MXPA06011805A - Metodo para aumentar agotamiento de celulas b. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona metodos para aumentar agotamiento de celulas B, al promover acceso intravascular de subconjuntos de celulas B secuestradas en tejidos linfoides, haciendo a las celulas B sensibles a exterminio mediado por el agente de agotamiento de celulas B. Un metodo de promover acceso intravascular es por el uso de antagonistas de integrina. Metodos para tratar desordenes de celulas B por este enfoque tambien se proporcionan.

Description

células B de memoria y células efectoras denominadas "células de plasma" . Las células B de memoria tienen una mayor extensión de vida y continúan expresando anticuerpo ligado a membrana con la misma especificidad que la célula padre original . Células de plasma no producen anticuerpo ligado a membrana sino por el contrario producen forma secretada del anticuerpo. Anticuerpos secretados son las moléculas efectoras principales de inmunidad humoral . Terapéuticos de anticuerpo dirigidos contra dianas de célula B que se basan en la habilidad de los anticuerpos de infusión pasiva a células que contienen antigeno agotadas, se han desarrollado para tratar enfermedades de célula B. Por ejemplo, anticuerpos dirigidos a las moléculas de superficie CD20, CD22 y CD52 (Treon et al., 2000, Seminare in Oncology 27(6 suppl 12): 79-85; Juweid, 2003, Current Opinión in Molecular Therapeutics 5 (2) : 192-198 ; Cersosimo, 2003, Monoclonal antibodies in the treatment of cáncer, Part I, American Journal of Health-System Pharmacy 60-(15) : 1531-1548; parte II en 60 (16) 1631-1641 se han desarrollado. El antigeno CD20 (también denominado antigeno de diferenciación restringida de linfocito B humano, Bp35) es una fosfoproteína transmembrana con un peso molecular aproximado de 35 kD que se expresa exclusivamente en células B normales y malignas. Su expresión se regula durante el desarrollo de células B que emerge en células pre-B tardías, y se presenta en linfocitos inmaduros B y maduros B (Valentine et al, . 1989, J. Biol. Chem. 264: 11282-11287; y Einfeld et al., 1988, EMBO J. 7:711-717). El antígeno también se expresa en más que 90% de linfornas no-Hodgkin de célula B (NHL) (Anderson et al., 1984, Blood 63: 1424-1433), pero no se encuentra en células madre o troncales hematopoyéticas , células pro-B, células de plasma normal u otros tejidos normales (Tedder et al., 1985, J. Imunol . 135:973-979). CD20 se considera que regula una o -varias etapas previas en el proceso de activación para inicio y diferenciación del ciclo celular (Tedder et al., supra) y posiblemente funciona como un canal de ión calcio (Tedder et al., 1990, J". Cell. Biochem. 14D:195) . Las integrinas son una familia de receptores de adhesión celular, de transmembrana, heterodiméricos , que pueden mediar las interacciones de matriz célula-célula y célula-extracelular (Humphries, et al., 1990·, TIB3 28:313-320). Las integrinas comprenden dos glicoproteínas de membrana tipo I, sin relación, conocidas como las subunidades alfa y beta que no se asocian covalentemente entre sí (Humphries, supra) . Todas las sub-unidades alfa y beta tienen grandes dominios extracelulares (700-1100 residuos) , una hélice de transmembrana y pequeños dominios citoplásmicos (30-50 residuos) por subunidad (Humphries, 2000, supra) . Los mamíferos tienen al menos diecinueve diferentes subunidades alfa y ocho subunidades beta que se ensamblan para formar al menos 25 receptores diferentes (Humphries, 2000, Biochem. Soc. Trans . 28: 311-339) . Las subunidades alfa incluyen alfaE, alfa 1- 11, alfaV, alfalIB, alfaL, alfaM, alfaX y alfaD (Arnaout et al., 2002, Immunological Reviews 186:125-140). Las subunidades incluyen 1-8 betas (Arnaout, supra). Las subunidades integrinas se expresan en diferentes combinaciones y en diferentes tipos de célula. Alfal, alfa2, alfaE, alfaL, alfaM, alfaX, alfaD, y beta2 comparten un dominio extracelular N-terminal distante denominado el "dominio I" o "dominio A", asi denominado debido a que el dominio se ha insertado en la integrina o debido a su homología al motivo A en el factor de von illebrand (Harris et al., 2000, JBC 275: 23409-23412). El dominio I es de aproximadamente 200 residuos y se ha reportado crítico para enlace de ligando (Harris, supra) . Alfa4, también conocido como CD49d o la subunidad alfa de VLA-4, se ha mostrado que se asocia con betal (CD29) y beta7 (Arnaout, supra; Barclay et al., Eds . , 1997, The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Ed, p. 262-263) . (Ver también las subunidades dadas y las referencias descritas en "the Integrin Page", ubicada en http : //integrins . hypermart .net) . Las integrinas alfa4betal también se conocen como la integrina de antígeno-4 muy tardía (VLA-4) (Mousa, 2002, Cur. Opin.Chem. Biol . 6:534-541). La integrina VLA-4 se expresa en la mayoría de los leucocitos, excepto por neutrófilos y plaquetas (Barclay, supra) . Enlaza con los ligandos VCAM-1, fibronectina, trombospondina, colágenos e invasina (Plow et al., 2000, JBC 275: 21785-21788). Alfa4beta7 también se conoce como la molécula de adhesión de parche Peyer de linfocito-1 (LPAM-1) . Alfa4beta7 se expresa en la mayoría de las células T y B de nodos linfáticos, células N , y eosinófilos (Barclay, supra) , y liga a la molécula de adhesión de célula vascular-1 (VCAM-1) , molécula de adhesión de célula de adresina mucocosal-1 (MAdCAM-1) , y fibronectina (Plow, supra) . AlfaL, también conocida como CDlla o la subunidad alfa del antígeno asociado a la función de leucocito de integrina-1 (LFA-1) , se ha mostrado que se asocia con beta2 (CD18) para formar LFA-1 (Amaout , supra; Barclay, supra, p.156-157). (Ver también, "the Integrin Page" y las referencias ahí citadas, arriba) . A diferencia de alfa4, alfaL contiene un "dominio I" (Harris, supra) . La integrina alfaLbeta2 (LFA-1) se expresa en todos los leucocitos en humanos . Liga al menos cinco ligandos CD54 (ICAM-1) , CD102 (ICAM-2) , CD50 (ICAM-3), ICAM-4, y 1CAM-5 (Plo , supra) . VCAM-1, también denominada INCAM-110 o CD 106, se expresa de manera predominante en el endotelio vascular pero también se ha identificado en células dendriticas foliculares e interfoliculares, algunos macrófagos, células estromales de médula ósea y poblaciones de células no- asculares en articulaciones, riñon, músculo, corazón, placenta y cerebro (The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd edition, eds . , Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Company, San Diego, CA, 1977) . El uso terapéutico de varias anti-integrinas para tratar diversas enfermedades, incluyendo diversas enfermedades de inflamación y auto inmunes se ha explorado debido a la actividad de integrinas en tráfico de leucocitos (Mousa, supra; Yusuf-Makagiánsar et al., 2002, Medicinal Research Reviews 22:146-167; Vincenti, 2002, American Journal of Transplantation 2:898-903). Recientemente, se ha reportado que alfaLbeta2 (LFA-1) y alfa4betal (VLA-4) hacen substanciales y la mayoría de las contribuciones superpuestas a retención de célula B dentro de la zona marginal (MZ) en ratones (Lu et al., 2002, Science 297:409-412). Lu reportó que las células MZ B expresan niveles elevados de alfaLbeta2 (LFA-1) y alfa4betal (VLA-4) y enlazan con los ligandos ICAM-1 (CD54) y VCAM-l (CD106) que se expresan en MZ . MZ es rica en células de memoria IgM+ y células que reaccionan con auto-antigenos y antígenos bacterianos. Ratones tratados con anticuerpos bloqueadores anti-alfa4 y anti- alfaL se reportó que han perdido células B de zona marginal del bazo y la sangre (Lu, supra, p. 410-411) . Se especuló que el desplazar las células B de un adhesivo, nicho mediado-alfalbeta2 LT en el bazo al bloquear la función de integrina puede ser una forma de purgar el compartimiento de células malignas o autoreactivas (Lu, supra, p.412). La relevancia clínica de retirar estas células B del compartimiento en el bazo no es clara; estas células pueden moverse fuera de un compartimiento solo para pasar a otro compartimiento. Para una malignidad de célula B, es posible que purgar estas células B patogénicas puede resultar de hecho en o exacerbar metástasis, empeorando de esta manera la enfermedad . Rituximab (RituxanMR, Genentech, Inc, South San Francisco, CA and Biogen-IDEC, Cambridge, MA; MabtheraMR, F . Hoffman-LaRoche, Ltd., Basel, Suiza) es un anticuerpo monoclonal quimérico dirigido contra la molécula CD20. Rituximab actualmente se emplea para el tratamiento de pacientes con linfoma no-Hodgkin de célula B, CD20 positivo, de relapso o refractario de bajo grado o folicular. Se observa que en algunos pacientes tratados con Rituximab, un número pequeño de células B residuales se presentan en la sangre. El mecanismo de agotamiento de la célula B a través de una terapia anti-CD20 no es completamente claro. Se ha especulado por ejemplo, que Rituxan induce apoptosis de las células B o que las células B se exterminan por células NK que entran al bazo. En general se considera que todas las células B que expresan CD20 son igualmente sensibles a exterminio por el anticuerpo anti-CD20. Seria ventajoso el desarrollar terapias mejoradas para tratar enfermedades mediadas por células B debido a que las terapias actuales no agotan todas las células B. La presente invención resuelve estos problemas y proporciona otras ventajas, como se describe en detalle a continuación. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en parte en la identificación aquí de mecanismos in vivo por los cuales anticuerpos anti-hCD20 eliminan células B. Se descubrió de manera sorprendente que ciertos linfocitos de célula B residentes en tejidos y órganos, en particular aquellos en la zona marginal (MZ) del bazo, fueron resistentes a exterminio con anticuerpo CD20 anti-humano, aún cuando estas células expresan niveles suficientes de CD20 en su superficie y se encontró que están saturadas con el anticuerpo anti-CD20 administrado. De manera interesante, el promover la salida de estas células B de los tejidos en donde son residentes en el sistema vascular y/o prolongar su presencia en la circulación les hace sensibles a exterminio por el anticuerpo anti-CD20. En vista de esta observación, un enfoque a mejorar el acceso intravascular de estas células B secuestradas es movilizarlas a la circulación con antagonistas de integrinas que acarrean estas células B a ciertas zonas en los tejidos linfoides . La presente invención proporciona un método para aumentar el agotamiento de célula B en un mamífero que sufre de un desorden de célula B, que comprende administrar al mamífero, uno o más agentes de movilización de células B tal como un antagonista de integrina alfaL y/o un antagonista de integrina alfa4, y una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes de agotamiento de célula B tal como un anticuerpo anti-CD20. El agotamiento de célula B puede aumentarse al administrar una combinación de los antagonistas de alfa4 y alfaL integrinas y un agente de agotamiento de célula B. En la modalidad preferida, el mamífero o paciente es un humano. La invención también proporciona un método para mejorar la eficacia de agotamiento de célula B por un agente de agotamiento tal como un anticuerpo de enlace CD20, que comprende administrar a un paciente que sufre de un desorden de célula B al menos un agente de movilización de célula B. Un antagonista de al> integrina y un antagonista de a4 integrina actúan sinergisticamente para mejorar el agotamiento de célula B. La invención además proporciona un método para tratar una malignidad o neoplasma de célula B caracterizado por células B que expresan un marcador especifico tal como CD20, que comprende administrar a un paciente que sufre del neoplasma o malignidad, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que liga el marcador específico, tal como un anticuerpo de enlace CD20, y al menos un agente de movilización de célula B, tal como un antagonista de alfaL integrina y/o un antagonista de alfa4 integrina. En una modalidad, el neoplasma de célula B se elige del grupo que consiste de linfoma de no-Hodgkin (NHL) , NHL linfocítico pequeño (SL) , enfermedad de Hodgkin predominante en linfocito (LPHD) , linfomas de células centrales foliculares (FCC) , leucemia linfocitica aguda (ALL) , leucemia linfocítica crónica (CLL) , y leucemia de células velludas. Para tratar estos cánceres, en una modalidad, el anticuerpo se administra mediante infusión intravenosa. La dosis administrada está en el intervalo de aproximadamente 100 mg/m2 a 375 mg/m2 por dosis. Todavía otro aspecto de la invención es un método para aliviar un desorden auto-inmune regulado por célula B que comprende administrar a un paciente que sufre del desorden auto inmune, una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de agotamiento de células B, tal como un anticuerpo de enlace CD20, y al menos un agente de movilización de célula B, tal como un antagonista de alfaL integrina y/o un antagonista de alfa4 integrina. En modalidades específicas, la enfermedad auto inmune se elige del grupo que consiste de artritis reumatoide y artritis reumatoide juvenil, lupus sistémico eritematoso (SLE) incluyendo lupus nefritis, enfermedad de Wegener, enfermedad de intestino inflamatorio, colitis ulcerativa, púrpura trom ocitopénica idiopática (ITP) , púrpura trobocitopénica trombótica (TTP) , tro bocitopenia auto inmune, esclerosis múltiple, soriasis, nefropatia IgA, polineuropatías IgM, miastenia gravis, vasculitis asociada con ANCA, diabetes mellitus, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen, Neuromielitis Óptica (NMO) y glomerulonefritis . En modalidades preferidas, el anticuerpo de enlace CD20 se administra en forma intravenosa o subcutánea. En modalidades preferidas, el anticuerpo se administra intravenosamente a una dosis en el intervalo de 10 mg a 500 mg por dosis y en una modalidad específica, la dosis es 100 mg/dosis. Adicionalmente, la invención proporciona un método para agotar células B de las células B de zona marginal en el bazo y/o en centros germinales de tej idos linfoides de un paciente que sufre de un desorden de células B tal como un neoplasma de célula B o un desorden auto inmune regulado por células B, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de agotamiento tal como un anticuerpo de enlace CD20 y al menos un agente de movilización de célula B tal como un ántagonista de alfaL integrina y/o antagonista de alfa4 integrina. En cualquiera de los métodos de la invención, el agente de movilización de célula B puede ser un antagonista alfaL integrina o antagonista de alfa4 integrina, o una combinación de estos. En una modalidad, el antagonista de alfa4 integrina es un antagonista de alfa4betal. En una modalidad alterna, el antagonista es un antagonista de alfa4beta7. Todavía en otra modalidad, el antagonista es un antagonista de alfaLbeta2. En cualquiera de los métodos de la presente invención, en diferentes modalidades, el antagonista de alfaL o alfaé integrina puede ser un anticuerpo que liga la integrina, o la subunidad alfa o beta de la integrina, o un ligando de la integrina. De esta manera, anticuerpos que ligan ICAM-1 (CD-54) o VCAM-1 (CD-106) se abarca. Similarmente, fragmentos biológicamente activos de anticuerpos que funcionan esencialmente igual que el anticuerpo de longitud íntegra para ligar y bloquear actividad biológica de la alfa4 o alfaL integrina tal como el fragmento H52 de anti-CD18 FAB' 2 (Genentech, South San Francisco, CA) son abarcados. Cuando el agente de movilización es un alfaL antagonista, en una modalidad, el anticuerpo antagonista de alfaL integrina es un anticuerpo que liga la subunidad alfaL, CD11A, de preferencia el anticuerpo efalizumab (RaptivaMR, Genentech, Inc.), o un anticuerpo de enlace CD11A que comprende la secuencia VL y VH de SEQ ID NO. 49 y 50, respectivamente de efalizumab, o un fragmento biológicamente activo de estos anticuerpos . Cuando el agente de movilización es un antagonista alfa4 integrina, en una modalidad, el antagonista es el anticuerpo natalizumab (TysabriMR, Biogen-IDEC) , o su fragmento biológicamente activo, que liga la subunidad alfa4. En modalidades preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, humano o quimérico, o un fragmento de estos. En otra modalidad, el antagonista alfaL o alfa4 integrina es una pequeña molécula. Muchas de estas moléculas pequeñas antagonistas de integrina se conocen. Cualquiera uno o más de los compuestos que tiene la fórmula XI y particularmente los compuestos de la Tabla 4 es una modalidad de una pequeña molécula antagonista de alfaL integrina. Cualquiera uno o más de los compuestos que tienen la fórmula I, II o III, cualquier compuesto de la fórmula X y que tiene cualquiera de los substituyentes mostrados en las Tablas I y II, y particularmente cualquier compuesto de la Tabla III es una modalidad de una molécula pequeña antagonista de alfa4 integrina. En una modalidad adicional, el antagonista alfaL o alfa4 integrina puede ser una inmunoadhesina que comprende la porción de enlace de integrina, soluble o dominio extracelular de ligando respectivo. En una modalidad, la inmunoadhesina es una porción de enlace de alfaL ligando soluble de ICAM-1 (CD-54) fusionada a la bisagra IFc de una Iggl humana. En una modalidad separada, la inmunoadhesina es una porción de enlace de alfa4 ligando soluble de VCAM-1 (CD-106) fusionada a la bisagra IFc de una Iggl humana.

En cualquiera de los métodos de la invención, el agente de agotamiento de la célula B es un antagonista de un marcador de superficie de célula B tal como CD20, CD22, CD54, y semejantes. En una modalidad preferida, el marcador de superficie de célula B es CD20. En otra modalidad, el marcador de superficie de célula B es CD22. En una modalidad, el agente de agotamiento de célula B es un anticuerpo o fragmento del anticuerpo que liga un marcador de superficie de célula B tal como CD20, de preferencia CD20 de humano (hCD20) . Muchos de estos anticuerpos anti-CD20 se conocen, incluyendo anticuerpos humanos y médicos y anti-CD20 humanizado aquí descrito. En modalidades preferidas, el anticuerpo anti-hCD20 es Rituximab (RituxanMR) ; un anticuerpo humanizado que comprende las secuencias de aminoácido VL y VH de SEQ ID No. 29 y SEQ ID No. 30, respectivamente; anticuerpo humanizado 2H7 v31, vll4, vl38, v477, v588, o v511 que comprende las secuencias que aquí se proporcionan o su fragmento biológicamente activo o sus variantes deficientes én fucosa. En una modalidad, 2H7.v511 humanizado se proporciona en una formulación liquida que comprende anticuerpo a 20mg/mL, sulfato de histidina 10 mM a pH5.8, 60mg/ml de sacarosa, 0.2 mg/ml de polisorbato 20.

En cualquiera de los métodos de la invención, cualquier combinación de anticuerpo, pequeña molécula y/o inmunoad esina como agente de movilización de célula B y/o cualquier combinación de agente de agotamiento de célula B puede administrarse. Por ejemplo, el agente de agotamiento de célula B puede ser un anticuerpo que liga CD20 y el agente de movilización de célula B puede ser uno o más antagonistas de molécula pequeña de alfa4 y/o alfaL integrina. En cualquiera de los métodos de la invención, el agente o agentes de movilización de célula B y el agente de agotamiento de célula B pueden administrase en forma concurrente, secuencial o alterna entre concurrencia y secuencial, en cualquier orden. Cuando dos o mas agentes de movilización se emplean, por ejemplo un antagonista de alfaL integrina en combinación con un antagonista de alfa4 integrina, los dos agentes pueden administrarse en forma concurrente secuencial o alterna entre concurrente y secuencial, en cualquier orden. En una modalidad, un anticuerpo anti-CD20 se administra para primero agotar células B en circulación, seguido por administración de un antagonista alfaL integrina o por una combinación de antagonista alfaL integrina y antagonista alfa4 integrina para movilizar células B que residen en órganos tales como el bazo, nodos linfáticos, centros germinales, cavidad peritoneal y semejantes, además seguido por tratamiento repetido con un anticuerpo de enlace anti-CD20 para agotar células B movilizadas residuales . En una modalidad adicional, la invención comprende composiciones que contienen dos o mas agentes de movilización, por ejemplo una combinación de antagonistas de alfaL integrina y un antagonista de alfa4 integrina. Composiciones de la invención además incluyen una combinación de uno o más agentes de movilización de célula B con uno o más agentes de agotamiento de célula B. Una modalidad particular es una composición que contiene un antagonista de alfaL integrina, un antagonista de alfa4 integrina y un anticuerpo anti-CD20. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra gráficamente expresión de hCD20 en poblaciones de linfocitos en circulación de ratones transgénicos hCD20 (hCD20 Tg+) , la población de linfocitos se caracteriza por expresión de superficie de B220 y CD3. La Figura 2 muestra expresión de superficie de hCD20 durante ontogenia de célula B y en tejidos linfoides . Progenitores de células B y subconjuntos en la médula ósea (panel superior) , bazo (panel medio) y otros órganos linfoides (panel inferior) se analizaron para expresión de hCD20. La Figura 3 demuestra agotamiento de población de células B, caracterizado por expresión de B220 y CD43, de médula ósea de ratones de hCD20 Tg+ tratados con control o con anti-hCD20 mAb (2H7) (panel izquierdo) . Cuantificación de hCD20 detectada en poblaciones desde células B también se muestra (panel derecho) . La Figura 4 muestra agotamiento de células B por anti-hCD20 mAbs de sangre periférica de ratones hCD20 Tg+ tratados con anticuerpos anti-CD20. La Figura 5 muestra agotamiento y reabastecimiento de células B después de tratamiento con anti-hCD20 mAb. La Figura 6 muestra distintas cinéticas de agotamiento de células B en sangre, nodos linfáticos y cavidad peritoneal de ratones hCD20 Tg+ tratados con anticuerpo anti-hCD20. La Figura 7 muestra sensibilidad de células B de bazo de ratones transgénicos tratados con 0.5 mg de anti-hCD20 mAb (fondo) o de control IgG2a mAb (superior) . La Figura 8 muestra enumeraciones de agotamiento de células B FO y MZ en el bazo de ratones descrito en la Figura 7.

La Figura 9 muestra saturación de CD20 con anti-hCD20 mAbs en células B de bazo resistentes. La Figura 10 muestra resistencia de células B de parche GC de Peyer a agotamiento anti-hCD20 mAb. Células B de parche Peyer se aislaron de ratones tratados con IgG2a de control (panel superior) o anti-hCD20 mAb (panel inferior) y caracterizado por tensión con B220 y CD38. Células B maduras y GC de ratones de control (barras abiertas) y tratados con anti-hCD20 MAb (barras rellenas) se cuantificaron (panel derecho) . La Figura 11 muestra resistencia de células B GC esplénicas a agotamiento por anti-hCD20mAb . La Figura 12 muestra agotamiento de células B de zona marginal después de tratamiento con control o anti-hCD20 mAbs durante 15 semanas (0.1 mg por 2 semanas, IP) - La Figura 13 muestra agotamiento de células B por administración de altas dosis de anti- a -hCD20 mAb. Dosis como se ilustra. La Figura 14 muestra respuestas inmunes de células B siguiendo el tratamiento de hCD20 mAb, específicamente respuestas inmunes secundarias como se describe en el ejemplo 3. La Figura 15 muestra respuesta inmune independiente de T a un antígeno bacteriano como se estima por análisis FACS (panel izquierdo) de plasmablastos específicos de antigeno (Ag) aislados de ratones agotados de célula B, 4 días después de administración de Streptococcus Pneumoniae termo inactivado. La Figura 16 muestra trazos FACS que demuestran movilización de células B de zona marginal en la básculatura mejora la sensibilidad de células B MZ a agotamiento de anti-hCD20 mAb. La Figura 17 muestra resultados de cuantificación de células B MZ (CD21hiCD23l0) en sangre de ratones tratada con agentes de movilización. La Figura 18 es una gráfica que muestra cuantificación de total de células B220+ en el bazo de ratones tratadas con anti-hCD20 mAb sólo y en combinación con agentes de movilización. La Figura 19 muestra trazos de FACS de células de ratones tratados con 25 µ de lipopolisacarido (LPS) y anti- hCD20 mAb. La Figura 20 muestra gráficamente cuantificación de linfocitos de ratones hCD20 Tg+ tratados con control de vehículo o compuesto A. Linfocitos aislados de nodos linfáticos (paneles 1 y 2) y sangre (paneles 3 y 4) a 20 horas, se cuantificaron y expresaron como error promedio _+ estándar (n=4) .

La Figura 21 demuestra que el hígado se requiere para agotamiento de célula B, como se describe más completamente en el ejemplo 5. Los ratones se sometieron a operación simulada (panel izquierdo) o sujeción de la vena portal y arteria hepática (panel derecho) seguido por inyección IV inmediata de control o anti-hCD20 (0.2 mg) mAb. La Figura 22 muestra cuantificación de células B en sangre de los ratones tratados en forma operación simulada o sujetos como en el ejemplo 5. Todas las células aisladas de ratones tratados con anti-hCD20 mAb se saturaron con el mAb administrado in vivo (datos no mostrados) . La Figura 23 muestra que el bazo no se requiere para agotamiento de célula B, como se describe más completamente en el ejemplo 5. Ratones se sometieron ya sea a esplenectomía ficticia (y leva superior) o esplenectomía (y leva inferior) y se analizaron por agotamiento de células B. La Figura 24 muestra el por ciento de las células B en sangre periférica de los ratones tratados en falso o de esplenectomía del ejemplo 5, cuantificaron y expresaron como error promedio + estándar. La Figura 25 muestra que células upfer se tragan a células B B220+, como se describe más completamente en el ejemplo 5. Se trataron ratones con 0.1 mg IgG de control (izquierdo superior) o anti-hCD20 mAb. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES A. Definiciones Los siguientes términos como aquí se emplean, se pretenden que tengan las siguientes definiciones: El término "antagonista" o "inhibidor" /integrina como se emplea aquí, significa un compuesto que reduce o evita enlace de una integrina tal como alfaébetal, alfalbeta7, o alfalbeta2 integrina, a un ligando tal como VCAM-1, MAdCAM-1, ICAMI -5, y semejantes o reduce o evita retención de células B en tejidos linfoides, incluyendo Centros Germinales y/o una zona marginal del bazo. Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para cuando menos inhibir parcialmente el enlace y puede ser una cantidad inhibitoria . El término "anticuerpo" se emplea en el sentido más amplio e incluye específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud integra) , anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo que exhiben una función o actividad biológica deseada. Los anticuerpos que comprenden un polipéptido de está invención pueden ser quimédicos, humanizados o humanos . Los anticuerpos que comprenden un polipéptido de está invención pueden ser un fragmento de anticuerpo. Estos anticuerpos y métodos para generarlos se describen con más detalle a continuación. En forma alterna, un anticuerpo de esta invención puede producirse al inmunizar un animal con un polipéptido de esta invención. De esta manera, un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de está invención se contempla. "Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud integra, en general su región variable o de enlace de antigeno. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab 1 , F(ab')2, Fv; y diacuerpos; anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecífieos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. "Fragmentos funcionales" retienen sustancialmente el enlace con un antígeno del anticuerpo de longitud integra, y retienen una actividad biológica. "Anticuerpo de enlace CD20" y "anticuerpo anti-CD20" se emplean aquí en forma intercambiable y abarcan todos los anticuerpos que digan CD20 con suficiente afinidad de manera tal que el anticuerpo sea útil como un agente terapéutico para hacer blanco a una célula que expresa el antígeno y no reaccionan en forma cruzada significativamente con otras proteínas tales como una proteína de control negativo en los ensayos descritos a continuación. Anticuerpos biespecífieos en donde un brazo del anticuerpo liga a CD20 también se contemplan. También por esa definición se abarcan anticuerpos de enlace CD20 están fragmentos funcionales de los anticuerpos precedentes. El anticuerpo de enlace CD20 puede ligar CD20 con una Kd, por ejemplo, <10nM. En modalidades preferidas, el enlace es a una Kd de <7.5nM, más preferiblemente <5nM, aún mas preferible entre l-5nM, en particular <lnM. En una modalidad especifica, los anticuerpos anti-CD20 ligan CD20 de primate y de humano. En modalidades especificas, los anticuerpos que ligan CD20 son humanizados o quiméricos. Anticuerpos que ligan CD20 incluyen por ejemplo, rituximab (RITUXA ™) , m2H7 (2H7 murino) , hu2H7 (2H7 humanizado) y todas sus variantes funcionales, incluyendo sin limitación, hu2H7.vl6 (v representa versión), v31, vll4, vl38, v477, v588, o v511 o su fragmento biológicamente activo, así como sus variantes deficientes en fucosa que tienen mejorada función ADCC. Patentes y publicaciones de patentes referentes a anticuerpos CD20 incluyen las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,776,456, 5,736,137, 6,399,061, y 5,843,439, así como las solicitudes de Patentes de los E.U.A. Nos. US2002/0197255A1 y 2003/0021781A1 (Anderson et al.); Patente de los E.U.A. No. 6,455,043 Bl y WOOO/09160 (Grillo-López, A.); WOOO/27428 (Grillo-López y White); WO00/27433 (Grillo-López y Leonard) ; WOOO/44788 (Braslawsky et al.); WO01/10462 (Rastetter, W.); WO01/10461 (Rastetter y White) ; WO01/10460 (White y Grillo-López); Solicitud de patente de los E.U.A. No. US2002/0006404 y WO02/04021 (Hanna y Hariharan) ; Solicitud de patente de los E.U.A. No. US2002/0012665 Al y WO01/74388 (Hanna, . ) ; Solicitud de patente de los E.U.A. No. US2002/0009444 Al, y WOOl/80884 (Grillo-López, A.); WO01/97858 (White, C.); Solicitud de patente de los E.U.A. No. US2002/0128488 Al y WO02/34790 (Reff, M . ) ; W002/060955 (Braslawsky et al.); WO2/096948 (Braslawsky et al.); WO02/079255 (Reffand Davies) ; Patente de los E.U.A. No. 6,171,586 Bl , y W098/56418 (Lam et al.); W098/58964 (Raju, S.); W099/22764 (Raju, S.); W099/51642, Patente de los E.U.A. No. 6,194,551 Bl, Patente de los E.U.A. No. 6,242,195 Bl , Patente de los E.U.A. No. 6,528,624 Bl y Patente de los E.U.A. No. 6,538,124 (Idusogie et al.); WO00/42072 (Presta, L.); WO00/67796 (Curd et al.); WOOl/03734 (Grillo-López et al.); Solicitud de patente de los E.U.A. No. Patente de los E.U.A. No. 2002/0004587 Al y WOOl/77342 (Miller y Presta); Solicitud de patente de los E.U.A. No. US2002/0197256 (Grewal, I. ) ; Patentes de los E.U.A. Nos. 6,090,365 Bl, 6,287, 537B1, 6,015,542, 5,843,398, y 5,595,721, (Kaminski et al.); Patentes de los E.U.A. Nos. 5,500,362, 5,677,180, 5,721,108, y 6,120,767 (Robinson et al.); solicitud de Patente de los E.U.A. No. 6,410,391 Bl (Raubitschek et al.); Patente de los E.U.A. No. 6,224,866 Bl y WOOO/20864 (Barbera-Guillem, E. ) ; WO01/13945 (Barbera-Gui11era, E . > ; WO00/67795 (Goldenberg); O00/74718 (Goldenbergand Hansen) ; WO00/76542 (Golay et al.); WO01/72333 (Wolin y Rosenblatt) ; Patente de los E.U.A. No. 6,368,596 Bl (Ghetie et al.); Solicitud de patente de los E.U.A. No. US2002/0041847 Al, (Goldenberg, D.); Solicitud de patente de los E.U.A. No. US2003/0026801 Al (Weiner y Hartmann) ; W002/102312 (Engleman, E.), cada uno de los cuales se incorpora expresamente aguí por referencia. Ver también Patente de los E.U.A. No. 5,849,898 y solicitud de patente EP No. 330,191 (Seed et al.); Patente de los E.U.A. No. 4,861,579 y EP332,865 A2 (Meyer y eiss) ; y W095/03770 (Bhat et al . ) . Los anticuerpos CD20 pueden ser anticuerpo desnudo o conjugado con un compuesto citotóxico tal como un radioisótopo o una toxina, estos anticuerpos incluyen el anticuerpo ZEVALINMR, gue se enlaza con el radioisótopo Yttrium-90 (IDEC Pharmaceuticals , San Diego, CA) y BEXXARMR, que se conjuga con I- 131 (Corixa, WA) . Variantes 2H7 humanizadas incluyen aquellas que tienen sustituciones aminoácido en el FR y variantes de maduración de afinidad con cambios en los CDRs injertados. Los aminoácidos substituidos en el CDR o FR no se limitan a aquellos presentes en el anticuerpo donador o aceptor. En otras modalidades, los anticuerpos anti-CD20 de la invención comprenden además cambios en residuos aminoácido en la región Fe que llevan a función efectora mejorada, incluyendo función ADCC y/o CDC mejorada y exterminio de célula B (también referida aquí como agotamiento de célula B) . En particular, se han identificado tres mutaciones para mejorar actividad CDC y ADCC: S298A/E333A/K334A, también referido aquí como variante o mutante triple Ala; numeración en la región Fe es de acuerdo con el sistema de numeración EU; Kabat et al., supra, como se describe en Idusogie et al., 2001, supra; Shields et al., supra). Otros anticuerpos anti-CD20 adecuados para utilizar con la presente invención incluyen aquellos que tienen cambios específicos que mejoran la estabilidad. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD20 quimérico tiene regiones V murinas y región C humana. Un anticuerpo anti-CD20 quimérico específico es RITUXAMR (RITüXIMAB"*; Genentech, Inc.) . Rituximab y hu2H7 puede mediar la lisis de células B a través tanto de citotoxicidad dependiente complemento (CDC) como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . Variantes de anticuerpo con secuencias de aminoácido de región Fe alteradas y capacidad de enlace Clq aumentada o disminuida se describen en la patente de los E.U.A. número 6,194,551 Bl y W099/51642. Los contenidos de esas publicaciones de patente se incorporan específicamente aquí por referencia. Ver también Idusogie et al. 2000, J. Immunol. 164: 4178-4184. WOOO/42072 (Presta) describe variantes polipéptido con enlace mejorado o disminuido a FcRs . El contenido de esa publicación de patente se incorpora específicamente aquí por referencia. Ver también Shields et al., 2001, «T. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604. "Enfermedad auto inmune" se emplea aquí en un sentido amplio, general para referirse a desordenes o condiciones en mamíferos en donde la destrucción de tejido normal o sano surge de respuestas inmune humorales o celulares del mamífero individual a sus constituyentes de tejido propios, o una manifestación de estos o la condición resultante de ello. Los términos "cáncer", "canceroso" y "maligno" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracterizan típicamente por crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a carcinoma incluyendo adenocarcinoma linfoma, blastoma, melanoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de estos cánceres incluyen cáncer de célula escamosa, cáncer de pequeñas células pulmonares, cáncer sin pequeñas células pulmonares, cáncer gastrointestinal, linfoma de Hodgkin y no-Hodgkin, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado tal como carcinoma hepático y hepatoma, cáncer de vejiga, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glándulas salivales, carcinoma de riñon tal como carcinoma de células renales y tumores de Wilms, carcinoma de célula basal, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer esofágico y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. En forma óptima, el cáncer expresará o tendrá asociado con la célula de cáncer, BLyS . En algunas modalidades, los cánceres para tratamiento aquí incluyen linfoma leucemia y mieloma, sus subtipos, tales como linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, leucemia linfocítica o linfoblástica aguda, linfoma no-Hodgkin y Hodgkin, y mieloma mieloide agudo.

