CN101506236B

CN101506236B - 抗淀粉样β蛋白的单克隆抗体及其用途

Info

Publication number: CN101506236B
Application number: CN2006800519854A
Authority: CN
Inventors: B·拉布科夫斯基; S·巴格霍恩; H·希伦; U·埃贝尔特; A·R·斯特里宾格; P·克勒
Original assignee: Abbott GmbH and Co KG; Abbott Laboratories
Current assignee: AbbVie Deutschland GmbH and Co KG; AbbVie Inc
Priority date: 2005-11-30
Filing date: 2006-11-30
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2026-11-30
Also published as: KR20080090407A; WO2007064972A2; US20220017607A1; RU2432362C2; KR20150061042A; JP2018093876A; RS53270B2; IL228535A; JP2014037413A; CA2631195C; BRPI0619357A2; JP2024075584A; JP2022091786A; IL243807A0; US10323084B2; KR101439828B1; IL297746A; IL231857A; SG10201706600VA; JP2009519012A

Abstract

本发明涉及可用于例如阿尔兹海默病或其它神经变性性疾病的预防、治疗和诊断的单克隆抗体(例如8F5和8C5)。

Description

抗淀粉样β蛋白的单克隆抗体及其用途

发明背景

技术领域

本发明涉及可例如用于阿尔兹海默病或其它神经变性性疾病的预防、治疗和诊断的单克隆抗体(例如8F5和8C5)。

技术背景

阿尔兹海默病(AD)是一种认知能力进行性丧失以及特有的神经病理学特征包括大脑若干区域的淀粉样蛋白沉积、神经原纤维缠结和神经元缺失为特征的神经变性的疾病，参见Hardy和Selkoe(Science297，353(2002)；Mattson(Nature 431，7004(2004)。淀粉样蛋白沉积的主要成分是淀粉样蛋白β肽(Aβ)，其中以长42个氨基酸的类型(Aβ1-42)最为显著。

具体的说，淀粉样β(1-42)蛋白质是具有42个氨基酸的多肽，其通过蛋白水解处理淀粉样前体蛋白(APP)衍生得到。除了淀粉样β(1-42)蛋白质的人变体外，这还包括存在于人以外的生物体、尤其是其它哺乳动物、又特别是大鼠中的淀粉样β(1-42)蛋白质的亚型。在含水环境中趋向于发生聚合的这种蛋白质可以迥然不同的分子形式存在。

不溶性蛋白的沉积与痴呆病症如阿尔兹海默病的发生或发展的简单相关被证实不可信(Terry et al.，Ann.Neurol.30.572-580(1991)；Dickson et al.，Neurobiol.Aging 16，285-298(1995))。相反，突触和认知性感觉的丧失似乎与可溶性形式的Aβ(1-42)更有关联(Lue et al.，Am.J.Pathol.155，853-862(1999)；McLean et al.，Ann.Neurol.46，860-866(1999))。

虽然过去已经产生出抗Aβ(1-42)的多克隆和单克隆抗体，但无一被证实能在动物和/或人中产生所需的疗效而又不产生严重的副作用。例如，对高龄APP23小鼠接受的持续5个月每周一次的N末端定向性抗Aβ(1-42)抗体的临床前研究所得的被动免疫结果显示治疗相关性副作用。特别是这些小鼠比用盐水处理的小鼠显示出微出血量和严重程度加剧(Pfeifer et al.，Science 2002298：1379)。最近也有描述高龄(＞24个月)Tg2576和PDAPP小鼠有类似的出血增加情况(Wilcock et al.，JNeuroscience 2003，23：3745-51；Racke et al.，J Neuroscience 2005，25：629-636)。在这两种小鼠品系中，注射抗Aβ(1-42)都导致微出血的显著增加。因此，存在开发预防或减慢疾病发展又不会诱发人体负面的和潜在的致命影响的生物制品的巨大的治疗需求。鉴于大众寿命的日益延长，由于这种延长，每年诊断出的阿尔兹海默病患者的数量增加，因此这种需求尤其明显。此外，这种抗体将允许对有阿尔兹海默病症状的患者进行正确的诊断，而目前的诊断只能在尸体解剖时才能得到确证。另外，所述抗体将允许对造成这种衰竭性疾病的蛋白质和其它生物因子的生物特性进行阐释。

本文提到的所有专利和出版物通过引用整体结合到本文中。

发明概述

本发明包括这样的分离抗体，其对淀粉样β(Aβ)蛋白球聚体(globulomer)的结合特异性大于对淀粉样β蛋白单体的结合特异性。因此，观察到优先结合现象。抗体可以是例如单克隆抗体如8F5或8C5。对球聚体的结合特异性与对单体的结合特异性的比例为至少1.4。具体的说，该比例优选为至少约1.4到至少约16.9。(1.0-17.5的比例，包括端点在内，及其小数部分，也被认为属于本发明的范围。例如，1.1、1.2、1.3、...、2.0、2.1、2.2...、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5以及其间的全部整数及其百分数被认为属于本发明的范围之内。)淀粉样β蛋白单体可以是例如Aβ(1-42)单体或Aβ(1-40)单体。

此外，本发明还涵括由美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)保藏号为PTA-7238的杂交瘤产生的单克隆抗体(本文称为“8F5”)以及产生这种单克隆抗体(即8F5)的杂交瘤。同样，本发明包括由美国典型培养物保藏中心保藏号为PTA-7407的杂交瘤产生的单克隆抗体(本文称为“8C5”)以及产生这种单克隆抗体(即8C5)的杂交瘤。

另外，本发明包括包含有由SEQ ID NO：1编码的可变重链的单克隆抗体。这个抗体可以是鼠抗体、人抗体或人源化抗体。

此外，本发明包括包含有由SEQ ID NO：2编码的可变轻链的单克隆抗体。这个抗体同样可以是鼠抗体、人抗体或人源化抗体。该抗体还可包含有由SEQ ID NO：1编码的可变轻重链，且可以是人抗体或人源化抗体。

而且，本发明包括包含有SEQ ID NO：3的单克隆抗体。该抗体可以是鼠抗体、人抗体或人源化抗体。

此外，本发明涵括包含有SEQ ID NO：4的单克隆抗体。这个抗体可以是鼠抗体、人抗体或人源化抗体。这个抗体还可包含有SEQ IDNO：3，且可以是鼠抗体、人抗体或人源化抗体。

另外，本发明包括包含有由SEQ ID NO：11编码的可变重链的单克隆抗体。这个抗体可以是鼠抗体、人抗体或人源化抗体。

此外，本发明包括包含有由SEQ ID NO：12编码的可变轻链的单克隆抗体。这个抗体同样可以是鼠抗体、人抗体或人源化抗体。该抗体还可包含有由SEQ ID NO：11编码的可变重链，且可以是人抗体或人源化抗体。

而且，本发明包括包含有SEQ ID NO：19的单克隆抗体。该抗体可以是鼠抗体、人抗体或人源化抗体。

此外，本发明涵括包含有SEQ ID NO：20的单克隆抗体。这个抗体可以是鼠抗体、人抗体或人源化抗体。这个抗体还可包含有SEQ IDNO：19，且可以是鼠抗体、人抗体或人源化抗体。

本发明还包括这样的分离抗体，其对淀粉样β蛋白球聚体(globulomer)的结合特异性大于对淀粉样β蛋白原纤维的结合特异性。这个抗体可以是例如单克隆的，可以是由美国典型培养物保藏中心保藏号为PTA-7243的杂交瘤或保藏号为PTA-7407的杂交瘤产生的单克隆抗体。产生这些单克隆抗体的杂交瘤也属于本发明的范围之内。

此外，本发明包括这样的抗体，其中可变重链的互补决定区(CDR)中至少有一个选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。

而且，本发明还包括这样的抗体，其中可变轻链的CDR中至少有一个选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。这个抗体还可包含至少一个选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的可变重链CDR。

本发明还包括这样的抗体，其中可变重链的CDR中至少有一个选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15。

此外，本发明还涵括这样的抗体，其中可变轻链的CDR中至少有一个选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。这个抗体还可包含至少一个选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：15的可变重链CDR。

另外，本发明涵括对阿尔兹海默病需要患者治疗或预防的方法。这个方法包括将上述分离抗体中的任何一种或多种以足以实现治疗或预防的量给予该患者。

本发明分离抗体可例如通过选自肌肉内给药、静脉内给药和皮下给药的途径来给予。

本发明还包括对怀疑患有阿尔兹海默病的患者进行诊断的方法。这个方法包括以下步骤：1)从该患者分离生物样品；2)使该生物样品与至少一种上述抗体进行接触，接触的时间和条件足够使抗原/抗体复合物得以形成；和3)检测所述样品中抗原/抗体复合物的存在，复合物的存在表明该患者患有阿尔兹海默病。该抗原可以是例如球聚体或者其部分或片段，该部分或片段具有与完全球聚体相同的功能特性(例如结合活性)。

此外，本发明包括另一种对怀疑患有阿尔兹海默病的患者进行诊断的方法。这个方法包括以下步骤：1)从该患者分离生物样品；2)使该生物样品与抗原进行接触，接触的时间和条件足够使抗原/抗体复合物得以形成；3)向所得的抗体/抗原复合物加入缀合物，加入的时间和条件足够使该缀合物与结合抗体发生结合，其中该缀合物包含上述抗体中的一种，这个抗体与能够产生可检测信号的信号产生化合物连接；和4)通过检测信号产生化合物所产生的信号检测在该生物样品中可能存在的抗体的存在，该信号表明该患者患有阿尔兹海默病。该抗原可以是球聚体或者其部分或片段，该部分或片段具有与完全球聚体相同的功能特性(例如“结合活性”)。

本发明包括又一种对怀疑患有阿尔兹海默病的患者进行诊断的方法。这个方法包括以下步骤：1)从该患者分离生物样品；2)使该生物样品与抗抗体进行接触，其中该抗抗体对上述抗体中的一种具有特异性，接触的时间和条件足够使抗抗体/抗体复合物得以形成，该复合物含有该生物样品中存在的抗体；3)向所得的抗抗体/抗体复合物加入缀合物，加入的时间和条件足够使该缀合物与结合抗体发生结合，其中该缀合物包含抗原，这个抗原与能够产生可检测信号的信号产生化合物结合；和4)检测信号产生化合物所产生的信号，该信号表明该患者患有阿尔兹海默病。

此外，本发明包括包含有上述抗体中的任何一种或多种(例如8F5和8C5)的组合物。

本发明包括另一种对阿尔兹海默病需要患者预防或治疗的方法。这个方法包括将上述组合物以足以实现预防或治疗的量直接给予该患者的这个步骤。

另外，本发明涵括包含有上述抗体中的至少一种和药学上可接受的佐剂的疫苗。

而且，本发明包括又一种对阿尔兹海默病需要患者预防或治疗的方法。这个方法包括将上述疫苗以足以实现预防或治疗的量给予该患者的这个步骤。

此外，本发明涵括鉴定适用于对预测会发生阿尔兹海默病的患者进行自动免疫接种的化合物的方法。这个方法包括：1)使一种或多种目的化合物暴露于上述抗体中的一种或多种，暴露的时间和条件足以使该一种或多种化合物与该一种或多种抗体发生结合；2)鉴定与该一种或多种抗体发生结合的那些化合物，所鉴定出的化合物用于对预测会发展阿尔兹海默病的患者进行主动免疫。

还有，本发明包括这样的试剂盒，其包括：a)上述分离抗体中的至少一种，和b)包含有与信号产生化合物连接的抗体的缀合物，其中该缀合物的该抗体不同于该分离抗体。该试剂盒还可包括包装插页，上有关于试剂盒的各成分如何进行使用的说明。

本发明还涵括这样的试剂盒，其包括：a)抗上述抗体中的一种的抗抗体，和b)包含有与信号产生化合物连接的抗原的缀合物。该抗原可以是球聚体或者其片段或部分，该片段或部分具有与球聚体相同的功能特性(例如结合活性)。而且，该试剂盒还可包括包装插页，上有关于试剂盒的各成分如何进行使用的说明。

附图简述

图1图解比较了8F5对球聚体相对于Aβ(1-42)单体、Aβ(1-40)和sAPP的的选择性。8F5的选择性系数可以计算为各EC50值之间的比例(与HFIP中的Aβ(1-42)单体之比：555.8/90.74＝6.1；与NH₄OH中的Aβ(1-42)单体之比：1007/90.74＝11.1；与Aβ(1-40)单体之比：667.8/90.74＝7.4；与sAPP之比＞100)。

图2图解说明结合原纤维的重链和轻链抗体(泳道4、6、8)和上清液中相应的非结合游离部分(泳道3、5、7)的SDS-PAGE分析。

图3图解说明来自患轻度认知损害(MCI，左)或阿尔兹海默病(AD，右)患者的CSF样品中的Aβ42和Aβ40含量。在两组中，可以观察到与标准抗体6E10相比或者与用相同ELISA进行的直接样品分析相比，8F5结合较高比例的Aβ(1-42)和较少或相等数量的Aβ(1-40)。

图4图解说明三组APP转基因小鼠(即6G1、8F5、PBS)和一组非转基因同胎仔鼠(野生型)中的新物体认知指数，该指数是对未知物体与对熟知物体所花的时间。各小鼠(数字在柱条下方给出)用单克隆抗体6G1或8F5进行免疫或者用介质(即磷酸缓冲盐水PBS和野生型)进行处理，做法是连续三周每周一次腹膜内注射。最后一次注射的当天，进行新物体认知试验。PBS组和野生型组之间的差异表明这个实验示例(paradigm)中的APP转基因小鼠有认知缺损。注射PBS的小鼠以机会水平认知(即不显著偏离50)，而所有其它小鼠显示物体识别力(t-检验；星号)。当将抗体处理过的APP转基因小鼠的认知水平与对照组进行比较时发现，与PBS处理的小鼠有显著差异，但与野生型小鼠没有显著差异(ANOVA加post-hoc t-检验；圆圈)，表明用抗体处理逆转了这些APP转基因小鼠的认知缺损。

图5(A)图解说明编码本文称为“8F5”的单克隆抗体的可变重链的DNA序列(SEQ ID NO：1)，图5(B)说明编码单克隆抗体8F5的可变轻链的DNA序列(SEQ ID NO：2)。(互补决定区(CDR)在每个序列中加下划线表示；另参见图6。)

图6(A)图解说明单克隆抗体8F5的可变重链的氨基酸序列(SEQID NO：3)，图6(B)图解说明单克隆抗体8F5的可变轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。可变重链的一个CDR由氨基酸序列SYGMS(SEQID NO：5)表示。可变重链的另一个CDR由氨基酸序列ASINSNGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO：6)表示，可变重链的又一个CDR由氨基酸序列SGDY(SEQ ID NO：7)表示。可变轻链的一个CDR由氨基酸序列RSSQSLVYSNGDTYLH(SEQ ID NO：8)表示。可变轻链的另一个CDR由氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO：9)表示，可变轻链的又一个CDR由氨基酸序列SQSTHVPWT(SEQ ID NO：10)表示。所有上述CDR在图6(A)和6(B)中以下划线表示。

图7显示不同浓度的抗体与阿尔兹海默病(AD)患者或老龄APP转基因小鼠的新皮层的横切片的结合。具体的说，图7(A)图解确认在APP转基因小鼠系Tg2576和在AD患者(RZ55)中用刚果红染色淀粉样沉积物为大脑组织中的斑块和大脑血管中的大脑淀粉样血管病(CAA)。图7(B)图解说明对AD患者(RZ16)中的Aβ(淀粉样斑块)脑实质沉积物的染色只在6G1和市售可得抗体6E10出现，而8F5和8C5显示相当弱的染色。图7(C)图解说明对TG2576小鼠中的Aβ(淀粉样斑块)脑实质沉积物的强染色只在6G1和市售可得抗体6E10出现，而8F5和8C5显示相当弱的染色。图7(D)-(G)图解说明用图像分析对组织学图像中的Aβ斑块染色进行的分析定量。光密度值(0％＝无染色)由斑块的灰度值减去背景组织的灰度值计算得出。(图(D)＝Tg2576小鼠中结合0.7μg/ml抗体；图(E)＝APP/L小鼠中结合0.07-0.7μg/ml抗体；图(F)＝AD患者(RZ55)中结合0.7μg/ml抗体；图(G)＝AD患者(RZ16)中结合0.07-0.7μg/ml抗体)对市售可得抗体6E10(星号)和4G8(圆圈)与抗体6G1、8C5和8F5(一个星号/圆圈：p＜0.05，两个星号/圆圈：p＜0.01，三个星号/圆圈：p＜0.001，均相对于于对照比较；在ANOVA后，post-hoc Bonferroni的t检验p＜0.001)之间的染色差异进行了统计学上的评估(图(D)和图(E))。在图(E)和(G)中，抗体8C5和8F5总是显示出比市售可得抗体6E10和4G8显著更低的染色(ANOVA检验p＜0.001后，post-hoc的t检验中，p＜0.05。图(H)图解说明对Aβ血管沉积物的强烈染色(箭头)只在6G1和市售可得抗体6E10出现，而8F5或8C5的染色要弱得多。在Tg2576小鼠中发现定性类似情况(这里未显示)。

图8图解比较了8C5对球聚体相对于Aβ(1-42)单体、Aβ(1-40)和sAPP的选择性。8C5的选择性系数可计算为各EC50值之间的比值(对HFIP中的Aβ(1-42)单体：2346/568.2＝4.1；对NH₄OH中的Aβ(1-42)单体：＞100；对Aβ(1-40)单体：＞100；对sAPP：＞100)

图9(A)图解说明了编码8C5的重链的核苷酸序列(SEQ IDNO：11)，图9(B)图解说明了编码8C5的轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)。编码图10(A)和10(B)中所述的相应CDR的核苷酸序列以下划线表示。

