DE102007057583A1

DE102007057583A1 - Waschmittel mit stabilisierten Enzymen

Info

Publication number: DE102007057583A1
Application number: DE102007057583A
Authority: DE
Inventors: Robin Dr. Ghosh; Andreas Dr. Michels; Cornelius Dr. Bessler; Daniela Lowis
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2007-11-28
Filing date: 2007-11-28
Publication date: 2009-06-04
Also published as: EP2220204A1; US20100227789A1; US8466098B2; EP2220204B1; WO2009068501A1

Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend Phosphatverbindungen mit aliphatischen und/oder aromatischen Resten, die als Enzymstabilisatoren wirken. Weitere Gegenstände sind die Verwendung solcher Verbindungen als reversible Inhibitoren von Enzymen, insbesondere proteolytischen Enzymen, und somit als Stabilisatoren in Wasch- oder Reinigungsmitteln sowie weitere in einem Zusammenhang hiermit stehende Verfahren und Verwendungen.

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend Phosphatverbindungen mit aliphatischen und/oder aromatischen Resten, die als Enzymstabilisatoren wirken.
Der Einsatz von Enzymen in Wasch- und Reinigungsmitteln ist im Stand der Technik etabliert. Sie dienen dazu, das Leistungsspektrum der betreffenden Mittel entsprechend ihren speziellen Aktivitäten zu erweitern. Hierzu gehören insbesondere hydrolytische Enzyme wie Proteasen, Amylasen, Lipasen und Cellulasen. Die ersten drei genannten hydrolysieren Proteine, Stärke und Fette und tragen somit unmittelbar zur Schmutzentfernung bei. Cellulasen werden insbesondere wegen ihrer Gewebewirkung eingesetzt. Eine weitere Gruppe von Wasch- und Reinigungsmittelenzymen sind oxidative Enzyme, insbesondere Oxidasen, die ggf. im Zusammenspiel mit anderen Komponenten vorzugsweise dazu dienen, Anschmutzungen zu bleichen oder die bleichenden Agentien in situ zu erzeugen. Neben diesen Enzymen, die einer fortwährenden Optimierung unterworfen werden, werden laufend weitere Enzyme für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln bereitgestellt, um insbesondere spezielle Anschmutzungen optimal angehen zu können, wie beispielsweise Pektinasen, β-Glucanasen, Mannanasen oder weitere Hemicellulasen zur Hydrolyse insbesondere spezieller pflanzlicher Polymere.
Die am längsten etablierten und in praktisch allen modernen, leistungsfähigen Wasch- und Reinigungsmitteln enthaltenen Enzyme sind Proteasen und hierunter insbesondere Serin-Proteasen, zu denen auch die Subtilasen zählen. Sie bewirken den Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. Allerdings hydrolysieren sie auch sich selbst (Autoproteolyse) und alle anderen in den betreffenden Mitteln enthaltenen Proteine, d. h. insbesondere auch weitere Enzyme. Dies geschieht besonders während des Reinigungsvorgangs, d. h. in der wässrigen Waschflotte, wenn vergleichsweise günstige Reaktionsbedingungen vorliegen. Dies geschieht aber auch während der Lagerung der betreffenden Mittel, weshalb mit zunehmender Lagerdauer immer auch ein gewisser Verlust von Enzymaktivitäten, beispielsweise der Proteaseaktivität, einhergeht. In der Regel ist die Enzymaktivität in dem Wasch- oder Reinigungsmittel umgekehrt proportional zur Lagerdauer, mit fortschreitender Lagerdauer nimmt die Enzymaktivität immer weiter ab. Besonders problematisch ist dies in gelförmigen oder flüssigen und insbesondere in wasserhaltigen Rezepturen, weil in diesem mit dem enthaltenen Wasser sowohl das Reaktionsmedium als auch das Hydrolyse-Reagenz zur Verfügung stehen.
Ein Ziel bei der Entwicklung von Wasch- und Reinigungsmitteln besteht somit darin, die enthaltenen Enzyme besonders während der Lagerung zu stabilisieren. Darunter wird der Schutz gegen verschiedene ungünstige Einflüsse verstanden, wie beispielsweise gegen Denaturierung oder Zerfall durch physikalische Einflüsse oder Oxidation. Ein Schwerpunkt dieser Entwicklungen besteht im Schutz der enthaltenen Proteine und/oder Enzyme gegen proteolytische Spaltung. Diese kann durch den Aufbau physikalischer Barrieren erfolgen, etwa durch Verkapselung der Enzyme in speziellen Enzymgranulaten oder durch Konfektionierung der Mittel in Zwei- oder Mehrkammersystemen. Ein anderer vielfach beschrittener Weg besteht darin, den Mitteln chemische Verbindungen zuzusetzen, die die Proteasen inhibieren und somit insgesamt als Stabilisatoren für die Proteasen und die anderen enthaltenen Proteine und Enzyme wirken. Es muss sich dabei um reversible Proteaseinhibitoren handeln, da die Proteaseaktivität nur vorübergehend, insbesondere während der Lagerung, nicht aber mehr während des Reinigungsprozesses unterbunden werden soll.
Als reversible Proteaseinhibitoren sind im Stand der Technik Polyole, insbesondere Glycerin und 1,2-Propylenglycol, Benzamidin-Hydrochlorid, Borax, Borsäuren, Boronsäuren oder deren Salze oder Ester etabliert. Darunter sind vor allem Derivate mit aromatischen Gruppen, etwa ortho-, meta- oder para-substituierte Phenylboronsäuren zu erwähnen, insbesondere 4-Formylphenyl-Boronsäure (4-FPBA) beziehungsweise die Salze oder Ester der genannten Verbindungen. Ein besonders guter Schutz ergibt sich, wenn Borsäurederivate zusammen mit Polyolen eingesetzt werden, da sie dann einen das Enzym stabilisierenden Komplex bilden können. Auch Peptidaldehyde, das heißt Oligopeptide mit reduziertem C-Terminus, insbesondere solche aus 2 bis 50 Monomeren, sind zu diesem Zweck beschrieben. Zu den peptidischen reversiblen Proteaseinhibitoren gehören unter anderem Ovomucoid und Leupeptin. Auch spezifische, reversible Peptid-Inhibitoren sowie Fusionsproteine aus Proteasen und spezifischen Peptid-Inhibitoren werden hierfür eingesetzt.
Polyole wie Glycerin und 1,2-Propylenglycol haben sich jedoch aufgrund ihrer hohen notwendigen Einsatzkonzentrationen als unvorteilhaft erwiesen, weil die übrigen Wirkstoffe der betreffenden Mittel damit nur noch in entsprechend geringeren Anteilen enthalten sein können.
Unter den bereits in vergleichsweise niedriger Konzentration wirksamen Serin-Protease-Inhibitoren nehmen Borsäurederivate eine herausragende Stellung ein. Beispielsweise offenbart die internationale Patentanmeldung WO 96/21716 A1 dass als Proteaseinhibitoren wirkende Borsäurederivate auch geeignet sind, Enzyme in Wasch- und Reinigungsmitteln zu stabilisieren. Eine Auswahl besonders leistungsfähiger Stabilisatoren sind offenbart in der internationalen Patentanmeldung WO 96/41859 A1 .
