JP3353209B2

JP3353209B2 - αｖβ３インテグリンに対する抗体

Info

Publication number: JP3353209B2
Application number: JP51764493A
Authority: JP
Inventors: キム，キュン・ジン; ホートン，マイケル・エイ; ボダリー、サラ・シー; チャンタラパイ、アナン
Original assignee: ジェネンテク，インコーポレイテッド
Priority date: 1992-04-03
Filing date: 1993-03-30
Publication date: 2002-12-03
Anticipated expiration: 2017-12-03
Also published as: JPH07505528A; US6369204B1; US5652110A; WO1993020229A1; AU680411B2; EP0633945B1; DE69322860T2; AU3941393A; DE69322860D1; CA2132091A1; US6359126B1; CA2132091C; ATE175241T1; US5652109A; EP0633945A1; US5578704A

Description

【発明の詳細な説明】発明の技術分野この出願は、αｖβ３インテグリンに対するモノクロ
ーナル抗体の産生のためのハイブリッド細胞株（リンパ
球ハイブリドーマ）、そのような均一な抗体、およびそ
のような抗体の診断および治療目的への使用に関する。

発明の背景 αｖβ３は、細胞接着を促進する細胞表面糖タンパク
質レセプターのインテグリンスーパー遺伝子ファミリー
の成員である。各細胞は、その接着能を定める特定の範
囲のレセプターを有している。インテグリンは、非共有
結合的に会合したαおよびβサブユニットのヘテロダイ
マーとして発現される。ハインズ（Hynes,R.O.）によっ
て提唱された命名法によれば［Cell 48、875〜886（198
7）］、インテグリンは、それぞれ共通のβサブユニッ
トと該共通のβサブユニットと会合することが知られて
いる一連の種々のαサブユニットとからなるファミリー
に分けることができる。異なるα鎖は、起源の細胞の種
類によって、最初の発見者によって用いられた下つき文
字によって、またはαｖβ３レセプターの場合のように
リガンドの性質によって（すなわち、αｖはビトロネク
チンレセプターのα鎖を意味する）表示される。すべて
ではないが多くのインテグリンレセプターは、フィブロ
ネクチンの細胞結合ドメインの研究から最初に定められ
た［ルオスラーティ（Ruoslahti,E.）およびピエールシ
ュバクター（Pierschbachter,M.D.）、Cell 44、517051
8（1986）；ルオスラーティおよびピエールシュバクタ
ー、Science 238、491〜497（1987）］、トリペプチド
配列Arg−Gly−Asp（または１文字アミノ酸コードを用
いてRGD）を介してタンパク質と相互作用することが示
されている。

αｖβ３（ビトロネクチンレセプターまたはVNRとも
呼ばれる）はβ３インテグリンサブファミリーの成員で
あり、内皮細胞、メラノーマ細胞、平滑筋細胞を含む種
々の細胞上で発現され、他のインテグリンであるα２β
１（VLA−２）（コラーゲンＩ型およびラミニンに対す
るレセプター）とともに破骨細胞の表面上で発現される
［ホートン（Horton,M.A.）およびデービーズ（Davies,
J.）、J.Bone Min.Res.４、803〜808（1989）；デービ
ーズら、J.Cell.Biol.109、1817〜1826（1989）；ホー
トン、Int.J.Exp.Pathol.71、741〜759（1990）］。α
ｖβ３は、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、フィブ
ロネクチン、トロンボスポンジン、オステオポンチン、
骨シアロプロテインII（bone sialo protein II）およ
びフォン・ビルブラント因子への細胞接着を媒体する。

破骨細胞は、骨組織の吸収に関与する主要タイプの骨
細胞である。吸収過程は、発育中の破骨細胞の造血部位
から骨格部分への増殖および走化性、その後の吸収部位
への成熟細胞の移動、骨基体への破骨細胞の付着、およ
びその結果として骨吸収に直接関与する極性化した機能
性の成熟最終細胞の生成を含む。αｖβ３は、RGD配列
を含有する骨マトリックスタンパク質への破骨細胞の接
着を媒体する。

αｖβ３に対する抗体は、このインテグリンの生物学
的役割および構造／機能相関をその種々のリガンドを用
いて研究するうえで重要な診断および治療手段となるこ
とが期待される。とりわけ、破骨細胞上の独特のエピト
ープを検出するモノクローナル抗体は、破骨細胞の発達
を理解するうえで大きな価値を有するであろう。さらに
重要なことには、破骨細胞の骨マトリックスタンパク質
への結合を阻害するαｖβ３特異的な中和モノクローナ
ル抗体は、過剰な骨吸収と関連する病的状態の治療に有
用な治療剤として大きな可能性を秘めている。

αｖβ３上の種々のエピトープに結合する当該技術分
野で知られた幾つかのモノクローナル抗体が存在する。
破骨細胞腫（骨巨細胞腫瘍）からの破骨細胞で免疫し
て、ホートンら［Cancer Res.45、5663〜5669（198
5）］は正常ヒト胎児骨および種々の腫瘍性および非腫
瘍性の骨病変における破骨細胞に結合するモノクローナ
ル抗体を分泌する11のマウスハイブリドーマを産生させ
た。これらのうち一つで23C6と呼ばれるものは、その
後、αｖβ３複合体に結合することが示され、破骨細胞
の機能を破砕し得ることが示された［ホートンら、Exp.
Cell.Res.195、368〜375（1991）］。PCT出願公開第WO
89/05155号公報（1989年６月15日公開）およびチェレシ
ュ（Cheresh）らのJ.Biol.Chem.262:17703〜17711（198
7）に開示された他のモノクローナル抗体LM609（ハイブ
リドーマLM609 ATCC HB9537中で産生）もまたαｖβ３
複合体に結合することがわかり、腫瘍細胞および血管形
成内皮細胞の表面上に存在するECr分子のビトロネクチ
ン、フィブリノーゲンおよびフォン・ビルブラント因子
への結合を阻害する能力のため、腫瘍増殖インヒビター
として治療目的に使用することが提唱されている。モノ
クローナル抗体13C2（ホートンら、Cancer Res.1985、
上記）はαｖβ３のαｖ部分に結合することが示された
が、一方、幾つかの他のモノクローナル抗体はβ３部分
を認識することが報告されている［ネスビット（Nesbit
t,S.）ら、ビトロネクチンレセプター（CD51）のエピト
ープ分析、「白血球分類IV」白血球分化抗原、クナップ
（Knapp,W.）ら（編）1991、p.1037中］。当該技術分野
で種々報告されている特異的モノクローナル抗体もま
た、内皮細胞および種々のメラノーマ細胞株に結合する
ことが示された。

αｖβ３発現細胞のαｖβ３リガンド（ビトロネクチ
ンおよびフィブロネクチンなど）への結合を有効に阻害
し得るαｖβ３インテグリンに対する高親和性モノクロ
ーナル抗体に対する必要性が存在する。

破骨細胞および任意にαｖβ３を発現することがわか
っている他の細胞に結合するαｖβ３に対するモノクロ
ーナル抗体を提供することがさらに望ましい。

αｖβ３の対応リガンドへの結合の有効なインヒビタ
ーであり、αｖβ３を発現することがわかっている他の
細胞には結合することなく破骨細胞に特異的に結合す
る、すなわち破骨細胞上の標的インテグリンに対して一
層特異的であるモノクローナル抗体を提供することが特
に望ましい。

