CN101005854A - 用于增进b细胞消除的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过促进淋巴组织中扣留的B细胞亚群进入血管内使得B细胞对B细胞消除剂介导的杀伤作用敏感来提升B细胞消除的方法。促进进入血管内的一种方法是通过使用整联蛋白拮抗剂。还提供了通过这种方法来治疗B细胞紊乱的方法。

Description

用于增进B细胞消除的方法

相关申请

本申请要求根据U.S.C.§1.19(e)(1)赋予2004年4月16提交的美国临时申请60/563,263的权益，将其完整公开书引入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及杀死B细胞的方法。

发明背景

淋巴细胞是白血球的几种群体之一；它们特异识别和应答外来抗原。三类主要的淋巴细胞是B淋巴细胞(B细胞)、T淋巴细胞(T细胞)和天然杀伤(NK)细胞。B淋巴细胞是负责抗体生成和提供体液免疫的细胞。B细胞在骨髓中成熟并离开骨髓，在它们的细胞表面上表达抗原结合抗体。当幼稚B细胞首次遭遇其膜结合抗体的特异抗原时，细胞开始快速分裂，且其后代分化成记忆B细胞和称做“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞具有较长的寿命，并继续表达与最初的亲代细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不生成膜结合抗体，但改为生成分泌形式的抗体。分泌型抗体是体液免疫的主要效应分子。

已经开发了针对B细胞靶的抗体治疗剂用于治疗B细胞疾病，这些治疗剂依赖被动输注抗体的能力来消除携带抗原的细胞。例如，已经开发了靶向CD20、CD22和CD52表面分子的抗体(Treon等，2000，Seminars inOncology 27(6增刊12)：79-85；Juweid，2003，Current Opinion in MolecularTherapeutics 5(2)：192-198；Cersosimo，2003，Monoclonal antibodies in thetreatment of cancer，第I部分，American Journal of Health-System Pharmacy60(15)：1531-1548；第II部分，60(16)：1631-1641)。

CD20抗原(也称为人B淋巴细胞限制分化抗原，Bp35)是在正常和恶性B细胞上表达的、分子量约35kD分子量的跨膜磷蛋白。其表达在B细胞发育过程中受到调控，在晚期前B细胞(pre-B cell)中出现并在未成熟和成熟B淋巴细胞上存在(Valentine等，1989，J.Biol.Chem.264：11282-11287；及Einfeld等，1988，EMBO J.7：711-717)。该抗原还在超过90％的B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson等，1984，Blood 63：1424-1433)，但在造血干细胞、原B细胞(pro-B cell)、正常浆细胞或其它正常组织上没有发现(Tedder等，1985，J.Immunol.135：973-979)。认为CD20调节细胞周期起始和分化的激活过程的早期步骤(Tedder等，见上文)，并可能作为钙离子通道发挥作用(Tedder等，1990，J.Cell.Biochem.14D：195)。

整联蛋白是能介导细胞-细胞和细胞-胞外基质相互作用的异二聚体跨膜细胞粘着受体的一个家族(Humphries等，1990，TIBS 28：313-320)。整联蛋白包含彼此非共价缔合的两个无关I型膜糖蛋白，称为α和β亚基(Humphries，见上文)。所有α和β亚基每个亚基都具有大型胞外域(700-1100个残基)、一个跨膜螺旋和小型胞质域(30-50个残基)(Humphries，2000，见上文)。

哺乳动物具有至少19种不同α亚基和8种β亚基，装配成至少25种不同受体(Humphries，2000，Biochem.Soc.Trans.28：311-339)。α亚基包括αE、α1-11、αV、αIIB、αL、αM、αX和αD(Arnaout等，2002，Immunological Reviews 186：125-140)。β亚基包括β1-8(Arnaout，见上文)。整联蛋白亚基以不同组合在不同细胞类型中表达。α1、α 2、αE、αL、αM、αX、αD、和β2共享远端N端胞外域，称为“I结构域”或“A结构域”，这样叫是因为该结构域已经插入整联蛋白或是因为它与冯维勒布兰德因子的A模体(motif)的同源性(Harris等，2000，JBC 275：23409-23412)。I结构域有约200个残基，且有报道说对于配体结合是至关重要的(Harris，见上文)。

α4，也称为CD49d或VLA-4的α亚基，已证明与β1(CD29)和β7有关(Amaout，见上文；Barclay等编，1997，The Leukocyte Antigen Facts Book，第2版，262-263)。(还可参见 http://integrins.hypermart.net上“the IntegrinPage”上公开的所列亚基和所引文献)。α4β1整联蛋白也称为极晚期抗原-4整联蛋白(VLA-4)(Mousa，2002，Cur.Opin.Chem.Biol.6：534-541)。VLA-4整联蛋白在多数白细胞上表达，除了嗜中性粒细胞和血小板(Barclay，见上文)。它结合配体VCAM-1、纤连蛋白、血小板反应蛋白、胶原蛋白、和侵袭素(Plow等，2000，JBC 275：21785-21788)。α4β7也称为淋巴细胞派尔斑粘着分子-1(LPAM-1)。α4β7在多数淋巴结T和B细胞、NK细胞、和嗜曙红细胞上表达(Barclay，见上文)，且结合血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、粘膜地址素细胞粘附分子-1(MAdCAM-1)、和纤连蛋白(Plow，见上文)。

αL，也称为CD11a或整联蛋白白细胞功能相关抗原-1(LFA-1)的α亚基，已证明与β2(CD18)缔合而形成LFA-1(Arnaout，见上文；Barclay，见上文，156-157)。(还可参见“the Integrin Page”及其引用的文献，见上文)。与α4不同，αL含有“I结构域”(Harris，见上文)。αLβ2(LFA-1)整联蛋白在人中在所有白细胞上表达。它结合至少5种配体CD54(ICAM-1)、CD102(ICAM-2)、CD50(ICAM-3)、ICAM-4和ICAM-5(Plow，见上文)。

VCAM-1，也称为INCAM-110或CD106，主要在血管内皮上表达，但也在滤泡和滤泡间树突细胞、有些巨噬细胞、骨髓基质细胞、和关节、肾、肌肉、心、胎盘和脑中的非血管细胞群上鉴定到(Barclay等编，1977，TheLeukocyte Antigen Facts Book，第2版，Academic Press，Harcourt Brace&Company，San Diego，CA)。

由于整联蛋白在白细胞运输中的活性，已经探究了几种抗整联蛋白在治疗多种疾病包括多种炎症和自身免疫病中的治疗性用途(Mousa，见上文；Yusuf-Makagiansar等，2002，Medicinal Research Reviews 22：146-147；Vincenti，2002，American Journal of Transplantation 2：898-903)。最近，有报道说αLβ2(LFA-1)和α4β1(VLA-4)对小鼠边缘区(MZ)中的B细胞保持做出实质性且多半重叠的贡献(Lu等，2002，Science 297：409-412)。Lu报告说MZB细胞表达升高水平的αLβ2(LFA-1)和α4β1(VLA-4)，而且它们结合MZ中表达的配体ICAM-1(CD54)和VCAM-1(CD106)。MZ富含IgM+记忆细胞和与自身抗原和细菌抗原起反应的细胞。有报道说经抗α4和抗αL阻断性抗体处理的小鼠丧失了脾和血液的边缘区B细胞(Lu，见上文，410-411)。推测通过阻断整联蛋白功能由脾中粘附性LT α1β2介导的小生境转移B细胞可能是清除自身反应性或恶性细胞区室的一种方法(Lu，见上文，412)。由脾中隔室清除这些B细胞的临床实用性(relevance)尚不清楚；这些细胞可能只是从一个隔室移出又进入另一个隔室。对于B细胞恶性肿瘤，有可能的是清除这些致病性B细胞可能实际上导致或加剧转移，由此使疾病恶化。

Rituximab(Rituxan^TM，Genentech Inc.，South San Francisco及Biogen-IDEC，Cambridge，MA；Mabthera，F.Hoffman-LaRoche Ltd.，Basel，Switzerland)是针对CD20分子的嵌合单克隆抗体。Rituximab目前用于治疗复发的或难治的低级或滤泡性CD20阳性B细胞非何杰金氏淋巴瘤患者。在用Rituximab处理的有些患者中观察到血液中存在小数目的残余B细胞。经由抗CD20疗法的B细胞消除机制尚不完全清楚。推测是例如Rituxan诱导B细胞凋亡或者进入脾的NK细胞杀死B细胞。通常认为表达CD20的所有B细胞对CD20结合抗体的杀伤作用同等敏感。

开发用于治疗B细胞介导的疾病的改进疗法将是有利的，因为目前的疗法不能消除所有B细胞。本发明解决了这些问题并提供了其它优势，正如下文详细描述的。

发明概述

本发明部分基于本文中抗hCD20抗体消除B细胞的体内机制的鉴定。令人惊讶的发现驻留在组织和器官中的某些B淋巴细胞，特别是脾边缘区(MZ)中的那些，对抗人CD20抗体的杀伤作用有抵抗力，即使这些细胞在它们的表面上表达足够水平的CD20并发现被施用的抗CD20抗体饱和。有趣的是，促进这些B细胞由它们驻留的组织出来进入血管系统和/或延长它们在循环中的存在使得它们对抗CD20抗体的杀伤作用敏感。考虑到这个观察结果，改进这些扣留的B细胞进入血管内的一种方法是用将这些B细胞束缚在淋巴组织某些区域的整联蛋白的拮抗剂动员它们进入循环。

本发明提供了在患有B细胞紊乱的哺乳动物中提升B细胞消除的方法，包括对所述哺乳动物施用一种或多种B细胞动员剂诸如αL整联蛋白拮抗剂和/或α4整联蛋白拮抗剂和治疗有效量的一种或多种B细胞消除剂诸如抗CD20抗体。B细胞消除能通过施用α4和αL整联蛋白拮抗剂和B细胞消除剂的组合物来提升。在优选的实施方案中，哺乳动物或患者是人。

本发明还提供了增强诸如结合CD20的抗体之消除剂的B细胞消除功效的方法，包括对患有B细胞紊乱的患者施用至少一种B细胞动员剂。αL整联蛋白拮抗剂和α4整联蛋白拮抗剂协同作用而增强B细胞消除。

本发明还提供了治疗特征为B细胞表达诸如CD20之特定标志的B细胞肿瘤或恶性肿瘤的方法，包括对患有肿瘤或恶性肿瘤的患者施用治疗有效量的结合特异标志的抗体诸如结合CD20的抗体和至少一种B细胞动员剂诸如αL整联蛋白拮抗剂和/或α4整联蛋白拮抗剂。在一个实施方案中，B细胞肿瘤选自下组：非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、淋巴细胞占优势的何杰金氏病(lymphocyte predominant Hodgkin’s disease)(LPHD)、滤泡中心细胞(FCC)淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、和毛细胞性白血病。为了治疗这些癌症，在一个实施方案中，经静脉内输液来施用抗体。施用的剂量在每剂约100mg/m²至375mg/m²的范围内。

本发明的还有一个方面是减轻B细胞调控的自身免疫性疾病的方法，包括对患有自身免疫性疾病的患者施用治疗有效量的B细胞消除剂诸如结合CD20的抗体和至少一种B细胞动员剂诸如αL整联蛋白拮抗剂和/或α4整联蛋白拮抗剂。在具体的实施方案中，自身免疫病选自下组：类风湿性关节炎和幼年型类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)包括狼疮肾炎、韦格纳氏病(Wegner’s disease)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化症、银屑病、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、ANCA相关血管炎、糖尿病、雷诺氏综合征(Reynaud’s syndrome)、斯耶格伦氏综合征(Sjorgen’s syndrome)、视神经脊髓炎(NMO)和肾小球肾炎。在优选的实施方案中，静脉内或皮下施用结合CD20的抗体。在优选的实施方案中，以每剂10mg至500mg范围内的剂量静脉内施用抗体，而在一个具体的实施方案中，剂量是100mg/剂。

另外，本发明提供了消除患有B细胞紊乱诸如B细胞肿瘤或B细胞调控的自身免疫性紊乱的患者脾脏中边缘区B细胞和/或淋巴组织生发中心中的B细胞的方法，包括对所述患者施用治疗有效量的消除剂诸如结合CD20的抗体和至少一种B细胞动员剂诸如αL整联蛋白拮抗剂和/或α4整联蛋白拮抗剂。

在本发明的任何方法中，B细胞动员剂可以是αL整联蛋白拮抗剂或α4整联蛋白拮抗剂或其组合。在一个实施方案中，α4整联蛋白拮抗剂是α4β1的拮抗剂。在一个可选实施方案中，拮抗剂是α4β7的拮抗剂。在另一个实施方案中，拮抗剂是αLβ2的拮抗剂。

在本发明的任何方法中，在不同的实施方案中，αL或α4整联蛋白拮抗剂可以是结合整联蛋白或者整联蛋白的α或β亚基的抗体，或是整联蛋白的配体的抗体。如此，涵盖结合ICAM-1(CD-54)或VCAM-1(CD-106)的抗体。类似的，涵盖本质上与全长抗体一样发挥功能而结合并阻断α4或αL整联蛋白的生物学活性的抗体生物学活性片段，诸如抗CD18 Fab’₂片段H52(Genentech，South San Francisco，CA)。当动员剂是αL整联蛋白拮抗剂时，在一个实施方案中，αL整联蛋白拮抗剂抗体是结合αL亚基CD11a的抗体，优选抗体efalizumab(Raptiva^TM，Genentech Inc.)，或是分别包含efalizumab的SEQ ID NO：49和50的VL和VH序列的结合CD11a的抗体，或是这些抗体的生物学活性片段。当动员剂是α4整联蛋白拮抗剂时，在一个实施方案中，拮抗剂是结合α4亚基的抗体natalizumab(Tysabri^TM，Biogen-IDEC)或其生物学活性片段。在优选的实施方案中，抗体是人源化的、人源的、或嵌合的抗体或其片段。

在另一个实施方案中，αL或α4整联蛋白拮抗剂是小分子。已知许多此类整联蛋白拮抗剂小分子。任何一种或多种具有通式XI的化合物，特别是表4中的化合物是αL整联蛋白拮抗剂小分子的实施方案。任何一种或多种具有通式I、II、或III的化合物、通式X且具有表1和2中所示任一取代基的任何化合物，特别是表3中的任何化合物是α4整联蛋白拮抗剂小分子的实施方案。

在另一个实施方案中，αL或α4整联蛋白拮抗剂可以是包含可溶性整联蛋白结合部分或相应配体胞外域的免疫粘附素。在一个实施方案中，免疫粘附素是与人IgG1的铰链和Fc融合的ICAM-1(CD-54)的可溶性αL配体结合部分。在另一个实施方案中，免疫粘附素是与人IgG1的铰链和Fc融合的VCAM-1(CD-106)的可溶性α4配体结合部分。

在本发明的任何方法中，B细胞消除剂是B细胞表面标志，诸如CD20、CD22、CD54、诸如此类的拮抗剂。在一个优选的实施方案中，B细胞表面标志是CD20。在另一个实施方案中，B细胞表面标志是CD22。在一个实施方案中，B细胞消除剂是结合B细胞表面标志诸如CD20，优选人CD20(hCD20)的抗体或抗体片段。已知许多此类抗CD20抗体，包括本文公开的人源的、嵌合的、和人源化的抗CD20抗体。在优选的实施方案中，抗hCD20抗体是Rituximab(Rituxan^TM)；分别包含SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的VL和VH氨基酸序列的人源化抗体；包含本文提供的序列的人源化抗体2H7 v31、v114、v138、v477、v588、或v511，或其生物学活性片段，或其岩藻糖缺陷变体。

在一个实施方案中，在液态制剂中提供人源化2H7.v511，该液态制剂包含20mg/ml抗体、10mM硫酸组氨酸pH5.8、60mg/ml蔗糖、0.2mg/ml聚山梨醇酯20。

在本发明的任何方法中，可施用作为B细胞动员剂的抗体、小分子、和/或免疫粘附素的任何组合和/或B细胞消除剂的任何组合。例如，B细胞消除剂可以是结合CD20的抗体，而B细胞动员剂可以是α4和/或αL整联蛋白的一种或多种小分子拮抗剂。

在本发明的任何方法中B细胞动员剂和B细胞消除剂可以任何次序同时、顺序、或在同时和顺序之间轮流施用。在使用两种或多种动员剂时，例如αL整联蛋白拮抗剂联合α4整联蛋白拮抗剂，两种试剂可以任何次序同时、顺序、或在同时和顺序之间轮流施用。在一个实施方案中，施用抗CD20抗体以首先消除循环中的B细胞，随后施用αL整联蛋白拮抗剂或αL整联蛋白拮抗剂和α4整联蛋白拮抗剂的组合以动员驻留在器官诸如脾、淋巴结、生发中心、腹膜腔、等此类器官中的B细胞，再然后重复抗CD20结合抗体的处理以消除剩余动员的B细胞。

在另一个实施方案中，本发明包括含有两种或多种动员剂例如αL整联蛋白拮抗剂和α4整联蛋白拮抗剂的组合的组合物。本发明的组合物还包括一种或多种B细胞动员剂与一种或多种B细胞消除剂的组合。一个具体的实施方案是含有αL整联蛋白拮抗剂、α4整联蛋白拮抗剂、和抗CD20抗体的组合物。

附图简述

图1显示了hCD20转基因(hCD20Tg⁺)小鼠的循环中淋巴细胞群中的hCD20表达，对该淋巴细胞群鉴定了B220和CD3的表面表达。

图2显示了B细胞个体发育过程中和淋巴组织中hCD20的表面表达。对骨髓(顶图)、脾(中图)、和其它淋巴器官(底图)中的B细胞祖先和子集分析了hCD20表达。

图3证明了来自用对照或用抗hCD20 mAb(2H7)处理的hCD20Tg⁺小鼠骨髓的特征为表达B220和CD43的B细胞群的消除(左图)。还显示了在B细胞群上检测到的hCD20的数量(右图)。

图4显示了抗hCD20mAb对来自用抗CD20抗体处理的hCD20Tg⁺小鼠外周血的B细胞的消除。

图5显示了抗hCD20mAb处理后的B细胞消除和补充。

图6显示了用抗hCD20抗体处理的hCD20Tg⁺小鼠血液、淋巴结、和腹膜腔中B细胞消除的独特动力学。

图7显示了来自用0.5mg抗hCD20mAb(底部)或对照IgG_2amAb(顶部)处理的转基因小鼠的脾B细胞的敏感性。

图8显示了图7中所描述的小鼠脾中FO和MZ B细胞消除的点查。

图9显示了抗性脾B细胞上抗hCD20mAb对CD20的饱和。

图10显示了派尔斑GC B细胞对抗hCD20mAb消除作用的抵抗。派尔斑B细胞分离自经对照IgG_2a(顶图)或抗hCD20mAb(底图)处理的小鼠并通过B220和CD38染色鉴定。对来自对照(空心柱)和抗hCD20mAb处理(实心柱)小鼠的成熟和GC B细胞定量(右图)。

图11显示了脾GC B细胞对抗hCD20mAb的消除作用的抵抗。

图12显示了用对照或抗hCD20mAb处理15周(每2周0.1mg，IP)后边缘区B细胞的消除。

图13显示了施用高剂量抗α-hCD20mAb对B细胞的消除作用。剂量如图所示。

图14显示了hCD20mAb处理后的B细胞免疫应答，具体是实施例3中描述的再次免疫应答。

图15显示了通过对施用热灭活肺炎链球菌后4天分离自B细胞消除小鼠的抗原(Ag)特异性成浆细胞进行的FACS分析(左图)评估的针对细菌抗原的T不依赖性免疫应答。

图16显示的FACS图证明了动员边缘区B细胞进入脉管系统增强MZ B细胞对抗hCD20mAb消除作用的敏感性。

图17显示了用动员剂处理的小鼠血液中MZ B细胞(CD21^hiCD23^lo)的定量结果。

图18显示了单独用抗hCD20mAb和连同动员剂处理的小鼠脾中总B220+细胞的定量。

图19显示了来自用25μg脂多糖(LPS)和抗hCD20mAb处理的小鼠的细胞的FACS图。

图20显示了来自用载体(vehicle)对照或化合物A处理的hCD20Tg⁺小鼠的淋巴细胞的定量。对于20小时分离自淋巴结(小图1和2)和血液(小图3和4)的淋巴细胞定量并表述成平均值±标准误差(n＝4)。

图21证明了B细胞消除需要肝，正如实施例5中更完整描述的。小鼠接受假装(左图)或夹住门静脉和肝动脉(右图)随后立即IV注射对照或抗hCD20mAb(0.2mg)。

图22显示了来自实施例5的假装或夹住处理小鼠的血液中B细胞的定量。分离自抗hCD20mAb处理小鼠的所有细胞被体内施用的mAb所饱和(数据未显示)。

图23显示了B细胞消除不需要脾，正如实施例5中更完整描述的。小鼠接受假装的脾切除术(顶行)或脾切除术(底行)并分析B细胞消除。

图24显示了实施例5的假装或脾切除术处理小鼠的外周血中B细胞的百分比，定量并表述成平均值±标准误差。

图25显示了Kupfer细胞吞噬B220⁺B细胞，正如实施例5中更完整描述的。小鼠用0.1mg对照IgG或抗hCD20mAb处理。

发明详述

A.定义

下列术语在用于本文时意图具有如下定义：

术语整联蛋白的“拮抗剂”或“抑制剂”在用于本文时指降低或阻止整联蛋白诸如α4β1、α4β7、或αLβ2整联蛋白结合配体诸如VCAM-1、MadCAM-1、ICAM1-5诸如此类或者降低或阻止B细胞滞留在淋巴组织中包括脾的生发中心和/或边缘区的化合物。“有效量”指足以至少部分抑制结合的数量且可以是抑制性数量。

术语“抗体”采用最广的含义且具体包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(如双特异性抗体)、和展示期望生物学活性或功能的抗体片段。包含本发明多肽的抗体可以是嵌合的、人源化的、或人源的。包含本发明多肽的抗体可以是抗体片段。下文更详细的描述了此类抗体和生成它们的方法。或者，可以通过用本发明的多肽免疫动物来生成本发明的抗体。如此，设想了针对本发明多肽的抗体。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是它们的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。“功能性片段”本质上保留了全长抗体与抗原的结合，且保留了生物学活性。

“结合CD20的抗体”和“抗CD20抗体”在本文中可互换使用且涵盖以足够亲和力结合CD20从而可作为治疗剂用于靶向表达该抗原的细胞且与其它蛋白质诸如下文描述的测定法中的阴性对照蛋白质没有显著交叉反应的所有抗体。还设想了其中抗体的一个臂结合CD20的双特异性抗体。结合CD20的抗体的这个定义还涵盖前述抗体的功能性片段。结合CD20的抗体能以Kd例如＜10nM结合CD20。在优选的实施方案中，结合的Kd是＜7.5nM，更优选＜5nM，甚至更优选在1-5nM之间，最优选＜1nM。

在一个具体的实施方案中，抗CD20抗体结合人和灵长类CD20。在具体的实施方案中，结合CD20的抗体是人源化的或嵌合的。结合CD20的抗体包括例如rituximab(RITUXAN)、m2H7(鼠2H7)、hu2H7(人源化2H7)及其所有功能性变体，包括但不限于hu2H7.v16(v代表形式(version))、v31、v114、v138、v477、v588、或v511或其生物学活性片段，及其具有改良ADCC功能的岩藻糖缺陷变体。

涉及CD20抗体的专利和专利出版物包括美国专利号5,776,456、5,736,137、6,399,061、和5,843,439，以及美国专利申请号US 2002/0197255A1和2003/0021781 A1(Anderson等)；美国专利号6,455,043 B1和WO00/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO 00/27428(Grillo-Lopez和White)；WO00/27433(Grillo-Lopez和Leonard)；WO 00/44788(Braslawsky等)；WO01/10462(Rastetter，W.)；WO 01/10461(Rastetter和White)；WO 01/10460(White和Grillo-Lopez)；美国申请号US 2002/0006404和WO 02/04021(Hanna和Hariharan)；美国申请号US 2002/0012665 A1和WO 01/74388(Hanna，N.)；美国申请号US 2002/0009444 A1和WO 01/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO 01/97858(White，C.)；美国申请号US 2002/0128488A1和WO 02/34790(Reff，M.)；WO 02/060955(Braslawsky等)；WO 02/096948(Braslawsky等)；WO 02/079255(Reff和Davies)；美国专利号6,171,586 B1和WO 98/56418(Lam等)；WO 98/58964(Raju，S.)；WO 99/22764(Raju，S.)；WO 99/51642、美国专利号6,194,551 B1、美国专利号6,242,195 B1、美国专利号6,528,624 B1和美国专利号6,538,124(Idusogie等)；WO 00/42072(Presta，L.)；WO 00/67796(Curd等)；WO 01/03734(Grillo-Lopez等)；美国申请号US 2002/0004587 A1和WO 01/77342(Miller和Presta)；美国申请号US 2002/0197256(Grewal，I.)；美国专利号6,090,365 B1、6,287,537 B1、6,015,542、5,843,398、和5,595,721(Kaminski等)；美国专利号5,500,362、5,677,180、5,721,108、和6,120,767(Robinson等)；美国专利号6,410,391 B1(Raubitschek等)；美国专利号6,224,866 B1和WO 00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO 01/13945(Barbera-Guillem，E.)；WO 00/67795(Goldenberg)；WO 00/74718(Goldenberg和Hansen)；WO 00/76542(Golay等)；WO 01/72333(Wolin和Rosenblatt)；美国专利号6,368,596 B1(Ghetie等)；美国申请号US 2002/0041847 A1(Goldenberg，D.)；美国申请号US2003/0026801 A1(Weiner和Hartmann)；WO 02/102312(Engleman，E.)，将每一篇明确引入本文作为参考。还可参见美国专利号5,849,898和欧洲申请号330,191(Seed等)；美国专利号4,861,579和EP 332,865 A2(Meyer和Weiss)；和WO 95/03770(Bhat等)。

CD20抗体可以是裸露的抗体或偶联有细胞毒性化合物诸如放射性同位素或毒素。此类抗体包括连接有放射性同位素钇-90的抗体ZEVALIN(IDEC Pharmaceuticals，San Diego，CA)和偶联有I-131的BEXXAR(Corixa，WA)。

人源化2H7变体包括那些在FR中具有氨基酸替代的变体和在移植的CDR中具有变化的亲和力成熟变体。CDR或FR中替代的氨基酸不限于供体或受体抗体中存在的那些氨基酸。在其它实施方案中，本发明的抗CD20抗体还在Fc区中的氨基酸残基中包含导致改良效应物功能的变化，包括增强的CDC和/或ADCC功能和B细胞杀伤作用(在本文中也称为B细胞消除)。具体而言，对改进CDC和ADCC活性鉴定了三种突变：S298A/E333A/K334A，在本文中也称为三联Ala突变体或变体；Fc区的编号依照EU编号系统；(Kabat等，见上文，正如Idusogie等，2001，见上文中所描述的；Shields等，见上文)。

适用于本发明的其它抗CD20抗体包括那些具有改进稳定性的具体变化的抗体。在有些实施方案中，嵌合抗CD20抗体具有鼠源V区和人源C区。这样一种具体的嵌合抗CD20抗体是RITUXAN(RITUXIMAB；GenentechInc.)。Rituximab和hu2H7能经由补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)二者介导B细胞溶解。美国专利号6,194,551 B1和WO 99/51642中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列和提高的或降低的Clq结合能力的抗体变体。将那些专利出版物的内容明确引入本文作为参考。还可参见Idusogie等，J.Immunol.164：4178-4184，2000。

WO 00/42072(Presta)描述了具有改良的或降低的FcR结合的多肽变体。将该专利出版物的内容明确引入本文作为参考。还可参见Shields等，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604，2001。

“自身免疫病”在本文中采用广泛的、一般的含义，指哺乳动物中因个别哺乳动物对其自身组织成分的体液或细胞免疫应答而发生破坏正常或健康组织的紊乱或状况，或其表现或者由此产生的状况。

