CN104203978A

CN104203978A - 针对硬化蛋白的免疫结合剂

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Publication number: CN104203978A
Application number: CN201280064333.XA
Authority: CN
Inventors: C-M.谢; A.伊万诺夫; W.威格尔
Original assignee: AbbVie Inc
Current assignee: AbbVie Inc
Priority date: 2011-10-24
Filing date: 2012-10-24
Publication date: 2014-12-10
Also published as: US20130171096A1; CA2853258A1; US20150266977A1; WO2013063095A1; UY34411A; TW201323440A; SG11201401791WA; RU2014120981A; AR088513A1; JP2014533659A; EP2771360A1; US8999331B2; HK1200322A1; MX2014004977A

Abstract

本发明描述了结合硬化蛋白或硬化蛋白和TNF的蛋白质，连同其在用于治疗、预防和诊断硬化蛋白相关疾病以及用于检测细胞、组织、样品和组合物中的硬化蛋白或硬化蛋白和TNF的组合物和方法中的用途。

Description

针对硬化蛋白的免疫结合剂

与相关申请的交叉参考

本专利申请要求于2011年10月24日提交的美国临时申请系列号61/550,724的优先权，所述美国临时申请全文以引用方式并入本文。

技术领域

提供了硬化蛋白(sclerostin)结合蛋白及其具体的在急性和慢性免疫性疾病的预防和/或治疗中的用途，所述急性和慢性免疫性疾病例如类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、多发性硬化及其他自身免疫疾病。

背景技术

SOST基因编码称为硬化蛋白的24KD蛋白质，所述硬化蛋白基于序列相似性被分类为含半胱氨酸结的糖蛋白的DNA家族成员(Avasian-Kretchmer(2004)Mol.Endocrinol.8(1):1-12)。硬化蛋白是骨形成的负调节物，其抑制成骨细胞增殖以及分化并且阻抑体外成骨细胞矿化(Poole等人(2005)FASEBJ.19:1836-38；Winkler等人(2005)J.Biol.Chem.280(4):2498-2502)。

硬化蛋白是经典Wnt信号传导途径的抑制剂。它与LRP4、LRP5和/或LRP6受体结合，导致β-连环蛋白的稳定，导致通过转录调节物包括淋巴样增强因子1(LEF)和T细胞因子(TCF)的基因转录调控。硬化蛋白抑制允许通过Wnt途径的信号传导，导致骨形成(van Bezooijen等人(2007)J.Bone Min.Res.22(1):19-28)。

经典Wnt信号传导的增加导致增加的骨量(Li等人(2005)J.Biol.Chem.280(20):19883-7；Semenov等人(2005)J.Biol.Chem.280(29):26770-775)。LRP5中的功能突变体的丧失导致在人和LRP5KO小鼠中的骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征中可见的低骨量表型，证实与在这些患者中可见的表型类似的表型(Balemans等人(2008)Calcif.Tissue Int.82:445-53)。已鉴定了SOST基因的两种人突变，所述突变导致硬化性狭窄和Van Buchem’s病，两者均导致高骨量表型(Brunkow等人(2001)Am.J.Hum.Genet.68:577-89；Balemans等人(2001)Hum Mol Genet10:537-43)。另外，硬化蛋白KO小鼠证实高骨量表型，而硬化蛋白过生产Tg小鼠具有低骨量表型(Li等人(2008)J.Bone和Min.Res.23(6):860-9)。

UCB Celltech(以前的Celltech)与AMGEN合作开发了用于治疗骨质疏松症和骨折愈合的硬化蛋白中和mAb。I期临床试验已完成。II期试验已在骨质疏松症中完成，并且III期试验已开始。用于治疗骨折愈合的多重II期试验在进行中。TNF在关节炎中的致病作用完全确定，因为TNF-α拮抗剂降低炎症且限制人疾病中的软骨损害和骨质侵蚀的进展(van den Berg(2001)Arthritis Res.3:18-26)。尽管TNF拮抗剂已改革RA治疗，但显著部分的患者不足够响应这些药物。使用TNF-α和SOST的临床前研究指向在关节炎病理生理学中的独立和重叠作用两者。虽然硬化蛋白或TNF-α抑制单独仅对促炎基因表达发挥适度作用，但SOST抑制与TNF-α抑制的组合导致强协同应答。特别地，抑制硬化蛋白和TNF-α的组合具有阻断炎症且促进骨愈合两者的潜力，给患者提供更大的临床益处。

尽管自从该关键促炎细胞因子被发现,已有多种针对硬化蛋白的被介绍，但仍存在对改善的抗体的需要，所述改善的抗体可有效介导或中和炎症应答或自身免疫障碍过程中的硬化蛋白活性，同时保护或恢复骨矿物质密度、骨体积和骨强度。

发明内容

提供了结合人硬化蛋白的蛋白质。提供了结合蛋白，其包括但不限于抗体、其抗原结合部分、和多价多特异性结合蛋白例如DVD结合蛋白，其可结合人硬化蛋白和另一靶标例如TNF-α。提供了制备且使用本文描述的硬化蛋白结合蛋白的方法以及多种组合物，所述组合物可用于检测样品中的硬化蛋白的方法或者治疗或预防个体中的障碍的方法，所述障碍与硬化蛋白活性相关或怀疑与硬化蛋白活性相关。

在一个方面，提供了包含能够结合人硬化蛋白的抗原结合结构域的结合蛋白，所述抗原结合结构域包括包含下述的至少一个CDR：

CDR-H1。X₁–X₂–X₃–X₄–X₅(SEQ ID NO:15)，其中：

X₁是D或N或者不存在；

X₂是Y或N；

X₃是A或N；

X₄是L或N；

X₅是H或N；

CDR-H2。

X₁–X₂–X₃–X₄–X₅–X₆–X₇–X₈–X₉–X₁₀–X₁₁–X₁₂–X₁₃–X₁₄–X₁₅–X₁₆–X₁₇(SEQ IDNO:16)，其中：

X₁是G或N；

X₂是I或N；

X₃是S或N；

X₄是W或N；

X₅是H或N；

X₆是G或N；

X₇是D或N；

X₈是F或N；

X₉是I或N；

X₁₀是D或N；

X₁₁是Y或N；

X₁₂是A或N；

X₁₃是D或N；

X₁₄是S或N；

X₁₅是V或N；

X₁₆是K或N；和

X₁₇是G或N；

CDR-H3。X₁–X₂–X₃–X₄–X₅–X₆–X₇–X₈–X₉–X₁₀–X₁₁–X₁₂(SEQ ID NO:17)，

其中：

X₁是N或N；

X₂是N或N；

X₃是R或N；

X₄是G或N；

X₅是Y或N；

X₆是G或N；

X₇是G或N；

X₈是L或N；

X₉是D或N；和

X₁₀是V或N；

CDR-L1。X₁–X₂–X₃–X₄–X₅–X₆–X₇–X₈–X₉–X₁₀–X₁₁–X₁₂–X₁₃–X₁₄–X₁₅–X₁₆(SEQ ID NO:18)，其中：

X₁是S或N；

X₂是G或N；

X₃是S或N；

X₄是S或N；

X₅是S或N；

X₆是N或N；

X₇是I或N；

X₈是G或N；

X₉是S或N；

X₁₀是N或N；

X₁₁是T或N；

X₁₂是V或N；和

X₁₃是N或N；

CDR-L2。X₁–X₂–X₃–X₄–X₅–X₆–X₇(SEQ ID NO:19)，其中：

X₁是S或N；

X₂是N或N；

X₃是N或N；

X₄是Q或N；

X₅是R或N；

X₆是P或N；和

X₇是S或N；

或

CDR-L3。X₁–X₂–X₃–X₄–X₅–X₆–X₇–X₈–X₉(SEQ ID NO:20)，其中：

X₁是A或N；

X₂是A或N；

X₃是W或N；

X₄是D或N；

X₅是D或N；

X₆是S或N；

X₇是L或N；

X₈是N或N；

X₉是G或N；

X₁₀是S或N；

X₁₁是Y或N；和

X₁₂是V或N。

在一个实施例中，提供了包含至少一个CDR的结合蛋白，所述至少一个CDR包含SEQ ID NO:3的残基31-35；SEQ ID NO:3的残基50-66；SEQID NO:3的残基99-108；SEQ ID NO:4的残基23-34；SEQ ID NO:4的残基51-57；SEQ ID NO:4的残基90-101；SEQ ID NO:5的残基31-35；SEQ ID NO:5的残基50-66；SEQ ID NO:5的残基99-115；SEQ ID NO:6的残基23-33；SEQ ID NO:6的残基49-55；SEQ ID NO:6的残基88-96；SEQ ID NO:7的残基31-35；SEQ ID NO:7的残基50-66；SEQ ID NO:7的残基99-107；SEQID NO:8的残基23-33；SEQ ID NO:8的残基49-55；SEQ ID NO:8的残基88-95；SEQ ID NO:9的残基31-35；SEQ ID NO:9的残基50-66；SEQ ID NO:9的残基99-107；SEQ ID NO:10的残基24-39；SEQ ID NO:10的残基55-61；SEQ ID NO:10的残基94-112；SEQ ID NO:11的残基31-35；SEQ ID NO:11的残基50-66；SEQ ID NO:11的残基99-111；SEQ ID NO:12的残基24-39；SEQ ID NO:12的残基55-61；SEQ ID NO:12的残基94-113；SEQ ID NO:13的残基31-37；SEQ ID NO:13的残基52-69；SEQ ID NO:13的残基102-122；SEQ ID NO:14的残基24-34；SEQ ID NO:14的残基50-56；SEQ ID NO:14的残基89-97；SEQ ID NO:1998的残基31-35；SEQ ID NO:1998的残基50-66；SEQ ID NO:1998的残基99-110；SEQ ID NO.:1999的残基31-35；SEQ ID NO.:1999的残基50-66；SEQ ID NO.:1999的残基99-110；SEQ IDNO.:2000的残基31-35；SEQ ID NO.:2000的残基50-66；SEQ ID NO.:2000的残基99-110；SEQ ID NO.:2001的残基31-35；SEQ ID NO.:2001的残基50-66；SEQ ID NO.:2001的残基99-110；SEQ ID NO.:2002的残基31-35；SEQ ID NO.:2002的残基50-66；SEQ ID NO.:2002的残基99-110；SEQ IDNO.:2003的残基31-35；SEQ ID NO.:2003的残基50-66；SEQ ID NO.:2003的残基99-110；SEQ ID NO.:2004的残基31-35；SEQ ID NO.:2004的残基50-66；SEQ ID NO.:2004的残基99-110；SEQ ID NO.:2005的残基31-35；SEQ ID NO.:2005的残基50-66；SEQ ID NO.:2005的残基99-110；SEQ IDNO.:2006的残基31-35；SEQ ID NO.:2006的残基50-66；SEQ ID NO.:2006的残基99-110；SEQ ID NO.:2007的残基31-35；SEQ ID NO.:2007的残基50-66；SEQ ID NO.:2007的残基99-110；SEQ ID NO.:2008的残基23-36；SEQ ID NO.:2008的残基52–58；SEQ ID NO.:2008的残基101–109；SEQ IDNO.:2009的残基23-36；SEQ ID NO.:2009的残基52–58；SEQ ID NO.:2009的残基101–109；SEQ ID NO.:2008的残基23-36；SEQ ID NO.:2010的残基52–58；SEQ ID NO.:2010的残基101–109；SEQ ID NO.:2011的残基23-36；SEQ ID NO.:2011的残基52–58；SEQ ID NO.:2011的残基101–109；SEQ ID NO.:2012的残基23-36；SEQ ID NO.:2012的残基52–58；SEQ IDNO.:2012的残基101–109；SEQ ID NO.:2013的残基23-36；SEQ IDNO.:2013的残基52–58；SEQ ID NO.:2013的残基101–109；SEQ IDNO.:2014的残基23-36；SEQ ID NO.:2014的残基52–58；SEQ ID NO.:2014的残基101–109；SEQ ID NO.:2015的残基23-36；SEQ ID NO.:2015的残基52–58；SEQ ID NO.:2015的残基101–109；SEQ ID NO.:2016的残基23-36；SEQ ID NO.:2016的残基52–58；SEQ ID NO.:2016的残基101–109；SEQ ID NO.:2017的残基23-36；SEQ ID NO.:2017的残基52–58；SEQ IDNO.:2017的残基101–109；SEQ ID NO:2020的残基31-35；SEQ ID NO:2020的残基50-66；SEQ ID NO:2020的残基99-108；SEQ ID NO:2021的残基31-35；SEQ ID NO:2021的残基50-66；SEQ ID NO:2021的残基99-108；SEQ ID NO:2022的残基31-35；SEQ ID NO:2022的残基50-66；SEQ IDNO:2022的残基99-108；SEQ ID NO:2023的残基31-35；SEQ ID NO:2023的残基50-66；SEQ ID NO:2023的残基99-108；SEQ ID NO:2024的残基31-35；SEQ ID NO:2024的残基50-66；SEQ ID NO:2024的残基99-108；SEQ ID NO:2025的残基31-35；SEQ ID NO:2025的残基50-66；SEQ IDNO:2025的残基99-108；SEQ ID NO:2026的残基31-35；SEQ ID NO:2026的残基50-66；SEQ ID NO:2026的残基99-108；SEQ ID NO:2027的残基31-35；SEQ ID NO:2027的残基50-66；SEQ ID NO:2027的残基99-108；SEQ ID NO:2028的残基31-35；SEQ ID NO:2028的残基50-66；SEQ IDNO:2028的残基99-108；SEQ ID NO:2029的残基31-35；SEQ ID NO:2029的残基50-66；SEQ ID NO:2029的残基99-108；SEQ ID NO:2030的残基31-35；SEQ ID NO:2030的残基50-66；SEQ ID NO:2030的残基99-108；SEQ ID NO:2031的残基31-35；SEQ ID NO:2031的残基50-66；SEQ IDNO:2031的残基99-108；SEQ ID NO:2032的残基31-35；SEQ ID NO:2032的残基50-66；SEQ ID NO:2032的残基99-108；SEQ ID NO:2033的残基31-35；SEQ ID NO:2033的残基50-66；SEQ ID NO:2033的残基99-108；SEQ ID NO:2034的残基31-35；SEQ ID NO:2034的残基50-66；SEQ IDNO:2034的残基99-110；SEQ ID NO.:2035的残基31-35；SEQ ID NO.:2035的残基51-57；SEQ ID NO.:2035的残基90-101；SEQ ID NO.:2036的残基31-35；SEQ ID NO.:2036的残基51-57；SEQ ID NO.:2036的残基90-101；SEQID NO.:2037的残基31-35；SEQ ID NO.:2035的残基51-57；SEQ ID NO.:2037的残基90-101；SEQ ID NO.:2038的残基31-35；SEQ ID NO.:2038的残基51-57；SEQ ID NO.:2038的残基90-101；SEQ ID NO.:2039的残基31-35；SEQ ID NO.:2039的残基51-57；SEQ ID NO.:2039的残基90-101；SEQ IDNO.:2040的残基31-35；SEQ ID NO.:2040的残基51-57；SEQ ID NO.:2040的残基90-101；SEQ ID NO.:2041的残基31-35；SEQ ID NO.:2041的残基51-57；SEQ ID NO.:2041的残基90-101；SEQ ID NO.:2042的残基31-35；SEQ ID NO.:2042的残基51-57；SEQ ID NO.:2042的残基90-101；SEQ IDNO.:2043的残基31-35；SEQ ID NO.:2043的残基51-57；SEQ ID NO.:2043的残基90-101；SEQ ID NO.:2044的残基31-35；SEQ ID NO.:2044的残基51-57；SEQ ID NO.:2044的残基90-101；SEQ ID NO.:2045的残基31-35；SEQ ID NO.:2045的残基51-57；SEQ ID NO.:2045的残基90-101；SEQ IDNO.:2046的残基31-35；SEQ ID NO.:2046的残基51-57；SEQ ID NO.:2046的残基90-101；SEQ ID NO.:2047的残基31-35；SEQ ID NO.:2047的残基51-57；SEQ ID NO.:2047的残基90-101；SEQ ID NO.:2048的残基31-35；SEQ ID NO.:2048的残基51-57；SEQ ID NO.:2048的残基90-101；SEQ IDNO.:2049的残基31-35；SEQ ID NO.:2049的残基51-57；和SEQ ID NO.:2049的残基90-101。

在另一个实施例中，提供了包含上文描述的至少3个CDR的硬化蛋白结合蛋白。

在另一个实施例中，提供了包含表1的至少3个CDR的硬化蛋白结合蛋白：

表1

VH MSL10CDR组
		VH MSL10CDR-H1	SEQ ID NO:3的残基31-35
VH MSL10CDR-H2	SEQ ID NO:3的残基50-66
		VH MSL10CDR-H3	SEQ ID NO:3的残基99-108
VL MSL10CDR组
		VL MSL10CDR-L1	SEQ ID NO:4的残基23-34
VL MSL10CDR-L2	SEQ ID NO:4的残基51-57
		VL MSL10CDR-L3	SEQ ID NO:4的残基90-101

		VH MSL10AM1CDR组
VH MSL10AM1CDR-H1	SEQ ID NO:2020的残基31-35
		VH MSL10AM1CDR-H2	SEQ ID NO:2020的残基50-66
VH MSL10AM1CDR-H3	SEQ ID NO:2020的残基99-108
		VL MSL10AM1CDR组
VL MSL10AM1CDR-L1	SEQ ID NO:2035的残基23-34
		VL MSL10AM1CDR-L2	SEQ ID NO:2035的残基51-57
VL MSL10AM1CDR-L3	SEQ ID NO:2035的残基90-101

VH MSL10AM2CDR组
		VH MSL10AM2CDR-H1	SEQ ID NO:2021的残基31-35
VH MSL10AM2CDR-H2	SEQ ID NO:2021的残基50-66
		VH MSL10AM2CDR-H3	SEQ ID NO:2021的残基99-108
VL MSL10AM2CDR组
		VL MSL10AM2CDR-L1	SEQ ID NO:2036的残基23-34
VL MSL10AM2CDR-L2	SEQ ID NO:2036的残基51-57

VL MSL10AM2CDR-L3	SEQ ID NO:2036的残基90-101

VH MSL10AM3CDR组
		VH MSL10AM3CDR-H1	SEQ ID NO:2022的残基31-35
VH MSL10AM3CDR-H2	SEQ ID NO:2022的残基50-66
		VH MSL10AM3CDR-H3	SEQ ID NO:2022的残基99-108
VL MSL10AM3CDR组
		VL MSL10AM3CDR-L1	SEQ ID NO:2037的残基23-34
VL MSL10AM3CDR-L2	SEQ ID NO:2037的残基51-57
		VL MSL10AM3CDR-L3	SEQ ID NO:2037的残基90-101

		VH MSL10AM4CDR组
VH MSL10AM4CDR-H1	SEQ ID NO:2023的残基31-35
		VH MSL10AM4CDR-H2	SEQ ID NO:2023的残基50-66
VH MSL10AM4CDR-H3	SEQ ID NO:2023的残基99-108
		VL MSL10AM4CDR组
VL MSL10AM4CDR-L1	SEQ ID NO:2038的残基23-34
		VL MSL10AM4CDR-L2	SEQ ID NO:2038的残基51-57
VL MSL10AM4CDR-L3	SEQ ID NO:2038的残基90-101

VH MSL10AM5CDR组
		VH MSL10AM5CDR-H1	SEQ ID NO:2024的残基31-35
VH MSL10AM5CDR-H2	SEQ ID NO:2024的残基50-66
		VH MSL10AM5CDR-H3	SEQ ID NO:2024的残基99-108
VL MSL10AM5CDR组
		VL MSL10AM5CDR-L1	SEQ ID NO:2039的残基23-34
VL MSL10AM5CDR-L2	SEQ ID NO:2039的残基51-57
		VL MSL10AM5CDR-L3	SEQ ID NO:2039的残基90-101

		VH MSL10AM6CDR组

VH MSL10AM6CDR-H1	SEQ ID NO:2025的残基31-35
		VH MSL10AM6CDR-H2	SEQ ID NO:2025的残基50-66
VH MSL10AM6CDR-H3	SEQ ID NO:2025的残基99-108
		VL MSL10AM6CDR组
VL MSL10AM6CDR-L1	SEQ ID NO:2040的残基23-34
		VL MSL10AM6CDR-L2	SEQ ID NO:2040的残基51-57
VL MSL10AM6CDR-L3	SEQ ID NO:2040的残基90-101

VH MSL10AM7CDR组
		VH MSL10AM7CDR-H1	SEQ ID NO:2026的残基31-35
VH MSL10AM7CDR-H2	SEQ ID NO:2026的残基50-66
		VH MSL10AM7CDR-H3	SEQ ID NO:2026的残基99-108
VL MSL10AM7CDR组
		VL MSL10AM7CDR-L1	SEQ ID NO:2041的残基23-34
VL MSL10AM7CDR-L2	SEQ ID NO:2041的残基51-57
		VL MSL10AM7CDR-L3	SEQ ID NO:2041的残基90-101

		VH MSL10AM8CDR组
VH MSL10AM8CDR-H1	SEQ ID NO:2027的残基31-35
		VH MSL10AM8CDR-H2	SEQ ID NO:2027的残基50-66
VH MSL10AM8CDR-H3	SEQ ID NO:2027的残基99-108
		VL MSL10AM8CDR组
VL MSL10AM8CDR-L1	SEQ ID NO:2042的残基23-34
		VL MSL10AM8CDR-L2	SEQ ID NO:2042的残基51-57
VL MSL10AM8CDR-L3	SEQ ID NO:2042的残基90-101

VH MSL10AM9CDR组
		VH MSL10AM9CDR-H1	SEQ ID NO:2028的残基31-35
VH MSL10AM9CDR-H2	SEQ ID NO:2028的残基50-66
		VH MSL10AM9CDR-H3	SEQ ID NO:2028的残基99-108

VL MSL10AM9CDR组
		VL MSL10AM9CDR-L1	SEQ ID NO:2043的残基23-34
VL MSL10AM9CDR-L2	SEQ ID NO:2043的残基51-57
		VL MSL10AM9CDR-L3	SEQ ID NO:2043的残基90-101

		VH MSL10AM10CDR组
VH MSL10AM10CDR-H1	SEQ ID NO:2029的残基31-35
		VH MSL10AM10CDR-H2	SEQ ID NO:2029的残基50-66
VH MSL10AM10CDR-H3	SEQ ID NO:2029的残基99-108
		VL MSL10AM10CDR组
VL MSL10AM10CDR-L1	SEQ ID NO:2044的残基23-34
		VL MSL10AM10CDR-L2	SEQ ID NO:2044的残基51-57
VL MSL10AM10CDR-L3	SEQ ID NO:2044的残基90-101

VH MSL10AM10CDR组
		VH MSL10AM11CDR-H1	SEQ ID NO:2030的残基31-35
VH MSL10AM11CDR-H2	SEQ ID NO:2030的残基50-66
		VH MSL10AM11CDR-H3	SEQ ID NO:2030的残基99-108
VL MSL10AM10CDR组
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VL AE10-6AM8组

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VH AE10-6AM10CDR组

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VL AE10-6AM10组

VL AE10-6AM10CDR-L1	SEQ ID NO:2017的残基24-34
		VL AE10-6AM10CDR-L2	SEQ ID NO:2017的残基50-56
VL AE10-6AM10CDR-L3	SEQ ID NO:2017的残基89-97

在另一个实施例中，硬化蛋白结合蛋白可包含上文描述的至少两个可变结构域CDR组。在一个实施例中，两个可变结构域CDR组是VH MSL10CDR组和VL MSL10CDR组；VH MSL17CDR组和VL MSL17CDR组；VH MSL9-8CDR组和VL MSL9-8CDR组；VH MSK9CDR组和VL MSK9CDR组；VH MSK13CDR组和VL MSK13CDR组；VH MSK21CDR组或VL MSK21CDR组；VH AE10-6AM1CDR组和VL AE10-6AM1CDR组；VH AE10-6AM2CDR组和VL AE10-6AM2CDR组；VH AE10-6AM3CDR组和VL AE10-6AM3CDR组；VH AE10-6AM4CDR组和VL AE10-6AM4CDR组；VH AE10-6AM5CDR组和VL AE10-6AM5CDR组；VH AE10-6AM6CDR组和VL AE10-6AM6CDR组；VH AE10-6AM7CDR组和VLAE10-6AM7CDR组；VH AE10-6AM8CDR组和VL AE10-6AM8CDR组；VH AE10-6AM9CDR组和VL AE10-6AM9CDR组；VH AE10-6AM10CDR组和VL AE10-6AM10CDR组；VH MSL10AM1CDR组和VL MSL10AM1CDR组；VH MSL10AM2CDR组和VL MSL10AM2CDR组；VH MSL10AM3CDR组和VL MSL10AM3CDR组；VH MSL10AM4CDR组和VLMSL10AM4CDR组；VH MSL10AM5CDR组和VL MSL10AM5CDR组；VH MSL10AM6CDR组和VL MSL10AM6CDR组；VH MSL10AM7CDR组和VL MSL10AM7CDR组；VH MSL10AM8CDR组和VL MSL10AM8CDR组；VH MSL10AM9CDR组和VL MSL10AM9CDR组；VH MSL10AM10CDR组和VL MSL10AM10CDR组；VH MSL10AM1.2CDR组和VLMSL10AM1.2CDR组；VH MSL10AM2.2CDR组和VL MSL10AM2.2CDR组；VH MSL10AM3.2CDR组和VL MS L10AM3.2CDR组；以及VH MSL10AM4.2CDR组和VL MSL10AM4.2CDR组。

在另一个实施例中，本文描述的硬化蛋白结合蛋白包含两个可变结构域，其中第一可变结构域包含选自SEQ ID NO3、5、7、9、11、13、1719-1866、1998-2007、2018和2020-2034的序列，并且其中第二可变结构域包含选自SEQ ID NO4、6、8、10、12、1867-1997、2007-2017、2019和2035-2049的序列。

在另一个实施例中，提供了包括包含V_H的抗原结合结构域的硬化蛋白结合蛋白。在一个实施例中，V_H包含SEQ ID NO3、5、7、9、11、13、1719-1866、1998-2007、2018或2020-2034中的任一个。在另一个实施例中，提供了包括包含V_L的抗原结合结构域的硬化蛋白结合蛋白。在一个实施例中，V_L包含SEQ ID NO4、6、8、10、12、14、1867-1997、2008-2017、2019或2035-2049中的任一个。

在另一个实施例中，提供了包括包含V_H和V_L的抗原结合结构域的硬化蛋白结合蛋白。在一个实施例中，V_H包含SEQ ID NO:3、5、7、9、11或13，并且V_L包含SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、1867-1997、2008-2017、2019或2035-2049。

硬化蛋白结合蛋白可包括包含至少一个构架区氨基酸置换的可替代的人受体构架，其中所述构架的氨基酸序列与所述人受体构架的序列至少65％相同，并且包含与所述人受体构架相同的至少70个氨基酸残基。

在另一个实施例中，硬化蛋白结合蛋白包含可替代的人受体构架，其中所述受体构架包含在关键残基处的至少一个构架区氨基酸置换，所述关键残基包含：

与CDR相邻的残基；

糖基化位点残基；

罕见残基；

能够与人SOST相互作用的残基；

能够与CDR相互作用的残基；

经典残基；

在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；

在游标区(Vernier zone)内的残基；或

在Chothia限定的可变重链CDR1和Kabat限定的第一重链构架重叠的区域中的残基。

在另一个实施例中，本文描述的硬化蛋白结合蛋白还包含下述的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域；人IgG1恒定结构域；人IgG2恒定结构域；人IgG3恒定结构域；人IgG4恒定结构域；人IgE恒定结构域；或人IgA恒定结构域。在一个实施例中，重链免疫球蛋白恒定区是人IgG1恒定结构域。在一个实施例中，人IgG1恒定结构域包含SEQ ID NO:1691或SEQ ID NO:1692。

在另一个实施例中，本文描述的硬化蛋白结合蛋白包含轻链免疫球蛋白恒定结构域，其为人Igκ恒定结构域或人Igλ恒定结构域。示例性人Igκ恒定结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1693。示例性人Igλ恒定结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1694。

在另一个实施例中，本文描述的硬化蛋白结合蛋白是免疫球蛋白分子；scFv；单克隆抗体；人抗体；嵌合抗体；人源化抗体；单结构域抗体；Fab片段；Fab'片段；F(ab')2；Fv；或二硫键连接的Fv。在特定实施例中，硬化蛋白结合蛋白是人抗体。

另一个方面提供了能够结合人硬化蛋白的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含：

具有SEQ ID NO:1691或SEQ ID NO:1692的氨基酸序列的Ig恒定重区；

具有SEQ ID NO:1693或SEQ ID NO:1694的氨基酸序列的Ig恒定轻区；

具有SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、1719-1866、1998-2007、2018或2020-2034的氨基酸序列的Ig可变重区；和

具有SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、1867-1997、2008-2017、2019或2035-2049的氨基酸序列的Ig可变轻区。

在一个实施例中，提供了能够结合人硬化蛋白的结合蛋白，并且所述结合蛋白包含：

具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的Ig恒定重区；

具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的Ig恒定轻区；

具有表18中的VH的氨基酸序列的Ig可变重区；

具有SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、1719-1866、1998-2007、2018或2020-2034的VH的氨基酸序列；和

具有SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、1867-1997、2008-2017、2019或2035-2049的VL的氨基酸序列的Ig可变轻区。

另一个方面提供了包含多肽链的多价多特异性DVD结合蛋白，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中

VD1是第一重链可变结构域；

VD2是第二重链可变结构域；

C是重链恒定结构域；

X1是接头，条件是它不是CH1；

X2是Fc区；

(X1)n是(X1)0或(X1)1；(X2)n是(X2)0或(X2)1；和

其中

(a)VD1或VD2包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674或1684，并且结合蛋白能够结合硬化蛋白和另一靶标；

(b)VD1和VD2独立地包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674或1684，并且结合蛋白能够结合硬化蛋白和硬化蛋白；

(c)VD1包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674或1684，VD2包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、472、482、492、502、512、522、532、542、552、562、572、582、592、602、612、622、632、642、652、662、672、682、692、702、712、722、732、742、752、762、772、782、792、802、812、822、832、842、852、862、872、882、892、902、912、922、932、942、952、962、972、982、992、1002、1012、1022、1032、1042、1052、1062、1072、1082、1092、1102、1112、1122、1132、1142、1152、1162、1172、1182、1192、1202、1212、1222、1232、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1342、1352、1362、1372、1382、1392、1402、1412、1422、1432、1442、1452、1462、1472、1482、1492、1502、1512、1522、1532、1542、1552、1562、1572、1582、1592、1602、1612、1622、1632、1642、1652、1662、1672或1682，并且结合蛋白能够结合硬化蛋白和TNF-α；或

(d)VD2包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624或634，VD1包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、472、482、492、502、512、522、532、542、552、562、572、582、592、602、612、622、632、642、652、662、672、682、692、702、712、722、732、742、752、762、772、782、792、802、812、822、832、842、852、862、872、882、892、902、912、922、932、942、952、962、972、982、992、1002、1012、1022、1032、1042、1052、1062、1072、1082、1092、1102、1112、1122、1132、1142、1152、1162、1172、1182、1192、1202、1212、1222、1232、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1342、1352、1362、1372、1382、1392、1402、1412、1422、1432、1442、1452、1462、1472、1482、1492、1502、1512、1522、1532、1542、1552、1562、1572、1582、1592、1602、1612、1622、1632、1642、1652、1662、1672或1682，并且结合蛋白能够结合TNF-α和硬化蛋白。

在上文描述的DVD结合蛋白的一个实施例中，VD1-(X1)n-VD2包含SEQ ID NO:21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、481、491、501、511、521、531、541、551、561、571、581、591、601、611、621、631、641、651、661、671、681、691、701、711、721、731、741、751、761、771、781、791、801、811、821、831、841、851、861、871、881、891、901、911、921、931、941、951、961、971、981、991、1001、1011、1021、1031、1041、1051、1061、1071、1081、1091、1101、1111、1121、1131、1141、1151、1161、1171、1181、1191、1201、1211、1221、1231、1241、1251、1261、1271、1281、1291、1301、1311、1321、1331、1341、1351、1361、1371、1381、1391、1401、1411、1421、1431、1441、1451、1461、1471、1481、1491、1501、1511、1521、1531、1541、1551、1561、1571、1581、1591、1601、1611、1621、1631、1641、1651、1661、1671或1681。

VD1是第一轻链可变结构域；

VD2是第二轻链可变结构域；

C是轻链恒定结构域；

X1是接头，条件是它不是CL；

X2不包含Fc区；

(X1)n是(X1)0或(X1)1；

(X2)n是(X2)0或(X2)1；和

其中

(a)VD1或VD2包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679或1689，并且结合蛋白能够结合硬化蛋白和另一靶标；

(b)VD1和VD2独立地包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679或1689，并且结合蛋白能够结合硬化蛋白和硬化蛋白；

(c)VD1包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679或1689，VD2包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、387、397、407、417、427、437、447、457、467、477、487、497、507、517、527、537、547、557、567、577、587、597、607、617、627、637、647、657、667、677、687、697、707、717、727、737、747、757、767、777、787、797、807、817、827、837、847、857、867、877、887、897、907、917、927、937、947、957、967、977、987、997、1007、1017、1027、1037、1047、1057、1067、1077、1087、1097、1107、1117、1127、1137、1147、1157、1167、1177、1187、1197、1207、1217、1227、1237、1247、1257、1267、1277、1287、1297、1307、1317、1327、1337、1347、1357、1367、1377、1387、1397、1407、1417、1427、1437、1447、1457、1467、1477、1487、1497、1507、1517、1527、1537、1547、1557、1567、1577、1587、1597、1607、1617、1627、1637、1647、1657、1667、1677或1687，并且结合蛋白能够结合硬化蛋白和TNF-α；或

(d)VD2包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679或1689，VD1包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、387、397、407、417、427、437、447、457、467、477、487、497、507、517、527、537、547、557、567、577、587、597、607、617、627、637、647、657、667、677、687、697、707、717、727、737、747、757、767、777、787、797、807、817、827、837、847、857、867、877、887、897、907、917、927、937、947、957、967、977、987、997、1007、1017、1027、1037、1047、1057、1067、1077、1087、1097、1107、1117、1127、1137、1147、1157、1167、1177、1187、1197、1207、1217、1227、1237、1247、1257、1267、1277、1287、1297、1307、1317、1327、1337、1347、1357、1367、1377、1387、1397、1407、1417、1427、1437、1447、1457、1467、1477、1487、1497、1507、1517、1527、1537、1547、1557、1567、1577、1587、1597、1607、1617、1627、1637、1647、1657、1667、1677或1687，并且结合蛋白能够结合TNF-α和硬化蛋白。

在上文描述的DVD结合蛋白的一个实施例中，VD1-(X1)n-VD2包含SEQ ID NO:26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、386、396、406、416、426、436、446、456、466、476、486、496、506、516、526、536、546、556、566、576、586、596、606、616、626、636、646、656、666、676、686、696、706、716、726、736、746、756、766、776、786、796、806、816、826、836、846、856、866、876、886、896、906、916、926、936、946、956、966、976、986、996、1006、1116、1126、1136、1146、1156、1166、1176、1186、1196、1206、1216、1226、1236、1246、1256、1266、1276、1286、1296、1306、1316、1326、1336、1346、1356、1366、1376、1386、1396、1406、1416、1426、1436、1446、1456、1466、1476、1486、1496、1506、1516、1526、1536、1546、1556、1566、1576、1586、1596、1606、1616、1626、1636、1646、1656、1666、1676或1686。

另一个实施例提供了包含第一和第二多肽链的多价多特异性DVD-A结合蛋白，其中所述第一多肽链包含第一VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中

VD1是第一重链可变结构域；

VD2是第二重链可变结构域；

C是重链恒定结构域；

X1是第一接头；

X2是Fc区；

(X1)n是(X1)0或(X1)1；

(X2)n是(X2)0或(X2)1；和

其中所述第二多肽链包含第二VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中

VD1是第一轻链可变结构域；

VD2是第二轻链可变结构域；

C是轻链恒定结构域；

X1是第二接头；

X2不包含Fc区；(X1)n是(X1)0或(X1)1；

(X2)n是(X2)0或(X2)1；和

其中所述第一和第二X1接头是相同或不同的；

其中所述第一X1接头不是CH1和/或所述第二X1接头不是CL，和

其中

(a)VD1或VD2重链可变结构域包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674或1684，VD1或VD2轻链可变结构域包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679或1689，并且结合蛋白能够结合硬化蛋白和另一靶标；

(b)VD1和VD2重链可变结构域独立地包含来自下述的三个CDR：SEQID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674或1684，VD1或VD2轻链可变结构域包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679或1689，并且结合蛋白能够结合硬化蛋白和硬化蛋白；

(c)VD1重链可变结构域包含来自下述的三个CDR：24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674或1684，VD2重链可变结构域包含来自下述的三个CDR：SEQID NO:22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、472、482、492、502、512、522、532、542、552、562、572、582、592、602、612、622、632、642、652、662、672、682、692、702、712、722、732、742、752、762、772、782、792、802、812、822、832、842、852、862、872、882、892、902、912、922、932、942、952、962、972、982、992、1002、1012、1022、1032、1042、1052、1062、1072、1082、1092、1102、1112、1122、1132、1142、1152、1162、1172、1182、1192、1202、1212、1222、1232、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1342、1352、1362、1372、1382、1392、1402、1412、1422、1432、1442、1452、1462、1472、1482、1492、1502、1512、1522、1532、1542、1552、1562、1572、1582、1592、1602、1612、1622、1632、1642、1652、1662、1672或1682；VD1轻链可变结构域包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679或1689，VD2轻链可变结构域包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、387、397、407、417、427、437、447、457、467、477、487、497、507、517、527、537、547、557、567、577、587、597、607、617、627、637、647、657、667、677、687、697、707、717、727、737、747、757、767、777、787、797、807、817、827、837、847、857、867、877、887、897、907、917、927、937、947、957、967、977、987、997、1007、1017、1027、1037、1047、1057、1067、1077、1087、1097、1107、1117、1127、1137、1147、1157、1167、1177、1187、1197、1207、1217、1227、1237、1247、1257、1267、1277、1287、1297、1307、1317、1327、1337、1347、1357、1367、1377、1387、1397、1407、1417、1427、1437、1447、1457、1467、1477、1487、1497、1507、1517、1527、1537、1547、1557、1567、1577、1587、1597、1607、1617、1627、1637、1647、1657、1667、1677或1687，并且结合蛋白能够结合硬化蛋白和TNF-α；或

(d)VD2重链可变结构域包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674或1684，VD1重链可变结构域包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、472、482、492、502、512、522、532、542、552、562、572、582、592、602、612、622、632、642、652、662、672、682、692、702、712、722、732、742、752、762、772、782、792、802、812、822、832、842、852、862、872、882、892、902、912、922、932、942、952、962、972、982、992、1002、1012、1022、1032、1042、1052、1062、1072、1082、1092、1102、1112、1122、1132、1142、1152、1162、1172、1182、1192、1202、1212、1222、1232、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1342、1352、1362、1372、1382、1392、1402、1412、1422、1432、1442、1452、1462、1472、1482、1492、1502、1512、1522、1532、1542、1552、1562、1572、1582、1592、1602、1612、1622、1632、1642、1652、1662、1672或1682；VD2轻链可变结构域包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679或1689，VD1轻链可变结构域包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、387、397、407、417、427、437、447、457、467、477、487、497、507、517、527、537、547、557、567、577、587、597、607、617、627、637、647、657、667、677、687、697、707、717、727、737、747、757、767、777、787、797、807、817、827、837、847、857、867、877、887、897、907、917、927、937、947、957、967、977、987、997、1007、1017、1027、1037、1047、1057、1067、1077、1087、1097、1107、1117、1127、1137、1147、1157、1167、1177、1187、1197、1207、1217、1227、1237、1247、1257、1267、1277、1287、1297、1307、1317、1327、1337、1347、1357、1367、1377、1387、1397、1407、1417、1427、1437、1447、1457、1467、1477、1487、1497、1507、1517、1527、1537、1547、1557、1567、1577、1587、1597、1607、1617、1627、1637、1647、1657、1667、1677或1687，并且结合蛋白能够结合TNF-α和硬化蛋白。

在上文描述的DVD结合蛋白的一个实施例中，其中X1或X2为SEQ IDNO:1695、1696、1697、1698、1699、1700、1701、1702、1703、1704、1705、1706、1707、1708、1709、1710、1711、1712、1713、1714、1715、1716、2050、2051、2052、2053、2054、2055、2056、2057、2058和2059。

另一个实施例提供了包含四条多肽链的能够结合两个抗原的多价多特异性DVD-A结合蛋白，其中两条多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中

VD1是第一重链可变结构域；

VD2是第二重链可变结构域；

C是重链恒定结构域；

X1是第一接头；

X2是Fc区；

(X1)n是(X1)0或(X1)1；

(X2)n是(X2)0或(X2)1；和

其中两条多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中

VD1是第一轻链可变结构域；

VD2是第二轻链可变结构域；

C是轻链恒定结构域；

X1是第二接头；

X2不包含Fc区；

(X1)n是(X1)0或(X1)1；

(X2)n是(X2)0或(X2)1；和

其中所述第一和第二X1接头是相同或不同的；

其中所述第一X1接头不是CH1和/或所述第二X1接头不是CL，和

其中

(c)VD1重链可变结构域包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674或1684，VD2重链可变结构域包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、472、482、492、502、512、522、532、542、552、562、572、582、592、602、612、622、632、642、652、662、672、682、692、702、712、722、732、742、752、762、772、782、792、802、812、822、832、842、852、862、872、882、892、902、912、922、932、942、952、962、972、982、992、1002、1012、1022、1032、1042、1052、1062、1072、1082、1092、1102、1112、1122、1132、1142、1152、1162、1172、1182、1192、1202、1212、1222、1232、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1342、1352、1362、1372、1382、1392、1402、1412、1422、1432、1442、1452、1462、1472、1482、1492、1502、1512、1522、1532、1542、1552、1562、1572、1582、1592、1602、1612、1622、1632、1642、1652、1662、1672或1682；VD1轻链可变结构域包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679或1689，VD2轻链可变结构域包含来自下述的三个CDR：SEQ ID NO:27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、387、397、407、417、427、437、447、457、467、477、487、497、507、517、527、537、547、557、567、577、587、597、607、617、627、637、647、657、667、677、687、697、707、717、727、737、747、757、767、777、787、797、807、817、827、837、847、857、867、877、887、897、907、917、927、937、947、957、967、977、987、997、1007、1017、1027、1037、1047、1057、1067、1077、1087、1097、1107、1117、1127、1137、1147、1157、1167、1177、1187、1197、1207、1217、1227、1237、1247、1257、1267、1277、1287、1297、1307、1317、1327、1337、1347、1357、1367、1377、1387、1397、1407、1417、1427、1437、1447、1457、1467、1477、1487、1497、1507、1517、1527、1537、1547、1557、1567、1577、1587、1597、1607、1617、1627、1637、1647、1657、1667、1677或1687，并且结合蛋白能够结合硬化蛋白和TNF-α；或

在本文描述的多价多特异性DVD结合蛋白的一个实施例中，n为0。

提供了多价多特异性DVD结合蛋白的一个实施例，其中X1或X2为SEQ ID NO:1695、1696、1697、1698、1699、1700、1701、1702、1703、1704、1705、1706、1707、1708、1709、1710、1711、1712、1713、1714、1715、1716、2050、2051、2052、2053、2054、2055、2056、2057、2058和2059。

在另一个实施例中，本文描述的多价多特异性DVD结合蛋白包含两条第一多肽链和两条第二多肽链。

在本文描述的多价多特异性DVD结合蛋白的一个实施例中，Fc区是天然序列Fc区或变体序列Fc区。

在一个实施例中，Fc区是来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的Fc区。

在本文描述的包含第一和第二多肽链的多价多特异性DVD结合蛋白的另一个实施例中，第一多肽链的VD1和第二多肽链的所述VD1分别得自相同的第一和第二亲本抗体、或其抗原结合部分。

在本文描述的TNF-α和硬化蛋白DVD结合蛋白的一个实施例中，亲本抗TNF-α抗体结合TNF-α的效力不同于亲本抗硬化蛋白抗体结合人硬化蛋白的效力。

在本文描述的TNF-α和SOST DVD结合蛋白的另一个实施例中，亲本抗TNF-α抗体结合TNF-α的亲和力不同于所述抗硬化蛋白抗体结合人硬化蛋白的亲和力。

在本文描述的TNF-α和SOST DVD结合蛋白的另一个实施例中，抗TNF-α抗体和所述抗硬化蛋白抗体是人抗体、CDR移植抗体或人源化抗体。

在另一个实施例中，本文描述的TNF-α和SOST DVD结合蛋白具有由所述抗TNF-α抗体或所述抗硬化蛋白抗体显示出的至少一种所需特性。在一个实施例中，所需特性是一种或多种抗体参数。在一个实施例中，抗体参数是抗原特异性、对抗原的亲和力、效力、生物学功能、表位识别、稳定性、可溶性、生产效率、免疫原性、药物代谢动力学、生物利用度、组织交叉反应性或直向同源抗原结合。

另一个实施例提供了产生本文描述的多价多特异性DVD结合蛋白的方法，其包括在足以产生结合蛋白的条件下，在培养基中培养携带载体的宿主细胞，所述载体包含本文描述的核酸。在一个实施例中，根据该方法产生的50％-75％的结合蛋白是本文描述的双重特异性四价DNA结合蛋白。在一个实施例中，根据该方法产生的75％-90％的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。在一个实施例中，产生的90％-95％的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。

另一个实施例提供了根据所述方法产生的蛋白质。

在另一个实施例中，提供了包含本文描述的多价多特异性DVD结合蛋白和药学可接受的载体的药物组合物。

在另一个实施例中，包含多价多特异性DVD结合蛋白的药物组合物还包含至少一种另外的试剂。在一个实施例中，另外的试剂是治疗剂；显像剂；细胞毒性剂；血管生成抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻滞剂；粘附分子阻滞剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；氨甲蝶呤；环孢素；雷帕霉素；FK506；可检测标记或报道物；TNF拮抗剂；抗风湿药；肌肉松弛剂、麻醉药、非类固醇抗炎药(NSAID)；止痛剂；麻醉剂；镇静剂；局部麻醉剂；神经肌肉阻滞剂；抗微生物剂；抗牛皮癣药；皮质类固醇；同化类固醇；促红细胞生成素；免疫接种；免疫球蛋白；免疫抑制剂；生长激素；激素替代药物；放射性药物；抗抑郁药；抗精神病药物；刺激物；哮喘药物；β激动剂；吸入类固醇；肾上腺素或类似物；细胞因子；或细胞因子拮抗剂。

