DE10208812A1

DE10208812A1 - Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren

Info

Publication number: DE10208812A1
Application number: DE10208812A
Authority: DE
Inventors: Andreas Renz; Martijn Gipsmans; Ivo Feussner
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2002-03-01
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2003-09-11
Also published as: EP1527182A2; EP1527182A4; BR0307938A; WO2003074716A3; WO2003074715A3; JP2006503546A; WO2003074716A2; AU2003208769A1; AU2003208769A8; WO2003074715A2; CN1656226A; CA2477858A1; AU2003219899A1

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren, bevorzugt von konjugierten mehrfach-ungesättigten Fettsäuren wie konjugierter Linolsäure (CLA) durch transgener Expression von Desaturasen aus Insekten der Ordnung Lepidoptera. Erfindungsgemäß sind ferner transgene Expressionskassetten zur transgenen Expression von Desaturasen aus Insekten der Ordnung Lepidoptera, sowie die mit diesen transformierten transgenen Organismen.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren, bevorzugt von konjugierten mehrfach-ungesättigten Fettsäuren wie konjugierter Linolsäure (CLA) durch transgenen Expression von Desaturasen aus Insekten der Ordnung Lepidoptera. Erfindungsgemäß sind ferner transgene Expressionskassetten zur transgenen Expression von Desaturasen aus Insekten der Ordnung Lepidoptera, sowie die mit diesen transformierten transgene Organismen.
Fettsäuren und Triglyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharmabereich. Besonderes wertvolle und gesuchte ungesättigte Fettsäuren sind die sogenannten konjugierten ungesättigten Fettsäuren. Konjugierte mehrfach ungesättigte Fettsäuren sind im Vergleich zu anderen mehrfach ungesättigte Fettsäuren eher selten. Beispiele für konjugierte Fettsäuren sind die konjugierten Linolsäuren (CLA; conjugated linoleic acid), α-Parinarsäure (18:4 Octadecatetraensäure), Eleostearinsäure (18:3 Octadecatriensäure), die konjugierten Linolensäuren, Dimorphecolsäure und Calendulasäure (siehe Schema 1). Schema 1 Konjugierte polyungesättigte Fettsäuren
CLA ist ein Sammelbegriff für positionelle und strukturelle Isomere der Linolsäure, die sich durch ein konjugiertes Doppelbindungssystem beginnend am Kohlenstoffatom 8, 9, 10 oder 11 auszeichnen. Einige Beispiele sind in Schema 2 angegeben.
Geometrische Isomere existieren für jedes dieser positionellen Isomere, also cis-cis, trans-cis, cis-trans, trans-trans. Schema 2 Vier Isomere der konjugierten Linolsäuren
Die CLA Isomere (9Z,11E)-CLA und (10E,12Z)-CLA sind als die biologisch wirksamen Isomere bekannt. CLA ist überwiegend in Lebensmitteln tierischen Ursprungs enthalten. V. a. im Fleisch und in Milchprodukten von Wiederkäuern sind hohe CLA-Konzentrationen enthalten: ca. 3 bis 4 mg CLA/g Fett in Rind- und Lammfleisch (Chin et al. (1992) J Food Comp Anal 5: 185-197) sowie ca. 3 bis 7 mg CLA/g Fett in Milchprodukten (Dhiman et al. (1999) J Dairy Sci 82: 2146-56), wobei (9Z,11E)-CLA mit ca. 80% jeweils das Hauptisomer ist. Höhere Pflanzen enthalten nur Spuren von CLA wobei beide biologisch aktive CLA-Isomeren bis jetzt nicht in Pflanzen gefunden worden sind.
Für CLA sind eine Reihe positiver Effekte nachgewiesen worden, so reduziert die Verabreichung von CLA das Körperfett in Mensch und Tier bzw. erhöht den Futterumsatz in Körpergewicht bei Tieren (Park et al. (1997) Lipids 32: 853-858; Park et al. (1999) Lipids 34: 235-241; WO 94/16690; WO 96/06605; WO 97/46230; WO 97/46118). Durch Gabe von CLA lassen sich auch beispielsweise Allergien (WO 97/32008) oder Krebs (Banni et al. (1999) Carcinogenesis 20: 1019-1024, Thompson et al. (1997) Cancer Res 57: 5067-5072) positiv beeinflussen. Auch eine antiartheriosklerotische Wirkung von CLA ist belegt (Wilson et al. (2000) Nutr Res 20: 1795-1805). Untersuchungen wurden sowohl mit Isomeren als auch mit Isomerengemischen durchgeführt.
CLA kann synthetisch über alkalische Isomerisierung von Linolsäure hergestellt werden. Großtechnisch werden hierzu v. a. pflanzliche Öle mit einem hohen Gehalt an Linolsäure verwendet, z. B. Sonnenblumenöl oder Distelöl. Erhitzen über 180°C unter alkalischen Bedingungen katalysiert zwei Reaktionen:

1. die Fettsäure-Esterbindungen des Triglyceridgerüsts werden hydrolisiert und die freien Fettsäuren werden freigesetzt.
2. unkonjugierte, ungesättigte Fettsäuren mit zwei oder mehr Doppelbindungen werden konjugiert.

Kommerziell erhältliche CLA-Öle enthalten eine Mischung verschiedener CLA Isomere sowie andere gesättigte und ungesättigte Fettsäuren. Durch die Gegenwart dieser biologisch inaktiven und unnatürlichen Isomere ist eine aufwendige Reinigung der biologisch aktiven Isomere (9Z,11E) CLA und (10E,12Z) CLA notwendig oder es muss gezeigt werden, dass von der Isomerenmischung keine Gefahr für die Gesundheit von Mensch und Tier ausgehen. Bisher ist es nicht möglich, über alkalische Isomerisierung in einem ökonomisch relevanten Verfahren einzelne CLA Isomere herzustellen. Durch fraktionierte Kristallisation ist es möglich, die Isomere (9Z,11E)-CLA bzw. (10E,12Z)-CLA anzureichern. In allen genannten Verfahren ist es aber nicht möglich einzelne Isomere in hoher Qualität herzustellen. Die Reaktionsprodukte werden in den genannten Verfahren üblicherweise zu Methyl- oder Ethylestern umgesetzt, so dass nicht die natürliche Form des CLA, nämlich die freien Fettsäuren oder das Triacylglycerid vorliegen.
Durch Biokatalyse von Linolsäure zu CLA können diese Nachteile der chemischen Umwandlung überwunden werden. Verschiedene Mikroorganismen des Pansens von Wiederkäuern sind zum Beispiel in der Lage, beim Prozess der Biohydrogenierung Linolsäure zu CLA umzusetzen. Dies geschieht unter anderem durch die enzymatische Aktivität einer CLA-Isomerase. Diese Enzymaktivität wurde beschrieben in Butyrivibrio fibrisolvens (Kepler and Tovee (1966) J Biol Chem 241: 1350), Propionibacterium acnes (Deng et al., 1st International Conference on CLA, 2001, Alesund, Norway), Clostridium sporogenes und Lactobacillus reuteri (WO 99/32604; WO 01/00846). Die bisher beschriebenen CLA-Isomerasen verwenden freie Fettsäuren als Substrat. Die Gene kodierend für CLA-Isomerase aus Lactobacillus reuteri und Propionibacterium acnes wurden kloniert, und die Isomerase aus Propionibacterium konnte in heterologe Mikroorganismen funktional exprimiert werden. Die biologische Umsetzung von Linolsäure zu CLA durch Mikroorganismen hat zwar qualitative Vorteile gegenüber der alkalischen Isomerisierung, sie ist aber aufgrund der Fermentationskosten ökonomisch nachteilig und liefert lediglich freie Fettsäuren, aber keine Triglyceride. Freie Fettsäuren haben jedoch nachteilige sensorische Eigenschaften und sind für den Einsatz im Lebens- oder Futtermittelbereich im wesentlichen ungeeignet. Eine nachfolgende Umsetzung der freien Fettsäuren - beispielsweise Glycerin oder Gylceriden unter Lipase-Katalyse - ist möglich, jedoch aufwendig.
Die Übertragung der auf bakteriellen CLA-Isomerasen basierenden Verfahren auf andere Organismen, ist nicht unbedingt möglich. Bisher konnte nachgewiesen werden, dass CLA-Isomerasen freie Linolsäure zu CLA umsetzen (Cepler and Tove (1967) J Biochem Chem 242: 5686-5692). In höheren Organismen, wie beispielsweise Pflanzen, liegt Linolsäure jedoch hauptsächlich in veresterter Form vor. Lipide wie Triacylglyceride stellen die Speicherform dar, Thioester wie Acyl-CoA die aktivierte Form der Fettsäure.
Fettsäuren mit trans-Doppelbindungen sind ausgesprochen selten. Im Samenöl einiger Pflanzen sind Fettsäuren mit Doppelbindungen in trans-Position vorhanden. So ist im Samenöl von verschiedene Thalictrum-Arten eine E5-Fettsäure detektiert worden (Rankoff et al. (1971) J Amer Oil Chem Soc 48: 700-701). Außerdem ist in Aquilegia vulgaris eine E5-Desaturase Aktivität beschrieben worden (Longman et al. (2000) Biochem Soc Trans 28: 641-643). Es sind aber keine Pflanzen beschrieben worden die entweder trans-Vaccensäure (E11-Octadecensäure) oder E10-Octadecensäure enthalten.
Es ist bekannt das die Desaturierung von Fettsäuren in Pflanzen hauptsächlich durch zwei Mechanismen erfolgen kann:

1. In Plastiden werden Fettsäuren-ACP-Ester durch eine lösliche Desaturase vorzugsweise an Position 9 desaturiert und
2. am Endoplasmatischen Reticulum werden Membranlipide, vor allem Phosphatidylcholine, durch Membran-gebundene Desaturasen bevorzugt weiter an Positionen 6, 12 und 15 desaturiert.

In manchen Pflanzen werden konjugierte Fettsäuren durch die Aktivität einer Konjugase hergestellt (Crombie et al. (1984) J Chem Soc Chem Commun 15: 953-955; Crombie et al. (1985) J Chem Soc Perkin Trans 1: 2425-2434; Fritsche et al. (1999) FEBS Letters 462: 249-253; Cahoon et al. (2001) J Biol Chem 276: 2637-2643; Qiu et al. (2001) Plant Physiol 125: 847-855). Die Biosynthese von konjugierte Fettsäuren wie Calendulasäure, Eleostearinsäure oder Punicinsäure läuft über die Desaturierung von Ölsäure zu Linolsäure durch eine Δ12-Desaturase und eine weitere Desaturierung, verbunden mit einer Umlagerung der Z9- oder Z12-Doppelbindung zur Konjutrien Fettsäure durch eine spezifische Konjutrien-bildende Desaturase (Konjugase). Neben der Herstellung von Calendulasäure wird von Qui et al. (2001) Plant Physiol 125: 847-855) auch die Herstellung von konjugierte Linolsäure durch die enzymatische Aktivität der Konjugase beschrieben. Von Nachteil ist bei dieser Nebenaktivität jedoch, dass durch die enzymatische Wirkung das unerwünschte 8,10-Isomer der konjugierte Linolsäure entsteht.
Pheromon-Desaturasen aus Lepidoptera zeigen eine große Diversität an Substratspezifitäten und Desaturierungsmechanismen (Roelofs and Wolf (1988) J Chem Ecol 14: 2019-2031; Roelofs (1995) Proc Nat Acad Sci USA 92: 44-49; Tillman et al. (1999) Insect Biochem 29: 481-514). Diese Enzymaktivitäten bewirken die Herstellung von ungewöhnlichen ungesättigte Fettsäuren-CoA-Derivate verschiedenster Kettenlänge und mit Doppelbindungen an unterschiedliche Positionen und mit unterschiedlichen Konfigurationen. Diese fungieren als Edukt für die Biosynthese von Pheromonen. Liu et. al beschreiben eine E11-Desaturase aus der Pheromondrüse einer Mottenart ("light brown apple moth"), die vermutlich eine Funktion in der Pheromonbiosynthese spielt (Liu WT et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99(2): 620-624.
Es stellte sich daher die Aufgabe, neue Verfahren bereit zu stellen, die zu Trigylceriden mit einem hohen Gehalt an ungesättigten Fettsäuren, bevorzugt konjugierten mehrfach-ungesättigten Fettsäuren wie CLA führen. Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von ungesättigte Fettsäuren umfassenden Trigylceriden durch transgene Expression mindestens einer Fettsäuredesaturase aus Insekten der Ordnung Lepidoptera.
In vielen Organismen, u. a. in Pflanzen, liegen die Fettsäuren im Cytosol hauptsächlich als CoA-Ester vor. In Hefen und Tieren stellt die Desaturierung von Acyl-CoA-Fettsäuren den Hauptsyntheseweg für ungesättigte Fettsäuren dar während in Pflanzen dieser Mechanismus eher selten ist (Cahoon EB et al. (2000) Plant Physiol. 124: 243-251). Überraschenderweise konnte gezeigt werden, dass die transgene Expression von Desaturasen aus Lepidoptera zu einer Desaturierung der gesättigte und ungesättigte Fettsäuren- CoA-Ester führt. Dies führt dazu, dass letztendlich beide aktive CLA-Isomeren hergestellt und in den Speicherlipiden eingebaut werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat insbesondere den Vorteil, das ausgehend von Organismen, bevorzugt Pflanzen, mit hohem Ölgehalt, wie beispielsweise Raps oder Sonnenblume, direkt CLA-enthaltende Triglyceride hergestellt werden können. Die Verwendung eukaryotischer Enzyme aus Insekten der Ordnung Lepidoptera ermöglicht eine gute Expression ohne die mit prokaryotischen Proteinen oft verbundenen toxischen Effekte.
"Fettsäuredesaturasen" meint Enzyme, die in der Lage sind in Fettsäuren oder deren Derivaten, wie beispielsweise bevorzugt Fettsäure-CoA-Estern eine Doppelbindung einzuführen. Dabei können gegebenenfalls Cofaktoren wie NADPH, NADH oder aber auch Sauerstoff zusätzlich erforderlich sein. Dabei sind solche Desaturasen bevorzugt, die Acyl-CoA Fettsäuren als Substrat verwenden können, deren Fettsäure eine Kettenlänge von 14, 16, 18 oder 20 C-Atomen hat, bevorzugt 18 C-Atome.
Bevorzugt umfasst der Begriff der Fettsäuredesaturasen solche Enzyme, die in der Lage sind, in Fettsäuren oder deren Derivaten, wie beispielsweise bevorzugt Fettsäure-CoA-Estern, eine Doppelbindung an der Position C8, C9, C10, C11 oder C12 zu erzeugen. Bevorzugt sind ferner solche Desaturasen, die zu gezielten Strukturisomeren, also spezifisch zu cis oder trans Doppelbindungen führen. Spezifisch heißt dabei, dass das jeweilige Strukturisomer zu mindestens 60%, bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindesten 95% entsteht. Ganz besonders bevorzugt sind Desaturasen, die in Fettsäuren oder deren Derivaten, wie beispielsweise bevorzugt Fettsäure- CoA-Estern eine Doppelbindung generieren, wie sie in einem CLA- Isomer vorkommt.
"Bevorzugte wesentliche Eigenschaft" einer Fettsäuredesaturase aus Lepidoptera meint Enzyme mit mindestens einer der nachfolgenden Eigenschaften:

a) Spezifische Erzeugung einer cis-Doppelbindung in Position C8, C9, C10, C11 oder C12 oder einer trans-Doppelbindung in Position C8, C9, C10, C11 oder C12.
b) Substratspezifität für Fettsäuren, Fettsäure-CoA-Ester oder andere Fettsäurederivate mit einer Kettenlänge der Fettsäure von 16 und/oder 18 C-Atomen. Substratspezifität meint dabei die Eigenschaft einer Fettsäuredesaturase, Substrate mit der angegebenen Kettenlänge schneller umzusetzen als Substrate mit anderer Kettenlänge. Dabei ist die Umdrehungsgeschwindigkeit des bevorzugten Substrates gegenüber den nicht-bevorzugten Substraten um mindestens 50%, bevorzugt mindestens 100%, ganz besonders bevorzugt mindestens 200%, am meisten bevorzugt mindesten 500% erhöht.

Bevorzugt ist mindestens jeweils eine Eigenschaft aus i) oder ii) gegeben.
Fettsäuredesaturasen umfasst Enzyme, die eine isolierte Doppelbindung einführen können, jedoch auch Konjugasen, die ausgehend von einer Doppelbindung in einem Substrat ein konjugiertes Doppelbindungssystem erzeugen können. Dabei wird die erste Doppelbindung bevorzugt verschoben.
Bevorzugt sind beispielsweise Konjugasen, die

a) eine Z11-Doppelbindung in zwei E10 und Z12 Doppelbindungen umwandeln ("Z11-(E10,Z12)-Konjugase"),
b) eine E11-Doppelbindung in zwei E10 und Z12 Doppelbindungen umwandeln ("E11-(E10,Z12)-Konjugase"),
c) eine Z10-Doppelbindung in zwei E10 und Z12 Doppelbindungen umwandeln ("Z10-(E10,Z12)-Konjugase").

Zusammengefasst können diese Enzyme als (E10,Z12)-Konjugasen bezeichnet werden. Diese Enzyme können auch als E10-Desaturasen gelten. Die wesentliche Eigenschaft der ganz besonders bevorzugten E10-Desaturasen ist die Einführung einer trans-Doppelbindung in Position C-10 einer Fettsäure oder eines Fettsäure-CoA-Esters, wobei die Fettsäure eine Kettenlänge von 18 C-Atomen hat.
Ferner bevorzugt sind Konjugasen, die

a) eine Z10-Doppelbindung in zwei Z9 und E11 Doppelbindungen umwandeln ("Z10-(Z9,E11)-Konjugase"),
b) eine E10-Doppelbindung in zwei Z9 und E11 Doppelbindungen umwandelt ("E10-(Z9,E11)-Konjugase")
c) eine Z11-Doppelbindung in zwei Z9 und E11 Doppelbindungen umwandelt ("Z11-(Z9,E11)-Konjugase").

Zusammengefasst können diese Enzyme als (Z9,E11)-Konjugasen bezeichnet werden. Diese Enzyme können auch als E11-Desaturasen gelten. Die wesentliche Eigenschaft der ganz besonders bevorzugten E11-Desaturasen ist die Einführung einer trans-Doppelbindung in Position C11 einer Fettsäure oder eines Fettsäure-CoA-Esters, wobei die Fettsäure eine Kettenlänge von 18 C-Atomen hat.
Am meisten bevorzugt sind E10-, E11-, Z10- und Z11-Desaturasen, sowie Z11-(E10,Z12)-Konjugase, E11-(E10,Z12)-Konjugase, Z10-(Z9,E11)-Konjugase und E10-(Z9,E11)-Konjugase mit einer Substratspezifität für Fettsäure oder Fettsäure-Derivate wie Fettsäure-CoA-Ester mit einer Fettsäure-Kettenlänge von 18 C-Atomen.
Bevorzugt stammen die Fettsäuredesaturasen aus einer Lepidoptera- Familie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acrolepiidae, Agaristidae, Arctiidae, Bombycidae, Carposinidae, Cochylidae, Cossidae, Eriocraniidae, Gelechiidae, Geometridae, Gracillariidae, Hepialidae, Ithomiidae, Lasiocampidae, Lycaenidae, Lymantriidae, Lyonetiidae, Nepticulidae, Noctuidae, Notodontidae, Nymphalidae, Oecophoridae, Papilionidae, Pieridae, Psychidae, Pterophoridae, Pyralidae, Saturniidae, Sesiidae, Sphingidae, Tortricidae, Yponomeutidae und Zygaenidae. Insbesondere bevorzugt sind Fettsäuredesaturasen aus einer Lepidoptera-Familie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tortricidae, Pyralidae, Papilionidae, Noctuidae und Geometridae.
E11-Desaturasen bzw. die für diese kodierenden Nukleinsäuresequenzen werden bevorzugt aus Organismen der Arten Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Leucinodes orbonalis, Ostrinia nubilalis, Sesamia grisescens, Brachmia macroscopa, Paraargyresthia japonica, Mnesictena flavidalis, Telorta edentata, Epiplema moza, Argyresthia chamaecypariae, Bradina sp., Dichrocrocis punctiferalis, Cryptoblabes gnidiella, Palpita unionalis, Sceliodes cordalis, Anisodes sp., Caloptilia theivora, Phyllonorycter ringoniella, Deilephila elpenor, Manduca sexta, Scirpophaga excerpalis, Scirpophaga nivella, Andraca bipunctata oder Diatraea saccharalis isoliert. Besonders bevorzugt werden die E11-Desaturasen bzw. die dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus den Pheromondrüsen vorgenannter Insekten isoliert. Beispielhaft sei die E11-Desaturase aus den Pheromondrüsen der "light brown apple moth" (Epiphyas postvittana) (SEQ ID NO: 2), aus Ostrinia nubilalis (SEQ ID NO: 4) und aus Ostrinia furnicalis (SEQ ID NO: 6) zu nennen. Die E11-Desaturasen aus genannten Organismen nehmen die pflanzlichen Acyl-CoA Fettsäurederivate als Substrat an.
E10-Desaturasen bzw. die für diese kodierenden Nukleinsäuresequenzen werden bevorzugt aus Organismen der Arten Dichrocrocis chlorophanta, Dichrocrocis punctiferalis, Bombyx mandarina, Bombyx mori, Coloradia velda, Hemileuca eglanterina, Hemileuca electra electra, Hemileuca electra mojavensis, Hemileuca nuttalli oder Notarcha derogata isoliert. Besonders bevorzugt werden die E10-Desaturasen bzw. die dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus den Pheromondrüsen vorgenannter Insekten isoliert.
E9-Desaturasen bzw. die für diese kodierenden Nukleinsäuresequenzen werden bevorzugt aus Organismen der Arten Epiplema plaqifera, Phyllonorycter coryli, Phyllonorycter harrisella, Phyllonorycter sylvella, Gelechiinae, Bryotropha sp., Bryotropha terrella, Gelechia betulae, Adoxophyes orana, Exartema appendiceum, Zeiraphera canadensis, Loxostege neobliteralis, Ostrinia nubilalis, Dioryctria clarioralis, Dioryctria merkeli, Dioryctria resinosella, Spodoptera exigua, Spodoptera triturata oder Polia grandis isoliert. Besonders bevorzugt werden die E9-Desaturasen bzw. die dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus den Pheromondrüsen vorgenannter Insekten isoliert.
E8-Desaturasen bzw. die für diese kodierenden Nukleinsäuresequenzen werden bevorzugt aus Organismen der Arten Phyllonorycter saportella, Phyllonorycter sp. oder Dichrocrocis punctiferalis isoliert. Besonders bevorzugt werden die E8-Desaturasen bzw. die dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus den Pheromondrüsen vorgenannter Insekten isoliert.
Z11-Desaturasen, wie sie zur Herstellung der Z11-Octadecensäure vorteilhaft eingesetzt werden können, sind beschrieben für Bombyx mori (Ando et al. (1988) Agric Biol Chem. 52: 473-478), Trichoplusia ni und Helicoverpa zea (Knipple et al. (1998) Proc Nat Acad Sci USA 95: 15287-15292). Weitere Z11-Desaturasen bzw. die für sie kodierenden Nukleinsäuresequenzen können bevorzugt aus Manduca sexta, Diatraea grandiosella, Earias insulana, Earias vittella, Plutella xylostella, Bombyx mori oder Diaphania nitidalis isoliert werden. Beispielhaft seien die Desaturasen aus Helicoverpa zea (SEQ ID NO: 8), Trichoplusia ni (SEQ ID NO: 10) und Argyrotaenia velutinana (SEQ ID NO: 12) zu nennen. Besonders bevorzugt werden Z11-Desaturasen bzw. die dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus Pheromondrüsen vorgenannter Insekten isoliert.
Z10-Desaturasen bzw. die für sie kodierenden Nukleinsäuresequenzen werden bevorzugt aus Organismen der Arten Ctenopseustis filicis, Pseudexentera spoliana, Hemileuca eglanterina, Hemileuca electra electra, Hemileuca electra mojavensis, Hemileuca nuttalli, Eurhodope advenella, Mamestra configurata oder Dichrocrocis punctiferalis isoliert, besonders bevorzugt aus den Pheromondrüsen vorgenannter Insekten. Beispielhaft sei die Desaturase aus Planototrix octo (SEQ ID NO: 14) zu nennen.
(E10,Z12)-Konjugasen bzw. die für diese kodierenden Nukleinsäuresequenzen können vorteilhaft aus Bombyx mori, Phyllonorycter crataegella, Amorbia cuneana, Notocelia incarnatana, Notocelia uddmanniana, Bombyx mandarina, Coloradia velda, Hemileuca eglanterina, Hemileuca electra electra, Hemileuca electra mojavensis, Hemileuca nuttalli, Notarcha derogata, Rondotia menciana, Amphion floridensis, Hyles gallii, Hyloicus pinastri, Manduca sexta, Sphinx drupiferarum, Earias insulana, Nola confusalis oder Notarcha basipunctalis isoliert werden. Besonders bevorzugt werden die (E10,Z12)-Konjugasen bzw. die dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus den Pheromondrüsen vorgenannter Insekten isoliert.
(Z9,E11)-Konjugasen bzw. die für diese kodierenden Nukleinsäuresequenzen können vorteilhaft aus Diatraea saccharalis, Xyrosaris lichneuta, Dioryctria abietella, Stenoma cecropia, Phalonidia manniana, Pselnophorus vilis, Dioryctria abietella; Dioryctria rubella, Myelopsis tetricella, Jodis lactearia, Scopula personata, Spodoptera descoinsi, Spodoptera eridania, Spodoptera latifascia, Spodoptera littoralis oder Spodoptera litura isoliert werden. Besonders bevorzugt werden die (Z9,E11)-Konjugasen bzw. die dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus den Pheromondrüsen vorgenannter Insekten isoliert.
Sowohl Z11-Desaturasen als auch Z11-Konjugasen nehmen die pflanzlichen Acyl-CoA Fettsäurederivate als Substrat an, und die kombinierte Expression dieser beider Klassen von Desaturasen aus Lepidoptera in Pflanzen führt zu einer Herstellung von (10E,12Z)-CLA, welches in den Speicherlipiden eingebaut wird.
Verschiedene Möglichkeiten der Kombination der Konjugasen oder Desaturasen miteinander oder pflanzlichen Enzymen gibt es, um die gewünschten CLA-Isomere, insbesondere (9Z,11E)-CLA und (10E,12Z)-CLA herzustellen. Nachstehende Verfahren sind beispielhaft jedoch nicht einschränkend zu verstehen:

1. Ausgehend von Stearinsäure über trans-Desaturierung an Position C-11 - beispielsweise durch eine E11-Desaturase - trans- Vaccensäure hergestellt werden (Schema 3).
Schema 3 Biosynthesewege zur Herstellung von (9Z,11E)-CLA und (10E,12Z)-CLA ausgehend von Stearinsäure

Ausgehend von Palmitinsäure wird über trans-Desaturierung an Position C-9 - beispielsweise durch eine E9-Desaturase - Palmitelaidinsäure (9E-Hexadecensäure) hergestellt. Diese kann anschließend über die enzymatische Aktivität einer Elongase zu trans-Vaccensäure verlängert werden (Schema 4).
Schema 4 Biosynthesewege zur Herstellung von (9Z,11E)-CLA und (10E,12Z)-CLA ausgehend von Palmitinsäure

Trans-Vaccensäure kann dann von einer Δ9-Desaturase zum (9Z,11E)-CLA Isomer umgesetzt werden. Für Säugetiere und Mensch konnte gezeigt werden, dass trans-Vaccensäure durch die enzymatische Aktivität einer endogenen Δ9-Desaturase zu CLA umgesetzt wird (WO 99/20123; Santora JE et al. (2000) J Nutr 130: 208-215; Adlof RO et al. (2000) Lipids 35: 131-135). Ebenso konnte gezeigt werden das Insektenzellen die eine E11-Desaturase exprimieren, das entstandene E11-Fettsäure- Edukt in ein Z9, E11-Fettsäure umwandeln können (Liu WT et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99(2): 620-624. Pflanzliche Δ9-Desaturasen können ebenso die Umsetzung von trans-Vaccensäure zum (Z9,E11)-CLA Isomer katalysieren. Diese Umsetzung kann in einer besonders bevorzugten Ausführungsform durch zusätzliche Expression einer Z9-Desaturase weiter gesteigert werden. Bevorzugt sind dabei zytosolisch-aktive Z9-Desaturasen, wie beispielsweise die Z9-Desaturase aus Hefe. Die Produktion des (Z9,E11)-CLA Isomers in Pflanzen ist also möglich durch die Expression einer trans-Desaturase. Das besonders vorteilhafte (9Z,11E)-CLA Isomer wird dabei unter Einfluss pflanzlicher Z9-Desaturasen gebildet.
2. Ausgehend von Stearinsäure wird zunächst über trans-Desaturierung an Position C10 die entsprechende E10-Octadecensäure gebildet (Schema 3). Alternativ kann ausgehend von Palmitinsäure wird über trans-Desaturierung an Position C8 E8-Hexadecensäure hergestellt. Diese kann anschließend über die enzymatische Aktivität einer Elongase zu E10-Octadecensäure verlängert werden (Schema 4). Diese Fettsäure wird durch die Aktivität einer Δ12-Desaturase zum (E10,Z12)-CLA Isomer umgesetzt werden. Diese Reaktion wird auch durch pflanzliche Δ12-Desaturasen katalysiert. Diese Umsetzung kann in einer besonders bevorzugten Ausführungsform durch zusätzliche Expression einer Z12-Desaturase weiter gesteigert werden.
3. Es können auch entsprechende (E10,Z12)-Konjugasen aus Lepidoptera eingesetzt werden. Diese wandeln beispielsweise Z11- Octadecensäure (cis-Vaccensäure), E11-Octadecensäure (trans- Vaccensäure) oder Z10-Octadecensäure in (E10,Z12)-CLA um. Dazu wird zunächst Stearinsäure unter Wirkung einer Z11-Desaturase zu Z11-Octadecensäure, wie oben beschrieben zu trans- Vaccensäure oder durch eine Z10-Desaturase zu Z10-Octadecensäure umgesetzt.
4. Ferner können auch (Z9,E11)-Konjugasen aus Lepidoptera vorteilhaft mit (Z11)-, (Z10)- oder (E10)-Desaturasen kombiniert werden. Diese Desaturasen produzieren ausgehend von Stearinsäure Z11-Octadecensäure (cis-Vaccensäure), Z10-Octadecensäure oder E10-Octadecensäure, welche anschließend durch eine (Z9/E11)-Konjugase zu (Z9,E11)-CLA umgesetzt werden.