Unabhängig von ihrer stabilisierenden Wirkung weisen die Borsäurederivate jedoch einen entscheidenden Nachteil auf. Viele Borsäurederivate, wie beispielsweise Borat, bilden mit einigen anderen Wasch- bzw. Reinigungsmittelinhaltsstoffen unerwünschte Nebenprodukte, so dass diese in den betreffenden Mitteln nicht mehr für den erwünschten Reinigungszweck zur Verfügung stehen oder sogar als Verunreinigung auf dem Waschgut zurückbleiben.
Es stellte sich somit die Aufgabe, borfreie chemische Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die als Enzyminhibitoren wirken und somit als Enzymstabilisatoren in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet sind. Mit dieser Aufgabe ist als weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung verbunden, borfreie chemische Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die als Proteaseinhibitoren wirken und somit als Stabilisatoren für Proteasen und/oder auch für andere Enzyme in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet sind.
Hierbei war der Einsatz in insgesamt flüssigen, gelförmigen oder pastösen Wasch- und Reinigungsmitteln von besonderem Interesse, und darunter insbesondere in solchen, die Wasser enthalten.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Wasch- oder Reinigungsmittel, enthaltend ein Enzym und eine Verbindung der allgemeinen Strukturformel
in der X ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist und Y ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass solche Verbindungen die in den erfindungsgemäßen Wasch- und Reinigungsmitteln enthaltenen Enzyme, beispielsweise insbesondere Proteasen, überraschend effektiv stabilisieren, und dies im Vergleich mit Borat als Enzymstabilisator bereits bei einer niedrigeren oder gleich hoher Konzentration. Diese Verbindungen schaffen damit Freiraum für Formulierung von Wasch- und Reinigungsmitteln durch die Möglichkeit, Enzymstabilisatoren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind wie beispielsweise 1,2-Propylenglykol oder Borverbindungen (zum Beispiel Borste und andere Borsäurederivate oder 4-FPBA), in geringerer Konzentration einsetzen zu können oder vollständig auf diese zu verzichten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, dass die Reste X und Y der Verbindung identisch sind, wobei der Rest X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: -CH₂-CH₂-CH₃, Phenyl, und der Rest Y ebenfalls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: -CH₂-CH₂-CH₃, Phenyl. Eine besonders bevorzugte Verbindung weist daher als Rest X und als Rest Y eine: -CH₂-CH₂-CH₃-Gruppe auf. Eine weitere besonders bevorzugte Verbindung weist demnach als Rest X und als Rest Y eine Phenylgruppe auf. Jedoch stellen alle Wasch- und Reinigungsmittel mit Verbindungen der oben angegebenen allgemeinen Strukturformel weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar, sofern die Reste X und Y jeweils aliphatisch oder aromatisch sind und diese Verbindung eine Stabilisierung eines Enzyms in dem Wasch- oder Reinigungsmittel bewirkt. Ebenso ist es möglich, dass der Rest X aliphatisch und der Rest Y aromatisch ist oder der Rest X aromatisch ist und der Rest Y aliphatisch ist.
Unter einem Wasch- oder Reinigungsmittel sind erfindungsgemäß alle Mittel zu verstehen, die sich zum Waschen oder Reinigen von insbesondere Textilien und/oder festen Oberflächen eignen.
Unter einem Enzym ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein Protein zu verstehen, das eine bestimmte biokatalytische Funktion ausübt. Unter Protease im Sinne der vorliegenden Anmeldung wird ein Enzym verstanden, welches die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert und dadurch in der Lage ist, Peptide oder Proteine zu spalten.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die genannten Verbindungen in allen protonierten und/oder deprotonierten Formen. Gegebenenfalls sind entgegengesetzt geladene Kationen (H⁺, Na⁺, K⁺ oder ähnliche) bzw. Anionen (Cl^–, Br^–, Formiat, Acetat etc.) anwesend. In all diesen Formen kann die vorliegende Erfindung verwirklicht werden. Entscheidend ist jeweils die Wechselwirkung zwischen der erfindungsrelevanten Verbindung, die das Enzym stabilisiert und dem erfindungsgemäß zu stabilisierenden Enzym.
Ohne an diese Theorie gebunden sein zu müssen wird erfindungsgemäß davon ausgegangen, daß die erfindungsrelevanten Verbindungen, d. h. der stabilisierenden Verbindungen, mit dem zu stabilisierenden Enzym einen Komplex bilden. Voraussichtlich erfolgt eine nicht-kovalente Bindung der stabilisierenden Verbindung in oder an der Substratbindungstasche des Enzyms. Auf diese Weise wird das aktive Zentrum des Enzyms durch eine nicht durch dieses Enzym hydrolysierbare Verbindung blockiert und steht daher nicht mehr für die Katalyse anderer zugegener Substrate zur Verfügung. Die stabilisierende Wirkung der Verbindung erfolgt daher durch eine Inhibition des Enzyms. Hierbei handelt es sich um eine reversible Bindung, d. h. um ein Gleichgewicht zwischen Assoziation und Dissoziation. Der Gleichgewichtskoeffizient dieser Reaktion wird als Inhibitionskonstante oder K_i bezeichnet. Auf Grund der reversiblen Bindung der stabilisierenden Verbindung an das Enzym ist das Enzym in dem Wasch- bzw. Reinigungsmittel inhibiert und damit stabilisiert, wohingegen die Komplexe durch die veränderten Bedingungen beim Einsatz des Wasch- und Reinigungsmittels verstärkt dissoziieren, beispielsweise durch die Verdünnung des Wasch- bzw. Reinigungsmittels in der Wasch- bzw. Reinigungslösung, durch das Vorhandensein weiterer und/oder höheraffiner Enzymsubstrate oder durch die Veränderung des pH-Wertes in der Wasch- bzw. Reinigungslösung. Die Begriffe „stabilisierend" und „inhibierend" bzw. „hemmend" sowie „Stabilisator" und „Inhibitor" bzw. „Hemmstoff" sind in der vorliegenden Patentanmeldung daher als gleichbedeutend zu betrachten.
Da der Gleichgewichtskoeffizient bzw. die Inhibitionskonstante K_i wie beschrieben für die Funktionalität der Verbindung als Enzymstabilisator von wesentlicher Bedeutung ist, stellt einen weiteren Gegenstand der Erfindung ein Wasch- oder Reinigungsmittel dar, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Verbindung bezüglich des Enzyms eine Inhibitionskonstante (K_i) von 0,01 bis 10 mM aufweist. In einer weiter bevorzugen Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, dass die stabilisierende Verbindung bezüglich des Enzyms eine Inhibitionskonstante (K_i) von 0,03 bis 5 mM aufweist.