発明の要約本発明は、αｖβ３インテグリンに対するモノクロー
ナル抗体の産生および広範な特徴付けに係る成功した研
究に基づいている。従って、本発明は、αｖβ３上の独
特のエピトープを認識することができ、および／または
αｖβ３に対する高親和性を示すモノクローナル抗体に
関する。本発明はとりわけ、αｖβ３複合体またはその
β３部分上の独特のエピトープを認識するモノクローナ
ル抗体に関する。本発明はさらに、ビトロネクチンおよ
びフィブロネクチンへのαｖβ３発現細胞の結合を有効
に阻害するモノクローナル抗体に関する。特に重要な側
面において、本発明は、破骨細胞上のαｖβ３には特異
的に結合するが他の細胞（たとえば、メラノーマ細胞C3
2R、Ｍ−21、HA−Ａ、HA−ＬおよびHT−144およびヒト
臍帯静脈内皮細胞）上の他のαｖβ３には結合しないモ
ノクローナル抗体に関する。

一つの観点において、本発明は、（１）αｖβ３発現
細胞のフィブリノーゲンへの結合を阻害することがで
き、（２）破骨細胞に結合することができ、および
（３）10C4.1.3、9G2.1.3および9D4.9.1よりなる群から
選ばれたモノクローナル抗体のいずれか一つによって認
識されるエピトープと実質的に同じエピトープに結合す
ることができ、または上記３つの抗体とほぼ同じかまた
はそれより大きなαｖβ３に対する親和性を有する抗α
ｖβ３モノクローナル抗体に関する。

他の観点において、本発明は、そのような抗体をコー
ドする単離核酸、およびそのような抗体を産生するハイ
ブリドーマまたは組換え細胞に関する。

別の観点において、本発明は、そのような抗体の治療
目的または診断目的での使用に関する。本発明のモノク
ローナル抗体は、過剰な骨吸収を特徴とする疾患または
病的状態を治療し、および／または腫瘍の増殖を阻止す
るため、単独でまたは（化学）療法剤と組み合わせて治
療剤として有用である。本発明のモノクローナル抗体は
また、細胞上のαｖβ３の存在を決定するための診断お
よび分析アッセイ、細胞の分類および組織化学的組織染
色に有用である。

これらおよび他の観点は、以下の詳細な記載から明ら
かとなるであろう。

図面の簡単な記載図１は、抗αｖβ３抗体の産生方法を示す模式図であ
る。

図２は、この発明の抗体、２つの陽性コントロール
（23C6および13C2）およびIgG陰性コントロールを用い
たαｖβ３成分の免疫沈降を示す。

図3A−Ｆは、モノクローナル抗体23C6 αｖβ３エピ
トープをこの発明の幾つかのモノクローナル抗体のエピ
トープと比較したフローサイトメトリーによる比較を示
す。図3Aは、αｖβ３形質転換細胞の蛍光標識23C6単独
による染色を示し、図3Bは、非標識23C6と競合した蛍光
標識23C6による染色を示し、図3C、3D、3Eおよび3Fは、
本発明の４腫のモノクローナル抗体による標識23C6と競
合した染色を示す。

図4A−Ｂは、αｖβ３形質転換293細胞がフィブリノ
ーゲン（図4A）またはビトロネクチン（図4B）に結合す
るのを阻害するモノクローナル抗体の能力を示す。興味
深いことに、23C6は他のモノクローナル抗体が阻害した
ようにフィブリノーゲンへの細胞の結合を阻害すること
ができた。しかしながら、9D4.9.1は、試験した他のモ
ノクローナル抗体のいずれよりも実質的に高い親和性を
示した。下のパネルに示すように、モノクローナル抗体
10C4.1.3および9D4.9.1のみがビトロネクチンへの細胞
の結合を実質的に阻害することができ、この場合も、後
者は試験した他のモノクローナル抗体よりも高い親和性
を示した。

図5Aおよび5Bは、それぞれ、フィブリノーゲンおよび
ビトロネクチンへの可溶性αｖβ３の結合の種々のモノ
クローナル抗体による阻害を示す。結果は、ほぼ図4A−
Ｂに示した結果と似ている。

図6A−Ｂは、骨巨細胞腫瘍からのヒト破骨細胞（多核
細胞）のイムノペルオキシダーゼ組織化学染色を示す。
6A:モノクローナル抗体10C4.1.3。6B:IgGコントロール
抗体。写真は330×の倍率で撮った。

発明の詳細な記載 A.定義および一般的方法本明細書において使用する「モノクローナル抗体」な
る語は、抗体の実質的に均一な集団をいう、すなわち、
該集団を構成する個々の抗体は、少量で存在するかもし
れない天然に生じ得る変異を別として特異性および親和
性が同一である。モノクローナル抗体組成物は、１種を
越えるモノクローナル抗体を含有してよいことに注意す
べきである。

本発明の範囲に包含されるモノクローナル抗体には、
採取源の種や免疫グロブリンクラスやサブクラスの表示
のいかんに拘わらずハイブリッドおよび組換え抗体（た
とえば、「ヒト化」抗体）もそれらが本明細書に記載す
る新規で非自明な特徴を有する限りにおいて含まれ、好
ましい態様においてはモノクローナル抗体10C4.1.3、9G
2.1.3または9D4.9.1によって認識されるのと実質的に同
じエピトープに結合することができ、および／または23
C6または9D4.9.1と同じかまたはそれ以上のエピトープ
親和性を有する抗体である。

それゆえ、修飾語の「モノクローナル」は、抗体の実
質的に均一な集団としての抗体の特性を示し、抗体を特
定の方法によって産生することを要求することを意味し
ない。たとえば、本発明のモノクローナル抗体は、コー
ラー（Kohler）とミルシュタイン（Milstein）によって
最初に記載されたハイブリッド法（Nature 256:495（19
75））を用いて製造することができるし、または組換え
DNA法によって製造することもできる。たとえば、カビ
リー（Cabilly）らの米国特許第4,816,567号またはメイ
ジ（Mage）およびラモイ（Lamoyi）のMonoclonal Antib
ody Production Techniques and Applications、79〜97
頁（マーセル・デッカー（Marcel Dekker,Inc.）、ニュ
ーヨーク、1987）を参照。

ハイブリッド法においては、マウスまたは他の適当な
宿主動物を皮下、腹腔内または筋肉内経路によりαｖβ
３インテグリンで免疫し、免疫に使用したタンパク質に
特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリ
ンパ球を生成させる。別法として、リンパ球をインビト
ロで免疫することもできる。ついで、ポリエチレングリ
コールなどの適当な融合剤を用いてリンパ球をミエロー
マ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を生成させる
［ゴーディング（Goding）、Monoclonal Antibodies:Pr
inciples and Practice、59〜103頁（アカデミック・プ
レス、1986）］。実施例に示すように、αｖβ３の細胞
外ドメイン（経膜ドメインまたは細胞質ドメインを含有
しない欠けたαｖβ３）で免疫すると驚くほど多数の抗
αｖβ３抗体が得られ、そのような免疫が幾つかのモノ
クローナル抗体の独特の特異性および高親和性に一部寄
与するものと思われる。加えて、リンパ節細胞（脾臓細
胞または他の組織よりもむしろ）の融合パートナーとし
ての使用は有用であると思われた。

このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、融合
していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を抑制す
る１種または２種以上の物質を好ましくは含有する適当
な培地中に植えて増殖させる。たとえば、親ミエローマ
細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠失している
場合には、ハイブリドーマのための培地は、一般にヒポ
キサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（これら物
質はHGPRT−欠失細胞を増殖させない）を含有している
であろう（HAT培地）。

好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択し
た抗体−産生細胞による抗体の安定な高レベル発現を支
持し、HAT培地などの培地に感受性であるものである。
これらのうち好ましいミエローマ細胞株は、サーク・イ
ンスティチュート・セル・ディストリビューション・セ
ンター（Salk Institute Cell Distribution Cente
r）、サンジエゴ、カルフォルニア、米国から入手可能
なMOPC−21およびMPC−11マウス腫瘍に由来するもの、
およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン、ロックビル、メリーランド、米国から入手可能なSP
−２細胞、またはP3X63Ag8U.1マウスミエローマ細胞
［イエルトン（Yelton）ら、Curr.Top.Microbiol.Immun
ol.81、１（1978）］などのマウスミエローマ株であ
る。ヒトミエローマ細胞株およびマウス−ヒトヘテロミ
エローマ細胞株もまたヒトモノクローナル抗体の産生の
ために記載されている［コズバー（Kozbor）、J.Immuno
l.133:3001（1984）；ブロダー（Brodeur）ら、Monoclo
nal Antibody Production Techniques and Application
s、51〜63頁（マーセル・デッカー、ニューヨーク、198
7）］。上述したように、これらハイブリドーマはリン
パ節融合により調製した。

ハイブリドーマ細胞を増殖させた培地を、個々の鎖ま
たは好ましくはαｖβ３複合体に対するモノクローナル
抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、結合特
異性の決定は、免疫沈降により、またはラジオイムノア
ッセイ（RIA）や酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ELIS
A）などのインビトロ結合アッセイにより、または蛍光
発色セルソーターにより行う。本発明のモノクローナル
抗体は、以下に説明するように、可溶性のまたは細胞に
結合したαｖβ３に結合し中和能を有するものである。
ついで、種々の細胞タイプ上のαｖβ３への結合の特異
性を決定するが、その目的は、αｖβ３以外のいずれの
他のインテグリンにも結合せず、好ましくはメラノーマ
腫瘍細胞、内皮細胞および破骨細胞上のαｖβ３を識別
することができる、すなわちそのような細胞タイプのい
ずれか一つに対して実質的に特異的である抗体を同定す
ることにある。実質的な特異性とは、一般に、少なくと
も細胞株C32R、Ｍ−21、HA−Ａ、HA−Ｌ、HT−63または
MG−63のいずれかに比べて破骨細胞に対してモノクロー
ナル抗体10C4.1.3によって示された識別の程度で候補の
細胞タイプに対して抗体が特異的であることを意味す
る。明らかにこのことは、結合する抗体の量によってま
たは他の通常の測定手段によって表現される。最後に、
スクリーニングを任意に狭めて抗体10C4.1.3、9G2.1.3
または9D4.9.1によって認識されるエピトープと実質的
に同じエピトープに結合する抗体を検出する（以下に23
C6について記載する種類の競合アッセイにより決定され
る、ただし、本発明の３種のモノクローナル抗体は候補
のエピトープ結合を決定するための標識競合試薬として
用いられるであろう）。「同じエピトープ」とは、たと
えばαｖβ３のアラニンスキャニング変異（alanine sc
anned variants）を用いたエピトープマッピングによっ
て決定されるように、上記３種の基準抗体が結合する正
確なアミノ酸または炭水化物を意味するものでないこと
に注意すべきである。「同じエピトープ」は、天然の基
準抗体の一つが完全な形態でαｖβ３に結合することに
よってブロックされるαｖβ３ドメインを意味する。も
ちろん、「同じエピトープ」は、基準CDRに構造的に相
互作用または結合するαｖβ３ドメイン残基または炭水
化物を含む。

本発明の好ましい態様において、モノクローナル抗体
は、たとえばマンソンおよびポラール（Munson ＆ Poll
ard）のスキャッチャード分析（Anal.Biochem.107:220
（1980））によって決定されるように、23C6よりも大き
な親和性および好ましくは9D4.9.1と同じかまたはそれ
より大きな親和性を有するであろう。

本明細書において使用する「中和抗体」とは、αｖβ
３の生物学的活性を実質的に阻害または除去することの
できるモノクローナル抗体をいう。一般に中和抗体は、
モノクローナル抗体23C6と同じかまたはそれより大きな
程度で、および好ましくはモノクローナル9D4.9.1、10C
4.1.3または9G2.1.3と同じかまたはそれより大きな程度
でビトロネクチンやフィブリノーゲンなどの細胞マトリ
ックスリガンドへのαｖβ３の結合を阻害するであろ
う。

所望の特異性および親和性を有する中和抗体を産生す
るハイブリドーマ細胞が同定されたら、これらクローン
を一般に限界希釈法によってサブクローニングし、標準
法により増殖させる。ゴーディング、Monoclonal Antib
odies:Principles and Practice、59〜104頁（アカデミ
ック・プレス、1986）。この目的に適した培地として
は、たとえば、ダルベッコの変性イーグル培地またはRP
MI−1640培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細
胞は動物中で腹水腫瘍としてインビボで増殖させること
もできる。

これらサブクローンによって分泌されたモノクローナ
ル抗体は、たとえば、プロテインＡ−セファロース、ヒ
ドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳
動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなど
の通常の免疫グロブリン精製法により培地、腹水または
血清から適当に分離する。

本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、通
常の方法（たとえば、マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコ
ードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴ
ヌクレオチドプローブを用いることにより）を用いて容
易に単離およびシークエンシングすることができる。本
発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好まし
い採取源として用いることができる。単離されたら、DN
Aを発現ベクターまたはクローニングベクター中にライ
ゲートし、ついでこれをシミアンCOS細胞、チャイニー
ズハムスター卵巣（CHO）細胞、または他の仕方では免
疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞中
にトランスフェクションする。これら形質転換細胞を培
養して組換え宿主細胞培地中でモノクローナル抗体を合
成する。

DNAは、その発現によって産生される免疫グロブリン
の特性を変化させるために任意に修飾させる。免疫グロ
ブリンの変異体はよく知られている。たとえば、キメラ
抗体は、相同なマウス配列の代わりにヒトＨ鎖およびＬ
鎖定常ドメインのコード配列で置換することにより製造
する（カビリーら、前掲書、またはモリソン（Morriso
n）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851（1984））。加え
て、選択するFcドメインは、IgA、IgD、IgE、IgG−１、
−２、−３または−４、またはIgMのいずれからのもの
であってもよい。Fcドメインは、補体結合などのエフェ
クター機能を任意に有していてよい。

ヒト化形態のマウス抗体は、ヒト枠組み構造ドメイン
中にマウス抗体の相補性決定領域を置換することにより
製造する（たとえば、PCT公開第WO92/22653号（1992年1
2月23日公開）参照）。幾つかの態様において、選択し
たマウス枠組み構造残基もまたヒト免疫グロブリン中に
置換される。

本発明の免疫グロブリンと細胞毒性残基との融合物
は、たとえば、免疫グロブリンコード配列に細胞毒性非
免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または
一部をライゲートすることにより製造される。そのよう
な非免疫グロブリンポリペプチドとしては、リシン、ジ
フテリアトキシンまたはシュードモナス外毒素などのポ
リペプチド毒素が挙げられる。