Die so hergestellte CLA-Fettsäuren bzw. deren Derivate wie CoA- Fettsäureester werden in den Membranlipiden und Triacylglyceride gespeichert.
Die wünschenswerten Enzymaktivitäten konnten in Insekten der Ordnung Lepidoptera, insbesondere in den oben genannten Insektenarten lokalisiert werden. Dazu wurden die im Rahmen dieser Erfindung bereitgestellten Testsysteme verwendet (Beispiel 2, 3 und 4).
Die für diese Aktivitäten kodierenden Enzyme, bzw. die für diese kodierenden Nukleinsäuresequenzen, können in der dem Fachmann vertrauten Weise aus den entsprechenden Organismen isoliert werden, oder durch Mutagenese aus entsprechenden bekannten Sequenzen abgeleitet werden.
Das Auffinden einer Proteinsequenz oder einer korrespondierenden cDNA-Sequenz zu einer enzymatischen Aktivität, Funktionalität oder Phänotyp ist eine klassische Aufgabenstellung der Biochemie und Molekularbiologie. Dem Fachmann sind verschiedene Verfahren bekannt, wie er diese Aufgabe lösen kann. Diese Verfahren basieren zum Beispiel auf dem im Rahmen dieser Erfindung zur Verfügung gestellten Tests zur Bestimmung der Desaturase oder Konjugase Aktivität (siehe u. a. Beispiel 3). Die Bestimmung der jeweiligen spezifischen Aktivität einer Desaturase/Konjugase erfolgt über die Analyse des Fettsäuremusters beispielsweise über Gaschromatographie wie in den Beispielen 2, 3 oder 4 beschrieben. Unter Verwendung dieses Tests ist es möglich, ausgehend von einem biologischen Material, in dem eine Desaturase- oder Konjugase-Aktivität detektiert wurde, das entsprechende Protein oder die Nukleinsäure, die für ein Protein mit Desaturase- oder Konjugase-Aktivität kodiert, zu isolieren und zu analysieren.
Beispielhaft kann man die Methode der Expressionsklonierung ("expression cloning") anwenden. Diese Methode ist vielfach dazu angewendet worden, ausgehend von einer bestimmten enzymatischen Aktivität, einer bestimmten Funktionalität oder einem bestimmten Phänotyp, das dafür verantwortliche Gen oder die korrespondierende cDNA zu isolieren (Dalboge H (1997) FEMS Microbiology Reviews 21(1): 29-42, Simonsen H and Lodish HF (1994) Trends Pharmacol Sci 15(12): 437-441). Die klassische Methode der Expressionsklonierung ist vielfach beschrieben, zum Beispiel für Membranproteine, sekretierte Faktoren und Transmembrankanäle (Masu Y et al. (1987) Nature 329(6142): 836-838; Wong GG et al. (1985) Science 228(4701): 810-815; Lustig KD et al. (1996) Development 122(12): 4001-4012; Smith WC and Harland RM (1992) Cell 70(5): 829-840; Lemaire P et al. (1995) Cell 81(1): 85-94; Gillissen B et al. (2000) Plant Cell 12(2): 291-300; Lotan T and Hirschberg J (1995) FEBS Letters 364: 125-128).
Bei dem infolge beschriebenen verallgemeinerten Verfahren der Expressionsklonierung verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience beschrieben sind.
Allgemein kann man ausgehend von einen Organismus, Zellen oder Gewebe, die zur Erzeugung einer Desaturase- oder Konjugase-Aktivität befähigt sind, eine Expressionsbibliothek herstellen. Beispielhaft isoliert man in der dem Fachmann geläufigen Weise zunächst mRNA oder bevorzugt poly(A)-mRNA aus gesagten Organismus, Zellen oder Gewebe und stellt davon ausgehend cDNA her (Gubler U, Hoffman BJ (1983) Gene 25: 263-269). Verschiedene Systeme zur mRNA oder poly(A)-mRNA Isolierung sind dem Fachmann bekannt und kommerziell erhältlich. Beispielhaft kann die Synthese mit dem "Quick Prep Micro mRNA Purification Kit" (Amersham Pharmacia Biotech) durchgeführt werden. Die Erststrang-cDNA Synthese wird bevorzugt mit einem Oligo(dT)-Primer unter Einsatz einer reversen Transkriptase ausgeführt (Borson ND et al. (1992) PCR Methods Appl 2: 144-148; Chenchik A et al. (1994) CLONTECHniques 9(1): 9-12). Es sind verschiedene Systeme bekannt und kommerziell erhältlich, die die Erzeugung von vollständigen cDNAs ("fulllength cDNAs") ermöglichen. Beispielhaft sei der "SMART™ cDNA Library Construction Kit" (Clontech, Cat. #K1051-1) genannt. Dieser verwendet die SMART™ Technologie (SMART = Switch Mechanism At the 5' end of RNA Templates) zur Erzeugung von cDNA-Bibliotheken (Herrler M (2000) J Mol Med 78(7): B23). Hier kommen bestimmte Oligonukleotide und das Verfahren der Langstrecken-PCR ("long-distance PCR") zum Einsatz. Das Verfahren ist im Beispiel 4 beschrieben.
An die doppelsträngigen cDNAs können Adaptoren mit Einzelstrangüberhängen ligiert werden, die eine Klonierung beispielhaft in einen Expressionsvektor, der mit Restriktionsenzymen geschnitten wurde und kompatible kohäsive Enden aufweist, erfolgen. Bevorzugt erfolgt die Klonierung gerichtet, so dass die Leserichtung festgelegt ist und ein gegebenenfalls vorhandener Promotor sense-RNA ausgehend von der cDNA Insertion erzeugt. Bei dem beispielhaft verwendeten SMART™-System werden kompatible SfiI (A) und SfiI (B) - Überhänge zu einer gerichteten Klonierung in einen mit SfiI (Erkennungsequenz GGCCNNNN!NGGCC) geschnittenen Vektor verwendet. Jeweils ein cDNA-Molekül wird in ein Vektormolekül kloniert, so dass letztlich eine Vielzahl sich in der integrierten cDNA unterscheidende Vektoren, basierend auf dem gleichen Basisvektor, vorliegen, die die Expressionsbibliothek bilden. In dieser Expressionsbibliothek sind auch Vektoren enthalten, die eine Desaturase- oder Konjugasetransgen exprimieren können. Prinzipiell sind alle Expressionsvektoren geeignet, die in der Lage sind, Desaturasen oder Konjugasen in aktiver Form in einem transformierten Organismus transgen zu exprimieren. Beispielhaft seien der lambda TriplEX2 Vektor (nach Excision pTriplEX2 Vektor; Hersteller Clontech) zur transgenen Expression in E.coli, oder der Vektor pYES2 (Hersteller: Invitrogen) zur transgenen in der Hefe S. cerevisiae genannt (siehe Beispiel 4).
Gegebenenfalls kann man eine Normalisierung durchführen, um Unterschiede in der Expressionshöhe einzelner Gene auszugleichen, so dass die cDNA zu jedem exprimierten Gen - unabhängig von der tatsächlichen Expressionshöhe - mit einer ähnlichen Kopienzahl in der Expressionsbibliothek vertreten ist. Für die Herstellung von poly(A)-mRNA, cDNA und normalisierter cDNA sind verschiedene Systeme beschrieben (US 5,482,845) (Soares MB et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 9228-9232; Carninci P et al. (2000) Genome Res 10: 1617-1630; Bonaldo MF et al. (1996) Genome Res 6: 791-806).
Alternativ kann man auch eine subtraktive Expressionsbibliothek anfertigen. Hier vergleicht man die cDNAs von einem Organismus, Zellen oder Gewebe, der eine Desaturase- oder Konjugase aufweist, mit den cDNAs eines Organismus, Zellen oder Gewebe, der diese Aktivität nicht aufweist und möglichst von der gleichen Gattung und Art ist. Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, wie man gezielt die cDNAs isolieren kann, die nur in dem biologischen Material mit der Desaturase- oder Konjugase-Aktivität exprimiert sind. Entsprechende Verfahren und Systeme sind beschrieben und kommerziell erhältlich. Beispilehaft sei der "PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit" (Hersteller: Clontech) oder "Subtractor™ Kit" (Hersteller: Invitrogen) zunennen, der eine bis zu mehr als 1000-fache Anreicherung seltener und/oder selektiv exprimierter cDNAs ermöglicht. Unter Verwendung einer subtraktiven Hybridisierung werden all die cDNAs entfernt, die in beiden biologischen Materialien vorhanden sind (Chu ZL et al. (1997) Proc Nat Acad Sci USA 94: 10057-10062; Hudson C et al. (1997) Cell 91: 397-405; Mueller CGF et al. (1997) J Exp Med 186: 655-663; von Stein OD et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 2598-2602; Wong BR et al. (1997) J Biol Chem 272: 25190-25194; Yokomizo T et al. (1997) Nature 387: 620-624; Zhicheng S and Jacobs-Lorena M (1997) J Biol Chem 272: 28895-28900).
Die transgene Expression der in der Expressionsbibliothek enthaltenen cDNAs kann beispielhaft in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen realisiert werden, die anschliessend einem Test auf das Desaturase- oder Konjugase-Protein, zum Beispiel einem Test auf eine Desaturase- oder Konjugase-Aktivität, unterzogen werden.
Zur Isolierung der Desaturase- oder Konjugase transgen exprimierenden Vektoren aus der Expressionsbibliothek, wird die Expressionsbibliothek bevorzugt in einen Organismus transformiert. Vorzugsweise transformiert man einzelne Zellen des besagten Organsimus derart, dass jede Zelle oder jeder ausgehend von dieser Zelle regenerierte Organismus jeweils nur mit einer Art Vektormolekül transformiert ist. Im Prinzip sind alle Organismen oder von ihnen abgeleitete Zellen für die Transformation geeignet, die in der Lage sind, eine aktive Desaturase oder Konjugase transgen zu exprimieren. Dies können prokaryotische und eukaryotische Organismen sein. Bevorzugt sind alle Pflanzen, von ihnen abgeleitete Zellen, aber auch andere photosynthetische Organismen, wie zum Beispiel Algen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien hier Systeme genannt, die auf einer transgenen Expression in Bakterien wie E.coli, Hefen wie Saccharomyces oder Pichia, Säugerzellen wie COS oder CHO, oder Zellen photosynthetisch aktiver Organsimen wie Synechocystis basieren. Bevorzugt sind eukaryotische Organismen, ganz besonders bevorzugt sind eukaryotische Organismen, die in der Lage sind Fettsäuren oder Acyl-CoA Fettsäuren zu synthetisieren. Bevorzugt tragen die zur Transformation verwendeten Expressionsvektoren einen Selektionsmarker, zum Beispiel eine Antibiotikaresistenz oder ein Aminosäuresynthesegen zur Selektion auf Aminosäuredefizienz, das eine Selektion erfolgreich transformierter Zellen ermöglicht. Weitere Verfahren der Selektion sind weiter unten beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Expressionsklonierung in Hefe vorgenommen werden. Dazu kann beispielhaft das auf dem Vektor pYES2 basierende Hefeexpressionssystem der Firma Invitrogen verwendet werden. pYES2 ist ein "high-copy" episomaler Vektor zur induzierbaren Expression rekombinanter Proteine in S. cerevisiae. Die Selektion transformierter Hefestämme erfolgt auf Basis der Uracil-Defizienz (pYES2 trägt das ura3 Gen).
Weiter bevorzugte Expressionsvektoren und Transfektionsmethoden zur Herstellung der transformierten Organismen entsprechen den allgemein für die Herstellung transgener Organismen verwendeten Verfahren.
Von der Gesamtzahl der transformierten Organismen oder von ihnen abgeleiteten Zellen ausgehend werden diejenigen angereichert und isoliert, die in der Lage sind, eine Desaturase oder Konjugase transgen zu exprimieren und/oder eine entsprechende Desaturase- oder Konjugase Aktivität aufweisen.
Allgemein kann der Nachweis der Desaturase-Aktivität dadurch erfolgen, dass man einen transformierten Organismen oder von ihm abgeleiteten Zellen kultiviert, in einem geeigneten Puffer oder Lösungsmittel aufschliesst, den Aufschluss mit Fettsäuren oder Acyl-CoA Fettsäuren und gegebenenfalls mit einem Co-Faktor wie NADH oder NADPH oder Sauerstoff in Verbindnung bringt und die entstehende desaturierte Fettsäure oder Acyl-CoA Fettsäuren nachweist. Die Fettsäuren oder Acyl-CoA Fettsäuren können bevorzugt aus dem transformierten Organsismus selber stammen, wenn der Organsimus oder die von ihm abgeleiteten Zelle in der Lage sind, selber Fettsäuren oder Acyl-CoA Fettsäuren zu synthetisieren. Anderenfalls können Fettsäuren oder Acyl-CoA Fettsäuren aber auch zugesetzt werden.
Der Nachweis der durch die Deaturase oder Konjugase modifizierten Fettsäure oder Acyl-CoA Fettsäure kann, gegebenen falls nach Extraktion aus dem Inkubationansatz zum Beispiel mit einem Lösungsmittel wie Ethylacetat, über übliche dem Fachmann geläufige Methoden erfolgen. Dazu können Separationsmethoden wie Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), Gaschromatographie (GC), Dünnschichtchromatogaphie (DC) und Detektionsmethoden wie wie Massenspektroskopie (MS oder MALDI), UV-Spektroskopie oder Autoradiographie zum Einsatz kommen. Bevorzugt erfolgt der Nachweis unter durch Gaschromatographie wie in den Beispielen 3, 4 oder 5 beschrieben.
Die Isolierung der transformierten Organismen oder von ihnen abgeleiteten Zellen, die in der Lage sind eine Desaturase oder Konjugase transgen zu exprimieren, kann beispielhaft dadurch geschehen, dass man die Gesamtzahl der Zellen in Untergruppen unterteilt, diese Untergruppen gegebenenfalls separat kultiviert und die Desaturase- oder Konjugase-Aktivität der einzelnen Untergruppen mißt. Die Untergruppe, in der eine Zellart vorhanden ist, die ein Desaturase- oder Konjugase-Protein in funktionell aktiver Form transgen exprimiert, weist eine erhöhte Desaturase- oder Konjugase-Aktivität auf. Diese Untergruppe wird weiter unterteilt und das Verfahren so lange wiederholt, bis man zu einer monoklonalen Kultur gelangt, d. h. einer Kultur, die lediglich einen Vektor mit einer bestimmten für eine Desaturase oder Konjugase kodierenden cDNA enthält.
Aus dem transformierten Organismus oder Zelle kann der Vektor, der die Nukleinsäure kodierend für die Desaturase oder Konjugase enthält, zurückgewonnen werden. Dies kann zum Beispiel mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) geschenen. Dazu Verwendet man Oligonukleotidprimern, die zu Vektorsequenzen, die das Desaturase oder Konjugase cDNA-Insert flankieren, komplementät sind. Die Kenntnis der Desaturase oder Konjugase Nukleinsäuresequenz ist dazu nicht erfoderlich. Alternativ kann der Vektor, wenn er nicht in das Genom des Wirts integriert ist, aus den Zellen rückgewonnen, in E.coli transformiert, propagiert und sequenziert werden, um die für die Desaturase oder Konjugase kodierende Nukleinsäuresequenz zu erhalten. Auch aus dem isolierten Vektor kann die Desaturase- oder Konjugase-Nukleinsäuresequenz nach oben beschriebenen Verfahren ohne Kenntnis ihrer Sequenzfolge mittels PCR isoliert werden. Nach den PCR-Reaktionen können zusätzlich Linker an das Amplikon angefügt werden, die eine gerichtete Klonierung ermöglichen. Die Klonierung kann aber auch mittels "blunt-end" Ligation oder T-Überhangsligation in einer dem Fachmann geläufigen Weise erfolgen. Die mittels PCR selektiv amplifizierte cDNA der Desaturase- oder Konjugase kann so auch ohne vorherige Sequenzaufklärung direkt in einen Vektor kloniert werden, der zur Herstellung eines transgenen, eine Desaturase- oder Konjugase exprimierenden Organsimus geeignet ist. Diese Klonierung kann beispielsweise als "blunt end" Klonierung unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Techniken erfolgen. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie oben zitiert.
Besonders bevorzugt kann die oben beschriebene Expressionsklonierung in der Hefe Saccharomyces cerevisiae durchgeführt werden. Dazu können auch Systeme verwendet werden, bei dem die transgen zu exprimierenden cDNAs mittels homologer Rekombination in eine erzeugte Integrationsplattform integriert werden (Lagarde D et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1): 64-72).
Alternativ kann die Expressionsklonierung auch unter Verwendung einer wie oben beschriebenen nicht-amplifizierten Expressionsbibliothek in vitro vorgenommen werden. Entsprechende Systeme sind beschrieben und kommerziell herhältlich. Beispielhaft sei das "TNT™ Coupled Reticulocyte Lysate System" (Promega; Promega Notes Number 67, 1998, p. 02) genannt. Kirschner et al. haben einen in vitro Ansatz (IVEC = "in vitro expression cloning") entwicklet, der ohne lebende Zellen auskommt (US 5,654,150; King RW et al. (1997) Science 277, 973). Das System ist erfolgreich vor allem auf Enzyme und Kinasen angewendet worden. Kirschner et al. haben Kinasesubstrate und Proteasen identifiziert (Lustig KD et al. (1997) Meth Enzymol 283: 83; Stukenberg PT et al. (1997) Curr Biol 7: 338; Kothakota S et al. (1997) Science 278: 294). Beim "in vitro expression cloning" (IVEC) werden kleine Fraktionen der Expressionsbibliothek eingesetzt. Diese Fraktionen von jeweils ca. 50 bis 100 Klonen von cDNAs sind in Plasmiden enthalten und werden mittels eines gekoppelten in vitro Transkriptions-/Translationssystems auf der Basis von Retikolozytenlysat in ihre korrespondierenden Proteine übersetzt. Dazu wird wie oben beschrieben eine oligo(dT)-geprimte cDNA-Bibliothek konstruiert und in ein high copy Expressionsplasmid mit einem T3, T7 oder SP6 Promoter kloniert. Diese Plasmid-Bibliothek wird dann in E.coli transformiert. Jeweils ca. 50 bis 100 unabhängige Tranformanten werden auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Selektionsantibiotikum bis zu einer Koloniengrösse von ca. 1 mm kultiviert, gesammelt und vereinigt. Aus einem Teil dieser Bakterien wird Plasmid- DNA isoliert. Diese Plamid-DNA wird als Matrize direkt in einem Retikolozytensytem transkribiert und translatiert. Details des Verfahrens können zum Beispiel dem Handbuch des Herstellers entnommen werden (TNT™ Coupled Reticulocyte Lysate Systems Technical Bulletin #TB126, Promega Corporation)". Je nach Anzahl der "fulllength" cDNA Klone in der Bibliothek werden ca. 30 bis 50 Proteine in jedem Einzelansatz synthetisiert. Die produzierten Proteine werden hinsichtlich ihrer Desaturase- oder Konjugase Aktivität überprüft. Einzelansätze, die eine erhöhte Desaturase- oder Konjugase Aktivität aufweisen werden weiter unterteilt. Unterteilung der Einzelansätze führt zu der für eine Desaturase- oder Konjugase kodierenden cDNA. Aus den in dieser Präparation enthaltenen Vektoren kann mittels PCR die für die Desaturase- oder Konjugase kodierende Nukleinsäure herausamplifiziert werden und - gegebenenfalls ohne Kenntnis und Analyse der Sequenz - wie oben beschrieben zur Herstellung eines eine Desaturase oder Konjugase transgen exprimierenden Organsimus verwendet werden.
Alternativ zum Kaninchen Retikolozytenextrakt kann auch Weizenkeimextrakt für die kombinierte Transkription/Translation verwendet werden (zum Beispiel unter Einsatz des TNT™ Wheat Germ Extract System der Firma Clontech).
In einer weiteren vorteilhaften Anwendung können die cDNAs in einen retroviralen Vektor kloniert werden. Dies erlaubt eine hocheffiziente Transformationen der Zellen. Retrovirale Expressionsvektoren und Expressionssysteme sind beschrieben (Kitamura T, International Journal of Hematology 1998, 67: 351-359) und kommerziell erhältlich (zum Beispiel von Clontech; New Retroviral & ClonCapture Expression Libraries; CLONTECHniques October 1998, XIII(4): 22-23). Die Transfektion erfolgt zunächst in eine Verpackungszelllinie (zum Beispiel EcoPack™-293 oder RetroPack™ PT67 Cell Line der Firma Clontech). Mit den so generierten Viren kann die entsprechende Targetzelllinie transfiziert und hinsichtlich dergewünschten Aktivität seletioniert werden. Die Inserts können sodann zum Beispiel über PCR gewonnen und analysiert werden. Ferner können sie - auch ohne vorherige Sequenzanalyse wie oben beschrieben direkt in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert werden, der dann zur Herstellung eines Desaturase oder Konjugase transgen exprimierenden Organismus verwendet werden kann.
E10- oder E11-Desaturasen können erhalten werden, indem bekannte cis-Desaturasen über Mutagenese so verändert werden, dass sie spezifisch für die Desaturierung in trans-Position sind. Dazu können beispielsweise nachfolgende für cis-Desaturasen kodierende Nukleinsäuresequenzen als Ausgangssequenzen einer Mutagenese unterworfen werden:

a) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Z11-Desaturase aus Helicoverpa zea mit der SEQ ID NO: 7,
b) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Z11-Desaturase aus Trichoplusia ni mit der SEQ ID NO: 9,
c) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Z11-Desaturase aus Argyrotaenia velutinana mit der SEQ ID NO: 11 oder
d) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Z10-Desaturase aus Planotortrix octo mit der SEQ ID NO: 13.