图10(A)说明单克隆抗体8C5的可变重链的氨基酸序列(SEQ IDNO：19)，图10(B)说明单克隆抗体8F5的可变轻链的氨基酸序列(SEQID NO：20)。可变重链的一个CDR由氨基酸序列SYGMS(SEQ ID NO：13)表示。可变重链的另一个CDR 由氨基酸序列SIKNNGGSTYYPDSLKG(SEQ ID NO：14)表示，可变重链的又一个CDR由氨基酸序列SGDY(SEQ ID NO：15)表示。可变轻链的一个CDR由氨基酸序列RSSQSLVHSNGDTFLH(SEQ ID NO：16)表示。可变轻链的另一个CDR由氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO：17)表示，可变轻链的又一个CDR由氨基酸序列SQSIHVPWT(SEQ ID NO：18)表示。所有上述CDR在图10(A)和10(B)中以下划线表示。

发明详述

本发明涉及本文称为“8F5”的单克隆抗体以及其它相关抗体(例如8C5)。这些抗体可例如用于阿尔兹海默病和其它神经变性性疾病的诊断、预防和治疗。

单克隆抗体8F5及单克隆抗体8C5具有许多值得关注的特性，这些特性使得它们成为极其值得关注的治疗用候选者及极其有用的诊断用候选者。例如，单克隆抗体8F5和8C5对Aβ(1-42)球聚体的结合优先于对单体或原纤维的结合。

术语“Aβ(X-Y)”在本文中指人淀粉样β蛋白质中从氨基酸位置X到氨基酸位置Y、包括X和Y在内的氨基酸序列，具体的说指氨基酸序列DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGAIIGLMVGGW IA或其任何天然变体中从氨基酸位置X到氨基酸位置Y、包括位置X和位置Y在内的氨基酸序列，或者具有最多三个另外的氨基酸置换、而这些置换没有一个会妨碍球聚体的形成的序列，所述变体具体的说是具有至少一个选自以下的突变的那些变体：A2T、H6R、D7N、A21G(“Flemish”)、E22G(“Arctic”)、E22Q(“Dutch”)、E22K(“Italian”)、D23N(“Iowa”)、A42T和A42V，其中数字是相对于Aβ肽的起始位置。“另外的”氨基酸置换在本文中定义为与自然界中所不存在的规范序列的任何偏差。

更具体的说，术语“Aβ(1-42)”在本文中指人淀粉样β蛋白质中从氨基酸位置1到氨基酸位置42、包括1和42在内的氨基酸序列，具体的说指从氨基酸位置1到氨基酸位置42、包括1和42在内的氨基酸序列DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGAIIGLMVGGW IA(对应于氨基酸位置1-42)，或其任何天然变体，所述变体可以是例如具有至少一个选自以下的突变的那些变体：A2T、H6R、D7N、A21G(“Flemish”)、E22G(“Arctic”)、E22Q(“Dutch”)、E22K(“Italian”)、D23N(“Iowa”)、A42T和A42V，其中数字是相对于Aβ肽的起始位置，或者具有最多三个另外的氨基酸置换、而这些置换没有一个会妨碍球聚体的形成的序列，。同样，术语“Aβ(1-40)”在本文中指人淀粉样β蛋白质中从氨基酸位置1到氨基酸位置40、包括1和40在内的氨基酸序列，具体的说指从氨基酸位置1到氨基酸位置40、包括1和40在内的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGW或其任何天然变体，所述变体包括例如具有至少一个选自以下的突变的那些变体：A2T、H6R、D7N、A21G (“Flemish”)、E22G(“Arctic”)、E22Q(“Dutch”)、E22K(“Italian”)和D23N(“Iowa”)，其中数字是相对于Aβ肽的起始位置，或者具有最多三个另外的氨基酸置换、而这些置换没有一个会妨碍球聚体的形成的序列，。

术语“Aβ(X-Y)球聚体”(也称“Aβ(X-Y)球形寡聚体”)在本文中指以上所定义的Aβ(X-Y)肽的可溶性、球形、非共价的联合体(association)，该联合体具有均匀性和独特的物理特性。Aβ(X-Y)球聚体是Aβ(X-Y)肽的稳定、非纤维状、寡聚的集合体(assembly)，可通过将该肽与阴离子去污剂一起温育来获得。与单体和原纤维相比，这些球聚体的特征是具有确定的亚单位集合体数(例如PCT国际申请公开说明书WO 04/067561中所描述，早期集合体形式，n＝3-6，“寡聚体A”，和后期集合体形式，n＝12-14，“寡聚体B”)。球聚体具有3维球形结构(“熔融小球(molten globule)”，参见Barghorn et al.，2005，J Neurochem，95，834-847)。它们还可通过一种或多种以下特征来表征：

-能用混杂蛋白酶(如嗜热菌蛋白酶或内切蛋白酶GluC)切割N末端氨基酸X-23，产生截短形式的Aβ(X-Y)球聚体；

-混杂蛋白酶和抗体不能接近C末端氨基酸24-Y；

-截短形式的这些Aβ(X-Y)球聚体保持了球聚体的3维核心结构，同时核心表位Aβ(20-Y)在其球聚体构象下具有更好的可接近性。

根据本发明，具体的说出于评估本发明抗体的结合亲和力的目的，术语“Aβ(X-Y)球聚体”在本文中指可通过国际申请公开说明书WO 04/067561(其通过引用整体结合到本文中)描述的方法获得的产物。该方法包括使天然、重组或合成的Aβ(X-Y)肽或其衍生物解折叠；使至少部分上解折叠的Aβ(X-Y)肽或其衍生物暴露于去污剂；减少去污作用和继续进行温育。

出于使肽解折叠的目的，可让氢键破坏剂如六氟异丙醇(HFIP)作用于蛋白质。当作用温度为约20-50℃、具体的说约35-40℃时，几分钟、例如约10-60分钟的作用时间就足够了。随后将被蒸发至干的、优选为浓缩形式的残余物溶解于可与含水缓冲液混溶的合适有机溶剂如二甲亚砜(DMSO)，产生出至少部分上解折叠的肽或其衍生物的悬浮液，该悬浮液随后可以进行使用。如果需要，可将悬浮液原液在低温下、例如在约-20℃下储藏临时的一段时间。

或者，可将肽或其衍生物吸收在轻微酸性的、优选含水的溶液中，例如约10mM HCl水溶液。在大约几分钟的温育时间后，将不溶性成分离心除去。以10,000g几分钟就适宜了。这些方法步骤优选在室温下、即20-30℃范围内进行。离心后获得的上清液含有Aβ(X-Y)肽或其衍生物，可在低温下、例如在约-20℃下储藏临时的一段时间。

接下来暴露于去污剂涉及到肽或其衍生物发生寡聚化产生中间体型的寡聚体(在国际申请公开说明书WO 04/067561中称为寡聚体A)。出于这个目的，让去污剂作用于任选至少部分解折叠的肽或其衍生物，直到产生了足够的中间寡聚体。优选的是使用离子型去污剂，特别是阴离子去污剂。

根据一个具体的实施方案，使用下式(I)的去污剂：

R-X，

其中基团“R”是具有6-20个、优选10-14个碳原子的无支链或有支链烷基或者具有6-20个、优选10-14个碳原子的无支链或有支链烯基，基团“X”是酸性基团或其盐，该X优选选自-COO^-M⁺、-SO₃ ^-M⁺，最优选为-OSO₃ ^-M⁺，M⁺为氢阳离子或者优选选自碱金属阳离子、碱土金属阳离子和铵阳离子的无机或有机阳离子。最有利的是式(I)其中R为无支链烷基的去污剂，该烷基中特别值得一提的是烷-1-基基团。特别优选的是十二烷基硫酸钠(SDS)。还可方便地使用月桂酸和油酸。十二烷酰肌氨酸这种去污剂的钠盐(也称sarkosyl NL-30或

)也特别有利。

去污剂作用的时间具体的说取决于寡聚化的肽或其衍生物是否已经解折叠，且如果已经解折叠，则取决于解折叠程度如何。如果根据解折叠步骤，肽或其衍生物已预先用氢键破坏剂(即具体的说用六氟异丙醇)进行了处理，则当作用温度为约20-50℃、具体的说约35-40℃时，作用时间为若干小时、有利地约1-20小时、具体的说约2-10小时。如果是从解折叠较少或者几乎没有解折叠的肽或其衍生物出发，则宜相应增加作用时间。如果肽或其衍生物已例如根据上述程序进行了预处理作为HFIP处理的替代，或者所述肽或其衍生物直接经过寡聚化，则当作用温度为约20-50℃、具体的说约35-40℃时，作用时间为约5-30小时、尤其是约10-20小时。温育后，不溶性成分通过离心法方便地除去。以10,000g几分钟就适宜了。

去污剂浓度的选定取决于所用的去污剂。如果是使用SDS，则适宜浓度为0.01-1％(重量)、优选0.05-0.5％(重量)、例如约0.2％(重量)。如果是使用月桂酸或油酸，则适宜稍高的浓度，例如0.05-2％(重量)、优选0.1-0.5％(重量)、例如约0.5％(重量)。去污作用发生于近似生理学含盐浓度范围内。因此，具体的说，NaCl适宜浓度为50-500mM、优选100-200mM、更优选约140mM。

随后的去污剂作用的减少和温育的继续涉及到进一步寡聚化产生本发明的Aβ(X-Y)球聚体(在国际申请公开说明书WO 04/067561中称为寡聚体B)。由于从前面步骤获得的组合物常常含有去污剂和处于生理范围的盐浓度，因此宜减少去污剂作用并优选还减少盐浓度。这可以这样来进行：将去污剂和盐例如适宜地用水或较低盐浓度的缓冲液(例如Tris-HCl，pH 7.3)进行稀释，从而减少去污剂和盐的浓度。稀释系数是约2-10、有利地是约3-8、特别合适的是约4。去污剂作用的减少也可通过加入能中和这个去污剂作用的物质来实现。这些物质的实例包括能够将去污剂络合的物质，如能够在纯化和提取措施中使细胞稳定化的物质，例如特别是EO/PO嵌段共聚物，具体的说商标为

F68的嵌段共聚物。同样可以使用的是烷氧基化的、特别是乙氧基化的烷基酚，如

X系列的乙氧基化叔辛基酚，具体的说是X100、3-(3-胆酰胺丙基二甲氨基)丙磺酸盐(3-(3-cholamidopropyldimethylammonio)-1-propanesulfonate，

)，或者烷氧基化的、具体的说乙氧基化的脱水山梨糖醇脂肪酯，如

系列的乙氧基化脱水山梨糖醇脂肪酯，具体的说是

20，所用浓度范围在特定临界胶束浓度附近或以上。

随后将溶液温育至产生出足够的Aβ(X-Y)球聚体。当作用温度为约20-50℃、具体的说约35-40℃时，作用时间是若干小时、优选约10-30小时、具体的说约15-25小时。然后可将溶液浓缩，可能出现的残余物可通过离心除去。同样，以10,000g几分钟就适宜了。离心后获得的上清液含有本文所述的Aβ(X-Y)球聚体。

Aβ(X-Y)球聚体可例如通过超滤、透析、沉淀或离心进行最终回收。进一步优选的是，Aβ(X-Y)球聚体在变性条件下例如通过SDS-PAGE进行电泳分离能产生双条带(例如对于Aβ(1-42)来说表观分子量为38/48kDa)，特别优选的是，在分离前对寡聚体进行戊二醛处理时，这些双条带合并成一个条带。还优选的是，对球聚体进行尺寸排阻色谱法产生单一峰(例如对于Aβ(1-42)来说对应于大约60kDa的分子量)。这个方法特别适合于从Aβ(1-42)肽出发获得Aβ(1-42)球聚体。优选地，球聚体显示出对神经元细胞的亲和力，同时还显示神经调节作用。“神经调节作用”定义为神经元的长期抑制作用，该抑制作用导致神经元在可塑性方面出现功能异常。

根据本发明的另一个方面，术语“Aβ(X-Y)球聚体”在本文中指本质上由Aβ(X-Y)亚单位组成的球聚体，其中优选的是平均来说12个亚单位中至少有11个是Aβ(X-Y)类型，更优选的是，小于10％的球聚体包含任何非Aβ(X-Y)肽，最优选的是，制品中的非Aβ(X-Y)肽的含量低于检测阈。更具体的说，术语“Aβ(1-42)球聚体”在本文中指包含如上定义的Aβ(1-42)单位的球聚体；术语“Aβ(12-42)球聚体”在本文中指包含如上定义的Aβ(12-42)单位的球聚体；术语“Aβ(20-42)球聚体”在本文中指包含如上定义的Aβ(20-42)单位的球聚体。

术语“交联Aβ(X-Y)球聚体”在本文中指可通过对如上定义的Aβ(X-Y)球聚体的组成单位进行交联、优选化学交联、更优选醛交联、最优选戊二醛交联而从该球聚体获得的分子。在本发明的另一个方面，交联球聚体基本上是这样的球聚体：其中的各单位至少部分上通过共价键连接，而不是只通过非共价相互作用保持在一起。

术语“Aβ(X-Y)球聚体衍生物”在本文中具体是指通过与有助于检测的基团发生共价连接而被标记的球聚体，所述基团优选为：荧光团，例如异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、维多利亚水母(Aequorea victoria)荧光蛋白、線鳚科(Dictyosoma)荧光蛋白或者它们的任何组合或荧光活性衍生物；发色团；化学发光团(chemoluminophore)，例如萤光素酶，优选北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶、费氏弧菌(Vibrio fischeri)萤光素酶或者它们的任何组合或化学发光活性衍生物；酶促活性基团，例如过氧化物酶如辣根过氧化物酶或者其酶促活性衍生物；电子致密基团(electron-dense group)，例如含重金属基团如含金基团；半抗原，例如酚衍化半抗原；强抗原性结构，例如如通过Kolaskar和Tongaonkar的算法预测具有抗原性的肽序列；另一分子的适体(aptamer)；螯合基团，例如六聚组氨酸基团；能介导进一步的特异性蛋白质-蛋白质相互作用的天然的或天然衍生的蛋白质结构，例如fos/jun对中的成员；磁性基团，例如铁磁性基团；或者放射性基团如包含¹H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I或它们的任何组合的基团；或者是指这样的球聚体：其通过高亲和力相互作用共价或非共价地、优选共价地与能促进失活、螯合、降解和/或沉淀的基团连接而附加标识，优选标识能促进体内降解的基团，更优选标识遍在蛋白，在这种情况下特别优选的是这一被标识寡聚体是在体内集合装配；或者是指通过上述基团的任何组合进行修饰的球聚体。这种标记的和附加标识的基团和将它们与蛋白质连接的方法是本领域公知的。标记和/或附加标识可在进行球聚体化(globulomerization)之前、过程中或之后进行。在本发明的另一个方面，球聚体衍生物是可通过标记和/或附加标识反应从球聚体获得的分子。相应地，术语“Aβ(X-Y)单体衍生物”在本文中具体是指如对球聚体所述进行标记或附加标识的Aβ单体。

术语“较大亲和力”在本文中指这样的相互作用的程度，其中未结合抗体和未结合球聚体与抗体-球聚体复合物之间的平衡更有利于抗体-球聚体复合物。同样，术语“较小亲和力”在本文中指这样的相互作用的程度，其中未结合抗体和未结合球聚体与抗体-球聚体复合物之间的平衡更有利于未结合抗体和未结合球聚体。

术语“Aβ(X-Y)单体”在本文中指Aβ(X-Y)肽的分离形式，优选没有参与到与其它Aβ肽的实质上非共价相互作用的Aβ(X-Y)肽形式。实际上，Aβ(X-Y)单体常常是以水溶液的形式提供。优选地，单体水溶液当用于例如测定本发明抗体的结合亲和力时，含有0.05％-0.2％、更优选约0.1％的NaOH。在另一个优选的情况中，单体水溶液含有0.05％-0.2％、更优选约0.1％的NaOH。当使用时，宜以适当的方式将溶液进行稀释。此外，溶液通常宜在其制备后2小时内、具体的说1小时内、特别是30分钟内使用。

术语“原纤维”在本文中指由非共价缔合的单个Aβ(X-Y)肽的集合体构成的分子结构，该集合体在电子显微镜下显示纤维状结构，能结合刚果红，在偏振光下显示双折射现象，其X-射线衍射图样是交叉β折叠结构。原纤维还可定义为可通过这样的方法获得的分子结构，该方法包括使合适的Aβ肽在例如0.1M HCl中，在去污剂不存在下，发生自身引发的聚合聚集(polymeric aggregation)，导致形成超过24个单位、优选超过100个单位的聚集体(aggregate)。这个方法是本领域公知的。Aβ(X-Y)原纤维适宜以水溶液形式使用。在本发明的一个特别优选的实施方案中，这样来制备原纤维水溶液：将Aβ肽溶于0.1％NH₄OH中，将它用20mM NaH₂PO₄，140mM NaCl，pH 7.4进行1∶4稀释，然后重调pH至7.4，所得溶液在37℃下温育20小时，然后以10000g离心10分钟，重悬浮于20mM NaH₂PO₄，140mM NaCl，pH 7.4中。

术语“Aβ(X-Y)原纤维”在本文中指包含Aβ(X-Y)亚单位的原纤维，其中优选的是平均来说至少90％的亚单位是Aβ(X-Y)类型，更优选的是至少98％的亚单位是Aβ(X-Y)类型，最优选的是非Aβ(X-Y)肽的含量低于检测阈。