术语“癌症”、“癌性”、和“恶性”意指或描述哺乳动物中通常表征为不受调控的细胞生长的生理学状况。癌症的例子包括但不限于癌，包括腺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、胰癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌诸如肝的癌和肝瘤、膀胱癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌诸如肾细胞癌和维尔姆斯氏肿瘤、基底细胞癌、黑素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌、和各种类型的头和颈癌。任选的是，癌症将表达BLyS，或者与癌细胞有关联。在有些实施方案中，本发明治疗的癌症包括淋巴瘤、白血病和骨髓瘤及其亚型，诸如伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性成淋巴细胞或淋巴细胞白血病、非何杰金氏和何杰金氏淋巴瘤、及急性髓细胞样白血病。

“胞外域”或“ECD”指本质上不含跨膜和胞质结构域的一种多肽形式。

术语“免疫相关疾病”指哺乳动物中免疫系统成分引起、介导、或以其它方式促成哺乳动物发病的疾病。还包括刺激或干预免疫应答对疾病发展具有改善作用的疾病。此术语包括自身免疫病、免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、传染病、和免疫缺陷病。可依照本发明治疗的免疫相关和炎性疾病的例子，其中有些是免疫或T细胞介导的，包括类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化病(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、Sjogren氏综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯氏病、桥本氏甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化病、特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏综合征、和慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎、炎性和纤维化肺病诸如炎性肠病(溃疡性结肠炎：克罗恩氏病)、麸胶敏感性肠病、和惠普尔氏病、自身免疫性或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应和荨麻疹、肺的免疫学疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病。传染病包括AIDS(HIV感染)、甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎、细菌感染、真菌感染、原生动物感染和寄生虫感染。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指由一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的，只是可能以极小量存在可能的天然存在突变。单克隆抗体是高度特异的，即针对单一抗原性位点。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示由基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler等，Nature256：495，1975描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等，Nature 352：624-628，1991和Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597，1991中描述的技术由噬菌体抗体库分离。

“嵌合”抗体(免疫球蛋白)有一部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展示期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；及Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855，1984)。本文中所使用的人源化抗体是嵌合抗体的一个子集。

“载体”在用于本文时包括在所采用的剂量和浓度对暴露于它们的细胞或哺乳动物无毒的生理学可接受载体、赋形剂、或稳定剂。通常，生理学可接受载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的实例包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN、聚乙二醇(PEG)、和PLURONIC。

本发明的“组合物”可包含一种或多种B细胞消除剂和/或一种或多种B细胞动员剂，任选联合生理学可接受载体。组合物还可包含额外的治疗剂来治疗预期的适应症。在有些实施方案中，组合物包含选自用于治疗免疫相关疾病的药物和用于治疗癌症的药物的第二治疗剂。在有些实施方案中，用于治疗癌症的药物选自胞毒剂、化疗剂、生长抑制剂和放疗剂。

非人(如鼠)抗体的“人源化”形式指包含衍生自非人免疫球蛋白的最低限度序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力、和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔、或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的构架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。通常，人源化抗体将包含基本上不少于至少一个、通常两个这样的可变区，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR，尽管FR区可包含改进结合亲和力的一个或多个氨基酸替代。FR中这些氨基酸替代的数目通常H链中不超过6个，而L链中不超过3个。人源化抗体任选还将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节可参见Jones等，Nature321：522-525，1986；Riechmann等，Nature 332：323-329，1988；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596，1992。

抗体“效应物功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性，且随抗体同种型而变化。抗体效应物功能的例子包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(如B细胞受体)的下调；和B细胞激活。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指细胞毒性的一种形式，其中结合到某些细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞、和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应物细胞能够特异结合携带抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞且绝对是此类杀伤作用所需要的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch等，Annu.Rev.Immunol.9：457-92，1991第464页上的表3概述了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的测定法。可用于此类测定法的效应物细胞包括完整性单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，如在动物模型中，诸如Clynes等，PNAS(USA)95：652-656，1998中公开的动物模型。

用于治疗或疗法的“哺乳动物”指归入哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农畜、及动物园、运动、或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛、诸如此类。优选的是，哺乳动物是人。

在用于本文时，“B细胞消除”指药物或抗体处理后较之处理前的水平降低动物或人体中的B细胞水平。B细胞水平可使用众所周知的测定法来测量，诸如通过全血细胞计数、通过对已知B细胞标志染色的FACS分析、和通过诸如实验实施例中描述的方法。B细胞消除可以是部分的或完全的。在一个实施方案中，表达CD20的B细胞消除了25％或更多。在接受B细胞消除药的患者中，B细胞通常在一段时间里消除，即药物在患者体内循环的时间和B细胞恢复的时间。

如果用B细胞消除剂连同B细胞动员剂处理后消除的B细胞百分比水平大于单独使用B细胞杀伤(消除)剂获得的水平，那么B细胞消除得到提升。B细胞消除水平可通过熟练医务人员熟悉的方法来测量。B细胞消除可通过未用和使用B细胞动员剂处理过的血液中B细胞的数目来测量。作为对B细胞定量的另一种例示性方法，可在用B细胞消除剂诸如抗CD20抗体处理后对癌症患者进行淋巴结活检以获得B细胞动员剂处理前的B细胞基线水平。然后对患者施用一种或多种B细胞动员剂连同或后续B细胞消除剂。在此第二轮B细胞消除处理方案后，进行第二淋巴结活检以对剩余B细胞定量。

“B细胞消除剂”在用于本文时指结合或以其它方式经由B细胞表面标志靶向B细胞，直接或间接导致目标B细胞死亡的任何拮抗剂。在用于本文时，B细胞在循环中遭到清除，诸如通过ADCC、CDC或其它机制。B细胞消除剂可以是蛋白质诸如细胞表面标志的抗体或配体，或者是小分子。B细胞消除剂可以偶联胞毒剂或生长抑制剂。在一个实施方案中，B细胞消除剂是结合CD20、CD22、或CD54的单克隆抗体(mAb)。下文公开了结合CD20的抗体。在优选的实施方案中，结合CD20的抗体是rituximab，或是人源化2H7v16，或是h2H7v16的变体。

“B细胞动员剂”在用于本文时指在哺乳动物中促进B细胞在血液中循环的任何分子，例如通过抑制B细胞在淋巴器官和其它B细胞负载组织中的粘附和滞留或者以其它方式促进B细胞从这些部位外出，或者通过抑制B细胞归巢至淋巴和其它器官和组织。在一个具体的实施方案中，B细胞动员剂抑制B细胞滞留在至少脾的边缘区，且优选脾的MZ和生发中心和淋巴组织。在另一个实施方案中，B细胞动员剂抑制B细胞归巢至脾。在还有一个实施方案中，该试剂抑制B细胞归巢至肠道(gut)。施用B细胞动员剂后外周血中B细胞的增加可通过已知方法来定量，诸如实施例中所描述的。

“B细胞紊乱”包括B细胞肿瘤(如CD20阳性B细胞肿瘤)或B细胞调控的自身免疫病或自身免疫相关状况，下文详细的公开了二者。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(Clq)结合它们的关联抗原所结合的抗体(适当亚类的)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163，1996中所描述的。

“分离的”抗体指已经由其天然环境的成分鉴定且分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰抗体的诊断性或治疗性用途的物质，且可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定超过95％(以重量计)的抗体，且最优选超过99％(以重量计)，(2)达到足以使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下使用考马斯蓝或优选银染的SDS-PAGE达到同质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体天然环境的至少一种成分不存在。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

术语“治疗有效量”指本发明组合物有效“减轻”或“治疗”受试者或哺乳动物中的疾病或紊乱的数量。通常，疾病或紊乱的减轻或治疗牵涉与该疾病或紊乱有关的一种或多种症状或医学问题的减轻。在有些实施方案中，它指导致哺乳动物中B细胞数目减少的数量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量能减少癌细胞的数目；减小肿瘤尺寸；抑制(即一定程度上减缓且优选终止)癌细胞渗透到周围器官中；抑制(即一定程度上减缓且优选终止)肿瘤转移；一定程度上抑制肿瘤生长；和/或一定程度上减轻与癌症有关的一种或多种症状。在药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死它们的程度，它可能是抑制细胞的和/或毒害细胞的。在有些实施方案中，本发明的组合物可用于预防受试者或哺乳动物中疾病或紊乱的发作或复发。例如，在患有自身免疫病的受试者中，本发明的组合物可用于预防或减轻发作(flare-up)。

“治疗”或“减轻”指治疗措施和预防措施二者，其中目标是预防或减缓(减轻)目标病理学状况或紊乱。如果在依照本发明的方法接受治疗量的本发明结合CD20的抗体后受试者显示可观测和/或可测量的特定疾病的一种或多种征候和症状的减轻或消失，那么受试者的CD20阳性癌症或自身免疫病得到了成功“治疗”。例如，对于癌症，发生了癌细胞数目的减少或癌细胞的消失；肿瘤尺寸的缩小；肿瘤转移的抑制(即一定程度的减缓且优选停止)；肿瘤生长一定程度的抑制；消退时间的延长，和/或与特定癌症有关的一种或多种症状一定程度的减轻；发病率和死亡率的降低，和生活质量的提高。疾病征候或症状的减轻还可以由患者感受到。治疗可实现完全响应，定义为癌症所有征候的消失，或者部分响应，其中肿瘤尺寸缩小，优选缩小超过50％，更优选缩小75％。如果患者经历稳定的疾病，也认为患者得到了治疗。在一个优选的实施方案中，癌症患者在一年后，优选在15个月后仍然没有癌症的发展。用于评估成功治疗和疾病改善的这些参数易于通过本领域受过适当训练的医师所熟悉的常规程序来测量。

“长期”施用指与短期模式相反，以连续模式施用药剂，将初始治疗效果(活性)维持较长一段时间。

“间歇”施用指不是无间断连续进行的处理，而是本质上循环的。

术语“胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(如I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰和Re¹⁸⁶)、化疗剂、和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，诸如噻替哌(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯(alkyl sulfonate)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)、和乌瑞替哌(uredopa)；亚乙基亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫化磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，诸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、磷雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、三芥环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类(nitrosurea)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类(enediyne)抗生素(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参阅如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186，1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二碳磷酸盐化合物(bisphosphonate)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素类(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素类(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素类(chromomycin)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN阿霉素(doxorubicin)(包括吗啉阿霉素、氰吗啉阿霉素、2-吡咯啉阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycin)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素类(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、曲麦克特(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、氮杂胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、羟甲雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸；蒽尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；醋酸羟哔咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；环氧甘醚(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)和美坦西醇类(ansamitocin)；丙米腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹达谋(mopidanmol)；nitraerine；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；足叶草酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；甲基苄肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS NaturalProducts，Eugene，OR)；丙亚胺(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西作非兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“ Ara-C”)；环磷酰胺；硫替哌；类紫杉醇类(taxoid)，如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANE^TM紫杉醇不含克列莫佛(Cremophor)的清蛋白改造纳米颗粒剂型(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)、和TAXOTERE多西他塞(doxetaxel)(Rhne-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide，VP-16)；异磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；NAVELBINE长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A类，诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；及任何上述药剂的制药学可接受盐、酸或衍生物。

该定义还包括起调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素药，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲奥昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那斯酮(onapristone)、和FARESTON托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏罗唑(vorozole)、FEMARA来曲唑(letrozole)、和ARIMIDEX阿纳托唑(anastrozole)；及抗雄激素，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf和H-Ras；核酶，诸如VEGF表达抑制剂(如ANGIOZYME核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗、和VAXID疫苗；PROLEUKINrIL-2；LURTOTECAN拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIXrmRH；及任何上述药剂的制药学可接受盐、酸或衍生物。

“生长抑制剂”在用于本文时指在体外和/或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低S期细胞百分比的药剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导GI停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春花生物碱类(长春新碱和长春碱)、TAXOL紫杉醇、和拓扑异构酶II抑制剂诸如阿霉素、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷、和博来霉素。那些阻滞GI的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂诸如他莫昔芬(tanoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪、双氯乙基甲胺、顺铂、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、和ara-C。其它信息可参见Murakaini等，1995，在《The Molecular Basis ofCancer》中，Mendelsohn和Israel编，第1章，“Cell cycle regulation，oncogenes，and antieioplastic drugs”，W B Saunders，Philadelphia，p.13。

“生发中心”指淋巴次级滤泡内的微环境，其中发生B细胞增殖、体细胞高变、和抗原结合选择。

“边缘区”指脾中含有生成低亲和力、多反应性抗体的一群B细胞的区域。由于此解剖学定位，边缘区B细胞频繁得以接触抗原，包括自身抗原。边缘区B细胞具有低激活阈值，对自身抗原特别有反应性(Viau等，Clin.Immunol.114：17-26，2005)，且对血液传播抗原有反应性。自身反应性B细胞扣留在边缘区中以防止高亲和力自身反应性。

多肽的“可溶性”部分在用于本文时指可溶于水且缺乏对脂类的可察觉亲和力的部分(如缺失跨膜结构域或者跨膜和胞质结构域)。

B.整联蛋白亚基

1.α4

术语“α4”或“α4多肽”或“α4蛋白质”(也称为CD49d、整联蛋白α4亚基或VLA-4α亚基)在用于本文时涵盖具有天然序列α4的生物学活性的“天然序列α4多肽”。在一个实施方案中，α4多肽的生物学活性促进淋巴组织的器官或区域中B淋巴细胞的粘附和滞留，例如经由与β亚基诸如β1(CD29)或β7缔合形成结合淋巴组织生发中心中至少固定化边缘区脾细胞上的胞外基质或配体的整联蛋白，如此限制B淋巴细胞进入血管内。“天然序列”α4多肽包含与衍生自自然界的相应α4多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列α4多肽可从自然界分离或者可通过重组和/或合成手段生成。术语“天然序列α4多肽”包括多肽天然存在的截短形式、天然存在的变体形式(如可变剪接形式)、天然存在的同工型、和天然存在的等位基因变体。下面显示了人α4多肽序列的一个实例(Genbank编号S06046)：

  1  mfptesawlg krganpgpea avretvmlll clgvptgrpy nvdtesally qgphntlfgy

 61  svvlhshgan rwllvgapta nwlanasvin pgaiyrcrig knpgqtceql qlgspngepc

121  gktcleerdn qwlgvtlsrq pgengsivtc ghrwknifyi knenklptgg cygvppdlrt

181  elskriapcy qdyvkkfgen fascqagiss fytkdlivmg apgssywtgs lfvynittnk

241  ykafldkqnq vkfgsylgys vgaghfrsqh ttevvggapq heqigkayif sidekelnil

301  hemkgkklgs yfgasvcavd lnadgfsdll vgapmqstir eegrvfvyin sgsgavmnam

361  etnlvgsdky aarfgesivn lgdidndgfe dvaigapqed dlqgaiyiyn gradgisstf

421  sqrieglqis kslsmfgqsi sgqidadnng yvdvavgafr sdsavllrtr pvvivdasls

481  hpesvnrtkf dcvengwpsv cidltlcfsy kgkevpgyiv lfynmsldvn rkaespprfy

541  fssngtsdvi tgsiqvssre ancrthqafm rkdvrdiltp iqieaayhlg phviskrste

601  efpplqpilq qkkekdimkk tinfarfcah encsadlqvs akigflkphe nktylavgsm

661  ktlmlnvslf nagddayett lhvklpvgly fikileleek qincevtdns gvvqldcsig

721  viyvdhlsri disflldvss lsraeedlsi tvhatcenee emdnlkhsrv tvaiplkyev

 781  kltvhgfvnp tstvygsnde nepetcmvek mnltfhvint gnsmapnvsv eimvpnsfsp

 841  qtdklfnild vqtttgechf enyqrvcale qqksamqtlk givrflsktd krllycikad

 901  phclnflcnf gkmesgkeas vhiqlegrps ilemdetsal kfeiratgfp epnprvieln

 961  kdenvahvll eglhhqrpkr yftiviisss lllglivlll isyvmwkagf fkrqyksilq

1021  eenrrdswsy insksndd [SEQ ID NO：1]

(残基1-39是信号序列的氨基酸。残基40-1048是产物α4整联蛋白的氨基酸)。

α4联合β1形成整联蛋白α4β1(VLA-4、CD49d/CD29)，或者联合β7亚基形成整联蛋白α4β7。

2.β1

术语“β1”(CD29)或“β1多肽”或“β1蛋白质”在用于本文时涵盖具有天然序列β1的生物学活性的“天然序列β1多肽”。在一个优选的实施方案中，依照本发明的β1多肽的生物学活性指促进淋巴组织的器官或区域中B淋巴细胞的粘附和滞留，例如经由与α亚基诸如α4或α2缔合形成结合至少固定化边缘区脾细胞或生发中心细胞上的胞外基质或配体的整联蛋白，如此限制B淋巴细胞进入血管内。“天然序列”β1多肽包含与衍生自自然界的相应β1多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列β1多肽可从自然界分离或者可通过重组和/或合成手段生成。术语“天然序列β1多肽”包括多肽天然存在的截短形式、天然存在的变体形式(如可变剪接形式)、天然存在的同工型(诸如A-D)、和天然存在的等位基因变体。下面显示了人β1多肽序列的一个实例(Genbank编号P05556)：

  1  mnlqpifwig lissvccvfa qtdenrclka nakscgeciq agpncgwctn stflqegmpt

 61  sarcddleal kkkgcppddi enprgskdik knknvtnrsk gtaeklkped ihqiqpqqlv

121  lrlrsgepqt ftlkfkraed ypidlyylmd lsysmkddle nvkslgtdlm nemrritsdf

181  rigfgsfvek tvmpyisttp aklrnpctse qncttpfsyk nvlsltnkge vfnelvgkqr

241  isgnldspeg gfdaimqvav cgsligwrnv trllvfstda gfhfagdgkl ggivlpndgq

301  chlennmytm shyydypsia hlvqklsenn iqtifavtee fqpvykelkn lipksavgtl

361  sanssnviql iidaynslss evilengkls egvtisyksy ckngvngtge ngrkcsnisi

421  gdevqfeisi tsnkcpkkds dsfkirplgf teevevilqy icececqseg ipespkcheg

481  ngtfecgacr cnegrvgrhc ecstdevnse dmdaycrken sseicsnnge cvcgqcvcrk

541  rdntneiysg kfcecdnfnc drsnglicgg ngvckcrvce cnpnytgsac dcsldtstce

601  asngqicngr gicecgvckc tdpkfqgqtc emcqtclgvc aehkecvqcr afnkgekkdt

661  ctaecsyfni tkvesrdklp qpvqpdpvsh ckekdvddcw fyftysvngn nevmvhvven

721  pecptgpdii pivagvvagi vliglallli wkllmiihdr refakfekek mnakwdtgen

781  piyksavttv vnpkyegk [SEQ ID NO：2]

3.β7

术语“β7”或“β7多肽”或“β7蛋白质”在用于本文时涵盖具有天然序列β7的生物学活性的“天然序列β7多肽”。在一个实施方案中，依照本发明的β7多肽的生物学活性指促进α4β7+淋巴细胞归巢至肠道(gut)，如此限制B淋巴细胞进入血管内。在另一个实施方案中，β7多肽的生物学活性指促进淋巴组织的器官或区域诸如脾的MZ中B淋巴细胞的粘附和滞留，例如经由与α亚基诸如α4的缔合。“天然序列”β7多肽包含与衍生自自然界的相应β7多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列β7多肽可从自然界分离或者可通过重组和/或合成手段生成。术语“天然序列β7多肽”包括多肽天然存在的截短形式、天然存在的变体形式(如可变剪接形式)、天然存在的同工型(诸如A-D)、和天然存在的等位基因变体。下面显示了人β7多肽序列的一个实例(Genbank编号P26010)：

  1  mvalpmvlvl llvlsrgese ldakipstgd atewrnphls mlgscqpaps cqkcilshps

 61  cawckqlnft asgeaearrc arreellarg cpleeleepr gqqevlqdqp lsqgargega

121  tqlapqrvrv tlrpgepqql qvrflraegy pvdlyylmdl sysmkddler vrqlghallv

181  rlqevthsvr igfgsfvdkt vlpfvstvps klrhpcptrl ercqspfsfh hvlsltgdaq

241  aferevgrqs vsgnldspeg gfdailqaal cqeqigwrnv srllvftsdd tfhtagdgkl

301  ggifmpsdgh chldsnglys rstefdypsv gqvaqalsaa niqpifavts aalpvyqels

361  klipksavge lsedssnvvq limdaynsls stvtlehssl ppgvhisyes qcegpekreg

421  kaedrgqcnh vrinqtvtfw vslqathclp ephllrlral gfseelivel htlcdcncsd

481  tqpqaphcsd gqghlqcgvc scapgrlgrl cecsvaelss pdlesgcrap ngtgplcsgk

541  ghcqcgrcsc sgqssghlce cddascerhe gilcggfgrc qcgvchchan rtgracecsg

601  dmdscispeg glcsghgrck cnrcqcldgy ygalcdqcpg cktpcerhrd caecgafrtg

661  platncstac ahtnvtlala pilddgwcke rtldnqlfff lveddargtv vlrvrpqekg

721  adhtqaivlg cvggivavgl glvlayrlsv eiydrreysr fekeqqqlnw kqdsnplyks

781  aitttinprf qeadsptl [SEQ ID NO：3]

4.αL

术语“αL”或“αL多肽”或“αL蛋白质”或“CD11a”在用于本文时涵盖具有天然序列αL(CD11a)的生物学活性的“天然序列αL多肽”。在一个实施方案中，αL多肽的生物学活性指促进淋巴组织的器官或区域中B淋巴细胞的粘附和滞留，例如经由与β亚基诸如β2(CD18)缔合形成结合至少固定化边缘区脾细胞或生发中心上的胞外基质或配体的整联蛋白。αLβ2(CD11a/CD18)(LFA-1)的另一种生物学活性是促进B淋巴细胞从血液归巢至脾和淋巴结。这两种生物学活性都导致限制这些B淋巴细胞进入血管内。

αLβ2(LFA-1)结合至少CD54(ICAM-1)、CD102(ICAM-2)、和CD50(ICAM-3)。“天然序列”αL多肽包含与衍生自自然界的相应αL多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列αL多肽可从自然界分离或者可通过重组和/或合成手段生成。术语“天然序列αL多肽”包括多肽天然存在的截短形式、天然存在的变体形式(如可变剪接形式)、天然存在的同工型、和天然存在的等位基因变体。下面显示了人αL多肽序列的一个实例(SWISSPROT编号P207017；EMBL/GENBANK编号Y00796)：

   1  mkdscitvma mallsgffff apassynldv rgarsfsppr agrhfgyrvl qvgngvivga

  61  pgegnstgsl yqcqsgtghc lpvtlrgsny tskylgmtla tdptdgsila cdpglsrtcd

 121  qntylsglcy lfrqnlqgpm lqgrpgfqec ikgnvdlvfl fdgsmslqpd efqkildfmk

 181  dvmkklsnts yqfaavqfst syktefdfsd yvkrkdpdal lkhvkhmlll tntfgainyv

 241  atevfreelg arpdatkvli iitdgeatds gnidaakdii ryiigigkhf qtkesqetlh

 301  kfaskpasef vkildtfekl kdlftelqkk iyviegtskq dltsfnmels ssgisadlsr

 361  ghavvgavga kdwaggfldl kadlqddtfi gnepltpevr agylgytvtw lpsrqktsll

 421  asgapryqhm grvllfqepq ggghwsqvqt ihgtqigsyf ggelcgvdvd qdgetellli

 481  gaplfygeqr ggrvfiyqrr qlgfeevsel qgdpgyplgr fgeaitaltd ingdglvdva

 541  vgapleeqga vyifngrhgg lspqpsqrie gtqvlsgiqw fgrsihgvkd legdgladva

 601  vgaesqmivl ssrpvvdmvt lmsfspaeip vhevecsyst snkmkegvni ticfqikslv

 661  pqfqgrlvan ltytlqldgh rtrrrglfpg grhelrrnia vttsmsctdf sfhfpvcvqd

 721  lispinvsln fslweeegtp rdqraqgkdi ppilrpslhs etweipfekn cgedkkcean

 781  lrvsfspars ralrltafas lsvelslsnl eedaywvqld lhfppglsfr kvemlkphsq

 841  ipvsceelpe esrllsrals cnvsspifka ghsvalqmmf ntlvnsswgd svelhanvtc

 901  nnedsdlled nsattiipil ypiniliqdq edstlyvsft pkgpkihqvk hmyqvriqps

 961  ihdhniptle avvgvpqpps egpithqwsv qmeppvpchy edlerlpdaa epclpgalfr

1021  cpvvfrqeil vqvigtlelv geieassmfs lcsslsisfn sskhfhlygs naslaqvvmk

1081  vdvvyekqml ylyvlsgigg llllllifiv lykvgffkrn lkekmeagrg vpngipaeds

1141  eqlasgqeag dpgclkplhe kdsesgggkd [SEQ ID NO：4]

5.β2

术语“β2”(CD18)或“β2多肽”或“β2蛋白质”在用于本文时涵盖具有天然序列β2的生物学活性的“天然序列β2多肽”。“天然序列”β2多肽包含与衍生自自然界的相应β2多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列β2多肽可从自然界分离或者可通过重组和/或合成手段生成。术语“天然序列β2多肽”包括多肽天然存在的截短形式、天然存在的变体形式(如可变剪接形式)、天然存在的同工型、和天然存在的等位基因变体。下面显示了人β2多肽序列的一个实例(Genbank编号P05107)：

  1  mlglrpplla lvgllslgcv lsqectkfkv sscreciesg pgctwcqkln ftgpgdpdsi

 61  rcdtrpqllm rgcaaddimd ptslaetqed hnggqkqlsp qkvtlylrpg qaaafnvtfr

121  rakgypidly ylmdlsysml ddlrnvkklg gdllralnei tesgrigfgs fvdktvlpfv

181  nthpdklrnp cpnkekecqp pfafrhvlkl tnnsnqfqte vgkqlisgnl dapeggldam

241  mqvaacpeei gwrnvtrllv fatddgfhfa gdgklgailt pndgrchled nlykrsnefd

301  ypsvgqlahk laenniqpif avtsrmvkty eklteiipks avgelsedss nvvhliknay

361  nklssrvfld hnalpdtlkv tydsfcsngv thrnqprgdc dgvqinvpit fqvkvtatec

421  iqeqsfvira lgftdivtvq vlpqcecrcr dqsrdrslch gkgflecgic rcdtgyigkn

481  cecqtqgrss qelegscrkd nnsiicsglg dcvcgqclch tsdvpgkliy gqycecdtin

541  ceryngqvcg gpgrglcfcg kcrchpgfeg sacqcertte gclnprrvec sgrgrcrcnv

601  cechsgyqlp lcqecpgcps pcgkyiscae clkfekgpfg kncsaacpgl qlsnnpvkgr

661  tckerdsegc wvaytleqqd gmdryliyvd esrecvagpn iaaivggtva givligilll

721  viwkalihls dlreyrrfek eklksqwnnd nplfksattt vmnpkfaes  [SEQ ID NO：5]

C.α4整联蛋白

术语“α4整联蛋白”在用于本文时指由一个α4亚基和一个β亚基构成的异二聚体。α4整联蛋白的实例包括α4β1(VLA-4或VLA-4整联蛋白)或α4β7(LPAM-1或LPAM-1整联蛋白)。α4β1在大多数淋巴细胞上表达，可能的例外是嗜中性粒细胞和血小板；它还可能在非淋巴组织中表达。α4β7在大多数淋巴结T和B细胞、NK细胞和嗜曙红细胞上表达。α4β1牵涉淋巴细胞从血液迁移到炎症部位的组织。α4β7牵涉α4β7+淋巴细胞经由粘膜高内皮小静脉(mucosal high endothelial venules)上MAdCAM-1的识别归巢至肠道(gut)。

α4整联蛋白的生物学活性的例子可包括下列活性的任何一项或组合：(1)结合α4β1的配体(如选自VCAM-1、纤连蛋白、血小板反应蛋白、胶原蛋白和侵袭素(invasion)的任一配体)，(2)结合α4β7的配体(如选自血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、粘膜地址素细胞粘附分子-1(MAdCAM-1)、和纤连蛋白的任一配体)，和(3)促进B淋巴细胞的粘附和滞留和/或归巢至淋巴组织的器官或区域诸如脾中的边缘区。