另一个实施例提供了用于就疾病或障碍治疗受试者的方法，其通过给受试者施用本文描述的多价多特异性DVD结合蛋白(其结合TNF-α和硬化蛋白)，使得实现治疗。

提供了用于生成本文描述的多价多特异性DVD结合蛋白的方法，其包括下述步骤：

a)获得第一亲本抗体或其抗原结合部分；

b)获得第二亲本抗体或其抗原结合部分；

c)构建本文描述的多肽链；

e)表达所述多肽链；

使得生成DVD结合蛋白。

在上文描述的方法的另一个实施例中，所述第一亲本抗体或其抗原结合部分、和所述第二亲本抗体或其抗原结合部分是人抗体、CDR移植抗体或人源化抗体。

在上文描述的方法的另一个实施例中，所述第一亲本抗体或其抗原结合部分、和所述第二亲本抗体或其抗原结合部分是Fab片段、F(ab')₂片段、包含在铰链区处由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)、单链抗体或双抗体(diabody)。

在该方法的另一个实施例中，第一亲本抗体或其抗原结合部分具有由DVD结合蛋白显示出的至少一种所需特性。

在上述方法的另一个实施例中，第二亲本抗体或其抗原结合部分具有由DVD结合蛋白显示出的至少一种所需特性。

在一个实施例中，在上文描述的方法中，Fc区是天然序列Fc区或变体序列Fc区。在一个实施例中，Fc区是来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的Fc区。

在另一个实施例中，在上文描述的方法中，所需特性是第一亲本抗体或其抗原结合部分的一种或多种抗体参数。

在另一个实施例中，在上文描述的方法中，所需特性是第二亲本抗体的一种或多种抗体参数。

在一个实施例中，所述抗体参数是抗原特异性、对抗原的亲和力、效力、生物学功能、表位识别、稳定性、可溶性、生产效率、免疫原性、药物代谢动力学、生物利用度、组织交叉反应性或直向同源抗原结合。

在上文描述的方法的另一个实施例中，第一亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第一抗原的亲和力不同于所述第二亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第二抗原的亲和力。

在另一个实施例中，第一亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第一抗原的效力不同于所述第二亲本抗体或其抗原结合部分结合所述第二抗原的效力。

在另一个实施例中，本文描述的硬化蛋白结合蛋白结合人硬化蛋白且能够调节SOST的生物学功能。

提供了中和结合蛋白，其中该中和结合蛋白包含如上所述的硬化蛋白结合蛋白，并且其中所述中和结合蛋白能够中和硬化蛋白。

在另一个实施例中，提供了结合前人硬化蛋白、成熟人硬化蛋白或截短的人硬化蛋白的中和硬化蛋白结合蛋白。

在一个实施例中，本文描述的中和硬化蛋白结合蛋白减少硬化蛋白与其受体结合的能力。在一个实施例中，中和硬化蛋白结合蛋白减少前人硬化蛋白、成熟人硬化蛋白或截短的人硬化蛋白与硬化蛋白受体结合的能力。

在另一个实施例中，本文描述的中和硬化蛋白结合蛋白能够降低硬化蛋白生物活性中的一种或多种，包括：包括成骨细胞分化和成骨细胞功能的抑制，导致骨形成的抑制。

在一个实施例中，提供了如通过表面等离子共振测量的，与所述靶标具有下述结合速率常数(K_on)的硬化蛋白结合蛋白：至少约10²M^-1s^-1；至少约10³M^-1s^-1；至少约10⁴M^-1s^-1；至少约10⁵M^-1s^-1；或至少约10⁶M^-1s^-1。

在另一个实施例中，提供了如通过表面等离子共振测量的，与所述靶标具有下述离开速率常数(K_off)的硬化蛋白结合蛋白：至多约10^-3s^-1；至多约10^-4s^-1；至多约10^-5s^-1；或至多约10^-6s^-1。

在另一个实施例中，提供了与所述靶标具有下述解离常数(K_D)的硬化蛋白结合蛋白：至多约10^-7M；至多约10^-8M；至多约10^-9M；至多约10^-10M；至多约10^-11M；至多约10^-12M；或至多10^-13M。

另一个方面提供了硬化蛋白结合蛋白构建体，其包含本文描述的硬化蛋白结合蛋白，并且还包含接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域。在一个实施例中，提供了硬化蛋白结合蛋白构建体，其中所述构建体包含下述硬化蛋白结合蛋白：免疫球蛋白分子、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、Fab’、双特异性抗体、F(ab’)2、Fv或DVD结合蛋白。

在一个实施例中，提供了硬化蛋白结合蛋白构建体，其中所述构建体包含下述重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域、人IgG4恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgE恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域或人IgA恒定结构域。

在另外一个实施例中，硬化蛋白结合蛋白构建体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1691；SEQ ID NO:1692；SEQ ID NO:1693；和SEQ ID NO:1694的免疫球蛋白恒定结构域。

在另一个实施例中，本文描述的硬化蛋白结合蛋白构建体具有比所述硬化蛋白结合蛋白构建体的可溶配对物(counterpart)更大的体内半衰期。

另一个方面提供了包含硬化蛋白结合蛋白构建体的硬化蛋白结合蛋白缀合物，其中所述硬化蛋白结合蛋白缀合物还包含免疫粘附分子、显像剂、治疗剂或细胞毒性剂。

提供了可用于制备硬化蛋白结合蛋白的示例性显像剂，并且所述示例性显像剂包括但不限于放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。

提供了示例性放射性标记，并且所述示例性放射性标记包括但不限于³H_、 ¹⁴C_、 ³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho或¹⁵³Sm。

在一个实施例中，提供了包含治疗剂或细胞毒性剂的硬化蛋白结合蛋白缀合物，所述试剂还包含抗代谢药、烷基化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环、毒素或细胞凋亡试剂。

在另一个实施例中，本文描述的结合蛋白具有人糖基化模式。

在另一个实施例中，本文描述的硬化蛋白结合蛋白包括硬化蛋白结合蛋白构建体和硬化蛋白结合蛋白缀合物，可以结晶结合蛋白的形式。示例性晶形保留本文描述的硬化蛋白结合蛋白的未结晶形式的生物活性中的至少一些。此类晶形还可用作无载体药物控制释放的结晶硬化蛋白结合蛋白。

另一个实施例提供了编码本文描述的硬化蛋白结合蛋白、包括结合蛋白构建体的分离的核酸。此类核酸可插入载体内，以用于进行多种遗传分析和重组技术，用于表达、表征或改善本文描述的硬化蛋白结合蛋白的一种或多种特性。用于克隆编码本文描述的结合蛋白的核酸的示例性载体包括但不限于pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ。

本文提供且描述了包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码结合蛋白的核酸。提供了宿主细胞，并且所述宿主细胞可以是原核或真核的。示例性原核宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。提供了可用作宿主细胞的真核细胞，并且所述真核细胞包括原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。

示例性真菌细胞是酵母细胞，包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。提供了可用作宿主细胞的示例性动物细胞，并且所述示例性动物细胞包括但不限于哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞。示例性哺乳动物细胞包括CHO和COS细胞。提供了可用作宿主细胞的昆虫细胞，并且所述昆虫细胞为昆虫Sf9细胞。

载体可包含编码本文描述的硬化蛋白结合蛋白的核酸，其中该核酸可操作地连接至适当的转录和/或翻译序列，以允许在携带载体的特定宿主细胞中表达结合蛋白。

另一个方面提供了产生硬化蛋白结合蛋白的方法，其包括在足以产生能够结合硬化蛋白的结合蛋白的条件下，在培养基中培养包含编码硬化蛋白结合蛋白的载体的宿主细胞。如此产生的蛋白质可分离且用于本文描述的多种组合物和方法中。

提供了组合物，并且所述组合物包括用于释放结合蛋白的组合物，其中所述组合物包含：(a)制剂，其中所述制剂包含本文描述的结晶结合蛋白，和成分；和(b)至少一种聚合物载体。

提供了可用于组合物的示例性聚合物载体，并且所述示例性聚合物载体包括但不限于下述中的一种或多种：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(缩酚酸肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸共乙醇酸)或PLGA、聚(b-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二氧环己酮)；聚(乙二醇)、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有机)磷腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、马来酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、复合多元醇、白蛋白、海藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、其掺和物和共聚物。

在另一个方面，提供了组合物的成分，其中该成分是白蛋白、蔗糖、海藻糖、拉克替醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇或聚乙二醇。

另一个实施例提供了用于处理哺乳动物的方法，其包括给哺乳动物施用有效量的本文描述的组合物的步骤。

提供了包含本文描述的硬化蛋白结合蛋白和药学可接受的载体的药物组合物。药学可接受的载体还可充当佐剂以增加组合物中的硬化蛋白结合蛋白的吸收或分散。示例性佐剂是透明质酸酶。

在另一个实施例中，药物组合物还包含用于治疗其中SOST活性是有害的障碍的至少一种另外的治疗剂。

另一个实施例提供了用于降低人SOST活性的方法，其包括使人SOST与本文的硬化蛋白结合蛋白接触，使得人SOST活性降低。

在另一个实施例中，包含本文描述的硬化蛋白结合蛋白的药物组合物包含至少一种另外的试剂。在一个实施例中，另外的试剂是治疗剂；显像剂；细胞毒性剂；血管生成抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻滞剂；粘附分子阻滞剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；氨甲蝶呤；环孢素；雷帕霉素；FK506；可检测标记或报道物；TNF拮抗剂；抗风湿药；肌肉松弛剂；麻醉药；非类固醇抗炎药(NSAID)；止痛剂；麻醉剂；镇静剂；局部麻醉剂；神经肌肉阻滞剂；抗微生物剂；抗牛皮癣药；皮质类固醇；同化类固醇；促红细胞生成素；免疫接种；免疫球蛋白；免疫抑制剂；生长激素；激素替代药物；放射性药物；抗抑郁药；抗精神病药物；刺激物；哮喘药物；β激动剂；吸入类固醇；肾上腺素或类似物；细胞因子；或细胞因子拮抗剂。另一个实施例提供了用于就疾病或障碍治疗受试者的方法，其通过给受试者施用本文描述的多价多特异性DVD结合蛋白(其结合TNF-α和硬化蛋白)，使得实现治疗。

在另一个实施例中，提供了可通过给受试者施用本文描述的硬化蛋白结合蛋白的方法治疗的障碍，其中该障碍是类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、系统性红斑狼疮、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变态反应性疾病、牛皮癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉瘤样病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、川崎病、格雷夫斯氏病、肾病变综合征、慢性疲劳综合症、韦格纳氏肉芽肿、过敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、肾的微观脉管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒症综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗塞、阿狄森氏病、散发性多腺体缺陷I型和多腺体缺陷II型、施密特氏综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、脱发、斑秃、血清反应阴性关节病、关节病、莱特氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体属、耶尔森氏菌属和沙门氏菌属相关关节病、脊椎关节病、动脉粥样硬化性疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫溶血性贫血、库姆斯阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、幼年型恶性贫血、肌痛性脑炎/Royal Free病、慢性皮肤粘膜念珠菌病、巨细胞动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关疾病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见变异型免疫缺陷病(常见变异型低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢功能衰竭、卵巢早衰、纤维化肺病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关间质性肺病、混合性结缔组织病相关肺病、系统性硬化病相关间质性肺病、类风湿性关节炎相关间质性肺病、系统性红斑狼疮相关肺病、皮肌炎/多肌炎相关肺病、斯耶格伦氏病相关肺病、强直性脊柱炎相关肺病、脉管炎弥漫性肺病、含铁血黄素沉着相关肺病、药物诱发性间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性粒细胞肺炎、淋巴细胞浸润性肺病、传染后的间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(经典自身免疫性或类狼疮性肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、B型胰岛素抗性伴黑棘皮症、甲状旁腺功能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少症、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎、肾的微观脉管炎、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育或NOS、精子自身免疫、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、古德帕斯丘氏综合征、结节性多动脉炎的肺部表现、急性风湿热、类风湿性脊柱炎、斯蒂尔病、系统性硬化病、干燥综合征、高安氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺功能亢进、甲状腺肿自身免疫性甲状腺功能减退(桥本氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体源性葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风、急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精诱发性肝损伤、胆汁淤积、异质性肝病、药物诱发性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、过敏症和哮喘、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如抑郁和精神分裂症)、Th2型和Th型介导的疾病、急性和慢性疼痛(不同形式的疼痛)、和癌症例如肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和直肠癌和造血系统恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生或传染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾衰竭、腺癌、空中异位搏动、AIDS痴呆复合征、酒精诱发性肝炎、变应性结膜炎、变应性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、肌萎缩侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞变性、抗CD3治疗、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉和外周动脉瘤、主动脉夹层、动脉高血压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、伯基特氏淋巴瘤、烧伤、心律不齐、心脏眩晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺转流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮层变性、小脑障碍、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关障碍、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理状态、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、克雅氏病、培养阴性脓毒症、囊性纤维化、细胞因子治疗相关障碍、拳击员痴呆、脱髓鞘疾病、登革出血热、皮炎、皮肤病症、糖尿病(diabetes)、糖尿病(diabetes mellitus)、糖尿病动脉硬化性疾病、弥漫性路易体疾病、扩张型充血性心肌病、基底神经节障碍、中年唐氏综合症、由阻滞CNS多巴胺受体的药物诱发的药物诱发性运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛、锥体束外和小脑障碍、家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺植入物排斥、弗里德里希氏共济失调、功能性外周动脉障碍、真菌性脓毒症、气性坏疽、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒症、革兰氏阳性脓毒症、由于胞内生物的肉芽肿、多毛细胞性白血病、哈-斯二氏(Hallervorden-Spatz)病、桥本氏甲状腺炎、花粉热、心脏移植排斥、血色素沉着、血液透析、溶血性尿毒症综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律失常、HIV感染/HIV神经病变、霍奇金氏病、多动性运动障碍、超敏反应、过敏性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评估、特发性阿狄森氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、无力、婴儿脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、A型流感、电离辐射暴露、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血-再灌注损伤、缺血性中风、幼年型类风湿性关节炎、幼年型脊髓性肌萎缩、卡波济氏肉瘤、肾移植排斥、军团菌属、利什曼病、麻风病、皮质脊髓系统损害、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢/特发性、偏头痛、线粒体多系统障碍、混合性结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性病(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph)、重症肌无力、鸟胞内分枝杆菌、结核分枝杆菌、骨髓发育不良综合征、心肌梗塞、心肌缺血性障碍、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾病变、神经变性疾病、神经源性I肌肉萎缩、嗜中性粒细胞减少性发热、非霍奇金淋巴瘤、腹主动脉及其分支阻塞、阻塞性动脉障碍、疗法、睾丸炎/附睾炎、睾丸炎/输精管切除术逆转过程、器官巨大症、骨质疏松症、胰腺移植排斥、胰腺癌、副肿瘤综合征/恶性肿瘤的血钙过多、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周动脉粥样硬化疾病、外周血管障碍、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫肺炎、肺炎、POEMS综合征(多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤改变综合征)、灌注后综合征、泵后综合征、MI后心切开术综合征、先兆子痫、进行性核上性麻痹、原发性肺动脉高压、放射疗法、雷诺现象和雷诺氏病、雷诺氏病、雷弗素姆氏病、规则的窄QRS波心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈症、路易体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、中风、镰状细胞性贫血、皮肤同种移植物排斥、皮肤改变综合征、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损害、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统的梅毒、全身过敏、系统性炎症应答综合征、全身性幼年型类风湿性关节炎、T细胞或FABALL、毛细管扩张、闭塞性血栓性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定型心绞痛、尿毒症、尿脓毒症、荨麻疹、心脏瓣膜病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关的出血性综合征、韦-科二氏(Wernicke-Korsakoff)综合征、威尔逊氏病、任何器官或组织的异种移植物排斥、急性冠状动脉综合征、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘多发性神经根神经病、急性缺血、成人斯蒂尔氏病、斑秃、过敏反应、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、动脉硬化、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌属感染相关的自身免疫障碍、自身免疫性肠病变、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴组织增生综合征(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢早衰、睑缘炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管疾病、灾难性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈椎病、慢性缺血、瘢痕性类天疱疮、具有多发性硬化危险的临床孤立综合征(cis)、结膜炎、儿童期起病的精神障碍、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病视网膜病变、糖尿病、椎间盘突出、椎间盘脱出、药物诱发性免疫性溶血性贫血、心内膜炎、子宫内膜异位症、眼内炎、巩膜外层炎、多形红斑、重症多形红斑、妊娠性类天疱疮、格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征(GBS)、花粉热、休斯综合征、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、包涵体肌炎、传染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾疾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角结膜炎、库斯毛尔病或库-迈二氏(Kussmaul-Meier)病、兰德里氏麻痹、郎格罕氏细胞组织细胞增生症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多血管炎、白赫铁列夫症(morbus bechterev)、运动神经元障碍、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、重症肌无力、骨髓发育不良综合征、心肌炎、神经根障碍、神经病变、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、卵巢癌、少关节JRA、外周动脉阻塞性疾病(PAOD)、外周血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、静脉炎、结节性多动脉炎(或结节性动脉外周炎)、多软骨炎、风湿性多肌痛、白发症、多关节JRA、多内分泌腺缺陷综合征、多肌炎、风湿性多肌痛(PMR)、泵后综合征、原发性帕金森病、前列腺和直肠癌和造血系统恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不全、复发性视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、硬皮病、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不全、硅酮相关结缔组织病、斯-威二氏(sneddon-wilkinson)皮肤病、强直性脊柱炎、斯-约二氏(Stevens-Johnson)综合征(SJS)、全身性炎症应答综合征、颞动脉炎、弓形体性视网膜炎、中毒性表皮坏死松解症、横贯性脊髓炎、TRAPS(肿瘤坏死因子受体、1型变态反应、II型糖尿病、荨麻疹、寻常性间质性肺炎(UIP)、血管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、伏格特-小柳-原田三氏(Vogt-Koyanagi-Harada)综合征(VKH综合征)、湿性黄斑变性、伤口愈合或耶尔森氏菌属和沙门氏菌属相关关节病。

另一个实施例提供了用于就其中SOST活性是有害的疾病或障碍治疗受试者的方法，其通过给受试者施用本文描述的硬化蛋白结合蛋白，使得实现治疗。该方法可用于治疗呼吸障碍；哮喘；变态反应性和非变态反应性哮喘；由于感染的哮喘；由于由呼吸道合胞病毒(RSV)感染的哮喘；慢性阻塞性肺疾病(COPD)、涉及气道炎症的其他病症；嗜酸性细胞增多症；纤维化和粘液产生过多；囊性纤维化；肺纤维化；特应性障碍；特应性皮炎；荨麻疹；湿疹；变应性鼻炎；和变应性肠胃炎；皮肤的炎性和/或自身免疫性病症；胃肠道器官的炎性和/或自身免疫性病症；炎性肠病(IBD)；溃疡性结肠炎；克罗恩氏病；肝的炎性和/或自身免疫性病症；肝硬化；肝纤维化；由乙型肝炎和/或丙型肝炎病毒引起的肝纤维化；硬皮病；肿瘤或癌症；肝细胞癌；成胶质细胞瘤；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤；病毒感染；HTLV-1感染(例如来自HTLV-1)；保护性1型免疫应答表达的阻抑、或在疫苗接种过程中保护性1型免疫应答表达的阻抑。

在上述方法的进一步实施例中，对受试者的施用是通过肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内(intracolic)、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内(intraosteal)、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮。

提供了治疗患有其中硬化蛋白是有害的障碍的患者的方法，其包括在施用第二试剂之前、同时或之后施用本文描述的硬化蛋白结合蛋白的步骤，其中所述第二试剂是吸入类固醇；β-激动剂；短效或长效β-激动剂；白三烯或白三烯受体的拮抗剂；ADVAIR；IgE抑制剂；抗IgE抗体；XOLAIR；磷酸二酯酶抑制剂；PDE4抑制剂；黄嘌呤；抗胆碱能药；肥大细胞稳定剂；色甘酸；IL-4抑制剂；IL-5抑制剂；嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)/CCR3抑制剂；组胺或其受体包括H1、H2、H3和H4的拮抗剂；前列腺素D或其受体DP1和CRTH2的拮抗剂；TNF拮抗剂；TNF受体的可溶片段；TNF酶拮抗剂；TNF转换酶(TACE)抑制剂；毒蕈碱受体拮抗剂；TGF-β拮抗剂；干扰素γ；吡非尼酮；化学治疗剂、氨甲蝶呤；来氟米特；西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物、CCI-779；COX2或cPLA2抑制剂；NSAID；免疫调节剂；p38抑制剂；TPL-2、MK-2和NFkB抑制剂；布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素；柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制剂；美沙拉嗪；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1β抗体；抗IL-6抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF的抗体或激动剂；CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体；FK506；雷帕霉素；霉酚酸酯；布洛芬；泼尼松龙；磷酸二酯酶抑制剂；腺苷激动剂；抗血栓药；补体抑制剂；肾上腺素能剂；IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂；IL-1β转换酶抑制剂；TNF-α转换酶抑制剂；T细胞信号传导抑制剂；金属蛋白酶抑制剂；6-巯嘌呤；血管紧张素转换酶抑制剂；可溶性细胞因子受体；可溶性p55TNF受体；可溶性p75TNF受体；sIL-1RI；sIL-1RII；sIL-6R；抗炎细胞因子；IL-4；IL-10；IL-11；SOST；或TGF-β。

附图说明

图1A是双重可变结构域(DVD)构建体的图示，并且显示由两个亲本抗体生成DVD结合蛋白的策略。

图1B是构建体DVD1-Ig、DVD2-Ig和两个嵌合单特异性抗体克隆的图示。

图2证实抗TNF、抗硬化蛋白或组合疗法对诱发性关节炎的小鼠模型中的足肿胀的作用。图2A显示当用抗小鼠TNF mAb、抗硬化蛋白mAb、或抗小鼠TNF mAb和抗硬化蛋白mAb的组合给药时，爪厚度的变化。图2B显示当用抗小鼠TNF mAb、抗硬化蛋白mAb、或抗小鼠TNF mAb和抗硬化蛋白mAb的组合给药时的关节炎踝骨体积。图2C显示当用抗小鼠TNFmAb、抗硬化蛋白mAb、或抗小鼠TNF mAb和抗硬化蛋白mAb的组合给药时，在腰椎(L5)中的小梁骨的骨密度。

图3显示抗SOST抗体的比对。

图4显示在晚期治疗小鼠胶原诱发性关节炎(CIA)模型中的TNF和SOST的组合中和，其中治疗在炎症发作后五天开始。图4A显示当用抗小鼠TNF mAb、抗硬化蛋白mAb、或抗小鼠TNF mAb和抗硬化蛋白mAb的组合给药时，爪厚度的变化。图4B显示当用抗小鼠TNF mAb、抗硬化蛋白mAb、或抗小鼠TNF mAb和抗硬化蛋白mAb的组合给药时的关节炎踝骨体积。图4C显示当用抗小鼠TNF mAb、抗硬化蛋白mAb、或抗小鼠TNF mAb和抗硬化蛋白mAb的组合给药时，在腰椎(L5)中的小梁骨的骨密度。

图5显示硬化蛋白抑制恢复小鼠中的关节炎关节中的骨的能力，其中治疗在炎症发作后五天开始。图5A显示当用抗IL1α治疗剂和抗IL1β治疗剂、抗硬化蛋白、或抗IL1α治疗剂和抗IL1β治疗剂以及抗硬化蛋白的组合给药时，爪厚度的变化。图5B显示当用抗IL1α治疗剂和抗IL1β治疗剂、抗硬化蛋白、或抗IL1α治疗剂和抗IL1β治疗剂以及抗硬化蛋白的组合给药时的关节炎踝骨体积。图5C显示当用抗IL1α治疗剂和抗IL1β治疗剂、抗硬化蛋白、或抗IL1α治疗剂和抗IL1β治疗剂以及抗硬化蛋白的组合给药时，在腰椎(L5)中的小梁骨的骨密度。

图6显示来自克罗恩氏病的小鼠模型的数据。图6A显示当小鼠用抗TNF mAb、抗硬化蛋白mAb、或抗TNF mAb和抗硬化蛋白mAb的组合给药时的结肠炎症评分。图6B显示当小鼠用抗TNF mAb、抗硬化蛋白mAb、或抗TNF mAb和抗硬化蛋白mAb的组合给药时，在腰椎(L5)中的小梁骨的骨密度。

图7显示结合概况数据，其证实在由TNF饱和后，示例性硬化蛋白/TNFDVD-Ig结合硬化蛋白，并且反之亦然。

具体实施方式

提供了结合硬化蛋白的硬化蛋白结合蛋白，包括但不限于抗硬化蛋白抗体或其抗原结合部分，以及提供了结合SOST和另一靶标的多价多特异性结合蛋白例如DVD结合蛋白。提供了多个方面，其涉及抗体和抗体片段、DVD结合蛋白及其药物组合物、以及用于制备此类硬化蛋白结合蛋白包括抗体、DVD结合蛋白及其片段的核酸、重组表达载体和宿主细胞。还提供了使用硬化蛋白结合蛋白在体外或体内检测人硬化蛋白的方法；和调控基因表达的方法。

还提供了能够与本文描述的硬化蛋白结合蛋白竞争的任何结合蛋白或抗体。

除非本文另有定义，否则科学和技术术语应具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应是明确的，然而，在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。在本专利申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式的使用是非限制性的。另外，除非另有具体说明，否则术语例如“元件”或“组分”包括包含一个单位的元件和组分以及包含超过一个亚单位的元件和组分两者。

一般地，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名法和技术是本领域众所周知和通常使用的。除非另有说明，否则提供的方法和技术一般根据本领域众所周知的且如多种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用且讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文描述的进行。与本文描述的分析化学、有机合成化学、以及医学和药物化学结合使用的命名法、以及实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送、以及患者治疗。

为了提供的内容可更容易理解，下文定义了所选术语。

术语“多肽”指氨基酸的任何聚合物链。术语“肽”和“蛋白质”可与术语多肽互换使用，并且还指氨基酸的聚合物链。术语“多肽”包含天然或人工蛋白质、蛋白质片段和具有蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合物的。除非上下文另有矛盾，否则在本文中“多肽”的使用预期包含多肽及其片段和变体(包括变体的片段)。对于抗原性多肽，多肽的片段任选含有至少一个连接或非线性的多肽表位。至少一个表位片段的精确边界可使用本领域普通技术加以证实。片段包含至少约5个连接氨基酸，例如至少约10个连接氨基酸、至少约15个连接氨基酸或至少约20个连接氨基酸。多肽变体如本文描述的。

术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”指这样的蛋白质或多肽，由于其衍生起源或来源而不与在其天然状态伴随其的天然结合的组分结合；基本上不含来自相同物种的其他蛋白质；由来自不同物种的细胞表达；或在自然界中不存在。因此，化学合成的或在与它天然源于其的细胞不同的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合的组分“分离的”。蛋白质还可通过分离使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术致使基本上不含天然结合的组分。

术语“回收”指通过分离例如使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术，致使化学种类例如多肽基本上不含天然结合的组分的过程。

术语“人硬化蛋白”或“人SOST”(本文缩写为“hSOST”)指称为硬化蛋白的24KD蛋白质或其活性片段，所述硬化蛋白已基于序列相似性分类为含半胱氨酸结的糖蛋白的DNA家族成员(Avasian-Kretchmer(2004)Mol.Endocrinol.8(1):1-12)。硬化蛋白是骨形成的负调节物，其抑制成骨细胞增殖以及分化并且阻抑体外成骨细胞矿化(Poole等人(2005)FASEB J.19:1836-38；Winkler等人(2005)J.Biol.Chem.280(4):2498-2502)。术语人“SOST”预期包括重组人硬化蛋白(rhSOST)，其可通过标准重组表达方法进行制备。人SOST的序列显示于表2中。

表2.人硬化蛋白的序列

“生物活性”指细胞因子的所有固有生物学特性。硬化蛋白的生物学特性包括但不限于与硬化蛋白受体结合。

在提及抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用中的术语“特异性结合”意指相互作用依赖在化学种类上的特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别且结合特异性蛋白质结构而不是一般的蛋白质。如果抗体对表位“A”特异性，则在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离的未标记的A)的分子的存在将降低与抗体结合的标记的A的量。

术语“抗体”泛指由四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子、或其任何功能片段、突变体、变体或衍生物，其保留Ig分子的基本表位结合特点。此类突变体、变体、或衍生抗体形式是本领域已知的。其非限制性实施例在下文讨论。

在全长抗体中，每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由下述三个结构域组成：CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区还可再分成称为互补性决定区(CDR)的高变区，由称为构架区(FR)的更保守区域点缀。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端以下述次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可具有任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

术语“Fc区”用于限定免疫球蛋白重链的C末端区，其可通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化生成。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定结构域：CH2结构域和CH3结构域，并且任选包含CH4结构域。Fc部分中改变抗体效应子功能的氨基酸残基的替换是本领域已知的(美国专利号5,648,260和5,624,821)。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、噬菌作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)、和抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。在一些情况下，这些效应子功能是治疗性抗体希望的，但在其他情况下，取决于治疗目的，可能是不必要的或甚至有害的。某些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3，分别经由与FcγR和补体C1q结合来介导ADCC和CDC。新生儿Fc受体(FcRn)是决定抗体的循环半衰期的关键组分。在另外一个实施例中，替换抗体的恒定区例如抗体的Fc区中的至少一个氨基酸残基，使得改变抗体的效应子功能。免疫球蛋白的两条相同重链的二聚化由CH3结构域的二聚化介导，并且由铰链区内的二硫键稳定(Huber等人Nature264:415-20；Thies等人(1999)J.Mol.Biol.293:67-79.)。在铰链区内防止重链-重链二硫键的半胱氨酸残基突变将使CH3结构域的二聚化失稳。负责CH3二聚化的残基已得到鉴定(Dall’Acqua(1998)Biochem.37:9266-9273.)。因此，能够生成单价半-Ig。有利的是，这些单价半Ig分子已在自然界中对于IgG和IgA亚类发现(Seligman(1978)Ann.Immunol.129:855-70；Biewenga等人(1983)Clin.Exp.Immunol.51:395-400)。FcRn:Ig Fc区的化学计量学已测定为2:1(West等人(2000)Biochem.39:9698-708)，并且半Fc足以介导FcRn结合(Kim等人(1994)Eur.J.Immunol.24:542-548)。破坏CH3结构域的二聚化的突变可能对其FcRn结合没有更大的不良作用，因为对于CH3二聚化重要的残基位于CH3b片层结构的内界面上，而负责FcRn结合的区域位于CH2-CH3结构域的外界面上。然而，由于其小于常规抗体那种的大小，半Ig分子可能在组织穿透中具有某些优点。在一个提供的实施例中，替换在结合蛋白的恒定区例如Fc区中的至少一个氨基酸残基，使得重链二聚化被破坏，导致半DVD Ig分子。IgG的抗炎活性完全依赖于IgG Fc片段的N联聚糖的唾液酸化。抗炎活性的精确聚糖需求已得到确定，使得可产生适当的IgG1Fc片段，由此生成具有极大增强的效力的完全重组的唾液酸化IgG1Fc(Anthony等人(2008)Science320:373-376)。

术语抗体的“抗原结合部分”(或简单的“抗体部分”)指保留与抗原(例如人硬化蛋白(hSOST))特异性结合的能力的一个或多个抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段进行。此类抗体实施例还可以是与两种或更多种不同抗原特异性结合的双特异性、双重特异性或多特异性形式。在术语抗体的“抗原结合部分”内包含的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区处由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)包含单个可变结构域的dAb片段(Ward等人(1989)Nature341:544-546,PCT公开号WO90/05144)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可使用重组法通过合成接头进行连接，所述合成接头使其能够制备为单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science242:423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。此类单链抗体也意欲包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。还包含其他形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对的接头，由此迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并且产生两个抗原结合位点(参见例如，Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak等人(1994)Structure2:1121-1123)。此类抗体结合部分是本领域已知的(Kontermann和Dubel编辑，AntibodyEngineering(2001)Springer-Verlag.New York.第790页(ISBN3-540-41354-5))。另外，单链抗体也包括包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人(1995)Protein Eng.8(10):1057-1062；和美国专利号5,641,870)。

免疫球蛋白恒定(C)结构域指重(CH)或轻(CL)链恒定结构域。鼠和人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的。

术语“结合蛋白构建体”指这样的多肽，其包含与接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域连接的抗原结合部分中的一种或多种。接头多肽包含由肽键连接的两个或更多个氨基酸残基，并且用于连接一个或多个抗原结合部分。此类接头多肽是本领域众所周知的(参见例如Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak等人(1994)Structure2:1121-1123)。免疫球蛋白恒定结构域指重或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列在表3中提供。

下文提供的VH和VL结构域序列包含互补决定区(CDR)和构架序列，其或是本领域已知的或是使用本领域已知的方法可容易辨别的。在一些实施例中，这些CDR和/或构架序列中的一种或多种替换为来自结合蛋白的其他CDR和/或构架序列，而不丧失功能，所述结合蛋白是本领域已知与相同抗原结合的。

表3.人IgG重链恒定结构域和轻链恒定结构域的序列

再进一步地，硬化蛋白结合蛋白例如抗体或其抗原结合部分可以是更大的免疫粘附分子(immunoadhesion molecule)的部分，所述更大的免疫粘附分子由抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成。此类免疫粘附分子的例子包括使用链霉抗生物素蛋白核心区，以制备四聚scFv分子(Kipriyanov等人(1995)Human Antibod.Hybridomas6:93-101)，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端多聚组氨酸标签，以制备二价和生物素化scFv分子(Kipriyanov等人(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)。抗体部分例如Fab和F(ab')2片段可使用常规技术由完整抗体制备，例如完整抗体分别的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可如本文描述的使用标准重组DNA技术获得。

术语“分离的抗体”指这样的抗体，其基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体(例如特异性结合hSOST的分离的抗体基本上不含特异性结合hSOST以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合hSOST的分离的抗体可与其他抗原例如来自其他物种的硬化蛋白分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本上不含其他细胞材料和/或化学品。

术语“单克隆抗体”或“mAb”指得自基本上均质抗体群体的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的，除了可以小量存在的可能天然存在的突变之外。单克隆抗体是高特异性的，针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比之下，每种mAb针对抗原上的单一决定簇。修饰词“单克隆的”不应解释为需要通过任何具体方法的抗体生产。

术语“人抗体”预期包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。提供了人抗体，并且所述人抗体可包括例如在CDR且特别是CDR3中，不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，术语“人抗体”不预期包括这样的抗体，其中源自另一个哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列已移植到人构架序列上。

术语“重组人抗体”预期包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体(还在下文部分II C中描述)，从重组、组合人抗体文库中分离的抗体(Hoogenboom(1997)TIB Tech.15:62-70；Azzazy和Highsmith(2002)Clin.Biochem.35:425-445；Gavilondo和Larrick(2002)BioTechniques29:128-145；Hoogenboom和Chames(2000)Immunol.Today21:371-378)，从对人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295；Kellermann和Green(2002)Curr.Opin.Biotechnol.13:593-597；Little等人(2000)Immunol.Today21:364-370)，或由涉及人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在某些实施例中，对此类重组人抗体实施体外诱变(或当使用对于人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其虽然源自且涉及人种系VH和VL序列，但可能在体内人抗体种系储库中不天然存在。

术语“嵌合抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序列以及来自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重和轻链可变区的抗体。

术语“CDR移植抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL的CDR区中的一个或多个的序列替换为另一个物种的CDR序列，例如具有鼠重和轻链可变区的抗体，其中鼠CDR(例如CDR3)中的一个或多个已替换为人CDR序列。

术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域公认的这些术语指编号氨基酸残基的系统，所述氨基酸残基比抗体或其抗原结合部分的重和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变(即高变)(Kabat等人(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-391和Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH公开号91-3242)。对于重链可变区，高变区范围为对于CDR1的氨基酸位置31–35、对于CDR2的氨基酸位置50-65、和对于CDR3的氨基酸位置95-102。对于轻链可变区，高变区范围为对于CDR1的氨基酸位置24-34、对于CDR2的氨基酸位置50-56、和对于CDR3的氨基酸位置89-97。

术语“CDR”指在抗体可变区内的互补决定区。在重链和轻链的可变区各自中存在三个CDR，其对于可变区各自指定为CDR1、CDR2和CDR3。术语“CDR组”指在能够结合抗原的单个可变区中出现的一组三个CDR。这些CDR的确切边界已根据不同系统不同限定。由Kabat描述的系统(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1987)和(1991))不仅提供了可应用于任何抗体可变区的明确的残基编号系统，还提供了限定三个CDR的精确残基边界。这些CDR可被称为Kabat CDR。Chothia及同事(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917和Chothia等人(1989)Nature342:877-883)发现Kabat CDR内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大的多样性。这些亚部分被指定为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指定轻链和重链区。这些区可被称为Chothia CDR，其具有与KabatCDR重叠的边界。限定与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界已由Padlan(1995)描述。尽管某些实施例使用Kabat或Chothia限定的CDR，但本文使用的方法可利用根据这些系统中的任一个限定的CDR。

术语“经典残基”指如由Chothia等人(1987)J.Mol.Biol.196:901-907；Chothia等人(1992)J.Mol.Biol.227:799)定义的，CDR或构架中限定特定经典CDR结构的残基。根据Chothia等人，许多抗体的CDR的关键部分具有几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大的多样性。每个经典结构主要指定关于形成环的氨基酸残基的连续区段的一组肽主链扭角。

“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDR中具有一种或多种变化的抗体，其导致与不具有一种或多种变化的亲本抗体相比较，抗体对靶抗原的亲和力的改善。示例性亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。多种用于产生亲和力成熟的抗体的程序是本领域已知的。例如，Marks等人(1992)Bio/Technol.10:779-783描述了由VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或构架残基的随机诱变由Barbas等人(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.USA91:3809-3813；Schier等人(1995)Gene169:147-155；Yelton等人(1995)J.Immunol.155:1994-2004；Jackson等人(1995)J.Immunol.154(7):3310-3319；Hawkins等人(1992)J.Mol.Biol.226:889-896描述。具有活性增强氨基酸残基的活性的在选择性诱变位置和接触或高变位置处的选择性突变在美国专利号6,914,128中描述。

术语“多价结合蛋白”指示包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。在一个实施例中，多价结合蛋白被改造为具有三个或更多个抗原结合位点，并且一般不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”指能够结合两种或更多种有关或无关靶标的结合蛋白。提供了“双重可变结构域”(“DVD”)结合蛋白，并且所述结合蛋白包含两个或更多个抗原结合位点，并且是四价或多价结合蛋白。DVD可以是单特异性的，即能够结合一种抗原，或多特异性的，即能够结合两种或更多种抗原。“DVD结合蛋白”包含两条重链DVD多肽和两条轻链DVD多肽。DVD结合蛋白的每一半包含重链DVD多肽和轻链DVD多肽，以及两个或更多个抗原结合位点。每个结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，具有总共六个CDR涉及抗原结合/抗原结合位点。DVD结合蛋白也称为DVD-Ig^TM分子。

DVD结合蛋白的设计、表达和表征的描述在PCT公开号WO2007/024715、美国专利号7,612,181和Wu等人(2007)Nature Biotech.25:1290-1297中提供。此类DVD结合蛋白的例子包括包含结构式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的重链，其中VD1是第一重链可变结构域，VD2是第二重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，X2是Fc区，并且n是0或1，但在一个实施例中，是1；和包含结构式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的轻链，其中VD1是第一轻链可变结构域，VD2是第二轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CL，X2不包含Fc区；并且n是0或1，但在一个实施例中，是1。此类DVD结合蛋白可包含两条此类重链和两条此类轻链，其中每条链包含串联连接的可变结构域，而在可变区之间不含间插恒定区，其中重链和轻链结合，以形成串联功能抗原结合位点，并且一对重和轻链可与另一对重和轻链结合，以形成具有四个功能抗原结合位点的四聚结合蛋白。在另一个例子中，DVD结合蛋白可包含重和轻链，所述重和轻链各自包含串联连接的三个可变结构域(VD1、VD2、VD3)，而在可变结构域之间不含间插恒定区，其中一对重和轻链可结合，以形成三个抗原结合位点，并且其中一对重和轻链可与另一对重和轻链结合，以形成具有六个抗原结合位点的四聚结合蛋白。

DVD结合蛋白可结合一个或多个硬化蛋白表位。DVD结合蛋白还可结合硬化蛋白表位和硬化蛋白多肽以外的第二靶抗原的表位。

术语“双特异性抗体”指通过下述生成的全长抗体：畸胎瘤(quadroma)技术(参见Milstein和Cuello(1983)Nature305(5934):537-40)、两种不同的单克隆抗体的化学缀合(参见Staerz等人(1985)Nature314(6012):628-31)、纽进洞(knob-into-hole)或在Fc区中引入突变的相似方法(参见Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(14):6444-6448)，导致其中仅一种是功能双特异性抗体的多重不同的免疫球蛋白种类。通过分子功能，双特异性抗体在其两个结合臂之一(一对HC/LC)上结合一种抗原(或表位)，并且在其第二臂(不同的一对HC/LC)上结合不同抗原(或表位)。通过该定义，双特异性抗体具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列两者中)，并且对于它与之结合的每种抗原是单价的。

术语“双重特异性抗体”指可在其两个结合臂的每一个(一对HC/LC)中结合两种不同抗原(或表位)的全长抗体(参见PCT公开号WO02/02773)。相应地，双重特异性抗体具有两个相同的抗原结合臂，具有相同的特异性和相同的CDR序列，并且对于它与之结合的每种抗原是二价的。

结合蛋白的“功能抗原结合位点”是能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力不一定像抗原结合位点源自其的亲本抗体一样强，但结合抗原的能力必须可使用已知用于评估与抗原结合的抗体的多种方法中的任一种测量。此外，本文多价抗体的抗原结合位点各自的抗原结合亲和力无需在数量上是相同的。

术语“细胞因子”是用于蛋白质的一般术语，所述蛋白质由一个细胞群体释放，并且作为细胞间介质作用于另一个细胞群体。此类细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子和常规多肽激素。在细胞因子中包括的是生长激素，例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如促滤泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)；苗勒管抑制物质；小鼠促性腺素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子例如NGF-alpha(NGF-α)；血小板生长因子；胎盘生长因子；转化生长因子(TGF)例如TGF-alpha(TGF-α)和TGF-beta(TGF-β)；胰岛素样生长因子-1和-11；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素例如干扰素-α(IFN-α)、干扰素-beta(IFN-β)和干扰素-γ(IFN-γ)；集落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-33；及其他多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。术语细胞因子包括来自天然源或来自重组细胞培养的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等价物。

术语“供体”和“供体抗体”指提供一个或多个CDR的抗体。在一个实施例中，供体抗体是来自与构架区得自或源自其的抗体不同的物种的抗体。在人源化抗体的上下文中，术语“供体抗体”指提供一个或多个CDR的非人抗体。

术语“构架”和“构架序列”指可变区减去CDR的剩余序列。因为CDR序列的确切定义可由不同系统确定，所以对构架序列的含义实施相应不同的解释。六个CDR(轻链的CDR-L1、-L2和-L3以及重链的CDR-H1、-H2和-H3)还将轻链和重链上的构架区分成每条链上的四个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，CDR3位于FR3和FR4之间。无需将特定亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4，如由其他人提及的构架区代表在单条天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合FR。FR代表四个亚区之一，并且FRs代表构成构架区的四个亚区中的两个或更多个。

术语“受体”和“受体抗体”指提供核酸序列的抗体，所述核酸序列编码构架区中的一个或多个的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列。在一些实施例中，术语“受体”指提供编码一个或多个恒定区的核酸序列的抗体氨基酸。在另外一个实施例中，术语“受体”指提供核酸序列的抗体氨基酸，所述核酸序列编码构架区和恒定区中的一个或多个。在具体实施例中，术语“受体”指人抗体氨基酸或核酸序列，其提供或编码构架区中的一个或多个的至少80％，在一个实施例中至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列。依照该实施例，受体可含有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少10个氨基酸残基，其在人抗体的一个或多个特定位置处不出现。受体构架区和/或一个或多个受体恒定区可例如源自或得自种系抗体基因、成熟抗体基因、功能抗体(例如本领域众所周知的抗体、开发中的抗体或商购可得的抗体)。

人重链和轻链受体序列是本领域已知的。在一个实施例中，提供了来自V-base(hvbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或国际ImMunoGeneTics (himgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/LocusGenes/)的人重链和轻链受体序列。术语“种系抗体基因”或“基因片段”指未经历成熟过程的由非淋巴样细胞编码的免疫球蛋白序列，所述成熟过程导致遗传重排和突变以用于表达特定免疫球蛋白(参见例如Shapiro等人(2002)Crit.Rev.Immunol.22(3):183-200；Marchalonis等人(2001)Adv.Exp.Med.Biol.484:13-30)。由多个实施例提供的优点之一源于下述认识：种系抗体基因比成熟抗体基因更可能保存物种中的个体特有的必需氨基酸序列结构，因此当在该物种中治疗上使用时，更不太可能识别为来自外部源。

术语“关键”残基指在可变区内的某些残基，其对抗体、特别是人源化抗体的结合特异性和/或亲和力具有更大影响。关键残基包括但不限于下述中的一个或多个：与CDR相邻的残基、潜在糖基化位点(可以是N或O糖基化位点)、罕见残基、能够与抗原相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、经典残基、在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基、在游标区内的残基、和在Chothia限定的可变重链CDR1和Kabat限定的第一重链构架之间重叠的区域中的残基。

术语“人源化抗体”指这样的抗体，其包含来自非人物种(例如小鼠)的重和轻链可变区序列，但其中VH和/或VL序列的至少一部分已改变为更“人样的”，即更类似于人种系可变序列。一类人源化抗体是CDR移植抗体，其中人CDR序列引入非人VH和VL序列内，以替换相应的非人CDR序列。另外，“人源化抗体”是抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其与目的抗原免疫特异性结合，并且包含具有基本上人抗体的氨基酸序列的构架(FR)区和具有基本上非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。在CDR上下文中的术语“基本上”指与非人抗体CDR的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的CDR。人源化抗体包含至少一个和通常两个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)的基本上全部，其中CDR区的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的CDR区，并且构架区的全部或基本上全部是人免疫球蛋白共有序列的构架区。在一个实施例中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)、通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体含有轻链以及重链的至少可变结构域两者。抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施例中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施例中，人源化抗体仅含有人源化重链。在具体实施例中，人源化抗体仅含有轻链的人源化可变结构域和/或人源化重链。

人源化抗体可来自免疫球蛋白的任何种类，包括IgM、IgG、IgD、IgA或IgE，或任何同种型包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。人源化抗体可包含来自超过一个种类或同种型的序列，并且特定的恒定结构域可使用本领域众所周知的技术选择为最佳化所需效应子功能。

人源化抗体的构架和CDR区无需精确对应于亲本序列，例如供体抗体CDR或共有构架可通过至少一个氨基酸残基的置换、插入和/或缺失进行诱变，使得在该位点处的CDR或构架残基不对应于供体抗体或共有构架。在一个实施例中，然而，此类突变不是广泛的。通常，至少80％、至少85％、更至少90％和至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的残基。术语“共有构架”指共有免疫球蛋白序列中的构架区。术语“共有免疫球蛋白序列”指由相关免疫球蛋白序列家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,德国1987))。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置由在家族中该位置处最频繁出现的氨基酸占据。如果两个氨基酸同样频繁出现，则任一可包括在共有序列中。

