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CN109513003A - 用于治疗疾病的t-细胞重定向双特异性抗体 - Google Patents

用于治疗疾病的t-细胞重定向双特异性抗体 Download PDF

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CN109513003A
CN109513003A CN201811306068.7A CN201811306068A CN109513003A CN 109513003 A CN109513003 A CN 109513003A CN 201811306068 A CN201811306068 A CN 201811306068A CN 109513003 A CN109513003 A CN 109513003A
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CN
China
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seq
cell
antibody
compound
interferon
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CN201811306068.7A
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C.H.张
D.M.戈德堡
E.A.罗西
D.罗西
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IBC Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
IBC Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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Abstract

本发明涉及使用T‑细胞重定向复合物的组合物和方法，所述T‑细胞重定向复合物具有针对T‑细胞抗原的至少一个结合位点和针对患病细胞或病原体上的抗原的至少一个结合位点。优选地，所述复合物是DNL™复合物。更优选地，所述复合物包括双特异性抗体(bsAb)。最优选地，所述bsAb是抗‑CD3 x抗‑CD19双特异性抗体，但是可使用针对其它T‑细胞抗原和/或疾病相关联抗原的抗体。所述复合物能够靶向输送效应T细胞以诱导与疾病如癌症、自身免疫疾病或传染病相关联的细胞的T‑细胞介导细胞毒性。所述细胞毒性免疫响应通过共同施用基于干扰素的试剂来增强，所述基于干扰素的试剂包括干扰素‑α、干扰素‑β、干扰素‑λ1、干扰素‑λ2或干扰素‑λ3。

Description

用于治疗疾病的T-细胞重定向双特异性抗体
本申请是与母案发明名称相同的分案申请，母案的中国申请号是201380032464.4
国际申请号是PCT/US2013/054842，申请日是2013年8月14日。
相关申请的交叉引用
本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2012年8月14 日提交的临时美国专利申请61/682,965；2012年12月4日提交的 61/733,268和2013年4月3日提交的61/807,998的权益，每个优先 权申请以引用的方式整体并入本文。
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技术领域
本发明涉及使用T-细胞重定向复合物的组合物和方法。优选地， 复合物包括双特异性抗体，其具有针对T-细胞抗原的一个结合位点和 针对在患病细胞或病原体上表达的抗原的另一个结合位点。然而，在 替代实施方案中，可利用不同类型的结合分子。在更优选实施方案中， 复合物制备为DOCK-AND-LOCKTM复合物，其中使用来自人蛋白激 酶A(PKA)调控亚基的二聚化和停靠结构域(DDD)部分与来自 AKAP(A-激酶锚定蛋白质)的锚定结构域(AD)部分之间的结合相互作 用来将组分连接在一起。然而，制造双特异性抗体复合物的其它方法 是已知的并且可使用。主题复合物可包括结合至在T细胞上表达的抗 原，如CD3的一种或多种抗体或抗原结合抗体片段和结合至靶细胞 上的抗原，如CD19、CD20、CD22、CD33、CD66e、EpCAM、HER2/neu、 EGF受体或另一种肿瘤相关联抗原(TAA)或在不同患病细胞或致病有
背景
使用双特异性抗体(bsAb)来将靶向杀灭肿瘤细胞的效应T细胞重 定向已经在临床前和临床展示相当大的希望(参见，例如，Topp等人， 2012，Blood 120：5185-87；Bargou等人，2008，Science 321：974-77)。 双特异性抗体含有对于T-细胞募集和活化的CD3具有特异性的第一 结合位点和靶向疾病相关联抗原如CD19的第二结合位点(Bassan， 2012，Blood 120：5094-95)。双特异性抗体使CD3+T细胞与靶向疾病细 胞直接接触并且诱导细胞介导细胞毒性(Bassan，2012)。已经报告抗 -CD3 X抗-CD19双特异性抗体可在患有MRD+ALL的大约70％成人 患者中以极低浓度来产生完整并且持久的分子缓解(Topp等人，2012，Blood 120：5185-87)。识别神经胶质瘤和T细胞上的CD3表位的双特 异性抗体已经成功用于治疗人患者的大脑肿瘤(Nitta等人Lancet 1990；355：368-371)。
产生双特异性抗体的许多方法是已知的(参见，例如美国专利号7, 405,320)。双特异性抗体可通过四重杂交瘤方法产生，所述方法包括 使各自产生识别不同抗原位点的单克隆抗体的两种不同杂交瘤融合 (Milstein和Cuello，Nature 1983；305：537-540)。融合杂交瘤能够合 成两个不同重链和两个不同轻链，其可随机相关联以给出具有10个 不同抗体结构的不均匀群体，其中只有一个，占总抗体分子的1/8， 具有双特异性，并且因此必须进一步从其它形式中纯化。与亲本杂交 瘤相比，融合杂交瘤经常在细胞遗传学上不太稳定，使得制造细胞系 的产生更成问题的。
产生双特异性抗体的另一种方法使用异双功能交联剂来化学拴 系两个不同单克隆抗体，以使得所得杂种偶联物结合至两个不同靶(S taerz等人Nature 1985；314：628-631；Perez等人Nature 1985；316： 354-356)。通过此方法产生的双特异性抗体基本上是两个IgG分子的 杂偶联物，其缓慢扩散至组织中并且从循环中快速移除。双特异性抗 体也可通过将两个亲本单克隆抗体中的每一个还原成相应一半分子， 然后混合并允许再氧化以获得杂种结构来产生(Staerz和Bevan.Proc Natl Acad Sci USA 1986；83：1453-1457)。另一替代方案涉及使用适 当接头使两种或三种经过单独纯化的Fab′片段化学交联。所有这些化 学方法由于较高制造成本、繁重的生产过程、大量的纯化步骤、产量 低(＜20％)和不均匀的产物而对于商业开发是不合需要的。
通过重组DNA技术产生的抗体的离散VH和VL域可彼此配对以 形成具有结合能力的二聚体(重组Fv片段)(美国专利号4,642,334)。然 而，这类非共价相关联分子在生理条件下不足够稳定以具有任何实际 用途。可将同源VH和VL结构域与具有适当组成和长度(通常由多于 12个氨基酸残基组成)的肽接头接合以形成具有结合活性的单链 Fv(scFv)。通过改变接头长度来制造具有多价性和多重特异性的基于 scFv的药剂的方法公开于美国专利号5,844,094、美国专利号 5,837,242和WO98/44001。常常与产生具有多价性和多重特异性的基 于scFv的药剂相关联的常见问题是较低表达水平、不均匀产物、导 致聚集体的在溶液中的不稳定性、在血清中的不稳定性和削弱的亲和 力。
靶向CD3和CD19的若干双特异性抗体在临床开发中。基于scFv 的双特异性抗体构建体，被称为(双特异性T-细胞衔接体)使用 含有经由柔性接头以串联方式连接的2个抗原结合特异性的单一多 肽，所述抗原结合特异性分别由同源VH和VL促成(参见，例如， Nagorsen等人，2009，Leukemia&Lymphoma 50：886-91；Amann等人，2009，JImmunother32：453-64；Baeuerle和Reinhardt，2009，Cancer Res 69：4941-44)。被称为(双亲和力重定向)的另一种双特异性抗 体利用二硫化物稳定化的双功能抗体设计(参见，例如，Moore等人， 2011，Blood 117：4542-51；Veri等人，2010，Arthritis Rheum62：1933-43)。和由于其尺寸较小(～55kDa)而展现快速血液清除率， 从而需要频繁施用以保持双特异性抗体的治疗水平。
需要可产生具有更长T1/2、较好药代动力学性质、增加的体内稳 定性和/或改善的体内功效的改进的双特异性抗体复合物的方法和组 合物。进一步需要例如通过共同施用可增强双特异性抗体构建体的功 效的辅助治疗剂，如干扰素，来改进在癌症和其它疾病中治疗性使用 的基于抗-CD3的双特异性抗体的功效的组合物和方法。
发明内容
本发明涉及使用新颖、T-细胞重定向复合物的组合物和方法。优 选地，复合物包含双特异性抗体(bsAb)，其优选地包含连接至稳定化 F(ab)2或其它抗体片段的抗-CD3scFv或其它抗体片段。在以下实施 例中公开的示例性设计将抗-CD3 scFv与抗-CD19 F(ab)2组合以形成 特异性靶向B细胞的称为(19)-3s的构建体。在下文更详细地论述的 将抗-CD3与针对其它肿瘤相关联抗原的抗体片段组合的其它bsAb 用于各种实体肿瘤的靶向T细胞免疫疗法中。此设计的优势包括二价 结合至肿瘤细胞、杜绝快速肾清除率的较大尺寸(～130kDa)，和有效 T-细胞介导的细胞毒性。bsAb介导T细胞与同源靶细胞之间的免疫突触的形成、诱导在靶细胞存在下的T-细胞活化和增殖、重定向体外 靶细胞的有效T-细胞介导杀灭并且抑制体内人肿瘤的生长。
优选实施方案涉及产生为三价DNLTM复合物的主题双特异性抗 体，其具有更长T1/2、更好药代动力学性质和增加的体内稳定性。产 生并使用DNLTM复合物的方法是熟知的，所述复合物包括结合至来 自AKAP的AD部分的来自人PKA调控亚基RIα、RIβ、RIIα或RIIβ 的DDD部分的二聚体(参见，例如，美国专利号7,550,143；7,521,056； 7,534,866；7,527,787；7,666,400；7,906,118；7,901,680；8,003,111 和8,034,352，其中每一个的实施例部分以引用方式并入本文。)通过 将不同效应子部分如抗体或抗体片段连接至DDD和AD部分，可构建并使用实际上包括效应物的任何组合的DNLTM复合物。
有用的抗体可为各种同种型，优选地人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4， 更优选地包括人IgG1铰链和恒定区序列。抗体或其片段可为嵌合人- 小鼠、人源化(人框架和鼠高变(CDR)区域)或完全人，以及其变化， 如半IgG4抗体(被称为“单抗体”)，如由van der NeutKolfschoten等人 (Science 2007；317：1554-1557)所述。更优选地，抗体或其片段可设计或选择以包括属于特定同种异型的人恒定区序列，从而可在施用至人 受试者时导致减小的免疫原性。施用的优选同种异型包括非G1m1同 种异型(nG1m1)，如G1m3、G1m3，1、G1m3，2或G1m3，1，2。更优选 地，同种异型选自由以下组成的组：nG1m1、G1m3、nG1m1，2和Km3 同种异型。
在各种实施方案中，T-细胞重定向双特异性抗体可施用至受试者 以治疗病状。本领域技术人员将认识到可用T-细胞重定向双特异性抗 体来治疗的任何病状可用主题组合物和方法来治疗。示例性病状包括 但不限于癌症、增生、神经退化性疾病、阿尔茨海默氏病、心血管疾 病、代谢性疾病、血管炎、病毒感染、真菌感染、细菌感染、糖尿病 性视网膜病、黄斑变性、自身免疫性疾病、水肿、肺高血压、败血症、 心肌血管新生、斑块新生血管、再狭窄、血管损伤后形成新内膜、毛 细血管扩张症、血友病关节、血管纤维瘤、与慢性炎症相关的纤维化、 肺纤维化、深静脉血栓形成或创面肉芽。
在特定实施方案中，bsAb可用于治疗自身免疫性疾病，例如急 性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、 西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham′schorea)、重症肌无力、全身性红斑狼 疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合症、大疱性类天疱疮、1型糖尿 病、2型糖尿病、过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感 染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎(Takayasu′s arteritis)、爱迪生 氏病(Addison′sdisease)、类风湿性关节炎、多发性硬化症、肉状瘤病、 溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊 柱炎、古德帕斯丘综合症(Goodpasture′s syndrome)、血管闭塞性脉管 炎、干燥综合症(syndrome)、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏 甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、甲状腺素症、硬皮病、慢性活动性 肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常型天疱疮、韦格纳氏肉芽肿 病(Wegener′s granulomatosis)、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨 (tabes dorsalis)、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球 肾炎、牛皮癣或纤维性肺泡炎。
在某些实施方案中，bsAb可用于治疗癌症。预期可靶向任何类 型的肿瘤和任何类型的肿瘤抗原。可被靶向的示例性类型的癌症包括 急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、胆癌、乳腺癌、宫颈癌、 慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜 癌、食道癌、胃癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、 非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶 质瘤、黑色素瘤、肝癌、前列腺癌和膀胱癌。然而，本领域技术人员 将认识到实际上任何类型癌症的肿瘤相关联抗原是已知的。
可被靶向的肿瘤相关联抗原包括但不限于：α-胎蛋白(AFP)、α- 辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体有特异性的抗原、ART-4、B7、Ba 733、 BAGE、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、碳酸酐酶IX、CASP-8/m、 CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、 CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、 CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、 CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、 CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD80、CD83、 CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、 CDK-4/m、CDKN2A、CTLA-4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、 结肠特异性抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-Met、 DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、成纤维细胞生长因子(FGF)、Flt-1、Flt-3、叶酸盐受体、G250抗原、 GAGE、gp100、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素 (HCG)和其亚基、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF-1)、 HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、 IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、 IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、 KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑 制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、 TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、 MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、 NCA66、NCA95、NCA90、PAM4抗原、胰腺癌粘蛋白、PD-1受体、 胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、 PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、 SAGE、S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL 受体、TNF-α、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、 VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A-抗原、补体因子C3、C3a、 C3b、C5a、C5、血管生成标记物、bcl-2、bcl-6、Kras、致癌基因标 记物以及致癌基因产物(参见，例如Sensi等人，Clin Cancer Res2006， 12：5023-32；Parmiani等人，JImmunol2007，178：1975-79；Novellino 等人Cancer Immunol Immunother2005，54：187-207)。
可以结合抗-CD3抗体或其片段使用的示例性抗体包括但不限 于：hA19(抗-CD19，美国专利号7，109，304)、hR1(抗-IGF-1R，201 0年3月12日提交的美国专利申请序号12/722,645)、hPAM4(抗粘 蛋白，美国专利号7,282,567)、hA20(抗-CD20，美国专利号7,251,164)、hIMMU31(抗-AFP，美国专利号7,300,655)、hLLl(抗-CD74， 美国专利号7,312,318)、hLL2(抗-CD22，美国专利号7,074,403)、h Mu-9(抗-CSAp，美国专利号7,387,773)、hL243(抗-HLA-DR，美国 专利号7,612,180)、hMN-14(抗-CEACAM5，美国专利号6,676,924)、 hMN-15(抗-CEACAM6，美国专利号7,541,440)、hRS7(抗-EGP-1， 美国专利号7,238,785)、hMN-3(抗-CEACAM6，美国专利号7,541, 440)、Ab124和Ab125(抗-CXCR4，美国专利号7,138,496)，每一个 引用的专利或申请的实施例部分以引用的方式并入本文。可连接至抗 -CD3以治疗各种疾病状况的替代抗体包括但不限于阿昔单抗(抗-糖 蛋白IIb/IIIa)、阿仑珠单抗(抗-CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔 单抗(抗EGFR)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)(抗-CD33)、替伊莫单抗(ib ritumomab)(抗-CD20)、帕木单抗(抗EGFR)、利妥昔单抗(抗-CD20)、 托西莫单抗(抗-CD20)、曲妥珠单抗(抗ErbB2)、兰布罗利珠单抗(lam brolizumab)(抗-PD-1受体)、尼沃鲁单抗(nivolumab)(抗-PD-1受体)、 易普利单抗(抗-CTLA-4)、阿巴伏单抗(抗-CA-125)、阿德姆单抗(抗- EpCAM)、阿丽珠单抗(抗-IL-6受体)、贝那利珠单抗(benralizumab)(抗 -CD125)、阿托珠单抗(GA101、抗-CD20)、CC49(抗-TAG-72)、AB-P G1-XG1-026(抗-PSMA，美国专利申请11/983,372，保藏为ATCC PT A-4405和PTA-4406)、D2/B(抗-PSMA，WO2009/130575)、托珠单抗 (抗-IL-6受体)、巴利昔单抗(抗-CD25)、达利珠单抗(抗-CD25)、伊法 利珠单抗(抗-CD11a)、GA101(抗-CD20；Glycart Roche)、那他珠单 抗(抗-α4整联蛋白)、奥马珠单抗(抗-IgE)；抗TNF-α抗体如CDP571 (Ofei等人，2011，Diabetes 45：881-85)、MTNFAI、M2TNFAI、M3T NFAI、M3TNFABI、M302B、M303(ThermoScientific，Rockford，I L)、英利昔单抗(Centocor，Malvern，PA)、塞妥珠单抗(certolizumab p egol)(UCB，Brussels，Belgium)、抗-CD40L(UCB，Brussels，Belgium)、阿达木单抗(Abbott，Abbott Park，IL)、(Human Genome Sciences)；阿尔茨海默病的抗体疗法如Alz50(Ksiezak-Reding等人，1 987，J Biol Chem 263：7943-47)、格特鲁单抗、茄尼醇单抗和英利昔 单抗；抗-纤维蛋白抗体如59D8、T2G1、MH1；抗-CD38抗体如MO R03087(MorphoSys AG)、MOR202(Celgene)、HuMax-CD38(Genmab) 或达雷木单抗(daratumumab)(Johnson & Johnson)；抗-HIV抗体如P4 /D10(美国专利8,333,971)、Ab75、Ab76、Ab77(Paulik等人，1999，Biochem Pharmacol 58：1781-90)以及由Polymun(Vienna，Austria)描 述并出售，还由美国专利5,831,034、美国专利5,911,989和Vcelar等 人，AIDS2007；21(16)：2161-2170和Joos等人，Antimicrob.Agents Chemother.2006；50(5)：1773-9描述的抗-HIV抗体。
在其它实施方案中，主题bsAb可用于治疗感染致病生物体，如 细菌、病毒或真菌的受试者。可治疗的示例性真菌包括小孢霉属(Mi crosporum)、毛癣菌属(Trichophyton)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、 申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、新型隐球菌(Cryptococcus neofo rmans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、荚膜组织胞浆菌(Histopl asma capsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)或白色念珠 菌(Candida albican)。示例性病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病 毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、人乳头状瘤病毒、乙型肝炎 病毒、丙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠病毒、脊髓灰 质炎病毒、人血清细小病毒样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳房肿瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革热病毒、风疹病毒、 麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、埃巴二氏病毒、鼠白血病 病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉 络丛脑膜炎病毒或蓝舌病毒。示例性的细菌包括炭疽杆菌、无乳链球菌、嗜肺军团菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈 瑟菌、肺炎球菌属、流感嗜血杆菌B、梅毒螺旋体、莱姆病螺旋体、 绿脓杆菌、麻风分枝杆菌、布氏杆菌、结核杆菌或支原体。针对病原 体的已知抗体包括但不限于P4D10(抗-HIV)、CR6261(抗-流感)、艾韦 单抗(抗-乙型肝炎)、泛维珠单抗(抗-呼吸道合胞体病毒)、福拉韦单抗 (抗-狂犬病病毒)、莫维珠单抗(抗-呼吸道合胞体病毒)、帕利珠单抗(抗 -呼吸道合胞体病毒)、帕诺库单抗(抗-假单胞菌)、雷韦单抗(抗-狂犬 病病毒)、瑞加韦单抗(抗-巨细胞病毒)、司韦单抗(抗-巨细胞病毒)、t ivirumab(抗-乙型肝炎)和乌珠单抗(抗-大肠杆菌)。
主题bsAb可与一种或多种免疫调节剂组合施用以增强免疫响 应。免疫调节剂可包括但不限于细胞因子、趋化因子、干细胞生长因 子、淋巴毒素、成血因子、集落刺激因子(CSF)、促红细胞生成素、 血小板生成素、肿瘤坏死因子-α(TNF)、TNF-β、粒细胞-集落刺激因 子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干 扰素-β、干扰素-γ、干扰素-λ、称为“S1因子”的干细胞生长因子、人 生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲 状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、卵泡刺激素(FSH)、 促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成 纤维细胞生长因子、催乳激素、胎盘催乳素、OB蛋白质、苗勒氏管 抑制物质、小鼠促性腺素相关联肽、抑制素、活化素、血管内皮生长 因子、整联蛋白、NGF-β、血小板生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛 素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-1、 IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、 IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、 LIF、FLT-3、血管稳定蛋白、血小板反应蛋白、内皮抑素，或淋巴毒素。在某些实施方案中，双特异性抗体或抗体片段可连接至免疫调节 剂，如细胞因子。细胞因子复合物公开于例如美国专利号7,906,118 和8,034,3522中，其中每一个的实施例部分以引用方式并入本文。可 结合T-细胞重定向bsAb使用的优选免疫调节剂包括干扰素-α、干扰 素-β和干扰素-λ。
虽然对于效应T细胞具有特异性的抗体或其它结合分子优选地 结合至CD3抗原，但是在效应T细胞上表达的其它抗原是已知的并 且可由T-细胞重定向复合物靶向。示例性T-细胞抗原包括但不限于， CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、 CD40L、CD44、CD45、CD69和CD90。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分并包括在内以进一步展现本发 明的某些实施方案。实施方案可通过参考这些附图中的一个或多个以 及在本文中呈现的具体实施方案的详细说明来更好理解。
图1.包含抗-CD19F(ab)2x抗-CD3 scFv的DOCK-AND-LOCK TM复合物的形成的示意图。
图2.由(19)-3s介导的Daudi伯基特淋巴瘤与T细胞之间的免疫 突触形成。新鲜分离的T细胞以2.5∶1的E∶T比率与Daudi细胞组合。 细胞在室温下用0、1或5μg/mL的(19)-3s处理30分钟，然后通过流 式细胞术分析。抗-CD20-FITC和抗-CD7-APC分别用于识别Daudi和T细胞。共结合指示为CD20+/CD7+事件的％。用(19)-3s处理之后， 45.5％流动事件是CD20/CD7双重阳性的，指示Daudi与T细胞联会 (A)，与对于不具有抗体的混合细胞所测量的2％(B)形成对比。添加 (19)-3s导致＞90％的Daudi与T细胞关联(C)。
图3.将Jurkat(T细胞)和Daudi(B细胞)以1∶1比率组合，用0.1 μg/mL(19)-3s处理30分钟并且用抗-CD20-FITC(A)和抗-CD3-PE(B) 染色，然后通过荧光显微术分析。合并图像(C)揭示绿色染色的Daudi 和红色染色的Jurkat细胞之间的突触形成。在不存在(19)-3s的情况 下，突触形成不明显(D)。
图4.(19)-3s介导的Daudi和Jurkat细胞的细胞至细胞关联的剂 量响应分析。
图5.由(A)BITETM、DARTTM和(B)(19)-3s介导的细胞至细胞关 联的比较。BITETM和DARTTM的数据从Moore等人(2011，Blood 117： 4542-4551获得。
图6.由(A)(19)-3s对照bsAb相比于(B)(M1)-3s MUC5AC和(C) (E1)-3s TROP-2靶向bsAb所介导的T细胞和Capan-1胰癌细胞之间 的突触形成。CFSE标记的Capan-1细胞在bsAb存在下与PKH26标 记的Jurkat共孵育。
图7.由(19)-3s活化的T-细胞。CD69表达的上调是T-细胞活化 中的较早事件。与PBMC(A)或纯化T细胞(B)组合的Daudi细胞，以 及单独的纯化T细胞(C)用所指示抗体处理过夜，并且用抗-CD3-PE 和抗-CD69-APC染色，然后通过流式细胞术分析。在通过前向相比于侧向散射对T细胞进行门控以及抗-CD3染色之后，评估CD69表 达。(A)Daudi细胞与相等数目PBMC的组合产生1.6％CD69+T细胞。 添加3ng/mL(19)-3s诱导27％CD69+T细胞。包含与非靶向F(ab)2融合的Okt3-scFv-AD2模块的对照构建体[(M1)-3s]和hA19-Fab-DDD 2模块都不诱导T-细胞活化。(B)与未处理的细胞混合物相比，用(M1) -3s或hA19-Fab-DDD2处理Daudi和纯化的T细胞未增加CD69+T 细胞的数目(＜4％)。交替地，(19)-3s诱导稳健的T-细胞活化，产生8 0％CD69+细胞。(C)在不添加Daudi(靶)细胞的情况下，(19)-3s未诱 导CD69表达和T-细胞活化。这些结果证明(19)-3s-介导的T细胞与 靶细胞之间的突触形成对于T-细胞活化是需要和足够的。
图8.通过(19)-3s诱导T-细胞增殖。(A)与IL-2/PHA阳性对照和 (14)-3s(非靶结合对照)相比，PBMC与3nM或30pM(19)-3s一起孵 育。(B)在耗竭B细胞的PBMC中未观察到T细胞增殖，指示靶细胞 (B细胞)为T-细胞活化和增殖所需要。
图9.(19)-3s T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。对于(A)(19)-3s 和(B)(14)-3s(非靶向)DNLTM bsAb复合物来确定Nalm-6、Raji、Ramos 和Namalwa癌细胞的细胞毒性的剂量响应曲线。(C)使用从两个不同 供体和Nalm-6癌细胞获得的PBMC或T细胞观察到一致结果。
图10.(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3s T-细胞重定向bsAb的体外细胞 毒性。确定由(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3s T-细胞重定向bsAb诱导的(A) Namalwa、(B)Jeko和(C)Daudi细胞的细胞毒性的剂量响应曲线。
图11.实体肿瘤细胞系中的T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒 性。(A)与非靶向(19)-3s bsAb相比，确定(14)-3s bsAb的LS174T结 肠腺癌细胞系的细胞毒性的剂量响应曲线。(B)与非靶向(19)-3s bsAb 相比，确定(E1)-3s bsAb的Capan-1胰腺腺癌细胞系的细胞毒性的剂 量响应曲线。(C)与非靶向(19)-3s bsAb相比，确定(E1)-3s和(15)-3s bsAb的NCI-N87胃癌细胞系的细胞毒性的剂量响应曲线。
图12.癌细胞系中的T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性数据的 概述。
图13.使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶 向。带有用人PBMC(5x106个细胞)重构的Raji伯基特淋巴瘤(1x106个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠用(19)-3s治疗仅1周，如箭头 所指示来施用：(A)未治疗、(B)用130μg单一剂量来治疗、(C)用每 剂量43μg来治疗3次，(D)用每剂量26μg来治疗5次。
图14.重复给药对于使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物 的体内重新靶向的效应。NOD/SCID小鼠异种移植物如图13的图例 中指示来制备。(19)-3s如箭头所指示来施用：(A)未治疗、(B)用每剂 量130μg的静脉内施用的(19)-3s来治疗2x、(C)用每剂量130μg的 皮下施用的(19)-3s来治疗2x、(D)用每剂量65μg的静脉内施用的 (19)-3s治疗4x、(E)用每剂量43μg的静脉内施用的(19)-3s来治疗6x、 (F)用每剂量43μg的静脉内施用的对照(M1)-3s来治疗6x。
图15.实体肿瘤异种移植物中的T-细胞重新靶向bsAb的体内功 效。NOD/SCID小鼠异种移植物用LS174T结肠腺癌(A、B)或Capan-1 胰腺癌(C、D)来制备。(A)只向小鼠施用T细胞而没有bsAb。(B)如 指示，小鼠用(E1)-3s bsAb治疗。(C)只向小鼠施用PBMC而没有bsAb。(D)如指示，小鼠用(14)-3s bsAb治疗。
图16.在存在或不存在干扰素-α的情况下，通过(E1)-3sDNLTM复合物的肿瘤生长的体内抑制。在添加或不添加干扰素-α的情况下， 小鼠中的Capan-1胰腺癌异种移植物NOD/SCID用抗-TROP-2 x抗 -CD3 bsAb治疗。(A)干扰素-α以TROP-2靶向DNLTM复合物形式添 加。(B)干扰素-α以可购得(聚乙二醇干扰素α-2a)形式来 添加。
图17.在存在或不存在干扰素-α的情况下，用(E1)-3s治疗的 NOD/SCID小鼠的存活曲线。对照未被治疗或用单独干扰素-α治疗。
详述
定义
除非另有说明，否则“一个(a)”或“一种(an)”表示一个(种)或多个 (种)。
如本文所使用的，术语“和”与“或”可用来指合取或析取。也就是 说，这两个术语应该被理解为等同于“和/或”，除非另有说明。
“治疗剂”是对疾病的治疗有用的原子、分子或化合物。治疗剂的 实例包括抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、酶、核酸酶、激素、免 疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、 光活性剂、染料，和放射性同位素。
如本文使用的“抗体”是指全长(即，天然发生的或通过正常免疫 球蛋白基因片段重组过程来形成)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或 免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，如抗体片段。“抗 体”包括单克隆、多克隆、双特异性、多特异性、鼠、嵌合、人源化 和人抗体。
“裸抗体”是未连接到治疗剂或诊断剂上的抗体或其抗原结合片 段。完整裸抗体的Fc部分可提供效应功能，如补体固定和ADCC(参 见，例如，Markrides，Pharmacol Rev50：59-87，1998)。裸抗体诱导细 胞死亡的其它机制可包括细胞凋亡。(Vaswani和Hamilton，AnnAllergy Asthma Immunol81：105-119，1998。)