Die Inhibitionskonstante K_i kann auf folgende Weise ermittelt werden: Für die Charakterisierung eines reversiblen Inhibitors der enzymatischen Aktivität ist die Inhibitionskonstante K_i eine charakteristische und entscheidende Größe. K_i beschreibt das Gleichgewicht zwischen Enzym, Inhibitor und Enzym-Inhibitor Komplex für eine reversible Bindung. Der Enzym-Inhibitor Komplex ist dabei katalytisch nicht aktiv und inhibiert die Reaktion durch Herabsetzung der Konzentration von freiem Enzym, das noch zur Bindung von Substrat zur Verfügung steht. Der K_i ist dementsprechend definiert als: Ki = [I] × [E]/[EI]
Darin bedeuten [E], [I] und [EI] die jeweiligen molaren Gleichgewichtskonzentrationen von Enzym (E), Inhibitor (I) und dem Enzym-Inhibitor-Komplex (EI). Dieser Definition entsprechend ist eine Substanz mit einem kleinen K_i unter den jeweiligen Testbedingungen ein guter Inhibitor.
Die Bestimmung des K_i erfolgt auf der Grundlage des Aktivitätstests der Protease in Anwesenheit des entsprechenden Inhibitors. Über die im Stand der Technik etablierte und dem Fachmann bekannte Michaelis-Menten-Kinetik (Leonor Michaelis, Maud Menten (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung, Biochem. Z. 49:333–369) werden die enzymatischen Parameter K_m, und k_cat in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen des Inhibitors bestimmt. Für eine Michaelis-Menten-Kinetik gilt vereinfacht:
Hierin bedeuten:

E:: Enzym
S:: Substrat
ES:: Enzym-Substrat-Komplex
P:: Produkt
k₁, k_–1, k₂:: Geschwindigkeitskonstanten

Hierin ist k₂ ein Maß der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung (Vmax), auch Wechselzahl, molekulare Aktivität, „turnover number" oder kcat genannt (kcat = Vmax/[Eo], wobei [Eo] die Ausgangskonzentration des Enzyms ist). Die Michaeliskonstante (d. h. die Substratkonzentration, die bei der Halbsättigung vorliegt, bei der die Umsatzgeschwindigkeit also v = Vmax/2 beträgt), ergibt sich zu
K_m = k_–1/k₁ (Michaelis-Menten-Fall, gegeben wenn k2 << k1) oder bzw. allgemeiner zu
K_m = k_–1 + k₂/k₁ (Briggs-Haldane-Situation, gegeben für den Fall, dass k2 gegenüber k1 nicht vernachlässigt werden kann).
Die Sättigungsfunktion eines "Michaelis-Menten Enzyms" ergibt sich unter Verwendung der Parameter Km und Vmax wie folgt:
Hierin bedeutet:

v:: Bildungsgeschwindigkeit von P (v = "Geschwindigkeit") [mol I–1 s–1]
vmax:: maximale Geschwindigkeit [mol I–1 s–1]
Km:: Michaelis-Menten-Konstante [mol I–1]
[S]:: Substratkonzentration [mol I–1]

Durch die Bestimmung der Anfangskatalyse-Rate (v_Anf.) – für Proteasen der Anfangshydrolyse-Rate – bei verschiedenen Substratkonzentrationen [S] und Einpassung der experimentellen Daten in nachstehende Gleichung 1 wird die Inhibitionskonstante K_i erhalten. VAnf. = kcat × [S] × E0/(Km × (1 + [I]/Ki) + S) Gleichung 1
Hierin steht [I] wiederum für die Inhibitor-Konzentration.
Alternativ kann K_i unter Verwendung der Cheng-Prusoff-Gleichung (Gleichung 2, Cheng Y., Prusoff W. H. (1973) Biochem.Pharmacol. 22, 3099–3108) über den IC₅₀-Wert bestimmt werden. Die Bestimmung des IC₅₀-Werts erfolgt über die Bestimmung der katalytischen Aktivität an einem Substrat in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen des Inhibitors und der Anpassung der experimentellen Daten an eine sigmoidale Dosis-Wirkungs-Gleichung mit variabler Steigung (Pseudo-Hill-Steigungen). Es handelt sich dabei um die Inhibitor-Konzentration, die nötig ist, um eine 50%ige Inhibition zu erreichen.
K_i ergibt sich damit aus folgender Gleichung 2: Ki = IC50/(1 + [S]/Kd) Gleichung 2
Darin bedeuten [S] die Substratkonzentration im Test und K_d die Dissoziationskonstante für das Substrat, die bei der IC₅₀-Konzentration des Inhibitors als identisch mit Km für das Substrat gesetzt werden kann.
Die auf diese Weise bestimmbaren K_i-Werte kennzeichnen die Verbindung in Bezug auf das eingesetzte Enzym. In Beispiel 1 wurde die Restaktivität einer Protease, nämlich die Bacillus lentus-Alkalische Protease F49 (gemäß WO 95/23221 A1 ) in Gegenwart eines Inhibitors bestimmt. Da es sich dabei um eine typische Subtilisin-Protease handelt, sind die mit diesem Enzym erhaltenen Werte auch für andere Serin-Proteasen, insbesondere andere Subtilisin-Proteasen typisch. Der exakte Wert für ein interessierendes Enzym muss im Zweifel anhand des jeweils konkreten Enzyms ermittelt werden.
Wie vorstehend bereits erläutert ist ein Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen, die in Wasch- und Reinigungsmitteln die Stabilisierung mindestens eines Enzyms bewirken, gegenüber dem Stand der Technik, dass sie günstige Inhibitionskonstanten bezüglich der in Wasch- und Reinigungsmitteln einzusetzenden Enzyme aufweisen. Dies gilt insbesondere für Proteasen, aber auch für andere Enzyme. Eine weitgehend reversible Bindung der Inhibitoren ist somit gewährleistet, d. h. sie gehen nicht zu feste und nicht zu lose vorübergehende Wechselwirkungen mit dem Enzym ein. Vorteilhafterweise liegt damit während der Lagerung der Wasch- und Reinigungsmittel der Großteil der Enzyme in Form eines Enzym-Inhibitor-Komplexes vor. Die Enzyme, insbesondere Proteasen, und ggf. weitere vorhandene Proteine werden auf diese Weise geschützt, beispielsweise gegenüber katalytischen, insbesondere hydrolytischen Aktivitäten dieser Enzyme selbst. Im Falle von Proteasen sind diese daher vor einer Proteolyse durch diese Enzyme geschützt, d. h. sie sind gegen Proteolyse stabilisiert. Im Augenblick der Verdünnung des erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittels mit Wasser zur Herstellung einer wäßrigen Wasch- bzw. Reinigungslösung während des Reinigungsvorgangs wird das Bindungsgleichgewicht in Richtung Dissoziation verschoben, so dass sich der Komplex auflöst und der Großteil der erfindungsrelevanten Enzyme katalytisch aktiv wird. Es handelt sich bei den erfindungsrelevanten Verbindungen also gemäß der formulierten Aufgabe um funktionierende Enzym-Inhibitoren und somit um Enzym-Stabilisatoren für Wasch- und Reinigungsmittel.