关于构建DVD结合蛋白或其他结合蛋白分子，“接头”用于指示包含由肽键连接的两个或更多个氨基酸残基的多肽，并且用于连接一个或多个抗原结合部分。此类接头多肽是本领域众所周知的(参见例如Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448；Poljak等人(1994)Structure,2:1121-1123)。示例性接头包括但不限于GGGGSG(SEQ ID NO:1695)、GGSGG(SEQ ID NO:1696)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1697)、GGSGGGGSGS(SEQ ID NO:1698)、GGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1699)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:1700)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:1701)、ASTKGP(SEQ ID NO:1702)、ASTKGPSVFPLAP(SEQ IDNO:1703)、TVAAP(SEQ ID NO:1704)、TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:1705)、AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO:1706)、AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQID NO:1707)、AKTTPKLGG(SEQ ID NO:1710)、SAKTTPKLGG(SEQ IDNO:1709)、SAKTTP(SEQ ID NO:1702)、RADAAP(SEQ ID NO:1711)、RADAAPTVS(SEQ ID NO:1712)、RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO:1713)、RADAAAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1714)、SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:1715)、ADAAP(SEQ ID NO:1716)、ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO:2050)、QPKAAP(SEQ ID NO:2051)、QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO:2052)、AKTTPP(SEQ ID NO:2053)、AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO:2054)、AKTTAP(SEQ ID NO:2055)、AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO:2056)、GENKVEYAPALMALS(SEQ IDNO:2057)、GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO:2058)和GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO:2059)。

如由Foote和Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499)描述的，术语“游标”区指可调整CDR结构且细调与抗原的拟合的构架残基亚组。游标区残基形成在CDR下的层，并且可能影响CDR的结构和抗体的亲和力。

术语“中和”指当结合蛋白特异性结合抗原时，抗原(例如SOST)的生物活性的中和。在一个实施例中，本文描述的中和结合蛋白与hSOST结合，导致hSOST的生物活性的抑制。在一个实施例中，中和结合蛋白结合hSOST，并且使hSOST的生物活性降低至少约20％、40％、60％、80％、85％或更多。通过中和结合蛋白抑制hSOST的生物活性可通过测量本领域众所周知的一种或多种hSOST生物活性指示剂进行评价。

术语“活性”包括活性例如抗体(例如与SOST抗原结合的抗hSOST抗体)对抗原的结合特异性/亲和力，和/或抗体(例如其与hSOST的结合抑制hSOST的生物活性的抗hSOST抗体)的中和效力。

术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施例中，表位决定簇包括化学活性的分子表面分组，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施例中，可具有特定三维结构特征和/或比电荷特征。表位是由抗体结合的抗原区。在某些实施例中，当抗体优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原时，它被说成特异性结合抗原。如果抗体交叉竞争(一种防止另一种的结合或调节另一种的效应)，则抗体被说成“与相同表位结合”。另外，表位的结构限定(重叠、相似、相同)是提供信息的，但功能限定通常是更相关的，因为它们包含结构(结合)和功能(调节、竞争)参数。

术语“表面等离子共振”指例如使用BIAcore系统(Pharmacia BiosensorAB,Uppsala,Sweden and Piscataway,NJ)，通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度中的改变，允许分析实时生物特异性相互作用的光学现象。关于更多描述，参见等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；等人(1991)BioTechniques,11:620-627；Johnsson等人(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；和Johnnson等人(1991)Anal.Biochem.198:268-277。

如本领域已知的，术语“K_on”(以及“Kon”、“kon”)意指结合蛋白(例如抗体)与抗原结合以形成结合复合物例如抗体/抗原复合物的结合速率常数。如本文可互换使用的，“Kon”也由术语“结合速率常数”或“k_a”已知。该值指示抗体与其靶抗原的结合速率或抗体和抗原之间的复合物形成速率，如由下式显示的：

抗体(“Ab”)+抗原(“Ag”)→Ab-Ag。

如本领域已知的，术语“K_off”(以及“Koff”、“koff”)意指结合蛋白(例如抗体)从结合复合物(例如抗体/抗原复合物)解离的离开速率常数。如本文可互换使用的，“koff”也由术语“解离速率常数”或“k_d”已知。该值指示抗体与其靶抗原的解离速率或Ab-Ag复合物随着时间过去分离成游离抗体和抗原的解离速率，如由下式显示的：

Ab+Ag←Ab-Ag。

术语“K_D”(以及“K_d”)意指“平衡解离常数”，并且指在平衡时的滴定测量中获得的值，或通过将解离速率常数(Koff)除以结合速率常数(Kon)获得的值。结合速率常数(Kon)、解离速率常数(Koff)和平衡解离常数(K用于代表抗体与抗原的结合亲和力。用于测定结合和解离速率常数的方法是本领域众所周知的。使用基于荧光的技术提供检查在平衡时的生理学缓冲液中的样品的高灵敏度和能力。可使用其他实验方法和仪器例如(生物分子相互作用分析)测定(例如可得自BIAcore International AB,a GE Healthcarecompany,Uppsala，瑞典的仪器)。另外，还可使用可得自Sapidyne Instruments(Boise,Idaho)的(动力学排除测定)测定。

术语“标记”和“可检测标记”意指附着至特异性结合配偶体例如抗体或分析物的部分，例如以致使特异性结合对的成员例如抗体和分析物之间的反应可检测。如此标记的特异性结合配偶体例如抗体或分析物被称为“可检测标记的”。因此，术语“标记的结合蛋白”指具有掺入的标记的蛋白质，所述标记提供结合蛋白的鉴定。在一个实施例中，标记是可产生信号的可检测标记，所述信号可通过目视或仪器方法检测，例如掺入放射性标记的氨基酸或附着至具有生物素基部分的多肽，所述生物素基部分可通过标记的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白(例如含有可通过光学或比色法检测的荧光标记或酶促活性的链霉抗生物素蛋白)进行检测。用于多肽的标记例子包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素(例如³H_、 ¹⁴C_、 ³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho或¹⁵³Sm)、色原、荧光标记(例如FITC、罗丹明、镧系磷光体)、酶促标记(例如辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基、由次级报道物识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、次级抗体的结合位点、金属结合结构域、附加表位)和磁性试剂(例如钆螯合物)。通常用于免疫测定的代表性标记例子包括产生光的部分，例如吖啶鎓化合物，和产生荧光的部分，例如荧光素。其他标记在本文中描述。在这点上，部分自身可能不是可检测标记的，但可在与另外一种部分反应后变得可检测。术语“可检测标记”的使用预期包含后面一种类型的可检测标记。

术语“SOST结合蛋白缀合物”或“硬化蛋白结合蛋白缀合物”指与第二化学部分例如治疗剂或细胞毒性剂化学连接的本文描述的硬化蛋白结合蛋白。术语“试剂”在本文中用于指示化学化合物、化学化合物混合物、生物大分子或由生物材料制备的提取物。在一个实施例中，治疗剂或细胞毒性剂包括但不限于百日咳毒素、泰素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。当用于免疫测定的背景下时，硬化蛋白结合蛋白缀合物可以是可检测标记的抗体，其用作检测抗体。

术语“晶体”和“结晶的”指以晶体形式存在的结合蛋白(例如抗体)或其抗原结合部分。晶体是物质固态的一种形式，其不同于其他形式例如无定形固态或液晶态。晶体由规则、重复、三维排列的原子、离子、分子(例如蛋白质例如抗体)或分子装配(例如抗原/抗体复合物)组成。这些三维排列根据本领域充分了解的特异性数学关系排列。在晶体中重复的基本单位或构件块被称为不对称单位。在符合给定、定义明确的晶体学对称性的排列中的不对称单位重复提供了晶体的“单胞”。通过在所有三个维度中规则平移的晶胞重复提供了晶体。参见Giegé等人，Crystallization of Nucleic Acids andProteins,a Practical Approach,第2版中的第1章，(Ducruix和Giegé编辑)(Oxford University Press,New York,1999)第1-16页。

术语“多核苷酸”意指两个或更多个核苷酸的聚合物形式，所述核苷酸为核糖核苷酸或脱氧核苷酸，或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单和双链形式的DNA。

术语“分离的多核苷酸”应意指这样的多核苷酸(例如具有基因组、cDNA或合成起源，或其一些组合)，由于其起源，“分离的多核苷酸”不与“分离的多核苷酸”与之一起在自然界中发现的多核苷酸的全部或部分结合；与它在自然界中不与之连接的多核苷酸可操作地连接；或不作为更大序列的部分在自然界中出现。

术语“载体”意指能够转运它已与之连接的另一核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其指另外的DNA区段可连接到其内的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可连接到病毒基因组内。某些载体能够在它们引入其内的宿主细胞内自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞内后整合到宿主细胞的基因组内，并且由此连同宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们与之可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单的“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，提供了其他形式的表达载体，例如发挥等价功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

术语“可操作地连接的”指其中所述组分处于允许其以其预期方式起作用的关系中的并列。与编码序列“可操作地连接的”控制序列以这样的方式连接，使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现。“可操作地连接的”序列包括与目的基因连接的表达控制序列，和反式或在一定距离处起作用以控制目的基因的表达控制序列。术语“表达控制序列”指实现它们与之连接的编码序列表达和加工所需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和需要时，增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质依赖于宿主生物而不同；在原核生物中，此类控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，一般地，此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”预期包括其存在是表达和加工必需的组分，并且还可包括其存在是有利的另外的组分，例如前导序列和融合配偶体序列。

如本文定义的，“转化”指外源DNA通过其进入宿主细胞的任何过程。转化可使用本领域众所周知的多种方法在天然或人工条件下发生。转化可依赖用于将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞内的任何已知方法。该方法基于被转化的宿主细胞加以选择，并且可包括但不限于病毒感染、电穿孔、脂转染和粒子轰击。此类“经转化的”细胞包括稳定转化的细胞，其中插入的DNA能够或作为自主复制的质粒或作为宿主染色体的部分复制。它们还包括瞬时表达插入的DNA或RNA有限时间段的细胞。

术语“重组宿主细胞”(或简单的“宿主细胞”)意指外源DNA已引入其内的细胞。在一个实施例中，宿主细胞包含两个或更多个(例如多个)编码抗体的核酸，例如美国专利号7,262,028中所述的宿主细胞。此类术语不仅意指特定主体细胞，还意指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响可在后续代中出现某些修饰，所以此类后代事实上可能与亲本细胞不相同，但仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。在一个实施例中，宿主细胞包括来自任何生物界的原核和真核细胞。在另一个实施例中，真核细胞包括原生生物、真菌、植物或动物细胞。在另一个实施例中，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK293、COS、NS0、SP2和PER.C6；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母。

标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成、以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂转染)。酶促反应和纯化技术可根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文描述的进行。前述技术和程序一般可根据本领域众所周知的且如多种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用且讨论。参见例如Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。

如本领域已知的，“转基因生物”指具有含有转基因的细胞的生物，其中引入生物(或生物的祖先)内的转基因表达在该生物中并非天然表达的多肽。“转基因”是DNA构建体，其稳定且可操作地整合到转基因生物由其发育的细胞的基因组内，指导编码的基因产物在转基因生物的一个或多个细胞类型或组织中表达。

术语“调控”和“调节”可互换使用，并且指目的分子活性(例如hSOST的生物活性)的变化或改变。调节可以是目的分子的某一活性或功能量级的增加或减少。示例性分子活性和功能包括但不限于结合特征、酶促活性、细胞受体活化和信号转导。

相应地，术语“调节剂”是能够改变或更改目的分子的活性或功能(例如hSOST的生物活性)的化合物。例如，与在不存在调节剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，调节剂可引起分子的某一活性或功能量级的增加或减少。在某些实施例中，调节剂是减少分子至少一种活性或功能量级的抑制剂。示例性抑制剂包括但不限于蛋白质、肽、抗体、肽体、碳水化合物或小有机分子。肽体例如在PCT公开号WO01/83525中描述。

术语“激动剂”指这样的调节剂，与在不存在激动剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，当其与目的分子接触时，引起分子的某一活性或功能量级的增加。特定目的激动剂可包括但不限于硬化蛋白多肽、核酸、碳水化合物或与人硬化蛋白(hSOST)结合的任何其他分子。

术语“拮抗剂”和“抑制剂”指这样的调节剂，与在不存在拮抗剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，当其与目的分子接触时，引起分子的某一活性或功能量级的减少。具体的目的拮抗剂包括阻断或调节人硬化蛋白的生物或免疫活性的拮抗剂。人硬化蛋白的拮抗剂和抑制剂可包括但不限于蛋白质、核酸、碳水化合物或与人硬化蛋白结合的任何其他分子。

术语“有效量”指这样的治疗量，其足以降低或改善障碍或者其一种或多种症状的严重性和/或持续时间；预防障碍的进展；引起障碍的消退；预防与障碍相关的一种或多种症状的复发、发展、发作或进展；检测障碍；或者增强或改善另一种治疗(例如预防剂或治疗剂)的一种或多种预防或治疗效应。

“患者”和“受试者”在本文中可互换使用，以指动物，例如哺乳动物，包括灵长类动物(例如人、猴和黑猩猩)、非灵长类动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、犬、大鼠、小鼠、鲸)、鸟类(例如鸭或鹅)和鲨鱼。在一个实施例中，患者或受试者是人，例如被治疗或评价疾病、障碍或病症的人，处于疾病、障碍或病症危险中的人，具有疾病、障碍或病症的人，和/或被治疗疾病、障碍或病症的人。

术语“样品”以其最广泛的含义使用。“生物样品”包括但不限于来自活物或以前的活物的任意数量的物质。此类活物包括但不限于人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、猴、犬、兔及其他动物。此类物质包括但不限于血液(例如全血)、血浆、血清、尿、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。

“一种组分”、“多种组分”和“至少一种组分”一般指捕获抗体、检测或缀合物抗体、对照、校准物、一系列校准物、灵敏度实验对象组、容器、缓冲剂、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、底物(例如作为溶液)、停止溶液等等，其可包括在试剂盒中用于测定测试样品，例如患者尿、血清或血浆样品，依照本文描述的方法和本领域已知的其他方法。因此，在本公开内容的上下文中，“至少一种组分”、“一种组分”和“多种组分”可包括如上文的多肽或其他分析物，例如包含分析物例如多肽的组合物，其任选例如通过与抗分析物(例如抗多肽)抗体结合而固定在固体载体上。一些组分可在溶液中或冻干用于重构以用于测定中。

“对照”指已知并非分析物(“阴性对照”)或含有分析物(“阳性对照”)的组合物。阳性对照可包含已知浓度的分析物。“对照”、“阳性对照”和“校准物”在本文中可互换使用，以指包含已知浓度的分析物的组合物。“阳性对照”可用于确定测定性能特征，并且是试剂(例如分析物)完整性的有用指示物。

“预定截断”和“预定水平”一般指测定截断值，其通过针对预定截断/水平比较测定结果，用于评价诊断/预后/治疗功效结果，其中所述预定截断/水平已与多种临床参数(例如疾病的严重性，进展/非进展/改善等)联系或相关。虽然本公开内容可提供示例性预定水平，但众所周知截断值可依赖于免疫测定的性质(例如采用的抗体等)而改变。还完全在本领域技术人员普通技术内的是采用本文公开内容用于其他免疫测定，以获得免疫测定特异性截断值以用于基于本公开内容的那些其他免疫测定。虽然预定截断/水平的精确值可在测定之间不同，但如本文描述的关系(如果存在的话)一般应是适用的。

如在如本文描述的诊断测定中使用的“预处理试剂”例如裂解、沉淀和/或增溶试剂，是裂解任何细胞和/或增溶测试样品中存在的任何分析物的试剂。如本文进一步描述的，预处理不是所有样品必需的。除其他事项外，增溶分析物(例如目的多肽)可使分析物从样品中存在的任何内源结合蛋白释放成为必需。预处理试剂可以是均质的(不需要分离步骤)或异质的(需要分离步骤)。使用异质预处理试剂，在进行至下一个测定步骤前，从测试样品中去除任何沉淀的分析物结合蛋白。

在本文描述的免疫测定和试剂盒的上下文中的“质量控制试剂”包括但不限于校准物、对照和灵敏度实验对象组。通常使用“校准物”或“标准”(例如一种或多种，例如多个)，以便建立用于分析物例如抗体或分析物浓度内插的校准(标准)曲线。作为另外一种选择，可使用接近预定阳性/阴性截断的单一校准物。多重校准物(即超过一种校准物或不同量的一种或多种校准物)可结合使用，以便包含“灵敏度实验对象组”。

“危险”指或在目前或在未来的一些点时发生的特定事件的可能性或概率。“危险分层”指允许医生将患者分类成发展特定疾病、障碍或病症的低、中、高或更高危险的已知临床危险因素的排列。

在特定结合对的成员(例如抗原(或其片段)和抗体(或其抗原反应片段))之间的相互作用的上下文中的“特异性的”和“特异性”指相互作用的选择反应性。短语“与……特异性结合”和类似短语指抗体(或其抗原反应片段)与分析物(或其片段)特异性结合并且不与其他实体特异性结合的能力。

“特异性结合配偶体”是特异性结合对的成员。特异性结合对包含两种不同分子，其通过化学或物理方式彼此特异性结合。因此，除常见免疫测定的抗原和抗体特异性结合对之外，其他特异性结合对可包括生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)、碳水化合物和凝集素、互补核苷酸序列、效应子和受体分子、辅因子和酶、酶抑制剂和酶等等。此外，特异性结合对可包括其为原始特异性结合成员类似物的成员，例如分析物-类似物。免疫反应性特异性结合成员包括抗原、抗原片段和抗体包括单克隆和多克隆抗体，以及其复合物、片段和变体(包括变体的片段)，无论是分离的还是重组产生的。

术语“变体”意指这样的多肽，其由于氨基酸的添加(例如插入)、缺失或保守置换而在氨基酸序列方面不同于给定多肽(例如硬化蛋白、BNP、NGAL或HIV多肽、或抗多肽抗体)，但保留给定多肽的生物活性(例如变体硬化蛋白可与抗硬化蛋白抗体竞争结合硬化蛋白)。氨基酸的保守置换，即用具有相似特性(例如电荷区的亲水性以及程度和分布)的不同氨基酸替换氨基酸在本领域中公认为通常涉及较小改变。如本领域理解的，这些较小改变可部分通过考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)进行鉴定(参见例如Kyte等人(1982)J.Mol.Biol.157:105-132)。氨基酸的亲水指数基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知可置换具有相似亲水指数的氨基酸，并且仍保留蛋白质功能。在一个方面，置换具有±2的亲水指数的氨基酸。氨基酸的亲水性还可用于揭示将导致保留生物学功能的蛋白质的置换。在肽的上下文中的氨基酸亲水性的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，已报道与抗原性和免疫原性良好关联的有用量度(参见例如美国专利号4,554,101)。如本领域理解的，具有相似亲水性值的氨基酸置换可导致保留生物活性例如免疫原性的肽。在一个方面，置换用具有在彼此±2内的亲水性值的氨基酸进行。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者均受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察一致，与生物学功能相容的氨基酸置换应理解为依赖于氨基酸的相对相似性，且特别是那些氨基酸的侧链，如由疏水性、亲水性、电荷、大小及其他特性揭示的。“变体”还可用于描述多肽或其片段，其例如由于蛋白酶解、磷酸化或其他翻译后修饰进行不同加工，仍保留其生物活性或抗原反应性，例如与硬化蛋白结合的能力。除非上下文另有矛盾，在本文中“变体”的使用预期包含变体的片段。

I.结合人SOST的抗体。

一个方面提供了分离的鼠单克隆抗体或其抗原结合部分，其以高亲和力、缓慢离开速率和高中和能力与硬化蛋白结合。第二个方面提供了结合硬化蛋白的嵌合抗体。第三个方面提供了结合硬化蛋白的CDR移植抗体或其抗原结合部分。第四个方面提供了结合硬化蛋白的人源化抗体或其抗原结合部分。第五个方面提供了结合硬化蛋白和一种其他靶标的双重可变结构域结合蛋白(DVD结合蛋白)。在一个实施例中，抗体或其部分是分离的抗体。在一个实施例中，提供了中和人抗硬化蛋白的抗体。

I.A.制备抗硬化蛋白抗体的方法

提供了通过本领域已知的许多技术中的任一种制备的抗硬化蛋白抗体。

I.A.1.使用杂交瘤技术的抗硬化蛋白单克隆抗体

单克隆抗体可使用本领域已知的广泛多样的技术进行制备，包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或其组合。例如，单克隆抗体可使用杂交瘤技术产生，所述杂交瘤技术包括本领域已知并例如在Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)；Hammerling等人，于：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中教导的技术。术语“单克隆抗体”并不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指源自单个克隆包括任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体，而不是指它由其产生的方法。

使用杂交瘤技术产生且筛选特异性抗硬化蛋白抗体的方法是本领域常规且众所周知的。一个实施例提供了生成单克隆抗体的方法以及由该方法产生的抗体，所述方法包括培养分泌抗体的杂交瘤细胞，其中在一个实施例中，杂交瘤通过下述生成：使从用抗原免疫接种的小鼠分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，并且随后从起因于融合的杂交瘤中筛选分泌能够结合多肽的抗体的杂交瘤克隆。简言之，可用硬化蛋白抗原免疫接种小鼠。在一个实施例中，将硬化蛋白抗原与佐剂一起施用，以刺激免疫应答。此类佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。此类佐剂可通过将多肽隔离在局部沉积物中而保护其不受快速分散，或它们可含有刺激宿主分泌对于巨噬细胞趋化性的因子和免疫系统其他组分的物质。在一个实施例中，如果多肽被施用，则免疫接种程序表将涉及经过数周展开的两次或更多次多肽施用。

在用硬化蛋白抗原免疫接种动物后，可从动物获得抗体和/或抗体产生细胞。通过使动物放血或处死，从动物获得含抗硬化蛋白抗体的血清。可如其从动物获得的使用血清，可从血清中获得免疫球蛋白级分，或可从血清中纯化抗硬化蛋白抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，因此具有一系列异质特性。

一旦检测到免疫应答，例如在小鼠血清中检测到对抗原SOST特异性的抗体，就收获小鼠脾且分离脾细胞。随后通过众所周知的技术使脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞融合，例如来自可得自美国典型培养物中心(ATCC,Manassas,Virginia,US)的细胞系SP20的细胞。通过有限稀释选择并克隆杂交瘤。随后通过本领域已知的方法就分泌能够结合SOST的抗体的细胞来测定杂交瘤克隆。可通过用阳性杂交瘤克隆免疫接种小鼠来生成一般含有高水平抗体的腹水。

在另一个实施例中，可由免疫接种的动物制备产生抗体的永生化杂交瘤。在免疫接种后，将动物处死，并且使脾B细胞融合至如本领域众所周知的永生化的骨髓瘤细胞。参见例如Harlow和Lane，同上。在一个实施例中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性细胞系)。在融合和抗生素选择后，使用SOST或其部分或表达SOST的细胞筛选杂交瘤。在一个实施例中，使用酶联免疫测定(ELISA)或放射性免疫测定(RIA)，在一个实施例中，使用ELISA进行起始筛选。ELISA筛选的例子在PCT公开号WO00/37504中提供。

如下文进一步讨论的，产生抗硬化蛋白抗体的杂交瘤被选择、克隆且还筛选希望的特征，包括强杂交瘤生长、高抗体产生和希望的抗体特征。杂交瘤可在同系动物体内、在缺乏免疫系统的动物例如裸鼠中或在体外细胞培养中进行培养并扩增。选择、克隆且扩增杂交瘤的方法是本领域普通技术人员众所周知的。

在一个实施例中，如上所述，杂交瘤是小鼠杂交瘤。在另一个实施例中，杂交瘤在非人、非小鼠物种例如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生。在另一个实施例中，杂交瘤是人杂交瘤，其中使人非分泌性骨髓瘤与表达抗硬化蛋白抗体的人细胞融合。

可通过已知技术生成识别特异性表位的抗体片段。例如，提供了通过免疫球蛋白分子的蛋白酶解切割产生的Fab和F(ab')2片段，其中使用酶例如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段)。F(ab')2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CHI结构域。

I.A.2.使用SLAM的抗硬化蛋白单克隆抗体

在另一个实施例中，提供了使用本领域中称为选择淋巴细胞抗体法(SLAM)的程序从单个、分离的淋巴细胞生成的重组抗体，所述SLAM如美国专利号5,627,052；PCT公开号WO92/02551；和Babcook等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7843-7848中所述。在该方法中，使用抗原特异性溶血噬斑测定筛选分泌目的抗体的单个细胞，例如源自部分1中所述的免疫接种动物中任一种的淋巴细胞，其中使用接头例如生物素将抗原SOST、SOST亚单位或其片段与绵羊红血细胞偶联，并用于鉴定分泌具有针对SOST的特异性的抗体的单个细胞。在鉴定分泌抗体的目的细胞后，通过逆转录酶PCR从细胞中拯救重和轻链可变区(VH和VL)cDNA，随后可在适当的免疫球蛋白恒定区(例如，人恒定区)背景中，在哺乳动物宿主细胞例如COS或CHO细胞中表达这些可变区。用扩增的免疫球蛋白序列转染的、源自体内选择的淋巴细胞的宿主细胞，随后可经历进一步的体外分析和选择，例如通过淘选经转染的细胞以分离表达针对SOST的抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列还可进行体外操作，例如通过体外亲和力成熟法，例如PCT公开号WO97/29131和WO00/56772中描述的方法。

I.A.3.使用转基因动物的抗硬化蛋白单克隆抗体

在另一个实施例中，提供了通过用SOST抗原免疫接种非人动物产生的抗体，所述非人动物包含一些或全部人免疫球蛋白基因座。在一个实施例中，非人动物是XENOMOUSE转基因小鼠，包含人免疫球蛋白基因座大片段且在小鼠抗体产生方面有缺陷的工程改造的小鼠品系。参见例如，Green等人(1994)Nature Genet.7:13-21和美国专利号5,916,771；5,939,598；5,985,615；5,998,209；6,075,181；6,091,001；6,114,598和6,130,364。还参见PCT公开号WO91/10741；WO94/02602；WO96/34096和WO96/33735；WO98/16654；WO98/24893；WO98/50433；WO99/45031；WO99/53049；WO00/09560；和WO00/037504。转基因小鼠产生全人抗体的成体样人储库，且生成抗原特异性人Mab。通过引入兆碱基大小的、人重链基因座和x轻链基因座的种系构型YAC片段，转基因小鼠含有大约80％的人抗体储库。参见Mendez等人，Nature Genetics,15:146-156(1997)；以及Green和Jakobovits,J.Exp.Med.,188:483-495(1998)。

I.A.4.使用重组抗体文库的抗硬化蛋白单克隆抗体

提供了制备抗体的体外方法，其中筛选抗体文库以鉴定具有所需结合特异性的抗体。关于此类重组抗体文库筛选的方法是本领域众所周知的，且包括在例如下述参考文献中描述的方法：Ladner等人，美国专利号5,223,409；Kang等人，PCT公开号WO92/18619；Dower等人，PCT公开号WO91/17271；Winter等人，PCT公开号WO92/20791；Markland等人，PCT公开号WO92/15679；Breitling等人，PCT公开号WO93/01288；McCafferty等人，PCT公开号WO92/01047；Garrard等人，PCT公开号WO92/09690；Fuchs等人，Bio/Technology,9:1369-1372(1991)；Hay等人，Hum.Antibod.Hybridomas,3:81-85(1992)；Huse等人，Science,246:1275-1281(1989)；McCafferty等人，Nature,348:552-554(1990)；Griffiths等人，EMBO J.,12:725-734(1993)；Hawkins等人，J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)；Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)；Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576-3580(1992)；Garrard等人，Bio/Technology,9:1373-1377(1991)；Hoogenboom等人，Nucl.Acid Res.,19:4133-4137(1991)；和Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)；美国专利申请公开号2003/0186374；和PCT公开号WO97/29131。

重组抗体文库可来自用硬化蛋白或硬化蛋白的部分免疫接种的受试者。作为另外一种选择，重组抗体文库可来自首次用于实验的受试者，即，尚未用硬化蛋白免疫接种的受试者，例如，来自尚未用人硬化蛋白免疫接种的人受试者的人抗体文库。通过用包含人硬化蛋白的肽筛选重组抗体文库，以由此选择识别硬化蛋白的那些抗体，来选择本发明的抗体。用于进行此类筛选和选择的方法是本领域众所周知的，例如在先前段落中的参考文献中所述的。为了选择对人硬化蛋白具有特定结合亲和力的抗体，例如以特定K_off速率常数从人硬化蛋白解离的抗体，本领域已知的表面等离子共振方法可用于选择具有所需K_off速率常数的抗体。为了选择对人硬化蛋白具有特定中和活性的抗体，例如具有特定IC₅₀的抗体，可使用本领域已知的用于评价人硬化蛋白活性抑制的标准方法。

在一个方面，提供了结合人硬化蛋白的分离的抗体或其抗原结合部分。在一个实施例中，该抗体是中和抗体。在多个实施例中，该抗体是重组抗体或单克隆抗体。

例如，提供了也可使用本领域已知的多种噬菌体展示方法来生成的抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域在噬菌体颗粒表面上展示，所述噬菌体颗粒携带编码其的多核苷酸序列。特别地，此类噬菌体可用于展示由储库或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体可用抗原进行选择或鉴定，例如使用标记的抗原或结合或捕获至固体表面或珠子的抗原。这些方法中使用的噬菌体通常是包括fd和M13结合结构域的丝状噬菌体，所述结合结构域由具有Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域的噬菌体表达，所述抗体结构域或与噬菌体基因III或与基因VIII蛋白质重组融合。提供了可用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法，并包括下述参考文献中公开的那些：Brinkmann等人，J.Immunol.Methods,182:41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods,184:177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.,24:952-958(1994)；Persic等人，Gene,187:9-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunology,57:191-280(1994)；PCT公开号WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047(PCT/GB91/01134)；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；以及美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108。

如上文参考文献中所述，在噬菌体选择后，来自噬菌体的抗体编码区可进行分离并用于生成完整抗体，且在任何所需宿主中表达，所述完整抗体包括人抗体或任何其他所需抗原结合片段，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如下文详细描述的。例如，也可采用重组生产Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术，使用本领域已知的方法，例如下述参考文献中公开的那些：PCT公开WO92/22324；Mullinax等人，BioTechniques,12(6):864-869(1992)；和Sawai等人，Am.J.Reprod.Immunol.,34:26-34(1995)；和Better等人，Science,240:1041-1043(1988)。可用于生产单链Fv和抗体的技术例子包括下述参考文献中描述的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology,203:46-88(1991)；Shu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7995-7999(1993)；和Skerra等人，Science,240:1038-1041(1988)。

作为通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替代，提供了本领域已知的用于筛选大型组合文库的其他方法，并且所述其他方法可应用于双重特异性抗体的鉴定。如通过Szostak和Roberts的PCT公开号WO98/31700，以及Roberts,R.W.和Szostak,J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:12297-12302中描述的，一类可替代的表达系统是其中重组抗体文库作为RNA-蛋白融合物表达的表达系统。在该系统中，通过在其3'末端上携带嘌呤霉素(肽基受体抗生素)的合成mRNA的体外翻译，在mRNA及其编码的肽或蛋白之间产生共价融合。因此，基于编码的肽或蛋白例如抗体或其部分的特性，例如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合，特定mRNA可从mRNA的复杂混合物(例如，组合文库)中富集。从此类文库筛选回收的编码抗体或其部分的核酸序列，可通过如上所述的重组方法(例如，在哺乳动物宿主细胞中)表达，且此外可通过mRNA-肽融合物的另外筛选循环，或通过如上所述用于重组抗体体外亲和力成熟的其他方法实施进一步的亲和力成熟，在所述mRNA-肽融合物中已将突变引入最初选择的一种或多种序列内。

在另一种方法中，提供了使用本领域已知的酵母展示方法生成的抗体。在酵母展示方法中，使用遗传方法以使抗体结构域束缚于酵母细胞壁，且将它们展示在酵母表面上。特别地，此类酵母可用于展示由储库或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。提供了可用于制备抗体的酵母展示方法的例子，并且所述例子包括由Wittrup等人在美国专利号6,699,658中公开的那些。

I.B.重组硬化蛋白抗体的产生

提供了通过本领域已知的许多技术中的任一种产生的抗体。例如，来自宿主细胞的表达，其中编码重和轻链的一种或多种表达载体通过标准技术转染到宿主细胞内。术语“转染”的多种形式预期包含通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等等。尽管能够在原核或真核宿主细胞中表达提供的抗体，但优选在真核细胞中、且最优选在哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为此类真核细胞(且特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能装配且分泌正确折叠和有免疫学活性的抗体。

提供的用于表达重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220中描述，与DHFR选择标记一起使用的dhfr-CHO细胞，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol,.159:601-621中描述的)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞内时，抗体通过将宿主细胞培养足够时间段来生产，以允许抗体在宿主细胞中表达，或在一个实施例中，抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内。抗体可使用标准蛋白质纯化法从培养基中回收。

宿主细胞也可用于产生功能性抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。应当理解上述程序的改变在提供的内容范围内。例如，可能希望用DNA转染宿主细胞，所述DNA编码如提供的抗体的轻链和/或重链的功能性片段。重组DNA技术也可用于去除编码轻和重链中任一或两者的一些或全部DNA，所述DNA对于结合目的抗原不是必需的。由此类截短的DNA分子表达的分子也由如提供的抗体包含。另外，提供了双功能抗体，并且所述双功能抗体可通过标准化学交联方法将抗体与第二抗体交联来产生，其中一条重链和一条轻链是抗体，而另一条重链和轻链对目的抗原以外的抗原特异性。

在用于重组表达抗体或其抗原结合部分的示例性系统中，提供了编码抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体，其通过磷酸钙介导的转染引入dhfr-CHO细胞内。在重组表达载体内，抗体重和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调控元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，所述DHFR基因允许使用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用该载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许表达抗体重和轻链，且从培养基中回收完整的抗体。使用标准分子生物学技术以制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养基中回收抗体。再进一步地，提供了合成重组抗体的方法，其通过在合适的培养基中培养宿主细胞直至重组抗体被合成。该方法还可包括从培养基中分离重组抗体。

I.B.1.抗人硬化蛋白抗体

本文的表格提供了示例性人抗人硬化蛋白抗体的VH和VL区的氨基酸序列列表。

表6提供了包含能够结合人硬化蛋白的抗原结合结构域的硬化蛋白结合蛋白，所述抗原结合结构域包括包含本文提供的氨基酸序列的至少一个CDR。

I.B.2.抗人硬化蛋白嵌合抗体

嵌合抗体是其中抗体的不同部分源自不同动物物种的分子，例如具有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的，并在实例部分中详细讨论。参见例如Morrison,Science,229:1202-1207(1985)；Oi等人，BioTechniques,4:214-221(1986)；Gillies等人，J.Immunol.Methods,125:191-202(1989)；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397。另外，可使用为产生“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)；Neuberger等人，Nature,312:604-608(1984)；Takeda等人，Nature,314:452-454(1985))，其通过将来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物活性的人抗体分子的基因剪接在一起。

在一个实施例中，提供了通过用人IgG1恒定区替换部分1中所述的鼠单克隆抗人硬化蛋白抗体的重链恒定区产生的嵌合抗体。

I.B.3.抗SOST CDR移植抗体

提供了包含来自人抗体的重和轻链可变区序列的CDR移植抗体，其中V_H和/或V_L的一个或多个CDR区替换为鼠抗体的CDR序列。来自任何人抗体的构架序列均可充当用于CDR移植的模板。然而，在此类构架上的直接链替换通常导致与抗原的结合亲和力的一些丧失。人抗体与原始鼠抗体越同源，使鼠CDR与人构架组合将在CDR中引入可降低亲和力的变形的可能性越小。因此，优选选择替换除CDR外的鼠可变构架的人可变构架与鼠抗体可变区构架具有至少65％序列同一性。更优选除CDR外的人和鼠可变区具有至少70％序列同一性。甚至更优选除CDR外的人和鼠可变区具有至少75％序列同一性。最优选除CDR外的人和鼠可变区具有至少80％序列同一性。用于生产嵌合抗体的方法是本领域已知的(还参见EP0239400；PCT公开号WO91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)；镶面(veneering)或表面重建(resurfacing)(参见例如EP0592106；EP0519596；Padlan,Molecular Immunology,28(4/5):489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering,7(6):805-814(1994)；Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:969-973(1994))；和链改组(参见例如美国专利号5,565,352)。

I.B.4.抗人硬化蛋白人源化抗体

人源化抗体是源自结合所需抗原的非人物种抗体的抗体分子，具有来自非人物种抗体的一个或多个互补性决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区。已知的人Ig序列例如在下述环球网站处公开：www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi；www.atcc.org/phage/hdb.html；www.sciquest.com/；www.abcam.com/；www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html；www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html；www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm；www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html；www.antibodyresource.com/；mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno-logy.html.www.immunologylink.com/；pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html；www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/；www.pebio.com/pa/340913/340913.html-；www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html；www.biodesign.com/table.asp；www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html；www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html；www.isac-net.org/sites_geo.html；aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html；baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html；www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/；www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/INTRO.html；www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；imgt.cnusc.fr:8104/；www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html；antibody.bath.ac.uk/；abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem-inar/Slide01.html；www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/；www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html；www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo-ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html；www.jerini.de/fr roducts.htm；www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,U.S.Dept.Health(1983)。如本领域已知的，此类输入的序列可用于降低免疫原性，或降低、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、离开速率、亲合力(avidity)、特异性、半衰期或任何其他合适的特征。

人构架区中的构架(FR)残基可用来自CDR供体抗体的相应残基置换，以改变抗原结合，在一个实施例中，改善抗原结合。这些构架置换通过本领域众所周知的方法鉴定，例如通过对CDR和构架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的构架残基，和序列比较以鉴定在特定位置处的罕见构架残基。参见例如，Queen等人，美国专利号5,585,089；Riechmann等人，Nature,332:323-327(1988)。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的且是本领域技术人员熟悉的。举例说明且展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可选择FR残基且与共有和输入序列组合，使得实现所需抗体特征，例如对一种或多种靶抗原的亲和力增加。一般而言，CDR残基直接且最基本地涉及影响抗原结合。抗体可使用本领域已知的多种技术进行人源化，例如但不限于下述参考文献中描述的那些：Jones等人，Nature,321:522-525(1986)；Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988)；Sims等人，J.Immunol.,151:2296-2308(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987),Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285-4289(1992)；Presta等人，J.Immunol.,151:2623-2632(1993)；Padlan,Molecular Immunology,28(4/5):489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering,7(6):805-814(1994)；Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:969-973(1994)；PCTPublication Nos.WO91/09967；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；WO99/06834(PCT/US98/16280)；WO97/20032(PCT/US96/18978)；WO92/11272(PCT/US91/09630)；WO92/03461(PCT/US91/05939)；WO94/18219(PCT/US94/01234)；WO92/01047(PCT/GB91/01134)；和WO93/06213(PCT/GB92/01755)；EP专利号EP0592106；EP0519596和EP0239400；美国专利号5,565,332；5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539和4,816,567。

I.B.5.抗硬化蛋白DVD结合蛋白

还提供的是结合硬化蛋白的一个或多个表位的双重可变结构域结合蛋白(DVD结合蛋白)。DVD结合蛋白还可结合硬化蛋白的表位和硬化蛋白多肽以外的第二靶抗原的表位。此类DVD结合蛋白的实施例包括包含结构式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的重链，其中VD1是第一重链可变结构域，VD2是第二重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，X2是Fc区，并且n是0或1，且在一个实施例中，是1；和包含结构式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的轻链，其中VD1是第一轻链可变结构域，VD2是第二轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CL，X2不包含Fc区；并且n是0或1，且在一个实施例中，是1。此类DVD结合蛋白可包含两条此类重链和两条此类轻链，其中每条链包含串联连接的可变结构域，而在可变区之间不含间插恒定区，其中重链和轻链结合，以形成两个串联抗原结合位点，并且一对重和轻链可与另一对重和轻链结合，以形成具有四个抗原结合位点的四聚结合蛋白。在另一个实施例中，DVD结合蛋白可包含重和轻链，所述重和轻链各自包含串联连接的三个可变结构域例如VD1、VD2、VD3，而在可变结构域之间不含间插恒定区，其中一对重和轻链可结合，以形成三个抗原结合位点，并且其中一对重和轻链可与另一对重和轻链结合，以形成具有六个抗原结合位点的四聚结合蛋白。

DVD结合蛋白中的每个可变结构域(VD)均可得自一种或多种“亲本”单克隆抗体，其结合一种或多种所需抗原或表位，例如硬化蛋白和/或非硬化蛋白抗原或表位(例如TNF-α)。

III.A.亲本单克隆抗体的生成

DVD结合蛋白的可变结构域可从亲本抗体获得，包括能够结合目的抗原的单克隆抗体(mAb)。这些抗体可以是天然存在的或可通过重组技术产生。应当理解如果结合所需靶抗原或表位的抗体是多克隆的，则仍需要获得来自多克隆群体的单一抗体，即多克隆群体的单一单克隆成员的抗原结合位点的可变结构域，以用于生成DVD结合蛋白。单克隆抗体可通过本领域已知的多种方法中的任一种生成，包括本文描述的那些(参见上文部分A.1.-A.4.)。

III.B.用于选择亲本单克隆抗体的标准

提供了与选择亲本抗体有关的实施例，所述亲本抗体具有DVD结合蛋白中所需的至少一种或多种特性。在一个实施例中，所需特性是一种或多种抗体参数。在另一个实施例中，抗体参数是抗原特异性、对抗原的亲和力、效力、生物学功能、表位识别、稳定性、可溶性、生产效率、免疫原性、药物代谢动力学、生物利用度、组织交叉反应性和直向同源抗原结合。

III.B.1.对抗原的亲和力

治疗性mAb的所需亲和力可取决于抗原的性质和所需的治疗终点。在一个实施例中，在阻断细胞因子-细胞因子受体相互作用时，单克隆抗体具有较高的亲和力(Kd＝0.01–0.50pM)，因为此类相互作用通常是高亲和力相互作用(例如<pM-<nM范围)。在此类情况下，mAb对其靶标的亲和力应等于或好于细胞因子(配体)对其受体的亲和力。另一方面，具有较低亲和力(>nM范围)的mAb可能在例如清除循环的潜在致病性蛋白中具有治疗性效果，例如结合、隔绝和清除靶抗原例如A-β淀粉状蛋白的循环种类的单克隆抗体。在其他情况下，通过定点诱变降低现有高亲和力mAb的亲和力、或使用对其靶标具有较低亲和力的mAb可用于避免可能的副作用，例如，高亲和力mAb可能隔绝或中和所有其预期的靶标，由此完全耗尽/消除靶向的蛋白质的一种或多种功能。在这种情境中，低亲和力mAb可隔绝/中和可能负责疾病症状(病理或超量产生的水平)的靶标的一部分，从而允许部分靶标继续执行其一种或多种正常生理功能。因此，可能降低Kd来调整剂量和/或减少副作用。亲本mAb的亲和力可能在适当地靶向细胞表面分子来实现所需治疗结果中起作用。例如，如果靶标在癌细胞上以高密度表达、而在正常细胞上以低密度表达，则较低亲和力mAb将在肿瘤细胞上结合比正常细胞上更多的靶标，导致肿瘤细胞经由ADCC或CDC消除，且因此可具有所需的治疗效果。因此，选择具有所需亲和力的mAb可能与可溶性和表面靶标两者有关。

通过受体与其配体相互作用时的信号传导可取决于受体-配体相互作用的亲和力。类似地，可想到mAb对表面受体的亲和力可决定细胞内信号传导的性质以及该mAb是否可递送激动剂或拮抗剂信号。mAb介导的信号传导的基于亲和力的性质可能对其副作用概况具有影响。因此，需要通过体外和体内实验谨慎确定治疗性单克隆抗体的所需亲和力和所需功能。

可依赖于所需治疗结果实验性确定结合蛋白(例如抗体)的所需Kd。在一个实施例中，选择对特定抗原的亲和力(Kd)等于或好于DVD结合蛋白对相同抗原的所需亲和力的亲本抗体。通过Biacore或另一种类似技术评价抗原结合亲和力和动力学。在一个实施例中，每个亲本抗体对其抗原具有下述解离常数(Kd)：至多约10^-7M；至多约10^-8M；至多约10^-9M；至多约10^-10M；至多约10^-11M；至多约10^-12M；或至多约10^-13M。由其获得VD1的第一亲本抗体和由其获得VD2的第二亲本抗体可对各自抗原具有相似或不同亲和力(K_D)。如通过表面等离子共振测定的，每个亲本抗体对抗原具有下述结合速率常数(Kon)：至少约10²M^-1s^-1；至少约10³M^-1s^-1；至少约10⁴M^-1s^-1；至少约10⁵M^-1s^-1；或至少约10⁶M^-1s^-1。由其获得例如VD1的第一亲本抗体和由其获得VD2的第二亲本抗体可对各自抗原具有相似或不同的结合速率常数(Kon)。在一个实施例中，如通过表面等离子共振测定的，每个亲本抗体对抗原具有下述离开速率常数(Koff)：至多约10^-3s^-1；至多约10^-4s^-1；至多约10^-5s^-1；或至多约10^-6s^-1。由其获得VD1的第一亲本抗体和由其获得VD2的第二亲本抗体可对各自抗原具有相似或不同的离开速率常数(Koff)。

III.B.2.效力

亲本单克隆抗体的所需亲和力/效力将取决于所需的治疗结果。例如，对于受体-配体(R-L)相互作用，亲和力(kd)等于或好于R-L kd(pM范围)。对于致病性循环蛋白的简单清除，Kd可在低nM范围，例如清除循环A-β肽的各种种类。另外，Kd也将取决于靶标是否表达相同表位的多拷贝，例如靶向Aβ寡聚体中的构象表位的mAb。

当VD1和VD2结合相同抗原但是不同表位时，DVD结合蛋白将含有对相同抗原的结合位点，从而增加亲合力以及由此的DVD结合蛋白的表观Kd。在一个实施例中，选择具有等于或低于DVD结合蛋白中所需的Kd的亲本抗体。亲本mAb的亲和力考虑也取决于DVD结合蛋白是否含有四个或更多个相同抗原结合位点(即，来自单个mAb的DVD结合蛋白)。在此情况下，表观Kd将由于亲合力而高于mAb。此类DVD结合蛋白可用于交联表面受体、增加中和效力、增强病理蛋白质的清除等。

在另一个实施例中，选择对特定抗原的中和效力等于或好于DVD结合蛋白对相同抗原的所需中和潜力的亲本抗体。可通过靶标依赖性生物测定评价中和效力，在所述靶标依赖性生物测定中，适当类型的细胞响应于靶标刺激而产生可测量的信号(即，增殖或细胞因子产生)，而通过mAb的靶标中和可以剂量依赖的方式降低信号。