また、結合体はインビトロ法によって製造することが
できる。たとえば、イムノメトキシンは、ジスルフィド
交換反応を用い、または免疫グロブリンと毒素ポリペプ
チドとの間にチオエーテル結合を生成させることにより
構築することができる。この目的のための適当な試薬の
例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メル
カプトブチルイミデートが挙げられる。加えて、他の融
合物を同様の組換え法により容易に製造することができ
る。本発明の免疫グロブリンのための適当な融合パート
ナーとしては、ウイルス配列、Ｔ細胞レセプターなどの
細胞レセプター、TNF、インターフェロンもしくはイン
ターロイキンなどのサイトカイン、および他の生物学的
または免疫学的に活性なポリペプチドが挙げられる。一
般に、そのような非免疫グロブリン性の融合ポリペプチ
ドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換する。別法と
して、本発明の抗体の一方の抗原結合部位の可変ドメイ
ンと置換する。

αｖβ３以外の抗原に対して特異性を有する抗体のFr
またはCDRを置換すると、αｖβ３に対する特異性を有
する一方の抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性
を有する他方の抗原結合部位とからなるキメラ２価抗体
が作製されるであろう。そのような態様では、Ｌ鎖を欠
失させ、Ｈ鎖のFvを所望のポリペプチドと置換する。こ
れら抗体は、使用したFcドメインが有する免疫グロブリ
ン「アーム」の数に依存して２価または多価であると呼
ばれる（IgMは多価であろう）。上記非免疫グロブリン
は別として、抗体はまた、１を越える特異性を有する抗
体の組換えによっても多価とすることができる。たとえ
ば、ある態様における抗体は、本明細書に記載するαｖ
β３に結合することができるとともに、CD3、CD4、CD
8、CD18、CD11a、CD11bまたはCD11cなどのＴ細胞決定基
にも結合することができる。これら他の抗体はよく知ら
れている。多特異的（multispecific）で多価な抗体
は、両抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードするDNAで細胞を
共形質転換することにより製造され、発現された抗体の
一部はイムノアフィニティークロマトグラフィーなどに
よって回収された所望の構造を有する。別法として、そ
のような抗体は複数の１価抗体を通常の仕方でインビト
ロで組換えることにより製造される。

１価抗体もまた、それ自体通常の技術によって製造さ
れる。Ｌ鎖と修飾Ｈ鎖との組換え発現が適している。Ｈ
鎖の架橋を防ぐため、一般にFc領域中のいずれの部位に
おいてもＨ鎖を切り出すことができる。別法として、架
橋を防ぐために関連するシステインを他の残基で置換す
るかまたは欠失させる。１価抗体を製造するためにイン
ビトロ法を用いることもできる、たとえば、完全な抗体
を酵素開裂することによりFab断片が調製される。

診断的応用のためには、本発明の抗体は一般に検出可
能な残基で標識されるであろう。検出可能な残基は、直
接かまたは間接に検出可能なシグナルを生成し得るもの
であればいかなるものであってもよい。たとえば、検出
可能な残基は³H、¹⁴C、³²P、³⁵Sまたは¹²⁵Iなどの放射
性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート、ロー
ダミンまたはルシフェリンなどの蛍光または化学ルミネ
ッセンス化合物；たとえば、¹²⁵I、³²P、¹⁴C、テクネチ
ウムまたは³Hなどの放射性同位元素標識、アルカリホス
ファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペ
ルオキシダーゼなどの酵素であってよい。

抗体を検出可能な残基に別々に結合させるため、ハン
ター（Hunter）ら、Nature 144:945（1962）；デービッ
ド（David）ら、Biochemistry 13:1014（1974）；ペイ
ン（Pain）ら、J.Immunol.Meth.40:219（1981）；およ
びナイグレン（Nygren）、J.Histochem.and Cytochem.
30;407（1982）に記載された方法を含む当該技術分野で
公知のいずれの方法をも用いることができる。

本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接および間接
サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイなどの
いずれの公知のアッセイ法においても用いることができ
る。ゾラ（Zola）、Monoclonal Antibodies:A Manual o
f Techniques、147〜158頁（CRCプレス、1987）。

競合結合アッセイは、限られた量の抗体への結合に対
して標識標準（αｖβ３またはその免疫学的反応領域で
あってよい）が被験試料分析対象物と競合する能力に依
存する。被験試料中のαｖβ３の量は、抗体に結合した
標準の量に反比例する。結合した標準の量の決定を容易
にするため、抗体に結合した標準および分析対象物を結
合しないで残った標準および分析対象物から都合よく分
離できるよう、競合の前または競合後に抗体を一般に不
溶化させる。

サンドイッチアッセイは、それぞれ検出すべきタンパ
ク質の異なる免疫原部分すなわちエピトープと結合する
ことのできる２種の抗体を使用する。サンドイッチアッ
セイにおいては、被験試料分析対象物は固相支持体上に
固定化された第一の抗体に結合し、その後、第二の抗体
が該分析対象物に結合して不溶性の３部分複合体を形成
する。デービッド（David）およびグリーン（Green
e）、米国特許第4,376,110号。第二の抗体はそれ自体検
出可能な残基で標識されていてもよいし（直接サンドイ
ッチアッセイ）、または検出可能な残基で標識した抗免
疫グロブリン抗体を用いて測定することもできる（間接
サンドイッチアッセイ）。たとえば、サンドイッチアッ
セイの一つのタイプはELISAアッセイであり、この場
合、検出可能な残基は酵素である。

本発明の抗体はまたインビボ造影にも有用であり、放
射性オパック試薬（radi−opaque agent）または放射性
同位元素などの検出可能な残基で標識した抗体を宿主に
好ましくは血流中に投与し、該標識抗体の宿主中での存
在および位置をアッセイする。この造影法は、腫瘍形成
または骨の異常の病期の決定および治療に有用である。
抗体は、核磁気共鳴、放射線学または当該技術分野で公
知の他の検出手段によろうと、宿主中で検出可能ないか
なる残基で標識してもよい。

本発明の中和抗体は、所望でない骨吸収や腫瘍細胞の
増殖または転移を予防または治療するため治療学的応用
において特に有用である。明らかに、10C4.1.3タイプの
モノクローナル抗体は以下の表２に記載したのと同じタ
イプの腫瘍の治療またはインビボ造影のために有用では
ない。というのは、これらモノクローナル抗体はそのよ
うな細胞上に認められるαｖβ３に結合しないからであ
る。その代わり、これらモノクローナル抗体は、骨の吸
収または分解の病的状態、たとえば骨粗鬆症において認
められるものやある種の腫瘍によるPTHrP過剰発現の結
果として認められるものの治療に特に有用である。

治療学的応用のため、本発明の抗体を哺乳動物、好ま
しくはヒトに薬理学的に許容し得る剤型にて投与する。
本発明の抗体は、巨丸として静脈内に、または長期にわ
たる連続注入により、または筋肉内、皮下、関節内、滑
液のう内、鞘内、経口、局所または吸入経路により投与
する。抗体が適当な作用を有している場合には、全身的
治療効果とともに局所効果を得るために、腫瘍内、腫瘍
周囲、病変内または病変周囲経路により適当に投与する
こともできる。