1.α4整联蛋白的配体

α4整联蛋白配体，VCAM-1(CD106)，在其胞外部分中含有七个IgSFC2结构域(Barclay等，1997，见上文，pp.386-387)。VCAM-1在结构域1和4中分别含有两个独立的α4β1(VLA-4)结合位点(关于整联蛋白结合位点参见例如Vonderheide等，1994，J.Cell Biol.125：215-222；Jones等，1995，Nature 373：539-544)。人VCAM-1(CD106)的全长氨基酸序列提供于Barclay等，见上文第387页，及经由GenBank编号M73255或SWISSPROTP19320。

下面显示了人VCAM-1多肽序列的一个实例(SWISSPROT编号P19320)：

1 mpgkmvvilg asnilwimfa asqafkiett pesrylaqig dsvsltcstt gcespffswr

 61  tqidsplngk vtnegttstl tmnpvsfgne hsylctatce srklekgiqv eiysfpkdpe

121  ihlsgpleag kpitvkcsva dvypfdrlei dllkgdhlmk sqefledadr ksletkslev

181  tftpviedig kvlvcraklh idemdsvptv rqavkelqvy ispkntvisv npstklqegg

241  svtmtcsseg lpapeifwsk kldngnlqhl sgnatltlia mrmedsgiyv cegvnligkn

301  rkevelivqe kpftveispg priaaqigds vmltcsvmgc espsfswrtq idsplsgkvr

361  segtnstltl spvsfenehs ylctvtcghk klekgiqvel ysfprdpeie msgglvngss

421  vtvsckvpsv ypldrleiel lkgetileni efledtdmks lenkslemtf iptiedtgka

481  lvcqaklhid dmefepkqrq stqtlyvnva prdttvlvsp ssileegssv nmtclsagfp

541  apkilwsrql pngelqplse natltlistk medsgvylce ginqagrsrk eveliiqvtp

601  kdikltafps esvkegdtvi isctcgnvpe twiilkkkae tgdtvlksid gaytirkaql

661  kdagvyeces knkvgsqlrs ltldvqgren nkdyfspell vlyfasslii paigmiiyfa

721  rkanmkgsys lveaqkskv  (SEQ ID NO：6)

(信号序列为残基1-24；胞外域为残基25-698；跨膜域为残基699-720；而胞质域为残基721-739)。

α4整联蛋白配体，MAdCAM在其胞外部分中含有两个IgSF C2结构域(Tan等，1998，Structure 6：793-801)。MAdCAM是α4β7和L-选择蛋白的受体(Elangbam等，1997，Vet.Pathol.34：61-73)。下面显示了人MAdCAM全长氨基酸序列的一个实例(SWISSPROT编号Q13477)：

1   mdfglallla gllglllgqs lqvkplqvep pepvvavalg asrqltcrla cadrgasvqw

61  rgldtslgav qsdtgrsvlt vrnaslsaag trvcvgscgg rtfqhtvqll vyafpdqltv

121 spaalvpgdp evactahkvt pvdpnalsfs llvggqeleg aqalgpevqe eeeepqgded

181 vlfrvterwr lpplgtpvpp alycqatmrl pglelshrqa ipvlhsptsp eppdttspes

241 pdttspespd ttspespdtt sqeppdttsq eppdttsqep pdttspeppd ktspepapqq

301 gsthtprspg strtrrpeis qagptqgevi ptgsskpagd qlpaalwtss avlgllllal

361 ptyhlwkrcr hlaeddthpp aslrllpqvs awaglrgtgq vgisps  (SEQ ID NO：7)

(信号序列为残基1-18；胞外域为残基19-341；跨膜域为残基342-362；而胞质域为残基363-406)。

2.α4整联蛋白拮抗剂

术语“α4整联蛋白拮抗剂”在用于本文时采用最广的含义，且包括部分或完全阻断α4整联蛋白的生物学活性的任何分子。依照一个实施方案，α4整联蛋白拮抗剂部分或完全阻断α4整联蛋白与其配体之间的相互作用，并执行下列事件的任何一项或组合：(1)在哺乳动物中促进淋巴细胞从淋巴器官或组织外出和/或以其它方式促进B淋巴细胞的循环和(2)部分或完全阻断、抑制、或中和天然序列α4整联蛋白信号。在一个实施方案中，α4整联蛋白拮抗剂抑制脾和肠道(gut)中的B细胞粘附和滞留。在一个更具体的实施方案中，α4β1拮抗剂抑制至少脾的边缘区或淋巴组织的生发中心中的B细胞粘附和滞留。α4整联蛋白的有用拮抗剂包括α亚基的拮抗剂、β亚基的拮抗剂、及α和β两种亚基的拮抗剂。

依照一个优选的实施方案，α4整联蛋白拮抗剂是α4β1(VLA-4)拮抗剂，例如WO 99/06432中所描述的。依照另一个优选的实施方案，α4整联蛋白拮抗剂是α4β7(LPAM-1)拮抗剂，例如美国申请号08/700,737中描述的人源化mAb MLN-02/LDP-02或美国专利号6,407,066中描述的焦谷氨酸衍生物和相关化合物。依照一个实施方案，α4整联蛋白拮抗剂是双重α4β1/α4β7拮抗剂，例如R-411(Hijazi等，2004，J.Clin.Pharmacol.44：1368-1378)，或者美国专利号6,482,849或Egger等，2002年7月，J.Pharmacol.Exp.Ther 302(1)：53-62中描述的拮抗剂。

依照一个实施方案，拮抗剂结合α4亚基。依照另一个实施方案，拮抗剂结合α4整联蛋白的配体，例如配体VCAM-1或MAdCAM-1配体。α4整联蛋白例如α4β1和α4β7的拮抗剂可同时或顺序地联合使用，以促进哺乳动物中的B淋巴细胞循环。α4β1(VLA-4)和/或α4β7(LPAM-1)的多种不同拮抗剂可同时或顺序地联合使用，以促进哺乳动物中的B淋巴细胞循环。

α4整联蛋白拮抗剂可以是抗体、小分子、或免疫粘附素。

3.α4整联蛋白的抗体拮抗剂

在一个实施方案中，α4整联蛋白拮抗剂是抗体。术语“抗体”采用最广的含义，且包括多克隆的和单克隆的、全长和片段、人源化的、嵌合的、双特异性的、等等抗体。在一个优选的实施方案中，α4整联蛋白拮抗剂是结合α4β1(VLA-4)、α4β7(LPAM-1)的抗体，或是结合单独的α亚基的抗体，诸如下文实施例中公开的抗CD49d抗体。

作为α4整联蛋白拮抗剂的抗体的实例包括Biogen-Idec的TYSABRI(natalizumab)，先前所谓的Antegren(美国专利号6,602,503、5,840,299、和5,730,978，引入本文作为参考)、诸如此类。

依照另一个实施方案，α4整联蛋白拮抗剂是结合α4整联蛋白的配体例如上文所列任一配体的抗体，特别是抗VCAM-1抗体或抗MAdCAM-1抗体。例如，人源化VCAM-1抗体，2A2，可从Alexion Pharmaceuticals Inc(NewHaven，CT)获得。

特异结合α4β1(VLA-4)的人源化抗体的实例包括包含下文所示一种或多种VL和VH链的抗体：

1)包含如下序列的轻链可变区

a)    1  DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQDIN KYMAWYQQTP GKAPRLLIHY TSALQPGIPS

     61  RFSGSGSGRD YTFTISSLQP EDIATYYCLQ YDNLWTFGQG TKVEIK  (SEQ ID NO：8)；

或

b)    1  DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQDIN KYMAWYQQTP GKAPRLLIYY TSALQPGIPS

     61  RFSGSGSGRD YTFTISSLQP EDIATYYCLQ YDNLWTFGQG TKVEIK  (SEQ ID NO：9)；

和

2)包含如下序列的重链可变区

c)    1  QVQLVQSGAE VKKPGASSVK VSCKASGFNI KDTYIHWVRQ APGQRLEWMB RIDPANGYTK

     61  YDPKFQGRVT ITADTSASTA YMELSSLRSE DTAVYYCARE GYYGNYGVYA MDYWGQGTLV

    121  TVSS  (SEQ ID NO：10)，

d)    1  QVQLVQSGAE VKKPGASSVK VSCKASGFNI KDTYIHWVRQ APGQGLEWMB RIDPANGYTK

     61  YDPKFQGRVT ITADTSASTA YMELSSLRSE DTAVYYCARE GYYGNYGVYA MDYWGQGTLV

    121  TVSS  (SEQ ID NO：11)，或

e)    1  QVQLVQSGAE VKKPGASSVK VSCKASGFNI KDTYIHWVRQ APGQRLEWMB RIDPANGYTK

     61  YDPKFQGRVT ITADTSASTA YMELSSLRSE DTAVYYCARE GYFGNYGVYA MDYWGQGTLV

    121  TVSS  (SEQ ID NO：12)。

特异结合VLA-4的人源化抗体的一个实例包含：

1)包含如下序列的轻链可变区

a)    1  SIVMTQSPSSL SASVGDRVTI TCKASQSVTN DVAWYQQKPG KAPKLLIYYA SNRYTGVPDR

     61  FSGSGYGTDFT FTISSLQPED IATYYCQQDY SSPYTFGQGT KVEIK  (SEQ ID NO：13)，

b)    1  DIQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCKASQSVTN DVAWYQQKPG KAPKLLIYYA SNRYTGVPDR

     61  FSGSGSGTDFT FTISSLQPED IATYYCQQDY SSPYTFGQGT YVEIK  (SEQ ID NO：14)，

或

c)    1  SIVMTQSPDSL AVSLGERVTI NCKASQSVTN DVAWYQQKPG QSPKLLIYYA SNRYTGVPDR

     61  FSGSGYGTDFT FTISSVQAED VAVYYCQQDY SSPYTFGGGT KLEIK  (SEQ ID NO：15)；

和

2)包含如下序列的重链可变区

d)    1  QVQLQESGPGL VRPSQTLSLT CTVSGFNIKD TYMHWVRQPP GRGLEWIGRI DPASGDTKYD

     61  PKFQVRVTMLV DTSSNTAWLR LSSVTAADTA VYYCADGMWV STGYALDFWG QGTTVTVSS(SEQ ID NO：16)，

e)    1  QVQLQESPGL VRPSQTLSLTC TVSGFNIKDT YMHWVRQPPG RGLEWIGRID PASGDTKYDP

     61  KFQVKAT ITA DTSSNQFSLRL SSVTAADTAV YYCADGMWVS TGYALDFWGQ GTTVTVSS(SEQ ID NO：17)，

f)    1  QVQLQESGPG LVRPSQTLSLT CTVSGFNIKD TYMHWVRQPP GRGLEWIGRI DPASGDTKYD

     61  PKFQVRVTML VDTSSNQFSLR LSSVTSEDTA VYYCADGMWV STGYALDFWG QGTTVTVSS(SEQ ID NO：18)，

g)    1  QVQLQESGPG LVRPSQTLSLT CTVSGFNIKD TYMHWVKQRP GRGLEWIGRI DPASGDTKYD

     61  PKFQVRVTML VDTSSNQFSLR LSSVTAADTA VYYCADGMWV STGYALDFWG QGTTVTVSS(SEQ ID NO：19)，

h)    1  QVQLQESGPG LVRPSQTLSLT CTASGFNIKD TYMHWVRQPP GRGLEWIGRI DPASGDTKYD

     61  PKFQVRVTML VDTSSNQFSLR LSSVTAADTA VYYCADGMWV STGYALDFWG QGTTVTVSS(SEQ ID NO：20)，或

i)    1  QVQLQESGAE VVKPGSSVKLS CKASGFNIKD TYMHWVKQRP GQGLEWIGRI DPASGDTKYD

     61  PKFQVKATIT ADESTSTAYLE LSSLRSEDTA VYYCADGMWV STGYALDFWG QGTTVTVSS(SEQ ID NO：21)。

4.α 4整联蛋白的免疫粘附素拮抗剂

依照还有一个实施方案，整联蛋白拮抗剂是免疫粘附素。此类免疫粘附素的一个实例是包含结合α4的α4整联蛋白配体的可溶性部分例如α4整联蛋白配体诸如VCAM-1(CD106)和/或MAdCAM-1的配体结合域或胞外域的免疫粘附素。在一个实施方案中，免疫粘附素拮抗剂是与IgG诸如人IgG1的Fc区融合的可溶性配体结合域。

VCAM-1和MAdCAM-1的结合域是本领域知道的。VCAM-1结合α4β1，主要经由结构域1(依照UniProt的残基25-105)内的几个残基(残基39、40、和43)及来自结构域2(依照UniProt的残基109-212)的几个残基的贡献；VCAM-1结合α4β7，主要经由结构域2内的残基及来自结构域1的残基的贡献(Newham等，1997，J. Biol.Chem.272：19429-19440)。MAdCAM-1结合α4β7，经由结构域1(依照UniProt的残基23-112)和结构域2(依照UniProt的残基113-231)二者；MAdCAM-1残基40、41、42、和44是完全结合所需要的，且消除残基143-150就消除结合。MAdCAM-1微弱结合α4β1，且消除残基143-150也消除与α4β1的结合(Newham等，1997，见上文)。尽管α4β1和α4β7二者都能结合VCAM-1和MAdCAM-1二者，但是存在配体偏爱性。α4β1主要是VCAM-1的受体，而α4β7主要是MAdCAM-1的受体(Newham等，1997，见上文)。

5.α4整联蛋白的小分子拮抗剂

在另一个实施方案中，α4整联蛋白拮抗剂是小分子。作为α4整联蛋白拮抗剂的小分子的实例包括美国专利号6,239,108、6,469,047、6,482,849、和6,706,753、已公开的PCT申请号WO 01/21584和WO 02/16313、和2003年5月20日提交的美国临时专利申请号60/472,072中所公开的。依照一个实施方案，拮抗剂是WO 01/21584中作为α4整联蛋白拮抗剂所引用的和下文更完整描述的任一小分子。依照另一个实施方案，拮抗剂是WO 01/21584中所引用的任一小分子或下文表中显示的任何小分子。

a.化学定义

在用于定义本文公开的小分子时，下列术语具有所示定义：

术语“烷基”在单独或作为另一个术语例如烷基氨基、烷基磺酰基、烷基硫代等的一部分使用时指分枝或不分枝的、饱和或不饱和的脂肪族烃基，它具有指定的碳原子数，或者如果没有指定数目的话，具有可多达且包括12个碳原子。“烷基”在单独或作为另一个术语的一部分使用时优选指饱和烃链，但是也包括不饱和烃碳链，诸如“烯基”和“炔基”。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、正庚基、3-庚基、2-甲基己基，诸如此类。术语“低级烷基”、“C₁-C₆烷基”和“1-6个碳原子的烷基”含义相同且互换使用。优选的“C₁-C₆烷基”是甲基、乙基、1-丙基、异丙基、1-丁基或仲丁基。

术语“取代烷基”或“取代的C_n-C_m烷基”，其中m和n是规定烷基所含碳原子范围的整数，指用一个、两个、三个或四个卤素、三氟甲基、羟基、未取代和取代C₁-C₇烷氧基、受保护羟基、氨基(包括烷基和二烷基氨基)、受保护氨基、未取代和取代C₁-C₇酸基、未取代和取代C₃-C₇杂环基、未取代和取代苯氧基、硝基、羧基、受保护羧基、未取代和取代烷氧羰基、未取代和取代酰基、氨基甲酰基、氨基甲酸基、氰基、甲基磺酰基氨基、未取代和取代苄氧基、未取代和取代C₃-C₆碳环基或C₁-C₄烷氧基取代的上述烷基。取代烷基可以是用相同或不同取代基取代一次(优选的)、两次或三次。

上述取代烷基的实例包括但不限于氰甲基、硝甲基、羟甲基、三苯甲基氧甲基、丙酸基甲基、氨甲基、羧甲基、羧乙基、羧丙基、烷基氧羰基甲基、烯丙基氧羰基氨基甲基、氨基甲酸基甲基、甲氧基甲基、乙氧基甲基、叔丁氧基甲基、乙酸基甲基、氯甲基、溴甲基、碘甲基、三氟甲基、6-羟基己基、2，4-二氯(正丁基)、2-氨基(异丙基)、2-氨基甲酸基乙基等等。烷基还可以用碳环基团取代。实例包括环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、和环己基甲基，以及相应的-乙基、-丙基、-丁基、-戊基、-己基等。上组实例的优选基团包括取代的甲基，如与“取代的C_n-C_m烷基”用相同取代基取代的甲基。取代甲基的实例包括诸如羟甲基、受保护的羟甲基(如四氢吡喃基氧甲基)、乙酸基甲基、氨基甲酸基甲基、三氟甲基、氯甲基、羧甲基、溴甲基和碘甲基等基团。

术语“非芳香族”指不具有定义芳香性的特性的碳环或杂环。对于芳香性，环必须是平面的，在每个环原子处具有垂直于环平面的p轨道，并满足休克尔规则，即环中的π电子数是(4n+2)，其中n是整数(即π电子数是2、6、10或14)。本文提供的非芳香族环不满足这些芳香性标准中的一项或全部。

术语“烷氧基”在用于本文时包括饱和的，即O-烷基，和不饱和的，即O-烯基和O-炔基。例示性烷氧基具有规定的碳原子数，诸如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基等等基团。术语“取代烷氧基”指用与“取代烷基”相同取代基取代的这些烷氧基。

术语“酸基(酰氧基)”指具有规定碳原子数的碳酰氧基，诸如甲酸基、乙酸基、丙酸基、丁酸基、戊酸基、己酸基、庚酸基等等。术语“取代酸基(酰氧基)”指用与“取代烷基”相同取代基取代的这些酸基(酰氧基)。

术语“烷基羰基”、“烷酰基”和“酰基”在本文中互换使用且涵盖具有规定碳原子数的基团，诸如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基、苯甲酰基等等。

术语“烷基磺酰基”指基团-NH-SO₂-烷基、-SO₂-NH-烷基、-N-(SO₂-烷基)₂和-SO₂-N(烷基)₂。优选的烷基磺酰基是-NH-SO₂-甲基、-NH-SO₂-乙基、-NH-SO₂-丙基、-NH-SO₂-异丙基、-N-(SO₂-甲基)₂和-N-(SO₂-丁基)₂。

术语“氨基”指伯胺(即-NH₂)、仲胺(即-NRH)和叔胺(即-NRR)。优选的仲胺和叔胺是烷基胺和二烷基胺，诸如甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、二甲胺、二乙胺、二丙胺和二异丙胺。

“羧基”在本文中指游离酸-COOH及其酯，诸如烷基、芳基和芳烷基酯。优选的酯是甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、异丁酯、仲丁酯和叔丁酯。

术语“碳环基”、“碳环的”和“碳环”在单独和作为复杂基团诸如碳环烷基的一部分使用时指具有3-14个碳原子且优选3-7个碳原子的单环、二环、或三环脂肪环。优选的碳环基团包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。术语“取代碳环基”和“碳环”指用与“取代烷基”相同取代基取代的这些基团。

“碳环烷基”指与上文定义的烷基共价键合的上文定义的碳环基团。

术语“杂环”指具有5-16个成员的单环、二环或三环环系统，其中至少一个环原子是杂原子(即N、O和S以及SO或SO₂)。环系统是饱和的、不饱和的或部分不饱和的，且可以是芳香族的(除非规定为非芳香族的)。例示性杂环包括哌啶、哌嗪、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吗啉、吡喃、吡咯、呋喃、噻吩(噻吩基)、咪唑、吡唑、噻唑、异噻唑、二噻唑、噁唑、异噁唑、二噁唑、噻二唑、噁二唑、四唑、三唑、噻三唑、噁三唑、噻二唑、噁二唑、嘌呤及其苯并稠合衍生物(benzofused derivative)。

短语“任选用...取代”理解为指一个或多个规定取代基共价连接于取代部分，除非另有说明。在超过一个时，取代基可以是相同的或不同的基团。

术语“烯基”指具有指定碳原子数、含有一个或多个碳-碳双键的分枝或不分枝烃基，每个双键各自是顺式、反式、或非几何异构体。术语“取代烯基”指用与“取代烷基”相同取代基取代的这些烯基。

术语“炔基”指具有指定碳原子数、含有一个或多个碳-碳三键的分枝或不分枝烃基。术语“取代炔基”指用与“取代烷基”相同取代基取代的这些炔基。

术语“烷基硫代”和“C₁-C₁₂取代的烷基硫代”分别指连接于硫的C₁-C₁₂烷基和C₁-C₁₂取代的烷基，该硫继而成为烷基硫代或取代烷基硫代基团连接于指定基团或取代基的点。

“亚烷基二氧基”指-O-烷基-O-基团，其中烷基定义如上。优选的亚烷基二氧基是亚甲基二氧基和乙烯基二氧基。

术语“芳基”在单独或作为另一个术语的一部分使用时指具有指定碳原子数或者如果没有指定数目的话可多达14个碳原子的同素环芳香族基团，无论是否稠合的。优选的芳基包括苯基、萘基、联苯基、菲基(phenanthrenyl)、萘并萘基(naphthacenyl)、诸如此类(参见如《Lang′s Handbook of Chemistry》，Dean，J.A.编，1985，第13版，表7-2)。

术语“芳酰基”指与羰基键合的芳基，诸如苯甲酰基等。

术语“取代苯基”或“取代芳基”指用一个、两个、三个、四个或五个优选1-2个、1-3个或1-4个选自卤素(F、Cl、Br、I)、羟基、受保护羟基、氰基、硝基、烷基(优选C₁-C₆烷基)、烷氧基(优选C₁-C₆烷氧基)、苄氧基、羧基、受保护羧基、羧甲基、受保护羧甲基、羟甲基、受保护羟甲基、氨甲基、受保护氨甲基、三氟甲基、烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、杂环基磺酰氨基、杂环基、芳基、或其它规定基团的取代基取代的苯基或芳基。这些取代基中的一个或多个次甲基(CH)和/或亚甲基(CH₂)可继而用与上文所述相似的基团取代。术语“取代苯基”的实例包括但不限于单或二(卤代)苯基，诸如2-氯苯基、2-溴苯基、4-氯苯基、2，6-二氯苯基、2，5-二氯苯基、3，4-二氯苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-溴苯基、3，4-二溴苯基、3-氯-4-氟苯基、2-氟苯基等等；单或二(羟基)苯基，诸如4-羟基苯基、3-羟基苯基、2，4-二羟基苯基、及其受保护羟基衍生物等等；硝基苯基，诸如3-或4-硝基苯基；氰基苯基，例如4-氰基苯基；单或二(低级烷基)苯基，诸如4-甲基苯基、2，4-二甲基苯基、2-甲基苯基、4-(异丙基)苯基、4-乙基苯基、3-(正丙基)苯基等等；单或二(烷氧基)苯基，例如3，4-二甲氧基苯基、3-甲氧基-4-苄氧基苯基、3-甲氧基-4-(1-氯甲基)苄氧基-苯基、3-乙氧基苯基、4-(异丙氧基)苯基、4-(叔丁氧基)苯基、3-乙氧基-4-甲氧基苯基等等；3-或4-三氟甲基苯基；单或二羧基苯基或(受保护羧基)苯基，诸如4-羧基苯基；单或二(羟甲基)苯基或(受保护羟甲基)苯基，诸如3-(受保护羟甲基)苯基或3，4-二(羟甲基)苯基；单或二(氨甲基)苯基或(受保护氨甲基)苯基，诸如2-(氨甲基)苯基或2，4-(受保护氨甲基)苯基；或单或二(N-(甲基磺酰氨基))苯基，诸如3-(N-甲基磺酰氨基))苯基。同样，术语“取代苯基”表示其中取代基不同的二取代苯基，例如3-甲基-4-羟基苯基、3-氯-4-羟基苯基、2-甲氧基-4-溴苯基、4-乙基-2-羟基苯基、3-羟基-4-硝基苯基、2-羟基-4-氯苯基等等，以及其中取代基不同的三取代苯基，例如3-甲氧基-4-苄氧基-6-甲基磺酰氨基、3-甲氧基-4-苄氧基-6-苯基磺酰氨基、和其中取代基不同的四取代苯基，诸如3-甲氧基-4-苄氧基-5-甲基-6-苯基磺酰氨基。优选的取代苯基包括2-氯苯基、2-氨基苯基、2-溴苯基、3-甲氧基苯基、3-乙氧基-苯基、4-苄氧基苯基、4-甲氧基苯基、3-乙氧基-4-苄氧基苯基、3，4-二乙氧基苯基、3-甲氧基-4-苄氧基苯基、3-甲氧基-4-(1-氯甲基)苄氧基-苯基、3-甲氧基-4-(1-氯甲基)苄氧基-6-甲基磺酰氨基苯基。同样，术语“取代苯基”表示稠合了芳基、苯基或杂芳基的苯基。稠环还可以用任何、优选1、2或3个上文关于“取代烷基”定义的取代基取代。

术语“芳基烷基”指具有指定碳原子数的一个、两个、或三个芳基连接于具有指定碳原子数的烷基，包括但不限于苯甲基、萘甲基、苯乙基、二苯甲基(二苯基甲基)、三苯甲基等等。优选的芳基烷基是苯甲基。

术语“取代芳基烷基”指在任何碳处用芳基，优选C₆-C₁₀芳基取代的任何烷基，优选C₁-C₈烷基，所述芳基经由任何芳环位置与烷基键合且所述烷基部分用一个、两个或三个选自卤素(F、Cl、Br、I)、羟基、受保护羟基、氨基、受保护氨基、C₁-C₇酰氧基、硝基、羧基、受保护羧基、氨基甲酰基、氨基甲酸基、氰基、C₁-C₆烷基硫代、N-(甲基磺酰氨基)或C₁-C₄烷氧基的基团取代。任选的是，芳基可以用一个、两个、三个、四个或五个选自卤素、羟基、受保护羟基、硝基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、羧基、受保护羧基、羧甲基、受保护羧甲基、羟甲基、受保护羟甲基、氨甲基、受保护氨甲基、或N-(甲基磺酰氨基)的基团取代。如上所述，当C₁-C₈烷基部分或芳基部分或二者是双取代时，取代基可以是相同的或不同的。此基团还可以作为取代芳烷氧基的取代芳烷基部分(moiety)出现。

术语“取代芳烷基”和此基团在“取代芳烷氧基”中出现时的实例包括诸如2-苯基-1-氯乙基、1-苯基-1-氯甲基、1-苯基-1-溴甲基、2-(4-甲氧基苯基)乙基、2，6-二羟基-4-苯基(正己基)、5-氰基-3-甲氧基-2-苯基(正戊基)、3-(2，6-二甲基苯基)正丙基、4-氯-3-氨基苯甲基、6-(4-甲氧基苯基)-3-羧基(正己基)、5-(4-氨甲基苯基)-3-(氨甲基)(正戊基)等等基团。

术语“羧基保护基”在用于本文时指在化合物的其它官能基上进行反应时常用于封闭或保护羧酸基团的羧酸基团的酯衍生物之一。此类羧酸保护基的实例包括4-硝基苯甲基、4-甲氧基苯甲基、3，4-二甲氧基苯甲基、2，4-二甲氧基苯甲基、2，4，6-三甲氧基苯甲基、2，4，6-三甲基苯甲基、五甲基苯甲基、3，4-亚甲基二氧基苯甲基、二苯甲基、4，4′-二甲氧基二苯甲基、2，2′，4，4′-四甲氧基二苯甲基、烷基诸如叔丁基或叔戊基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4，4′-二甲氧基三苯甲基、4，4′，4″-三甲氧基三苯甲基、2-苯基丙-2-基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、苯甲酰甲基、2，2，2-三氯乙基、β-(三甲基甲硅烷基)乙基、β-(二(正丁基)甲基甲硅烷基)乙基、对甲苯磺酰乙基、4-硝基苯甲基磺酰乙基、烯丙基、肉桂基、1-(三甲基甲硅烷基甲基)丙-1-烯-3-基、和类似部分。所采用羧基保护基的种类并不重要，只要衍生化羧酸对分子其它位置上的后续反应条件是稳定的且能在适当点消除而不破坏分子的剩余部分。具体而言，重要的是不使羧基受保护分子面临强亲核碱或采用高度活化的金属催化剂诸如拉尼镍的还原性条件。(在消除下文讨论的氨基保护基和羟基保护基时也应避免此类苛刻的消除条件。)优选的羧酸保护基是烯丙基和对硝基苯甲基。也可以使用头孢菌素、青霉素和肽领域中使用的类似羧基保护基来保护羧基取代基。这些基团的其它实例参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts，《Protective Groups in Organic Synthesis》，第2版，John Wiley &Sons Inc.，New York，N.Y，1991，第5章；E.Haslam，《Protective Groups inOrganic Chemistry》，J.G.W.McOmie编，Plenum Press，New York，N.Y.，1973，第5章；及T.W.Greene，《Protective Groups in Organic Synthesis》，John Wileyand Sons，New York，NY，1981，第5章。术语“受保护羧基”指用上述羧基保护基之一取代的羧基。