Auch können E11-Desaturasen durch eine Mutagenese so verändert werden das längerkettige Fettsäuren besser oder überhaupt umgesetzt werden können. Dazu kann beispielsweise als Ausgangssequenz eingesetzt werden

a) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine E11-Desaturase aus Epiphyas postvittana mit der SEQ ID NO: 1,
b) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine E11-Desaturase aus Ostrinia nubilalis mit der SEQ ID NO: 3, oder
c) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine E11-Desaturase aus Ostrinia furnacalis mit der SEQ ID NO: 5.

Auch ist es denkbar die Spezifität für die Position, an der die Doppelbindung durch oben genannte Desaturasen eingeführt wird, durch Mutagenese zu ändern.
Verfahren zur Veränderung der Eigenschaften wie Substratspezfität von Desaturasen durch Mutagenese ist bekannt (Cahoon et al. (1997) Proc Nat Acad Sci USA 94: 4872-4877; WO 98/06735). Weitere geeignete Verfahren sind für andere Enzyme des Lipidmetabolismus wie beispielsweise Lipoxygenasen beschrieben und übertragbar (Hornung et al. (2000) Biochem Soc Trans 28: 825-826; Schwarz et al. (2001) J Biol Chem 276: 773-779).
Nukleinsäuresequenzen kodierend für Desaturasen/Konjugasen zum Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch mittels Polymerasekettenreaktion unter Verwendung entsprechender degenerierter Oligonukleotidprimer aus cDNA Präparationen - oder Banken der entsprechenden oben genannten Lepidoptera-Arten isoliert werden. Dabei kommen bevorzugt das Oligonukleotid-Primerpaar beschrieben durch SEQ ID NO: 15 und 16 oder das das Oligonukleotid- Primerpaar beschrieben durch SEQ ID NO: 17 und 18 zum Einsatzt.
Die Nukleinsäuresequenz der in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommenden Fettsäuredesaturase aus Lepidptera ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass sie

a) in ihren sense-Strang eine Sequenzmotiv beschrieben durch SEQ ID NO: 15 oder 17 enthält, oder
b) in ihren antisense-Strang eine Sequenzmotiv beschrieben durch SEQ ID NO: 16 oder 18 enthält.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Proteinsequenz der in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommenden Fettsäuredesaturase aus Lepidptera bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Homologie von mindestens 65%, bevorzugt mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90% zu einer der Fettsäuredesaturasen beschrieben durch SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 oder 14 hat und - optional und bevorzugt - über mindestens eine der bevorzugten wesentlichen Eigenschaften einer Desaturase oder Konjugase verfügt.
Die so gekennzeichneten Proteine können auch natürliche oder künstliche Mutationen einer der oben genannten Desaturase-Nukleinsäuresequenzen sowie deren Homologen aus anderen Tier- oder Pflanzengattungen und -arten umfassen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z. B. Transitionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewingback" oder Auffüllen von Überhängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid-Primer kommen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz kodierend für die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommenden Fettsäuredesaturase aus Lepidptera bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Homologie von mindestens 65%, bevorzugt mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 80, ganz besonders bevorzugt mindestens 90% zu einer der Nukleinsäuresequenz beschrieben durch SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 oder 13 hat und - optional und bevorzugt - für ein Protein kodiert, das über mindestens eine der bevorzugten wesentlichen Eigenschaften einer Desaturase oder Konjugase verfügt.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren oder Polypetiden wird die Identität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 12 Length Weight: 4
Average Match: 2,912 Average Mismatch: -2,003
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz kodierend für die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommenden Fettsäuredesaturase aus Lepidptera bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass sie unter Standardbedingungen mit einer der oben genannten für Desaturasen kodierenden Nukleinsäuresequenz, bevorzugt mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 oder 13 hybridisiert.
Standardhybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben. Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2 × SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0.2 × SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20 × SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7.0). Darüber hinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:

1. Hybridisierungbedingungen mit zum Beispiel
- a) 4 × SSC bei 65°C,
- b) 6 × SSC bei 45°C,
- c) 6 × SSC bei 68°C, 100 µg/ml denaturierter Fischsperma-DNA,
- d) 4 × SSC, 50% Formamid, bei 42°C,
- e) 2 × oder 4 × SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung), oder
- f) 2 × oder 4 × SSC, 30 bis 40% Formamid, bei 42°C (schwach stringente Bedingung).
2. Waschschritte mit zum Beispiel
- a) 0,1 × SSC bei 65°C, oder
- b) 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei 68°C, oder
- c) 0,1 × SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C, oder
- d) 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C, oder
- e) 2 × SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung).

"Nukleinsäuresequenz" meint im Rahmen dieser Erfindung beispielsweise eine genomische oder eine komplementäre DNA (cDNA)-Sequenz oder eine RNA-Sequenz sowie halb- oder vollsynthetische Analoga davon. Diese Sequenzen können in linearer oder zirkulären Form, extrachromosomal oder integriert in das Genom vorliegen. Die Nukleotidsequenzen der erfindungsgemässen Expressionskassetten oder Nukleinsäuren können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen werden oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Ausserdem sind artifizielle Nukleinsäuresequenzen geeignet, solange sie die gewünschte wesentliche Eigenschaft haben. Beispielsweise können synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons erzeugt werden, die von zu transformierenden Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können anhand der Kodonnutzung aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit in üblicher Weise bestimmt werden. Besonders geeignet sind kodierende Nukleotidsequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäss der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Um unerwünschte pflanzliche Regulationsmechanismen zu umgehen, kann man beispielsweise ausgehend von der Aminosäuresequenz eines Desaturase aus Lepidoptera-Insekten unter Berücksichtigung der pflanzlichen Kodon-Nutzung DNA-Fragmente rückübersetzen und daraus die vollständige, für einen Einsatz in der Pflanze optimierte exogene Desaturasesequenz herstellen.
Alle vorstehend erwähnten Nukleotidsequenzen sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Bei der Präparation eines Nukleinsäurekonstruktes können verschiedene DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass eine Nukleotid-Sequenz mit korrekter Leserichtung und korrektem Leseraster erhalten wird. Für die Verbindung der Nukleinsäure-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
"Transgen" meint bezüglich zum Beispiel einer Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskassette, einem Vektor oder einem Organismus alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommene Konstruktionen oder deren Verwendung, in denen sich entweder

a) die für eine Desaturase kodierende Nukleinsäuresequenz, oder
b) eine mit der für eine Desaturase kodierenden Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder
c) (a) und (b)

Transgene Expression meint die Verwendung einer transgenen Expressionskassette zur Expression einer Nukleinsäuresequenz.
Die Erfindung betrifft ferner transgene Expressionskassetten, die eine für eine Desaturase kodierende Nukleinsäuresequenz enthalten, sowie Vektoren umfassend diese Expressionkassetten.
In besagten transgenen Expressionskassetten steht ein für eine Desaturase kodierendes Nukleinsäuremolekül bevorzugt in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einem genetischen Kontrollelement (beispielsweise einem Promotor), das die transgene Expression (Transkription und/oder Translation) besagter Desaturase in einem Organismus, bevorzugt in Pflanzen, gewährleistet. Soll die transgene Expressionskassette direkt in die Pflanze eingeführt und die Desaturase in plantae exprimiert werden, so sind pflanzenspezifische genetische Kontrollelemente (beispielsweise Promotoren) bevorzugt. Die Desaturase kann jedoch auch in anderen Organismen oder in vitro erexprimiert werden. In diesem sind alle prokaryotischen oder eukaryotischen genetischen Kontrollelemente (beispielsweise Promotoren) bevorzugt, die die Expression in den jeweils für die Herstellung gewählten Organismus erlauben.
Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit der zu exprimierenden Desaturase-Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promoter fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung als auch die Herstellung einer transgenen Expressionskassette kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience und bei Gelvin et al. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen. Bevorzugt kann die transgene Expressionskassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promoter und zu exprimierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden.
Unter einer transgenen Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen die Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Desaturasederart hinter einen endogenen Promotor platziert wird, dass die Expression der Desaturase unter Kontrolle des endogenen Promotors erfolgt. Die durch die Insertion entstehende Fusion von endogenem Promotor und Desaturase-Nukleinsäuresequenz ist eine transgene Expressionskassetten im Sinne der Erfindung.
Pflanzenspezifische Promotoren meint grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, -geweben, -kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein. Bevorzugt sind:

a) Konstitutive Promotoren
Bevorzugt sind Vektoren, die eine konstitutive Expression in Pflanzen ermöglichen (Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195-2202). "Konstitutiver" Promotor meint solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140: 281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6: 221-228) oder der 19S CaMV Promotor (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195-2202). Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der "Rubisco small subunit (SSU)"-Promotor (US 4,962,028), der LeguminB-Promotor (GenBank Acc.-Nr. X03677), der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-649), den Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18: 675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 9692-9696), den Smas Promotor, den Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor (US 5,683,439), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991), sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist.
b) Gewebespezifische Promotoren
Bevorzugt sind ferner Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen.
Samenspezifische Promotoren
wie zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200; Bustos mm et al. (1989) Plant Cell 1(9): 839-53), des 25 Albumingens (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3): 459-67), des Napin Gens (US 5,608,152; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199: 515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2): 233-9; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13(10): 1090f), der Oleosin-Promoter aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Bce4-Promoter aus Brassica (WO 91/13980). Weitere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG), Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP Glucose Pyrophosphatase (AG- Pase) oder die Stärkesynthase. Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben. Vorteilhaft eingesetzt werden können der Promoter des lpt2 oder lpt1-Gen (WO 95/15389, WO 95/23230) oder die Promotoren beschrieben in WO 99/16890 (Promotoren des Hordein-Gens, des Glutelin-Gens, des Oryzin-Gens, des Prolamin-Gens, des Gliadin-Gens, des Glutelin-Gens, des Zein-Gens, des Kasirin-Gens oder des Secalin-Gens).
Knollen-, Speicherwurzel- oder Wurzel-spezifische Promotoren wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel.
Blattspezifische Promotoren
wie Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8: 2445-2451).
Blütenspezifische Promotoren
wie beispielsweise der Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).
- Antheren-spezifische Promotoren wie den 5126-Promotor (US 5,689,049, US 5,689,051), den globl Promotor und den γ-Zein Promotor.
c) Chemisch induzierbare Promotoren
Die transgenen Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 89-108), durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z. B. der PRP1 Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2: 397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden.
d) Stress- oder Pathogen-induzierbare Promotoren
Ferner sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder abiotischen Stress induziert werden wie beispielsweise der pathogen-induzierbare Promotor des PRP1-Gens (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), der hitzeinduzierbare hsp70- oder hsp80-Promoter aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierare alpha-Amylase Promoter aus der Kartoffel (WO 96/12814), der licht-induzierbare PPDK Promotor oder der verwundungsinduzierte pinII-Promoter (EP 375091).
Pathogen-induzierbare Promotoren umfassen die von Genen, die infolge eines Pathogenbefalls induziert werden wie beispielsweise Gene von PR-Proteinen, SAR-Proteinen, β-1,3-Glucanase, Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al. (1983) Neth J Plant Pathol 89: 245-254; Uknes, et al. (1992) The Plant Cell 4: 645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4: 111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9: 335-342; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2: 325-342; Somssich et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83: 2427-2430; Somssich et al. (1988) Mol Gen Genetics 2: 93-98; Chen et al. (1996) Plant J 10: 955-966; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 2507-2511; Warner, et al. (1993) Plant J 3: 191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1: 961-968(1989).
Umfasst sind auch verwundungs-induzierbare Promotoren wie der des pinII Gens (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28: 425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14: 494-498), des wun1 und wun2-Gens (US 5,428,148), des win1- und win2-Gens (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215: 200-208), des Systemin (McGurl et al. (1992) Science 225: 1570-1573), des WIP1-Gens (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73-76), des MPI-Gens (Corderok et al. (1994) The Plant J 6(2): 141-150) und dergleichen.
e) Entwicklungsabhängige Promotoren
Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise fruchtreifung-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifung-spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794, EP 409 625). Entwicklungsabhängige Promotoren schließt zum Teil die Gewebespezifischen Promotoren ein, da die Ausbildung einzelner Gewebe naturgemäß entwicklungsabhängig erfolgt.