そのような剤型には、もともと非毒性で治療用でない
薬理学的に許容し得る担体が含まれる。そのような担体
の例としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸
アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血
清タンパク質、リン酸またはグリシンなどの緩衝液、ソ
ルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部
分グリセリド混合物、水、塩、または硫酸プロタミンな
どの電解質、塩化ナトリウム、金属塩、コロイド状シリ
カ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セ
ルロース性ポリマー、およびポリエチレングリコールが
挙げられる。抗体の局所剤型またはゲルベース剤型のた
めの担体としては、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウムやメチルセルロースなどの多糖類、ポリビニリピロ
リドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリ
オキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレング
リコール、および木ロウアルコールが挙げられる。通常
のデポ剤型には、たとえば、マイクロカプセル、ナノ−
カプセル、リポソーム、プラスター、舌下錠剤、および
ポリラクチド：ポリグリコライドコポリマーなどのポリ
マーマトリックスが含まれる。凍結乾燥させるのではな
く水溶液の剤型として存在する場合には、抗体は一般に
約0.1mg/mlから100mg/mlの濃度で調合するが、これら範
囲から大きくはずれることも許容される。

疾患の予防または治療のため、抗体の適当な投与量
は、上記のように処置しようとする疾患の種類、該疾患
の重篤度および経過（抗体が予防目的または治療目的で
投与されるかにかかわらず）、以前行った治療の経過、
通常の病歴および該抗体に対する応答、および担当医の
裁量に依存するであろう。抗体は一度または一連の処置
にわたって患者に適当に投与する。

疾患の種類および重篤度に応じて、たとえば１回また
は２回以上の分割投与によるかまたは連続的な注入によ
るかにかかわらず、約0.015〜15mg抗体/Kg患者体重が、
患者に投与するための投与量の最初の候補として挙げら
れる。数日もしくはそれより長期にわたって投与を繰り
返す場合、病的状態に応じて疾患の兆候の所望の抑制が
生じるまで処置を繰り返す。しかしながら、他の投与計
画も有用であり、本発明の範囲から逸脱するものではな
い。

本発明の他の態様によれば、主要な抗体とは異なるエ
ピトープに対する他の抗体、または意図する治療適応
症、たとえば骨粗鬆症などの過剰の骨吸収に付随する病
的状態の予防または治療または腫瘍細胞の増殖または転
移の阻害のための公知の１種または２種以上の通常の治
療剤などのような、同じ臨床目的のために有効な他の薬
剤と連続的にまたは組み合わせて該抗体を投与すること
により、疾患を予防または治療するうえでの抗体の有効
性は改善することができる。

本発明の抗体はまた、アフィニティー精製剤としても
有用である。この手順において、αｖβ３に対する抗体
を当該技術分野で公知の方法を用いてセファデックス樹
脂や濾紙などの適当な支持体上に固定化する。ついで、
固定化抗体を精製すべきαｖβ３を含有する試料と接触
させ、その後、支持体を適当な溶媒で洗浄して固定化抗
体に結合したαｖβ３以外は試料中の実質的にすべての
物質を除去する。最後に、支持体をグリシン緩衝液（pH
5.0）などの他の適当な溶媒で洗浄して抗体からαｖβ
３を放出させる。

以下に提供する実施例は説明のためであって、本発明
を限定することを意図するものでは決してない。

実施例１ A.ヒトαｖβ３に特異的なモノクローナル抗体の生成 αｖβ３インテグリンに特異的なモノクローナル抗体
を産生させるため、αｖβ３複合体を発現する293−15D
細胞株（αｖまたはβ３を発現するPMNCVベクターから
調製したDNAとネオマイシン耐性遺伝子をコードするDNA
で293細胞（ATCC CRL1573）をトランスフェクションす
ることにより生成）から精製したαｖβ３インテグリン
でBalb/cマウスを免疫した。αｖβ３の精製は、レンチ
ル（lentil）レクチンカラムを用いることにより293−1
5D細胞のNP−40細胞溶解液から行った。ついで、調製し
たαｖβ３の純度を等電点電気泳動により確認した。マ
ウスをMPL/TDMアジュバント（リビ・イムノケム・リサ
ーチ（Ribi Immunochem.Research Inc.）、ハミルト
ン、モンタナ州）中に乳濁したαｖβ３（５μｇ）で１
回、ついでMPL/TDMアジュバント中に浸した（immersifi
ed）αｖβ３（5mg）で２週間の間隔で６回、足趾中に
免疫した。最後の免疫から３日後、記載に従い（ヤーム
ッシュ（Yarmush）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.77:2899、1
980）、これらマウスからのリンパ節細胞を35％ポリエ
チレングリコールを用いてP3X63Ag8U.1ミエローマ細胞
（イエルトン（Yelton）ら、Curr.Top.Microbiol.Immun
ol.81:1、1978）と融合させた。以後の手順は図１に示
してある。ELISAによる可溶性αｖβ３への結合能およ
びFACSCAN（ベクトン・ディッキンソン・FACS・システ
ムズ（Becton Dickinson FACS systems）、マウンテン
ビュー、カリフォルニア州）を用いた流動微小蛍光測定
分析による種々のインテグリンを発現する細胞株への結
合能により、抗αｖβ３抗体産生についてハイブリドー
マ細胞株を選択した。これら陽性モノクローナル抗体の
イソタイプ（表１）の決定を、イソタイプ特異的なアル
カリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン
（ハーロウ（Harlow）およびレイン（Lane）、Antibodi
es:A Laboratory Manual、597頁、コールドスプリング
ハーバーラボラトリー、1988）を用いたELISAにより行
った。

陽性ハイブリドーマ細胞株を限界希釈法により２回サ
ブクローニングした。

B.モノクローナル抗体によるαｖβ３複合体の免疫沈降 10％FCSを含有するF12/DMEM培地で増殖させた293−15
Dトランスフェクション体をEDTA処理することにより回
収し、NHS−LC−ビオチンを用いてビオチン化した。細
胞（５×10⁶細胞/ml）をNIH−LS−ビオチン（１μg/m
l）とともに室温にて１時間インキュベートした。つい
で、0.5M NaCl₂ 1mM CaCl₂および1mN MgCl₂を含有する
0.05mMトリス緩衝液（細胞洗浄緩衝液）中で洗浄するこ
とにより未結合のビオチンを除去した。細胞を１％NP−
40で処理して溶解し、10分間ミクロ遠心分離して細胞破
砕物を除去した。この上澄み液を免疫沈降に用いた。0.
5M NaClおよび0.1％ツイーン−20を含有する0.05Mトリ
ス緩衝液（IP洗浄緩衝液）中のプロテイン−Ｇ（50μ
ｌ）をモノクローナル抗体（100μl;100μg/ml）ととも
に室温にて30分間インキュベートした。IP洗浄緩衝液中
で２回洗浄した後、プロテイン−Ｇ上の非特異的結合部
位を１％BSAで室温にて１時間ブロックし、２回洗浄
し、ビオチン化膜タンパク質を含有する上澄み液ととも
に室温にて１時間インキュベートした。複合体を６回洗
浄し、２−MEを含有するSDS PAGE−試料緩衝液中で沸騰
させることにより還元し、12％SDSポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動により分析した。図２はその結果
を示す。