III.B.3.生物学功能

单克隆抗体可潜在地执行几种功能。这些功能中的一些列于表4中。这些功能可通过体外测定(例如基于细胞的和生物化学测定)和体内动物模型来评价。

表4.治疗性抗体的一些潜在应用。

可选择具有在本文和表8中的例子中所述的不同功能的mAb，来实现所需治疗结果。两种或更多种选择的亲本单克隆抗体然后可以DVD结合蛋白形式使用以实现在单个DVD结合蛋白中的两种不同功能。例如，可通过选择中和特定细胞因子例如SOST功能的亲本mAb、并选择增强病理蛋白的清除的亲本mAb，来产生DVD结合蛋白。类似地，可选择识别两个不同细胞表面受体的两个亲本mAb，一个mAb具有对一个受体的激动剂功能，而另一个mAb具有对不同受体的拮抗剂功能。各自具有不同功能的这两个所选mAb可用于构建单个DVD结合蛋白，该DVD结合蛋白将在单个分子中具有所选单克隆抗体的两个不同功能(激动剂和拮抗剂)。类似地，可将各阻断各自的受体配体(例如EGF和IGF)结合的两个针对细胞表面受体的拮抗性mAb以DVD结合蛋白形式使用。相反地，可选择拮抗性抗受体mAb(例如抗EGFR)和中和抗可溶性介质(例如抗-IGF1/2)mAb来制备DVD结合蛋白。

III.B.4.表位识别：

蛋白质的不同区域可执行不同功能。例如，细胞因子例如硬化蛋白的特定区域与细胞因子受体相互作用，以致使受体活化，而可能需要该蛋白质的其他区域来稳定细胞因子。在该情况下，可选择与细胞因子上的一个或多个受体相互作用区特异性结合的mAb，并由此阻断细胞因子-受体相互作用。在一些情况下，例如某些结合多个配体的趋化因子受体，可选择结合与仅一个配体相互作用的表位(趋化因子受体上的区域)的mAb。在其他情况下，单克隆抗体可与靶标上的表位结合，该表位不直接负责该蛋白质的生理功能，但是mAb与这些区域的结合可干扰该蛋白质的生理功能(位阻)或改变其构象，使得该蛋白质不能起作用(针对具有多个配体的受体的mAb，其改变受体构象，使得没有一个配体可结合)。不阻断细胞因子与其受体结合、但是阻断信号转导的抗细胞因子单克隆抗体也已经得到鉴定(例如125-2H、抗IL-18mAb)。

表位和mAb功能的例子包括但不限于阻断受体-配体(R-L)相互作用(结合R相互作用位点的中和mAb)；引起R结合减少或无R结合的位阻。抗体可在受体结合位点以外的位点结合靶标，但是仍然通过引起构象改变和消除功能(例如奥马佐单抗，Genetech/Novartis)、与R结合但阻断信号传导(125-2H mAb)而干扰受体结合及靶标的功能。

在一个实施例中，亲本mAb需要靶向合适的表位以发挥最大功效。此类表位在DVD结合蛋白中应该是保守的。可通过几种方法测定mAb的结合表位，所述方法包括共结晶、mAb-抗原复合物的有限蛋白酶解加上质谱肽作图(Legros V.等人2000蛋白质Sci.9:1002-10)、噬菌体展示的肽文库(O'Connor KH等人2005J Immunol Methods.299:21-35)、以及诱变(Wu C.等人.2003J Immunol170:5571-7)。

III.B.5.物理化学和药学特性

使用抗体的治疗性处理经常要求施用高剂量，经常为几mg/kg(由于通常的大分子量所致在质量基础上的低效力)。为了调整患者顺应性并充分解决慢性病治疗和门诊病人治疗，需要皮下(s.c.)或肌内(i.m.)施用治疗性mAb。例如，皮下施用的最大所需体积是～1.0mL，且因此，需要>100mg/mL的浓度来限制每剂的注射数。在一个实施例中，以一剂施用治疗性抗体。然而，通过蛋白质-蛋白质相互作用(例如有可能增加免疫原性危险的聚集)和通过在加工和递送过程中的限制(例如粘度)限制了此类制剂的开发。因此，临床功效所要求的大的数量以及相关的开发约束，限制了对抗体制剂的潜力的充分开发以及以高剂量方案皮下施用。显而易见的是，蛋白质分子和蛋白质溶液的物理化学和药学特性是极为重要的，例如稳定性、可溶性和粘度特征。

III.B.5.i.稳定性

“稳定的”抗体制剂是其中抗体在贮存后基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。可在选择的温度下测量稳定性达选择的时间段。在一个实施例中，制剂中的抗体在室温(约30℃)下或在40℃下稳定至少一个月，和/或在约2-8℃下稳定至少1年至少2年。另外，在一个实施例中，在冷冻(至例如-70℃)和融化制剂(此后称为“冻融循环”)后，该制剂是稳定的。在另一个实施例中，“稳定的”制剂可以是这样的制剂，其中小于约10％和小于约5％的蛋白质作为聚集体存在于该制剂中。

需要在各种温度下体外稳定达延长的时间段的DVD结合蛋白。可通过快速筛选在升高的温度下体外稳定(例如，在40℃下稳定2-4周)的亲本mAb，且然后评价稳定性来实现这一点。在2-8℃下的贮存期间，蛋白质显示出至少12个月例如至少24个月的稳定性。可使用各种技术例如阳离子交换层析、大小排阻层析、SDS-PAGE、以及生物活性测试来评价稳定性(单体、完整分子的％)。关于可采用以分析共价和构象修饰的分析技术的更全面列表，参见Jones,A.J.S.(1993)“Analytical methods for the assessment ofprotein formulations and delivery systems,”，在Cleland,J.L.；Langer,R.,编辑Formulation and delivery of peptides and proteins,1st edition(Washington,ACS),第22-45页；以及Pearlman,R.；Nguyen,T.H.(1990)“Analysis of proteindrugs,”，在Lee,V.H.,编辑Peptide and protein drug delivery，第1版(NewYork,Marcel Dekker,Inc.),第247-301页。

异质性和聚集体形成：抗体的稳定性可以是这样的，使得制剂可显示出在GMP抗体材料中小于约10％、以及在一个实施例中小于约5％、在另一个实施例中小于约2％、或在一个实施例中在0.5％至1.5％范围内或更低的作为聚集体存在。大小排阻层析是检测蛋白质聚集体的灵敏、可重复并且非常强健的方法。

除低聚集体水平之外，在一个实施例中，抗体必须是化学稳定的。可通过离子交换层析(例如阳离子或阴离子交换层析)、疏水相互作用层析、或其他方法例如等电聚焦或毛细管电泳测定化学稳定性。例如，抗体的化学稳定性可以是这样的，使得在2-8℃下贮存至少12个月后，与贮存测试前的抗体溶液相比，在阳离子交换层析中代表未修饰的抗体的峰可增加不高于20％、在一个实施例中不高于10％、或在另一个实施例中不高于5％。

在一个实施例中，亲本抗体显示结构的完整性；正确的二硫键形成，以及正确折叠：由于抗体二级或三级结构改变的化学不稳定性可影响抗体活性。例如，如通过抗体活性指示的稳定性可以是这样的，使得在2-8℃下贮存至少12个月后，与贮存测试前的抗体溶液相比，抗体活性可降低不多于50％、在一个实施例中不多于30％或甚至不多于10％、或在一个实施例中不多于5％或1％。可采用适合的抗原结合测定来测定抗体活性。

III.B.5.ii.可溶性：

mAb的“可溶性”与产生正确折叠的单体IgG相关。可因此通过HPLC评价IgG的可溶性。例如，可溶的(单体的)IgG将引起HPLC层析仪上的单个峰，而不溶性(例如多聚体的和聚集的)将产生多个峰。本领域技术人员将因此能够使用常规HPLC技术检测IgG可溶性的升高或降低。对于可采用来分析可溶性的分析技术的更全面列表(参见Jones,A.G.Dep.Chem.Biochem.Eng.,Univ.Coll.London,London,UK.编辑：Shamlou,P.Ayazi,Process.Solid-Liquid Suspensions(1993),93-117.(Butterworth-Heinemann,Oxford,UK)和Pearlman,Rodney；Nguyen,Tue H,Advances in ParenteralSciences(1990),4(Pept.Protein Drug Delivery),247-301。治疗性mAb的可溶性对于制备为通常为足够给药所要求的高浓度是重要的。如本文所概括的，可能要求>100mg/mL的可溶性来提供有效的抗体给药。例如，在研究早期，抗体可溶性可能不小于约5mg/mL，在一个实施例中，在高级加工科学阶段不小于约25mg/mL，或者在一个实施例中，不小于约100mg/mL，或者在一个实施例中，不小于约150mg/mL。蛋白质分子的固有特性对于该蛋白质溶液的物理化学特性，例如稳定性、可溶性、粘度，是重要的。然而，本领域技术人员将认识到，存在众多种可用作添加剂以有益地影响最终蛋白质制剂特征的赋形剂。这些赋形剂可包括：(i)液体溶剂、助溶剂(例如醇，如乙醇)；(ii)缓冲剂(例如磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、氨基酸缓冲液)；(iii)糖或糖醇(例如蔗糖、海藻糖、果糖、棉子糖、甘露糖醇、山梨糖醇、葡聚糖)；(iv)表面活性剂(例如聚山梨醇酯20、40、60、80、泊洛沙姆)；(v)等渗性改性剂(例如，盐，如NaCl，糖，糖醇)；以及(vi)其他(例如，防腐剂、螯合剂、抗氧化剂、螯合物质(例如EDTA)、可生物降解的聚合物、载体分子(例如HAS、PEG)。

粘度是就抗体制造和抗体加工(例如渗滤/超滤)、罐装/封装(fill-finish)加工(泵送方面、过滤方面)和递送方面(可注射性、复杂的设备递送)而言高度重要的参数。低粘度使得抗体的液体溶液能够具有较高浓度。这使得相同剂量能够以较小的体积施用。小注射体积具有在注射感觉上较低疼痛的优点，而且该溶液没有必要是等渗的以降低患者在注射时的疼痛。抗体溶液的粘度可以是这样的，使得在剪切速率100(1/s)下，抗体溶液粘度低于200mPas，在一个实施例中低于125mPas，在另一个实施例中低于70mPas，且在另一个实施例中低于25mPas或甚至低于10mPas。

III.B.5.iii.生产效率

产生在哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中有效表达的DVD结合蛋白，在一个实施例中将需要两个本身在哺乳动物细胞中有效表达的亲本单克隆抗体。稳定哺乳动物系(即CHO)的生产得率应该高于约0.5g/L，在一个实施例中高于约1g/L，且在另一个实施例中在从约2到约5g/L或更多的范围内(Kipriyanov SM,Little M.1999Mol Biotechnol.12:173-201；Carroll S,Al-Rubeai M.2004Expert Opin Biol Ther.4:1821-9)。

抗体和Ig融合蛋白在哺乳动物细胞中的生产受几个因素影响。经由整合强启动子、增强子和选择标记对表达载体的工程改造，可最大化目的基因从整合的载体拷贝的转录。鉴定允许高水平基因转录的载体整合位点可增加蛋白从载体的表达(Wurm等人，2004，Nature Biotechnology，2004，22(11)：1393-1398)。另外，生产水平受抗体重和轻链的比率以及蛋白装配和分泌过程中各个步骤影响(Jiang等人，2006，Biotechnology Progress，Jan-Feb2006，第22卷，no.1，第313-318页)。

III.B.6.免疫原性

施用治疗性mAb可导致免疫反应的一定发生率(即，针对治疗性mAb的内源性抗体的形成)。应当在选择亲本单克隆抗体期间分析可能引起免疫原性的潜在元件，并且可采取降低这种危险的步骤，以在DVD结合蛋白构建之前最优化亲本单克隆抗体。已经发现小鼠来源的抗体在患者中具有高免疫原性。包含小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体的生成提供了降低治疗性抗体免疫原性的合理的下一步(Morrison和Schlom，1990)。作为另外一种选择，可通过将鼠CDR序列转移入人抗体构架(重构/CDR移植/人源化)而降低免疫原性，如Riechmann等人，1988关于治疗性抗体所述。另一种方法称为“表面重建”或“镶面”，该方法从啮齿类动物可变轻和重结构域开始，仅仅将表面可及的构架氨基酸改变为人氨基酸，而CDR和隐蔽的氨基酸则保持来自亲本啮齿类动物抗体(Roguska等人，1996)。在另一类人源化中，代替移植整个CDR，一个技术仅移植“特异性决定区”(SDR)，将所述“特异性决定区”定义为涉及抗体与其靶标结合的CDR残基的亚群(Kashmiri等人，2005)。这使通过可利用的抗体-靶标复合物三维结构的分析或抗体CDR残基的突变分析来确定哪些残基与靶标相互作用而鉴定SDR成为必要。作为另外一种选择，与鼠、嵌合或人源化抗体相比，完全人抗体可能具有降低的免疫原性。

降低治疗性抗体免疫原性的另一种方法是消除预测有免疫原性的某些特定序列。在一种方法中，在第一代生物制剂已经在人中得到测试并发现具有不可接受的免疫原性后，可对B细胞表位作图且然后改变，来避免免疫检测。另一种方法使用预测并去除可能的T细胞表位的方法。已经开发了计算方法来扫描并鉴定具有与MHC蛋白结合的潜力的生物学治疗剂肽序列(Desmet等人，2005)。作为另外一种选择，可使用基于人树突细胞的方法来鉴定潜在的蛋白变应原中的CD4⁺T细胞表位(Stickler等人，2005；S.L.Morrison和J.Schlom,Important Adv.Oncol.(1990)，第3-18页；Riechmann,L.,Clark,M.,Waldmann,H.和Winter,G.“Reshaping human antibodies fortherapy,”Nature(1988)332:323-327；Roguska-M-A,Pedersen-J-T,Henry-A-H,Searle-S-M,Roja-C-M,Avery-B,Hoffee-M,Cook-S,Lambert-J-M, Rees-A-R,Guild-B-C,“A comparison of two murine mAbs humanized byCDR-grafting and variable domain resurfacing,”Protein Engineering,(1996),9:.895-904；Kashmiri-Syed-V-S,De-Pascalis-Roberto,Gonzales-Noreen-R,Schlom-Jeffrey,“SDR grafting--a new approach to antibody humanization,”Methods(San Diego Calif.),May2005,36(1):25-34；Desmet-Johan,Meersseman-Geert,Boutonnet-Nathalie,Pletinckx-Jurgen,De-Clercq-Krista,Debulpaep-Maja,Braeckman-Tessa,Lasters-Ignace,“Anchor profiles ofHLA-specific peptides:analysis by a novel affinity scoring method andexperimental validation,”Proteins(2005)58:53-69；Stickler-M-M,Estell-D-A,Harding-F-A.,“CD4+T-cell epitope determination using unexposed humandonor peripheral blood mononuclear cells,”J.Immunother.(2000)23:654-60.)

III.B.7.体内功效

为了生成具有所需体内功效的DVD结合蛋白，当以组合给予时，生成并选择具有相似的所需体内功效的mAb是重要的。然而，在一些情况下，DVD结合蛋白可能表现出两个单独mAb的组合所不能实现的体内功效。例如，DVD结合蛋白可使两个靶标临近，从而引起两个单独mAb的组合所不能实现的活性。本文在部分B3中描述了额外的所需生物学功能。可基于诸如药物代谢动力学半衰期(t1/2)；组织分布；可溶的与细胞表面靶标；以及靶标浓度-可溶性/密度-表面的因素，选择具有DVD结合蛋白中所需特征的亲本抗体。

III.B.8.体内组织分布

为了生成具有所需体内组织分布的DVD结合蛋白，在一个实施例中，必须选择具有类似的所需体内组织分布概况的亲本mAb。作为另外一种选择，基于双重特异性靶向策略的机制，在其他时候，当以组合给予时，可能不要求选择具有类似的所需体内组织分布的亲本mAb。例如，在一种DVD结合蛋白的情况中，其中，一个结合组分将DVD结合蛋白靶向特定位点，由此将第二结合组分带到相同靶标位点。例如，DVD结合蛋白的一个结合特异性可靶向胰腺(胰岛细胞)，而另一个特异性可将GLP1带到胰腺来诱导胰岛素。

III.B.9.同种型

为了生成具有所需特性的DVD结合蛋白，所需特性包括但不限于同种型、效应子功能和循环半衰期，依赖于治疗效用和所需治疗终点选择具有适当的Fc效应子功能的亲本mAb。存在五种主要的重链种类或同种型，其中一些具有几个亚型，且这些决定抗体分子的效应子功能。这些效应子功能存在于抗体分子的铰链区、CH2和CH3结构域。然而，抗体分子其他部分中的残基可能也对效应子功能具有作用。铰链区Fc效应子功能包括：(i)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，(ii)补体(C1q)结合、活化和依赖补体的细胞毒性(CDC)，(iii)抗原-抗体复合物的吞噬作用/清除，以及(iv)在一些情况下的细胞因子释放。抗体分子的这些Fc-效应子功能是通过Fc区与一组种类特异性细胞表面受体的相互作用介导的。IgG1同种型的抗体是最活跃的，而IgG2和IgG4具有最小或没有效应子功能。IgG抗体的效应子功能是通过与三种结构上同源的细胞Fc受体型(及亚型)(FcgR1、FcgRII和FcgRIII)相互作用而介导的。可通过在较低铰链区突变FcgR和C1q结合所需的特定氨基酸残基(例如L234A、L235A)来消除IgG1的这些效应子功能。Fc区、特别是CH2-CH3结构域中的氨基酸残基也决定抗体分子的循环半衰期。该Fc功能通过Fc区与新生Fc受体(FcRn)的结合而介导，所述新生Fc受体负责抗体分子从酸性溶酶体再循环回到全身循环。

mAb是否应该具有活性或失活同种型将取决于抗体所需的治疗终点。同种型的使用以及所需治疗结果的一些例子罗列如下：

1.如果所需终点是功能性中和可溶性细胞因子，则可使用失活同种型；

2.如果所需结果是清除病理蛋白，则可使用活性同种型；

3.如果所需结果是清除蛋白质聚集体，则可使用活性同种型；

4.如果所需结果是拮抗表面受体，则使用失活同种型(Tysabri，IgG4；，突变的IgG1)；

5.如果所需结果是清除靶细胞，则使用活性同种型(Herceptin，IgG1(并具有增强的效应子功能)；以及

6.如果所需结果是不进入CNS而将蛋白质从循环清除，则可使用IgM同种型(例如，清除循环Ab肽种类)。

可通过各种本领域熟知的体外方法测定亲本mAb的Fc效应子功能。

如所讨论的，对同种型以及由此效应子功能的选择将取决于所需的治疗终点。万一需要简单中和循环靶标，例如，阻断受体-配体相互作用，则可能不要求效应子功能。在此类情况下，需要消除效应子功能的抗体Fc区内的同种型或突变。在另一种以消除靶细胞为治疗终点的情况下，例如消除肿瘤细胞，需要增强效应子功能的Fc-区内的同种型或突变或去岩藻糖基化(Presta GL,Adv.Drug Delivery Rev.,58:640-656,2006；Satoh M.,Iida S.,Shitara K.,Expert Opinion Biol.Ther.,6:1161-1173,2006)。类似地，取决于治疗效用，可通过经由在Fc区引入特定突变来调节抗体-FcRn相互作用，来降低/延长抗体分子循环半衰期(Dall’Acqua WF,Kiener PA,Wu H.,J.Biol.Chem.,281:23514-23524(2006)；Petkova SB.,Akilesh S.,Sproule TJ.等人，Internat.Immunol.,18:1759-1769(2006)；Vaccaro C.,Bawdon R.,Wanjie S等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:18709-18714(2007)。

可能需要对于DVD结合蛋白证实影响正常治疗性mAb的不同效应子功能的各种残基的公开信息。在DVD结合蛋白形式中，有可能鉴定为调节单克隆抗体效应子功能的那些以外的另外(不同)Fc-区残基是重要的。

总体而言，关于哪些Fc效应子功能(同种型)对于最终DVD结合蛋白形式将是关键的决定将取决于疾病指征、治疗靶标、所需治疗终点和安全性考虑。下文列出的是示例性的适当的重链和轻链恒定区，包括但不限于：

IgG1–同种异型：G1mz

IgG1突变体–A234，A235

IgG2–同种异型：G2m(n-)

κ–Km3

λ

Fc受体和C1q研究：可通过(例如L234A、L235A)铰链区突变来取消抗体与细胞膜上任何超表达的靶标复合造成的不需要的依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和依赖补体的细胞毒性(CDC)的可能性。由于认为FcgR结合发生在IgG1铰链区上的重叠位点中，所以预期存在于mAb的IgG1铰链区中的这些置换的氨基酸导致mAb与人Fc受体(而非FcRn)的结合减少。mAb的这个特征可导致比含有野生型IgG的抗体改善的安全性概况。可通过流式细胞术实验使用细胞系(例如THP-1、K562)和表达FcgRIIb(或其他FcgR)的工程改造的CHO细胞系测定mAb与人Fc受体的结合。与IgG1对照单克隆抗体相比，mAb显示与FcgRI和FcgRIIa结合降低，而与FcgRIIb的结合未受影响。由抗原/IgG免疫复合物引起的C1q结合和活化触发具有随后的炎症和/或免疫调节应答的经典补体级联反应。IgGs上的C1q结合位点被定位在IgG铰链区内的残基。通过C1q ELISA评价C1q与渐增浓度的mAb的结合。结果证明，如当与野生型对照IgG1的结合相比时所预期的，mAb不能与C1q结合。总体而言，L234A、L235A铰链区突变消除mAb与FcgRI、FcgRIIa和C1q的结合，但是不影响mAb与FcgRIIb的相互作用。这些数据提示，具有突变Fc的mAb将在体内与抑制性FcgRIIb正常相互作用，但可能将不能与活化FcgRI和FcgRIIa受体或C1q相互作用。

人FcRn结合：新生受体(FcRn)负责IgG穿过胎盘的转运并控制IgG分子的分解代谢半衰期。可能需要增加抗体的终末半衰期来改善功效、降低施用的剂量或频率、或改善对靶标的定位。作为另外一种选择，相反的作法可能是有利的，即，降低抗体的终末半衰期以降低全身暴露或改善靶标对非靶标结合比率。设计IgG与其补救受体FcRn之间的相互作用提供了增加或降低IgG终末半衰期的途径。循环中的蛋白质(包括IgG)由某些细胞例如血管内皮细胞通过微胞饮作用在流体相被吸收。IgG可在内体中在微酸性条件(pH6.0-6.5)下结合FcRn，并且可再循环到细胞表面，在那里它在几乎中性条件(pH7.0-7.4)下释放。FcRn80、16、17上Fc区结合位点的作图显示，在物种间保守的两个组氨酸残基His310和His435是造成这种相互作用的pH依赖性的原因。使用噬菌体展示技术，鉴定了增加与FcRn的结合并延长小鼠IgG半衰期的小鼠Fc区突变(参见Victor,G.等人，Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997))。在pH6.0但不在pH7.0增加人IgG对FcRn的结合亲和力的Fc区突变也已得到鉴定(参见Dall'Acqua等人，J.Immunol.,169(9):5171-80(2002))。此外，在一种情况下，对于猕猴(rhesus)FcRn也观察到类似的pH依赖的结合增加(最高达27倍)，且与亲本IgG相比，这导致猕猴中血清半衰期的2倍增加(参见Hinton等人，J.Biol.Chem.,279(8):6213-6216(2004))。这些发现说明，通过设计Fc区与FcRn相互作用而延长抗体治疗剂的血浆半衰期是可行的。相反的，减弱与FcRn相互作用的Fc区突变可缩短抗体半衰期。

III.B.10.药物代谢动力学(PK)

为了生成具有所需药物代谢动力学概况的DVD结合蛋白，在一个实施例中，选择具有相似的所需药物代谢动力学概况的亲本mAb。一个考虑是对单克隆抗体的免疫原性应答(即“HAHA”，人抗人抗体应答；“HACA”，人抗嵌合抗体应答)还使这些治疗剂的药物代谢动力学变复杂。在一个实施例中，使用免疫原性最小或没有免疫原性的单克隆抗体来构建DVD结合蛋白，使得结果产生的DVD结合蛋白也将具有最小免疫原性或没有免疫原性。决定mAb的PK的一些因素包括但不限于mAb的内在特性(VH氨基酸序列)、免疫原性、FcRn结合和Fc功能。

由于啮齿类动物中的PK概况与食蟹猴(cynomolgus monkey)和人中的单克隆抗体的PK概况良好相关(或接近地预测后者)，所以可容易地在啮齿类动物中测定所选亲本单克隆抗体的PK概况。

选择具有所需PK特征(和本文讨论的其他所需功能特性)的亲本单克隆抗体后，构建DVD结合蛋白。由于DVD结合蛋白含有来自两个亲本单克隆抗体的两个抗原结合结构域，所以也评价DVD结合蛋白的PK特性。因此，在测定DVD结合蛋白的PK特性时，可采用基于来自两个亲本单克隆抗体的两个抗原结合结构域的功能性测定PK概况的PK测定。可测定DVD结合蛋白的PK概况。可影响DVD结合蛋白的PK概况的其他因素包括抗原结合结构域(CDR)方向、接头大小、以及Fc/FcRn相互作用。可通过评估下列参数而评价亲本抗体的PK特征：吸收、分布、代谢和排泄。

吸收：迄今为止，治疗性单克隆抗体的施用是通过肠胃外途径(例如静脉内[IV]、皮下[SC]或肌内[IM])。mAb在SC或IM施用后从胞间隙吸收到体循环中主要是通过淋巴途径。血管外施用后，可饱和的系统前(presystemic)蛋白酶解降解可能导致可变的绝对生物利用度。通常，由于在较高剂量饱和的蛋白酶解能力，可观察到伴随单克隆抗体剂量渐增的绝对生物利用度的增加。由于淋巴液缓慢引流到血管系统中，mAb的吸收过程通常是相当缓慢的，而且吸收的持续时间可发生数小时至几天。单克隆抗体在SC施用后的绝对生物利用度一般在50％至100％范围内。在通过DVD结合蛋白构建体靶向的在血脑屏障(BBB)的转运介导结构的情况下，在血浆中的循环时间可减少，这是由于在血脑屏障(BBB)上增强的跨细胞转运进入CNS区室内，在其中DVD结合蛋白被释放以使得能够经由其第二抗原识别位点相互作用。

分布：IV施用后，单克隆抗体通常遵循双相血清(或血浆)浓度-时间概况，从快速分布相开始，随后为缓慢消除相。一般，双指数药物代谢动力学模型最好地描述这类药物代谢动力学概况。mAb在中央室(centralcompartment)中的分布体积(Vc)通常等于或略大于血浆体积(2-3升)。因为血清(血浆)浓度-时间曲线的分布相受长吸收部分掩盖，所以血清(血浆)浓度对时间概况中的独特双相模式对于其他肠胃外施用途径例如IM或SC可能不明显。许多因素，包括物理化学特性、位点特异性和靶标定向的受体介导的摄取、组织结合能力以及mAb剂量，可影响mAb的生物分布。这些因素中的一些可促成mAb生物分布中的非线性。

代谢和排泄：由于分子大小，完整的单克隆抗体不通过肾排泄到尿中。它们首先通过代谢(例如分解代谢)灭活。对于基于IgG的治疗性单克隆抗体，半衰期一般在数小时或1-2天到20天以上的范围内。mAb的消除可受许多因素影响，包括但不限于对FcRn受体的亲和力、mAb的免疫原性、mAb的糖基化程度、mAb对蛋白酶解的易感性、以及受体介导的消除。

III.B.11.人和tox物种(tox species)的组织交叉反应性模式

相同的染色模式提示，可在tox物种中评估潜在的人毒性。tox物种是不相关的毒性得到研究的那些动物。

选择符合两个标准的个别抗体：(1)适于抗体靶标已知表达的组织染色，和(2)来自相同器官的人和tox物种组织之间的类似的染色模式。

标准1：免疫接种和/或抗体选择一般采用重组或合成的抗原(蛋白质、碳水化合物或其他分子)。与天然配对物的结合以及针对无关抗原的反筛选通常是治疗性抗体筛选漏斗的部分。然而，针对众多抗原进行筛选经常是不现实的。因此，使用来自所有主要器官的人组织的组织交叉反应性研究用以排除抗体与任何无关抗原的不需要的结合。

标准2：使用人和tox物种组织的比较组织交叉反应性研究(食蟹猴、狗、可能的啮齿类动物及其他，测试与人研究中相同的36或37个组织)帮助验证tox物种的选择。在冷冻组织切片的典型组织交叉反应性研究中，治疗性抗体可显示对已知抗原的预期结合，和/或基于低水平相互作用的对组织的较低程度结合(非特异性结合、对相似抗原的低水平结合、基于低水平电荷的相互作用等)。在任何情况下，最相关的毒理学动物物种是与人和动物组织结合的一致性程度最高的动物物种。

组织交叉反应性研究遵循适当的规章指导方针，包括EC CPMPGuideline III/5271/94“Production and quality control of mAbs”和1997USFDA/CBER“Points to Consider in the Manufacture and Testing of MonoclonalAntibody Products for Human Use”。将从尸体解剖或活组织检查获得的人组织冷冻切片(5μm)在物镜上固定并干燥。使用抗生物素蛋白-生物素系统，实施组织切片的过氧化物酶染色。FDA的指导方针“Points to Consider in theManufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use”.相关参考文献包括Clarke,J.(2004),Boon,L.(2002a),Boon,L.(2002b),Ryan,A.(1999)。

组织交叉反应性研究经常以两个阶段完成，第一阶段包括来自一个人供体的32个组织(通常为：肾上腺、胃肠道、前列腺、膀胱、心脏、骨骼肌、血细胞、肾、皮肤、骨髓、肝、脊髓、乳房、肺、脾、小脑、淋巴结、睾丸、大脑皮质、卵巢、胸腺、结肠、胰腺、甲状腺、内皮、甲状旁腺、输尿管、眼、垂体、子宫、输卵管和胎盘)的冷冻切片。在第二阶段，用来自三个不相关成体的最多达38个组织(包括肾上腺、血液、血管、骨髓、小脑、大脑、子宫颈、食道、眼、心脏、肾、大肠、肝、肺、淋巴结、乳房乳腺、卵巢、输卵管、胰腺、甲状旁腺、外周神经、垂体、胎盘、前列腺、唾液腺、皮肤、小肠、脊髓、脾、胃、横纹肌、睾丸、胸腺、甲状腺、扁桃体、输尿管、膀胱和子宫)实施完整交叉反应性研究。通常在最低限度两个剂量水平上完成研究。

可将治疗性抗体(即测试物品)和同种型匹配的对照抗体生物素化用于抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC)检测；其他检测方法可包括对FITC(或以其他方式)标记的测试物品的第三抗体检测，或对未标记的测试物品用标记的抗人IgG进行预复合(precomplexing)。

简言之，将从尸体解剖或活组织检查获得的人组织的冷冻切片(约5μm)在物镜上固定并干燥。使用抗生物素蛋白-生物素系统，实施组织切片的过氧化物酶染色。首先(在预复合检测系统的情况下)，将测试物品与生物素化的第二抗人IgG温育并使其发展为免疫复合物。将在2和10μg/mL的测试物品终浓度的免疫复合物添加到在物镜上的组织切片上，然后用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶试剂盒使组织切片反应30分钟。随后，应用过氧化物酶反应底物DAB(3,3’-二氨基联苯胺)4分钟进行组织染色。使用抗原-琼脂糖珠子作为阳性对照组织切片。

基于正被讨论的靶抗原的已知表达，将任何特异性染色判断为预期的(例如，与抗原表达一致)或意外的反应性。将任何判断为特异性的染色关于强度和频率进行评分。抗原或血清竞争或阻断研究可帮助进一步确定观察到的染色是特异性的还是非特异性的。

如果发现两个所选抗体符合选择标准——适当的组织染色，人和毒理学动物特定组织之间的匹配染色——则可选择它们用于DVD结合蛋白生成。

对于最终DVD结合蛋白构建体必须重复组织交叉反应性研究，但是尽管这些研究遵循本文概括的相同方案，对它们进行评估是更复杂的，这是因为任何结合可来自两个亲本抗体中的任一种，而任何不清楚的结合需要用复杂的抗原竞争研究来确认。

显而易见的是，如果由于(1)缺乏意外的组织交叉反应性发现以及(2)在相应人和毒理学动物物种组织之间的组织交叉反应性发现的适当相似性选择两个亲本抗体，则使用多特异性分子如DVD结合蛋白的组织交叉反应性研究的复杂工作将得到极大简化。

III.B.12.特异性和选择性

为了生成具有所需特异性和选择性的DVD结合蛋白，需要生成并选择具有类似的所需特异性和选择性概况的亲本mAb。

利用DVD结合蛋白的特异性和选择性的结合研究可由于四个或更多个结合位点(每个抗原各两个)而复杂化。简言之，利用DVD结合蛋白使用ELISA、BIAcore、KinExA或其他相互作用研究的结合研究，需要监控一个、两个或更多个抗原对DVD结合蛋白的结合。虽然BIAcore技术可分析多个抗原的顺序、独立结合，但更传统的方法包括ELISA或更现代的技术例如KinExA则不能。因此每个亲本抗体的仔细表征是关键的。在每个个别抗体已对特异性进行表征后，对DVD结合蛋白中个别结合位点的特异性保持的确认就得到极大简化。

显而易见的是，如果两个亲本抗体在组合为DVD结合蛋白之前就对于特异性进行选择，则测定DVD结合蛋白特异性的复杂工作就得到极大简化。

抗原-抗体相互作用研究可采取许多形式，包括许多经典的蛋白蛋白相互作用研究，包括ELISA(酶联免疫吸附测定)、质谱分析法、化学交联、具有光散射的SEC、平衡透析、凝胶渗透、超滤、凝胶层析、大区分析型SEC、微量制备型超速离心(沉降平衡)、分光镜方法、滴定微量热、(在分析型超速离心机中)沉降平衡、(在分析型离心机中)沉降速度、表面等离子共振(包括BIAcore)。相关参考文献包括“Current Protocols in ProteinScience,”John E.Coligan,Ben M.Dunn,David W.Speicher,Paul T,Wingfield(编辑)，第3卷，第19和20章，John Wiley&Sons Inc.出版，及其中包括的参考文献，以及“Current Protocols in Immunology,”John E.Coligan,BarbaraE.Bierer,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober(编辑)，JohnWiley&Sons Inc出版，及其中包括的相关参考文献。

在全血中的细胞因子释放：可通过细胞因子释放测定研究mAb与人血细胞的相互作用(Wing,M.G.,Therapeutic Immunology(1995),2(4):183-190；“Current Protocols in Pharmacology,”S.J.Enna,Michael Williams,John W.Ferkany,Terry Kenakin,Paul Moser(编辑)，John Wiley&Sons Inc出版；Madhusudan,S.,Clinical Cancer Research(2004),10(19):6528-6534；Cox,J.Methods(2006),38(4):274-282；Choi,I.,Eur.J.Immunol.,(2001),31(1):94-106)。简言之，将多种浓度的mAb与人全血温育24小时。测试的浓度应当包括广泛的范围，包括模拟患者典型血液水平的终浓度(包括但不限于100ng/ml–100μg/ml)。温育后，对上清液和细胞裂解物分析IL-1Rα、TNF-α、IL-1b、IL-6和IL-8的存在。将对mAb生成的细胞因子浓度概况与阴性人IgG对照和阳性LPS或PHA对照产生的概况进行比较。mAb从细胞上清液和细胞裂解物展示的细胞因子概况与使用对照人IgG的那种比较。在一个实施例中，单克隆抗体不和人血细胞相互作用以自发释放炎性细胞因子。

对DVD结合蛋白的细胞因子释放研究是复杂的，这是由于四个或更多个结合位点，每个抗原各两个。简言之，如本文所述的细胞因子释放研究测量完整DVD结合蛋白对全血或其他细胞系统的作用，但是不能分析是该分子的哪一部分引起细胞因子释放。一旦细胞因子释放已得到检测，就必须测定DVD结合蛋白质制剂的纯度，这是因为一些共纯化细胞组分可独立地引起细胞因子释放。如果纯度不是问题，则可能需要采用DVD结合蛋白片段化(包括但不限于去除Fc部分、分离结合位点等)、结合位点诱变或其他方法来解读(deconvolute)任何观察。显而易见的是，如果在组合为DVD结合蛋白之前对于缺乏细胞因子释放选择两个亲本抗体，则这种复杂工作就得到极大简化。

III.B.13.与用于毒理学研究的其他物种的交叉反应性

在一个实施例中，选择对合适的tox物种(例如食蟹猴)有足够交叉反应性的个别抗体。亲本抗体需要结合直向同源物种靶标(即食蟹猴)并引发适当的反应(调节、中和、活化)。在一个实施例中，对直向同源物种靶标的交叉反应性(亲和力/效力)应当在人靶标的10倍之内。在实践中，对多个物种包括小鼠、大鼠、狗、猴(和其他非人灵长类动物)以及疾病模型物种(即用于哮喘模型的羊)评估亲本抗体。亲本单克隆抗体对tox物种的可接收的交叉反应性允许在相同物种中的进一步DVD结合蛋白毒理学研究。出于该原因，两个亲本单克隆抗体应当对共同的tox物种具有可接收的交叉反应性，从而允许在相同物种中的DVD结合蛋白毒理学研究。

亲本mAb可选自能够结合特定靶标且本领域众所周知的多种mAb。这些包括但不限于，抗硬化蛋白，抗SOST，抗TNF抗体(美国专利号6,258,562)，抗IL-12和/或抗IL-12p40抗体(美国专利号6,914,128)；抗IL-18抗体(美国专利申请公开号2005/0147610A1)，抗C5，抗CBL，抗CD147，抗gp120，抗VLA-4，抗CD11a，抗CD18，抗VEGF，抗CD40L，抗CD-40(例如，参见WO2007124299)、抗Id，抗ICAM-1，抗CXCL13，抗CD2，抗EGFR，抗TGF-β2，抗HGF，抗cMet，抗DLL-4，抗NPR1，抗PLGF，抗ErbB3，抗E-选择蛋白，抗Fact VII，抗Her2/neu，抗F gp，抗CD11/18，抗CD14，抗ICAM-3，抗RON，抗CD-19，抗CD80(例如，参见PCT公开号WO2003/039486)，抗CD4，抗CD3，抗CD23，抗β2-整联蛋白，抗α4β7，抗CD52，抗HLA DR，抗CD22(参见例如，美国专利号5,789,554)，抗CD20，抗MIF，抗CD64(FcR)，抗TCRαβ，抗CD2，抗Hep B，抗CA125，抗EpCAM，抗gp120，抗CMV，抗gpIIbIIIa，抗IgE，抗CD25，抗CD33，抗HLA，抗IGF1,2，抗IGFR，抗VNR整联蛋白，抗IL-1α、抗IL-1β，抗IL-1受体，抗IL-2受体，抗IL-4，抗IL-4受体，抗IL5，抗IL-5受体，抗IL-6，抗IL-6R，RANKL，NGF，DKK，αVβ3，抗IL-8，抗IL-9，抗IL-13，抗IL-13受体，和抗IL-23；IL-23p19；(参见Presta,“Selection,design,andengineering of therapeutic antibodies,”J.Allergy Clin.Immunol.,116:731-736(2005)和在环球网站hwww.path.cam.ac.uk/～mrc7/humanisation/antibodies.html)。

亲本mAb还可选自批准用于在临床试验或临床用途开发中使用的多种治疗性抗体。此类治疗性抗体包括但不限于，利妥昔单抗(IDEC/Genentech/Roche)(参见例如美国专利号5,736,137)，批准治疗非霍奇金氏淋巴瘤的嵌合抗CD20抗体；HuMax-CD20，目前由Genmab开发中的抗CD20，在美国专利号5,500,362中描述的抗C20抗体，AME-133(AppliedMolecular Evolution)，hA20(Immunomedics，Inc.)，HumaLYM(Intracel)，和PRO70769(PCT/US2003/040426，名称为“Immunoglobulin Variants and UsesThereof”)，曲妥珠单抗(Genentech)(参见例如美国专利号5,677,171)，批准治疗乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗体；帕妥珠单抗(rhuMab-2C4，)，目前由Genentech开发中；在美国专利号4,753,894中描述的抗Her2抗体；西妥昔单抗(Imclone)(美国专利号4,943,533；PCT WO96/40210)，在用于多种癌症的临床试验中的嵌合抗EGFR抗体；ABX-EGF(美国专利号6,235,883)，目前由Abgenix-Immunex-Amgen开发中；HuMax-EGFr(美国系列号10/172,317)，目前由Genmab开发中；425，EMD55900，EMD62000，和EMD72000(MerckKGaA)(美国专利号5,558,864；Murthy等人，1987，Arch Biochem Biophys.252(2)：549-60；Rodeck等人，1987，J Cell Biochem.35(4)：315-20；Kettleborough等人，1991，Protein Eng.4(7)：773-83)；ICR62(Institute ofCancer Research)(PCT WO95/20045；Modjtahedi等人，1993，J.Cell Biophys.1993，22(1-3)：129-46；Modjtahedi等人，1993，Br J Cancer.1993，67(2)：247-53；Modjtahedi等人，1996，Br J Cancer，73(2)：228-35；Modjtahedi等人，2003，Int J Cancer，105(2)：273-80)；TheraCIM hR3(YM Biosciences，Canada and Centro de Immunologia Molecular，Cuba(美国专利号5,891,996；美国专利号6,506,883；Mateo等人，1997，Immunotechnology，3(1)：71-81)；mAb-806(Ludwig Institute for Cancer Research，Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluth等人，2003，Proc Natl Acad Sci USA.100(2)：639-44)；KSB-102(KS Biomedix)；MR1-1(IVAX，National Cancer Institute)(PCT WO0162931A2)；和SC100(Scancell)(PCT WO01/88138)；阿来组单抗(Millenium)，目前批准用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病的人源化mAb；莫罗单抗-CD3(Orthoclone)，由Ortho Biotech/Johnson&Johnson开发的抗CD3抗体，替伊莫单抗由IDEC/Schering AG开发的抗CD20抗体，吉妥珠单抗奥佐米星由Celltech/Wyeth开发的抗CD33(p67蛋白质)抗体，阿法赛特由Biogen开发的抗LFA-3Fc融合物)，阿昔单抗由Centocor/Lilly开发，巴利昔单抗由Novartis开发，帕利珠单抗由Medimmune开发，英夫利昔单抗由Centocor开发的抗TNFα抗体，阿达木单抗由Abbott开发的抗TNFα抗体，由Celltech开发的抗TNFα抗体，戈利木单抗(CNTO-148)，由Centocor开发的完全人TNF抗体，依那西普由Immunex/Amgen开发的p75TNF受体Fc融合物，来那西普，早先由Roche开发的p55TNF受体Fc融合物，ABX-CBL，由Abgenix开发中的抗CD147抗体，ABX-IL8，由Abgenix开发中的抗IL8抗体，ABX-MA1，由Abgenix开发中的抗MUC18抗体，Pemtumomab(R1549，90Y-muHMFG1)，由Antisoma开发的抗MUC1，Therex(R1550)，由Antisoma开发中的抗MUC1抗体，AngioMab(AS1405)，由Antisoma开发中，HuBC-1，由Antisoma开发中，由Antisoma开发中的Thioplatin(AS1407)，(那他珠单抗)，由Biogen开发中的抗α-4-β-1(VLA-4)和α-4-β-7抗体，VLA-1mAb，由Biogen开发中的抗VLA-1整联蛋白抗体，LTBR mAb，由Biogen开发中的抗淋巴毒素β受体(LTBR)抗体，CAT-152，由Cambridge AntibodyTechnology开发中的抗TGF-β2抗体，ABT874(J695)，由Abbott开发中的抗IL-12p40抗体，CAT-192，由Cambridge Antibody Technology和Genzyme开发中的抗TGFβ1抗体，CAT-213，由Cambridge Antibody Technology开发中的抗嗜酸性粒细胞趋化因子1抗体，由Cambridge AntibodyTechnology和Human Genome Sciences，Inc.开发中的抗Blys抗体，TRAIL-R1mAb，由Cambridge Antibody Technology和Human GenomeSciences，Inc.开发中的抗TRAIL-R1抗体，贝伐单抗，rhuMAb-VEGF)，由Genentech开发中的抗VEGF抗体，由Genentech开发中的抗HER受体家族抗体，抗组织因子(ATF)，由Genentech开发中的抗组织因子抗体，(奥马佐单抗)，由Genentech开发中的抗IgE抗体，(依法利珠单抗)，由Genentech和Xoma开发中的抗CD11a抗体，MLN-02抗体(以前为LDP-02)，由Genentech和Millenium Pharmaceuticals开发中，HuMax CD4，由Genmab开发中的抗CD4抗体，HuMax-IL15，由Genmab和Amgen开发中的抗IL15抗体，HuMax-Inflam，由Genmab和Medarex开发中，HuMax-Cancer，由Genmab和Medarex和Oxford GcoSciences开发中的抗类肝素酶I抗体，HuMax-Lymphoma，由Genmab和Amgen开发中，HuMax-TAC，由Genmab开发中，IDEC-131，和由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗CD40L抗体，IDEC-151(克立昔单抗)，由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗CD4抗体，IDEC-114，由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗CD80抗体，IDEC-152，由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗CD23，由IDECPharmaceuticals开发中的抗巨噬细胞移动因子(MIF)抗体，BEC2，由Imclone开发中的抗独特型抗体，IMC-1C11，由Imclone开发中的抗KDR抗体，DC101，由Imclone开发中的抗flk-1抗体，由Imclone开发中的抗VE钙粘着蛋白抗体，(拉贝珠单抗)，由Immunomedics开发中的抗癌胚抗原(CEA)抗体，(依帕珠单抗)，由Immunomedics开发中的抗CD22抗体，AFP-Cide，由Immunomedics开发中，MyelomaCide，由Immunomedics开发中，LkoCide，由Immunomedics开发中，ProstaCide，由Immunomedics开发中，MDX-010，由Medarex开发中的抗CTLA4抗体，MDX-060，由Medarex开发中的抗CD30抗体，由Medarex开发中的MDX-070，由Medarex开发中的MDX-018，(IDM-1)，以及由Medarex和Immuno-Designed Molecules开发中的抗Her2抗体，由Medarex和Genmab开发中的抗CD4抗体，HuMax-IL15，由Medarex和Genmab开发中的抗IL15抗体，CNTO148，由Medarex和Centocor/Johnson&Johnson开发中的抗TNFα抗体，CNTO1275，由Centocor/Johnson&Johnson开发中的抗细胞因子抗体，MOR101和MOR102，由MorphoSys开发中的抗细胞间粘附分子1(ICAM-1)(CD54)抗体，MOR201，由MorphoSys开发中的抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)抗体，(维西珠单抗)，由Protein Design Labs开发中的抗CD3抗体，由Protein Design Labs开发中的抗γ干扰素抗体，抗α5β1整联蛋白，由Protein Design Labs开发中，抗IL-12，由Protein Design Labs开发中，ING-1，由Xoma开发中的抗Ep-CAM抗体，(奥马佐单抗)，由Genentech和Novartis开发的人源化抗IgE抗体，和MLN01，由Xoma开发中的抗β2整联蛋白抗体。在另一个实施例中，治疗剂包括KRN330(Kirin)；huA33抗体(A33，Ludwig Institute for Cancer Research)；CNTO95(αV整联蛋白，Centocor)；MEDI-522(αVβ3整联蛋白，Medimmune)；伏洛昔单抗(αVβ1整联蛋白，Biogen/PDL)；人mAb216(B细胞糖基化表位，NCI)；BiTE MT103(双特异性CD19x CD3，Medimmune)；4G7xH22(双特异性B细胞xFcγR1，Medarex/Merck KGa)；rM28(双特异性CD28x MAPG，美国专利号EP1444268)；MDX447(EMD82633)(双特异性CD64x EGFR，Medarex)；卡妥索单抗(removab)(双特异性EpCAM x抗CD3，Trion/Fres)；厄马索单抗(双特异性HER2/CD3，Fresenius Biotech)；奥戈伏单抗(OvaRex)(CA-125，ViRexx)；(WX G250)(碳酸酐酶IX，Wilex)；CNTO888(CCL2，Centocor)；TRC105(CD105(内皮糖蛋白)，Tracon)；BMS-663513(CD137激动剂，Brystol Myers Squibb)；MDX-1342(CD19，Medarex)；希普利珠单抗(Siplizumab)(MEDI-507)(CD2，Medimmune)；奥法木单抗(Humax-CD20)(CD20，Genmab)；利妥昔单抗(Rituxan)(CD20，Genentech)；维妥珠单抗(hA20)(CD20，Immunomedics)；依帕珠单抗(CD22，Amgen)；鲁昔单抗(IDEC152)(CD23，Biogen)；莫罗单抗-CD3(CD3，Ortho)；HuM291(CD3fc受体，PDL Biopharma)；HeFi-1，CD30，NCI)；MDX-060(CD30，Medarex)；MDX-1401(CD30，Medarex)；SGN-30(CD30，Seattle Genentics)；SGN-33(林妥珠单抗)(CD33，Seattle Genentics)；扎木单抗(HuMax-CD4)(CD4，Genmab)；HCD122(CD40，Novartis)；SGN-40(CD40，SeattleGenentics)；Campath1h(阿来组单抗)(CD52，Genzyme)；MDX-1411(CD70，Medarex)；hLL1(EPB-1)(CD74.38，Immunomedics)；加利昔单抗(IDEC-144)(CD80，Biogen)；MT293(TRC093/D93)(切割的胶原，Tracon)；HuLuc63(CS1，PDL Pharma)；伊匹单抗(MDX-010)(CTLA4，Brystol Myers Squibb)；替西木单抗(Ticilimumab，CP-675,2)(CTLA4，Pfizer)；HGS-ETR1(马帕木单抗)(DR4TRAIL-R1激动剂，Human Genome Science/Glaxo Smith Kline)；AMG-655(DR5，Amgen)；Apomab(DR5，Genentech)；CS-1008(DR5，DaiichiSankyo)；HGS-ETR2(来沙木单抗)(DR5TRAIL-R2激动剂，HGS)；西妥昔单抗(爱必妥)(EGFR，Imclone)；IMC-11F8(EGFR，Imclone)；尼妥珠单抗(EGFR，YM Bio)；帕尼单抗(Vectabix)(EGFR，Amgen)；扎鲁木单抗(HuMaxEGFr)(EGFR，Genmab)；CDX-110(EGFRvIII，AVANTImmunotherapeutics)；阿德木单抗(MT201)(Epcam，Merck)；依决洛单抗(Panorex，17-1A)(Epcam，Glaxo/Centocor)；MORAb-003(叶酸受体a，Morphotech)；KW-2871(神经节苷脂GD3，Kyowa)；MORAb-009(GP-9，Morphotech)；CDX-1307(MDX-1307)(hCGb，Celldex)；曲妥珠单抗(赫赛汀)(HER2，Celldex)；帕妥珠单抗(rhuMAb2C4)(HER2(DI)，Genentech)；阿泊珠单抗(HLA-DRβ链，PDL Pharma)；AMG-479(IGF-1R，Amgen)；抗IGF-1R R1507(IGF1-R，Roche)；CP751871(IGF1-R，Pfizer)；IMC-A12(IGF1-R，Imclone)；BIIB022(IGF-1R，Biogen)；Mik-β-1(IL-2Rb(CD122)，Hoffman LaRoche)；CNTO328(IL6，Centocor)；抗KIR(1-7F9)(杀伤细胞Ig样受体(KIR)，Novo)；Hu3S193(Lewis(y)，Wyeth，Ludwig Institute of CancerResearch)；hCBE-11(LTβR，Biogen)；HuHMFG1(MUC1，Antisoma/NCI)；RAV12(N-联碳水化合物表位，Raven)；CAL(甲状旁腺激素相关蛋白(PTH-rP)，University of California)；CT-011(PD1，CureTech)；MDX-1106(ono-4538)(PD1，Medarex/Ono)；MAb CT-011(PD1，Curetech)；IMC-3G3(PDGFRa，Imclone)；巴维昔单抗(磷脂酰丝氨酸，Peregrine)；huJ591(PSMA，Cornell Research Foundation)；muJ591(PSMA，Cornell Research Foundation)；GC1008(TGFb(泛)抑制剂(IgG4)，Genzyme)；英夫利昔单抗(类克)(TNFa，Centocor)；A27.15(运铁蛋白受体，Salk Institute，INSERN WO2005/111082)；E2.3(运铁蛋白受体，Salk Institute)；贝伐单抗(阿瓦斯丁)(VEGF，Genentech)；HuMV833(VEGF，Tsukuba Research Lab-WO/2000/034337，University ofTexas)；IMC-18F1(VEGFR1，Imclone)；IMC-1121(VEGFR2，Imclone)。