Weitere zur Expression in Pflanzen geeignet Promotoren sind beschrieben (Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153: 253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61: 1-11; Berger et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 8402-8406). Besonders bevorzugt sind konstitutive sowie Samenspezifische Promotoren.
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E.coli Bakterien ermöglichen. Als Pflanzen Promotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage.
Die in den erfindungsgemässen transgenen Expressionskassetten oder Vektoren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem Promoter funktionell verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemässen transgenen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemässen transgenen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz den Promoter mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionsteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131-17135) und Hitzestress (Schoffl F et al., Molecular & General Genetics 217(2-3): 246-53, 1989) beschrieben.
Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3'-Region von Genen wie beipielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adh1-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15: 435-440).
Die transgene Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promoter enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al. (1984) EMBO J 3: 835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Synthase)-Terminator und der NOS(Nopalin-Synthase)-Terminator.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der transgenen Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B (1998) Methods. 14(4): 381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.
Eine transgene Expressionskassette und die von ihr abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemässen transgenen Expressionskassetten, Vektoren oder Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:

a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456), Antibiotika oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphinotricin etc. verleihen. Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft seien genannt: DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren und Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren (bar und pat Gen), 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N-(phosphonomethyl)glycin) verleihen, das für das Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase), das den Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon inaktiviert), Sulfonylurea- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen sowie bxn Gene, die für Bromoxynil degradierende Nitrilaseenzyme kodieren, das aasa-Gen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Apectinomycin verleih, das Streptomycinphosphotransferase (SPT) Gen, das eine Resistenz gegen Streptomycin gewährt, das Neomycinphosphotransferas (NPTII) Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin oder Geneticidin verleiht, das Hygromycinphosphotransferase (HPT) Gen, das eine Resistenz gegen Hygromycin vermittelt, das Acetolactatsynthas Gen (ALS), das eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide verleiht (z. B. mutierte ALS-Varianten mit z. B. der 54 und/oder Hra Mutation).
b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1): 29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Sheen et al. (1995) Plant Journal 8(5): 777-784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6): 2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12): 5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267-271; WO 97/41228; Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6: 325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques. 23(5): 912-8), die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Ow et al. (1986) Science 234: 856-859; Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10: 324-414), das Aequoringen (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3): 1259-1268), die β-Galactosidase, R- Locus Gen (kodieren ein Protein, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht; Dellaporta et al., In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11: 263-282, 1988), ganz besonders bevorzugt ist die β-Glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907).
c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemässen transgenen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E.coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.

Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selektionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).
Beispielhaft - jedoch nicht einschränkend - kann die erfindungsgemässe transgene Expressionskassette eine folgende Struktur haben:

a) 5'-Pflanzenspezifischer Promotor/Desaturase/Terminator-3'

Bevorzugt hat die erfindungsgemässe transgene Expressionskassette eine folgende Struktur:

a) 5'-35S-Promotor/Desaturase/OCS-Terminator-3', oder
b) 5'-LeguminB-Promotor/Desaturase/NOS-Terminator-3'

Für die erfindungsgemässen vorteilhaften Verfahren zur CLA- Biosynthese kann eine Kotransformation mit mehr als einem der oben genannten Beispiele a) oder b) vorteilhaft sein. Ferner kann die Transformation mit einem oder mehr Vektoren, die jeweils eine Kombination der oben genannten transgenen Expressionskassetten enthalten, vorteilhaft sein.
Zusätzlich kann besagte transgene Expressionskassette eine Nukleinsäuresequenz enthalten, deren transgene Expression zu einer Steigerung der Fettsäure-Biosynthese führt (infolge proOIL). Diese zusätzich transgen exprimierte proOIL Nukleinsäuresequenz kann bespielhaft aber nicht einschränkend ausgewählt sein aus Nukleinsäuren kodierend für Acetyl-CoA-Carboxylase (ACCase), Glycerol-3-Phosphat Acyltransferase (GPAT), Lysophosphatidat-Acyltransferase (LPAT), Diacylglycerol-Acyltransferase (DAGAT) und phospholipid:diacylglycerol-acyltransferase (PDAT).
Die proOIL Nukleinsäuresequenzen umfassen auch solche Nukleinsäuren, deren transgene Expression eine antisense-RNA oder doppelsträngige RNA erzeugt, die ebenfalls eine Erhöhung der Fettsäure- Produktion bewirkt.
Bevorzugte Beispiele umfassen Vektoren, die folgende transgenen Expressionskassetten enthalten:

a) 5'-35S-Promotor/Desaturase/OCS-Terminator/LeguminB- Promotor/proOIL/NOS-Terminator-3';
b) 5'-35S-Promotor/proDesaturase oder Konjugase/OCS-Terminator/LeguminB-Promotor/proOIL/NOS-Terminator-3';

Die Konstrukte a) und b) erlauben die gleichzeitige Transformation der Pflanze mit einer Desaturase und einer die Fettsäure- Biosynthese steigernden Sequenz proOIL.
Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonierungstechniken können die erfindungsgemässen Desaturase oder pro- OIL Nukleinsäuren oder transgenen Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E.coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u. a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren können.
Die erfindungsgemässen Desaturase oder proOIL Nukleinsäuren oder transgenen Expressionskassetten werden bevorzugt in geeignete Transformationsvektoren insertiert. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 (1993) beschrieben. Beispiele und Verfahren zur Transformation sind weiter unten ausgeführt.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organismen, transformiert mit wenigstens einer erfindungsgemässen transgenen Expressionskassette oder einem erfindungsgemässen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw. - oder Vermehrungsgut abgeleitet von solchen Organismen.
Unter Organismus, Ausgangs- oder Wirtsorganismen werden prokaryotische oder eukaryotische Organismen, wie beispielsweise Mikroorganismen oder pflanzliche Organismen verstanden.
Bevorzugte Mikroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algen oder Pilze.
Bevorzugte Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Clostrridium, Proionibacterium, Butyrivibrio, Eubacterium, Lactobacillus, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes, Phaeodactylum, Colpidium, Mortierella, Entomophthora, Mucor, Crypthecodinium oder Cyanobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis.
Bevorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemässen Konstrukte befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismus sind solche aus der Gattung Agrobacterium und insbesondere der Art Agrobacterium tumefaciens.
Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula oder Pichia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Phytophthora infestans oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1, 2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschriebene Pilze.
Als transgene Organismen bevorzugt sind vor allem pflanzliche Organismen. "Pflanzlicher Organismus" umfasst jeden Organismus, der zur Photosynthese befähigt ist, sowie die von diesem abgeleitete Zellen, Gewebe, Teile oder Vermehrungsgut (wie Samen oder Früchte). Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches. Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sowie Gymnospermen sind bevorzugt. Eingeschlossen sind reife Pflanze, Saatgut, Sprosse und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut (zum Beispiel Knollen, Samen oder Früchte), Pflanzenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
"Pflanze" umfasst alle einjährigen und mehrjährige, monokotyledonen und dikotyledonen Pflanzen und schließt beispielhaft jedoch nicht einschränkend solche der Gattungen Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Picea und Populus ein.
Bevorzugt sind Pflanzen nachfolgender Pflanzenfamilien: Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculiaceae, Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.
Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Gramineae wie Alfalfa, Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern.
Die Erfindung wird ganz besonders bevorzugt aus dikotyledone pflanzliche Organismen angewendet. Bevorzugte dikotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel

- Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula und andere mehr,
- Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat) und andere mehr,
- Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps), campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl), oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli) und weitere Kohlarten; und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Canola und andere mehr,
- Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini und andere mehr,
- Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) Soja sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss und andere mehr
- Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae wie beispielsweise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffestrauch) und andere mehr,
- Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) sowie Tabak oder Paprika und andere mehr,
- Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch) und andere mehr,
- Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch) und andere mehr,
- Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karrotte)) und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Selarie)) und andere mehr; und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer) und andere mehr,

Umfasst sind ferner Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäume, Blumen, Schnittblumen, Sträucher oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose); Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen, die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen, Cyanobakterien sowie Moose. Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Insbesondere bevorzugt ist Synechocystis.
Am meisten bevorzugt sind Pflanzen, die zur Ölproduktion geeignet sind, wie beispielsweise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel (Carthamus tinctorius), Ölbaum, Soja, Erdnuß, Rizinus, Ölpalme, Mais, Weizen, Kakaostrauch oder verschiedene Nussarten wie beispielsweise Walnuss, Kokosnuß oder Mandel. Am meisten bevorzugt sind ferner Arabidopsis, Baumwolle, Flachs, Lein.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen oder Cyanobakterien, sowie Moose. Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Ferner bevorzugt sind Protozoen wie Dinoflagellaten genannt.
Aus vorgenannten Organismen sind insbesondere die bevorzugt, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können wie Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färberdistel, Rizinus, Erdnuß, Kakaobohne oder Sonnenblume oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, besonders bevorzugt werden Soja, Raps, Sonnenblume oder Saccharomyces cerevisiae.
Die in den Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann batch weise, semi batch Weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nach gefüttert werden.
Die Einführung einer erfindungsgemässen transgenen Expressionskassette in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zellen, Gewebe, Organe, Teile oder Samen), kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die transgene Expressionskassetten enthalten sind. Die transgene Expressionskassette kann in den Vektor (zum Beispiel ein Plasmid) über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Das entstandene Plasmid wird zunächst in E.coli eingeführt. Korrekt transformierte E.coli werden selektioniert, gezüchtet und das rekombinante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen.
Die Einführung einer erfindungsgemässen Expressionskassette in Zellen, bevorzugt in pflanzliche Zellen, kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacterien sein. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der Expressionskassette mittels Plasmidvektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.
Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert, dass die entsprechende DNA, RNA oder Protein in die entsprechende Wirtzelle eingebracht wird.
Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185: 527-537). So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228: 104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75: 30-36; Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al. (1980) Science 208: 1265; Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).
Die Desaturasen bzw. Konjugasen lassen sich zur gentechnologischen Veränderung eines breiten Spektrums an Organsimen, bevorzugt von Pflanzen verwenden, so daß diese ein de novo Produzent eines oder mehrerer von Lipiden hergeleiteter Produkte, wie beide CLA-Isomere, wird. Pflanzen werden nach Transformation zunächst regeneriert und anschließend wie üblich angezüchtet bzw. angebaut.
Klonierungsvektoren und Techniken zur genetischen Manipulation von Ciliaten und Algen sind dem Fachmann bekannt (WO 98/01572; Falciatore et al. (1999) Marine Biotechnology 1(3): 239-251; Dunahay et al. (1995) J Phycol 31: 10004-1012).
Verschiedene Methoden und Vektoren zum Einschleusen von Genen in das Genom von Pflanzen sowie zur Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen sind bekannt (Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993); White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 15-38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, S. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205-225; Halford NG, Shewry PR (2000) Br Med Bull 56(1): 62-73). Dazu zählen beispielhaft die oben erwähnten. Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte "particle bombardment" Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion. Im Falle dieser "direkten" Transformationsmethoden sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe, pBR322, M13mp Reihe, pACYC184 etc. können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Diese Stämme enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid), das auf die Pflanze nach Agrobaterium-Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA), wird in das Genom der Pflanzenzelle integriert. Alternativ können durch Agrobakterium auch binäre vektoren (Mini-Ti-Plasmide) auf Pflanzen übertragen und in deren Genom integriert werden. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone, diploide Pflanzenzellen geeignet, wohingegen die direkten Transformationstechniken sich für jeden Zelltyp eignen. Verfahren zur Agrobakterium vermittelten Transformation sind beispielsweise beschrieben bei Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229f. Werden Agrobacterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wird ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden.
Für die Agrobacterium Tranformation werden bevorzugt binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163: 181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das nptII Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4: 277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101.2 oder pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA; Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711), pBinAR, pPZP200 oder pPTV.
Die mit einem solchen Vektor transformierten Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z. B. von Raps, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschliessend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist beschrieben (White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, S. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205-225). Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die integriert die oben beschriebenen erfindungsgemässen Desaturase oder Konjugase, pro- Desaturase oder Konjugase oder proOIL Nukleinsäuren oder transgenen Expressionskassetten oder Vektoren enthalten.
Stabil transformierte Zellen d. h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide (wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc.) zu verleihen vermag (s. o.). Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind oben genannt und umfassen bevorzugt das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol 21(5): 871-884), das nptII Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten vorzugsweise kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden. Entsprechende Verfahren sind beschriebe (Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14: 273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89: 525-533).
Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nukleinsäuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermehrung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektionsmethoden ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression einer Desaturase oder einer proOIL-Nukleinsäuresequenz und deren Auswirkung auf die CLA und/oder Fettsäure Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.
Aus den transgenen Organismen werden die bevorzugt ausgewählt, die im Vergleich zum untransformierten Wildtyp eine verbesserte CLA Produktion aufweisen. Eine verbesserte CLA Produktion bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Beispiel die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung wenigstens einer Verbindung aus der Gruppe der CLA deren Estern wie beispielsweise CoA-Ester oder Glyceridester, in dem transgenen Organismen gegenüber dem nicht gentechnisch modifizierten Ausgangsorganismus. Dabei ist die CLA Produktion in dem transgenen Organismus gegenüber dem nicht gentechnisch modifizierten Ausgangsorganismus bevorzugt um 10%, besonders bevorzugt um 50%, ganz besonders bevorzugt um 100% erhöht. Verbessert kann ebenfalls eine vorteilhaft veränderte qualitative Zusammensetzung des CLA-Gemisches bedeuten, d. h. einer gegenüber dem Ausgangsorganismus erhöhten relativen Anteil an (9Z,11E)-CLA und/oder (10E,12Z)-CLA.
Erfindungsgemäss sind ferner von den oben beschriebenen transgenen Organismen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der oben beschriebenen erfindungsgemässen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Kosmetika oder Feinchemikalien, wie freien Fettsäuren, insbesondere CLA. Insbesondere bevorzugt ist die Verwendung zur Herstellung von CLA enthaltenen Lipiden, bevorzugt Triglyceriden.
Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemässe, genetisch veränderte Pflanzen können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futtermittel verwendet werden.
Aus den Organismen werden nach Anzucht die Lipide in üblicherweise gewonnen. Hierzu können die Organismen nach Ernte zunächst aufgeschlossen werden oder direkt verwendet werden. Die Lipide werden vorteilhaft mit geeigneten Lösungsmitteln wie apolare Lösungsmittel wie Hexan oder Ethanol, Isopropanol oder Gemischen wie Hexan/Isopropanol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol bei Temperaturen zwischen 0°C bis 80°C, bevorzugt zwischen 20°C bis 50°C extrahiert. Die Biomasse wird in der Regel mit einem Überschuß an Lösungsmittel extrahiert beispielsweise einem Überschuß von Lösungmittel zu Biomasse von 1 : 4. Das Lösungmittel wird anschließend beispielsweise über eine Destillation entfernt. Die Extraktion kann auch mit superkritischem CO₂ erfolgen. Nach Extraktion kann die restliche Biomasse beispielsweise über Filtration entfernt werden.
Das so gewonnene Rohöl kann anschließend weiter aufgereinigt werden, beispielsweise in dem Trübungen über das Versetzen mit polaren Lösungsmittel wie Aceton oder Chloroform und anschließender Filtration oder Zentrifugation entfernt werden. Auch eine weitere Reinigung über Säulen ist möglich.
Zur Gewinnung der freien Fettsäuren aus den Triglyceriden werden diese in üblicherweise verseift.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind pflanzliche Öle, Fettsäuregemische und/oder Triglyceridgemische mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren, bevorzugt an CLA, die nach den oben genannten erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, sowie deren Verwendung zur Herstellung von Nahrungsmitteln, Tierfutter, Kosmetika oder Pharmazeutika. Hierzu werden diese den Nahrungsmitteln, dem Tierfutter, den Kosmetika oder Pharmazeutika in üblichen Mengen zugesetzt.