実施例２細胞培養および種々の組織の免疫蛍光染色 10％FCS、グルタミンおよび抗生物質を含有するF12/D
MEM培地（1:1 o/o混合物）中で増殖させたトランスフェ
クションした細胞および腫瘍細胞を1,000rpmにて５分間
遠心分離することによりセルソーター緩衝液（CSB、１
％FCSおよび0.01％NaN₃を含有するPBS）中で３回洗浄
し、CSB中に４×10⁶細胞/mlとなるように再懸濁した。
細胞（25μｌ）を96ウエルＵ−底プレート中に加え、抗
体（100μｌ）とともに氷上で30分間インキュベートし
た。インキュベーションの終了時、細胞をCSB中で２回
洗浄し、細胞をFITC結合ヤギ抗マウスIg抗体とともに氷
上で30分間インキュベートすることにより、細胞に結合
したモノクローナル抗体を検出した。細胞をCSB中で２
回洗浄し、CBS（0.5ml）中に再懸濁し、記載に従い（ロ
ーケン（Loken）ら、Ann.N.Y.Acad.Sci.254:163−；ミ
ラー（Miller）ら、Rev.Sci.Instrum.49:1137−９、198
7）、流動微小蛍光測定により分析した。その結果を表
２に示す。

表２は、可溶性インテグリンタンパク質を用いたELIS
Aによると同様に異なるインテグリンを発現するトラン
スフェクションした細胞のFACS分析による、これらモノ
クローナル抗体により認識されるαｖβ３の部分の決定
を示す。モノクローナル抗体9G2.1.3はαｖβ３を発現
する293−15Dに強く結合し、II b−III aを発現する293
−CLBには非常に弱く結合したが、αｖβ１を発現する2
93−52Bには結合しなかった。モノクローナル抗体10C4.
1.3は293−15Dのみに結合し他には結合しなかった。そ
れゆえ、これら２つのモノクローナル抗体（9G2.1.3お
よび10C4.1.3）はαｖβ３を認識すると結論された。対
照的に、モノクローナル抗体9D4.9.1は293−15Dおよび2
93−CLBの両方に強く結合したが293−52Bには結合しな
かった。それゆえ、モノクローナル抗体9D4.9.1はαｖ
β３のβ３部分に結合すると結論された。

表２はまた、モノクローナル抗体9C9.11.11が破骨細
胞、ヒト内皮細胞および種々のメラノーマ細胞に結合す
ることを示している。この染色パターンは23C6の染色パ
ターンに似ている。対照的に、モノクローナル抗体10C
4.1.3は破骨細胞のみを認識し、驚くべき非常に狭い特
異性を示唆している。ヒトメラノーマ腫瘍細胞、神経膠
腫細胞および正常内皮細胞に対するモノクローナル抗体
9D4.9.1および9G2.1.3の染色パターンは、モノクローナ
ル抗体23C6の染色パターンと似ている。これらモノクロ
ーナル抗体は種々のヒトメラノーマ細胞を認識し、破骨
細胞を強く認識し、ヒト破骨細胞腫MG−63細胞およびヒ
ト内皮細胞を弱く認識した。対照的に、モノクローナル
抗体10C4.1.3は、ヒト破骨細胞に対する強い結合および
ヒトミエローマ細胞の一つであるＭ−21に対する弱い結
合を示したが、他の細胞に対する結合は示さなかった。
これら結果は、10C4.1.3がヒト破骨細胞に独特のエピト
ープを認識することを示唆している。

実施例３競合免疫蛍光染色によるエピトープの決定 αｖβ３トランスフェクションした293−15D細胞（１
×10⁵細胞/100μｌ）を第一精製モノクローナル抗体（1
00μｌ）とともに氷上で30分間インキュベートし、２回
洗浄し、第二モノクローナル抗体であるFITC結合モノク
ローナル抗体23C6とともに30分間インキュベートした。
インキュベーションの終了時、細胞をCSB中で２回洗浄
し、CBS（0.5ml）中に再懸濁し、293−15D細胞上へのFI
TC結合モノクローナル抗体23C6の結合レベルを流動微小
蛍光測定（FACSCAN）により調べた。その結果を図３に
示す。パネルは以下の通りである：（3A）なし＋ FL−23C6 (陰影の部分は非染色細胞を示す) （3B） 23C6 ＋ FL−23C6 （3C） 9D4.9.1 ＋ FL−23C6 （3D） 9G2.1.3 ＋ FL−23C6 （3E） 10C4.1.3 ＋ FL−23C6 （3F） IgG ＋ FL−23C6 αｖβ３のα−鎖（CD51と呼ばれる）またはビトロネ
クチンレセプターのβ−鎖（CD61）を認識する幾つかの
モノクローナル抗体が記載されている（ネスビット（Ne
sbitt）ら、1991、"Leukocyte typing IV、1037頁）。
さらに最近の研究（ホートン、Int.J.Exp.Pathol.、71:
741［1990］）は、CD51のβエピトープを認識するモノ
クローナル抗体として分類されたモノクローナル抗体23
C6およびLM609が完全なαｖβ３複合体を認識するかも
しれないことを示した。それゆえ、αｖβ３複合体に結
合するモノクローナル抗体が23C6とは異なるエピトープ
を認識することを確認するため、100倍高レベルの非標
識モノクローナル抗体の存在下での293−15Dのフルオレ
セイン処理23C6による染色を調べ、FACSCANにより分析
した。図３に示す結果は、モノクローナル抗体9D4.9.1
および10C4.1.3はフルオレセイン処理23C6の15D細胞へ
の結合に対して全く干渉しないことを示した。同じ実験
において、同量の非標識23C6はＦ−23C6の結合を完全に
阻害したが、関連のないコントロールのモノクローナル
抗体は何ら影響を及ぼさなかった。それゆえ、少なくと
もこれら２つのモノクローナル抗体は23C6によって認識
されるエピトープとは異なるエピトープを確かに認識す
ることが確認された。対照的に、モノクローナル抗体9G
2.1.3は、高濃度にてＦ−23C6結合に若干の阻害効果を
示したが、Ｆ−23C6結合を完全に阻害することはできな
かった。それゆえ、モノクローナル抗体9G2.1.3はＦ−2
3C6によって認識されるエピトープとは異なるエピトー
プを認識するが、これらエピトープは指向が近接してい
ると思われる。LM609（チェレシュら、J.Biol.Chem.、2
62:17703〜17711［1987］）は23C6と同じエピトープを
認識することが報告されているので、本発明者らのモノ
クローナル抗体はモノクローナル抗体LM609によって認
識されるエピトープとは異なるエピトープを認識すると
結論される。

実施例４リガンド（フィブリノーゲンおよびビトロネクチン）へ
の293−15D細胞の結合に対するモノクローナル抗体によ
る阻害マイクロプレート（ヌンク、ブレイカパートC8マクシ
ソープ（Breakapart C8 Maxi Sorp））をフィブリノー
ゲンまたはビトロネクチン（100μl/ウエル、10μg/m
l）で４℃にて一夜コーティングした。PBS中で３回洗浄
した後、プレートをPBS中の１％BSAで１時間ブロック
し、ついで種々の濃度のモノクローナル抗体とともに30
分間インキュベートし、ついで⁵¹Cr標識した293−15D細
胞（100ml）を加えた。プレートを600rpmにて２分間遠
心分離し、37℃で90分間インキュベートした。インキュ
ベーションの終了時にプレートを３回洗浄し、リガンド
に結合した⁵¹Cr標識293−15D細胞をガンマカウンターで
カウントした。αｖβ３を発現する⁵¹Cr標識293−15Dト
ランスフェクション体の調製は以下のようにして行っ
た。10％FCS、0.1％グルコースおよび2mMグルタミンを
含有するF12/DMEM中で細胞を40時間増殖させ、PBS中の1
0mM EDTAで２分間処理することによって回収し、PBS中
で２回洗浄し、FCSを含有しない培地中に５×10⁷細胞/m
lとなるように再懸濁した。ついで、293−15D細胞（0.5
ml）を250mCi⁵¹Crとともに37℃にて１時間インキュベー
トした。インキュベーション終了時にF12/DMEM培地中で
３回洗浄することによって過剰の未結合⁵¹Crを除き、FC
Sを含有しない培地中に６×10⁵細胞/mlとなるように再
懸濁した。図4A−Ｂはその結果を示す。