III.C.DVD结合蛋白的构建

多价多特异性双重可变结构域结合蛋白(DVD结合蛋白)被这样设计，使得来自2种不同亲本单克隆抗体的两个不同轻链可变结构域(VL)通过重组DNA技术直接或经由短接头串联连接，随后为轻链恒定结构域。类似地，重链包含串联连接的两个不同重链可变结构域(VH)，随后为恒定结构域CH1和Fc区。

可变结构域可使用重组DNA技术从亲本抗体获得，所述亲本抗体通过本文所述方法中的任一种生成。在一个实施例中，可变结构域是鼠重或轻链可变结构域。在另一个实施例中，可变结构域是CDR移植的或人源化的可变重或轻链结构域。在一个实施例中，可变结构域是人重或轻链可变结构域。

在一个实施例中，第一和第二可变结构域使用重组DNA技术直接互相连接。在另一个实施例中，可变结构域经由接头序列进行连接。在一个实施例中，连接两个可变结构域。三个或更多个可变结构域也可直接或经由接头序列进行连接。可变结构域可结合相同抗原或可结合不同抗原。提供了DVD结合蛋白，其可包括一个免疫球蛋白可变结构域和一个非免疫球蛋白可变结构域，例如受体的配体结合结构域或酶活性结构域。DVD结合蛋白也可包含两个或更多个非Ig结构域。

接头序列可以是单个氨基酸或多肽序列。在一个实施例中，接头序列是GGGGSG(SEQ ID NO:1695)、GGSGG(SEQ ID NO:1696)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1697)、GGSGGGGSGS(SEQ ID NO:1698)、GGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1699)、GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:1700)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1701)、ASTKGP(SEQ ID NO:1702)、ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:1703)、TVAAP(SEQ ID NO:1704)、TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:1705)、AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ IDNO:1706)、AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:1707)、AKTTPKLGG(SEQID NO:1710)、SAKTTPKLGG(SEQ ID NO:1709)、SAKTTP(SEQ IDNO:1702)、RADAAP(SEQ ID NO:1711)、RADAAPTVS(SEQ ID NO:1712)、RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO:1713)、RADAAAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1714)、SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:1715)、ADAAP(SEQ ID NO:1716)、ADAAPTVSIFP P(SEQ ID NO:2050)、QPKAAP(SEQ ID NO:2051)、QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO:2052)、AKTTPP(SEQ ID NO:2053)、AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO:2054)、AKTTAP(SEQ ID NO:2055)、AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO:2056)、GENKVEYAPALMALS(SEQ IDNO:2057)、GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO:2058)和GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO:2059)。接头序列的选择基于几种Fab分子的晶体结构分析。在Fab或抗体分子结构中的可变结构域和CH1/CL恒定结构域之间存在天然柔性键合。这种天然键合包含约10-12个氨基酸残基，由来自V结构域的C末端的4-6个残基和来自CL/CH1结构域的N末端的4-6个残基促成。本文描述的DVD结合蛋白可使用CL或CH1的N末端5-6个氨基酸残基，或11-12个氨基酸残基分别作为DVD结合蛋白轻链和重链中的接头来生成。CL或CH1结构域的N末端残基，特别是前5-6个氨基酸残基，采取环构象而无强二级结构，并且因此可充当2个可变结构域之间的柔性接头。CL或CH1结构域的N末端残基是可变结构域的天然延伸，因为它们是Ig序列的部分，并且因此使可能由接头和接点引起的任何免疫原性大程度地降到最低。

其他接头序列可包括任何长度的CL/CH1结构域的任何序列，但不是CL/CH1结构域的所有残基；例如CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基；轻链接头可来自Cκ或Cλ；且重链接头可源自任何同种型的CH1，包括Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。接头序列还可源自其他蛋白例如Ig样蛋白，(例如，TCR、FcR、KIR)；基于G/S的序列；铰链区衍生的序列；和来自其他蛋白的其他天然序列。

在一个实施例中，使用重组DNA技术使恒定结构域与2个连接的可变结构域连接。在一个实施例中，包含串联连接的重链可变结构域的序列与重链恒定结构域连接，且包含串联连接的轻链可变结构域的序列与轻链恒定结构域连接。在一个实施例中，恒定结构域分别是人重链恒定结构域和人轻链恒定结构域。在一个实施例中，DVD重链还与Fc区连接。Fc区可以是天然序列Fc区，或变体Fc区。在另一个实施例中，Fc区是人Fc区。在另一个实施例中，Fc区包括来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、或IgD的Fc区。

在最优选的实施例中，将两条重链DVD多肽和两条轻链DVD多肽组合，以形成DVD结合蛋白。能够结合特定靶抗原例如SOST的特异性DVD结合蛋白的详细描述及其制备方法，在下文实例部分中提供。

III.D.DVD结合蛋白的产生

提供了可通过本领域已知的许多技术中的任一种来生产的DVD结合蛋白，所述技术包括例如来自宿主细胞的表达，其中编码DVD结合蛋白重链和DVD结合蛋白轻链的一种或多种表达载体通过标准技术转染到宿主细胞内。术语“转染”的多种形式预期包含通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。尽管可能在原核或真核宿主细胞中表达提供的DVD结合蛋白，但在真核细胞中表达DVD结合蛋白，所述真核细胞例如哺乳动物宿主细胞，因为此类真核细胞(且特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠和有免疫学活性的DVD结合蛋白。

用于表达提供的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216-4220中描述，与DHFR选择标记一起使用的dhfr-CHO细胞，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.，159：601-621中描述的)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、SP2和PER.C6细胞。当编码DVD结合蛋白的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞内时，DVD结合蛋白通过将宿主细胞培养足够时间段来生产，以允许DVD结合蛋白在宿主细胞中表达，或DVD蛋白分泌到其中宿主细胞生长的培养基内。DVD结合蛋白可使用标准蛋白纯化法从培养基中回收。

在用于重组表达提供的DVD结合蛋白的示例性系统中，编码DVD结合蛋白重链和DVD结合蛋白轻链的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染引入dhfr-CHO细胞内。在重组表达载体内，DVD结合蛋白重和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，所述DHFR基因允许使用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许表达DVD结合蛋白重和轻链，且从培养基中回收完整的DVD结合蛋白。使用标准分子生物学技术以制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养基中回收DVD结合蛋白。再进一步地，提供了合成DVD结合蛋白的方法，其通过在合适的培养基中培养宿主细胞直至合成DVD结合蛋白。该方法还可包括从培养基中分离DVD结合蛋白。

DVD结合蛋白的重要特征是它可以与常规抗体相似的方式生产和纯化。DVD结合蛋白的生产导致具有所需双重特异性活性的均质、单一的主要产物，而无恒定区的任何序列修饰或任何种类的化学修饰。生成“双特异性”、“多特异性”和“多特异性多价”全长结合蛋白的其他先前描述的方法不导致单一的主要产物，而是导致装配的无活性、单特异性、多特异性、多价、全长结合蛋白和具有不同结合位点组合的多价全长结合蛋白的混合物的细胞内或分泌的生产。例如，基于由Miller和Presta(PCT公开号WO2001/077342(A1)描述的设计，存在重和轻链的16种可能组合。因此只有6.25％的蛋白可能处于所需活性形式，而非与其他15个可能组合相比作为单一主要产物或单一原始产物。使用标准层析技术使所需完全活性形式的蛋白与无活性和部分活性形式的蛋白分离仍有待证实，所述标准层析技术一般在大规模制备中使用。

令人惊讶的是，提供的“双重特异性多价全长结合蛋白”的设计导致双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链，所述轻链和重链主要装配成所需“双重特异性多价全长结合蛋白”。

至少50％、至少75％且至少90％的装配且表达的DVD结合蛋白是所需双重特异性四价蛋白。这个方面特别增强了提供的本发明的商业效用。因此，提供了在单个细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链的方法，导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的单一主要产物。

提供了在单个细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链的方法，导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的“主要产物”，其中“主要产物”超过所有装配的蛋白的50％，包含双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链。

提供了在单个细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链的方法，导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的单一“主要产物”，其中“主要产物”超过所有装配的蛋白的75％，包含双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链。

提供了在单个细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链的方法，导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的单一“主要产物”，其中“主要产物”超过所有装配的蛋白的90％，包含双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链。

IV.硬化蛋白结合蛋白和结合蛋白生产性细胞系的产生

在提供的实施例中，硬化蛋白结合蛋白包括抗硬化蛋白抗体显示出减少或中和SOST活性的高能力，例如如通过本领域已知的几种体外和体内测定中的任一种评价的。优选地，硬化蛋白结合蛋白还显示出减少或中和SOST活性的高能力。

在实施例中，结合蛋白或其抗原结合部分结合人硬化蛋白，其中如通过表面等离子共振测量的，所述结合蛋白或其抗原结合部分以约0.1s^-1或更少的k_off速率常数与人SOST解离，或以约1x10^-6M或更少的IC₅₀抑制人SOST活性。作为另外一种选择，如通过表面等离子共振测量的，结合蛋白或其抗原结合部分可以约1x10^-2s^-1或更少的k_off速率常数与人硬化蛋白解离，或可以约1x10^-7M或更少的IC₅₀抑制人硬化蛋白活性。作为另外一种选择，如通过表面等离子共振测量的，结合蛋白或其抗原结合部分可以约1x10^-3s^-1或更少的k_off速率常数与人硬化蛋白解离，或可以约1x10^-8M或更少的IC₅₀抑制人硬化蛋白。作为另外一种选择，如通过表面等离子共振测量的，结合蛋白或其抗原结合部分可以约1x10^-4s^-1或更少的k_off速率常数与人硬化蛋白解离，或可以约1x10^-9M或更少的IC₅₀抑制人硬化蛋白活性。作为另外一种选择，如通过表面等离子共振测量的，结合蛋白或其抗原结合部分可以约1x10^-5s^-1或更少的k_off速率常数与人硬化蛋白解离，或可以约1x10^-10M或更少的IC₅₀抑制人硬化蛋白活性。作为另外一种选择，如通过表面等离子共振测量的，结合蛋白或其抗原结合部分可以约1x10^-5s^-1或更少的k_off速率常数与人硬化蛋白解离，或可以约1x10^-11M或更少的IC₅₀抑制人硬化蛋白活性。

在某些实施例中，结合蛋白包括重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。在一个实施例中，重链恒定区是IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体可包括轻链恒定区，为κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。在一个实施例中，抗体包括κ轻链恒定区。作为另外一种选择，抗体部分可以是例如Fab片段或单链Fv片段。

Fc部分中改变抗体效应子功能的氨基酸残基替换是本领域已知的(Winter等人，美国专利号5,648,260和5624821)。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、依赖补体的细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。取决于治疗目的，在一些情况下这些效应子功能对于治疗性抗体是所需的，但在其他情况下可能是不必要的或甚至有害的。某些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3，经由分别与FcγRs和补体C1q结合介导ADCC和CDC。新生Fc受体(FcRn)是决定抗体循环半衰期的关键组分。在另外一个实施例中，至少一个氨基酸残基在抗体恒定区例如抗体Fc区中进行替换，使得抗体的效应子功能被改变。

一个实施例提供了标记的结合蛋白，其中抗体或抗体部分用另一种功能分子(例如，另一种肽或蛋白)衍生化或连接。例如，标记的结合蛋白可通过使抗体或抗体部分与一种或多种其他分子实体功能性连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)来衍生，所述其他分子实体例如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、可检测试剂、细胞毒性剂、药学试剂、和/或可介导抗体或抗体部分与另一种分子(例如链霉抗生物素蛋白核心区或聚组氨酸标签)结合的蛋白或肽。

提供了结合蛋白例如抗体或抗体部分可由之衍生化的有用的可检测试剂，包括荧光化合物。示例性荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。抗体也可用可检测酶衍生化，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶等。当抗体用可检测酶衍生化时，它通过添加酶用于生产可检测反应产物的另外的试剂进行检测。例如，当可检测试剂辣根过氧化物酶存在时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺导致可检测的有色反应产物。抗体也可用生物素衍生化，且通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的间接测量进行检测。

另一个实施例提供了结晶结合蛋白。在一个实施例中，提供了如本文公开的完整抗硬化蛋白抗体及其片段的晶体，以及包含此类晶体的制剂和组合物。在一个实施例中，结晶结合蛋白具有比结合蛋白的可溶性配对物更长的体内半衰期。在另一个实施例中，结合蛋白在结晶化后保留生物活性。

提供了结晶结合蛋白，并且所述结晶结合蛋白可根据本领域已知的和如PCT公开号WO02072636中公开的方法来生产。

另一个实施例提供了糖基化的结合蛋白，其中抗体或其抗原结合部分包含一个或多个碳水化合物残基。新生体内蛋白生产可经历称为翻译后修饰的进一步加工。特别地，糖(糖基)残基可酶促添加，这个过程称为糖基化。所得到的具有共价连接的寡糖侧链的蛋白被称为糖基化蛋白或糖蛋白。

天然存在的抗体是在Fc结构域以及可变结构域中具有一个或多个碳水化合物残基的糖蛋白。Fc结构域中的碳水化合物残基对Fc结构域的效应子功能有重要作用，对抗体的抗原结合或半衰期有最低限度的作用(R.Jefferis，Biotechnol.Prog.，21：11-16(2005))。相比之下，可变结构域的糖基化可能对抗体的抗原结合活性有作用。可变结构域中的糖基化可能对抗体结合亲和力具有负面作用，可能是由于空间位阻(Co,M.S.等人，Mol.Immunol.,30:1361-1367(1993))，或导致对抗原的亲和力增加(Wallick,S.C.等人，Exp.Med.,168:1099-1109(1988)；Wright,A.等人，EMBO J.,10:2717-2723(1991))。

提供的一个方面涉及生成糖基化位点突变体，其中结合蛋白的O或N联糖基化位点已进行突变。本领域技术人员可使用标准的众所周知的技术来生成此类突变体。提供了保留生物活性但具有增加或减少的结合活性的糖基化位点突变体。

在另外一个提供的实施例中，抗体或抗原结合部分的糖基化得到修饰。例如，可制备无糖基化抗体(即该抗体缺乏糖基化)。糖基化可进行改变，以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可制备导致一个或多个可变区糖基化位点消除的一个或多个氨基酸置换，由此消除那个位点上的糖基化。此类无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。此类方法在PCT公开WO2003/016466A2以及美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述。

此外或可替代地，提供了经修饰的结合蛋白，并且所述结合蛋白可制备为具有改变的糖基化类型，例如具有减少量的岩藻糖基残基的岩藻糖基化不足抗体(参见Kanda，Yutaka等人，Journal of Biotechnology(2007)，130(3)，300-310.)，或具有增加的等分GlcNAc结构的抗体。此类改变的糖基化模式已显示增加抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。提供了具有改变的糖基化机制的细胞，并且所述细胞已在本领域中得到描述，且可用作在其中表达重组抗体的宿主细胞，由此生产具有改变的糖基化的抗体。参见例如，Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740；Umana等人，“Engineeredglycoforms of an antineuroblastoma IgG1with optimized antibody-dependentcellular cytotoxic activity,”Nat.Biotech.,17:176-180(1999)，以及欧洲专利号：EP1,176,195；PCT公开号WO03/035835和WO99/54342。

蛋白质糖基化取决于目的蛋白的氨基酸序列，以及在其中表达蛋白的宿主细胞。不同生物可产生不同的糖基化酶(例如，糖基转移酶和糖苷酶)，且具有不同的可用底物(核苷酸糖)。由于此类因素，蛋白质糖基化模式和糖基残基组成可依赖于在其中表达特定蛋白的宿主系统而不同。提供了有用的糖基残基，并且所述糖基残基可包括但不限于，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰葡糖胺和唾液酸。在一个实施例中，糖基化的结合蛋白包含糖基残基，使得糖基化模式是人的。

本领域技术人员已知不同的蛋白质糖基化可导致不同的蛋白质特征。例如，与哺乳动物细胞例如CHO细胞系中表达的相同蛋白质的那种相比较，在微生物宿主例如酵母中生产，和利用酵母内源性途径糖基化的治疗性蛋白质的功效可能是减少的。此类糖蛋白在人中也可以是免疫原性的，且在施用后显示减少的体内半衰期。人和其他动物中的特定受体可识别特定糖基残基且促进蛋白从血流中快速清除。其他不利效应可包括蛋白折叠、可溶性、对蛋白酶的易感性、运输、转运、区室化、分泌、由其他蛋白或因子识别、抗原性、或变应原性的变化。因此，从业者可能更喜欢具有特定糖基化组成和模式的治疗性蛋白质，例如等同于或至少类似于在人细胞或预期受试动物的物种特异性细胞中生产的那种的糖基化组成和模式。

表达不同于宿主细胞那种的糖基化蛋白可通过遗传修饰宿主细胞以表达异源糖基化酶来完成。使用本领域已知的技术，从业者可生成显示人蛋白质糖基化的抗体或其抗原结合部分。例如，酵母菌株已进行遗传修饰以表达非天然存在的糖基化酶，使得在这些酵母菌株中生产的糖基化蛋白(糖蛋白)显示等同于动物细胞特别是人细胞那种的蛋白质糖基化(美国专利申请公开号20040018590和20020137134)。

除结合蛋白之外，提供了对此类结合蛋白特异的抗独特型(抗Id)抗体。抗Id抗体是识别独特决定簇的抗体，所述独特决定簇一般与另一种抗体的抗原结合区相关。抗Id可通过用结合蛋白或其含CDR区免疫接种动物来制备。免疫接种的动物将识别，且对免疫接种抗体的独特型决定簇应答且产生抗Id抗体。显而易见的是，可能更容易对整合到DVD结合蛋白分子中的两种或更多种亲本抗体生成抗独特型抗体；而且通过本领域公认的方法(例如BIAcore、ELISA)确认结合研究，以验证对每种亲本抗体的独特型特异的抗独特型抗体也识别DVD结合蛋白背景中的独特型(例如抗原结合位点)。对DVD结合蛋白的两个或更多个抗原结合位点中的每一个特异的抗独特型抗体为测量患者血清中人DVD结合蛋白的DVD结合蛋白浓度提供了理想试剂。例如可使用“夹心测定ELISA形式”确立DVD结合蛋白浓度测定，其中，针对第一抗原结合区域的抗体包被于固相(例如BIAcore芯片、ELISA板等)上，以漂洗缓冲液漂洗，与血清样品温育，另一个漂洗步骤以及最后与针对另一个抗原结合位点的另一个抗独特型抗体温育，其自身被酶标记以用于定量结合反应。在一个实施例中，对于具有多于两个不同的结合位点的DVD结合蛋白，针对两个最外部结合位点(距恒定区最远和最近)的抗独特型抗体将不仅有助于确定人血清中的DVD结合蛋白浓度，而且也证明体内分子的完整性。每个抗Id抗体也可用作“免疫原”以在另外一种动物中诱导免疫应答，从而产生所谓的抗抗Id抗体。

此外，本领域技术人员将认识到，目的蛋白可使用宿主细胞文库来表达，所述宿主细胞文库进行基因工程改造以表达多种糖基化酶，使得文库的成员宿主细胞生产具有变体糖基化模式的目的蛋白。从业者随后可选择并分离具有特定新糖基化模式的目的蛋白。在一个实施例中，具有特定选择的新糖基化模式的蛋白显示改善或改变的生物学性质。

V.硬化蛋白结合蛋白的用途

已知其与人硬化蛋白结合的能力，提供了硬化蛋白结合蛋白或其抗原结合部分，并可用于检测硬化蛋白(例如，在生物样品中，例如血清或血浆中)，使用常规免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。提供了用于检测生物样品中的硬化蛋白的方法，其包括使生物样品与提供的结合蛋白或抗原结合部分接触，且检测与硬化蛋白结合的结合蛋白(或抗原结合部分)或未结合的结合蛋白(或结合部分)，由此检测生物样品中的硬化蛋白。结合蛋白用可检测物质直接或间接标记，以促进结合或未结合的抗体的检测。合适的可检测物质包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括异鲁米诺；且合适放射性材料的例子包括³H_、 ¹⁴C_、 ³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho或¹⁵³Sm。

作为标记结合蛋白的替代方案，人硬化蛋白可通过竞争免疫测定在生物学流体中进行测定，其中利用由可检测物质标记的rhSOST标准和未标记的人硬化蛋白结合蛋白。在这种测定中，组合生物样品、标记的rhSOST标准和人硬化蛋白结合蛋白，并且测定与未标记的抗体结合的标记的重组人硬化蛋白标准的量。在生物样品中人硬化蛋白的量与和硬化蛋白结合蛋白结合的标记的rhSOST标准的量成反比。类似地，人硬化蛋白还可通过竞争免疫测定在生物学流体中进行测定，其中利用由可检测物质标记的rhSOST标准和未标记的人硬化蛋白结合蛋白。

在提供的实施例中，结合蛋白和硬化蛋白结合部分能够在体外和体内中和人硬化蛋白活性。因此，提供了此类结合蛋白及其硬化蛋白结合部分，并且可例如在包含hSOST的细胞培养物中、在人受试者中或在具有抗体与其交叉反应的硬化蛋白的其他哺乳动物受试者中用于抑制hSOST活性。一个实施例提供了用于抑制hSOST活性的方法，其包括使hSOST与硬化蛋白结合蛋白或其结合部分接触，使得hSOST活性被抑制。例如，在包含或怀疑包含hSOST的细胞培养物中，硬化蛋白结合蛋白或其结合部分可添加到培养基中，以抑制培养物中的hSOST活性。

另一个实施例提供了用于减少受试者中的hSOST活性的方法，有利地来自患有其中硬化蛋白活性是有害的疾病或障碍的受试者。提供了用于减少患有此类疾病或障碍的受试者中的硬化蛋白活性的方法，所述方法包括给受试者施用抗体或抗体部分，使得受试者中的硬化蛋白活性减少。在一个实施例中，硬化蛋白是人硬化蛋白，并且受试者是人受试者。作为另外一种选择，受试者可以是表达抗体能够与之结合的硬化蛋白的哺乳动物。再进一步地，受试者可以是硬化蛋白已引入其内的哺乳动物(例如通过施用硬化蛋白和/或通过表达SOST转基因)。硬化蛋白结合蛋白可施用于人受试者用于治疗目的。此外，结合蛋白可施用于表达抗体能够与之结合的硬化蛋白的非人哺乳动物，用于兽医学目的或作为人疾病的动物模型。关于后者，此类动物模型可用于评估抗体的治疗功效(例如测试施用剂量和时程)。

术语“其中硬化蛋白活性是有害的障碍”预期包括疾病和其他障碍，其中患有该障碍的受试者中硬化蛋白的存在已显示或怀疑负责障碍的病理生理学或是或怀疑是促进障碍恶化的因素。因此，其中硬化蛋白活性是有害的障碍是其中硬化蛋白活性减少预期减轻障碍症状和/或进展的障碍。此类障碍可例如由患有障碍的受试者生物学流体中硬化蛋白浓度的增加(例如受试者血清、血浆、滑液等中硬化蛋白浓度的增加)来证实，这可例如使用如上所述的抗硬化蛋白抗体进行检测。可用抗体治疗的障碍的非限制性例子包括下文关于抗体的药物组合物部分中讨论的那些障碍。

提供了能够结合单独的硬化蛋白(例如人硬化蛋白)或多种抗原(例如人硬化蛋白和另一种非硬化蛋白抗原)的DVD结合蛋白。因此，DVD结合蛋白可阻断或减少人硬化蛋白的活性和另一靶抗原的活性。此类其他靶抗原可包括可溶性靶标(例如TNF)和细胞表面受体靶标(例如VEGFR、EGFR)。

此类其他抗原包括但不限于，在可公开获得的数据库中列出的靶标，所述数据库包括在环球网上可获得的那些。这些靶标数据库包括下述列表：

治疗靶(hxin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp)；

细胞因子和细胞因子受体(hwww.cytokinewebfacts.com/,hwww.copewithcytokines.de/cope.cgi和

hcmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html)；

趋化因子(hcytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html)；

趋化因子受体和GPCR(hcsp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html,hwww.gpcr.org/7tm/)；

嗅感受器(hsenselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp)；

受体(hwww.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm)；

癌症靶(hcged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi)；

作为可能的抗体靶的分泌性蛋白质(hspd.cbi.pku.edu.cn/)；

蛋白质激酶(hspd.cbi.pku.edu.cn/)和

人CD标记(hcontent.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf)和(Zola H,2005CD molecules2005:human cell differentiationmolecules Blood,106:3123-6)。

DVD结合蛋白可用作治疗剂以同时阻断两种或更多种不同靶标即hSOST和一种或多种其他非SOST靶抗原，以增强功效/安全性和/或增加患者覆盖度。此类靶标可包括可溶性靶(TNF)和细胞表面受体靶(VEGFR和EGFR)。

另外，提供了DVD结合蛋白，其可用于组织特异性递送(靶向组织标记和疾病介质以用于增强局部PK，从而达到较高的功效和/或较低的毒性)，包括细胞内递送(靶向内在化受体和细胞内分子)，递送至脑内(靶向运铁蛋白受体和CNS疾病介质以用于穿过血脑屏障)。DVD结合蛋白也可充当载体蛋白，以经由与那种抗原的非中和表位结合将抗原递送至特定位置，并且也增加抗原的半衰期。此外，DVD结合蛋白可设计成与植入患者内的医学设备物理连接，或靶向这些医学设备(参见Burke,Sandra E.；Kuntz,RichardE.；Schwartz,Lewis B.,Zotarolimus eluting stents.Advanced Drug DeliveryReviews(2006),58(3),437-446；Surface coatings for biological activation andfunctionalization of medical devices,Hildebrand,H.F.；Blanchemain,N.；Mayer,G.；Chai,F.；Lefebvre,M.；Boschin,F.,Surface and Coatings Technology(2006),200(22-23),6318-6324；Wu等人，“Drug/device combinations for local drugtherapies and infection prophylaxis,”Biomaterials,27:2450-2467(2006)；Marques等人，“Mediation of the Cytokine Network in the Implantation ofOrthopedic Devices,”第21章，在Biodegradable Systems in Tissue Engineeringand Regenerative Medicine，(Reis等人，编辑)(CRC Press LLC，Boca Raton，2005)中，第377-397页。简言之，将合适的细胞类型导向医学植入物部位可促进愈合和恢复正常组织功能。作为另外一种选择，也提供了通过与设备偶联或靶向设备的DVD结合蛋白对设备植入后释放的介质(包括但不限于细胞因子)的抑制。例如，支架多年来已在介入性心脏病学中使用，以清除闭塞动脉且改善至心肌的血流。然而，常规裸金属支架已知在一些患者中引起再狭窄(治疗区域中动脉的再变窄)，且可导致血凝块。近来，抗CD34抗体包被的支架已得到描述，它通过捕获在血液中各处循环的内皮祖细胞(EPC)来减少再狭窄且阻止血凝块发生。内皮细胞是血管衬里的细胞，允许血液平稳流动。EPC与支架硬表面附着形成平滑层，所述平滑层不仅促进愈合而且还阻止再狭窄和血凝块，所述再狭窄和血凝块是以前与支架使用相关的并发症(Aoji等人2005J Am Coll Cardiol.45(10):1574-9)。除改善需要支架的患者的结果之外，还存在需要心血管旁路手术的患者的牵涉。例如，用抗EPC抗体包被的假体血管管道(人工动脉)将消除使用来自患者腿或臂的动脉用于旁路手术移植的需要。这将减少外科手术和麻醉时间，这本身又将减少冠状动脉外科手术死亡。DVD结合蛋白以这样的方式设计，使得它与细胞表面标记(例如CD34)以及蛋白(或任何种类的表位，包括但不限于蛋白、脂质和多糖)结合，其已包被在植入的设备上以促进细胞募集。一般而言此类方法也可应用于其他医学植入物。作为另外一种选择，DVD结合蛋白可包被在医学设备上，并且在植入且从设备中释放所有DVD时(或可能需要另外的新鲜DVD结合蛋白的任何其他需要，包括已装载的DVD结合蛋白的老化和变性)，设备可通过给患者全身施用新鲜DVD结合蛋白进行再装载，其中DVD结合蛋白被设计成用一组结合位点与目的靶标(细胞因子、细胞表面标记(例如CD34)等)结合，且用另一组与包被在设备上的靶标(包括蛋白，任何种类的表位，包括但不限于脂质、多糖和聚合物)结合。这种技术具有扩展包被的植入物有用性的优点。

V.A.DVD结合蛋白在多种疾病中的用途

提供了可用作治疗分子以治疗多种疾病的DVD结合蛋白。此类DVD分子可结合与特定疾病有关的一种或多种靶标。多种疾病中的此类靶标的例子在下文描述。

VI.人自身免疫和炎症应答

在一个方面，提供了DVD结合蛋白，其能够结合人硬化蛋白和已牵涉普遍的自身免疫和炎症应答的一种或多种抗原，包括C5、CCL1(I-309)、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL13(mcp-4)、CCL15(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19、CCL2(mcp-1)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MIP-2)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(mcp-3)、CCL8(mcp-2)、CXCL1、CXCL10(IP-10)、CXCL11(I-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL2、CXCL3、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9、IL13、IL8、CCL13(mcp-4)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CR1、IL8RA、XCR1(CCXCR1)、IFNA2、IL10、IL13、IL17C、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL22、IL5、IL8、IL9、LTA、LTB、MIF、SCYE1(内皮单核细胞活化细胞因子)、SPP1、TNF、TNFSF5、IFNA2、IL10RA、IL10RB、IL13、IL13RA1、IL5RA、IL9、IL9R、ABCF1、BCL6、C3、C4A、CEBPB、CRP、ICEBERG、IL1R1、IL1RN、IL8RB、LTB4R、TOLLIP、FADD、IRAK1、IRAK2、MYD88、NCK2、TNFAIP3、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、CD28、CD3E、CD3G、CD3Z、CD69、CD80、CD86、CNR1、CTLA4、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、FCGR3A、GPR44、HAVCR2、OPRD1、P2RX7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、BLR1、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCR4、GPR2、SCYE1、SDF2、XCL1、XCL2、XCR1、AMH、AMHR2、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、C19orf10(IL27w)、CER1、CSF1、CSF2、CSF3、DKFZp451J0118、FGF2、GFI1、IFNA1、IFNB1、IFNG、IGF1、IL1A、IL1B、IL1R1、IL1R2、IL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL8、IL8RA、IL8RB、IL9、IL9R、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17R、IL18、IL18R1、IL19、IL20、KITLG、LEP、LTA、LTB、LTB4R、LTB4R2、LTBR、MIF、NPPB、PDGFB、TBX21、TDGF1、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、TNF、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF11A、TNFRSF21、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF11、VEGF、ZFPM2和RNF110(ZNF144)。

VI.A.哮喘

变应性哮喘的特征在于存在嗜曙红细胞增多、杯形细胞组织转化、上皮细胞改变、气道高反应性(AHR)、和Th2和Th1细胞因子表达、以及血清IgE水平升高。目前已普遍接受气道炎症是成为哮喘发病机制基础的关键因素，涉及炎症细胞及其分泌的介质包括细胞因子和趋化因子的复杂相互影响，所述炎症细胞例如T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞。皮质类固醇是目前用于哮喘的最重要抗炎治疗，然而，它们的作用机制是非特异性的，且存在安全性关系，尤其是在幼年型患者群体中。因此证明开发更特异性和靶向的治疗是有正当理由的。

其中炎症和AHR两者可被评价的动物模型例如OVA-诱导的哮喘小鼠模型，是本领域已知的且可用于测定多种DVD结合蛋白治疗哮喘的能力。用于研究哮喘的动物模型在下述参考文献中公开：Coffman等人，Journal ofExperimental Medicine(2005),201(12),1875-1879；Lloyd等人，Advances inImmunology(2001),77,263-295；Boyce等人，Journal of Experimental Medicine(2005),201(12),1869-1873；和Snibson等人，Journal of the British Society forAllergy and Clinical Immunology(2005),35(2),146-52。除这些靶标对的常规安全性评价之外，关于免疫抑制程度的特异性测试在最佳靶标对的选择中可以是有正当理由的和有帮助的(参见，Luster等人，Toxicology(1994),92(1-3),229-43；Descotes等人，Developments in biological standardization(1992),7799-102；Hart等人，Journal of Allergy and Clinical Immunology(2001),108(2),250-257)。

一个方面提供了能够结合SOST和选自下述的一种或多种例如两种靶标的DVD结合蛋白：IL-4、IL-5、IL-8、IL-9、IL-13、IL-18、IL-5R(α)、TNFSF4、IL-4R(α)、干扰素α、嗜伊红粒细胞趋化蛋白、TSLP、PAR-2、PGD2或IgE。一个实施例包括双重特异性抗硬化蛋白/TNFαDVD结合蛋白作为对于哮喘治疗有利的治疗剂。

VI.B.类风湿性关节炎(RA)

全身性疾病类风湿性关节炎(RA)的特征在于关节滑膜中的慢性炎症反应，且伴随软骨变性和近关节骨侵蚀。包括TNF、趋化因子和生长因子的许多促炎细胞因子在患病关节中表达。给RA小鼠模型全身施用抗TNF抗体或sTNFR融合蛋白显示是抗炎和关节保护的。多种细胞因子包括硬化蛋白已牵涉于RA。其中用静脉内施用的英夫利昔单抗(嵌合型抗TNF mAb)(Harriman G,Harper LK,Schaible TF.1999Summary of clinical trials inrheumatoid arthritis using infliximab,an anti-TNFalpha treatment.Ann.Rheum.Dis.,58Suppl1:I61-4)阻断RA患者的TNF活性的临床研究，已提供了下述证据：TNF调节IL-6、IL-8、MCP-1和VEGF生产，免疫和炎症细胞募集到关节内，血管发生，和基质金属蛋白酶1和3的血液水平减少。类风湿性关节炎中炎症途径的更佳理解已导致与类风湿性关节炎有关的其他治疗靶标的鉴定。有希望的治疗例如白细胞介素-6拮抗剂(IL-6受体抗体MRA，由Chugai，Roche开发(参见Nishimoto,Norihiro等人，Arthritis&Rheumatism,(2004),50(6):1761-1769)、CTLA4Ig(阿巴西普，Genovese等人(2005)“Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alphainhibition,”N.Engl.J.Med.,353:1114-23.)、以及抗B细胞治疗(利妥昔单抗，Okamoto H，Kamatani N.(2004)"Rituximab for rheumatoid arthritis,"N.Engl.J.Med.，351：1909)，在过去的一年中已在随机对照试验中进行测试。硬化蛋白和其他细胞因子例如IL-15和IL-18已使用RA动物模型鉴定为起作用(治疗性抗体HuMax-IL_15，AMG714参见Baslund,Bo等人，Arthritis&Rheumatism(2005),52(9):2686-2692)。组合抗TNF和另一种介质例如硬化蛋白的双重特异性抗体疗法在增强临床功效和/或患者覆盖度方面具有很大的潜能。例如，阻断TNF和VEGF两者可潜在地根除炎症和血管发生，所述炎症和血管发生都与RA的病理生理学有关。也预期了能够阻断TNF-α和硬化蛋白的DVD结合蛋白。除这些靶标对的常规安全性评价之外，关于免疫抑制程度的特异性测试在最佳靶标对的选择中可以是有正当理由的和有帮助的(参见Luster等人，Toxicology(1994),92(1-3),229-43；Descotes等人，Developments in biological standardization(1992),7799-102；Hart等人，Journal of Allergy and Clinical Immunology(2001),108(2),250-257)。DVD结合蛋白是否将用于治疗类风湿性关节炎可使用临床前动物RA模型例如胶原诱导的关节炎小鼠模型进行评价。其他有用的模型也是本领域众所周知的(参见Brand DD.，Comp Med.,(2005)55(2)：114-22)。基于亲本抗体对人和小鼠直向同源物的交叉反应性(例如，对人和小鼠TNF、人和小鼠IL-15等的反应性)，可用“匹配的替代抗体”衍生的DVD结合蛋白进行在小鼠CIA模型中的验证研究；简言之，可在可能的程度上，将基于两个(或更多个)小鼠靶标特异性抗体的DVD结合蛋白与用于人DVD结合蛋白构建的亲本人或人源化抗体的特征进行匹配(相似的亲和力、相似的中和效力、相似的半衰期等)。

一个实施例提供了结合人硬化蛋白和另一种非硬化蛋白靶标的DVD结合蛋白，其也可用于治疗SOST在其中起作用的其他疾病。此类疾病包括但不限于SLE、多发性硬化(MS)、脓毒症、多种神经疾病和癌症(包括子宫颈、乳腺、胃)。下文还提供了硬化蛋白在其中起作用的疾病和障碍的更广泛列表。

一个实施例提供能够结合huSOST和下述的一种或多种靶标的DVD结合蛋白：TNFα、IL-12、TWEAK、IL-23、CXCL13、CD40、CD40L、IL-18、VEGF、VLA-4、TNFβ、CD45RB、CD200、IFN-γ、GM-CSF、FGF、C5、CD52、硬化蛋白或CCR2。

VI.C.SLE(狼疮)

SLE的免疫病理学标志是多克隆B细胞活化，这导致血球蛋白过多症、自身抗体产生和免疫复合物形成。基本异常似乎是由于广泛性T细胞调节异常导致的T细胞不能抑制禁忌B细胞克隆。此外，B和T细胞的相互作用通过几种细胞因子例如IL-10以及共刺激分子例如CD40和CD40L、B7和CD28和CTLA-4得到促进，所述细胞因子和共刺激分子起始第二信号。这些相互作用连同免疫复合物和细胞凋亡材料的受损吞噬清除，使免疫应答与所产生的组织损害永存。

一个方面提供了DVD结合蛋白，其能够结合人硬化蛋白和已牵涉于SLE的一种或多种下述抗原：B细胞靶向的治疗：CD-20、CD-22、CD-19、CD28、CD4、CD80、HLA-DRA、IL10、IL2、IL4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFSF5、TNFSF6、BLR1、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、ICOSL、IGBP1、MS4A1、RGS1、SLA2、CD81、IFNB1、IL10、TNFRSF5、TNFRSF7、TNFSF5、AICDA、BLNK、GALNAC4S-6ST、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、IL10、IL11、IL4、INHA、INHBA、KLF6、TNFRSF7、CD28、CD38、CD69、CD80、CD83、CD86、DPP4、FCER2、IL2RA、TNFRSF8、TNFSF7、CD24、CD37、CD40、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CR2、IL1R2、ITGA2、ITGA3、MS4A1、ST6GAL1、CD1C、CHST10、HLA-A、HLA-DRA、和NT5E.；共刺激信号：CTLA4或B7.1/B7.2；B细胞存活抑制：BlyS，BAFF；补体失活：C5；细胞因子调节：关键原理是任何组织中的净生物学应答是促炎或抗炎细胞因子局部水平之间平衡的结果(参见Sfikakis PP等人，2005Curr Opin Rheumatol17：550-7)。SLE被视为具有文件证明的血清IL-4、IL-6、IL-10升高的Th-2驱动的疾病。也预期了能够结合下述的DVD结合蛋白：IL-4、IL-6、IL-10、IFN-α或TNF-α。本文讨论的靶标组合将增强关于SLE的治疗功效，所述治疗功效可在许多狼疮临床前模型中进行测试(参见PengSL(2004)Methods Mol.Med.,102:227-72)。基于亲本抗体对人和小鼠直向同源物的交叉反应性(例如对人和小鼠CD20、人和小鼠干扰素α等的反应性)，可用“匹配的替代抗体”衍生的DVD结合蛋白进行在小鼠狼疮模型中的验证研究；简言之，可在可能的程度上，将基于两个(或更多个)小鼠靶标特异性抗体的DVD结合蛋白与用于人DVD结合蛋白构建的亲本人或人源化抗体的特征进行匹配(相似的亲和力、相似的中和效力、相似的半衰期等)。

VI.D.多发性硬化(MS)

多发性硬化(MS)是具有主要未知病因的复杂人自身免疫型疾病。遍及神经系统的髓鞘碱性蛋白(MBP)的免疫学破坏是多发性硬化的主要病理学。MS是具有复杂病理学的疾病，所述病理学涉及经由CD4+和CD8+T细胞的浸润和中枢神经系统内的应答。细胞因子、活性氮种类和共刺激分子在CNS中的表达都已在MS中得到描述。主要考虑是促成自身免疫发展的免疫学机制。特别地，抗原表达、细胞因子和白细胞相互作用、以及帮助平衡/调节其他T细胞例如Th1和Th2细胞的调节性T细胞，是关于治疗靶标鉴定的重要范围。

IL-12是由APC生产且促进Th1效应细胞分化的促炎细胞因子。IL-12在患有MS的患者的发展中的疾灶中以及受EAE影响的动物中产生。先前显示干扰IL-12途径有效阻止啮齿类动物中的EAE，且使用抗IL-12mAb体内中和IL-12p40在普通狨猴中在髓鞘诱导的EAE模型中具有有利作用。

TWEAK是TNF家族成员，在中枢神经系统(CNS)中组成型表达，取决于细胞类型具有促炎、增殖或细胞凋亡作用。它的受体Fn14由内皮细胞、反应性星形胶质细胞和神经元在CNS中表达。TWEAK和Fn14mRNA表达在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)期间在脊髓中增加。当小鼠在引发期后进行处理时，在C57BL/6小鼠中髓鞘少突胶质糖蛋白(MOG)诱导的EAE中的抗TWEAK抗体处理导致疾病严重性和白细胞浸润减少。

一个方面提供了能够结合SOST和下述的一种或多种例如两种靶标的DVD结合蛋白：包括IL-12、TWEAK、IL-23、CXCL13、CD40、CD40L、IL-18、VEGF、VLA-4、TNF、CD45RB、CD200、IFNγ、GM-CSF、FGF、C5、CD52、骨桥蛋白和/或CCR2。一个实施例包括双重特异性抗硬化蛋白/TNF-αDVD结合蛋白作为对MS治疗有利的治疗剂。