Un "dominio extracelular" o "ECD" se refiere a una forma de un polipéptido que esencialmente está libre de los dominios transmembrana y citoplásmico . El término "enfermedad inmuno-relacionada" significa una enfermedad en donde un componente del sistema inmune de un mamífero causa, media o de otra forma contribuye a morbidez en el mamífero. También se incluyen enfermedades en donde el estímulo o intervención de la respuesta inmune tiene un efecto de mejora en el avance de la enfermedad. Se incluyen en este término enfermedades auto inmunes, enfermedades inflamatorias inmuno-mediadas, enfermedades inflamatorias no-inmuno-mediadas, enfermedades infecciosas y enfermedades inmunodeficientes . Ejemplos de enfermedades inmuno-relacionadas e inflamatorias, algunos de los cuales son mediadas por células T o inmunes pueden tratarse de acuerdo con la invención incluyen 1, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, espondiloartropatías , esclerosis sistémica (escleroderma) , miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis polimiositis) síndrome de Sjogrens, vásculitis sistémica, sarcoidosis, anemia emolítica auto-inmune (pancitopenia inmune hemoglobinuria nocturnal paroxismal) , trombocitopenia auto-inmune (púrpura trombocitopenica ideopática, trombocitopenia inmunomediada) , tiroiditis (enfermedad grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocltica juvenil, tiroiditis atrófica) diabetes mellitus, enfermedad renal inmuno-mediada (glumerolonefritis , nefritis tubulointertisial) , enfermedades desmielinantes de los sistemas nervioso central y periférico, tales como esclerosis múltiple, poli-neuropatías desmielinante idiopática o síndrome de Guillain-Barré, y poli-neuropatías desmielinante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos) , hepatitis activa crónica auto-inmune, cirrosis biliar primaria, hepatitisgranulomatosa, y cholangitis esclerosante, enfermedades de pulmones fibróticas e inflamatorias tales como enfermedad de intestino inflamatorio (colitis ulcerativa: enfermedad de Crohn) , enteropatía sensible a gluten, y enfermedad de Whipple, enfermedades de la piel auto-inmunes o inmuno-mediadas incluyendo enfermedades de la piel bulosa, dermatitis de contacto y eritema multiforme, psoriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a los alimentos y urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón tales como neumonías eusinofílicas , fibrosis pulmonar ideopática y neumonitis de hipersensibilidad, enfermedades asociadas a transplante incluyendo rechazo de injerto y enfermedad de inj erto-contra-anfitrión. Enfermedades infecciosas incluyen SIDA (infección HIV) hepatitis A, B, C, D, y E, infecciones bacterianas, infecciones fúngales, infecciones de protozoarios e infecciones parasitarias. El término "anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones de origen natural posible, que pueden estar presentes en cantidades menores. Anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigidos contra un solo sitio antigénico. Aún más, en contraste con preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no habrá de considerarse que requiere producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse por el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al., 1975, Nature 256: 495, o pueden elaborarse por métodos de ADN recombinante (ver por ejemplo la patente de los E.U.A. número 4,816,567) . Los "anticuerpos monoclonales " también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpo fago que utilizan las técnicas descritas en Clackson et al. 1991, Nature 352: 624-628 y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597, por ej emplo . Anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulina) tienen una porción de la cadena pesada y/o ligera idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de especies particulares o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, asi como fragmentos de estos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente de los E.U.A. número 4,816,567; y Morrison et al-, 1984, Proc. Nati. Acad Sci . USA 81: 6851-6855). Anticuerpo humanizado como se emplea aquí es un subconjunto de anticuerpos quiméricos. "Portadores" como se emplea aquí, incluyen portadores excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables, que no son tóxicos para la célula o mamífero expuesto a ellos a las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una solución amortiguada de pH acuoso. Ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyen ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmuno-globulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinil pirrodilona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa mannosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcar alcoholes tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal, tales como sodio; y/o sulfactantes no iónicos tales como TWEENMR, polietilen glicol (PEG) , y PLURONICMR. Una "composición" de esta invención puede comprender uno o más agentes de agotamiento de células B y/o uno o más agentes de movilización de células B, opcionalmente en combinación con un portador fisiológicamente aceptable. La composición además puede comprender un agente terapéutico adicional para tratar la indicación pretendida. En algunas modalidades, la composición comprende un segundo agente terapéutico seleccionado de una droga para tratar una enfermedad inmuno-relacionada y una droga para tratar a un cáncer. En algunas modalidades, la droga para tratar a un cáncer se elige de un grupo que consiste de un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y un agente quimioterapéutico. Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo afector o recipiente) en donde residuos de región hipervariable del recipiente se reemplazan por residuos de región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tales como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen las deseadas especificidad, afinidad y capacidad. En algunos casos, residuos de región de marco de trabajo Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo de recipiente o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el desempeño de anticuerpo tal como afinidad de enlace. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables en donde todo o sustancialmente todo de los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todo o sustancialmente todo de las regiones FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana aunque las regiones FR pueden incluir una o más substituciones aminoácido que mejoran la afinidad de enlace . El número de estas substituciones aminoácido en FR típicamente no son mayores a 6 en la cadena H y en la cadena L no mayores a 3. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mayores detalles ver Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988, Nature 332: 323-329; y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol . 2:593-596. "Funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas que se atribuyen a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o región Fe variante de secuencia aminoácido) de un anticuerpo, y varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: citotoxicidad dependiente de complemento y de enlace Clq; enlace receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo receptor de célula B) y activación de célula B. "Citotoxicidad mediada de células dependientes de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en donde Ig secretado ligado en receptores Fe (FcRs) presente en ciertas células citotóxicas (por ejemplo células natural killer (N ) , neutrófilos y macrófagos) permiten a estas células efectoras citotóxicas ligar específicamente a una célula diana que contiene antígeno y subsecuentemente exterminar la célula diana con citotoxinas . Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y se retienen absolutamente para este exterminio. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan Fe? RUI solo, mientras que los monocitos expresan FC^RI FCj'RII y FC RIII. La expresión de FCR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página- 464 de Ravetch et al., 1991, Annu. Rev. Immunol 9:457-92. Para estimar actividad ADCC de una molécula de interés, un ensayo ADCC in vi tro tal como aquel descrito en las patentes de los E.U.A. números 5,500,362 o 5,821,337 puede realizarse. Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC= peripheral blood mononuclear cells) y células natural killer (NK) . En forma alterna o adicionalmente, actividad ADCC de la molécula de interés puede ser estimada in vivo, por ejemplo en un modelo de animal tal como se describe en Clynes et al., 1998, PNAS (USA) 95:652-656. "Mamífero" para propósitos de tratamiento o terapia se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, de deportes o mascotas tales como perros, caballos, gatos, vacas y semejantes. De preferencia el mamífero es humano. También como se emplea aquí "agotamiento de células B" se refiere a una reducción en niveles de células B en un humano o animal después de tratamiento con droga o anticuerpo, en comparación con el nivel antes del tratamiento. Niveles de células B se miden utilizando ensayos bien conocidos tales como al obtener un conteo de sangre completo, por tinción con análisis FACS por marcadores de células B conocidos y por métodos tales como se describe en los ejemplos experimentales. Agotamiento de célula B puede ser parcial o completo. En una modalidad, el agotamiento de células B que expresa un CD20 es 25% o más. En un paciente que recibe una droga de agotamiento de célula B, células B en general se agotan para la duración del tiempo cuando la droga circula en el cuerpo del paciente y el tiempo para recuperación de células B. Se aumenta el agotamiento de células B si el nivel o porcentaje de células B agotadas después de tratamiento con el agente de agotamiento de células B combinado con el agente de movilización de células B es mayor que el nivel obtenido con el agente de exterminio de células B (agotamiento) solo. Los niveles de agotamiento de células B pueden medirse por métodos familiares para una persona con destreza médica en la especialidad. El agotamiento de células B puede medirse por el número de células B en la sangre sin y con tratamiento con el agente de movilización de células B. como otro método ejemplar de cuantificar las células B, una biopsia de nodos linfáticos de un paciente de cáncer, puede realizarse después de tratamiento con el agente de agotamiento de células B, tal como un anticuerpo anti-CD20, para obtener un nivel de línea base de células B antes de tratamiento con el o los agentes de movilización de células B. El paciente entonces se le administra uno o más agentes de movilización de célula B junto con o seguido por el agente de agotamiento de células B. Posterior a esta segunda ronda de régimen de tratamiento de agotamiento de células B, una segunda biopsia de nodos linfáticos se realiza para cuantificar las células B restantes . Un "agente de agotamiento de células B" como se emplea aguí, es cualquier antagonista que liga con o de otra forma hace blanco a una célula B a través de un marcador de superficie de célula B que resulta directa o indirectamente en la muerte de las células B diana. Como se emplea aquí, las células B se eliminan en la circulación tal como por ADCC, CDC u otro mecanismo. El agente de agotamiento de célula B puede ser una proteína tal como un anticuerpo o ligando del marcador de superficie celular, o una molécula pequeña. El agente de agotamiento de células B puede conjugarse con un agente citotóxico o agente inhibidor de crecimiento. En una modalidad, el agente de agotamiento de células B es un anticuerpo monoclonal (mAb) que liga CD20, CD22 o CD54. Anticuerpos que ligan CD20 se describen a continuación. En modalidades preferidas, el anticuerpo que liga CD20 es rituximab, o 2H7vl6 humanizado o una variante de h2H7v!6. Un "agente de movilización de célula B" como se emplea aquí, es cualquier molécula que promueve la circulación de células B en mamíferos en la sangre por ejemplo por inhibición de la adhesión y retención de células B en órganos linfoides y otros tejidos cargados con células o de otra forma promueve la salida de células B de estos sitios o al inhibir H01 de células B con órganos y tejidos linfoides y otros. En otra modalidad específica, el agente de movilización de célula B inhibe la retención de células B al menos en la zona marginal del bazo, y de preferencia el centro MZ y germinal del bazo y tejidos linfoides. En otra modalidad, el agente de movilización de células B inhibe H01 de las células B al bazo. Todavía en otra modalidad, el agente inhibe H01 de la célula B al intestino. Un incremento en células B en la sangre periférica con administración de agente de movilización de células B, puede ser cuantificado por métodos conocidos tal y como se describe en los ejemplos. Un "Desorden de células B" incluye un neoplasma de células B (por ejemplo neoplasma de células B CD20 positivo) o una condición relacionada auto-inmune o enfermedad auto-inmune regulada por células B ambas descritas en detalle a continuación. "Citotoxicidad dependiente complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en la presencia de complemento. La activación de la ruta de complemento clásica se inicia por el enlace del primer componente del sistema de complemento (Clq) con anticuerpos (de la apropiada subclase) que se ligan a su antígeno conato. Para estimar la activación de complemento, un ensayo CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al., 1996, J". Immunol . Methods 202: 163, puede realizarse. Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interfieren con usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más de 95% en peso de anticuerpo como se determina por el método de Lowry, y más preferiblemente más de 99% en peso (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia aminoácidos interna o N-terminal por el uso de un secuenciador de copa de centrif gado, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie, o de preferencia tinción de plata. Anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente sin embargo se preparará anticuerpo aislado por al menos una etapa de purificación. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de una composición de esta invención efectiva para "aliviar" o "tratar" una enfermedad o desorden en un sujeto o mamífero. En general , el alivio o tratamiento de una enfermedad o desorden involucra la reducción de uno o más síntomas o problemas médicos asociados con la enfermedad o desorden. En algunas modalidades, es una cantidad que resulta en la reducción del número de células B en el mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva de la droga puede reducir el número de células de cáncer; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir frenar en cierta medida y de preferencia detener) la infiltración de células de cáncer en órganos periféricos; inhibir (es decir frenar en cierta medida y de preferencia detener) metástasis de tumor; inhibir, en cierta medida, el crecimiento del tumor; y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en que la droga puede evitar crecimiento y/o exterminar células de cáncer existentes, puede ser citostática y/o citotóxica. En algunas modalidades, una composición de esta invención puede emplearse para evitar el inicio o reocurrencia de la enfermedad o desorden en un sujeto o mamífero. Por ejemplo, en un sujeto con enfermedad auto-inmune, una composición de esta invención puede utilizarse para evitar o aliviar apariciones bruscas de lesiones .

"Tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en donde el objeto es evitar o frenar (reducir) la condición o desorden patológico objetivo o diana. Un sujeto se "trata" exitosamente para un cáncer CD20 positivo o una enfermedad auto-inmune si, después de recibir una cantidad terapéutica del anticuerpo de enlace CD20 de la invención de acuerdo con los métodos de la presente invención, el sujeto muestra reducción observable y/o medible en o ausencia de uno o más signos y síntomas de la enfermedad particular. Por ejemplo, para cáncer, reducción en el número de células del cáncer o ausencia de las células de cáncer; reducción en el tamaño del tumor; inhibición (es decir frenado en cierta medida y de preferencia detenerla) la metástasis del tumor; inhibición, en cierta medida, del crecimiento del tumor; incremento en longitud y remisión y/o alivio en cierta medida, de uno o más síntomas asociados con el cáncer específico; morbilidad y mortalidad reducida y mejora en el aspecto de calidad de vida. La reducción de los signos y síntomas de una enfermedad también puede sentirse por el paciente. El tratamiento puede lograr una respuesta completa, definido como desaparición de todos los signos de cáncer, o una respuesta parcial, en donde se disminuye el tamaño del tumor, de preferencia en más de 50%, más preferible en 75%. También se considera un paciente tratado si el paciente experimenta una enfermedad estable. En una modalidad preferida, los pacientes de cáncer todavía están libres de avance en el cáncer después de un año, de preferencia después de 15 meses . Estos parámetros para estimar un tratamiento exitoso y mejora en la enfermedad se miden fácilmente por procedimientos rutinarios familiares para un médico con destreza apropiada en la especialidad. Administración "crónica" se refiere a administración de el o los agentes en un modo continuo en oposición a un modo agudo, a fin de mantener el efecto (actividad) terapéutico inicial por un periodo prolongado de tiempo. Administración "intermitente" es tratamiento que no se realiza consecutivamente sin interrupción sino más bien de naturaleza cíclica. El término "agente citotóxico" como se emplea aquí se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de células y/o provoca destrucción de las células . El término se pretende que incluye isótopos radioactivos (I131, I125, Y90 and Re186) agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de plantas o animales o sus fragmentos .

Un "agente quimioterapéutica-" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y CYTOXANMR ciclofosfamida; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzudopa, carbucona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilaminilaminas incluyendo altetramina, trietilenmelamina, trietilenfosfaramida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (en especial bulatacxna y bulatacxnona) ; una camtotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; criptoficina (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CBl-TMl) ; eleutorobina; pancratistatina; sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clormafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, and ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos enediina (por ejemplo calicheamicina, en especial calicheamicina gama II y calicheamicina omega II (ver por ejemplo Agnew, 1994. Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186); dinemicina incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos tales como clodronato; una esperamicina; asi como neocarzinostatina cromóforo y cromóforos antibióticos de la enediina de la cromoproteína enediina relacionados) ; aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas , dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMICINAMR doxorubicina (incluyendo morfolina-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina; idarubicina, marcellomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, streptonigrina, streptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracil (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, dromoestanolona propionato, epitiostanol , mepitiostano, testolactona; anti- adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; agentes de reabastecimiento de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosido; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinodes tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilinico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacárido PSK1® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razozaxona; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; trizicuanona; 2 , 2 ' , 2 "-triclorotrietilamina; tricotenos (en especial toxina T-2 , verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobrinol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, TAXOLMR paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulación de nanopartxculas de ingeniería de albúmina libre de Cremofor ABRAXANEMR de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) y TAXOTEREMR doxetaxel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; cloranbucil; GEMZARMR gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina; platino; etoposido (VP-16) ; ifosfamida; mi oxantrona; vincristina; NAvELBINEMR vinorelbina; novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RF 2000; difluorometilormitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinóico; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores . También se incluyen en esta definición agentes an i-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como anti-estrógenos y moduladores de receptor de estrógeno selectivos (SERMs= selective estrogen receptor modulators) incluyendo por ejemplo tamoxifen (incluyendo tamoxifen NOLVADEX101) raloxifen, droloxifen, 4-hidroxitamoxifen, trioxifen, keoxifen, LY117018, onapristona, y FARESTON- toremifen; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales tales como por ejemplo 4 (5) -imidazoles, aminoglutetimida acetato megestrol MEGASEMR, exemestano AROMASINMR, formestanie, fadrozol, vorzol RIVIS0RMR, letrozol FEMARAMR, y anastrozol ARIMIDEXMR; y anti andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; así como troxecitabina (un análogo de citosina nucleósido 1,3-dioxolano) ; oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación de células aberrantes tales como por ejemplo, PCK-alfa, Ralf y H-Ras; ribozimas tales como el inhibidor de expresión VEGF (por ejemplo la ribozima ANGIOZIMEMR) y el inhibidor de expresión HER2 ; vacunas tales como vacunas de terapia de genes, por ejemplo vacuna ALLOVECTINMR, vacuna LEUVECTINM, y vacuna VAXIDMR; PROLEUKINMR rIL-2; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECANMR; ABARELIX"* rmRH; y sales ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores . Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se emplea aquí, se refiere a un compuesto o inhibición que inhibe el crecimiento de una célula in vitro y/o in vivo. De esta manera, el agente inhibidor de crecimiento puede ser aquel que reduzca significativamente el por ciento de células en la fase S. Ejemplos de agentes de inhibición de crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance del ciclo celular (en un sitio diferente a la fase S) tales como agentes que inducen el freno de GI y el freno de fase M. Bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) paclitaxel TAXOLMR e inhibidores topo II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposido, y bleomicina. Aquellos agentes que frenan GI también se derraman sobre el freno de fase S, por ejemplo agentes de alquilación de ADN tales como tanoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Mayor información puede encontrarse por Murakaini et al., 1995, In: The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsonn and Israel, eds . , capitulo 1 "Cell cycle regulation, oncogenes, and antieioplastic drugs, " (W B Saunders : Philadelphia) , ver página 13. Un "Centro Germinal" es un micro-ambiente dentro de un folículo secundario linfoide en donde proliferación de células B, hipermutación somática y selección del ácido antígeno ocurre. La "zona marginal" es una región del bazo que contiene una población de células B que produce anticuerpos poli reactivos de baja afinidad. Debido a esta ubicación anatómica, las células B de zona marginal frecuentemente entran en contacto con antígeno, incluyendo auto-antígeno . Células B de zona marginal tienen bajos umbrales de activación, son particularmente reactivas a auto-antígenos (Viau et al., 2005, Clin. I munol . , 114: 17-26), y reactivas a antígenos transportados por la sangre . Células B auto-reactivas son secuestradas en la zona marginal para evitar auto-reactividad de alta afinidad. Una porción "soluble" de un polipéptido como se emplea aquí, se refiere a una porción que es soluble en agua y carece de apreciable afinidad por lípidos (por ejemplo faltante el dominio de transmembrana o la transmembrana y los dominios citoplásmicos) . B. Sub-unidades Integrina 1. Alfa4 El término "alfa4" o "alfa4 polipéptido" o "alfa4 proteína" (también referido como sub-unidad CD49d, integrina alfa4 o sub-unidad VLA-4 alfa) cuando se emplea aquí, abarca "polipéptidos alfa4 de secuencia nativa" que tiene actividad biológica de una alfa4 de secuencia nativa. En una modalidad, la actividad biológica de un polipéptido alfa4 promueve la adhesión y retención de linfocitos B en un órgano o un área de un tejido linfoide, por ejemplo a través de asociación con una sub-unidad beta tal como (CD29) o beta7 para formar una integrina que liga con una matriz extracelular o ligando en al menos una célula de bazo de zona marginal inmovilizada en los centros germinales de tejidos linfoides, de esta manera limitando el acceso intravascular del linfocito B. Un polipéptido alfa4 de "secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia aminoácido que un polipéptido alfa 4 correspondiente derivado de la naturaleza. Estos polipéptidos alfa4 de secuencia nativa pueden aislarse en la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes y/o sintéticos . El término "polipéptido alfa4 de secuencia nativa" incluye formas truncadas de origen natural , formas variantes de origen natural (por ejemplo formas alternativamente combinadas) , iso-formas de origen natural, y variantes alélicas de origen natural del polipéptido. Un ejemplo de una secuencia de polipéptido alfa4 humana se ilustra a continuación (Número de Acceso Genbank S06046) : 1 mfptesawlg krganpgpea avretvmlll clgvptgrpy nvdtesally qgphntlfgy 61 swlhshgan rwllvgapta nwlanasvin pgaiyrcrig knpgqtceql qlgspngepc 121 gktcleerdn qwlgvtlsrq pgengsivtc ghrwknifyi knenklptgg cygvppdlrt 181 elskriapcy qdyvkkfgen fascqagiss fytkdlivmg apgssywtgs lfvynittnk 241 ykafldkgnq vkfgsylgys vgaghfrsqh ttewggapq heqigkayif sidekelnil 301 hemkgkklgs yfgasvcavd lnadgfsdll vgapmqstir eegrvfvyin sgsgavmnam 361 etnlvgsdky aarfgesivn Igdidndgfe dvaigapqed dlqgaiiyn gradgisstf 421 sqrieglqis kslsmfgqsi sgqidadnng yvdvavgafr sdsavllrtr pwivdasls 481 hpesvnrtkf dcvengwpsv cidltlcfsy kgkevpgyiv Ifynmsldvn rkaespprfy 541 fssngtsdvi tgsiqvssre ancrthqafm rkdvrdiltp iqieaayhlg phviskrste 601 efpplqpilq qkkekdimkk tinfarfcah encsadlqvs akigflkphe nktylavgsm 661 ktlmlnvslf nagddayett lhvklpvgly fikileleek qincevtdns gwqldcsig 721 yiyvdhlsri disflldvss lsraeedlsi tvhatcenee emdnlkhsrv tvaiplkyev 781 kltvhgfvnp tsfvygsnde nepetcmvek mnltfhvint gnsmapnvsv eimvpnsfsp 841 qtdklfnild vqtttgechf enyqrvcale qqksamqtlk givrflsktd krllycikad 901 phclnflcnf gkmesgkeas vhiqlegrps ilemdetsal kfeiratgfpepnprvieln 961 kdenvahvll eglhhqrpkr yftiviisss lllglivlll isyvmwkagf fkrqyksilq 1021 eenrrdswsy insksndd [SEQ ID NO: 1] (Residuos 1-39 son aminoácidos de la secuencia de señal. Los residuos 40 a 1048 son aminoácidos del producto alfa4 integrino) . Alfa4 se combina con 1 para formar integrina 4 1 (VLA-4, CD49d/CD29) , o con la subunidad 7 para formar la integrina 4 7. 2. Betal Los términos "betal" (CD29) o "polipeptido betal" o "proteína betal" cuando se emplean aquí, abarcan "betal polipéptido de secuencia nativa" que tiene una actividad biológica de la secuencia nativa betal. En una modalidad preferida, la actividad biológica de un polipéptido betal de acuerdo con esta invención es promover la adhesión y retención de linfocitos B en un órgano o un área de un tejido linfoide, por ejemplo a través de asociación con una subunidad alfa tal como alfa4 o alfa2 para formar una integrina que liga a una matriz extracelular o ligando en al menos una célula de bazo de zona marginal inmovilizada o célula central germinal, limitando de esta manera el acceso intravascular del linfocito B . Un betal polipéptido "secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido betal correspondiente derivado de la naturaleza. Estos betal polipéptidos de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes y/o sintéticos. El término "betal polipéptido de secuencia nativa" incluye formas truncadas de origen natural, formas variantes de origen natural (por ejemplo formas combinadas alternativas) isoformas de origen natural (tales como A-D) y variantes alélicas de origen natural del polipéptido. Un ejemplo de una secuencia betal polipéptido humana se muestra a continuación (número de acceso Genbank P05556) : 1 mnlqpifwig lissvccvfa qtdenrclka nakscgeciq agpncgwctn stflqegmpt 61 sarcddleal kkkgcppddi enprgskdik knknvtnrsk gtaeklkped ihqiqpqqlv 121 lrlrsgepqt ftlkfkraed ypidlyylmd lsysmkddle nvkslgtdlm nemrritsdf 181 rigfgsfvek tvmpyisttp aklrnpctse qncttpfsyk nvlsltnkge vfnelvgkqr 241 isgnldspeg gfdaimqvav cgsligwrnv trllvfstda gfhfagdgkl ggivlpndgq 301 chlennmytm shyydypsia hlvqklsenn iqtifavtee fqpvykelkn lipksavgtl 361 sanssnvigl iidaynslss evilengkls egvtisyksy ckngvngtge ngrkcsnisi 421 gdevqfeisi tsnkcpkkds dsfkirplgf teevevilqy icececqseg ipespkcheg 481 ngtfecgacr cnegrvgrhc ecstdevnse dmdaycrken sseicsnnge cvcgqcvcrk 541 rdntneiysg kfcecdnfnc drsnglicgg ngvckcrvce cnpnytgsac dcsldtstce 601 asngqicngr gicecgvckc tdpkfqgqtc emcqtclgvc aehkecvqcr afnkgekkdt 661 ctqecsyfni tkvesrdklp qpvqpdpvsh ckekdvddcw fyftysvngn nevmvhvven 721 pecptgpdii pivagwagi vliglallli wkllmiihdr refakfekek mnakwdtgen 781 piyksavttv vnpkyegk [SEQ ID NO: 2] 3. Beta7 Los términos "beta7" o "beta7 polipéptido" o "beta7 proteína" cuándo se emplean aquí abarcan "beta7 polipéptidos de secuencia nativa" que tiene una actividad biológica en la secuencia nativa beta7. En una modalidad, la actividad biológica de un beta7 polipéptido de acuerdo con esta invención es promover hol de los linfocitos alfa4beta7+ al intestino, de esta manera limitando el acceso intravascular de los linfocitos B. En otra modalidad, la actividad biológica de un beta7 polipéptido es promover la adhesión y retención de linfocitos B en un órgano o un área de un tejido linfoide tal como MZ del bazo, por ejemplo a través de asociación con una sub-unidad alfa tal como alfa4. Un beta7 polipéptido de "secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia aminoácido que un beta7 polipéptido correspondiente derivado de la naturaleza. Estos beta7 polipéptidos de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes y/o sintéticos . El término "beta7 polipéptido de secuencia nativa" incluye formas truncadas de origen natural, formas variantes de origen natural (por ejemplo formas combinadas alternas) isoformas de origen natural (tales como A-D) y variantes alélicas de origen natural del polipéptido. Un ejemplo de una secuencia beta7 polipéptido humana se muestra a continuación (número de acceso Genbank P26010) : 1 mvalpmvlvl llvlsrgese ldakipstgd atewrnphls mlgscqpaps cqkcilshps 61 cawckqlnft asgeaearrc arreellarg cpleeleepr gqqevlqdqp lsqgargega 121 tqlapqrvrv tlrpgepqql · qvrflraegy pvdlyylmdl sysmkddler vrqlghallv 181 rlqevthsvr igfgsfvdkt vlpfvstvps klrhpcptrl ercqspfsfh hvlsltgdaq 241 aferevgrqs vsgnldspeg gfdailqaal cqeqigwrnv srllvftsdd tfhtagdgkl 301 ggifmpsdgh chldsnglys rstefdypsv gqvaqalsaa niqpifavts aalpvyqels 361 klipksavge lsedssnwq limdaynsls stvtlehssl ppgvhisyes qcegpekreg 421 kaedrgqcnh vrinqtvtfw vslqathclp ephllrlral gfseelivel htlcdcncsd 481 tqpqaphcsd gqghlqcgvc scapgrlgrl cecsvaelss pdlesgcrap ngtgplcsgk 541 ghcqcgrcsc sgqssghlce cddascerhe gilcggfgrc qcgvchchan rtgracecsg 601 dmdscispeg glcsghgrck cnrcqcldgy ygalcdqcpg cktpcerhrd caecgafrtg 661 platncstac ahtnvtlala pilddgwcke rtldnqlfff lveddargtv vlrvrpqekg 721 adhtqaivlg cvggivavgl glvlayrlsv eiydrreysr fekeqqqlnw kqdsnplyks 781 aitttinprf qeadsptl [SEQ ID NO: 3] 4. AlfaL Los términos "alfa L" o "alfaL polipéptido" o "alfaL proteína" o "CDlla" cuando se emplean aqui abarcan "alfaL polipéptidos de secuencia nativa" que tienen actividad biológica de la secuencia nativa alfaL (CDlla) . En una modalidad, la actividad biológica de un alfaL polipéptido es promover la adhesión y retención de linfocitos B en un órgano o un área de un tejido linfoide, por ejemplo a través de asociación con una subunidad beta tal como beta2 (CD18) , para formar una integrina que liga a una matriz extracelular o ligando en al menos una célula central germinal o célula de bazo de zona marginal inmovilizada. Otra actividad biológica de alfaLbeta2 (CDlla/CD18) (LFA-1) es para promover asentamiento de linfocitos B de la sangre al bazo y nodo linfático. Ambas de estas actividades biológicas resultan en acceso intravascular limitante de estos linfocitos B. AlfaLbeta2 (LFA-1) se liga a cuando menos CD54 (ICAM-1) , CD102 (ICAM2) , y CD50 (ICAM-3) . Un alfaL polipéptido de "secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia amino ácido que un alfaL polipéptido correspondiente derivado de la naturaleza. Estos alfaL polipéptidos de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes y/o sintéticos. El término "alfaL polipéptido de secuencia nativa" incluye formas truncadas de origen natural, formas variantes de origen natural (por ejemplo formas combinadas en forma alterna) , isoformas de origen natural, y variantes alélicas de origen natural del polipéptido . Un ej emplo de una secuencia de alfaL polipéptido humana se muestra a continuación (No. de Acceso SWISSPROT P207017; No. de Acceso EMBL/GENBANK Y00796) : 1 mkdscitvma mallsgffff apassynldv rgarsfsppr agrhfgyrvl qvgngvivga 61 pgegnstgsl yqcqsgtghc Ipvtlrgsny tskylgmtla tdptdgsila cdpglsrtcd 121 qntylsglcy lfrqnlqgpm lqgrpgfqec ikgnvdlvfl fdgsmslqpd efqkildfmk 181 dvmkklsnts yqfaavqfst syktefdfsd yvkrkdpdal Ikhvkhmlll tntfgainyv 241 atevfreelg arpdatkvli iitdgeatds gnidaakdii ryiigigkhf qtkesqetlh 301 kfaskpasef vkildtfekl kdlftelqkk iyviegtskq dltsfnmels ssgisadlsr 361 ghawgavga kdwaggfldl kadlqddtfi gnepltpevr agylgytvtw Ipsrqktsll 421 asgapryqhm grvllfqepq ggghwsqvqt ihgtqigsyf ggelcgvdvd qdgétellli 481 gaplfygeqr ggrvfiyqrr qlgfeevsel ggdpgyplg fgeaitaltd ingdglvdva 541 vgapleeqga vyifngrhgg Ispqpsqrie gtqvlsgiqw fgrsihgvkd legdgladva 601 vgaesqmivl ssrpwdmvt lmsfspaeip vhevecsyst snkmkegvni ticfqiksly 661 pqfqgrl an ltytlqldgh rtrrrglfpg grhelrrnia vttsmsctdf sfhfpvcvqd 721 lispinvsln fslweeegtp rdqraqgkdi ppilrpslhs etweipfekn cgedkkcean 781 lrvsfspars ralrltafas lsvelslsnl eedaywvqld lhfppglsfr kvemlkphsq 841 ipvsceelpe esrllsrals cnvsspifka ghsvalqmmf ntlvnsswgd svelhanvtc 901 nnedsdlled nsattiipil ypiniliqdq edstlyvsft pkgpkihq k hmyqvriqps 961 ihdhniptle avvgvpqpps egpithqwsv qmeppvpchy edlerlpdaa epclpgalfr 1021 cpwfrqeil vqvigtlelv geieassmfs lcsslsisfn sskhfhlygs naslaqvvmk 1081 vdwyekqml ylyvlsgigg lykvgffkrn Ikekmeagrg vpngipaeds 1141 eqlasgqeag dpgclkplhe kdsesgggkd [SEQ ID NO: 4] 5. Beta2 Los términos "beta2" (CD18) o "beta2 polipéptido" o "beta2 proteina" cuando se emplean aquí, abarcan "beta2 polipéptidos de secuencia nativa" que tienen una actividad biológica de una beta2 de secuencia nativa. Un beta2 polipéptido de "secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de amino ácidos que un beta2 polipéptido correspondiente derivado de la naturaleza. Estos beta2 polipéptidos de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes y/o sintéticos. El término "beta2 polipéptido de secuencia nativa" incluye formas truncadas de origen natural, formas variantes de origen natural (por ejemplo, formas combinadas en forma alterna) , isoformas de origen natural, y variantes alélicas de origen natural del polipéptido. Un ejemplo de una secuencia beta2 polipéptido humana se ilustra a continuación (No. de Acceso Genbank P05107) : 1 mlglrpplla Ivgllslgcv lsqectkfkv sscreciesg pgctwcqkln ftgpgdpdsi 61 rcdtrpqllm rgcaaddimd ptslaetqed hnggqkqlsp qkvtlylrpg qaaafnvtfr 121 rakgypidly ylmdlsysml ddlrnvkklg gdllralnei tesgrigfgs fvdktvlpfv 181 nthpdklrnp cpnkekecqp pfafrhvlkl tnnsnqfqte vgkqlisgnl dapeggldam 241 mqvaacpeei gwrnvtrllv fatddgfhfa gdgklgailt pndgrchled nlykrsnefd 301 ypsvgqlahk laenniqpif avtsrmvkty eklteiipks avgelsedss nwhliknay 361 nklssrvfld hnalpdtlkv tydsfcsngv thrnqprgdc dgvqinvpit fqvkvtatec 421 iqeqsfvira lgftdivtvq vlpqcecrcr dqsrdrslch gkgflecgic rcdtgyigkn 481 cecqtqgrss qelegscrkd nnsiicsglg dcvcgqclch tsdvpgkliy gqycecdtin 541 ceryngqvcg gpgrglcfcg kcrc pgfeg sacqcertte gclnprrvec sgrgrcrcnv 601 cechsgyqlp lcqecpgcps pcgkyiscae clkfekgpfg kncsaacpgl qlsnnpvkgr 661 tckerdsegc wvaytleqqd gmdryliyvd esrecvagpn iaaivggtva givligilll 721 viwkalihls dlreyrrfek eklksqwnnd nplfksattt vmnpkfaes [SEQ ID NO: 5] C. Alfa4 Integrina El término "alfa4 integrina" cuando se emplea aqui, se refiere a un heterodimero que comprende una subunidad alfa4 y una subunidad beta. Ejemplos de alfa4 integrinas incluyen alfa4betal (VLA-4 o VLA-4 integrina) o alfa4beta7 (LPAM-1 o LPAM-1 integrina) .