Ferner weisen erfindungsgemäße Verbindungen im Vergleich mit etablierten Enzymstabilisatoren aus dem Stand der Technik, beispielsweise gegenüber Polyolen, einen geringen Volumenbedarf auf.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsrelevanten Verbindungen gegenüber dem Stand der Technik besteht darin, daß sie als Elemente lediglich Kohlenstoff (C), Wasserstoff (H), Phosphor (P) und Sauerstoff (O) aufweisen und insbesondere frei von Bor sind. Sie bilden somit nicht die unerwünschten, auf Bor zurückzuführenden Nebenprodukte mit anderen Wasch- oder Reinigungsmittelinhaltsstoffen.
Ferner verfügen sie über eine gute Wasserlöslichkeit, so dass sie in entsprechende Wasch- und Reinigungsmittel einfach eingearbeitet werden können. Weiterhin wird dadruch ein Ausfällen während der Lagerung vermindert bzw. ganz vermieden.
Grundsätzlich wirken die genannten Verbindungen vermutlich deshalb als reversible Inhibitoren, weil sie dem Substrat der Enzyme, betreffend Proteasen insbesondere hinsichtlich der zu hydrolysierenden Säureamidbindung, strukturell gleichen. Umgekehrt lassen sich also die Enzyme, bevorzugt proteolytische Enzyme, durch die erfindungsrelevanten Verbindungen inhibieren. Dies gilt insbesondere für Serin-Proteasen, wie anhand der Beispiele zur vorliegenden Anmeldung mit der positiven Wirkung der beschriebenen Verbindungen anhand von Subtilisinen gezeigt ist.
In erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmitteln, die in einer bevorzugten Ausführung in überwiegend fester Form vorliegen und in einer zweiten Ausführung in überwiegend flüssiger, pastöser oder Gelform vorliegen, ist das Enzym insbesondere in einem Gehalt von 2 μg bis 20 mg pro g des Mittels, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg pro g des Mittels, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg pro g des Mittels, ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 μg des Mittels enthalten.
Die Verbindung, d. h. der Stabilisator, ist in erfindungsgemäßen Mitteln insbesondere in einem Gehalt bis zu 50 mg pro g des Mittels, vorzugsweise bis zu 10 mg besonders bevorzugt bis zu 7 mg ganz besonders bevorzugt bis zu 5 mg pro g des Mittels enthalten. Weiterhin ist bevorzugt, dass die in dem Mittel enthaltene Menge der Verbindung, d. h. der das Enzym stabilisierenden Verbindung, bezogen auf das stabilisierte Enzym von 0,01 bis 100 × der Inhibitionskonstante K_i, vorzugsweise 0,1 bis 10 × K_i, besonders bevorzugt 1 bis 5 × K_i, beträgt.
Vorzugsweise beträgt das molare Verhältnis der stabilisierenden Verbindung zum Enzym 1:1 bis 1.000:1, insbesondere von 1:1 bis 500:1, besonders bevorzugt von 1:1 bis 100:1, ganz besonders bevorzugt von 1:1 bis 20:1.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung bilden Wasch- oder Reinigungsmittel, die dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, β-Glucosidase, Carrageenase, Oxidase, Oxidoreduktase, Lipase, Esterase oder Mischungen hiervon. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Protease, bevorzugt eine Serinprotease, weiter bevorzugt eine Subtilase und besonders bevorzugt ein Subtilisin ist. Denn insbesondere für Wasch- und Reinigungsmittel oder allgemein Enzym enthaltende Kompositionen wie Enzymhochkonzentrate, die mindestens ein proteolytisches Enzym (Protease) beinhalten, ist die Lagerstabilität der Enzyme ein generelles Problem. Proteolytische Enzyme führen auf Grund ihrer enzymatischen Aktivität zur Hydrolyse von Proteinen wie zum Beispiel Enzymen und Peptiden, die in der Zusammensetzung enthalten sind, seien es andere Proteine bzw. Enzyme oder aber auch die Proteasen selbst. Eine Hydrolyse der Protease durch deren eigene proteolytische Aktivität wird als Autoproteolyse bezeichnet. Das Maß der Lagerstabilität von allen in einer Protein-/Enzymkomposition enthaltenen Proteinen/Enzymen ist damit insbesondere abhängig von der proteolytischen Aktivität einer Protease innerhalb dieser Komposition. Um die Lagerstabilität aller Enzyme einer solchen Komposition zu erhöhen ist es daher notwendig, gerade die proteolytische Aktivität der Protease während der Lagerzeit zu inhibieren. Dies geschieht im günstigsten Fall durch die Zugabe einer erfindungsgemäßen Verbindung, die für die in der Zusammensetzung enthaltene Protease einen spezifischen und reversiblen Inhibitor mit einer hohen Affinität zur Protease darstellt.
Beispiele für solche Proteasen sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase^® von der Firma Novozymes A/S, Bagsværd, Dänemark, erhältlich. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase^®, beziehungsweise Savinase^® von der Firma Novozymes vertrieben. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 leiten sich die unter der Bezeichnung BLAP^® geführten Protease-Varianten ab.
Weitere Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym^®, Relase^®, Everlase^®, Nafizym, Natalase^®, Kannase^® und Ovozymes^® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect^®, Purafect^®OxP und Properase^® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol^® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi^® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather^® und Protease P^® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass solche Proteasen besonders gut durch die erläuterten Verbindungen stabilisiert bzw. reversibel inhibiert werden. Zudem werden auch bestimmte Varianten von Proteasen, d. h. auch Varianten der genannten Proteasen, durch diese Verbindungen besonders vorteilhaft stabilisiert. Solche Protease-Varianten sind Teil der nachfolgend beschriebenen Erfindungsgegenstände.
Eine erfindungsgemäß stabilisierte beziehungsweise reversibel inhibierte Protease kann ein Wildtypenzym oder eine Protease-Variante sein. Unter Wildtypenzym ist zu verstehen, dass das Enzym in einem natürlich vorkommenden Organismus bzw. in einem natürlichen Habitat vorhanden ist aus diesem isoliert werden kann. Enzyme sind jedoch veränderbar und werden zum Teil gezielt verändert, insbesondere um ihre Eigenschaften den vorgesehenen Einsatzzwecken anzupassen oder um ihre katalytische Aktivität zu beeinflussen. Diese Veränderungen erfolgen durch oftmals durch Änderung der Aminosäuresequenz des Enzyms. Solche Veränderungen können dabei gezielt und somit ortsgerichtet oder zufällig, beispielsweise durch Zufallsmutageneseverfahren, erfolgen. Unter einer Enzym-Variante werden Enzyme verstanden, die aus einem Ausgangsenzym, beispielsweise einem Wildtyp-Enzym, durch Veränderung der Aminosäuresequenz erzeugt wurden. Die Veränderung der Aminosäuresequenz erfolgt vorzugsweise durch Mutationen, wobei Aminosäure-Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder Kombinationen hiervon vorgenommen sein können. Das Einbringen solcher Mutationen in Proteine ist Stand der Technik und dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie hinlänglich bekannt. Grundsätzlich können alle Enzyme derartig verändert sein. Erfindungsgemäß bevorzugt sind Protease-Varianten. Diese wurden aus einer Ausgangsprotease, beispielsweise einer Wildtyp-Protease, durch Veränderung der Aminosäuresequenz erzeugt, wobei bevorzugt Aminosäure-Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder Kombinationen hiervon vorgenommen wurden. Die Ausgangsprotease muss jedoch nicht zwingend eine natürlich vorkommende Wildtyp-Protease sein, auch eine aus dem Stand der Technik bekannte Protease, an der bereits Veränderungen vorgenommen wurden, kann weiterentwickelt werden und daher erneut als Ausgangsprotease zur Erzeugung weiter Protease-Varianten dienen.