“抗体片段”是完整抗体的一部分，如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、 Fv、scFv、dAb等。与结构无关，抗体片段与由全长抗体识别的相同 抗原结合。举例来说，术语“抗体片段”包括由可变区组成的分离片段， 如由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段，以及其中轻和重可变区由肽 接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。“单链抗体”，经常缩写 为“scFv”，由多肽链组成，其包含相互作用以形成抗原结合位点的 VH和VL域。VH和VL域通常通过1至25个氨基酸残基的肽来连接。 抗体片段还包括双功能抗体、三抗体和单域抗体(dAb)。
“嵌合抗体”是一种重组蛋白，其含有的可变域包括来源于一种物 种的抗体(优选地啮齿动物抗体)的互补决定区(CDR)，而抗体分子的 恒定域来源于人抗体的那些恒定域。对于兽医学应用，嵌合抗体的恒 定结构域可来源于其它物种，如猫或狗的恒定结构域。
“人源化抗体”是一种重组蛋白，其中来自一种物种的抗体(例如， 啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的可变重链和可变轻链转移至 人重链可变域和轻链可变域(包括人构架区(FR)序列)中。抗体分子的 恒定结构域是来源于人抗体的恒定结构域。为了保持结合活性，来自 亲本(例如，鼠)抗体的有限数目的FR氨基酸残基可被取代为相应人 FR残基。
“人抗体”是从转基因小鼠中获得的抗体，所述转基因小鼠已经被 基因工程化以响应于抗原挑战而产生特异性人抗体。在此技术中，将 人重链基因座和轻链基因座的元件引入至来源于胚胎干细胞系的小 鼠品系中，所述胚胎干细胞系含有内源重链基因座和轻链基因座的靶 向破坏。转基因小鼠可以合成对人抗原有特异性的人抗体，并且小鼠 可以用来产生分泌人抗体的杂交瘤。用于从转基因小鼠中获得人抗体 的方法由Green等人，Nature Genet.7：13(1994)，Lonberg等人，Nature 368：856(1994)和Taylor等人，Int.Immun.6：579(1994)描述。人抗体 还可以通过基因转染或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建， 所有所述方法和技术是本领域中已知的。(参见，例如McCafferty等 人，1990，Nature 348：552-553，公开了从来自未免疫供体的免疫球蛋 白可变域基因库(repertoire)中体外产生人抗体及其片段)。在此技术 中，将抗体可变结构域基因同框克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳 蛋白基因中，并在噬菌体粒子的表面上展示为功能性抗体片段。因为 丝状粒子含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能 性质进行选择也导致选择编码呈现所述性质的抗体的基因。以此方 式，噬菌体模拟B细胞的一些性质。可以在各种形式下进行噬菌体 展示，对于它们的综述，参见例如Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology3：5564-571(1993)。还可以由体外活化的B细胞 来产生人抗体。(参见，美国专利号5,567,610和5,229,275)。
如本文中所使用，术语“抗体融合蛋白”是重组产生的抗原结合分 子，其中抗体或抗体片段被连接至另一种蛋白质或肽，如相同的或不 同的抗体或抗体片段或DDD肽或AD肽。融合蛋白可以包含单一抗 体组分、不同抗体组分的多价或多特异性的组合或同一抗体组分的多 个拷贝。融合蛋白可以另外地包含抗体或抗体片段和治疗剂。适用于 此类融合蛋白的治疗剂的实例包括免疫调节剂和毒素。一种优选的毒 素包含核糖核酸酶(RNA酶)，优选地为重组RNA酶。优选免疫调节 剂可为干扰素，如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-λ。
“多特异性抗体”是可以同时结合至少两个具有不同结构的靶标 (例如，两个不同的抗原、在同一抗原上的两个不同表位、或半抗原 和/或抗原或表位)的抗体。“多价抗体”是可以同时结合至少两个具有 相同或不同结构的靶标的抗体。价态表明抗体对单一抗原或表位具有 多少个结合臂或位点；即，一价的、二价的、三价的或多价的。抗体 的多价性意味着抗体可以使用多种相互作用结合抗原，从而增加结合 抗原的亲合力。特异性表明抗体能够结合多少个抗原或表位；即，单 特异性的、双特异性的、三特异性的、多特异性的。使用这些定义， 天然抗体(例如，IgG)是二价的，因为它具有两个结合臂，但所述抗 体是单特异性的，因为它结合一个表位。多特异性的、多价的抗体是 含有多于一个具有不同特异性的结合位点的构建体。
“双特异性抗体”是可以同时结合两个具有不同结构的靶标的抗 体。双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)可具有特异性结 合至例如T细胞的至少一个臂，和特异性结合至由患病细胞、组织、 器官或病原体产生或与其相关联的抗原(例如肿瘤相关联抗原)的至 少一个其它臂。可以使用分子工程来产生各种双特异性抗体。
抗体制剂或本文描述的组合物被认为以“治疗有效量”来施用，只 要所施用的量是生理显著的。如果试剂的存在导致接受受试者的生理 机能的可检测变化，那么试剂是生理显著的。在具体实施方案中，如 果抗体制剂的存在引起抗肿瘤响应或减轻自身免疫或传染病状态的 体征和症状，那么抗体制剂是生理显著的。生理显著效应也可为在接 受受试者中引起体液和/或细胞免疫响应，导致靶细胞的生长抑制或 死亡。
干扰素疗法
在各种实施方案中，主题T-细胞重定向bsAb可与一种或多种干 扰素如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-λ组合使用。人干扰素在本领域 中是熟知的并且人干扰素的氨基酸序列可容易地从公开的数据库获 得(例如，GenBank保藏号AAA52716.1；AAA52724；AAC41702.1； EAW56871.1；EAW56870.1；EAW56869.1)。人干扰素还可商业上从 各种供应商获得(例如，Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA； Genentech，South SanFrancisco，CA；EMD Millipore，Billerica，MA)。
已经报告干扰素-α(IFNα)在动物癌症模型(Ferrantini等人，1994， J Immunol153：4604-15)和人癌症患者(Gutterman等人，1980，Ann I ntern Med 93：399-406)中具有抗肿瘤活性。IFNα可发挥各种直接抗肿 瘤效应，包括下调致癌基因、上调肿瘤抑制因子、经由增加肿瘤表面 MHC I类蛋白质的表达来增强免疫识别、增强细胞凋亡和对于化学 治疗剂敏感化(Gutterman等人，1994，PNAS USA 91：1198-205；Mat arrese等人，2002，Am JPathol 160：1507-20；Mecchia等人，2000， Gene Ther 7：167-79；Sabaawy等人，1999，IntJ Oncol 14：1143-51； Takaoka等人，2003，Nature 424：516-23)。对于一些肿瘤，IFNα可经由活化STAT1而具有直接和有效的抗增殖效应(Grimley等人，1998 Blood 91：3017-27)。干扰素-α2b偶联至抗肿瘤抗体，如hL243抗-HL A-DR抗体并且在体外和体内耗竭淋巴瘤和骨髓瘤细胞(Rossi等人，2 011，Blood 118：1877-84)。
间接地，IFNα可抑制血管生成(Sidky和Borden，1987，Cancer R es 47：5155-61)并且刺激宿主免疫细胞，所述宿主免疫细胞对于总体 抗肿瘤响应可为极其重要的但是很大程度上被低估(Belardelli等人，1 996，Immunol Today 17：369-72)。IFNα经由对于骨髓细胞(Raefsky等 人，1985，J Immunol 135：2507-12；Luft等人，1998，J Immunol 16 1：1947-53)、T-细胞(Carrero等人，2006，J Exp Med 203：933-40；Pil ling等人，1999，Eur JImmunol 29：1041-50)和B-细胞(Le等人，200 1，Immunity 14：461-70)的效应而对于免疫响应具有多效影响。作为先 天免疫系统的重要调节剂，IFNα诱导树突状细胞的快速分化和活化 (Belardelli等人，2004，Cancer Res 64：6827-30；Paquette等人，199 8，J LeukocBiol 64：358-67；Santini等人，2000，J Exp Med 191：17 77-88)并且增强NK细胞的细胞毒性、迁移、细胞因子产生和抗体依 赖性细胞毒性(ADCC)(Biron等人，1999，Ann RevImmunol 17：189-2 20；Brunda等人1984，Cancer Res 44：597-601)。
已经报告干扰素-β可有效治疗各种实体肿瘤。在患有HCV-相关 肝癌的患者中完全切除或消融原发肿瘤之后，每周两次用6百万单位 的IFN-β治疗36个月的患者展示肝细胞癌的降低复发(Ikeda等人， 2000，Hepatology 32：228-32)。用干扰素-β的基因疗法诱导神经胶质 瘤、黑素瘤和肾细胞癌的细胞凋亡(Yoshida等人，2004，Cancer Sci 95：858-65)。观察到内源性IFN-β通过抑制体内血管生成而抑制肿瘤 生长(Jablonska等人，2010，JClinInvest.120：1151-64。)
IFN的疗效迄今为止已经得到验证，这种验证是通过以下实现 的：批准IFN-α2用于治疗毛细胞白血病、慢性骨髓性白血病、恶性 黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、尖锐湿疣、AIDs相关卡波西肉瘤和慢性 乙型和丙型肝炎；IFN-β用于治疗多发性硬化；和IFN-γ用于治疗慢 性肉芽肿疾病和恶性骨硬化。尽管存在关于这一组自分泌和旁分泌细 胞因子的大量文献，其在健康和疾病中的功能仍被阐明，包括临床引 入的更有效和更新颖的形式(Pestka，2007，J.Biol.Chem 282：20047- 51；Vilcek，2006，Immunity 25：343-48)。
干扰素是抗肿瘤和抗微生物宿主防御中的关键作用参与者，并且 作为癌症和传染病的治疗剂已经得到广泛研究(Billiau等人，2006， Cytokine Growth Factor Rev 17：381-409；Pestka等人，2004，Immunol Rev 202：8-32)。尽管对于I和II型干扰素(IFN-α/β和γ)的相当大的研 究，其在临床环境中的使用是有限的，这是因为在患者体内的较短循 环半衰期、全身毒性和次优响应(Pestka等人，2004，Immunol Rev 202：8-32；Miller等人，2009，Ann N YAcad Sci 1182：69-79)。在2003 年早期IFN-λ家族的发现带来了开发这些未满足的临床适应症的替 代IFN剂的令人兴奋的新机会(Kotenko等人，2003，Nat Immunol4：69-77；Sheppard等人，2003，Nat Immunol 4：63-8)。
IFN-λ，被称为III型干扰素，是由IFN-λ1、2、3(也分别称为白 介素-29、28A和28B)组成的一组新描述的细胞因子，其由位于染色 体19上的三个不同基因来遗传编码(Kotenko等人，2003，NatImmunol 4：69-77；Sheppard等人，2003，Nat Immunol 4：63-8)。在蛋白质水平下， IFN-λ2和-λ3是高度同源的，具有96％氨基酸一致性，而IFN-λ1与 IFN-λ2和-λ3共有大约81％同源性(Sheppard等人，2003，Nat Immunol 4：63-8)。IFN-λ经由与I型IFN诱导的途径类似的JAK/STAT途径来 启动信号转导，包括活化JAK1和TYK2激酶、磷酸化STAT蛋白质 和活化IFN-刺激基因因子3(ISGF3)的转录复合物(Witte等人，2010，Cytokine Growth Factor Rev 21：237-51；Zhou等人，2007，J Virol 81：7749-58)。
III型与I型IFN系统之间的主要差异是其相应受体复合物的分 布。IFN-α/β经由两种广泛表达的I型干扰素受体来信号转导，并且 与IFN-α/β施用相关联的所得全身毒性限制其作为治疗剂的使用 (Pestka等人，2007，J Biol Chem 282：20047-51)。相比之下，IFN-λ经 由由独特IFN-λ受体1(IFN-λR1)和IL-10受体2(IL-10R2)组成的异源 二聚体受体复合物来信号传导。如以前报告(Witte等人，2009，Genes Immun 10：702-14)，IFN-λR1具有非常有限的表达模式，其中在上皮 细胞、黑素细胞和肝细胞中水平最高，并且在原代中枢神经系统(CNS) 细胞中水平最低。血液免疫系统细胞表达较高水平的短IFN-λ受体剪 接变体(sIFN-λR1)，其抑制IFN-λ作用。神经元细胞和免疫细胞的有 限响应性意味着常常与IFN-α疗法相关联的严重毒性对于IFN-λ来说 可能缺失或显著减少(Witte等人，2009，Genes Immun 10：702-14；Witte 等人，2010，Cytokine Growth Factor Rev 21：237-51)。最近发布报告虽 然IFN-α和IFN-λ在肝细胞中诱导一组常见ISG(干扰素刺激基因)的 表达，但是不同于IFN-α，IFN-λ的施用在纯化淋巴细胞或单核细胞 中不诱导STAT活化或ISG表达(Dickensheets等人，2013，JLeukoc Biol.93，于12/20/12线上公布)。提出对于治疗慢性HCV感染，IFN-λ 可优于IFN-α，因为它不太可能诱导经常与IFN-α疗法相关联的白细 胞减少(Dickensheets等人，2013)。
IFN-λ显示与IL-10-相关细胞因子类似的结构特征，但是在功能 上具有I型IFN样抗病毒和抗增殖活性(Witte等人，2009，Genes Im mun 10：702-14；Ank等人，2006，JVirol80：4501-9；Robek等人，2 005，J Virol 79；3851-4)。已经证明IFN-λ1和-λ2可减少各种病毒的病 毒复制或细胞病变效应，包括DNA病毒(乙型肝炎病毒(Robek等人， 2005，J Virol79：3851-4，Doyle等人，2006，Hepatology 44：896-906) 和单纯性疱疹病毒2(Ank等人，2008，J Immunol 180：2474-85))、ss(+) RNA病毒(EMCV；Sheppard等人，2003，Nat Immunol4：63-8)和丙 型肝炎病毒(Robek等人，2005，J Virol 79：3851-4，Doyle等人，2006，Hepatology 44：896-906；Marcello等人，2006，Gastroenterol 131：188 7-98；Pagliaccetti等人，2008，J Biol Chem 283：30079-89)、ss(-)RN A病毒(水泡性口炎病毒；Pagliaccetti等人，2008，J Biol Chem 283：30079-89)和流感-A病毒(Jewell等人，2010，JVirol 84：11515-22)和双 链RNA病毒如轮状病毒(Pott等人，2011，PNAS USA 108：7944049)。 IFN-λ3已经从遗传研究中被识别为HCV感染中的关键细胞因子(Ge 等人，2009，Nature 461：399-401)，并且也展示相对于EMCV的有效 活性(Dellgren等人，2009，GenesImmun 10：125-31)。鼻病毒诱导的 IFN-λ产生的缺乏报告与鼻病毒诱导的哮喘恶化的严重性高度相关联 (Contoli等人，2006，Nature Med 12：1023-26)并且已经提出IFN-λ疗 法是治疗变应性哮喘的新方法(Edwards和Johnston，2011，EMBO M ol Med 3：306-8；Koltsida等人，2011，EMBO Mol Med 3：348-61)。
IFN-λ的抗增殖活性已经在多种人癌细胞系中证实，包括神经内 分泌癌BON1(Zitzmann等人，2006，Biochem Biophys Res Commun 344：1334-41)、成胶质细胞瘤LN319(Meager等人，2005，Cytokine 31：109-18)、永生角化细胞HaCaT(Maher等人，2008，CancerBiol Ther 7：1109-15)、黑素瘤F0l(Guenterberg等人，2010，Mol Cancer Ther 9：510-20)和食道癌TE-11(Li等人，2010，Eur J Cancer 46：180-90)。在 动物模型中，IFN-λ经由先天和适应性免疫响应来诱导肿瘤细胞凋亡 和破坏，表明IFN-λ的局部递送可能是治疗人恶性肿瘤中的有用辅助 策略(Numasaki等人，2007，J Immunol 178：5086-98)。
在临床环境中，聚乙二醇化IFN-λ1(PEG-IFN-λ1)暂时地用于患有 慢性丙型肝炎病毒感染的患者。在阶段Ib研究(n＝56)中，当将PEG- IFN-λ1施用至在IFN-α疗法之后复发的基因型1HCV患者时，在所 有剂量水平(0.5-3.0μg/kg)下观察到抗病毒活性，并且病毒负载减少2. 3至4.0对数(Muir等人，2010，Hepatology 52：822-32)。IIb期研究(n ＝526)示出与PEG-IFN-α相比，具有HCV基因型1和4的患者对于 使用PEG-IFN-λ1的治疗具有显著更高响应率。同时，与PEG-IFN-α 相比，通常与I型干扰素治疗相关联的不良事件比率对于PEG-IFN-λ 1是较低的。很少观察到嗜中性白细胞减少和血小板减少并且流感样 症状、贫血和肌肉骨骼症状的比率降低至对于PEG-IFN-α治疗所发 现的比率的约1/3。然而，严重不良事件、抑郁症和其它常见不良事 件(≥10％)的比率在PEG-IFN-λ1与PEG-IFN-α之间是相似的。与PE G-IFN-α相比，在最高剂量PEG-IFN-λ1中发现较高比率的肝毒性(“Investigational Compound PEG-Interferon Lambda Achieved Higher Response Rateswith Fewer Flu-like and Musculoskeletal Symptoms and Cytopenias Than PEG-Interferon Alfa in Phase IIb Study of 52 6 Treatment-Naive Hepatitis CPatients,”2011年4月2日，来自Bri stol-Myers Squibb新闻公报)。
在各种实施方案中，主题T-细胞重定向双特异性抗体可与一种或 多种干扰素如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-λ1、干扰素-λ2或干扰素-λ3 组合使用。当与主题bsAb一起使用时，干扰素可在bsAb之前、同 时或之后施用。当同时施用时，干扰素可与bsAb偶联或分开。
T-细胞重定向双特异性抗体复合物
各种实施方案涉及bsAb，其包含连接至针对疾病相关联抗原如 CD19的抗体或其片段的抗-CD3抗体或其片段。双特异性抗-CD3 x 抗-CD19抗体在本领域中为已知的并且目前在临床开发中，如 (双特异性T-细胞衔接体)(例如，Nagorsen等人，2009，Leukemia & Lymphoma 50：886-91；Amann等人，2009，J Immunother 32：453-64； Baeuerle和Reinhardt，2009，Cancer Res 69：4941-44)和(参见， 例如，Moore等人，2011，Blood 117：4542-51；Veri等人，2010，Arthritis Rheum 62：1933-43)。
布利那图单抗(Blinatumomab)是包含用5-氨基酸接头连接的VH和VL域抗-CD3和抗-CD19抗体片段的抗体，并且表达为粘 接至本身以形成抗原结合位点的单一多肽链。认为布利那图单抗起作 用的方式是使T-细胞-特异性CD3和B-细胞特异性CD19抗原紧密接 近，以引发针对并置B细胞的T-细胞毒性响应，其不需要癌细胞的 T-细胞特异性(例如，Portell等人，2013，Clin Pharmacol5(增刊1)： 5-11)。由于它的较短半衰期，布利那图单抗需要连续静脉内输注以便 有效，(Portell等人，2013)。患有持续或复发最小残留疾病的B-细胞 ALL患者的II期试验报告大约80％的全面缓解率(Portell等人，2013)。
低至0.005 mg/m2/天的布利那图单抗剂量报告可有效消除非霍奇 金淋巴瘤患者的癌细胞(Bargou等人，2008，Science 321：974-77)。部 分和完全缓解从0.015mg剂量水平开始观察到并且在0.06 mg剂量下 测试的全部六个患者经历肿瘤消退(Bargou等人，2008)。在体外，布 利那图单抗在10pg/mL浓度下诱导MEC-1细胞的50％细胞溶解 (Topp等人，2012，Blood 120：5185-87；Bassan等人，2012，Blood 120：5094-95)。
布利那图单抗的抗-CD19部分从HD37杂交瘤衍生(参见，例如， 美国专利号7,575,923，其实施例部分以引用方式并入本文)，所述杂 交瘤可公开获得(例如，Santa CruzBiotechnology目录号sc-18894)。 布利那图单抗的抗-CD3部分从TR66杂交瘤衍生(美国专利号7,575, 923；Traunecker等人，1991，EMBO J.10：3655-59)，所述杂交瘤也 可公开获得(例如，Enzo Life Sciences，目录号ALX-804-822-C100)。
可用于要求保护的方法和组合物中的针对CD3的各种抗体是公 开已知的且/或可购得，如从LSBio(目录号LS-B6698、LS-B8669、 LS-B8765、LS-C96311、LS-C58677等)；(目录号ab5690、 ab16669、ab699、ab828、ab8671等)；Santa CruzBiotechnology(目录 号sc-20047、sc-20080、sc-19590、sc-59008、sc-101442等)；和许多其它供应商。
在一个优选实施方案中，用作DNLTM复合物一部分的抗-CD3部 分的氨基酸序列如以下在SEQ ID NO：96至SEQ ID NO：101中公开。 然而，本领域普通技术人员将认识到任何已知抗-CD3抗体可用于要 求保护的方法和组合物中。优选地，有用的抗体部分是人源化或人抗 体。
可用于要求保护的方法和组合物中的针对CD19的各种抗体是公 开已知的且/或可购得，如从Santa Cruz Biotechnology(目录号sc-390 244、sc-373897、sc-18894、sc-18896等)；(目录号ab2523 2、ab134114、ab140981、ab1255等)；ABBIOTECTM(目录号252262、 252248、250585、251063等)和许多其它供应商。
在一个优选实施方案中，抗-CD19抗体部分是人源化A19抗体， 其包括轻链CDR序列CDR1 KASQSVDYDGDSYLN(SEQ ID NO： 90)、CDR2 DASNLVS(SEQ ID NO：91)和CDR3QQSTEDPWT(S EQ ID NO：92)和重链CDR序列CDR1 SYWMN(SEQ ID NO：93)、 CDR2QIWPGDGDTNYNGKFKG(SEQ ID NO：94)和CDR3 RETT TVGRYYYAMDY(SEQ ID NO：95)。
其它抗-CD3 x抗-CD19双特异性抗体是已知的，如其 也并入HD37的抗-CD19Fv序列和TR66的抗-CD3Fv序列(Moore等 人，2011，Blood 117：4542-51；Veri等人，2010，Arthritis Rheum 62： 1933-43)。Moore等人(2011)报告与具有pg/mL范围内的EC50值的带 有相同抗-CD19和抗-CD3可变区序列的单链、双特异性抗体相比，双特异性抗体更有效诱导B细胞溶解(Moore等人，20 11)。已经报告除和之外的其它抗-CD3 x抗-CDl9双 特异性抗体(参见，例如，Wei等人，2012，Cell Oncol35：423-34；P ortner等人，2012，Cancer Immunol Immunother 61：1869-75；Zhou 等人，2012，Biotechnol Lett.34：1183-91)。在某些实施方案中，任何 已知抗-CD3 x抗-CD19双特异性抗体可用于诱导针对疾病相关联细 胞或病原体的免疫响应。
在最优选实施方案中，抗-CD3 x抗-CD19双特异性抗体被制备 成为DNLTM构建体，如以下实施例1中所公开。本领域普通技术人 员将认识到主题T-细胞重定向双特异性抗体不限于抗-CD3 x抗 -CD19构建体，而是可包括连接至抗-CD3抗体部分的针对任何已知 疾病相关联抗原的抗体。
一般抗体技术
制备针对实际上任何靶抗原的单克隆抗体的技术在本领域中是 熟知的。参见例如Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)，和 Coligan等人(编)，CURRENT PROTOCOLSIN IMMUNOLOGY，第1 卷，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley & Sons 1991)。简单地说，可获得单 克隆抗体，方法是将包含抗原的组合物注入小鼠，移除脾以获得B- 淋巴细胞，将B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂 交瘤，选择产生抗原抗体的阳性克隆，培养产生抗原抗体的克隆，并 且从杂交瘤培养物中分离抗体。
MAb可通过多种已确立的技术从杂交瘤培养物分离和纯化。此 类分离技术包括使用蛋白A琼脂糖凝胶的亲和色谱、体积排阻色谱 和离子交换色谱。参见例如Coligan的第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3 页。还参见Baines等人，“Purification ofImmunoglobulin G(IgG)，”于 METHODS INMOLECULAR BIOLOGY，第10卷，第79-104页(TheHumana Press，Inc.1992)。
初始产生了针对免疫原的抗体之后，可对抗体进行测序并随后通 过重组技术进行制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技 术人员熟知的。使用从人源化、嵌合或人抗体衍生的抗体组分消除与 鼠恒定区免疫原性相关联的潜在问题。
嵌合抗体
嵌合抗体是一种重组抗体，其中人抗体的可变区已置换为例如小 鼠抗体的可变区，包括小鼠抗体的互补决定区(CDR)。嵌合抗体在施 用至受试者时显示降低的免疫原性和增强的稳定性。克隆鼠免疫球蛋 白可变域的一般技术公开例如于Orlandi等人，Proc.Nat′l Acad.Sci. USA 86：3833(1989)。构建嵌合抗体的技术是本领域技术人员熟知的。 举例来说，Leung等人，Hybridoma 13：469(1994)产生LL2嵌合体， 方法是将编码鼠LL2(一种抗-CD22单克隆抗体)的Vκ和VH域的DNA 序列与相应人κ和IgG1恒定区域组合。
人源化抗体
产生人源化MAb的技术在本领域中是熟知的(参见，例如，Jone s等人，Nature321：522(1986)，Riechmann等人，Nature 332：323 (1988)，Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)，Carter等人，Pr oc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biote ch.12：437(1992)，和Singer等人，J.Immun.150：2844(1993))。 嵌合或鼠单克隆抗体可通过将来自小鼠免疫球蛋白的可变重链和轻 链的小鼠CDR转移到人抗体的相应可变结构域中来进行人源化。嵌 合单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)也可置换为人FR序列。因为简单 地将小鼠CDR转移到人FR中通常导致抗体亲和力降低或甚至丧失， 所以可能需要进行额外修饰以恢复鼠抗体的初始亲和力。此举可通过 将FR区中的一个或多个人残基置换为其鼠对应物以获得对其表位具 有良好结合亲和力的抗体来实现。参见例如Tempest等人，Biotechn ology 9：266(1991)和Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)。总 体上，不同于其鼠对应物并且接近或接触一个或多个CDR氨基酸残 基而定位的那些人FR氨基酸残基是取代候选物。
人抗体
使用组合方法或用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来产 生完全人抗体的方法在本领域中为已知的(例如，Mancini等人，2004， New Microbiol.27：315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.High Throughput Screen.8：117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin. Phamacol.3：544-50)。还可通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体展 示技术构建完全人抗体，所述方法和技术在本领域中都是已知的。参 见例如McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990)。预期所述完全人 抗体表现比嵌合或人源化抗体甚至更少的副作用并且在体内起基本 上内源性人抗体的作用。在某些实施方案中，所要求保护的方法和工 序可以使用由此类技术产生的人抗体。
在一个替代方案中，可使用噬菌体展示技术来产生人抗体(例如 Dantas-Barbosa等人，2005，Genet.Mol.Res.4：126-40)。人抗体可由 正常人或由表现特定疾病病况(如癌症)的人产生(Dantas-Barbosa等 人，2005)。由患病个体构建人抗体的优势在于循环抗体谱系可能偏 向针对疾病相关抗原的抗体。
在此方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等人(2005)构 建来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。一般来说， 从循环血液淋巴细胞获得总RNA(同上)。从μ、γ和κ链抗体谱系克 隆重组Fab并插入噬菌体展示文库中(同上)。将RNA转变成cDNA 并用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物制备Fab cDNA文库(Marks等人，1991，J.Mol.Biol.222：581-97)。文库构建根 据Andris-Widhopf等人(2000，于：PHAGE DISPLAY LABORATORY MANUAL，Barbas等人(编)，第1版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY第9.1至9.22页)来执行。最终Fab片 段用限制性核酸内切酶消化并插入噬菌体基因组中以制备噬菌体展 示文库。这类文库可通过如在本领域中已知的标准噬菌体展示方法来 筛选(参见，例如，Pasqualini和Ruoslahti，1996，Nature 380：364-366； Pasqualini，1999，The Quart.J.Nucl.Med.43：159-162)。
噬菌体展示可以多种格式执行，关于其综述，请参见例如Johnson 和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology 3：5564-571(1993)。 还可以由体外活化的B细胞来产生人抗体。参见美国专利号5,567,610 和5,229,275，其以引用方式整体并入本文。熟练技术人员将认识到， 这些技术是作为示例并且可利用制备和筛选人抗体或抗体片段的任 何已知方法。
在另一替代方案中，可使用已进行遗传工程改造以产生人抗体的 转基因动物来使用标准免疫方案产生针对基本上任何免疫原性标靶 的抗体。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法由Green等人，Nat ure Genet.7：13(1994)，Lonberg等人，Nature 368：856(1994)，和T aylor等人，Int.Immun.6：579(1994)描述。这类系统的非限制性实例 是(例如，Green等人，1999，J.Immunol.Methods 231：11-23)，其来自Abgenix(Fremont，CA)。在和类 似动物中，已使小鼠抗体基因失活并置换为功能性人抗体基因，而小 鼠免疫系统的其余部分保持完整。
将用含有部分人IgH和Igκ基因座，包括大部 分可变区序列连同辅助基因和调控序列的生殖系构型YAC(酵母人工 染色体)转化。人可变区库可以用来获得产抗体的B细胞，所述B细 胞可以通过已知的技术加工成杂交瘤。用靶抗原免疫的 将通过正常免疫反应产生人抗体，其可通过上文所论述的标准技 术进行收集和/或制造。可获得的多种品系，其各自 能够产生不同类别的抗体。已证明转基因产生的人抗体具有治疗潜 能，同时保留正常人抗体的药物动力学性质(Green等人，1999)。熟 练技术人员将认识到，所要求保护的组合物和方法不限于使用 系统，而是可利用已进行遗传工程改造以产生人抗体的任 何转基因动物。
抗体克隆和产生
各种技术，如制造嵌合或人源化抗体，可能涉及抗体克隆和构建 的程序。目标抗体的抗原结合Vκ(可变轻链)和VH(可变重链)序列可 通过多种分子克隆程序获得，如RT-PCR、5′-RACE和cDNA文库筛 选。来自表达鼠抗体的细胞的抗体的V基因可以通过PCR扩增来克 隆并且测序。为证实其可靠性，可使克隆的VL和VH基因在细胞培养 物中表达为嵌合Ab，如Orlandi等所述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86： 3833(1989))。基于V基因序列，然后可以设计并且构建人源化抗体， 如由Leung等(Mol.Immunol.，32：1413(1995))所述。
cDNA可以通过一般的分子克隆技术由任何已知的产生鼠抗体 的杂交瘤系或转染细胞系制备(Sambrook等人，Molecular Clonmg，A laboratory manual′，第2版(1989))。可以使用引物VK1BACK和 VK1FOR(Orlandi等人，1989)或由Leung等(BioTechniques，15：286(1993))描述的延伸的引物组来扩增抗体的Vκ序列。VH序列可使用引 物对VH1BACK/VH1FOR(Orlandi等人，1989)或Leung等(Hybridoma， 13：469(1994))所述的退火成鼠IgG恒定区的引物进行扩增。可如 Leung等(Mol.Immunol.，32：1413(1995))所述通过组合长寡核苷酸模版合成和PCR扩增来构建人源化V基因。
可以将Vκ的PCR产物亚克隆进入分期载体(staging vector)，如 基于pBR327的分期载体(VKpBR)，所述分期载体含有Ig启动子、信 号肽序列以及适宜的限制位点。VH的PCR产物可亚克隆到类似分期 载体中，如基于pBluescript的VHpBS。含有Vκ和VH序列连同启动子和信号肽序列的表达盒可从VKpBR和VHpBS切除并分别连接至 适当表达载体中，如pKh和pG1g(Leung等人，Hybridoma，13：469 (1994))。可以将表达载体共转染进入适当的细胞并且监测上清液中嵌 合、人源化或人抗体的产生。或者，Vκ和VH表达盒可切除并亚克隆 至单一表达载体如pdHL2中，如由Gillies等人描述。(J.Immunol. Methods 125；191(1989)并且也示于Losman等人，Cancer，80：2660 (1997)中)。
在一替代实施方案中，可将表达载体转染至已预先适应在无血清 培养基中转染、生长和表达的宿主细胞中。可使用的示例性细胞系包 括Sp/EEE、Sp/ESF和Sp/ESF-X细胞系(参见，例如，美国专利号 7,531,327；7,537,930和7,608,425；其实例部分各自以引用方式并入 本文)。这些示例性细胞系是基于以突变型Bcl-EEE基因转染、暴露 于甲氨蝶呤以扩增所转染基因序列并且预先适应无血清细胞系以供 蛋白质表达的Sp2/0骨髓瘤细胞系。
抗体片段