现回到8F5(图1所示)及8C5(图8)，相比于非特异性抗体6G1和6E10，Aβ(1-42)球聚体特异性抗体即单克隆抗体8F5和8C5主要识别Aβ(1-42)球聚体形式而不是Aβ(1-40)或Aβ(1-42)单体的标准制品，包括聚集的Aβ(1-42)。具体的说，8F5只通过无变性PAGE-蛋白质印迹而不是通过SDS-PAGEA蛋白质印迹分析检测Aβ(1-42)球聚体，这表明是与核心Aβ(1-42)球聚体结构中的更为复杂的去污剂可解离亚基间表位发生结合。亚基间表位定义为位于至少两个亚单位上的复杂非线型跨空间表位。更具体的说，对各种Aβ(1-42)和Aβ(1-40)标准制品的斑点印迹分析显示，特异性8F5和8C5在对Aβ(1-42)球聚体的识别与对非球聚体Aβ形式(标准的Aβ(1-40)/(1-42)单体制品、聚集的Aβ(1-42))的识别上存在显著差异，而同种型非特异性抗体6G1和6E10却不是这样。通过在夹心ELISA中对Aβ(1-42)球聚体、Aβ(1-42)单体、Aβ(1-40)单体和可溶性淀粉样前体蛋白α结合进行定量，证实了8F5和8C5对球聚体有特异性，而6G1和6E10没有特异性。此外，由于这些抗体在无变性的蛋白质印迹后而不是在SDS蛋白质印迹后接近球聚体，很可能每个抗体识别的是在Aβ(1-42)的氨基酸20-30区域中亚单位之间的结构非线型表位。对球聚体的这种特异性是重要的，因为用球聚体优先抗体如8F5或8C5特异性靶向球聚体形式的Aβ，将会：1)避免靶向不溶性淀粉样沉积物(与不溶性淀粉样沉积物的结合可能是用不溶性Aβ进行免疫过程中所观察到的炎性副作用的原因)；2)避开据报道具有预识别(precognitive)生理功能(Plan et al.，J.ofNeuroscience 23：5531-5535(2003)的Aβ单体和APP；和3)提高抗体的生物利用度，因为它不会由于广泛结合不溶性沉积物而被遮挡或不可接近。

本发明还包括编码单克隆抗体8F5和8CD的可变轻链和重链的分离核苷酸序列(或其片段)，以及具有包含、对应于、相同于、可杂交于或可互补于与这些编码核苷酸序列的至少约70％(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％)、优选至少约80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％)、更优选至少约90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列的那些核苷酸序列(或其片段)。(关于百分比同一性，70％-100％之间(包括70％和100％)的所有整数(及其小数)均被认为都属于本发明的百分比同一性范围之内。)这种序列可衍自任何来源(例如从天然来源分离，通过半合成途径产生，或者从头合成)。具体的说，这种序列可分离自或衍自实施例中所述的来源之外的来源(例如细菌、真菌、藻类、小鼠或人)。

除了上述核苷酸序列外，本发明还包括单克隆抗体8F5和单克隆抗体8C5的可变轻链和重链的氨基酸序列(或者这些氨基酸序列的片段)。此外，本发明还包括包含、对应于、相同于或可互补于与本发明蛋白质的氨基酸序列的至少约70％、优选至少约80％、更优选至少约90％同一性的氨基酸序列(或其片段)。(同样，70％-100％之间(包括70％和100％)的所有整数(及其小数)(如同以上有关核苷酸序列同一性所述)也被认为属于本发明的核苷酸序列同一性范围之内。)

出于本发明的目的，核苷酸序列的“片段”定义为对应于指定核苷酸序列的某个区域的、由大约至少6个、优选至少约8个、更优选至少约10个核苷酸、甚至更优选至少约15个核苷酸组成的连续序列。

术语“同一性”指两个序列在特定的比较窗或区段范围内基于核苷酸对核苷酸比较的相关性。因此，同一性定义为两个DNA区段(或者两个氨基酸序列)的相同链(正义链或反义链)之间的相同性、对应性或等同性的程度。“序列同一性百分数”是这样计算的：将两个进行最佳比对的序列在特定区域范围内进行比较；确定两个序列中出现相同碱基或氨基酸的位置的数量，以得到相匹配位置的数量；将这种位置的数量除以被比较区段中的位置总数，所得的商再乘以100。序列的最佳比对可以通过Smith&Waterman，Appl.Math.2：482(1981)的算法、Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的算法、Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：2444(1988)的方法和执行相关算法的计算机程序(例如Clustal Macaw Pileup(http://cmgm.Stanford. edu/biochem218/11Multiple.pdf；Higgins et al.，CABIOS.5L151-153(1989))、FASTDB(Intelligenetics)、BLAST(National Center forBiomedical Information；Altschul et al.，Nucleic Acids Research 25：3389-3402(1997))、PILEUP(Genetics Computer Group，Madison，WI)或GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7.0，Genetics Computer Group，Madison，WI)来进行。(参见美国专利5,912,120。)

出于本发明目的，“互补性”定义为两个DNA区段之间的相关性程度。它是通过测量一个DNA区段的正义链在适当条件下与另一DNA区段的反义链发生杂交形成双螺旋的能力来确定的。“互补序列”定义为基于典范的碱基配对规则与给定序列配对的序列。例如，一个核苷酸链中的序列A-G-T与另一个核苷酸链中的序列T-C-A是“互补的”。

在双螺旋中，腺嘌呤在一条链中出现，胸腺嘧啶则在另一条链中出现。同样，如鸟嘌呤存在于一条链中，则胞嘧啶会存在于另一条链中。两个DNA区段的核苷酸序列之间的相关性越大，该两个DNA区段的两条链之间形成杂合双链体的能力越大。

两个氨基酸序列之间的“相似性”定义为在两个序列中有一系列的相同和保守的氨基酸残基存在。两个氨基酸序列之间的相似性程度越高，该两个序列的对应性、相同性或等同性越高。(两个氨基酸序列之间的“同一性”定义为在两个序列中有一系列的完全同样或不变的氨基酸残基存在。)“互补性”、“同一性”和“相似性”的定义是本领域普通技术人员公知的。

“(由)......编码的”是指编码多肽序列的核酸序列，其中该多肽序列或其部分含有这样的氨基酸序列，其由该核酸序列编码的多肽的至少3个氨基酸、更优选至少8个氨基酸、甚至更优选至少15个氨基酸组成。

另外，当单链形式的核酸分子在适当的温度和离子强度条件下能与另一核酸分子退火时，则该核酸分子与该另一核酸分子“可杂交”(参见Sambrook et al.，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual，SecondEdition(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York))。温度和离子强度条件决定了杂交的“严格性”。

本文所用的术语“杂交”一般用来指核酸在适当的严格性条件下的杂交，本领域技术人员根据探针序列和靶标序列的特性对严格性条件是容易明了的。杂交和洗涤的条件是本领域公知的，根据所需的严格性通过改变温育时间、温度和/或溶液的离子强度来对条件作出调整也是容易实现的。参见例如Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd edition，Cold spring harbor Press，Cold Springharbor，N.Y.，1989，这个文献在上文也提到过，它通过引用结合到本文中。(另参见Short Protocols in Molecular Biology，ed.Ausubel et al.和Tijssen，Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，″Overview of principlesof hybridization and the strategy of nucleic acid assays″(1993)，这两个文献通过引用结合到本文中。)具体的说，条件的选择决定于被杂交序列的长度(特别是探针序列的长度)、核酸的相对G-C含量和允许的错配数量。如需要的是互补性程度较低的链之间的部分杂交，则优选低严格条件。当需要的是完美或近乎完美的互补性时，则优选高严格条件。对于典型的高严格条件，杂交溶液含有6X S.S.C、0.01MEDTA、1x Denhardt氏溶液和0.5％SDS。杂交是在约68摄氏度下进行，对于克隆的DNA的片段进行约3-4小时，对于总真核DNA进行约12-约16小时。对于中等严格性，可以采取用3X氯化钠、柠檬酸钠(SSC)的溶液、50％甲酰胺(0.1M的此缓冲剂，pH 7.5)和5X Denhardt氏溶液进行的滤膜预杂交和杂交。那么就可以在37摄氏度下预杂交4小时，接着在37摄氏度下与总量等于3,000,000cpm的标记探针杂交16小时，再接着在2X SSC和0.1％SDS溶液中进行洗涤，即在室温下洗涤4次，每次1分钟，然后在60摄氏度下洗涤4次，每次30分钟。干燥后，暴露于膜。对于低严格性，将杂交的温度降到低于双链体的解链温度(T_m)约12摄氏度。已知T_m是G-C含量和双链体长度以及溶液的离子强度的函数。

“杂交”要求两个核酸含有互补的序列。但是，视杂交的严格性而定，碱基之间可能会出现错配。如上所述，使核酸杂交的适当严格性取决于核酸的长度和互补的程度。这些变量是本领域公知的。更具体的说，两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越大，具有这些序列的核酸的杂交体的T_m值越大。对于长度大于100个核苷酸的杂交体，已有计算T_m的方程式(参见Sambrook et al.，出处同上)。对于与较短核酸的杂交，错配的位置变得更为重要，寡核苷酸的长度决定其特异性(参见Sambrook et al.，出处同上)。

本文所用的“分离核酸片段或序列”是单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变了的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离核酸片段可以由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段组成。(指定多核苷酸的“片段”指这样的多核苷酸序列：其包含由与指定核苷酸序列的某个区域有同一性或互补性的大约至少6个核苷酸、优选至少约8个核苷酸、更优选至少约10个核苷酸、甚至更优选至少约15个核苷酸、最优选至少约25个核苷酸组成的不间断序列。)核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)用以下单字母符号指代：“A”指代腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对RNA或DNA)，“C”指代胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指代鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指代尿苷酸，“UT”指代脱氧胸苷酸，“R”指代嘌呤(A或G)，“Y”指代嘧啶(C或T)，“K”指代G或T，“H”指代A或C或T，“I”指代肌苷，“N”指代任何核苷酸。

术语“功能上等同的片段或亚片段”与“功能等同片段或亚片段”在本文中可互用。这些术语指分离核酸片段中的这样的部分或亚序列：其中无论该片段或亚片段是否编码活性酶，其改变基因表达或产生某种表型的能力都得到保持。例如，该片段或亚片段可用于设计嵌合构建物以在被转化植物中产生所需的表型。可这样设计作共抑制或反义之用的嵌合构建物：将无论是否编码活性酶的核酸片段或其亚片段，以相对于植物启动子序列的适当方向进行连接。

术语“同源性”、“同源的”、“基本上相似”、“基本上对应”在本文中可互用。它们指这样的核酸片段：其中一个或多个核苷酸碱基的变化不会影响核酸介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语还指对本发明核酸片段的修饰如缺失或插入，相对于初始的未修饰片段，该修饰基本上没有改变所产生的核苷酸片段的功能性特性。因此应认识到，本发明所涵括的不只是特定的示例性序列，这一点本领域技术人员会意识到。

“基因”指能表达特定蛋白质的核酸片段，包括该编码序列前面和后面的调节序列(分别为5′非编码序列和3′非编码序列)。

“天然基因”指自然界中所存在的带有其自身的调节序列的基因。相反，“嵌合序列”指在自然界中通常不一起存在的核酸片段的组合。因此，嵌合构建物可包含衍自不同的来源的调节序列和编码序列，或者衍自相同的来源、但排列方式不同于自然界中通常存在的方式的调节序列和编码序列。(术语“分离(的)”是指序列被脱离其自然环境。)

“外来”基因指在宿主生物中通常不存在、而是通过基因转移引入到该宿主生物中的基因。外来基因可包括插入到非天然生物中的天然基因或者嵌合构建物。“转基因”是通过转化程序被引入到基因组中的基因。

“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调节序列”指位于编码序列上游、当中或下游的核苷酸序列(位于上游或下游的分为叫5′非编码序列和3′非编码序列)，它们能影响相关的编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。调节序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。

“启动子”或“调节基因序列”指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。该序列由近端的和较为远端的上游元件组成，后种元件往往被称为增强子。因此，“增强子”是能刺激启动子或调节基因序列活性的DNA序列，它可以是启动子的固有元件或者是被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子序列也可位于基因的被转录部分当中、和/或被转录序列的下游。启动子可以全部衍自天然基因，或者可以由衍自自然界中存在的不同启动子的不同元件组成，乃至可以包含合成的DNA区段。本领域技术人员认识到，不同的启动子可指导基因在不同组织或细胞类型中的表达，或者在不同发育阶段的表达，或者响应不同环境条件的表达。能引起基因在大多数宿主细胞类型中最多次数的表达的启动子，通常被称为“组成型启动子”。各种类型的可用于植物细胞的新启动子不断得到发现；在Okamuro和Goldberg，Biochemistry of Plants15：1-82(1989)的汇编资料中可以找到很多例子。还要认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切界限未曾得到完全定义，稍有差异的DNA片段可能也有相同的启动子活性。

“内含子”是基因中的不编码蛋白质序列的一部分的间插序列。因此，这种序列被转录成RNA后就被切除而不被翻译。该术语还用于被切除的RNA序列。“外显子”是基因序列中的这样一个部分：它被转录和存在于衍自该基因的成熟信使RNA中，但不一定是编码最终基因产物的序列的一部分。

“翻译前导序列”指位于基因的启动子序列和编码序列之间的DNA序列。翻译前导序列在完全加工的mRNA中在翻译起始序列的上游存在。翻译前导序列可影响初级转录物向mRNA的加工、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的实例已有描述(Turner，R.和Foster，G.D.(1995)Molecular Biotechnology 3：225)。

“3′非编码序列”指位于编码序列的下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化识别序列和其它编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的序列。聚腺苷酸化信号通常以影响聚腺苷酸束(tract)向mRNA前体的3′末端的加入为特征。Ingelbrecht et al.，Plant Cell1：671-680(1989)举例说明了不同的3′非编码序列的使用。

“RNA转录物”指RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所产生的产物。RNA转录物如果是DNA序列的完美互补拷贝，则称它为初级转录物，或者它可以是衍自初级转录物的转录后加工的RNA序列，称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”指没有内含子的、能被细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指用反转录酶从mRNA模板合成的、与该模板互补的DNA。cDNA可以是单链的，或者可用DNA聚合酶I的Klenow片段转化成双链形式。“正义”RNA指包括mRNA的、能在细胞当中或在体外被翻译成蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”指与靶标初级转录物或mRNA的全部或部分互补的、能阻断靶标基因的表达的RNA转录物(美国专利5,107,065)。反义RNA的互补性可以涉及特定基因转录物的任何部分，即在5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列。“功能RNA”指可能不被翻译、但仍对细胞过程具有作用的反义RNA、核酶RNA或其它RNA。术语“互补序列(complement)”和“反向互补序列(reverse complement)”在本文中在mRNA转录物上可互用，意在定义信息链的反义RNA。

术语“内源RNA”指在用本发明的重组构建物转化前在宿主的基因组中存在的任何核酸序列所编码的任何RNA，既可以是天然的，也可以是非天然的，即通过重组手段、诱变等引入的。

术语“非天然的”是指人工的，与自然界中通常存在的不一致。

术语“有效连接”指将各核酸序列缔合在单一核酸片段上，使得一个序列的功能受到另一个序列的调节。例如，某启动子如果能够调节某编码序列的表达，则它就与该编码序列有效连接(即该编码序列处于该启动子的转录控制下)。编码序列可以以正义或反义方向与调节序列有效连接。在另一个实例中，本发明的互补RNA区域能直接或间接地在靶标mRNA上游(5′)有效连接，或者在靶标mRNA下游(3′)有效连接，或者在靶标mRNA当中有效连接，或者第一互补区域在靶标mRNA上游(5′)，其互补序列在靶标mRNA下游(3′)。

本文所用的术语“表达”指功能性最终产物的产生。基因的表达涉及到该基因的转录和mRNA翻译为前体或成熟蛋白质。“反义抑制”指能够抑制靶标蛋白质的表达的反义RNA转录物的产生。“共抑制”指能够抑制相同的或本质上类似的外来或内源基因的表达的正义RNA转录物的产生(美国专利5,231,020)。

“成熟”蛋白质指经过翻译后加工的多肽，即已除去了初级翻译产物中存在的任何前肽(prepeptide或propeptide)的多肽。“前体”蛋白质指mRNA翻译的初级产物，即其中仍存在有前肽。前肽可以是但不限于胞内定位信号。

“稳定转化”指核酸片段向宿主生物的基因组中转移并产生遗传上稳定的遗传特征。相反，“短暂转化”指核酸片段向宿主生物的细胞核或含DNA细胞器转移并导致基因表达，但不发生整合和稳定的遗传特征。含有转化核酸片段的宿主生物称为“转基因”生物。本文所用的术语“转化”既指稳定的转化也指短暂的转化。

本发明所用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的，在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold SpringHarbor，1989(下文称“Sambrook”)中有更详细的描述。

术语“重组(的)”指将序列的两个不同的分开区段进行人工组合，例如通过化学合成或者通过用遗传工程技术对核酸的分离区段进行操纵。

“PCR”或“聚合酶链式反应”是一种用以合成大量的特定DNA区段的技术，由一系列的重复循环组成(Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，CT)。通常，将双链DNA热变性，使与靶标区段的3′边界互补的两个引物在低温下退火，然后在中温下延伸。这三个连续步骤构成一组称为一个循环。

聚合酶链式反应(“PCR”)是一种通过模板的反复复制在短时间里将DNA扩增几百万倍的强大技术。(Mullis et al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263-273(1986)；Erlich et al.，欧洲专利申请第50,424号；欧洲专利申请第84,796号；欧洲专利申请第258,017号；欧洲专利申请第237,362号；Mullis，欧洲专利申请第201,184号；Mullis et al.，美国专利第4,683,202号；Erlich，美国专利第4,582,788号；和Saiki et al.，美国专利第4,683,194号)。该过程采用几组特异性的体外合成寡核苷酸来引发DNA合成。引物的设计取决于待分析的DNA的序列。该技术是通过许多个以下循环(通常20-50个)步骤来进行：高温使模板解链、让引物与模板当中的互补序列退火、然后用DNA聚合酶使模板复制。