Somit können beispielsweise alle der vorstehend beschriebenen Proteasen unverändert in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt sein und durch die beschriebenen Verbindungen stabilisert sein. Sie können aber auch das Ausgangsenzym für eine Variante darstellen, welche dann in einem erfindungsgemäßen Mittel enthalten und durch die beschriebenen Verbindungen stabilisiert ist.
Unter allen beschriebenen Proteasen bzw. Varianten weiter bevorzugt ist das Wildtypenzym bzw. das Ausgangsenzym der Variante:

– Die Alkalische Protease aus Bacillus amyloliquefaciens (BPN'),
– Die Alkalische Protease aus Bacillus licheniformis (Subtilisin Carlsberg),
– Die Alkalische Protease PB92,
– Subtilisin 147 und/oder Subtilisin 309 (Savinase)
– Die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, vorzugsweise aus Bacillus lentus DSM 5483,
– Die Alkalische Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233),
– die Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14391) oder eine hierzu mindestens zu 70% identische Alkalische Protease,
– die Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) oder eine hierzu mindestens zu 98,5% identische Alkalische Protease,
– die Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14392) oder eine hierzu mindestens zu 98,1% identische Alkalische Protease,
– die Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14393) oder eine hierzu mindestens zu 70% identische Alkalische Protease.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel daher dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, wobei die Veränderung eine Substitution, Insertion oder Deletion einer Aminosäure ist, und sie zu der Ausgangsprotease auf Aminosäureebene zu mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 92,5%, besonders bevorzugt mindestens 95% und ganz besonders bevorzugt mindestens 97,5% identisch ist.
Verfahren zur Durchführung und Erstellung von Sequenzvergleichen, sogenannte Alignments, sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie bekannt. Durch solche Sequenzvergleiche werden für zu vergleichende Sequenzen beispielsweise die Identitäts- oder Homologiewerte ermittelt. Solch ein Vergleich geschieht dadurch, dass ähnliche Abfolgen in den Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen der betrachteten Proteine einander zugeordnet werden. Dies nennt man Homologisierung. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Bei der Analyse von Nukleotid sequenzen sind wiederum beide komplementären Strange und jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen; ebenso die Degeneriertheit des genetischen Codes und die organismenspezifische Verwendung der Codons (Codon-Usage). Inzwischen werden Alignments über Computerprogramme erstellt, wie beispielsweise durch die Algorithmen FASTA oder BLAST; dieses Vorgehen wird beispielsweise von D. J. Lipman und W. R. Pearson (1985) in Science, Band 227, S. 1435–1441 beschrieben.
Eine Zusammenstellung aller in den verglichenen Sequenzen übereinstimmenden Positionen wird als Konsensus-Sequenz bezeichnet.
Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit oder Homologie der verglichenen Sequenzen zueinander. Diese wird in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben bzw. in einem Alignment einander entsprechenden Positionen wiedergegeben. Ein weiter gefasster Homologiebegriff bezieht die konservierten Aminosäure-Austausche in diesen Wert mit ein. Es ist dann von Prozent Ähnlichkeit die Rede. Solche Aussagen können über ganze Proteine oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden.
Homologe Bereiche von verschiedenen Proteinen sind durch Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz definiert. Diese können auch durch identische Funktion gekennzeichnet sein. Sie geht bis zu völligen Identitäten in kleinsten Bereichen, sogenannten Boxen, die nur wenige Aminosäuren umfassen und meist für die Gesamtaktivität essentielle Funktionen ausüben. Unter den Funktionen der homologen Bereiche sind kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Protein ausgeübten Funktion zu verstehen, wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasserstoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder Übergangskomplexes.
Insbesondere dienen solche Sequenzvergleiche bzw. Alignments auch zur Ermittlung von einander entsprechenden Positionen in unterschiedlichen Molekülen. So kann beispielsweise in einem Alignment von unterschiedlichen Enzymen festgestellt werden, welche Positionen in der jeweiligen Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz einander entsprechen, auch wenn die jeweiligen Sequenzen beispielsweise unterschiedliche Gesamtlängen oder unterschiedliche Domänen bzw. Teilsequenzen aufweisen oder wenn innerhalb einer Sequenz zusätzliche Aminosäuren bzw. Nukleotide vorhanden sind. Einer bestimmten Position in einer ersten Sequenz kann daher eine entsprechende Position in einer zweiten Sequenz konkret zugeordnet werden, wobei es durchaus möglich ist, dass sich die einander entsprechenden Positionen an unterschiedlichen Steilen im Molekül befinden. Ferner können an den entsprechenden Positionen unterschiedliche Aminosäurereste vorhanden sein. Daher wird für solche Sequenzvergleiche bzw. zur Bestimmung einer Position konkret angegeben, um welche Position es sich handelt und von welchem Enzym ausgegangen wird, d. h. welche Zählweise der Positionsbestimmung zu Grunde zu legen ist.
Für die nachfolgenden Erfindungsgegenstände wird zur Positionsbestimmung die Aminosäuresequenz des reifen (mature) Proteins der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 verwendet, die in der internationalen Offenlegungsschrift WO 91/02792 A1 offenbart ist und eine Länge von 269 Aminosäureresten aufweist (in der vorliegenden Anmeldung bezeichnet als Alkalischen Protease aus Bacillus lentus).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, wobei die Veränderung eine Substitution oder Insertion einer Aminosäure in demjenigen Bereich der Aminosäuresequenz ist, der den Positionen 95 bis 103 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus in einem Alignment zugeordnet ist.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei einer solchen Protease-Variante um eine Variante mit einer Insertion einer einzelnen Aminosäure nach einer oder mehrerer der Positionen 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 und/oder 103 und ganz besonders bevorzugt zwischen den Positionen 97 und 98 und/oder den Positionen 99 und 100.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, die den Positionen 3, 4, 36, 42, 43, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 250, 253, 255 und 268 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus in einem Alignment zugeordnet sind, wobei die Veränderung eine Substitution, Insertion oder Deletion einer Aminosäure ist.