术语“羟基保护基”在用于本文时指在化合物的其它官能基上进行反应时常用于封闭或保护羟基的羟基的衍生物。此类保护基的实例包括四氢吡喃基氧基、乙酸基、氨基甲酸基、三氟、氯、羧基、溴和碘基。这些基团的其它实例参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts，《Protective Groups in OrganicSynthesis》，第2版，John Wiley & Sons Inc，New York，NY，1991，第2-3章；E.Haslam，《Protective Groups in Organic Chemistry》，J.G.W.McOmie编，Plenum Press，New York，NY，1973，第5章；及T.W.Greene，《Protective Groupsin Organic Synthesis》，John Wiley and Sons，New York，NY，1981。术语“受保护羟基”指用上述羟基保护基之一取代的羟基。

术语“氨基保护基”在用于本文时指常用于封闭或保护氨基而在化合物的其它官能基上进行反应的氨基衍生物。此类保护基的实例包括氨基甲酸酯/盐、酰胺、烷基和芳基、亚胺，以及能消除以再生所需氨基的许多N-杂原子衍生物。这些基团的其它实例参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts，《ProtectiveGroups in Organic Synthesis》，第2版，John Wiley & Sons Inc，New York，NY，1991，第7章；E.Haslam，《Protective Groups in Organic Chemistry》，J.G.W.McOmie编，Plenum Press，New York，NY，1973，第5章；及T.W.Greene，《Protective Groups in Organic Synthesis》，John Wiley and Sons，New York，NY，1981。术语“受保护氨基”指用上述氨基保护基之一取代的氨基。

术语“杂环基团”、“杂环的”、“杂环基”、或“杂环”在单独和作为复杂基团诸如杂环烷基的部分使用时互换使用且指具有指定原子数，通常是3-约10个环原子的任何单环、二环、或三环的饱和或非芳香族不饱和环，其中环原子是碳和1个、2个、3个或4个氮、硫或氧原子。通常，5员环具有0-2个双键，而6员环或7员环具有0-3个双键，且氮或硫杂原子可任选是氧化的，且任何氮杂原子可任选是季铵化的。实例包括吗啉基、吡咯烷基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、2，3-二氢呋喃基、2H-吡喃基、四氢吡喃基、硫杂丙环基、噻吨基(thietanyl)、四氢噻吨基、氮杂环丙烯基、氮杂环丙烷基、1-甲基-2-吡咯基、哌啶基、和3，4，5，6-四氢哌啶基。优选的基团是吗啉基。

“杂环烷基”或“杂环烯基”指与上文定义的烷基或烯基共价键合的上文定义的杂环基团。

除非另有规定，“杂芳基”在单独和作为复杂基团诸如杂芳烷基的部分使用时指具有指定原子数的任何单环、二环、或三环的芳香环系统，其中至少一个环是含有1-4个选自氮、氧、和硫的杂 原子的5员环、6员环或7员环，且优选的是至少一个杂原子是氮(《Lang′s Handbook of Chemistry》，见上文)。该定义包括其中任何上述杂芳环与苯环稠合的任何二环基团。优选其中杂原子是氮或氧的杂芳基。

下列环系统是术语“杂芳基”所指杂芳基(无论是取代的或未取代的)的实例：噻吩基、呋喃基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、噻二唑基、噁二唑基、四唑基、噻三唑基、噁三唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、噻嗪基、噁嗪基、三嗪基、噻二嗪基、噁二嗪基、二噻嗪基、二噁嗪基、噁噻嗪基、四嗪基、噻三嗪基、噁三嗪基、二噻二嗪基、咪唑啉基、二氢嘧啶基、四氢嘧啶基、四唑并[1，5-b]哒嗪基和嘌呤基，以及苯并稠合衍生物，例如苯并噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、苯并咪唑基和吲哚基。

含有1个硫或氧原子及1-3个氮原子的杂环5员环系统也适用于本发明。此类优选基团的实例包括噻唑基，特别是噻唑-2-基和噻唑-2-基N-氧化物；噻二唑基，特别是1，3，4-噻二唑-5-基和1，2，4-噻二唑-5-基；噁唑基，优选噁唑-2-基；和噁二唑基，诸如1，3，4-噁二唑-5-基和1，2，4-噁二唑-5-基。具有2-4个氮原子的5员环系统的一组其它优选实例包括咪唑基，优选咪唑-2-基；三唑基，优选1，3，4-三唑-5-基；1，2，3-三唑-5-基、1，2，4-三唑-5-基；和四唑基，优选1H-四唑-5-基。苯并稠合衍生物的一组优选实例是苯并噁唑-2-基、苯并噻唑-2-基和苯并咪唑-2-基。

上述杂环环系统其它合适的具体实例是含有1-3个氮原子及任选的1个硫或氧原子的6员环系统。此类实例包括吡啶基，诸如吡啶-2-基、吡啶-3-基、和吡啶-4-基；嘧啶基，优选嘧啶-2-基和嘧啶-4-基；三嗪基，优选1，3，4-三嗪-2-基和1，3，5-三嗪-4-基；哒嗪基，特别是哒嗪-3-基；和吡嗪基。吡啶N-氧化物和哒嗪N-氧化物和吡啶基、嘧啶-2-基、嘧啶-4-基、哒嗪基和1，3，4-三嗪-2-基是优选的一组。任选取代杂环环系统的取代基和上文讨论的5员环和6员环系统的其它实例可参见W.Druckheimer等，美国专利号4,278,793。

特别优选的一组“杂芳基”包括：1，3-噻唑-2-基、4-(羧甲基)-5-甲基-1，3-噻唑-2-基、4-(羧甲基)-5-甲基-1，3-噻唑-2-基钠盐、1，2，4-噻二唑-5-基、3-甲基-1，2，4-噻二唑-5-基、1，3，4-三唑-5-基、2-甲基-1，3，4-三唑-5-基、2-羟基-1，3，4-三唑-5-基、2-羧基-4-甲基-1，3，4-三唑-5-基钠盐、2-羧基-4-甲基-1，3，4-三唑-5-基、1，3-噁唑-2-基、1，3，4-噁二唑-5-基、2-甲基-1，3，4-噁二唑-5-基、2-(羟甲基)-1，3，4-噁二唑-5-基、1，2，4-噁二唑-5-基、1，3，4-噻二唑-5-基、2-巯基-1，3，4-噻二唑-5-基、2-(甲基硫代)-1，3，4-噻二唑-5-基、2-氨基-1，3，4-噻二唑-5-基、1H-四唑-5-基、1-甲基-1H-四唑-5-基、1-(1-(二甲基氨基)乙-2-基)-1H-四唑-5-基、1-(羧甲基)-1H-四唑-5-基、1-(羧甲基)-1H-四唑-5-基钠盐、1-(甲基磺酸)-1H-四唑-5-基、1-(甲基磺酸)-1H-四唑-5-基钠盐、2-甲基-1H-四唑-5-基、1，2，3-三唑-5-基、1-甲基-1，2，3-三唑-5-基、2-甲基-1，2，3-三唑-5-基、4-甲基-1，2，3-三唑-5-基、吡啶-2-基N-氧化物、6-甲氧基-2-(N-氧化物)-哒嗪-3-基、6-羟基哒嗪-3-基、1-甲基吡啶-2-基、1-甲基吡啶-4-基、2-羟基嘧啶-4-基、1，4，5，6-四氢-5，6-二氧-4-甲基-偏三嗪-3-基、1，4，5，6-四氢-4-(甲酰基甲基)-5，6-二氧-偏三嗪-3-基、2，5-二氢-5-氧-6-羟基-偏三嗪-3-基、2，5-二氢-5-氧-6-羟基-偏三嗪-3-基钠盐、2，5-二氢-5-氧-6-羟基-2-甲基-偏三嗪-3-基钠盐、2，5-二氢-5-氧-6-羟基-2-甲基-偏三嗪-3-基、2，5-二氢-5-氧-6-甲氧基-2-甲基-偏三嗪-3-基、2，5-二氢-5-氧-偏三嗪-3-基、2，5-二氢-5-氧-2-甲基-偏三嗪-3-基、2，5-二氢-5-氧-2，6-二甲基-偏三嗪-3-基、四唑[1，5-b]哒嗪-6-基和8-氨基四唑[1，5-b]-哒嗪-6-基。

“杂芳基”的可选基团包括：4-(羧甲基)-5-甲基-1，3-噻唑-2-基、4-(羧甲基)-5-甲基-1，3-噻唑-2-基钠盐、1，3，4-三唑-5-基、2-甲基-1，3，4-三唑-5-基、1H-四唑-5-基、1-甲基-1H-四唑-5-基、1-(1-(二甲基氨基)乙-2-基)-1H-四唑-5-基、1-(羧甲基)-1H-四唑-5-基、1-(羧甲基)-1H-四唑-5-基钠盐、1-(甲基磺酸)-1H-四唑-5-基、1-(甲基磺酸)-1H-四唑-5-基钠盐、1，2，3-三唑-5-基、1，4，5，6-四氢-5，6-二氧-4-甲基-偏三嗪-3-基、1，4，5，6-四氢-4-(2-甲酰基甲基)-5，6-二氧-偏三嗪-3-基、2，5-二氢-5-氧-6-羟基-2-甲基-偏三嗪-3-基钠盐、2，5-二氢-5-氧-6-羟基-2-甲基-偏三嗪-3-基、四唑[1，5-b]哒嗪-6-基、和8-氨基四唑[1，5-b]哒嗪-6-基。

术语“低级”在与术语诸如例如烷基一起使用形成“低级烷基”时指含有1-6个碳原子。

“制药学可接受盐”包括酸和碱加成盐二者。“制药学可接受的酸加成盐”指那些保留游离碱的生物学效力和特性且在生物学或其它方面没有不良特性，用无机酸和有机酸形成的盐，所述无机酸诸如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、碳酸、磷酸等等，而所述有机酸可选自脂肪族、脂环族、芳香族、芳脂族(araliphatic)、杂环、羧基、和磺酸类有机酸，诸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、马来酸、丙二酸(maloneicacid)、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸、抗坏血酸、谷氨酸、氨茴酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、扑酸(embonic acid)、苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸(salicyclic acid)等等。

“制药学可接受的碱加成盐”包括那些由无机碱衍生的盐，诸如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等等。特别优选铵、钾、钠、钙和镁盐。由制药学可接受的有机无毒碱衍生的盐包括伯、仲、和叔胺、取代胺包括天然存在取代胺、环胺和碱性离子交换树脂诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙氨基乙醇、trimethamine、二环己基胺、赖氨酸。精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、hydrabamine、胆碱、甜菜碱、亚乙基二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤类、哌嗪(piperizine)、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等等。特别优选的有机无毒碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、trimethamine、二环己基胺、胆碱、和咖啡因。

b.α4整联蛋白拮抗剂-通式I、II、和III

可用于本发明方法的α4整联蛋白的小分子拮抗剂包括通式I、II、或III的化合物及WO 01/21584中所述：

或

其中

Z是H或低级烷基；

A可具有下列结构：

或

其中

B是氰烷基、碳环或杂环，任选用一个或多个R₁取代基取代；q是0-3；R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆各自是氢、烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硝基、脲、氰基、硫代、烷基硫代、羟基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷氧基羰基氨基、芳氧基羰基氨基、烷基亚硫酰基、磺酰基、烷基磺酰基、芳烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、烷酰基、烷酰基氨基、环烷酰基氨基、芳基、芳基烷基、卤素、或烷基膦酰基，且R₁、R₂、R₃、R₄和R₅用0-3个选自下组的取代基取代：羟基、羧基、低级烷氧基羰基、低级烷基、硝基、氧代、氰基、碳环基、杂环基、杂芳基、低级烷基硫代、低级烷氧基、低级烷基氨基、低级烷酰基氨基、低级烷基亚硫酰基、低级磺酰基、低级烷基磺酰基、低级烷酰基、芳基、芳酰基、杂环羰基、卤素和低级烷基膦酰基；或者R₁至R₅中有两个一起形成碳环或杂环；

Y是H、烷氧基、烷氧基烷氧基、芳氧基、烷基氨基烷氧基、二烷基氨基烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、杂环基或杂芳基烷基，其中上述每种可以是取代的或未取代的；

X₁是H、C(O)OR、C(O)NRaRb、C(O)R、或C(O)SR，其中R、Ra和Rb各自是氢或烷基、烷氧基、芳基、杂环基、杂芳基，用0-4个选自下组的取代基取代：卤素、羟基、氨基、羧基、硝基、氰基、杂环基、杂芳基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳烷基、芳烷基氧基、芳氧基羰基、芳烷基氧基羰基、亚烷基二氧基、低级烷氧基羰基、低级烷基、低级烯基、低级炔基、低级烷基硫代、低级烷氧基、低级烷基氨基、低级烷基亚硫酰基、低级磺酰基、低级烷基磺酰基、低级烷酰基、低级烷基膦酰基、氨基磺酰基低级烷基、羟基低级烷基、烷基亚硫酰基低级烷基、烷基磺酰基低级烷基、烷基硫代低级烷基、杂芳基硫代低级烷基、杂芳基氧基低级烷基、杂芳基氨基低级烷基、卤代低级烷基、和烷氧基低级烷基；其中所述杂环基、杂芳基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳烷基、芳烷基氧基、芳氧基羰基和芳烷基氧基羰基任选用卤素、羟基、氨基、羧基、硝基、氰基、烷基和烷氧基取代；且其中Ra和Rb与它们所附着的氮一起可形成用0-5个取代基R或Rd取代的杂环基或杂芳基；其中Rd具有如下结构；或其制药学可接受的盐：

其中X’是选自C(O)NRa、C(O)的二价接头或键；

X₂和X₃每种各自是氢、卤素、羟基、氨基、羧基、硝基、氰基，或是取代或未取代的烷基、芳基、杂环基、杂芳基、芳基、芳酰基、芳氧基、亚烷基二氧基、低级烷基羰基氨基、低级烯基羰基氨基、芳基羰基氨基、芳基烷基羰基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基、低级烷氧基羰基、低级烷基、低级烯基、低级炔基、低级烷基硫代、低级烷氧基、低级烷基氨基、低级烷基亚硫酰基、低级磺酰基、低级烷基磺酰基、低级烷酰基、低级烷基膦酰基、氨基磺酰基低级烷基、羟基低级烷基、烷基亚硫酰基低级烷基、烷基磺酰基低级烷基、烷基硫代低级烷基、杂芳基硫代低级烷基、杂芳基氧基低级烷基、杂芳基氨基低级烷基、卤代低级烷基、烷氧基低级烷基；且其中X₁与X₂或X₃可键合在一起形成杂环或杂芳基环；或者X₃与Z一起形成杂双环；

X_1’、X_2’、X_3’和X_4’每种各自是氢、卤素、羟基、氨基、羧基、硝基、氰基，或是取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂环基、杂芳基、芳基、芳酰基、芳氧基、亚烷基二氧基、低级烷基羰基氨基、低级烯基羰基氨基、芳基羰基氨基、芳基烷基羰基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基、低级烷氧基羰基、低级烷基、低级烯基、低级炔基、低级烷基硫代、低级烷氧基、低级烷基氨基、低级烷基亚硫酰基、低级磺酰基、低级烷基磺酰基、低级烷酰基、低级烷基膦酰基、氨基磺酰基低级烷基、羟基低级烷基、烷基亚硫酰基低级烷基、烷基磺酰基低级烷基、烷基硫代低级烷基、杂芳基硫代低级烷基、杂芳基氧基低级烷基、杂芳基氨基低级烷基、卤代低级烷基、烷氧基低级烷基。

本发明的化合物含有一个或多个不对称碳原子。因此，所述化合物可以非对映异构体、对映体或其混合物的形式存在。上文所述综合体可采用外消旋物、非对映异构体或对映体作为起始材料或作为中间体。非对映异构化合物可通过层析或结晶方法分开。类似的，对映混合物可使用相同技术或本领域知道的其它技术分开。每个不对称碳原子可以是R或S构型，而这两种构型都属于本发明的范围之内。优选具有S构型的化合物。

在一个优选的实施方案中，结构I中的X₁的是C(O)OR、C(O)R、或C(O)SR，更优选C(O)NRaRb，剩余变量A、Z、Y、X₂、X₃和X₄具有上文给出的定义。X₁基团优选位于相对于环附着点的对位，但是也可能优选位于间位。Ra和Rb与它们所附着的氮一起可优选形成用0-5个取代基R取代的5员或6员杂环基或杂芳基。杂环基或杂芳基环系统将优选含有一个氮原子，但是也可能优选在环系统中含有另一个氮或氧原子。杂环系统可含有稠合杂环基或杂芳基环或二者组合，且环可以是取代的或未取代的。

合适的具体杂环基和杂芳基的代表性实例有：

R、Ra和Rb还可以是非环，例如氢或烷基、芳基、杂环基、杂芳基、用0-4个选自下组的取代基取代：卤素、羟基、氨基、羧基、硝基、氰基、杂环基、杂芳基、芳基、芳酰基、芳氧基、亚烷基二氧基、低级烷氧基羰基、低级烷基、低级烯基、低级炔基、低级烷基硫代、低级烷氧基、低级烷基氨基、低级烷基亚硫酰基、低级磺酰基、低级烷基磺酰基、低级烷酰基、低级烷基膦酰基、氨基磺酰基低级烷基、羟基低级烷基、烷基亚硫酰基低级烷基、烷基磺酰基低级烷基、烷基硫代低级烷基、杂芳基硫代低级烷基、杂芳基氧基低级烷基、杂芳基氨基低级烷基、卤代低级烷基、烷氧基低级烷基；任选如上所述取代。优选的基团是取代的或未取代的低级烷基、低级烯基、芳基、和芳基低级烷基。

此类R、Ra和Rb基团的有些代表性实例显示于下：

在一个优选的实施方案中，A可具有如下结构(IX)：

其中优选的是，R₁、R₅、或R₁和R₅二者不是氢。就是说，优选的A基团是邻位取代的苯甲酰基。特别优选的邻位取代基是氯、溴、氨基和羟基。除R₁和/或R₅以外，苯甲酰基的苯环可优选在R₂、R₃或R₄处具有一个或二个额外取代基。优选的R₁、R₂、R₃、R₄、和R₅包括硝基、卤素(Cl、Br、F、I)、氨基、芳基、低级烷基、低级烷基硫代、低级烷氧基、低级烷基氨基、低级烷基亚硫酰基、低级烷基磺酰基、低级烷酰基、和低级烷基膦酰基，它们每一种各自可以是取代的或未取代的。

结构A(IX)的有些代表性实例包括：

Y优选OH或其酯或制药学可接受的羧酸盐。优选的酯是取代的或未取代的烷基、烯基、芳基、和芳基烷基酯。

Z优选是氢。

优选的R₂、R₃和R₄包括卤素、烷基、氨基、烷基氨基、和烷基羰基氨基，其中烷基可以是取代的或未取代的。对于具有结构I的化合物，X₂和X₃更优选是氢。对于具有结构II的化合物，X₂、X₃和X₄更优选是氢。

在一个具体的实施方案中，通式I、II、或III中的X₁可以是下文表I中显示的任一基团，它在与它所附着的羰基组合时指定为取代基R。在一个具体的实施方案中，A是表1中显示的指派为取代基R′的任意基团。

c.通式X的优选化合物

具体的α4整联蛋白拮抗剂包括下文通式X的拮抗剂，它们具有表1和2中显示的R和R′取代基，以及表3中显示的具体化合物。

表1：通式X的R和R′取代基

其它α4整联蛋白小分子拮抗剂包括下表中列举的拮抗剂。

表2

d.具体的α4整联蛋白拮抗剂小分子

下文表3列举了α4整联蛋白小分子拮抗剂的具体和代表性化合物。

表3

D.αL整联蛋白

术语“αL整联蛋白”在用于本文时指由αL亚基和β亚基构成的异二聚体。αL整联蛋白的实例包括αLβ2亚基(LFA-1或LFA-1整联蛋白)。αL整联蛋白的生物学活性的实例包括下列活性的任何一项或组合：(1)结合LFA-1的配体(如CD54(ICAM-1)、CD102(ICAM-2)、CD50(ICAM-3)、CD242(ICAM-4)、和ICAM-5(telecephalin)任一种)；和(2)促进B淋巴细胞附着于器官或固定化的脾、或淋巴结细胞。

1.αL整联蛋白的配体

依照一个实施方案，αLβ2(LFA-1)的配体是ICAM-1(CD54)。下面显示了人ICAM-1(CD54)多肽序列的一个实例(SWISSPROT编号P05362)：

  1  mapssprpal pallvllgal fpgpgnaqts vspskvilpr ggsvlvtcst scdqpkllgi

 61  etplpkkell lpgnnrkvye lsnvqedsqp mcysncpdgq staktfltvy wtpervclap

121  lpswqpvgkn ltlrcqvegg apranltvvl lrgekelkre pavgepaevt ttvlvrrdhh

181  ganfscrtel dlrpqglelf entsapyqlq tfvlpatppq lvsprvlevd tqgtvvcsld

241  glfpvseaqv hlalgdqrln ptvtygndsf sakasvsvta edegtqrltc avilgnqsqe

301  tlqtvtiysf papnviltkp evsegtevtv kceahprakv tlngvpaqpl gpraqlllka

361  tpedngrsfs csatlevagq lihknqtrel rvlygprlde rdcpgnwtwp ensqqtpmcq

421  awgnplpelk clkdgtfplp igesvtvtrd legtylcrar stqgevtrev tvnvlsprye

481  iviitvvaaa vimgtaglst ylynrqrkik kyrlqqaqkg tpmkpntqat pp[SEQ ID NO：22]

残基1-27构成信号序列，残基28-480构成胞外域，残基481-503构成跨膜域，而残基504-542构成胞质域。

依照一个实施方案，αL整联蛋白，例如αLβ2(LFA-1)的配体是ICAM-2(CD102)。下面显示了人ICAM-2(CD102)多肽序列的一个实例(Genbank编号CAG46633，EMBL编号CR541834.1)：

  1  mssfgyrtlt valftliccp gsdekvfevh vrpkklavep kgslevncst tcnqpevggl

 61  etsldkilld eqaqwkhylv snishdtvlq chftcsgkqe smnsnvsvyq pprqviltlq

121  ptlvavgksf tiecrvptve pldsltlflf rgnetlhyet fgkaapapqe atatfnstad

181  redghrnfsc lavldlmsrg gnifhkhsap kmleiyepvs dsqmviivtv vsvllslfvt

241  svllcfifgq hlrqqrmgty gvraawrrlp qafrp      [SEQ ID NO：23]

残基1-21构成信号序列，残基22-224构成胞外域，残基225-248构成跨膜域，而残基249-275构成胞质域。

依照一个实施方案，αL整联蛋白，例如αLβ2(LFA-1)的配体是ICAM-3(CD50)。下面显示了人ICAM-3(CD50)多肽序列的一个实例(SWISSPROT编号P32942)：

  1  matmvpsvlw pracwtllvc clltpgvqgq efllrvepqn pvlsaggslf vncstdcpss

 61  ekialetsls kelvasgmgw aafnlsnvtg nsrilcsvyc ngsqitgssn itvyglperv

121  elaplppwqp vgqnftlrcq veggsprtsl tvvllrweee lsrqpaveep aevtatvlas

181  rddhgapfsc rteldmqpqg lglfvntsap rqlrtfvlpv tpprlvaprf levetswpvd

241  ctldglfpas eaqvylalgd qmlnatvmnh gdtltatata taradqegar eivcnvtlgg

301  errearenlt vfsflgpivn lseptahegs tvtvscmaga rvqvtldgvp aaapgqpaql

361  alnatesddg rsffcsatle vdgeflhrns svqlrvlygp kidratcpqh lkwkdktrhv

421  lqcqargnpy pelrclkegs srevpvgipf fvnvthngty qcqasssrgk ytlvvvmdie

481  agsshfvpvf vavlltlgvv tivlalmyvf rehqrsgsyh vreestylpl tsmqpteamg

541  eepsrae    [SEQ ID NO：24]

残基1-29构成信号序列，残基30-485构成胞外域，残基486-510构成跨膜域，而残基511-547构成胞质域。

依照一个实施方案，αL整联蛋白，例如αLβ2(LFA-1)的配体是ICAM-4。下面显示了人ICAM-4多肽序列的一个实例(SWISSPROT编号Q14773)：

  1  mgslfplsll fflaaaypgv gsalgrrtkr aqspkgspla psgtsvpfwv rmspefvavq

 61  pgksvalncs nscpqpqnss lrtplrqgkt lrgpgwvsyq lldvrawssl ahclvtcagk

121  trwatsrita ykpphsvile ppvlkgrkyt lrchvtqvfp vgylvvtlrh gsrviysesl

181  erftgldlan vtltyefaag prdfwqpvic harlnldglv vrnssapitl mlawspapta

241  lasgsiaalv gilltvgaay lckclamksq a  [SEQ ID NO：25]

残基1-22构成信号序列，残基23-240构成胞外域，残基241-261构成跨膜域，而残基262-271构成胞质域。

依照一个实施方案，αL整联蛋白，例如αLβ2(LFA-1)的配体是ICAM-5。下面显示了人ICAM-5多肽序列的一个实例(SWISSPROT编号Q9UMF0)：

  1  mpgpspglrr allglwaalg lglfglsavs qepfwadlqp rvafverggs lwlncstncp

 61  rpergglets lrrngtqrgl rwlarqlvdi repetqpvcffrcarrtlqa rglirtfqrp

121  drvelmplpp wqpvgenftl scrvpgagpr asltltllrg aqelirrsfa gepprargav

181  ltatvlarre dhganfscra eldlrphglg lfenssapre lrtfslspda prlaaprlle

241  vgserpvsct ldglfpasea rvylalgdqn lspdvtlegd afvatatata saeqegarql

301  vcnvtlggen retrenvtiy sfpaplltls epsvsegqmv tvtcaagaqa lvtlegvpaa

361  vpgqpaqlql natenddrrs ffcdatldvd getliknrsa elrvlyaprl ddsdcprswt

421  wpegpeqtlr ceargnpeps vhcarsdgga vlalgllgpv tralsgtyrc kaandqgeav

481  kdvtltveya paldsvgcpe ritwlegtea slscvahgvp ppdvicvrsg elgaviegll

541  rvarehagty rceatnprgs aaknvavtve ygprfeepsc psnwtwvegs grlfscevdg

601  kpqpsvkcvg sggttegvll plappdpspr apriprvlap giyvcnatnr hgsvaktvvv

661  saesppemde stcpshqtwl egaeasalac aargrpspgv rcsregipwp eqqrvsreda

721  gtyhcvatna hgtdsrtvtv gveyrpvvae laasppggvr pggnftltcr aeawppaqis

781  wrappralni glssnnstls vagamgshgg eyecartnah grharritvr vagpwlwvav

841  ggaaggaall aagaglafyv qstackkgey nvqeaessge avclngaggg aggaagaegg

901  peaaggaaes paegevfaiq ltsa  [SEQ ID NO：26]