Alfa4betal ( [alfa] 4ss;l) se expresa en la mayoría de los leucocitos con excepción possible de neutrófilos y plaquetas; también se expresa en tejido no linfoide. Alfa4beta7 (alfa4beta7) se expresa en la mayoría de las células B y T no linfático, células NK y eosinófilos, alfa4betal está involucrado en la migración de leucocitos de la sangre a tejidos en sitios de inflamación. alfa4beta7 está involucrada en el asentamiento de linfocitos 4 7+ al intestino a través del reconocimiento de MAdCAM-1 en vénulas altamente endoteliales de mucosa. Ejemplos de la actividad biológica de una alfa4 integrina pueden incluir cualquiera o una combinación de las siguientes actividades: (1) enlazar a un ligando de alfa4betal (por ejemplo, cualquiera de los ligandos seleccionados del grupo que consiste de VCAM-1, fibronectina, trombospondina, colágenos e invasina) , (2) enlazar a un ligando de alfa4beta7 (por ejemplo, cualquiera de los ligandos seleccionados del grupo que consiste de molécula de adhesión de célula vascular-1 (VCAM-1) , molécula de adhesión de célula de adresina mucosal-1 (MAdCAM-1) , y fibronectina, y (3) promover la adhesión y retención y/o asentamiento de linfocitos B a un órgano o un área de un tejido linfoide tal como la zona marginal en el bazo . 1. Ligandos de Alfa4 Integrina El ligando alfa4 integrina, VCAM-1 (CD106) , contiene siete dominios IgSF C2 en su porción extracelular (Barclay et al., 1997, supra, page 386-387). VCAM-1 contiene dos sitios de enlace independientes para alfa4betal (VLA-4) en los dominios 1 y 4, respectivamente (ver por ejemplo, Vonderheide, et al., 1994, J". Cell Biol. 125:215-222; Jones, et al., 1995, Nature 373: 539- 544 para sitios de enlace de integrina) . La secuencia de amino ácido de longitud íntegra de VCAM-1 humano (CD106) se proporciona en la página 387 de Barclay et al, supra, y a través del No. de Acceso GenBank M73255 o SWISSPROT P19320. Un ejemplo de una secuencia polipéptido VCAM-1 humana se ilustra a continuación (No. de Acceso SWISSPROT P19320) : 1 mpgkmwilg asnilwimfa asqafkiett pesrylaqig dsvsltcstt gcespffswr 61 tqidsplngk vtnegttstl tmnpvsfgne hsylctatce srklekgiqv eiysfpkdpe 121 ihlsgpleag kpitvkcsva dvypfdrlei dllkgdhlmk sqefledadr ksletkslev 181 tftpviedig kvlvcraklh idemdsvptv rqavkelqvy ispkntvisv npstklqegg 241 svtmtcsseg lpapeifwsk kldngnlqhl sgnatltlia mrmedsgiyv cegvnligkn 301 rkevelivqe kpftveispg priaaqigds vmltcsvmgc espsfswrtq idsplsgkvr 361 segtnstltl spvsfenehs ylctvtcghk klekgiqvel ysfprdpeie msgglvngss 421 vtvsckvpsv ypldrleiel Ikgetileni efledtdmks lenkslemtf iptiedtgka 481 lvcqaklhid dmefepkqrq stqtlyvnva prdttvlvsp ssileegssv nmtclsqgfp 541 apkilwsrql pngelqplse natltlistk medsgvylce ginqagrsrk eveliiqvtp 601 kdikltafps esvkegdtvi isctcgnvpe twiilkkkae tgdtvlksid gaytirkaql 661 kdagvyeces knkvgsqlrs ltldvqgren nkdyfspell vlyfasslii paigmiiyfa 721 rkanmkgsys Iveaqkskv (SEQ ID NO: 6) (Secuencia de señal en los residuos 1 a 24; Dominio extracelular en los residuos 25 a 698; Dominio de transmembrana en los residuos 699 a 720; y Dominio citoplásmico en los residuos 721 a 739) . El ligando alfa 4 integrina, MAdCAM contiene dos dominios IgSF C2 en su porción extracelular (Tan et al. 1998, Structure 6: 793-801). MAdCAM es un receptor para alfa4beta7 y L-selectina (Elangbam et al., 1997, Vet. Pathol., 34: 61-73). Un ejemplo una secuencia de amino ácido de longitud íntegra de MAdCAM humana se proporciona a través del No. de Acceso S ISSPROT: Q13477. 1 mdfglallla gllglllgqs Iqvkplqvep pepwavalg asrqltcrla cadrgasvqw 61 rgldtslgav qsdtgrsvlt vrnaslsaag trvcvgscgg rtfqhtvqll vyafpdqltv 121 spaalvpgdp evactahkvt pvdpnalsfs llvggqeleg aqalgpevqe eeeepqgded 181 vlfrvterwr Ipplgtpvpp alycqatmrl pglelshrqa ipvlhsptsp eppdttspes 241 pdttspespd ttspespdtt sqeppdttsq eppdttsqep pdttspeppd ktspepapqq 301 gsthtprspg strtrrpeis qagptqgevi ptgsskpagd qlpaalwtss avlgllllal 361 ptyhlwkrcr laeddthpp aslrllpqvs awaglrgtgq vgisps · (SEQ ID NO: 7) (Secuencia de señal en los residuos 1 a 18; Dominio extracelular en los residuos 19 a 341; Dominio transmembrana en los residuos 342 a 362; y Dominio citoplásmico en los residuos 363 a 406) . 2. Antagonista de Alfa4 Integrina El término "antagonista de alfa4 integrina" como se emplea aquí, se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea en forma parcial o completa una actividad biológica de una alfa4 integrina. De acuerdo con una modalidad, antagonista alfa4 integrina bloquea parcial o completamente la interacción entre una alfa4 integrina o su ligando, y realiza caulquiera o una combinación de los siguientes eventos: (1) promueve salida de linfocitos de órganos o tejidos linfoides y/o de otra forma promueve la circulación de linfocitos B en mamíferos y (2) bloquea parcial o completamente, inhibe o neutraliza señalización de alfa4 integrina de secuencia nativa. En una modalidad, el antagonista alfa4 integrina inhibe adhesión de célula B y retención en el bazo e intestino. En una modalidad más especifica, el antagonista alfa4betal inhibe la adhesión de célula B y retención en al menos la zona marginal del bazo o centro germinal de tejido linfoide. Antagonistas útiles de alfa4 integrina incluyen antagonistas de la subunidad alfa, antagonistas de la subunidad beta, y antagonistas de ambas sub-unidades alfa y beta. De acuerdo con una modalidad preferida, el antagonista alfa4 integrina es un antagonista alfa4betal (VLA-4) , por ejemplo aquellos descritos en WO 99/06432. De acuerdo con otra modalidad preferida, el antagonista alfaé integrina es un antagonista alfa4beta7 (LPAM-1) , por ejemplo el MAb MLN-02/LDP-02 humanizado, descrito en la solicitud de patente de los E.U.A. No. de Serie 08/700,737 o los derivados de ácido piroglutámico y compuestos relacionados descritos en la patente de los E.U.A. No. 6,407,066. De acuerdo con una modalidad, el antagonista alfa4 integrina es un antagonista dual alfa4betal/alfa4beta7, por ejemplo R-411 (Hijazi et al., 2004, J. Clin. Pharmacol., 44:1368-1378), o los antagonistas descritos en la patente de los E.U.A. No. 6,482,849, o En Egger et al., 2002 Jul . , J. Pharmacol. Exp. Ther., 302 (1) : 53-62. De acuerdo con una modalidad, el antagonista liga a la subunidad alfa4. De acuerdo con otra modalidad, el antagonista enlaza un ligando de la alfa4 integrina, por ejemplo los ligandos VCAM-1 o el ligando MAdCAM-1. Antagonists de alfa4 integrinas, por ejemplo alfa4betal y alfa4beta7, pueden emplearse en conjunto, simultáneamente o secuencialmente, para promover circulación de B linfocitos en mamíferos. Múltiples diferentes antagonistas de alfa4betal (VLA-4) y/o alfa4beta7 (LPAM-1) pueden emplearse en conjunto, simultánea o secuencialmente, para promover la circulación de linfocitos B ¦ en mamíferos. El antagonista alfa4 integrina puede ser un anticuerpo, una pequeña molécula o una inmunoadhesina . 3. Antagonists de Anticuerpo de Alfa4 Integrina En una modalidad, el antagonista alfa4 integrina es un anticuerpo. El término "anticuerpo" se emplea ampliamente, e incluye anticuerpos policlonales y monoclonales , de longitud íntegra y fragmentos, humanizados, quiméricos, bi-específicos y semejantes. En una modalidad preferida, el antagonista alfa4 integrina es un anticuerpo que liga alfa4betal (VLA-4 ) , alfa4beta7 (LPAM-1) , o un anticuerpo que liga la subunidad alfa sola, tal como el anticuerpo anti-CD49d descrito en los Ejemplos a continuación. Ejemplos de anticuerpos que son antagonistas de alfa4 integrina incluyen TYSABRIMR de Biogen-Idec (natalizumab) , previamente denominado Antegren (patentes de los E.U.A. Nos. 6,602,503, 5,840,299, y 5,730,978, que aquí se incorpora por referencia), y semejantes. De acuerdo con otra modalidad, el antagonista alfa4 integrina es un anticuerpo que enlaza un ligando de una alfa4 integrina, por ejemplo cualquiera de los ligandos citados anteriormente, y particularmente un anticuerpo anti- CAM-1 o un anticuerpo anti-MAdCAM-1. Por ejemplo, un anticuerpo VCAM-1 humanizado, 2A2 , está disponible de Alexion Pharmaceuticals Inc. (New Haven, CT) . Ejemplos de Abs humanizados que enlazan específicamente alfa4beta (VLA-4) incluyen aquellos que comprenden una o más de las cadenas VL y VH mostradas a continuación·. 1) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia a) 1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQDIN KYMAWYQQTP GKAPRLLIHY TSALQPGIPS 61 RFSGSGSGRD YTFTISSLQP EDIATYYCLQ YDNLWTFGQG TKVEIK (SEQ ID NO : 8); o b) 1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQDIN KYMAWYQQTP G APRLLIYY TSALQPGIPS 61 RFSGSGSGRD YTFTISSLQP EDIATYYCLQ YDNLWTFGQG TKVEI (SEQ ID NO: 9) ; y 2) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia c) 1 QVQLVQSGAE VKKPGASSVK VSCKASGFNI KDTYIHWVRQ APGQRLEWMB RIDPANGYTK 61 YDPKFQGRVT ITADTSASTA YMELSSLRSE DTAVYYCARE GYYGNYGVYA MDYWGQGTLV 121 TVSS (SEQ ID NO: 10), d) 1 QVQLVQSGAE VKKPGASSVK VSCKASGFNI KDTYIHWVRQ APGQGLEWMB RIDPANGYTK 61 YDPKFQGRVT ITADTSASTA YMELSSLRSE DTAVYYCARE GYYGNYGVYA MDYWGQGTLV 121 TVSS (SEQ ID NO: 11), o e) 1 QVQLVQSGAE VKKPGASSVK VSCKASGFNI KDTYIHWVRQ APGQRLEWMB RIDPANGYTK 61 YDPKFQGRVT ITADTSASTA YMELSSLRSE DTAVYYCARE GYFGNYGVYA MDYWGQGTLV 121 TVSS (SEQ ID NO: 12 ) . Un ejemplo de un anticuerpo humanizado que liga específicamente VLA-4 que comprende: 1) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia a) 1 SIVMTQSPSSL1 SASVGDRVTI TCKASQSVTN DVAWYQQKPG KAPKLLIYYA SNRYTGVPDR 61 FSGSGYGTDFT FTISSLQPED IATYYCQQDY SSPYTFGQGT KVEIK (SEQ ID NO: 13), b) 1 DIQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCKASQSVTN DVAWYQQKPG KAPKLLIYYA SNRYTGVPDR 61 FSGSGSGTDFT FTISSLQPED IATYYCQQDY SSPYTFGQGT YVEIK (SEQ ID NO: 14), o c) 1 SIVMTQSPDSL AVSLGERVTI NCKASQSVTN DVAWYQQKPG QSPKLLIYYA SNRYTGVPDR 61 FSGSGYGTDFT FTISSVQAED VAVYYCQQDY SSPYTFGGGT KLEIK (SEQ ID NO: 15) ; y 2) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia d) 1 QVQLQESGPGL VRPSQTLSLT CTVSGFNIKD TY HWVRQPP GRGLEWIGRI DPASGDTKYD 61 PKFQVRVTMLV DTSSNTAWLR LSSVTAADTA VYYCADGMWV STGYALDFWG QGTTVTVSS (SEQ ID NO: 16) , e) 1 QVQLQESPGL VRPSQTLSLTC TVSGFNIKDT YMHWVRQPPG RGLEWIGRID PASGDTKYDP 61 KFQVKATITA DTSSNQFSLRL SSVTAADTAV YYCADGMWVS TGYALDFWGQ GTTVTVSS (SEQ IDNO: 17), f) 1 QVQLQESGPG LV PSQTLSLT CTVSGFNIKD TYMHWVRQPP GRGLEWIGRI DPASGDTKYD 61 PKFQVRVTML VDTSSNQFSLR LSSVTSEDTA VYYCADGMWV STGYALDFWG QGTTVTVSS (SEQ IDNO: 18), g) 1 QVQLQESGPG LVRPSQTLSLT CTVSGFNIKD TYMHWVKQRP GRGLEWIGRI DPASGDTKYD 61 PKFQVRVTML VDTSSNQFSLR LSSVTAADTA VYYCADGMWV STGYALDFWG QGTTVTVSS (SEQ ID NO: 19), h) 1 QVQLQESGPG LVRPSQTLSLT CTASGFNIKD TYMHWVRQPP GRGLEWIGRI DPASGDTKYD 61 PKFQVRVTML VDTSSNQFSLR LSSVTAADTA VYYCADGMWV STGYALDFWG QGTTVTVSS (SEQ IDNO : 20), o i) 1 QVQLQESGAE WKPGSSV LS CKASGFNIKD TYMHWVKQRP GQGLEWIGRI DPASGDTKYD 61 PKFQVKATIT ADESTSTAYLE LSSLRSEDTA VYYCADGMWV STGYALDFWG QGTTVTVSS (SEQ ID NO: 21) . 4. Antagonistas de inmunoadhesina de Alfa4 Integrina De acuerdo con aún otra modalidad, el antagonista de integrina es una inmunoadhesina. Un ejemplo de esta inmunoadhesina es aquel que comprende una porción soluble de un ligando de alfa4 integrina que liga a alfa4, por ejemplo, el dominio de enlace de ligando o el dominio extracelular de un ligando de la alfa4 integrina, tal como VCAM-1 (CD106) y/o MAdCAM-l. En una modalidad, el antagonista de inmunoadhesina es un dominio de enlace ligando soluble fusionado a una región Fe de una IgG tal como una IgG 1 humana. Los dominios de enlace de VCAM-1 y MAdCAM-1 se conocen en la especialidad. VCAM-1 enlaza a alfa4betal primordialmente por varios residuos (residuos 39, 40 y 43) dentro del Dominio 1 (residuos 25-105 de acuerdo con UniProt) con una contribución de varios residuos del Dominio 2 (residuos 109-212 de acuerdo con UniProt) ; VCAM-1 liga a alfa4beta7 primordialmente por los residuos dentro del Dominio 2 con una contribución de los residuos dentro del Dominio 1. (Newham et al., 1997, J. Biol . Chem. , 272:19429-19440). MAdCAM-1 liga a alfa4beta7 por tanto el Dominio 1 (residuos 23-112 de acuerdo con UniProt) como el Dominio 2 (residuos 113-231 de acuerdo con UniProt); los residuos MAdCAM-1 40, 41, 42 y 44 se requirieron para completo enlace y remoción de los residuos 143-150 elimina el enlace. MAdCAM-1 liga deficientemente con a betal, y la remoción de los residuos 143-150 también eliminan el enlace a a4betal. (Newham et al., 1997, supra) . Aunque tanto como alfa4betal y alfa4beta7 pueden ligar tanto VCAM-1 como MAdCAM-1, hay una preferencia de ligando. Alfa4betal primordialmente es un receptor de VCAM-1, y alfa4beta7 es primordialmente un receptor para MAdCAM-1. (Newham et al . , 1997, supra) .

. Antagonistas de Pequeña Molécula de Alfa4 Integrina En otra modalidad, el antagonista de alfa4 integrina es una molécula pequeña. Ejemplos de moléculas pequeñas que son antagonistas de alfa4 integrina incluyen aquellas descritas en las patentes de los E.U.A. Nos. 6,239,108, 6,459,047, 6,482,849, y 6,706,753, solicitudes de patentes PCT publicadas Nos. WO 01/21584 y WO 02/16313, y en la solicitud de patente provisional de los E.U.A. No. de Serie 60/472,072, presentada en mayo 20, 2003. De acuerdo con una modalidad, el antagonista es cualquiera de las moléculas pequeñas descritas como antagonistas de alfa4 integrina en WO 01/21584 y como se describe más completamente a continuación. De acuerdo con otra modalidad, el antagonista es cualquiera de las moléculas pequeñas descritas en WO 01/21584 o cualquiera de aquellas mostradas en las Tablas siguientes, a. Definiciones Químicas Como se emplea para definer las moléculas pequeñas aquí descritas, los siguientes términos químicos tienen las definiciones indicadas: El término "alquilo" empleado solo o como parte de otro término, por ejemplo alquilamino, alquilsulfonilo-, alquiltio, etc., significa un grupo hidrocarburo alifático ramificado o sin ramificar, saturado o insaturado, que tiene el número de átomos de carbono especificados, o si no se especifica el número, que tiene hasta e incluyendo 12 átomos de carbono. "Alquilo" cuando se emplea solo o como parte de otro término, de preferencia significa una cadena hidrocarburo saturada, sin embargo también incluye cadenas de carbono de hidrocarburos insaturadas tales como "alquenilo" y "alquinilo" . Ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, ter-butilo, n-pentilo, 2- metilbutilo, 2,2-dimetilpropilo, n-hexilo, 2-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo, n-heptilo, 3-heptilo, 2-metil-hexilo, y semejantes. Los términos "alquilo inferior" "alquilo Cx-C6" y "alquilo de 1 a 6 átomos de carbono" son sinónimos y se emplean en forma intercambiable. Grupos "C1-C6 alquilo" preferidos son metilo, etilo, 1-propilo, isopropil 1-butilo o sec-butilo. Los términos "alquilo substituido" o "alquilo Cn-Cm substituido" en donde m y n son enteros que identifican el intervalo de átomos de carbono contenidos en el grupo alquilo, denota los grupos alquilo anteriores que están substituidos por uno, dos, tres o cuatro grupos halógeno, trifluorometilo hidroxi, C^-C, alcoxi sin substituir y substituido, hidroxi protegido, amino (incluyendo alquilo y dialquil amino) , amino protegido, ^Cy aciloxi sin substituir y substituido, C3-C7 heterocíclilo sin substituir y substituido, fenoxi sin substituir y substituido, nitro, carboxi, carboxi protegido, carboalcoxi sin substituir y substituido, acilo sin substituir y substituido, carbamoilo, carbamoiloxi , ciano, metilsulfonilamino, benziloxi sin substituir y substituido, C3-C3 carbociclilo o Ci-C4 alcoxi sin substituir y substituido. Los grupos alquilo substituidos pueden estar substituidos una vez (de preferencia) , dos o tres veces con el mismo o con diferentes substituyentes . Ejemplos de los grupos alquilo anteriormente substituidos incluyen, pero no están limitados a; cianometilo, nitometilo, hidroximetilo, tritiloximetilo, propioniloximetilo, aminimetilo, carboximetilo, carboxietilo, carboxipropilo, alquiloxicarbonilmetilo, aliloxicarbonilaminometilo, carbamoiloximetilo, metoximetilo, etoximetilo, t-butoximetilo, acetoximetilo, clorometilo, bromometilo, yodometilo, trifluorometilo, 6-hidroxihexilo, 2 , 4-dicloro (n-butilo) , 2-amino(iso-propilo) , 2-carbamoiloxietilo y semejantes. El grupo alquilo también puede estar substituido con un grupo carbocíclico . Ejemplos incluyen grupos ciclopropilmetilo, ciclobutilmetilo, ciclopentilmetilo y ciclohexilmetilo, así como correspondientes grupos -etilo, -propilo, butilo, -pentilo, -hexilo, etc. Un grupo preferido de ejemplos dentro del grupo anterior incluye el grupo metilo substituido, por ejemplo un grupo metilo substituido por los mismos substituyentes que el grupo "Cn-Cm alquilo substituido". Ejemplos del grupo metilo substituido incluyen grupos tales como hidroximetilo, hidroximetilo protegido (por ejemplo tetrahidropiraniloximetilo) , acetoximetilo, carbamoiloximetilo, trifluorometilo, clorometilo, carboximetilo, bromometilo y yodometilo. El término "no-aromático" se refiere a anillos carbociclo o heterociclo que no tienen las propiedades que definen la aromaticidad. Para aromaticidad, un anillo debe ser planar, tener orbitales p que son perpendiculares al plano del anillo en cada átomo de anillo y satisfacen la regla de Huckel en donde el número de electrones pi en el anillo es (4n+2) en donde n es un entero (es decir el número de electrones pi es 2, 6, 10 o 14) . Anillos no-aromáticos que aquí se proporcionan no satisfacen uno o todos estos criterios para aromaticidad El término "alcoxi" como se emplea aquí, incluye grupos saturados, es decir O-alquilo, e insaturados, es decir O-alquenilo y O-alquinilo. Grupos alcoxi ejemplares tienen el número de átomos de carbono especificados tales como grupos metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, t-butoxi y semejantes. El término "alcoxi substituido" significa estos grupos alcoxi substituidos por los mismos substituyentes que el grupo "alquilo substituido" . El término "aciloxi" denota grupos carboaciloxi que tienen el número especificado de átomos de carbono tales como formiloxi, acetoxi, propioniloxi , butiriloxi, pentanoiloxi , hexanoiloxi, heptanoiloxi , y semejantes. El término "aciloxi substituido" significa estos grupos aciloxi substituidos por los mismos substituyentes que el grupo "alquilo substituido" . El término "alquilcarbonilo" , "alcanoilo" y "acilo" se emplean en forma intercambiable aqui abarcan grupos que tienen el número especificado de átomos de carbono tales como formilo, acetilo, propionilo, butirilo, pentanoilo, hexanoilo, heptanoilo, benzoilo y semej antes . El término "alquilsulfonilo" denota los grupos -NH-S02-alquilo, -S02-NH-alquilo, -N- (S02-alquilo) 2 y -SOz-N (alquilo) 2. Grupos alquilsulfonilo preferidos son - H- S02-Me, -NH-S02-Et, -NH-S02-Pr, -NH-S02-iPr, -N- (S02-Me)2 y N- (S02-Bu)2. El término "amino" denota aminas primarias (es decir -NH2) , secundarias (es decir -NRH) y terciarias (es decir -NRR) . Aminas secundarias y terciarias preferidas son alquilamina y dialquil aminas tales como metilamina, etilamina, propilamina, isopropilamina, dimetilamina, dietilamina, dipropilamina y disopropilamina . Por "carboxilo" se entiende aquí un -COOH ácido libre asi como sus ásteres tales como alquilo, arilo y aralquilo. Esteres preferidos son metilo, etilo, propilo, butilo, i-butilo, s-butilo y t-butilo. Los términos "carbociclilo" , "carbociclílico" y "carbociclo" solos y cuando se emplean como una porción en un grupo complejo tal como un grupo carbocicloalquilo, se refieren a un anillo mono-, bi-, o triciclico alifático que tiene de 3 a 14 átomos de carbono y de preferencia 3 a 7 átomos de carbono . Grupos carbocíclicos preferidos incluyen grupos ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. Los términos "carbociclilo substituido" y "carbociclo" significan estos grupos substituidos por los mismos substituyentes que el grupo "alquilo substituido" . Un grupo "carbocicloalquilo" es un grupo carbociclo como se definió anteriormente ligado covalentemente a un grupo alquilo como se definió con anterioridad. El término "heterociclo" se refiere a un sistema de anillo mono-, bi- o tri-cíclico que tiene 5-16 miembros, en donde al menos un átomo de anillo es un heteroátomo (es decir N, O y S así como SO, o S02) . El sistema de anillo es saturado, insaturado o parcialmente insaturado y puede ser aromático (al menos que se especifique como no-aromático) . Heterociclos ejemplares incluyen piperidina, piperazina, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, morfolina, pirano, pirol, furano, tiofeno (tienilo) , imidazol, pirazol, tiazol, isotiazol, ditiazol, oxazol, isoxazol, dioxazol, tiadiazol, oxadiazol, tetrazol, triazol, tiatriazol, oxatriazol, tiadiazol, oxadiazol, purina y derivados benzofusionados de los mismos. La frase "opcionalmente substituido con" se entiende que significa, a menos de que se establezca de otra forma, que uno o más de los substituyentes especificados se conecta covalentemente a la porción substituida. Cuando más de uno, los substituyentes pueden ser el mismo o un grupo diferente. El término "alquenilo" significa un grupo hidrocarburo ramificado o sin ramificar, que tiene el número de átomos de carbono designados que contienen uno o más dobles enlaces carbono-carbono, cada doble enlace es independientemente un isómero cis, trans o no geométrico. El término "alquenilo substituido" significa que estos grupos alquenilo substituidos por los mismos substituyentes que el grupo "alquilo substituido" .

El término "alquinilo" significa un grupo hidrocarburo ramificado o sin ramificar que tiene el número de átomos de carbono designados que contienen uno o más triples enlaces carbono-carbono . El término "alquinilo substituido" significa estos grupos alquinilo substituidos por los mismos substituyentes que el grupo "alquilo substituido" . El término "alquiltio" y "alquiltio C-_-C12 substituido" denota grupos C^-C^ alquilo y 0-012 alquilo substituido, respectivamente conectados a un azufre que a su vez es el punto de conexión para el grupo alquiltio o alquiltio substituido con el grupo o substituyente designado . Un grupo "alquilendioxi" es un grupo -O-alquil -O-, en donde alquilo es como se definió anteriormente. Grupos alquilendioxi preferidos son metilendioxi y etilendioxi . El término "arilo" cuando se emplea solo o como parte de otro término significa un grupo aromático homocíclico ya sea que esté o no fusionado con el número de átomos de carbono designados o si no se designa número, hasta 14 átomos de carbono. Grupos arilo preferidos incluyen fenilo, naftilo, bifenilo, fenantrenilo, naftacenilo, y semejantes (ver por ejemplo Lang Handbook of Chemistry (Dean, J. A., ed) , 1985, 13ava edición Tabla 7-2) . El término "aroilo" significa un grupo arilo unido a un carbonilo, tal como benzoilo, etc. El término "fenilo substituido" o "arilo substituido" denota un grupo fenilo o un grupo arilo substituido con uno, dos, tres, cuatro o cinco, de preferencia 1-2,1-3 o 1-4 substituyentes seleccionados de halógeno (F, Cl, Br, I), hidroxi, hidroxi protegido, ciano, nitro, alquilo (de preferencia Cx-C6 alquilo) , alcoxi (de preferencia Cx-C6 alkoxi) , benziloxi, carboxi, carboxi protegido, carboximetilo, carboximetilo protegido, hidroximetilo, hidroximetilo protegido, aminometilo, aminometilo protegido, trifluorometilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, heterociclilsulfonilamino, heterociclilo, arilo, u otros grupos especificados. Uno o más grupos metino (CH) y/o metileno (CH2) en estos substituyentes a su vez pueden estar substituidos con un grupo similar a aquellos anteriormente anotados. Ejemplos del término "fenilo substituido" incluyen pero no están limitados a un grupo mono- o di (halo) fenilo tal como 2-clorofenilo, 2-bromofenilo, 4-clorofenilo, 2 , 6-diclorofenilo, 2,5-diclorofenilo, 3 , 4-diclorofenilo, 3-clorofenilo, 3-bromofenilo, 4-bromofenilo, 3 , 4-dibromofenilo, 3- cloro- 4-fluorofenilo, 2-fluorofenilo y semej ntes; un grupo mono- o di (hidroxi) fenilo tal como 4-hidroxifenilo, 3-hidroxifenilo, 2 , 4-dihidroxifenilo, los derivados hidroxi protegidos de los mismos y semejantes; un grupo nitrofenilo tal como 3- o 4-nitrofenilo; un grupo cianofenilo, por ejemplo 4-cianofenilo; un grupo mono- o di (alquilo inferior) fenilo tal como 4-metilfenilo, 2,4-dimetilfenilo, 2-metilfenilo, 4- (iso-propil) fenilo, 4-etilfenilo, 3- (n-propil) fenilo y semejantes; un grupo mono o di (alcoxi) fenilo por ejemplo, 3 , 4-dimetoxifenilo, 3-metoxi-4-benziloxifenilo, 3-metoxi-4- (1-clorometil) -benziloxi-fenilo, 3-etoxifenilo, 4- (isopropoxi) fenilo, 3-etoxi-4-metoxifenilo y semejantes; 3- o 4-trifluorometilfenilo; un mono- o dicarboxifenilo o grupo (carboxi protegido) fenilo tal como 4-carboxifenilo; un mono- o di (hidroximetil) fenilo o (hidroximetil protegido) fenilo tal como 3- (hidroximetil protegido) fenilo o 3,4-di (hidroximetil) fenilo; un mono- o di (aminometil) fenilo o (aminometil protegido) fenilo tal como 2- (aminome il ) fenilo o 2 , 4- (aminometil protegido) fenilo; o un mono- o di (N- (metilsulfonilamino) ) fenilo tal como 3- (N-metilsulfonilamino) ) fenilo . También, el término "fenilo substituido" representa grupos fenilo disubstituidos en donde los substituyentes son diferentes, por ejemplo, 3-metil-4-hidroxifenilo, 3- cloro-4-hidroxifenilo, 2-metoxi-4-bromofenilo, 4-etil-2-hidroxifenilo, 3-hidroxi-4-nitrofenilo, 2-hidroxi-4-clorofenilo, y semejantes, así como grupos fenilo trisubstituidos en donde los substituyentes son diferentes, por ejemplo 3-metoxi-4-benziloxi-6-metil sulfonilamino, 3-metoxi-4-benziloxi-6-fenil sulfonilamino, y grupos fenilo tetrasubstituidos en donde los substituyentes son diferentes tales como 3-metoxi-4-benziloxi-5-metil-6-fenil sulfonilamino . Grupos fenilo substituidos preferidos incluyen los grupos 2-clorofenilo, 2-aminofenilo, 2-bromofenilo, 3-metoxifenilo, 3-etoxi-fenilo, 4-benziloxifenilo, 4-metoxifenilo, 3 -etoxi-4-benziloxifenilo, 3,4-dietoxifenilo, 3-metoxi-4-benziloxifenilo, 3-metoxi-4- (1-clorometil)benziloxi-fenilo, 3-metoxi-4- (1-clorometil)benziloxi-6-metil sulfonil aminofenilo.