Besonders bevorzugt erfolgt eine Aminosäureänderung gegenüber dem Ausgangsmolekül in einer oder mehreren der folgenden Positionen: 3, 4, 43, 61, 188, 193, 199, 211, 224, 250 und 253 (Zählung gemäß der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus), besonders bevorzugt mit einem oder mehreren der Aminosäureaustausche X3T, X4I, X43V, X61A, X188P, X193M, X199I, X211L, X211D, X211E, X211G, X211N oder X211Q, X224V, X250G und/oder X253N. Insbesondere handelt es sich bei der Protease um eine Variante mit einer Punktmutation in Position 211, vorzugsweise mit einer Substitution einer einzelnen Aminosäure in dieser Position, besonders bevorzugt mit der Aminosäuresubstitution X211L. Die vorstehenden Positionsangaben beziehen sich wiederum auf diejenigen Aminosäurereste, die den genannten Positionen der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus in einem Alignment zugeordnet sind.
Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel können ausschließlich ein Enzym enthalten. Alternativ können sie auch weitere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration enthalten. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen, wobei prinzipiell alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar sind. Als weitere Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere Proteasen, Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Mannanasen, Tannasen, Xylanasen, Xanthanasen, β-Glucosidasen, Carrageenasen, Oxidasen, Oxidoreduktasen, Lipasen oder Esterasen sowie vorzugsweise deren Gemische. Bei der Cellulase handelt es sich vorzugsweise um ein Cellulase-Gemisch oder eine Einkomponentencellulase, vorzugsweise bzw. überwiegend um eine Endoglucanase und/oder eine Cellobiohydrolase. Bei der Oxidoreduktase handelt es sich vorzugsweise um eine Oxidase, insbesondere eine Cholin-Oxidase, oder um eine Perhydrolase.
Diese Enzyme sind im Prinzip natürlichen Ursprungs; ausgehend von den natürlichen Molekülen stehen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln aber auch verbesserte Varianten zur Verfügung, die entsprechend bevorzugt eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Mittel enthalten Enzyme vorzugsweise in Gesamtmengen von 1 × 10^–8 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein. Bevorzugt sind die Enzyme von 0,001 bis 5 Gew.-%, weiter bevorzugt von 0,01 bis 5 Gew.-%, noch weiter bevorzugt von 0,05 bis 4 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,075 bis 3,5 Gew.-% in erfindungsgemäßen Mitteln enthalten, wobei jedes enthaltene Enzym in den genannten Mengenverhältnissen vorliegen kann.
Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M. M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), S. 751–766) bestimmt werden. Besonders bevorzugt unterstützen die weiteren Enzyme die Wirkung des Mittels, beispielsweise die Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels, hinsichtlich bestimmter Anschmutzungen oder Flecken. Besonders bevorzugt zeigen die Enzyme synergistische Effekte hinsichtlich ihrer Wirkung gegenüber bestimmter Anschmutzungen oder Flecken, d. h. die in der Mittelzusammensetzung enthaltenen Enzyme unterstützen sich in ihrer Reinigungsleistung gegenseitig. Synergistische Effekte können nicht nur zwischen verschiedenen Enzymen, sondern auch zwischen einem oder mehreren Enzymen und weiteren Inhaltsstoffen des erfindungsgemäßen Mittels auftreten.
Die in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzten Enzyme stammen entweder ursprünglich aus Mikroorganismen, etwa der Gattungen Bacillus, Streptomyces, Humicola, oder Pseudomonas, und/oder werden nach an sich bekannten biotechnologischen Verfahren durch geeignete Mikroorganismen produziert, beispielsweise durch transgene Expressionswirte der Gattungen Bacillus oder durch filamentöse Fungi.
In erfindungsgemäßen Mitteln wird das Enzym bzw. die Enzyme sowie die stabilisierende Verbindung vorzugsweise mit einzelnen oder mehreren der folgenden Inhaltsstoffe kombiniert: nichtionische, anionische und/oder kationische Tenside, Bleichmittel, Bleichaktivatoren, Bleichkatalysatoren, Builder und/oder Cobuilder, Säuren, alkalische Substanzen, Hydrotropen, Lösungsmittel, Verdicker, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Korrosionsinhibitoren, ins besondere Silberschutzmittel (Silberkorrosionsinhibitoren), Soil-Release-Wirkstoffe, Farbtransfer (oder -Übertragungs)-Inhibitoren, Schaum¬inhibitoren, Abrasivstoffe, Farbstoffe, Duftstoffe, Parfums, antimikrobielle Wirkstoffe, UV-Schutzmittel bzw. -Absorbenzien, Antistatika, Perlglanzmitteln und Hautschutzmitteln, weitere Stabilisatoren, insbesondere Enzymstabilisatoren, und andere Komponenten, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit Wasch- oder Reinigungsmittel dar, die dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine weitere Komponente enthalten, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tensiden, Buildern, Säuren, alkalischen Substanzen, Hydrotropen, Lösungsmitteln, Verdickungsmitteln, Bleichmitteln, Farbstoffen, Parfums, Korrosionsinhibitoren, Sequestriermitteln, Elektrolyten, optischen Aufhellern, Vergrauungsinhibitoren, Silberkorrosionsinhibitoren, Farbübertragungsinhibitoren, Schauminhibitoren, Abrasivstoffen, UV-Absorbenzien, Lösungsmitteln, Antistatika, Perlglanzmitteln und Hautschutzmitteln. Erfindungsgemäße Mittel enthalten vorzugsweise mindestens einen Komplexbildner und/oder Buildersubstanzen, wobei es sich bei dem Builder insbesondere um einen Zeolith-Builder handelt, und/oder ein nichtionisches Tensid, wobei es sich bei dem nichtionischen Tensid vorzugsweise um einen Hydroxymischether handelt, und/oder optischen Aufheller, wobei es sich bei dem optischen Aufheller um Diphenylverbindungen, insbesondere um Distyryl-Biphenylderivate, und/oder um Stilbentriazin-Derivate handelt.