残基1-31构成信号序列，残基32-835构成胞外域，残基836-856构成跨膜域，而残基857-924构成胞质域。

2.αL整联蛋白拮抗剂

术语“αL整联蛋白拮抗剂”在用于本文时采用最广的含义，且包括部分或完全阻断αL整联蛋白的生物学活性的任何分子。依照一个实施方案，αL整联蛋白拮抗剂部分或完全阻断αL整联蛋白与其配体之间的相互作用并执行下列事件的任何一项或组合：(1)在哺乳动物中促进淋巴细胞的循环和(2)部分或完全阻断、抑制、或中和天然序列αL整联蛋白信号。依照一个实施方案，αL整联蛋白拮抗剂抑制B细胞附着于脾或淋巴结。在一个更具体的实施方案中，αL整联蛋白拮抗剂抑制B细胞附着于脾的边缘区和/或生发中心和淋巴结。

αL整联蛋白和α4整联蛋白的拮抗剂可单独使用，或是同时或顺序地联合使用，以促进哺乳动物中的B淋巴细胞循环。在一个实施方案中，αL整联蛋白和α4整联蛋白的多种不同拮抗剂可单独使用，或是同时或顺序地联合使用，以促进哺乳动物中的B淋巴细胞循环。拮抗剂可结合αL整联蛋白、αL亚基、或αL整联蛋白的配体。

合适的αL整联蛋白拮抗剂包括抑制αL整联蛋白与配体诸如ICAM-1(CD54)的相互作用的任何化合物。例如，αL整联蛋白拮抗剂可以是小分子、肽、蛋白质、免疫粘附素、和抗αL抗体或其片段，且可以是例如αLβ2(LFA-1)拮抗剂。这些术语指针对αL亚基(CD11a)或β亚基例如β2(CD18)或二者的拮抗剂。优选的是，拮抗剂针对或结合αL(CD11a)亚基或作为一个单位的αL整联蛋白。

3.αL整联蛋白的抗体拮抗剂

例如，αL拮抗剂可以是结合αL整联蛋白、αL亚基或是结合αL整联蛋白的配体的抗体。结合αL亚基(CD11a)的抗体包括例如抗体MHM24(Hildreth等，1983，Eur.J.Immunol.13：202-208)、IgG1抗体R3.1(BoehringerIngelheim Pharmaceuticals Inc.，Ridgefield，CT)、25-3(或25.3)、可从Immunotech(France)获得的、Olive等，1986，在Feldmann编的《Human TCell Clones.A new Approach to Immune Regulation》中，Clifton，NJ，Humana，p.173中引用的一种IgG1，KBA(IgG2a)(Nishimura等，1987，Cell.Immunol.107：32；Nishimura等，1985，同上94：122)、M7/15(IgG2b)(Springer等，1982，Immunol.Rev.68：171)、IOT16(Vermot Desroches等，1991，Scand.J.Immunol.33：277-286)、SPVL7(Vermot Desroches等，见上文)、和可从ATCC获得的、杂交瘤编号#TIB-217的M17/4(IgG2a)。一种优选的抗CD11a抗体是人源化抗体efalizumab(Raptiva^TM；Genentech，CA)。其它优选的抗CD11a抗体包括美国专利号6,037,454中描述的人源化抗体。通常还优选的是，抗CD11a抗体不是T细胞消除抗体，就是说，施用抗CD11a抗体不会降低循环中T细胞的水平。

在一个实施方案中，人源化抗CD11a抗体包含VL序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSG

STLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPLTFGQGTK

VEIK(SEQ ID NO.49)，和

VH序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGHWMNWVRQAPGKGLEW

VGMIHPSDSETRYNQKFKDRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA

RGIYFYGTTYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.50)；或者

在另一个实施方案中，抗CD11a抗体包含

MHM24 VL序列

DVQITQSPSYLAASPGETISINCRASKTISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGS

TLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPLTFGTGTKL

ELK(SEQ ID NO.51)，和

MHM24 VH序列

EVQLQQPGAELMRPGASVKLSCKASGYSFTGHWMNWVRQRPGQGLEW

IGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLTVDKSSSSAYMQLSSPTSEDSAVYYCAR

GIYFYGTTYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO.52)。

结合β亚基的抗体的实例包括抗CD18抗体，诸如MHM23(Hildreth等，见上文)、M18/2(IgG2a)(Sanches-Madrid等，1983，J.Exp.Med.158：586)、H52(Fekete等，1990，J.Clin.Lab Immunol.31：145-149)、Mas191c(Vermot Desroches等，见上文)、IOT18(Vermot Desroches等，见上文)、60.3(Taylor等，1988，Clin.Exp.Immunol.71：324-328)、和60.1(Campana等，1986，Eur.J.Immunol.16：537-542)。还可参见US 5,997,867。

合适的αLβ2(LFA-1)结合分子，包括抗体的其它实例参见例如Hutchings等，见上文、WO 98/51343、WO 91/18011、WO 91/16928、WO91/16927、加拿大专利中请2,008,368、WO 90/15076、WO 90/10652、WO90/13281、WO 93/06864、WO 93/21953、EP 387,668、EP 379,904、EP 346,078、US 5,932,448、US 5,622,700、US 5,597,567、U.S.5,071,964、U.S.5,002,869、US 5,730,983、澳大利亚专利申请8815518、FR 2700471A、EP 289,949、EP362526、和EP 303,692。

αLβ2(LFA-1)拮抗剂还包括抑制αLβ2(LFA-1)与其配体的相互作用的抗体，包括例如针对ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、ICAM-4、和ICAM-5中的一种或多种的抗体。此类抗体可通过商业途径获得，例如抗ICAM-1抗体enlimomab(BIRR-1)和1A6，分别可从Boehringer IngelheimPharmaceuticals(Ridgefield，CT)和Perlan Therapeutics Inc.(San Diego，CA)获得；及抗ICAM-3抗体ICM3，可从ICOS Corp.(Bothell，WA)获得。

4.αL整联蛋白的免疫粘附素拮抗剂

依照还有一个实施方案，整联蛋白拮抗剂是免疫粘附素。此类免疫粘附素的一个实例是包含结合αL的αL整联蛋白配体的可溶性部分例如αL整联蛋白配体诸如例如ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、ICAM-4、和ICAM-5的配体结合域或胞外域的免疫粘附素。

ICAM配体的结合域是已知的。ICAM-1在结构域1(依照通用蛋白质资源目录即Universal Protein Resource catalog(UniProt)的残基41-103)内结合LFA-1(CD11a)。参见例如Bella等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：4140-4145。ICAM-2在结构域1(依照UniProt的残基41-98)内结合LFA-1(CD11a)和MAC-1(CD11b)。参见例如Bella等，1998，见上文；及Hermand等，2000，J.Biol.Chem.275：26002-26010。ICAM-3在结构域1(依照UniProt的残基46-103)内结合LFA-1(CD11a)而不结合MAC-1(CD11b)。参见例如Bella等，1998，见上文；及Hermand等，2000，见上文。ICAM-4在结构域1(依照UniProt的残基62-124)内结合LFA-1(CD11a)(Hermand等，2000，见上文)。ICAM-5在结构域1(依照UniProt的残基48-130)内结合LFA-1(CD11a)。参见例如Tian等，2000，Eur.J.Immunol.30：810-818。

本发明的整联蛋白或整联蛋白亚基的拮抗剂具体包括蛋白质，更具体地包括抗体和其功能片段、肽、免疫粘附素和小分子。所述抗体可以是人源化的、人的或嵌合的形式，或是这些抗体的片段。

5.αL整联蛋白的小分子拮抗剂

依照一个实施方案，αL整联蛋白拮抗剂是小分子。作为αL整联蛋白拮抗剂的小分子的实例包括已公开的PCT申请WO 99/49856和WO02/059114中所公开的。依照一个实施方案，拮抗剂是WO 02/059114中所引用的具有通式IX的任一小分子，正如下文详细所述。依照另一个实施方案，拮抗剂是WO 02/059114中所引用的和表4中所显示的任一小分子(即化合物编号4、5、35、17、10、12、13、14、41、44、6、15、36、37、38、40、42、9、3和51)。

a.通式XI

B细胞动员剂还包括αL整联蛋白拮抗剂，包括通式XI的αL整联蛋白拮抗剂化合物或其药学可接受的盐：

其中

Cy是非芳香族碳环或杂环，任选用羟基(-OH)、巯基(-SH)、硫代烷基、卤素(如F、Cl、Br、I)、氧代(＝O)、硫代(＝S)、氨基、氨基烷基、脒(-C(NH)-NH₂)、胍(-NH₂-C(NH)-NH₂)、硝基、烷基、烷氧基或酰基取代；

X是二价烃链，任选用羟基、巯基、卤素、氨基、氨基烷基、硝基、氧代、或硫代取代，且任选用N、O、S、SO、或SO₂中断；

Y是碳环或杂环，任选用羟基、巯基、卤素、氧代、硫代、烃、卤代烃、氨基、脒、胍、氰基、硝基、烷氧基、或酰基取代；

L是键或二价烃，任选有一个或多个碳原子用N、O、S、SO、或SO₂替换，且任选用羟基、卤素、氧代、或硫代取代；或是烃的三个碳原子用氨基酸残基替换；

R₁是H、OH、氨基、O-碳环、或烷氧基，任选用氨基、碳环或杂环取代；

R_2-5各自是H、羟基、巯基、卤素、氰基、氨基、脒、胍、硝基、或烷氧基；或者R₃与R₄一起形成稠合碳环或杂环，任选用羟基、卤素、氧代、硫代、氨基、脒、胍、或烷氧基取代；

R₆是H或烃链，任选用碳环或杂环取代；

及其盐、溶剂合物、和水合物；

前提是当Y是苯基，R₂、R₄、和R₅是H，R₃是Cl，且R₁是OH时，X不是环己基。

A、Z、Y、X₁、X₂、X₃、和X₄定义如上，既是一般的又是优选的。

Cy可以是3-5员环。在另一个实施方案中，Cy可以是5员或6员非芳香族杂环，任选用羟基、巯基、卤素(优选F或Cl)、氧代(＝O)、硫代(＝S)、氨基、脒、胍、硝基、烷基、或烷氧基取代。Cy可以是5员非芳香族杂环，任选用羟基、氧代、硫代、Cl、C_1-4烷基(优选甲基)、或C_1-4烷酰基(优选乙酰基、丙酰基或丁酰基)取代。非芳香族杂环可包含一个或多个杂原子(N、O、或S)且任选用羟基、氧代、巯基、硫代、甲基、乙酰基、丙酰基、或丁基取代。在具体的实施方案中，非芳香族杂环包含至少一个氮原子，任选用甲基或乙酰基取代。在一个特别优选的实施方案中，非芳香族杂环选自哌啶、哌嗪、吗啉、四氢呋喃、四氢噻吩、噁唑啉、噻唑啉，任选用羟基、氧代、巯基、硫代、烷基或烷酰基取代。在一个最优选的实施方案中，Cy是选自四氢呋喃-2-基、噻唑啉-5-基、噻唑啉-2-酮-5-基、和噻唑啉-2-硫酮-5-基和环丙基吡咯烷(cyclopropapyrrolidine)的非芳香族杂环。在另一个优选的实施方案中，Cy是3-6员碳环，任选用羟基、巯基、卤素、氧代、硫代、氨基、脒、胍、烷基、烷氧基或酰基取代。在一个具体的实施方案中，碳环是饱和的或部分不饱和的。在具体的实施方案中，Cy是选自环丙基、环丙烯基、环丁基、环丁烯基、环戊基、环戊烯基、环己基和环己烯基的碳环。

X是C_1-5二价烃接头，任选有一个或多个碳原子用N、O、S、SO或SO₂替换且任选用巯基、巯基、卤素、氨基、氨基烷基、硝基、氧代或硫代取代。在一个优选的实施方案中，X将有至少一个碳原子。替换和取代可形成烃链内或是任一或两个末端的酰胺部分(-NRC(O)-或-C(O)NR-)。其它部分包括磺酰胺(-NRSO₂-或-SO₂NR)、酰基、醚、硫醚和胺。在一个特别优选的实施方案中，X是基团-CH₂-NR₆-C(O)-，其中羰基-C(O)-部分与Cy相连(即共价结合)而R₆是烷基即甲基且更优选H。

Y是碳环或杂环，任选用羟基、巯基、卤素、氧代、硫代、烃、卤代烃、氨基、脒、胍、氰基、硝基、烷氧基或酰基取代。在具体的实施方案中，Y是酰基或杂芳基，任选用卤素或羟基取代。在一个特别优选的实施方案中，Y是苯基、呋喃-2-基、噻吩-2-基、用卤素(优选Cl)或羟基取代的苯基，优选在间位取代。

L是二价烃，任选有一个或多个碳原子用N、O、S、SO或SO₂替换且任选用羟基、卤素、氧代或硫代取代；或是烃的三个碳原子用氨基酸残基替换。优选的是，L在长度上小于10个原子，更优选5个或更小，最优选5个或3个原子。在具体的实施方案中，L选自-CH＝CH-C(O)-NR₆-CH₂-、-CH₂-NR₆-C(O)-、-C(O)-NR₆-CH₂-、-CH(OH)-(CH₂)₂-、-(CH₂)₂-CH(OH)-、-(CH₂)₃-、-C(O)-NR₆-CH(R₇)-C(O)-NR₆-、-NR₆-C(O)-CH(R₇)-NR₆-C(O)-、-CH(OH)-CH₂-O-和-CH(OH)-CF₂-CH₂-，其中每个R₆各自是H或烷基，而R₇是氨基酸侧链。优选的氨基酸侧链包括非天然存在的侧链诸如苯基或天然存在的侧链。优选的侧链是来自Phe、Tyr、Ala、Gln和Asn的侧链。在一个优选的实施方案中，L是-CH＝CH-C(O)-NR₆-CH₂-，其中其-CH＝CH-部分与Y相邻(即共价结合)。在另一个优选的实施方案中，L是-CH₂-NR₆-C(O)-，其中其亚甲基部分(-CH₂-)与Y相邻。

R₁是H、OH、氨基、O-碳环或烷氧基，任选用氨基、碳环或杂环取代。在一个优选的实施方案中，R₁是H、苯基或C_1-4烷氧基，任选用碳环诸如苯基取代。在一个具体的实施方案中，R₁是H。在另一个具体的实施方案中，R₁是甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、苯氧基或苄氧基。在还有一个具体的实施方案中，R₁是NH₂。在一个特别优选的实施方案中，R₁是乙氧基。在另一个特别优选的实施方案中，R₁是异丁氧基。在另一个特别优选的实施方案中，R₁是用氨基取代的烷氧基，例如2-氨基乙氧基、N-吗啉基乙氧基、N，N-二烷基氨基乙氧基、季铵羟基烷氧基(如三甲基铵羟基乙氧基)。

R_2-5各自是H、羟基、巯基、卤素、氰基、氨基、脒、胍、硝基或烷氧基；或者R₃与R₄一起形成稠合碳环或杂环，任选用羟基、卤素、氧代、硫代、氨基、脒、胍或烷氧基取代。在一个具体的实施方案中，R₂和R₃各自是H、F、Cl、Br或I。在另一个具体的实施方案中，R₄和R₅都是H。在另一个具体的实施方案中，R₂和R₃其中一个是卤素，而另一个是氢或卤素。在一个具体的实施方案中，R₃是Cl，而R₂、R₄和R₅每个是H。在另一个特别优选的实施方案中，R₂和R₃都是Cl，而R₄和R₅都是H。

R₆是H或烃链，任选用碳环杂环取代。在一个优选的实施方案中，R₆是H或烷基，即甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。在一个具体的实施方案中，R₆是H。

b.优选的通式XIa-f

在一个优选的实施方案中，本发明的化合物具有通式XIa-XIf：

其中Cy、Y、L和R_1-6定义如上。在一个特别优选的实施方案中，通式XIa-XIf的化合物中标有星号(*)的碳原子是手性的。在一个具体的实施方案中，碳原子具有R-构型。在另一个具体的实施方案中，碳原子具有S-构型。

c.具体的αL小分子拮抗剂

具体的αL拮抗剂小分子包括下文表4中所显示的。

表4

E.B细胞消除剂

上文定义的B细胞消除剂是经表面标志或抗原靶向B细胞，直接或间接导致B细胞死亡的拮抗剂分子。此类B细胞消除剂通常结合B细胞表面标志或抗原。B细胞消除剂可以是例如抗B细胞表面抗原抗体。此类B细胞消除剂的实例包括抗CD20、抗CD22、和抗CD52抗体，诸如抗CD20抗体，natiluzamab。

1.B细胞表面标志和抗原

“B细胞表面标志”或“B细胞表面抗原”在用于本文时指在B细胞表面上表达、可用与其结合的拮抗剂靶向它的抗原。例示性B细胞表面标志包括例如《The Leukocyte Antigen Facts Book》，第2版，1997，Barclay等编，Academic Press，Harcourt Brace & Co.，New York中描述的CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白细胞表面标志。其它B细胞表面标志包括CD180(RP105)、FcRH2(IRTA4)、CD79A(Igα)、C79B(Igβ)、B细胞CR2、CD196(CCR6)、CD72(Lyb-2)、P2X5、HLA-DOB、CD185(CXCR5)、CD23(FcεRII)、BR3、Btig、NAG14、SLGC16270、FcRH1(IRTA5)、CD307(IRTA2)、ATWD578、FcRH3、FcRH1(IRTA1)、FcRH6、CD269(BCMA)。

一种具体的B细胞表面抗原是“CD20”抗原，在超过90％来自外周血或淋巴器官的B细胞的表面上发现的35kDa非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B细胞发育过程中表达，并保持至浆细胞分化。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞上。文献中CD20的其它名称包括“B淋巴细胞限制抗原”、“B1”、和“Bp35”。例如Clark等，1985，PNAS(USA)82：1766中描述了CD20抗原。《The Leukocyte Antigen Facts Book》，Barclay等，见上文，p.182，还有EMBL Genbank编号X12530和Swissprot P11836中显示了人CD20的氨基酸序列。

另一种具体的B细胞表面抗原是“CD22”抗原，也称为BL-CAM或Lyb8。CD22是分子量约130(减短的)至140kD(未减短的)的1型整合膜糖蛋白。它在B淋巴细胞的细胞质和细胞膜中都表达。CD22抗原早期在B细胞淋巴细胞分化中出现，大致与CD19阶段相同。与其它B细胞标志不同，CD22膜表达限于晚期分化阶段，例如在成熟B细胞(CD22+)与浆细胞(CD22-)之间。例如Wilson等，1991，J.Exp.Med.173：137及Wilson等，1993，J.Immunol.150：5013中描述了CD22抗原。

另一种具体的B细胞表面抗原是BR3(也称为BLyS(BAFF)受体3或BAFF-R)。TNF家族成员BAFF是BR3的配体(Patel等，2004，J.Biol.Chem.279：16727-16735；Thompson等，2001，Science 293，Issue 5537，2108-2111)。

结合B细胞表面抗原的抗体，例如本文描述的抗CD20抗体的“功能性片段”指保留以与衍生它们的完整全长分子基本上相同的亲和力与抗原例如CD20结合且通过体外或体内测定法的测量展示生物学活性诸如消除B细胞的那些片段。

2.B细胞消除抗体

B细胞消除抗体诸如抗CD20和人源化抗CD20结合抗体等等的生物学活性至少包括抗体与人B细胞标志，诸如人CD20的结合，更优选与人和其它灵长类B细胞标志诸如CD20(包括猕猴、恒河猴、黑猩猩)的结合。有用的抗体以不高于1×10^-8的K_d值，优选不高于约1×10^-9的K_d值结合B细胞抗原。有用的抗体在体内能够杀死或消除B细胞，优选与未用此类抗体处理的适当阴性对照相比至少减少20％。B细胞消除可以是ADCC、CDC、或其它机制其中一种或多种的结果。

在本文疾病处理的有些实施方案中，可能比其它的更希望特定的效应物功能或机制，且优选B细胞消除抗体诸如抗CD20抗体(例如人源化抗CD20抗体，2H7和嵌合抗CD20抗体，Rituximab)的某些变体能实现那些生物学功能，例如ADCC。

术语“rituximab”或“RITUXAN”在本文中指在美国专利号5,736,137中称为“C2B8”，针对CD20抗原的经过遗传工程改造的嵌合鼠源/人源单克隆抗体，包括其保留结合CD20能力的片段。

a.抗CD20抗体

CD20抗体的实例包括：“C2B8”，现在称为“rituximab”(“RITUXAN”)(美国专利号5,736,137)；钇-[90]标记的2B8鼠源抗体，称为“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan”(ZEVALIN)，可从IDEC Pharmaceuticals Inc.购买(美国专利号5,736,137；2B8于1993年6月22日保藏于ATCC，编号HB11388)；鼠源IgG2a“B1”，也称为“Tositumomab”，任选用¹³¹I标记产生“131I-B1”或“碘I131 tositumomab”抗体(BEXXAR^TM)，可从Corixa购买(还可参见美国专利号5,595,721)；鼠源单克隆抗体“1F5”(Press等，Blood 69(2)：584-591，1987)及其变体，包括“框架补片的”或人源化的1F5(WO 2003/002607，Leung，S.，ATCC保藏物HB-96450)；鼠源2H7和嵌合2H7抗体(美国专利号5,677,180)；一种人源化2H7(WO 2004/056312，Lowman等，及下文所列)；HUMAX-CD20^TM，靶向B细胞细胞膜中CD20分子的完全人源的高亲和力抗体(Genmab，Denmark；还可参见例如G1ennie和van de Winkel，Drug Discovery Today 8：503-510，2003及Cragg等，Blood101：1045-1052，2003)；WO 2004/035607(Teeling等)中所列人源单克隆抗体；US 2004/0093621(Shitara等)中描述的Fc区结合有复杂N-糖苷连接糖链的抗体；CD20结合分子，诸如AME系列抗体，如WO 2004/103404(Watkins等，Applied Molecular Evolution)中列举的AME-33^TM抗体；A20抗体或其变体，诸如嵌合或人源化A20抗体(分别是cA20、hA20)(US2003/0219433，Immunomedics)；及单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2，可从International Leukocyte Typing Workshop获得(Valentine等，在《Leukocyte Typing III》中，McMichael编，p.440，Oxford University Press，1987)。本文优选的CD20抗体是嵌合、人源化、或人源CD20抗体，更优选rituximab，一种人源化2H7，嵌合或人源化A20抗体(Immunomedics)，和HUMAX-CD20^TM人源CD20抗体(Genmab)。

在每种这些抗体中，可以消除Fc区的C端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)，例如在多肽的纯化过程中或者通过重组改造编码多肽的核酸。因此，包含诸如具有本文Fc区的抗体或免疫粘附素等肽的组合物可包含具有K447的多肽、所有K447消除的多肽、或是具有和没有K447残基的多肽的混合物。如此，尽管下文提供的全长重链序列包含K447，然而下文的抗体组合物意图包含重链缺乏K447的抗体。

鼠源抗人CD20抗体，m2H7具有VH序列：

  1  QAYLQQSGAE LVRPGASVKM SCKASGYTFT SYNMHWVKQT PRQGLEWIGA IYPGNGDTSY

 61  NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYFCARVV YYSNSYWYFD VWGTGTTVTV

121  S  (SEQ ID NO：27)

和VL序列：

 1  QIVLSQSPAI LSASPGEKVT MTCRASSSVS YMHWYQQKPG SSPKPWIYAP SNLASGVPAR

61  FSGSGSGTSY SLTISRVEAE DAATYYCQQW SFNPPTFGAG TKLELK  (SEQ ID NO：28)。

纯粹为了本发明，“人源化2H7v.16”指如下完整抗体或抗体片段，它包含可变轻链序列：

 1  DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASSSVS YMHWYQQKPG KAPKPLIYAP SNLASGVPSR

61  FSGSGSGTDF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SFNPPTFGQG TKVEIKR    (SEQ ID NO：29)；

和

  1  EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT SYNMHWVRQA PGKGLEWVGA IYPGNGDTSY

 61  NQKFKGRFTI SVDKSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVV YYSNSYWYFD VWGQGTLVTV

121  SS         (SEQ ID NO：30)。

若人源化2H7v.16抗体是完整抗体，则优选的是它包含v16轻链氨基酸序列：

  1  DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASSSVS YMHWYQQKPG KAPKPLIYAP SNLASGVPSR

 61  FSGSGSGTDF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SFNPPTFGQG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS

121  DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL

181  SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC        (SEQ ID NO：31)；

和v16重链氨基酸序列：

  1  EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT SYNMHWVRQA PGKGLEWVGA IYPGNGDTSY

 61  NQKFKGRFTI SVDKSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVV YYSNSYWYFD VWGQGTLVTV

121  SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ

181  SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL

241  GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ

301  YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR

361  EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS

421  RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK         (SEQ ID NO：32)。

基于形式16的所有其它变体的V区具有v16的氨基酸序列，除了下表指出的氨基酸替代的位置。除非另有说明，2H7变体具有与v16相同的轻链。

2H7形式	重链(VH)改变	轻链(VL)改变	Fc改变
				16			-
31	-	-	S298A，E333A，K334A
				73	N100A	M32L
75	N100A	M32L	S298A，E333A，K334A
				96	D56A，N100A	S92A
114	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A

115	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A，E356D，M358L
				116	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，K334A，K322A
138	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A，K326A
				477	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A，K326A，N434W
375	-	-	K334L
				511	D56A，N100Y，S100aR	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A，K326A
588	-	-	S298A，E333A，K334A，K326A

前述人源化2H7v.16 mAb的有些变体的序列如下：

2H7v.31具有与上文SEQ ID NO：31相同的轻链，及重链氨基酸序列：

  1  EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT SYNMHWVRQA PGKGLEWVGA IYPGNGDTSY

 61  NQKFKGRFTI SVDKSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVV YYSNSYWYFD VWGQGTLVTV

121  SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ

181  SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL

241  GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ

301  YNATYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIAAT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR

361  EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS

421  RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK         (SEQ ID NO：33)；

2H7v.138具有重链氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG

YTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSL

RAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA

LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN

VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC

VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC

KVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW

ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL

SLSPGK    (SEQ ID NO：43)

和v138轻链氨基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSR

FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS

DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL

SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC  (SEQ ID NO：44)；

2H7v.114具有与v.138相同的轻链序列，上文SEQ ID NO：44，及重链氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG

YTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSL

RAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA

LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN

VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC

VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC

KVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW

ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL

SLSPGK    (SEQ ID NO：45)；

2H7v.477具有2H7v.138的轻链序列(SEQ ID NO：44)，及重链氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG

YTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSL

RAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA

LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN

VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC

VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC

KVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW

ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHWHYTQKSL

SLSPGK  (SEQ ID NO：46)；

2H7v.511具有2H7v.138的轻链序列(SEQ ID NO：44)，及重链氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSY

NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTV

SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ

SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL

GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ

YNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSR

EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS

RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK  (SEQ ID NO：47)。

形式114、115、116、138、477、511每个包含VL序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS

LQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR  (SEQ ID NO：48)。

b.抗CD22抗体、B细胞消除抗体、等等

B细胞消除抗体还包括识别CD20、CD22、CD23、BR3、和CD80的抗体和结合配体。实例包括抗CD22抗体LyphoCide^TM，也称为epratuzumab(Immunomedics Inc.，Morris Plains，NJ)；BAFF-R(CT)BR3阻断肽(QEDBioscience Inc.，San Diego，CA)；抗CD23抗体，IDEC-152，一种灵长类化抗体(Biogen IDEC，Cambridge，MA)；抗CD80抗体，DEC-114，一种灵长类化抗体(Biogen IDEC，Cambridge，MA)；等等。