PCR反应的产物是这样进行分析：进行琼脂糖凝胶分离，然后进行溴化乙锭染色，再用紫外透照法进行显现。或者，可将放射性dNTP加到PCR中以向产物中掺入标记。在这种情况下，PCR的产物通过将凝胶暴露于X射线片来显现。对PCR产物进行放射标记的额外好处是能对单个扩增产物的水平进行定量。

术语“重组构建物”、“表达构建物”和“重组表达构建物”在本文中可互用。这些术语指可用本领域技术人员公知的标准方法插入到细胞基因组中的遗传材料功能单位。这种构建物可以单独使用，或者可以与载体一起使用。如果使用载体，则载体的选择取决于要用来转化宿主植物的方法，这是本领域技术人员公知的。例如，可以使用质粒。为了成功转化、选择和繁殖包含本发明的任何分离核酸片段的宿主细胞而必须在载体上存在的遗传元件，是技术人员所熟知的。技术人员还会认识到，不同的独立转化事件会导致不同的表达水平和模式(Jones et al.，(1985)EMBO J.4：2411-2418；De Almeida et al.，(1989)Mol.Gen.Genetics 218：78-86)，因此必须对多个事件进行筛选以获得显示所需的表达水平和模式的细胞系。这种筛选可通过DNA的Southern分析、mRNA表达的Northern分析、蛋白质表达的Western分析或者表型分析来实现。

本文所用的“单克隆抗体”意指含有共同的重链和共同的轻链氨基酸序列的抗体的一种抗体分子制品，与之相对的是来自含有不同抗体的混合物的“多克隆”抗体制品。单克隆抗体可通过几种新型技术如噬菌体、细菌、酵母或核糖体展示来产生，也可通过以杂交瘤衍生抗体为例证的经典方法来产生(例如由通过杂交瘤技术如标准的Kohler和Milstein杂交瘤方法((1975)Nature 256：495-497)制备的杂交瘤分泌的抗体)。因此，本发明的非杂交瘤衍生的激动性抗体尽管可能是通过非经典方法衍生得到，但仍称为单克隆抗体。

本文所用的“分离抗体”意指基本上与具有不同抗原特异性的其它抗体分开的抗体(例如，特异性结合球聚体的分离抗体基本上与特异性结合球聚体之外的抗原的抗体分开)。但是，特异性结合球聚体的分离抗体可能对其它抗原具有交叉反应性。此外，分离抗体可以大体上与其它细胞材料和/或化学药品分开。

本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)指抗体的一个或多个保持特异性结合抗原的能力的片段。已证实抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的各片段来执行。这种抗体实施方案还可以是特异性结合两个或多个不同抗原的双特异性、二重特异性或多特异性形式。涵括在术语抗体的“抗原结合部分”当中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，为包含两个通过铰链区中的二硫化物桥接的Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体的单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)，其包含单一可变结构域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的VL和VH两个结构域由分别的基因所编码，但可用重组方法通过合成的接头将它们连接起来，合成的接头使它们能够构成单一的蛋白质链，在该蛋白质链中VL区和VH区能配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Nat/.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这种单链抗体也意在涵括在抗体的“抗原结合部分”这个术语当中。还涵括的有其它形式的单链抗体如双功能抗体。双功能抗体是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达在单一多肽链上，但所用的接头太短，而不能使同一条链上的两个结构域配对，从而迫使这两个结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger，P.，et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448；Poljak，R.J.，et al.(1994)Structure 2：1121-1123)。这种抗体结合部分是本领域公知的(Kontermann和Dubeleds.，Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag.New York.790pp.(ISBN 3-540-41354-5)。

还有，抗体或其抗原结合部分还可以是较大的免疫黏附分子的一部分，该免疫黏附分子是由该抗体或抗体部分与一个或多个其它蛋白质或肽发生共价或非共价缔合而形成。这种免疫黏附分子的实例包括使用链霉亲和素核心区来制作四聚scFv分子(Kipriyanov，S.M.，et al.(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)和使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标签来制作二价和生物素酰化的scFv分子(Kipriyanov，S.M.，et al.(1994)Mol.Immunol.31＝I047-1058)。抗体部分如Fab和F(ab′)₂片段可用常规技术从完整抗体制备，如分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶对完整抗体进行消化来制备。此外，抗体、抗体部分和免疫黏附分子可用本文所述的标准重组DNA技术获得。

本文所用的术语“重组人抗体”意在包括所有通过重组手段制备、表达、产生或分离的人抗体，如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组、组合人抗体库分离的抗体(Hoogenboom H.R.，(1997)TIB Tech.15：62-70；Azzazy H.，和Highsmith W.E.，(2002)Clin.Biochem.35：425-445；Gavilondo J.V.，和Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29：128-145；Hoogenboom H.，和Chames P.(2000)Immunology Today 21：371-378)、从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor，L.D.，et al.(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295；Kellermann S-A.，和Green L.L.(2002)Current Opinion inBiotechnology 13：593-597；Little M.et al(2000)Immunology Today21：364-370)或者通过任何其它涉及到将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的手段制备、表达、产生或分离的抗体。这种重组人抗体具有衍自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是，在某些实施方案中，这种重组人抗体经历体外诱变(或者如果使用人Ig序列的转基因动物的话，经历体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列：它们虽然衍自和关联于人种系VH序列和VL序列，但可能并不在体内人抗体种系库当中天然存在。(另参见Kabat et al..Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242，1991)。但是，本发明的人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变引入的或者通过体内体细胞突变引入的突变)。(另参见Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，New York：ColdSpring Harbor Press，1990)。

术语“嵌合抗体”指包含来自一种物种的重链和轻链可变区序列和来自另一种物种的恒定区序列的抗体，如其中鼠重链和轻链可变区与人恒定区连接在一起的抗体。

术语“CDR移植抗体”指包含来自一种物种的重链和轻链可变区序列、但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列用另一种物种的CDR序列取代的抗体，如具有鼠重链和轻链可变区、其中一个或多个鼠CDR(例如CDR3)已用人CDR序列取代的抗体。

本发明的重组人抗体具有衍自人种系免疫球蛋白序列可变区，且还可包括衍自人种系免疫球蛋白序列的恒定区。(参见Kabat et al.(1991)，出处同上。)但是，在某些实施方案中，这种重组人抗体经历体外诱变(或者如果使用人Ig序列的转基因动物的话，经历体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列：它们虽然衍自和关联于人种系VH序列和VL序列，但可能并不在体内人抗体种系库当中天然存在。不过在某些实施方案中，这种重组抗体是选择性诱变或回复突变或这两种情况的结果。

术语“回复突变”指这样的过程：其中人抗体的一些或全部的体细胞性突变的氨基酸被来自同源种系抗体序列的相应种系残基替代。将本发明人抗体的重链和轻链序列分别与VBASE数据库中的种系序列进行比对，以鉴定出具有最高同源性的序列。VBASE是所有的人种系可变区序列的综合目录，是将包括GenBank和EMBL数据文库的最新发布序列在内的公布序列汇编而成。该数据库是在MRC Centrefor Protein Engineering(Cambridge，UK)开发，作为已测序的人抗体基因的收藏库(网址http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-intro.php？menu＝901)。本发明的人抗体中的差异，通过将编码这种差异性氨基酸的明确核苷酸位置进行突变来回传到种系序列。对于每种氨基酸这样被鉴定为回复突变的候选者的角色，都应研究其在抗原结合中的直接或间接角色，任何在突变后被发现会影响人抗体的任何合宜特性的氨基酸，都不应包括在最终人抗体中。为使要经历回复突变的氨基酸的数量减到最少，可保留那些被发现与最近的种系序列不同、但与第二种系序列中的相应氨基酸相同的氨基酸位置，条件是第二种系序列与本发明的人抗体的序列在所指涉氨基酸的两侧相同和共线性(co-linear)达至少10个、优选12个氨基酸。回复突变可在抗体最优化的任何阶段出现。

“标记结合蛋白”是其中本发明抗体或抗体部分衍生或连接到另一功能分子(例如另一肽或蛋白质)的蛋白质。例如，本发明的标记结合蛋白可通过将本发明抗体或抗体部分(通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其它方式)与一个或多个其它分子实体发生功能连接来衍生，所述分子实体如另一抗体(例如双特异性抗体或双功能抗体)、可检测物剂、细胞毒性剂、药剂和/或能介导该抗体或抗体部分与另一分子的缔合的蛋白质或肽(如链霉亲和素核心区或聚组氨酸标签)。

出于本发明目的，“糖基化结合蛋白”是这样的蛋白质：其中抗体或其抗原结合部分包含一个或多个碳水化合物残基。体内新生的蛋白质可进行进一步的加工，此称翻译后修饰。具体的说，可酶促加入糖(糖基)残基，这个过程称为糖基化。所得的带有共价连接的寡糖侧链的蛋白质称为糖基化蛋白质或糖蛋白。抗体就是在Fc结构域以及可变结构域中有一个或多个碳水化合物残基的糖蛋白。Fc结构域中的碳水化合物残基对Fc结构域的效应子功能具有重要的影响，而对抗体的抗原结合或半衰期的影响最小(R.Jefferis，Biotechnol.Prog.21(2005)，pp.11-16)。与此对比，可变结构域的糖基化可能对抗体的抗原结合活性有影响。可变结构域中的糖基化可能会对抗体结合亲和力有负面影响(这可能是因为位阻所致)(Co，MS.，et al.，Mol.Immunol.(1993)30：1361-1367)，或者可能会导致对抗原的亲和力增加(Wallick，S.C.，et al.，Exp.Med.(1988)168：1099-1109；Wright，A.，et al.，EMBO J.(1991)10：27172723)。此外，可以产生出其中结合蛋白的O-或N-连接糖基化位点已被突变的糖基化位点突变体。本领域技术人员可用标准的公知技术产生出这样的突变体。还设想到了保持有生物活性、但结合活性得到提高或降低的糖基化位点突变体。

此外，可对本发明抗体或抗原结合部分的糖基化加以修饰。例如，可产生出无糖基化抗体(即缺乏糖基化的抗体)。可对糖基化加以改变，以例如提高抗体对抗原的亲和力。这种碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列当中的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可作出一个或多个会导致一个或多个可变区糖基化位点被消除的氨基酸置换，从而消除该位点处的糖基化。这种糖基化会提高抗体对抗原的亲和力。这种方法在国际申请公开说明书WO 03/016466A2及美国专利5,714,350和6,350,861中有更详细的描述，这三个专利每一个都通过引用整体结合到本文中。

另外，可产生出糖基化类型发生改变的修饰抗体，如岩藻糖基残基数量减少的低岩藻糖基化抗体或分叉(bisecting)GlcNAc结构增加的抗体。这种改变了的糖基化模式已证实能提高抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可通过例如在糖基化体系(machinery)发生了改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化体系发生了改变的细胞在本领域中已有描述，可用作宿主细胞来表达本发明的重组抗体从而产生糖基化改变了的抗体。(参见例如Shields，R.L.et al.(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740；Umana et al.(1999)Nat.Biotech.17：176-1，以及欧洲专利EP 1,176,195；国际申请公开号WO 03/035835和WO99/5434280，这些文献和专利的每一个通过引用整体结合到本文中。)

蛋白质糖基化取决于目的蛋白质的氨基酸序列，以及表达该蛋白质的宿主细胞。不同的生物可产生不同的糖基化酶(例如糖基转移酶和糖苷酶)，可有不同的底物(核苷酸糖)可供利用。由于这些因素，蛋白质糖基化模式和糖基残基的组成可随表达特定蛋白质的宿主系统而异。可用于本发明的糖基残基包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰葡糖胺和唾液酸。优选地，糖基化结合蛋白所包含的糖基残基使得糖基化模式是人糖基化模式。

本领域技术人员公知，不同的蛋白质糖基化会导致不同的蛋白质特性。例如，在微生物宿主如酵母中产生并用酵母内源途径糖基化的治疗性蛋白质，与在哺乳动物细胞如CHO细胞系中表达的相同蛋白质相比，其功效会降低。这种糖蛋白还可能在人体中具有免疫原性，并显示给药后体内半衰期减少。人和其它动物中的特异性受体可识别特定的糖基残基，促进蛋白质从血流中的快速清除。其它不良反应可包括蛋白质折叠、溶解度、对蛋白酶的易感性、运输、转运、区室化、分泌、被其它蛋白质或因子的识别、抗原性或变应原性方面的变化。因此，业内人士可能偏好具有特定的糖基化组成和模式的治疗性蛋白质，所述特定的糖基化组成和模式例如相同于或至少类似于在人细胞中或在预期动物对象的物种特异性细胞中产生的糖基化组成和模式。

要表达不同于宿主细胞的糖基化蛋白质的糖基化蛋白质，这可通过将宿主细胞遗传修饰成能表达异源糖基化酶来实现。业内人士使用本领域公知的技术可产生出显示人蛋白质糖基化的抗体或其抗原结合部分。例如，已将酵母菌株遗传修饰成能表达非天然糖基化酶，使得在这些酵母菌株中产生的糖基化蛋白质(糖蛋白)显示的蛋白质糖基化与动物细胞特别是人细胞的相同(美国专利申请公开说明书20040018590和20020137134及国际申请公开说明书WO 05/100584A2)。

此外，本领域技术人员会认识到，可用文库的遗传设计的表达各种糖基化酶的宿主细胞表达目的蛋白质，使得该库中的成员宿主细胞产生出具有不同的糖基化模式的目的蛋白质。业内人士然后可选择和分离出具有特定的新型糖基化模式的目的蛋白质。优选地，具有特别选定的新型糖基化模式的蛋白质显示出改进的或改变的生物特性。

本发明还提供通过对包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物进行免疫，从非人、非小鼠动物产生本发明单克隆抗体的方法。这种动物可用本领域公知的方法来产生。在一个优选的实施方案中，非人动物可以是大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。能产生抗体的无限增殖化杂交瘤可从被免疫动物制备得到。免疫后，将动物处死，将脾B细胞与无限增殖化骨髓瘤细胞融合，这是本领域公知的。参见例如Harlow和Lane，出处同上。在一个优选的实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性细胞系)。在融合和进行抗生素选择后，用抗原(例如球聚体)或其部分或者表达目的抗原的细胞筛选杂交瘤。在一个优选的实施方案中，用酶联免疫测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)、优选ELISA进行初始筛选。国际申请公开说明书WO00/37504(其通过引用结合到本文中)提供了ELISA筛选的一个实例。

对能产生抗体的杂交瘤进行选择、克隆并就合宜特性进行进一步筛选，所述合宜特性包括充沛的杂交瘤生长(robust hybridoma growth)、高抗体生产和适需的抗体特性，这在下文进一步论述。杂交瘤可在同种同基因(syngeneic)型动物中、在缺乏免疫系统的动物例如裸鼠中体内培养和扩展，或者在体外细胞培养物中培养和扩展。选择、克隆和扩展杂交瘤的方法是本领域技术人员公知的。优选地，被免疫动物是能表达人免疫球蛋白基因的非人动物，脾B细胞与衍自该非人动物的相同物种的骨髓瘤融合。

在一个方面，本发明提供能产生旨在用于阿尔兹海默病的治疗、诊断和预防的单克隆抗体的杂交瘤。在一个优选的实施方案中，杂交瘤是小鼠杂交瘤。在另一个优选的实施方案中，杂交瘤在非人、非小鼠物种如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生。在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤与表达抗球聚体的抗体的人细胞发生融合。

如在美国专利5,627,052、国际申请公开说明书WO 92/02551和Babcock，J.S.et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-7848中所述，可用本领域称为选定淋巴细胞抗体方法(selected lymphocyteantibody method(SLAM)的程序从单个分离的淋巴细胞产生重组抗体。在这个方法中，用抗原特异性溶血斑块测定法筛选能分泌目的抗体的单细胞(例如衍自被免疫动物的淋巴细胞)，在该测定中抗原(例如球聚体)或其片段是用接头如生物素与绵羊红细胞偶联，并用来鉴定能分泌对该抗原有特异性的抗体的单细胞。鉴定出能分泌抗体的目的细胞后，通过反转录酶-PCR从细胞拯救出重链和轻链可变区cDNA，然后可将这些可变区在哺乳动物宿主细胞如COS或CHO细胞中在适当的免疫球蛋白恒定区(例如人恒定区)情况下进行表达。用衍自体内选定淋巴细胞的扩增免疫球蛋白序列转染的宿主细胞，然后就可进行进一步的体外分析和选择，例如通过对被转染细胞进行淘选以分离出能表达抗IL-18抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列还可例如通过体外亲和力成熟方法进行体外操作，所述方法例如国际申请公开说明书WO97/29131和国际申请公开说明书WO 00/56772中所述的那些方法。

术语“人源化抗体”指包含来自非人物种(例如小鼠)的重链和轻链可变区序列、但其中VH和/或VL序列的至少一部分已被改变成更加“人样”即更类似于人种系可变序列的抗体。一种类型的人源化抗体是其中人CDR序列被引入到非人VH和VL序列中以替代相应的非人CDR序列的CDR移植抗体。具体的说，术语“人源化抗体”是这样的抗体或其变体、衍生物、类似物或片段：它们能免疫特异性地结合目的抗原，包含有基本上具有人抗体的氨基酸序列的构架(FR)区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。本文在CDR情形中所用的术语“基本(本质)上”指其氨基酸序列与非人抗体CDR的氨基酸序列至少80％、优选至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的CDR。人源化抗体包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域(Fab、Fab′、F(ab′)₂、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的CDR区，所有或基本上所有的构架区是人免疫球蛋白共有序列的构架区。优选地，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)、通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体既含轻链也含至少可变结构域的重链。该抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体只含人源化轻链。在其它实施方案中，人源化抗体只含人源化重链。在特定的实施方案中，人源化抗体只含人源化可变结构域的轻链和/或人源化重链。