可通过已知技术产生识别特定表位的抗体片段。抗体片段是抗体 的抗原结合部分，如F(ab′)2、Fab′、F(ab)2、Fab、Fv、scFv等。F(ab′)2片段可通过用胃蛋白酶消化抗体分子而产生，而Fab′片段可通过还原 F(ab′)2片段的二硫键桥而产生。或者，可构建Fab′表达文库(Huse等 人，1989，Science，246：1274-1281)以允许快速且容易地鉴别具有期望 特异性的单克隆Fab′片段。F(ab)2片段可通过抗体的木瓜蛋白酶消化 来产生。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结 构域缔合形成标靶结合位点。这两个结构域由肽接头(L)进一步共价 连接。制造scFv分子和设计合适肽接头的方法描述于美国专利号 4,704,692；美国专利号4,946,778；Raag和Whitlow,FASEB 9：73-80(1995)以及Bird和Walker，TIBTECH,9：132-137(1991)中。
产生单域抗体(DAB或VHH)的技术也在此项技术中已知的，如 例如在以引用方式并入本文的Cossins等人(2006，Prot Express Purif 51：253-259)中所公开。可以例如采用标准免疫技术从骆驼(camel)、羊 驼(alpaca)或美洲驼(llama)中获得单结构域抗体。(参见例如 Muyldermans等人，TIBS 26：230-235，2001；Yau等人，J Immunol Methods 281：161-75，2003；Maass等人，J Immunol Methods 324：13-25， 2007)。该VHH可以具有强大的抗原结合能力，并可以与常规VH-VL 对所不可及的新表位相互作用。(Muyldermans等人，2001)。羊驼血 清IgG含有约50％仅有重链的骆驼IgG抗体(HCAb)(Maass等人， 2007)。羊驼可用已知抗原(如TNF-α)免疫并且可分离结合并中和靶抗 原的VHH(Maass等人，2007)。已鉴定出扩增几乎所有羊驼VHH编 码序列的PCR引物，并可以将其用来构建羊驼VHH噬菌体展示文库， 可利用所述文库通过本领域熟知的标准生物淘选技术(Maass等人， 2007)分离抗体片段。在某些实施方案中，抗胰癌VHH抗体片段可用 于要求保护的组合物和方法中。
抗体片段可通过全长抗体的蛋白水解或者在大肠杆菌或另一种 宿主中表达编码片段的DNA来制备。抗体片段可通过常规方法用胃 蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体来获得。这些方法由例如 Goldenberg，美国专利号4,036,945和4,331,647和其中包含的参考文献来描述。还参见Nisonoff等人，Arch Biochem.Biophys.89：230 (1960)；Porter，Biochem.J.73：119(1959)，Edelman等人，于METHODS IN ENZYMOLOGY第1卷，第422页(Academic Press 1967)，和 Coligan，第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。
抗体同种异型
治疗性抗体的免疫原性与输注反应风险增加和治疗性反应的持 续时间减少相关(Baert等人，2003，N Engl JMed 348：602-08)。治疗性 抗体在宿主中诱导免疫反应的程度可以部分地通过抗体的同种异型 来确定(Stickler等人，2011，Genes and Immunity 12：213-21)。抗体同种 异型与抗体的恒定区序列中特定位置上的氨基酸序列变化相关。含有重链γ-型恒定区的IgG抗体的同种异型命名为Gm同种异型(1976，J Immunol 117：1056-59)。
对于常见的IgG1人抗体而言，最普遍的同种异型是G1m1 (Stickler等人，2011，Genes and Immunity 12：213-21)。然而，G1m3同 种异型也常常发生于白种人中(Stickler等人，2011)。已经报道了当向 非G1m1(nG1m1)接受者(如G1m3患者)施用时，G1m1抗体含有倾向 于诱导免疫反应的同种异型序列(Stickler等人，2011)。非G1m1同种 异型抗体在施用至G1m1患者时并不同样具有免疫原性(Stickler等 人，2011)。
人G1m1同种异型包含重链IgG1的CH3序列中的Kabat位置356 上的氨基酸天冬氨酸和Kabat位置358上的亮氨酸。nG1m1同种异型 包含Kabat位置356上的氨基酸谷氨酸和Kabat位置358上的甲硫氨 酸。G1m1和nG1m1同种异型两者均包含Kabat位置357上的谷氨酸残基，并且所述同种异型有时称为DEL和EEM同种异型。针对示例 性抗体利妥昔单抗(SEQID NO：85)和维妥珠单抗(SEQ ID NO：86)，显 示出G1m1和nG1m1同种异型抗体的重链恒定区序列的非限制性实 例。
利妥昔单抗重链可变区序列(SEQ ID NO：85)
维妥珠单抗重链可变区(SEQ ID NO：86)
Jefferis和Lefranc(2009，mAb1：1-7)综述了作为IgG同种异型的 特征的序列变化和它们对免疫原性的影响。他们报道了与G1m17同 种异型中的Kabat 214上的赖氨酸残基相比，G1m3同种异型的特征 在于Kabat位置214上的精氨酸残基。nG1m1，2同种异型的特征在于 Kabat位置356上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸以及Kabat 位置431上的丙氨酸。G1m1，2同种异型的特征在于Kabat位置356 上的天冬氨酸、Kabat位置358上的亮氨酸以及Kabat位置431上的 甘氨酸。除了重链恒定区序列变体之外，Jefferis和Lefranc(2009)报 道了κ轻链恒定区中的同种异型变体，其中Km1同种异型的特征在 于Kabat位置153上的缬氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，Km1，2 同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨酸和Kabat位置191上 的亮氨酸，并且Km3同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨 酸和Kabat位置191上的缬氨酸。
对于治疗性抗体而言，维妥珠单抗和利妥昔单抗分别是对治疗各 种各样血液恶性肿瘤和/或自身免疫性疾病有用的、对抗CD20的人 源化和嵌合IgG1抗体。表1比较了利妥昔单抗与维妥珠单抗的同种 异型序列。如在表1中所示，利妥昔单抗(G1m17，1)是DEL同种异型 IgG1，在利妥昔单抗中的赖氨酸相对维妥珠单抗中的精氨酸在Kabat 位置214(重链CH1)上具有额外序列变化。已经报道了在受试者中维 妥珠单抗比利妥昔单抗的免疫原性小(参见，例如Morchhauser等人， 2009，J Clin Oncol 27：3346-53； Goldenberg等人，2009，Blood 113：1062-70；Robak & Robak，2011，BioDrugs 25：13-25)，这种作用已 经被归因于人源化抗体与嵌合抗体之间的差异。然而，EEM与DEL 同种异型之间的同种异型差异也可能解释维妥珠单抗的更低免疫原 性。
表1利妥昔单抗对维妥珠单抗的同种异型
为了减小治疗性抗体在nG1m1基因型个体中的免疫原性，希望 选择的抗体同种异型对应于G1m3同种异型，其特征在于Kabat 214 上的精氨酸；和nG1m1，2无效同种异型，其特征在于Kabat位置356 上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸以及Kabat位置431上的丙氨酸。出人意料地，发现重复皮下施用G1m3抗体经过很长一段时 间并不会导致明显的免疫反应。在替代实施方案中，与G1m3同种异 型一样的人IgG4重链具有Kabat 214上的精氨酸、Kabat 356上的谷 氨酸、Kabat 359上的甲硫氨酸以及Kabat 431上的丙氨酸。因为免疫原性看起来似乎至少部分地与那些位置上的残基相关，所以对于治疗 性抗体的人IgG4重链恒定区序列的使用也是一个优选的实施方案。 G1m3 IgG1抗体与IgG4抗体的组合也可以是对治疗性施用有用的。
已知的抗体
靶抗原和示例性抗体
在一个优选实施方案中，使用识别和/或结合至抗原的抗体，所 述抗原以高水平表达于靶细胞上并且主要或仅表达于患病细胞上而 非正常组织上。用于治疗例如癌症的示例性抗体包括但不限于 LL1(抗-CD74)、LL2或RFB4(抗-CD22)、维妥珠单抗(hA20，抗-CD20)、 利妥昔单抗(抗-CD20)、阿托珠单抗(GA101，抗-CD20)、兰布罗利珠 单抗(抗-PD-1受体)、尼沃鲁单抗(抗-PD-1受体)、易普利单抗(抗 -CTLA-4)、RS7(抗-上皮细胞糖蛋白-1(EGP-1，也称为TROP-2))、PAM4 或KC4(均抗-粘蛋白)、MN-14(抗-癌胚抗原(CEA，也称为CD66e或 CEACAM5)、MN-15或MN-3(抗-CEACAM6)、Mu-9(抗-结肠-特异性 抗原-p)、Immu 31(抗-α-胎蛋白)、R1(抗-IGF-1R)、A19(抗-CD19)、 TAG-72(例如，CC49)、Tn、J591或HuJ591(抗-PSMA(前列腺-特异性 膜抗原))、AB-PG1-XG1-026(抗-PSMA二聚体)、D2/B(抗-PSMA)、G250(抗-碳酸酐酶IXMAb)、L243(抗-HLA-DR)阿仑珠单抗(抗 -CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉妥珠单抗(抗 -CD33)、伊图莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(抗-CD20)；帕木单抗(抗 EGFR)；托西莫单抗(抗-CD20)；PAM4(又名clivatuzumab，抗-粘蛋白)和曲妥珠单抗(抗ErbB2)。这类抗体在本领域中为已知的(例如，美国 专利号5,686,072；5,874,540；6,107,090；6,183,744；6,306,393； 6,653,104；6,730,300；6,899,864；6,926,893；6,962,702；7,074,403； 7,230,084；7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；7,300,655； 7,312,318；7,585,491；7,612,180；7,642,239；和美国专利申请公布号20050271671；20060193865；20060210475；20070087001；其实施例 部分各自以引用方式并入本文。)有用的具体已知的抗体包括hPAM4 (美国专利号7,282,567)、hA20(美国专利号7,251,164)、hA19(美国专 利号7,109,304)、hIMMU-31(美国专利号7,300,655)、hLL1(美国专利号7,312,318)、hLL2(美国专利号7,074,403)、hMu-9(美国专利号 7,387,773)、hL243(美国专利号7,612,180)、hMN-14(美国专利号6,676,924)、hMN-15(美国专利号7,541,440)、hR1(美国专利申请 12/772,645)、hRS7(美国专利号7,238,785)、hMN-3(美国专利号 7,541,440)、AB-PG1-XG1-026(美国专利申请11/983,372，其保藏为 ATCC PTA-4405和PTA-4406)和D2/B(WO 2009/130575)，关于附图 和实施例部分，每一个列举的专利或申请的文本以引用的方式并入本 文。
可使用所述偶联物进行靶向的其它适用抗原包括碳酸酐酶IX、 B7、CCCL19、CCCL21、CSAp、HER-2/neu、BrE3、CD1、CD1a、 CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、 CD19、CD20(例如C2B8、hA20、1F5MIAb)、CD21、CD22、CD23、 CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、 CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD67、 CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、 CD147、CD154、CEACAM5、CEACAM6、CTLA-4、α-胎蛋白(AFP)、 VEGF(例如，纤连蛋白剪接变体)、ED-B纤连蛋白(例如， L19)、EGP-1(TROP-2)、EGP-2(例如17-1A)、EGF受体(ErbB1)(例如，)、ErbB2、ErbB3、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸盐受体、 Ga 733，GRO-β、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、HER-2/neu、 胰岛素样生长因子(ILGF)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-2R、IL-4R、 IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、IGF-1R、Ia、HM1.24、神经节 苷脂、HCG、L243结合的HLA-DR抗原、CD66抗原即CD66a-d或 其组合、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、巨噬细胞迁 移抑制因子(MIF)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、胎 盘生长因子(PlGF)、PSA(前列腺-特异性抗原)、PSMA、PAM4抗原、 PD-1受体、NCA-95、NCA-90、A3、A33、Ep-CAM、KS-1、Le(y)、 间皮蛋白、S100、腱生蛋白、TAC、Tn抗原、Thomas-Friedenreich 抗原、肿瘤坏死抗原、肿瘤血管生成抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1 和R2)、TROP-2、VEGFR、RANTES、T101，以及癌干细胞抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5，和致癌基因产物。
如通过流式细胞术展示并且可作为选择免疫疗法的合适抗体的 指导的造血恶性细胞上的合适抗原(群集指定，或CD)靶标的综合分 析是于2008年1月15日在线预公布的Craig和Foon，Blood；DOL 10.1182/blood-2007-11-120535。
CD66抗原由具有类似结构的五种不同糖蛋白CD66a-e组成，其 分别由癌胚抗原(CEA)基因家族成员BCG、CGM6、NCA、CGM1和 CEA编码。这些CD66抗原(例如，CEACAM6)主要表达于粒细胞、 消化道的正常上皮细胞和各种组织的肿瘤细胞中。也包含作为癌症的 合适靶标的是癌症睾丸抗原，如NY-ESO-1(Theurillat等人，Int.J.C ancer 2007；120(11)：2411-7)，以及骨髓性白血病(Kozlov等人，Can cer Genet.Cytogenet.2005；163(1)：62-7)以及B-细胞疾病中的CD79 a，和非霍奇金氏淋巴瘤的CD79b(Poison等人，Blood 110(2)：616-62 3)。许多前述抗原公开于2002年11月15日提交的题为“Use of Mul ti-specific，Non-covalent Complexes for Targeted Delivery of Therap eutics”的美国临时申请序号60/426,379中。归于更具有治疗抗性前体 恶性肿瘤细胞群体的癌症干细胞(Hill和Perris，J.Natl.Cancer Inst. 2007；99：1435-40)具有可在某些癌症类型中被靶向的抗原，如前列腺 癌(Maitland等人，Ernst Schering Found.Sympos.Proc.2006；5：15 5-79)、非小细胞肺癌(Donnenberg等人，J.Control Release 2007；1 22(3)：385-91)和成胶质细胞瘤(Beier等人，Cancer Res.2007；67(9)： 4010-5)中的CD133，和结直肠癌(Dalerba eral.，Proc.Natl.Acad.S ci.USA 2007；104(24)10158-63)、胰癌(Li等人，CancerRes.2007； 67(3)：1030-7)和头颈部鳞状细胞癌(Prinee等人，Proc.Natl.Acad.Sc i.USA2007；104(3)973-8)中的CD44。
对于多发性骨髓瘤疗法，已经描述针对例如CD38和CDl38(Ste venson，Mol Med2006；12(11-12)：345-346；Tassone等人，Blood 20 04；104(12)：3688-96)、CD74(Stein等人，ibid.)、CS1(Tai等人，Bloo d 2008；112(4)：1329-37和CD40(Tai等人，2005；CancerRes.65(1 3)：5898-5906)的合适靶向抗体。
巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是先天和适应性免疫和细胞凋亡的 重要调控剂。已经报告CD74是MIF的内源性受体(Leng等人，2003， J Exp Med 197：1467-76)。拮抗性抗-CD74抗体对于MIF介导的细胞 内途径的治疗效应可用于治疗广泛范围的疾病状况，如膀胱、前列腺、 乳腺、肺、结肠和慢性淋巴细胞白血病的癌症(例如，Meyer-Siegler 等人，2004，BMC Cancer 12：34；Shachar & Haran，2011，LeukLym phoma 52：1446-54)；自身免疫性疾病如类风湿性关节炎和全身性红 斑狼疮(Morand & Leech，2005，Front Biosci 10：12-22；Shachar& H aran，2011，Leuk Lymphoma 52：1446-54)；肾脏疾病如肾同种异体移植物排斥(Lan，2008，Nephron Exp Nephrol.109：e79-83)；和许多炎 症疾病(Meyer-Siegler等人，2009，Mediators Inflamm epub March 2 2，2009；Takahashi等人，2009，Respir Res 10：33。米拉珠单抗(hLL 1)是用于治疗MIF介导疾病的治疗用途的示例性抗-CD74抗体。
抗TNF-α抗体是本领域中已知的，并且可以对治疗免疫性疾病 如自身免疫性疾病、免疫功能障碍(例如，移植物抗宿主疾病、器官 移植排斥反应)或糖尿病有用。已知的对抗TNF-α的抗体包括：人抗 体CDP571(Ofei等人，2011，Diabetes 45：881-85)；鼠抗体MTNFAI、 M2TNFAI、M3TNFAI、M3TNFABI、M302B以及M303(Thermo Sc ientific，Rockford，IL)；英失利昔单抗(Centocor，Malvern，PA)；塞妥 珠单抗(UCB，Brussels，Belgium)；以及阿达木单抗(Abbott，Abbott P ark，IL)。这些和许多其它已知的抗TNF-α抗体可以用于所要求保护 的方法和组合物中。对治疗免疫失调或自身免疫性疾病有用的其它抗 体包括但不限于：抗B细胞抗体，如维妥珠单抗、依帕珠单抗、米 拉珠单抗或hL243；托珠单抗(抗IL-6受体)；巴利昔单抗(抗CD25)； 达利珠单抗(抗CD25)；依法利珠单抗(抗CD11a)；莫罗单抗(muromo nab)-CD3(抗CD3受体)；抗CD40L(UCB，Brussels，Belgium)；那 他珠单抗(抗α4整联蛋白)以及奥马珠单抗(抗IgE)。
可以使用已知的对抗B细胞抗原的抗体来治疗1型糖尿病和2 型糖尿病，如对抗CD22的抗体(依帕珠单抗和hRFB4)、对抗CD74 的抗体(米拉珠单抗)、对抗CD19的抗体(hA19)、对抗CD20的抗体(维 妥珠单抗)或对抗HLA-DR的抗体(hL243)(参见，例如，Winer等人， 2011，Nature Med 17：610-18)。
本发明的药物组合物可以用来治疗具有代谢疾病(如淀粉样变性) 或神经退化性疾病(如阿尔茨海默病)的受试者。巴匹珠单抗 (Bapineuzumab)正处于阿尔茨海默氏病疗法的临床试验中。其它提出 用于治疗阿尔茨海默氏病的抗体包括Alz 50(Ksiezak-Reding等人， 1987，J Biol Chem 263：7943-47)、甘替鲁单抗(gantenerumab)和索兰珠 单抗(solanezumab)。已报导抗TNF-α抗体英利昔单抗(Infliximab)减少 淀粉样斑块并且改良认知。
在一优选实施方案中，可使用所要求保护的组合物和方法治疗的 疾病包括心血管疾病，如纤维蛋白凝块、动脉粥样硬化、心肌缺血和 梗塞。纤维蛋白抗体(例如scFv(59D8)；T2G1；MH1)是已知的并且正 作为显露所述凝块和肺栓塞的成像剂进行临床试验，而抗粒细胞抗体 (如MN-3、MN-15、抗NCA95和抗CD15抗体)可靶向心肌梗塞和心 肌缺血。(参见例如美国专利No.5,487,892；5,632,968；6,294,173； 7,541,440，各专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。可使用抗 巨噬细胞、抗低密度脂蛋白(LDL)和抗CD74(例如hLL1)抗体来靶向 动脉粥样硬化斑块。阿昔单抗(Abciximab)(抗糖蛋白IIb/IIIa)已批准在 经皮冠状动脉介入干预和治疗不稳定型心绞痛中辅助用于预防再狭 窄(Waldmann等人，2000，Hematol 1：394-408)。针对氧化型LDL的抗 体在小鼠模型中诱导已建立的动脉粥样硬化的好转(Ginsberg，2007，J Am Coll Cardiol 52：2319-21)。已显示抗ICAM-1抗体在大鼠中减少脑 动脉闭塞后的缺血性细胞损伤(Zhang等人，1994，Neurology 44：1747-51)。针对白细胞抗原的市售单克隆抗体由以下代表：OKT 抗T细胞单克隆抗体(可获自OrrhoPharmaceutical Company)，其结合 正常T淋巴细胞；由具有ATCC登记号HB44、HB55、HB12、HB78 和HB2的杂交瘤产生的单克隆抗体；G7Ell、W8E7、NKP15和 GO22(Becton Dickinson)；NEN9.4(New England Nuclear)；和 FMCll(Sera Lab)。针对纤维蛋白和血小板抗原的抗体的描述含于 Knight，Semin.Nucl.Med.，20：52-67(1990)中。
最优选抗体/抗原对的实例是LL1，抗-CD74MAb(不变链，II类- 特异性伴侣蛋白，Ii)(参见，例如，美国专利号6,653,104；7,312,318； 其实施例部分各自以引用方式并入本文)。CD74抗原高度表达于B- 细胞淋巴瘤(包括多发性骨髓瘤)和白血病、某些T-细胞淋巴瘤、黑色 素瘤、结肠癌、肺癌和肾癌、胶质母细胞瘤和某些其它癌症中(Ong 等人，Immunology 98：296-302(1999))。在癌症中使用CD74抗体的综 述包含于Stein等人，ClinCancer Res.2007年9月15日；13(18Pt 2)：5556s-5563s中，其以引用方式并入本文。优选地用抗-CD74抗体 治疗的疾病包括但不限于非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏疾病、黑素瘤、 肺癌、肾癌、结肠癌、多形性成胶质细胞瘤、组织细胞瘤、骨髓性白 血病和多发性骨髓瘤。
在另一优选实施方案中，可使用针对病原体的治疗性偶联物，因 为针对病原体的抗体是已知的。例如，以下文献中已特别公开特异性 结合由感染性病变(包括病毒性、细菌性、真菌性和寄生虫性感染， 例如，由如细菌、立克次氏体、支原体、原生动物、真菌和病毒的病 原体引起)产生或与其相关的标志以及与所述微生物相关的抗原和产 物的抗体和抗体片段：Hansen等，美国专利No.3,927,193和 Goldenberg美国专利No.4,331,647、4,348,376、4,361,544、4,468,457、 4,444,744、4,818,709和4,624,846，所述各文献的实施例部分以引用 的方式并入本文，以及上文引用的Reichert和Dewitz。针对传染性生 物体(抗毒素和抗病毒抗体)以及其它靶标的抗体的综述列表包含于 Casadevall，Clin Immunol1999；93(1)：5-15中，其以引用方式并入本 文。
在一优选实施方案中，病原体选自由以下组成的组：HIV病毒、 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、无乳链球菌(Streptococcu s agalactiae)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphy lococcus aureus)、嗜肺军团杆菌(Legionella pneumophilia)、化脓链球 菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟菌 (Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)、肺炎 球菌(Pneumococcus)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组 织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、流感嗜血杆菌B(Hemophilis infll uenzaeB)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)、莱姆病螺旋菌(Lym e disease spirochetes)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分枝 杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布氏杆菌(Brucella abortus)、狂犬 病病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I、单纯疱疹病毒II、 人血清细小病毒样病毒、呼吸道合胞体病毒、水痘-带状疱疹病毒、B 型肝炎病毒、C型肝炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病 毒、埃巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus)、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、 水疱型口炎病毒、辛德毕斯病毒(sindbis virus)、淋巴细胞性脉络丛脑 膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病病毒、仙台病毒(Sendai vims)、猫白血病 病毒、呼肠弧病毒、脊髓灰质炎病毒、猿病毒40、小鼠乳腺肿瘤病 毒、登革热病毒、风疹病毒、西尼罗河病毒(WestNile virus)、恶性疟 原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、刚地 弓形虫(Toxoplasma gondii)、让氏锥虫(Trypanosomarangeli)、克氏锥 虫(Trypanosoma cruzi)、罗德西亚锥虫(Trypanosoma rhodesiensei)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、牛巴贝虫(Babesia bovis)、柔嫩 艾美球虫(Elmeriatenella)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、热带 利什曼虫(Leishmania tropica)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、小泰雷尔 梨浆虫(Theileria parva)、水疱绦虫(Taeniahydatigena)、羊绦虫(Taeni a ovis)、牛肉绦虫(Taenia saginata)、细粒棘球绦虫(Echinococcus gra nulosus)、科氏中殖孔绦虫(Mesocestoides corti)、关节支原体(Mycopl asma arthritidis)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.orale)、 精氨酸支原体(M.arginini)、拉氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawi i)、唾液支原体(M.salivarium)和肺炎支原体(M.pneumoniae)，如美国 专利No.6,440,416所公开，所述专利的实施例部分以引用的方式并 入本文。
用于治疗自身免疫疾病或免疫系统功能障碍(例如，移植物抗宿 主疾病、器官移植排斥)的抗体在本领域中为已知的并且可用于所公 开的方法和组合物中。用于治疗自身免疫/免疫功能障碍疾病的抗体 可结合至示例性抗原，包括但不限于BCL-1、BCL-2、BCL-6、CD1a、 CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD11c、CD13、 CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、 CD33、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD41a、CD43、CD45、CD55、TNF-α、干扰素和HLA-DR。以上论述的结合至这些和其它靶抗原的 抗体可用于治疗自身免疫或免疫功能障碍疾病。可用bsAb治疗的自 身免疫性疾病包括急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板 减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、全身性红斑 狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合症、大疱性类天包疮、青少年 糖尿病、过敏性紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉 炎、ANCA相关血管炎、爱迪生氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化 症、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动 脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘综合症、血管闭塞性脉管炎、干燥 综合症、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺素症、硬皮 病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常型天疱疮、 韦格纳氏肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞 性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣和纤维性 肺泡炎。
在各种实施方案中，要求保护的方法和组合物可利用在本领域中 已知的各种抗体中的任何一种。有用的抗体可从许多已知来源商业上 获得。例如，多种分泌抗体的杂交瘤细胞系可从美国典型培养物保藏 中心(ATCC，Manassas，VA)获得。大量针对各种疾病标靶(包括但不限 于肿瘤相关抗原)的抗体已保藏于ATCC和/或已公布可变区序列并且 可获得以用于所要求保护的方法和组合物中。参见例如美国专利号 7,312,318；7,282,567；7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509； 7,049,060；7,045,132；7,041,803；7,041,802；7,041,293；7,038,018； 7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；6,994,976；6,994,852； 6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；6,962,813； 6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547； 6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475； 6,905,681；6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594； 6,881,405；6,878,812；6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062； 6,861,511；6,861,227；6,861,226；6,838,282；6,835,549；6,835,370； 6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；6,783,758；6,770,450； 6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；6,733,981； 6,730,307；6,720,155；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908； 6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734； 6,673,344；6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833； 6,610,294；6,605,441；6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745； 6,572；856；6,566,076；6,562,618；6,545,130；6,544,749；6,534,058； 6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；6,511,665；6,491,915； 6,488,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；6,468,529； 6,465,173；6,461,823； 6,458,356；6,455,044；6,455,040、6,451,310； 6,444,206’6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726； 6,406,694；6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350； 6,383,759；6,383,484；6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481； 6,355,444；6,355,245；6,355,244；6,346,246；6,344,198；6,340,571； 6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；6,187,287；6,183,744； 6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；5,874,540； 5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595； 5,677,136；5,587,459；5,443,953、5,525,338,其实施例部分各自以引 用方式并入本文。这些只是示例性的并且多种其它抗体和其杂交瘤在 本领域中为已知的。本领域技术人员将认识到针对几乎任何疾病相关 联抗原的抗体序列或分泌抗体的杂交瘤细胞可通过针对所关注的选 定疾病相关联靶的抗体来简单搜索ATCC、NCBI和/或USPTO数据 库而获得。所克隆抗体的抗原结合结构域可使用本领域中熟知的标准 技术进行扩增、切除、连接至表达载体中、转染至适应宿主细胞中以 及用于蛋白质产生(参见例如美国专利号7,531,327；7,537,930； 7,608,425和7,785,880，其实施例部分以引用方式并入本文)。
补体系统是涉及经常由细胞受体活化的血清糖蛋白的蛋白裂解 的复杂级联。“补体级联”是组成性和非特异性的，但是它必须活化以 便起作用。补体活化产生一系列单向的酶促和生化反应。在此级联中， 特异性补体蛋白质，C5，形成两个高度活性的炎症性副产物，C5a 和C5b，其共同地活化白细胞。这进而引起许多其它炎症副产物，包 括有害细胞因子、炎症酶和细胞粘附分子。这些副产物可在一起导致 在许多炎症疾病中发现的组织的破坏。此级联最终导致诱导炎症响 应、吞噬细胞趋化性和调理作用以及细胞溶解。
补体系统可经由两个不同途径，经典途径和替代途径来活化。大 多数补体组分已被编号(例如，C1、C2、C3等)，但是一些被称为“因 子”。必须使一些组分酶促裂解以活化其功能；其它仅组合以形成具 有活性的复合物。经典途径的活性组分包括C1q、C1r、C1s、C2a、C2b、C3a、C3b、C4a和C4b。替代途径的活性组分包括C3a、C3b、 因子B、因子Ba、因子Bb、因子D和备解素(Properdin)。每个途径 的最后一个阶段是相同的，并且涉及部件组装成膜侵袭复合物。膜侵 袭复合物的活性组分包括C5a、C5b、C6、C7、C8和C9n。