También, el término "fenilo substituido" representa grupos fenilo que tienen un grupo arilo, fenilo o heteroarilo fusionado. El anillo fusionado también puede substituirse con cualquiera de preferencia 1, 2 o 3, de los substituyentes identificados anteriormente para grupos "alquilo substituido" . El término "arilalquilo" significa uno, dos o tres grupos arilo que tienen el número de átomos de carbono designados , agregados al grupo alquilo que tiene el número de átomos de carbono designados incluyendo pero no limitados a: benzilo, naftilmetilo, fenetilo, benzhidrilo (difenilmetilo) , tritilo y semejantes. Un grupo arilalguilo preferido es el grupo benzilo. El término "arilalquilo substituido" denota un grupo alquilo, de preferencia un grupo substituido en cualquier átomo de carbono con un grupo arilo, de preferencia un grupo C6-C10arilo, unido al grupo alquilo a través de cualquier posición de anillo arilo y substituido en la porción alquilo con uno, dos o tres grupos seleccionados de halógeno (F, Cl, Br, I), hidroxi, hidroxi protegido, amino, amino protegido, ^-^acilo i , nitro, carboxi, carboxi protegido, carbamoil, carbamoiloxi , ciano, N- (metilsulfonilamino) o Cj^-^alcoxi. Opcionalmente el grupo arilo puede estar substituido con uno, dos, tres, cuatro o cinco grupos seleccionados de halógeno, hidroxi, hidroxi protegido, nitro, carboxi, carboxi protegido, carboximetilo, carboximetilo protegido, hidroximetilo , hidroximetilo protegido, aminometilo, aminometilo protegido, o un grupo N-(metilsulfonilamino) . Como con anterioridad, cuando cualquier porción C-C& alquilo o la porción arilo o ambas están disubstituidas, los substituyentes pueden ser iguales o diferentes . Este grupo también puede aparecer como la porción aralquilo substituido de un grupo aralcoxi substituido. Ejemplos del término "aralquilo substituido" y este grupo cuando ocurre en un grupo "aralcoxi substituido" incluyen grupos tales como 2-fenil-l-cloroetilo, 1-fenil-l-clorometilo, 1-fenil-l-bromometilo, 2- (4-metoxifenil) etilo, 2 , 6-dihidroxi-4-fenil (n-hexilo) , 5-ciano-3-metoxi~2-fenilo (n-pentilo) , 3- (2,6-dimetilfenilo) n-propilo, 4-cloro-3-aminobenzilo, 6- (4-metoxifenilo) -3-carboxi (n-hexilo) , 5- (4-aminometilo fenilo) -3- (aminometilo) (n-pentilo), y semejantes. El término "grupo carboxi-protector" como se emplea aqui, se refiere a uno de los derivados éster del grupo de ácido carboxílico comúnmente empleados para bloquear o proteger el grupo de ácido carboxílico mientras que se llevan a cabo reacciones en otros grupos funcionales en el compuesto. Ejemplos de estos grupos protectores de ácido carboxílico incluyen 4-nitrobenzilo, 4-metoxibenzilo, 3 , 4-dimetoxibenzilo, 2,4-dimetoxibenzilo, 2,4,6- trimetoxibenzilo, 2,4,6-trimetilobenzilo, pentametilobenzilo, 3,4-metilendioxibenzilo, benzhidrilo, 4,4'-dimetoxibenzhidrilo, 2,2 ' , , 41 -tetrametoxibenzhidrilo, alquilo tal como t-butilo o t-amilo, tritilo, 4-metoxitritilo, 4 , 41 -dimetoxitritilo, 4, 4', 4"- trimetoxitritilo, 2-fenilprop-2-ilo, trimetilsiloilo, t-butildimetilsiloilo, fenacilo, 2 , 2 , 2-tricloroetilo, beta- (trimetilsiloil) etilo, butilo) metilsiloil) etilo, p- toluensulfoniletilo, 4-nitrobenzilsulfoniletilo, alilo, cinamilo, 1- (trimetilosiloilmetil) prop-1- en -3-ilo, y porciones semejantes. Las especies del grupo carboxi-protector empleado no son críticas siempre que el ácido carboxílico derivatizado sea estable para la condición de la o las reacciones subsecuentes en otras posiciones de la molécula y puede retirarse en el punto apropiado sin interrumpir el resto de la molécula. En particular, es importante no someter una molécula carboxi-protegida a fuertes bases nucleofilicas o condiciones reductivas que emplean catalizadores de metal altamente activados tales como níquel de Raney. (Estas condiciones de remoción árduas también habrán de evitarse cuando se retiran grupos amino-protectores y grupos hidroxi-protectores discutidos a continuación) . Grupos protectores de ácido carboxílico preferidos son los grupos alilo y p-nitrobenzilo . Grupos carboxi-protectores similares empleados en las técnicas de cefalosporina, penicilina y péptido también pueden emplearse para proteger substituyentes del grupo carboxi. Adicionales ejemplos de estos grupos se encuentran en T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2a edición, John Wiloey & Sons, Inc., New York, N.Y., 1991, capitulo 5; E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry" , J. G. W. McOmie, Ed. , Plenum Press, New York, N. Y., 1973, Capítulo 5, y T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiloey and Sons, New York, NY, 1981, Capitulo 5. El término "carboxi protegido" se refiere a un grupo carboxi substituido con uno de los grupos carboxi protectores anteriores . El término "grupo hidroxi-protector" como se emplea aquí, se refiere a un derivado del grupo hidroxi comúnmente empleado para bloquear o proteger el grupo hidroxi mientras que las reacciones se llevan a cabo en otros grupos funcionales en el compuesto. Ejemplos de estos grupos protectores incluyen grupos tetrahidropiraniloxi , acetoxi, carbamoiloxi , trifluoro, cloro, carboxi, bromo y yodo. Adicionales ejemplos de estos grupos se encuentran en T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2a edición, John Wiloey & Sons, Inc., New York, NY, 1991, Capítulos 2-3; E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry", J. G. W. McOmie, Ed. , Plenum Press, New York, NY, 1973, Capítulo 5, y T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiloey and Sons, New York, NY, 1981 El término "hidroxi protegido" se refiere a un grupo hidroxi substituido con uno de los grupos hidroxi-protectores anteriores . El término "grupo amino-protector" como se emplea aquí, se refiere a un derivado de los grupos comúnmente empleados para bloquear o proteger un grupo amino mientras que las reacciones se llevan a cabo en otros grupos funcionales en el compuesto. Ejemplos de estos grupos protectores incluyen grupos carbamatos, amidas, alquilo y arilo, iminas, asi como muchos derivados de N-heteroátomo que pueden retirarse para regenerar el grupo amina deseado. Adicionales ejemplos de estos grupos se encuentran en T. W. Greene y P. G. M. Wuts , "Protective Groups in Organic Synthesis", 2a edición, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, Capítulo 7; E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry" , J. G. W. McOmie, Ed. , Plenum Press, New York, NY, 1973, Capítulo 5, y T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, NY, 1981. El término "amino protegido" se refiere a un grupo amino substituido con uno de los grupos amino-protectores anteriores . Los términos "grupo heterocíclico" , "heterocíclico" , "heterociclilo" , o "heterociclo" solos y cuando se emplean como una porción en un grupo complejo tal como un grupo heterocicloalquilo, se emplean en forma intercambiable y se refieren a cualquier anillo mono-, bi-, o tricíclico saturado o no aromáticamente insaturado que tiene el número de átomos designados en general de 3 a aproximadamente 10 átomos de anillo, en donde los átomos de anillo son átomos de carbono y 1, 2, 3 o 4 nitrógeno, azufre u oxígeno. Típicamente, un anillo de 5-miembros tiene 0 a 2 dobles enlaces y un anillo de 6- o 7-miembros tiene 0 a 3 dobles enlaces y los heteroátomos de nitrógeno o azufre pueden opcionalmente estar oxidados, y cualquier eteroátomo de nitrógeno puede estar cuaternizado opcionalmente. Ejemplos incluyen morfolinilo, pirrolidinilo, oxiranilo, oxetañilo, tetra idrofuranilo, 2 , 3-dihidrofuranilo, 2H-piranilo, tetrahidropiranilo, tiiranilo, tietanilo, tetrahidrotietanilo, aziridinilo, azetidinilo, l-metil-2-pirrolilo, piperidinilo, y 3,4,5,6-tetrahidropiperidinilo . Un grupo preferido es el grupo morfolinilo. Un grupo "heterocicloalquilo" o un "heterocicloalquenilo" es un grupo heterociclo como se definió anteriormente, ligado covalentemente a un grupo-alquilo o alquenilo como se definió con anterioridad. A menos que de otra forma se especifique, "heteroarilo" solo y cuando se emplea como una porción en un grupo complejo tal como un grupo eteroaralquilo, se refiere a un sistema de anillo aromático mono-, bi-, o tric clico que tiene un número de átomos designados en donde al menos un anillo es un anillo de 5- , 6- o 7-miembros que contiene de uno a cuatro heteroátomos seleccionados del grupo de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y de preferencia al menos un heteroátomo es nitrógeno {Lang Hybook of Chemistry, supra) . Se incluye la definición cualesquiera grupos bicíclicos en donde cualquiera de los anillos heteroarilo anteriores se fusionan a un anillo benceno. Heteroarilos en donde nitrógeno u oxígeno es el heteroátomo, se prefieren. Los siguientes sistemas de anillo son ejemplos de los grupos heteroarilo (ya sea substituidos o sin substituir) denotados por el término "heteroarilo" : tienilo, furilo, imidazolilo, pirazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tetrazolilo, tiatriazolilo, oxatriazolilo, piridilo, pirimidilo, pirazinilo, piridazinilo, tiazinilo, oxazinilo, triazinilo, tiadiazinilo, oxadiazinilo, ditiazinilo, dioxazinilo, oxatiazinilo, tetrazinilo, tiatriazinilo, oxatriazinilo, ditiadiazinilo, imidazolinilo, dihidropirimidilo, tetrahidropirimidilo, tetrazolo [1 , 5-b] iridazinilo purinilo, así como derivados benzo fusionados, por ejemplo benzoxazolilo, benzofurilo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, benzotriazolilo, benzoimidazolilo e indolilo . Sistemas de anillo de 5 miembros heterocíclicos que contienen un átomo de azufre u oxígeno y uno a tres átomos de nitrógeno también son adecuados para utilizar en la presente invención. Ejemplos de estos grupos preferidos incluyen tiazolilo, en particular tiazol-2-ilo y tiazol-2-ilo N-oxide, tiadiazolilo, en particular 1, 3 , 4-tiadiazol-5-ilo y 1,2,4- tiadiazol-5-ilo, oxazolilo, de preferencia oxazol-2-ilo, y oxadiazolilo, tales como 1 , 3 , 4-oxadiazol-5-ilo, y 1,2,4- oxadiazol-5-ilo. Un grupo de ejemplos preferidos adicionales de sistemas de anillo de 5 miembros con dos a cuatro átomos de nitrógeno incluyen imidazolilo, de preferencia imidazol-2-ilo; triazolilo, de preferencia 1 , 3 , 4-triazol-5-ilo; 1, 2, 3-triazol-5-ilo, 1 , 2 , -triazol-5-ilo, y tetrazolilo, de preferencia lH-tetrazol-5-ilo . Un grupo preferido de ejemplos de derivados benzo fusionados son benzoxazol-2 -ilo, benztiazol-2-ilo y benzimidazol-2-ilo. Adicionales ejemplos específicos convenientes de los sistemas de anillo heterocíclicos anteriores son sistemas de anillo de 6 miembros que contienen de 1 a 3 átomos de nitrógeno y opcionalmente un átomo de azufre u oxígeno. Estos ejemplos incluyen piridilo tales como pirid-2-ilo, pirid-3-ilo, y pirid-4-ilo; pirimidilo, de preferencia pirimid-2-ilo y pirimid-4-ilo; triazinilo, de preferencia 1 , 3 , 4-triazin-2-ilo y 1 , , 5-triazin-4-ilo; piridazinilo, en particular piridazin-3-ilo, y pirazinilo. Los piridina N-óxidos y piridazina N-óxidos y los grupos piridilo, pirimid-2-ilo, pirimid-4-ilo, piridazinilo y 1 , 3 , 4-triazin-2-ilo son un grupo preferido. Los substituyentes para los sistemas de anillo heterociclico opcionalmente substituido y adicionales ejemplos de los sistemas de anillos de 5 a 6 miembros anteriormente discutidos pueden encontrarse en W. Druckheimer y colaboradores, Patente de los E.U.A. No. 4, 278, 793. Un grupo particularmente preferido de "heteroarilo" incluye; sal de sodio 1, 3-tiazol-2-ilo, 4- (carboximetil) -5-metilo-l, 3-tiazol-2-ilo, 4- (carboximetil) -5-metilo-l, 3-tiazol-2-ilo, 1,2,4-tiadiazol-5-ilo, 3- metilo-1 , 2 , 4-tiadiazol-5-ilo, 1,3,4-triazol-5-ilo, 2 -metilo-1 , 3 , 4-triazol-5-ilo, 2-hidroxi-1, 3 , 4-triazol-5-ilo, sal de sodio 2-carboxi-4-metilo-1,3, 4-triazol-5-ilo, 2-carboxi-4-metilo-1 , 3 , 4-triazol-5-ilo, 1 , 3-oxazol-2-ilo, 1 , 3 , 4-oxadiazol-5-ilo, 2-metilo-1 , 3 , 4-oxadiazol-5-ilo, 2- (hidroximetilo) -1, 3 , 4-oxadiazol-5-ilo, 1,2,4- oxadiazol-5-ilo, 1 , 3 , 4-tiadiazol-5-ilo, 2-tiol-l , 3 , 4-tiadiazol-5-ilo, 2 - (metilotio) -1 , 3 , 4-tiadiazol-5-ilo, 2-amino-l, 3 , -tiadiazol-5-ilo, 1H- tetrazol-5-ilo, l-metilo-lH-tetrazol-5-ilo, 1- (1- (dimetilamino) eth-2-ilo) -lH-tetrazol-5-ilo, sal sodio de 1- (carboximetil) -lH-tetrazol-5-ilo, 1- (ácido metilsulfonico) -lH-tetrazol-5-ilo, 1- (ácido metilsulfonico) -1H-tetrazol-5-il sal sodio, 2-metilo-lH-tetrazol-5-ilo , 1 , 2 , 3-triazol-5-ilo, 1-metilo-1 , 2,3-triazol-5-ilo, 2-metilo-l , 2 , 3-triazol-5-ilo, 4-metilo-1,2,3- triazol-5-ilo, pirid-2-ilo N-óxido, 6-metoxi-2- (n-óxido) -piridaz-3-ilo, 6-hidroxipiridaz-3-ilo, 1-metilopirid-2-ilo, l-metilopirid-4-ilo, 2-hidroxipirimid-4-ilo, 1,4,5, 6-tetrahidro-5 , 6-dioxo-4-metilo-as-triazin-3-ilo, 1,4,5, 6-tetra idro-4- (formilmetilo) -5, 6-dioxo-as-triazin-3-ilo, sal 2 , 5-dihidro-5-oxo~6-hidroxi-astriazin-3-il sodio-, sal 2 , 5-di idro-5-oxo-6-hidroxi-as-triazin-3-il sodio, sal 2 , 5-dihidro-5-oxo-6- idroxi-2-metilo-astriazin-3-il sodio, 2 , 5-dihidro-5-oxo-6-hidroxi-2 -metilo-as-triazin-3-ilo, 2 , 5-di idro-5-oxo-6-metoxi-2-metilo-as-triazin-3-ilo, 2 , 5-dihidro-5-oxo-as-triazin-3-ilo, 2 , 5-dihidro-5-oxo-2-metilo-as-triazin-3-ilo, 2,5-dihidro-5-oxo-2 , 6-dimetilo-as-triazin-3-ilo, tetrazolo [1, 5-b] piridazin-6-il y 8-aminotetrazolo [1 , 5-b] -piridazin-6-il . Un grupo alterno de "heteroarilo" incluye: 4-(carboximetil) -5-metil-l , 3-tiazol-2-ilo, sal 4- (carboximetil) -5-metil-l , 3-tiazol-2-il sodio, 1,3,4- triazol-5-ilo, 2-metilo-l , 3 , 4-triazol-5-ilo, 1?-tetrazol-5-ilo, l-metilo-lH-tetrazol-5-ilo, 1- (1- (dimetilamino) et-2-ilo) -lH-tetrazol-5-ilo, lH-tetrazol-5-ilo, sal 1- (carboximetil) -lH-tetrazol-5-ilo, 1- (ácido metilsulfónico) -lH-tetrazol-5-ilo, sal 1- (ácido metilsulfónico) - IH-tetrazol-5-il sodio, 1 , 2 , 3-triazol-5-ilo, 1 , 4 , 5 , 6-tetrahidro-5 , 6-dioxo-4- metilo-as-triazin-3-ilo, 1,4,5, 6-tetrahidro-4- (2-formilmetilo) -5, 6-dioxo-as-triazin-3-ilo, sal 2 , 5-dihidro-5-oxo-6- hidroxi-2-metilo-as-triazin-3-il sodio, 2 , 5-dihidro-5-oxo-6- idroxi-2-metilo-as-triazin-3-ilo, tetrazolo [1, 5-b] piridazin-6-ilo, y 8-aminotetrazolo [1, 5-b]piridazin-6-ilo. El término "inferior" cuando se emplea con un término tal como alquilo para formar "alquilo inferior", por ejemplo, significa que contiene de 1 a 6 átomos de carbono . "Sales farmacéuticamente aceptables" incluyen tanto sales de adición de ácido, como base. "Sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que retienen la efectividad biológica y propiedades de las bases libres y que no son biológicamente o de otra forma indeseables, formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido hidroclorhidrico (* en inglés dice hydrochloric acid) , ácido hidrobrorimico (*en inglés dice hydrobromic acid) , ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido carbónico, ácido fosfórico y semejantes y ácidos orgánicos pueden seleccionarse de las clases alifáticas y polifásica aromática, aralifática, heterocíclica, carboxílica y sulfónica de ácidos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido glucónico, ácido láctico, ácido pirilico, ácido oxálico, ácido málico, ácido maleico, ácido maloneico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido aspártico, ácido ascórbico, ácido glutámico, ácido antranilico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandemico, ácido embonico, ácido fenilacético, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido salicíclico y semejantes. "Sales de adición de base farmacéuticamente aceptables" incluyen aquellas derivadas de bases inorgánicas tales como sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, sales de aluminio y semejantes. Se prefieren particularmente las sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio. Sales derivadas de bases no tóxicas orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primaria, secundarias y terciarias, aminas substituidas incluyendo aminas substituidas de origen natural, aminas cíclicas y resinas de intercambio de iones básicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dietilaminoetanol , trimetamina, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaina, etiloendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperizina, piperidina, N-etilopiperidina, resinas* (en el dictado dices que todas empiezan con resina) poliamina y semejantes. Bases no tóxicas orgánicas particularmente preferidas son isopropiloamina, dietilamina, etanolamina, trimetamina, diciclohexilamina, colina, y cafeína, b. Antagonista de Alfa4 Integrina - Fórmula I, II, y III Antagonistas de molécula pequeña de alfa4 integrinas útiles en los métodos de la invención incluyen compuestos de la fórmula I, II, o III y como se describe en WO 01/21584: m en donde Z es H o alquilo inferior; A puede tener la estructura: o VII en donde B es cianoalquilo, un carbociclo o un heterociclo opcionalmente substituido con uno o más substituyentes Rx; q es 0-3; Rlt R2 , R3 , R4 , Rs y R6 independendientemente son hidrógeno, alquilo, amino, alquiloamino, dialquiloamino, nitro, urea, ciano, tio, alquilotio, hidroxi, alcoxi, alcoxialquilo, alcoxicarbonilo, alcoxicarboniloamino, arilooxicarbonilamino, alquilosulfimilo, sulfonilo, alquilosulfonilo, aralquilosulfonilo, arilosulfonilo, heteroarilsulfonilo, alcanoilo, alcanoilamino, cicloalcanoilamino, arilo, arilalquilo, halógeno, o alquilfosfonilo, y Rx, R2, R3, R4 y Rs están substituidos con 0 a 3 substituyentes seleccionados del grupo que consiste de hidroxi, carboxi, alcoxi carbonilo inferior, alquilo inferior, nitro, oxo, ciano, carbociclilo, heterociclilo, heteroarilo, alquiltio inferior, alcoxi inferior, alquiloamino inferior, - aleanoilamino inferior, alquilosulfinilo inferior, sulfonilo inferior, alquilsulfonilo inferior, alcanoilo inferior, arilo, aroilo, heterociclilcarbonilo, halógeno y alquilfosfonilo; o dos de Rx a Rs juntos forman un anillo carbociclo o heterociclico; Y es H, alcoxi, alcoxialcoxi , arilooxi, alquilamino alcoxi, dialquilaminoalcoxi , alquilamino, arilamino, heterociclilo o heteroarilalquilo, en donde cada uno de los anteriores puede estar substituido o sin substituir; x es H, C(0)OR, C(0)R, C(0)SR, R, Ra y Rb, individualmente son hidrógeno o alquilo, alcoxi, arilo, heterociclilo, heteroarilo, substituidos con 0 a 4 substituyentes seleccionados del grupo que consiste de halógeno, hidroxi, amino, carboxilo, nitro, ciano, heterociclilo, heteroarilo, arilo, aroilo, arilooxi, aralquilo, aralquilooxi , arilooxicarbonilo, aralquilooxicarbonilo, alquilendioxi , alcoxicarbonilo inferior, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, alquiltio inferior, alcoxi inferior, alquilamino inferior, alquilsulfinilo inferior, sulfonilo inferior, alquilsulfonilo inferior, alcanoilo inferior, alquilfosfonilo inferior, aminosulfonilo alquilo inferior, hidroxi alquilo inferior, alquilsulfinilo alquilo inferior, alquilsulfonilo alquilo inferior, alquiltio -alquilo inferior, heteroariltio alquilo inferior, heteroariloxi alquilo inferior, heteroarilamino alquilo inferior, halo alquilo inferior, y alcoxi alquilo inferior; en donde el heterocíclilo, heteroarilo, arilo, aroilo, ariloxi, aralquil, aralquilooxy, ariloxicarbonilo y aralquiloxicarbonilo está opcionalmente substituido con halógeno, hidroxilo, amino, carboxilo, nitro, ciano, alquilo y alcoxi; y en donde Ra y Rb junto con el nitrógeno al cual se conectan, pueden formar un grupo heterociclilo o heteroarilo substituido con 0 a 5 substituyentes R o Rd; en donde Rd tiene la estructura: en donde X' es un enlazador di alente seleccionado del grupo que consiste de C(0)NRa, C(O) o un enlace; X2 y X3 cada uno ndependientemente hidrógeno, halógeno, hidroxi, amino, carboxilo, nitro-, ciano, o alquilo substituido y sin substituir arilo, heterociclilo, heteroarilo, arilo, aroilo, arilooxi, alquilendioxi, alquilo inferior carbonilamino, alquenilo inferior carbonilamino, aril carbonilamino, arilalquilo carbonilamino, alcoxi inferior carbonilamino, alquilamino inferior carbonilamino, ariloamino carbonilamino, alcoxicarbonilo inferior, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, alquiltio inferior, alcoxi inferior, alquilamino inferior, alquilsulfinilo inferior, sulfonilo inferior, alquilsulfonilo inferior, alcanoilo inferior, alquilfosfonilo inferior, aminosulfonilo alquilo inferior, hidroxi alquilo inferior, alquilsulfinilo alquilo inferior, alquilsulfonilo alquilo inferior, alquiltio alquilo inferior, heteroariltio alquilo inferior, heteroariloxi alquilo inferior, heteroarilamino alquilo inferior, halo alquilo inferior, alcoxi alquilo inferior; y en donde X1 y X2 o X3 pueden unirse en conjunto para formar uno o varios anillos heterocíclico o heteroarilo; o X3 y Z juntos forman un anillo heterobicíclico; ?, , X2,, X3, y X4, cada uno independientemente son hidrógeno, halógeno, hidroxi, amino, carboxilo, nitro, ciano, o alquilo substituido y sin substituir alquenilo, alquinilo, ariloalquilo, heterociclilo, heteroarilo, arilo, aroilo, arilooxi, alquilendioxy, alquilo inferior, carboniloamino, alquenilo inferior carbonilamino, arilo carboniloamino, ariloalquil carbonilamino, alcoxi inferior carbonilamino, alquilamino inferior carbonilamino, arilamino carbonilamino, alcoxicarbonilo inferior, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, alquiltio inferior, alcoxi inferior, alquilamino inferior, alquilsulfinilo inferior, sulfonilo inferior, alquilsulfonilo inferior, alcanoilo inferior, alquilfosfonilo inferior, aminosulfonilo alquilo inferior, hidroxi alquilo inferior, alquilsulfinilo alquilo inferior, alquilsulfonilo alquilo inferior, alquiltio alquilo inferior, heteroariltio alquilo inferior, heteroariloxi alquilo inferior, heteroarilamino alquilo inferior, halo alquilo inferior, alcoxi alquilo inferior; o una sal farmacéuticamente aceptable .

Los compuestos de la invención contienen uno o más átomos de carbono asimétricos. De acuerdo con esto, los compuestos pueden existir como diasteriomeros , enantiomeros o sus mezclas. Las síntesis anteriormente descritas pueden emplear racematos, diasteriomeros o enantiomeros como materiales de partida o como intermediarios. Compuestos diasterioméricos pueden separarse por métodos cromatógraficos o de cristalización. Similarmente, mezclas enantioméricas pueden separarse utilizando las mismas técnicas u otras conocidas en la especialidad. Cada uno de los átomos de carbono asimétricos pueden estar en la configuración o S y ambas de estas configuraciones están dentro del alcance de la invención. Compuestos que tienen la configuración S se prefieren. En una modalidad preferida, X1 en la estructura I es C(0)OR, o C(0)SR, de preferencia C (O)NRaRb, con las variables restantes A, Z, Y, X2, X3 y X4 que tienen cualquiera de las definiciones dadas anteriormente . El grupo x de preferencia está en la posición para respecto al punto de conexión del anillo pero también puede de preferencia estar en la posición meta. Ra y Rb junto con el nitrógeno al cual se conectan pueden de preferencia formar un grupo heterociclilo o heteroarilo de 5 o 6 miembros substituidos con 0 a 5 substituyentes R. El sistema de anillo heterociclilo o heteroarilo de preferencia contendrá un átomo de nitrógeno, pero también de preferencia contiene otro átomo de nitrógeno o un oxígeno en el sistema de anillo. Los sistemas de anillo hetero pueden contener anillos heterociclilo o heteroarilos fusionados o una combinación de ambos y los anillos pueden estar substituidos o sin substituir. Ejemplos representativos de grupos heterociclilo y heteroarilo específicos convenientes son: R, Ra y Rb también pueden ser no cíclicos, por ejemplo un hidrógeno o alquilo, arilo, heterociclilo, heteroarilo, substituido con 0 a 4 substituyentes seleccionados del grupo que consiste de halógeno, hidroxi, amino, carboxilo, nitro, ciano, heterocililo, heteroarilo, arilo, aroilo, ariloxy, alquilendioxi, alcoxicarbonilo inferior, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, alquiltio inferior, alcoxi inferior, alquilamino inferior, alquilsulfonilo inferior, sulfonilo inferior, alquilsulfonilo inferior, alcanoilo inferior, alquilfosfonilo inferior, aminosulfonilo alquilo inferior, hidroxi alquilo inferior, alquilsulfinilo alquilo inferior, alquilsulfonilo alquilo inferior, alquiltio alquilo inferior, heteroariltio alquilo inferior, heteroariloxi alquilo inferior, heteroarilamino alquilo inferior, halo alquilo inferior, alcoxi alquilo inferior; opcionalmente substituidos como se describió anteriormente . Grupos preferidos son substituido y sin substituir, alquilo inferior, alquenilo, arilo, y aril alquilo inferior. Algunos ejemplos representativos de estos grupos R, Ra y Rb se muestran a continuación: En una modalidad preferida, A puede tener estructura (IX) en donde de preferencia R17 Rs, o ambas Rx y R5 no son hidrógeno. Esto es, grupos A preferidos son grupos benzoilo orto substituidos . Substiyentes particularmente preferidos son cloro, bromo, amino e hidroxi . Además de Rx y/o Rs, el anillo fenilo del benzoilo puede de preferencia tener uno o dos substituyentes adicionales en R2, R3 o R4. Rx, R2, R3 R4, y Rs preferidos incluyen nitro, halógeno (Cl, Br, F, I) , amino, arilo, alquilo inferior, alquiltio inferior, alcoxi inferior, alquilamino inferior, alquilo inferior sulfinilo, alquilsulfonilo inferior, alcanoilo inferior y alquilfosfonilo inferior, cada uno de los cuales puede estar substituido o sin substituir . Algunos ejemplos representativos de la estructura A (IX) incluyen: Y de preferencia OH o un éster o su sal de ácido carboxilico farmacéuticamente aceptable. Esteres preferidos son substituidos o sin substituir alquilo, alquenilo, arilo y arilo alquil ésteres . Z de preferencia es hidrógeno. X2, X3 y X4 preferidos incluyen halógeno, alquilo, amino, alquilamino, y alquil carbonilamino, el grupo alquilo de los cuales puede estar substituido o sin substituir. Para compuestos que tienen la estructura I, X2 y X3 son más preferiblemente hidrógeno. Para compuestos que tienen la estructura II, X2, X3 y X4 son de preferencia hidrógeno. En una modalidad particular, Xx de las Fórmulas I, II, o III, pueden ser cualquiera de los grupos mostrados en la Tabla 1 a continuación, que se designa como substituyente R cuando se combina con el carbonilo del cual depende. En una modalidad particular, A es cualquiera de los grupos mostrados en la Tabla 1 que se designa como substituyente R' . c. Compuestos Preferidos de la Fórmula X Antagonistas de alfa4 integrina específicos incluyen aquellos de la fórmula X siguiente, que tienen los substituyentes R y R' mostrados en las Tablas 1 y 2, asi como los compuestos específicos mostrados en la Tabla 3.

Tabla 1. Substituyentes R y R' de la Formula X Otros antagonistas de alfa4 integrina molécula pequeña incluyen aquellos citados en siguiente tabla. Tabla 2. d. Antagonista de Alfa4 Integrina específico de Pequeñas Moléculas Compuestos particulares y representativos para antagonistas de alfa4 integrina específico de pequeñas moléculas se citan en la siguiente Tabla 3 : Tabla 3.

D. AlfaL integrina . El término "alfaL integrina" cuando se emplea aquí, se refiere a un heterodímero que comprende una sub-unidad alfaL y una sub-unidad beta. Un ejemplo de una alfaL integrina que contiene sub-unidades alfaLbeta2 (LFA-1 o LFA-1 integrina). Ejemplos de las actividades biológicas de una alfaL integrina incluye cualquiera o combinación de las siguientes actividades: (1) enlace con un ligando de LFA-1 (por ejemplo cualquiera de CD54 (ICAM-1) , CD102 (ICAM-2), CD50 (ICAM-3), CD242 (ICAM-4) , y ICAM-5 (teleencefaliña) y (2) promover la conexión de linfocitos B a un órgano o a células de bazo inmovilizadas o células de nodo linfático. 1. Ligandos de AlfaL Integrina De acuerdo con una modalidad, el ligando de alfaLbeta2 (LFA-1) es ICAM-1 (CD-54) . Un ejemplo de una secuencia de polipéptido ICAM-1 humano (CD-54) se ilustra a continuación (Número de acceso SWISSPROT P05362) . 1 mapssprpal pallvllgal fpgpgnaqts vspskvilpr ggsvlvtcst scdqpkllgi 61 etplpkkell Ipgnnrkvye lsnvqedsqp mcysncpdgq staktfltvy wtpervelap 121 lpswqpvgkn ltlrcqvegg apranltwl lrgekelkre pavgepaevt ttvlvrrdhh 181 ganfscrtel dlrpqglelf entsapyqlq tfvlpatppq lvsprvlevd tqgtwcsld 241 glfpvseaqv hlalgdqrln ptvtygndsf sakasvsvta edegtqrltc avilgnqsqe 301 tlqtvtiysf papnviltkp evsegtevtv kceahprakv tlngvpaqpl gpraqlllka 361 tpedngrsfs csatlevagq lihknqtrel rvlygprlde rdcpgnwt p ensqqtpmcq 421 awgnplpelk clkdgtfplp igesvtvtrd legtylcrar stqgevtrev tvnvlsprye 481 iviitwaaa vimgtaglst ylynrqrkik kyrlqqaqkg tpmkpntqat pp [SEQ ID NO: 22] Los residuos 1 a 27 comprenden una secuencia de señal, los residuos 28 a 480 comprenden un dominio extracelular, los residuos 481 a 503 comprenden un dominio de transmembrana y los residuos 504 a 542 comprenden un dominio citoplásmico . De acuerdo con una modalidad, el ligando de alfaL integrina, por ejemplo, alfaLbeta2 (LFA-1) es ICAM-2 (CD-102) . Un ejemplo de una secuencia de polipéptidos ICAM-2 humana (CD-102) se muestra a continuación (Número de Acceso Genbank CAG46633, Número de Acceso EMBL CR541834.1) 1 mssfgyrtlt valftliccp gsdekvfevh vrpkklavep kgslevncst tcnqpevggl 61 etsldkilld egaqwkhylv snishdtvlq chftcsgkqe smnsnvsvyq pprqviltlq 121 ptlvavgksf tiecrvptve pldsltlflf rgnetlhyet fgkaapapqe atatfnstad 181 redghrnfsc lavldlmsrg gnifhkhsap kmleiyepvs dsgmviivtv vsvllslfvt 241 svllcfifgq hlrqqrmgty gvraawrrlp qafrp [SEQ ID NO: 23] Los residuos 1 a 21 comprenden una secuencia de señal, los residuos 22 a 224 comprenden un dominio extracelular, los residuos 224 a 248 comprenden un dominio de transmembrana y los residuos 249 a 275 comprenden un dominio citoplásmico . De acuerdo con una modalidad, el ligando de alfaL integrina, por ejemplo alfaLbeta2 (LFA-1) es ICAM-3 (CD-50) . Un ejemplo de una secuencia polipéptido ICAM-3 humana (CD-50) se muestra a continuación (Número de acceso SWISSPROT P32942) . 1 matmvpsvlw pracwtllvc clltpgvqgq efllrvepqn pvlsaggslf vncstdcpss 61 ekialetsls kelvasgmgw aafnlsnvtg nsrilcsvyc ngsqitgssn itvyglperv 121 elaplppwqp vgqnftlrcq veggsprtsl twllrweee lsrqpaveep aevtatvlas 181 rddhgapfsc rteldmqpqg lglfvntsap rqlrtfvlpv tpprlvaprf levetswpvd 241 ctldglfpas eaqvylalgdqmlnatvmnh gdtltatata taradqegar eivcnvtlgg 301 errearenlt vfsflgpivn lseptahegs tvtvscmaga rvqvtldgvp aaapgqpaql 361 qlnatesddg rsffcsatle vdgeflhrns svqlrvlygp kidratcpqh Ikwkdktrhv 421 Iqcqargnpy pelrclkegs srevpvgipf fvnvthngty qcqasssrgk ytlwvmdie 481 agsshfvpvf vavlltlgw tivlalmyvf rehqrsgsyh vreestylpl tsmqpteamg 541 eepsrae [SEQ ID NO: 24] Los residuos 1 a 29 comprenden una secuencia de señal, los residuos 30 a 485 comprenden un dominio extracelular, los residuos 486 a 510 comprenden un dominio transmembrana y los residuos 511 a 547 comprenden un dominio citoplásmico . De acuerdo con una modalidad, el ligando de alfaL integrina, por ejemplo alfaLbeta2 (LFA-1) es ICAM-4. Un ejemplo de una secuencia de polipéptidos ICAM-4 humana se muestra a continuación (Número de acceso SWISSP OT Q14773) . 1 mgslfplsll fflaaaypgv gsalgrrtkr aqspkgspla psgtsvpfwv rmspef a q 61 pgksvqlncs nscpqpqnss Irtplrqgkt Irgpgwvsyq lldvrawssl a clvtcagk 121 trwatsrita ykpphsvile ppvlkgrkyt lrchvtq fp vgylwtlrh gsrviysesl 181 erftgldlan vtltyefaag prdfwqpvic harlnldglv vrnssapitl mlawspapta 241 lasgsiaalv gilltvgaay lckclamksq a [SEQ ID NO: 25] Los residuos 1 a 22 comprenden una secuencia de señal, los residuos 23 a 240 comprenden un dominio extracelular, los residuos 241 a 261 comprenden un dominio transmembrana y los residuos 262 a 271 comprenden un dominio citoplásmico . De acuerdo con una modalidad, el ligando de alfaL integrina, por ejemplo alfaLbeta2 (LFA-1) es ICAM-5. Un ejemplo de una secuencia de polipéptidos ICAM-5 humana se muestra a continuación (Número de acceso SWISSPROT Q9UMF0) . 1 mpgpspglrr allglwaalg lglfglsavs qepfwadlqp rvafverggs lwlncstncp 61 rpergglets lrrngtqrgl rwlarqlvdi repetqpvcf frcarrtlqa rglirtfqrp 121 drvelmplpp wqpvgenftl scrvpgagpr asltltllrg aqelirrsfa gepprargav 181 ltatvlarre dhganfscra eldlrphglg lfenssapre Irtfslspda prlaaprlle 241 vgserpvsct Idglfpasea rvylalgdqn lspdvtlegd afvatatata saeqegarql 301 vcnvtlggen retrenvtiy sfpaplltls epsvsegqmv tvtcaagaqa Ivtlegvpaa 361 vpgqpaqlql natenddrrs ffcdatldvd getliknrsa elrvlyaprl ddsdcprswt 421 wpegpeqtlr ceargnpeps vhcarsdgga vlalgllgpv tralsgtyrc kaandqgeav 481 kdvtltveya paldsvgcpe ritwlegtea slscvahgvp ppdvicvrsg elgaviegll 541 rvarehagty rceatnprgs aaknvavtve ygprfeepsc psnwtwvegs grlfscevdg 601 kpqpsvkcvg sggttegvll plappdpspr apriprvlap giyvcnat r hgsvaktwv 661 saesppemde stcpshqtwl egaeasalac aargrpspgv rcsregipwp eqqrvsreda 721 gtyhcvatna hgtdsrtvtv gveyrpwae laasppggvr pggnftltcr aeawppaqis 781 wrappralni glssnnstls vagamgshgg eyecartnah grharrxtvr vagpwlwvav 841 ggaaggaall aagaglafyv qstackkgey nvqeaessge avclngaggg aggaagaegg 901 peaaggaaes paegevfaxq ltsa [SEQ ID NO: 26] Los residuos 1 a 31 comprenden una secuencia de señal, los residuos 32 a 835 comprenden un dominio extracelular, los residuos 836 a 856 comprenden un dominio de transmembrana y los residuos 857 a 924 comprenden un dominio citoplásmico . 2. Antagonista de AlfaL integrina. El término "antagonista alfaL integrina" como se emplea aquí, se emplea en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea en forma parcial o completa una actividad biológica de una alfaL integrina. De acuerdo con una modalidad, un antagonista de alfaL integrina bloquea de forma parcial o completa la interacción entre una alfa integrina y su ligando y cualquiera o combinación de los siguientes eventos: (1) promueve la circulación de linfocitos B en mamíferos y (2) bloquea parcial o completamente, inhibe o neutraliza la señalización de alfaL integrina de secuencia nativa. De acuerdo con la modalidad, el antagonista de alfaL integrina inhibe la conexión de célula B al bazo o a los nodos linfáticos. En una modalidad más específica, el antagonista de alfaL integrina inhibe conexión de célula B a la zona marginal y/o el centro germinal del bazo y nodos linfáticos. Antagonistas de al¡ integrina y a4 integrina pueden emplearse solos o emplearse en conjunto, simultánea o secuencialmente para promover la circulación de linfocitos B en mamíferos . En una modalidad, antagonistas diferentes de l¡ integrina y ce 4 integrina pueden emplearse solos o emplearse en conjunto simultánea o secuencialmente para promover la circulación de linfocitos B en mamíferos . El antagonista puede ligar a la aL integrina, a las sub-unidad l¡ o a un ligando de a L integrina . Adecuados antagonistas de al¡ integrina incluyen cualquier compuesto que inhibe la interacción de aL integrina y un ligando, tal como ICAM-1 (CD-54) . El antagonista de alfaL integrina puede ser una pequeña molécula, péptido, proteína inmunodhesina, un anti-alfaL anticuerpo o un fragmento de los mismos, por ejemplo y puede ser por ejemplo un antagonista de alfaLbeta2 (LFA-1) . Estos términos se refieren a antagonistas dirigidos contra ya sea la sub-unidad alfaL (CDlla) o la sub-unidad beta, por ejemplo beta2 (CD18) o ambos. De preferencia, el antagonista se dirige a o liga a la sub-unidad alfaL (CD11 a) o a la alfaL integrina como una unidad. 3. Antagonistas de anticuerpo de alfaL integrina. El alfaL antagonista puede ser un anticuerpo que liga alfaL integrina, la solubilidad alfaL o enlaza un ligando de la alfaL integrina, por ejemplo. Anticuerpos que ligan la sub-unidad alfaL (CDlla) incluyen por ejemplo el anticuerpo MHM24 (Hildreth et al., 1983, Eur. J. Iminunol . 13:202-208), el anticuerpo IgGl R3.1 (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals , Inc., Ridgefield, CT) , 25-3 (o 25.3), un IgGl disponible de Immunotech, Francia, como se cita en Olive et al., 1986, In: Feldmann, ed. , Human T cell Clones. A new Approach a Immune Regulation, Clifton, NJ, Humana, p. 173), KBA (IgG2a) (Nishimura et al., 1987, Cell. Immunol. 107:32; Nishimura et al., 1985, ibid. 94:122), 7/15 (IgG2b) (Springer et al., 1982, Immunol. Rev. 68:171), IOT16 (Vermot Desroches et al., 1991, Scand J. Imniunol. 33:277-286), SPVL7 (Vermot Desroches et al., supra) , y MI7/4 (IgG2a) , disponible de ATCC con número de acceso de hibridoma TIB-217. Un anticuerpo anti-CDUA preferido es el anticuerpo humanizado efalizumab, (Raptiva^; Genentech, CA) . Otros anticuerpos anti-CDUA preferidos incluyen los anticuerpos humanizados descritos en la patente de los EUA número 6,037,454. También en general se prefiere que los anticuerpos anti-CDUA no son anticuerpos que agotan células T, esto es, que la administración del anticuerpo anti-CDUA no reduce el nivel de células T en circulación. En una modalidad, el anticuerpo anti-CDUA humanizado es aquel que comprende la secuencia VL de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTIS YLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSG VPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO. 49) , y La secuencia VH de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGHWMISnWRQAPGKGLEWVGMIHPSDSE TRYNQKF DRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIYFYGTTYFDYWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO. 50); o En otra modalidad, el anticuerpo anti-CDllA es aquel que comprende la secuencia MHM24 VL. DVQITQSPSYLAASPGETISINCRASKTISKYLA YQEKPGKTN LLIYSGSTLQSG IPSRFSGSGSGTDF TLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPLTFGTGTKLEL (SEQ ID NO. 51) , y La secuencia MHM2 VH EVQLQQPGAELMRPGASVKLSCKASGYSFTGHWMNWVRQRPGQGLEWIGMIHPSDSE TRLNQKFKDKATLTVDKSSSSAYMQLSSPTSEDSAVYYCARGIYFYGTTYFDYWGQG TTLTVSS (SEQ ID NO. 52) Ejemplos de anticuerpos que ligan la sub-unidad beta incluyen anticuerpos anti-CD 18 tales como MHM23 (Hildreth et al., supra) , MI8/2 (IgG2a) (Sanches-Madrid et al., 1983, J. Exp. Med. 158: 586), H52 (Fekete et al., 1990, J. Clin. Lab Immunol . 31:145-149), Masl91c (Vermot Desroches et al., supra), IOT18 (Vermot Desroches et al., supra), 60.3 (Taylor et al., 1988, Clin. Exp. Immunol. 71:324-328), and 60.1 (Campana et al., 1986, Eur. J. Immunol. 16: 537-542) . Ver también la patente de los EUA número 5,997,867. Otros ejemplos de moléculas de enlace alfaLbeta2 (LFA-1) convenientes incluyendo anticuerpos, se describen por ejemplo en Hutchings et al., supra., W098/51343, WO 91/18011, WO 91/16928, WO 91/16927, sulicitud de patente canadiense 2,008,368, WO 90/15076, WO 90/10652, WO 90/13281, WO 93/06864, WO 93/21953, EP 387,668, EP 379,904, EP 346,078, Patente de los E.U.A. No. 5,932,448, Patente de los E.U.A. No. 5,622,700, Patente de los E.U.A. No. 5,597,567, Patente de los E.U.A. No. 5,071,964, Patente de los E.U.A. No. 5,002,869, Patente de los E.U.A. No. 5,730,983, solicitud de patente australiana 8815518, FR 2700471A, EP 289,949, EP 362526, y EP 303,692. Antagonistas alfaLbeta2 (LFA-1) también incluyen anticuerpos que inhiben la interacción de alfaLbeta2 (LFA-1) y su receptor, incluyendo por ejemplo anticuerpos contra uno o más de ICAM-1, ICAM-2, ICAM- 3, ICAM-4, y ICAM-5. Estos anticuerpos están comercialmente disponibles, por ejemplo los anticuerpos anti-ICAM-l (enlimomab) (BIRR-1) y 1A6 disponib-le de Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals (Ridgefield, CT) y Perlan Therapeutics Inc., (San Diego, CA) , respectivamente; y el .anticuerpo anti-ICAM-3 ICM3, disponible de (Bothell, WA) . 4. Antagonistas de xnmunoadhesxna de AlfaL integrina. De acuerdo con todavía otra modalidad, el antagonista de integrina es una inmunoadhesina . Un ejemplo de esta inmunoadhesina es aquel que comprende una porción soluble de un ligando de alfaL integrina que liga a alfaL, por ejemplo el dominio de enlace ligando o el dominio extracelular de un ligando de la alfaL integrina tal como ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, ICAM-4, y ICAM 5, por ej emplo . Los dominios de enlace de ligandos ICAM se conocen. ICAM-1 liga a toLFA-1 (CDlla) dentro del dominio 1 (residuos 41-103 de acuerdo con el catálogo de recursos de proteínas universal (UniPort) ) . Ver por ejemplo Bella et al., 1998, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 95: 4140-4145. ICAM-2 liga a LFA-1 (CDlla) y MAC-1 (CDllb) dentro del dominio 1 (residuos 41-98 de acuerdo con UniPort). Ver por ejemplo Bella et al., 1998, supra,-and Hermand et al., 2000, J. Biol . Chem. , 275: 26002-26010. ICAM-3 liga a LFA-1 (CDlla) dentro del dominio 1 (residuos 46-103 de acuerdo con UniPort) y no liga a MAC-1 (CDI Ib). Ver por ejemplo Bella et al., 1998, supra,-and Hermand et al., 2000, supra). ICAM-4 liga a LFA-1 (CDlla) dentro del dominio 1 (residuos 62-124 de acuerdo con UniPort) (Hermand et al., 2000, supra). ICAM-5 liga a toLFA-1 (CDlla) dentro del dominio 1 (residuos 48-130 de acuerdo con UniPort) . Ver por ejemplo Tian et al., 2000, Eur. J. Immunol., 30: 810-818. Los antagonistas de sub-unidad integrina o integrina de la invención incluyen específicamente proteínas en particular anticuerpos y sus fragmentos funcionales, péptidos, inmunoadhesinas y pequeñas moléculas. Los anticuerpos pueden ser humanizados, humanos o formas quiméricas, o un fragmento de estos. 5. Antagonistas de pequeña molécula de alfaL integrina. De acuerdo con una modalidad, el antagonista de alfaL integrina es una molécula pequeña. Ejemplos de moléculas pequeñas que son antagonistas de alfaL integrina incluyen aquellos descritos en las solicitudes PCT publicadas WO 99/49856, y WO 02/059114. De acuerdo con una modalidad, el antagonista es cualquiera de las moléculas pequeñas descritas en WO 02/059114 que tiene la fórmula (IX) como se describe a continuación. De acuerdo con otra modalidad, el antagonista es cualquiera de las moléculas pequeñas descritas en WO 02/059114 e ilustradas en la tabla 4 (es decir compuestos numerados 4, 5, 35, 17, 10, 12, 13, 14, 41, 44, 6, 15, 36, 37, 38, 40, 42, 9, 3 y 51) . a. Fórmula XI Agentes de movilización de célula B también incluyen antagonistas de alfaL integrina incluyendo los compuestos antagonistas alfaL integrina en la fórmula XI: en donde Cy es un carbociclo no aromático o heterociclo opcionalmente substituido con hidroxilo (-0H) , mercapto (-SH) , tioalquilo, halógeno (e.g. F, Cl, Br, I), oxo (=0), tio (=S) , amino, aminoalquilo, amidina (-C( H)-NH2) , guanidina (-NH2-C (NH) -NH2) , nitro, alquilo, alcoxy o acilo; X es una cadena hidrocarburo divalente sustituida opcionalmente con hidroxilo, mercapto, halógeno, amino, aminoalquilo, nitro, oxo o tio e interrumpido opcionalmente N, 0, S, SO o S02; Y es un carbociclo o heterociclo opcionalmente substituido con hidroxilo, mercapto, halógeno, oxo, tio, un hidrocarburo, un hidrocarburo halo-substituido, amino, amidina, guanidina, ciano, nitro, alcoxi o acilo,· L es un enlace o un hidrocarburo divalente que opcionalmente tiene uno o más átomos de carbono reemplazados con N, O, S, SO o S02, opcionalmente substituido con hidroxilo, halógeno, oxo o tio; o tres átomos de carbono del hidrocarburo se reemplazan con un residuo aminoácido; R-L es H, OH, amino, O-carbociclo o alcoxi opcionalmente substituido con amino, un carbociclo o un heterociclo; R2_5 son independientemente H, idroxilo, mercapto, halógeno, ciano, amino, amidina, guanidina, nitro o alcoxi; o R3 y R4 juntos forman un carbociclo fusionado o heterociclo opcionalmente substituido con hidroxilo, halógeno, oxo, tio, amino, amidina, guanidina o alcoxi; R6 es H o una cadena de hidrocarburo opcionalmente substituida con un carbociclo o un heterociclo; y sus sales, solvatos e hidratos; Con la condición de que cuando Y es fenilo, R2, R4 y R5 son H, R3 es Cl y R1 es OH entonces X es diferente a ciclohexilo; O su sal farmacéuticame te aceptable . A, Z, Y, Xlf X2, X3 y X4 son como se definió anteriromente, tanto en general como de preferencia. Cy puede ser un anillo de 3 a 5 miembros . En otra modalidad, Cy puede ser un heterociclo no aromático de 5 o 6 miembros, opcionalmente substituido con hidroxil, mercapto, halógeno (de preferencia F o Cl) oxo, (=0) , tio (=S) , amino, amidina, guanidina, nitro, alquil, o alcoxi. Cy puede ser un heterociclo no aromático de 5 miembros opcionalmente substituido con hidroxilo, oxo, tio, Cl, C1-4 alquil (de preferencia metilo), o Cl-4 alcanoil (de preferencia acetilo, propanoilo o butanoilo) . El heterociclo no aromático puede comprender uno o más heteroátomos (N, O o S) y está opcionalmente substituido con hidroxilo, oxo, mercapto, tio, metilo, acetilo, propanoilo o butilo. En modalidades particulares, el heterociclo no aromático comprende al menos un átomo de nitrógeno que está substituido opcionalmente con metilo o acetilo. En una modalidad particularmente preferida, el heterociclo no aromático se elige de un grupo que consiste de piperidina, piperazina, morfolina, tetrahidrofurano, tetrahidrotiofeno, oxazolidina, tiazolidina opcionalmente sustituido con hidroxi, oxo, mercapto, tio, alquil o alcanoil. En una modalidad más preferida, Cy es un heterociclo no aromático seleccionado del grupo que consiste de tetrahidrofuran-2-ilo, tiazolidina-5-ilo, tiazolidin-2-one-5-ilo, y tiazolidina-2-tione-5-ilo y ciclopropapirrolidina . En otra modalidad preferida Cy es un carbociclo de 3 a 6 miembros opcionalmente substituido con hidroxilo, mercapto, halógeno, oxo, tio, amino, amidina, guanidina, alquil, alcoxi o acilo. En una modalidad particular, el carbocilco está saturado o parcialmente insaturado. En modalidades particulares Cy es un carbociclo seleccionado del grupo que consiste de ciclopropilo, ciclopropenilo, ciclobutilo, ciclobutenilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo y ciclohexenilo . X es un enlazador hidrocarburo divalente C_5 que opcionalmente tiene uno o más átomos de carbono reemplazados con N, 0, S, SO o SOz y opcionalmente está substituido con hidroxilo, mercapto, halógeno, amino, aminoalquilo, nitro, oxo o tio. En una modalidad preferida X tendrá al menos un átomo de carbono . Reemplazos y substituciones pueden formar una porción amida (-NRC(O)- o -C(O)NR-) dentro de la cadena hidrocarburo en cualquiera o ambos extremos . Otras modalidades que incluyen sulfonamida (-NRS02- or -S02NR) , acilo, éter, tioéter y amina. En una modalidad particularmente preferida X es el grupo -CH2-NR6-C (O) - en donde la sub-porción carbonilo -C(0)- es adyacente (es decir, ligada covalentemente) a Cy y R6 es alquilo, es decir metilo y más preferiblemente H. Y es un carbociclo o heterociclo opcionalmente substituido con hidroxilo, mercapto, halógeno, oxo, tio, un hidrocarburo, un hidrocarburo halo-substituido, amino, amidina, guanidina, ciano, nitro, alcoxi o acilo. En una modalidad particular Y es arilo o heteroarilo opcionalmente substituido con halógeno o hidroxilo. En una modalidad particularmente preferida, Y es fenilo furan-2-ilo, thiophene-2-ilo, fenilo substituido con un halógeno (de preferencia Cl) o hidroxilo de preferencia en la posición meta. L es un hidrocarburo divalente que opcionalmente tiene uno o más átomos de carbono reemplazados con N, O, S, SO o S02 y opcionalmente está substituido con hidroxil, halógeno oxo, o thio; o tres átomos de carbono del hidrocarburo se reemplazan con un residuo amino ácido. De preferencia L es menos que 10 átomos de longitud y más preferiblemente 5 o menos y más preferiblemente 5 o 3 átomos de longitud. En modalidades particulares, L se elige del grupo que consiste de -CH=CH-C(0) -NR6-CH2-, -CH2-NR6-C (O) - , -C (O) -NRS-CH2- , CH(OH)- (CH2)2-, - (CH2)2-CH(OH) -, - (CH2) 3- , -C (O) -NR6-CH (R7) -C(0)-NR6-, ~NR6-C(0) -CH(R7) -NR6-C(0) -, -CH (OH) -CH2-0- y -CH (OH) -CF2-CH2- en donde cada R5 es independientemente H o alquilo y R7 es una cadena lateral amino ácido. Cadenas laterales amino ácido preferidas incluyen cadenas laterales que no son de origen natural tales como fenilo o cadenas laterales de origen natural . Cadenas laterales preferidas son aquellas de Phe, Tyr, Ala, Gln y Asn. En una modalidad preferida L es -CH=CH-C (O) -NR6-CH2- en donde la porción -CH=CH- es adyacente (es decir ligada covalentemente) a Y. En otra modalidad preferida, L es - CH2-NR6-C (O) - en donde su porción metileno (-CH2-) está adyacente a Y. Rx es H, OH, amino, O-carbociclo o alkoxi opcionalmente sustituido con amino, un carbociclo o un heterociclo. En una modalidad preferida, Rx es H, fenilo o Cx_4 alkoxy opcionalmente sustituido con un carbociclo tal como fenilo. En una modalidad particular, x es H. En otra modalidad particular R2 es metoxi, etoxi, propiloxi, butiloxi, isobutiloxi, s-butiloxi, t-butiloxi, fenoxi o benziloxi . Todavía en otra modalidad particular Rx es H2. En una modalidad particularmente preferida Rx es etoxi. En otra modalidad particularmente preferida x es isobutiloxi. En otra modalidad particularmente preferida R-L es alkoxi sustituido con amino, por ejemplo 2-aminoetoxi, N-morfolinoetoxi , N, N-dialquiaminoetoxi , hidroxi alkoxi amonio cuaternario (por ejemplo hidroxietoxitrimetilamonio) . R2_s son independientemente H, hidroxilo, mercapto, halógeno, ciano, amino, amidine, guanidine, nitro o alkoxi; o R3 y R4 juntos forman un carbociclo fusionado o heterociclo opcionalmente sustituido con hidroxilo, halógeno, oxo, thio, amino, amidina, guanidina o alkoxi. En una modalidad en particular, R2 y R3 son independientemente H, F, Cl, Br o I . En otra modalidad particular, R4 y Rs son ambos H. En otra modalidad particular, uno de 2 y R3 es un halógeno mientras que el otro es hidrogeno o un halógeno. En una modalidad particularmente preferida, R3 es Cl mientras que R2, R4 y R5 son cada uno H. En otra modalidad particularmente preferida, R2 y R3 son ambos Cl mientras que R4 y Rs son ambos H. R6 es H o una cadena de hidrocarburo opcionalmente sustituida por un carbociclo o un heterociclo. En una modalidad preferida, R6 es H o alquilo, es decir metil, etil, propil, butil, i-butil, s-butil o t-butil. En una modalidad en particular, R6 es H. b. Formulas Preferidas Xla-f En una modalidad preferida, los compuestos de la invención tienen las formulas generales (Xla) - (XIf) en donde Cy, Y, L y Rx_6 son como se definió previamente. En una modalidad particularmente preferida, el átomo de carbono marcado con un asterisco (*) en los compuestos de la formula (IXa) - (IXf ) es quiral . En una modalidad particular, el átomo de carbono tiene una configuración R. En otra modalidad en particular, el átomo de carbono tiene una configuración S. c. Antagonistas de Moléculas Pequeña Alfa L Especifica Moléculas pequeña antagonistas alfa L especificadas incluyen aquellas mostradas en la tabla 4 siguiente . Tabla 4.