人源化抗体可选自免疫球蛋白的任何类别和任何同种型，前者包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，后者包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可包含来自超过一种类别或同种型的序列，且可用本领域公知的技术选择特定的恒定结构域以使所需的效应子功能最优化。

人源化抗体的构架区和CDR区不需要精确对应于亲本序列，例如供体抗体CDR或共有构架可通过置换、插入和/或缺失至少一个氨基酸残基进行诱变，使得在该位点处的CDR或构架残基不对应于供体抗体或共有构架。但是在一个优选的实施方案中，这种突变不会大量发生。通常，至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的人源化抗体残基会对应于亲本FR序列和CDR序列的残基。本文所用的术语“共有构架”指共有免疫球蛋白序列中的构架区。此外，本文所用的术语“共有免疫球蛋白序列”指由相关免疫球蛋白序列家族中的最常出现氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987)。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置都被在该家族中该位置处最常出现的氨基酸所占据。如果两个氨基酸出现频率相等，则任一个都可包括在共有序列中。

术语“活性”包括诸如抗体对抗原的结合特异性/亲和力的活性。

术语“表位”包括任何能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面组(chemically active surface grouping)，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，而在某些实施方案中则可具有特定的三维结构特性和/或特定的电荷特性。表位是被抗体结合的抗原的区域。在某些实施方案中，抗体如果能在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶标抗原，则称之能特异性结合抗原。

本文所用的术语“表面等离子共振”指可以实时生物特异性相互作用进行分析的一种光学现象，该分析是通过例如用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，NJ)检测生物传感器矩阵中的蛋白质浓度变化来进行。更多的描述参见

U.，et al.(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；

U.，et al.(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.，et al.(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；和Johnnson，B.，et al.(1991)Anal.Biochem.198：268-277。

本文所用的术语“K_on”意指抗体与抗原缔合形成抗体/抗原复合物的“缔合速率(on rate)”常数，这是本领域公知的。

本文所用的术语“K_off”意指抗体从抗体/抗原复合物解离的“解离速率(off rate)”常数，这是本领域公知的。

本文所用的术语“K_d”意指特定的抗体-抗原相互作用的“解离常数”，这是本领域公知的。

本文所用的术语“标记结合蛋白”指掺入了标记的蛋白质，该标记使该结合蛋白可以被鉴定。优选地，该标记是可检测标志，例如放射标记氨基酸的掺入或与可被标记亲和素检测的生物素酰化部分的多肽的连接(例如含有能通过光学或比色方法检测的荧光标志或酶促活性的链霉亲和素)。多肽用标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如³H、¹⁴C、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho或¹⁵³Sm)；荧光标记(例如FITC、罗丹明或镧系磷(lanthanidephosphors)；酶标记(例如辣根过氧化物酶、萤光素酶或碱性磷酸酶)；化学发光标志；生物素酰基基团；被第二报道分子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域或表位标签)；和磁性物质如钆螯合物。

术语“抗体缀合物”指与第二化学部分如治疗性或细胞毒性剂发生化学连接的结合蛋白如抗体。这里使用的术语“(物)剂”表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或者从生物材料制备的提取物。优选地，治疗性或细胞毒性剂包括但不限于百日咳毒素、紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质类固醇、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素以及这些物剂的类似物和同系物。

本文所用的术语“晶体”和“结晶的”指以晶体形式存在的抗体或其抗原结合部分。晶体是物质固态的一种形式。

术语“免疫”在本文中指将抗原呈递到免疫系统(immune repertoire)的过程，无论该免疫系统是在天然的遗传上未改变的生物中存在，还是在被修饰成能显示人工的人免疫系统的转基因生物中存在。类似地，“免疫原性制品”是含有会增强抗原的免疫原性的佐剂或其它添加剂的抗原制剂。这方面的一个实例是纯化形式的GLP-1受体与弗氏完全佐剂共注射于小鼠。本文所用的“超免疫(法)”是将免疫原性制剂中的抗原连续、多次呈递给宿主动物以旨在发展出强烈的免疫应答的做法。

测量抗体的结合动力学的一种方式是凭借表面等离子共振。本文所用的术语“表面等离子共振”指一种以实时生物特异性相互作用进行分析的光学现象，该分析是通过例如用Biacore系统(BiacoreInternational，Upsala，Sweden and Piscataway，NJ)检测生物传感器矩阵中的蛋白质浓度变化来进行。更多的描述参见

et al.(1993)Annales de Biologie Clinique(Paris)51：19-26；

et al.(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson et al.(1995)Journal of MolecularRecognition 8：125-131；和Johnnson et al.(1991)Analytical Biochemistry198：268-277。

“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、包衣料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一个或多个以及它们的组合。在许多情况下，优选的是将等渗剂例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠包括在组合物中。药学上可接受的载体还可包含少量的能提高抗体或抗体部分的货架期或有效性的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。

本发明的药物组合物可包括“治疗有效量的”或“预防有效量的”本发明抗体或抗体部分。“治疗有效量”指在必要的剂量下和时间里能有效实现所需的治疗结果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可由本领域技术人员进行确定，它可根据以下各种因素而异：个体的疾病状态、年龄、性别和体重，抗体或抗体部分在个体中引起所需的应答的能力。治疗有效量还是这样的量：在该量下抗体或抗体部分的治疗有效作用超出任何毒性或有害作用。“预防有效量”指在必要的剂量下和时间里能有效实现所需的预防结果的量。通常，由于预防剂量是在疾病早期阶段之前或在疾病早期阶段用于受试者，因此预防有效量会低于治疗有效量。

可将本发明的抗体和抗体部分掺入到适合于例如肠胃外给药的药物组合物中。优选地，可将抗体或抗体部分制备成含有0.1-250mg/ml抗体的可注射溶液。可注射溶液可以是在无色玻璃(flint)或琥珀色玻璃(amber)小瓶、安瓿或预充注射器中的液体剂型或冻干剂型。缓冲剂可以是L-组氨酸(1-50mM)，最好5-10mM，pH 5.0-7.0(最好pH6.0)。其它合适的缓冲剂包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。可使用浓度0-300mM(对于液体剂型最好150mM)的氯化钠来缓和溶液的毒性。对于冻干剂型，可包括抗冻剂，主要是0-10％蔗糖(最好0.5-1.0％)。其它合适的抗冻剂包括海藻糖和乳糖。对于冻干剂型，可包括增量剂(bulking agent)，主要是1-10％甘露糖醇(最好2-4％)。在液体剂型和冻干剂型中都可使用稳定剂，主要是1-50mM L-甲硫氨酸(最好5-10mM)。其它合适的增量剂包括甘氨酸、精氨酸，可作为0-0.05％聚山梨醇酯-80(最好0.005-0.01％)加入。另外的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。

本发明的组合物可以为多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液剂(例如可注射和可输注溶液剂)、分散剂或混悬剂、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于预定的给药方式和治疗应用。典型的优选组合物为可注射或可输注溶液剂形式，如与用于和其它抗体一起对人进行被动免疫的那些组合物相似的组合物。优选的给药方式是胃肠外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)给药。在一个优选的实施方案中，抗体通过静脉内输注或注射给予。在另一个优选的实施方案中，抗体通过肌肉内或皮下注射给予。

通常，治疗用组合物在制造和储藏条件下必须是无菌的和稳定的。组合物可配制成溶液剂、微乳、分散剂、脂质体或者其它与高药物浓度相配的有序结构。无菌可注射溶液剂可这样制备：将活性化合物(即抗体或抗体部分)以所需的量掺入到适当的溶剂中，同时按需一起掺入以上列举的一种成分或其组合，然后进行过滤除菌。分散剂通常是这样制备：将活性化合物掺入到含有基本的分散介质和所需的选自以上列举成分的其它成分的无菌介质中。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌冻干散剂的情况中，优选的制备方法是进行真空干燥和喷雾干燥，从之前进行过无菌过滤的活性成分加上任何另外所需成分的溶液产生出这些成分的粉末。溶液的适当流动性可例如这样来保持：使用包衣料如卵磷脂，在分散剂的情况中维持所需的颗粒大小，和使用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括能延迟吸收的物剂如单硬脂酸盐和明胶来实现。

本发明的抗体和抗体部分可通过多种本领域公知的方法给予，不过对于许多治疗应用，优选的给药途径/方式是皮下注射、静脉内注射或输注。本领域技术人员会认识到，给药途径/方式要依所需的结果而变。在某些实施方案中，可将活性化合物与能保护该化合物免受快速释放的载体一起进行制备，所述载体如为控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。有许多制备这种制剂的方法已申请了专利或者为本领域技术人员所公知。参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分可进行口服给药，例如与惰性稀释剂或可吸收可食用载体一起给予。化合物(如果需要，还有其它成分)还可包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，压制成片剂，或者直接掺入到受试者的膳食中。对于口服治疗给药，可将化合物与赋形剂一起掺合并以可摄取片剂、口含片剂、药片剂(troche)、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafer)等的形式使用。为通过胃肠外给药之外的方式给予本发明化合物，可能需要将该化合物用能防止其失活的材料包衣或者与该材料一起共给予。

还可将辅助性活性化合物掺入到组合物中。在某些实施方案中，可将本发明的抗体或抗体部分与一种或多种可用于治疗阿尔兹海默病或相关疾病或病症的另外治疗药剂一起共配制和/或共给予。例如，可将一种本发明抗体或其抗体部分与一种或多种能结合其它靶标的另外抗体一起共配制和/或共给予。

在某些实施方案中，可将本发明的单克隆抗体或其片段与本领域公知的半衰期延长介质连接。这种介质包括但不限于Fc结构域、聚乙二醇和葡聚糖。这种介质描述于例如美国申请系列号09/428,082和公布的PCT申请号WO 99/25044，出于任何目的这两个专利通过引用结合到本文中。

除了以上论述到的各程序外，从业人员也熟知这样的标准资料：这些资料描述用于大分子(例如DNA分子、质粒等)的构建、操作和分离，用于重组生物的产生和用于克隆的筛选和分离的特定条件和程序(参见例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1989)；Maliga et al.，Methods in PlantMolecular Biology，Cold Spring Harbor Press(1995)；Birren et al.，Genome Analysis：Detecting Genes，1，Cold Spring Harbor，New York(1998)；Birren et al.，Genome Analysis：Analyzing DNA，2，Cold SpringHarbor，New York(1998)；Plant Molecular Biology：A LaboratoryManual，eds.Clark，Springer，New York(1997))。

单克隆抗体的用途

本发明的单克隆抗体(例如8F5和8CF)具有许多值得关注的用途。例如，单克隆抗体可如上所述用于阿尔兹海默病的预防、治疗和诊断。此外，该抗体可用于抗抗体的开发。此外，产生相应抗体的杂交瘤使得能够稳定提供相同单克隆抗体(即试剂)的连续来源，从而保证各种实验以及治疗应用中各抗体之间的同一性。

还有，本发明的方法使得可以制备适量的用于制备其它原料的起始原料，而其它原料又可用来产生单克隆抗体(或其它抗体)供用于治疗阿尔兹海默病。上文提到，所述抗体还可用来进行被动免疫，以预防阿尔兹海默病或者以阿尔兹海默病的相同症状如认知损伤为特征的其它相关神经病症。

在本发明的一个诊断实施方案中，使本发明的抗体(例如8F5)或其部分包被在固体相上(或者存在于液体相中)。然后使试验样品或者说生物样品(例如全血、脑脊髓液、血清等)与固体相进行接触。如果样品中存在抗原(例如球聚体)，这种抗原会结合固体相上的抗体，然后通过直接或间接方法检测。直接方法涉及简单地检测到复合物本身的存在，从而检测到抗原的存在。在间接方法中，将缀合物加到被结合抗原。缀合物包含与信号产生化合物或标记相连接的、能与被结合抗原发生结合的第二抗体。要是该第二抗原与被结合抗原发生结合，信号产生化合物就会产生可测量的信号。于是这种信号表明了抗原在试验样品中的存在。

用于诊断性免疫测定的固体相的实例有多孔材料和无孔材料、乳胶颗粒、磁性颗粒、微颗粒(参见例如美国专利5,705,330)、珠粒、膜、微量滴定孔和塑料管。固体相材料的选择和对缀合物中存在的抗原或抗体进行标记的方法，如果需要的话根据所需的测定模式性能特性来确定。

如上所述，缀合物(或指示试剂)会包含与信号产生化合物或标记连接的抗体(或者也许是抗抗体，视测定法而定)。这一信号产生化合物或“标记”本身是可检测的，或者可与一种或多种另外的化合物反应产生可检测产物。信号产生化合物的实例包括发色团、放射性同位素(例如125I、131I、32P、3H、35S和14C)、化学发光化合物(例如吖啶

(acridinium))、颗粒(可见的或荧光的)、核酸、络合剂或者催化剂如酶(例如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和核糖核酸酶)。在使用酶的情况中(例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)，发色、发荧光或发光的基因底物的加入会导致可检测信号的产生。也可使用其它检测系统如时间分辨荧光、内反射荧光、扩增(例如聚合酶链反应)和拉曼光谱。

可用上述免疫测定法测试的生物流体的实例包括血浆、全血、干全血、血清、脑脊髓液或者组织和细胞的水提取物或有机金属的水提取物。

本发明还涵括检测抗体在试验样品中的存在的方法。这个方法包括以下步骤：(a)使怀疑含有抗体的试验样品与对患者样品中的该抗体有特异性的抗抗体接触，接触的时间和条件足够使抗抗体/抗体复合物得以形成，其中该抗抗体是能结合患者样品中的抗体的本发明抗体；(b)向所得的抗抗体/抗体复合物加入缀合物，该缀合物包含与能够产生可检测信号的信号产生化合物连接的抗原(其能结合该抗抗体)；和(d)通过检测信号产生化合物所产生的信号，检测在试验样品中可能存在的抗体的存在。可使用包含抗该抗抗体的抗体的对照品或校准品。

本发明还包括包含有一种或多种本文所述抗体或其部分及药学上可接受的佐剂(例如弗氏佐剂或磷酸缓冲盐水)的疫苗。

试剂盒也包括在本发明的范围之内。更具体的说，本发明包括用以测定怀疑患有阿尔兹海默病或者别的以认识损害为特征的病症的患者中抗原(例如球聚体)的存在的试剂盒。具体的说，用以测定抗原在试验样品中的存在的试剂盒包含：a)本文所定义的抗体或其片段；和b)包含与能够产生可检测信号的信号产生化合物连接的第二抗体(对该抗原具有特异性)的缀合物。该试剂盒还可含有对照品或校准品以及说明书，该对照品或校准品包含能结合该抗原的试剂，该说明书详述如何使用试剂盒和试剂盒各组分。

本发明还包括用以检测试验样品中的抗体的试剂盒。该试剂盒可包含a)对目的抗体有特异性的抗抗体(例如本发明抗抗体之一)和b)前文所定义的抗原或其部分。也可包括包含有能结合该抗原的试剂的对照品或校准品。更具体的说，该试剂盒可包含a)对该抗体有特异性的抗抗体(如本发明抗抗体之一)和b)包含有与能够产生可检测信号的信号产生化合物连接的抗原(例如球聚体)的缀合物。此外，该试剂盒还可包含对照品或校准品以及说明书或包装插页，该对照品或校准品包含能结合该抗原的试剂，该说明书或包装插页描述应如何使用试剂盒和试剂盒各组分。

该试剂盒还可包含一个容器如小瓶、瓶子(bottle)或条，所述每种容器具有预定(pre-set)固体相，以及含有相应缀合物的其它容器。这些试剂盒还可含有装着为进行测定所需的其它试剂(如洗涤、加工和指示试剂)的小瓶或容器。

还应指出的是，本发明不仅包括上述全长抗体，还包括其部分或片段，例如其Fab部分。另外，本发明涵括任何具有与本发明抗体相同的特性的抗体，所述相同的特性是例如结合特异性、结构等方面的特性。

保藏信息：

能产生单克隆抗体8F5的杂交瘤(ML5-8F5.1F2.2A2)根据布达佩斯条约的条款于2005年12月1日寄存在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110)，分配的保藏号为ATCC No.PTA-7238。

能产生单克隆抗体8C5的杂交瘤(ML5-8C5.2Cl.8E6.2D5)根据布达佩斯条约的条款于2006年2月28日寄存在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110)，分配的保藏号为ATCC No.PTA-7407。

本发明可用以下非限制性实施例进行说明：

实施例I(a)

单克隆抗体8F5和8C5的产生

将Balb/c小鼠用如Barghorn et al.，2005，J Neurochem，95，834-847中所述的50微克Aβ(1-42)球聚体(于CFA(Sigma)中)进行sub-q免疫，并以一个月的时间间隔加强免疫两次。收集脾脏，将脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞以5∶1比例通过PEG程序进行融合。将融合细胞以2×10⁵个细胞/ml、200ml/孔接种在96孔平皿中的重氮丝氨酸/次黄嘌呤选择培养基中。让细胞生长形成可见集落，通过直接ELISA测定法测定上清液的Aβ寡聚体反应性。通过限制性稀释对分泌抗Aβ寡聚体抗体的杂交瘤进行亚克隆，直到抗体表达呈现稳定。