嵌合和人源化A20抗体具有美国临时申请2003/0219433中公开的下列序列。cA20抗CD20抗体具有VL序列：

 1  DIQLTQSPAI LSASPGEKVT MTCRASSSVS YIHWFQQKPG SSPKPWIYAT SNLASGVPVR

61  FSGSGSGTSY SLTISRVEAE DAATYYCQQW TSNPPTFGGG TKLEIK  (SEQ ID NO：34)；和VH序列：

  1  QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYNMHWVKQT PGRGLEWIGA IYPGNGDTSY

 61  NQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARST YYGGDWYFDV WGQGTTVTVS

121  S    (SEQ ID NO：35)。

一种hA20抗CD20抗体具有VL序列：

 1  DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTCRASSSVS YIHWFQQKPG KAPKPWIYAT SNLASGVPVR

61  FSGSGSGTDY TFTISSLQPE DIATYYCQQW TSNPPTFGGG TKLEIK  (SEQ ID NO：36)；

和VH1序列：

 1  QVQLQQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFT SYNMHWVKQA PGQGLEWIGA IYPGNGDTSY

61  NQKFKGKATL TADESTNTAY MELSSLRSED TAFYYCARST YYGGDWYFDV WGQGTTVTVS

121  S    (SEQ ID NO：37)。

一种可选的hA20 VH1具有序列：

  1  QVQLQQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFS SYNMHWVRQA PGQGLEWMGA IYPGNGDTSY

 61  NQKFKGRATI TADESTNTAY MELSSLRSED TAFYFCARST YYGGDWYFDV WGQGTTVTVS

121  S    (SEQ ID NO：38)。

人源化(FR补片)IF5抗体具有美国临时申请2003/0040606中公开的序列。

一种hu1F5抗CD20抗体具有VL序列：

  1  QVQLVASGAE VNKPGASVKV SCKASGYTFT SYNMHWVRQP PGRGLEWIGA IYPGNGDTSY

 61  NQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARSH YGSNYVDYFD YWGQGTTVTV

121  SS    (SEQ ID NO：39)；和VH序列：

 1  DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASSSLS FMHWYQQKPG SSPKPWIYATSNLASGVPSR

61  FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYFCHQW SSNPLTFGAG TKLTVLR  (SEQ ID NO：40)。一种可选的hu1F5抗CD20抗体具有VL序列：

  1  QVQLVASGAE VNKPGASVKV SCKASGYTFT SYNMHWVRQPP GRGLEWIGA IYPGNGDTSY

 61  NQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSHY GSNYVDYFD YWGQGTTVTV

121  SS    (SEQ ID NO：41)；

和VH序列：

 1  DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASSSLS FMHWYQQKPG QAPVPVIYAT SNLASGVPSR

61  FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYFCHQW SSNPLTFGAG TKLTVLR  (SEQ ID NO：42)。

F.治疗方法

本发明的方法可用于治疗许多恶性和非恶性疾病包括自身免疫病和相关状况，以及癌症包括B细胞淋巴瘤和白血病。例如，骨髓中的干细胞(B细胞祖先)缺乏CD20抗原，容许健康的B细胞在CD20拮抗剂处理后再生并在几个月内回到正常水平。

1.自身免疫性紊乱和相关状况

自身免疫病或自身免疫相关状况包括关节炎(类风湿性关节炎诸如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎症性关节炎、变性关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病关节炎、脊椎关节炎、和幼年期发作的类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎(arthritis chronica progrediente)、变形性关节炎、慢性原发性多关节炎(polyarthritis chronica primaria)、反应性关节炎、和强直性脊柱炎)、炎性过度增殖性皮肤病、银屑病诸如斑块状银屑病、滴状银屑病(gutattepsoriasis)、脓疱性银屑病、和指甲银屑病、特应性包括特应性疾病诸如干草热和乔布氏综合征、皮炎包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎、和特应性皮炎、x连锁的高IgM综合征、荨麻疹诸如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹、多肌炎/皮肌炎、青少年型皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、硬皮病(包括系统性硬皮病)、硬化病诸如系统性硬化病、多发性硬化病(MS)诸如脊髓-视性MS(spino-optical MS)、原发性进行性MS(PPMS)、和复发性缓和性MS(RRMS)、进行性系统性硬化病、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化病(sclerosis disseminata)、共济失调性硬化病、视神经脊髓炎(NMO)、炎性肠病(IBD)(例如克罗恩氏病、自身免疫介导的胃肠病、结肠炎诸如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、微观结肠炎(microscopic colitis)、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎、和透壁性结肠炎、和自身免疫性炎性肠病)、坏疽性脓皮症、节结性红斑、原发性硬化性胆管炎、巩膜外层炎)、呼吸窘迫综合征，包括成人型或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、整个或部分葡萄膜炎症、虹膜炎、脉络膜炎、自身免疫性血液学紊乱、类风湿性脊椎炎、突发性听觉丧失、IgE介导的疾病诸如过敏性和变应性和特应性鼻炎、脑炎诸如拉斯默森氏脑炎和边缘系和/或脑干脑炎、葡萄膜炎，诸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎、或自身免疫性葡萄膜炎、具有和没有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)诸如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、自身免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜增殖性或膜性增殖性GN(MPGN)，包括I型和II型、和快速发展的GN、变应性状况和应答、变应性反应、湿疹包括变应性或特应性湿疹、哮喘诸如细支气管哮喘(asthmabronchiale)、支气管哮喘(bronchial asthma)、和自身免疫性哮喘、牵涉T细胞浸润和慢性炎性应答的状况、针对外来抗原的免疫反应诸如妊娠过程中的胎儿A-B-O血型、慢性肺部炎性疾病、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、狼疮，包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、儿科狼疮、非肾狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮、脱发狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)诸如皮肤SLE或亚急性皮肤SLE、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematodes)、新生儿狼疮综合征(NLE)、和播散性红斑狼疮、幼年期发作的(I型)糖尿病，包括儿科胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、成人期发作的糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特发性尿崩症、与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和延迟性超敏感性有关的免疫应答、结核病、结节病、肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳氏肉芽肿病、粒细胞缺乏、血管炎病，包括血管炎(包括大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏)动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎氏病和节结性多动脉炎/节结性动脉周围炎)、微观多动脉炎、CNS血管炎、坏死性、皮肤性、或超敏感性血管炎、系统性坏死性血管炎、和ANCA相关血管炎，诸如丘-施二氏血管炎或综合征(CSS))、颞动脉炎、再生障碍性贫血、自身免疫性再生障碍性贫血、库姆斯阳性贫血(Coombs positive anemia)、戴-布二氏贫血、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血(anemia perniciosa)、阿狄森氏病、单纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA)、因子VIII缺陷、血友病A、自身免疫性中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、牵涉白细胞渗出的疾病、CNS炎性紊乱、多器官损伤综合征诸如败血症、外伤或出血继发的、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病(anti-glomerular basement membranedisease)、抗磷脂抗体综合征、变应性神经炎、贝切特氏病、卡斯尔曼氏综合征、古德帕斯丘氏综合征、雷诺氏综合征、斯耶格伦氏综合征、史-约二氏综合征、类天疱疮诸如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、粘膜类天疱疮型天疱疮(pemphigusmucus-membrane pemphigoid)、和红斑性天疱疮)、自身免疫性多内分泌腺病、莱特氏病或综合征、免疫复合物肾炎、抗体介导的肾炎、多神经病、慢性神经病诸如IgM多神经病或IgM介导的神经病、血小板减少症(例如心肌梗死患者形成的)，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血后紫癜(PTP)、肝素诱导的血小板减少症、和自身免疫或免疫介导的血小板减少症诸如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP、睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、原发性甲状腺功能减退症、甲状旁腺功能减退、自身免疫性内分泌病包括甲状腺炎诸如自身免疫性甲状腺炎、桥本氏病、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)、或亚急性甲状腺炎、自身免疫性甲状腺疾病、特发性甲状腺功能减退症、格雷夫斯氏病、多腺性综合征诸如自身免疫性多腺性综合征(或多腺性内分泌病综合征)、瘤外综合征，包括神经学瘤外综合征诸如兰伯特-伊顿肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征、僵人或僵体综合征、脑脊髓炎诸如变应性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis)或变应性脑脊髓炎(encephalomyelitis allergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)、重症肌无力诸如胸腺瘤相关重症肌无力、小脑变性、神经性肌强直、视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、和感觉神经病、多病灶运动神经病、席汉氏综合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎、淋巴样间质性肺炎(LIP)、梗阻性细支气管炎(非移植)对NSIP、吉兰-巴雷综合征、贝格尔氏病(IgA肾病)、特发性IgA肾病、线性IgA皮肤病、原发性胆汁性肝硬化、肺硬变、自身免疫性肠病综合征、乳糜泻、腹部疾病、口炎性腹泻(麸质肠病)、难治的口炎性腹泻、特发性口炎性腹泻、冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS；卢格里克氏病)、冠状动脉病、自身免疫性耳病诸如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听觉缺失、视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、多软骨炎诸如难治的或复发的多软骨炎、胚泡蛋白沉着症、淀粉样变、巩膜炎、非癌性淋巴细胞增多、原发性淋巴细胞增多、包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(如良性单克隆丙球蛋白病和性质未确定的单克隆丙球蛋白病，MGUS)、周围神经病、瘤外综合征、通道病诸如癫痫、偏头痛、心率失常、肌肉紊乱、耳聋、盲、周期性瘫痪、和CNS的通道病、孤独症、炎性肌病、病灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、内分泌性眼病、葡萄膜视网膜炎、脉络膜视网膜炎、自身免疫性肝脏病学紊乱、纤维肌痛、多发性内分泌衰竭(multiple endocrine failure)、施密特氏综合征、肾上腺炎、胃萎缩、早老性痴呆、脱髓鞘病诸如自身免疫性脱髓鞘病和慢性炎性脱髓鞘性多神经病、糖尿病肾病、德雷斯勒氏综合征、斑秃、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象、食道运动功能障碍、指端硬化、和毛细管扩张)、男性和女性自身免疫性不孕不育、混合性结缔组织病、恰加斯氏病、风湿热、习惯性流产、农民肺、多形红斑、心切开术后综合征、柯兴氏综合征、鸟爱好者肺、变应性肉芽肿性血管炎、良性淋巴细胞性血管炎、阿尔波特氏综合征、肺泡炎诸如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎、间质性肺部、输血反应、麻风、疟疾、利什曼病、锥虫病(kypanosomiasis)、血吸虫病、蛔虫病、曲霉病、Sampter氏综合征、卡普兰氏综合征、登革热、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、弥漫性肺间质纤维化、肺间质纤维化、肺纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化、眼内炎、持久隆起性红斑、胎儿成红细胞增多症、嗜酸性筋膜炎(eosinophilicfaciitis)、舒尔曼氏综合征、费尔提氏综合征、flariasis、睫状体炎诸如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)、或Fuch氏睫状体炎、亨诺-许兰二氏紫癜、人免疫缺陷病毒(HIV)感染、艾柯病毒感染、心肌病、阿尔茨海默氏病、细小病毒感染、风疹病毒感染、种痘后综合征、先天性风疹感染、爱泼斯坦-巴尔病毒感染、腮腺炎、埃文斯综合征、自身免疫性性腺衰竭、西登哈姆氏舞蹈病、链球菌后肾炎、闭塞性血栓脉管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺毒症、脊髓痨、脉络膜炎、巨细胞性多肌痛、内分泌性眼病、慢性超敏性肺炎、干燥性角膜结膜炎、流行性角膜结膜炎、特发性肾炎综合征、微小病变肾病、良性家族性和缺血-再灌注损伤、视网膜自身免疫、关节炎症、支气管炎、慢性阻塞性气道疾病、硅沉着病、口疮、口疮性口炎、动脉硬化性紊乱、无精子形成(aspermiogenese)、自身免疫性溶血、伯克氏病、冷球蛋白血症、杜普伊特伦氏挛缩、晶体过敏性眼内炎(endophthalmia phacoanaphylactica)、变应性小肠炎(enteritis allergica)、麻风节结性红斑、特发性面瘫、慢性疲乏综合征、风湿热(febris rheumatica)、哈-里二氏病、感觉神经性听觉缺失、阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuriaparoxysmatica)、性腺功能减退、局限性回肠炎、白细胞减少症、传染性单核细胞增多症、横贯性脊髓炎(traverse myelitis)、原发性特发性粘液水肿、肾病、交感性眼炎(ophthalmia symphatica)、  肉芽肿性睾丸炎(orchitisgranulomatosa)、胰腺炎、急性多神经根炎、坏疽性脓皮症、奎尔万氏甲状腺炎、获得性脾萎缩(acquired spenic atrophy)、由于抗精子抗体的不育症、非恶性胸腺瘤、白癜风、SCID和爱泼斯坦-巴尔病毒相关疾病、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、寄生虫病诸如利什曼病(Lesihmania)、中毒性休克综合征、食物中毒、牵涉T细胞浸润的状况、白细胞粘附缺陷、与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫应答、牵涉白细胞渗出的疾病、多器官损伤综合征、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、变应性神经炎、自身免疫性多内分泌腺病、卵巢炎、原发性粘液水肿、自身免疫性萎缩性胃炎、交感性眼炎、风湿病、混合性结缔组织病、肾病综合征、胰岛炎、多内分泌衰竭(polyendocrine failure)、周围神经病、自身免疫性多腺性综合征I型、成人期发作的特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)、全秃、扩张型心肌病、获得性大疱性表皮松解(epidermolisis bullosa acquisita)(EBA)、血色素沉着、心肌炎、肾病综合征、原发性硬化性胆管炎、化脓性或非化脓性鼻窦炎、急性或慢性鼻窦炎、筛窦炎、额窦炎、上颌窦炎、或蝶窦炎、嗜曙红细胞相关紊乱诸如嗜曙红细胞增多症、肺嗜曙红细胞增多性浸润、嗜曙红细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏综合征、慢性嗜酸性肺炎、热带嗜曙红细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉肿、或含有嗜曙红细胞的肉芽肿、过敏反应、血清阴性脊椎关节炎(spondyloarthritides)、多内分泌自身免疫病、硬化性胆管炎、巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤假丝酵母病、布鲁顿氏综合征、婴儿期一过性低丙球蛋白血症、威斯科特-奥尔德里齐综合征、共济失调性毛细管扩张、与胶原病有关的自身免疫性紊乱、风湿病、神经病学疾病、淋巴结炎、缺血再灌注紊乱、血压应答降低、血管功能障碍、毛细管扩张(antgiectasis)、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血、和伴随血管化的疾病、变应性超敏性紊乱、肾小球肾炎(glomerulonephritides)、再灌注损伤、心肌或其它组织的再灌注损伤、具有急性炎性成分的皮肤病、急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性紊乱、眼和眶炎性紊乱、粒细胞输血相关综合征、细胞因子诱导的毒性、发作性睡病、急性重度炎症、慢性顽固性炎症、肾盂炎、肺硬变、糖尿病性视网膜病、糖尿病性大动脉紊乱、动脉内再生、消化性溃疡、心瓣炎、和子宫内膜异位症。

2.癌症，CD20⁺癌症

B细胞肿瘤或恶性肿瘤的特征是表达B细胞抗原或表面标志诸如CD20。例如，CD20阳性癌症指那些包含在细胞表面上表达CD20的细胞的异常增殖的癌症。CD20阳性B细胞肿瘤包括CD20阳性何杰金氏病，包括以淋巴细胞为主型的何杰金氏病(LPHD)；非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；滤泡中心细胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；毛细胞性白血病。非何杰金氏淋巴瘤包括低级/滤泡非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、中级/滤泡NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无裂细胞NHL、贮积病(bulky disease)NHL、类浆细胞淋巴细胞性淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症。还设想了这些癌症复发的治疗。LPHD是尽管进行了放疗或化疗处理仍趋向于复发且特征为CD20阳性恶性细胞的一类何杰金氏病。CLL是四类主要的白血病之一。A cancer of成熟B细胞called淋巴细胞，CLL表现为细胞在血液、骨髓和淋巴组织中的进行性积累。缓慢进展淋巴瘤是一种缓慢发展的、不能治愈的疾病，其中患者在多次消退和复发后平均存活6-10年。

在具体的实施方案中，本文描述的治疗和提升B细胞消除的方法可用于治疗B细胞肿瘤或恶性肿瘤，诸如非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、以淋巴细胞为主型的何杰金氏病(LPHD)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴细胞性白血病、类风湿性关节炎和幼年型类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)包括狼疮肾炎、韦格纳氏病、炎性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化病、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、血管炎、糖尿病、雷诺氏综合征、Siorgen氏综合征、和肾小球肾炎。

B细胞消除的期望水平将取决于疾病。例如，在CD20阳性癌症的治疗中，可能希望将B细胞消除最大化。如此，对于CD20(或其它B细胞表面抗原或标志)阳性B细胞肿瘤的治疗，希望B细胞消除足以至少防止疾病的发展，这可由本领域熟练医师来评估，例如通过监测肿瘤生长(大小)、癌性细胞类型的增殖、转移、和/或特定癌症的其它征候和症状。优选的是，B细胞消除足以在至少2个月的时间里防止疾病发展，更优选3个月，甚至更优选4个月，更优选5个月，甚至更优选6个月或更多个月。在甚至更优选的实施方案中，B细胞消除足以将消退的时间延长至少6个月，更优选9个月，更优选1年，更优选2年，更优选3年，甚至更优选5年或更多年。在一个最优选的实施方案中，B细胞消除足以治愈疾病。在优选的实施方案中，癌症患者中的B细胞消除是治疗前基线水平的至少约75％且更优选80％、85％、90％、95％、99％和甚至100％。

3.自身免疫性紊乱

为了治疗自身免疫病，可能希望根据个别患者中的疾病和/或状况的严重性通过调节B细胞消除剂例如结合CD20的抗体的剂量来调控B细胞消除程度。B细胞消除可以是完全的或部分的。在初始处理期间可能希望全部B细胞消除，但在后续处理中，可调节剂量只实现部分消除。在一个实施方案中，B细胞消除是至少20％，即与治疗前的基线水平相比80％或更少的目标例如CD20阳性B细胞得以保留。在其它实施方案中，B细胞消除是25％、30％、40％、50％、60％、70％或更高。优选的是，B细胞消除足以停止疾病的发展，更优选的是减轻所治疗具体疾病的征候和症状，甚至更优选的是治愈疾病。

用于评估肿瘤的治疗功效或成果的参数是适当疾病的熟练医师所知道的。通常，熟练医师会寻找特定疾病的征候和症状的减轻。所述参数可包括疾病发展、消退时间和稳定疾病的中值时间。

下列参考文献描述了淋巴瘤和CLL、它们的诊断、治疗和用于测量治疗功效的标准医学程序。Canellos GP、Lister TA、Sklar JL，《The Lymphomas》，W.B.Saunders Company，Philadelphia，1998；van Besien K和Cabanillas F，“Clinical  Manifestations，Staging and Treatment of Non-Hodgkin′sLymphoma”，第70章，pp1293-1338，在《Hematology，Basic Principles andPractice》中，第3版，Hoffman等编，Churchill Livingstone，Philadelphia，2000；及Rai K和Patel D，“Chronic Lymphocytic Leukemia”，第72章，pp1350-1362，在《Hematology，Basic Principles and Practice》中，第3版，Hoffman等编，Churchill Livingstone，Philadelphia，2000。

用于评估自身免疫或自身免疫相关疾病的治疗功效或成果的参数是适当疾病的熟练医师所知道的。通常，熟练医师会寻找特定疾病的征候和症状的减轻。下面是示例。

在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗类风湿性关节炎(RA)。RA的特征是多个关节的炎症、软骨损失和导致关节破坏和最终降低关节功能的骨侵蚀。另外，由于RA是系统疾病，因此它可能在其它组织诸如肺、眼和骨髓中具有影响。

B细胞消除剂诸如结合B细胞抗原的抗体，例如结合CD20的抗体与B细胞动员剂诸如整联蛋白抗体一起可用作早期RA(即未用过甲氨喋呤(MTX))患者中的一线疗法，或者联合如MTX或环磷酰胺。在另一个实施方案中，B细胞消除剂例如抗CD20抗体与B细胞动员剂诸如抗α4和/或抗αL拮抗剂包括抗体的这种组合可作为二线疗法联合如甲氨喋呤用于治疗调节疾病的抗风湿药物和/或甲氨喋呤难治的患者。这些试剂，例如人源化的结合CD20的抗体和整联蛋白抗体，可用于预防和控制关节损伤，延迟结构损伤，减轻与类风湿性关节炎中的炎症有关的疼痛，且通常减轻中度至严重类风湿性关节炎中的征候和症状。类风湿性关节炎患者可在用用于治疗RA的其它药物(见下面的联合疗法)处理之前、之后或一起用B细胞消除剂，例如人源化抗CD20抗体和B细胞动员剂，例如抗整联蛋白抗体进行处理。在一个实施方案中，用B细胞消除剂诸如抗CD20结合抗体治疗服用先前失败的调节疾病的抗风湿药物和/或对单独施用的甲氨喋呤具有不当应答的患者。在另一个实施方案中，除了抗整联蛋白抗体以外，还对患者施用人源化的抗CD20结合抗体、抗CD20结合抗体加环磷酰胺、或抗CD20结合抗体加甲氨喋呤。

评估类风湿性关节炎的治疗功效的一种方法以美国风湿病学学会(ACR)标准为基础，它格外测量疼痛和肿胀关节的改进百分比。与无抗体处理(如处理前的基线)或安慰剂处理相比，类风湿性关节炎患者可评分为例如ACR20(20％改善)。评估抗体治疗功效的其它方法包括X射线评分诸如用于对结构损伤诸如骨侵蚀和关节腔变窄评分的SharpX射线评分。还可根据治疗过程中或之后各时期的健康评估问卷(HAQ)得分、AIMS得分、SF-36对患者评估失能的预防或改善。ACR20标准可包括疼痛关节计数和肿胀关节计数二者的20％改善加上5项额外测量中至少3项的20％改善：

1.依据直观类比标度的患者疼痛评价(VAS)，

2.疾病活性的患者整体评价(VAS)，

3.疾病活性的医师整体评价(VAS)，

4.由健康评估问卷测量的患者自我评价失能，和

5.急性期反应物，CRP或ESR。

ACR50和70定义类似。优选的是，对患者施用一定量的B细胞消除剂诸如本发明的抗CD20结合抗体，其足以实现至少ACR20的得分，优选至少ACR30，更优选至少ACR50，甚至更优选至少ACR70，最优选至少ACR75和更高。

银屑病关节炎具有独特的放射线照相特征。对于银屑病关节炎，关节侵蚀和关节空间变窄也可通过Sharp得分来评估。B细胞消除剂，诸如本文公开的人源化抗CD20结合抗体可用于预防关节损伤以及减轻紊乱的疾病征候和症状。

本发明的另一个方面是通过对患有SLE的患者施用治疗有效量的B细胞消除剂诸如人源化抗CD20结合抗体来治疗狼疮或SLE的方法。SLEDAI得分提供了疾病活性的数值量化。SLEDAI是已知与疾病活性有关的24项临床和实验室参数的加权指数，数值范围0-103。参见例如Gescuk等，2002，Current Opinion in Rheumatology 14：515-521。认为针对双链DNA的抗体引起肾发红(renal flares)和狼疮的其它表现。可对接受抗体处理的患者监测到达肾发红的时间(time to renal flare)，这定义为血清肌酸酐、尿液蛋白质或尿液中血的显著的、可重现的升高。或者/另外，可对患者监测抗核抗体和针对双链DNA的抗体的水平。SLE治疗包括高剂量的皮质类固醇类和/或环磷酰胺(HDCC)。

脊椎关节病是一组关节紊乱，包括强直性脊柱炎、银屑病关节炎和克罗恩氏病。治疗成果可通过经过验证的患者和医师整体评价测量工具来测定。

使用各种药物来治疗银屑病；处理直接因疾病严重性而不同。具有更温和形式银屑病的患者通常利用局部处理来控制疾病，诸如局部类固醇类、蒽林(anthralin)、钙泊三烯(calcipotriene)、氯倍他索(clobetasol)、和他扎罗汀(tazarotene)，而具有中度和严重银屑病的患者更有可能采用系统(甲氨喋呤、类维A类、环孢霉素、PUVA和UVB)疗法。还使用Tar。这些疗法是安全性关注、费时方案、或不便治疗方法的组合体。此外，有些需要昂贵的设备和办公场所的专用空间。系统药物处理可产生严重的副作用，包括高血压、高脂血症、骨髓抑制、肝病、肾病和胃肠不适。同样，使用光疗可提高皮肤癌的发生率。除了与使用局部疗法有关的不便和不适以外，光疗和系统处理需要患者循环开始和结束处理并由于它们的副作用而监测终生暴露量。

银屑病的治疗功效通过监测疾病的临床征候和症状的变化来评估，包括较之基线状况的医师整体评价(PGA)变化和银屑病面积和严重性指数(PASI)得分、银屑病症状评价(PSA)。可在整个治疗期间在用于指示特定时间点经受的发痒程度的直观类比标度上对患者定期测量。

4.剂量

根据待治疗的适应症和本领域熟练医师所熟悉的与剂量给药有关的因素，将以有效治疗该适应症同时毒性和副作用最低的剂量施用本发明的B细胞消除剂和B细胞动员剂。

对于CD20阳性B细胞肿瘤的治疗，希望B细胞消除足以至少防止疾病的发展，这可由本领域熟练医师来评估，例如通过监测肿瘤生长(大小)、癌性细胞类型的增殖、转移、特定癌症的其它征候和症状。优选的是，B细胞消除足以在至少2个月的时间里防止疾病发展，更优选3个月，甚至更优选4个月，更优选5个月，甚至更优选6个月或更多个月。在甚至更优选的实施方案中，B细胞消除足以将消退的时间延长至少6个月，更优选9个月，更优选1年，更优选2年，更优选3年，甚至更优选5年或更多年。在一个最优选的实施方案中，B细胞消除足以治愈疾病。在优选的实施方案中，癌症患者中的B细胞消除是处理前基线水平的至少约75％且更优选80％、85％、90％、95％、99％和甚至100％。

对于CD20阳性癌症或自身免疫病的治疗，治疗有效剂量可以在约250mg/m²至约400mg/m²或500mg/m²的范围中，优选约250-375mg/m²。在一个实施方案中，剂量范围是275-375mg/m²。在治疗CD20阳性B细胞肿瘤的一个实施方案中，以300-375mg/m²的范围施用抗体。对于患有B细胞淋巴瘤诸如非何杰金氏淋巴瘤的患者的治疗，在一个具体的实施方案中，将以10mg/kg或375mg/m²的剂量对人类患者施用本发明的抗CD20抗体和人源化抗CD20抗体。在一个实施方案中，可以7-15mg/kg的剂量范围施用Rituximab。对于治疗NHL，一个剂量给药方案将是在治疗的第一周施用一剂剂量10mg/kg的抗体组合物，随后是2周间隔，然后施用第二剂相同量的抗体。通常，NHL患者一年间接受一次此类治疗，但在淋巴瘤复发后可重复此类治疗。在另一个剂量给药方案中，所治疗的具有低级NHL的患者接受四周人源化2H7形式，优选v16(每周375mg/m²)，随后在第五周接受三个额外疗程的抗体加标准CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)或CVP(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松)化疗，它是每三周施行，持续三个循环。

对于治疗类风湿性关节炎，在一个实施方案中，人源化抗CD20抗体的剂量范围是125mg/m²(相当于约200mg/剂)至600mg/m²，以两剂给药，例如第一天施用第一剂200mg，随后第15天给予第二剂200mg。在不同的实施方案中，剂量是250mg/剂、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg。

Genentech和Biogen Idec临床调查评估了使用多剂范围从低达10mg至可高达一剂1g的抗CD20(hu2H7.v16和Rituximab)治疗自身免疫病的效力(见Rituximab研究的背景部分；及WO 04/056312，实施例16)。一般而言，在这些临床调查中分两剂施用抗体，间隔约两周。临床调查中所研究的治疗方案实例包括，人源化CD20抗体2H7.v16用于类风湿性关节炎时为2×10mg(即2剂，每剂10mg；对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量～10.1mg/m²)、2×50mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量55mg/m²)、2×200mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量220mg/m²)、2×500mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量～550mg/m²)、和2×1000mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量～1100mg/m²)；及Rituxan为2×500mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量～550mg/m²)、2×1000mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量～1100mg/m²)。在每个这些剂量，在施用第一剂抗体后观察到实质性的循环中B淋巴细胞消除。

在具有自身免疫病的患者中治疗自身免疫病和消除B细胞的本发明复发中，在一个实施方案中，以范围为0.1mg至1000mg的平剂量施用人源化2H7抗体。我们发现在低于300mg，甚至10mg的平剂量实现了实质性B细胞消除。因而，在本发明B细胞消除和治疗方法中，在不同的实施方案中，以0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、200、或250mg的剂量施用hu2H7.v511抗体。如果目标是部分或短期B细胞消除，那么可使用较低剂量，如20mg、10mg或更低。