E. Agentes de agotamiento de célula B Agentes de agotamiento de células B como se definió anteriormente son moléculas antagonistas que hacen diana en células B mediante marcadores de superficie, o antígenos que resultan en la muerte de las células B en forma directa o indirecta. Estos agentes de agotamiento de células B en general ligan un antígeno o marcador de superficie de célula B. Agentes de agotamiento de células B pueden ser anticuerpos de antígeno de superficie anticélula B, por ejemplo. Ejemplos de estos agentes de agotamiento de células B incluyen anticuerpos anti-CD20, anti-CD22, y anti- CD52 tales como el anticuerpo anti-CD20, natiluzamab. 1. Marcadores de Superficie de célula B y Antígenos Un "marcador de superficie de célula B" o "antígeno de superficie de célula B" como se emplea aquí, es un antígeno expresado en la superficie de una célula B que puede hacerse diana con un antagonista que se liga a él. Marcadores de superficie de célula B ejemplares incluyen marcadores de superficie de leucocitos CD10, CD19, CD20, CD21, CD22 , CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74 , CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83 , CDw84, CD85, y CD86, descritos por ejemplo en The Leukocyte Antigen Facts Book, 2da Edición. 1997, Barclay et al., Editors, Academic Press, Harcourt Brace & Co . , New York. Otros marcadores de superficie de célula B incluyen CD180 (RP105) , FCRH2 (IRTA4) , CD79A (Iga), C79B (Ig/?), células B CR2, CD196 (CCR6) , CD72 (Lyb-2), P2X5, HLA-DOB, CD185 (CXCRS) , CD23 (Fe RII), BR3 , Btig, NAG14 , SLGC16270, FcRHl (IRTA5) , CD307 (IRTA2 ) , ATWD578 , FcRH3 , FcRHl (IRTA1) , FCRH6, CD269 (BCMA) . Un antígeno de superficie de célula B particular es el antígeno "CD20" , una fosfoproteína no glicosilada de 35 kDa, que se encuentra en la superficie del 90% de células B de sangre periférica u órganos linfoides. CD20 se expresa durante el desarrollo temprano de células pre-B y permanece hasta diferenciación de células de plasma. CD20 esta presente en células B normales así como células B malignas. Otros nombres para CD20 en la literatura incluyen "antígeno de restricción de linfocito B" , "Bl", y "Bp35" . El antigeno CD20 se describe por Clark et al., 1985, PNAS (USA) 82:1766, por ejemplo. La secuencia de amino ácidos de CD20 humano se muestra en The Leukocyte Antigen Facts Book, Barclay et al. Supra, página 182, y también en el No. de Acceso Genbank EMBL X12530 y Swissprot P11836. Otro antígeno de superficie de célula B particular es el antígeno "CD22", también conocido como BL-CAM o Lyb8. CD22 es una glico proteína de membrana integral tipo 1 con peso molecular de aproximadamente 130 (reducido) a 140kD (sin reducir) . Se expresa tanto en el citoplasma como en la membrana celular de linfocitos B . Antígeno CD22 aparece temprano en la diferenciación de linfocitos de célula B aproximadamente en la misma etapa que el antígeno CD19. A diferencia de otros marcadores de célula B, la expresión de membrana CD22 se limita a etapas de diferenciación tardías, por ejemplo entre células B maduras (CD22+) y células de plasma (CD22-) . El antígeno CD22 se describe por ejemplo por Wilson et al., 1991, J". Exp. Med. 173:137 y Wilson et al., 1993, J. Immunol. 150:5013. Otro antígeno de superficie de célula B particular es BR3 (también conocido como BLyS (BAFF) receptor 3 o BAFF- R) . El miembro de familia TNF BAFF es un ligando para BR3 (Patel et al, 2004, J. Biol.Chem., 279: 16727-16735; Thompson et al., 2001, Science, 293, Issue 5537, 2108-2111) . "Fragmentos funcionales" de los anticuerpos de enlace antígeno de superficie de célula B, por ejemplo anticuerpos anti-CD20 aquí descritos, son aquellos fragmentos que retienen enlace al antigeno, por ejemplo CD20, sustancialmente con la misma afinidad que la molécula de longitud integra intacta, de la cual se derivan y demuestran actividad biológica tales como agotar células B, como se mide por ensayos in Vitro o in vivo. 2. Anticuerpos de Agotamiento de célula B Actividad biológica de anticuerpos de agotamiento de célula B tal como anticuerpos anti~CD20 y de enlace anti-CD20 humanizado y semejantes, incluyen al menos enlace del anticuerpo a un marcador de célula B humana, tal como CD20 humano, más preferiblemente, el enlace a marcadores de células B de humanos y otros primates tales como CD20 (incluyendo como monos cinomolgus, monos rhesus, chimpancés). Anticuerpos útiles ligan el antigeno de célula B con un valor Kd no superior a 1 x 10"8, de preferencia un valor Kd no superior a 1 x 10"9. Anticuerpos útiles son capaces de exterminar o agotar células B in vivo, de preferencia en al menos 20% cuando se comparan con el control negativo apropiado que no se trata con este anticuerpo . Agotamiento de célula B puede ser resultado de uno o más de ADCC, CDC, u otro mecanismo. En algunas modalidades de tratamiento de enfermedades aqui, funciones o mecanismo efectores específicos pueden desearse frente a otros, y ciertos variantes del anticuerpo de agotamiento de célula B tal como el anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo, el anticuerpo anti-CD20 humanizado, 2H7 y el anticuerpo anti-CD20 quimérico, Rituximab) se prefieren para lograr esas funciones biológicas, por ejemplo, ADCC. Los términos "rituximab" o "RITUXANMR" aquí se refieren al anticuerpo monoclonál murino/humano quimérico de ingeniería genética dirigido contra el antígeno CD20 y designado "C2B8" en la Patente de los E.U.A. No. 5,736,137, incluyendo sus fragmentos que retienen la capacidad por ligar CD20. a. Anticuerpos Anti-CD20 Ejemplos de anticuerpos CD20 incluyen: "C2B8", que ahora se denomina "rituximab" ( "RITUXAN#" ) (Patente de los E.U.A. No. 5,736,137); el anticuerpo murino 2B8 etiquetado con itrio- [90] designado "Y2B8" o "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEVALINMR) , comercialmente disponible de IDEC Pharmaceuticals , Inc. (Patente de los E.U.A No. 5,736,137; 2B8 depositado con ATCC bajo el número de acceso HB11388 en junio 22, 1993); IgG2a murina "Bl", también denominada "Tositumomab" , opcionalmente etiquetada con 131I para generar el anticuerpo "131I-B1" o "yodo 1131 tositumomab" (BEXXA MR) comercialmente disponible de Corixa (ver también Patente de los E.U.A No. 5,595,721); anticuerpo monoclonal murino "1F5" (Press et al. Blood 69 (2 ): 584-591 (1987) y sus variantes incluyendo 1F5 humanizada o "de marco parchado (" ( O 2003/002607, Leung, S.; ATCC depósito HB-96450) ; anticuerpo 2H7 murino y 2H7 quimérico (Patente de los E.U.A No. 5,677,180); un 2H7 humanizado (WO 2004/056312 (Lowman et al.) y como se estableció anteriormente); anticuerpo de alta afinidad totalmente humano HUMAX-CD20MR dirigido a la molécula CD20 en la membrana celular de células B (Genmab, Denmark; ver por ejemplo Glennie y van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) y Cragg et al., Blood 101: 1045-1052 (2003)); los anticuerpos monoclonales humanos establecidos en WO 2004/035607 (Teeling et al.); los anticuerpos que tienen cadenas de azúcar enlazadas a N glucósido complejos ligados a la región Fe descrita en Patente de los E.U.A. No. 2004/0093621 (Shitara et al.); moléculas de enlace CD20 tales como la serie de anticuerpos AME, por ejemplo anticuerpos AME-33MR como se establece en WO 2004/103404 (Watkins et al., Applied Molecular Evolution) ; anticuerpo A20 o sus variantes tales como anticuerpo A20 quimérico o humanizado (cA20, hA20, respectivamente) (US 2003/0219433, Immunomedics) ; y anticuerpos monoclonales y L27, G28-2 , 93-1B3 , B-Cl o NU-B2, disponible de The International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., In: i-euJocyte Typing III (McMichael, Ed. , p. 440, Oxford University Press (1987) ) . Los anticuerpos CD20 preferidos aquí son anticuerpos CD20 quiméricos humanizados o humanos, más preferiblemente rituximab, un anticuerpo 2H7 humanizado, un anticuerpo quimérico o humanizado A20 (Immunomedics) , y el anticuerpo CD20 humano HUMAX-CD20MR (Genmab) . En cada uno de estos anticuerpos, la lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fe puede retirarse por ejemplo durante purificación del polipéptido o por ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica el polipéptido. De acuerdo con esto, una composición que comprende un polipéptido tal como un anticuerpo o una inmunoadhesina que tiene una región Fe aquí, puede comprender polipéptidos con 447, con todo 447 retirado, o una mezcla de polipéptidos con y sin el residuo 447. De esta manera, aunque las secuencias de cadena H de longitud integra proporcionadas a continuación incluyen K447, se pretende que las composiciones de los siguientes anticuerpos comprenden anticuerpos que carecen de K447 en la cadena H. El anticuerpo CD20 antihumano murino, m2H7 tiene la secuencia VH: 1 QAYLQQSGAE LVRPGASVKM SCKASGYTFT SY MHWVKQT PRQGLE IGA IYPGNGDTSY 61 NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYFCARW YYSNSYWYFD VWGTGTTVTV 121 S (SEQ ID NO: 27) Y la secuencia VL: 1 QIVLSQSPAI LSASPGEKVT MTCRASSSVS YMHWYQQKPG SSP PWIYAP SNLASGVPAR 61 FSGSGSGTSY SLTISRVEAE DAATYYCQQW SFNPPTFGAG TKLELK (SEQ ID NO : 28) Puramente para los presentes propósitos, "2H7v.l6 humanizado" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo intacto que comprende la secuencia ligera variable: 1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASSSVS YMHWYQQKPG KAPKPLIYAP SNLASGVPSR 61 FSGSGSGTDF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SFNPPTFGQG TKVEIKR (SEQ ID NO: 29); y Y la secuencia pesada variable: 1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT SYNMH VRQA PGKGLEWVGA IYPGNGDTSY 61 NQKFKGRFTI SVDKSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARW YYSNSYWYFD VWGQGTLVTV 121 SS (SEQ ID NO: 30) Cuando el anticuerpo 2H7v.l6 humanizado es un anticuerpo intacto, de preferencia comprende la secuencia de amino ácidos de cadena ligera vl6 : 1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASSSVS YMHWYQQKPG KAPKPLIYAP SNLASGVPSR 61 FSGSGSGTDF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SFNPPTFGQG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS 121 DEQLKSGTAS WCLLNMFYP REAKVQ KVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL 181 SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC (SEQ ID NO: 31) ; y La secuencia de amino ácido de cadena pesada vl6: 1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT SYNMHWVRQA PGKGLEWVGA IYPGNGDTSY 61 NQKFKGRFTI SVDKSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARW YYSNSYWYFD VWGQGTLVTV 121 SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ 181 SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EP SCDKTHT CPPCPAPELL 241 GGPSVFLFPP KP DTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF WYVDGVEVH NAKTKPREEQ 301 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR 361 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS 421 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 32) La región V de todas las otras variantes basada en la versión 16 tiene la secuencia de amino ácido de vl6 excepto en las posiciones de sustituciones de amino ácidos que se indican en la siguiente tabla. A menos que se indique de otra forma, las variantes 2H7 tienen la misma cadena L que la de vl6.