实施例II

8F5和8C5结合Aβ(1-40)和Aβ(1-42)的球聚体优先于结合它们的单体制品

为测试8F5的选择性，使用两种进行了不同的溶解的Aβ(1-42)单体制品，并使用刚制备的Aβ(1-40)作为单体的替代物。进行了两个类型的实验。在第一个实验中，通过夹心ELISA法，以球聚体衍化但是构象异构的(globulomer derived but conformer)非特异性的MAb 6G1(参见S.Barghorn et al.J.Neurochemistry，95：834(2005))作为捕捉抗体，测试8F5对Aβ球聚体的特异性。用生物素酰化8F5作为第二和构象异构(conformer)选择性抗体。这个实验在以下实施例2.1中描述。

在第二个实验(在以下实施例2.2中描述)中，通过斑点印迹免疫测定法分析寡聚体对Aβ(1-42)单体和对Aβ(1-40)单体的选择性。在这个实验中，8F5显示出对Aβ(1-42)球聚体(对比已知抗体4G8，其映射到的区域与8F5类似，但由用线型肽Aβ(17-24)(Abcam Ltd.，Cambridge，MA)进行免疫衍生)的结合优先于对Aβ(1-42)单体的结合和对Aβ(1-40)单体的结合。8C5的试验方案同8F5。

实施例2.1：单克隆抗体8F5和8C5的寡聚体选择性

a)Aβ(1-42)球聚体的制备：

将9mg Aβ(1-42)Fa.Bachem溶于1.5ml HFIP(1.1.1.3.3.3六氟-2-丙醇)中，在37℃下温育1,5h。将所得溶液在SpeedVac中蒸发，悬浮于396μl DMSO(5mM Aβ储备溶液)中。将样品在超声波水浴中超声处理20秒钟，振摇10分钟，在-20℃下储藏过夜。

将样品用4.5ml PBS(20mM NaH₂PO₄；140mM NaCl；pH 7,4)稀释，加入0.5ml 2％SDS水溶液(0.2％SDS含量)。将所得混合物在37℃下温育7小时，用16ml H₂O稀释，在37℃下再温育16小时。然后，将Aβ(1-42)球聚体溶液以3000g离心20分钟。上清液用30KDacentriprep浓缩到0.5ml。将浓缩液在6℃下对5mM NaH₂PO₄；35mMNaCl；pH7.4透析过夜。随后，将Aβ(1-42)球聚体浓缩液以10000g离心10分钟。然后将上清液分成等分试样，在-20℃下储藏。

b)HFIP预处理的单体Aβ(1-42)的制备：

将3mg人Aβ(1-42)(Bachem Inc，目录号H-1368)溶于1.7mlEppendorff管中的0.5ml HFIP(6mg/ml悬浮液)中，在37℃下振摇1.5h(Eppendorff Thermo混合器，1400rpm)，直到获得透明溶液。将样品在speed vac浓缩器中干燥(1.5h)，重悬于13.2μl DMSO中，振摇10秒钟，然后进行超声浴超声处理(20秒钟)，振摇(例如在EppendorffThermo混合器中，1400rpm)10分钟。

加入6ml 20mM NaH₂PO₄；140mM NaCl；0.1％嵌段式聚醚(Pluronic)F68；pH 7.4，在室温下搅拌1小时。将样品在3000g下离心20分钟。弃去上清液，将沉淀溶于0.6ml 20mM NaH₂PO₄；140mMNaCl；1％嵌段式聚醚F68；pH 7.4中。加入3.4ml水，在室温下搅拌1小时，然后以3000g离心20分钟。将上清液以8×0.5ml等分试样在-20℃下储藏。

c)单体Aβ(1-42)的NH₄OH溶液的制备：

将1mg Aβ(1-42)固体粉末(Bachem Inc.，目录号H-1368)溶于0.5ml 0.1％NH₄OH水溶液(刚制备)(2mg/ml)中，立即在室温下振摇30秒钟以获得透明溶液。将样品在-20℃下储藏备用。

d)单体Aβ(1-40)的制备：

将1mg人Aβ(1-40)(Bachem Inc，目录号H-1194)悬浮于Eppendorff管中的0.25ml HFIP(4mg/ml悬浮液)中。将该管在37℃下振摇1.5小时(例如在EppendorffThermo混合器中，1400rpm)以获得透明溶液，然后在speed vac浓缩器中干燥(1.5小时)。将样品重新溶于46μl DMSO(21.7mg/ml溶液)中，振摇10秒钟，然后在超声浴中超声处理20秒钟。振摇(例如在Eppendorff Thermo混合器中，1400rpm)10分钟后，将样品在-20℃下储藏备用。

e)抗Aβ小鼠单克隆抗体8F5的生物素酰化：

将500μl抗Aβ小鼠单克隆抗体8F5于PBS中的溶液(0.64mg/ml)加到刚溶于水的2μl 20mg/ml Sulfo-NHS-生物素(Pierce Inc.，目录号21420)，振摇(例如在EppendorffThermo混合器中，1400rpm)30分钟，在透析管中6℃下对500ml 20mM Na Pi；140mM NaCl；pH 7.4透析16小时。将透析液在-20℃下储藏备用。8C5据此进行生物素酰化。f)Aβ样品的夹心ELISA：

g)试剂目录：

1.F96Cert.Maxisorp NUNC-Immuno Plate，目录号439454

2.结合抗体：抗Aβ小鼠单克隆抗体6G1，溶于PBS中；浓度：0.4mg/ml；在-20℃下储藏

3.包被缓冲液：100mM碳酸氢钠；pH 9.6

4.ELISA封闭剂；Roche Diagnostics GmbH，目录号1112589

5.PBST缓冲液：

20mM NaH₂PO₄；140mM NaCl；0.05％Tween 20；pH 7.4

6.牛清蛋白部分V(albumin bovine fraction V)，无蛋白酶；Serva，目录号11926.03；4℃下储藏

7.PBST+0.5％BSA缓冲液：

20mM NaH₂PO₄；140mM NaCl；0.05％Tween 20；pH 7.4+0.5％BSA

8.Aβ(1-42)球聚体标准储备液：5mM NaH₂PO₄；35mM NaCl的溶液；pH7.4；浓度：10.77mg/ml；-20℃下储藏

9.Aβ(1-42)单体HFIP处理标准储备液：3mM NaH₂PO₄；21mMNaCl；0.15％嵌段式聚醚F68的溶液；pH 7.4；浓度：0.45mg/ml；-20℃下储藏

10.Aβ(1-42)单体于NH₄OH中的标准储备溶液；于0.1％NH₄OH中的溶液；浓度：2mg/ml；-20℃下储藏

11.Aβ(1-40)单体HFIP处理标准储备液：于DMSO中的溶液；浓度：21.7mg/ml；-20℃下储藏

12.生物素酰化的抗Aβ小鼠单克隆抗体克隆8F5；于PBS中的溶液；浓度：0.24mg/ml；-80℃下储藏

13.链霉亲和素-POD缀合物；Fa.Roche，目录号1089153

14.染色：TMB；Roche Diagnostics GmbH，目录号92817060；42mM DMSO溶液；3％H₂O₂水溶液；100mM乙酸钠pH 4.9

15.通过加入2M磺酸溶液停止染色

试剂的制备：

采用以下方案：

1.结合抗体

将单克隆6G1储备溶液解冻，在包被缓冲液中1∶400稀释。

2.封闭剂：将封闭剂溶于100ml水中制备封闭储备溶液，以10ml的等分试样在-20℃下储藏。对于每个要封闭的板，将3ml封闭储备溶液用27ml水稀释。

3.Aβ标准溶液：

a)Aβ(1-42)球聚体

-将1μl Aβ(1-42)球聚体标准储备溶液加到1076μl PBST+0.5％BSA＝10μg/ml

-将50μl 10μg/ml Aβ(1-42)球聚体标准溶液加到4950μl PBST+0.5％BSA＝100ng/ml

b)Aβ(1-42)单体，HFIP处理

-将10μl Aβ(1-42)单体HFIP预处理标准储备溶液加到440μl PBST+0.5％BSA＝10μg/ml

-将50μl10μg/ml Aβ(1-42)单体HFIP预处理标准溶液加到4950μlPBST+0.5％BSA＝100ng/ml

c)Aβ(1-42)单体于NH₄OH中的溶液

-将5μl Aβ(1-42)单体于NH₄OH中的标准储备溶液加到995μlPBST+0.5％BSA＝10μg/ml

-将50μl 10μg/ml Aβ(1-42)单体于NH₄OH中的标准溶液加到4950μl PBST+0.5％BSA＝100ng/ml

d)Aβ(1-40)单体，HFIP预处理

-将1μl Aβ(1-40)单体HFIP预处理标准储备溶液加到49μl PBST+0.5％BSA＝430μg/ml

-将10μl 430μg/ml Aβ(1-40)单体HFIP预处理标准储备溶液加到420μl PBST+0.5％BSA＝10μg/ml

-将50μl10μg/ml AB(1-40)单体HFIP预处理标准溶液加到4950μlPBST+0.5％BSA＝100ng/ml

标准曲线：

编号储备溶液 PBST+0.5％BSA

最终浓度

1 2ml S 0ml

100ng/ml

2 0.633ml(1) 1.367ml

31.6ng/ml

3 0.633ml(2) 1.367ml

10ng/ml

4 0.633ml(3) 1.367ml

3.16ng/ml

5 0.633ml(4) 1.367ml

1ng/ml

6 0.633ml(5) 1.367ml

0.32ng/ml

7 0.633ml(6) 1.367ml

0.1ng/ml

8 0ml 2ml

0.0ng/ml

1.第一抗体：生物素酰化的单克隆抗体8F5：

将浓缩的生物素酰化抗Aβ单克隆抗体8F5在PBST+0.5％BSA缓冲液中稀释。稀释系数为1/1200＝0.2μg/ml。将抗体立即使用。

2.标记试剂：

使链霉亲和素-POD缀合物冻干品在0.5ml水中复原。加入500μl甘油，以100μl的等分试样在-20℃下储藏备用。

将浓缩的标记试剂在PBST缓冲液中稀释。

稀释系数为1/10000。立即使用。

3.染色溶液TMB：

将20ml100mM乙酸钠pH 4.9与200μl TMB溶液和29.5μl 3％过氧化物溶液进行混合。立即使用。

样品板设置：(注意所有的标准品均重复进行两次)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
B	31.6	31.6	31.6	31.6	31.6	31.6	31.6	31.6	31.6	31.6	31.6	31.6
													C	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
D	3.16	3.16	3.16	3.16	3.16	3.16	3.16	3.16	3.16	3.16	3.16	3.16
													E	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
F	0.32	0.32	0.32	0.32	0.32	0.32	0.32	0.32	0.32	0.32	0.32	0.32
													G	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
H	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0

所采用的程序：

1.每孔加入100μl抗Aβ小鼠单克隆抗体6G1溶液，在4℃下温育过夜。

2.弃去抗体溶液，用250μl PBST缓冲液洗涤各孔三次。

3.每孔加入260μl封闭溶液，在室温下温育2小时。

4.弃去封闭溶液，用250μl PBST缓冲液洗涤各孔三次。

5.标准品制备后，将标准品以100μl/孔加到板中。在室温下温育2小时，并在4℃下温育过夜。

6.弃去标准溶液，用250μl PBST缓冲液洗涤各孔三次。

7.每孔加入200μl生物素酰化的第一抗体8F5溶液，在室温下温育1.5小时。

8.弃去抗体溶液，用250μl PBST缓冲液洗涤各孔三次。

9.每孔加入200μl标记溶液，在室温下温育1小时。

10.弃去标记溶液，用250μl PBST缓冲液洗涤各孔三次。

11.向每孔加入100μl TMB溶液，在室温下温育(5-15分钟)。

12.观察染色情况，在背景染色开始后每孔加入50μl终止溶液。

13.在450nm下进行UV读数。

14.从标准曲线计算结果。

15.进行评估

抗体8F5的结果在图1中显示，抗体8C5的结果在图8中显示。在Log EC50值方面，相比于两种不同制备的Aβ(1-42)单体(分别为2.745和3.003)和Aβ(1-40)单体(2.825)的较低值，Aβ(1-42)球聚体抗原(1.958)明显最低。这些数据表明，抗体8F5对Aβ(1-42)球聚体的选择性为对Aβ(1-42)单体的选择性的约10倍。

在抗体8C5上也获得几乎相同的结果，在图8中显示。

实施例2.2：单克隆抗体8F5和8C5的寡聚体选择性

-通过斑点印迹方法区别Aβ单体和Aβ球聚体：8F5和8C5与4G8的比较。

用PBS对Aβ(1-42)球聚体、Aβ1-42单体和Aβ1-40单体进行稀释，浓度范围为100pmol/μl-0.01pmol/μl。将每个样品取1μl点滴到硝酸纤维素膜上。将小鼠单克隆抗体4G8和8F5(0.2μg/ml)以及与碱性磷酸酶偶联的抗小鼠IgG作为第二抗体和染色试剂NBT/BCIP(RocheDiagnostics，Mannheim)一起用于检测。通过显像密度计(GS 800，Biorad，Hercules，CA，USA)在10pmol的抗原浓度下对检测信号分析其强度(反射密度＝RD)。在此浓度下，对于每种Aβ形式，所测得的反射密度都在显像密度计检测的线性范围内。另一种抗体8C5也以类似的方案进行使用。结果在下表1中显示：

表1：Aβ1-40单体和Aβ1-42单体的抗Aβ抗体的区别。该区别计算为Aβ1-42球聚体和Aβ1-42单体分别与Aβ1-40单体的检测信号比。

具体的说，以上结果表明，8F5和8C5与市售可得的映射到Aβ(17-24)(即线型序列)的抗Aβ(1-42)抗体4G8相比显示出不同的结合谱(binding profile)。更具体的说，8F5和8C5显示出对球聚体的结合优先于对Aβ42单体的结合(参见第4列；比较1.4与1)和对球聚体的结合优先于对Aβ40的结合(第5列；比较16.9与4.2)。这两个相对于标准4G8的改进的结合选择性，如上所述应导致在使用8F5和/或8C5时副作用的产生更少(例如蚀斑结合)。

实施例III

8F5和8C5与AB(1-42)原纤维的结合

由于8F5抗体是针对可溶性球聚体而产生的，猜测认为8F5应该不会结合沉积的斑块或原纤维材料。因此，如以下实施例所述对8F5与聚合的Aβ原纤维悬浮液的结合进行测试。

Aβ(1-42)原纤维的制备：

将1mg Aβ(1-42)(Bachem Inc.，目录号：H-1368)溶于500μl 0.1％NH₄OH(Eppendorff管)水溶液中，将样品在室温下搅拌1分钟，然后以10000g离心5分钟。将上清液吸取到新的Eppendorff管中，按照Bradford蛋白质浓度测定法(BIO-RAD Inc.测定程序)测量Aβ(1-42)浓度。

将100μl的这一刚制备的Aβ(1-42)溶液用300μl 20mM NaH₂PO₄；140mM NaCl；pH 7.4中和，然后用2％HCl调pH 7.4。将样品在37°C下再温育20小时，离心(10min，10000g)。弃去上清液，将原纤维沉淀用400μl 20mM NaH₂PO₄；140mM NaCl；pH 7.4在Vortex混合器上搅拌1分钟进行重悬，然后进行离心(10min，10000g)。弃去上清液后，重复此重悬程序，对最终原纤维悬浮液再进行离心沉淀(10min，10000g)。再次弃去上清液，将最终沉淀在Vortex混合器上搅拌1分钟重悬于380μl 20mM NaH₂PO₄；140mM NaCl；pH7.4中。将所得样品的等分试样在冷藏器中-20℃下储藏。

将80μl原纤维悬浮液与320μl 20mM NaH₂PO₄；140mM NaCl；0.05％Tween 20；pH 7.4缓冲液进行混合，在室温下搅拌5分钟，然后进行超声处理(20秒钟)。离心(10min，10000g)后，将沉淀在Vortex混合器中搅拌重悬于190μl 20mM NaH₂PO₄；140mM NaCl；0.05％Tween20；pH 7.4中。

-抗体与Aβ(1-42)原纤维的结合

将此原纤维悬浮液的10μl等分试样与以下物质一起进行温育：

a)10μl 20mM Na Pi；140mM NaCl；pH 7.4

b)10μl 0.1μg/μl单克隆抗体6E10Signet Inc.目录号9320，20mM

c)NaH₂PO₄；140mM NaCl；pH 7.4

d)10μl 0.1μg/μl单克隆抗体4G8Signetlnc.目录号9220，20mM NaPi；140mM NaCl；pH 7.4中

e)10μl 0.1μg/μl单克隆抗体8F5(8C5)，于20mM Na Pi；140mMNaCl；pH 7.4中

将样品在37℃下温育20小时。最后将样品离心(10min，10000g)。收集含有未结合抗体级分的上清液，与20μl SDS-PAGE样品缓冲液混合。将沉淀级分用50μl 20mM NaH₂PO₄；140mM NaCl；pH 7.4缓冲液在Vortex混合器中搅拌1分钟进行洗涤，然后离心(10min，10000g)。将最终沉淀重悬于20μl 20mM Na Pi；140mM NaCl；0.025％Tween 20；pH 7.4缓冲液中，并溶于20μl SDS-PAGE缓冲液中。

-SDS-PAGE分析

将上清液和重悬沉淀样品在98℃下加热5分钟，在以下条件下加样到4-20％Tris/Glycin Gel上。

SDS样品缓冲液：0.3g SDS；0.77g DTT；4ml1M Tris/HCl pH 6.8；8ml甘油；1ml1％溴酚蓝乙醇溶液；加水到50ml 4-20％Tris/Glycin Gel：Invitrogen Inc.，No.：EC6025BOX中。