用于评价DVD结合蛋白分子治疗MS有用性的几种动物模型是本领域已知的(参见Steinman L等人，(2005)Trends Immunol.26(11):565-71；LublinFD.等人，(1985)Springer Semin Immunopathol.8(3):197-208；Genain CP等人，(1997)J Mol Med.75(3):187-97；Tuohy VK等人，(1999)J Exp Med.189(7):1033-42；Owens T等人，(1995)Neurol Clin.13(1):51-73；和't Hart等人，J.Immunol.,175(7):4761-4768(2005)。基于亲本抗体对人和动物物种直向同源物的交叉反应性(例如对人和小鼠SOST、人和小鼠TWEAK等的反应性)，可用“匹配的替代抗体”衍生的DVD结合蛋白分子进行在小鼠EAE模型中的验证研究；简言之，可在可能的程度上，将基于两个(或更多个)小鼠靶标特异性抗体的DVD结合蛋白与用于人DVD结合蛋白构建的亲本人或人源化抗体的特征进行匹配(相似的亲和力、相似的中和效力、相似的半衰期等)。将同样的概念应用于其他非啮齿类动物物种中的动物模型，其中将选择“匹配的替代抗体”衍生的DVD结合蛋白用于预期的药理学和可能的安全性研究。除这些靶标对的常规安全性评价之外，关于免疫抑制程度的特异性测试在最佳靶标对的选择中可以是有正当理由的和有帮助的(参见Luster等人，Toxicology(1994),92(1-3),229-43；Descotes等人，Developmentsin biological standardization(1992),7799-102；Jones R.2000Rovelizumab(ICOS Corp).IDrugs.3(4):442-6)。

VI.E.脓毒症

脓毒症的病理生理学由革兰氏阴性生物(脂多糖[LPS]、脂质A、内毒素)和革兰氏阳性生物(脂磷壁酸、肽聚糖)的外膜组分起始。这些外膜组分能够与单核细胞表面上的CD14受体结合。由于近期描述的toll样受体，信号随后传递给细胞，导致促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1(IL-1)的最终生产。压倒性的炎症和免疫应答是脓毒性休克的基本特征，且在由脓毒症诱导的组织损伤、多器官衰竭和死亡发病机理中起重要作用。细胞因子，尤其是肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素(IL-1)，已显示是脓毒性休克的关键介质。这些细胞因子对组织具有直接的毒性作用；它们还激活磷脂酶A2。这些及其他作用导致血小板活化因子浓度增加，促进氧化氮合酶活性，促进经由嗜中性粒细胞的组织浸润，和促进嗜中性粒细胞的活性。

脓毒症和脓毒性休克治疗仍是临床难题，且使用针对炎症应答的生物学反应调节剂(即抗TNF、抗MIF)的近期前瞻性试验仅显示适度的临床利益。近期，兴趣已转向针对逆转伴随的免疫抑制时间段的治疗。实验动物和危急患病患者中的研究已证实淋巴器官和一些实质组织细胞凋亡增加促成这种免疫抑制、无反应性、和器官系统功能障碍。在脓毒症综合征期间，淋巴细胞的细胞凋亡可由IL-2的不存在或由糖皮质激素、粒酶或所谓的‘死亡’细胞因子：肿瘤坏死因子α或Fas配体释放来触发。细胞凋亡经由胞质和/或线粒体胱天蛋白酶的自体活化而进展，所述自体活化可受Bcl-2家族的促和抗细胞凋亡成员的影响。在实验动物中，使用细胞凋亡抑制剂的处理不仅可阻止淋巴样细胞的细胞凋亡；它还改善结果。尽管在很大程度上由于与其施用和组织靶向相关的技术困难，使用抗细胞凋亡剂的临床试验仍然遥远，但淋巴细胞的细胞凋亡抑制代表关于脓毒性患者的吸引人的治疗靶标。同样地，靶向炎症介质和细胞凋亡介质两者的双重特异性试剂可能具有附加利益。一个方面提供了能够结合硬化蛋白和下述的与脓毒症有关的一种或多种靶标的DVD结合蛋白：TNF、IL-1、MIF、IL-6、IL-8、IL-18、IL-12、IL-23、FasL、LPS、Toll样受体、TLR-4、组织因子、MIP-2、ADORA2A、CASP1、CASP4、IL10、IL1B、NFKB1、PROC、TNFRSF1A、CSF3、CCR3、IL1RN、MIF、NFKB1、PTAFR、TLR2、TLR4、GPR44、HMOX1、HMG-B1、中期因子、IRAK1、NFKB2、SERPINA1、SERPINE1或TREM1。此类DVD结合蛋白对于脓毒症的功效可在本领域已知的临床前动物模型中进行评价(参见Buras JA等人，(2005)Nat.Rev.Drug Discov.,4(10):854-65和Calandra T等人，(2000)Nat.Med.,6(2):164-70)。

VI.F.神经障碍和神经变性疾病

神经变性疾病是慢性的，在所述情况下其通常是年龄依赖性的，或急性的(例如中风、外伤性脑损伤、脊髓损伤等)。它们的特征在于神经元功能的渐进性丧失(神经元细胞死亡、脱髓鞘)，活动度丧失和记忆丧失。成为慢性神经变性疾病(例如，阿尔茨海默氏病，AD)基础的机制的新出现的知识显示了复杂的病因学，且多种因素已被识别为促进其发展和进展，例如年龄，升糖(glycemic)状态，淀粉状蛋白生产和多聚化，与其受体RAGE(关于AGE的受体)结合的渐进性糖化终极产物(AGE)积聚，脑氧化应激增加，脑血流量减少，神经炎症包括炎症细胞因子和趋化因子释放，神经元功能障碍和小胶质细胞活化。因此这些慢性神经变性疾病代表多种细胞类型和介质之间的复杂相互作用。关于此类疾病的治疗策略是有限的，且主要构成用非特异性抗炎剂(例如皮质类固醇、COX抑制剂)或试剂阻断炎症性过程，以阻止神经元丧失和/或突触功能。这些治疗不能阻止疾病进展。近期研究暗示更加靶向的治疗，例如针对可溶性Aβ肽(包括Aβ寡聚体形式)的抗体，不仅可帮助阻止疾病进展而且还可帮助维持记忆。这些初步观察暗示靶向超过一种疾病介质(例如Aβ和促炎细胞因子例如TNF)的特异疗法，可提供比使用靶向单一疾病机制(例如单独的可溶性Aβ)观察到的甚至更好的对慢性神经变性疾病的治疗功效(参见C.E.Shepherd等人，NeurobiolAging.2005Oct24；Nelson RB.,Curr Pharm Des.2005；11:3335；William L.Klein.；Neurochem Int.2002；41:345；Janelsins等人，“Early correlation ofmicroglial activation with enhanced tumor necrosis factor-alpha and monocytechemoattractant protein-I expression specifically within the entorhinal cortex oftriple transgenic Alzheimer's disease mice,”Journal of Neuroinflammation,2(23):1-12(2005)；Soloman B.,Curr Alzheimer Res.2004；1:149；Igor Klyubin等人，Nat Med.2005；11:556-61；Arancio O等人，EMBO Journal(2004)1-10；Bornemann KD等人，Am J Pathol.2001；158:63；Deane R等人，Nat Med.2003；9:907-13；和Eliezer Masliah等人，Neuron.2005；46:857)。

DVD结合蛋白可结合硬化蛋白和与慢性神经变性疾病例如阿尔茨海默病有关的一种或多种靶标。此类靶标包括但不限于，牵涉于AD发病机理的任何介质，可溶性或细胞表面的，例如AGE(S100A，两性霉素)、促炎细胞因子(例如IL-1)、趋化因子(例如MCP1)、抑制神经再生的分子(例如Nogo，RGM A)、增强神经突生长的分子(神经营养蛋白)和可介导在血脑屏障上的转运的分子(例如运铁蛋白受体、胰岛素受体或RAGE)。DVD结合蛋白的功效可在临床前动物模型中进行验证，例如超表达淀粉状前体蛋白或RAGE且发展阿尔茨海默氏病样症状的转基因小鼠。此外，可构建DVD结合蛋白并在动物模型中测试功效，并且可选择最佳的治疗性DVD结合蛋白用于在人患者中测试。DVD结合蛋白也可用于治疗其他神经变性疾病例如帕金森氏病。α-突触核蛋白与帕金森氏病理学有关。能够靶向硬化蛋白和LINGO-1、α-突触核蛋白和/或炎症介质例如TNF、IL-1、MCP-1的DVD结合蛋白可证明是对于帕金森氏病的有效治疗且加以考虑。

VI.G.神经元再生和脊髓损伤

尽管病理学机制的知识增加，但脊髓损伤(SCI)仍是破坏性病症且代表特征在于高医学需要的医学适应症。大多数脊髓损伤是挫伤或压迫损伤，并且原发性损伤通常随后为继发性损伤机制(炎症介质例如细胞因子和趋化因子)，所述继发性损伤机制使最初损伤恶化且导致损害区域显著放大，有时超过10倍。SCI中的这些原发性和继发性机制非常类似于由其他方式例如中风引起的脑损伤中的那些。没有令人满意的治疗，且高剂量单次快速静脉注射甲基强的松龙(MP)是损伤后8小时窄时间窗内唯一使用的治疗。然而，这种治疗只预期阻止继发性损伤而不产生任何显著的功能恢复。它因为缺乏明确功效和严重的不利作用而受到猛烈批评，所述不利作用如具有后续感染的免疫抑制和严重组织病理学肌肉改变。没有批准刺激内源性再生潜能的其他药物、生物制剂或小分子，但近年来有希望的治疗原理和药物候选物已在SCI动物模型中显示功效。人SCI中的功能恢复缺乏在很大程度上由抑制神经突生长的因子引起，所述因子在损害部位处、在瘢痕组织中、在髓鞘质中以及在损伤相关细胞上。此类因子是髓鞘相关蛋白NogoA、OMgp和MAG、RGM A、瘢痕相关CSPG(硫酸软骨素蛋白聚糖)和关于反应性星形胶质细胞的抑制因子(有时为脑信号蛋白和肝配蛋白(ephrin))。然而，在损害部位处，不仅发现了生长抑制分子，而且还发现了神经突生长刺激因子，如神经营养蛋白、层粘连蛋白、L1等。神经突生长抑制和生长促进分子的这种总体可能解释了，阻断单一因子如NogoA或RGM A在啮齿类动物SCI模型中导致显著的功能恢复，因为抑制影响的减少可使平衡从生长抑制转移到生长促进。然而，对于阻断单个神经突长出抑制分子观察到的恢复并不完全。为了达到更快速和更显著的恢复，可能需要阻断2种神经突长出抑制分子例如Nogo和RGM A，或阻断神经突长出抑制分子并增强神经突长出增强分子例如Nogo和神经营养蛋白的功能，或阻断神经突长出抑制分子例如Nogo和促炎分子例如TNF(参见McGee AW等人(2003)Trends Neurosci.,26:193；Marco Domeniconi等人(2005)J.Neurol.Sci.,233:43；Milan Makwana1等人(2005)FEBS J.272:2628；Barry J.Dickson(2002)Science,298:1959；Felicia YuHsuan Teng等人(2005)J.Neurosci.Res.79:273；Tara Karnezis等人(2004)Nature Neuroscience,7:736；Gang Xu等人(2004)J.Neurochem.,91:1018)。

在一个方面，结合人硬化蛋白的DVD结合蛋白还可结合下述靶标对中的一个或两个：例如NgR和RGM A；NogoA和RGM A；MAG和RGM A；OMGp和RGM A；RGM A和RGM B；CSPG和RGM A；聚集蛋白聚糖、中期因子、神经蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、Te38和TNF-α；与促进树突和轴突萌发的抗体组合的Aβ球聚体-特异性抗体被提供。树突病理学是非常早期的AD病征，且已知NOGO A限制树突生长。可将此类ab类型与任何SCI候选(髓鞘蛋白)Ab组合。其他DVD结合蛋白靶标可包括NgR-p75、NgR-Troy、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-Lingo、Lingo-Troy、Lingo-p75、MAG或Omgp的任何组合。此外，靶标还可包括牵涉于神经突抑制的任何介质，可溶性或细胞表面的，例如Nogo、Ompg、MAG、RGM A、脑信号蛋白、肝配蛋白、可溶性Aβ、促炎细胞因子(例如IL-1)、趋化因子(例如MIP1a)、抑制神经再生的分子。抗nogo/抗RGM A或类似DVD结合蛋白的功效可在脊髓损伤的临床前动物模型中进行验证。此外，可构建这些DVD结合蛋白并在动物模型中测试功效，并且可选择最佳的治疗性DVD结合蛋白用于在人患者中测试。此外，可构建靶向单个受体上的2个不同配体结合位点的DVD结合蛋白，所述受体例如结合3种配体Nogo、Ompg和MAG的Nogo受体，以及结合Aβ和S100A的RAGE。此外，神经突长出抑制剂例如nogo和nogo受体，也在免疫学疾病如多发性硬化中阻止神经再生方面起作用。nogo-nogo受体相互作用的抑制已显示增强多发性硬化动物模型中的恢复。因此，可阻断一种免疫介质例如细胞因子如IL-12和神经突长出抑制剂分子例如Nogo或RGM功能的DVD结合蛋白，可提供比阻断单独的免疫或神经突长出抑制剂分子更快和更大的功效。

一般而言，抗体不以有效和相关方式跨越血脑屏障(BBB)。然而，在某些神经疾病中，例如中风、外伤性脑损伤、多发性硬化等，BBB可能受损，且允许DVD结合蛋白和抗体向脑内增加的渗透。在不发生BBB渗漏的其他神经病症中，可采用内源转运系统的靶向，包括在BBB的血管内皮上的载体介导的转运蛋白例如葡萄糖和氨基酸载体和受体介导的胞转作用介导细胞结构/受体，使得能够进行DVD结合蛋白的跨BBB转运。在BBB上使得能够进行此类转运的结构包括但不限于胰岛素受体、运铁蛋白受体、LRP和RAGE。此外，策略使得还能够使用DVD结合蛋白作为穿梭物(shuttle)以将潜在药物转运到CNS内，包括低分子量药物、纳米颗粒和核酸(Coloma MJ等人(2000)Pharm Res.17(3):266-74；Boado RJ等人(2007)Bioconjug.Chem.18(2):447-55)。

VI.H.肿瘤学障碍

单克隆抗体治疗已显现为关于癌症的重要治疗方式(von Mehren等人，Annu.Rev.Med.,54:343-69(2003))。抗体可通过下述发挥抗肿瘤作用：诱导细胞凋亡、改变方向的细胞毒性、干扰配体-受体相互作用、或阻止对瘤表型关键的蛋白表达。此外，抗体可靶向肿瘤微环境组分，干扰重要结构例如肿瘤相关脉管系统的形成。抗体还可靶向其配体是生长因子的受体，例如表皮生长因子受体。抗体因此抑制刺激细胞生长的天然配体与靶向的肿瘤细胞结合。作为另外一种选择，抗体可诱导抗独特型网络、补体介导的细胞毒性、或抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)。与单特异性治疗相比较，靶向两种分开的肿瘤介质的双重特异性抗体的使用将可能产生另外的利益。

另一个实施例提供了结合人硬化蛋白的DVD结合蛋白，其还能够结合与肿瘤学疾病有关的另一靶标，包括但不限于：IGFR、IGF、VGFR1、PDGFRb、PDGFRa、IGF1,2、ERB3、CDCP、1BSG2、ErbB3、CD52、CD20、CD19、CD3、CD4、CD8、BMP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、TNF、TNFSF10、BMP6、EGF、FGF1、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GRP、IGF1、IGF2、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、INHA、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、VEGF、CDK2、FGF10、FGF18、FGF2、FGF4、FGF7、IGF1R、IL2、BCL2、CD164、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、GNRH1、IGFBP6、IL1A、IL1B、ODZ1、PAWR、PLG、TGFB1I1、AR、BRCA1、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、E2F1、EGFR、ENO1、ERBB2、ESR1、ESR2、IGFBP3、IGFBP6、IL2、INSL4、MYC、NOX5、NR6A1、PAP、PCNA、PRKCQ、PRKD1、PRL、TP53、FGF22、FGF23、FGF9、IGFBP3、IL2、INHA、KLK6、TP53、CHGB、GNRH1、IGF1、IGF2、INHA、INSL3、INSL4、PRL、KLK6、SHBG、NR1D1、NR1H3、NR1I3、NR2F6、NR4A3、ESR1、ESR2、NR0B1、NR0B2、NR1D2、NR1H2、NR1H4、NR1I2、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR5A1、NR5A2、NR6A1、PGR、RARB、FGF1、FGF2、FGF6、KLK3、KRT1、APOC1、BRCA1、CHGA、CHGB、CLU、COL1A1、COL6A1、EGF、ERBB2、ERK8、FGF1、FGF10、FGF11、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GNRH1、IGF1、IGF2、IGFBP3、IGFBP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、INSL3、INSL4、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、MMP2、MMP9、MSMB、NTN4、ODZ1、PAP、PLAU、PRL、PSAP、SERPINA3、SHBG、TGFA、TIMP3、CD44、CDH1、CDH10、CDH19、CDH20、CDH7、CDH9、CDH1、CDH10、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH7、CDH8、CDH9、ROBO2、CD44、ILK、ITGA1、APC、CD164、COL6A1、MTSS1、PAP、TGFB1I1、AGR2、AIG1、AKAP1、AKAP2、CANT1、CAV1、CDH12、CLDN3、CLN3、CYB5、CYC1、DAB2IP、DES、DNCL1、ELAC2、ENO2、ENO3、FASN、FLJ12584、FLJ25530、GAGEB1、GAGEC1、GGT1、GSTP1、HIP1、HUMCYT2A、IL29、K6HF、KAI1、KRT2A、MIB1、PART1、PATE、PCA3、PIAS2、PIK3CG、PPID、PR1、PSCA、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、STEAP、STEAP2、TPM1、TPM2、TRPC6、ANGPT1、ANGPT2、ANPEP、ECGF1、EREG、FGF1、FGF2、FIGF、FLT1、JAG1、KDR、LAMA5、NRP1、NRP2、PGF、PLXDC1、STAB1、VEGF、VEGFC、ANGPTL3、BAI1、COL4A3、IL8、LAMA5、NRP1、NRP2、STAB1、ANGPTL4、PECAM1、PF4、PROK2、SERPINF1、TNFAIP2、CCL11、CCL2、CXCL1、CXCL10、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、IFNA1、IFNB1、IFNG、IL1B、IL6、MDK、EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、ITGB3、PDGFA、TEK、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBR1、CCL2、CDH5、COL18A1、EDG1、ENG、ITGAV、ITGB3、THBS1、THBS2、BAD、BAG1、BCL2、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CDH1(E-钙粘着蛋白)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN2A(p16INK4a)、COL6A1、CTNNB1(b-连环蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、ERBB2(Her-2)、ESR1、ESR2、F3(TF)、FOSL1(FRA-1)、GATA3、GSN(凝溶胶蛋白)、IGFBP2、IL2RA、IL6、IL6R、IL6ST(糖蛋白130)、ITGA6(a6整联蛋白)、JUN、KLK5、KRT19、MAP2K7(c-Jun)、MKI67(Ki-67)、NGFB(NGF)、NGFR、NME1(NM23A)、PGR、PLAU(uPA)、PTEN、SERPINB5(乳腺丝抑蛋白)、SERPINE1(PAI-1)、TGFA、THBS1(血小板反应蛋白-1)、TIE(Tie-1)、TNFRSF6(Fas)、TNFSF6(FasL)、TOP2A(拓扑异构酶Iia)、TP53、AZGP1(锌-a-糖蛋白)、BPAG1(网蛋白)、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CLDN7(密蛋白-7)、CLU(簇蛋白)、ERBB2(Her-2)、FGF1、FLRT1(纤连蛋白)、GABRP(GABAa)、GNAS1、ID2、ITGA6(a6整联蛋白)、ITGB4(b4整联蛋白)、KLF5(GC Box BP)、KRT19(角蛋白19)、KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)、MACMARCKS、MT3(金属硫蛋白-III)、MUC1(粘蛋白)、PTGS2(COX-2)、RAC2(p21Rac2)、S100A2、SCGB1D2(亲脂素B)、SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SPRR1B(Spr1)、THBS1、THBS2、THBS4、和TNFAIP2(B94)、RON、c-Met、CD64、DLL4、PLGF、CTLA4、磷脂酰丝氨酸、ROBO4、CD80、CD22、CD40、CD23、CD28、CD55、CD38、CD70、CD74、CD30、CD138、CD56、CD33、CD2、CD137、DR4、DR5、RANKL、VEGFR2、PDGFR、VEGFR1、MTSP1、MSP、EPHB2、EPHA1、EPHA2、EpCAM、PGE2、NKG2D、LPA、SIP、APRIL、BCMA、MAPG、FLT3、PDGFR-α、PDGFRβ、ROR1、PSMA、PSCA、SCD1和CD59。

VII.药物组合物

提供了包含本发明的抗体或其抗原结合部分和药学可接受的载体的药物组合物。提供了包含抗体的药物组合物，并且所述药物组合物用于在下述方面使用，但不限于下述方面：诊断、检测或监控障碍，预防、治疗、管理或改善障碍或其一种或多种症状，和/或研究。在具体实施例中，提供了包含一种或多种抗体的组合物。在另一个提供的实施例中，药物组合物包含一种或多种抗体，以及治疗其中SOST活性是有害的障碍的抗体以外的一种或多种预防或治疗剂。在一个实施例中，预防或治疗剂已知在障碍或其一种或多种症状的预防、治疗、管理或改善中有用，或已在其中使用或目前正在其中使用。依照这些实施例，组合物还可包含载体、稀释剂或赋形剂。

抗体和抗体部分可掺入适合于给受试者施用的药物组合物内。通常地，药物组合物包含抗体或抗体部分和药学可接受的载体。术语“药学可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的例子包括下述一种或多种：水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等、及其组合。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化钠。药学可接受的载体还可包含少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，所述辅助物质增强抗体或抗体部分的保存期限或有效性。

多种递送系统是已知的，且可用于施用一种或多种抗体或一种或多种抗体与预防剂或治疗剂的组合，用于预防、管理、治疗或改善障碍或其一种或多种症状，例如被包封在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞、受体介导的胞吞(参见例如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.,262:4429-4432(1987))、作为逆转录病毒或其他载体的部分的核酸构建。提供了施用预防或治疗剂的方法，并且所述方法包括但不限于，肠胃外施用(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)，硬膜外施用，瘤内施用和粘膜施用(例如，鼻内和经口途径)。此外，可使用肺施用，例如利用吸入器或喷雾器，和含气溶胶化剂的制剂。参见例如，美国专利号6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；以及PCT公开号WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346、和WO99/66903。一个实施例提供了使用Alkermes肺药物递送技术(Alkermes,Inc.,Cambridge,Massachusetts,US)施用的抗体或抗体部分、组合疗法或组合物。在提供的具体实施例中，预防或治疗剂肌内、静脉内、瘤内、经口、鼻内、肺、或皮下施用。预防或治疗剂可通过任何方便的途径施用，例如通过输注或单次快速静脉注射，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，且可连同其他生物学活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。

在一个实施例中，可将抗体偶联的碳纳米管(CNT)与肿瘤细胞在体外的特异性结合、随后为用近红外(NIR)光对其高特异性切除用于靶向肿瘤细胞。例如，可将生物素化极性脂质用于制备稳定的、生物相容的、非细胞毒性的CNT分散体，然后将所述CNT分散体附着在一个或两个不同的neutralite抗生物素蛋白衍生的DVD结合蛋白，所述DVD结合蛋白针对一个或多个肿瘤抗原(例如CD22)(Chakravarty，P.等人(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，105:8697-8702)。

具体实施例提供了可能希望使预防或治疗剂局部施用在需要治疗的区域；这可通过例如但不限于局部输注、注射、或通过植入物来完成，所述植入物为多孔或无孔材料，包括膜和基质，例如硅橡胶(sialastic)膜、聚合物、纤维基质(例如，)、或胶原基质。一个实施例提供了有效量的一种或多种抗体拮抗剂局部施用于受试者的受累区域，以预防、治疗、管理、和/或改善障碍或其症状。另一个实施例提供了有效量的一种或多种抗体，与有效量的抗体以外的一种或多种疗法(例如，一种或多种预防或治疗剂)组合，局部施用于受试者的受累区域，以预防、治疗、管理、和/或改善障碍或其一种或多种症状。

在另一个实施例中，预防或治疗剂可在控释或持续释放系统中递送。在一个实施例中，可使用泵以达到控释或持续释放(参见Langer,上文；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.,14:20；Buchwald等人，1980,Surgery,88:507；Saudek等人，1989,N.Engl.J.Med.,321:574)。另一个实施例提供了可用于实现疗法的控释或持续释放的聚合物材料(参见例如，Goodson，J.M.，第6章，在Medical Applications of Controlled Release,第II卷，Applicationsand Evaluation中,(Langer和Wise，编辑)(CRC Press，Inc.，Boca Raton，1984)，第115-138页；Ranger和Peppas，1983，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；还参见Levy等人，1985,Science228:190；During等人，1989,Ann.Neurol.25:351；Howard等人，1989,J.Neurosurg.71:105)；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；U.S.Patent No.5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO99/15154；和PCT公开号WO99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的例子包括但不限于，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯共乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯共乙交酯)(PLGA)、和聚原酸酯。在一个实施例中，持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可沥滤杂质、贮藏稳定、无菌和生物可降解的。在另外一个实施例中，控释或持续释放系统可接近预防或治疗靶标放置，从而只需要全身剂量的部分(参见例如，Goodson，在Medical Applications of ControlledRelease中，同上，第2卷，第115-138页(1984))。

控释系统在Langer(1990，Science249：1527-1533)的综述中讨论。提供了本领域技术人员已知的任何技术，并且所述技术可用于生产包含一种或多种治疗剂的持续释放制剂。参见例如，美国专利号4,526,938，PCT公开WO91/05548，PCT公开WO96/20698，Ning等人，1996，"IntratumoralRadioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using aSustained-Release Gel,"Radiotherapy&Oncology，39：179-189，Song等人，1995，"Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,"PDAJournal of Pharmaceutical Science&Technology，50：372-397，Cleek等人，1997，"Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody forCardiovascular Application,"Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854，和Lam等人，1997，"Microencapsulation of Recombinant HumanizedMonoclonal Antibody for Local Delivery,"Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760。

具体实施例提供了，当组合物是编码预防或治疗剂的核酸时，核酸可体内施用以促进其编码的预防或治疗剂的表达，这通过下述实现，将其构建为合适的核酸表达载体的部分且施用，使得其成为细胞内的，例如利用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或直接注射，或使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或与已知进入核的同源异型框样肽连接施用(参见例如，Joliot等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：1864-1868)。作为另外一种选择，核酸可细胞内引入且通过同源重组整合入宿主细胞DNA内用于表达。

提供了配制为与其预期施用途径相容的药物组合物。施用途径的例子包括但不限于，肠胃外，例如，静脉内、皮内、皮下、经口、鼻内(例如，吸入)、经皮(例如，局部)、跨粘膜、和直肠施用。在具体实施例中，组合物依照常规方案配制为药物组合物，所述药物组合物适合于静脉内、皮下、肌内、经口、鼻内或局部施用于人类。通常地，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因(lignocamne)，以减轻注射部位处的疼痛。

如果组合物将局部施用，则组合物可配制为软膏、乳膏、经皮贴剂、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气溶胶、溶液、乳剂形式或本领域技术人员众所周知的其他形式。参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences andIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.(1995)。对于不可喷雾的局部剂型，通常采用包含与局部应用相容的载体或一种或多种赋形剂，且具有例如大于水的动态粘度的粘性至半固体或固体形式。合适的制剂包括但不限于，溶液、悬浮液、乳剂、乳膏、软膏、粉末、搽剂、油膏等，必要时进行灭菌或与助剂(例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲液或盐)混合以用于影响多种性质，例如，渗透压。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中活性成分，例如与固体或液体惰性载体组合，与加压挥发物(例如，气体推进剂，例如)在混合物中包装或包装在挤压瓶中。必要时保湿剂或湿润剂也可加到药物组合物和剂型中。此类另外成分的例子是本领域众所周知的。

如果该方法包括组合物的鼻内施用，则组合物可配制为气溶胶形式、喷雾剂、雾或滴剂形式。特别地，提供了预防或治疗剂，并可以从加压包或喷雾器呈递的气溶胶喷雾剂形式方便地递送，其中使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供阀来测定，以递送计量的量。可配制包含化合物和合适粉末基例如乳糖或淀粉的粉末混合物的胶囊和药液筒(由例如明胶组成)，用于在吸入器或吹入器中使用。

如果该方法包括经口施用，则组合物可配制为片剂、胶囊、扁胶剂、粒状胶囊(gelcap)、溶液、悬浮液等经口形式。片剂或胶囊可通过常规方法用药学可接受的赋形剂制备，所述赋形剂例如粘合剂(例如，预凝胶玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、或羟丙基甲基纤维素)；充填剂(例如，乳糖、微晶纤维素、或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。片剂可通过本领域众所周知的方法进行包被。用于经口施用的液体制剂可采取下述形式，但不限于下述形式，溶液、糖浆或悬浮液，或它们可呈现为干燥产品，用于在使用前用水或其他合适的载体构建。此类液体制剂可通过常规方法用药学可接受的添加剂制备，所述添加剂例如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物、或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水载体(例如，杏仁油、油酯、乙醇、或分馏植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。适当时制剂还可包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于经口施用的制剂可适当地配制，用于缓慢释放、控释、或持续释放一种或多种预防或治疗剂。

提供的方法可包括用气溶胶化剂配制的组合物的肺施用，例如利用吸入器或喷雾器。参见例如，美国专利号6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；和PCT公开号WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346、和WO99/66903。具体实施例提供了使用Alkermes肺药物递送技术(Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass.)施用的抗体、组合疗法、和/或组合物。

提供的方法可包括配制用于通过注射(例如通过单次快速静脉注射或连续输注)肠胃外施用的组合物的施用。用于注射的制剂可与添加的防腐剂一起以单位剂型(例如，在安瓿或多剂容器中)呈递。组合物可采取此类形式，如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳剂，且可包含配制试剂例如悬浮、稳定和/或分散剂。作为另外一种选择，活性成分可为粉末形式用于在使用前用合适的载体(例如，无菌无致热原水)构建。

提供的方法可另外包括配制为积存制剂的组合物的施用。此类长效制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，组合物可用合适的聚合物材料或疏水材料(例如，作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶衍生物(例如，作为微溶盐)。

提供的方法包括配制为中性或盐形式的组合物的施用。药学可接受的盐包括由阴离子形成的那些，所述阴离子例如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及由阳离子形成的那些，所述阳离子例如源自钠、钾、铵、钙、铁氢氧化物，异丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的那些。

一般地，组合物的成分分开或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为在密封容器中的干冷冻干燥粉末或无水浓缩剂，所述密封容器例如安瓿或小药囊，其指示活性剂的量。当施用方式是输注时，组合物可用包含无菌药物级别的水或盐水的输注瓶分配。当施用方式是注射时，可提供无菌注射用水或盐水安瓿，使得成分可在施用前进行混合。

特别地，还提供了包装在密封容器中的一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，所述密封容器例如安瓿或小药囊，其指示试剂的量。一个实施例提供了一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，作为在密封容器中的干无菌冷冻干燥粉末或无水浓缩剂供应，且可重构(例如，用水或盐水)至合适浓度以用于给受试者施用。一个实施例提供了一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，作为在密封容器中的干无菌冷冻干燥粉末提供，其单位剂量为至少5mg，例如至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少75mg、或至少100mg。冷冻干燥的预防或治疗剂或药物组合物应在其原容器中贮存于2℃-8℃，并且预防或治疗剂或药物组合物应在重构后1周内施用，例如5天内、72小时内、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内、或1小时内。可替代的实施例提供了一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，以液体形式在指示试剂的量和浓度的密封容器中提供。在一个实施例中，液体形式的施用的组合物在密封容器中提供，为至少0.25mg/ml，例如至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml或至少100mg/ml。液体形式应在其原容器中贮存于2℃-8℃。

提供了可掺入适用于肠胃外施用的药物组合物内的抗体和抗体部分。在一个实施例中，抗体或抗体部分将制备为包含0.1-250mg/ml抗体的可注射溶液。可注射溶液可由在燧石或琥珀色小瓶、安瓿或预装注射器中的液体或冷冻干燥剂型组成。缓冲液可以是L-组氨酸(1-50mM)，最佳5-10mM，pH5.0-7.0(最佳pH6.0)。其他合适的缓冲液包括但不限于，琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠可用于修饰浓度为0-300mM(对于液体剂型最佳150mM)的溶液的毒性。对于冷冻干燥剂型可包括冷冻保护剂，主要为0-10％蔗糖(最佳0.5-1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冷冻干燥剂型可包括膨胀剂，主要为1-10％甘露糖醇(最佳2-4％)。稳定剂可在液体和冷冻干燥剂型中使用，主要为1-50mM L-甲硫氨酸(最佳5-10mM)。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸、精氨酸，可作为0-0.05％聚山梨醇酯80(最佳0.005-0.01％)包括。另外的表面活性剂包括但不限于，聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。提供了制备为可注射溶液用于肠胃外施用的包含抗体或抗体部分的药物组合物，并还可包含用作佐剂的试剂，例如用于增加治疗性蛋白(例如，抗体)吸收、或分散的那些。特别有用的佐剂是透明质酸酶(例如重组人透明质酸酶)。在可注射溶液中添加透明质酸酶改善肠胃外施用，特别是皮下施用后的人生物利用度。它还允许具有较少疼痛和不适的更大注射部位体积(即大于1ml)，和最低限度的注射部位反应发生率(参见WO2004/078140和美国专利申请公开号2006104968)。

提供的组合物可为多种形式。这些包括例如，液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。示例性形式取决于预期施用方式和治疗应用。通常的组合物为可注射或可输注溶液形式，例如类似于由其他抗体被动免疫接种人使用的那些的组合物。示例性施用方式是肠胃外的(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一个实施例中，抗体通过静脉内输注或注射来施用。在另一个实施例中，抗体通过肌内或皮下注射来施用。

治疗性组合物通常必须是无菌且在制备和贮存条件下是稳定的。组合物可配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体、或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可通过下述制备：将需要量的活性化合物(即，抗体或抗体部分)与上文列举的一种成分或成分组合一起掺入合适的溶剂中，必要时随后进行过滤灭菌。一般地，分散体通过将活性化合物掺入无菌载体内来制备，所述无菌载体包含基本分散介质和来自上文列举那些的必需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌、冷冻干燥粉末的情况下，示例性制备方法是由其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外所需成分的粉末的真空干燥和喷雾干燥。溶液的正确流动性可通过下述来维持，例如利用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下维持所需颗粒大小和利用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来引起，所述试剂例如单硬脂酸盐和明胶。

提供了可通过本领域已知的多种方法施用的抗体和抗体部分，尽管对于许多治疗应用，示例性施用途径/模式是皮下注射、静脉内注射或输注。如技术人员将认识到的，施用途径和/或模式将依所需结果而变。在某些实施例中，活性化合物可与载体一起制备，所述载体将保护化合物免于快速释放，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂、和微囊化递送系统。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法是获得专利保护的或是本领域技术人员一般已知的。参见例如，Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson,编辑，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

在某些提供的实施例中，抗体或抗体部分可例如与惰性稀释剂或可同化食用载体一起经口施用。化合物(和若需要的其他成分)也可装入硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接掺入受试者的饮食内。对于经口治疗施用，化合物可与赋形剂掺合，且以可摄食片剂、口腔含化片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafer)等的形式使用。为了通过肠胃外施用以外施用化合物，可能必须用材料包被化合物、或将化合物与材料共施用，以防止其失活。

补充性活性化合物也可掺入组合物内。实施例提供了与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共施用的抗体或抗体部分，所述治疗剂用于治疗其中SOST活性是有害的障碍。例如，抗hSOST抗体或抗体部分可与结合其他靶标的一种或多种另外的抗体(例如，结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)共配制和/或共施用。此外，一种或多种抗体可与2种或更多种前述治疗剂组合使用。此类组合疗法可有利地利用较低剂量的施用的治疗剂，因此避免与多种单一疗法相关的可能毒性或并发症。

在某些实施例中，针对SOST的抗体或其片段与本领域已知的半衰期延长载体连接。此类载体包括但不限于，Fc结构域、聚乙二醇、和葡聚糖。此类载体在例如美国系列号09/428,082和公开的PCT公开号WO99/25044中描述。

在具体实施例中，提供了施用的包括编码本发明的抗体或本发明的另一种预防或治疗剂的核苷酸序列的核酸序列，以经由基因疗法治疗、预防、管理、或改善障碍或其一种或多种症状。基因疗法指通过给受试者施用表达的或可表达核酸来进行的疗法。在这个提供的实施例中，核酸生产其编码的抗体或介导预防或治疗作用的预防或治疗剂。

提供了本领域可用的任何关于基因治疗的方法。关于基因治疗方法的一般综述，参见Goldspiel等人，1993,Clinical Pharmacy,12:488-505；Wu等人，“Delivery systems for gene therapy,”Biotherapy,3:87-95(1991)；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.,32:573-596；Mulligan,Science,260:926-932(1993)；以及Morgan和Anderson,“Human Gene Therapy,”Ann.Rev.Biochem.,62:191-217(1993)；Robinson,C.,Trends Biotechnol.,11:155(1993)。可使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法描述于Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993)；和Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)。多种基因治疗方法的详细描述公开于美国申请公开号US2005/0042664。

硬化蛋白在与涉及免疫和炎症元素的多种疾病相关的病理学中起关键作用。这些疾病包括但不限于，获得性免疫缺陷病综合征；获得性免疫缺陷相关疾病；获得性恶性贫血；急性冠状动脉综合征；急性和慢性痛(不同形式的疼痛)；急性特发性多神经炎；与器官移植相关的急性免疫性疾病；与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病；急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病；急性缺血；急性肝病；急性风湿热；急性横贯性脊髓炎；阿狄森氏病；成人(急性)呼吸窘迫综合征；成人斯蒂尔氏病；酒精性肝硬变；酒精诱发性肝损伤；变应性疾病；变态反应；脱发；斑秃；阿尔茨海默氏病；过敏反应；强直性脊柱炎；强直性脊柱炎相关性肺病；抗磷脂抗体综合征；再生障碍性贫血；动脉硬化；关节病；哮喘；动脉粥样化疾病/动脉硬化；动脉粥样硬化；特应性变态反应；特应性湿疹；特应性皮炎；萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退；自身免疫性大疱性疾病；自身免疫性皮炎；自身免疫性糖尿病；与链球菌感染相关的自身免疫性病症；自身免疫性肠病；自身免疫性溶血性贫血；自身免疫性肝炎；自身免疫性听力丧失；自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)；自身免疫介导的低血糖；自身免疫性心肌炎；自身免疫性嗜中性白细胞减少症；自身免疫性卵巢早衰；自身免疫性血小板减少症(AITP)；自身免疫性甲状腺病；自身免疫性葡萄膜炎；闭塞性细支气管炎；白塞氏病；睑炎；支气管扩张；大疱性类天疱疮；恶病质；心血管病；灾变性抗磷脂综合征；乳糜泻；颈椎关节强硬；衣原体；胆汁郁积；慢性活动性肝炎；慢性嗜酸性肺炎；慢性疲乏综合征；与器官移植相关的慢性免疫性疾病；慢性缺血；慢性肝病；慢性粘膜皮肤念珠菌病；疤痕性类天疱疮；具有多发性硬化危险的临床孤立综合征(CIS)；常见的多种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)；结缔组织病相关性间质性肺病；结膜炎；库姆斯阳性溶血性贫血；儿童期起病的精神障碍；慢性阻塞性肺部疾病(COPD)；克罗恩氏病；隐原性自身免疫性肝炎；隐原性纤维化肺泡炎；泪囊炎；抑郁；皮炎硬皮病；皮肌炎；皮肌炎/多肌炎相关性肺病；糖尿病性视网膜病；糖尿病；扩张型心肌病；盘状红斑狼疮；椎间盘突出；椎间盘脱出；弥散性血管内凝血；药物诱发性肝炎；药物诱发性间质性肺病；药物诱发性免疫性溶血性贫血；心内膜炎；子宫内膜异位；眼内炎；肠病性滑膜炎；巩膜外层炎；多形性红斑；重型多形性红斑；女性不育；纤维化；纤维化肺疾病；妊娠期类天疱疮；巨细胞性动脉炎(GCA)；肾小球肾炎；甲状腺肿性自身免疫性甲状腺功能减退(桥本氏病)；古德帕斯丘氏综合征；痛风性关节炎；移植物抗宿主病(GVHD)；格雷夫斯氏病；B群链球菌(GBS)感染；格-巴二氏综合征(GBS)；血黄素沉着病相关肺病；花粉热；心力衰竭；溶血性贫血；过敏性紫癜；乙型肝炎；丙型肝炎；休斯综合征；亨廷顿氏舞蹈病；甲状腺机能亢进；甲状旁腺机能减退；特发性白细胞减少症；特发性血小板减少症；特发性帕金森氏病；特发性间质性肺炎；特应性肝病；IgE介导的变态反应；免疫性溶血性贫血；内含体肌炎；传染病；传染性眼炎性疾病；炎性肠病；炎性脱髓鞘疾病；炎性心脏病；炎性肾病；胰岛素依赖性糖尿病；间质性肺炎；IPF/UIP；虹膜炎；幼年型慢性关节炎；幼年型恶性贫血；幼年型类风湿性关节炎；川崎氏病；角膜炎；干燥性角膜结膜炎；库斯毛尔病或库-迈二氏病；兰德里氏麻痹；郎格罕氏细胞组织细胞增多症；线性IgA疾病；网状青斑；莱姆关节炎；淋巴细胞性浸润性肺病；黄斑变性；特发性男性不育症或NOS；恶性肿瘤；肾显微血管炎；显微镜下多脉管炎；混合型结缔组织病相关性肺病；白赫铁列夫症；运动神经元病症；粘膜类天疱疮；多发性硬化(所有亚型：原发进行性，继发进行性，复发缓和性等)；多器官衰竭；肌痛脑炎/Royal Free疾病；重症肌无力；脊髓异常增生综合征；心肌梗死；心肌炎；肾病综合征；神经根障碍；神经病；非酒精性脂肪性肝炎；非甲非乙型肝炎；视神经炎；器官移植排斥；骨关节炎；骨质溶解；卵巢癌；卵巢衰竭；胰腺炎；寄生虫病；帕金森氏病；少关节JRA；类天疱疮；落叶型天疱疮；寻常型天疱疮；周围动脉闭塞性疾病(PAOD)；周围血管疾病(PVD)；外周动脉疾病(PAD)；晶状体性葡萄膜炎；静脉炎；结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)；多软骨炎；风湿性多肌痛；白发症；多关节JRA；多发性内分泌缺陷综合征；多肌炎；多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏；风湿性多肌痛(PMR)；传染后间质性肺病；炎症后间质性肺病；泵后综合征；卵巢早衰；原发性胆汁性肝硬变；原发性粘液性水肿；原发性帕金森综合征；原发性硬化性胆管炎；原发性硬化性肝炎；原发性血管炎；前列腺和直肠癌以及造血系统恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)；前列腺炎；牛皮癣；1型牛皮癣；2型牛皮癣；牛皮癣性关节炎；牛皮癣性关节病；结缔组织病继发的肺动脉高压；结节性多动脉炎的肺部表现；单纯红细胞再生障碍；原发性肾上腺机能不足；放射性纤维化；反应性关节炎；莱特氏病；复发型视神经脊髓炎；肾脏病NOS；再狭窄；类风湿性关节炎；类风湿性关节炎相关性间质性肺病；风湿性心脏病；SAPHO(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)；肉状瘤病；精神分裂症；施密特氏综合征；硬皮病；继发性淀粉样变性；休克肺；巩膜炎；坐骨神经痛；继发性肾上腺机能不足；脓毒症综合征；脓毒性关节炎；脓毒性休克；血清反应阴性关节病；聚硅氧烷相关的结缔组织病；斯耶格伦氏病相关性肺病；斯耶格伦氏综合征；斯-威二氏皮肤病；精子自身免疫性；脊椎关节病；关节强硬性脊椎炎；斯-约二氏综合征(SJS)；斯蒂尔氏病；中风；交感性眼炎；全身性炎症应答综合征；全身性红斑狼疮；全身性红斑狼疮相关性肺病；全身性硬皮病；全身性硬皮病相关性间质性肺病；高安氏病/动脉炎；颞动脉炎；Th2型和Th1型介导的疾病；甲状腺炎；中毒性休克综合征；弓形体性视网膜炎；中毒性表皮坏死松解症；横贯性脊髓炎；TRAPS(肿瘤坏死因子受体I型(TNFR)相关性周期综合征)；B型胰岛素抗性伴黑棘皮症；1型变态反应；1型自身免疫性肝炎(经典自身免疫性或类狼疮肝炎)；2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)；II型糖尿病；溃疡性结肠炎性关节病；溃疡性结肠炎；荨麻疹；寻常型间质性肺炎(UIP)；葡萄膜炎；脉管炎性弥散性肺病；脉管炎；春季结膜炎；病毒性视网膜炎；白癜风；伏格特-小柳-原田三氏综合征(VKH综合征)；韦格纳氏肉芽肿病；湿性黄斑变性；伤口愈合；或耶尔森氏菌和沙门氏菌相关关节病。

抗体和抗体部分可用于治疗患有自身免疫性疾病的人，所述自身免疫性疾病特别是与炎症、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、牛皮癣、多发性硬化(MS)及其他自身免疫性疾病相关的那些。

抗体或抗体部分也可与自身免疫和炎性疾病治疗中有用的一种或多种另外治疗剂一起施用。

在提供的实施例中，可用组合物和方法治疗或诊断的疾病包括但不限于：原发性和转移性癌症，包括乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰腺、肝、胆囊和胆管、小肠、尿道(包括肾、膀胱和尿道上皮)、女性生殖道(包括子宫颈、子宫和卵巢，以及绒毛膜癌和妊娠性滋养层细胞病)、男性生殖道(包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺(包括甲状腺、肾上腺和脑下垂体)和皮肤的癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤(包括从骨和软组织产生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤)，脑、神经、眼和脑膜(包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤和脑膜瘤)的肿瘤，从造血恶性肿瘤例如白血病和淋巴瘤(霍奇金与非霍奇金淋巴瘤)产生的实体瘤。

在另一个实施例中，提供了用于治疗癌症或预防来自肿瘤的转移的抗体或其抗原结合部分。此类治疗可涉及抗体或其抗原结合部分单独地或与另一种治疗剂或治疗例如放射治疗和/或化疗剂组合地施用。

提供了可与下述试剂组合的抗体或其抗原结合部分：包括但不限于抗瘤剂、放射治疗、化学疗法例如DNA烷基化剂、顺铂、碳铂、抗微管蛋白剂、紫杉醇、多西他赛、紫素、阿霉素、吉西他滨、健择、蒽环、亚得里亚霉素、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、依立替康、受体酪氨酸激酶抑制剂(例如埃罗替尼、吉非替尼)、COX-2抑制剂(例如塞来昔布)、激酶抑制剂和siRNA。