図４の上のパネルは、種々の濃度のモノクローナル抗
体の存在下でフィブリノーゲンコーティングしたウエル
への⁵¹Cr−293 15Dの結合を示す。３つのすべてのモノ
クローナル抗体が、フィブリノーゲンへの⁵¹Cr−293 15
Dの結合を非常に有効に阻害した。最も強い阻害はモノ
クローナル抗体9D4.9.1の場合に示された。下のパネル
は、ビトロネクチンをコーティングしたウエルへの⁵¹Cr
−293 15Dの結合を示す。試験した条件下で、9D4.9.1お
よび10C4.1.3はこの相互反応を阻害することができた
が、9G2.1.3および23C6はもしあったとしても非常に弱
い阻害を示した。一般に、αｖβ３トランスフェクショ
ンした細胞とビトロネクチンとの相互反応を阻害するこ
とは、αｖβ３トランスフェクションした細胞とフィブ
リノーゲンとの相互反応を阻害することに比べて一層困
難であった。

実施例５フィブリノーゲンおよびビトロネクチンへのαｖβ３イ
ンテグリンの結合に対するモノクローナル抗体による阻
害マイクロタイタープレートを精製フィブリノーゲンま
たはビトロネクチン（100μl/ウエル、10μg/ml）で４
℃にて一夜コーティングした。PBS中で３回洗浄した
後、プレートを１％BSAで室温にて１時間ブロックし
た。PBS中でプレートを洗浄した後、種々の濃度のモノ
クローナル抗体とともに氷上で30分間プレインキュベー
トした⁵¹Cr−293−15D細胞をリガンドをコーティングし
たプレートに移した。ついで、プレートを600rpmにて２
分間遠心分離し、37℃にて90分間インキュベートした。
インキュベーションの終了時、プレートをPBS中で３回
洗浄し、リガンドに結合した⁵¹Cr標識293−15D細胞をガ
ンマカウンターによりカウントした。得られた結果（実
施例４に示す結果と似ている）を図5aおよび5bに示す。

実施例６ヒト組織および骨インプリントの凍結切片の組織化学的
染色ヒト破骨細胞腫瘍およびヒト胎児四肢骨（妊娠14
週）、新生ウサギおよびラットの骨、ニワトリ胚の骨お
よび成体アカシカの枝角からの骨インプリント（imprin
ts）の凍結切片、およびヒト成人由来の以下の組織（肝
臓、腎臓、膵臓、直腸、腸骨、心臓、肺、胸腺、扁桃、
脾臓、胎盤、皮膚、子宮頚、臍帯、乳癌、悪性黒色腫、
末梢血および骨髄単核細胞の塗抹標本）からの凍結切片
を記載に従って調製した［ホートンら、Cancer Res.4
5、5663〜5669（1985）］。これらを空気乾燥し、アセ
トン中に室温にて10分間固定し、使用時まで−20℃にて
貯蔵した。スライドを室温とし、PBS中で再び水和さ
せ、ついで精製モノクローナル抗体（１μｇ）を含有す
る１％FCS/PBS（150μｌ）とともに１時間インキュベー
トした。１％FCS/PBS中で洗浄した後、スライドをビオ
チン化抗マウスIgと、ついでアビジン−ビオチン−西洋
ワサビペルオキシダーゼ複合体とともに順番に製造業者
の推奨する希釈にて（ベクター・ラブ（Vector Lab）、
バーリンゲーム、カリフォルニア州）１時間インキュベ
ートした。さらに洗浄した後、結合したペルオキシダー
ゼをpBS中に0.07％H₂O₂を含有するジアミノベンジジン
テトラヒドロクロライド（オーガノン・テクニナ（Orga
non Teknina Corp.）、ダーハム、ノースカロライナ
州）（0.1mg/ml）中で発色させ、0.5％メチルグリーン
で５分間対比染色した。ついで、スライドを等級アルコ
ール中で脱水し、ついでキシレン中で清澄化させ、顕微
鏡観察のため積載台（permountant）上に積載した（フ
ィッシャー・サイエンティフィック（Fisher Scientifi
c Co.）、サンフランシスコ、カリフォルニア州）。

図６は、モノクローナル抗体10C4.1.3を用いたヒト骨
インプリントからの多核破骨細胞および骨巨細胞腫瘍の
凍結切片の明瞭な膜染色を示す。コントロールのモノク
ローナル抗体は染色を示さなかった。モノクローナル抗
体9D4.9.1および9G2.1.3はモノクローナル抗体10C4.1.3
と類似の染色パターンを示した。いずれのモノクローナ
ル抗体も、従来のホルマリン−固体およびパラフィン−
包埋組織切片において破骨細胞ビトロネクチンレセプタ
ーを認識しなかった。

本発明者らは、ヒトと対比してラット、ウサギ、ニワ
トリおよびシカ由来の骨インプリント中に存在する破骨
細胞へのこれらモノクローナル抗体の結合を調べた。

骨インプリントをモノクローナル抗体、ついでＦ−ヤ
ギ抗マウスIgGを用いて染色した。蛍光染色のレベルを
蛍光顕微鏡を用いて調べ、弱い（＋）、中位（＋＋）お
よび強い（＋＋＋）または不在（−）として等級分けし
た。

モノクローナル抗体9G2.1.3は、ヒトに加えてウサ
ギ、ニワトリ、シカからの破骨細胞を認識する。この分
布は23C6の場合に認められる分布と似ている（ホートン
ら、前掲書）。対照的にモノクローナル抗体9D4.9.1お
よび10C4.1.3はヒト破骨細胞のみを認識した。現在ま
で、いかなるαｖβ３複合体特異的モノクローナル抗体
もそのような種特異性を示していない。

上記３つのモノクローナル抗体によって認識される抗
原の分布を、上記正常成体および胎児起源の凍結切片上
の免疫組織化学により分析した（データは示していな
い）。モノクローナル抗体9D4.9.1は、試験したすべて
の組織において血小板（および骨髄中の巨核球）を強く
染色した。加えて、すべての組織において血管内皮が種
々、弱く染色された。モノクローナル抗体9G2.1.3もま
た血管内皮を染色したが、血小板および巨核球とは反応
しなかった。両抗体とも、腎臓（糸球体、細管）、肝シ
ヌソイド、直腸および回腸平滑筋、胎盤（栄養膜細胞層
および合胞体層）および悪性黒色腫における腫瘍性メラ
ノサイトを染色した。対照的に、モノクローナル抗体10
C4.1.3はモノクローナル抗体9G2.1.3によって認識され
た組織において染色しないかまたははるかに弱い反応を
示した。たとえば、モノクローナル抗体10C4.1.3は消化
管の平滑筋または胎盤を染色しなかった。