Sequenzen

1. SEQ ID NO: 1: Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Acyl-CoA E11-desaturase aus Epiphyas postvittana.
2. SEQ ID NO: 2: Proteinsequenz kodierend für eine Acyl-CoA E11-desaturase aus Epiphyas postvittana.
3. SEQ ID NO: 3: Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Acyl-CoA Z/E11 desaturase aus Ostrinia nubilalis.
4. SEQ ID NO: 4: Proteinsequenz kodierend für eine Acyl-CoA Z/E11 desaturase aus Ostrinia nubilalis.
5. SEQ ID NO: 5: Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Acyl-CoA Z/E11 desaturase aus Ostrinia furnacalis.
6. SEQ ID NO: 6: Proteinsequenz kodierend für eine Acyl-CoA Z/E11 desaturase aus Ostrinia furnacalis.
7. SEQ ID NO: 7: Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Acyl-CoA Δ11 desaturase aus Helicoverpa zea.
8. SEQ ID NO: 8: Proteinsequenz kodierend für eine Acyl-CoA Δ11 desaturase aus Helicoverpa zea.
9. SEQ ID NO: 9: Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Acyl-CoA Δ11 desaturase aus Trichoplusia ni.
10. SEQ ID NO: 10: Proteinsequenz kodierend für eine Acyl-CoA Δ11 desaturase aus Trichoplusia ni.
11. SEQ ID NO: 11: Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Acyl- CoA Δ11 desaturase aus Argyrotaenia velutinana.
12. SEQ ID NO: 12: Proteinsequenz kodierend für eine Acyl-CoA Δ11 desaturase aus Argyrotaenia velutinana.
13. SEQ ID NO: 13: Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Acyl- CoA Z10 Desaturase aus Planotortrix octo.
14. SEQ ID NO: 14: Proteinsequenz kodierend für eine Acyl-CoA Z10 Desaturase aus Planotortrix octo.
15. SEQ ID NO: 15: 5'-ATYACHGCCGGKKMYCAYMG-3'
16. SEQ ID NO: 16: 5'-GGRAABDYGTGRTGGWAGTT-3'
17. SEQ ID NO: 17: 5'-CCCCAYCRNCTSTGGWCNCA-3'
18. SEQ ID NO: 18: 5'-CCCTCTAGARTGRRWARTTRTGRWA-3'
19. SEQ ID NO: 19: 5'-TAATACGACTCACTATAG-3'
20. SEQ ID NO: 20: 5'-ACATAACTAATTACATGAT-3'

Beispiele

Die Erfindung wird in den folgenden Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren näher erläutert. Dabei werden Abkürzungen mit folgender Bedeutung verwendet:

Allgemeine Methoden

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E.coli Zellen, Anzucht der Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, AgaroseGelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E.coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467).

Beispiel 1

Anzucht der Lepidoptera Insekten

Die Insekten werden in Terrarrien auf geeigtneten Wirtspflanzen gehalten. Die Wachstumsbedingungen sind: 27°C, Tag-Nacht-Rhythmus:
14 h Licht, 10 Stunden Dunkelheit. Insekten bzw. Larven werden zweimal in der Woche auf frische Pflanzen umgesetzt. Puppen werden gesammelt und Männchen und Weichchen werden getrennt in Terrarien bis zum Schlüpfen der fertigen Insekten gehalten. Etwa 1 bis 2 Tage nach Schlüpfen der Insekten können die Pheromondrüsen isoliert weren.

Beispiel 2

Isolierung von Desaturase- oder Konjugase cDNAs mittels degenerierten Primer

Die Pheromondrüsen werden aus dem Hinterleib erwachsener Motten isoliert und in N2 liq. eingefroren bis gesamt RNA isoliert wird mittels, zum Beispiel, TRIzol (GIBCO/BRL) nach Herstellerangaben. Erfahrungsgemäss kann aus ungefähr 30 mg Frischgewebe etwa 60 bis 80 µg gesamt RNA isoliert werden. Etwa 5 µg gesamt RNA wird eingesetzt um eine Erststrang-cDNA mit einen oligo(dT)-Primer herzustellen. Hierzu kann zum Beispiel den SMART RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH) nach Herstellerangaben verwendet werden. Diese Einzelstrang-cDNA dient als Matrice für eine PCR worin den zentralen Bereich der Desaturase/Konjugase-cDNA amplifiziert wird. Zwei degenerierte Primer werden so entworfen, dass sie die konservierte zentrale Region der Desaturasen/Konjugasen aus Lepidoptera amplifizieren können, und in folgenden PCR-Protokol eingesetzt:
5 µl verdünnter Einzelstrang-cDNA
0,2 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP
0,5 µM 5'-Primer (SEQ ID NO 8)
0,5 µM 3'-Primer (SEQ ID NO 9)
10 µl 5 × Advantage 2 reaction buffer (CLONTECH)
1 µl 50 × Advantage 2 DNA Polymerase mix (CLONTECH)
H2O add. 50 µl
Alternativ werden als Primerpaar die degenerierten Primer mit der SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 für die Amplifikation der zentrale Desaturasenregion verwendet.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
1 Schritt mit: 94°C (5 min)
35 Zyklen mit: 94°C (30 sec), 56°C (30 sec), 72°C (3 min)
1 Schritt mit: 72°C (10 min)
Warteposition: 4°C
Das PCR-Produkt wird direkt beispielsweise in den linearisierten TOPO TA PCR 2.1 Vector (INVITROGEN) ligiert und anschließend in E.coli TOP 10 kompetente Zellen (INVITROGEN) transformiert. Positive Kolonien werden nochmals amplifiziert, die Plasmid-DNA aufgereinigt (QIAGEN Plasmid Mini Kit) und anschließend sequenziert.
Auf Grund der gewonnene Sequenzinformation können gen-spezifische Primer abgeleitet werden und zur Amplifizierung von 5'- und 3'-Bereiche eingesetzt werden (SMART RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH)). Auch diese PCR-Produkte werden in den TOPO TA PCR 2.1 Vector (INVITROGEN) ligiert und anschließend in TOP 10 kompetente Zellen (INVITROGEN) transformiert. Positive Kolonien werden nochmals amplifiziert und die Plasmid-DNA aufgereinigt (QIAGEN Plasmid Mini Kit) und anschließend sequenziert.
Aus den so generierten Fragmenten, kann die vollständige Sequenz einer Desaturase/Konjugase mittels Standardklonierungstechniken zusammengesetzt und zur Charakterisierung beispielsweise in den pYES2 Vektor (INVITROGEN) zur Hefe-Expression überführt werden. Saccharomyces INVSc1 (INVITROGEN) werden mit den entsprechenden pYES2-Expressionsvektoren mittels eines modifizierten PEG/Lithiumacetat-Protokolls transformiert (Ausubel et al. (1996) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York). Nach der Selektion auf CMdum-Agarplatten mit 2% Glucose werden vier pYES2DESAT-Transformanten (pYES2DESATa-d) und eine pYES2-Transformante zur weiteren Züchtung und funktionellen Expression ausgewählt.

Beispiel 3

Funktionelle Expression einer Desaturase/Konjugase in Hefe

Vorkultur: 20 ml CMdum-Flüssigmedium mit 2% (Gew./Vol.) Raffinose wurden mit den transgenen Hefeklonen (pYES2DESATa-d, pYES2) angeimpft und 3 T bei 30°C, 200 rpm gezüchtet, bis eine optische Dichte bei 600 nm (OD600) von 1,5-2 erreicht war.
Hauptkultur: Für die Expression wurden 20 ml CMdum-Flüssigmedium mit 2% Raffinose und 1% (Vol./Vol.) Tergitol NP-40 mit den entsprechende Substrate, wie Stearinsäure, Palmitinsäure oder Myristinsäure, auf eine Endkonzentration von 0,003% (Gew./Vol.) angereichert. Die Medien wurden mit den Vorkulturen auf eine OD600 von 0,05 angeimpft. Die Expression wurde bei einer OD600 von 0,2 mit 2% (Gew./Vol.) Galaktose für 16 Std. induziert, wonach die Kulturen eine OD600 von 0,8 bis 1,2 erreicht hatten.
Fettsäureanalyse: Die Gesamt-Fettsäuren wurden aus Hefekulturen extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert. Davon wurden Zellen von 5 ml Kultur mittels Zentrifugation (1000 × g, 10 min. 4°C) geerntet und einmal mit 100 mM NaHCO3, pH 8,0, gewaschen, um restliches Medium und Fettsäuren zu entfernen. Zur Herstellung der Fettsäuremethylester (FAMES) werden die Zellsedimente schockgefroren in N2 liq. und unter N2-Gas bei 30^ºC lyophyllisiert. Das Pellet wird in 1% Natriummethoxyd in Methanol homogenisiert und für 20 minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden gleiche Volumen von 1 M NaCl und n-Heptan zugegeben, gemischt und der Überstand in ein GC-Rörchen überführt. Die Proben werden auf einer DB-Wax-Kapillarsäule (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm; Agilent J & W) in einem Hewlett Packard-6890-Gaschromatograph mit einem Flammenionisationsdetektor aufgetrennt. Die Ofentemperatur wurde von 60°C (5 min halten) bis 200°C mit einer Rate von 20°C/min (20 min halten) und schließlich auf 250°C (30 min halten) mit einer Rate von 20°C/min programmiert. Stickstoff wurde als Trägergas verwendet (1,6 ml/min). Die Fettsäuren wurden durch Vergleich mit Retentionszeiten von FAME-Standards (SIGMA) identifiziert. Als Standard werden dazu vorzugsweise nachfolgende Fettsäuren verwendet: c9-16:1, t9-16:1, 18:0, c9-18:1, t9-18:1, c11-18:1, t11-18:1, c9,c12-18:2, t9,t12-18:2, c9,t11-18:2, t10,c12-18:2. (Die Nomenklatur der Standards entspricht der für Fettsäuren üblichen und gibt zunächst Konfiguration (c = cis oder t = trans) und Stellung der Doppelbindung bzw. Kettenlänge der Fettsäure an.)
Weitere Fütterungsexperimente mit verschiedenen anderen Fettsäuren (z. B. Laurinsäure, trans-Vaccensäure, cis-Vaccensäure, E10-Octadecensäure oder Z10-Octadecensäure) können zur detaillierteren Bestätigung der Substratselektivität dieser Desaturase/Konjugase durchgeführt werden.