虽然补体系统的任何这些组分可由抗体复合物来靶向，但是某些 补体组分是优选的。C3a、C4a和C5a导致肥大细胞释放趋化因子如 组胺和血清素，其吸引吞噬细胞、抗体和补体等。这些组分形成一组 优选的靶标。另一组优选靶标包括C3b、C4b和C5b，其增强外来细 胞的吞噬作用。另一组优选靶标是这两个组的前驱组分，即，C3、 C4和C5。C5b、C6、C7、C8和C9诱导外来细胞的溶解(膜侵袭复 合物)并且形成另一组优选靶标。
补体C5a如C3a是过敏毒素。它介导炎症并且是诱导嗜中性粒 细胞释放抗微生物蛋白酶和氧自由基的趋化引诱剂。因此，C5a和它 的前驱C5是尤其优选的靶标。通过靶向C5，不仅C5a，而且C5b 受影响，从而启始膜侵袭复合物的组装。因此，C5是另一个优选靶标。C3b，和它的前驱C3，也是优选靶标，因为经典和替代补体途径 取决于C3b。三种蛋白质影响此因子的水平，C1抑制剂、蛋白质H 和因子I，并且这些蛋白质也是根据本发明的优选靶标。补体调控蛋 白质，如CD46、CD55和CD59，可为抗体复合物结合的靶标。
凝血因子也是优选靶标，尤其组织因子和凝血酶。组织因子也是 已知的，如组织促凝血酶原激酶、CD142、凝血因子III或因子III。 组织因子是整体式膜受体糖蛋白和细胞因子受体超家族的成员。组织 因子的配体结合细胞外域由两个结构模块组成，所述结构模块具有与 组织因子分类为2型细胞因子受体成员一致的特征。组织因子涉及凝 血蛋白酶级联并且通过在组织因子的细胞外域与循环凝血因子、丝氨 酸蛋白酶因子VII或因子VIIa之间形成高亲和力复合物来启始外在 和内在凝血级联。这些酶促活性复合物，然后活化因子IX和因子X， 导致凝血酶产生和血块形成。
组织因子由各种细胞类型表达，包括单核细胞、巨噬细胞和血管 内皮细胞，并且由IL-1、TNF-α或细菌脂多糖来诱导。蛋白激酶C 涉及内皮细胞组织因子表达的细胞因子活化。通过内毒素和细胞因子 来诱导组织因子是开始在患有革兰氏阴性败血症的患者中发现的弥 散性血管内凝血的重要机制。组织因子也似乎涉及各种非止血功能包 括炎症、癌症、大脑功能、免疫响应和肿瘤相关联血管生成。因此， 靶向组织因子的抗体复合物不仅适用于治疗凝血，而且可治疗败血 症、癌症、病理性血管生成，和根据本发明的其它免疫和炎症失调疾 病。凝血途径与细胞因子网络之间的复杂相互作用通过若干细胞因子 影响各种细胞中的组织因子表达的能力和配体结合至受体的效应来 提示。已经报告配体结合(因子VIIa)给出细胞内钙信号，因而指示组 织因子是真实受体。
凝血酶是活化形式的凝血因子II(凝血酶原)；它将纤维蛋白原转 化成纤维蛋白。凝血酶是巨噬细胞的有效趋化因子，并且可改变其细 胞因子和花生四稀酸代谢物的产生。它在伴随败血症的凝血中是尤其 重要的。许多研究已经记录在败血症患者中或在动物模型施用LPS 之后的凝血系统的活化。尽管超过三十年研究，LPS诱导肝毒性的机 制仍然知之甚少。现在清楚的是其涉及细胞与体液介体之间的一系列 复杂和连续相互作用。在这一段相同时间内，革兰氏阴性全身败血症 和它的后遗症已经成为主要健康问题，使用针对LPS或各种炎症介 体的单克隆抗体的尝试只导致治疗失败。靶向凝血酶和至少一种其它靶标的抗体复合物解决败血症治疗中的临床失败。
在其它实施方案中，抗体复合物结合至MHC I类、MHC II类或 辅助分子，如CD40、CD54、CD80或CD86。抗体复合物也可结合 至T-细胞活化细胞因子，或细胞因子介体，如NF-κB。
在某些实施方案中，两个不同靶标之一可为癌细胞受体或癌症相 关抗原，尤其选自由以下组成的组：B-细胞谱系抗原(CD19、CD20、 CD21、CD22、CD23等)、VEGF、VEGFR、EGFR、癌胚抗原(CEA)、 胎盘生长因子(PlGF)、腱生蛋白、HER-2/neu、EGP-1、EGP-2、CD25、 CD30、CD33、CD38、CD40、CD45、CD52、CD74、CD80、CD138、 NCA66、CEACAM1、CEACAM6(癌胚抗原相关细胞粘附分子6)、 MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、IL-6、α-胎蛋白(AFP)、 A3、CA125、结肠-特异性抗原-p(CSAp)、叶酸盐受体、HLA-DR、 人绒毛膜促性腺素(HCG)、Ia、EL-2、胰岛素样生长因子(IGF)和IGF 受体、KS-1、Le(y)、MAGE、坏死抗原、PAM-4、前列腺酸性磷酸 酶(PAP)、Pr1、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原 (PSMA)、S100、T101、TAC、TAG72、TRAIL受体和碳酸酐酶IX。
与败血症和免疫失调和其它免疫病症相关联的靶标包括MIF、 IL-1、IL-6、IL-8、CD74、CD83和C5aR。已经发现针对C5aR的抗 体和抑制剂改善患有败血症的啮齿动物的存活(Huber-Lang等人， FASEB J 2002；16：1567-1574；Riedemann等人，J ClinInvest 2002；110：101-108)和猴子的败血性休克和成人呼吸窘迫综合征(Hangen等 人，J SurgRes1989；46：195-199；Stevens等人，J ClinInvest 1986； 77：1812-1816)。因此，对于败血症，两个不同靶标之一优选地是与感 染相关联的靶标，如LPS/C5a。其它优选靶标包括HMGB-1、组织因 子、CD14、VEGF和IL-6，其各自与败血病或败血性休克相关联。 优选抗体复合物是靶向来自HMGB-1、组织因子和MIF，如MIF/组 织因子和HMGB-1/组织因子的两个或更多个靶标的那些抗体复合 物。
在其它实施方案中，不同靶标之一可为与移植物抗宿主疾病或移 植排斥相关联的靶标，如MIF(Lo等人，Bone Marrow Transplant，3 0(6)：375-80(2002))。不同靶标之一也可为与以下病症相关联：急性 呼吸窘迫综合征如IL-8(Bouros等人，PMC Pulim Med，4(1)：6(2004)， 动脉粥样硬化或再狭窄如MIF(Chen等人，Arterioscler Thromb VascBiol，24(4)：709-14(2004)，哮喘如IL-18(Hata等人，Int Immunol，10 月11日，2004 Epub先于印刷)，肉芽肿疾病如TNF-α(Ulbricht等人， Arthritis Rheum，50(8)：2717-8(2004)，神经病变如氨甲酰化EPO(促 红细胞生成素)(Leist等人，Science 305(5681)：164-5(2004)，或恶病 质如IL-6和TNF-α。
其它靶标包括C5a、LPS、IFN-γ、B7、CD2、CD4、CD14、CD 18、CD11a、CD11b、CD11c、CD14、CD18、CD27、CD29、CD38、 CD40L、CD52、CD64、CD83、CD147、CD154。单核细胞通过某些微生物抗原(包括LPS)的活化可在一定程度上由CD18、CD11b或C D11c的抗体来抑制，因而牵涉β2-整联蛋白(Cuzzola等人，J Immuno l 2000；164：5871-5876；Medvedev等人，JImmunol 1998；160：45 35-4542)。已经发现CD83在巨细胞动脉炎(GCA)中起作用，巨细胞动脉炎是一种全身性血管炎，影响中等和大尺寸的动脉，主要是主动 脉弓和主动脉本身的的颅外分支，导致血管狭窄和随后组织缺血，以 及失明、中风和主动脉弓综合征的严重并发症(Weyand和Goronzy， N Engl J Med 2003；349：160-169；Hunder和Valente，于：INFLAMMATORY DISEASES OF BLOOD VESSELS.G.S.Hoffman和C. M.Weyand编，Marcel Dekker，New York，2002；255-265)。发现C D83的抗体在人GCA的SCID小鼠模型中消除血管炎(Ma-Krupa等 人，J Exp Med 2004；199：173-183)，对于这些调查者表明在活化时 表达CD83的树突状细胞是GCA中的关键抗原处理细胞。在这些研 究中，其使用小鼠抗-CD83 MAb(来自Research Diagnostics的IgG1 克隆HB15e)。CD154，TNF家族的成员，表达于CD4-阳性T-淋巴细 胞表面上，并且已经报告CD154的人源化单克隆抗体在患有活动性 全身性红斑狼疮(SLE)的患者中产生显著临床益处(Grammar等人，J Clin Invest 2003；112：1506-1520)。也暗示此抗体可以适用于其它自 身免疫疾病(Kelsoe，J Clin Invest 2003；112：1480-1482)。事实上， 此抗体也报告为在患有难治性免疫血小板减少性紫癜的患者中有效(Kuwana等人，Blood 2004；103：1229-1236)。
在类风湿性关节炎中，重组白介素-1受体拮抗剂，IL-1Ra或阿 那白滞素，已经展示活性(Cohen等人，Ann Rheum Dis 2004； 63：1062-8；Cohen，Bheum Dis Clin North Am2004；30：365-80)。迄今 需要同时用甲氨喋呤治疗的这些患者的治疗的改善是将阿那白滞素 与一个或多个抗-促炎症效应细胞因子或抗-促炎症效应趋化因子(如 以上列出)组合。事实上，在类风湿性关节炎的抗体疗法的综述中， Taylor(Curr Opin Pharmacol 2003；3：323-328)暗示除了TNF以外，这 类细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-15、IL-17和IL-18的其它抗体是 适用的。
本发明的药物组合物可以用来治疗具有代谢疾病(如淀粉样变性) 或神经退化性疾病(如阿尔茨海默病)的受试者。巴匹珠单抗 (Bapineuzumab)正处于阿尔茨海默氏病疗法的临床试验中。其它提出 用于治疗阿尔茨海默氏病的抗体包括Alz 50(Ksiezak-Reding等人， 1987，J Biol Chem 263：7943-47)、甘替鲁单抗(gantenerumab)和索兰珠 单抗(solanezumab)。已报导抗TNF-α抗体英利昔单抗(Infliximab)减少 淀粉样斑块并且改良认知。
在一优选实施方案中，可使用所要求保护的组合物和方法治疗的 疾病包括心血管疾病，如纤维蛋白凝块、动脉粥样硬化、心肌缺血和 梗塞。纤维蛋白抗体(例如scFv(59D8)；T2G1s；MH1)是已知的并且 正作为公开所述凝块和肺栓塞的成像剂进行临床试验，而抗粒细胞抗 体(如MN-3、MN-15、抗NCA95和抗CD15抗体)可靶向心肌梗塞和 心肌缺血。(参见例如美国专利No.5,487,892；5,632,968；6,294,173； 7,541,440，各专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。可使用抗 巨噬细胞、抗低密度脂蛋白(LDL)、抗-MIF和抗CD74(例如hLL1)抗 体来靶向动脉粥样硬化斑块。阿昔单抗(Abciximab)(抗糖蛋白IIb/IIIa)已批准在经皮冠状动脉介入干预和治疗不稳定型心绞痛中辅助用于 预防再狭窄(Waldmann等人，2000，Hematol 1：394-408)。针对氧化型 LDL的抗体在小鼠模型中诱导已建立的动脉粥样硬化的好转(Ginsber g，2007，J Am Coll Cardiol 52：2319-21)。已显示抗ICAM-1抗体在 大鼠中减少脑动脉闭塞后的缺血性细胞损伤(Zhang等人，1994，Neurology 44：1747-51)。针对白细胞抗原的市售单克隆由以下代表：OKT 抗T细胞单克隆抗体(可获自Ortho Pharmaceutical Company)，其结 合正常T淋巴细胞；由具有ATCC登记号HB44、HB55、HB12、HB 78和HB2的杂交瘤产生的单克隆抗体；G7E11、W8E7、NKP15和G O22(Becton Dickinson)；NEN9.4(New England Nuclear)；和FMCll(S era Lab)。针对纤维蛋白和血小板抗原的抗体的描述含于Knight，Se min.Nuc，.Med.，20：52-67(1990)中。
可以使用的其它抗体包括对抗感染性疾病因子(agent)的抗体，所 述感染性疾病因子如细菌、病毒、支原体或其它病原体。许多对抗此 类感染性因子的抗体是本领域中已知的，并且任何此类已知的抗体可 以用于所要求保护的方法和组合物中。例如，对抗人免疫缺陷病毒I (HIV-1)的gp120糖蛋白抗原的抗体是已知的，并且某些此类抗体可 以对人具有免疫保护作用。参见例如Rossi等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.86：8055-8058，1990。已知抗-HIV抗体包括由Johansson等人 (AIDS，2006年10月3日；20(15)：1911-5)描述的抗包膜抗体，以及由 Polymun(Vienna，Austria)描述并出售，也由美国专利5,831,034、美国专利5,911,989和Vcelar等人，AIDS 2007；21(16)：2161-2170和Joos 等人，Antimicrob.Agents(hemother.2006；50(5)：1773-9描述的抗-HIV 抗体，所述参考文献以引用方式整体并入本文。
对抗疟疾寄生虫的抗体可以针对孢子体阶段、裂殖子阶段、裂殖 体阶段以及配子体阶段。已经产生针对子孢子(环子孢子抗原)的单株 抗体，并且已被证明可在体外和啮齿动物内中和子孢子(N.Yoshida等 人，Science 207：71-73，1980)。几个小组已经开发刚地弓形虫的抗体， 所述刚地弓形虫是涉及弓形体病的原生寄生虫(Kasper等人，J.Immunol.129：1694-1699，1982；同上，30：2407-2412，1983)。已开发针 对血吸虫童虫表面抗原的抗体并且已经发现在体内或体外针对血吸 虫童虫起作用(Simpson等人，Parasitology，83：163-177，1981；Smith 等人，Parasitology，84：83-91，1982：Gryzch等人，J.Immunol.， 129：2739-2743，1982；Zodda等人，J.Immunol.129：2326-2328，1982；Dissous等人，J.Immuno，.129：2232-2234，1982)
克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)是恰加斯病的致病因子，并且通过 吸血的食虫椿象科昆虫来传播。已经产生在体外特异性地抑制寄生虫 的一种形式向另一种形式(上鞭毛体至锥鞭毛体阶段)分化的抗体，并 且所述抗体与细胞表面糖蛋白反应；然而，哺乳动物(血流)形式的寄 生虫不存在此抗原(Sher等人，Nature，300：639-640，1982)。
抗真菌抗体是本领域中已知的，如抗-核盘菌(Sclerotinia)抗体(美 国专利7,910,702)；抗葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(antiglucuronoxyloma nnan)抗体(Zhong和Priofski，1998，Clin Diag Lab Immunol 5：58-6 4)；抗-假丝酵母(Candida)抗体(Matthews和Bumie，2001，Curr Opin Investig Drugs 2：472-76)；以及抗鞘糖脂抗体(Toledo等人，2010，B MC Microbiol 10：47)。
已经开发了对抗造成大部分人感染的大多数微生物(细菌、病毒、 原生生物、真菌、其它寄生虫)的适合的抗体，并且许多已经在先前 用于体外诊断目的。这些抗体和可以通过常规方法产生的更新的抗体 适合用于本发明。
免疫偶联物
在某些实施方案中，抗体或其片段可以与一种或多种治疗剂和/ 或诊断剂组合使用。治疗剂不需要相同但是可不同，例如药物和放射 性同位素。举例来说，131I可并入抗体或融合蛋白质的酪氨酸中并且 药物连接至赖氨酸残余物的ε氨基。可将载体部分连接至例如经过还 原的SH基团和/或碳水化合物侧链。制造治疗剂或诊断剂与抗体或融 合蛋白质的共价或非共价偶联物的许多方法在本领域中为已知的并 且可利用任何这类已知方法。
治疗剂或诊断剂可以通过二硫键的形成而连接在还原抗体组分 的铰链区。或者，所述试剂可使用异双官能交联剂(如3-(2-吡啶基二 硫基)丙酸N-琥珀酰酯(SPDP))连接。Yu等人，Int.J.Cancer 56：24 4(1994)。用于此类偶联的一般技术是本领域中众所周知的。参见例 如Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROS S-LINKING(CRC Press1991)；Upeslacis等人，“Modification of An tibodies by Chemical Methods，”MONOCLONAL ANTIBODIES：P RINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等人(编)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，“Production and Characterization of SyntheticPeptide-Derived Antibodies，”MONOCLONAL ANTIBODI ES：PRODUCTION，ENGINEERING ANDCLINICAL APPLICATI ON，Ritter等人(编)，第60-84页(Cambridge University Press1995)。 或者，可通过抗体Fc区中的碳水化合物部分偶联载体部分。碳水化 合物基团可用于增加结合至硫醇基的相同试剂的负载，或碳水化合物 部分可用于结合不同治疗剂或诊断剂。
经由抗体碳水化合物部分将肽偶联至抗体组分的方法是本领域 技术人员熟知的。参见例如Shih等人，Iht.J.Cancer 41：832(1988)； Shih等人，Int.J.Cancer 46：1101(1990)；和Shih等人美国专利号 5,057,313，其通过引用方式整体并入本文。一般方法涉及使具有氧化 碳水化合物部分的抗体与具有至少一个游离胺官能的载体聚合物反 应。此反应产生初始希夫碱(Schiff base)(亚胺)键联，其可通过还原成 仲胺而稳定以形成最终偶联物。
在免疫偶联物的抗体组分是抗体片段的情况下可能不存在Fc 区。然而，有可能将碳水化合物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链 可变区中。参见，例如，Leung等人，J.Immunol.154：5919(1995)； Hansen等人，美国专利No.5,443,953(1995)，Leung等人，美国专 利No.6,254,868，所述文献均以引用方式整体并入本文。使用经过 工程改造的碳水化合物部分来连接治疗剂或诊断剂。
在一些实施方案中，螯合剂可连接至抗体、抗体片段或融合蛋白 质和用于螯合治疗剂或诊断剂，如放射性核素。示例性螯合剂包括但 不限于DTPA(如Mx-DTPA)、DOTA、TETA、NETA或NOTA。偶联 并使用螯合剂来将金属或其它配体连接至蛋白质的方法在本领域中 是熟知的(参见，例如，美国专利号7,563,433，其实施例部分以引用 方式并入本文)。
在某些实施方案中，放射性金属或顺磁性离子可通过与具有长尾 的试剂反应来连接至蛋白质或肽，所述尾可连接有结合离子的多个螯 合基团。这样的尾可以是具有可结合螯合基团的侧基的聚合物，例如 聚赖氨酸、多糖或其它衍生化链或可衍生链，所述螯合基团为，例如 乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、聚胺、 冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟，和已知可用于此目的的相似基团。
螯合物可直接连接至抗体或肽，例如如美国专利4,824,659中公 开，其以引用方式整体并入本文。特别有用的金属螯合物组合包括 2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物，它们与总能量范围为60 至4,000 keV的诊断同位素一起用于放射成像，所述同位素为例如 125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、 11C、13N、15O、76Br。相同的螯合物在与非放射性金属例如锰、铁和 钆复合时可用于MRI。如NOTA、DOTA以及TETA的巨环螯合剂可 与各种金属和放射性金属一起使用，最特别地分别与放射性核素镓、 钇和铜一起使用。可通过根据目标金属调整环的大小而使此类金属螯 合物复合物变得非常稳定。本发明包括其它环类型的螯合物如大环聚 醚，它们对于稳定地结合核素如用于RAIT的223Ra有价值。
最近，已经公开了用于PET扫描技术中的18F-标记方法，例如通 过F-18与金属或其它原子如铝反应。18F-Al偶联物可与直接连接至 抗体或用于在预靶向方法中标记靶向性构建体的螯合基团，如 DOTA、NOTA或NETA复合。这类F-18标记技术公开于美国专利号 7,563,433中，其实施例部分以引用方式并入本文。
在优选实施方案中，单独或另外复合至一种或多种效应物如细胞 因子的双特异性抗体形成为DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合物(参 见，例如，美国专利号7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143； 7,666,400；7,901,680；7,906,118；7,981,398；8,003，111，其实施例部 分各自以引用方式并入本文。)总体上，所述技术利用在cAMP-依赖 性蛋白激酶(PKA)的调控(R)亚基的二聚化和停靠结构域(DDD)序列 与从任何各种AKAP蛋白质衍生的锚定结构域(AD)序列之间发生的 特异性和高亲和力结合相互作用(Baillie等人，FEBSLetters.2005；579： 3264.Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。DDD和 AD肽可连接至任何蛋白质、肽或其它分子。因为DDD序列自发二 聚化并结合至AD序列，所以所述技术允许在可连接至DDD或AD 序列的任何选定分子之间形成复合物。
虽然标准DNLTM复合物包括具有连接至一个AD连接分子的两 个DDD连接分子的三聚体，但是复合结构的变化允许形成二聚体、 三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和其它多聚体。在一些实施方案中， DNLTM复合物可包括结合至相同抗原决定簇或两个或更多个不同抗原的两个或更多个抗体、抗体片段或融合蛋白质。DNLTM复合物还可 包括一种或多种其它效应物，如蛋白质、肽、免疫调节剂、细胞因子、 白介素、干扰素、结合蛋白质、肽配体、载体蛋白质、毒素、核糖核 酸酶如抗肿瘤核糖核酸酶、抑制性寡核苷酸如siRNA、抗原或异种抗原、聚合物如PEG、酶、治疗剂、激素、细胞毒性剂、抗血管生成剂、 促细胞凋亡剂或任何其它分子或聚合体。
1968年，首次从兔骨骼肌中分离出PKA，其在由第二信使cAMP 结合R亚基而触发的最彻底研究的信号转导途径之一中起关键作用 (Walsh等人，J.Biol.Chem.1968；243：3763)。全酶的结构由两个通过 R亚基保持为非活性形式的催化亚基组成(Taylor，J.Biol.Chem. 1989；264：8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚基(RI和 RII)，并且各类型具有α和β同种型(Scott，Pharmacol.Ther. 1991；50：123)。因此，PKA调控亚基的四个同种型是RIα、RIβ、RIIα 和RIIβ，其各自包括DDD部分氨基酸序列。R亚基仅分离为稳定二聚体并且显示二聚化结构域由RIlα的前44个氨基端残基组成 (Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：222)。如下论述，其它调控 亚基的氨基酸序列的类似部分涉及二聚化和停靠，其分别位于调控亚 基的N-末端附近。cAMP结合R亚基造成用于广谱丝氨酸/苏氨酸激 酶活性的活性催化亚基释放，所述活性催化亚基通过PKA的区室化 经由其与AKAP停靠而面向所选择的底物(Scott等人，J.Biol.Chem. 1990；265；21561)。
自从第一种AKAP微管相关蛋白-2于1984年表征以来(Lohmann 等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 1984；81：6723)，又在从酵母到人范 围内的物种中鉴别出具有多种结构的超过50种AKAP，其定位于各 种亚细胞位点，包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内 质网(Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.CellBiol.2004；5：959)。AKAP中用 于PKA的AD是具有14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等人，J.Biol. Chem.1991；266：14188)。AD的氨基酸序列在个别AKAP之间十分不 同，其中针对RII二聚体所报导的结合亲和力在2至90nM范围内 (Alto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2003；100：4445)。AKAP仅结合 二聚R亚基。对于人RIIα而言，AD结合由23个氨基末端残基形成 的疏水性表面(Colledge和Scott，Trends Cell Biol.1999；6：216)。因此， 人RIIα的二聚化结构域和AKAP结合结构域都定位在相同N端的44 氨基酸的序列内(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：222；Newlon 等人，EMBO J.2001；20：1651)，其在本文被称为DDD。
我们已发展出一种平台技术，其利用人PKA调控亚基的DDD 和AKAP的AD作为一对优良的接头模块用于将任何两个实体(在下 文称为A与B)停靠成非共价复合物，所述复合物可通过在DDD与A D的至关重要的位置中引入半胱氨酸残基以促进形成二硫键而进一 步锁定为DNLTM复合物。所述途径的一般方法如下。实体A通过将 DDD序列连接至A的前驱体进行构建，产生下文称为a的第一组分。 因为DDD序列将实现二聚体的自发形成，因此A将由a2构成。实体 B通过将AD序列连接至B的前驱体进行构建，产生下文称为b的第 二组分。a2中所含的DDD的二聚基元将产生用于结合b中所含的A D序列的停靠位点，由此促进a2与b容易地缔合形成由a2b构成的二 元三聚复合物。此结合事件通过随后的反应以经由二硫桥键共价固定 两个实体而成为不可逆的，这基于有效局部浓度的原则而非常有效地 发生，因为初始的结合相互作用会使置于DDD和AD两者上的反应 性硫醇基靠近(Chmura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001；98：84 80)以位点特异性地连接。通过使用接头、衔接子模块和前体的各种 组合，可产生并使用不同化学定量关系的各种各样的DNLTM构建体 (参见例如U.S.No.7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和7, 666,400。)
通过远离两个前驱体的官能团连接DDD和AD，还预期所述位 点特异性连接将保留两个前驱体的原始活性。此方法在性质上是模块 化的并且可潜在应用于位点特异性共价连接多种物质，包括肽、蛋白 质、抗体、抗体片段和具有多种活性的其它效应子部分。利用构建以 下实施例中所述的偶联AD和DDD的效应物的融合蛋白法，可将几 乎任何蛋白质或肽并入DNLTM构建体中。然而，所述技术并不具限 制性并且可利用其它偶联方法。
已知用于制备融合蛋白的多种方法，包括核酸合成、杂交和/或 扩增以产生编码目标融合蛋白的合成双链核酸。可通过标准分子生物 学技术将所述双链核酸插入用于制造融合蛋白的表达载体中(参见例 如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，第2版，1989)。在所述优选实施方案中，AD和/或DDD部 分可连接于效应蛋白或肽的N-末端或C-末端。然而，熟练技术人员 将认识到，AD或DDD部分连接于效应子部分的位点可根据效应子 部分的化学性质和效应子部分中参与其生理活性的部分而改变。多种 效应子部分的位点特异性连接可使用本领域中已知的技术执行，如使 用二价交联试剂和/或其它化学偶联技术。
Dock-and-LockTM(DNLTM)技术用于产生不同格式的多种复合物 (Rossi等人，2012，Bioconjug Chem 23：309-23)。基于维妥珠单抗(抗 -CD20)和依帕珠单抗(抗-CD22)的双特异性六价抗体(bsHexAb)通过 将融合至二聚化和停靠结构域(DDD)的稳定化(Fab)2与含有附接于每 个重链的C-末端的锚定结构域(AD)的IgG组合来构建(CH3-AD2-IgG)(Rossi等人，2009，Blood 113，6161-71)。与其亲本mAb的混合物相比， 这些基于Fc的bsHexAb，以下称为“Fc-bsHexAb”，诱导独特信号转 导事件(Gupta等人，2010，Blood 116：3258-67)，并且在体外展示有效 细胞毒性。然而，Fc-bsHexAb从小鼠循环中清除的速率比亲本mAb 快大约两倍(Rossi等人，2009，Blood 113，6161-71)。虽然Fc-bsHexAb 离体高度稳定，但是可能在体内发生一些解离，例如通过细胞内加工。 此外，Fc-bsHexAb没有CDC活性。
基于Fc的免疫细胞因子也组装为DNLTM复合物，其包括融合至 C-末端CH3-AD2-IgGFc的干扰素-α 2b(IFNα2b)的两个或四个分子 (Rossi等人，2009，Blood 114：3864-71；Rossi等人，2010，Cancer R es 70：7600-09；Rossi等人，2011，Blood 118：1877-84)。Fc-IgG-IFNα 保持接近于重组IFNα的较高比活性，并且在体外和体内针对非霍奇 金淋巴瘤(NHL)异种移植物是显著有效的。小鼠中的Fc-IgG-IFNα的 T1/2长于聚乙二醇化IFNα，但是为亲本mAb的一半长。与Fc-bsHex Ab相似，Fc-IgG-IFNα在体内随着时间的推移而解离并且展示降低C DC，但是ADCC增强。
AD和DDD部分中的结构功能关系
对于不同类型的DNLTM构建体，可利用不同AD或DDD序列。 示例性DDD和AD序列提供于下文中。
DDDI
DDD2
AD1
AD2
技术人员将会意识到，DDD1和DDD2基于蛋白激酶A的人RIIα 同种型的DDD序列。然而，在替代实施方案中，DDD和AD部分可 以基于蛋白激酶A的人RIα形式的DDD序列和相应AKAP序列，如 下文DDD3、DDD3C和AD3中所例示。
DDD3
DDD3C
AD3
然而，在替代实施方案中，在DNLTM复合物的构建中可利用AD 和/或DDD部分的序列变体。例如，人PKADDD序列仅存在4个变 体，与PKARIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分相对应。RIIα DDD 序列是上文公开的DDD1和DDD2的基础。四种人PKA DDD序列 于下文示出。所述DDD序列表示RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、 RIα的残基12-61和RIβ的残基13-66。(应注意，DDD1的序列与人 PKARIIα DDD部分相比稍有改变。)
PKA RIα
PKA RIβ
PKA RIIα
PKA RIIβ
已对AD和DDD结构域的结构功能关系进行了研究。(参见例如 Bums-Hamuro等人，2005，Protein Sci 14：2982-92；Carr等人，2001， J Biol Chem 276：17332-38；Alto等人，2003，Proc Natl Acad Sci USA 100：4445-50；Hundsrucker等人，2006，Biochem J 396：297-306； Stokka等人，2006，Biochem J 400：493-99；Gold等人，2006，Mol Cell 24：383-95；Kinderman等人，2006，Mol Cell 24：397-408，所述 各文献的整个正文以引用的方式并入本文。
例如，Kinderman等(2006，Mol Cell24：397-408)检查了AD-DDD 结合相互作用的晶体结构，并且得出结论：人DDD序列含有许多对 于二聚体形成或AKAP结合重要的保守氨基酸残基，在下面SEQ ID NO：1中加下划线标出。(参见Kinderman等，2006的图1，以引用的方式并入本文。)熟练技术人员将认识到，在设计DDD序列的序列变 体时，将希望避免改变任何加下划线残基，而对于二聚化和AKAP 结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。
如以下更详细论述，已对于二十个常见L-氨基酸中的每一种表 征保守氨基酸取代。因此，基于Kinderman(2006)的数据和保守氨基 酸取代，基于SEQ ID NO：1的潜在替代DDD序列展示于表2。在制 定表2中，只考虑高度保守氨基酸取代。举例来说，带电残基只取代 相同电荷的残基，具有较小侧链的残基用类似大小的残基取代，羟基 侧链只用其它羟基取代等。因为脯氨酸对于氨基酸次级结构的独特效 应，没有其它残基取代脯氨酸。有限数目的这类潜在替代DDD部分 序列展示于以下SEQ ID NO：12至SEQ ID NO：31中。本领域技术人 员将认识到DDD部分种类内的几乎无限数目的替代物质可通过标准 技术来构建，例如使用商用肽合成器或熟知的定点诱变技术。氨基酸 取代对于AD部分结合的效应还可容易地通过标准结合测定来确定， 例如如Alto等人(2003，Proc Natl Acad Sci USA 100：4445-50)中所公 开。
表2.DDD1(SEQ ID NO：1)中的保守氨基酸取代。共有序列公开 为SEQ ID NO：87。
Alto等(2003，Proc Natl Acad Sci USA 100：4445-50)对各种AKAP 蛋白的AD序列进行生物信息学分析，以设计称为AKAP-IS的RII 选择性AD序列(SEQ ID NO：3)，其对DDD的结合常数为0.4nM。AKAP-IS序列设计成AKAP与PKA结合的肽拮抗剂。AKAP-IS序列 中取代倾向于使与DDD的结合减弱的残基在SEQ ID NO：3中加下划 线显示。熟练技术人员将认识到，在设计AD序列的序列变体时，将 希望避免改变任何加下划线残基，而对于DDD结合不太关键的残基 可进行保守氨基酸取代。表3展示AKAP-IS(AD1，SEQ ID NO：3)序 列中的潜在保守氨基酸取代，类似于以上表2中的对于DDD1(SEQ ID NO：1)展示的氨基酸取代。
有限数目的这类潜在替代AD部分序列展示于以下SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：49中。另外，基于Alto等人(2003)的数据，可 能AD部分序列种类内的很大数目的物质可由本领域技术人员制备、 测试并使用。应注意Alto(2003)的图2展示可制备的甚至较大数目的潜在氨基酸取代，同时基于实际结合实验，保留对于DDD部分的结 合活性。
AKAP-IS
表3.AD1(SEQ ID NO：3)中的保守氨基酸取代。共有序列公开为 SEQ ID NO：88。
Gold等人(2006，Mol Cell 24：383-95)利用结晶学和肽筛选开发 SuperAKAP-IS序列(SEQ ID NO：50)，其对PKA的RII同种型表现出 与RI同种型相比高5个数量级的选择性。加下划线残基指示相对于 AKAP-IS序列的氨基酸置换的位置，所述氨基酸置换增强对RIIα的 DDD部分的结合。在此序列中，N-端Q残基编号为残基编号4并且 C-端A残基为残基编号20。可以进行置换以影响对RIIα的亲和性的 残基是残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等人，2006)。预期在 某些替代实施方案中，可用SuperAKAP-IS序列取代AKAP-IS AD部 分序列来制备DNLTM构建体。可用来取代AKAP-IS AD序列的其它 替代序列于SEQ ID NO：51-53中示出。相对于AKAP-IS序列的取代 加下划线显示。预期如同SEQ ID NO：4中所示的AD2序列，AD部 分还可包括额外N-端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C-端残基甘氨酸和 半胱氨酸。
SuperAKAP-IS
替代性AKAP序列
Gold等人的图2公开来自以下展示的各种AKAP蛋白质的额外 DDD结合序列。
RI特异性AKAP
AKAP-KL
AKAP79
AKAP-Lbc
RI特异性AKAP
AKAPce
RIAD
PV38
双重特异性AKAP
AKAP7
MAP2D
DAKAP1
DAKAP2
Stokka等人(2006，Biochem J 400：493-99)也开发AKAP结合至 PKA的肽竞争剂，其展示于SEQ ID NO：64-66中。肽拮抗剂命名为 Ht31(SEQ ID NO：64)、RIAD(SEQ ID NO：65)和PV-38(SEQ ID NO：66)。 Ht-31肽对于PKA的RII同种型显示较高亲和力，而RIAD和PV-38 对于RI显示较高亲和力。