电泳缓冲液：7.5g Tris；36g甘氨酸；2.5g SDS；加水到2.51。

在20mA下进行PAGE。凝胶进行考马斯蓝R250染色。

结果

SDS-PAGE的考马斯蓝染色表明，抗体的重链和轻链主要存在于原纤维悬浮液的上清液中(泳道7，图2)，原纤维悬浮液的剩余部分显示极少的抗体物质，同时还显示4.5kDa的部分解聚Aβ。与8F5和8C5不同的是，相比于原纤维结合级分(泳道6，图2)，其它抗Aβ抗体不在可溶性级分中出现(6E10，泳道3，图2)，或者部分地出现(4G8，泳道5，图2)。

通过测量原纤维结合级分和上清液级分中的抗体重链的反射密度值，从SDS-PAGE分析对与原纤维类型的Aβ的相对结合进行评估，并按照下式进行计算：

原纤维结合抗体级分＝RD_{原纤维级分}×100％/(RD_{原纤维级分}+RD_上清液级 _分)

获得了以下数值：

抗体	原纤维抗体结合级分
		6E10	98％
8F5	16％
		8C5	21％

这些数据表明结合的8F5和8C5与标准抗体6E10相比有显著下降。

实施例IV

内源Aβ(1-42)球聚体相对于Aβ(1-40)的优先结合

基于Aβ的寡聚体概念，重要的是抗Aβ寡聚体抗体也能显示在体内对Aβ(1-42)寡聚体的优先结合，特别是在轻度认知损害和AD患者中优先于Aβ(1-40)的结合。将Aβ(1-42)物质相对于Aβ(1-40)降低的这一想法，用于通过NSAID治疗AD的治疗方法中(Weggen et al.，Nature414，212-216(2001))。据认为，与Aβ(1-40)，那些NSAID降低Aβ(1-42)，在阿尔茨海默病的治疗中显示最佳的功效。Aβ(1-42)/Aβ(1-40)比对于选择性疗法以及对于诊断性目的都是重要的。

用来自阿尔兹海默病患者和MCI患者的CSF样品进行分析。从图3所示和以下描述的结果可以得出结论，8F5具有优于诸如6E10的Aβ抗体的重大优点，因为8F5检测出Aβ(1-42)的比例高于检测出聚集度较低的Aβ(1-40)的比例。这个优点使得可以更有选择性地诊断和中和MCI和AD患者中的Aβ(1-42)型寡聚体。

A)用寡聚体选择性抗Aβ鼠单克隆抗体8F5进行免疫沉淀后MCI和 AD患者的CSF中的内源Aβ(1-42)和Aβ(1-40)水平：

将抗Aβ单克隆抗体固定化于CNBr活化的Sepharose 4B：

a)单克隆抗体6E10Signet Inc.，目录号9320

b)单克隆抗体8F5

将0.4g CNBr活化的Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Bio-techAB，Uppsala，Sweden，Inc.，目录号17-0430-01)加到10ml1mM HCl水溶液中，在室温下温育30分钟。将CNBr活化的Sepharose 4B用10ml1mM HCl洗涤三次，用10ml100mM NaHCO₃；500mM NaCl；pH 8.3洗涤两次。对于每种固定化抗体，将100μlCNBr活化的Sepharose 4B基质加到950μl 0.5mg/ml抗Aβ鼠单克隆抗体溶液(于100mMNaHCO₃；500mM NaCl；pH 8.3中)。在室温下振摇2小时后，将样品以10000g离心5分钟。然后，将500μl 100mM乙醇胺；100mMNaHCO₃；500mM NaCl；pH 8.3缓冲液加到珠粒，将样品在室温下振摇1小时。将抗Aβ鼠单克隆抗体-Sepharose样品以10000g离心5分钟，用500μl 20mM NaH₂PO₄；140mM NaCl；pH 7.4洗涤5次。加入叠氮化钠至0.02％终浓度使样品稳定化，然后在6℃下进行储藏。

免疫沉淀：

a)小鼠单克隆抗体(mMAb)6E10-Sepharose

b)小鼠单克隆抗体(mMAb)8F5-Sepharose

将200μl的人脑脊液样品用200μl 20mM NaH₂PO₄NaH₂PO₄；140mM NaCl；0.05％Tween 20；pH 7.4进行稀释。将这些样品加到2μl抗Aβ小鼠单克隆抗体-Sepharose基质，在室温下搅拌2小时。将样品以10000g离心5分钟。弃去上清液，将抗Aβ小鼠单克隆抗体-Sepharose用50μl PBS洗涤两次，搅拌1分钟后离心(5分钟，10000g)。弃去上清液，接着将Sepharose珠粒悬浮于50μl 2mM NaH₂PO₄NaH₂PO₄；14mM NaCl，pH7.4中，然后在室温下搅拌1分钟，以10000g离心5分钟。在下一个步骤中，将抗Aβ小鼠单克隆抗体-Sepharose珠粒用50μl 50％CH₃CN；0.2％TFA水溶液进行处理。在室温下振摇10分钟后，将样品以10000g离心5分钟。收集上清液并转移到1.5ml Eppendorf管。将样品与50μl水混合，在Speed Vac浓缩器中蒸发。将沉淀重新溶解于4μl 70％HCOOH，在室温下振摇10分钟，用76μl 1M Tris-溶液和720μl 20mM NaH₂PO₄NaH₂PO₄；140mM NaCl；0.05％Tween 20；pH 7.4中和。

用于测定CSF中的Aβ(1-40)、(1-42)单体形式的样品：

a)没有进行免疫沉淀时CSF样品中的Aβ含量：

将158μl CSF用342μl 20mM NaH₂PO₄；140mM NaCl；0.05％Tween 20；pH 7.4进行稀释。将此1∶3.16稀释液进行夹心ELISA，在评估过程中加以考虑。

b)进行免疫沉淀后CSF样品中的Aβ含量：

将得自上述程序的样品进行分析。

用于测定CSF中的Aβ(1-40)的夹心ELISA方案

试剂目录：

1.F96Cert.Maxisorp NUNC-Immuno Plate，目录号439454

2.结合抗体

抗Aβ单克隆抗体克隆6E10；Signet目录号9320；浓度：0.4mg/mlBradford(BioRad)；-20℃下储藏

3.偶联缓冲液

100mM碳酸氢钠；pH9.6

4.ELISA封闭试剂；Roche Diagnostics GmbH，目录号1112589

5.PBST缓冲液

20mM NaH₂PO₄NaH2PO4；140mM NaCl；0.05％Tween 20；pH7.4

6.Aβ(1-40)标准品：

Aβ(1-40)固体粉末；Bachem目录号H-1194；-20℃下储藏

7.第一抗体：

抗Aβ(1-40)兔pAb；经亲和纯化；于PBS中的溶液；浓度：0.039mg/ml；

Signet目录号9130-005；-20℃下储藏

8.标记试剂：抗兔-POD缀合物；Fa.Jackson ImmunoResearch目录号111-036-045；

9.染色

TMB；Roche Diagnostics GmbH目录号92817060；42mM于DMSO；3％H₂O₂水溶液；100mM乙酸钠pH 4.9

10.终止溶液2M磺酸

用于制备试剂的方案：

1.结合抗体：

将抗Aβ单克隆抗体6E10(Signet Inc，目录号9320)稀释至终浓度0.7mg/ml。

2.封闭剂：

为了制备封闭储备溶液，将封闭试剂溶于100ml H₂O中，以各为10ml的等分试样在-20℃下储藏。将3ml的封闭储备溶液用27mlH₂O进行稀释，供封闭一个ELISA板。

3.Aβ(1-40)单体形式标准稀释液：

A)Aβ(1-40)单体标准储备液：将0.5mg Aβ(1-40)溶于250μl0.1％NH₄OH中，浓度：2mg/ml；刚制备；立即使用。

B)将5μl Aβ(1-40)单体标准储备溶液加到995μl PBST＝10μg/ml

C)将5μl，10μg/ml Aβ(1-40)单体标准溶液加到4995μl PBST＝10ng/ml

标准曲线：

编号储备溶液 PBST

最终浓度

1 2ml B 0ml

10000pg/ml

2 0.633ml (1) 1.367ml

3160pg/ml

3 0.633ml(2) 1.367ml

1000pg/ml

4 0.633ml (3) 1.367ml

316pg/ml

5 0.633ml (4) 1.367ml

100pg/ml

6 0.633ml(5) 1.367ml

31.6pg/ml

7 0.633ml(6) 1.367ml

10pg/ml

6 0ml 2ml

0.0pg/ml

样品：

IP：免疫沉淀样品

编号样品 PBST

稀释系数

1 0.4mlIP 0ml

直接

2 0.1ml(1) 0.4ml

1∶5

3 0.1ml(2) 0.4ml

1∶25

4 0.1ml(3) 0.4ml

1∶125

4.第一抗体：

将浓缩的抗Aβ(1-40)pAb稀释在PBST缓冲液中稀释。稀释系数为1/200＝0.2μg/ml。立即使用。

5.第二抗体：

将冻干的抗兔-POD缀合物溶于0.5ml H₂O中，与500μl甘油混合。然后将抗体浓缩物以100μl等分试样在-20℃下储藏。将浓缩物在PBST缓冲液中进行1∶10′000稀释。将抗体溶液立即使用。

6.TMB溶液：将20ml的100mM乙酸钠pH 4.9与200μl TMB溶液和29.5μl 3％过氧化氢混合在一起。将此溶液立即使用。

样品板设置：(注意所有的标准品和样品均重复运行两次。)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	10000	10000	U1	U1
B	3160	3160	U2	U2

C	1000	1000	U3	U3
					D	316	316	U4	U4
E	100	100	U5	U5
					F	31.6	31.6	U6	U6
G	10	10	U7	U7
					H	0.0	0.0	U8	U8

U1-U#＝未知样品

所用的程序：

1.每孔加入100μl结合抗体溶液，在4℃下温育过夜。

2.弃去抗体溶液，用250μlPBST缓冲液洗涤各孔三次。

3.每孔加入260μl封闭溶液，在室温下温育2小时。

4.弃去封闭溶液，用250μl PBST缓冲液洗涤各孔三次。

5.标准品和样品制备后，将标准品和样品以100μl/孔加到板中，在室温下温育2小时，并在4℃下温育过夜。

6.弃去标准品/样品溶液，用250μl PBST缓冲液洗涤各孔三次。

7.每孔加入200μl第一抗体溶液，在室温下温育1.5小时。

8.弃去抗体溶液，用250μl PBST缓冲液洗涤各孔三次。

9.每孔加入200μl标记溶液，在室温下温育1小时。

10.弃去标记溶液，用250μl PBST缓冲液洗涤各孔三次。

11.向每孔加入100μl TMB溶液，在室温下温育(5-15分钟)。

12.观察颜色发展情况，每孔加入50μl终止溶液。

13.在450nm下读数。

14.从标准曲线计算结果。

15.进行评估：

如果未知样品的消光不在校准曲线的线性范围，那么以适当的样品稀释度重复进行ELISA。

用于测定CSF中的Aβ(1-42)单体形式的夹心ELISA方案

试剂目录：

1.F96Cert.Maxisorp NUNC-Immuno Plate目录号439454

2.结合抗体

3.包被缓冲液

100mM碳酸氢钠；pH9.6

4.ELISA封闭剂；Roche Diagnostics GmbH，目录号1112589

5.PBST缓冲液

20mM NaH2PO4NaH2PO4；140mM NaCl；0.05％Tween 20；pH7.4

6.Aβ(1-42)标准品：Aβ(1-42)固体粉末；Bachem目录号H-1368；-20℃下储藏

7.第一抗体：

抗Aβ(1-42)兔pAb；经亲和纯化；经生物素酰化；于PBS中的溶液，含50％甘油；浓度：0.25mg/ml；Signet目录号9137-005；-20℃下储藏

8.标记试剂：

抗兔-POD缀合物；Fa.Jackson ImmunoResearch，目录号111-036-045

9.染色：

TMB；Roche Diagnostics GmbH，目录号92817060；42mM DMSO溶液3％H₂O₂水溶液100mM乙酸钠，pH4.9终止液：2M磺酸

用于制备试剂的方法：

1.结合抗体：

将抗Aβ单克隆抗体克隆6E10以1∶400稀释在包被缓冲液中。

2.封闭剂：将封闭试剂溶于100ml水中制备封闭储备溶液，将各10ml等分试样在-20℃下储藏。对于每个要封闭的板，将3ml封闭储备溶液用27ml水进行稀释。

3.Aβ(1-42)单体形式，标准稀释液：

Aβ(1-42)单体标准储备溶液：将0.5mg Aβ(1-42)溶于250μl0.1％NH₄OH；浓度：2mg/ml；刚制备；立即使用。

将5μl Aβ(1-42)单体标准储备溶液加到995μl PBST＝10μg/ml。

将5μl、10μg/ml Aβ(1-42)单体标准溶液加到4995μl PBST＝10ng/ml。

标准曲线：

编号储备溶液 PBST

最终浓度

1 2ml B 0ml

10000pg/ml

2 0.633ml(1) 1.367ml

3160pg/ml

3 0.633ml(2) 1.367ml

1000pg/ml

4 0.633ml(3) 1.367ml

316pg/ml

5 0.633ml(4) 1.367ml

100pg/ml

6 0.633ml(5) 1.367ml

31.6pg/ml

7 0.633ml(6) 1.367ml

10pg/ml

8 0ml 2ml

0.0pg/ml

样品：

IP：免疫沉淀样品

编号样品 PBST

稀释系数

1 0.4ml IP 0ml

直接

2 0.1ml(1) 0.4ml

1∶5

3 0.1ml(2) 0.4ml

1∶25

4 0.1ml(3) 0.4ml

1∶125

所用的程序：

1.第一抗体：

将浓缩的抗Aβ(1-42)pAb稀释在PBST缓冲液中。稀释系数为1/1250＝0.2μg/ml。立即使用。

2.标记试剂：

使抗兔-POD缀合物冻干品在0.5ml水中复原。加入500μl甘油，将各100μl的等分试样在-20℃下储藏备用。

将浓缩的标记试剂在PBST缓冲液中稀释。稀释系数为1/5000。立即使用。

3.TMB溶液：

样品板设置：(注意所有的标准品和样品均重复运行两次)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	10000	10000	U1	U1
B	3160	3160	U2	U2
													C	1000	1000	U3	U3
D	316	316	U4	U4
													E	100	100	U5	U5
F	31.6	31.6	U6	U6
													0	10	10	U7	U7
H	0.0	0.0	U8	U8

U1-U#＝未知样品

所用的程序：

1.每孔加入100μl结合抗体溶液，在4℃下温育过夜。

2.弃去抗体溶液，用250μl PBST缓冲液洗涤各孔三次。

3.每孔加入260μl封闭溶液，在室温下温育2小时。

4.弃去封闭溶液，用250μl PBST缓冲液洗涤各孔三次。

5.标准品和样品制备后，将标准品和样品以100μl/孔加到板中。在室温下温育2小时，并在4℃下温育过夜。

6.弃去标准品/样品溶液，用250μl PBST缓冲液洗涤各孔三次。

7.每孔加入200μl第一抗体溶液，在室温下温育1.5小时。

8.弃去抗体溶液，用250μl PBST缓冲液洗涤各孔三次。

9.每孔加入200μl标记溶液，在室温下温育1小时。

10.弃去标记溶液，用250μl PBST缓冲液洗涤各孔三次。

11.向每孔加入100μl TMB溶液，在室温下温育(5-15分钟)。

12.观察染色情况，每孔加入50μl终止溶液。

13.在450nm下读数。

14.从标准曲线计算结果。

15.进行评估：

结果

Aβ40ELISA(Slgnet) Aβ42ELISA(Slgnet) Aβ42/40

MCI样品(n＝4) Aβ(1-40) SEM Aβ(1-42) SEM

没有IP 11678,9 2879,4 1242,0 353,5 7,84％

6E10IP 8282,4 2185,7 2035,1 280,9 17,35％

8F5IP 8586,1 2396,8 2654,6 411,4 20,95％

AD样品(n＝2) Aβ(1-40) SEM Aβ(1-42) SEM

没有IP 7297,5 1464,5 843,0 157,5 10,95％

6E10IP 5610,2 28,3 1453,0 14,5 20,57％

8F5IP 4133,9 86,9 1670,2 12,3 28,78％

以上结果表明了以下情况：

a.与非球聚体选择性抗体如6E10相比，球聚体优先抗体如8F5(或8C5)对Aβ42的结合优先于对Aβ40的结合，这不受疾病状态的限制。这个结果表明阿尔兹海默病得到成功治疗，因为将Aβ42优先于Aβ40进行消除被遵循为一种AD治疗的思想(例如通过使用R-氟比洛芬(Flurizan)，R-氟比洛芬在Myriad Inc所公布的临床试验中证明具有AD治疗功效)。这个思想是由S.Weggen等(J Biol Chem.(2003)278(34)：31831-7)公布。结果在图3中显示。

b.患者与健康对照者相比，球聚体优先抗体如8F5(或8C5)结合Aβ42更多过结合Aβ40。这个结果更加说明阿尔兹海默病得到成功治疗，如上所述，将Aβ42优先于Aβ40进行消除被遵循为一种AD治疗思想(例如使用非类固醇的抗炎药物，如R-氟比洛芬)。(参见图3)。B)用球聚体选择性抗Aβ鼠单克隆抗体8F5或8C5进行免疫沉淀后相比于用球聚体非选择性抗体6E10进行免疫沉淀后，人CSF中的内源 Aβ(1-42)和Aβ(1-40)水平：

b1)用Dynabeads M-280绵羊抗小鼠IgG进行免疫沉淀(IP)