还提供了可与多种疾病治疗中有用的一种或多种另外治疗剂一起施用的结合蛋白。

提供了抗体或其抗原结合部分可单独或组合使用以治疗此类疾病。应当理解抗体或其抗原结合部分可单独或与另外的试剂例如治疗剂组合使用，所述另外的试剂由技术人员根据其预期目的进行选择。例如，另外的试剂可以是领域公认为治疗由抗体治疗的疾病或病症有用的治疗剂。另外的试剂也可以是赋予治疗性组合物有利属性的试剂，例如影响组合物粘度的试剂。

还应理解要包括的组合是对其预期目的有用的那些组合。下文所述试剂是举例说明性目的的且不希望是限制性的。该组合可以是抗体和选自下述的至少一种另外的试剂。组合还可包括超过一种另外的试剂，例如，两种或三种另外的试剂，如果组合是这样的，使得形成的组合物可执行其预期功能的话。

示例性组合是非类固醇消炎药，也称为NSAIDS，它包括药物如布洛芬。其他示例性组合是皮质类固醇，包括强的松龙；当与抗硬化蛋白抗体组合治疗患者时，通过逐渐减少所需的类固醇剂量，可减少或甚至消除类固醇使用的众所周知的副作用。提供了抗体或抗体部分可与之组合用于类风湿性关节炎的治疗剂的非限制性例子，并且所述例子包括但不限于下述：细胞因子抑制性消炎药(CSAID)；针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、干扰素、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF。抗体或其抗原结合部分可与针对细胞表面分子或其配体包括CD154(gp39或CD40L)的抗体组合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、CTLA。

治疗剂的示例性组合可在自身免疫和后续炎症级联中的不同点上进行干扰；示例性例子包括TNF拮抗剂，如嵌合、人源化或人TNF抗体，D2E7、(PCT公开号WO97/29131)、CA2(Remicade^TM)、CDP571、和可溶性p55或p75TNF受体，其衍生物(p75TNFR1gG(Enbrel^TM)或p55TNFR1gG(Lenercept)，以及TNFα转换酶(TACE)抑制剂；类似地由于相同原因IL-1抑制剂(白细胞介素-1转换酶抑制剂，IL-1RA等)可以是有效的。其他示例性组合包括白细胞介素11。另外一种示例性组合是自身免疫应答的其他关键参与物(player)，所述关键参与物可与SOST功能平行作用，依赖于SOST功能或与SOST功能一致。另外一种示例性组合是非耗尽性抗CD4抑制剂。另外一种示例性组合包括共刺激途径CD80(B7.1)或CD86(B7.2)拮抗剂，包括抗体、可溶性受体或拮抗性配体。

抗体或其抗原结合部分还可与试剂组合，所述试剂例如氨甲蝶呤、6-MP、硫唑嘌呤、柳氮磺吡啶、美沙拉嗪、奥沙拉嗪、氯喹/羟氯喹、青霉胺、硫化苹果酸金(肌内和经口)、硫唑嘌呤、秋水仙碱、皮质类固醇(经口、吸入和局部注射)、β2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗)、黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)、色甘酸盐、萘多罗米、酮替芬、异丙托铵和乙东碱、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟米特、NSAID例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰经由促炎细胞因子例如TNFα或IL-1的信号传导的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TNFα转换酶(TACE)抑制剂、T细胞信号传导抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如，可溶性p55或p75TNF受体和衍生物p75TNFRIgG(Enbrel^TM和p55TNFRIgG(Lenercept))、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)、塞来昔布、叶酸、硫酸羟氯喹、洛芬昔布、依那西普、英夫利昔单抗、萘普生、伐地考昔、柳氮磺吡啶、甲基强的松龙、美洛昔康、乙酸甲基强的松龙、硫代苹果酸金钠、阿司匹林、曲安缩松、萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛、叶酸盐、萘普酮、扶他林、吡罗昔康、依托度酸、双氯酚酸钠、奥沙普嗪、盐酸羟可酮、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、双氯酚酸钠/米索前列醇、芬太尼、阿那白滞素、人重组体、盐酸曲马多、双水杨酸酯、舒林酸、氰钴胺素/fa/吡哆醇、扑热息痛、阿仑膦酸钠、强的松龙、硫酸吗啡、盐酸利多卡因、吲哚美辛、硫酸葡糖胺/软骨素、盐酸阿米替林、磺胺嘧啶、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸奥洛帕定、米索前列醇、甲氧萘丙酸钠、奥美拉唑、环磷酰胺、利妥昔单抗、IL-1TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18BP、抗IL-18、抗IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、罗氟司特、IC-485、CDC-801和美索普南。示例性组合包括氨甲蝶呤或来氟米特，并且在中等或重度类风湿性关节炎的情况下，包括环孢菌素。

也可与结合蛋白组合使用以治疗类风湿性关节炎(RA)的非限制性的另外的试剂包括但不限于下述：非类固醇消炎药(NSAID)；细胞因子抑制性消炎药(CSAID)；CDP-571/BAY-10-3356(人源化抗TNFα抗体；Celltech/Bayer)；cA2/英夫利昔单抗(嵌合抗TNFα抗体；Centocor)；75kdTNFR-IgG/依那西普(75kD TNF受体-IgG融合蛋白；Immunex；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1994)第37卷，S295；J.Invest.Med.(1996)第44卷，235A)；55kdTNF-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)；IDEC-CE9.1/SB210396(非耗尽性灵长类动物源化(primatized)抗CD4抗体；IDEC/SmithKline；参见例如Arthritis&Rheumatism(1995)第38卷，S185)；DAB486-IL-2和/或DAB389-IL-2(IL-2融合蛋白；Seragen；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1993)第36卷，1223)；抗Tac(人源化抗IL-2Rα；Protein Design Labs/Roche)；IL-4(抗炎细胞因子；DNAX/Schering)；IL-10(SCH52000；重组IL-10，抗炎细胞因子；DNAX/Schering)；IL-4；IL-10和/或IL-4激动剂(例如，激动性抗体)；IL-1RA(IL-1受体拮抗剂；Synergen/Amgen)；阿那白滞素（/Amgen)；TNF-bp/s-TNF(可溶性TNF结合蛋白；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S284；Amer.J.Physiol.-Heart and Circulatory Physiology(1995)第268卷，第37-42页)；R973401(磷酸二酯酶IV型抑制剂；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S282)；MK-966(COX-2抑制剂；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S81)；伊落前列素(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S82)；氨甲蝶呤；沙立度胺(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S282)和沙立度胺相关药物(例如，Celgen)；来氟米特(抗炎和细胞因子抑制剂；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S131；Inflammation Research(1996)第45卷，第103-107页)；氨甲环酸(纤溶酶原活化抑制剂；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S284)；T-614(细胞因子抑制剂；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S282)；前列腺素E1(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S282)；替尼达普(非类固醇消炎药；参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S280)；萘普生(非类固醇消炎药；参见例如，Neuro Report(1996)第7卷，第1209-1213页)；美洛昔康(非类固醇消炎药)；布洛芬(非类固醇消炎药)；吡罗昔康(非类固醇消炎药)；扶他林(非类固醇消炎药)；吲哚美辛(非类固醇消炎药)；柳氮磺吡啶(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S281)；硫唑嘌呤(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S281)；ICE抑制剂(白细胞介素-1β转换酶抑制剂)；zap-70和/或lck抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或lck抑制剂)；VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂(血管内皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子受体抑制剂；血管发生抑制剂)；皮质类固醇消炎药(例如，SB203580)；TNF-转变酶抑制剂；抗-IL-12抗体；抗-IL-18抗体；白细胞介素-11(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S296)；白细胞介素-13(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S308)；白细胞介素-17抑制剂(参见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S120)；金；青霉胺；氯喹；苯丁酸氮芥；羟氯喹；环孢菌素；环磷酰胺；全淋巴照射；抗-胸腺细胞球蛋白；抗-CD4抗体；CD5-毒素；经口施用的肽和胶原；氯苯扎利二钠；细胞因子调节剂(CRA)HP228和HP466(Houghten Pharmaceuticals，Inc.)；ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(ISIS2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；强的松；奥古蛋白；糖胺聚糖多硫酸盐；米诺环素；抗-IL2R抗体；海生和植物脂质(鱼和植物种子脂肪酸；参见例如，DeLuca等人(1995)Rheum.Dis.Clin.North Am.21：759-777)；金诺芬；保泰松；甲氯灭酸；氟芬那酸；静脉内免疫球蛋白；弃白通；阿托立平；霉酚酸(RS-61443)；他克莫司(FK-506)；西罗莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(therafectin)；克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷)；氨甲蝶呤；bcl-2抑制剂(参见Bruncko，Milan等人，Journal of Medicinal Chemistry(2007)，50(4)，641-662)；抗病毒剂；和免疫调节剂。

在一个实施例中，结合蛋白或其抗原结合部分与下述试剂之一组合施用用于治疗类风湿性关节炎(RA)：KDR的小分子抑制剂，Tie-2的小分子抑制剂；氨甲蝶呤；强的松；塞来昔布；叶酸；硫酸羟氯喹；洛芬昔布；依那西普；英夫利昔单抗；来氟米特；萘普生；伐地考昔；柳氮磺吡啶；甲基强的松龙；布洛芬；美洛昔康；乙酸甲基强的松龙；硫代苹果酸金钠；阿司匹林；硫唑嘌呤；曲安缩松；萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛；叶酸盐；萘普酮；扶他林；吡罗昔康；依托度酸；双氯酚酸钠；奥沙普嗪；盐酸羟可酮；重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛；双氯酚酸钠/米索前列醇；芬太尼；阿那白滞素，人重组体；盐酸曲马多；双水杨酸酯；舒林酸；氰钴胺素/fa/吡哆醇；扑热息痛；阿仑膦酸钠；强的松龙；硫酸吗啡；盐酸利多卡因；吲哚美辛；硫酸葡糖胺/软骨素；环孢菌素；盐酸阿米替林；磺胺嘧啶；盐酸羟可酮/扑热息痛；盐酸奥洛帕定；米索前列醇；甲氧萘丙酸钠；奥美拉唑；霉酚酸酯；环磷酰胺；利妥昔单抗；IL-1TRAP；MRA；CTLA4-IG；IL-18BP；IL-12/23；抗IL18；抗IL15；BIRB-796；SCIO-469；VX-702；AMG-548；VX-740；罗氟司特；IC-485；CDC-801；和美索普南。

结合蛋白可与之组合用于炎性肠病的治疗剂的非限制性例子包括下述：布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素、柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂肪加氧酶抑制剂；美沙拉嗪；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1βmAb；抗IL-6mAb；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，所述细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF。抗体或其抗原结合部分可与针对细胞表面分子或其配体的抗体组合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90。抗体或其抗原结合部分还可与试剂组合，所述试剂例如氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟米特、NSAID例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰经由促炎细胞因子例如TNFα或IL-1的信号传导的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TNFα转换酶抑制剂、T细胞信号传导抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)和抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)以及bcl-2抑制剂。

其中结合蛋白可组合用于克罗恩氏病的治疗剂的例子包括下述：TNF拮抗剂，例如抗TNF抗体，阿达木单抗(PCT公开号WO97/29131；)，CA2(REMICADE)，CDP571，TNFR-Ig构建体，(p75TNFRIgG和p55TNFRIgG(LENERCEPT^TM))抑制剂和PDE4抑制剂。抗体或其抗原结合部分可与皮质类固醇组合，例如布地奈德和地塞米松。结合蛋白或其抗原结合部分还可与试剂组合，所述试剂例如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉嗪，以及干扰促炎细胞因子例如IL-1合成或作用的试剂，例如IL-1β转换酶抑制剂和IL-1ra。抗体或其抗原结合部分还可与T细胞信号传导抑制剂一起使用，例如，酪氨酸激酶抑制剂6-巯基嘌呤。结合蛋白或其抗原结合部分可与IL-11组合。结合蛋白或其抗原结合部分可与下述试剂组合：美沙拉嗪、强的松、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、英夫利昔单抗、甲基强的松龙琥珀酸钠、地芬诺酯/硫酸阿托品、盐酸洛哌丁胺、氨甲蝶呤、奥美拉唑、叶酸盐、环丙沙星/葡萄糖-水、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、盐酸四环素、氟轻松、甲硝唑、硫柳汞/硼酸、消胆胺/蔗糖、盐酸环丙沙星、硫酸莨菪碱、盐酸哌替啶、盐酸咪达唑、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸异丙嗪、磷酸钠、磺胺甲异唑/甲氧苄啶、塞来昔布、聚卡波非、萘磺酸右丙氧芬、氢化可的松、多种维生素、巴柳氮二钠、磷酸可待因/扑热息痛、盐酸考来维仑、氰钴胺素、叶酸、左氟沙星、甲基强的松龙、那他珠单抗和干扰素γ。

结合蛋白可与之组合用于多发性硬化(MS)的治疗剂的非限制性例子包括下述：皮质类固醇；强的松龙；甲基强的松龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；氨甲蝶呤；4-氨基吡啶；替扎尼定；干扰素-β1a(AVONEX；Biogen)；干扰素-β1b(BETASERON；Chiron/Berlex)；干扰素α-n3)(InterferonSciences/Fujimoto)，干扰素-α(Alfa Wassermann/J&J)，干扰素β1A-IF(Serono/Inhale Therapeutics)，聚乙二醇化干扰素(Peginterferon)α2b(Enzon/Schering-Plough)，共聚物1(Cop-1；COPAXONE；Teva PharmaceuticalIndustries，Inc.)；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨；针对其他人细胞因子或生长因子及其受体的抗体或拮抗剂，所述细胞因子或生长因子及其受体例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF。结合蛋白可与针对细胞表面分子或其配体的抗体组合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90。结合蛋白还可与试剂组合，所述试剂例如氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟米特、NSAID例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰经由促炎细胞因子例如TNFα或IL-1的信号传导的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TACE抑制剂、T细胞信号传导抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13和TGFβ)和bcl-2抑制剂。

其中结合蛋白可组合用于多发性硬化的治疗剂的例子包括干扰素-β，例如IFNβ1a和IFNβ1b；考帕松，皮质类固醇，胱天蛋白酶抑制剂，例如胱天蛋白酶-1抑制剂，IL-1抑制剂，TNF抑制剂，以及针对CD40配体和CD80的抗体。

结合蛋白还可与试剂组合，所述试剂例如阿来组单抗、屈大麻酚、尤迈(Unimed)、达克珠单抗、米托蒽醌、盐酸扎利罗登、4-氨基吡定、乙酸格拉太咪尔、那他珠单抗、辛纳必醇、a-免疫因子NNSO3、ABR-215062、AnergiX.MS、趋化因子受体拮抗剂、BBR-2778、卡拉古林、CPI-1189、LEM(脂质体包封化的米托蒽醌)、THC.CBD(大麻素激动剂)、MBP-8298、美索普南(PDE4抑制剂)、MNA-715、抗IL-6受体抗体、神经素(neurovax)、哌非尼酮allotrap1258(RDP-1258)、sTNF-R1、他仑帕奈、特立氟胺、TGF-β2、替利莫肽、VLA-4拮抗剂(例如，TR-14035、VLA4Ultrahaler、Antegran-ELAN/Biogen)、干扰素γ拮抗剂、IL-4激动剂。

提供了结合蛋白可与之组合用于心绞痛的治疗剂的非限制性例子，并且所述例子包括下述：阿司匹林、硝酸甘油、单硝酸异山梨酯、琥珀酸美托洛尔、阿替洛尔、酒石酸美托洛尔、阿罗地平磺酸盐、盐酸地尔硫硝酸异山梨酯、重硫酸氯吡格雷、硝苯地平、阿托伐他汀钙、氯化钾、呋塞米、斯伐他汀、盐酸维拉帕米、地高辛、盐酸普萘洛尔、卡维地洛、赖诺普利、螺内酯、氢氯噻嗪、马来酸依那普利、纳多洛尔、雷米普利、依诺肝素钠、肝素钠、缬沙坦、盐酸索他洛尔、非诺贝特、依泽替米贝、布美他尼、氯沙坦钾、赖诺普利/氢氯噻嗪、非洛地平、卡托普利、富马酸比索洛尔。

提供了结合蛋白可与之组合用于强直性脊柱炎的治疗剂的非限制性例子，并且所述例子包括下述：布洛芬、扶他林和米索前列醇、萘普生、美洛昔康、吲哚美辛、扶他林、塞来昔布、洛芬昔布、柳氮磺吡啶、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、米诺环素、强的松、依那西普、英夫利昔单抗。

提供了结合蛋白可与之组合用于哮喘的治疗剂的非限制性例子，并且所述例子包括下述：沙丁胺醇、沙美特罗/氟替卡松、孟鲁司特钠、丙酸氟替卡松、布地奈德、强的松、沙美特罗羟萘甲酸盐、盐酸左旋沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇/异丙托铵、强的松龙磷酸钠、曲安缩松、倍氯美松双丙酸酯、异丙托溴铵、阿奇霉素、醋酸吡布特罗、强的松龙、无水茶碱、甲基强的松龙琥珀酸钠、克拉霉素、扎鲁司特、富马酸福莫特罗、流感病毒疫苗、甲基强的松龙、阿莫西林三水合物、氟尼缩松、变态反应注射、色甘酸钠、盐酸非索那丁、氟尼缩松/薄荷醇、阿莫西林/克拉维酸钾、左氟沙星、吸入器辅助装置、愈创木酚甘油醚、地塞米松磷酸钠、盐酸莫西沙星、盐酸多西环素、愈创木酚甘油醚/d-甲吗喃、p-麻黄素/cod/氯苯那敏、加替沙星、盐酸西替立嗪、糠酸莫米他松、沙美特罗羟萘甲酸盐、苯佐那酯、头孢氨苄、pe/二氢可待因酮/氯苯那敏、盐酸西替立嗪/伪麻黄碱、苯福林/cod/异丙嗪、可待因/异丙嗪、头孢罗齐、地塞米松、愈创木酚甘油醚/伪麻黄碱、氯苯那敏/二氢可待因酮、奈多罗米钠、硫酸特布他林、肾上腺素、甲基强的松龙、硫酸间羟异丙肾上腺素。

提供了结合蛋白可与之组合用于COPD的治疗剂的非限制性例子，并且所述例子包括下述：硫酸沙丁胺醇/异丙托铵、异丙托溴铵、沙美特罗/氟替卡松、沙丁胺醇、沙美特罗羟萘甲酸盐、丙酸氟替卡松、强的松、无水茶碱、甲基强的松龙琥珀酸钠、孟鲁司特钠、布地奈德、富马酸福莫特罗、曲安缩松、左氟沙星、愈创木酚甘油醚、阿奇霉素、倍氯美松双丙酸酯、盐酸左旋沙丁胺醇、氟尼缩松、头孢曲松钠、阿莫西林三水合物、加替沙星、扎鲁司特、阿莫西林/克拉维酸钾、氟尼缩松/薄荷醇、氯苯那敏/二氢可待因酮、硫酸间羟异丙肾上腺素、甲基强的松龙、糠酸莫米他松、p-麻黄素/cod/氯苯那敏、醋酸吡布特罗、p-麻黄素/氯雷他定、硫酸特布他林、噻托溴铵、(R,R)-福莫特罗、TgAAT、西洛司特、罗氟司特。

提供了结合蛋白可与之组合用于HCV的治疗剂的非限制性例子，并且所述例子包括下述：干扰素-α-2a、干扰素-α-2b、干扰素-αcon1、干扰素-α-n1、聚乙二醇化干扰素-α-2a、聚乙二醇化干扰素-α-2b、三氮唑核苷、聚乙二醇干扰素α-2b+三氮唑核苷、熊脱氧胆酸、甘草酸、胸腺法新、马克胺(Maxamine)、VX-497以及通过干扰下述靶标用于治疗HCV的任何化合物：HCV聚合酶、HCV蛋白酶、HCV解旋酶、HCV IRES(内部核糖体进入位点)。

提供了结合蛋白可与之组合用于特发性肺纤维化的治疗剂的非限制性例子，并且所述例子包括下述：强的松、硫唑嘌呤、沙丁胺醇、秋水仙碱、硫酸沙丁胺醇、地高辛、γ干扰素、甲基强的松龙琥珀酸钠(sod succ)、劳拉西泮、呋塞米、赖诺普利、硝酸甘油、螺内酯、环磷酰胺、异丙托溴铵、放线菌素d、阿替普酶、丙酸氟替卡松、左氟沙星、硫酸间羟异丙肾上腺素、硫酸吗啡、盐酸羟可酮、氯化钾、曲安缩松、无水他克莫司、钙、干扰素-α、氨甲蝶呤、霉酚酸酯、干扰素-γ-1β。

提供了结合蛋白可与之组合用于心肌梗塞的治疗剂的非限制性例子，并且所述例子包括下述：阿司匹林、硝酸甘油、酒石酸美托洛尔、依诺肝素钠、肝素钠、重硫酸氯吡格雷、卡维地洛、阿替洛尔、硫酸吗啡、琥珀酸美托洛尔、华法令钠、赖诺普利、单硝酸异山梨酯、地高辛、呋塞米、斯伐他汀、雷米普利、替奈普酶、马来酸依那普利、托拉塞米、瑞替普酶、氯沙坦钾、盐酸喹那普利/镁碳水合物(mag carb)、布美他尼、阿替普酶、依那普利拉、盐酸胺碘酮、盐酸替罗非班m-水合物、盐酸地尔硫卡托普利、厄贝沙坦、缬沙坦、盐酸普萘洛尔、福辛普利钠、盐酸利多卡因、依非巴特、头孢唑啉钠、硫酸阿托品、氨基己酸、螺内酯、干扰素、盐酸索他洛尔、氯化钾、多库酯钠、盐酸多巴酚丁胺、阿普唑仑、普伐他丁钠、阿托伐他丁钙、盐酸咪达唑、盐酸哌替啶、硝酸异山梨酯、肾上腺素、盐酸多巴胺、比伐卢定、罗素伐他丁、依泽替米贝/斯伐他汀、阿伐麦布、卡立伯来德。

提供了结合蛋白可与之组合用于牛皮癣的治疗剂的非限制性例子，并且所述例子包括下述：KDR的小分子抑制剂、Tie-2的小分子抑制剂、卡泊三烯、丙酸氯倍他索、曲安缩松、丙酸卤倍他索、他佐罗汀、氨甲蝶呤、氟轻松、增强型二丙酸倍他米松、醋酸氟轻松、阿昔曲丁、焦油(tar)洗发剂、戊酸倍他米松、糠酸莫米他松、酮康唑、丙吗卡因/氟轻松、戊酸氢化可的松、氟羟可舒松、尿素、倍他米松、丙酸氯倍他索/润滑药(emoll)、丙酸氟替卡松、阿奇霉素、氢化可的松、湿润配方、叶酸、丙缩羟强龙、吡美莫司、煤焦油、双醋二氟松、叶酸依那西普、乳酸、8-甲氧基补骨质素、hc/次五倍子酸铋(bismuth subgal)/znox/resor、乙酸甲基强的松龙、强的松、遮光剂、氯氟舒松、水杨酸、蒽地酚、氯可托龙、煤提取物、煤焦油/水杨酸、煤焦油/水杨酸/硫、去羟米松、地西泮、润滑药、氟轻松/润滑药、矿物油/蓖麻油/na lact、矿物油/花生油、石油/肉豆蔻酸异丙酯、补骨脂素、水杨酸、皂/三溴沙仑、硫柳汞/硼酸、塞来昔布、英夫利昔单抗、环孢菌素、阿来塞普、依法利珠单抗、他克莫司、吡美莫司、PUVA、UVB、柳氮磺吡啶。

提供了结合蛋白可与之组合用于牛皮癣性关节炎的治疗剂的非限制性例子，并且所述例子包括下述：氨甲蝶呤、依那西普、洛芬昔布、塞来昔布、叶酸、柳氮磺吡啶、萘普生、来氟米特、乙酸甲基强的松龙、吲哚美辛、硫酸羟氯喹、强的松、舒林酸、增强型二丙酸倍他米松、英夫利昔单抗、氨甲蝶呤、叶酸盐、曲安缩松、扶他林、二甲基亚砜、吡罗昔康、双氯酚酸钠、酮基布洛芬、美洛昔康、甲基强的松龙、萘普酮、托美汀钠、卡泊三烯、环孢菌素、双氯酚酸钠/米索前列醇、氟轻松、硫酸葡糖胺、硫代苹果酸金钠、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、布洛芬、利塞膦酸钠、磺胺嘧啶、硫鸟嘌呤、伐地考昔、阿来塞普、依法利珠单抗和bcl-2抑制剂。

提供了结合蛋白可与之组合用于再狭窄的治疗剂的非限制性例子，并且所述例子包括下述：西罗莫司、紫杉醇、依维莫司、他克莫司、咗他莫司、扑热息痛。

提供了结合蛋白可与之组合用于坐骨神经痛的治疗剂的非限制性例子，并且所述例子包括下述：重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、洛芬昔布、盐酸环苯扎林、甲基强的松龙、萘普生、布洛芬、盐酸羟可酮/扑热息痛、塞来昔布、伐地考昔、乙酸甲基强的松龙、强的松、磷酸可待因/扑热息痛、盐酸曲马多/扑热息痛、美他沙酮、美洛昔康、美索巴莫、盐酸利多卡因、双氯酚酸钠、加巴喷丁、地塞米松、卡立普多、酮咯酸氨基丁三酸醇盐、吲哚美辛、扑热息痛、地西泮、萘普酮、盐酸羟可酮、盐酸替扎尼定、双氯酚酸钠/米索前列醇、萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛、asa/oxycod/羟可酮ter、布洛芬/二氢可待因酮bit、盐酸曲马多、依托度酸、盐酸丙氧芬、盐酸阿米替林、卡立普多/磷酸可待因/asa、硫酸吗啡、多种维生素、甲氧萘丙酸钠、柠檬酸奥芬那君、替马西泮。

提供了其中结合蛋白可组合用于SLE(狼疮)的治疗剂的例子，并且所述例子包括下述：NSAIDS，例如，扶他林、萘普生、布洛芬、吡罗昔康、吲哚美辛；COX2抑制剂，例如，塞来昔布、洛芬昔布、伐地考昔；抗疟药，例如，羟氯喹；类固醇，例如，强的松、强的松龙、布地奈德、地塞米松；细胞毒素，例如，硫唑嘌呤、环磷酰胺、霉酚酸酯、氨甲蝶呤；PDE4抑制剂或嘌呤合成抑制剂，例如骁悉。结合蛋白还可与试剂组合，所述试剂例如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸、奥沙拉嗪、依木兰，以及干扰促炎细胞因子例如IL-1合成、生产或作用的试剂，例如胱天蛋白酶抑制剂，如IL-1β转换酶抑制剂和IL-1ra。结合蛋白还可与T细胞信号传导抑制剂一起使用，例如酪氨酸激酶抑制剂；或靶向T细胞活化分子的分子，例如CTLA-4-IgG或抗B7家族抗体，抗PD-1家族抗体。结合蛋白可与IL-11或抗细胞因子抗体组合，例如芬突利珠单抗(抗IFNg抗体)，或抗受体受体抗体，例如抗IL-6受体抗体和针对B细胞表面分子的抗体。抗体或其抗原结合部分还可与下述试剂一起使用：LJP394(阿贝莫司)，耗尽或灭活B细胞的试剂，例如利妥昔单抗(抗CD20抗体)，淋弗斯特(lymphostat)-B(抗BlyS抗体)，TNF拮抗剂，例如，抗TNF抗体，阿达木单抗(PCT公开号WO97/29131；)，CA2CDP571，TNFR-Ig构建体(p75TNFRIgG和p55TNFRIgG)和bcl-2抑制剂，因为已证实bcl-2在转基因小鼠中的超表达导致狼疮样表型(参见Marquina，Regina等人，Journal of Immunology(2004)，172(11)，7177-7185)，因此预期抑制具有治疗性作用。

药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的抗体或其抗体部分。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需治疗结果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可由本领域技术人员来确定，且可根据下述因素而变，例如个体疾病状态、年龄、性别、和重量，以及抗体或抗体部分在个体中引起所需应答的能力。治疗有效量也是其中治疗有利作用大于抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需预防结果的量。通常地，因为预防剂量在疾病前或疾病早期时在受试者中使用，所以预防有效量将小于治疗有效量。

剂量方案可进行调整以提供最佳所需应答(例如，治疗或预防应答)。例如，可施用快速灌注方式，几个分份剂量可随着时间过去而施用，或剂量可如治疗情形的紧急状态所指示的按比例减少或增加。为了易于施用和剂量一致性，以单位剂型配制肠胃外组合物是特别有利的。术语“单位剂型”指适合作为单一剂量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上不连续单位；每个单位包含与所需药学载体结合的计算为产生所需疗效的预定量的活性化合物。关于单位剂型的详细说明由下述指示且直接取决于下述：(a)活性化合物的独特特征和待达到的具体治疗或预防作用，和(b)配合这种用于治疗个体中敏感性的活性化合物的领域固有的局限性。

应当指出剂量值可依待减轻的病症类型和严重性而变。还应理解对于任何特定受试者，根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断，具体剂量方案应当随着时间过去进行调整，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的，且不希望限制要求保护的组合物的范围或实践。

VIII.诊断

本文公开内容也提供诊断应用。这进一步阐明如下。提供了结合硬化蛋白的抗体，并且所述抗体可以多种形式中的任一种采用，以在体内、体外或离体(即在已得自活个体，实施程序，随后返回个体的细胞或组织中)检测硬化蛋白。DVD结合蛋白提供了能够在多种诊断和检测测定形式中与硬化蛋白的表位以及其他抗原或表位结合的进一步优点。

I.测定方法

本公开内容也提供了使用如本文所述的至少一个抗硬化蛋白结合蛋白或其抗原结合部分包括DVD结合蛋白测定测试样品中硬化蛋白或其片段(“分析物”)的存在、量或浓度的方法。可将本领域已知的任何合适的测定用于该方法。例子包括但不限于免疫测定，例如夹心免疫测定(例如单克隆、多克隆和/或DVD结合蛋白夹心免疫测定或其任何变化(例如单克隆/DVD结合蛋白、DVD结合蛋白/多克隆等)，包括放射性同位素检测(放射免疫测定(RIA))和酶检测(酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)(例如Quantikine ELISA测定，R&D Systems，Minneapolis，MN)))、竞争性抑制免疫测定(例如正向和反向)、荧光偏振免疫测定(FPIA)、酶多重免疫测定技术(EMIT)、生物发光共振能量转移(BRET)和均质化学发光测定等。在基于SELDI的免疫测定中，将特异性结合目的分析物(或其片段)的捕获试剂附着于质谱分析法探针的表面，例如预活化的蛋白芯片阵列。然后将分析物(或其片段)特异性捕获在生物芯片上，并通过质谱分析法检测捕获的分析物(或其片段)。作为另外一种选择，可将分析物(或其片段)从捕获试剂洗脱并通过传统MALDI(基质辅助激光解吸/电离)或通过SELDI检测。化学发光微粒免疫测定，特别是采用自动化分析仪(AbbottLaboratories，Abbott Park，IL)的那种，是免疫测定的例子。

在本公开内容的实践中，使用本领域众所周知的用于采集、处理和加工尿、血液、血清和血浆以及其他体液的方法，例如，当采用如此处所述的抗硬化蛋白结合蛋白作为免疫诊断试剂和/或用于分析物免疫测定试剂盒时。测试样品可除目的分析物之外包含另外的部分，例如抗体、抗原、半抗原、激素、药物、酶、受体、蛋白、肽、多肽、寡核苷酸和/或多核苷酸。例如，样品可以是从受试者获得的全血样品。将测试样品特别是全血在如本文所述的免疫测定之前进行处理(例如，用预处理试剂)可能是必需的或需要的。即使在预处理不是必需的(例如大多数尿样品)的情况中，也任选可进行预处理(例如，作为商业平台上制度的部分)。

预处理试剂可以是适用于免疫测定和试剂盒的任何试剂。预处理任选包含：(a)一种或多种溶剂(例如甲醇和乙二醇)和任选的盐，(b)一种或多种溶剂和盐，以及任选的去污剂，(c)去污剂，或(d)去污剂和盐。预处理试剂是本领域已知的，且可采用此类预处理，例如，用于在Abbott TDx、和分析仪(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)上的测定的那种，如文献所述(参见例如，Yatscoff等人，Abbott TDx Monoclonal AntibodyAssay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood，Clin.Chem.36：1969-1973(1990)，以及Wallemacq等人，Evaluation of the New AxSYMCyclosporine Assay：Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood andEMIT Cyclosporine Assays，Clin.Chem.45：432-435(1999))，和/或可通过商业途径获得的。另外，可如Abbott的美国专利号5,135,875；欧洲专利公开号0471293；PCT公开号WO2008/082984；以及美国专利申请公开号2008/0020401中所述完成预处理。预处理试剂可以是异质试剂或均质试剂。

使用异质预处理试剂，预处理试剂沉淀样品中存在的分析物结合蛋白(例如，可结合分析物或其片段的蛋白)。此类预处理步骤包括通过向样品添加预处理试剂将形成的混合物上清液从沉淀的分析物结合蛋白分离，来取出任何分析物结合蛋白。在此类测定中，将不存在任何结合蛋白的混合物上清液用于测定中，直接进行到抗体捕获步骤。

使用均质预处理试剂时，没有此类分离步骤。使测试样品和预处理试剂的全部混合物与标记的对于分析物(或其片段)特异性的结合配偶体例如标记的抗分析物抗体(或其抗原反应性片段)接触。在由第一特异性结合配偶体捕获之前或期间，这种测定中采用的预处理试剂通常在预处理的测试样品混合物中得到稀释。尽管有此类稀释，但一定量的预处理试剂在捕获期间依然存在(或保留)于测试样品混合物中。示例性标记的特异性结合配偶体可以是DVD结合蛋白(或其片段、变体或变体的片段)。

在异质形式中，从受试者获得测试样品后，制备第一混合物。该混合物含有在分析物(或其片段)方面进行评价的测试样品和第一特异性结合配偶体，其中第一特异性结合配偶体和测试样品中含有的任何分析物形成第一特异性结合配偶体-分析物复合物。在一个实施例中，第一特异性结合配偶体是抗分析物抗体或其片段。第一特异性结合配偶体可以是如本文所述的DVD结合蛋白(或其片段、变体、或变体的片段)。添加测试样品和第一特异性结合配偶体以形成混合物的顺序并不关键。在一个实施例中，将第一特异性结合配偶体固定化在固相上。在免疫测定中使用(用于第一特异性结合配偶体，以及任选第二特异性结合配偶体)的固相可以是本领域已知的任何固相，例如但不限于磁性颗粒、珠子、试管、微量滴定板、杯、膜、支架分子、薄膜、滤纸、盘和芯片。

形成含有第一特异性结合配偶体-分析物复合物的混合物后，使用本领域已知的任何技术将任何未结合的分析物从复合物去除。例如，可通过洗涤将未结合的分析物去除。然而，理想地，第一特异性结合配偶体以多于存在的任何分析物的量存在于测试样品中，使得存在于测试样品中的所有分析物由第一特异性结合配偶体结合。

去除任何未结合的分析物后，将第二特异性结合配偶体加入混合物以形成第一特异性结合配偶体-分析物-第二特异性结合配偶体复合物。第二特异性结合配偶体例如是与分析物上的表位结合的抗分析物抗体，所述表位不同于第一特异性结合配偶体结合的分析物上的表位。此外，在一个实施例中，第二特异性结合配偶体用如上所述的可检测标记进行标记有或含有如上所述的可检测标记。第二特异性结合配偶体可以是如本文所述的DVD结合蛋白(或其片段、变体、或变体的片段)。

可使用本领域已知的任何合适的可检测标记。例如，可检测标记可以是放射性标记(例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、³²P和³³P)、酶促标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡糖6-磷酸脱氢酶等)、化学发光标记(例如吖啶鎓酯、硫酯、或磺胺；鲁米诺、异鲁米诺、菲啶鎓酯等)、荧光标记(例如荧光素(例如5-荧光素、6-羧基荧光素、3’6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等))、罗丹明、藻胆蛋白、R-藻红蛋白、量子点(例如硫化锌封端的硒化镉)、温度测量标记、或免疫-聚合酶链反应标记。标记、标记程序和标记的检测的介绍见于Polak和Van Noorden，Introduction to Immunocytochemistry，第2版，Springer Verlag，N.Y.(1997)，以及Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals(1996)，其是由Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon出版的组合手册和目录。荧光标记可用于FPIA(参见例如，美国专利号5,593,896、5,573,904、5,496,925、5,359,093、和5,352,803)。吖啶鎓化合物可在均质或异质化学发光测定中用作可检测标记(参见例如，Adamczyk等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.16:1324-1328(2006)；Adamczyk等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.4:2313-2317(2004)；Adamczyk等人，Biorg.Med.Chem.Lett.14:3917-3921(2004)；和Adamczyk等人，Org.Lett.5:3779-3782(2003))。

示例性吖啶鎓化合物是吖啶鎓-9-甲酰胺。用于制备吖啶鎓-9-甲酰胺的方法在下述中描述：Mattingly,J.Biolumin.Chemilumin.6:107-114(1991)；Adamczyk等人，J.Org.Chem.,63:5636-5639(1998)；Adamczyk等人，Tetrahedron,55:10899-10914(1999)；Adamczyk等人，Org.Lett.,1:779-781(1999)；Adamczyk等人，Bioconjugate Chem.,11:714-724(2000)；Mattingly等人，在Luminescence Biotechnology:Instruments and Applications中；Dyke,K.V.编辑；CRC Press:Boca Raton，第77–105页(2002)；Adamczyk等人，Org.Lett.,5:3779-3782(2003)；以及美国专利号5,468,646,5,543,524和5,783,699。另一种示例性吖啶鎓化合物是吖啶鎓-9-羧酸芳基酯。吖啶鎓-9-羧酸芳基酯的例子是10-甲基-9-(苯氧羰基)吖啶鎓氟磺酸盐(可得自CaymanChemical，Ann Arbor，MI)。在McCapra等人，Photochem.Photobiol.4：1111-21(1965)；Razavi等人，Luminescence15：245-249(2000)；Razavi等人，Luminescence15：239-244(2000)；以及美国专利号5,241,070中描述了用于制备吖啶鎓-9-羧酸芳基酯的方法。在US2008-0248493中阐述了关于吖啶鎓-9-羧酸芳基酯及其用途的其他细节。

可依照Adamczyk等人，Anal.Chim.Acta,579(1)：61-67(2006)中所述的方法实施化学发光测定(例如，使用如上所述的吖啶鎓或其他化学发光剂)。虽然可使用任何合适的测定形式，但微量培养板化学发光分析仪(Mithras LB-940，Berthold Technologies U.S.A.，LLC，Oak Ridge，TN)使小体积的多样品快速测定成为可能。

添加测试样品和特异性结合配偶体以形成用于化学发光测定的混合物的顺序并不关键。如果第一特异性结合配偶体用化学发光剂例如吖啶鎓化合物进行可检测地标记，则形成可检测地标记的第一特异性结合配偶体-分析物复合物。作为另外一种选择，如果使用第二特异性结合配偶体，而且第二特异性结合配偶体用化学发光剂例如吖啶鎓化合物进行可检测地标记，则形成可检测地标记的第一特异性结合配偶体-分析物-第二特异性结合配偶体复合物。无论标记与否，任何未结合特异性结合配偶体都可使用本领域已知的任何技术例如洗涤从混合物去除。

可在添加上述吖啶鎓化合物之前、同时或之后，在混合物中原位生成过氧化氢、或为混合物提供或补充过氧化氢(例如，过氧化氢的来源为已知含有过氧化氢的一种或多种缓冲液或其他溶液)。可以许多方法原位生成过氧化氢，如对于本领域技术人员显而易见的。

在同时或随后将至少一种碱性溶液添加到样品时，生成指示分析物存在的可检测信号，即化学发光信号。碱性溶液含有至少一种碱，并且具有高于或等于10、例如大于或等于12的pH。碱性溶液的例子包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铵、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钙、碳酸钙、和碳酸氢钙。加入样品的碱性溶液的量取决于碱性溶液的浓度。根据使用的碱性溶液的浓度，本领域技术人员可容易地测定加入样品的碱性溶液的量。

可使用本领域技术人员已知的常规技术检测生成的化学发光信号。基于生成的信号强度，可定量样品中分析物的量。具体而言，样品中分析物的量与生成的信号强度成比例。可通过将生成的光的量与关于分析物的标准曲线进行比较或通过与参考标准进行比较定量存在的分析物的量。可使用连续稀释或已知浓度的分析物溶液，通过质谱分析法、重量分析方法和其他本领域已知技术生成标准曲线。尽管上文重点描述了使用吖啶鎓化合物作为化学发光剂，但本领域普通技术人员可容易使该描述适应于其他化学发光剂的使用。

一般可使用本领域已知的任何形式进行分析物免疫测定，例如，但不限于夹心形式。具体而言，在一种免疫测定形式中，采用至少两种抗体来分离和定量样品中的分析物例如人分析物，或其片段。更具体而言，所述至少两种抗体结合分析物(或其片段)上的不同表位，从而形成免疫复合物，将其称为“夹心”。一般地，在免疫测定中，可将一种或多种抗体用于捕获测试样品中的分析物(或其片段)(通常将这些抗体称为“捕获”抗体)，并且可将一种或多种抗体用于将可检测的(即可定量的)标记结合到夹心(常常将这些抗体称为“检测抗体”或“缀合物”)。因此，在夹心免疫测定形式的背景中，如本文所述的DVD结合蛋白(或其片段、变体、或变体的片段)可用作捕获抗体、检测抗体或二者。例如，一种具有可结合分析物(或其片段)上第一表位的结构域的DVD结合蛋白可用作捕获抗体，和/或另一种具有可结合分析物(或其片段)上第二表位的结构域的DVD结合蛋白可用作检测抗体。在这点上，具有可结合分析物(或其片段)上第一表位的第一结构域以及可结合分析物(或其片段)上第二表位的第二结构域的DVD结合蛋白可用作捕获抗体和/或检测抗体。作为另外一种选择，一种具有可结合第一分析物(或其片段)上表位的第一结构域以及可结合第二分析物(或其片段)上表位的第二结构域的DVD结合蛋白可用作捕获抗体和/或检测抗体，以检测并任选定量两种或更多种分析物。在分析物可以多于一种形式(例如单体形式和二聚体/多聚体形式，其可为同聚体的或异聚体的)存在于样品中的情况下，一种具有可结合仅暴露于单体形式上的表位的结构域的DVD结合蛋白、以及另一种具有可结合二聚体/多聚体形式不同部分上的表位的结构域的DVD结合蛋白，可用作捕获抗体和/或检测抗体，由此使给定分析物的不同形式的检测和任选的定量成为可能。另外，采用在单个DVD结合蛋白内和/或在DVD结合蛋白之间具有不同亲和力的DVD结合蛋白可提供亲合力优势。在如本文所述的免疫测定的背景中，在DVD结合蛋白结构中整合一种或多种接头一般可能是有益的或需要的。当存在时，最佳的是，接头应该具有足够的长度和结构灵活性，以使得能够通过内部结构域结合表位以及通过外部结构域结合另一个表位。在这点上，如果DVD结合蛋白可结合两个不同的分析物，且一个分析物大于另一个，则理想的是由外部结构域结合较大的分析物。

一般而言，可使对于(例如怀疑含有)SOST蛋白质(或其片段)进行测试的样品与至少一个捕获抗体(或多个抗体)和至少一个检测抗体(其可以是第二检测抗体或第三检测抗体或甚至连续编号的抗体，例如在捕获和/或检测抗体包含多个抗体时)同时或序贯且以任何顺序接触。例如，可使测试样品首先与至少一个捕获抗体、且然后(序贯)与至少一个检测抗体接触。作为另外一种选择，使测试样品首先与至少一个检测抗体、且然后(序贯)与至少一个捕获抗体接触。在另一个替代形式中，可使测试样品同时与捕获抗体和检测抗体接触。

在夹心测定形式中，首先使怀疑含有SOST(或其片段)的样品在允许形成第一结合蛋白/SOST复合物的条件下与至少一个第一捕获结合蛋白(例如SOST抗体)接触。如果使用多于一个捕获结合蛋白，则形成包含两个或更多个捕获结合蛋白的第一捕获结合蛋白/SOST复合物。在夹心测定中，以测试样品中预期的SOST分析物(或其片段)的最大量的摩尔过量的量使用结合蛋白，即，例如至少一个捕获结合蛋白。例如，可使用约5μg到约1mg抗体/mL缓冲液(例如，微粒包被缓冲液)。

竞争性抑制免疫测定包含序贯和经典形式，所述竞争性抑制免疫测定常用于测量小分析物，这是因为要求仅由一个抗体结合。在序贯竞争性抑制免疫测定中，将针对硬化蛋白的捕获结合蛋白包被在微量滴定板的孔或其他固体支持物上。当将含有硬化蛋白的样品添加到孔中时，硬化蛋白与捕获结合蛋白结合。洗涤后，将已知量的标记的(例如，生物素或辣根过氧化物酶(HRP))硬化蛋白添加到孔中。酶促标记的底物是生成信号所必需的。合适的HRP底物的例子是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。洗涤后，测量由标记的分析物生成的信号，并且其与样品中的硬化蛋白的量成反比。在经典竞争性抑制免疫测定中，将针对硬化蛋白的结合蛋白包被在固体支持物(例如微量滴定板的孔)上。然而，与序贯竞争性抑制免疫测定不同，将样品和标记的硬化蛋白同时添加到孔中。样品中的任何硬化蛋白与标记的硬化蛋白竞争结合捕获结合蛋白。洗涤后，测量由标记的硬化蛋白生成的信号，并且其与样品中的硬化蛋白的量成反比。

任选地，在测试样品与至少一个捕获结合蛋白(例如，第一捕获抗体)接触之前，可将所述至少一个捕获结合蛋白结合在固体支持物上，这促进第一结合蛋白/硬化蛋白(或其片段)复合物从测试样品的分离。捕获结合蛋白结合的基质可以是促进捕获抗体-分析物复合物从样品分离的任何合适的固体支持物或固相。