Die zu wählenden Inhaltsstoffe wie auch die Bedingungen, unter denen das Mittel eingesetzt wird, wie beispielsweise Temperatur, pH-Wert, Ionenstärke, Redox-Verhältnisse oder mechanische Einflüsse, sollten für das jeweilige Reinigungsproblem optimiert sein. So liegen übliche Temperaturen für Wasch- und Reinigungsmittel in Bereichen von 10°C bei manuellen Mitteln über 20°C, 30°C, 40°C und 60°C bis hin zu 95° bei maschinellen Mitteln oder bei technischen Anwendungen. Da bei modernen Wasch- und Spülmaschinen die Temperatur meist stufenlos einstellbar ist, sind auch alle Zwischenstufen der Temperatur eingeschlossen. Vorzugsweise werden die Inhaltsstoffe der betreffenden Mittel aufeinander abgestimmt. Bevorzugt sind Synergien hinsichtlich der Reinigungsleistung. Besonders bevorzugt diesbezüglich sind Synergien, die in einem Temperaturbereich zwischen 20°C und 60°C vorhanden sind, da auch das in den erfindungsgemäßen Mitteln enthaltene Enzym bzw. die enthaltenen Enzyme in diesem Temperaturbereich katalytisch aktiv sind.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens einen weiteren Stabilisator enthält. In einem solchen Mittel sind daher mindestens zwei Verbindungen vorhanden, die eine Stabilisierung eines enthaltenen Enzyms, vorzugsweise einer Protease, bewirken. Bevorzugt wirken diese Verbindungen synergistisch, d. h. die durch beide Verbindungen erreichte Stabilisierungswirkung übersteigt die Summe der beiden einzelnen Stabilisierungswirkungen. In einer bevozugten Ausführungsform handelt es sich bei dem/den Stabilisator(en) um ein oder mehrere Polyole, insbesondere um Glycerin oder 1,2-Ethylenglycol, um ein Antioxidans, um Lactat oder ein oder mehrere Lactatderivate oder Kombinationen hiervon. Ebenfalls bevorzugt handelt es sich um eine oder mehrere derjenigen enzymstabilisierenden bzw. -inhibierenden Verbindungen, die in den internationalen Patentanmeldungen WO 07/113241 A1 oder WO 02/008398 offenbart sind.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Strukturformel
in der X ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist und Y ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist, als reversibler Inhibitor eines Enzyms in einem Wasch- oder Reinigungsmittel. Denn wie vorstehend bereits ausgeführt, bewirken diese Verbindungen auf Grund ihres Wirkmechanismus als reversibler Inhibitor eine vorteilhafte Stabilisierung des Enzyms in dem Wasch- oder Reinigungsmittel. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass die Reste X und Y identisch sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass der Rest X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: -CH₂-CH₂-CH₃, Phenyl. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass der Rest Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: -CH₂-CH₂-CH₃, Phenyl.
Auf Grund der beschriebenen vorteilhaften erfindungsgemäßen Verwendungen einer solchen Verbindung zur Stabilisierung eines Enzyms in einem Wasch- oder Reinigungsmittel ist eine solche Kombination von Enzym und Stabilisator ebenfalls vorteilhaft einzusetzen bei der Herstellung eines entsprechenden Wasch- oder Reinigungsmittels. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung eines Enzyms und einer Verbindung der allgemeinen Strukturformel
in der X ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist und Y ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist, zur Herstellung eines Wasch- oder Reinigungsmittels. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dieser Erfindungsgegenstand dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, β-Glucosidase, Carrageenase, Oxidase, Oxidoreduktase, Lipase oder Mischungen hiervon. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Enzym um eine Protease, bevorzugt eine Serinprotease, weiter bevorzugt eine Subtilase und besonders bevorzugt ein Subtilisin.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Wasch- oder Reinigungsverfahren, in dem ein Enzym zur Wirkung kommt, welches inhibiert und/oder stabilisiert ist mit einer Verbindung der allgemeinen Strukturformel
in der X ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist und Y ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist. Denn wie vorstehend bereits ausgeführt, bewirken diese Verbindungen auf Grund ihres Wirkmechanismus als reversibler Inhibitor eine vorteilhafte Stabilisierung des Enzyms in dem Wasch- oder Reinigungsmittel, so dass für das Wasch- oder Reinigungsverfahren eine höhere Enzymaktivität zur Verfügung steht im Vergleich mit einem Wasch- oder Reinigungsmittel, in dem das Enzym nicht stabilisiert war. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsverfahren, dadurch gekennzeichnet, dass ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel eingesetzt ist, wie es vorstehend beschrieben ist.
Aus der vorteilhaften Anwendung erfindungsgemäßer Wasch- oder Reinigungsmittel in Wasch- oder Reinigungsverfahren ergibt sich konsequenterweise, dass die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel für Reinigungszwecke vorteilhaft verwendbar sind. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt daher die Verwendung eines Wasch- oder Reinigungsmittels, wie es vorstehend beschrieben ist, zum Waschen und/oder Reinigen von Textilien und/oder harten Oberflächen dar.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter, ohne sie jedoch darauf einzuschränken.
Beispiele
Beispiel 1
Untersuchung der Protease-Restaktivität in Gegenwart eines Inhibitors
Zum Nachweis, dass die unten aufgeführten Verbindungen eine die Protease-Aktivität inhibierende Wirkung ausüben und somit eine stabilisierende Wirkung aufweisen, wurde die proteolytische Restaktivität der Bacillus lentus-Alkalische Protease F49 (gemäß WO 95/23221 A1 ) in Anwesenheit dieser Verbindungen ermittelt.
In parallelen Reaktionsansätzen wurden in 100 mM Tris-Puffer, pH 6,8, 0,1% (w/v) BrijTM35 das Substrat Succinyl Alanin-Alanin-Prolin-Phenylalanin-para-Nitroanilid (AAPFpNA; Bachem L-1400) und 5 × 10^–9 bzw. 1 × 10^–8 M der Protease vorgelegt. Hinzu kamen die nachstehend aufgeführten zu testenden Verbindungen in einer Endkonzentration von 10 mM. Sie waren jeweils in wasserfreiem DMSO gelöst, wobei Effekte von DMSO auf die enzymatische Aktivität über die entsprechende Referenz mit derselben Menge DMSO, aber ohne die betreffende Verbindung, korrigiert wurden. Die Inkubation erfolgte für 5 min bei pH 8,6 und 25°C. Als Vergleich diente der entsprechende Reaktionsansatz mit Protease, aber ohne die betreffende Verbindung. Die Proteaseaktivität in diesen Vergleichsansätzen wurde als 100% gesetzt.
Auf diese Weise wurden folgende Verbindungen untersucht:

V1: Dibutylphosphat
V2: Dibenzylphosphat

Die Verbindungen führten zu einer Restaktivität der Protease von weniger als 60%. Hierunter ist V1 der stärkste und damit am besten geeigente Protease-Inhibitor bzw. Stabilisator, gefolgt von V2. Die Restaktivitäten der Protease betrugen 45% für V1 und 56% für V2.
Aufgrund dieser Ergebnisse sind diese Verbindungen sehr gut geeignet, die enzymatischen Aktivitäten in Protease enthaltenden Wasch- und Reinigungsmitteln während der Lagerung zu stabilisieren.
Beispiel 2
Untersuchung der Lagerstabilität proteasehaltiger Wasch- und Reinigungsmittel in Gegenwart von erfindungsgemäßen Enzymstabilisatoren
Als Basisrezeptur wurde ein Flüssigwaschmittel mit folgender Zusammensetzung angesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3–0,5% Xanthan Gum, 0,2–0,4% Anti-Schaummittel, 6–7% Glycerin, 0,3–0,5% Ethanol, 4–7% FAEOS, 24–28% Nichtionische Tenside, 1% Borsäure, 1–2% Natriumcitrat (Dihydrat), 2–4% Soda, 14–16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP, 0–0,4% PVP, 0–0,05% optischer Aufheller, 0–0,001% Farbstoff, Rest: demineralisiertes Wasser.