Ht3l
RIAD
PV-38
Hundsrucker等人(2006，Biochem J 396：297-306)开发了AKAP与 PKA的结合的其它肽竞争剂，与PKA的RII形式的DDD的结合常 数低至0.4 nM。各种AKAP拮抗性肽的序列提供于Hundsrucker等人 的表1中，复制于下文表4中。AKAPIS代表一种合成RII亚基结合 肽。所有其它肽都来源于所指定AKAP的RII结合结构域。
表4.AKAP肽序列
在不同AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基在下文通过 参考AKAP IS序列(SEQ ID NO：3)加下划线显示。残基与Alto等人 (2003)所观察到是相同的，其中添加C-末端丙氨酸残基。(参见 Hundsrucker等人(2006)的图4，其以引用方式并入本文。)对RII DDD序列有特别高的亲和性的肽拮抗剂的序列为AKAP-IS、 AKAP7δ-wt-pep、AKAP76-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep的那些。
AKAP-IS
Carr等人(2001，J Biol Chem 276：17332-38)检查了来自人和非人 蛋白质的不同AKAP结合DDD序列之间序列同源性的程度，并且鉴 别出DDD序列中似乎在不同DDD部分中最高度保守的残基。其在 下文通过参考SEQ ID NO：1的人PKARIIα DDD序列加下划线表示。特别保守的残基进一步以斜体表示。残基与Kinderman等人(2006)提 出的对于结合至AKAP蛋白质至关重要的那些残基重叠但是不相同。 熟练技术人员将认识到，在设计DDD的序列变体时，最优选的是避 免改变最保守的残基(斜体)，并且优选还避免改变保守残基(加下划 线)，而既未加下划线也不是斜体的残基可考虑进行保守氨基酸取代。
基于Carr等人(2001)的数据的DDD1(SEQ ID NO：1)序列的一组 修饰的保守氨基酸取代展示于表5中。与这一组减少的取代序列一 样，存在可由本领域技术人员在没有过多实验下产生、测试并使用的 超过65,000个可能替代的DDD部分序列。本领域技术人员可容易获 得这类替代DDD氨基酸序列，如以上公开于表2和表3。
表5.DDD1(SEQ ID NO：1)中的保守氨基酸取代。共有序列公开 为SEQ ID NO：89。
本领域技术人员将认识到使用本领域中标准的技术以及仅常规 实验，DDD或AD氨基酸序列中的这些和其它氨基酸取代可用于产 生AD或DDD部分种类内的替代物质。
氢基酸取代
在替代实施方案中，所公开的方法和组合物可涉及产生和使用具 有一个或多个取代氨基酸残基的蛋白质或肽。举例来说，用于制备 DNLTM构建体的DDD和/或AD序列可如以上论述来修饰。
本领域技术人员知道，通常，氨基酸取代典型地涉及将氨基酸替 换为相对类似性质的另一种氨基酸(即，保守氨基酸取代)。各种氨基 酸的性质和氨基酸取代对于蛋白质结构和功能的效应是在本领域中 的广泛研究和知识的主题。
举例来说，可考虑氨基酸的亲水指数(Kyte & Doolittle，1982，J. Mol.Biol.，157：105-132)。氨基酸的相对亲水性质有助于蛋白质的次级 结构合成，进而界定蛋白质与其它分子的相互作用。每一种氨基酸已 经基于其疏水性和电荷特性来指定亲水指数(Kyte& Doolittle，1982)， 它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)； 半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)； 苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)； 组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰 胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。在产生保守取代中，使用 其亲水指数在±2内的氨基酸是优选的，在±1内是更优选的，并且在 ±0.5内甚至是更优选的。
氨基酸取代还可考虑到氨基酸残基的亲水性(例如，美国专利号 4,554,101)。以下亲水性值已指定给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)； 赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0)；谷氨酸(+3.0)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰 胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)； 丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸 (-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5) 以及色氨酸(-3.4)。将氨基酸替换为类似亲水性的其它氨基酸是优选 的。
其它考虑因素包括氨基酸侧链的大小。举例来说，总体上氨基酸 用紧凑侧链，如甘氨酸或丝氨酸，用具有庞大侧链的氨基酸，例如， 色氨酸或酪氨酸来取代并非优选的。也考虑各种氨基酸残基对于蛋白 质次级结构的效应。通过实验研究，已经确定不同氨基酸残基对于蛋 白质域采用α-螺旋、β-薄片或反转次级结构的趋势的效应并且在本领 域中是已知的(参见，例如，Chou & Fasman，1974，Biochemistry， 13：222-245；1978，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276；1979，Biophys.J.， 26：367-384)。
基于这类考虑因素和广泛实验研究，已经构建保守氨基酸取代的 表格并且在本领域中为已知的。举例来说：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸 和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、 亮氨酸和异亮氨酸。替代地：Ala(A)leu、ile、val；Arg(R)gln、asn、 lys；Asn(N)his、asp、lys、arg、gln；Asp(D)asn、glu；Cys(C)ala、 ser；Gln(Q)glu、asn；Glu(E)gln、asp；Gly(G)ala；His(H)asn、 gln、lys、arg；Ile(I)Val、met、ala、phe、leu；Leu(L)val、met、ala、 phe、ile；Lys(K)gln、asn、arg；Met(M)phe、ile、leu；Phe(F)leu、val、ile、ala、tyr；Pro(P)ala；Ser(S)、thr；Thr(T)ser；Trp(W)phe、 tyr；Tyr(Y)trp、phe、thr、ser；Val(V)ile、leu、met、phe、ala。
氨基酸取代的其它考虑因素包括是否残基位于蛋白质内部或是 溶剂暴露的。对于内部残基，保守取代包括：Asp和Asn；Ser和Thr； Ser和Ala；Thr和Ala；Ala和Gly；Ile和Val；Val和Leu；Leu和 Ile；Leu和Met；Phe和Tyr；Tyr和Trp。(参见，例如PROWL网站rockefeller.edu)对于溶剂暴露残基，保守取代包括：Asp和Asn；Asp 和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和Asn；Ala和Pro；Ala和Gly； Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr；Lys和Arg；Val和Leu；Leu和 Ile；Ile和Val；Phe和Tyr。(同上)已经构建帮助选择氨基酸取代的 各种阵列，如PAM250评分阵列、Dayhoff阵列、Grantham阵列、 McLachlan阵列、Doolittle阵列、Henikoff阵列、Miyata阵列、Fitch 阵列、Jones阵列、Rao阵列、Levin阵列和Risler阵列(同上)
在确定氨基酸取代中，还可考虑分子间或分子内键的存在，如形 成带正电荷残基(例如，His、Arg、Lys)与带负电荷残基(例如，Asp、 Glu)之间的离子键(盐桥键)或相邻半胱氨酸残基之间的二硫键。
将任何氨基酸取代为所编码的蛋白质序列中的任何其它氨基酸 的方法为熟知的并且只需本领域技术人员的常规实验，例如定点诱变 技术或合成并组装编码氨基酸取代并且剪接至表达载体构建体中的 寡核苷酸。
治疗剂
在替代实施方案中，可使用治疗剂如细胞毒性剂、抗血管生成剂、 促细胞凋亡剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前药、 毒素、酶或其它药剂，其偶联至主题bsAb或在bsAb之前、同时或 之后个别地施用。所使用的药物可具有选自由以下组成的组的药学性 质：抗有丝分裂、抗激酶、烷基化、抗代谢物、抗生素、生物碱、抗 血管生成、促细胞凋亡剂和其组合。
有用的示例性药物可以包括但不限于：5-氟尿嘧啶、阿法替尼、 阿普立定(aplidin)、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类药物、阿西替尼、 AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、博舒替尼、 苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、 卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立 替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、克唑替尼、环磷 酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、地尼西宝(dinaciclib)、多西 他赛、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉阿霉素(2P-DOX)、氰基-吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、埃罗替尼、 雌莫司汀、表鬼臼毒素、埃罗替尼、恩替诺特、雌激素受体结合剂、 依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、依西美坦、芬 戈莫德、氟脲苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度、福他替尼、吉 尼替彼(ganetespib)、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼、吉西他滨、羟 基脲、依鲁替尼、伊达比星、伊德利斯、异环磷酰胺、伊马替尼、L- 天冬酰胺酶、拉帕替尼、来那度胺、亚叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、 氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉 霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、来那替尼、尼洛替尼、亚硝基脲、 奥拉帕尼、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、 PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、索拉非尼、链脲霉素、SU11248、舒 尼替尼、它莫西芬、替莫唑胺(DTIC的水性形式)、反铂、沙利度胺、 硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓扑替康、乌拉莫司汀、瓦他拉尼、 长春瑞滨、长春碱、长春新碱、长春花生物碱以及ZD1839。
所使用的毒素可包括蓖麻毒素、相思豆毒素、皂草素、核糖核酸 酶(RNA酶)(例如抗肿瘤核糖核酸酶(onconase))、DNA酶I、葡萄球菌 肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外 毒素和假单胞菌内毒素。
有用的趋化因子包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β以及 IP-10。
在某些实施方案中，抗血管生成剂，如血管抑素、baculostatin、 血管能抑素；乳腺丝抑蛋白；抗VEGF抗体；抗PlGF肽和抗体；抗 血管生长因子抗体；抗Flk-1抗体；抗Flt-1抗体和肽；抗Kras抗体； 抗-cMET抗体；抗MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)抗体；层粘连蛋白肽； 纤连蛋白肽；纤溶酶原激活物抑制剂；组织金属蛋白酶抑制剂；干扰 素；白细胞介素-12；IP-10；Gro-β；血小板反应蛋白；2-甲氧基雌二 醇；增殖蛋白相关的蛋白质；羧胺三唑；CM101；马立马司他 (Marimastat)；戊聚糖多硫酸盐；血管生成素-2；干扰素-α；除莠霉素A；PNU145156E；16K催乳素片段；利诺胺(Linomide)(罗喹美克 (roquinimex))；沙利度胺(thalidomide)；己酮可可碱；染料木黄酮； TNP-470；内皮抑素；紫杉醇；蛇毒解离素(accutin)；血管抑素；西 多福韦(cidofovir)；长春新碱；博来霉素；AGM-1470；血小板因子4 或米诺环素(minocycline)可以是有用的。
所使用的免疫调节剂可选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒 素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、 血小板生成素和其组合。特别适用者为淋巴毒素，如肿瘤坏死因子 (TNF)；造血因子，如白介素(IL)；集落刺激因子，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；干扰素， 如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-λ；和干细胞生长因子，如称为“S1 因子”者。包括在细胞因子之中的是：生长激素，如人生长激素、N- 甲硫氨酰基人生长激素以及牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素 (FSH)、促甲状腺激素(TSH)以及促黄体激素(LH)；肝细胞生长因子； 前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白； 肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒抑制物质；小鼠促性腺激素相关的肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小 板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化 生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素 样生长因子-II；红细胞生长素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰 素-α、干扰素-β以及干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF (M-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、 IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit配体或FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子以及LT。
特别有用的治疗放射性核素包括但不限于111In、177Lu、212Bi、 213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、 142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、 225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109pd、143pr、149pm、169Er、 194Ir、198Au、199Au、211Pb和227Th。治疗性的放射性核素优选的衰变 能量在20keV至6,000 keV范围内，针对俄歇(Auger)发射体优选地 在60keV至200keV范围内、针对β发射体在100keV至2,500keV范围内以及针对α发射体在4,000keV至6,000keV范围内。适用β 粒子发射核素的最大衰变能优选为20-5,000keV，更优选为100-4,000 keV，并且最优选为500-2,500keV。随俄歇发射粒子实质上衰变的放 射性核素也是优选的。举例来说，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、 Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、1-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。 有用的发射β粒子的核素的衰变能量优选地是＜1,000keV，更优选地 ＜100keV，并且最优选地＜70keV。随着α粒子产生而实质上衰变的 放射性核素也是优选的。此类放射性核素包括但不限于Dy-152、 At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、 At-217、Bi-213、Th-227和Fm-255。适用α粒子发射放射性核素的 衰变能优选为2,000-10,000keV，更优选为3,000-8,000keV，并且最 优选为4,000-7,000keV。另外的潜在的有用放射性同位素包括11C、 13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、 103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、 168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、 58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等。一些适用诊断 核素可包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94Tc、 94mTc、99mTc或111In。
治疗剂可以包括光活性剂或染料。荧光组合物(如荧光染料)和其 它色原体或染料(如对可见光敏感的卟啉)已经通过将适合的光引导 至损伤而用来检测并治疗损伤。在治疗中，这已经被称为光辐射、光 照疗法或光动力学疗法。参见Jori等人(编)，PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985)；vanden Bergh，Chem.Britain(1986)，22：430。此外，已经将单 克隆抗体与光活化的染料偶联用于实现光照疗法。参见Mew等人， J.Immunol.(1983)，130：1473；同上，Cancer Res.(1985)，45：4380； Oseroff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)，83：8744；同上，Photochem.Photobiol.(1987)，46：83；Hasan等人，Prog.Clin.Biol.Res. (1989)，288：471；Tatsuta等人，Lasers Surg.Med.(1989)，9：422；Pelegrin 等人，Cancer(1991)，67：2529。
其它适用治疗剂可包括寡核苷酸，尤其优选地针对致癌基因和致 癌基因产物如bcl-2或p53的反义寡核苷酸。优选形式的治疗性寡核 苷酸是siRNA。熟练的技术人员将认识到任何siRNA或干扰RNA种 类可以附接至抗体或其片段用于递送至靶向组织。针对多种标靶的许 多siRNA物质在本领域中是已知的，并且在所要求保护的方法和组 合物中可利用任何所述已知siRNA。
有可能使用的已知siRNA物质包括对以下具有特异性的那些： IKK-γ(美国专利7,022,828)；VEGF、Flt-1和Flk-1/KDR(美国专利 7,148,342)；Bcl2和EGFR(美国专利7,541,453)；CDC20(美国专利 7,550,572)；转导蛋白(β)样蛋白3(美国专利7,576,196)；KRAS(美国 专利7,576,197)；碳酸酐酶II(美国专利7,579,457)；补体组分3(美国 专利7,582,746)；白介素-1受体相关激酶4(IRAK4)(美国专利 7,592,443)；存活素(美国专利7,608,7070)；超氧化物歧化酶1(美国专 利7,632,938)；MET原癌基因(美国专利7,632,939)；淀粉样蛋白β前 驱体蛋白(APP)(美国专利7,635,771)；IGF-1R(美国专利7,638,621)； ICAM1(美国专利7,642,349)；补体因子B(美国专利7,696,344)； p53(7,781,575)和载脂蛋白B(7,795,421)，各参考专利的实施例部分以 引用的方式并入本文。
其它siRNA物质可从已知商业来源获得，如Sigma-A1drich(St Louis，MO)、Invitrogen(Carlsbad，CA)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)、Ambion(Austin，TX)、Dharmacon(Thermo Scientific， Lafayette，CO)、Promega(Madison，WI)、Mirus Bio(Madison，WI)和 Qiagen(Valencia，CA)以及许多其它来源。siRNA物质的其它可公开获 得的来源包括位于斯德哥尔摩生物信息学中心的siRNAdb数据库、 MIT/ICBPsiRNA数据库、位于博得研究院的RNAi联合shRNA文库 和位于NCBI的探针数据库。例如，在NCBI探针数据库中存在30,852 种siRNA物质。熟练技术人员将认识到，对于任何目标基因，或者 已对siRNA物质进行了设计，或者其可容易地使用可公开获得的软 件工具进行设计。任何所述siRNA物质都可使用主题DNL复合物进 行递送。
治疗性治疗的方法
各种实施方案涉及治疗受试者如哺乳动物(包括人、驯养或伴侣 宠物如犬和猫)的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的细 胞毒性bsAb。
在一个实施方案中，其可以用主题bsAb治疗的免疫疾病可能包 括，例如，关节疾病如强直性脊柱炎、幼年型类风湿关节炎、类风湿 关节炎；神经系统疾病，如多发性硬化和重症肌无力；胰腺疾病如糖 尿病，特别是青少年发病型糖尿病；胃肠道疾病，如慢性活动性肝炎、 乳糜泻、溃疡性结肠炎、克隆氏病，恶性贫血；皮肤疾病如牛皮癣或 硬皮病；过敏性疾病，如哮喘和移植相关的病症，如移植物抗宿主病 和移植排斥反应。
施用细胞毒性bsAb可通过同时或依序施用治疗有效量的结合至 或与靶细胞表面上的另一个抗原发生反应的另一种抗体来补充。优选 额外MAb包括选自由以下组成的组的至少一种人源化、嵌合或人M Ab：与CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、IGF-1R、 CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD32b、CD33、CD3 7、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD70、C D74、CD79a、CD80、CD95、CD126、CD133、CD138、CD154、C EACAM5、CEACAM6、B7、AFP、PSMA、EGP-1、EGP-2、碳酸酐 酶IX、PAM4抗原、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、Ia、 MIF、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、Flt-3、VEGFR、PlGF、ILGF、 IL-6、IL-25、腱生蛋白、TRAIL-R1、TRAIL-R2、补体因子C5、致 癌基因产物或其组合发生反应的MAb。所使用的各种抗体，如抗CD19、抗CD20和抗CD22，为本领域的技术人员所已知。参见例如G hetie等人，CancerRes.48：2610(1988)；Hekman等人，Cαncer Im munol.Immunother.32：364(1991)；Longo，Curr.Opin.Oncol.8：353 (1996)，美国专利号5,798,554；6,187,287；6,306,393；6,676,924；7, 109,304；7,151,164；7,230,084；7,230,085；7,238,785；7,238,786；7, 282,567；7,300,655；7,312,318；7,501,498；7,612,180；7,670,804和 美国专利申请公布号20080131363；20070172920；20060193865和2 0080138333，其实施例部分各自以引用方式并入本文。
bsAb疗法可进一步补充以同时或依序施用至少一种其它治疗 剂。例如，“CVB”(1.5g/m2环磷酰胺、200-400mg/m2依托泊苷和15 0-200mg/m2卡莫司汀)是用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的方案。Patti 等人，Eur.J.Haematol.51：18(1993)。其它合适的组合化疗方案是 本领域技术人员熟知的。参见例如Freedman等人，“Non-Hodgkin′s L ymphomas，”CANCER MEDICINE，第2卷，第3版，Holland等人 (编)，第2028-2068版(Lea &Febiger1993)。作为例子，用于治疗 中间级非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化学治疗方案包括C-MOPP (环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和泼尼松)和CHOP(环磷酰胺、阿霉 素、长春新碱和泼尼松)。适用第二代化学治疗方案为m-BACOD(甲 氨蝶呤、博来霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和甲酰 四氢叶酸)，而适合第三代方案为MACOP-B(甲氨蝶呤、阿霉素、环 磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和甲酰四氢叶酸)。其它适用 药物包括丁酸苯酯、苯达莫司汀和苔藓虫素-1。
主题bsAb可根据已知方法进行配制以制备药学上适用的组合 物，由此将bsAb与药学上适合的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸盐 缓冲盐水是药学上适合的赋形剂的一个实例。其它合适赋形剂是本领 域技术人员熟知的。参见例如Ansel等人，PHARMACEUTICALDOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea & Febiger 1990、)和Gennaro(编)，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)和其修订版。
主题bsAb可配制成用于通过例如推注或连续输注进行静脉内施 用。优选地，bsAb输注持续少于约4个小时的时间，并且更优选持 续少于约3个小时的时间。举例来说，第一推注可在30分钟，优选 地甚至15分钟内输注，并且其余部分在后续2-3小时内输注。注射制剂可以单位剂型来呈现，例如，在安瓿或多剂量容器中，其中添加 防腐剂。组合物可采用诸如于油性或水性媒剂中的混悬液、溶液或乳 液等形式，并且可含有配制剂，如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。或 者，活性成分可呈在使用前用适合媒剂(例如无菌无热原质水)复原的 粉末形式。
可以采用另外的药学方法控制bsAb作用的持续时间。可以通过 使用聚合物以复合或吸附bsAb来制备控释制剂。例如，生物相容性 聚合物包括聚(乙烯-共-醋酸乙烯)基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚 酐共聚物基质。Sherwood等人，Bio/Technology 10：1446(1992)。从 这类基质释放的速率取决于bsAb的分子量、基质内的bsAb的量， 和分散粒子的大小。Saltzman等人，Biophys.J.55：163(1989)；Sh erwood等人，同上。其它固体剂型描述于以下文献中：Ansel等人， PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS，第5版(Lea & Febiger 1990)和Gennaro(编)，REMING TON’S PHARMACEUTICALSCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)，及其修订版。
bsAb还可皮下地或甚至通过其它肠胃外途径，如静脉内、肌肉 内、腹膜内或血管内来施用至哺乳动物。此外，可通过连续输注或通 过单次或多次推注进行施用。优选地，bsAb输注持续少于约4个小 时的时间，并且更优选持续少于约3个小时的时间。
一般而言，bsAb对于人的施用剂量将根据诸如患者年龄、体重、 身高、性别、一般医学病状和以往病史等因素而变化。期望为接受者 提供在约1mg/kg至25mg/kg范围内的作为单次静脉输注的bsAb的 剂量，但如情况需要也可以施用较低或较高的剂量。对于70kg患者 1-20mg/kg的剂量例如为70-1,400mg，或对于1.7-m患者为41-824 mg/m2。需要时剂量可重复，例如每周一次持续4-10周，每周一次持 续8周，或每周一次持续4周。在维持疗法中需要时，其还可以较低 频率给予，如每隔一周一次持续若干个月，或每月或每季度一次持续许多个月。
或者，bsAb可以按照每2周或3周一剂施用，总共重复至少3 剂。或者，所述构建体可以每周施用2次，持续4至6周。如果使剂 量降至约200-300mg/m2(对于1.7-m患者为每剂340mg，或者对于 70kg患者为4.9mg/kg)，那么其可每周施用一次或甚至两次持续4 至10周。或者，给药时程可减少，即每2或3周一次持续2-3个月。 然而已经确定，甚至可通过缓慢静脉内输注，根据重复给药循环施用 甚至更高的剂量，如20mg/kg每周一次或每2-3周一次。给药时程可 任选地以其它时间间隔重复，并且剂量可在对剂量和时程进行适当调 整下通过各种胃肠外途径给予。
虽然bsAb可以周期性推注形式来施用，但是在替代实施方案中， bsAb可通过连续输注来施用。为了增加Cmax并且延伸bsAb在血液 中的PK，连续输注可例如通过留置导管来施用。这类设备在本领域 中为已知的，如或PORT-A-导管(参 见，例如，Skolnik等人，Ther Drug Monit 32：741-48，2010)并且可使用任何这类已知留置导管。各种连续输注泵在本领域中也是已知的并 且可使用任何这类已知输注泵。连续输注的剂量范围可在0.1与 3.0mg/kg/天之间。更优选地，bsAb可通过在2至5小时，更优选地 2-3小时的相对较短周期内静脉内输注来施用。
在优选的实施方案中，bsAb对癌症的治疗是有用的。癌症的实 例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血 病、骨髓瘤或淋巴恶性疾病。所述癌症的更特定实例如下所述并且包 括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、尤因氏肉瘤(Ewingsarcoma)、 韦尔姆斯氏瘤(Wilms tumor)、星形细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、 非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或 胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、 肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、肝细胞癌瘤、神经内分泌肿瘤、甲状腺髓 样癌、甲状腺分化癌、乳癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌 或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、阴门癌、肛门癌、 阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如细 胞未迁移至受试者体内原始恶性疾病或肿瘤部位以外的部位的肿瘤) 和继发性恶性细胞或肿瘤(例如由转移产生的肿瘤，转移为恶性细胞 或肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的次级部位)。有益于本发明 的治疗方法的癌症涉及表达、过表达或异常表达IGF-1R的细胞。
癌症或恶性疾病的其它实例包括但不限于：急性儿童成淋巴细胞 性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性 骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性) 肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍 奇金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性淋巴瘤、成人非霍奇金氏淋巴瘤、成 人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关性淋巴瘤、AIDS相关 性恶性疾病、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神 经胶质瘤、脑瘤、乳癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋 巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫 颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴 细胞性白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童 小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外胚细胞瘤、儿童霍 奇金氏病、儿童霍奇金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、 儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非霍奇金氏淋 巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层瘤、儿童原发性肝癌、儿童 横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢 性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋 巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、 尤因氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细 胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、戈谢氏病(Gaucher′s Disease)、 胆囊癌、胃部癌、胃肠道良性肿瘤、胃肠道肿瘤、胚细胞瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、 高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛 细胞胰腺癌、卡波济氏肉瘤(Kaposi′sSarcoma)、肾癌、喉癌、唇口腔 癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳癌、恶性 间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、原发灶隐 匿的转移性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多 发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、骨髓发育不良综合症、髓 细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和副鼻窦癌、 鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小 细胞肺癌、原发灶隐匿性转移性鳞状颈癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤 维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨骼的恶性纤维组织 细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢胚细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、 病变蛋白血症、真性红细胞增多症、副甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞 瘤、垂体肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、 直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、 唾液腺癌、肉状瘤病肉瘤、塞扎里综合症(Sezary Syndrome)、皮肤癌、 小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经 外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾 盂和输尿管的移行细胞癌、移行肾盂和输尿管癌、滋养层细胞瘤、输 尿管和肾盂细胞癌、输尿管癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路 和下丘脑神经胶质瘤、阴门癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、韦尔姆 斯氏瘤，和除赘瘤以外位于上列器官系统中的任何其它过度增生性疾 病。