根据疾病，可以约1mg/kg至20mg/kg的剂量范围对患者施用抗整联蛋白抗体诸如α4和αL抗体。在不同的实施方案中，剂量方案是1-15mg/kg、1-10mg/kg、2-10mg/kg、3-10mg/kg。在一个具体的实施方案中，以约5mg/kg施用每种α4和αL抗体。

作为一般建议，α4或αL整联蛋白的小分子拮抗剂在肠胃外施用时每剂的初始制药学有效量将在约0.01-100mg/kg的范围中，优选约0.1至20mg/kg患者体重每天，所用化合物的典型初始范围是0.3至15mg/kg/天。口服单位剂量形式，诸如片剂和胶囊，优选含有约25至约1000mg本发明化合物。

在治疗疾病时，可对患者长期或间歇施用本发明的B细胞动员剂和消除剂，这由疾病的熟练医师决定。

通过静脉内灌注或皮下施用药物的患者可能遭受不良事件，诸如发热、发冷、灼伤感、虚弱和头痛。为了减轻此类不良时间或将其降至最低，患者可接受初始适应剂量的抗体，随后是治疗剂量。适应剂量将低于治疗剂量，使患者适应而耐受更高剂量。

5.施用路径

依照医务人员知道的方法对人类患者施用用于本发明方法的拮抗剂和抗体，诸如通过静脉内施用，如推注或通过连续灌注一段时间，通过皮下、肌肉内、动脉内、腹膜内、肺内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内、损伤内、或吸入路径(如鼻内)，通常通过静脉内或皮下施用。

在一个实施方案中，通过静脉内灌注施用人源化2H7抗体和/或人源化抗α4β1抗体，natalizumab，以0.9％氯化钠溶液作为灌注载体(vehicle)。

6.联合疗法

在治疗上文所述B细胞肿瘤时，可在多药方案中连同一种或多种治疗剂诸如化疗剂用本发明的B细胞动员剂和B细胞消除剂特别是结合CD20的抗体处理患者。B细胞动员剂和B细胞消除剂，例如结合CD20的抗体，可与化疗剂或者在无响应后与其它疗法同时、顺序、或交替施用。淋巴瘤处理的标准化疗可包括环磷酰胺、阿糖胞苷、美法仑(melphalan)和米托蒽醌mitoxantrone)和美法仑(melphalan)。CHOP是用于治疗非何杰金氏淋巴瘤的最常用化疗方案之一。下面是CHOP方案中使用的药物：环磷酰胺(品牌名称cytoxan，neosar)；亚德里亚霉素(阿霉素/羟基阿霉素)；长春新碱(Oncovin)；和泼尼松龙(有时称为Deltasone或Orasone)。在具体的实施方案中，对有所需要的患者施用B细胞消除剂诸如结合CD20的抗体和B细胞动员剂诸如α4或αL整联蛋白拮抗剂，连同一种或多种下列化疗剂：阿霉素、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松龙。在一个具体的实施方案中，连同CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)疗法用本发明的抗CD20抗体和抗α4β1抗体处理患有淋巴瘤(诸如非何杰金氏淋巴瘤)的患者。在另一个实施方案中，可连同CVP(环磷酰胺、长春新碱、和泼尼松)化疗用本发明的人源化的结合CD20的抗体和小分子α4和/或αL整联蛋白拮抗剂处理癌症患者。在一个具体的实施方案中，连同CVP用人源化2H7.v16和natalizumab处理患有CD20阳性NHL的患者。在治疗CLL的一个具体实施方案中，连同氟达拉滨(fludarabin)和环磷酰胺(cytoxan)其中之一或二者兼之的化疗施用结合CD20的抗体和整联蛋白拮抗剂。

在治疗上文所述自身免疫病或自身免疫相关状况时，可连同第二治疗剂诸如免疫抑制剂诸如在多药方案中用B细胞消除剂诸如结合CD20的抗体和α4和/或αL整联蛋白拮抗剂处理患者。B细胞消除剂可与B细胞动员剂同时、顺序、或交替施用，且与免疫抑制剂或者在无响应后与其它疗法同时、顺序、交替施用。免疫抑制剂可以本领域所列相同或较低剂量施用。优选的附属性免疫抑制剂将取决于许多因素，包括所治疗紊乱的类型以及患者的病史。

“免疫抑制剂”在本文中用于附属疗法时指作用于抑制或掩盖患者免疫系统的物质。此类试剂将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。此类试剂的实例包括类固醇类诸如糖皮质类固醇类，如泼尼松、甲基泼尼松龙、和地塞米松；2-氨基-6-芳基-5-取代嘧啶类(参见美国专利号4,665,077)、硫唑嘌呤(或环磷酰胺，如果硫唑嘌呤有不良反应的话)；溴隐亭；戊二醛(它掩盖MHC抗原，如美国专利号4,120,649中所述)；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢霉素A；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂包括抗干扰素-α、-β、或-γ抗体；抗肿瘤坏死因子-α抗体；抗肿瘤坏死因子-β抗体；抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；全T抗体，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合结构域的可溶肽(7/26/90出版的WO 90/08187)；链激酶；TGF-α；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T细胞受体(美国专利号5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等，Science 251：430-432，1991；WO 90/11294；及WO 91/01133)；和T细胞受体抗体(EP 340,109)诸如T10B9。

对于治疗类风湿性关节炎，可用B细胞消除剂诸如抗CD20抗体和B细胞动员剂诸如α4和/或αL整联蛋白拮抗剂处理患者，连同任何一种或多种下列药物：调节疾病的抗风湿药物(DMARD)(如甲氨喋呤)、NSAI或NSAID(非类固醇抗炎药)、HUMIRA^TM(adalimumab；Abbott Laboratories)、ARAVA(来氟米特)、REMICADE(infliximab；Centocor Inc.，Malvern，Pa)、ENBREL(依那西普；Immunex，WA)、COX-2抑制剂。常用于RA的DMARD是羟氯喹、柳氮磺吡啶、甲氨喋呤、来氟米特、依那西普、infliximab、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金(口服)、金(肌肉内)、米诺环素、环孢霉素、葡萄球菌蛋白质A免疫吸附。adalimumab是结合TNF-α的人单克隆抗体。infliximab是结合TNF-α的嵌合单克隆抗体。依那西普是由人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分与人IgG1的Fc部分相连组成的“免疫粘附素”融合蛋白。关于RA的常规处理参见如“Guidelines for the management of rheumatoid arthritis”，Arthritis &Rheumatism 46(2)：328-346，2002年2月。在一个具体的实施方案中，可连同甲氨喋呤(MTX)用本发明的CD20抗体处理RA患者。MTX的例示性剂量是约7.5-25mg/kg/周。MTX可口服和皮下施用。

对于治疗强直性脊柱炎、银屑病关节炎和克罗恩氏病，可连同例如Remicade(infliximab；来自Centocor Inc.，Malvern，Pa)、ENBREL(依那西普；Immunex，WA)用B细胞消除剂诸如结合CD20的抗体和B细胞动员剂诸如α4和/或αL整联蛋白拮抗剂处理患者。

SLE治疗包括高剂量的皮质类固醇类和/或环磷酰胺(HDCC)。

关于治疗银屑病，可连同局部处理诸如局部类固醇类、蒽林、钙泊三烯、氯倍他索、和他扎罗汀或者连同甲氨喋呤、类维A类、环磷酰胺、PUVA和UVB疗法对患者施用B细胞消除剂诸如抗CD20结合抗体和B细胞动员剂诸如α4和/或αL整联蛋白拮抗剂。在一个实施方案中，用结合CD20的抗体与环孢霉素顺序或同时处理银屑病患者。

7.药用制剂

制备依照本发明使用的B细胞消除剂诸如结合CD20的抗体和B细胞动员剂诸如α4和/或αL整联蛋白拮抗剂的治疗用制剂，即例如将具有所需纯度的抗体与任选的制药学可接受载体、赋形剂、或稳定剂混合(《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980)，以冻干制剂或水溶液的形式贮存。可接受的载体、赋形剂、或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，还包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化乙烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

例示性抗CD20抗体制剂描述于WO 98/56418，明确引入本文作为参考。另一种制剂是一种液体多剂量制剂，该制剂包含40mg/mL抗CD20抗体、25mM醋酸盐、150mM海藻糖、0.9％苯甲醇、0.02％聚山梨醇酯20，pH5.0，它在2-8℃具有最少2年的保存期。另一种感兴趣的抗CD20制剂在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL二水合柠檬酸钠、0.7mg/mL聚山梨醇酯80、和注射用无菌水pH6.5中包含10mg/mL抗体。还有一种水性药用制剂包含10-30mM醋酸钠，约pH4.8至约pH5.5，优选pH5.5，聚山梨醇酯，作为表面活性剂，数量约0.01-0.1％v/v，海藻糖，数量约2-10％w/v，和苯甲醇，作为防腐剂(美国专利号6,171,586)。适于皮下施用的冻干制剂描述于WO 97/04801。这种冻干制剂可用合适的稀释液复水至高蛋白质浓度，且复水后的制剂可皮下施用于本发明所治疗的哺乳动物。

人源化2H7变体的一种抗体制剂在10mM组氨酸、6％蔗糖、0.02％聚山梨醇酯20，pH5.8中包含12-14mg/mL抗体。在一个具体的实施方案中，2H7变体特别是2H7.v16以20mg/mL抗体在10mM硫酸组氨酸、60mg/mL蔗糖、0.2mg/mL聚山梨醇酯20、和注射用无菌水pH5.8中配制。

小分子整联蛋白拮抗剂的例示性制剂公开于例如WO 02/059114。

本发明制剂还可包含所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。例如，可能还希望提供胞毒剂、化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(如作用于T细胞的免疫抑制剂，诸如环孢霉素或结合T细胞的抗体，如结合LFA-1的抗体)。此类其它试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、疾病或紊乱或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些通常以本文所述相同的剂量和施药路径使用，或是迄今采用剂量的约1-99％。

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶状药物传递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这些技术公开于《Remington′s PharmaceuticalSciences》第16版，Osol，A.编，1980。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适示例包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。

G.产品和试剂盒

本发明的另一个实施方案是含有可用于治疗自身免疫病或癌症诸如CLL的物质的产品。该产品包含至少一个容器和与容器有关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料构成，诸如玻璃或塑料。至少一个容器中装有有效治疗病症的组合物，而且可以具有无菌进入端口(例如容器可以是具有能够被皮下注射针头刺穿的阻塞物的静脉内溶液袋或小瓶)。可以在组合物中提供两种治疗性组合物。第一组合物中的至少一种活性试剂是B细胞消除剂，诸如结合CD20的抗体。可以在一个或多个分开的容器中装有第二或第二和第三组合物，其中含有至少一种B细胞动员剂，诸如α4或αL整联蛋白拮抗剂，例如针对αL和α4整联蛋白的抗体。或者，可以在分开的产品中包装整联蛋白拮抗剂组合物。标签或包装插页指示组合物用于治疗特定病症。标签或包装插页还将包括用于对患者施用组合物的指示。包装插页指治疗性产品的商品化包装中通常包含的说明书，它们含有关于使用此类治疗性产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。或者，该产品还可以包含装有制药学可接受缓冲液的容器，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏液和右旋糖溶液。它还可以包含商业和用户立场希望的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、和注射器。

H.抗体生产

1.单克隆抗体

单克隆抗体可使用最初由Kohler等，Nature 256：495，1975描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(美国专利号4,816,567)。

在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适当宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成与用于免疫的蛋白质特异结合的抗体的淋巴细胞。或者，可在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇与骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding，《Monoclonal Antibodies：Principles and Practice》，59-103，Academic Press，1986)。

将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，该培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称为融合配偶体)生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么杂交瘤的选择性培养基通常将含有次黄嘌呤、氨基喋呤、和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。

优选的融合配偶体骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持选择的抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对针对未融合亲本细胞进行选择的选择性培养基敏感的骨髓瘤细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如可从SalkInstitute Cell Distribution Center(San Diege，California USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的衍生系，以及可从American Type Culture Collection(Rockville，Maryland USA)获得的SP-2及衍生物如X63-Ag8-653细胞。还描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(Kozbor，J.Immunol.133：3001，1984；及Brodeur等，《Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications》，51-63，Marcel Dekker Inc.，NewYork，1987)。

可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。

单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等，Anal.Biochem.107：220，1980描述的Scatchard分析来测定。

一旦鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，可通过有限稀释流程对克隆进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，《Monoclonal Antibodies：Principles and Practice》，59-103，AcademicPress，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养，如通过将细胞i.p.注射到小鼠体内。

可通过常规抗体纯化流程，诸如例如亲和层析(如使用蛋白A或蛋白G-Sepharose)或离子交换层析、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析等，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水、或血清适当分开。

编码单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离并测序(如通过使用能够特异结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞中，诸如不另外生成抗体蛋白质的大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性文章包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.5：256-262，1993和Plückthun，Immunol.Revs.130：151-188，1992。

在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature 348：552-554，1990中描述的技术构建的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等，Nature 352：624-628，1991和Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597，1991分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物描述了通过链改组，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.21：2265-2266，1993)，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替换方法。

还可以修饰编码抗体的DNA以生成嵌合或融合抗体多肽，例如通过用人重链和轻链恒定区(C_H和C_L)序列替换同源鼠序列(美国专利号4,816,567；及Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851，1984)，或通过融合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列(异源多肽)。非免疫球蛋白多肽序列可替换抗体的恒定区，或者用它们替换抗体的一个抗原结合位点的可变区以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。

2.人源化抗体

本领域已经描述了用于将非人抗体人源化的方法。优选的是，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。人源化可本质上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones等，Nature 321：522-525，1986；Reichmann等，Nature 332：323-327，1988；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536，1988)，通过用高变区序列替换人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替换。在实践中，人源化抗体通常是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替换的人抗体。

当抗体意图用于人类治疗性用途时，用于制备人源化抗体的人可变区的选择，包括轻链和重链二者，对于降低抗原性和HAMA应答(人抗小鼠抗体)非常重要。根据所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体可变区序列对已知的人可变区序列的整个文库进行筛选。鉴定得到与啮齿类最接近的人V区序列并接受其中的人构架区(FR)用于人源化抗体(Sims等，J.Immunol.151：2296，1993；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901，1987)。另一种方法使用由特定轻链或重链亚群的所有人抗体的共有序列衍生的特定构架区。同一构架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285，1992；Presta等，J.Immunol.151：2623，1993)。

更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高结合亲和力和其它有利的生物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。通常可获得三维免疫球蛋白模型，且是本领域熟练技术人员所熟悉的。可获得图解和显示选定候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出并组合FR残基，从而获得所需抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。通常，高变区残基直接且最实质性的牵涉对抗原结合的影响。

人源化抗体可以是抗体片段，诸如Fab，任选偶联有一种或多种胞毒剂以生成免疫偶联物。或者，人源化抗体可以是全长抗体，诸如全长IgG1抗体。

3.人源抗体和噬菌体展示方法学

作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J_H)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到此类种系突变小鼠中将导致在抗原激发后生成人抗体。参见如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551，1993；Jakobovits等，Nature 362：255-258，1993；Bruggemann等，Year in Immuno.7：33，1993；及美国专利号5,545,806、5,569,825、5,591,669(都是GenPharm的)；5,545,807；和WO 97/17852。

或者，可使用噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348：552-553，1990)在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因全集生成人抗体和抗体片段。根据这一技术，将抗体V区基因克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因的读码框中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒表面。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行，综述参见如Johnson等，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571，1993。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature 352：624-628，1991从衍生自免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。可本质上遵循Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597，1991或Griffith等，EMBO J.12：725-734，1993描述的技术，由未免疫人供体构建V基因全集，并分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利号5,565,332和5,573,905。

如上所述，还可通过体外激活B细胞来生成人抗体(参见美国专利号5,567,610和5,229,275)。

4.抗体片段

在有些情况中，有利的是使用抗体片段，而非完整抗体。片段的较小尺寸能够快速清除，且可导致进入实体瘤得到改进。

已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见如Morimoto等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117，1992；和Brennan等，Science 229：81，1985)。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和分泌，从而能够容易的生成大量的这些片段。可从上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段，并通过化学偶联形成F(ab′)₂片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167，1992)。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)₂片段。美国专利号5,869,046描述了包含补救受体结合表位残基、体内半衰期延长的Fab和F(ab′)₂片段。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。Fv和sFv是缺乏恒定区但具有完整结合位点的唯一种类；如此，它们适于体内使用过程中降低的非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以产生在sFv的氨基或羧基末端具有效应物蛋白质的融合体。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如美国专利号5,641,870中描述的抗体。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

5.双特异性抗体

双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合CD20蛋白质的两种不同表位。其它此类抗体可联合CD20结合位点和另一种蛋白质的结合位点。或者，抗CD20臂可与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(如CD3)、或IgG的Fc受体(FcγR)诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)、或NKG2D或其它NK细胞激活配体的臂联合，使得细胞防御机制集中并定位于表达CD20的细胞。双特异性抗体还可用于将胞毒剂定位于表达CD20的细胞。这些抗体拥有CD20结合臂和结合胞毒剂(如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒素A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(如F(ab′)₂双特异性抗体)。

WO 96/16673描述了双特异性抗erbB2/抗FcRγIII抗体，而美国专利号5,837,234公开了双特异性抗ErbB2/抗FcγRI抗体。WO 98/02463显示了双特异性抗ErbB2/Fcα抗体。美国专利号5,821,337传授了双特异性抗ErbB2/抗CD3抗体。

用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两种链具有不同特异性(Millstein等，Nature 305：537-539，1983)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机搭配，这些杂交瘤(四源瘤quadroma)生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化非常麻烦，且产量低。WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659，1991公开了类似的流程。

根据一种不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、C_H2和C_H3区的Ig重链恒定区。优选的是，在至少一种融合物中具有包含轻链键合所必需的位点的第一重链恒定区(C_H1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主细胞中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供所需双特异性抗体的最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了更大灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率对所需链组合没有重大影响时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。

在此方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构促进所需双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。此方法公开于WO94/04690。关于制备双特异性抗体的其它细节参见例如Suresh等，Methods inEnzymology 121：210，1986。

根据美国专利号5,731,168中描述的另一种方法，可改造抗体分子对之间的界面，将从重组细胞培养物回收的异型二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分C_H3区。在此方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链替换(如酪氨酸或色氨酸)。通过用较小氨基酸侧链(如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同型二聚体提高异型二聚体产量的机制。

双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利号4,676,980)，和用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373、和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利号4,676,980。

文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学键制备双特异性抗体。Brennan等，Science 229：81，1985描述了通过蛋白水解切割完整抗体生成F(ab′)₂片段的流程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的条件下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键形成。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。

最新进展促进了从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，它们可通过化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225，1992描述了完全人源化双特异性抗体F(ab′)₂分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每个Fab′片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过度表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞对人乳瘤目标的溶解活性。

还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生产出双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148：1547-1553，1992。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。在铰链区还原抗体同型二聚体以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异型二聚体。这种方法也可用于生产抗体同型二聚体。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448，1993描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替换机制。这些片段包含通过接头相连的V_H和V_L，该接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的V_H和V_L区不得不与另一个片段上的互补V_L和V_H区配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.152：5368，1994。

希望得到具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60，1991。

6.多价抗体

多价抗体可以由表达抗体所结合的抗原的细胞比二价抗体更快的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易的通过重组表达编码抗体多肽链的核酸而生成的具有三个或更多抗原结合位点(如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体将包含Fc区和位于Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个、但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中多肽链包含两个或多个可变区。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变区，VD2是第二可变区，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选还包含至少两条(且优选四条)轻链可变区多肽。例如，本文的多价抗体可包含约2条至约8条轻链可变区多肽。本文涵盖的轻链可变区多肽包含至少轻链可变区，且任选还包含CL区。

7.宿主细胞的选择和转化

适于克隆或表达本文描述的重组mAb、免疫粘附素和其它多肽拮抗剂的宿主细胞是原核生物、酵母、或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科诸如埃希氏菌属(Escherichia)如大肠埃希氏菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(如1989年4月12日出版的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)、和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些实例只是例示而非限制。

可在细菌中生成全长抗体、抗体片段、和抗体融合蛋白，特别是在不需要糖基化和Fc效应物功能时，诸如在将治疗性抗体与胞毒剂(如毒素)偶联且免疫偶联物自身在破坏肿瘤细胞中显示效力时。全长抗体具有较大的循环半衰期。大肠杆菌中的生产更快速且成本更有效。关于在细菌中表达抗体片段和多肽参见如US 5,648,237(Carter等)、US 5,789,199(Joly等)、和US 5,840,523(Simmons等)，它描述了用于优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列，将这些专利引入本文作为参考。表达后，在可溶性级分中从大肠杆菌细胞糊状物分离抗体，并可根据同种型通过如蛋白A或G柱纯化。可以与用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法相类似进行最后的纯化。

除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是编码抗体诸如CD20抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或常见的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，可获得许多其它属、种、和菌株且可用于本文，诸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主诸如如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 361,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)诸如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌诸如如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

适用于表达如糖基化的结合CD20的抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)、和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种用于转染的病毒株，如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。

还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、和烟草的植物细胞培养物作为宿主。

然而，最大的兴趣在于脊椎动物细胞，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等，J.Gen.Virol.36：59，1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216，1980)；小鼠塞托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251，1980)；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68，1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。

用B细胞消除抗体诸如结合CD20的抗体或整联蛋白拮抗剂抗体生成的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在根据需要为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码所需序列的基因而修改的常规营养培养基中培养。

8.培养宿主细胞

可以在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可使用Ham等，Meth.Enz.58：44，1979；Barnes等，Anal.Biochem.102：255，1980；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利再审号30,985中描述的任何培养基作为宿主细胞的培养基。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白、或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁、和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以本领域熟练技术人员知道的适当浓度含有任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等就是先前为表达而选择宿主细胞所用的，这对于普通技术人员是显然的。

9.抗体的纯化

在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么首先需要通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等，Bio/Technology 10：163-167，1992描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的流程。简单的说，在存在醋酸钠(pH3.5)、EDTA、和苯基甲磺酰氯(PMSF)的条件下使细胞糊状物解冻约30分钟以上。可通过离心除去细胞碎片。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元，浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。

可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，其中优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13，1983)。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5：1567-1575，1986)。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是也可以使用其它基质。机械稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。对于包含C_H3结构域的抗体而言，可使用BakerbondABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSE^TM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。

在任何初步纯化步骤后，可以将包含目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(如约0-0.25M盐)进行。

10.抗体偶联物

可将抗体与胞毒剂偶联，诸如毒素或放射性同位素。在某些实施方案中，毒素是加利车霉素、美登木素生物碱、多拉司他汀(dolastatin)、auristatin E及其类似物或衍生物是优选的。

实验实施例

这些实验实施例作为例示，而非意图限制本发明的范围

实施例1：hCD20 Tg表达小鼠模型的构建

为了分析治疗性mAb通过靶向细胞表面抗原而消除细胞的体内作用机制，建立了表达人CD20(hCD20)基因组基因座的鼠模型(hcD20Tg⁺⁺小鼠)。将两条独立的细菌人工染色体(BAC)注射到衍生自FVB小鼠的胚泡中以生成表达hCD20的多个转基因建立者系。对将hCD20表达遗传给后代的两只建立者(founder)小鼠进行更详细的分析。这两个建立者系都展示相同的hCD20表达模式，因此本文呈现了来自只一个建立者系的数据。

通过FACS分析hCD20转基因(hCD20 Tg⁺)小鼠的循环中淋巴细胞子群，并根据外周淋巴细胞中的抗原B220和CD3的表达进行鉴定，如图1(上部左图)所示。对上部左图中框入的每个群体分析hCD20表达；CD3-B220⁺(上部右图)、CD3⁺B220^-(下部右图)、和CD3^-B220^-细胞(下部左图)。

对外周血细胞的分析揭示了hCD20专门在循环中B220⁺细胞中表达(图1)。通过平均荧光强度(MFI)测定的hCD20 Tg^+/+小鼠中的表达水平是人循环中B细胞的约50％。对外周B220^-细胞没有检测到hCD20表达。hCD20的表达在Tg^-同窝出生仔畜中检测不到。

因为B细胞在骨髓中发育，所以分析了B细胞个体发育过程中的hCD20表达。如图2的顶图所示，hCD20易于在特征为CD43^-B220^loIgM⁺的未成熟B细胞上检测到(见图3)。另外，hCD20在脾中上调，并在边缘区(MZ)B细胞上检测到hCD20表达的最高水平(图2，中部)。对Tg⁺和Tg^-小鼠进行了免疫组织化学以分析hCD20表达。将来自Tg⁺或Tg^-小鼠的脾针对IgM(绿色)、hCD20(红色)、或CD3(蓝色)染色。对脾组织的免疫组织化学(IHC)分析揭示了B细胞区域中hCD20染色与IgM的共定位(数据未显示)。根据IHC分析，hCD20染色不与IgM^hi染色浆细胞共定位，而根据FACS分析，也不与Syndecan 1⁺浆细胞共定位。在腹膜B1和B2细胞、成熟淋巴结B细胞、和派尔斑生发中心(GC)B细胞上检测到hCD20(图2-底图)。因此，这些转基因小鼠中的hCD20表达在性质上再现了在人和小鼠中描述的CD20表达样式。

实施例2：通过抗CD20抗体的处理在体内消除B细胞

在此项研究中，由抗hCD20抗体处理诱导的B细胞消除展示了随B细胞驻留其中的细胞隔室而不同的动力学。

1.抗hCD20 Mab处理

为了分析抗hCD20 mAb处理的生物学后果，用单个剂量的0.1mg对照小鼠IgG_2a(非特异性抗体)或包括RITUXAN、2H7、B1、和1F5在内的一组抗hCD20 mAb腹膜内处理hCD20 Tg⁺小鼠。RITUXAN、2H7、和1F5结合位于CD20第二胞外域内的可比表位(comparable epitope)；B1结合不同但交叠的表位。已有描述说将B细胞与B1一起保温不会动员CD20进入膜筏。由于小鼠IgG_2a与小鼠Fc受体(FcR)的结合最好地对应于(parallel)RITUXAN的人IgG₁主链与人FcR的结合，因此在鼠IgG_2a主链上检查所有抗CD20 mAb。

2.循环中B细胞的消除

通过FACS分析处理和对照小鼠外周血中存在的B细胞。通过CD23和CD21的表达鉴定B细胞子群。如图4所示，每种抗hCD20 mAb引起外周B细胞的消除(圆圈)。外周B细胞的消除与治疗性mAb的循环血清半衰期有关联(数据未显示)。

在处理后第6天、第6周、和第14周分析用抗hCD20抗体m2H7处理的hCD20 Tg⁺小鼠的外周血。如图5所示，抗hCD20处理消除循环中B细胞，如第6天所示(图5，左图)。处理后六周，当血清中不再检测得到抗hCD20 mAb时(＜1μg/ml)，通过FACS分析在循环中再次检测到B细胞(图5，中图)。随后，循环中B细胞正常化到处理前水平，如第14周所示(图5，右图)。与早期B细胞祖先群中缺乏hCD20表达一致(见图2)，只有骨髓中CD20⁺未成熟的和成熟的循环中B细胞遭到消除(圆圈)。

3.血液、淋巴结、腹膜腔中B细胞的消除

如上所述，在用m2H7抗hCD20 mAb处理的hCD20 Tg⁺小鼠中分析了来自血液、淋巴结、和腹膜腔的B细胞消除的动力学。结果显示于图6。与外周B细胞消除类似，第3小时、第2天、和第21天血液(顶部)、淋巴结(中部)、和腹膜腔(底部)中存在B细胞的分析证明抗hCD20 mAb处理导致来自hCD20 Tg⁺小鼠淋巴结和腹膜腔的B220⁺细胞的消除(图6)。有趣的是，消除的动力学在这三个隔室中有所不同。虽然超过90％的循环中B细胞在静脉内(IV)施用抗hCD20 mAb后3小时内消除(顶图)，但是淋巴结B细胞在IV或腹膜内(IP)施用抗hCD20 mAb后2天内消除(中图)，而腹膜B细胞消除超过90％需要约21天，即使IP施用抗hCD20 mAb(底图)。由于腹膜B细胞的再循环比淋巴结B细胞慢，因此截然不同的消除动力学对应于(parallel)淋巴细胞循环的动力学。