Beispiel 4

Expressionsklonierung von Desaturase/Konjugase aus Lepidoptera in Saccharomyces cerevisiae

a) Herstellung der cDNA-Bibliothek

Die Pheromondrüsen werden aus dem Hinterleib erwachsener Motten isoliert und in N2 liq. eingefroren bis gesamt RNA isoliert wird mittels, zum Beispiel, TRIzol (GIBCO/BRL) nach Herstellerangaben. Erfahrungsgemäss kann aus ungefähr 30 mg Frischgewebe etwa 60 bis 80 µg gesamt RNA isoliert werden. Etwa 5 µg gesamt RNA wird eingesetzt um eine cDNA-Bibliothek herzustellen. Hierfür kann zum Beispiel den SMART cDNA Library Construction Kit (CLONTECH) nach Herstellerangaben verwendet werden. Die isolierte doppelstrangige cDNA wird letzendlich in den linearisierten pYES2 (INVITROGEN) Hefeexpressionsvector ligiert. Dazu wird in den pYES2 zuerst die Multiple-Cloning-Site des pTriplEx2-Vektors (CLONTECH) insertiert. In den so modifizierten Vekor wird dann die doppelsträngige cDNA nach Verdau mit SfiIA sowie SfiIB gerichtet kloniert.

b) Hefetransformation

Etwa 1,5 µg Plasmid-DNA wird mit den Saccharomyces cerevisiae EASY COMP Transformation kit (INVITROGEN) in INVSc1 (INVITROGEN) transformiert nach Herstellerangaben. Zwei 50 µl-Ansätze werden auf Selektionsmedium in eine große eckige Petrischale (245 × 245 mm) ausplatiert, und für 3 tage bei 30°C inkubiert.

c) Anzucht der Hefen in Microtiterplatten

Einzelne Kolonien werden mit ein Pick-Roboter in Microtiterplatten (MTP) überführt. Die Vorkultur findet in 200 µl Medium [1 × CSM-Ura; 1 × YNB ohne Aminosäuren und Zucker; 0,5% Raffinose; 5% Glycerin; 40 mg/1 Adeninsulfat; 0,5% Ammoniumsulfat] für 72 Stunden bei 30°C und 250 Umdrehungen/Minute statt. Durch Zugabe eines durchschnittlichen Volumens aus der Vorkultur wird eine OD600 von 0,2 in der Hauptkultur eingestellt. Die Hauptkultur findet in 1 ml Medium [1 × CSM-Ura; 1 × YNB ohne Aminosäuren und Zucker; 0,5% Raffinose; 2% Galactose; 0,2% Tergitol NP-40; 40 mg/l Adeninsulfat; 0,5% Ammoniumsulfat; 0,3 mM Fettsäure-Substrat] für 2 bis 3 Wochen bei 16°C und 250 Umdrehungen/Minute, bis einer OD600 von 3 bis 4 erreicht wird, statt.

d) Fettsäureanalyse

Die Hefezellen werden sedimentiert (1000 × g, 10 min, 4°C) und bis zur weitere Verarbeitung bei -80°C gelagert. Zur Herstellung der Fettsäuremethylester (FAMES) werden die Zellsedimente schockgefroren in N2 liq. und unter N2-Gas bei 30^ºC lyophyllisiert. Das Pellet wird in 1% Natriummethoxyd in Methanol homogenisiert und für 20 minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden gleiche Volumen von 1 M NaCl und n-Heptan zugegeben, gemischt und der Überstand in ein GC-Gefäß überführt. Die Proben werden auf einer DB-Wax-Kapillarsäule (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm; Agilent J & W) in einem Hewlett Packard-6890-Gaschromatograph mit einem Flammenionisationsdetektor aufgetrennt. Die Ofentemperatur wurde von 60°C (5 min halten) bis 200°C mit einer Rate von 20°C/min (20 min halten) und schließlich auf 250°C (30 min halten) mit einer Rate von 20°C/min programmiert. Stickstoff wurde als Trägergas verwendet (1,6 ml/min). Die Fettsäuren wurden durch Vergleich mit Retentionszeiten von FAME-Standards (SIGMA) identifiziert. Dabei werden die gleichen Standards - wie in Beispiel 3 aufgeführt - verwendet. Weitere Fütterungsexperimente mit verschiedenen anderen Fettsäuren (z. B. Laurinsäure, trans-Vaccensäure, cis-Vaccensäure, E10-Octadecensäure oder Z10-Octadecensäure) können zur detaillierteren Bestätigung der Substratselektivität dieser Desaturase oder Konjugase durchgeführt werden.

e) Plasmidpräparation der positiven Hefen

Einzelklone welche positiv getestet worden sind werden erneut über 24 Stunden bei 28°C in 10 ml Minimalmedium [1 × CSM-Ura; 1 × YNB w/o AA, sugars; 2% glucose; 40 mg/l Adeninsulfat] angezogen und bei einer OD600 größer als 3 durch Zentrifugation sedimentiert. Das Hefepellet wird für 20 Minuten bei 37°C in 400 µl SCE-Puffer [1,2 M Sorbit; 0,1 M Na-Citrat, pH 7,0; 10 mM EDTA; 1 mg/ml Lytikase] inkubiert. Anschließend wird 400 µl STE-Puffer [2% SDS; 50 mM Tris/HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA] zur Zelllyse zugegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Präzipitation des Zellproteins wird 200 µl 5 M Natriumacetat zugegeben und 30 Minuten auf Eis gestellt. Nach Zentrifugation wird den Überstand überführt und mit 2,5-fachem Volumen Ethanol gefällt. Das sedimentierte Pellet wird mit 70% Ethanol gewaschen und letztendlich in sterilem Wasser aufgenommen. Die Sequenz der DESATU- RASE/KONJUGASE kann gegebenenfalls durch Sequenzierung unter Verwendung von Vector spezifischen Primern (SEQ ID NO: 12 und 13) ermittelt werden.

Beispiel 5

Manipulation der pflanzlichen Fettsäure-Biosynthese

a) Erzeugung von DNA Konstrukten zur Expression von Desaturasen/Konjugasen aus Lepidoptera in transgenen Pflanzen

Zur Herstellung von chimären DNA Konstrukten zur Erzeugung transgener A.thaliana bzw. B.napus Pflanzen, die die Desaturasen/Konjugasen aus Lepidoptera exprimieren, wird der Vektor pBinAR verwendet (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Sci 66: 221-230). Dieser enthält den 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al. (1980) Cell 21 (1): 285-294) sowie das Terminations- Signal des Octopin-Synthase Gens (Gielen et al. (1984) EMBO J 3: 835-846). Nach Klonierung der DESAT/KONJ in diesen Vektor erfolgt Erzeugung transgener A.thaliana bzw. Brassica napus Pflanzen.

b) Herstellung transgener Arabidopis thaliana Pflanzen

Wildtyp Arabidopsis thaliana Pflanzen (Columbia) werden mit dem Agrabacterium tumefaciens Stamm (GV3101 [pMP90]) auf Grundlage einer modifizierten Vacuuminfiltrationsmethode transformiert (Clough S und Bent A (1998) Plant J 16(6): 735-43; der Bechtold N et al. (1993) in: Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CRAcad Sci Paris 1144(2): 204-212). Die verwendeten Agrobacterium tumefaciens Zellen waren im Vorfeld mit den Plasmiden transformiert worden.
Samen der Primärtransformanden werden auf Grundlage der Antibiotikaresistenz selektioniert. Antibiotika resistente Keimlinge werden in Erde gepflanzt und als vollentwickelte Pflanzen zur biochemischen Analyse verwendet.

c) Herstellung transgener Brassica napus Pflanzen

Die Herstellung transgener Rapspflanzen orientiert sich an einem Protokoll von Bade JB und Damm B (in Gene Transfer to Plants, Potrykus I und Spangenberg G (eds.) Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Puffer angegeben ist.
Die Transformationen erfolgen mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101 [pMP90]. Zur Transformation werden die Plasmide pBinAR-TkTP/Vit E-AT verwendet. Samen von Brassica napus var. Westar werden mit 70% Ethanol (v/v) oberflächensteril gemacht, 10 Minuten bei 55°C in Wasser gewaschen, in 1%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Teepol, 0,1% v/v Tween 20) für 20 Minuten inkubiert und sechsmal mit sterilem Wasser für jeweils 20 Minuten gewaschen. Die Samen werden drei Tage auf Filterpapier getrocknet und 10 bis 15 Samen in einem Glaskolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca. 10 cm groß) werden die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explantate werden 30 Minuten mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einen 300 ml Kolben überführt. Nach Zugabe von 100 ml Kallusinduktionsmedium werden die Kulturen für 24 Stunden bei 100 U/min inkubiert.
Vom Agrobacterium Stamm wird eine Übernachtkultur bei 29°C in Luria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/l) angesetzt, davon 2 ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 Stunden bei 29°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0.4 bis 0.5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wird das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wird durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine OD₆₀₀ von 0.3 eingestellt.
Aus den Raps-Explantaten wird das Kallus-Induktionsmedium mit sterilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobakterium-Lösung hinzugefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agrobacterien-Suspension wird entfernt, die Raps-Explantate für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus-Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wird für 24 h auf einem Rotationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co-Kultivierung wird durch Wegnahme des Kallus-Induktionsmediums gestoppt und die Explantate zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explantaten wird in 15 cm Petrischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten entfernt.
Zur Regeneration werden jeweils 20 bis 30 Explantate in 90 mm Petrischalen überführt, welche 25 ml Sproß-Induktionsmedium mit Kanamycin enthalten. Die Petrischalen werden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage werden die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Sproß-Induktionsmedium umgesetzt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration ganzer Pflanzen werden wie von Bade, J. B und Damm, B. (in: Gene Transfer to Plants, Potrykus I und Spangenberg G (eds.) Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrieben durchgeführt.

d) Analyse des Fettsäuremuster in den transgenen Pflanzen

Die Samen transgener Pflanzen werden direkt in 1% Natriummethoxyd in Methanol homogenisiert und für 20 minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden gleiche Volumen von 1 M NaCl und n-Heptan zugegeben, gemischt und der Überstand in ein GC-Rörchen überführt. Die Proben werden auf einer DB-Wax-Kapillarsäule (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm; Agilent J & W) in einem Hewlett Packard-6890-Gaschromatograph mit einem Flammenionisationsdetektor aufgetrennt. Die Ofentemperatur wurde von 60°C (5 min halten) bis 200°C mit einer Rate von 20°C/min (20 min halten) und schließlich auf 250°C (30 min halten) mit einer Rate von 20°C/min programmiert. Stickstoff wurde als Trägergas verwendet (1,6 ml/min). Die Fettsäuren wurden durch Vergleich mit Retentionszeiten von FAME- Standards (SIGMA) identifiziert. Dabei werden die gleichen Standards - wie in Beispiel 3 aufgeführt - verwendet. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von ungesättigte Fettsäuren umfassenden Trigylceriden, dadurch gekennzeichnet, dass in einem pflanzlichen Organismus mindestens einer Fettsäuredesaturase aus Insekten der Ordnung Lepidoptera transgen exprimiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäuredesaturase in Fettsäuren, Fettsäure-CoA-Estern oder anderen Fettsäurederivaten eine Doppelbindung an der Position C8, C9, C10, C11 oder C12 erzeugen kann.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäuredesaturase spezifisch eine cis oder trans Doppelbindung in Fettsäuren, Fettsäure-CoA-Estern oder anderen Fettsäurederivaten mit einer Kettenlänge der Fettsäure von 16 oder 18 C-Atomen erzeugt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäuredesaturase eine Homologie von mindestens 65% zu einer der Fettsäuredesaturasen beschrieben durch SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 oder 14 hat.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz der Fettsäuredesaturase

a) in ihren sense-Strang eine Sequenzmotiv beschrieben durch SEQ ID NO: 15 oder 17 enthält, oder

b) in ihren antisense-Strang eine Sequenzmotiv beschrieben durch SEQ ID NO: 16 oder 18 enthält.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die ungesättigten Fettsäuren konjugierte Linolsäure umfassen.

7. Triglyceride hergestellt mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

8. Verwendung von Triglyceriden nach Anspruch 7 zu Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Kosmetika oder Feinchemikalien.