本文描述和要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或恶变前 病状以及用于预防发展成赘生性或恶性状态，包括但不限于上文所述 的那些病症。所述用途适用于已知或怀疑提前发展成赘瘤或癌症的病 状，尤其是在已发生由增生、化生或最特别是发育异常组成的非赘生 性细胞生长的情况下(关于所述异常生长病状的综述，请参见Robbin s和Angell，BASIC PATHOLOGY，第2版，W.B.Saunders Co.，Phi ladelphia，第68-79页(1976))。
发育异常常常是癌症的前兆，并且主要发现于上皮中。其是非赘 生性细胞生长的最无序形式，涉及个别细胞一致性和细胞结构定向的 丧失。在存在慢性刺激或炎症的情况下，发育异常特征性地发生。可 治疗的发育异常病症包括但不限于：无汗性外胚层发育不良、前面部 发育不良、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良、支气管肺发 育不良、大脑发育不良、宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨 颅骨发育不良、先天性外胚层发育不良、颅骨干发育不良、颅腕跗发 育不良、颅骨干骺端发育不良、牙本质发育异常、骨干结构不良、外 胚层发育不良、牙釉质发育不良、脑性眼球发育不全、偏侧骨骺发育 不良、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮异常增生、面 指生殖器发育异常、家族性颌骨纤维性发育异常、家族性白色皱褶性 发育异常、纤维肌肉发育异常、骨纤维性结构不良、旺盛骨性发育不 良、遗传性肾视网膜发育不良、有汗性外胚层发育不良、少汗性外胚 层发育不良、淋巴细胞减少性胸腺发育不良、乳腺发育不良、下颌骨 颜面发育不良、干骺端发育不良、蒙蒂尼氏发育异常(Mondini dysplasia)、单骨纤维性骨发育不良、粘液上皮发育异常、多发性骨骺 发育不良、眼耳脊椎发育不良、眼齿指发育不良、眼椎骨发育不全、 牙原性发育不良、眼下颌骨发育不良、根尖周牙骨质结构不良、多骨 纤维性结构不良、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良、视网膜发 育不良、中隔-眼发育不良、脊椎骨骺发育不良和脑室径向发育不良。
可治疗的其它赘生前病症包括但不限于良性异常增生性病症(例 如良性肿瘤、纤维囊性病状、组织肥大、肠息肉或腺瘤以及食道异常 增生)、粘膜白斑病、角化病、博文氏病(Bowen′s disease)、农夫皮肤 (Farmer′s Skin)、日光性唇炎和日光性角化病。
在优选实施方案中，使用本发明的方法抑制癌症，特别是上文所 列癌症的生长、发展和/或转移。
其它过度增生性疾病、病症和/或病状包括但不限于恶性疾病和 相关病症的进展和/或转移，如白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴 细胞性白血病、急性骨髓细胞性白血病(包括成骨髓细胞性、早幼粒 细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例 如慢性骨髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真 性红细胞增多症、淋巴瘤(例如霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性 骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体肿瘤，包括但不 限于肉瘤和癌瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨 原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮 肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠 癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、 腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、 支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、 胚胎癌、韦尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱 癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、 室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、 脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
表达载体
仍然其它实施方案可涉及包括编码抗体、抗体片段、细胞因子或 bsAb如DNLTM构建体的组成融合蛋白质的核酸的DNA序列。融合 蛋白质可包括连接至例如AD或DDD部分的抗体或片段或细胞因子。
各种实施方案涉及包括编码DNA序列的表达载体。载体可含有 编码人免疫球蛋白的轻链和重链恒定区和铰链区的序列，其可连接嵌 合、人源化或人可变区序列。载体可另外含有在选定宿主细胞中表达 所编码的蛋白质的启动子、增强子和信号或前导序列。尤其适用的载 体是pdHL2或GS。更优选地，轻链和重链恒定区和铰链区可来自人 EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中任选地同种异型位置中的至少一个氨基 酸更换成在不同IgG1同种异型中发现的氨基酸，并且其中任选地基 于EU编号系统的EU的重链的氨基酸253可置换成丙氨酸。参见 Edelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 63：78-85(1969)。在其它实 施方案中，IgG1序列可转化成IgG4序列。
本领域技术人员将认识到遗传工程化表达构建体并且插入宿主 细胞中以表达工程化蛋白质的方法在本领域中是熟知的并且只需常 规实验。宿主细胞和表达克隆抗体或片段的方法描述于例如美国专利 号7,531,327、7,537,930、7,785,880、8,076,410、8,153,433和8,372,603 中，其实施例部分各自以引用方式并入本文。
试剂盒
各种实施方案可涉及含有适于治疗或诊断患者的患病组织的组 分的试剂盒。示例性试剂盒可含有如本文描述的一种或多种bsAb。 如果含有用于施用的组分的组合物未配制成通过消化道递送，如通过 口服递送，那么可包括能够通过一些其它途径递送试剂盒组分的装 置。用于如肠胃外递送等应用的一种类型装置是注射器，其用于将组 合物注射至受试者体内。还可使用吸入装置。在某些实施方案中，治 疗剂可以含有无菌、液体制剂或冻干制剂的预充式注射器或自动注射 笔形式提供。
试剂盒组分可包装于一起或分隔于两个或多个容器中。在一些实 施方案中，容器可为容纳适于复原的组合物的无菌冻干制剂的小瓶。 试剂盒还可含有一种或多种适于复原和/或稀释其它试剂的缓冲液。 可使用的其它容器包括但不限于袋、盘、盒、管等。试剂盒组分可无 菌包装和保持于容器中。可以包括的另一种组件是提供给试剂盒使用 者的说明书。
实施例
提供以下实施例来示出，但是不限制本发明的权利要求。
实施例1.T-细胞重定向双特异性抗体DOCK-AND-LOCKTM (DNLTM)复合物
一些种类的示例性T-细胞重定向双特异性抗体制备为DNLTM复 合物，如下所述。复合物有效诱导针对适当靶细胞的免疫响应。
材料和方法
制备并使用DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合物的一般技术描 述于以下实例中。具有CD3和CD19的结合位点的示例性T-细胞重 定向双特异性抗体制备为DNLTM复合物，其被称为(19)-3s(图1)。抗- CD19F(ab)2 DNL模块通过在Fd链的羧基末端的二聚化和停靠结构 域(DDD2)的重组融合来构建。抗-CD3-scFv模块在添加锚定结构域(A D2)的情况下从Okt3mAb来设计，并且以格式VH-L1-VK-L2-6H-L3- AD2(“6H”公开如SEQ ID NO：105)组装，其中V域经由柔性肽接头 来融合并且AD2肽前面是6-His接头(SEQ ID NO：105)。抗-CD3可 变区、接头和AD2的序列如以下展示。
抗-CD3 scFv的VH序列
L1接头
抗-CD3scFv的VK序列
L2接头
Poly-His-L3接头
AD2
表达载体和DNLTM模块-构建包括连接至抗-CD3抗体部分的针 对各种疾病相关联抗原的抗体部分的DNLTM复合物，其总体上缩写 为(X)-3s bsAb。对于用于制备(X)-3s bsAb的每个DNLTM模块，在 SpESFX-10小鼠骨髓瘤细胞中开发独立生产细胞系(Rossi等人，2011，Biotechnol Prog27：766-75)。将编码Okt3scFv-AD2多肽(SEQ ID NO：96-101)的cDNA序列合成并且经由5’Xba I和3’Eag I限制位点 来克隆至pdHL2表达载体中。构建体包含scFv中的融合至VL的VH域，其具有结构VH-L1-VK-L2-6H-L3-AD2(“6H”公开为SEQ ID NO：105)。所表达的蛋白质具有来自原始Okt3 mAb的两个氨基酸取 代。CDR-H3中的半胱氨酸残基更换至丝氨酸(Kipryanov，1997，J Immunol Methods 200：69-77)。VL的倒数第二残基从天冬氨酸更换至 赖氨酸。
Okt3scFv-AD2模块与各种CH1-DDD2-Fab模块组合以产生一组 (X)-3s三价bsAb(表6)。CH1-DDD2-Fab-pdHL2表达载体如先前对于 类似构建体所述来构建(Rossi等人，2008，Cancer Res 68：8384-92)。 简单地说，编码CH1-DDD2-Fab的表达载体从相应IgG-pdHL2表达 载体产生，方法是用Sac II和Eag I限制酶切割CH1-铰链-CH2-CH3 域的编码序列并且替换成编码用相同酶从CH1-DDD2-Fab-hA20-pdH L2表达载体(Rossi等人，2008，Cancer Res 68：8384-92)上切割的CH 1-DDD2的507 bp序列。CH1-DDD2-Fab模块从人源化mAb hA19(抗 -CD19)、拉贝珠单抗(hMN-14，抗-CEACAM5)、clivatuzumab(hPAM4， 抗-粘蛋白)、hMN-15(抗-CEACAM6)、hRS7(抗-TROP-2)、维妥珠单 抗(hA20，抗-CD20)、hL243(抗-HLA-DR)和依帕珠单抗(hLL2，抗-C D22)衍生。被称为hA19的mAb从小鼠抗-CD19 mAb B43来人源化 (Uckun等人，1988，Blood 71：13-29)。每个表达载体通过用Sal I限 制酶消化来线性化并且用于通过电穿孔来转染SpESFX-10细胞。
克隆在含有0.2μM甲氨喋呤(MTX)的培养基中选择并且通过E LISA针对蛋白质表达来进行筛选。Okt3scFv-AD2捕获于Ni-NTA Hi sSorb板(Qiagen)上并且用抗-AD2 mAb检测。CH1-DDD2-Fab模块用 山羊-抗人-κ链捕获并且用山羊-抗人-F(ab’)2-HRP检测。蛋白质表达 的生产力通过逐步地增加MTX浓度直到3μM来扩增。Okt3scFv-A D2和CH1-DDD2-Fab模块通过亲和色谱分别使用Ni-和Kappa-Select树脂来从滚瓶培养物的肉汤中纯化至均质。DNLTM方 法用于经由摩尔当量Okt3scFv-AD2和CH1-DDD2-Fab模块的位点特 异性偶联来组装(X)-3s bsAb。举例来说，通过将22mg Okt3scFv-A D2与80mg CH1-DDD2-Fab-hA19组合来产生大约100mg(19)-3s。 混合物在室温下用1mM还原型谷胱甘肽来还原过夜，然后添加2m M氧化谷胱甘肽。(19)-3s通过使用Kappa-Select和Ni- 的连续亲和色谱来从反应混合物中纯化。遵循类似方法，额外(X)- 3s构建体以不同规模来组装。
表6.(X)-3s DNLTM构建体
分析方法-体积排阻高性能液相色谱(SE-HPLC)使用具有BIOSUI TETM250，4-μmUHR SEC柱的Alliance HPLC系统(Waters Corp) 来执行。电喷雾电离飞行时间(ESI-TOF)液相色谱/质谱法(LC-MS)以 耦接有6210 TOF MS的1200-系列HPLC(AgilentTechnologies，Sant a Clara，CA)来执行。(19)-3s通过反相HPLC(RP-HPLC)在60℃下， 使用0.1％甲酸水溶液中的30-80％乙腈14分钟梯度、使用Aeris wid epore 3.6μm C4柱(Phenomenex)来拆分。对于TOF MS，毛细管和 裂解电压分别设定为5500和300V。
细胞系和试剂-Raji、Ramos、Daudi、LS174T和Capan-1细胞系 购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，MD)并且Nalm-6细 胞购自Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellinien(DSMZ， Braunchweig，Germany)。除了Capan-1以外，所有细胞系保持于含有 10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素和1％MEM非必需氨 基酸的RPMI-1640中。Capan-1细胞用20％FBS来保持。所有细胞 培养基和补充物购自LifeTechnologies(Carlsbad，CA)。
PBMC和T细胞分离-人外周血单核细胞(PBMC)使用UNI-SEPMAXI试管(Novamed，Ltd，Jerusalem，Israel)从全供体血液(Blood Center of NJ，East Orange，NJ)来纯化。CD3-阳性T细胞根据制造商方案 使用Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)进行阴性 选择而从PBMC中分离。在用抗-CD3-PE抗体将富集T细胞染色之 后，T细胞分离效率通过FACS来评估。在一些情况下，也执行用C D-19和CD-14进一步染色来识别污染细胞。
T细胞活化-分离的T细胞以2.25x106个细胞/孔的最终密度涂覆 于6-孔组织培养板中。Daudi细胞以1.5x106个细胞/孔的最终密度添 加至一些孔，其它孔保持只含有T细胞。或者，PBMC以6x106个 细胞/孔的最终细胞密度添加至6-孔组织培养板。每个孔的体积达到3 mL。向适当孔，添加3ng/mL的(19)-3s、(M1)-3s或(19)-DDD2。在 37℃下孵育过夜之后，移除1mL的每个样品。将细胞球团化并且在 冰上用CD69-APC和CD3-PE标记20分钟。细胞用PBS中的1％BSA 洗涤2次并且使用FACSCALIBERTM流式细胞仪(BD Biosciences，SanJose，CA)来分析。
T细胞增殖-PBMC以含有指定试剂的1x106个细胞/毫升浓度播 种于T25烧瓶中。对于B细胞耗竭的烧瓶，B细胞根据制造商方案 通过使用来自Miltenyi的B细胞分离试剂盒进行阴性选择来移除。在 选择日，将100μL培养基从每个烧瓶中移除，在冰上用抗-CD7-APC标记20分钟，洗涤一次并且重新悬浮于含有7-AAD的300μL1％ BSA/PBS。对于每个样品，总体积使用FACSCALIBERTM流式细胞仪 来分析。每个样品重复计数两次。分析使用FlowJo软件来执行。对 于每个样品，将死亡(7-AAD+)细胞和残骸(基于前向相比于侧向分散) 移除。最后，将活CD7+细胞选择并且使用Prism软件来作图。
细胞结合测定(Jurkat/Capan-1)-Jurkat细胞根据制造商方案用 PKH26红色荧光细胞接头试剂盒(Sigma)来染色。Capan-1细胞根据制 造商方案用5μM CFSE(羧基荧光素双醋酸酯琥珀酰亚胺基酯，Life Technologies)来染色。将经过标记的Capan-1细胞添加至8-孔腔室载 玻片(Thermo Waltham，MA)并且允许连接过夜。第二天，将培养基移 除并且PKH26-标记的Jurkat细胞添加于含有0.1μg/mL(E1)-3s、(M1)-3s或(19)-3s的培养基中。在37℃下孵育1小时之后，载玻片用 PBS洗涤以移除任何未结合细胞并且通过荧光显微术来观察。
细胞结合测定(Jurkat/Daudi)-Jurkat和Daudi细胞分别用抗-CD3- PE和抗-CD20-FITC来标记。然后，在室温下，经过标记的细胞以2. 5∶1比率与0.1μg/mL(19)-3s共孵育30分钟。然后，等分试样的细 胞通过荧光显微术来观察。
细胞毒性测定(血液肿瘤细胞系)-靶细胞根据制造商方案用 PKH67绿色荧光细胞接头试剂盒(Sigma)来标记。简言之，5x106个 靶细胞重新悬浮于250μL稀释剂C中。在第二试管中，将1μL PKH26 染料添加至250μL稀释剂C。然后，将细胞悬浮液添加至染料溶液， 充分地混合并且在RT下孵育2分钟。反应通过添加相等体积FBS来 中止。然后，经过标记的细胞用完整RPMI洗涤3次。在未刺激的情 况下，分离T细胞用作效应细胞。效应细胞和PKH67标记的靶细胞 以10∶1比率组合并且涂覆于含有(19)-3s或(14)-3s的连续稀释液的 48孔板中。每个孔含有5x104个靶细胞和5x105个效应细胞。Jeko-1 测定在20％RPMI中执行。板在含有5％CO2的37℃恒温箱中孵育 18-24小时。在孵育之后，全部细胞从48孔板中移除至流式细胞仪管 中并且重新悬浮于含有1ug/mL 7AAD(以区分活细胞与死亡细胞)和 30，000个COUNTBRIGHTTM绝对计数珠粒(Life Technologies)的1％ BSA/PBS中。细胞在FACSCALIBERTM流式细胞仪上分析。对于每 个样品，8,000个COUNTBRIGHTTM珠粒计数为标准化参考。数据 使用FlowJo软件(Treestar，Inc.，Ashland，OR)来分析。对于每个样品， 将死亡细胞和残骸排除并且将总活靶细胞计数。
细胞毒性测定(实体肿瘤细胞系)-遵循与用PKH23染色相同的 程序，靶细胞用PKH67绿色荧光细胞接头试剂盒(Sigma)来标记。所 使用的效应细胞如下：对于Capan-1测定，从CD8+富集柱(R&D Sy stems，Minneapolis，MN)纯化之后，使用CD8+富集T细胞。对于LS174T细胞：在含有25U/mL IL-2和50ng/mL Okt3 Mab的培养基 孵育PBMC 5天之后，随后在含有单独25U/mL IL-2的培养基孵育 2天，使用经过刺激的T细胞。效应细胞和PKH67-标记靶细胞以3： 1比率组合(5x104个靶细胞和1.5x105个效应细胞/孔)并且涂覆于含有 (E1)-3s、(14)-3s或(19)-3s的连续稀释液的48孔板上。Capan-1测定 在20％RPMI中执行。板在含有5％CO2的37℃恒温箱中孵育42-4 8小时。孵育之后，悬浮细胞与来自全部孔的胰酶消化的连接细胞组 合并且转移至流式细胞仪管。将细胞洗涤一次并且重新悬浮于含有1 ug/mL7AAD(以区分活细胞与死亡细胞)和30,000个COUNTBRIGH TTM绝对计数珠粒的1％BSA/PBS中。细胞在FACSCALIBERTM流式 细胞仪上分析。对于每个样品，8,000 COUNTBRIGHTTM珠粒计数 为标准化参考。数据使用FlowJo软件(Treestar，Inc.，Ashland，OR)来 分析。对于每个样品，将死亡细胞和残骸排除并且将总活靶细胞计数。
体内功效-雌性NOD/SCID小鼠，8周龄，购自Charles River(W ilmington，MA)。向小鼠皮下注射与基质胶1∶1混合的Raji(1x106)与 人PBMC(5x106细胞)的混合物。治疗1小时后开始。每个实验中的 处理方案、剂量和动物数目描述于结果中。每日监测动物的肿瘤长出 迹象。一旦肿瘤出现，其每周测量两次。肿瘤体积(TV)通过使用卡尺 在二维空间测量来确定，并且体积定义为：Lx w2/2，其中L是肿瘤 的最长尺寸并且w是最短的。功效使用PrismGraphPad软件(v5；La Jolla，CA)在使用存活替代端点作为达到1.0cm3的肿瘤进展时间(TTP)的Kaplan-Meier曲线上通过对数秩检验来确定。显著性被认为是P ＜0.05。
结果
T-细胞重定向双特异性抗体的构建和生物化学分析。DNLTM方法 用于产生靶向各种肿瘤相关联抗原(包括CD19、CD20、HLA-DR、 TROP-2、CEACAM5和MUC5AC)的一组(X)-3s、T-细胞重定向bsAb。 这些结构的纯度通过SE-HPLC和SDS-PAGE分析来证明，其中只有 代表三种组成多肽(Okt3scFv-AD2、hA19-Fd-DDD2和hA19κ)的条带 是明显的(数据未展示)。LC-MS分析识别单一RP-HPLC峰，其具有 与来自它的推断氨基酸序列的(19)-3s的计算质量(137432.37 Da)一致 (质量精确度＝11ppm)的解卷积质谱，包括Okt3scFv-AD2和两个CH1-DDD2-hA19Fd链中的每一个上的预测氨基末端焦谷氨酸盐(数 据未展示)。未指示额外翻译后改进，包括糖基化。
由(19)-3s介导的Daudi伯基特淋巴瘤与T细胞之间的免疫突触形成。检查T-细胞重定向(19)-3s DNLTM复合物对于将效应T细胞靶 向输送至CD19+淋巴瘤细胞的效应(图2)。新鲜分离的T细胞以2.5∶1 的E∶T比率与Daudi细胞组合。细胞在室温下用0、1或5μg/mL的(19)-3s DNLTM复合物处理30分钟，然后通过流式细胞术分析。抗 -CD20-FITC和抗-CD7-APC分别用于识别Daudi和T细胞。共结合 指示为CD20+/CD7+事件的％。用(19)-3s处理之后，45.5％流动事件是 CD20/CD7双重阳性的，指示Daudi与T细胞联会(图2A)，与对于不 具有抗体的混合细胞所测量的2％(图2B)形成对比。添加(19)-3s导致 ＞90％的Daudi与T细胞关联(图2C)。这些结果表明(19)-3s DNLTM复 合物可有效地将T细胞引导至表达国标抗原的淋巴瘤细胞。
T细胞与靶淋巴瘤细胞之间的突触形成通过荧光显微术来证明 (图3)Jurkat(T细胞)和Daudi(B细胞)以1∶1比率组合，以0.1μg/mL (19)-3s DNLTM复合物处理30分钟并且用抗-CD20-FITC(图3A)和抗 -CD3-PE(图3B)染色，然后通过荧光显微术来分析。合并图像(图3C) 揭示绿色染色Daudi与红色染色Jurkat细胞之间的突触形成。突触形 成在不存在(19)-3s的情况下是不明显的(图3D)。图3C展示靶淋巴瘤 细胞与目标T细胞直接接触。
对于(19)-3s介导的T细胞与示例性B-细胞淋巴瘤细胞系的关联， 执行剂量反应系列(图4)。如图4中展示，在此实验的条件下，(19)-3s- 介导的T细胞与靶细胞的细胞至细胞关联的饱和在0.037与0.111 μg/ml之间的DNLTM复合物浓度下达到。
图5展示BITETM(图5A)、DARTTM(图5A)和DNLTM(图5B)抗-CD3 x抗-CD19复合物将T细胞重定向至目标CD19+B细胞的相对功效的 对比。BITETM和DARTTM的数据从Moore等人(2011，Blood 117：4542-51)获得。在所测试的0.0005μg/ml最低浓度下，(19)-3s DNLTM复合物比BITETM或DARTTM更有效地将T细胞靶向输送至B- 细胞淋巴瘤(图5)。与可比较的BITETM和DARTTM复合物相比，(19)-3s DNLTM复合物也诱导稍微较高最大水平的细胞至细胞关联(图5A)。 虽然难以从对于(19)-3s DNLTM复合物产生的单一数据点来推断， BITETM、DARTTM和DNLTM的EC50水平似乎是相似的(图5)。
(19)-3s、(E1)-3s和(M1)-3s介导的T细胞与靶肿瘤细胞的细胞-细胞关联。为了评估T-细胞重定向BsAb促进T细胞与其靶肿瘤细胞 关联的能力，将Jurkat T细胞与含有(X)-3s的靶肿瘤细胞共孵育并且 通过流式细胞术和荧光显微术来评估。Jurkat T细胞是CD4+T细胞白 血病细胞系，针对其在各种浓度的(19)-3s的存在下展现T细胞结合 而不耗竭FITC标记Daudi细胞的能力来选择并且通过流式细胞术针 对指示T细胞-B细胞相关联复合物的双重阳性(CD3+CD20+)群体的 检测来分析。在用0.5ng/mL(19)-3s处理之后，发现表观细胞-细胞关 联，并且用0.1μg/mL处理之后，超过25％细胞群体存在于细胞-细胞 关联中(图5)。荧光显微术支持此数据，因为在用0.1μg/mL(19)-3s 处理之后，免疫突触是明显的(图4)。在不存在(19)-3s的情况下，未 发现突触形成(数据未展示)。
此细胞-细胞关联也在胰腺肿瘤细胞系Capan-1中观察到(图6)。 Capan-1表达高水平TROP2和中度水平MUC5AC。因此，将TROP2- 靶向bsAb，(E1)-3s(图6C)，和MUC5AC-靶向bsAb，(M1)-3s(图6B) 与非靶向对照bsAb，(19)-3s(图6A)相比较。CFSE标记的Capan-1细胞在这些bsAb存在下与PKH26标记的Jurkat共孵育。如预期，荧光 显微术显示由(E1)-3s介导的较大T-细胞/Capan复合物，随后为由 (M1)-3s介导的较小、仍大量的复合物，以及(19)-3s处理之后的相对 较低复合物形成(图6)。
(19)-3s特异性诱导T细胞活化和增殖。(19)-3s活化T细胞的能 力在PBMC中(图7A)，或在与Daudi B细胞共孵育的T细胞中(图7B)， 通过测量CD69(一种T细胞活化的早期标记物)的表达水平来评估。 用3ng/mL(19)-3s处理在与Daudi B细胞共孵育的T细胞中诱导T 细胞活化，如与非靶向对照抗体，(19)-DDD2和(M1)-3s，以及在没 有Daudi靶细胞的情况下用(19)-3s处理的T细胞相比较，CD69表达 增加＞50倍所指示(图7B)。在抗体与含有T和B细胞的PBMC一起 孵育时，观察到相似结果；(19)-3s刺激CD69表达水平比非靶向对照高＞20倍(图7A)。在不存在靶细胞的情况下，用(19)-3s处理的纯化T 细胞不展示活化(图7C)。
T细胞增殖，作为T细胞活化的另一个指示，在用各种CD3-靶 向抗体处理PBMC之后进行评估。3nM或30pM的(19)-3s诱导T细 胞增殖类似于阳性对照IL-2/PHA(图8A)。非靶向对照抗体，(14)-3s， 在最高(3nM)浓度下展示一些非特异性T细胞增殖(图8A)。然而，T 细胞增殖在耗竭B细胞的PBMC中未观察到(图8B)，表明靶细胞是 特异性(19)-3s诱导的T细胞增殖必不可少的。
(X)-3s重定向的T-细胞介导的杀灭恶性肿瘤细胞系。每个T-细胞 靶向分子的细胞毒性通过其介导特异性肿瘤靶细胞的溶解的能力来 评估。对于血液肿瘤细胞系，在18-24小时测定中，使用未刺激、富 集T细胞群体作为效应细胞的10∶1 E∶T比率展示最佳测定条件。CD19 靶向bsAb，(19)-3s诱导相对低CD19表达的细胞系Ramos(IC50＝0.17 pM，溶胞最大＝79％)Daudi(IC50＝1pM，溶胞最大＝60％)，和Nalm6(IC50＝6 pM，溶胞最大＝93％)的最有效特异性杀灭(图9A)。有意思的是，高CD19 表达细胞系，Namalwa(IC50＝63 pM，溶胞最大＝60％)和Raji(IC50＝3nM， 溶胞最大＝41％)对于(19)-3s的敏感性最小(图9A)。非靶向(14)-3s DNLTM构建体在所测试的任何细胞系中具有极少细胞毒性效应(图9B)。 (19)-3s构建体对于Nalm-6ALL细胞系的一致细胞毒性效应通过从两 个不同供体获得的PBMC来获得(图9C)。
(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3s T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性效 应在多个细胞系中确定(图10)。CD22靶向bsAb，(22)-3s，展示有效 的(IC50＝5pM，溶胞最大＝60％)特异性T-细胞介导的溶解，在CD22阳 性Daudi细胞系中(图10C)，但是不在CD22阴性Namalwa细胞中(图 10A)。
CD20-靶向bsAb，(20)-3s在较高表达CD20细胞系， Daudi(IC50＝＜0.3pM，溶胞最大＝90％)(图10C)和Jeko(IC50＝1pM，溶胞最大＝90％)中展示最高效力(图10B)，与较低CD20-表达Namalwa细胞系 (IC50＝30pM，溶胞最大＝53％)形成比较(图10A)。
HLA-DR-靶向bsAb，(C2)-3s在表达HLA-DR的Jeko-1细胞系 中进行测试(IC50＝20pM，溶胞最大＝88％)(图10B)。
在10∶1的E∶T比率下，使用分离T细胞作为效应细胞，bsAb在 各种B细胞恶性肿瘤中诱导有效T细胞介导的细胞毒性，包括伯基 特淋巴瘤(Daudi，Ramos，Namalwa)套细胞淋巴瘤(Jeko-1)和急性淋巴 细胞性白血病(Nalm-6)(表7)。非肿瘤结合对照，(14)-3s，在＞10nM 下只诱导中度T-细胞杀灭。对于T-细胞重新靶向效力，抗原/表位的 性质，尤其它的尺寸和细胞表面的接近性，似乎比抗原密度更重要(表 7)。可能(20)-3s始终比(19)-3s和(C2)-3s更有效，甚至在CD19或 HLA-DR的表达大大高于CD20时也是如此，如分别对于Namalwa 和Jeko-1所发现(表7)。这可能是因为CD20表位包括具有细胞表面 的紧密接近性的较小细胞外环。当直接使用Daudi来比较时，(22)-3s 有效性最小。与CD19和CD20相比，CD22以最低密度表达，是快 速内化抗原，并且它的表位进一步远离细胞表面。这些因素中的每一 个可造成它的减少效力。最后，T-细胞重新靶向杀灭的敏感性是细胞 系依赖性的，如使用(19)-3s所观察到，其中Raji(IC50＞3nM)很大程度 上无反应的，然而Ramos(IC50＝2pM)是高敏感性的，虽然前者表达较 高CD19抗原密度(表7)。
总之，(19)-3s、(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3s同时结合至T细胞和 靶B细胞并且在体外诱导T-细胞介导的杀灭。DNL方法的模块化性 质允许快速产生多个相关偶联物以便重定向T-细胞杀灭各种B细胞 恶性肿瘤，而不需要额外重组工程设计和蛋白质产生。CD20细胞外 表位与细胞表面的紧密接近性导致(20)-3s的最高效力。
表7.离体重定向的T-细胞杀灭
1BL，伯基特淋巴瘤；ALL，急性淋巴细胞性白血病；MCL，套 细胞淋巴瘤。2通过流式细胞术确定并且相对于Daudi标准化的表达 水平。3IC50，实现50％靶细胞杀灭的皮摩尔浓度。
T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性效应也在实体肿瘤细胞中确 定(图11)。对于实体肿瘤细胞系，最佳测定条件确定为在42-48小时 测定中使用经过刺激的T细胞的3∶1 E∶T比率。每个bsAb诱导肿瘤 靶细胞的特异性T-细胞介导的溶解。在用(14)-3s处理之后，CEACAM5-表达结肠腺癌细胞系，LS-174T，展示有效特异性溶解 (IC50＝2pM)(图11A)。(E1)-3s介导了表达Capan-1胰腺腺癌细胞系的 TROP2的有效特异性溶解(IC50＝29pM)(图11B)。表达高水平的 CEACAM6和TROP2的胃癌细胞系NCI-N87展示相对于T-细胞靶向 分子，(15)-3s和(E1)-3s的非常有效特异性溶解(分别IC50＝3pM和0.85 pM)(图11C)。非靶向对照抗体，(19)-3s，对于Capan-1和LS174T在 ＞1nM的浓度下诱导较低(＜20％)非特异性溶解，并且在NCI-N87细 胞中诱导中度(～40％)非特异性溶解(图11A-C)。各种T-细胞重定向 bsAb在各种肿瘤细胞系中的体外细胞毒性数据的总结示于图12。各 种构建体展示目标肿瘤细胞的高达90％或更大的最大细胞溶解，其中 表达目标抗体的细胞系的IC50值总体上在较低皮摩尔范围内(图12)。
实施例2.体内研究T-细胞重定向DNLTM复合物
较小(＜60kDa)基于scFv的构建体如BITETM和DARTTM的一个潜 在限制是需要通过长期连续输注来施用，这归因于其毒性和从循环中 的快速清除。因为DNLTM bsAb的分子尺寸高于通常与肾清除率相关 联的阈值，所以它应展现从循环中的较慢清除。在单一推注静脉内注 射5mg/kg(19)-3s bsAb之后，我们测量小鼠的药代动力学参数(数据 未展示)。观察到两阶段清除分别具有1.1和5.1h的t1/2α和t1/2β，导 致1880pmol*h/mL的曲线下面积(数据未展示)，比在相同摩尔浓度下 施用的MT103(抗-CD19x抗-CD3 BITETM)所报告的大几乎6倍(美国 专利US2010/0303827A1)。主要差异显然是(19)-3s的t1/2α更长(数据 未展示)。因为(19)-3s的潜在有利性质，我们评估使用不太频繁给药 方案而非通常在动物研究中用于BITETM的每日给药的可能性。
前瞻性研究在用人PBMC重构的NOD/SCID小鼠中使用Raji人 伯基特淋巴瘤异种移植物来执行(图13，图14)。Raji细胞(1x106个 细胞/小鼠)与来自单一健康供体的新鲜分离的PBMC(5x106个细胞/ 小鼠)组合，与基质胶1∶1混合，并且在第0天SC注入研究中的全部动物体内。5只小鼠的群组接受静脉内注射的(19)-3s，共计在第0天 的130μg的单一剂量(图13B)，三个剂量的43μg(第0、2和4天)(图 13C)或五个每日剂量的26μg(第0-5天)(图13D)。用相同细胞混合物 接种但是未接受(19)-3s的未处理组(图13A)具有31天的中值存活时 间(MST)。每个治疗方案改善存活(p≤0.05)，其中三个剂量(每隔一天) 方案提供最大的存活益处(MST＝91天；P＝0.0018，通过对数秩分析)。
开始随访研究以确定不太频繁给药的功效(图14)。9只 NOD/SCID小鼠的群组以与上述类似的方式用Raji和PBMC接种。 在此项研究中，治疗延长两周，与第一个研究中的一周比较。群组接 受静脉内注射(19)-3s共计360μg的2x130-μg(图14B)、4x65-μg(图 14D)或两周内6x43-μg剂量(图14E)。向额外群组施用SC，而非静 脉内给药的2x130-μg剂量(图14C)。为了比较，制备未处理小鼠(图 14A)或用非靶向(M1)-3s抗体处理的小鼠(图14F)的对照组。截至第 28天，每个(19)-3s治疗组具有比未治疗的对照显著更小的 AUC(P＜0.05)。意外地，经由SC途径的两个每周剂量显然地与更大 频率静脉内给药一样有效。
体内研究也使用实体肿瘤来执行(图15)。如上所述，对于LS174T 结肠腺癌(图15A，图15B)或Capan-1胰腺癌(图15C，图15D)来制备 NOD/SCID小鼠异种移植物。在每个情况下，与对照相比，施用靶向 (E1)-3s(图15B)或(14)-3s(图15D)bsAb DNLTM构建体的小鼠展示改善 的存活。
总之，重新靶向bsAb(包括(19)-3s、(E1)-3s和(M1)-3sDNLTM构建 体)的T-细胞分别经由一价和二价结合CD3和CD19来介导T细胞与 分别B细胞、结肠腺癌或胰腺癌细胞之间的突触形成。T-细胞活化、 增殖和靶细胞杀灭通过pM浓度的DNLTM bsAb在离体环境中诱导。与在动物模型中每日静脉内施用并且在临床中连续输注的BITETM或 DARTTM构建体相比，DNLTM bsAb的有利性质，包括二价肿瘤结合 和较慢清除，允许不太频繁给药和可能SC施用。DNLTM方法的模 块化性质允许快速产生很多相关偶联物以便重定向T-细胞杀灭各种 恶性肿瘤，而不需要额外重组工程设计和蛋白质产生。