Diese Rezeptur wurde mit den zu testenden, inhibierenden Verbindungen gemäß Beispiel 1 und 1.275.000 HPE/I B. lentus-Alkalische Protease F 49 versetzt. Die in HPE angegebene Protease-Aktivität (Henkel-Protease-Einheiten) wurde nach van Raay, Saran und Verbeek, gemäß der Veröffenlichung „Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität in Enzymkonzentraten und enzymhaltigen Wasch-, Spül- und Reinigungsmitteln" in Tenside (1970), Band 7, S. 125–132, bestimmt.
Die Lagerung erfolgte über verschieden lange Zeiträume in luftdicht verschlossenen Gefäßen bei 30°C.
Zur Auswertung wurden die Anfangswerte für die proteolytische Aktivität des betreffenden Mittels mit den nach der Lagerung bestimmten Werten verglichen. Je höher die nach der Lagerung verbleibende Aktivität war, desto besser war die enthaltene Protease während der Lagerung inaktiviert und desto besser eignet sich die betreffende Verbindung als erfindungsgemäßer Stabilisator.
Alle untersuchten Verbindungen zeigten eine eindeutig stabilisierende Wirkung.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- WO 96/21716 A1 [0007]
- WO 96/41859 A1 [0007]
- WO 95/23221 A1 [0031, 0070]
- WO 91/02792 A1 [0053]
- WO 07/113241 A1 [0064]
- WO 02/008398 [0064]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Leonor Michaelis, Maud Menten (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung, Biochem. Z. 49:333–369 [0021]
- Cheng Y., Prusoff W. H. (1973) Biochem.Pharmacol. 22, 3099–3108 [0028]
- D. J. Lipman und W. R. Pearson (1985) in Science, Band 227, S. 1435–1441 [0048]
- A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M. M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), S. 751–766 [0060]
- van Raay, Saran und Verbeek, gemäß der Veröffenlichung „Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität in Enzymkonzentraten und enzymhaltigen Wasch-, Spül- und Reinigungsmitteln" in Tenside (1970), Band 7, S. 125–132 [0076]

Claims

Wasch- oder Reinigungsmittel, enthaltend ein Enzym und eine Verbindung der allgemeinen Strukturformel
in der X ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist und Y ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reste X und Y identisch sind.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: -CH₂-CH₂-CH₃, Phenyl.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: -CH₂-CH₂-CH₃, Phenyl.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung bezüglich des Enzyms eine Inhibitionskonstante (K_i) von 0,01 bis 10 mM aufweist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung bezüglich des Enzyms eine Inhibitionskonstante (K_i) von 0,03 bis 5 mM aufweist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym in einem Gehalt von 2 μg bis 20 mg pro Gramm des Mittels, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg pro g des Mittels, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg pro g des Mittels, ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg des Mittels enthalten ist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung in einem Gehalt bis zu 50 mg pro g des Mittels, vorzugsweise bis zu 10 mg besonders bevorzugt bis zu 7 mg ganz besonders bevorzugt bis zu 5 mg pro Gramm des Mittels enthalten ist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das molare Verhältnis der Verbindung zum Emzym 1:1 bis 1.000:1, insbesondere von 1:1 bis 500:1, besonders bevorzugt von 1:1 bis 100:1, ganz besonders bevorzugt von 1:1 bis 20:1 beträgt.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die in dem Mittel enthaltene Menge der bezogen auf das stabilisierte Enzym von 0,01 bis 100 × der Inhibitionskonstante K_i, vorzugsweise 0,1 bis 10 × K_i, besonders bevorzugt 1 bis 5 × K_i, beträgt.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in überwiegend fester Form.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in überwiegend flüssiger, pastöser oder Gelform.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, β-Glucosidase, Carrageenase, Oxidase, Oxidoreduktase, Lipase, Esterase oder Mischungen hiervon.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Protease, bevorzugt eine Serinprotease, weiter bevorzugt eine Subtilase und besonders bevorzugt ein Subtilisin ist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, wobei die Veränderung eine Substitution, Insertion oder Deletion einer Aminosäure ist, und sie zu der Ausgangsprotease auf Aminosäureebene zu mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 92,5%, besonders bevorzugt mindestens 95% und ganz besonders bevorzugt mindestens 97,5% identisch ist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, wobei die Veränderung eine Substitution oder Insertion einer Aminosäure in demjenigen Bereich der Aminosäuresequenz ist, der den Positionen 95 bis 103 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus in einem Alignment zugeordnet ist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, die den Positionen 3, 4, 36, 42, 43, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 250, 253, 255 und 268 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus in einem Alignment zugeordnet sind, wobei die Veränderung eine Substitution, Insertion oder Deletion einer Aminosäure ist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 17, ferner umfassend eines oder mehrere weitere Enzyme.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine weitere Komponente enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tensiden, Buildern, Säuren, alkalischen Substanzen, Hydrotropen, Lösungsmitteln, Verdickungsmitteln, Bleichmitteln, Farbstoffen, Parfums, Korrosionsinhibitoren, Sequestriermitteln, Elektrolyten, optischen Aufhellern, Vergrauungsinhibitoren, Silberkorrosionsinhibitoren, Farbübertragungsinhibitoren, Schauminhibitoren, Abrasivstoffen, UV-Absorbenzien, Lösungsmitteln, Antistatika, Perlglanzmitteln und Hautschutzmitteln.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens einen weiteren Stabilisator enthält.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem/den Stabilisator(en) um ein oder mehrere Polyole, insbesondere um Glycerin oder 1,2-Ethylenglycol, um ein Antioxidans, um Lactat oder ein oder mehrere Lactatderivate oder Kombinationen hiervon handelt.
Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Strukturformel
in der X ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist und Y ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist, als reversibler Inhibitor eines Enzyms in einem Wasch- oder Reinigungsmittel.
Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Reste X und Y identisch sind.
Verwendung nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: -CH₂-CH₂-CH₃, Phenyl.
Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: -CH₂-CH₂-CH₃, Phenyl
Verwendung eines Enzyms und einer Verbindung der allgemeinen Strukturformel
in der X ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist und Y ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist, zur Herstellung eines Wasch- oder Reinigungsmittels.
Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, β-Glucosidase, Carrageenase, Oxidase, Oxidoreduktase, Lipase, Esterase oder Mischungen hiervon.
Verwendung nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Protease, bevorzugt eine Serinprotease, weiter bevorzugt eine Subtilase und besonders bevorzugt ein Subtilisin ist.
Wasch- oder Reinigungsverfahren, in dem ein Enzym zur Wirkung kommt, welches inhibiert und/oder stabilisiert ist mit einer Verbindung der allgemeinen Strukturformel
in der X ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist und Y ein aliphatischer oder ein aromatischer Rest ist.
Wasch- oder Reinigungsverfahren, dadurch gekennzeichnet, dass ein Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 21 eingesetzt ist.
Verwendung eines Wasch- oder Reinigungsmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 21 zum Waschen und/oder Reinigen von Textilien und/oder harten Oberflächen.