Versión Cambios en Cambios en Cambios Fe 2H7 cadena cadena pesada ligera (VL) (v„) 16 - 31 - - S298A, E333A, K334A 73 N100A M32L 75 N100A M32L S298A, E333A, K334A Versión Cambios en Cambios en Cambios Fe 2H7 cadena cadena pesada ligera (VL) (vH) 96 D56A, N100A S92A 114 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A 115 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A, E356D, M358L 116 D56A, N100A M32L, S92A S298A, K334A, K322A 138 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A, K326A 477 D56A, NIOOA M32L, S92A S298A, E333A, 334A, K326A, N434W 375 - - 334L D56A, M32L, S92A S298A, E333A, K334A, 511 N100Y, K326A SlOOaR 588 - - S298A, E333A, K334A, K326A Las secuencias de algunas de las variantes de 2H7v.l6 mAb humanizado precedente son como sigue: 2H7v. 31 que tiene la misma secuencia de cadena L que SEQ ID NO: 31 anterior, con la secuencia amino ácido de cadena H: 1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT SY MHWVRQA PGKGLEWVGA IYPGNGDTSY 61 NQKFKGRFTI SVDKSK TLY LQ NSLRAED TAVYYCARW YYSNSYWYFD VWGQGTLVTV 121 SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL V DYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ 181 SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYIC V HK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL 241 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH AKTKPREEQ 301 Y ATYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIAAT IS AKGQPRE PQVYTLPPSR 361 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS 421 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 33) ; 2H7v.l38 que tiene la secuencia amino ácido de cadena H: EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASG YTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQM NSL RAEDTAVYYCARWYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTY ICN V HKPSNT VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP DTLMISRTPE VTC VWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRWSVLTVLHQDWLNG E YKC KVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT NQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENlSrYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG VFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG (SEQ ID N0:43) y la secuencia amino ácido de cadena L vl38: DIQMTQSPSSLSASVGDRV I CRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGV PSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ AFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIF PS DEQLKSGTASWCLLlsnsIFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO : 44) ; 2H7v.ll4 que tiene la misma secuencia de cadena L que V.138, SEQ ID NO: 44 anterior, con la secuencia amino ácido de cadena H: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG YTFTSYNm VRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQM NSL RAEDTAVYYCARWYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAA LGCLVKDYFPEPVTVS SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTY IC VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVOGVEVHNAK^ YKC KVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT NQVSLTCLVKGFYPSDIA VEW ESNGQPE1MY TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSL SLSPGK (SEQ IDNO:45); 2H7v.477 que tiene la secuencia en cadena L de 2H7v.l38 (SEQ ID NO:44), y la secuencia amino ácido de cadena H: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG YTFTSYNMHWVRQAPG GLEWVGAIYPGNGATSYNQ F GRFTISVDKS NTLYLQM NSL RAEDTAVYYCARWYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAA LGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTY ICN V HKPSNT VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA TKPREEQYNATYRWSVLTVLHQD LNGKE YKC KVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEW ESNGQPE YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG1WFSCSVMHEALHWHYTQ KSL SLSPGK (SEQ ID N0:46); 2H7v.511 que tiene la secuencia de cadena L de 2H7v.l38 (SEQID N0:44), y la secuencia amino ácido de cadena H: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGA SY NQ FKGRFTISVDKSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVWGQGTL VTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICJSTV1HKPSNTKVD KVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA TKPR EEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLP PSR EEMTKMQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEISnrYKTTPPVLDSDGSFFLYS LTV D S RWQQG VFSCSVMHEALHNHYTQ SLSLSPG (SEQ ID NO: 47) . Cada una de las versiones 114, 115, 116, 138, 477, 511 comprende la secuencia VL: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQ PGKAPKPLIYAPSMLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 48) . b. Anticuerpos Anti-CD22, anticuerpos de agotamiento de célula B y semejantes Anticuerpos de agotamiento de célula B también incluyen anticuerpos y ligandos de enlace que antagonxzan CD20, CD22, CD23, BR3 , y CD80. Ejemplos incluyen el anticuerpo anti-CD22 LyphoCideR, también conocido como epratuzumab (Immunomedics , Inc., Morris Plains, NJ) ; el péptido bloqueador BAFF-R (CT) BR3 (QED Bioscience, Inc., San Diego, CA) ; el anticuerpo anti-CD23, IDEC-152, un anticuerpo primatizado (Biogen IDEC, Cambridge, MA) , el anticuerpo anti-CD80, DEC-114, un anticuerpo primatizado (Biogen IDEC, Cambridge, MA) ; y semejantes. Anticuerpos A20 quiméricos y humanizados tienen las siguientes secuencias como se describe en la solicitud provisional de Patente de los E.U.A 2003/0219433. El anticuerpo anti-CD20 cA20 tiene la secuencia VL: 1 DIQLTQSPAI LSASPGEKVT MTCRASSSVS YIHWFQQKPG SSPKPWIYAT SNLASGVPVR 61 FSGSGSGTSY SLTISRVEAE DAATYYCQQ TSNPPTFGGG TKLEI (SEQ ID NO: 34) Y la secuencia VH: 1 QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYNMHWVKQT PGRGLEWIGA IYPGNGDTSY 61 NQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARST YYGGDWYFDV WGQGTTVTVS 121 S (SEQ ID NO: 35) Un anticuerpo anti-CD20 hA20 tiene la secuencia VL: 1 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTCRASSSVS YIHWFQQKPG KAPKPWIYAT SNLASGVPVR 61 FSGSGSGTDY TFTISSLQPE DIATYYCQQW TSNPPTFGGG TKLEIK (SEQ ID NO: 36) Y la secuencia VH1 : 1 QVQLQQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFT SYNMHWVKQA PGQGLEWIGA IYPGNGDTSY 61 NQKFKGKATL TADESTNTAY MELSSLRSED TAFYYCARST YYGGDWYFDV GQGTTVTVS 121 S (SEQ ID NO: 37) Un hA20VHl alterno tiene la secuencia: 1 QVQLQQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFS SYNMHWVRQA PGQGLEWMGA IYPGNGDTSY 61 NQKFKGRATI TADESTNTAY MELSSLRSED TAFYFCARST YYGGDWYFDV WGQGTTVTVS 121 S (SEQ ID NO: 38) Anticuerpos 1F5 humanizados (de parche FR) tienen las secuencias descritas en la Solicitud Provisional de los E.U.A No. 2003/0040606. Un anticuerpo anti-CD20 hulF5 tiene la secuencia VL: 1 QVQLVASGAE VNKPGASVKV SCKASGYTFT SYNMHWVRQP PGRGLEWIGA IYPGNGDTSY 61 NQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARSH YGSNYVDYFD YWGQGTTVTV 121 SS (SEQ ID NO: 39) Y la secuencia VH: 1 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASSSLS FMHWYQQKPG SSPKPWIYAT SNLASGVPSR 61 FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYFCHQW SSNPLTFGAG TKLTVLR (SEQ ID NO: 40) Un anticuerpo anti-CD20 ulF5 alterno tiene una secuencia VL: 1 QVQLVASGAE VNKPGASVKV SCKASGYTFT SYNMHWVRQPP GRGLEWIGA IYPGNGDTSY 61 NQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSHY GSNYVDYFD YWGQGTTVTV 121 SS (SEQ ID NO: 41) Y la secuencia VH: 1 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASSSLS FMHWYQQKPG QAPVPVIYAT SNLASGVPSR 61 FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYFCHQW SSNPLTFGAG TKLTVLR (SEQ ID NO: 42) F. Métodos de Tratamiento Los métodos de la invención son útiles para tratar una cantidad de enfermedades malignas y no malignas incluyendo enfermedades auto-inmunes y condiciones relacionadas y cánceres incluyendo linfomas de célula B y leucemia. Por ejemplo, células madre (progenitoras de célula B) en médula ósea carecen del antígeno CD20, permitiendo que células B sanas regeneren después de tratamiento con antagonistas CD20 y regresen a niveles normales dentro de varios meses. 1. Desórdenes Auto inmunes y Condiciones Relacionadas Enfermedades auto inmunes o condiciones antoinmunes relacionadas incluyen artritis (artritis reumatoide tales como artritis aguda, artritis reumatoide crónica, artritis gotoza, artritis gotoza aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis de psoriasis, artritis vertebral y artritis reumatoide de inicio juvenil, ostioartritis , artritis progrediente crónica, artritis deformans, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva y espondilitis anquilosante) , enfermedades de la piel hiperproliferativas inflamatorias, psoriasis tales como psoriasis de placa, psoriasis gutatte*, psoriasis pustular y psoriasis de las uñas, atopia incluyendo enfermedades atópicas tales como la fiebre del heno (*hay fever=pollinosis fiebre del heno=polinosis) y síndrome de Job, dermatitis incluyendo dermatitis de contacto, dermatitis de contacto crónica, dermatitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica, dermatitis herpetiformis, y dermatitis atópica, síndrome hiper IgM de enlace x, urticaria tal como urticaria alérgica crónica y urticaria idiopatica crónica, incluyendo urticaria auto inmune crónica, polimiositis/dermatomiositis , dermatomiositis juvenil, necrolisis epidérmica tóxica, escleroderma (incluyendo escleroderma sistémico) , esclerosis tales como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (MS igual a múltiple sclerosis) tal como MS espino-óptica, MS progresiva primaria (PPMS = primary progressive MS) , y MS de remisión con relapso (RRMS = relapsing remitting MS) , esclerosis sistémica progresiva, aterosclerosis , arteriosclerosis , esclerosis disseminata, esclerosis atáxica, neuromielitis óptica ( MO igual a neuromyelitis óptica) , enfermedades de intestino inflamatorio (IBD igual a inflammatory bowel disease) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales de mediadas auto inmunes, colitis tales como colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colagenosa, colitis poliposa, enterocolitis necrotizante, y colitis transmural, y enfermedad de intestino inflamatorio auto inmune) , pioderma gangrenosa, eritema nodoso, colangitis esclerosante primaria, episcleritis) , síndrome de ansiedad respiratoria, incluyendo síndrome de ansiedad respiratoria aguda o de adulto (ARDS = acute respiratory distress syndrome) , meningitis, inflamación de todo o parte de la uvea, iritis, coroiditis, un desorden hematológico auto inmune, espondilitis reumatoide, pérdida súbita de la audición, enfermedades mediadas por IgE, tales como anafilaxis, renitis alérgica y atópica, encefalitis tal como encefalitis de Rasmussen y encefalitis límbica y/o de uveitis tal como uveitis anterior, uveitis anterior aguda, uveitis granuíomatosa, uveitis no granulomatosa, uveitis facoantigénica, uveitis posterior, o uveitis auto inmune, glomerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico tal como glomerulonefritis crónica o aguda tal como GN primaria, GN inmuno mediada, GN membranosa (nefropatia membranosa) , GN membranosa idiopática o neofropatía membranosa idiopática, GN membrano- o membranosa proliferativa (MPGN) incluyendo Tipo I y Tipo II, y Gn de avance rápido, condiciones y respuestas alérgicas, reacción alérgica, eczema incluyendo eczema alérgico o atópico, asma tal como asma bronquial y asma auto inmune, condiciones que involucran infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, reacciones inmunes contra antígenos extraños tales como grupos de sangre A-B-0 durante embarazo, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis auto inmune, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus, incluyendo lupus nefritis, lupus cerebritis, lupus pediátrico, lupus no renal, lupus extra renal, lupus discoide, lupus de alopecia, lupus sistémico eritematoso (SLE) tal como SLE cutáneo o SLE cutáneo subagudo, lupus sistémico eritematodos *erythematodes , síndrome de lupus neonatal (NLE = neonatal lupus syndrome) , y lupus eritematoso diseminado, diabetes melitus de inicio juvenil (Tipo I) , incluyendo diabetes melitus dependiente de insulina pediátrica (IDDM = insulin-dependent diabetes mellitus) , diabetes melitus de inicio en adultos (diabetes tipo II) diabetes auto inmune, diabetes insípida ideopática, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por citoquinas y T-linfocitos , tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulornatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitides, incluyendo vasculitis (incluyendo vasculitis de grandes bazos (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (Takayasu ' s) ) , vasculitis de bazos medios (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nodosa/periarteritis nodosa) , poliarteritis microscópica, vasculitis de CNS, vasculitis necrotizante, cutánea, o de hipersensibilidad, vasculitis necrotizante sistémica y vasculitis asociada con ANCA, tal como vasculitis de Churg-Strauss o síndrome (CSS) ) , arteritis temporal, anemia aplástica, anemia aplástica auto inmune, anemia positiva de Coombs, anemia Diamond Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmune, incluyendo anemia hemolítica auto inmune (???? = auto inmune hemolytic anemia) , anemia perniciosa (anemia perniciosa) , enferemedad de Addison, anemia de glóbulos rojos puros o aplasia (PRCA = puré red cell anemia) , deficiencia de Factor VIII, hemofilia A, neutropenia auto inmune, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que involucran diapedesis de leucocitos, desórdenes inflamatorios del CNS, síndrome de lesión de múltiples órganos tales como aquellos secundarios a septicemia, trauma o hemorragia, enfermedades mediadas por complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de membrana basal anti-glomerular, síndrome de anticuerpo anti-fosfolípido, neuritis alérgica, enfermedad de Bechet o de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, pemfigoide tal como pemfigoide bulosa, y pemfigoide de la piel, pemfigus (incluyendo pemfigus vulgaris, pemfigus foliáceo, pemfiguoide de membrana de moco de pemphigus y pemfigus eritematoso) , poliendocrinopatías auto inmunes, enfermedad o síndrome de Reiter, nefritis compleja inmune, nefritis mediada por anticuerpos, polineuropatías , neuropatía crónica tal como polineuropatías IgM o neuropatía mediada por Ig , trombocitopenia (como se desarrolla por pacientes de infarto al miocardio, por ejemplo) , incluyendo púrpura trombocitopénica trombótica (PTP = thrombotic thrombocitopenic purpura) , púrpura post-transf sión (PTP = post-tranfusio purpura) , trotnbocitopenia inducida por heparina, y trombocitopenia auto inmune o inmuno mediada, tal como púrpura trombocitopénica ideopática (TTP = idiopathic thrombocitopenic purpura) , incluyendo ITP crónica o aguda, enfermedad auto inmune de los testículos y ovarios incluyendo orquitis y ooforitis auto inmune, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas auto inmunes incluyendo tiroiditis tal como tiroiditis auto inmune, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto) , o tiroiditis subaguda, enfermedad de tiroides auto inmune, hipotiroidismo ideopático, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares tales como síndromes poliglandulares auto inmunes (o síndromes de endocrinopatía poliglandular) , síndromes paraneoplásticos , incluyendo síndromes paraneoplásticos neurológicos tales como síndrome miasténico de Lambert-Eaton o síndrome de Eaton-Lambert, Síndrome de rigidez muscular o del hombre rígido, encefalomielitis tal como encefalomielitis alérgica o encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE = experimental allergic encephalomyelitis) , miastenia gravis tal como miastenia gravis asociada con timoma, de generación cerebelar, neuromiotonia, opsoclonus o síndrome de opsoclonus mioclonus (OMS = opsoclonus myoclonus syndrome) , y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome Sheehan, hepatitis auto inmune, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de células gigantes, hepatitis activa crónica o hepatitis activa crónica auto inmune, nuemonitis intersicial linfoide (LIP linfoid interstitial pneumonitis) , bronquiolitis obliterans (no de transplante) vs NSIP, síndrome de Guillain-Barré , enfermedad de Berger (neuropatía IgA) , nefropatía IgA ideopática, dermatosis IgA lineal, cirrosis biliar primaria, neumocirrosis , síndrome de enteropatía auto inmune, enfermedad Celiaca*, enfermedad Celiaca, esprue celiaca (enteropatía de gluten) , esprue refractaria, esprue ideopática, crioglobulinemia, esclerosis lateral amilotrópica (ALS = amylotrophic lateral sclerosis; enfermedad de Lou Gehrig) , enfermedad de arterias coronarias , enfermedad de oído auto inmune tal como enfermedad de oído interior auto inmune (AIED = autoimmune inner ear disease) , pérdida de audición auto inmune, síndrome opsoclonus mioclonus (OMS = opsoclonus myoclonus syndrome) , policondritis tal como policondritis refractaria o de recaída, proteinosis alveolar pulmonar, amiloidosis, escleritis, una linfocitosis no cavernosa, linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis de célula B monoclonal (por ejemplo gamopatía monoclonal benigna y gamopatía monoclonal de significancia indeterminada (MGUS = monoclonal gammopathy of undetermined significance) , neuropatía periférica, síndrome paraneoplástico, canalopatías tales como epilepsia, migraña, arritmia, desórdenes musculares, sordera, cequera, parálisis periódica y canalopatías del SNC, autismo, miopatxa inflamatoria, glomeruloesclerosis segmental focal (FSGS = focal segmental glomerulosclerosis) , oftalmopatía endocrina, uveoretinitis , corioretinitis , desorden hepatológico auto inmune, fibromialgia, falla endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinantes tales como enfermedades de desmielinantes auto inmunes y polineuropatía desmielinante inflamatoria crónica, nefropatía diabética, enfermedad de Dressler, alopecia areata, síndrome de CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismovilidad *dysmotility esofágica, esclerodactilia *sclerodactyly y telangiectasia) , infertilidad auto inmune masculina y femenina, enfermedad de tejidos conectivos mixtos, enfermedad de chagas, fiebre reumática, aborto recurrente, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome post-cardiotomía, síndrome de Cushing, pulmón del aficionado a las aves, angiitis granulomatosa alérgica, angiitis linfocítica benigna, síndrome de Alpont, alveolitis tal como alveolitis alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulomonar intersicial, reacción de transfusión, lepra, malaria, leishmaniasis , quipanosomiasis , esquistosomiasis , ascariasis, aspergilosis , síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersicial difusa, fibrosis pulmonar intersicial, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar ideopática, fibrosis sística, endoftalmitis , eritema elevatum et diutinum, eritroblastosis fetalis, faciitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariasis, ciclitis tal como ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, iridociclitis (aguda o crónica) , o ciclitis de Fuch, púrpura Henoch-Schonlein, infección de virus de inmunodeficiencia humana (HIV) , infección de ecovirus, cardiomiopatía, enfermedad de Alzheimer, .infección de parvovirus, infección de virus de rubéola, síndromes de post-vacunación, infección de rubéola congénita, infección de virus Epstein-Barr, paperas, síndrome de Evan, falla de gónadas auto inmune, corea de Sydenham, nefritis post-estreptococal , tromboanginitis ubiterans, tirotoxicosis , tabes dorsalis, corioiditis, polimialgia de células gigantes, oftalmopatía endocrina, neumonitis de hipersensibilidad crónica, queratoconjuntivitis sicca, queratoconjuntivitis epidémica, síndrome nefrítico ideopático, nefropatía de cambio mínimo, lesión de repercusión de isquemia y famliar benigna, autoinmunidad retinal, inflamación conjunta, bronquitis, enfermedad de vías respiratorias obstructivas crónica, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, desórdenes arteroescleróticos , aspermiogenesis , hemolisis auto inmune, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoalafiláctica, enteritis alérgica, eritema nodosum leprosum, parálisis facial ideop tica, síndrome de fatiga crónico, febris reumática, enfermedad de Hamman-Rich, pérdida de audición sensoneural, hemoglobinuria paroxismática, hipogonadismo, ileitis regionalis, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis cruzada, mixedema ideopático, nefrosis, oftalmía simpática, orquitis granuíornatosa, pancreatitis, poliradiculitis aguda, pioderma gangrenoso, tireoiditis de Quervain, atrofia esplénica adquirida, infertilidad debido a anticuerpos antiespermatozoides, timoma no maligno, vitíligo, enfermedades asociadas con SCID y virus Epstein-Barr, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) , enfermedades parasitarias tales como Leishmania, síndrome de choque tóxico, envenenamiento por alimentos, condiciones que involucran infiltración de células T, deficiencia de adhesión de leucocitos, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por citoguinas y T-linfocitos , enfermedades que involucran diapedésis de leucocitos, síndrome de lesión de múltiples órganos, enfermedades mediadas por complejos antigenos-anticuerpo, enfermedad de membrana basal antiglomerular, neuritis alérgica, poliendocrinopatías auto inmunes, ooforitis, mixedema primario, gastritis atrófica auto inmune, oftalmía simpática, enfermedades reumáticas, enfermedad de tejido conectivo mixto, síndrome nefrótico, insulitis, falla poli endocrina, neuropatía periférica, síndrome poliglandular auto inmune Tipo I, hipoparatiroidismo ideopático de inicio en adultos (AOIH = adult-onset idiopathic hypoparathyroidism) , alopecia totalis, cardiomiopatía dilatada, epidermólisis bulosa acquisita (EBA = epidermolisis bullosa acquisita) , hemocromatosis , miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, sinusitis etmoide frontal, maxilar o esfenoide, un desorden relacionado con eosinófilos, tal como eosinofilia, eosinofilia de infiltración pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, neumonía eosinofílica crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis bronconeumónica, aspergiloma o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxis, espondiloartritis cero negativa, enfermedad auto inmune poliendocrina, colangitis esclerosante, esclerótica, epiesclerótica, candidiasis mucocutánea crónica, síndrome de Bruton, hipogamaglobulinemia transitoria de infancia, síndrome de Wiskott-Aldrich, ataxia telangiectasia, desórdenes auto inmunes asociados con enfermedad de colágeno, reumatismo, enfermedad neurológica, limfadenitis , desorden de repercusión isquémica, reducción en respuesta de presión sanguínea, disfunción vascular, antgiectasia, lesión de tejido, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral, y enfermedad que acompaña a vascularización, desórdenes de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritis , lesión de repercusión, lesión de repercusión de miocardio u otros tejidos, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, meningitis purulenta aguda u otros desórdenes inflamatorios del sistema nervioso central, desórdenes inflamatorios oculares y orbitales, síndromes asociados con transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citoquina, narcolepsia, inflamación seria aguda, inflamación intratable crónica, pielitis, neumocirrosis , retinopatía diabética, desorden de grandes arterias diabéticas, hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvulitis, y endometriosis . 2. Cánceres, Cánceres CD20+ Una malignidad o neoplasma de células B se caracteriza por expresión de un antigeno de célula B o marcador superficial tal como CD20. Por ejemplo, cánceres CD20 positivos son aquellos que comprenden proliferación anormal de células que expresan CD20 en la superficie celular. Los neoplasmas de células B CD20 positivos incluyen enfermedad de Hodgkin CD20 positiva, incluyendo enfermedad de Hodgkin predominante en linfocitos (LPHD) ; linfoma no-Hodgkin (NHL) ; linfomas de células centrales foliculares (FCC) ; leucemia linfocitica aguda (ALL) ; leucemia linfocitica crónica (CLL) ; leucemia de células pilosas. El linfoma no-Hodgkin incluye linfoma no-Hodgkin folicular/bajo grado (NHL) , linfoma de linfocitico pequeño (SLL) , NHL folicular/grado intermedio, NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblástico de alto grado NHL, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de células no escindidas pequeñas de alto grado, NHL de enfermedad voluminosa, linfoma linfocitico plasmacitoide , linfoma de célula del manto, linfoma relacionado con SIDA y macroglobulinemia de Waldenstrom. Tratamiento de relapsos de estos cánceres también se contempla. LPHD es un tipo de enfermedad de Hodgkin que tiende a tener frecuente relapso a pesar de tratamiento con radiación o quimioterapia y se caracteriza por células malignas CD20 positivas. CLL es uno de cuatro tipos principales de leucemia. Un cáncer de células B maduras denominadas linfocitos, CLL se manifiesta por acumulación progresiva de células en la sangre, médula ósea y tejidos linfáticos. El linfoma indolente, es una enfermedad de lento crecimiento, incurable, en donde el paciente promedio sobrevive entre 6 y 10 años después de numerosos periodos de remisión y relapso. En modalidades especificas, los métodos de tratamiento y de aumento de agotamiento de células B descritos aquí son útiles para tratar neoplasmas o malignidades de células B, tales como linfoma no Hodgkin's (NHL), enfermedad de Hodgkin predominante de linfocitos (LPHD) , linfoma linfocitico pequeño (SLL) , leucemia linfocitica crónica, artritis reumatoide y artritis reumatoide juvenil, lupus sistémico eritematoso (SLE) incluyendo lupus nefritis, enfermedad de Wegeners, enfermedad intestinal inflamatoria, púrpura trombocitopenia idiopatica (ITP) , púrpura trombocitopenia trombótica (TTP) , trombocitopenia auto inmune, esclerosis múltiple, psoriasis, nefropatia IgA, poli neuropatías IgM, miastenia gravis, vasculitis, diabetes melitus, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen y glomerulonefritis .

El nivel deseado de agotamiento de célula B dependerá de la enfermedad. Por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer CD20 positivo puede ser conveniente llevar al máximo el agotamiento de la célula B. De esta manera, para el tratamiento de un neoplasma de célula B CD20 positivo (u otro marcador o antigeno de superficie de célula B) , es conveniente que el agotamiento de célula B sea suficiente para cuando menos evitar el avance de la enfermedad, que puede estimarse por el médico con destreza en la especialidad, por ejemplo al supervisar el crecimiento de tumor (tamaño) proliferación del tipo de células cancerosas, metástasis y/u otros signos y síntomas del cáncer particular. De preferencia, el agotamiento de células B es suficiente para evitar avance de la enfermedad por al menos dos meses, más preferiblemente tres meses, aún más preferible cuatro meses, más preferiblemente cinco meses, todavía más preferible seis o más meses. En modalidades todavía más preferidas, el agotamiento de células B es suficiente para incrementar el tiempo en remisión en al menos seis meses, más preferiblemente nueve meses, más preferiblemente un año, más preferiblemente dos años, más preferiblemente tres años, o más preferiblemente cinco o más años. En una modalidad más preferida, el agotamiento de células B es suficiente para curar la enfermedad. En modalidades preferidas, el agotamiento de células B en un paciente de cáncer es al menos aproximadamente 75% y más 80%, 85%, 90%, 95%, 99% e incluso 100% del nivel de linea base antes de tratamiento. 3. Desórdenes Auto inmunes Para tratamiento de una enfermedad auto inmune, puede ser conveniente el modular la extensión de agotamiento de célula B dependiendo de la enfermedad y/o la severidad de la condición en el paciente individual, al ajustar la dosis del agente de agotamiento de células B, por ejemplo anticuerpo de enlace CD20. El agotamiento de células B puede ser completo o parcial . Un agotamiento de células B total puede ser deseable durante el tratamiento inicial, pero en tratamientos subsecuentes, la dosis puede ajustarse para lograr solo agotamiento parcial . En una modalidad, el agotamiento de células B es al menos 20%, es decir 80% o menos de células diana por ejemplo B CD20 positivas permanecen en comparación al nivel de linea base antes de tratamiento. En otras modalidades, el agotamiento de célula B es 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% o mayor. De preferencia, el agotamiento de células B es suficiente para detener el avance de la enfermedad, más preferiblemente para alinear los signos y síntomas de la enfermedad particular bajo tratamiento, aún más preferible para curar la enfermedad.

Los parámetros para estimar la eficacia o éxito del tratamiento de neoplasma se conocerán por el médico con destreza en la enfermedad apropiada. En general, el médico con destreza buscará la reducción en los signos y síntomas de la enfermedad específica. Parámetros pueden incluir el tiempo promedio para avance de la enfermedad, tiempo en remisión y enfermedad estable. Las siguientes referencias describen linfomas y CLL, su diagnóstico, tratamiento y procedimientos médicos estándar para medir eficacia de tratamiento. Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas . W. B. Saunders Company, Philadelphia, 1998; van Besien K and Cabanillas, F: Clinical Manifestations , Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Cha . 70, pp 1293-1338, in: Hematology, Basic Principies and Practice, 3era edición Hoffinan y colaboradores, (editores) . Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000; y Rai, K y Patel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, pp 1350-1362, in: Hematology, Basic Principies and Practice, 3rd ed. Hoffinan y colaboradores, (editores). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000. Los parámetros para estimar eficacia o éxito de tratamiento de una enfermedad auto inmune o auto inmune relacionada serán conocidos por el médico con destreza en la enfermedad apropiada. En general, el médico con destreza buscará reducción en los signos y síntomas de la enfermedad específica. Lo siguiente se da a manera de ej emplos . En una modalidad, los métodos y composiciones de la invención son útiles para tratar artritis reumatoide (RA) . RA se caracteriza por inflamación de múltiples articulaciones, pérdida de cartílago y erosión de los huesos que lleva a una destrucción de articulaciones y finalmente función de articulación reducida. Adicionalmente, ya que RA es una enfermedad sistémica, puede tener efectos en otros tejidos tales como los pulmones, ojos y médula ósea. Agentes de agotamiento de células B tales como anticuerpos de enlace antígeno de células B, por ejemplo anticuerpos de enlace CD20, junto con agentes de movilización de células B tales como anticuerpo de integrina pueden emplearse como terapia de primer línea en pacientes con RA temprano (es decir, metotrexato (MTX) sin tratamiento previo) , o en combinación con por ejemplo MTX o ciclofosfamida . En otra modalidad esta combinación de agentes de agotamiento de células B, por ejemplo anticuerpos anti-CD20, junto con agentes de inmovilización de células B, tales como antagonistas anti-alfa4 y/o anti-alfaL, incluyendo anticuerpos, pueden emplearse en tratamiento como terapia de segunda línea para pacientes que fueron refractarios a metotrexato y/o drogas anti-reumáticas que modifican la enfermedad, en combinación por ejemplo con metotrexato. Estos agentes por ejemplo anticuerpos de enlace CD20 humanizados y anticuerpos de integrina, son útiles para evitar y controlar daño a las articulaciones, retardar daño estructural, disminuir el dolor asociado con inflamación en artritis reumatoide y en general reducir los signos y síntomas en artritis reumatoide moderada a severa. El paciente de artritis reumatoide puede ser tratado con el agente de agotamiento de células B, por ejemplo anticuerpo anti-CD20 humanizado, y agente de movilización de células B, por ejemplo, anticuerpo anti-integrina, antes de, después o junto con tratamiento con otras drogas empleadas para tratar RA (ver terapia en combinación siguiente) . En una modalidad, pacientes que previamente han fallado con drogas anti-reumáticas que modifican la enfermedad y/o han tenido una respuesta inadecuada a metotrexato solo, se tratan con un agente de agotamiento de células B tal como un anticuerpo enlace anti-CD20. En otra modalidad, además de los anticuerpos anti-integrina, a los pacientes se les administran anticuerpo de enlace anti-CD20 humanizado, anticuerpo de enlace anti-CD20 más ciclofosfamida, o anticuerpo de enlace anti-CD20 más metotrexato.

Un método para evaluar eficacia de tratamiento en artritis reumatoide se basa en los criterios del colegio americano de reumatología (American College of Rheumatology = (ACR) ) , que mide el por ciento de mejora en articulaciones suaves*tender e hinchadas, entre otras cosas. El paciente de artritis reumatoide puede ser calificado por ejemplo ACR 20 (20 por ciento de mejora) en comparación a sin tratamiento de anticuerpo (por ejemplo, línea base antes de tratamiento) o tratamiento con placebo. Otras formas de valor de eficacia de tratamiento con anticuerpos incluye calificación de rayos X tal como la calificación de rayos X Sharp utilizada para calificar daño estructural tal como erosión de huesos y estrechamiento del espacio en las articulaciones. Los pacientes también pueden ser evaluados por la prevención de o mejora en disabilidad con base en la calificación del cuestionario de evaluación de salud [HAQ = Health Assessment Questionnaire HAQ] , calificación AIMS, SF-36 en periodos de tiempo durante o después de tratamiento. Los criterios ACR 20 pueden incluir 20% de mejora tanto en conteo de articulación suave (dolorosa) y conteo de articulación hinchada más un 20% de mejora en al menos 3 de 5 medidas adicionales : 1. evaluación del dolor de paciente por escala analógica visual (VAS = visual analog scale VAS) , 2. evaluación global del paciente de actividad de la enfermedad (VAS) , 3. evaluación global del paciente de actividad de la enfermedad (VAS) , . desabilidad auto-estimada del paciente medida por el cuestionario de evaluación de salud (Health Assessment Questionnaire) , y 5. reactivos de fase aguda (CRP o ESR) . Los ACR 50 y 70 se definen en forma análoga. De preferencia, al paciente se le administra una cantidad de un agente de tratamiento de células B tal como un anticuerpo de enlace anti-CD20 de la invención efectivo para lograr al menos una calificación de ACR 20, de preferencia al menos ACR 30, más preferiblemente al menos ACR50, todavía más preferible al menos ACR70, más preferiblemente cuando menos ACR 75 y superior. Artritis Psoriacica tiene características radiográficas únicas y distintas. Para artritis psoriacica, la erosión de articulaciones y estrechamiento del espacio de articulaciones pueden evaluarse por la calificación Sharp por igual. Los agentes de agotamiento de células B tales como anticuerpos de enlace anti-CD20 humanizados aquí descritos pueden emplearse para evitar el daño a las articulaciones asi como reducir signos y síntomas de enfermedad del desorden. Todavía otro aspecto de la invención es un método para tratar Lupus o SLE al administrar al paciente que sufre de SLE, una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de agotamiento de células B tal como un anticuerpo de enlace anti-CD20 humanizado.

Calificaciones SLEDAI proporcionan una cuantificación numérica de actividad de enfermedad. SLEDAI es un índice ponderado de 24 parámetros clínicos y de laboratorio que se conoce se correlacionan con la actividad de la enfermedad, con un intervalo numérico de 0-103. Ver por ejemplo, Gescuk y colaboradores, 2002, Current Opinión in Rheumatology 14:515-521. Anticuerpos a DNA de doble hebra se considera que provocan apariciones bruscas de lesiones renales y otras manifestaciones de lupus. Pacientes que se someten a tratamiento de anticuerpos pueden supervisarse para el tiempo para aparición brusca de lesión renal, que se define como un incremento significante, reproducible en creatinina en suero, proteína de urea o sangre en la orina. En forma alterna o además, los pacientes pueden supervisarse por niveles de anticuerpos antinucleares y anticuerpos a DNA de doble hebra. Tratamientos para SLE se incluyen corticosteroides de altas dosis y/o ciclofosfamida (HDCC) . Espondiloartropatias son un grupo de desórdenes de las articulaciones, incluyendo espondilitis anquilosante, artritis psoriacica y enfermedad de Crohn. Éxito del tratamiento puede determinarse por herramientas para medición de evaluación global del médico y paciente. Diversos medicamentos se emplean para tratar psoriasis; el tratamiento difiere directamente en relación con la severidad de la enfermedad. Pacientes con una forma más salvaje de forma de psoriasis, típicamente utilizan tratamientos tópicos, tales como esteroides tópicos, antralina, calcipotrieno, clobetasol, tazaroteno, para manejar la enfermedad mientras que los pacientes con psoriasis moderada y severa probablemente empleen terapias sistémicas (metotrexatos , retinoides, ciclosporina, PUVA y UVB) . También se emplean alquitranes . Estas terapias tienen una combinación de consideraciones de seguridad, regímenes de consumo de tiempo, o inconvenientes procesos de tratamiento. Además, algunos requieren equipo costoso y espacio dedicado en el consultorio. Los medicamentos sistémicos pueden producir serios efectos secundarios, incluyendo hipertensión, hiperlipidemia, supresión de médula ósea, enfermedad del hígado, enfermedad de los ríñones, y malestar gastrointestinal. También, el uso de fototerapia puede aumentar la incidencia de cánceres en la piel. Además de la inconveniencia e incomodidad asociadas con el uso de terapias tópicas, la fototerapia y tratamientos sistémicos requieren poner en ciclo la terapia de activación y desactivación *on and off therapy en los pacientes y supervisar la exposición durante la vida debido a sus efectos secundarios. La eficacia del tratamiento para psoriasis se estima al supervisar cambios en signos clínicos y síntomas de la enfermedad influyendo cambios de evaluación global del médico (PGA) y calificaciones de índice de severidad y área de psoriasis (PASI) , evaluación de síntomas de psoriasis (PSA) en comparación con la condición de línea base . Puede medirse el paciente periódicamente a través de un tratamiento en la escala analógica visual empleada para indicar el grado de comezón experimentada en puntos en tiempo específicos. 4 dosis. Dependiendo de la indicación a tratar y factores relevantes a la dosificación que un médico con destreza en el campo estaría familiarizado, los agentes de agotamiento de células B y los agentes de movilización de células B de la invención serán administrados a una dosis que es eficaz para el tratamiento de esa indicación mientras que se reduce la toxicidad y efectos secundarios . Para el tratamiento de un neoplasma de células B CD20 positivo, es conveniente que el agotamiento de células B sea suficiente para cuando menos evitar avance de la enfermedad que puede estimarse por el médico con destreza en la especialidad, por ejemplo al supervisar el crecimiento de tumor (tamaño) , proliferación del tipo de células cancerosas, metástasis, otros signos y síntomas del cáncer particular. De preferencia, el agotamiento de células B es suficiente para evitar avance de la enfermedad por al menos 2 meses, más preferiblemente 3 meses, aún más preferiblemente 4 meses, más preferible 5 meses, aún más preferiblemente 6 meses o más. En incluso modalidades más preferidas, el agotamiento de células B es suficiente para incrementar el tiempo en remisión en al menos 6 meses, más preferiblemente 9 meses, más preferiblemente 1 año, más preferiblemente 2 años, más preferiblemente 3 años, aún más preferiblemente 5 años o más. En una modalidad más preferida, el agotamiento de células B es suficiente para curar la enfermedad. En modalidades preferidas, el agotamiento de células B en un paciente de cáncer es al menos aproximadamente 75% y más preferible 80%, 85%, 90%, 95%, 99% e incluso 100% del nivel de linea base antes del tratamiento.

Para el tratamiento de un cáncer CD20 positivo o una enfermedad auto-inmune, la dosis terapéuticamente efectiva puede estar en el intervalo de aproximadamente 250mg/m2 a aproximadamente 400mg/m2 o 500mg/m2, de preferencia aproximadamente 250-375mg/m2. En una modalidad, el intervalo de dosis es 275-375mg/m . En una modalidad del tratamiento de un neoplasma de células B CD20 positivas, el anticuerpo se administra en un intervalo de 300-375mg/m2. Para el tratamiento de pacientes que sufren de linfoma de célula B tales como linfoma no-Hodgkin, en una modalidad específica, los anticuerpos anti-CD20 y anticuerpos anti-CD20 humanizados de la invención se administrarán a un paciente humano a una dosis de 10mg/kg o 375mg/m2. En una modalidad, Rituximab puede administrarse a un intervalo de dosis de 7-15mg/kg. Para tratar NHL, un régimen de dosis seria administrar una dosis de la composición de anticuerpo una dosis de 10mg/kg en la primera semana de tratamiento, seguida por un intervalo de dos semanas, después una segunda dosis de la misma cantidad de anticuerpo se administra. En general, pacientes NHL reciben este tratamiento una vez durante un año pero ante recurrencia del linfoma, este tratamiento puede repetirse. En otro régimen de dosificación, pacientes tratados con NHL de bajo grado reciben cuatro semanas de una versión de 2H7 humanizado, de preferencia vi6 (375 mg/m2 semanalmente) seguido en la semana cinco por tres cursos adicionales del anticuerpo más quimioterapia estándar CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona) o CVP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona) , que se suministraron cada tres semanas por tres ciclos . Para tratar artritis reumatoide, en una modalidad, el intervalo de dosis para el anticuerpo anti-CD20 humanizado es 125 mg/m2 (equivalente a aproximadamente 200mg/dosis) a 600mg/m2, dado en dos dosis, por ejemplo la primera dosis de 200mg se administra el día uno por una segunda dosis de 200mg el día 15. En diferentes modalidades, la dosis es 250mg/dosis, 275mg, 300mg, 325mg, 350mg, 375mg, 400mg, 425mg, 450mg, 475mg, 500mg, 525mg, 550mg, 575mg, 600mg. Las investigaciones clínicas de Genentech y Biogen Idee han evaluado la efectividad terapéutica de tratamiento de enfermedades auto inmunes utilizando dosis de anti-CD20 (hu2H7.vl6 y Rituximab) en el intervalo tan bajo como lOmg hasta una dosis de Ig (ver la sección de antecedentes para estudios de Rituximab; y WO 04/056312, Ejemplo 16). En general, los anticuerpos se administraron en estas investigaciones químicas en dos dosis, separadas aproximadamente dos semanas. Ejemplos de regímenes estudiados en las investigaciones clínicas incluyen, para el anticuerpo CD20 humanizado 2H7.vl6 en artritis reumatoide a 2 x lOmg (promedios 2 dosis a lOmg por dosis; dosis total de ~10.1mg/m2 para 70kg, 67 para un paciente de 70kg de peso, 1.70m (67 pulgadas) de altura), 2 x 50mg (dosis total de 55mg/m2 para un paciente de 70kg, 1.70m (67 pulgadas) de altura), 2 x 200 mg (dosis total de 220mg/m2 para un paciente de 70kg de peso, 1.70m (67 pulgadas) de altura) , 2 x 500 (dosis total de -550 mg/m2 para un paciente de 70kg de peso, l.70m (67 pulgadas) de altura) y 2 x 1000 (dosis total de -1100 mg/m2 para un paciente de 70kg de peso, 1.70m (67 pulgadas) de altura) ; y para Rituxan, 2 x 500 mg (dosis total de -550 mg/m2 para un paciente de 70kg de peso, 1.70m (67 pulgadas) de altura), 2 x 1000 mg (dosis total de -1100 mg/m2 para un paciente de 70kg de peso, 1.70m (67 pulgadas) de altura) . En cada una de estas dosis, agotamiento substancial de linfocitos B en circulación se observa siguiendo la administración de la primera dosis del anticuerpo. En los presentes métodos de tratar enfermedades auto inmunes y de agotarse células B en un paciente que tiene una enfermedad auto-inmune, en una modalidad, un anticuerpo 2H7 humanizado se administra a una dosis llana en el intervalo de O.lmg a lOOOmg. Hemos encontrado que a dosis llanas o planas menores a 300mg, incluso lOmg, se logra un agotamiento substancial de células B . De esta manera, en los presentes métodos de agotamiento y tratamiento de células B en diferentes modalidades, el anticuerpo hu2H7.v511 se administra en dosis de 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20 25, 30, 40,50, 75, 100, 125, 150, 200, o 250mg. Menores dosis, por ejemplo, a 20mg, lOmg o menores pueden emplearse si es el objetivo agotamiento de células B a corto plazo o parcial . Dependiendo de la enfermedad, los anticuerpos anti-integrina tales como cu 4 y a~L anticuerpos pueden administrarse al paciente en un intervalo de dosis de aproximadamente lmg/kg a 20mg/kg. En diferentes modalidades, el intervalo de dosis es l-15mg/kg, 1-10mg/kg, 2-10mg/kg, 3-10mg/kg. En una modalidad específica, cada uno de los «4 y l¡ anticuerpos se administra a aproximadamente 5mg/kg. Como una proposición general, la cantidad farmacéuticamente efectiva inicial de los antagonistas de molécula pequeña de las a 4 o al¡ integrinas cuando se administran parenteralmente por dosis estará en el intervalo de aproximadamente 0.01-100mg/kg, de preferencia aproximadamente 0.1 a 20mg/kg del peso corporal del paciente por dia, con el intervalo inicial típico de un compuesto empleado que es 0.3 a 15mg/lcg/día . Formas de dosis unitarias orales tales como tabletas y cápsulas, de preferencia contienen de aproximadamente 25 a aproximadamente 100 Omg de un compuesto de la invención. Para tratar enfermedad, los agentes de movilización y agotamiento de célula B de la invención pueden administrarse al paciente crónica o intermitentemente, como se determina por el médico con destreza en la enfermedad. Un paciente que se le administra una droga por infusión intravenosa o sub-cutáneamente, puede experimentar eventos adversos tales como fiebre, calosfríos, sensación de quemado, astenia y dolor de cabeza. Para aliviar o minimizar estos eventos adversos, el paciente puede recibir una o varias dosis de acondicionamiento inicial del anticuerpo, seguido por una dosis terapéutica. La o las dosis de acondicionamiento serán menores que la dosis terapéutica para acondicionar al paciente a tolerar superiores dosis. 5. Ruta de administración. Los antagonistas y anticuerpos empleados en los métodos de la invención se administran a un paciente humano de acuerdo con métodos conocidos para los practicantes médicos, tales como por administración intravenosa, por ejemplo como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por rutas sub- cutánea, intramuscular, intra-arterial , intraperitoneal , intrapulmonar, intracerebro-espinal , intra-articular, intrasinovial , intratecal, intralesional o de inhalación (por ejemplo intranasal) , en general por administración intravenosa o subcutánea. En una modalidad, el anticuerpo 2H7 humanizado y/o anticuerpo anti-alfa4betal humanizado, natalizumab, se administra por infusión intravenosa con solución de cloruro de sodio 0.9% como un vehículo de infusión. 6. Terapia de combinación. Para tratar neoplasmas de célula B descritos anteriormente, puede tratarse el paciente con los agentes de movilización de célula B y los agentes de agotamiento de célula B en particular, anticuerpos de enlace CD20 de la presente invención en conjunto con uno o más agentes terapéuticos tales como un agente quimio terapéutico en un régimen de múltiples drogas. El agente de movilización de células B y el agente de agotamiento de células B, por ejemplo anticuerpo de enlace CD20, puede administrarse en forma concurrente secuencial o alterna con el agente quimio terapéutico, o después de no respuesta con otra terapia. Quimioterapia estándar para tratamiento de linfoma incluir ciclofosfamidas , citarabina, melfalán y mitoxantrona mas melfalán. CHOP es uno de los regímenes de quimioterapia más comunes para tratar linfoma No- Hodgkin. Las siguientes son drogas empleadas en el régimen CHOP: ciclofosfamida (nombres comerciales cytoxan, neosar) ; adriamicina (doxorubicina/ hidroxidoxorubicina) ; vincristina (Oncovin) ; y prednisolona (en ocasiones denominada Deltasone o Orasone) . En modalidades particulares, el agente de agotamiento de célula B tal como el anticuerpo de enlace CD20 y agentes de movilización de células B tales como antagonista a4 o al¡ integrina, se administra a un paciente que lo requiere en combinación con uno o más de los siguientes agentes quimio terapéuticos de doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina y prednisolona. En una modalidad especifica, un paciente que sufre de un linfoma (tal como linfoma no-Hodgkin) se trata con un anticuerpo anti-CD20 y un anticuerpo anti-alfa4betal de la presente invención en conjunto con terapia CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona) . En otra modalidad, el paciente de cáncer puede tratarse con un anticuerpo de enlace CD20 humanizado y un antagonista de y/o al¡ integrina de molécula pequeña de la invención en conjunto con quimioterapia CVP (ciclofosfamida, vincristina y prednisona) . En una modalidad específica, el paciente que sufre de NHL CD20 positivo se trata con 2H7.vl6 humanizado y natalizumab en conjunto con CVP. En una modalidad específica el tratamiento de CLL, un anticuerpo de enlace CD20 y antagonista integrina se administra en conjunto con quimioterapia con una o ambas de fludarabina y citoxán. Para tratar las enfermedades auto inmunes o condiciones relacionadas auto inmunes anteriormente descritas, el paciente puede tratarse con el agente de agotamiento de célula B tal como un anticuerpo de enlace CD20 y un antagonista ÉZ y/o aL integrina en conjunto con un segundo agente terapéutico tal como un agente inmuno-supresor, tal como un régimen de múltiples drogas. El agente de agotamiento de célula B puede administrarse en forma concurrente, secuencial o alterna con el agente de movilización de células B, y en forma concurrente secuencial alterna con el agente inmuno-supresor o ante falta de respuesta con otra terapia. El agente inmuno-supresor puede ser administrado a las mismas o menores dosis que como se establece en la técnica. El agente inmuno-supresor auxiliar preferido dependerá de muchos factores, incluyendo el tipo de desorden a tratar así como la historia del paciente. "Agente inmuno-supresor" como se emplea aqui para terapia auxiliar se refiere a sustancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmune del paciente . Estos agentes incluirán sustancias que suprimen producción de citoquina, regulan en forma descendente o suprimen expresión de auto-antígeno o enmascaran los antígenos MHC. Ejemplos de estos agentes incluyen esteroides tales como glucocorticoesteroides , por ejemplo prednisona, metilprednisolona, y dexametasona; pirimidina 2-amino-6-aril~5 substituidos (ver patente de los EUA número 4,665,077), azatioprina (o ciclofosfamida, si hay una reacción adversa a azatioprina) ; bromocriptina; glutaraldeida (que enmascara los antígenos MHC como se describe en la patente de los EUA número 4,120,649); anticuerpos anti-idiotípicos para antígenos MHC y fragmentos MHC; ciclosporina A; citoquina o antagonistas de receptor de citoquina incluyendo anticuerpos anti-interferona- ? , -ß, o -a ; - anticuerpos de factor de necrosis anti-tumor; -ß anticuerpos de factor de necrosis anti-tumor; y anticuerpos de anti-interleuquina*interleukin-2 , y anticuerpos receptores anti-IL-2; anticuerpos anti-L3T4; globulina anti-linfocitos heterólogos; pan-T anticuerpos, de preferencia anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; péptidos solubles que contienen dominio de enlace LFA-3 (WO 90/08187 publicada en 7/26/90); estreptoquinasa; TGF- ß ; estreptotornasa; RNA o DNA del anfitrión; FK506; RS-61443; deoxispergualina; rapamicina; receptor de célula T (patente de los EUA número 5,114,721); fragmentos receptores de célula B (Offner et al., Science 251:430- 432 (1991) ; WO 90/112941 y WO 91/01133) ; y anticuerpos receptores de célula T (EP 340,109) tal como T10B9. Para el tratamiento de artritis reumatoide, el paciente puede tratarse con un agente de agotamiento de célula B tal como un anticuerpo anti-CD20 y un agente de movilización de célula B tal como un antagonista de 4 y/o aL integrina en conjunto con cualquiera uno o más de las siguientes drogas: drogas antirreumáticas que modifican la enfermedad (DMARD= disease-modifying anti-rheumatic drugs) (por ejemplo metotrexato) , NSAI o NSAID (drogas anti- inflamatorias no esteroidales) , HUMIRAMR (adalimumab; Abbott Laboratories) , ARAVAMR (leflunomide) , REMICADEMR (infliximab; Centocor Inc . , of Malvern, Pa) , inhibidores COX-2 ENBREL (etanercept; Immunex, WA) . DMARDs comúnmente empleados en RA son hidroxicloroquina, sulfasalacina, metotrexato, lefunomida, etanercept, infliximab, azatioprina, D-penicilamina, oro (oral) , oro (intramuscular) , minociclina, ciclosporina, inmunoadsorcion de proteina A de estafilococo. Adalimumab es un anticuerpo monoclonal humano que liga a TNFa . Infliximab es un anticuerpo monoclonal quimérico que liga a TNFa . Etanercept es una proteína de fusión "inmunoadhesina" que consiste de la porción de enlace ligando extracelular del receptor de factor de necrosis de tumor humano 75kD (p75) (TNFR= tumor necrosis factor receptor) * (vamos a checar que esté completo) enlazado con la porción Fe de un IgGl humano. Para tratamiento convencional de RA, ver por ejemplo "Guidelines for the management of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheumatism 46 (2) : 328-346 (febrero, 2002) . En una modalidad especifica, el paciente RA se trata con un anticuerpo CD20 de la invención en conjunto con metotrexato (MTX) . Una dosis ejemplar de MTX es aproximadamente 7.5-25 mg/kg/semana . MTX puede administrarse en forma oral y subcutánea. Para el tratamiento de spondilitis anquilosante, artritis psoríatica y enfermedad de Crohn, puede tratarse el paciente con un agente de agotamiento de células B tal como anticuerpo enlace CD20 y un agente de movilización de célula B tal como un antagonista de c 4 y/o aL integrina en conjunto por ejemplo con RemicadeMR (infliximab; de Centocor Inc., de Malvern, Pa. ) , ENBREL (etanercept ; Immunex, WA) . Tratamientos para SLE incluyen altas dosis de corticoesteróides y/o ciclofosfamida (HDCC) . Para el tratamiento de psoriasis, los pacientes se les puede administrar un agente de agotamiento de células B tal como un anticuerpo de enlace anti-CD20 y un agente de movilización de células B tal como un antagonista de alfa y/o alfaL integrina, en conjunto con tratamientos tópicos tales como esteroides tópicos, antralina, calcipotrieno, clobetasol y tasaroteno, o con metortersarto retinoide, cicloporina, terapias de PUVA y UW. En una modalidad, el paciente de psoriasis se trata con anticuerpo de enlace CD20 secuencialmente o en forma concurrente con ciclosforina. 7. Formulaciones Farmacéuticas Formulaciones terapéuticas de los agentes de agotamiento de células B, tales como anticuerpos de enlace CD20 y agentes de movilización de célula B, tales como antagonistas de alfa4 y/o alfaL integrina empleados de acuerdo con la presente invención, se preparan para almacenamiento al mezclar el agente o antagonista de molécula pequeña, por ejemplo un anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con portadores excipientes o estabilizantes farmacéuticos opcionales {Remington' s Pharmaceutical Sciences 16ava edición, Oslo, A. Ed. (1980) ) , en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas . Portadores excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos a los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbenzil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro benzalko io; cloruro benzetonio; fenol, butil o benzil alcohol; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menores a aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofilicos tales como polinivilpirrolidona; amino ácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacaridos , disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trealosa, o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de proteína-Zn) ,·. y/o surfactantes no iónicos tales como TWEENMR, PLURONICSMR o polietilen glicol (PEG) . Formulaciones de anticuerpos anti-CD20 ejemplares se describen en W098/56418, expresamente incorporada aquí por referencia. Otra formulación es una formulación de multidosis líquida que comprende el anticuerpo anti-CD20 a 40 mg/mL, acetato 25 mM, trehalosa 150 mM, alcohol benzil 0.9%, polisorbate 20 0.02% a pH 5.0 que tiene una vida en almacenamiento mínima de dos años a 2-8 °C. Otra formulación anti-CD20 de interés comprende lOmg/mL de anticuerpo en 9.0 mg/mL cloruro de sodio, 7.35 mg/mL de citrato de sodio dihidrato, 0.7mg/mL polisorbate 80, y agua estéril para inyección, pH 6.5. Todavía otra formulación farmacéutica acuosa comprende acetato de sodio 10-30 mM de aproximadamente pH 4.8 a aproximadamente pH 5.5, de preferencia a pH 5.5, polisorbate como un surfactante en una cantidad de aproximadamente 0.01-0.1% v/v, trehalosa en una cantidad de aproximadamente 2-10% p/v, y alcohol bencílico* (c o z) como un conservador (Patente de los E.U.A. No. 6,171,586). Formulaciones liofilizadas adaptadas para administración subcutánea se describen en W097/04801. Estas formulaciones liofilizadas pueden reconstituirse como un diluyente conveniente a una elevada concentración de proteínas y la formulación reconstituida puede administrarse subcutáneamente al mamífero a tratarse aquí . Una formulación de anticuerpo para las variantes 2H7 humanizadas comprende un anticuerpo en 12-14 mg/mL en histidina 10 mM, sacarosa 6%, polisorbate 20 0.02%, pH 5.8. En una modalidad específica, variantes 2H7 y en particular 2H7.vl6 se formula a 20mg/mL el anticuerpo en sulfato de histidina lOmM, 60mg/ml sacarosa, 0.2 mg/ml polisorbate 20, y agua estéril para inyección en pH 5.8.