本领域普通技术人员将认识到结合至CD3、CD19或其它疾病相 关联抗原的其它抗体在本领域中为已知的并且任何这类抗体可用于 使用本领域中熟知的技术制备F(ab)2、scFv或其它抗体片段。这类替 代抗体或其片段可用于本方法和组合物中。如下论述，制造DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合物的方法可用于将任何已知抗体 或抗体片段并入稳定、生理活性复合物中。
实施例3.干扰素-α提高T-细胞重定向双特异性抗体的细胞毒性 效应
从hRS7和OKT3制备为DNLTM复合物的(E1)-3s抗-TROP-2x抗 -CD3双特异性抗体的治疗功效针对它在与人T-细胞混合并且注入小 鼠中时延迟Capan-1人胰腺腺癌肿瘤细胞的肿瘤长出的能力来进行测 试。也评估干扰素-α(呈E1*-2b或PEGASYS形式)在与此疗法组合时 的效应。
方法
向五周龄雌性NOD/SCID小鼠皮下注射与基质胶1∶1混合的 Capan-1(5x106个)与人T-细胞(2.5x106个细胞)的混合物(1∶2的E∶T比 率)。存在各自8只小鼠的六个不同治疗组。治疗由一个组组成，其 在施用Capan-1/T-细胞混合物之后1小时开始每天静脉内接收47 μg(E1)-3s历时五天。两个群组用等摩尔量的IFN治疗，一个接受由 IFN-α2b-DDD2-CK-hRS7 IgG1制备的DNL分子(E1*-2b；每周皮下 2.5μg x 4周)，同时另一个接受PEGASYS(Roche；每周皮下0.6μg x 4周)。两个其它组接受(E1)-3s加上E1*2b或(E1)-3s加上PEGASYS 的组合。最后一个组对照组保持未处理。表7总结各个治疗组。
表7.(E1)-3s疗法的治疗组
每日监测小鼠的肿瘤长出迹象。一旦肿瘤开始出现，所有动物使 其肿瘤每周测量两次。如果其肿瘤体积超过1.0cm3大小，将小鼠安 乐死以获得疾病进展。
结果
各个组的平均肿瘤体积展示于图16。为了清楚，含有组的数据(图16B)展示于与E1*2b组分开的图中(图16A)。直至第29 天，在与未治疗小鼠相比时，所有治疗在按照曲线下面积(AUC)控制 肿瘤生长方面显著较好，在第29天，将未治疗组中的第一只小鼠安 乐死以获得疾病进展(P＜0.0009；AUC29天)。(E1)-3s与的 组合导致在肿瘤长出方面的最佳总体抗肿瘤响应(图16B)。此治疗显 著比任何个别治疗更好(P＜0.042；AUC)并且优于(E1)-3s加上E1*-2b 的组合(P＝0.0312；AUC53天)(图16A)。在与单独El*2b或相比时，(E1)-3s加上E1*2b的组合可显著控制肿瘤生长(P＜0.0073；AUC46天)但是在与单独(E1)-3s相比时，不显著控制肿瘤生长(图 16A-B)。用(E1)-3s、或E1*-2b治疗的小鼠之间没有显著 差异(图16A-B)。
在存活方面，在与未治疗的小鼠相比时，所有治疗提供显著存活 益处(P＜0.0112；对数秩)(图17)。截至第81天，在用(E1)-3s加上E1*-2b 的组合治疗的小鼠与(E1)-3s加上治疗的小鼠之间没有中 值存活时间(MST)的显著差异(分别MST＝79.5和＞81天)(图17)。与任 何个别治疗相比，用(E1)-3s加上台疗的小鼠具有显著改 善的存活结果(P＜0.0237)(图17)。在与用单独E1*-2b或治疗的小鼠比较时，用(E1)-3s加上E1*2b治疗的小鼠具有存活益处 (两者都是MST＝53天；P＜0.0311)，但是在与仅用(E1)-3s治疗的小鼠 比较时，不具有存活益处(MST＝68天)(图17)。在与用E1*-2b治疗的 小鼠相比时，用(E1)-3s治疗提供存活的显著改善(P＝0.0406)，但是在 与用单独治疗的小鼠相比时，不提供存活的显著改善(图 17)。在仅用E1*2b治疗的小鼠与用单独治疗的小鼠之间 没有显著差异(图17)。
结果证明添加干扰素-α在与T-细胞重定向bsAb组合时提供存活 的大幅度增加以及肿瘤生长的减小。本领域普通技术人员将认识到添 加I型或III型干扰素(干扰素-α、干扰素-β或干扰素-λ)所观察到的改 善功效不限于特异性(E1)-3s bsAb，而是对于制备为DNLTM复合物或 其它形式如BITETM或DARTTM的其它T-细胞重定向bsAb观察到。
实施例4.DOCK-AND-LOCKTM的一般技术
以下论述的一般技术可用于使用所公开的方法和组合物来产生 具有连接至任何抗体或抗原结合抗体片段的AD或DDD部分的 DNLTM复合物。
表达载体
已使用质粒载体pdHL2来产生多种抗体和基于抗体的构建体。 参见Gillies等人，J Immunol Methods(1989)，125：191-202；Losman 等人，Cancer(Phila)(1997)，80：2660-6。所述双顺反子哺乳动物表达 载体引导IgG的重链和轻链的合成。许多不同IgG-pdHL2构建体的 载体序列基本上相同，仅有的差异存在于可变结构域(VH和VL)序列 中。使用本领域的技术人员已知的分子生物学工具，可将这些IgG表 达载体转化成Fab-DDD或Fab-AD表达载体。
为了产生Fab-DDD表达载体，将重链的铰链、CH2和CH3结构 域的编码序列用编码铰链的前4个残基、14个残基接头和DDD部分 例如人RIIα的前44个残基的序列(称为DDD1，SEQ ID NO：1)替代。 为了产生Fab-AD表达载体，将IgG的铰链、CH2和CH3结构域的 序列用编码铰链的前4个残基、15个残基接头和AD部分例如称为 AKAP-IS的17个残基的合成AD(称为AD1，SEQ ID NO：3)的序列替 代，所述17个残基的合成AD采用生物信息学和肽阵列技术产生并 显示以非常高的亲和性(0.4nM)结合RIIα二聚体。参见Alto等人Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A(2003)，100：4445-50。设计两个穿梭载体以促进 IgG-pdHL2载体转化为Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体，如下所述。
CH1的制备
使用pdHL2质粒载体作为模板，通过PCR扩增CH1结构域。左 侧PCR引物由CH1结构域的上游(5’)端和SacII限制核酸内切酶位点 组成，所述SacII限制核酸内切酶位点是CH1编码序列的5’。右侧引 物由编码铰链(PKSC(SEQ ID NO：102))前4个残基的序列组成，所述残基后面是4个甘氨酸和丝氨酸，最后两个密码子(GS)包含Bam HI 限制位点。将410 bpPCR扩增引物克隆到PCR克隆载体 (Inc.)中，并根据T7(5’)方向的插入片段来筛选克隆。
合成双链寡核苷酸，以编码DDD1的氨基酸序列，所述氨基酸 序列前面是接头肽的11个残基，前两个密码子包含BamHI限制位点。 终止密码子和EagI限制位点附接于3’端。所编码的多肽序列于下文 示出。
合成在其3’端有30个碱基对重叠的命名为RIIA1-44顶部和 RIIA1-44底部的两个寡核苷酸，并对它们进行组合从而包含174 bp DDD1序列的中心154个碱基对。使所述寡核苷酸退火并用Taq聚合 酶进行引物延伸反应。引物延伸后，通过PCR扩增双链体。将该扩 增引物克隆到中，并根据T7(5’)方向的插入片段进行筛选。
合成双链寡核苷酸，以编码AD1的氨基酸序列，所述氨基酸序 列前面是接头肽的11个残基，前两个密码子包含BamHI限制位点。 终止密码子和EagI限制位点附接于3’端。所编码的多肽序列于下文 示出。
合成编码上述肽序列的两个互补重叠的寡核苷酸，命名为 AKAP-IS顶部和AKAP-IS底部，并使其退火。通过PCR扩增双链体。 将扩增引物克隆到载体中并根据T7(5’)方向的插入片段进 行筛选。
连接DDD1与CH1
用BamHI和NotI限制酶将编码DDD1序列的190 bp片段从 中切除，并接着连接至CH1-中的相同位点中以产 生穿梭载体CH1-DDD1-
连接AD1与CH1
利用BamHI和NotI从中切除含有AD1序列的110bp 片段，然后将其连接到CH1-中的相同位点处从而产生穿梭 载体CH1-AD1-
利用这种模块设计，可以将CH1-DDD1或CH1-AD1并入到 pdHL2载体中的任何IgG构建体中。通过从pdHL2移除SacII/EagI 限制性片段(CH1-CH3)并将其置换为从相应穿梭载体切除 的CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI限制性片段将整个重链恒定 结构域置换为上述构建体之一。
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是用于生成C-DDD2-Fab-hMN-14的 表达载体，其具有DDD2(SEQID NO：2)的二聚化和停靠结构域序列， 所述DDD2经由14个氨基酸残基Gly/Ser肽接头附接至hMN-14的 Fd羧基末端。所分泌的融合蛋白由通过DDD2结构域的非共价相互 作用保持在一起的两个相同拷贝的hMN-14 Fab构成。
表达载体如下进行工程改造。合成制备包含部分接头肽和DDD2 的残基1-13的编码序列的两个重叠互补寡核苷酸。使所述寡核苷酸 退火并用T4 PNK磷酸化，从而在5’和3’端产生适合于与分别用限制 核酸内切酶BamHI和PstI消化的DNA连接的悬突。
将双链体DNA与通过用BamHI和PstI消化制备的穿梭载体 CH1-DDD1-连接以产生穿梭载体CH1-DDD2-用 SacII和EagI从CH1-DDD2-中切除507 bp片段，并将其与 通过用SacII和EagI消化而制备的IgG表达载体hMN-14(I)-pdHL2连接。最终表达构建体命名为C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。已利用 类似技术来产生多种不同人源化抗体的Fab片段的DDD2融合蛋白。
h679-Fd-AD2-pdHL2
h679-Fab-AD2经设计与C-DDD2-Fab-hMN-14配对。h679-Fd-A D2-pdHL2是用于制造h679-Fab-AD2的表达载体，所述h679-Fab-A D2具有通过14个氨基酸残基的Gly/Ser肽接头接附于CH1结构域的 羧基末端的AD2的锚定结构域序列(SEQ ID NO：4)。AD2在AD1的 锚定结构域序列之前具有一个半胱氨酸残基并且在其后具有另一个 半胱氨酸残基。
表达载体如下进行工程改造。合成制备包含AD2和部分接头序 列的编码序列的两个重叠互补寡核苷酸(AD2顶部和AD2底部)。将 所述寡核苷酸退火并用T4 PNK磷酸化，从而在5′和3′端上产生适合 与分别用限制性核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA连接的悬突。
将双链体DNA连接到通过用BamHI和SpeI消化制备的穿梭载 体CH1-AD1-中以产生穿梭载体CH1-AD2-利用 SacII和EagI限制酶从所述穿梭载体中切除含有CH1和AD2编码序 列的429碱基对片段，并将其连接到通过用这些相同的酶消化制备的 h679-pdHL2载体中。最终表达载体为h679-Fd-AD2-pdHL2。
产生TF2 DNLTM构建体
通过使C-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应获得三聚DNLTM构建体，命名为TF2。如下以＞90％产率产生TF2的试验批次。 将蛋白质L-纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)与h679-Fab-AD2 (60mg)以1.4∶1的摩尔比混合。总蛋白质浓度为于含1mM EDTA的PBS中1.5mg/ml。后续步骤包括TCEP还原、HIC色谱、DMSO氧 化和IMP 291亲和色谱。在添加TCEP前，SE-HPLC未显示任何a2b 形成的迹象。添加5mM TCEP快速引起与针对二元结构预期的157 kDa蛋白质一致的a2b复合物形成。通过IMP 291亲和色谱将TF2纯 化至接近均质(未示出)。IMP 291是含有679 Fab结合到其上的HSG 半抗原的合成肽(Rossi等人，2005，ClinCancer Res 11：7122s-29s)。IMP 291未结合部分的SE-HPLC分析证明a4、a2和游离κ链从产物的移 除(未示出)。
通过测定法测定TF2的功能性。将TF2、C-DDD1- hMN-14+h679-AD1(用作非共价a2b复合物的对照样品)或C-DDD2-h MN-14+h679-AD2(用作未还原a2和b组分的对照样品)稀释至1μg/ ml(总蛋白质)并流经固定有HSG的感测芯片。TF2的反应约为两个对照样品的反应的两倍，表明对照样品中仅h679-Fab-AD组分结合并保 留于感测芯片上。随后注入的WI2 IgG、针对hMN-14的抗独特型抗 体证明仅TF2具有与h679-Fab-AD紧密缔合的DDD-Fab-hMN-14组 分，如另外的信号响应所指示的。由WI2与固定于感测芯片上的TF 2结合引起的反应单位的额外增加与各自由C-DDD2-Fab-hMN-14的 一个亚基促成的两个完全功能性结合位点相符。此由TF2结合WI2 的两个Fab片段的能力所证实(未示出)。
产生TF10 DNLTM构建体
使用类似方案产生包含两个拷贝C-DDD2-Fab-hPAM4和一个拷 贝C-AD2-Fab-679的三聚TF10DNLT M构建体。使用如上所述关于制 造(抗CEA)2×抗HSG bsAb TF2所公开的方法制造TF10双特异性 ([hPAM4]2×h679)抗体。TF10带有两个人源化PAM4 Fab和一个人源化679Fab。
在稳定转染的骨髓瘤细胞中独立地表达两个融合蛋白 (hPAM4-DDD和h679-AD2)。组合组织培养上清液，得到两倍摩尔过 量的hPAM4-DDD。反应混合物在室温下在使用1mM还原型谷胱甘 肽的温和还原性条件下孵育24小时。还原后，反应通过使用2mM 氧化型谷胱甘肽轻微氧化而完成。通过亲和色谱使用IMP 291-affigel 树脂分离TF10，所述树脂以高特异性结合h679 Fab。
实施例5.从多个抗体生成AD和DDD连接的Fab和IgG融合 蛋白
采用前述实施例中描述的技术，构建表8中示出的IgG和Fab 融合蛋白，并将其并入到DNLTM构建体中。所述融合蛋白保留了亲 本抗体的抗原结合特征，并且所述DNLTM构建体表现出所并入抗体 或抗体片段的抗原结合活性。
表8.包含IgG或Fab的融合蛋白
实施例6.产生和使用包含两个不同抗体部分和细胞因子的 DNLTM构建体
在某些实施方案中，三聚体DNLTM构建体可包括三个不同效应 子部分，例如两个不同抗体部分和细胞因子部分。我们报告在此被称 为20-C2-2b的双特异性MAb-IFNα的产生和表征，其包括IFN-α2b 的两个拷贝和位点特异性连接至维妥珠单抗(人源化抗-CD20)的hL24 3(人源化抗-HLA-DR；IMMU-114)的稳定化F(ab)2。在体外，20-C2- 2b抑制四个淋巴瘤和八个骨髓瘤细胞系中的每一个，并且在除了一 个(HLA-DR-/CD20-)以外的所有骨髓瘤细胞系(未展示)中比单特异性 CD20-靶向MAb-IFNα或包括亲本抗体和IFNα的混合物更有效，表明 20-C2-2b适用于治疗各种造血病症。与只靶向HLA-DR或CD20的 单特异性MAb-IFNα(未展示)相比，20-C2-2b显示针对KMS12-BM(C D20+/HLA-DR+骨髓瘤)的更大细胞毒性，指示20-C2-2b中的所有三 个组分可造成毒性。
抗体
以下论述中使用的缩写是：20(CH3-AD2-IgG-V-mab、抗-CD20 IgG DNLTM模块)；C2(CH1-DDD2-Fab-hL243，抗-HLA-DR Fab2DNLTM模块)；2b(二聚体IFNα2B-DDD2 DNLTM模块)；734(抗-in-DTPA IgG DNLTM模块用作非靶向对照)。以下MAb由Immunomedics，Inc.提供： 维妥珠单抗或v-mab(抗-CD20 IgG1)、hL243γ4p(Immu-114，抗-HLA-DR IgG4)、鼠抗-IFNαMAb以及对于v-mab(WR2)和hL243(WT) 的大鼠抗独特型MAb。
DNLTM构建体
单特异性MAb-IFNα(20-2b-2b、734-2b-2b和C2-2b-2b)和双特异 性HexAb(20-C2-C2)通过使用DNLTM方法将IgG-AD2-模块与DDD2- 模块组合来产生，如前述实施例中所述。包括四聚体IFNα2b和MAb h734[抗-铟-DTPA IgG1]的734-2b-2b用作非靶向对照MAb-IFNα。
哺乳动物表达载体的构建以及产生克隆的后续产生和 CH3-AD2-IgG-v-mab的纯化公开于前述实施例中。经表达的重组融合 蛋白质具有经由15氨基酸长柔性接头肽连接至v-mab的CH3结构域 的羧基末端的AD2肽。重链-AD2和轻链多肽的共表达导致形成配备有两个AD2肽的IgG结构。表达载体通过电穿孔来转染至Sp/ESF细 胞(工程化细胞系Sp2/0)中。pdHL2载体含有二氢叶酸还原酶的基因， 因而允许克隆选择，以及使用甲氨喋呤(MTX)的基因扩增。稳定克隆 从用含有0.2μM MTX的培养基选择的96孔板分离。克隆经由夹心ELISA针对CH3-AD2-IgG-vmab生产力来筛选。模块在具有无血清培 养基的滚瓶培养物中产生。
DDD-模块，IFNα2b-DDD2，如以上论述通过经由18氨基酸长 柔性接头肽使DDD2肽重组融合至人IFNα2b的羧基末端来产生。如 对于所有DDD模块的情况，经表达的融合蛋白质自发形成稳定同型 二聚体。
CH1-DDD2-Fab-hL243表达载体从hL243-IgG-pdHL2载体产生， 方法是用SacII和EagI限制酶切割序列CH1-铰链-CH2-CH3域并且替 换为用编码用相同酶从C-DDD2-hMN-14-pdHL2表达载体切割的CH 1-DDD2的507bp序列。通过电穿孔将CH1-DDD2-Fab-hL243-pdHL 2转染至Sp/ESF细胞中之后，稳定、MTX-抗性克隆经由夹心ELIS A针对生产力进行筛选，所述夹心ELISA使用涂布有小鼠抗人κ链 以捕捉融合蛋白质的96孔微量滴定板，所述融合蛋白质用辣根过氧 物酶偶联山羊抗人Fab来检测。模块在滚瓶培养物中产生。
无血清H-SFM培养基中的滚瓶培养物和分批补料生物反应器产 生导致与迄今为止所产生的其它IgG-AD2模块和细胞因子-DDD2模 块可比较的产量。CH3-AD2-IgG-v-mab和IFNα2b-DDD2通过亲和色 谱分别使用MABSELECTTM(GE Healthcare)和HIS-HF镍亲 和力凝胶(Sigma)从培养液中纯化，如先前描述(Rossi等人，Blood 2009， 114：3864-71)。含有CH1-DDD2-Fab-hL243模块的培养液直接施加至 亲和力凝胶(GE-Healthcare)，其用PBS洗涤至基线 并且用0.1M甘氨酸，pH2.5来洗脱。
通过DNLTM产生20-C2-2b
三个DNLTM模块(CH3-AD2-IgG-v-mab、CH1-DDD2-Fab-hL243和 IFN-α2b-DDD2)以等摩尔数量组合以产生bsMAb-IFNα，20-C2-2b。 在室温下、在温和还原性条件(1mM还原型谷胱甘肽)下过夜停靠步骤 之后，添加氧化谷胱甘肽(2mM)以促进二硫键形成(锁定)。20-C2-2b 使用三个连续亲和色谱步骤来纯化至接近于均质性。最初，DNLTM混 合物用蛋白质A(MABSELECTTM)纯化，其结合至CH3-AD2-IgG-v-M Ab基团并且消除未反应的IFNα2b-DDD2或CH1-DDD2-Fab-hL243。 蛋白质A结合材料进一步通过IMAC使用HIS-HF镍亲和力凝胶来纯化，其特异性结合至IFNα2b-DDD2部分并且消除缺乏此 基团的任何构建体。使用hL243-抗-独特型亲和力凝胶的最终方法步 骤移除缺乏CH1-DDD2-Fab-hL243的任何分子。
本领域技术人员将认识到亲和色谱可用于纯化包括效应子部分 的任何组合的DNLTM复合物，只要三个效应子部分中的每一个的配 体可获得并且连接至柱材料。所选择的DNLTM构建体是结合至含有 三个效应子部分的各自配体的三个柱中的每一个并且可在洗涤之后 洗脱以移除未结合复合物的构建体。
以下实施例代表20-C2-2b的多个类似制备。等摩尔量的CH3-AD 2-IgG-v-mab(15mg)、CH1-DDD2-Fab-hL243(12mg)和IFN-α2b-DDD 2(5mg)以30-mL反应体积组合并且将1mM还原型谷胱甘肽添加至 溶液。在室温下16h之后，将2mM氧化谷胱甘肽添加至混合物，再保持在室温下6h。反应混合物施加至5-mL蛋白质A亲和力柱， 用PBS洗涤至基线并且用0.1M甘氨酸，pH2.5来洗脱。包含～20 mg蛋白质的洗脱液用3M Tris-HCl，pH 8.6中和并且渗析至HIS-S 结合缓冲液(10mM咪唑、300mM NaCl、50mM NaH2P O4，pH 8.0)中，然后施加至5-mL HIS-IMAC柱。柱用结 合缓冲液洗涤至基线并且用250mM咪唑、150mM NaCl、50mM NaH2PO4，pH 8.0洗脱。
包含～11.5mg蛋白质的IMAC洗脱液直接施加至WP(抗-hL243) 亲和力柱，用PBS洗涤至基线并且用0.1M甘氨酸，pH 2.5来洗脱。 所述方法产生7mg高度纯化的20-C2-2b。这是20-C2-2b的大约44％ 理论产率，其为50％总起始材料(在此实施例中为16mg)，其中25％的20-2b-2b和20-C2-C2中的每一个以副产物形式产生。
产生和表征20-C2-2b
双特异性MAb-IFNα通过将IgG-AD2模块，CH3-AD2-IgG-v-ma b，与两个不同二聚体DDD-模块，CH1-DDD2-Fab-hL243和IFNα2b- DDD2组合来产生。由于DDD-模块与两个AD2基团的随机关联，除 了20-C2-2b以外，预期形成两个副产物，20-C2-C2和20-2b-2b。
非还原SDS-PAGE(未展示)将20-C2-2b(～305kDa)拆分为位于20 -C2-C2(～365kDa)与20-2b-2b(255kDa)的条带之间的条带群集。还原 SDS-PAGE拆分包括20-C2-2b的五个多肽(v-mabHC-AD2、hL243Fd- DDD2、IFNα2b-DDD2和共迁移v-mab和hL243κ轻链)(未展示)。IF Nα2b-DDD2和hL243 Fd-DDD2不存在于20-C2-C2和20-2b-2b中。 MABSELECTTM结合至在DNLTM反应中产生的所有三个主要物质， 但是移除任何过量IFNα2b-DDD2和CH1-DDD2-Fab-hL243。HIS- 未结合部分主要包含20-C2-C2(未展示)。来自WT亲和色谱 的未结合部分包含20-2b-2b(未展示)。每个样品经受SE-HPLC和免疫 反应性分析，其证实SDS-PAGE分析的结果和结论。
还原20-C2-2b之后，它的五个组分多肽通过RP-HPLC来拆分并 且产生每个峰的个别ESI-TOF解卷积质量光谱(未展示)。原生、但是 非细菌表达的重组IFNα2在Thr-106处O-糖基化(Adolf等人，Bioch em J 1991；276(Pt 2)；511-8)。我们确定～15％的包括IFNα2b-DDD2 模块的多肽经过O-糖基化并且可通过RP-HPLC和SDS-PAGE来从非 糖基化多肽拆分(未展示)。20-C2-2b的LC/MS分析识别质量精确度 分别为15ppm和2ppm的IFNα2b-DDD2的O-糖基化和非糖基化物 质(未展示)。O-糖基化形式的观察质量指示O-连接多糖具有结构NeuGc-NeuGc-Gal-GalNAc，其也对于20-2b-2b预测到(＜1ppm)(未展 示)。LC/MS将v-mab和hL243κ链以及hL243-Fd-DDD2(未展示)识 别为单一、未修饰物质，并且观察质量匹配计算质量(＜35ppm)。v- mab HC-AD2的两种主要糖型识别为具有53，714.73(70％)和53,877.33(30％)的质量，分别指示通常与IgG相关联的G0F和G1FN-多糖(未 展示)。分析也证实HC-AD2的氨基末端修饰成焦谷氨酸，如对于具 有氨基未端谷氨酰胺的多肽所预测。
20-C2-2b的SE-HPLC分析拆分保留时间(6.7分钟)与它的计算质 量一致并且在较大20-C2-C2的保留时间(6.6分钟)与较小20-2b-2b的 保留时间(6.85分钟)之间的主要蛋白质峰，以及可能代表经由IFNα2b 自关联形成的非共价二聚体的一些较高分子量峰(未展示)。
免疫反应性测定证明20-C2-2b的均质性，其中每个分子含有三 个官能团(未展示)。20-C2-2b与任何三个成分模块的过量抗体一起孵 育导致高分子量免疫复合物的定量形成和20-C2-2b峰消失(未展示)。 HIS-和WT亲和力未结合部分分别不与WT和抗-IFNα免疫 反应(未展示)。MAb-IFNα示出与其亲本MAb的类似结合亲合力(未 展示)。
IFNα生物活性
各种MAb-IFNα的比活性使用基于细胞的报道基因测定来测量 并且与聚乙二醇干扰素α-2b比较(未展示)。如预期地，具有两个 IFNα2b基团的20-C2-2b的比活性(2454 IU/pmol)显著低于20-2b-2b 的比活性(4447 IU/pmol)或734-2b-2b的比活性(3764 IU/pmol)，仍大 于聚乙二醇干扰素α-2b(P＜0.001)(未展示)。20-2b-2b与734-2b-2b之 间的差异不显著。所有试剂之间的比活性在相对于总IFNα的IU/pmol 来标准化时最低限度地变化。基于这些数据，MAb-IFNα的每个 IFNα2b基团的比活性是重组IFNα2b(～4000 IU/pmol)的大约30％。
在离体环境中，20-C2-2bDNLTM构建体比正常B细胞更有效地耗 竭淋巴瘤细胞并且对于T细胞没有效应(未展示)。然而，它有效地消 除单核细胞(未展示)。虽然v-mab对于单核细胞没有效应，但是在用 hL243α4p和MAb-IFNα治疗之后观察到耗竭，并且20-2b-2b和734- 2b-2b展现类似毒性(未展示)。因此，20-C2-2b的可预见的较高效力 归因于抗-HLA-DR与IFNα的组合作用，其可通过HLA-DR靶向来增 强。这些数据表明单核细胞耗竭可为相关联抗-HLA-DR以及IFNα疗 法的药效效应；然而，此副效应可能是瞬时的，因为单核细胞群体从 造血干细胞中恢复。
本领域技术人员将认识到本文描述的产生并使用双特异性免疫 细胞因子，或包括三个不同效应子部分的其它DNLTM构建体的方法 可用于可并入DNLTM构建体中的抗体、抗体片段、细胞因子或其它 效应物的任何组合，例如抗-CD3与抗-CD19或其它抗-TAA与IFNα2b 的组合。
***
按照本公开内容，不需要过度的实验就可以制备和实行本文公开 和要求保护的所有组合物和方法。虽然组合物和方法已经在优选实施 方案方面描述，但是本领域技术人员显而易见的是，变化可用于组合 物和方法以及本文描述方法的步骤或步骤序列而不背离本发明的概 念、精神和范围。更具体地说，化学和生理相关的某些试剂可取代本 文描述的试剂，同时获得相同或类似结果。对本领域技术人员来说清 楚的所有所述相似的替代和修改被认为处在如由随附权利要求限定 的本发明的精神、范围以及理念之内。
序列表
<110> IBC 药品公司
<120> 用于治疗疾病的T-细胞重定向双特异性抗体
<130> IBC138WO1
<140>
<141>
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<151> 2013-04-03
<150> 61/733,268
<151> 2012-12-04
<150> 61/682,965
<151> 2012-08-14
<160> 105
<170> PatentIn 3.5版
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr
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Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala
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Ala Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
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Ala
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Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Asp Leu Leu Gln Gly Tyr
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Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala
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<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 19
Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Asn Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala
20 25 30
Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
35 40
<210> 20
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 20
Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Ala Tyr
1 5 10 15
Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala
20 25 30
Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
35 40
<210> 21
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 21
Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr
1 5 10 15
Ser Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala
20 25 30
Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
35 40
<210> 22
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 22
Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Val Asp Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala
20 25 30
Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
35 40
<210> 23
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 23
Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Val Glu Val Leu Lys Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala
20 25 30
Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
35 40
<210> 24
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 24
Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Val Glu Val Leu Arg Asn Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala
20 25 30
Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
35 40
<210> 25
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 25
Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Asn Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala
20 25 30
Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
35 40
<210> 26
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 26
Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Glu Leu Val Glu Phe Ala
20 25 30
Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
35 40
<210> 27
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 27
Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Asp Phe Ala
20 25 30
Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
35 40
<210> 28
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 28
Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Leu
20 25 30
Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
35 40
<210> 29
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 29
Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ile
20 25 30
Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
35 40
<210> 30
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 30
Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Val
20 25 30
Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
35 40
<210> 31
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 31
Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala
20 25 30
Val Asp Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
35 40
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 32
Asn Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 33
Gln Leu Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 34
Gln Val Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 35
Gln Ile Asp Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 36
Gln Ile Glu Phe Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 37
Gln Ile Glu Thr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 38
Gln Ile Glu Ser Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 39
Gln Ile Glu Tyr Ile Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 40
Gln Ile Glu Tyr Val Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 41
Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Arg Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 42
Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Asn Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 43
Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Glu Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 44
Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Gln Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 45
Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Asn Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 46
Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Asn
1 5 10 15
Ala
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 47
Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Leu
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 48
Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ile
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 49
Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Val
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 50
Gln Ile Glu Tyr Val Ala Lys Gln Ile Val Asp Tyr Ala Ile His Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 51
Gln Ile Glu Tyr Lys Ala Lys Gln Ile Val Asp His Ala Ile His Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 52
Gln Ile Glu Tyr His Ala Lys Gln Ile Val Asp His Ala Ile His Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 53
Gln Ile Glu Tyr Val Ala Lys Gln Ile Val Asp His Ala Ile His Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 54
Pro Leu Glu Tyr Gln Ala Gly Leu Leu Val Gln Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ala Ile
<210> 55
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 55
Leu Leu Ile Glu Thr Ala Ser Ser Leu Val Lys Asn Ala Ile Gln Leu
1 5 10 15
Ser Ile
<210> 56
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 56
Leu Ile Glu Glu Ala Ala Ser Arg Ile Val Asp Ala Val Ile Glu Gln
1 5 10 15
Val Lys
<210> 57
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 57
Ala Leu Tyr Gln Phe Ala Asp Arg Phe Ser Glu Leu Val Ile Ser Glu
1 5 10 15
Ala Leu
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 58
Leu Glu Gln Val Ala Asn Gln Leu Ala Asp Gln Ile Ile Lys Glu Ala
1 5 10 15
Thr
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 59
Phe Glu Glu Leu Ala Trp Lys Ile Ala Lys Met Ile Trp Ser Asp Val
1 5 10 15
Phe
<210> 60
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 60
Glu Leu Val Arg Leu Ser Lys Arg Leu Val Glu Asn Ala Val Leu Lys
1 5 10 15
Ala Val
<210> 61
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 61
Thr Ala Glu Glu Val Ser Ala Arg Ile Val Gln Val Val Thr Ala Glu
1 5 10 15
Ala Val
<210> 62
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 62
Gln Ile Lys Gln Ala Ala Phe Gln Leu Ile Ser Gln Val Ile Leu Glu
1 5 10 15
Ala Thr
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 63
Leu Ala Trp Lys Ile Ala Lys Met Ile Val Ser Asp Val Met Gln Gln
1 5 10 15
<210> 64
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 64
Asp Leu Ile Glu Glu Ala Ala Ser Arg Ile Val Asp Ala Val Ile Glu
1 5 10 15
Gln Val Lys Ala Ala Gly Ala Tyr
20
<210> 65
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 65
Leu Glu Gln Tyr Ala Asn Gln Leu Ala Asp Gln Ile Ile Lys Glu Ala
1 5 10 15
Thr Glu
<210> 66
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 66
Phe Glu Glu Leu Ala Trp Lys Ile Ala Lys Met Ile Trp Ser Asp Val
1 5 10 15
Phe Gln Gln Cys
20
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 67
Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Pro Asp Asn Ala Ile Gln Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 68
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 68
Lys Gly Ala Asp Leu Ile Glu Glu Ala Ala Ser Arg Ile Val Asp Ala
1 5 10 15
Val Ile Glu Gln Val Lys Ala Ala Gly
20 25
<210> 69
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 69
Lys Gly Ala Asp Leu Ile Glu Glu Ala Ala Ser Arg Ile Pro Asp Ala
1 5 10 15
Pro Ile Glu Gln Val Lys Ala Ala Gly
20 25
<210> 70
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 70
Pro Glu Asp Ala Glu Leu Val Arg Leu Ser Lys Arg Leu Val Glu Asn
1 5 10 15
Ala Val Leu Lys Ala Val Gln Gln Tyr
20 25
<210> 71
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 71
Pro Glu Asp Ala Glu Leu Val Arg Thr Ser Lys Arg Leu Val Glu Asn
1 5 10 15
Ala Val Leu Lys Ala Val Gln Gln Tyr
20 25
<210> 72
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 72
Pro Glu Asp Ala Glu Leu Val Arg Leu Ser Lys Arg Asp Val Glu Asn
1 5 10 15
Ala Val Leu Lys Ala Val Gln Gln Tyr
20 25
<210> 73
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 73
Pro Glu Asp Ala Glu Leu Val Arg Leu Ser Lys Arg Leu Pro Glu Asn
1 5 10 15
Ala Val Leu Lys Ala Val Gln Gln Tyr
20 25
<210> 74
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 74
Pro Glu Asp Ala Glu Leu Val Arg Leu Ser Lys Arg Leu Pro Glu Asn
1 5 10 15
Ala Pro Leu Lys Ala Val Gln Gln Tyr
20 25
<210> 75
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 75
Pro Glu Asp Ala Glu Leu Val Arg Leu Ser Lys Arg Leu Val Glu Asn
1 5 10 15
Ala Val Glu Lys Ala Val Gln Gln Tyr
20 25
<210> 76
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 76
Glu Glu Gly Leu Asp Arg Asn Glu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Phe Gln
1 5 10 15
Ile Ile Ser Gln Val Ile Ser Glu Ala
20 25
<210> 77
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 77
Leu Val Asp Asp Pro Leu Glu Tyr Gln Ala Gly Leu Leu Val Gln Asn
1 5 10 15
Ala Ile Gln Gln Ala Ile Ala Glu Gln
20 25
<210> 78
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 78
Gln Tyr Glu Thr Leu Leu Ile Glu Thr Ala Ser Ser Leu Val Lys Asn
1 5 10 15
Ala Ile Gln Leu Ser Ile Glu Gln Leu
20 25
<210> 79
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 79
Leu Glu Lys Gln Tyr Gln Glu Gln Leu Glu Glu Glu Val Ala Lys Val
1 5 10 15
Ile Val Ser Met Ser Ile Ala Phe Ala
20 25
<210> 80
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 80
Asn Thr Asp Glu Ala Gln Glu Glu Leu Ala Trp Lys Ile Ala Lys Met
1 5 10 15
Ile Val Ser Asp Ile Met Gln Gln Ala
20 25
<210> 81
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 81
Val Asn Leu Asp Lys Lys Ala Val Leu Ala Glu Lys Ile Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala Ile Glu Lys Ala Glu Arg Glu Leu
20 25
<210> 82
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 82
Asn Gly Ile Leu Glu Leu Glu Thr Lys Ser Ser Lys Leu Val Gln Asn
1 5 10 15
Ile Ile Gln Thr Ala Val Asp Gln Phe
20 25
<210> 83
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 83
Thr Gln Asp Lys Asn Tyr Glu Asp Glu Leu Thr Gln Val Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Glu Asp Val Ile Asn Tyr Ala
20 25
<210> 84
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 84
Glu Thr Ser Ala Lys Asp Asn Ile Asn Ile Glu Glu Ala Ala Arg Phe
1 5 10 15
Leu Val Glu Lys Ile Leu Val Asn His
20 25
<210> 85
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 85
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 86
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 87
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Ser或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> His、Lys或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Gln或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Gly或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Thr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Glu或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> Gln或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> Gly或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Thr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Glu或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> Arg或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(24)
<223> Gln或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Asp或Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> Glu或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (32)..(32)
<223> Ala、Leu、Ile或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(34)
<223> Glu或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Thr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(38)
<223> Arg或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> Arg或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (41)..(41)
<223> Glu或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (42)..(42)
<223> Ala、Leu、Ile或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (43)..(43)
<223> Arg或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (44)..(44)
<223> Ala、Leu、Ile或Val
<400> 87
Xaa Xaa Ile Xaa Ile Pro Pro Xaa Leu Xaa Xaa Leu Leu Xaa Xaa Tyr
1 5 10 15
Xaa Val Xaa Val Leu Xaa Xaa Xaa Pro Pro Xaa Leu Val Xaa Phe Xaa
20 25 30
Val Xaa Tyr Phe Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40
<210> 88
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Gln或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Ile、Leu或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Glu或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Tyr、Phe、Thr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Leu、Ile或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Lys或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Gln或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Asp或Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Asn或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(16)
<223> Gln或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Ala、Leu、Ile或Val
<400> 88
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Ile Val Xaa Xaa Ala Ile Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa
<210> 89
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Ser或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Gln或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Thr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> Val、Ile、Leu或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> Gln或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> Val、Ile、Leu或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(34)
<223> Glu或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Thr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(38)
<223> Arg或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> Arg或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (42)..(42)
<223> Ala、Leu、Ile或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (44)..(44)
<223> Ala、Leu、Ile或Val
<400> 89
Xaa His Ile Xaa Ile Pro Pro Gly Leu Xaa Glu Leu Leu Gln Gly Tyr
1 5 10 15
Thr Xaa Glu Val Leu Arg Xaa Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala
20 25 30
Xaa Xaa Tyr Phe Xaa Xaa Leu Xaa Glu Xaa Arg Xaa
35 40
<210> 90
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 90
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 91
Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 92
Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr
1 5
<210> 93
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 93
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 94
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 94
Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 95
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 95
Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 96
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 96
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 97
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 97
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 98
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 99
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 99
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 100
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 100
His His His His His His Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 101
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 101
Cys Gly Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile
1 5 10 15
Gln Gln Ala Gly Cys
20
<210> 102
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<400> 102
Pro Lys Ser Cys
1
<210> 103
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 103
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Ile Gln Ile
1 5 10 15
Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr Thr Val Glu Val Leu
20 25 30
Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala Val Glu Tyr Phe Thr
35 40 45
Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala
50 55
<210> 104
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 104
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Glu Tyr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln Gln Ala
20 25
<210> 105
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成6xHis标签
<400> 105
His His His His His His
1 5

Claims (33)

1.T-细胞重定向复合物和干扰素在制备用于治疗疾病的方法的药物中的用途，其包括：
a) 向患有所述疾病的受试者施用T-细胞重定向复合物以诱导T-细胞介导的针对与所述疾病相关联的靶细胞的免疫响应；其中T-细胞重定向复合物包括至少一个针对人CD3的结合位点和至少一个针对人Trop-2 的结合位点；以及
b) 干扰素选自干扰素-α。
2.如权利要求1 所述的用途，其进一步包括：
c) 诱导T-细胞介导的针对与所述疾病相关联的靶细胞的细胞毒性免疫响应。
3. 如权利要求1 所述的用途，其中所述干扰素增加所述T-细胞重定向复合物的功效。
4. 如权利要求3 所述的用途，其中干扰素与T-细胞重定向复合物的组合比单独干扰素和单独T-细胞重定向复合物更有效。
5. 如权利要求1 所述的用途，其中所述干扰素在所述T-细胞重定向复合物之前、同时或之后施用。
6. 如权利要求1 所述的用途，其中所述干扰素以游离干扰素、聚乙二醇化干扰素、干扰素融合蛋白质或偶联至抗体的干扰素形式来施用。
7. 如权利要求1 所述的用途，其中所述T-细胞重定向复合物是双特异性抗体，其包括结合CD3的第一抗体部分和结合Trop-2的第二抗体部分。
8. 如权利要求7 所述的用途，其中所述第一和第二抗体部分选自由以下组成的组：scFv、Fab 和dAb。
9. 如权利要求7 所述的用途，其中所述T-细胞重定向复合物包括：(i)偶联至来自AKAP 蛋白质的AD(锚定结构域)部分的第一抗体部分；和(ii)偶联至来自蛋白激酶A(PKA)调控亚基RIα、RIβ、RIIα或RIIβ 的DDD(二聚化和停靠结构域)部分的第二抗体部分；
其中所述DDD 部分的两个拷贝形成二聚体，所述二聚体结合至所述AD 部分的一个拷贝以形成所述复合物。
10. 如权利要求1 所述的用途，其中所述靶细胞是B 细胞、癌细胞或病原体细胞。
11. 如权利要求1 所述的用途，其中所述疾病是癌症、自身免疫疾病、免疫系统功能障碍或传染病。
12. 如权利要求1 所述的用途，其进一步包括向所述受试者施用治疗剂。
13. 如权利要求12 所述的用途，其中所述治疗剂选自由以下组成的组：抗体、抗体片段、药物、毒素、酶、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、抗生素、激素、免疫调节剂、细胞因子、趋化因子、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、硼化合物和放射性同位素。
14. 如权利要求13所述的用途，其中所述药物选自由以下组成的组：5-氟尿嘧啶、阿法替尼、阿普立定、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类药物、阿西替尼、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、博舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2 抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、克唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、地尼西宝、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉阿霉素(2P-DOX)、氰基-吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、埃罗替尼、雌莫司汀、表鬼臼毒素、埃罗替尼、恩替诺特、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、依西美坦、芬戈莫德、氟脲苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR (FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度、福他替尼、吉尼替彼、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼、伊达比星、伊德利斯、异环磷酰胺、伊马替尼、L-天冬酰胺酶、拉帕替尼、来那度胺、亚叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、来那替尼、尼洛替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、索拉非尼、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼、它莫西芬、替莫唑胺(DTIC 的水性形式)、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓扑替康、乌拉莫司汀、瓦他拉尼、长春瑞滨、长春碱、长春新碱、长春花生物碱以及ZD1839。
15. 如权利要求13所述的用途，其中所述趋化因子选自由以下组成的组：RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β 和IP-10。
16. 如权利要求13 所述的用途，其中所述免疫调节剂选自由以下组成的组：细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、成血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、促红细胞生成素和血小板生成素。
17. 如权利要求13所述的用途，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、肝细胞生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒抑制物质、小鼠促性腺激素相关的肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、促血小板生成素(TPO)、神经生长因子(NGF)、NGF-β、血小板生长因子、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、红细胞生长素(EPO)、骨诱导因子、干扰素、干扰素-α、干扰素-β 以及干扰素-λ、集落刺激因子(CSF)、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、粒细胞-CSF(G-CSF)、白细胞介素-1(IL-1)、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、kit 配体、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子以及LT(淋巴毒素)。
18. 如权利要求1 所述的用途，其中所述T-细胞重定向复合物静脉内施用。
19. 如权利要求1 所述的用途，其中所述T-细胞重定向复合物皮下施用。
20. 如权利要求1 所述的用途，其中所述干扰素是PEGASYS。
21. 一种T-细胞重定向复合物，其包括：
a) 偶联至来自AKAP 蛋白质的AD(锚定结构域)部分的T-细胞结合部分；其中T-细胞重定向复合物包括至少一个针对人CD3的结合位点和至少一个针对人Trop-2的结合位点；和
b) 结合至患病细胞或病原体的靶细胞结合部分，所述靶细胞结合部分偶联至来自蛋白激酶A(PKA)调控亚基RIα、RIβ、RIIα 或RIIβ的DDD(二聚化和停靠结构域)部分；其中所述DDD 部分的两个拷贝形成二聚体，所述二聚体结合至所述AD 部分的一个拷贝以形成所述复合物。
22. 如权利要求21 所述的复合物，其中所述复合物是双特异性抗体，其包括结合CD3的第一抗体部分和结合Trop-2的第二抗体部分。
23. 如权利要求22所述的复合物，其中所述第一和第二抗体部分选自由以下组成的组：Fab、scFv 和dAb。
24.如权利要求22所述的复合物，其中所述第一抗体部分是scFv并且所述第二抗体部分是Fab。
25. 如权利要求22 所述的复合物，其中所述第一抗体部分是Fab并且所述第二抗体部分是Fab。
26. 如权利要求21 所述的复合物，其中所述DDD 部分的所述氨基酸序列选自由以下组成的组：RIIα 的残基1-44，RIIβ 的残基1-44，RIα 的残基12-61 和RIβ 的残基13-66。
27. 如权利要求21所述的复合物，其中所述DDD 部分的所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:87 和SEQID NO:89。
28. 如权利要求21所述的复合物，其中所述AD 部分的所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、M SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQID NO:58、M SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、M SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:44 和SEQ ID NO:88。
29. 如权利要求21所述的复合物，其中向受试者施用所述T-细胞重定向复合物有效诱导效应T-细胞介导的针对B 细胞、癌细胞或病原体的免疫响应。
30. 如权利要求21 所述的复合物，其中所述复合物能够经由所述T-细胞结合部分和所述靶细胞结合部分将T 细胞连接至靶细胞，从而活化所述T 细胞来杀灭所述靶细胞。
31.权利要求21的所述的复合物，其中该复合物还包括干扰素PEGASYS。
32. 权利要求21的T-细胞重定向复合物在制备在个体中将效应T 细胞引导至靶细胞的药物中的用途。
33.一种药物组合物，其包括如权利要求21所述的T-细胞重定向复合物。
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