Aβ抗体溶液

以下纯抗体是根据标准纯化程序从杂交瘤获得。

-鼠单克隆抗体6E10；Fa.Signet Nr.：9320；1mg/ml于PBS缓冲液中

-鼠单克隆抗体8F5；1.65mg/ml于PBS缓冲液中

-鼠单克隆抗体8C5；1.44mg/ml于PBS缓冲液中

Dynabeads M-280绵羊抗小鼠IgG：

将绵羊抗小鼠IgG(Invitrogen Inc.，目录号112.02)与磁珠(Dynabeads)共价结合。

用单克隆小鼠抗体激活Dynabeads

-将dynabeads(Dynabeads M-280绵羊抗小鼠IgG，Invitrogen；Prod.No.112.02)的储备悬浮液小心振摇，以防止发泡。

-无菌移取1mL，转移到1.5mL反应小瓶中。

-将dynabeads用1mL免疫沉淀(IP)洗涤缓冲液(IP洗涤缓冲液：PBS(20mM NaH₂PO₄，140mM MaCl，pH 7.4)，0.1％(w/v)BSA)洗涤3次5分钟。在洗涤程序过程中，小心除去上清液，同时用磁性分选仪架(magnetic separator stand，MSS)将dynabeads固定化在反应小瓶的侧壁。

-将洗涤过的dynabeads与40μg Aβ抗体在1mL PBS，0.1％(w/v)BSA中一起温育。

-该活化在4℃下振摇温育过夜来进行。

-将活化的dynabeads用1mL IP洗涤缓冲液(PBS(20mMNaH₂PO₄，140mM NaCl，pH 7.4)，0.1％(w/v)BSA)洗涤4次30分钟(再次使用MSS)。

-将活化的dynabeads用1mL PBS，0.1％(w/v)BSA，0.02(w/v)％叠氮化钠重悬；旋涡混合并稍作离心。

-将抗体活化的dynabeads在4℃下储藏备用。

CSF样品制备：

将来自阿尔兹海默病患者的400μL CSF加到4μL完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche Inc.目录号1697498，1片剂溶于1mL水中)，将0.8μL500mM PMSF溶于甲醇中。10分钟后，加入1.6mL 20mMNaH₂PO₄，140mM NaCl，0.05％Tween 20，pH 7.4(PBST)。

人AD-CSF的Aβ物质的免疫沉淀：

将所制备的CSF样品的250μL等分试样加到25μL抗Aβ-Dynabeads悬浮液。

免疫沉淀是在6℃搅拌下进行16小时。随后的洗涤是用1mLPBS/0，1％(w/v)BSA洗涤三次5分钟、最后用1mL 10mM Tris/HCLpH 7.5缓冲液洗涤一次3分钟。在洗涤程序过程中，小心除去上清液，同时用磁性分选仪架(MSS)将dynabeads固定化在反应小瓶的侧壁。

在最后洗涤步骤后，将残余上清液彻底除去。Aβ肽和相应的抗体是这样从Dynabeads除去：将25μL无β-巯基乙醇的样品缓冲液(0.36M Bistris，0.16M N-二甘氨酸，1％SDS(w/v)，15％(w/v)蔗糖，0.004％(w/v)溴酚蓝)加到Eppendorff管，在微量恒温仪中于95℃加热5分钟。冷却到室温后，用磁性分选仪架(MSS)将dynabeads固定化在反应小瓶的侧壁，将上清液转移到另一Eppendorff管(IP洗脱液)。

用尿素-PAGE然后是蛋白质印迹程序对Aβ免疫沉淀物进行分析：

Aβ1-40和Aβ1-42物质的定量是按照H.W.Klafki et al.，AnalyticalBiochemistry 237，24-29(1996)最早描述的、后来也被J.Wiltfang et al.，J.Neurochemistry 81，481-496，2002使用的程序，通过8M尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳系统和随后的蛋白质印迹分析来进行。在实验程序中只作了两个小改动：

1)将积层凝胶中的SDS浓度调至0.25％(w/v)而不是0.1％(w/v)。

2)对于蛋白质印迹，用抗人Aβ(N)(82E1)小鼠IgG单克隆抗体(IBL，目录号10323)替代抗体1E8(Senetek Drug Delivery Technologies Inc.St.Louis，MO，USA)。

将免疫沉淀样品的15μL IP洗脱液等分试样加样到8M尿素PAGE上。在100V下进行电泳(15分钟)，并在60V下继续。当蓝色样品加样染料的运动前锋离凝胶末端还有0.5cm时，停止电泳。

蛋白质印迹程序：

蛋白质印迹分析是在半干燥印迹室(BioRad Inc.，75mA下45分钟)中，在7.5cm ×9cm硝酸纤维素0.45μm(BioRad Inc.)上进行。

印迹缓冲液：6g Tris；28.1g甘氨酸；500mL甲醇；用水调至2.5L。

将硝酸纤维素印迹在PBS中100℃煮沸10分钟。该印迹通过用50mL 5％(w/v)BSA于PBST中的溶液在室温下处理1小时进行饱和。除去流体相后，进行如下的洗涤步骤两次：50mL TTBS(25mMTris/HCl；150mM NaCl缓冲液；0.05％Tween 20；pH 7.5)室温下10分钟，然后50mL TBS(25mM Tris/HCl；150mM NaCl缓冲液；pH7.5)室温下10分钟。对于进一步的显影，将最终洗涤缓冲液从印迹弃去，加入15mL抗体I溶液(0.2μg/mL 82E1＝1∶500于3％(w/v)脱脂奶粉(Lasana Inc.)，于15mL TBS中)，6℃下保持20小时。除去缓冲液后，如上所述进行三个洗涤步骤。将印迹与抗体溶液II(抗小鼠-POD1∶10000稀释于15mL 3％(w/v)脱脂奶粉(于15mL TBS中))一起在室温下温育1小时。除去缓冲液后，如上所述进行三个洗涤步骤。

除去最后的洗涤缓冲液后，将2mL Super Signal West FemtoMaximum Sensitivity Substrate Enhancer和2mL过氧化物溶液进行混合。将刚制备的溶液倒在已在暗处预温育5分钟的印迹上。用VersaDoc成像系统(BioRad)记录化学发光。

成像参数：

-曝光时间180秒。

在30秒、60秒、120秒和180秒后记录照片。

结果是从180秒暴露时间的照片获得。

	Aβ40尿素-PAGE[pg/ml]	Aβ42尿素-PAGE[pg/ml]	比例Aβ42/Aβ40+42×100％
				6E10IP	4389	202	4.4％
8F5IP	1260	112	8.1％
				8C5IP	1202	211	14.9％

以上结果表明，球聚体优先抗体如8F5或8C5与非球聚体选择性抗体如6E10相比，结合人CSF中的Aβ42比结合Aβ40要多。这个结果说明阿尔兹海默病得到成功治疗，如上所述，将Aβ42优先于Aβ40进行消除被遵循为一种AD治疗思想(例如通过使用R-氟比洛芬(参见上文))。

实施例V

8F5在APP转基因小鼠中能改进新物体识别能力

为验证抗体8F5的中和性内部Aβ(1-42)球聚体表位对认知的正向作用，用APP转基因小鼠进行被动免疫实验，在实验中测试该小鼠记住它们曾探究过的物体的能力。一定时间后，延长第一次和第二次碰到物体之间的时间，APP转基因小鼠不能够识别已经探究过的物体。这个实验是基于动物的天然好奇性，对已经探究过的物体明显缺乏兴趣证明了对该物体的识别。

实施例V.1：单克隆抗体8F5能提高识别指数：

动物：

使用FVB xC57B 1背景(APP/L，ReMYND，Leuven，Belgium)的阿尔兹海默病单一转基因小鼠模型的雌性小鼠和FVBxC57B1背景的、作为野生型对照的3月龄阴性同胎仔鼠。所有小鼠在3周龄时通过聚合酶链式反应(PCR)进行基因型分型并得到唯一的身份登记号，一旦得知PCR结果，进行第二次PCR加以核实，然后再开始研究。将所有小鼠进行随机分配和年龄匹配，即通过计算机给予它们随机的号码，随机分配到某个治疗。在研究开始前18天通过处理组将各小鼠关入笼中，以让它们熟悉新的笼子环境。小鼠能自由获得预过滤的无菌水(紫外灯)和标准的鼠粮。该食物是在通风良好的储藏室中在干燥和凉爽的条件下储藏。每日检查水和食物的量，必要时加以供应，每周两次进行更新。将小鼠在颠倒的日夜节律下关养：在标准的RVS T2型金属笼(面积540cm²)中，从下午7时起14小时光亮/10小时黑暗。笼子装有结实的地板和一层垫草。每笼的小鼠数量按照动物福利立法受到限制。在行为试验开始前5天，将小鼠换到macrolon Type 2笼中运到实验室，以适应实验室环境为行为试验做准备。

处理(被动免疫)：

进行了三个单独的实验，其中小鼠(每组至少9只)在第1、8和15天接受腹膜内注射(500μg，240μL/小鼠)。用单克隆抗体6G1、8F5和其它非公开的抗体，所有抗体均溶于磷酸缓冲盐水或者用320μL磷酸缓冲盐水处理小鼠。

新物体识别试验：

在第三次处理的当天进行新物体识别试验。所用的方案遵循Dewachter等(Journal of Neuroscience，2002，22(9)：3445-3453)所描述的方法。让小鼠熟悉Plexiglas开放空间箱(52×52×40cm)1小时，该箱有黑色垂直壁和透明地板，由放置在箱子下方的灯暗淡照明。第二天，将各小鼠放在该箱中，进行10分钟识别试验。在这个试验过程中，将各小鼠分别放入有2个完全相同物体A(橙色圆筒或绿色立方体，大小类似±4cm)的开放空间中，通过计算机化系统(Ethovision，Noldusinformation Technology，Wageningen，Netherlands)记录小鼠探究物体A(当小鼠口鼻朝向该物体距离小于1cm和小鼠朝该物体的方向灵敏地嗅闻时)的持续时间(timeA_A)和频率(Freq_AA)。在进行2.5小时后的10分钟保持试验(第二试验)过程中，将新的物体(物体B，绿色立方体或橙色圆筒)与熟悉的物体(物体A)一起放入开放空间中(分别是Freq_A和Freq_B及Time_A和Time_B)。用识别指数(RI)测量非空间记忆力，识别指数定义为探究新物体的持续时间与探究两个物体的持续时间之比[Time_B/(Time_A+Time_B)×100]。在识别试验过程中探究物体A的持续时间和频率(Time_AA和Freq_AA)用来测量好奇性。

将所有三个研究的接受单克隆抗体6G1或8F5或磷酸缓冲盐水的APP转基因小鼠和接受磷酸缓冲盐水的非转基因同胎仔鼠进行合并，以进行数据分析(图4)。不能区别旧物体和新物体的小鼠其识别指数为50。能识别旧物体的小鼠会优先探究新物体，因此识别指数变成大于50。专门探究新物体的小鼠其识别指数为100。将每组的平均识别指数通过t检验与机会水平(即50)进行比较。将所有各组的平均识别指数也通过ANOVA然后是post-hoc t检验进行比较。PBS组和野生型组之间的差异表明这个示例中的APP转基因小鼠有认知缺损。注射PBS的小鼠以机会水平(即不显著偏离50)发挥，而所有其它小鼠显示物体识别力(图4：星号)。当将抗体处理过的APP转基因小鼠的性能与对照组进行比较时发现，与PBS处理的小鼠有显著差异，但与野生型小鼠比较没有显著差异(图4：圆圈)，表明用抗体8F5进行的处理逆转了这些APP转基因小鼠的认知缺损。

实施例VI

抗体8F5和8C5与淀粉样斑块形式的原纤维淀粉样β肽和老龄APP转基因小鼠和阿尔兹海默病患者脑膜血管中的淀粉样蛋白的特异性反应的原位分析

抗体8F5和8C5显示出对原纤维Aβ肽沉积物的染色减低，这提示它们的治疗作用是通过与可溶性球聚体形式的而不是原纤维沉积形式的Aβ肽结合来介导的。由于抗体与原纤维Aβ肽结合会导致聚集物的快速溶解和随后可溶性Aβ浓度的增加，而后者据认为具有神经毒性并可能导致微出血，因此优选的是能影响可溶性球聚体而不是单体的抗体疗法。

方法：

对于这些实验，使用了几种大脑材料样品：来自两个AD患者的皮层组织(RZ16和RZ 55)和来自19月龄Tg2576小鼠(APPSWE#001349，Taconic，Hudson，NY，USA)或12月龄老的APP/L小鼠(ReMYND，Leuven，Belgium)的皮层组织。

小鼠过量表达带家族性阿尔兹海默病突变的人APP，在大约11月龄时在脑实质中形成β淀粉样沉积物，在大约18月龄时在较大的脑血管中形成β淀粉样沉积物。将小鼠深度麻醉，穿心灌注0.1M磷酸缓冲盐水(PBS)以冲洗血液。然后，从头盖移取大脑，纵向切开。将其中半个大脑急冻(shock-frozen)，另半个大脑通过浸入4％多聚甲醛进行固定。将浸入固定的大脑半球通过在30％蔗糖的PBS溶液中浸泡进行低温保护，然后装在冰冻切片机上。将整个前脑切成40μm横切片，收集在PBS中，用于后面的染色程序。来自阿尔兹海默病患者的新皮层样品是获自德国慕尼黑Brain-Net，为冷冻组织，在解冻过程中在4％多聚甲醛中浸入固定，随后同小鼠组织一样进行处理。

用以下方案对各个切片进行刚果红染色：

材料：

-淀粉样蛋白染料刚果红试剂盒(Sigma-Aldrich；HT-60)，由NaCl酒精溶液、NaOH溶液和刚果红溶液组成。

-染色皿

-显微镜载玻片SuperfrostPlus和盖玻片

-乙醇、二甲苯，包埋介质

试剂：

-NaoH用NaCl溶液1∶100稀释产生碱性盐水

-碱性盐水用刚果红溶液1∶100稀释产生碱性刚果红溶液(在使用前15分钟内制备，过滤)

-将切片装在载玻片上，让它们干燥。

-将载玻片在染色皿中温育，首先是在碱性盐水中温育30-40分钟，然后是在碱性刚果红溶液中温育30-40分钟。

-用新鲜乙醇清洗三次，用二甲苯包埋。

首先对染色用Zeiss Axioplan显微镜(Zeiss，Jena，Germany)进行照相，定性评估。红颜色表明是斑块形式的和在较大脑膜血管中的淀粉样沉积物。之后对抗体染色的评估集中在这些结构。

染色是按照以下方案通过将切片与含有0.07-0.7μg/ml的各个抗体的溶液一起温育来进行：

材料：

-TBST洗涤溶液(Tris缓冲盐水加Tween 20；10x浓缩液；DakoCytomation S3306，DAKO，Hamburg，Germany)1∶10于Aquabidest中)

-0.3％H₂O₂的甲醇溶液

-驴血清(Serotec，Düsseldorf，Germany)，5％TBST溶液，作为封闭血清

-单克隆小鼠抗球聚体抗体，在TBST中以给定浓度稀释。

-第二抗体：生物素酰化的驴抗小鼠抗体(Jackson Immuno/Dianova，Hamburg，Germany；715-065-150；在TBST中1∶500稀释)

-StreptABComplex(DakoCytomation K 0377，DAKO，Hamburg，Germany)

-过氧化物酶底物试剂盒二氨基联苯胺(＝DAB；SK-4100；VectorLaboratories，Burlingame，CA，USA)

-Superfrost Plus显微镜载玻片和盖玻片

-无二甲苯包埋介质(Medite，Burgdorf，Germany；X-tra Kitt)

程序：

-将漂浮的切片转移到用冰冷的0.3％H₂O₂中，温育30分钟

-在TBST缓冲液中洗涤5分钟

-与驴血清/TBST一起温育20分钟

-与第一抗体一起在室温下温育24小时。

-在TBST缓冲液中洗涤5分钟

-与封闭血清一起温育20分钟

-在TBST缓冲液中洗涤5分钟

-与第二抗体一起在周围环境温度下温育60分钟

-在TBST缓冲液中洗涤5分钟

-与StreptABComplex一起在周围环境温度下温育60分钟

-在TBST缓冲液中洗涤5分钟

-与DAB一起温育20分钟

-将切片装在载玻片上，将载玻片风干，用酒精使载玻片脱水，将载玻片包埋

除了在显微镜下对切片进行目视检查外，另外还对淀粉样染色进行定量，做法是用ImagePro 5.0图像分析系统从组织学图像目视切取10个随机选择的斑块，测定它们的平均灰度值。从灰度值计算出光密度值，做法是将淀粉样斑块的密度减去染色材料的平均背景密度(0％-没有超过周围背景的斑块染色，100％-没有透射/最大染色)。用ANOVA检验抗体6E10/4G8分别与6G1、8C5和8F5的差值的统计学显著性。

结果：

所有所述的抗体染色材料证明是亲刚果红淀粉样沉积物(图7(A))。球聚体优先抗体8F5和8C5对Aβ肽的脑实质和脑膜亲刚果红沉积物的染色显著少于对抗体6G1和6E10的染色(图7(B)-(C)，(H))。对脑实质淀粉样斑块染色的定量分析揭示，所有抗体都结合斑块(统计学上显著的超出对照的密度)，但抗体8F5和8C5的结合显著低于参考抗体6E10(针对Aβ的N末端序列)，等于或低于参考抗体4G8(针对Aβ的N末端序列)(图7(D)-图(G))。抗体8F5和8C5与淀粉样沉积物的结合小于能识别Aβ单体或一部分Aβ序列的抗体。用结合原纤维Aβ肽的抗体进行处理会导致大脑组织中的淀粉样斑块的快速溶解和随后可溶性Aβ浓度的增加，而后者据认为具有神经毒性并可能导致微出血，和/或血管淀粉样蛋白的快速溶解，这也会导致微出血。因此，优选能影响可溶性球聚体而不是单体的抗体疗法。