Formulaciones ejemplares de antagonistas de integrina molécula pequeña se describen, por ejemplo, en WO 02/059114. La formulación aqui también puede contener mas de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, de preferencia aquellos con actividades complementarias que no afectan adversamente entre si. Por ejemplo, puede ser conveniente el proporcionar adicionalmente un agente citotóxico, agente quimioterapéutico, citoquina o agente inmunosupresor (por ejemplo, uno que actúa en células T, tal como ciclosporina o anticuerpo que liga células T por ejemplo uno que liga que liga LFA-1) . La cantidad efectiva de estos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de enfermedad o desorden o tratamiento y otros factores discutidos anteriormente. Estos en general se emplean en las mismas dosis y con rutas de administración como se describe aquí o de aproximadamente 1 a 99% de las dosis hasta la fecha empleadas. Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas por ejemplo por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli (metilmetacilato) respectivamente, el sistema de suministro de droga coloidal (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanoparticulas y nanocápsulas) o en raacro emulsiones. Estas técnicas se describen en Remington' s Pharmaceutical Sciences 16ava edición, Oslo, A. Ed. (1980) . Preparaciones de liberación sostenida pueden prepararse. Ejemplos convenientes de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista, estas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , poli (vinilalcohol) ) , (Patente de los E.U.A No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etilenvinil acetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradable tales como LUPRON DEPOT"11 (microesferas inyectables compuestas por copolímeros de ácido láctico- ácido glicólico y leuprolida acetato) , y ácido poli-D- (-) -3hidroxibutirico . Las formulaciones a utilizarse para administración i vivo deben ser estériles . Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estéril . G. Artículos de Manufactura y Equipos Otra modalidad de la invención es un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento de una enfermedad auto inmune o un cáncer tal como CLL. El artículo de manufactura comprende al menos un recipiente y un inserto de empaque u etiqueta en o asociado con el recipiente. Recipientes convenientes incluyen por ejemplo botellas, ampolletas, jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. Al menos un recipiente contiene una composición que es efectiva para tratamiento de la condición y puede tener una compuerta de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o ampolleta que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Dos composiciones terapéuticas pueden proporcionarse en el artículo de manufactura. Al menos un agente activo en la primera composición es un agente de agotamiento de células B, tal como un anticuerpo de enlace CD20. La segunda o- segundo y tercer composición que contiene al menos un agente de movilización de células B, tal como un antagonista de alfa4 o alfaL integrina, por ejemplo anticuerpos alfaL y alfa4 integrina, pueden ser contenidos en uno o mas recipientes separados. De forma alterna, la o las composiciones antagonistas de integrina pueden empacarse en un articulo separado de manufactura. El inserto de empaque o etiqueta indica que la composición se emplea para tratar la condición particular. El inserto de empaque o etiqueta además comprende instrucciones para administrar las composiciones al paciente. El inserto de empaque se refiere a instrucciones usualmente incluidas en empaques comerciales de productos terapéuticos que contienen información respecto a las indicaciones, uso, dosis, administración, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de estos productos terapéuticos . Adicionalmente, el articulo de manufactura además puede comprender un recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI igual a bacteriostatic water for injection) , salino amortiguado con fosfato, solución de Ringer y solución de destrozo. Además puede incluir otros materiales convenientes desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores diluyentes, filtros, agujas y jeringas. H. producción de Anticuerpos I. Anticuerpos Monoclonales Pueden elaborarse anticuerpos monoclonales utilizando el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), o pueden elaborarse por método de DNA recombinante (Patente de los E.U.A. No. 4, 816, 567) . En el método de hibridoma, un ratón u otro animal anfitrión apropiado tal como un hámster, se inmuniza como se describió anteriormente para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que ligaran específicamente a la proteína empleada para inmunización. En forma alterna, linfocitos pueden inmunizarse in Vitro. Después de inmunización, los linfocitos se aislan y después funcionan con una línea celular de mieloma utilizando un agente de fusión conveniente tal como polietilen glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Las células de hibridoma así preparadas se siembran y desarrollan en un medio de cultivo conveniente, este medio de preferencia contiene una o mas substancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas (también referidas como socios de fusión. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima y hipoxantina guanina fosforibosil transferaza (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo selectivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT) , estas substancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Células de mieloma de socios de fusión preferidas son aquellas que se funden eficientemente, soportan una producción de alto nivel estable de anticuerpo por células productoras de anticuerpo selectas y son sensibles a medio selectivo que elige contra las células parentales no fusionadas. Líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón OPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y SP-2 y derivados, por ejemplo células X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano, también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) ) .

Medio de cultivo en donde células de hibridomas se desarrollan, se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antxgeno. De preferencia, la especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de enlace in Vi tro, tal como radio-inmune-ensayo (RIA) o ensayo inmunosolvente enlazado con enzima (ELISA) . La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede por ejemplo determinarse por el análisis Scatchard descrito en Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980). Una vez que las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada se identifican, los clones pueden ser subclonados por procedimientos de dilución limitante y desarrollados por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, p.59-103 (Academic Press, 1986) ) . Medios de cultivo convenientes para este propósito incluyen por ejemplo un medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma también pueden desarrollarse in vivo como tumores de ascitos en un animal, por ejemplo mediante inyección i.p. de las células en ratones . Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclonos se separan convenientemente del medio de cultivo, fluido de ascitos, o suero por procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales tales como por ejemplo cromatografía de afinidad (utilizando proteína A o proteína G-Sepharose) o cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel , diálisis, etc. ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo al utilizar sondas de oligonucleotido que son capaces de ligar específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos) . Las células de hibridomas sirven como una fuente preferida de este ADN. Una vez aislado, el DNA puede colocarse en vectores de expresión, que después se transectan entre los anfitriones tales como células de E. coli , células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra forma no producen proteína anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células anfitrionas recombinantes . Artículos de revisión en expresión recombinante en bacterias de DNA que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al., 1993, Curr. Opinión in Immunol. 5:256-262 y Plückthun, 1992, Immunol. Revs. 130 : 151-188 (1992) .

En una modalidad adicional, anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibliotecas fago de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554. Clackson et al., Nature, 1991, 352:624-628 y Marks et al., 1991, J". Mol. Biol . 222:581-597 que describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente usando bibliotecas fago. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por entremezclado de cadena) , asi como infección combinatoria y recomendación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas fago muy grandes (Waterhouse et al., 1993, Nuc. Acids . Res. 21: 2265-2266). De esta manera, estas técnicas son alternativas viables a técnicas de hibridoma anticuerpo monoclonales tradicionales para aislamiento de anticuerpos monoclonales . El DNA que codifica el anticuerpo puede modificarse para producir polipéptidos de anticuerpo de fusión o quiméricos, por ejemplo al sustituir secuencias de dominio constante de cadena pesada y cadena ligera humana (CH y CL) para las secuencias murinas homologas (Patente de los E.U.A No. 4,816,567; y Morrison, et al., 1984, Proc. Nati Acad. Sci . USA 81:6851), o por fusión de la secuencia de codificación de inmunoglobulina con todo o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no-inmunoglobulina (polipéptido heterólogo) . Las secuencias de polipéptido no-inmunoglobulina pueden sustituir los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antigeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene su especificidad para un antígeno diferente. 2. Anticuerpos Humanizados Métodos para humanizar anticuerpos no humanos se han descrito en la técnica. De preferencia, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de amino ácido introducidos en el desde una fuente que no es humano. Estos residuos amino ácido no humanos a menudo se refieren como residuos de "importación", que típicamente se toman de un dominio de variable de "importación". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones y colaboradores 1986, Nature 321: 522-525; Reichmann y colaboradores, 1988, Nature, 332:323-327 ; Verhoeyen y colaboradores 1988, Science 239: 1534-1536) , al substituir secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los E.U.A No. 4,816,567) en donde substancialmente menos que un dominio variable humano intacto sea substituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en donde algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se substituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La selección de dominios variables humanos, tanto ligeros y pesados a utilizarse para producir los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y respuesta HAMA (anticuerpo humano antiratón) cuando el anticuerpo se pretende para uso terapéutico en humanos . De acuerdo con el método de "mejor ajuste" así denominado, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo roedor se supervisa contra la biblioteca completa de las secuencias de dominio variable humano conocidas . La secuencia de dominio V humano que es más cercana a la del roedor se identifica y la región de marco humano (FR) dentro de ella se acepta para el anticuerpo humanizado (Sims y colaboradores, 1993, J". I munol. 151:2296; Chothia y colaboradores, 1987, J". Mol.

Biol., 196:901). Otro método utiliza una región marco particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco puede emplearse para varios anticuerpos humanizados difeentes (Cárter y colaboradores, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 4285; Presta y colaboradores, 1993, J. Immunol. 151:2623). Además es importante que se humanicen anticuerpos con retención de alta afinidad de enlace para el antigeno y otras propiedades biológicas favorables . Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parental y humanizadas. Modelos inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos con destreza en la técnica. Están disponibles programas de computadoras que ilustran y exhiben estructuras de conformación tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidato selectas. La inspección de estas exhibiciones permite análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidato para ligar su antígeno. De esta manera, residuos FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias de importación y receptor de manera tal que la característica de anticuerpo deseada tal como afinidad incrementada para el o los antigenos diana, se logra. En general, los residuos de región hipervariable están involucrados en forma directa y más substancialmente en influenciar enlace de antígeno. El anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo tal como Fab, que se conjuga opcionalmente con uno o más agentes citotóxicos a fin de generar un inmunocon ugado . En forma alterna, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo de longitud íntegra, tal como un anticuerpo IgG de longitud íntegra. 3. Anticuerpos Humanos y Metodología de Exhibición Fago Como una alternativa a inmunización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces ante inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación*deletion homozigota del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal, resulta en inhibición completa de producción de anticuerpo endógena. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulina de linea germinal humana en estos ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos ante ataque con antígeno. Ver por ejemplo, Jakobovits y colaboradores, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 2551; Jakobovits y colaboradores, 1993 Nature 362: 255-258; Bruggemann y colaboradores, 1993, Year in Immuno. 7: 33; Patentes de los E.U.A. Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (todas las de GenPharm) ; 5,545,807; y WO 97/17852. En forma alterna, la tecnología de exhibición fago (McCafferty y colaboradores, 1990, Nature 348:552-553) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vi tro, de repertorios de gen de dominio variable de inmunoglobulina (V) de donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio de anticuerpo V se clonan en marco ya sea en un gen de proteína de revestimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y exhiben como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola hebra del genoma fago, selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe estas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La exhibición fago puede realizarse en una variedad de formatos, revisado por ejemplo, Johnson y colaboradores, 1993, Current Opinión in Structural Biology 3:564-571. Varias fuentes de segmento de gen V pueden utilizarse para exhibición fago. Clackson y colaboradores, 1991, Nature 352:624-628 aisló un conjunto diverso de anticuerpos anti-oxazolona de una pequeña biblioteca combinatoria al azar de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donadores humanos no inmunizados puede construirse y anticuerpos a un conjunto diverso de antlgenos (incluyendo Auto-antígenos) puede aislarse esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks y colaboradores, 1991, J". Mol. Biol. 222: 581-597, o Griffith y colaboradores, 1993, EMBO J. 12: 725-734. Ver también las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Como se discutió anteriormente, anticuerpos humanos también pueden generarse por células B activadas in vi tro (ver también las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,567,610 y 5,229,275) . . Fragmentos de Anticuerpo En ciertas circunstancias hay ventajas de utilizar fragmentos de anticuerpo, en vez de anticuerpos enteros . El tamaño menor de los fragmentos permite rápida liberación y puede conducir a un acceso mejorado a tumores sólidos . Diversas técnicas se han desarrollado para la producción de fragmentos de anticuerpos .

Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron mediante digestión proteolitica de anticuerpos intactos (ver por ejemplo, Morimoto y colaboradores, 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; y Brennan y colaboradores, 1985, Science, 229:81). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por cpelulas anfitrionas recombinantes . Fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv todos pueden expresarse en y secretarse de E. coli , permitiendo de esta manera la producción fácil de grandes cantidades de estos fragmentos. Fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibliotecas fago de anticuerpo discutidas previamente. En forma alterna, fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter y colaboradores, 1992, Bio/ echnology 10:163-167). De acuerdo con otro enfoque, fragmentos F (ab')2 pueden aislarse directamente de cultivo de células huésped recombinantes . Fragmentos Fab y F(ab')2 con incrementada vida media in vivo que comprende un receptor de recuperación que liga residuos epítope se describe en la Patente de los E.U.A. No. 5,869,046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes para el practicante con destreza. En otras modalidades, el anticuerpo a selección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) . Ver WO 93/16185; Patente de los E.U.A. No. 5,571,894; y Patente de los E.U.A. No. 5,587,458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos carentes de regiones constantes; de esta manera, son adecuados para reducir enlace en específico durante uso in vivo. Proteínas de fusión sFv pueden construirse para permitir fusión de una proteína efectuada ya sea en el extremo amino o carboxi de un sFv. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo como se describe en la Patente de los E.U.A. No. 5,641,870 por ejemplo. Estos fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecíficos o biespecificos . 5. Anticuerpos Biespecificos Anticuerpos biespecificos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para cuando menos dos epítopes diferentes. Anticuerpos biespecificos ejemplares pueden ligar a dos epítopes diferentes de la proteína CD20. Otros de estos anticuerpos pueden combinar un sitio de enlace CD20 con un sitio de enlace para otra proteína. En forma alterna, un brazo anti-CD20 puede combinarse con un brazo que liga a una molécula de activación en un leucocito tal como una molécula receptora de célula T (por ejemplo CD3) , o receptores Fe para IgG(FcfR), tal como Fc^RI (CD64) , Fc^RII (CD32) y Fey RUI (CD 16}, o NKG2D u otro ligando de activación de células NK, para enfocar y localizar mecanismos, de defensa celular a la célula de expresión CD20. Anticuerpos biespecífieos también pueden emplearse para localizar agentes citotóxicos con células que expresan CD20. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace CD20 y un brazo que liga el agente citotóxico (por ejemplo saporina, anti-interferona- a , vinca alcaloide, cadena ricina A, metotrexato o isótopo radioactivo hapteno) . Anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud integra o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab')2). WO 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico ErbB2/anti-Fcy RUI y Patente de los E.U.A. No. 5,837,234 describe un anticuerpo anti-ErbB2/anti-Fc¡ RI biespecífico. Un anticuerpo anti-ErbB2/Fc a biespecífico se muestra en W098/02463. La Patente de los E.U.A. No. ,821,337 ilustra un anticuerpo anti-ErbB2/anti-CD3 biespecífico . Métodos para producir anticuerpos biespecíficos se conocen en la especialidad. Producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud íntegra se basa en la co-expresión de dos pares de cadena ligera, cadena pesada inmunoglobulina en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein y colaboradores 1983, Nature, 305: 537-539). Debido al surtido aleatorio de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferente moléculas de anticuerpo, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. Purificación de la molécula correcta, que usualmente se realiza por etapas de cromatografá definida, es más bien problemática y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829, y en Traunecker y colaboradores, 1991, EMBO J, 10: 3655-3659. De acuerdo con un enfoque diferente, dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. De preferencia, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada Ig, que comprende al menos parte de la bisagra, regiones CH2 , y CH3. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para el enlace de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transfectan en una célula anfitriona conveniente. Esto proporciona mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipéptido en modalidades en donde proporciones diferentes de las tres cadenas polipéptido empleadas en la construcción proporcionan el rendimiento óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas polipéptido en un solo vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipéptido en proporciones iguales resulta en altos rendimientos o cuando las proporciones no tienen efecto significante en el rendimiento de la combinación de cadena deseada. En una modalidad preferida de este enfoque, los anticuerpos biespeclficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglubulina híbrida con una primet especificidad de enlace en un brazo, y un par de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina híbrido (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo . Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena inmunoglobulina indeseadas como la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecifica proporcionando una forma fácil de separación. Este enfoque se describe en WO 94/04690. Para mayores detalles en generar anticuerpos bispecíficos ver por ejemplo Suresh y colaboradores, 1986, Methods in Enzymology 121:210. De acuerdo con otro enfoque, descrito en la Patente de los E.U.A. No. 5,731,168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo pueden someterse a ingeniería para llevar al máximo el por ciento de hetero dímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante . La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3. En este método, uno o más cadenas laterales de amino ácido pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con más grandes cadenas laterales (por ejemplo tirosina o trptofano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar de la o las cadenas laterales grandes se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar grandes cadenas laterales de aminoácido con más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales indeseables tales como homodimeros . Anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos entrelazados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse con avidina, el otro con biotina. Estos anticuerpos por ejemplo se ha propuesto que hagan diana en células del sistema inmune a células indeseadas (Patente de los E.U.A. No. 4,676,980), y para tratamiento de infección HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089) . Anticuerpos heteroconj gados pueden elaborarse utilizando cualesquiera métodos de entrelazamiento convenientes. Agentes de entrelazamiento convenientes son bien conocidos en la técnica y se describen en la Patente de los E.U.A. No. 4,676,980, junto con una cantidad de técnicas de entrelazamiento. Técnicas oara generar anticuerpos biespecificos de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecificos pueden prepararse utilizando enlace químico. Brennan y colaboradores, 1985, Science 229: 81 describe un procedimiento en donde anticuerpos intactos se escinden proteolíicamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la presencia de un agente complejante ditiol, arsenito de sodio, para estabilizar ditioles vecinales y evitar formación de disulfuro intramolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' -TNB se reconvierte entonces al Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab '-TNB para formar el anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos biespecí icos producidos pueden emplearse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Reciente avance ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab'-SH de E. col!, que pueden acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos . Shalaby y colaboradores, 1992, J". Exp. Med. , 175: 217-225 describe la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecifico totalmente humanizada. Cada fragmento Fab' se secretó separadamente de E. coli y sometió a acoplamiento químico dirigido xn vitro para formar el anticuerpo biespecifico. El anticuerpo biespecifico así formado fue capaz de ligar a células que sobre expresan al receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como activar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de pecho humano . Diversas técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpo biespecificos directamente de cultivo celular recombinante también se han descrito. Por ejemplo, anticuerpos biespecificos se han producido utilizando cremalleras leucina. Kostelny y colaboradores, 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Los péptidos cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron con las porciones Fab ' de dos anticuerpos diferentes por fusión de genes . Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después reoxidan para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo . La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollxnger y colaboradores, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 ha proporcionado un mecanismo alterno para producir fragmentos de anticuerpo bioespecificos . Los fragmentos comprenden un VH conectado con un VL por un enlazador que es muy corto para permitir apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con esto, los dominios VH y VL de un fragmento se forzan para aparear con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de esta manera dos sitios de enlace antígeno. Otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecificos por el uso de dímeros Fv de cadena sencilla (sFv) también se reporta. Ver Gruber y colaboradores, 1994, J. Inmuno1. 152: 5368. Anticuerpos con más de dos valencias se contemplan. Por ejemplo, anticuerpos triespecificos pueden prepararse Tutt y colaboradores, 1991, J. Immunol. 147:60. 6. Anticuerpos Multivalentes Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antlgeno al cual se ligan los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes a la clase IgM) con tres o más sitios de enlace de antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes) , que pueden producirse fácilmente por expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de enlace de antígeno . El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste de) una región Fe o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de enlace de antígeno amino-terminales a la región Fe. El anticuerpo multivalente preferido aguí comprende (o consiste de) tres aproximadamente ocho, pero de preferencia cuatro sitios de enlace antígeno. El anticuerpo multivalente comprende cuando menos una cadena polipéptido (y de preferencia dos cadenas polipéptido) , en donde la o las cadenas polipéptido, comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la o las cadenas polipéptido pueden comprender VD1- (Xl)n-VD2- (X2)n-Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena polipéptido de una región Fe, XI y X2 representan un amino ácido o polipéptido y n es 0 o 1. Por ejemplo, la o las cadenas polipéptido pueden comprender: región de cadena VH-CH1-enlazador flexible VH-CHl-Fc; o región de cadena VH-CHI-VH-CHI-Fc. El anticuerpo multivalente aguí de preferencia además comprende al menos dos (y de preferencia cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente aquí puede por ejemplo comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Estos polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados aguí comprenden un dominio variable de cadena ligera y opcionalmente además comprenden un dominio CL. 7. Selección y Transformación de Células Anfitrionas Células anfitrionas convenientes para clonación o expresión de mAbs recombinante, inmunoadh.esinas y otros antagonistas de polipéptido descritos aquí, son células procariotas, de levadura o eucariotas superiores. Procariotas convenientes para este propósito incluyen eubacteria, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo Enterobacteriaceae tales como Escherlchia, e.g., E. coli , Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e. g. , Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratiamarcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (e.g., B. licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de abril 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un anfitrión de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), y E. coli W3110 (ATCC 27,325) son convenientes. Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes . Pueden producirse en bacterias anticuerpos de longitud íntegra, fragmentos de anticuerpo, y proteínas de fusión de anticuerpo, en particular cuando no se requieren glicosilación y función efectora Fe, tal como cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga con agente citotóxico (por ejemplo una toxina) y el inmunoconjugado por sí mismo muestra efectividad en destrucción de células de tumor. Anticuerpos de longitud íntegra tienen mayor vida media en circulación. La producción en E. coli es más rápida y más eficiente en costo. Para expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, ver por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 5,648,237 (Cárter et . al.), patente de los E.U.A. No. 5,789,199 (Joly et al.), y la patente de los E.U.A. No. 5,840,523 (Simmons et al.) que describen secuencias de señal y región de inicio de traducción (TIR - translation initiation región) para optimizar expresión y secreción, estas patentes aquí se incorporan por referencia. Después de expresión, el anticuerpo se aisla de la pasta de célula E. coli en una fracción soluble y puede ser purificado a través de por ejemplo una columna de proteína A o G dependiendo del isotipo. Purificación final puede llevarse a cabo en forma similar al proceso para purificar anticuerpo expresado por ejemplo en célula CHO. Además de procariotas, microbios eucarióticos tales como levaduras u hongos filamentosos son adecuados huéspedes de clonación o expresión para codificación de anticuerpo, tales como vectores de codificación de anticuerpo CD20. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de repostero común, es el más comúnmente empleado entre los microorganismos anfitriones eucarióticos inferiores. Sin embargo, una cantidad de otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles aguí, tales como Schizosaecharomyees pombe; anfitriones Kluyveromyces tales como, e.g., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K.wickerainii (ATCC 24,178), K waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, y K inarxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwannioinyces occidentales; y hongos filamentosos tales como, e.g. , Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y anfitriones Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger. Células anfitrionas convenientes para expresión por ejemplo de anticuerpo de enlace CD20 glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células invertebradas incluyen células de plantas e insectos . Numerosas cepas de baculovirus y variantes y células anfitrionas de insecto permisivas correspondientes de anfitriones tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophilamelanogaster (mosca de las frutas) , y Bo byx mori se han identificado. Una variedad de cepas virales para transfección están disponibles públicamente, por ejemplo la variante L-l de Autographa californica NPV y la variante Bm-5 de Bombyx mori NPV, y estos virus pueden emplearse como el virus de conformidad con la presente invención, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda. Cultivos de células de plantas para algodón, maiz, papa, soya, petunia, tomate y tabaco también pueden emplearse como anfitriones. Sin embargo, el interés ha sido el más grande en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Ejemplos de lineas celulares de anfitriones de mamíferos útiles son lineas CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; linea riñon embriónico humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216); células sertoli de ratón (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251; células de riñon de mono (CVI ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75) ; células de hígado humano (Hep G2 , HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI ( ather et al., 1982, Annals N. Y. Acad. Sci . 383:44-68); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2) . Células anfitrionas se transforman con vectores de expresión o clonación para un anticuerpo de agotamiento de células B tal como anticuerpo de enlace CD20, o una producción de anticuerpo antagonista de integrina y cultivan en medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificiar los genes que codifican las secuencias deseadas. 8. Cultivo de las Células Anfitriones Las células anfitrionas empleadas para producir un anticuerpo de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medio. Medios comercialmente disponibles tales como Ham's FIO (Sigma) , (Medio Esencial Mínimo (MEM - Minimal Essential Médium) ) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y medio Eagle Modificado con Dulbecco ( (DMEM) , Sigma) son adecuados para cultivar las células anfitrionas. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255, patentes de los E.U.A. Nos. 4, 767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o patente de los E.U.A. Re. 30,985 pueden emplearse como medio de cultivo para las células anfitrionas . Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , amortiguadores (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como la droga GENTAMYCINMR) , elementos en trazas (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquiera otros suplementos necesarios también pueden incluirse a concentraciones apropiadas que se conocerán por aquellos con destreza en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y semejantes, son aquellas previamente empleadas con la célula anfitriona selecta para expresión, y serán aparentes a la persona con destreza ordinaria. 9. Purificación de Anticuerpo Cuando se utilizan técnicas recombinantes , el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o directamente secretado al medio.

Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa, los desechos en partículas, ya sean células huésped o fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167 describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli . Brevemente, la pasta celular se descongela en la presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) sobre aproximadamente 30 min. Desechos celulares pueden retirarse por centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, sobrenadantes de estos sistemas de expresión en general primero se concentran utilizando un filtrado de concentración de proteina comercialmente disponible, por ejemplo una unidad de filtración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y pueden incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios . La composición de anticuerpo preparada a partir de las células pueden purificarse utilizando por ejemplo cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad; con la cromatografía de afinidad que es la técnica de purificación preferida. La conveniencia de proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies e isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. Proteína A puede emplearse para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas gammal, gamma2, o gammaé humano (Lindmark y colaboradores., 1983, J". Immunol . Meth. 62: 1-13). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para gamma3 humano (Guss et al., 1986, EMBO J. 5: 15671575) . La matriz a la cual el ligando de afinidad se conecta más a menudo es agarosa, pero otras matrices están disponibles. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli (estirendivinil) benzeno permiten gastos de flujo más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se logran con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX*"1 (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteína tales como fraccionación en una columna de intercambio de iones, precipitación de etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina, cromatografía de SEPHA OSEMR en una resina de intercambio de aniones o cationes (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de amonio, también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar. Siguiendo cualesquiera etapa o etapas de purificación preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrofóbica de bajo pH utilizando un amortiguador de elución a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, de preferencia realizado a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0.25M de sal) . 10. Anticuerpos Conjugados El anticuerpo puede conjugarse a un agente citotóxico tal como una toxina o un isótopo radioactivo. En ciertas modalidades, la toxina es calicheamicina, un maitansinoide, una dolastatina, auristatina E y análogos o derivados de los mismos, son preferibles. Ejemplos Experimentales Estos ejemplos experimentales son a manera de ilustración y no se pretenden como una limitación en el alcance de la invención. Ejemplo 1 Generación de un modelo de ratón de la expresión Tg hCD20 Un modelo murino que expresa el sitio genómico humano CD20 (hCD20) (ratones hCD20Tg++) se desarrolla para analizar mecanismo in vivo de función para mAbs terapéutico que elimina células al hacer diana en antígenos de superficie celular. Dos cromosomas aritificiales bacterianos independientes (BACs) se inyectan en blastocistos derivados de ratones FVB para generar múltiples lineas fundadoras transgénicas que expresan hCD20. Dos ratones fundadores que transmiten expresión hCD20 a progenia se sometieron a un análisis más detallado. Ambas líneas fundadoras demostraron patrones idénticos de expresión hCD20 y por lo tanto datos de solo una linea fundadora se presentarán aqui . Sub-poblaciones de linfocitos en circulación de los ratones transgénicos hCD20 (hCD20Tg+) se analizaon por FACS y caracterizaron de acuerdo con la expresión de antígenos B220 y CD3 en linfocitos periféricos como se muestra en la Figura 1 (panel izquierdo superior) . Cada una de las poblaciones encasilladas en el panel izquierdo superior se analizan para expresión de hCD20; CD3~ B220++ (panel derecho superior) , CD3+ B220" (panel derecho inferior) , y células CD3"B220" (panel izquierdo inferior) . Análisis de células de sangre periférica reveló que hCD20 se expresó exclusivamente en células B220+ B en circulación (Figura 1) . El nivel de expresión en ratones hCD20 Tg+/+, como se determina por intensidad fluorescente promedio (MFI) , fue aproximadamente 50% del de la célula B en circulación humana. No se detectó expresión de hCD20 en células B220" periféricas. Expresión de hCD20 no fue detectable en compañías de carnada Tg" (Figura 1, sombreada) . Conforme las células B se desarollan en la médula ósea, la expresión hCD20 durante ontogenia de célula B se analizó. Como se muestra en el panel superior de la Figura 2, hCD20 se detecta fácilmente en células B inmaduras, caracterizado como CD43" B220loIg + (ver Figura 3) . Además, hCD20 se reguló en forma ascendente en el bazo, con el más alto nivel de expresión de hCD20 detectado en células B de zona marginal (MZ) (Figura 2, medio) . Inmunohistoquimica se realiza en ratones Tg+ y Tg" para analizar la expresión de hCD20. Bazos de ratones Tg+ o Tg" se tiñieron para IgM (verde) , hCD20 (rojo) , o CD3 (azul) . Análisis inmunohistoquímico (IHC) de tejido esplénico reveló co-localización de tinción hCD20 con IgM entre las zonas de células B (datos no mostrados) . La tinción hCD20 no se co-localizó con IgMhl que tiñen células de plasma por análisis IHC, ni en células de plasma Syndecan 1+ por análisis FACS . hCD20 se detectó en células Bl y B2 perxtoneales, células B de nodo linfático maduro, células B de centro germinal de Parche Peyer's (GC) (Figura 2-panel inferior) . Por lo tanto, la expresión hCD20 en estos ratones transgénicos recapitulan en forma cualitativa el patrón de expresión CD20 como se describe en humanos y ratones. Ejemplo 2 Agotamiento de células B in vivo por tratamiento con un anticuerpo anti-CD20 En este estudio, agotamiento de células B inducido por tratamiento con un anticuerpo anti-hCD20 demuestra cinéticas que difieren de acuerdo con el compartimiento celular en donde residen las células B. 1. Tratamiento MAb Anti-hCD20 Para analizar las consecuencias biológicas de tratamiento anti-hCD20 mAb, ratones hCD20 Tg+ se trataron intraperitonealmente con una sola dosis de .1 mg de IgG2a de ratón de control (anticuerpo no específico) o con un anti-hCD20 mAbs de panel que incluye RITUXA MR, 2H7, Bl, y 1F5. RITUXANMR, 2H7 y 1F5 ligan epítopos comparables ubicados dentro del segundo dominio extracelular de CD20-; Bl liga a un epítopo diferente pero superpuesto. Incubación de células B con Bl se ha descrito para no movilizar CD20 en transportes de membrana. Ya que el enlace de IgG2a de ratón a receptores Fe de ratón (FcRs) hace un mejor paralelismo al enlace de la estructura principal IgGx humana de RITUXANMR con FcRs de humanos, todos los anti-CD20 mAbs se examinaron en una estructura principal IgG2a murina . 2. Agotamiento de Células B de Circulación Células B presentes en la sangre periférica de ratones tratados y de control se analizaron por FACS . Subpoblaciones de células B se identificaron por expresión de CD23 y CD21. Como se muestra en la Figura 4, cada uno de los anti-hCD20 mAbs provoca agotamiento de células B periféricas (círculo) . Agotamiento de células B periféricas se correlaciona con la vida media en suero en circulación de mAb terapéutico (datos nos mostrados) . Sangre periférica de ratones hCD20 Tg+ tratados con el anticuerpo m2H7 anti-hCD20 se analizan el día 6, semana 6, y semana 14 posterior al tratamiento. Como se ilustra en la Figura 5, tratamiento con células B en circulación agotadas con anti-hCD20, como se muestra el día 6 (Figura 5, panel izquierdo) . Seis semanas posterior al tratamiento, cuando el anti-hCD20 mAb no fue más detectab-le en el suero (<1 /g/ml) , células B de nuevo se detectaron por análisis FACS dentro de la circulación (Figura 5, panel medio) . Subsecuentemente, células B en circulación normalizadas a niveles de pre-tratamiento, como se muestra en la semana 14 (Figura 5, panel derecho) . Consistente con la falta de expresión de hCD20 en la población progenitora de células B temprana (ver Figura 2) , solo células B en circulación CD20+ inmaduras y maduras en la médula ósea se agotaron (círculo) . 3. Agotamiento de Células B en Sangre, Nodos Linfáticos, Caridad Peritoneal La cinética de agotamiento de células B de la sangre, nodos linfáticos y cavidad peritoneal, se analizó en ratones hCD20 Tg+ tratados con m2H7 anti-hCD20 mAb como se describió anteriormente . Los resultados se ilustran en la Figura 6. Similar al agotamiento de las células B periféricas, análisis de la presencia de células B en la sangre (superior) , nodos linfáticos (mitad) y cavidad peritoneal (fondo) a 3 horas, dia 2, y día 21 demostraron que el tratamiento con anti-hCD20 mAb resultó en agotamiento de células B220+ de nodos linfáticos y cavidad peritoneal de ratones hCD20 Tg+ (Figura 6) . De manera interesante, la cinética de agotamiento difiere entre estos tres compartimentos. Mientras que más del 90% de las células B en circulación se agotaron dentro de 3 horas después de administración intravenosa (IV) de anti-hCD20 mAbs (panel superior) , células B de nodo linfático se agotaron dentro de 2 días ya sea con administración IV o intraperitoneal (IP) de anti-hCD20 mAbs (panel medio) , y células B perifonéales requerían aproximadamente 21 días para más de 90% de agotamiento, a pesar de administración IP de anti-hCD20 mAb (panel inferior) . Ya que las células B peritoneales recirculan mas lentamente que las células B de nodos linfáticos, la cinética distinta de agotamiento paralelo es paralela a la cinética de circulación de linfocitos. Ejemplo 3 Jerarquía de Susceptibilidades del Subconjunto de Células B El ejemplo 3 demuestra que los subconjuntos de células B muestran diferentes susceptibilidades a agotamiento de células B ante tratamiento de anticuerpo anti-CD20. 1. Agotamiento de Células B en Bazo Ratones transgénicos descritos anteriormente para el ejemplo 1 (ratones hCD20 Tg+) se trataron con IgG2 de control o anti-hCD20 mAb. Se recolectaron bazos el día 4 posterior al tratamiento y analizaron por tinción de B220, IgM, CD21, y CD23, y caracterizado como células B foliculares CD21hiCD23+ (FO) o células B de zona marginal (MZ) CD21hiCD23" (Figura 7) . Las células B en cada subconjunto se cuantificaron, como se muestra en la Figura 8. En contraste con células B maduras en circulación que se agotaron completamente por anti-hCD20 mAb, (ver Figuras 3, 4, 5, y 6) , aproximadamente 30% de esplénocitos B220+ fueron resistentes al tratamiento de anti-hC20 mAb (Figura 7) . Análisis de subconjuntos de células B esplénicas revelo que las células B foliculares (FO) se agotaron significativamente (más del 90% de agotamiento) , mientras que las células B MZ y CD21hlCD23" exhibieron mayor resistencia a tratamiento con anti-hCD20. Aproximadamente 50% de las células B MZ permanecen siguiendo a la terapia anti-h.CD20 mAb (Figura 8) . Esplénocitos B220+ aislados de los ratones tratados con anti-hCD20 mAb, se analizaron ex vivo ya sea con un IgG2a mAb anti-ratón-FITC (para detectar anti-hCD20 mAb ligado) o con anti-hCD20 mAb adicional seguido por IgG2a mAb anti-ratón-FITC (para detectar la cantidad total de CD20 expresado) en células B esplénicas resistentes. Los resultados demuestran que la resistencia no se debió a la falta de expresión hCD20 en células B MZ, ya que hCD20 se expresa a un nivel superior en MZ en comparación con células B FO (Figura 8) , ni la resistencia se debió a la falta de accesibilidad de mAb terapéutico, ya que CD20 en células B esplénicas resistente fue casi saturado con el anti-hCD20 mAb administrado in vivo (Figura 9) . Aún más dramático que las células B de zona marginal esplénica resistentes, las células B centro germinal (GC) residentes dentro de los parches de Peyer demuestran mayor resistencia a tratamiento con anti-hCD20. Mientras que las células B220*CD38hi maduras se agotaron fácilmente, las células B B220+CD3810 GC fueron resistentes a terapia con anti-hCD20 mAb, como se muestra en la Figura 10. Para extender estas observaciones en células B GC residentes de parche Peyer, células B GC esplénicas generadas a través de inmunización con glóbulos rojos de ovejas (SRBCs igual a sheep red blood cells) , se probaron para resistencia. Ratones se inmunizaron con SRBCs para inducir formación de GC . Ya que GCs se forma de manera máxima al dia 8 después de inmunización, se trataron ratones el día 8 con 0.2 mg de IgG2a de control o anti-hCD20 mAb. Células B GC esplénicas se caracterizaron y cuantificaron por tinción de B220 y PNA (aglutinina de cacahuate) . La aglutinina de cacahuate tiñe para células B GC. Como se muestra en la Figura 11, ratones no inmunizados no desarrollan células B GC B220+PNA+ (panel izquierdo, circulo) . Ratones inmunizados SRBC desarrollan células B GC PNA+ (panel derecho, círculo) que fueron resistentes a exterminio de anti-hCD20 mAb (Figura 11, fondo) . La resistencia fue independiente a expresión hCD20, ya que tanto células B GC esplénicas o residentes de parche Peyer expresaron superiores niveles de hCD20 que las células B en circulación maduras sensibles (Figura 2) ,- independientemente del mAb que liga a células GC, como en células B GC recuperadas in vivo se saturaron con el mAb administrado; e independiente de la dosis de tratamiento o duración de tratamiento (datos no mostrados) . Por lo tanto, los datos aquí sugieren una jerarquía de sensibilidad a tratamiento anti-hCD20 mAb existe en el bazo: células B foliculares (más sensibles) > zona marginal > centro germinal (más resistentes) . Mayor prueba de la resistencia de células B MZ, ratones transgénicos se trataron con control de anticuerpos anti-hCD20 por 15 semanas (IP, 0.1 mg cada dos semanas) de agotamiento a largo plazo. Células B esplénica (B220+) se caracterizaron por expresión superficial de CD21 y CD23, y el número de células B FO Y MZ se cuantificó (n=3) . Además, altas dosis de anti-hCD20 mAb se administraron a ratones transgénicos . Células B esplénicas se analizaron 2 semanas posterior al tratamiento (n=4) . Ni la administración de anti-hCD20 mAb lOmg/ratón (equivalente a 15 veces mayor que un curso de cuatro semanas acumulativos de RITUXAN"* para pacientes NHL) (Figura 13) ni tratamiento continuo de ratones con 0.1 mg cada semana salteada por 4 meses con anti-hCD20 MAb resultó en mayor agotamiento de células B MZ (Figura 12) . Las células B resistentes residuales en ratones transgénicos tratados fueron funcionales, ya que ratones tratados con anti-hCD20 mAb fueron capaces de montar sustancialmente , aunque en forma reducida, respuestas inmune a inmunogenos y bacterias (Figura 14 y Figura 15) . Animales transgénicos se trataron con dos dosis de control o anti-hCD20 mAb (0.2 mg/dosis, IP) en las semanas 7 y 10. Los ratones se inmunizaron (SC) con (4-hidroxi-3-nitrofenil) acetilo conjugado con hemocianina de erizo de mar (NP-KLH) en la semana 1 y sometidas a prueba de nuevo en la semana 11. Niveles Ig específicos de NP se ensayaron en la semana 12 por ELISA. Se ilustran datos en la Figura 14, en donde pre-sangrado se refiere a muestra tomada antes de inmunización con NP-KLH. La Figura 15 muestra inmuno respuesta independiente de T a un antígeno bacteriano . Agotamiento completo de células Bl a un antígeno bacteriano. Agotamiento completo de células . Bl periféricas y peritoneales se logró 3 semanas después de tratamiento de dos dosis IP (0.2 mg/ratón) de control o ce-hCD2Q mAbs como se ilustra en la Figura 6. Respuestas independientes T se estimaron por análisis FACS (panel izquierdo) en plasmablastos específicos de antígeno (Ag) aislados 4 días después de administración de Streptococcus Pneunioniae termoinactivado . El número de plasmablastos específicos de Ag- se cuantifico (derecha) como promedio + error estándar (n=4) . Tinciones con Syndecan-1 para plasmablastos y células de plasma. Ejemplo 4 Acceso intrabascular mejora agotamiento de células B Este ejemplo muestra movilización de células B de zona marginal mejora la sensibilidad de estas células a agotamiento de anti-hCD20 mAb. La jerarquía de sensibilidad a tratamiento anti- CD20 mAb puede reflejar una resistencia intrínseca de células debido a la expresión de proteínas de superficie celular regulatoria negativa o factores anti-apoptósicos intracelulares , factores de supervivencia que se proporcionan por el micro ambiente MZ y GC, y/o acceso a mecanismos secretores requeridos . Para evaluar la contribución del microambiente a la mayor resistencia de células B MZ, se movilizaron células B MZ en la basculatura por co-administración de mAbs anti-aL y anti-a4 integrina. Ratones (hCD20 Tg+) se pre-trataron con IgG2a de control 3 días antes del inicio del estudio (día 3) para reducir los efectos no específicos de IgG en tráfico celular . El día 0 , se trataron ratones con 0.2 mg de control de IgG2a o anti-hCD20 mAb. Los ratones se inyectaron intravenosamente el día 2 con 0.1 mg cada uno de anti- CDlla (M17) y mAbs anti-a4 integrina (PS/2) .

Muestras de sangre se analizaron 1.5 y 6 horas después de administración de la mAbs anti-integrina . Como se muestra en la Figura 16, células B MZ (CD21hiCD23low) se movilizaron por el mAb anti-alfa integrina y agotaron por anti-hCD20 mAb. Números absolutos de células B MZ (CD21hlCD2310) en la sangre se cuantificaron y se muestran en la Figura 17. Movilización de células B MZ CD21hiCD23l0 hicieron estas células más sensibles a agotamiento mediado por anti-CD20 mAb. Ver por ejemplo Figura 16 paneles 2 y 5, paneles 3 y 6; y Figura 17. Análisis FACS de células B esplénicas de los ratones tratados revelo una disminución con comitantes de células B MZ (datos no mostrados) . Cuantificación de las células B220+ en total en el bazo mostró que la combinación de un ceL antagonista (anti-CDlla mAb) más anti-CD20 mAb resultó en mejor agotamiento de células B que anti-CD20 mAb sólo (Figura 18), pero la extensión de agotamiento logradas es incluso mayor utilizando la combinación de tanto alfaL como alfa4 mAbs con CD20 mAb (Figura 18). Los antagonistas «L y a4 trabajaron sinergisticamente para aumentar el número de células B en la circulación. No para estar limitados por cualquier mecanismo, este incremento en células B en circulación es probable debido tanto a movilización de células B como inhibición de asentamiento de células B.

Análisis de inmunohistoquímica del bazo confirma el agotamiento preferencial de células B MZ fuera de MOMA-nl que tiñe seno marginal con el tratamiento combinado de anti-integrinas y anti-hCD20 mAbs en comparación con la resistencia relativa de células B MZ fuera del seno marginal con anti-hCL20 mAbs solo (datos no mostrados) . MOMA-l se utiliza para teñir el subconjunto de macrófagos que separan FC de MZ . Para movilizar células B en el folículo (FO) se trataron ratones como se describió anteriormente para movilizar células B MZ, excepto porque el cóctel mAb anti-integrina se sustituyo con 25 µ g de lipo polisacárido (LPS) . Análisis FACS de las células tratadas y de control mostró que el tratamiento LPS resulta en la movilización de senos B MZ en el folículo (Figura 19) . En contraste con la movilización de células B MZ en la osculatura mostrada en la Figura 18, movilización de células B MZ en el folículo con administración DLPS no resulta en agotamiento de células B MZ (Figura 19) . Juntos, estos datos sugieren que células B MZ son intrínsecamente susceptibles a tratamiento con anti-hCD20 mAb y que el tráfico de células B en la osculatura es esencial para un agotamiento de células B eficiente.

La inmunohistoquímica de tejido esplénico de ratones tratados con control de IgG, anti-hCD20 mAb, anti-hCD20 y anti- ntegrina iriAbs o anti-hCD20 mAb y LPS se comparó. Con tratamiento BLPS, células teñidas con IgM se dieron dentro del borde de tinción de antigeno metalofilico-1 (MOMA-1) en este folículo agrandado (datos no mostrados) .

El compuesto A, un agonista receptor de fingosina 1-fosfato, se utiliza para evitar que células B de nodo linfático maduras regresen a la circulación, para estimar si esto interferirá con agotamiento de células B. se trataron ratones con control de vehículo o un agonista de receptor fingosina 1-fosfato (S1PR) (compuesto A) y trataron con anti-hCD20 mAbs . Ratones hCD20 Tg+ se trataron por alimentación con sonda oral con control de vehículo o Compuesto A (10 mg/kg cada 6 horas) . Una sola dosis de control o anti-hCD20 mAb (0.5 mg IP) se administra dos horas después de la primera dosis del Compuesto A. Linfocitos, aislados de nodos linfáticos (Figura 20, paneles 1 y 2) y sangre (Figura 20, paneles 3 y 4) a 20 horas, se cuantificaron y expresaron como promedio + error estándar (n=4) . Consistente con los efectos inhibitorios de agonistas S 1PR en salida de linfocitos de los nodos linfáticos a circulación, tanto células B como T disminuyeron significativamente en ratones tratados con el Compuesto A (Figura 20, paneles 3 y 4) . Mientras que las células B de nodos linfáticos se agotaron fácilmente por anti-hCD20 mAbs en ratones tratados con vehículo, células B de nodos linfáticos no se agotaron por anti-hCD20 mAbs en la presencia del Compuesto A (Figura 20, paneles 1 y 2) . En conjunto, estos datos soportan el requerimiento para que células B tengan acceso a la circulación para agotamiento eficiente. Ej emplo 5 El papel de hígado y bazo en agotamiento de células B Ya que el sistema reticuloendotelial (RES) representa una modalidad principal para liberación de células apoptósicas y complejos inmunes, las contribuciones del hígado y bazo al agotamiento de células B se examinaron. Para estimar contribución del hígado, tanto la vena portal como la arteria hepática se ligaron. La ligación se logró al someter ratones a operación simulada o sujetar la vena portal y la arteria hepática seguido por inyección IV inmediata de control o anti-hCD20 (0.2 mg) mAb. Diez minutos después de administración anti-hCD20 mAb, se analizó sangre periférica por células B B220+IgM+, como se muestra en las gráficas FACS . Para estimar las contribuciones esplénicas, ratones se sometieron ya sea a esplenectomia de operación simulada (Figura 23, hilera superior) o esplenectomia (Figura 24, hilera inferior) y se analizaron por agotamiento de célula B. Se analizó sangre 3 horas y un día después de tratamiento con una dosis subóptima de anti-hCD20 mAb (5 jug) ¦ No se detectaron diferencias en agotamiento de células B con superiores dosis de anti-hCD20 mAb (0.1 mg) . Fagocitosis por células de Kupfer de células B después de tratamiento con anti-hCD20 mAb se examinó. Se trataron ratones con 0.1 mg de control IgG (superior izquierda) o anti-hCD20 mAb. 15 minutos después de administración, se recolectaron hígados y analizaron por tinción de. B220 y F4/80 para células B y macrófagos, respectivamente. Células B220+ y F4/80"1" colocalizadas de 4 ratones tratados con control y anti-hCD20 mAb se cuantificaron. La ligación de la vena portal y la arteria hepática resultó en pérdida significante en la habilidad de agotamiento de anti-hCD20 mAbs (Figuras 21 y 22) . En contraste, ratones esplenectomizados demostraron agotamiento acelerado de células B (Figuras 23 y 24) , un efecto que probablemente era secundario a los números de célula B reducidos en ratones esplenectomizados. Examen histológico de hígados demostró colocalización de células B que tiñen B220+ dentro de macrófagos de tinción F4/80* en ratones tratados (Figura 25) , de esta manera células de Kupfer se tragaron las células B B220+. Por lo tanto, consistente con la función de RES, el hígado representa el portal mayor de agotamiento de célula B . Conclusión Estos datos identifican los mecanismos in vivo por los cuales anti-hCD20 mAbs elimina células B. Ante administración de anti-hCD20 mAbs, el mAb rápidamente liga las células B CD20+ y las células B ligadas con mAb en circulación, se liberan rápidamente a través del sistema reticuloendotelial (RES) . Es ventajoso para las células B que están revestidas con anti-hCD20 mAbs, residentes en tejido linfoide para lograr acceso a la vasculatura para suministrar las células B objetivo a células efectoras dentro del RES. Esto toma en cuenta los periodos de tiempo más largos requeridos para agotar las células B de nodo linfático y peritoneales de recirculación más lenta, en comparación con las células B en circulación. Similarmente, la jerarquía de sensibilidades observada para subconjuntos de células B cargadas con tejido y esplénicas reflejó las capacidades circulatorias reducidas de células B MZ y GC. Aún más, la capacidad en aumentar o inhibir agotamiento de células B como consecuencia de movilización o inhibición de linfocitos de salida de linfocitos, respectivamente, soporta adicionalmente la importancia de acceso intravascular en exterminio de células B . Los experimentos aquí demuestran resultados sorprendentes ya que la combinación de tratamiento con anticuerpo anti-CD20 y uno o más antagonistas de integrina demuestra gran sinergia para lograr agotamiento mejorado para células B agotando subconjuntos de células B no agotados o no expuestos previamente. Referencias Las referencias aquí citadas en esta solicitud, incluyendo patentes, solicitudes publicadas y otras publicaciones aquí se incorporan por referencia.

Claims (70)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para aumentar agotamiento de células B en un mamífero que sufre de un desorden de células B, que comprende administrar al mamífero uno o más agentes de movilización de células B y una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes de agotamiento de células B.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el mamífero es un humano .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de movilización de células B es un antagonista de cc4 integrina .
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el antagonista de a4 integrina es un antagonista de a4/?l.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 3 , caracterizado porque el antagonista de «4 integrina es un antagonista de a4/?7.
6. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 y 5, caracterizado porque el antagonista «4 integrina es un anticuerpo, o un fragmento biológicamente activo del mismo.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el antagonista aé integrina es un anticuerpo humanizado, humano o quimérico, o su fragmento biológicamente activo.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo liga a la subunxdad aé (CD-49d) .
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el antagonista de integrina es natalizumab.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el antagonista de en 4 integrina es el anticuerpo PS/2 producido por el hibridoma ATCC CRL-1911, o su fragmento o forma humanizada biológicamente activo.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el antagonista de 4 integrina es una molécula pequeña.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el antagonista de molécula pequeña comprende la fórmula: 11 en donde Z es H o alquilo inferior; A es : o VII en donde B es cianoalquilo, un carbociclo o un heterociclo opcionalmente substituido con uno o más substituyentes RX; q es 0-3; Rlt R2, R3, R4, R5 y RS independientemente son hidrógeno, alquilo, amino, alquiloamino, dialquiloamino, nitro, urea, ciano, tio, alquilotio, hidroxi, alcoxi, alcoxialquilo, alcoxicarbonilo, alcoxicarboniloamino, arilooxicarbonilamino, alquilosulfimilo, sulfonilo, alquilosulfonilo, aralquilosulfonilo , arilosulfonilo, heteroarilsulfonilo, alcanoilo, alcanoilamino, cicloalcanoilamino, arilo, arilalquilo, halógeno, o alquilfosfonilo, y R1# R2, R3, R4 y R5 están substituidos con 0 a 3 substituyentes seleccionados del grupo que consiste de hidroxi, carboxi, alcoxi carbonilo inferior, alquilo inferior, nitro, oxo, ciano, carbociclilo, heterociclilo, heteroarilo, alquiltio inferior, alcoxi inferior, alquiloamino inferior, alcanoilamino inferior, alquilosulfinilo inferior, sulfonilo inferior, alquilsulfonilo inferior, alcanoilo inferior, arilo, aroilo, heterociclilcarbonilo, halógeno y alquilfosfonilo inferior; o dos de R-L a RS juntos forman un anillo carbociclo o heterocíclico; Y es H, alcoxi, alcoxialcoxi , arilooxi, alquilamino alcoxi, dialquilaminoalcoxi , alquilamino, arilamino, heterociclilo o heteroarilalquilo, en donde cada uno de los anteriores puede estar substituido o sin substituir; Xx es H, C(0)OR, C(0)R, C(0)SR, R, Ra y Rb, individualmente son hidrógeno o alquilo, alcoxi, arilo, heterociclilo, heteroarilo, substituidos con 0 a 4 substituyentes seleccionados del grupo que consiste de halógeno, hidroxi, amino, carboxilo, nitro, ciano, heterociclilo, heteroarilo, arilo, aroilo, arilooxi, aralquilo, aralquilooxi , arilooxicarbonilo, aralquilooxicarbonilo, alquilendioxi , alcoxicarbonilo inferior, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, alquiltio inferior, alcoxi inferior, alquilamino inferior, alquilsulfinilo inferior, sulfonilo inferior, alquilsulfonilo inferior, alcanoilo inferior, alquilfosfonilo inferior, aminosulfonilo alquilo inferior, hidroxi alquilo inferior, alquilsulfinilo alquilo inferior, alquilsulfonilo alquilo inferior, alquiltio alquilo inferior, heteroariltio alquilo inferior, heteroariloxi alquilo inferior, heteroarilamino alquilo inferior, halo alquilo inferior, y alcoxi alquilo inferior; en donde el heterociclilo, heteroarilo, arilo, aroilo, ariloxi, aralquil, aralquilooxy, ariloxicarbonilo y aralquiloxicarbonilo está opcionalmente substituido con halógeno, hidroxilo, amino, carboxilo, nitro, ciano, alquilo y alcoxi; y en donde Ra y Rb junto con el nitrógeno al cual se conectan, pueden formar un grupo heterociclilo o heteroarilo substituido con 0 a 5 substituyentes R o Rd; en donde Rd tiene la estructura: en donde X1 es un enlazador di alente seleccionado del grupo que consiste de C(0)NRa, C(0) o un enlace; X2 y X3 cada uno independientemente son hidrógeno, halógeno, hidroxi, amino, carboxilo, nitro, ciano, o alquilo, substituido y sin substituir arilo, heterociclilo, heteroarilo, arilo, aroilo, arilooxi, alquilendioxi , alquilo inferior carbonilamino, alquenilo inferior carbonilamino, aril carbonilamino, arilalquilo carbonilamino, alcoxi inferior carbonilamino, alquilamino inferior carbonilamino, ariloamino carbonilamino, alcoxicarbonilo inferior, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, alquiltio inferior, alcoxi inferior, alquilamino inferior, alquilsulfinilo inferior, sulfonilo inferior, alquilsulfonilo inferior, alcanoilo inferior, alquilfosfonilo inferior, aminosulfonilo alquilo inferior, hidroxi alquilo inferior, alquilsulfinilo alquilo inferior, alquilsulfonilo alquilo inferior, alquiltio alquilo inferior, heteroariltio alquilo inferior, heteroariloxi alquilo inferior, heteroarilamino alquilo inferior, halo alquilo inferior, alcoxi alquilo inferior; y en donde Xx y X2 o X3 pueden unirse en conjunto para formar uno o varios anillos heterocíclico o heteroarilo; o X3 y Z juntos forman un anillo heterobicíclico; X1,, X2,, X3, y X4, cada uno independientemente son hidrógeno, halógeno, hidroxi, amino, carboxilo, nitro, ciano, o substituido y sin substituir alquilo alquenilo, alquinilo, ariloalquilo, heterociclilo, heteroarilo, arilo, aroilo, arilooxi, alquilendioxy, alquilo inferior, carboniloamino, alquenilo inferior carbonilamino, arilo carboniloamino, ariloalquil carbonilamino, alcoxi inferior carbonilamino, alquilamino inferior carbonilamino, arilamino carbonilamino, alcoxicarbonilo inferior, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, alquiltio inferior, alcoxi inferior, alquilamino inferior, alquilsulfinilo inferior, sulfonilo inferior, alquilsulfonilo inferior, alcanoilo inferior, alquilfosfonilo inferior, aminosulfonilo alquilo inferior, hidroxi alquilo inferior, alquilsulfinilo alquilo inferior, alquilsulfonilo alquilo inferior, alquiltio alquilo inferior, heteroariltio alquilo inferior, heteroariloxi alquilo inferior, heteroarilamino alquilo inferior, halo alquilo inferior, alcoxi alquilo inferior; o su sal farmacéuticamente aceptable .
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el antagonista de molécula pequeña comprende un compuesto de la fórmula: en donde y R1 comprenden cualquiera de los substituyentes R y R 1 designados citados en las Tablas 1 Y 2.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el antagonista de molécula pequeña es cualquiera de los compuestos citados en la Tabla 3.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de movilización de células B es un antagonista de aL integrina .
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el agente de movilización de células B es un antagonista de aL?2 integrina .
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el antagonista de aL es un anticuerpo o su fragmento biológicamente activo .
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, humano o quimérico, o su fragmento biológicamente activo.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el anticuerpo liga a la subunidad aL (CDlla) .
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el anticuerpo de enlace CDlla comprende las secuencias VL y VH de SEQ ID NO. 49 y 50, respectivamente o es efalizumab.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el antagonista de ali integrina es una molécula pequeña.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el antagonita aL de molécula pequeña comprende uno o más de : a) un compuesto de la Fórmula XI: en donde Cy es un carbociclo o heterociclo no aromático opcionalmente sustituido con hidroxilo (-0H) , mercapto (-SH) , tioalquilo, halógeno (F, Cl, Br, I), oxo (=0), tio (=S) , amino, aminoalquilo, amidina ( -C (NH) -NH2) , guanidina (-NH2-C (NH) -NH2) , nitro, alquilo, alcoxi o acilo; X es una cadena hidrocarburo divalente opcionalmente sustituida con hidroxilo, mercapto, halógeno, amino, aminoalquilo, nitro, oxo, o tio, y opcionalmente interrumpido con N, O, S, SO, o S02; Y es un carbociclo o heterociclo opcionalmente sustituido con hidroxilo, mercapto, halógeno, oxo, tio, un hidrocarburo, un hidrocarburo halo-substituido, amino, amidina, guanidina, ciano, nitro, alcoxi, o acilo,¦ L es un enlace o un hidrocarburo divalente que opcionalmente tiene uno o más átomos de carbono reemplazados con N, O, S, SO, o S02, y opcionalmente está substituido con hidroxilo, halógeno, oxo o tio; o tres átomos de carbono del hidrocarburo se reemplazan con un residuo amino ácido; R es H, OH, amino, O-carbociclo, o alcoxi opcionalmente sustituido con amino, un carbociclo o un heterociclo; R2_s independientemente son H, hidroxilo, mercapto, halógeno, ciano, amino, amidina, guanidina, nitro o alcoxi; o R3 y R4 juntos forman un carbociclo o heterociclo fusionado opcionalmente sustituido con hidroxilo, halógeno, oxo, tio, amino, amidina, guanidina, o alcoxi; Rs es H o una cadena hidrocarburo opcionalmente sustituida con un carbociclo o un heterociclo; o sus sales, solvatos e hidratos; con la condición de que cuando Y es fenilo, R2, R4 y Rs son H' es c^ Y Ri es 0H' entonces X es diferente a ciclohexilo; o su sal farmacéuticamente aceptable.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el antagonista al¡ de molécula pequeña comprende cualquiera de los compuestos citados en la Tabla 4.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el antagonista de a integrina es un anticuerpo que liga VCAM-1 (CD106) .
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el antagonista de a integrina es un anticuerpo que liga ICAM-1 (CD54) .
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el antagonista es una inmunoadhesina que comprende una porción de enlace ligando de VCAM-(CD106) fusionada a una bisagra y Fe de un IgG humano.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el antagonista es una inmunoadhesina que comprende una porción de enlace de ligando de ICAM-1 (CD54) fusionada a una bisagra y Fe de un IgG humano .
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende dos agentes de movilización de células B, en donde el primer agente de movilización es un antagonista de al¡ integrina y el segundo agente de movilización es un antagonista de a integrina.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la «4 integrina es a ß! o a^ß?, y la aL es aL?2.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizado porque el antagonista de al¡ integrina y el antagonista de a integrina ambos son anticuerpos .
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizado porque el antagonista de é integrina es natalizumab o su fragmento biológicamente activo o humanizado.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizado porque el antagonista de aL integrina es el anticuerpo efalizumab o su fragmento biológicamente activo o forma humanizada.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porgue el antagonista de a~L integrina y el antagonista de a4 integrina ambos son moléculas pequeñas .
34. 34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el agente de agotamiento de célula B es un antagonista de un marcador de superficie de célula B.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el marcador de superficie de célula B es CD20, CD22 o CD52.
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el marcador de superficie de célula B es CD20.
37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el agente de agotamiento de células B es un anticuerpo que liga CD20.
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el anticuerpo es rituximab .
39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el anticuerpo que liga CD20 es un anticuerpo humanizado.
40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el anticuerpo humanizado se elige del grupo de 2H7.vl6 humanizado, v31, vl!4, vl38, v477, v588, v511, y anticuerpo que comprende la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO. 29 y SEQ ID NO. 30 como cadena ligera variable y cadena pesada variable, respectivamente.
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humano o quimérico.
42. 42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el agente de movilización de células B y el agente de agotamiento de células B se administra en forma concurrente o secuencial .
43. 43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, caracterizado porque el primer y segundo agentes de movilización de células B se administran en forma concurrente.
44. 44. Un método para mejorar la eficacia de agotamiento de células B por un anticuerpo de enlace CD20, que comprende administrar a un paciente que sufre de un desorden de células B, uno o más agentes de movilización de células B.
45. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el anticuerpo de enlace CD20 es rituximab.
46. 46. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el anticuerpo de enlace CD20 se elige del grupo que consiste de 2H7.V16 humanizado, v31, vll4, vl38, v477, v588, v511 y anticuerpo que comprende la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO. 29 y SEQ ID NO. 30 como cadenas ligera variable y pesada variable, respectivamente.
47. 47. El método de conformidad con la reivindicación 45 o la reivindicación 46, caracterizado porque el agente de movilización de células B es un antagonista de a~L integrina.
48. 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el antagonista de al¡ integrina es efalizumab o un anticuerpo de enlace CDlla, que comprende las secuencias VL y VH de SEQ ID NO. 49 y 50, respectivamente.
49. 49. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-48, que comprende dos o más agentes de movilización de células B, en donde el primer agente de movilización es un antagonista de al¡ integrina y el segundo agente de movilización es un antagonista de a4 integrina.
50. 50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el antagonista de a4 integrina es un anticuerpo que liga a4ß1 o a4/?7.
51. 51. El método de conformidad con la reivindicación 49 o 50, caracterizado porque el antagonista de aL integrina es efalizumab o un anticuerpo de enlace CDlla que comprende las secuencias VL y VH de SEQ ID NO. 49 y 50, respectivamente.
52. 52. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el antagonista de ~L integrina y el antagonista de 4 integrina actúan sinergísticamente para mejorar agotamiento de célula B.
53. 53. Un método para tratar neoplasma o malignidad de células B, caracterizado por células B que expresan CD20, que comprende administrar a un paciente que sufre del neoplasma o malignidad, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de enlace CD20 y al menos un agente de movilización de células B.
54. 54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el anticuerpo de enlace CD20 es rituximab.
55. 55. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el anticuerpo de enlace CD20 se elige del grupo que consiste de 2H7.V16 humanizado, v31, vll4, v!38, v477, v588, v511 y anticuerpo que comprende la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO. 29 y SEQ ID NO. 30 como cadena ligera variable y cadena pesada variable, respectivamente.
56. 56. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 53-55, caracterizado porque el agente de movilización de células B es un antagonista de aL integrina.
57. 57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el antagonista de L integrina es efalizumab o un anticuerpo de enlace CDlla que comprende las secuencias VL y VH de SEQ ID NO. 49 y 50, respectivamente.
58. 58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el antagonita de 4 integrina es un anticuerpo o molécula pequeña que liga 4ß?.
59. 59. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el neoplasma de células B se elige del grupo que consiste de linfoma no-Hodgkin (NHL) , NHL linfocitico pequeño (SL) , enfermedad de Hodgkin predominante de linfocito (LPHD) , linfomas de células centrales foliculares (FCC) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , leucemia linfocitica crónica (CLL) , y leucemia de células pilosas .
60. 60. Método para aliviar un desorden auto immune regulado por células B, que comprende administrar a un paciente que sufre del desorden autoinmune, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de enlace CD20 y al menos un agente de movilización de células B.
61. 61. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo de enlace CD20 es rituximab.
62. 62. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el anticuerpo de enlace CD20 comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID No. 31 y una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO. 32.
63. 63. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-62, caracterizado porque el agente de movilización de células B es un antagonista de aL integrina.
64. 64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el antagonista de al¡ integrina es efalizumab o un anticuerpo de enlace CDlla que comprende las secuencias VL y VH de SEQ ID NO. 49 y 50, respectivamente.
65. 65. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-62, caracterizado porque el agente de movilización de células B, es un anticuerpo o molécula pequeña que liga a a4 ?1.
66. 66. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-62, caracterizado porque el desorden auto inmune se elige del grupo que consiste de artritis reumatoide y artritis reumatoide juvenil, lupus sistémico eritematoso (SLE) incluyendo nefritis de lupus, enfermedad de Wegener, enfermedad de intestino inflamatorio, colitis ulcerativa, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) , púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) , trombocitopenia autoinmune, esclerosis múltiple, soriasis, nefropatía IgA, polineuropatías IgM, miastenia gravis, vasculitis asociada con ANCA, diabetes melitus, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen, Neuromielitis Óptica (NMO) y glomerulonefritis .
67. 67. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque el desorden autoinmune es esclerosis múltiple.
68. 68. Un método para agotar células B de células marginales en el bazo de un paciente que sufre de neoplasma de células B o un desorden auto immune regulado por células B, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de enlace CD20 y al menos un agente de movilización de célula B.
69. 69. Una composición que comprende un anticuerpo que liga una al, integrina y un anticuerpo que liga un 4 integrina.
70. 70. La composición de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el anticuerpo que liga la a4 integrina es efalizumab o un anticuerpo de enlace CDlla que comprende las secuencias VL y VH de SEQ ID NO. 49 y 50, respectivamente.