ヒト黒色腫細胞、骨肉腫細胞および正常ヒト臍帯静脈
内皮細胞（HUVEC）を含む種々の細胞株へのこれらモノ
クローナル抗体の結合を流動微小蛍光測定によって調べ
ることにより、これらモノクローナル抗体により認識さ
れる抗原特異性をさらに検討した。モノクローナル抗体
9D4.9.1および9G2.1.3は種々のヒト黒色腫細胞に強く結
合し、MG−63ヒト骨肉腫細胞およびHUVECには一層弱く
結合した。対照的に、モノクローナル抗体10C4.1.3はヒ
ト黒色腫細胞株のうちの一つであるＭ−21にのみ弱く結
合した。これらの結果から、10C4.1.3が新規な抗原エピ
トープを認識することがさらに確認される。

以下の抗体産生ハイブリドーマをアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション、12301パークレインドラ
イブ、ロックビル、米国（ATCC）に寄託してある：抗体 ATCC受託番号寄託日 10C4.1.3 HB11029 1992年４月29日 9G2.1.3 HB11030 1992年４月29日 9D4.9.1 HB11031 1992年４月29日これら寄託は、特許手続き上の微生物の委託の国際的
承認に関するブタペスト条約の条項およびその規則下に
行った（ブダペスト条約）。このことは、生存微生物株
の維持を、寄託の日から30年間または特許の実施できる
期間または最後の請求後の５年間または特許の有効期間
のうちいずれか長い期間保証する。該微生物は、ブダペ
スト条約の約定下に、ならびにジェネンテクとATCCとの
間の契約（当該米国特許の発行または米国または外国特
許出願の公開のうちいずいれか早いときから該寄託微生
物株の継代物の永久的かつ非制限的な入手可能性を保証
し、35USC§122およびそれに従う特許商標長官の規則に
従って米国特許商標長官によって決定された権利を有す
る者に該継代物の入手可能性を保証する）に基づいて、
ATCCより入手可能である。

本出願の譲り受け人は、寄託されている微生物株が適
当な条件下で培養されているときに死亡もしくは紛失も
しくは破壊された場合には、通知によって同じ微生物株
の生存株で速やかに取り替えることに同意した。寄託し
た株の入手可能性は、その特許法に従って政府の権限下
に付与された権利を侵害するような該特許の実施を許諾
するものとして解釈されるべきではない。

ヨーロッパ特許が求められている指定国に関しては、
寄託微生物の試料は、ヨーロッパ特許の登録の公告の発
行までまたは該出願が拒絶されもしくは取り下げられも
しくは取り下げられたとみなされるまでは、該試料を請
求する者によって指名された専門家へのそのような試料
の供給によってのみ入手可能とされるであろう（EPC規
則28（４））。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 ＣＣ１２Ｒ 1:91）微生物の受託番号ＡＴＣＣＨＢ１１０３０微生物の受託番号ＡＴＣＣＨＢ１１０３１ (72)発明者ホートン，マイケル・エイイギリス国シービー11・３エックスジェイ・エセックス、エヌアール・サフロン・ウオールデン、クエンドン、ケンブリッジ・ロード、ザ・プライオリー（番地の表示なし) (72)発明者ボダリー、サラ・シーアメリカ合衆国カリフォルニア94107、サン・フランシスコ、トゥエンティース・ストリート1715番 (72)発明者チャンタラパイ、アナンアメリカ合衆国カリフォルニア94017、コルマ、エリス・ドライブ826番 (56)参考文献米国特許5057604（ＵＳ，Ａ) ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｏｎｅａｎｄＭｉｎｅｒａｌＲｅｓｅｒｃｈ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．３，ｐ．345− 351（Ｍａｒｃｈ 1992) Ｗ．Ｋｎａｐｐｅｔａｌ，”ＬｅｕｃｏｃｙｔｅＴｙｐｉｎｇＩＶ, ＷｈｉｔｅＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＡｎｔｉｇｅｎｓ”，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，1989年，ｐ．1037, Ｐ５．７ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 16/28 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】10C4.1.3（ATCC受託番号HB11029）、9G2.
1.3（ATCC受託番号HB11030）または9D4.9.1（ATCC受託
番号HB11031）よりなる群から選ばれたモノクローナル
抗体により認識されるものと同じヒトαｖβ３エピトー
プに結合することのできる抗αｖβ３モノクローナル抗
体。
【請求項２】（１）ヒト破骨細胞に結合することがで
き、かつ（２）ヒトαｖβ３発現細胞のフィブリノーゲ
ンへの結合を阻害することができる、請求項１に記載の
モノクローナル抗体。
【請求項３】ヒトαｖβ３発現細胞のビトロネクチンへ
の結合を阻害することができる、請求項２に記載のモノ
クローナル抗体。
【請求項４】ヒトαｖβ３複合体を認識する、請求項２
に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】モノクローナル抗体10C4.1.3または9G2.1.
3によって認識されるエピトープに結合する、請求項４
に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】該αｖβ３分子のβ３部分を認識する、請
求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】モノクローナル抗体9D4.9.1によって認識
されるエピトープに結合し、モノクローナル抗体9D4.9.
1に等しいかまたはそれ以上のヒトαｖβ３に対する親
和性を有する、請求項６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】II b III aに実質的に結合することができ
ない、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】ヒト破骨細胞以外のαｖβ３発現細胞には
実質的に結合することができない、請求項２に記載のモ
ノクローナル抗体。
【請求項１０】ヒト破骨細胞上のαｖβ３には結合する
ことができるがヒト臍帯静脈内皮上のαｖβ３には実質
的に結合することができない、請求項９に記載のモノク
ローナル抗体。
【請求項１１】検出可能なマーカーで標識してある請求
項10に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】水不溶性マトリックスに共有結合させて
ある請求項10に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】２特異的である請求項10に記載のモノク
ローナル抗体。
【請求項１４】抗体がヒトαｖβ３およびヒトＴ−細胞
マーカーに対して特異的である請求項13に記載のモノク
ローナル抗体。
【請求項１５】ヒトＴ−細胞マーカーがCD3、CD4、CD
8、CD18、CD11a、CD11bまたはCD11cである、請求項14に
記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】免疫グロブリンエフェクター機能を有す
るFcドメインを含む請求項10に記載のモノクローナル抗
体。
【請求項１７】一価である請求項10に記載のモノクロー
ナル抗体。
【請求項１８】IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgMのFcドメ
インを含む、請求項10に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１９】該抗体を細胞毒素に結合してある請求項
10に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】請求項１に記載のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項２１】請求項５に記載のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項２２】請求項７に記載のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項２３】請求項９に記載のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項２４】アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション受託番号ATCC HB11029として寄託されている
ハイブリドーマ細胞（以下、10C4.1.3という）。
【請求項２５】アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション受託番号ATCC HB11030として寄託されている
ハイブリドーマ細胞（以下、9G2.1.3という）。
【請求項２６】アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション受託番号ATCC HB11031として寄託されている
ハイブリドーマ細胞（以下、9D4.9.1という）。
【請求項２７】請求項24に記載のハイブリドーマ細胞に
よって産生されたモノクローナル抗体。
【請求項２８】請求項25に記載のハイブリドーマ細胞に
よって産生されたモノクローナル抗体。
【請求項２９】請求項26に記載のハイブリドーマ細胞に
よって産生されたモノクローナル抗体。
【請求項３０】（ａ）被験試料を請求項１に記載のモノ
クローナル抗体と接触させ、ついで（ｂ）該モノクローナル抗体に結合した被験試料中のα
ｖβ３の量を決定することを特徴とするイムノアッセ
イ。