实施例3：B细胞亚群易感性的等级

实施例3证明了B细胞亚群在抗CD20抗体处理后显示对B细胞消除的不同易感性。

1.脾中的B细胞消除

用对照IgG₂或抗hCD20 mAb处理上文为实施例1描述的转基因小鼠(hCD20 Tg⁺小鼠)。处理后第4天采集脾并分析B220、IgM、CD21、和CD23染色，并鉴定为CD21^hiCD23⁺滤泡(FO)B细胞或CD21^hiCD23^-边缘区(MZ)B细胞(图7)。对每个子集中的B细胞定量，如图8所示。

与受到抗hCD20 mAb完全消除的循环中成熟B细胞相反，(见图3、4、5、和6)，约33％的B220⁺脾细胞对抗hCD20 mAb处理有抗性(图7)。对B细胞亚群的分析揭示了滤泡(FO)B细胞受到显著消除(超过90％消除)，而CD21^hiCD23^-MZ B细胞展示对抗hCD20 mAb处理的更大抗性。约50％的MZ B细胞在抗hCD20 mAb疗法后保留(图8)。

在抗性脾B细胞上用FITC-抗小鼠IgG_2a mAb(用于检测结合的抗hCD20mAb)或用额外的抗hCD20 mAb及后续FITC-抗小鼠IgG_2a mAb(用于检测CD20表达的总量)离体(ex vivo)分析由抗hCD20 mAb处理小鼠分离的B220⁺脾细胞。结果证明抗性不是由于MZ B细胞中缺乏hCD20表达，因为hCD20在MZ中以高于FO B细胞的水平表达(图8)，也不是由于缺乏治疗性mAb的可达性，因为抗性脾B细胞上的CD20几乎被体内施用的抗hCD20 mAb饱和(图9)。

甚至比抗性脾边缘区B细胞更具戏剧性的是，驻留在派尔斑内的生发中心(GC)B细胞展示对抗hCD20 mAb处理的更大抗性。虽然成熟B220⁺CD38hiB细胞易于消除，但是B220⁺CD38^lo GC B细胞对抗hCD20 mAb疗法有抗性，如图10所示。

为了延伸对驻留派尔斑的GC B细胞的这些观察结果，对经由绵羊红细胞(SRBC)免疫接种生成的脾GC B细胞测试抗性。用SRBC免疫小鼠以诱导GC形成。当GC在免疫后第8天形成最大时，在第8天用0.2mg对照IgG_2a或抗hCD20 mAb处理小鼠。表征脾GC B细胞并通过B220和PNA(化生凝集素)染色定量。化生凝集素为GC B细胞染色。

如图11所示，未免疫小鼠不形成B220⁺PNA⁺GC B细胞(左图，圆圈)。SRBC免疫小鼠确实形成对抗hCD20 mAb杀伤有抗性(图11，底部)的PNA⁺GC B细胞(右图，圆圈)。这种抗性独立于hCD20表达，因为驻留派尔斑的和脾GC B细胞都以高于敏感的成熟循环中B细胞的水平表达hCD20(图2)；独立于结合GC细胞的mAb，因为体内回收的GC B细胞被施用的mAb饱和；且独立于治疗剂量或治疗持续时间(数据未显示)。因此，本文的数据说明脾中存在对抗hCD20 mAb处理的敏感性等级：滤泡(最敏感)＞边缘区＞生发中心(最有抗性)B细胞。

为了进一步测试MZ B细胞的抗性，用抗hCD20抗体对照处理转基因小鼠15周(IP，每两周0.1mg)以观察长期消除。通过CD21和CD23的表面表达表征脾B细胞(B220⁺)，并对FO和MZ B细胞的数目定量(n＝3)。另外，对转基因小鼠施用高剂量的抗hCD20 mAb。处理后2周分析脾B细胞(n＝4)。

施用抗hCD20 mAb高达10mg/小鼠(相当于NHL患者RITUXAN累积四周疗程的15倍以上)(图13)和4个月隔周施用0.1mg抗hCD20 mAb都不导致MZ B细胞的任何更大消除(图12)。

经处理转基因小鼠中的剩余抗性B细胞是有功能的，因为抗hCD20 mAb处理小鼠能够引发实质性的(虽然有所降低)针对免疫原和细菌的免疫应答(图14和图15)。在第7和10周用两个剂量(0.2mg/剂，IP)的对照或抗hCD20 mAb处理转基因动物。在第1周用偶联有匙孔虫戚血蓝蛋白的(4-羟基-3-硝基苯基)乙酰基(NP-KLH)免疫(SC)小鼠并在第11周再次攻击。在第12周通过ELISA测定NP特异性Ig水平。数据显示于图14，其中预先采血(pre-bleed)指用NP-KLH免疫前采集的样品。

图15显示了针对细菌抗原的T不依赖性免疫应答。两个IP剂量(0.2mg/小鼠)的对照或抗hCD20 mAb处理后3周实现了外周和腹膜B1细胞的完全消除，如图6所示。通过FACS分析(左图)对施用热灭活肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)后4天分离的抗原(Ag)特异性成浆细胞评估T不依赖性应答。对Ag特异性成浆细胞的数目定量(右边)，表述为平均值±标准误差(n＝4)。Syndecan-1针对成浆细胞和浆细胞染色。

实施例4：进入血管内增强B细胞消除

此实施例显示了边缘区B细胞的动员增强这些细胞对抗hCD20 mAb消除的敏感性。

对抗hCD20 mAb处理的敏感性等级可能反映了细胞由于表达负调控细胞表面蛋白质或胞内抗凋亡因子、由MZ和GC微环境提供的存活因子、和/或进入所需效应物机制所具有的内在抗性。为了评估微环境对MZ B细胞较大抗性的贡献，通过共施用抗αL和抗α4整联蛋白mAb动员MZ B细胞进入脉管系统。

在起动研究前3天(第-3天)用对照IgG_2a预处理小鼠(hCD20 Tg⁺)以将IgG对细胞运输的非特异影响降至最低。在第0天，用0.2mg对照IgG_2a或抗hCD20 mAb处理小鼠。在第2天给小鼠静脉内注射0.1mg每种抗CD11a(M17)和抗α4整联蛋白(PS/2)mAb。施用抗整联蛋白mAb后1.5和6小时分析血样。如图16所示，MZ B细胞(CD21^hiCD23^low)受到抗α整联蛋白mAb的动员和抗hCD20 mAb的消除。对血液中MZ B细胞(CD21^hiCD23^lo)的绝对数目定量，并显示于图17。CD21^hiCD23^loMZ B细胞的动员使得这些细胞对抗CD20 mAb介导的消除更加敏感。参见例如图16小图2和5、小图3和6；及图17。

处理小鼠脾B细胞的FACS分析揭示了MZ B细胞中的伴随的降低(数据未显示)。对脾中B220⁺细胞的定量显示αL拮抗剂(抗CD11a mAb)加抗CD20 mAb的组合导致比单独的抗CD20 mAb更好的B细胞消除(图18)，但是使用αL和α4 mAb二者与CD20 mAb的组合所达到的消除程度甚至更大(图18)。αL和α4拮抗剂协同作用而提高循环中的B细胞数目。不限于任何一种机制，循环中B细胞的这种提高很可能是由于B细胞动员和对B细胞归巢的抑制二者。

对脾的免疫组织化学分析确认了较之抗hCD20单独处理时边缘窦外面的MZ B细胞的相对抗性，抗整联蛋白和抗hCD20 mAb的联合处理对MOMA-1染色边缘窦外面的MZ B细胞的优先消除(数据未显示)。MOMA-1用于针对将Fc与MZ分开的巨噬细胞亚群染色。

为了动员B细胞进入滤泡(FO)，如上文动员MZ B细胞所述处理小鼠，只是用25μg脂多糖(LPS)替代抗整联蛋白mAb混合物。对处理和对照细胞的FACS分析显示LPS处理导致MZ B细胞动员进入滤泡(图19)。

与图18所示动员MZ B细胞进入脉管系统相反，通过施用LPS动员来自MZ的细胞进入滤泡不导致MZ B细胞的消除(图19)。总之，这些数据说明MZ B细胞对抗hCD20 mAb处理内在易感，而且B细胞进入脉管系统对于高效B细胞消除是必需的。

比较了来自用对照IgG、抗hCD20 mAb、抗hCD20、和抗整联蛋白mAb、或抗hCD20 mAb和LPS处理的小鼠的脾组织的免疫组织化学。通过LPS处理，在此扩大的滤泡中在亲金属抗原-1(MOMA-1)染色边缘里面看到了IgM染色细胞(数据未显示)。

使用化合物A，鞘氨醇1-磷酸受体激动剂来预防成熟淋巴结B细胞返回循环，以评估这是否会干扰B细胞消除。用载体(vehicle)对照或鞘氨醇1-磷酸受体(S1PR)激动剂(化合物A)处理小鼠并用抗hCD20 mAb攻击。

通过口服管饲法用载体(vehicle)对照或化合物A(每6小时10mg/kg)处理hCD20 Tg⁺小鼠。给药第一剂化合物A后2小时施用单个剂量的对照或抗hCD20 mAb(0.5mg IP)。在20小时对由淋巴结(图20，小图1和2)和血液(图20，小图3和4)分离的淋巴细胞定量并表述成平均值±标准误差(n＝4)。

与S1PR激动剂对淋巴细胞由淋巴结外出至循环的抑制作用一致的是，用化合物A处理的小鼠中B和T细胞二者显著降低(图20，小图3和4)。虽然在载体(vehicle)处理小鼠中淋巴结B细胞易于受到抗hCD20 mAb的消除，但是在存在化合物A时淋巴结B细胞不受抗hCD20 mAb的消除(图20，小图1和2)。总之，此数据支持高效消除对B细胞进入循环的要求。

实施例5：肝和脾在B细胞消除中的作用

由于网状内皮系统(RES)呈现了清除凋亡细胞和免疫复合物的主要形态(modality)，因此检查了肝和脾对B细胞消除的贡献。为了评估肝的贡献，结扎了门静脉和肝动脉二者。结扎是通过将小鼠进行假装或夹位门静脉和肝动脉随后立即IV注射对照或抗hCD20 mAb(0.2mg)而实现的。施用抗hCD20mAb后10分钟，对外周血分析B220⁺IgM⁺B细胞，如FACS图所示。

为了评估脾的贡献，小鼠接受假装的脾切除术(图23，顶行)或脾切除术(图24，底行)并分析B细胞消除。用亚最佳剂量的抗hCD20 mAb(5μg)处理后3小时和1天分析血液。使用更大剂量的抗hCD20 mAb(0.1mg)没有检测到B细胞消除的差异。检查了抗hCD20 mAb处理后Kupfer细胞对B细胞的吞噬作用。用0.1mg对照IgG(顶部左边)或抗hCD20 mAb处理小鼠。施用后15分钟，采集肝并分别对B细胞和巨噬细胞分析B220和F4/80染色。对来自4只对照和抗hCD20 mAb处理小鼠的共定位B220⁺和F4/80⁺细胞定量。

门静脉和肝动脉结扎导致抗hCD20 mAb的消除能力显著丧失(图21和22)。相反，切除脾的小鼠展示B细胞消除加速(图23和24)，这可能是切除脾的小鼠中B细胞数目降低继发的效果。

对肝的组织学检查展示了处理小鼠中F4/80⁺染色巨噬细胞内B220⁺染色B细胞的共定位(图25)，因此Kupfer细胞吞噬B220⁺B细胞。因此，与RES的功能一致的是，肝代表B细胞消除的主大门(major portal)。

结论

这些数据鉴定了抗hCD20 mAb消除B细胞的体内机制。在施用抗hCD20 mAb后，mAb快速结合CD20⁺B细胞且循环中mAb结合的B细胞经由网状内皮系统(RES)快速清除。有利的是驻留在淋巴组织中的被抗hCD20 mAb包被的B细胞得以进入脉管系统，从而将靶向B细胞递送至RES内的效应细胞。这就是消除较慢的再循环腹膜和淋巴结B细胞比循环中B细胞需要更长时间的原因。类似的，对脾和组织负载的B细胞亚群观察到的敏感性等级反映了MZ和GC B细胞降低的循环能力。此外，分别作为淋巴细胞动员或淋巴细胞外出抑制的后果而提升或抑制B细胞消除的能力进一步支持B细胞杀伤中进入血管内的重要性。

本文的实验展示了令人惊讶的结果，即抗CD20抗体和一种或多种整联蛋白拮抗剂的联合处理在通过消除先前未暴露的或未消除的B细胞亚群来实现增强的B细胞消除中展示极大协同作用。

参考文献

将此申请中引用的参考文献，包括专利、已出版的申请和其它出版物引入本文作为参考。

Claims (70)

1.在患有B细胞紊乱的哺乳动物中提升B细胞消除的方法，包括对所述哺乳动物施用一种或多种B细胞动员剂和治疗有效量的一种或多种B细胞消除剂。

2.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。

3.权利要求1的方法，其中所述B细胞动员剂是α4整联蛋白拮抗剂。

4.权利要求3的方法，其中所述α4整联蛋白拮抗剂是α4β1的拮抗剂。

5.权利要求3的方法，其中所述α4整联蛋白拮抗剂是α4β7的拮抗剂。

6.权利要求3、4和5任何一项的方法，其中所述α4整联蛋白拮抗剂是抗体或其生物学活性片段。

7.权利要求6的方法，其中所述α4整联蛋白拮抗剂是人源化的、人源的或嵌合的抗体或其生物学活性片段。

8.权利要求6的方法，其中所述抗体或抗体片段结合α4亚基(CD-49d)。

9.权利要求3的方法，其中所述α4整联蛋白拮抗剂是natalizumab。

10.权利要求3的方法，其中所述α4整联蛋白拮抗剂是由杂交瘤ATCCCRL-1911生成的抗体PS/2或其生物学活性片段或人源化形式。

11.权利要求3的方法，其中所述α4整联蛋白拮抗剂是小分子。

12.权利要求11的方法，其中所述小分子拮抗剂包含下列通式：

或

其中

Z是H或低级烷基；

A是：

或

或

或

其中B是氰烷基、碳环或杂环，任选用一个或多个R₁取代；且q是0-3；

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆各自是氢、烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硝基、脲、氰基、硫代、烷基硫代、羟基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷氧基羰基氨基、芳氧基羰基氨基、烷基亚硫酰基、磺酰基、烷基磺酰基、芳烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、烷酰基、烷酰基氨基、环烷酰基氨基、芳基、芳基烷基、卤素、或烷基膦酰基，且R₁、R₂、R₃、R₄和R₅用0-3个选自下组的取代基取代：羟基、羧基、低级烷氧基羰基、低级烷基、硝基、氧代、氰基、碳环基、杂环基、杂芳基、低级烷基硫代、低级烷氧基、低级烷基氨基、低级烷酰基氨基、低级烷基亚硫酰基、低级磺酰基、低级烷基磺酰基、低级烷酰基、芳基、芳酰基、杂环基羰基、卤素和低级烷基膦酰基；或者R₁至R₅中有两个一起形成碳环或杂环；

Y是H、烷氧基、烷氧基烷氧基、芳氧基、烷基氨基烷氧基、二烷基氨基烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、杂环基或杂芳基烷基，其中上述每种可以是取代的或未取代的；

X₁是H、C(O)OR、C(O)NRaRb、C(O)R、或C(O)SR，其中R、Ra和Rb各自是氢或烷基、烷氧基、芳基、杂环基、杂芳基，用0-4个选自下组的取代基取代：卤素、羟基、氨基、羧基、硝基、氰基、杂环基、杂芳基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳烷基、芳烷基氧基、芳氧基羰基、芳烷基氧基羰基、亚烷基二氧基、低级烷氧基羰基、低级烷基、低级烯基、低级炔基、低级烷基硫代、低级烷氧基、低级烷基氨基、低级烷基亚硫酰基、低级磺酰基、低级烷基磺酰基、低级烷酰基、低级烷基膦酰基、氨基磺酰基低级烷基、羟基低级烷基、烷基亚硫酰基低级烷基、烷基磺酰基低级烷基、烷基硫代低级烷基、杂芳基硫代低级烷基、杂芳基氧基低级烷基、杂芳基氨基低级烷基、卤代低级烷基、和烷氧基低级烷基；其中所述杂环基、杂芳基、芳基、芳酰基、芳氧基、芳烷基、芳烷基氧基、芳氧基羰基和芳烷基氧基羰基任选用卤素、羟基、氨基、羧基、硝基、氰基、烷基和烷氧基取代；且其中Ra和Rb与它们所连接的氮一起可形成用0-5个取代基R或Rd取代的杂环基或杂芳基；其中Rd具有如下结构：

其中X’是选自C(O)NRa、C(O)的二价接头或键；

X₂和X₃每种各自是氢、卤素、羟基、氨基、羧基、硝基、氰基，或是取代或未取代的烷基、芳基、杂环基、杂芳基、芳基、芳酰基、芳氧基、亚烷基二氧基、低级烷基羰基氨基、低级烯基羰基氨基、芳基羰基氨基、芳基烷基羰基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基、低级烷氧基羰基、低级烷基、低级烯基、低级炔基、低级烷基硫代、低级烷氧基、低级烷基氨基、低级烷基亚硫酰基、低级磺酰基、低级烷基磺酰基、低级烷酰基、低级烷基膦酰基、氨基磺酰基低级烷基、羟基低级烷基、烷基亚硫酰基低级烷基、烷基磺酰基低级烷基、烷基硫代低级烷基、杂芳基硫代低级烷基、杂芳基氧基低级烷基、杂芳基氨基低级烷基、卤代低级烷基、烷氧基低级烷基；且其中X₁与X₂或X₃可键合在一起形成杂环或杂芳基环(一个或多个)；或者X₃与Z一起形成杂双环；

X_1’、X_2’、X_3’和X_4’每种各自是氢、卤素、羟基、氨基、羧基、硝基、氰基，或是取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂环基、杂芳基、芳基、芳酰基、芳氧基、亚烷基二氧基、低级烷基羰基氨基、低级烯基羰基氨基、芳基羰基氨基、芳基烷基羰基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基、低级烷氧基羰基、低级烷基、低级烯基、低级炔基、低级烷基硫代、低级烷氧基、低级烷基氨基、低级烷基亚硫酰基、低级磺酰基、低级烷基磺酰基、低级烷酰基、低级烷基膦酰基、氨基磺酰基低级烷基、羟基低级烷基、烷基亚硫酰基低级烷基、烷基磺酰基低级烷基、烷基硫代低级烷基、杂芳基硫代低级烷基、杂芳基氧基低级烷基、杂芳基氨基低级烷基、卤代低级烷基、烷氧基低级烷基；

或其制药学可接受盐。

13.权利要求12的方法，其中所述小分子拮抗剂包含如下通式的化合物：

其中R和R’包含表1和2所列任何指定R和R’取代基。

14.权利要求12的方法，其中所述小分子拮抗剂是表3所列任一化合物。

15.权利要求1的方法，其中所述B细胞动员剂是αL整联蛋白拮抗剂。

16.权利要求15的方法，其中所述B细胞动员剂是αLβ2整联蛋白拮抗剂。

17.权利要求15的方法，其中所述αL整联蛋白拮抗剂是抗体或其生物学活性片段。

18.权利要求17的方法，其中所述抗体是人源化的、人源的、或嵌合的抗体或其生物学活性片段。

19.权利要求17的方法，其中所述抗体结合αL亚基(CD11a)。

20.权利要求17的方法，其中结合CD11a的抗体分别包含SEQ ID NO：49和50的VL和VH序列，或是efalizumab。

21.权利要求15的方法，其中所述αL整联蛋白拮抗剂是小分子。

22.权利要求21的方法，其中所述小分子αL拮抗剂包含如下一项或多项：

a)通式XI的化合物：

其中

Cy是非芳香族碳环或杂环，任选用羟基(-OH)、巯基(-SH)、硫代烷基、卤素(F、Cl、Br、I)、氧代(＝O)、硫代(＝S)、氨基、氨基烷基、脒(-C(NH)-NH₂)、胍(-NH₂-C(NH)-NH₂)、硝基、烷基、烷氧基或酰基取代；

X是二价烃链，任选用羟基、巯基、卤素、氨基、氨基烷基、硝基、氧代、或硫代取代，且任选用N、O、S、SO、或SO₂中断；

Y是碳环或杂环，任选用羟基、巯基、卤素、氧代、硫代、烃、卤代烃、氨基、脒、胍、氰基、硝基、烷氧基、或酰基取代；

L是键或二价烃，任选有一个或多个碳原子用N、O、S、SO、或SO₂替换，且任选用羟基、卤素、氧代、或硫代取代；或是烃的三个碳原子用氨基酸残基替换；

R₁是H、OH、氨基、O-碳环、或烷氧基，任选用氨基、碳环或杂环取代；

R_2-5各自是H、羟基、巯基、卤素、氰基、氨基、脒、胍、硝基、或烷氧基；或者R₃与R₄一起形成稠合碳环或杂环，任选用羟基、卤素、氧代、硫代、氨基、脒、胍、或烷氧基取代；

B₆是H或烃链，任选用碳环或杂环取代；

或其盐、溶剂合物、和水合物；

前提是当Y是苯基，R₂、R₄、和R₅是H，R₃是Cl，且R₁是OH时，X不是环己基；

或其制药学可接受盐。

23.权利要求21的方法，其中所述小分子αL拮抗剂包含表4所列任一化合物。

24.权利要求3的方法，其中所述α4整联蛋白拮抗剂是结合VCAM-1(CD106)的抗体。

25.权利要求15的方法，其中所述αL整联蛋白拮抗剂是结合ICAM-1(CD54)的抗体。

26.权利要求3的方法，其中所述拮抗剂是免疫粘附素，该免疫粘附素包含与人IgG的铰链和Fc融合的VCAM-1(CD106)的配体结合部分。

27.权利要求15的方法，其中所述拮抗剂是免疫粘附素，该免疫粘附素包含与人IgG的铰链和Fc融合的ICAM-1(CD54)的配体结合部分。

28.权利要求1的方法，包括两种B细胞动员剂，其中第一种动员剂是αL整联蛋白拮抗剂，而第二种动员剂是α4整联蛋白拮抗剂。

29.权利要求28的方法，其中所述α4整联蛋白是α4β1或α4β7，而所述αL是αLβ2。

30.权利要求28或29的方法，其中所述αL整联蛋白拮抗剂和所述α4整联蛋白拮抗剂都是抗体。

31.权利要求28或29的方法，其中所述α4整联蛋白拮抗剂是natalizumab或其生物学活性片段或人源化形式。

32.权利要求28或29的方法，其中所述αL整联蛋白拮抗剂是抗体efalizumab或其生物学活性片段或人源化形式。

33.权利要求28的方法，其中所述αL整联蛋白拮抗剂和所述α4整联蛋白拮抗剂都是小分子。

34.前述权利要求任一项的方法，其中所述B细胞消除剂是B细胞表面标志的拮抗剂。

35.权利要求34的方法，其中所述B细胞表面标志是CD20、CD22、或CD52。

36.权利要求35的方法，其中所述B细胞表面标志是CD20。

37.权利要求36的方法，其中所述B细胞消除剂是结合CD20的抗体。

38.权利要求37的方法，其中所述抗体是rituximab。

39.权利要求37的方法，其中所述结合CD20的抗体是人源化抗体。

40.权利要求39的方法，其中所述人源化抗体选自下组：人源化2H7.v16、v31、v114、v138、v477、v588、v51、和包含分别作为可变轻链和可变重链的SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30氨基酸序列的抗体。

41.权利要求37的方法，其中所述抗体是人源的或嵌合的抗体。

42.前述权利要求任一项的方法，其中所述B细胞动员剂和所述B细胞消除剂同时或顺序施用。

43.权利要求23至29任一项的方法，其中所述第一种和第二种B细胞动员剂同时施用。

44.增强结合CD20的抗体的B细胞消除功效的方法，包括对患有B细胞病症的患者施用一种或多种B细胞动员剂。

45.权利要求44的方法，其中所述结合CD20的抗体是rituximab。

46.权利要求44的方法，其中所述结合CD20的抗体选自下组：人源化2H7.v16、v31、v114、v138、v477、v588、v51、和包含分别作为可变轻链和可变重链的SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30氨基酸序列的抗体。

47.权利要求45或权利要求46的方法，其中所述B细胞动员剂是αL整联蛋白拮抗剂。

48.权利要求47的方法，其中所述αL整联蛋白拮抗剂是efalizumab或包含分别为VL和VH序列的SEQ ID NO：49和50的结合CD11a的抗体。

49.权利要求44-48任一项的方法，包括两种或多种B细胞动员剂，其中第一动员剂是αL整联蛋白拮抗剂，而第二种动员剂是α4整联蛋白拮抗剂。

50.权利要求49的方法，其中所述α4整联蛋白拮抗剂是结合α4β1或α4β7的抗体。

51.权利要求49或50的方法，其中所述αL整联蛋白拮抗剂是efalizumab或包含分别为VL和VH序列的SEQ ID NO：49和50的结合CD11a的抗体。

52.权利要求50的方法，其中所述αL整联蛋白拮抗剂和所述α4整联蛋白拮抗剂协同作用而增强B细胞消除。

53.治疗特征为B细胞表达CD20的B细胞肿瘤或恶性肿瘤的方法，包括对患有肿瘤或恶性肿瘤的患者施用治疗有效量的结合CD20的抗体和至少一种B细胞动员剂。

54.权利要求53的方法，其中所述结合CD20的抗体是rituximab。

55.权利要求53的方法，其中所述结合CD20的抗体选自下组：人源化2H7.v16、v31、v114、v138、v477、v588、v51、和包含分别作为可变轻链和可变重链的SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30氨基酸序列的抗体。

56.权利要求53-55任一项的方法，其中所述B细胞动员剂是αL整联蛋白拮抗剂。

57.权利要求56的方法，其中所述αL整联蛋白拮抗剂是efalizumab或包含分别为VL和VH序列的SEQ ID NO：49和50的结合CD11a的抗体。

58.权利要求57的方法，其中所述α4整联蛋白拮抗剂是结合α4β1的抗体或小分子。

59.权利要求56的方法，其中所述B细胞肿瘤选自下组：非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、以淋巴细胞为主型的何杰金氏病(LPHD)、滤泡中心细胞(FCC)淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、和毛细胞性白血病。

60.减轻B细胞调控的自身免疫性疾病的方法，包括对患有自身免疫性疾病的患者施用治疗有效量的结合CD20的抗体和至少一种B细胞动员剂。

61.权利要求59的方法，其中所述结合CD20的抗体是rituximab。

62.权利要求60的方法，其中所述结合CD20的抗体包含SEQ ID NO：31的轻链可变区序列和SEQ ID NO：32的重链可变区序列。

63.权利要求60-62任一项的方法，其中所述B细胞动员剂是αL整联蛋白拮抗剂。

64.权利要求63的方法，其中所述αL整联蛋白拮抗剂是efalizumab或包含分别为VL和VH序列的SEQ ID NO：49和50的结合CD11a的抗体。

65.权利要求60-62任一项的方法，其中所述B细胞动员剂是结合α4β1的抗体或小分子。

66.权利要求60-62任一项的方法，其中所述自身免疫性疾病选自下组：类风湿性关节炎和幼年型类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)包括狼疮肾炎、韦格纳氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化症、银屑病、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、ANCA相关血管炎、糖尿病、雷诺氏综合征、斯耶格伦氏综合征、视神经脊髓炎(NMO)和肾小球肾炎。

67.权利要求64的方法，其中所述自身免疫性疾病是多发性硬化症。

68.消除患有B细胞肿瘤或B细胞调控的自身免疫性疾病的患者脾脏中边缘区B细胞的方法，包括对所述患者施用治疗有效量的结合CD20的抗体和至少一种B细胞动员剂。

69.包含结合αL整联蛋白的抗体和结合α4整联蛋白的抗体的组合物。

70.权利要求69的组合物，其中所述结合α4整联蛋白的抗体是efalizumab或包含分别为VL和VH序列的SEQ ID NO：49和50的结合CD11a的抗体。

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