例子包括板(例如微量滴定板)的孔、试管、多孔凝胶(例如，硅胶、琼脂糖、葡聚糖或明胶)、聚合物膜(例如，聚丙烯酰胺)、珠子(例如，聚苯乙烯珠子或磁珠)、过滤器/膜(例如硝化纤维素或尼龙)的条、微粒(例如胶乳粒子、可磁化微粒(例如具有氧化铁或三氧化二铬核以及均聚或杂聚涂层且半径约1-10微米的微粒)。基质可包含合适的多孔材料，所述多孔材料具有合适的表面亲和力以结合抗原以及足够的孔隙率以允许检测抗体接近。尽管可使用水合状态下的胶状材料，但一般优选微孔性材料。此类多孔基质例如是厚度约0.01至约0.5mm、例如约0.1mm的片形式。尽管孔径可有相当大的变化，但例如孔径为约0.025至约15微米、例如约0.15至约15微米。可通过引起抗体与基质的共价键合的化学方法活化此类基质的表面。一般通过疏水性力吸附，产生抗原或抗体与基质的不可逆结合；作为另外一种选择，可使用化学偶联剂或其他方法将抗体与基质共价结合，如果此类结合不干扰抗体结合分析物的能力的话。作为另外一种选择，可将抗体与微粒结合，其中微粒已经预先用链霉抗生物素蛋白(例如Magnetic Beads，Invitrogen，Carlsbad，CA)或生物素(例如，使用Power-BindTM-SA-MP链霉抗生物素蛋白包被的微粒(Seradyn，Indianapolis，IN))或抗物种特异性单克隆抗体包被。如果需要，则可将基质衍生化以允许与抗体上的多种官能团的反应性。此类衍生化要求使用某些偶联剂，其例子包括但不限于马来酐、N-羟基琥珀酰亚胺、以及1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺。如果需要，则可将一种或多种捕获试剂(例如各自对一种或多种分析物特异的抗体(或其片段))附着在固相上不同的物理或可访问的位置(例如，生物芯片构型(参见例如美国专利号6,225,047；PCT公开号WO99/51773；美国专利号6,329,209；PCT公开号WO00/56934；和美国专利号5,242,828)。如果将捕获试剂附着在作为固体支持物的质谱分析法探针上，则可通过激光解吸电离质谱分析法检测与探针结合的分析物的量。作为另外一种选择，单个柱可填充不同的珠子，其用一种或多种捕获试剂衍生化，由此在单个位置捕获分析物(参见，抗体衍生的基于珠子的技术，例如Luminex的xMAP技术(Austin，TX))。

使对于分析物(或其片段)进行测定的测试样品与至少一个捕获抗体(例如第一捕获抗体)接触后，温育混合物以允许第一抗体(或多个抗体)-分析物(或其片段)复合物的形成。温育可在约4.5至约10.0的pH、约2℃至约45℃的温度下实施至少约一(1)分钟至约十八(18)小时的时间段，例如约1至约24分钟，例如约4至约18分钟。可在一个步骤(指将测试样品、至少一个捕获抗体和至少一个检测抗体都序贯或同时加入反应容器)或多于一个步骤(例如两个步骤、三个步骤等)中进行本文所述的免疫测定。

在形成(第一或多个)捕获抗体/分析物(或其片段)复合物后，然后在允许形成(第一或多个)捕获抗体/分析物(或其片段)/第二检测抗体复合物的条件下，使该复合物与至少一个检测抗体接触。尽管为了清楚起见说明为“第二”抗体(例如第二检测抗体)，但事实上，在将多个抗体用于捕获和/或检测时，所述至少一个检测抗体可以是第二、第三、第四等用于该免疫测定的抗体。如果使捕获抗体/分析物(或其片段)复合物与多于一个检测抗体接触，则形成(第一或多个)捕获抗体/分析物(或其片段)/(多个)检测抗体复合物。与捕获抗体(例如第一捕获抗体)一样，当使所述至少一个(例如第二和任意后来的)检测抗体与捕获抗体/分析物(或其片段)复合物接触时，要求在与上述条件类似的条件下温育一段时间，以形成(第一或多个)捕获抗体/分析物(或其片段)/(第二或多个)检测抗体复合物。在一个实施例中，至少一个检测抗体含有可检测标记。可检测标记可在形成(第一或多个)捕获抗体/分析物(或其片段)/(第二或多个)检测抗体复合物之前、同时、或之后与所述至少一个检测抗体(例如第二检测抗体)结合。可使用本领域已知的任何可检测标记(参见上述讨论，包括Polak和VanNoorden(1997)以及Haugland(1996)参考文献)。

可将可检测标记直接或通过偶联剂与抗体结合。可使用的偶联剂的例子是EDAC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺，氢氯化物)，其可通过商业途径从Sigma-Aldrich，St.Louis，MO获得。本领域已知其他可使用的偶联剂。本领域已知用于将可检测标记与抗体结合的方法。另外，可采购或合成许多可检测标记，其已经含有促进可检测标记与抗体偶联的末端基团，例如CPSP-吖啶鎓酯(即，9-[N-甲苯磺酰基-N-(3-羧丙基)]-10-(3-磺丙基)吖啶鎓甲酰胺)或SPSP-吖啶鎓酯(即N10-(3-磺丙基)-N-(3-磺丙基)-吖啶鎓-9-甲酰胺)。

(第一或多个)捕获抗体/分析物/(第二或多个)检测抗体复合物可但不必须在对标记定量之前从测试样品的剩余物中分离。例如，如果所述至少一个捕获抗体(例如第一捕获抗体)与固体支持物(例如孔或珠子)结合，则可通过去除(测试样品的)流体与固体支持物的接触而实现分离。作为另外一种选择，如果所述至少第一捕获抗体与固体支持物结合，则其可同时与含有分析物的样品和所述至少一个第二检测抗体接触，以形成第一(多个)抗体/分析物/第二(多个)抗体复合物，随后去除流体(测试样品)与固体支持物的接触。如果所述至少一个第一捕获抗体没有与固体支持物结合，则不需要为了定量标记的量而将(第一或多个)捕获抗体/分析物/(第二或多个)检测抗体复合物从测试样品去除。

在形成标记的捕获抗体/分析物/检测抗体复合物(例如第一捕获抗体/分析物/第二检测抗体复合物)后，使用本领域已知技术对复合物中标记的量进行定量。例如，如果使用酶促标记，则标记的复合物与对于标记的底物反应，这给出可定量的反应，例如显色。如果标记是放射性标记，则使用适当的工具例如闪烁计数器定量标记。如果标记是荧光标记，则通过用一种颜色的光(称为“激发波长”)刺激标记，并检测标记响应刺激而发射的另一种颜色(称为“发射波长”)，来定量标记。如果标记是化学发光标记，则通过目视或通过使用发光计、x光胶片、高速照相胶片、CCD照相机等检测发射的光而定量标记。一旦已对复合物中的标记的量进行了定量，就可通过适当的方法测定测试样品中分析物或其片段的浓度，例如通过使用标准曲线，所述标准曲线是利用已知浓度的分析物或其片段的连续稀释生成的。除了使用分析物或其片段的连续稀释，可通过重量分析法、质谱分析法和其他本领域已知技术生成标准曲线。

在采用分析仪的化学发光微粒测定中，缀合物稀释剂pH应为约6.0+/-0.2，微粒包被缓冲液应维持于约室温(即，从约17至约)下，微粒包被缓冲液pH应为约6.5+/-0.2，且微粒稀释剂pH应为约7.8+/-0.2。在一个实施例中，固体为小于约0.2％，例如小于约0.15％、小于约0.14％、小于约0.13％、小于约0.12％，或小于约0.11％，例如约0.10％。

FPIA基于竞争性结合免疫测定原理。当由线性偏振光激发时，荧光标记的化合物将发射具有一定偏振程度的荧光，该程度与其旋转速度成反比。当通过线性偏振光激发荧光标记的示踪物-抗体复合物时，发射的光保持高度偏振化，这是因为荧光团受光吸收时间和光发射时间之间旋转的限制。当“游离”示踪化合物(即，没有与抗体结合的化合物)由线性偏振光激发时，其旋转远快于在竞争性结合免疫测定中产生的相应的示踪物-抗体缀合物。FPIA比RIA有优势，这是因为没有要求特殊处理和处置的放射性物质。另外，FPIA是可容易地且快速执行的均质测定。

考虑到上述情况，提供了测定测试样品中分析物(或其片段)的存在、量或浓度的方法。该方法包含通过如下测定对测试样品测定分析物(或其片段)，所述测定(i)采用(i’)至少一个抗体、可结合分析物的抗体片段、可结合分析物的抗体变体、可结合分析物的抗体变体的片段、以及可结合分析物的DVD结合蛋白(或其片段、变体、或变体的片段)，以及(ii’)至少一个可检测标记，以及(ii)包括将测试样品中由可检测标记生成的、作为分析物(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号，与对照或校准物中生成的、作为分析物(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号进行比较。校准物任选是一系列校准物的部分，其中每个校准物通过分析物浓度而不同于其他校准物。

该方法可包括(i)使测试样品与关于下述的至少一个第一特异性结合配偶体接触：抗体的分析物(或其片段)、可结合分析物的抗体片段、可结合分析物的抗体变体、可结合分析物的抗体变体的片段、或可结合分析物的DVD结合蛋白(或其片段、变体、或变体的片段)，以便形成第一特异性结合配偶体/分析物(或其片段)复合物，(ii)使第一特异性结合配偶体/分析物(或其片段)复合物与关于下述的至少一个第二特异性结合配偶体接触：可检测地标记的抗分析物抗体的分析物(或其片段)、可结合分析物的可检测地标记的抗分析物抗体片段、可结合分析物的可检测地标记的抗分析物抗体变体、可结合分析物的可检测地标记的抗分析物抗体变体的片段、或可检测地标记的DVD结合蛋白(或其片段、变体、或变体的片段)，以便形成第一特异性结合配偶体/分析物(或其片段)/第二特异性结合配偶体复合物，以及(iii)通过检测或测量(ii)中形成的第一特异性结合配偶体/分析物(或其片段)/第二特异性结合配偶体复合物中由可检测标记生成的信号，测定测试样品中分析物的存在、量或浓度。这样的方法可以是优选的，在该方法中，对于分析物(或其片段)的至少一个第一特异性结合配偶体和/或对于分析物(或其片段)的至少一个第二特异性结合配偶体是如本文所述的DVD结合蛋白(或其片段、变体、或变体的片段)。

作为另外一种选择，该方法可包括使测试样品与关于下述的至少一个第一特异性结合配偶体接触：抗体的SOST分析物(或其片段)、可结合分析物的抗体片段、可结合分析物的抗体变体、可结合分析物的抗体变体的片段、或DVD结合蛋白(或其片段、变体、或变体的片段)，并同时或以任何顺序序贯使测试样品与至少一个第二特异性结合配偶体接触，所述至少一个第二特异性结合配偶体可与分析物(或其片段)竞争结合至少一个第一特异性结合配偶体，并且是可检测地标记的分析物、可结合第一特异性结合配偶体的可检测地标记的分析物片段、可结合第一特异性结合配偶体的可检测地标记的分析物变体、或可结合第一特异性结合配偶体的可检测地标记的分析物变体的片段。存在于测试样品中的任何SOST(或其片段)以及所述至少一个第二特异性结合配偶体彼此竞争，以分别形成第一特异性结合配偶体/分析物(或其片段)复合物和第一特异性结合配偶体/第二特异性结合配偶体复合物。该方法还包括通过检测或测量(ii)中形成的第一特异性结合配偶体/第二特异性结合配偶体复合物中由可检测标记生成的信号，测定测试样品中分析物的存在、量或浓度，其中第一特异性结合配偶体/第二特异性结合配偶体复合物中由可检测标记生成的信号与测试样品中分析物的量或浓度成反比。

上文方法还可包括对从其获得测试样品的患者诊断、预后、或评价治疗性/预防性处理的功效。如果该方法还包括对从其获得测试样品的患者评价治疗性/预防性处理的功效，则该方法任选还包括根据需要修改患者的治疗性/预防性处理以改善功效。可调整该方法以用于自动化系统或半自动化系统。

关于测定方法(及其试剂盒)，可能采用可通过商业途径获得的抗分析物抗体或如文献所述用于制备抗分析物的方法。多种抗体的商业供应包括但不限于Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz,CA)、GenWay Biotech,Inc.(San Diego,CA)、和R&D Systems(RDS；Minneapolis,MN)。

一般地，可采用预定水平作为基准点，针对所述基准点对测定测试样品的分析物或其片段后所获结果进行评价，例如，用于检测疾病或疾病危险。一般地，在作出这种比较中，通过将具体测定运行足够次数且在适当的条件下获得预定水平，使得可作出分析物的存在、量或浓度与疾病、障碍或病症的特定阶段或终点、或与具体临床标记之间的联系或关联。通常地，使用参考受试者(或受试者群体)的测定获得预定水平。测量的分析物可包括其片段、其降解产物、和/或其酶切产物。

特别地，关于如用于监控疾病进展和/或治疗的预定水平，分析物或其片段的量或浓度可以是“无变化的”、“有利的”(或“有利改变的”)、或“不利的”(或“不利改变的”)。“升高的”或“增加的”指测试样品中的量或浓度高于通常或正常水平或范围(例如预定水平)、或高于另一个参考水平或范围(例如较早或基线样品)。术语“降低的”或“减少的”指测试样品中的量或浓度低于通常或正常水平或范围(例如预定水平)、或低于另一个参考水平或范围(例如较早或基线样品)。术语“改变的”指样品中的量或浓度比起通常或正常水平或范围(例如预定水平)来、或比起另一个参考水平或范围(例如较早或基线样品)来改变(增加或减少)。

根据标准实践定义关于分析物的通常或正常水平或范围。因为分析物水平在一些情况下将会非常低，所以当与通常或正常水平或范围、或参考水平或范围相比，存在不能由实验误差或样品差异解释的任何净变化时，可考虑出现了所谓的变化水平或变化。因此，在特定样品中测量的水平将与来自所谓的正常受试者的类似样品中测定的水平或水平范围进行比较。在此背景中，分别地，“正常受试者”是例如没有可检测的疾病的个体，而“正常”(有时称为“对照”)患者或群体分别是例如没有表现可检测疾病的那些。另外，已知不会在大多数人群中常规发现高水平分析物，可将“正常受试者”认为是分析物的量或浓度无相当大的可检测的增加或升高的个体，而“正常”(有时称为“对照”)患者或群体是表现出分析物的量或浓度无相当大的可检测的增加或升高的那些。“表观正常受试者”是其中的分析物尚未进行评价或当前正在进行评价的受试者。当分析物正常不可检测(例如，正常水平是零，或在正常群体的约25至约75百分位范围内)，但是在测试样品中可检测时，以及当分析物以高于正常水平存在于测试样品中时，称该分析物水平是“升高的”。因此，尤其地，本公开内容提供了筛选患有特定疾病、障碍或病症，或者处于患有特定疾病、障碍或病症的危险中的受试者的方法。测定方法还可涉及其他标记的测定等等。

相应地，本文所述方法也可用于测定受试者是否患有给定疾病、障碍或病症，或者处于发展给定疾病、障碍或病症的危险中。具体地，此类方法可包括步骤：

(a)测定来自受试者的测试样品中硬化蛋白(或其片段)的浓度或量(例如使用本文所述方法或本领域已知方法)；和

(b)将步骤(a)中测定的硬化蛋白(或其片段)的浓度或量与预定水平比较，其中，如果步骤(a)中测定的分析物的浓度或量相对于预定水平是有利的，则将该受试者测定为未患有给定疾病、障碍或病症，或者没有给定疾病、障碍或病症的危险。然而，如果步骤(a)中测定的硬化蛋白的浓度或量相对于预定水平是不利的，则将该受试者测定为患有给定疾病、障碍或病症，或者具有给定疾病、障碍或病症的危险。

另外，本文提供了监控受试者中疾病进展的方法。最佳地，该方法包括步骤：

(a)测定来自受试者的测试样品中硬化蛋白的浓度或量；

(b)测定来自受试者的较晚测试样品中SOST的浓度或量；和

(c)将步骤(b)中测定的分析物的浓度或量与步骤(a)中测定的硬化蛋白的浓度或量比较，其中，如果当与步骤(a)中测定的硬化蛋白的浓度或量比较时，步骤(b)中测定的浓度或量是无变化的或是不利的，则测定受试者中的疾病继续、进展或恶化。比较而言，如果当与步骤(a)中测定的硬化蛋白的浓度或量比较时，步骤(b)中测定的硬化蛋白的浓度或量是有利的，则测定受试者中的疾病停止、消退或改善。

任选地，该方法还包括例如将步骤(b)中测定的硬化蛋白分析物的浓度或量与预定水平进行比较。另外，如果比较显示，例如步骤(b)中测定的分析物的浓度或量相对于预定水平不利地改变，则该方法任选包括用一种或多种药物组合物对受试者治疗一段时间。

再进一步地，该方法可用于在接收用一种或多种药物组合物治疗的受试者中监控治疗。具体而言，此类方法涉及提供对受试者施用一种或多种药物组合物之前来自受试者的第一个测试样品。接下来，测定来自受试者的第一个测试样品中硬化蛋白的浓度或量(例如，使用本文所述或本领域已知的方法)。测定硬化蛋白的浓度或量后，任选将硬化蛋白的浓度或量与预定水平进行比较。如果在第一个测试样品中测定的硬化蛋白的浓度或量低于预定水平，则不对该受试者用一种或多种药物组合物治疗。然而，如果在第一个测试样品中测定的硬化蛋白的浓度或量高于预定水平，则用一种或多种药物组合物对该受试者治疗一段时间。本领域技术人员可测定用一种或多种药物组合物对该受试者治疗的时间段(例如该时间段可从约七(7)天到约两年，例如从约十四(14)天到约一(1)年)。

在用一种或多种药物组合物治疗过程期间，然后从受试者获得第二个和后续的测试样品。从受试者获得所述测试样品的测试样品数目和时间并不关键。例如，第二个测试样品可在首次对受试者施用一种或多种药物组合物后七(7)天获得，第三个测试样品可在首次对受试者施用一种或多种药物组合物后两(2)周获得，第四个测试样品可在首次对受试者施用一种或多种药物组合物后三(3)周获得，第五个测试样品可在首次对受试者施用一种或多种药物组合物后四(4)周获得等。

从受试者获得每个第二个或后续测试样品后，测定第二个或后续测试样品中硬化蛋白分析物的浓度或量(例如，使用本文所述或本领域已知的方法)。然后将第二个和后续测试样品每一个中测定的硬化蛋白的浓度或量与第一个测试样品(例如，最初任选与预定水平进行比较的测试样品)中测定的分析物的浓度或量进行比较。如果当与步骤(a)中测定的分析物的浓度或量比较时，步骤(c)中测定的硬化蛋白的浓度或量是有利的，则测定受试者中的疾病停止、消退或改善，且应当对受试者继续施用步骤(b)的所述一种或药物组合物。然而，如果当与步骤(a)中测定的分析物的浓度或量比较时，步骤(c)中测定的浓度或量无变化或是不利的，则测定受试者中的疾病继续、进展或恶化，且应当用更高浓度的步骤(b)中对受试者施用的所述一种或多种药物组合物治疗受试者，或者应当用不同于步骤(b)中对受试者施用的所述一种或多种药物组合物的一种或多种药物组合物治疗受试者。具体而言，可用下述一种或多种药物组合物治疗受试者，所述一种或多种药物组合物不同于受试者以前为了减少或降低所述受试者分析物水平而接收的一种或多种药物组合物。

一般地，对于可能进行重复测试的测定(例如，监控疾病进展和/或对治疗的反应)，在已从受试者获得第一个测试样品后及时在一段时间获得第二个或后续的测试样品。具体而言，可在已从受试者获得第一个测试样品后的数分钟、数小时、数天、数周或数年获得来自受试者的第二个测试样品。例如，可在从受试者获得第一个测试样品后的如下时间段从受试者获得第二个测试样品：约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5.年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年。

当用于监控疾病进展时，上述测定可用于在患有急性病症的受试者中监控疾病进展。急性病症，也称为病危护理病症，指涉及例如心血管系统或排泄系统的急性、威胁生命的疾病或其他危急医学病症。一般，病危护理病症指那些需要在基于医院的背景(包括但不限于急诊室、重症监护病房、创伤中心、或其他急救护理背景)中的急性医学干预或通过随行医务人员或其他现场医学人员管理的那些病症。对于病危护理病症，通常在较短的时间范围内进行重复监控，所述较短的时间范围即数分钟、数小时或数天(例如，约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天)，而最初的测定同样一般在较短的时间范围(例如疾病或病症发作约数分钟、数小时或数天)之内完成。

该测定也可用于在患有慢性或非急性病症的受试者中监控疾病进展。非病危护理或非急性病症指涉及例如心血管系统和/或排泄系统的急性、威胁生命的疾病或其他危急医学病症以外的病症。通常地，非急性病症包括具有长期或慢性持续时间的那些。对于非急性病症，一般在较长的时间范围内进行重复监控，例如数小时、数天、数周、数月或数年(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5.年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年)，而初始测定同样一般在较长时间范围内完成，例如疾病或病症发作的约数小时、数天、数月或数年。

此外，可使用从受试者获得的第一个测试样品实施上述测定，其中第一个测试样品获得自一个来源，例如尿、血清或血浆。任选地，然后可使用从受试者获得的第二个测试样品重复上述测定，其中所述第二个测试样品获得自另一个来源。例如，如果从尿获得第一个测试样品，则可从血清或血浆获得第二个测试样品。可比较从使用第一个测试样品和第二个测试样品的测定获得的结果。可将该比较用于评价受试者中的疾病或病症状态。

此外，本公开内容也涉及测定倾向于或罹患给定疾病、障碍或病症的受试者是否会从治疗受益的方法。特别地，本公开内容涉及分析物配对物(companion)诊断方法和产品。因此，如本文所述的“监控受试者中疾病治疗”的方法还最理想地也可包含选择或鉴定用于治疗的候选人。

因此，在特定实施例中，本公开内容也提供了测定患有给定疾病、障碍或病症，或者处于患有给定疾病、障碍或病症的危险中的受试者是否是用于治疗的候选人的方法。一般地，受试者是经历过给定疾病、障碍或病症的一些症状的人，或是实际上已诊断为患有给定疾病、障碍或病症，或者处于患有给定疾病、障碍或病症的危险中的人，和/或显示本文所述分析物或其片段的不利浓度或量的人。

该方法任选包括如本文所述的测定，其中在用一种或多种药物组合物(例如，特别是用与涉及分析物的作用机制相关的药物)、用免疫抑制治疗、或通过免疫吸收治疗对受试者进行治疗之前和之后评价SOST，或其中在此类治疗后评价分析物，并将分析物的浓度或量与预定水平进行比较。治疗后观察到的不利的SOST浓度或量证实受试者不会受益于接收进一步或继续治疗，而治疗后观察到的有利的分析物浓度或量证实受试者会受益于接收进一步或继续治疗。这种证实帮助管理临床研究和提供改进的患者护理。

不言而喻的是，尽管本文的某些实施例在用于评价如本文所述的给定疾病、障碍或病症时是有益的，但测定和试剂盒可用于评价其他疾病、障碍或病症中的分析物。该测定方法也可涉及其他标记的测定等。

该测定方法也可用于鉴定改善给定疾病、障碍或病症的化合物。例如，可将表达分析物的细胞与候选化合物接触。可使用本文所述的测定方法将与化合物接触的细胞中的分析物表达水平与对照细胞中的进行比较。

II.试剂盒

还提供了对于测试样品中分析物(或其片段)的存在、量或浓度测定测试样品的试剂盒。试剂盒包含至少一个用于测定测试样品的硬化蛋白(或其片段)的组分、以及用于测定测试样品的分析物(或其片段)的说明书。所述至少一个用于测定测试样品的分析物(或其片段)的组分可包括含有抗硬化蛋白结合蛋白例如单克隆抗体或DVD结合蛋白(或其片段、变体、或变体的片段)的组合物，如本文描述的且其任选固定化在固相上。

试剂盒可包含至少一个通过免疫测定(例如化学发光微粒免疫测定)测定测试样品的SOST分析物的组分、以及通过免疫测定(例如化学发光微粒免疫测定)测定测试样品的SOST分析物的说明书。例如，试剂盒可包含至少一个对于SOST的特异性结合配偶体，例如抗硬化蛋白单克隆/多克隆抗体(或其可结合SOST分析物的片段、其可结合分析物的变体、或可结合分析物的变体的片段)或抗硬化蛋白DVD结合蛋白(或其片段、变体、或变体的片段)，其中任一个可以是可检测地标记的。可替代的或另外的，试剂盒可包含可检测地标记的SOST分析物(或其可结合抗分析物、单克隆/多克隆抗体或抗分析物DVD结合蛋白(或其片段、变体、或变体的片段)的片段)，其可与测试样品中的任何分析物竞争结合抗分析物单克隆/多克隆抗体(或其可结合分析物的片段、其可结合分析物的变体、或可结合分析物的变体的片段)或抗分析物DVD结合蛋白(或其片段、变体、或变体的片段)，其中任一个可固定化在固体支持物上。试剂盒可包含校准物或对照，例如分离的或纯化的分析物。试剂盒可包含至少一个容器(例如可易于例如用第一个特异性结合配偶体包被的管、微量滴定板或条)来实施测定，和/或缓冲液，例如测定缓冲液或洗涤缓冲液，其中任一个可作为浓溶液、可检测标记(例如酶促标记)的底物溶液、或终止液提供。在一个实施例中，试剂盒包含所有组分，即，实施该测定所必需的试剂、标准、缓冲液、稀释剂等。说明书可以是纸形式或计算机可读形式，例如盘、CD、DVD等等。

任何结合蛋白例如抗硬化蛋白结合蛋白或抗分析物DVD结合蛋白或示踪物可含有如本文所述的可检测标记，例如荧光团、放射性部分、酶、生物素/抗生物素蛋白标记、发色团、化学发光标记等，或试剂盒可包括用于进行可检测标记的试剂。可将抗体、校准物和/或对照在分开的容器中提供，或预先分配到合适的测定形式中，例如到微量滴定板中。

任选地，试剂盒包括质量控制组分(例如灵敏度实验对象组、校准物和阳性对照)。质量控制试剂的制备为本领域所熟知，并在关于多种免疫诊断产品的插页中得到描述。灵敏度实验对象组成员任选用于确立测定性能特征，并还任选是免疫测定试剂盒试剂完整性以及测定标准化的有用指示。

试剂盒也可任选包括进行诊断性测定或促进质量控制评估所需的其他试剂，例如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、酶底物、检测试剂等。其他组分，例如用于分离和/或处理测试样品的缓冲液和溶液(例如预处理试剂)也可包含在试剂盒中。试剂盒可另外包括一个或多个其他对照。可将试剂盒的一种或多种组分冻干，在那种情况下，试剂盒还可包含适于冻干的组分重构的试剂。

任选将试剂盒的多种组分按需提供在合适的容器(例如微量滴定板)中。试剂盒还可包括用于保持或贮存样品的容器(例如尿样品的容器或药液筒)。适当时，试剂盒任选也可含有反应容器、混合容器和促进制备试剂或测试样品的其他组分。试剂盒也可包括用于帮助获得测试样品的一种或多种仪器，例如注射器、移液管、镊子、量勺等等。

如果可检测标记是至少一个吖啶鎓化合物，则试剂盒可包含至少一个吖啶鎓-9-甲酰胺、至少一个吖啶鎓-9-羧酸芳基酯或其任何组合。如果可检测标记是至少一个吖啶鎓化合物，则试剂盒也可包含过氧化氢的来源，例如缓冲液、溶液、和/或至少一种碱性溶液。如果需要，则试剂盒可含有固相，例如磁性颗粒、珠子、试管、微量滴定板、杯、膜、支架分子、薄膜、滤纸、盘或芯片。

III.试剂盒及方法的适应

通过如本文所述的测定(例如免疫测定)测定测试样品中分析物的存在、量或浓度的试剂盒(或其组分)及方法，可进行适应以用于多种自动化和半自动化系统(包括其中固相包含微粒的那些)，如例如美国专利号5,089,424和5,006,309中所述、以及例如由Abbott Laboratories(Abbott Park，IL)作为商业销售的。

自动化或半自动化系统与非自动化系统(例如ELISA)相比，之间的一些差异包括附着第一个特异性结合配偶体(例如抗分析物、单克隆/多克隆抗体(或其片段、其变体、或其变体的片段)或抗分析物DVD结合蛋白(或其片段、其变体、或其变体的片段)的基质；任一方式，夹心形成和分析物反应性可受到影响)、捕获、检测和/或任何任选的洗涤步骤的长度和时间控制。尽管非自动化形式(例如ELISA)可能要求与样品和捕获试剂相对较长的温育时间(例如约2小时)，但自动化或半自动化形式(例如Abbott Laboratories)可能具有相对较短的温育时间(例如对约18分钟)。类似地，尽管非自动化形式(例如ELISA)可温育检测抗体(例如缀合试剂)相对较长的温育时间(例如约2小时)，但自动化或半自动化形式(例如)可能具有相对较短的温育时间(例如对约4分钟)。

可从Abbott Laboratories获得的其他平台包括但不限于(参见例如，美国专利号5,294,404)、EIA(珠子)和Quantum^TMII，以及其他平台。另外，可用其他形式例如在电化学或其他手提式或现场即时(point-of-care)测定系统中采用该测定、试剂盒和试剂盒组分。本公开内容例如适用于实施夹心免疫测定的商业Abbott Point of Care(AbbottLaboratories)电化学免疫测定系统。在例如美国专利号5,063,081、美国专利申请公开号2003/0170881、美国专利申请公开号2004/0018577、美国专利申请公开号2005/0054078、和美国专利申请公开号2006/0160164中描述了在单用途测试设备中的免疫传感器及其加工和操作方法。

特别地，关于分析物测定对系统的适应，下述构型是示例性的。用一对金电流分析工作电极和一个银-氯化银参考电极制造微制作硅芯片。在一个工作电极上，将具有固定化的抗分析物、单克隆/多克隆抗体(或其片段、其变体、或其变体的片段)或抗分析物DVD结合蛋白(或其片段、其变体、或其变体的片段)的聚苯乙烯珠子(0.2mm直径)，与电极上形成图案的聚乙烯醇聚合物涂层粘附。将该芯片以适于免疫测定的流体学形式装配到药液筒中。在药液筒样品保持室壁的部分上，有含有对于分析物的特异性结合配偶体的层，其中对于分析物的特异性结合配偶体是例如抗分析物、单克隆/多克隆抗体(或可结合分析物的其片段、其变体、或其变体的片段)或抗分析物DVD结合蛋白(或可结合分析物的其片段、其变体、或其变体的片段)，其中任一个可以是可检测地标记的。在药液筒流体袋内是包括对氨基苯酚磷酸的含水试剂。

在操作中，将怀疑含有分析物的样品添加到测试药液筒的保持室，并将药液筒插入阅读器。在对于分析物的特异性结合配偶体溶解到样品中后，药液筒中的泵元件迫使样品进入含有芯片的管道。在此将其振荡以促进形成夹心。在测定的倒数第二个步骤，将流体挤出袋子并进入管道，以将样品从芯片洗掉且进入废物室中。在测定的最终步骤，碱性磷酸酶标记与对氨基苯酚磷酸反应，以切割磷酸基团并允许释放的对氨基苯酚在工作电极上成为电化学氧化的。根据测量的电流，阅读器能够通过嵌入式算法和工厂测定的校准曲线计算样品中分析物的量。

不言而喻的是，本文所述方法和试剂盒必须包括用于实施免疫测定的其他试剂和方法。例如，包括多种缓冲液，例如本领域已知的和/或可易于制备或被最优化以应用的，例如用于洗涤，如缀合稀释剂、微粒稀释剂、和/或校准物稀释剂。示例性缀合稀释剂是用于某些试剂盒中的缀合稀释剂(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)，并含有2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、盐、蛋白封阻剂、抗微生物剂、和去污剂。示例性校准物稀释剂是用于某些试剂盒中的人校准物稀释剂(AbbottLaboratories，Abbott Park，IL)，其包含的缓冲液含有MES、其他盐、蛋白封阻剂、和抗微生物剂。另外，如美国专利申请号12/650,241中所述(还参见PCT/US2009/069846)，例如在I-Stat药液筒形式中，使用与信号抗体链接的核酸序列作为信号放大器，可获得改善的信号生成。

对于本领域技术人员将显而易见的是，本文描述的方法的其他合适修改和适应是明显的，且无需背离本文公开的实施例或范围使用合适的等同方案即可进行。

尽管目前已详细描述本发明，但通过参考下述实施例将更清楚地理解本发明，所述实施例被包括仅用于举例说明性目的且不希望是限制性的。

实例

实例1：抗人SOST抗体

实例1.1：通过体外展示系统鉴定针对硬化蛋白的全人结合蛋白

实例1.1.1：抗体选择

通过其结合重组人硬化蛋白的能力，通过体外展示技术从人抗体文库中分离全人抗人硬化蛋白单克隆抗体。根据DNA测序测定可变重(VH)和可变轻(VL)链的氨基酸序列。

实例1.1.2：全人抗人硬化蛋白结合蛋白AE10-6的亲和力成熟

通过体外展示技术使针对人硬化蛋白的AE10-6人结合蛋白亲和力成熟。序列比对显示硬化蛋白抗体AE10-6与人种系VH1-24/JH1和IGKV7-46/JL2共享最高同一性。为了改善AE10-6与硬化蛋白的亲和力，由IgBLAST数据库中的其他人抗体序列鉴定高变CDR残基，其也与种系VH1-24和IGKV7-46共享高同一性。随后通过PCR对相应的AE10-6CDR残基实施有限诱变，使用在这些位置处具有低简并性的引物，以产生适合于表面展示的以scFv形式的两个抗体文库。第一文库含有在VH CDR1、2和3(Kabat编号)中的残基34、51、54、57和95-100c处的突变；第二文库含有在三个VL CDR中的残基27b、29、30、52、53、55和91-96处的突变。为了进一步增加AE10-6与人种系构架序列的同一性，将在VH第30(T/S)、50(G/R)和52(D/N)位处的二元简并性引入第一文库内。另外，VH第105位在第一文库中是种系的(P/Q)。将在VL第24(K/R)、33(V/L)、54(R/L)、55(H/Q)、56(T/S)、91(H/S)和96(F/Y)位处的二元简并性引入第二文库内。(参见表1)。另外，VL第2位在第二文库中是种系的(T/A)。

下表(表5)提供了全人AE10-6结合蛋白的VH和VL的氨基酸序列列表，对所述全人AE10-6结合蛋白实施亲和力成熟选择方案。每个VH和VL序列的个别CDR的氨基酸残基以粗体指示。

表5.在抗硬化蛋白抗体AE10-6的亲和力成熟过程中发现的氨基酸残基。

将这些AE10-6文库转化且展示在细胞表面上，以通过磁性随后为荧光激活细胞分选针对低浓度的生物素化的硬化蛋白进行选择。进行改善结合速率、离开速率或两者的选择，并且从细胞回收亲和力调节的AE10-6克隆的抗体蛋白质序列，并且转换回IgG形式以用于进一步表征。

下表提供了源自AE10-6的亲和力成熟的全人硬化蛋白抗体的VH(表6)和VL(表7)区的氨基酸序列列表。每个VH序列的个别CDR的氨基酸残基以粗体指示。

表6.亲和力成熟的AE10-6变体的VH序列

表7.亲和力成熟的AE10-6变体的VL序列

下表提供了转换成IgG蛋白质用于表征的AE10-6克隆列表，VH(表8)和VL(表9)序列两者。

表8.IgG转换的克隆的VH序列

表9.IgG转换的克隆的VL序列

重和轻链对如下表10中制备：

表10.AE10-6亲和力成熟的克隆的重和轻链对

实例1.1.3：全人抗人硬化蛋白结合蛋白MSL10的亲和力成熟

通过体外展示技术使针对人TNF的MSL10人结合蛋白亲和力成熟。亲本MSL10抗体的VH和VL序列在下文提供。

亲本MSL10VH(SEQ ID NO:2018)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFDDYALHWVRQAPGKGLEWVSGISWHGDFIDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNGLRVEDMAIYYCAGNNRGYGGLDVWGQGTTVTVSS

亲本MSL1.1VL(SEQ ID NO:2019)

QSGLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGSYVFGGGTKLTVL

为了改善MSL10与硬化蛋白的亲和力，由IgBLAST数据库中的其他人抗体序列鉴定高变CDR残基，其也与人种系共享高同一性。随后通过PCR对相应的MSL10CDR残基实施有限诱变，使用在这些位置处具有低简并性的引物，以产生适合于表面展示的以scFv形式的两个抗体文库。

下表提供了源自MSL10的亲和力成熟的全人硬化蛋白抗体的VH(表14)和VL(表15)区的氨基酸序列列表。每个VH序列的个别CDR的氨基酸残基以粗体指示。

表14.亲和力成熟的MSL10变体的VH序列

表15.亲和力成熟的MSL10变体的VL序列

下表(表16)提供了全人SOST抗体MSL10的VH和VL的氨基酸序列列表。每个VH和VL序列的个别CDR的氨基酸残基以粗体指示。

表16：全人SOST抗体的VH和VL区的氨基酸序列列表

可比对上表中的全人SOST抗体的VH和VL区的个别CDR的序列，以提供共有CDR序列例如下表中的那些(表17)。

表17：SOST抗体CDR的共有序列

实例1.2：人SOST抗体的功能表征

实例1.2.1：硬化蛋白酶联免疫吸附测定(ELISA)方案

直接结合ELISA

下述方案用于表征通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来表征SOST抗体与人SOST的结合。用50μl/孔的以2μg/ml的山羊抗小鼠IgG-Fc在4℃下包被ELISA板过夜(Jackson目录#115-005-164)。将板用PBS/Tween洗涤3次。将在PBS/0.1％BSA中稀释至1μg/ml的50μl抗体添加到适当孔中，并在室温(RT)下温育1小时。将板用PBS/Tween洗涤3次。将50μl连续稀释的生物素-SOST添加到适当孔中，并在RT下温育1小时。将板用PBS/Tween洗涤3次。将在PBS/0.1％BSA中1:10,000稀释的50μl链霉抗生物素蛋白(Thermo Scientific目录#21126)添加到适当孔中，并在RT下温育1小时。将板用PBS/Tween洗涤3次。将50μl TMB(Zymed目录#002023)添加到适当孔中，并允许反应进行1分钟。用50μl2N H₂SO₄停止反应。在450nm处阅读吸光度。

抗人Fc捕获ELISA

将对抗人Fc特异性的抗体在0.2摩尔碳酸氢钠缓冲液(pH9.4)中稀释至1μg/ml。将板用100μl/孔在RT下包被2小时。通过将200μl在PBS中的5％脱脂奶粉添加到每个孔中，在RT下进行另外的结合能力的阻断共1小时。在洗涤板后，将100μl0.5μg/ml稀释的个别抗体一式两份添加到每个孔中。将板在RT下温育1小时并洗涤。将100μl100nM-0.001nM的1:6系列稀释的生物素rh(rcyno/rrat/rmouse)硬化蛋白添加到每个孔中，并将板在RT下温育1小时。在洗涤后，添加以120μl/孔的1:10,000稀释的SA-HRP。在RT下与SA-HRP的15分钟温育随后为洗涤。最后，将来自Invitrogen(目录#00-2023批号#425820A)的120μl TMB底物添加到每个孔中，并允许颜色发展10分钟。用60μl2N硫酸停止反应。在450nm处阅读板，收集数据且分析。

抗生物素捕获ELISA

将山羊抗生物素(Sigma CAT B3640-1MG)在0.2M碳酸氢钠缓冲液(Pierce CAT28382Lot IA109342)pH9.4中稀释至1μg/ml的浓度。将板以100μl/孔在RT下包被2小时。通过将200μl在PBS中的5％脱脂奶粉添加到每个孔中，在RT下进行另外的结合能力的阻断共1小时。在洗涤后，将100μl2μg/ml生物素rh(rcyno/rrat/rmouse)硬化蛋白添加到每个孔中。将样品在RT下温育1小时。在洗涤板后，将以25μg/ml开始的100μl1:6系列稀释的抗体添加到孔中。将样品在RT下温育一小时，并且洗涤板。添加以120μl/孔的1:5000稀释的抗人Fc-HRP(Jackson目录#109-036-098)，并在RT下温育30分钟。在洗涤后，将120μl TMB底物添加到每个孔中(Invitrogen目录#00-2023批号#425820A)。使颜色发展5-10分钟。用60μl2N硫酸停止反应。在450nm处阅读板，收集数据且分析。使用这种形式鉴定几种硬化蛋白特异性抗体(表11)。

表11硬化蛋白抗体

抗体名称	EC50,hu scl(nM)
		MSL10	0.4267(捕获)
MSL17	0.7783(捕获)
		MSL9-8	12.34(捕获)

MSK9	+(直接)
		MSK13	+(直接)
MSK21	+(直接)

实例1.2.2：TopFlash Wnt途径中和测定

下述方案经由被硬化蛋白抑制的Wnt途径活性的恢复用于评价mAb和DVD结合蛋白的硬化蛋白中和特性。HEK293A(Invitrogen，目录#:51-0036，批号#737470)细胞用TopFlash慢病毒(SA Biosciences，目录CLS018L-1)稳定进行，并且选择的1G6克隆进一步用Wnt-1慢病毒(Origene目录#SC303644)感染，导致共表达萤光素酶和Wnt-1的克隆。一个双重稳定克隆(克隆#14)已维持在T75烧瓶中的下述培养基中：DMEM(Invitrogen目录#11965-092)，具有10％合格FBS(Invitrogen目录#26140-079)、Pen-Strep(Invitrogen目录#15140-122)、L-谷氨酰胺(Invitrogen目录#25030-081最终2mM)、丙酮酸钠(Invitrogen目录#11360-070最终1mM)和2.5μg/ml嘌呤霉素(Invivogen目录#ant-pr-1)，直至在测定当天时的80-90％汇合。测定在测定培养基：不含嘌呤霉素的培养基中进行。将人硬化蛋白(Abbott)、食蟹猴硬化蛋白(Abbott)、鼠硬化蛋白和大鼠硬化蛋白等分且冷冻贮存于-80℃下。在第1天时，将克隆#14细胞以10,000细胞/孔铺平板在黑色侧面、透明底部组织培养处理的96孔板(Costar#3603)中的50ul测定培养基中，并且在37℃下温育过夜(20-24小时)。第二天(第2天)，在测定培养基中将硬化蛋白原液稀释至60nM(4X)用于人和食蟹猴，并且稀释至200nM(4X)用于小鼠和大鼠。将抗硬化蛋白抗体在测定培养基中稀释，通常以800nM(4X)开始。从具有细胞的板中去除培养基且替换为50μl/孔的新鲜测定培养基。接下来对于人和食蟹猴硬化蛋白，使细胞与25μl60nM(4X)一起温育1小时，并且对于小鼠和大鼠硬化蛋白，使细胞与25μl200nM一起温育1小时。之后，该抗硬化蛋白抗体(25μl4X)添加到细胞中，并且使板在37℃下温育过夜(20-24小时)。每个孔中的终体积是100μl。次日(第3天)，将细胞用200μlPBS(RT)洗涤一次。Promega萤光素酶试剂盒#E1501用于细胞裂解和萤光素酶读出。简言之，将5X细胞裂解试剂(Promega，目录#E153A)用milliQ水稀释至1X，并且将20μl添加到每个孔中。为了确保完全裂解，将板500rpm旋转20分钟。将100μl萤光素酶测定试剂(1小瓶，目录#E151A底物+10ml目录#E152A测定缓冲液)添加到每个孔中。在TopCount机器(程序：萤光素酶96，测定17：1秒/孔阅读)上阅读板。

AE10-6AM2、AE10-6AM3、AE10-6AM5、AE10-6AM6、AE10-6AM7和AE10-6AM8以1.5-7.7nM的IC50中和重组人硬化蛋白，以4.7-21.1nM的IC50中和重组食蟹猴硬化蛋白。AE10-6AM3、AE10-6AM7和AE10-6AM8以9.6-11.7nM的IC50中和重组小鼠硬化蛋白，以12.1-15.7nM的IC50中和重组大鼠硬化蛋白。MSL10AM1-11抗体以3-23.3nM的IC50中和重组人硬化蛋白。MSL10AM6、MSL10AM7、MSL10AM8、MSL10AM9、MSL10AM10、MSL10AM11以13.5-29.7nM的IC50中和重组食蟹猴硬化蛋白。

实例1.2.3：硬化蛋白抗体通过表面等离子共振的亲和力测量

抗体或抗硬化蛋白-TNF DVD与纯化的重组人、食蟹猴(cyno)、大鼠和小鼠硬化蛋白和TNFα的结合通过基于表面等离子共振的测量进行测定，使用Biacore T100或T200仪器(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ,USA)，在25℃下使用含有另外的150mM NaCl、和/或10mg/ml羧甲基葡聚糖、0.1mg/ml BSA的流动HBS-EP+(10mM HEPES[pH7.4]、150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20)。所有化学试剂均得自GE HealthcareLife Sciences,Piscataway,NJ,USA或否则来自如正文中所述的不同来源。使用标准胺偶联试剂盒根据制造商的说明书和15μg/ml时的程序，将在10mM乙酸钠(pH4.5)中稀释的大约10,000RU(或当使用CM3芯片时，3000RU)山羊抗小鼠或抗人IgG(Fcγ)片段特异性多克隆抗体(Pierce BiotechnologyInc，Rockford，IL)直接固定化在CM5(或CM3)研究级生物传感器芯片上。生物传感器表面上未反应的部分用乙醇胺封闭。在流动室2、3和4中的修饰的羧甲基葡聚糖表面用作反应表面。在流动室1中经修饰的羧甲基葡聚糖用作参考表面。Biaevaluation T100软件版本2.0.2，GE Healthcare Life Sciences用于同时拟合所有注射的结合和解离相(使用1:1拟合分析与局部Rmax)。纯化的抗体在运行缓冲液进行稀释，以用于在山羊抗小鼠或抗人IgG特异性反应表面上捕获。将作为配体捕获的抗体(1μg/ml)以10μl/分钟的流速注射在反应基质上。结合和解离速率常数，kon(单位M-1s-1)和koff(单位s-1)在50μl/分钟的连续流速下进行测定。通过对于硬化蛋白抗原范围为0.39-50nM和对于TNF范围为0.195-25nM的6-8个不同抗原浓度下进行动力学结合测量来获得速率常数。在每个循环结束时，用50mM NaOH的10秒注射或/和10mM甘氨酸pH1.5以100μl/分钟流速的10秒注射再生表面。仪器适当的Biaevaluation软件，GE Healthcare Life Sciences用于同时拟合结合和解离常数以及K_D(使用1:1总体拟合分析与局部Rmax)。将结合作为为时间的函数进行记录且计算动力学速率常数。在该测定中，可测量快达10⁷M^-1s^-1的结合速率和慢至10^-6s^-1的离开速率。在特定抗体/DVD结合蛋白的离开速率慢于10^-6s^-1时的情况下，k_d假定为小于或等于1*10^-6s^-1，并且在此类情况的假定下计算的K_D值通过将结合速率除以1*10^-6完成，并且作为“至少”给出。

人和食蟹猴硬化蛋白的抗硬化蛋白MSL10克隆的亲和力和动力学速率在下表12中提供，而所有硬化蛋白物种(人、食蟹猴、大鼠和小鼠)的AE10-6克隆的亲和力和动力学速率在表13中提供(MSL10克隆不结合小鼠和大鼠硬化蛋白)。

表12.抗硬化蛋白MSL10克隆对人和食蟹猴SOST的亲和力和动力学速率

表13.抗硬化蛋白AE10-6克隆对人和食蟹猴SOST的亲和力和动力学速率

实例2：在大鼠中的SOST抗体的药物代谢动力学分析

在Sprague-Dawley大鼠中执行人抗人SOST抗体的药物代谢动力学研究。用单剂4mg/kg抗体蛋白质对雄性大鼠进行静脉内给药，且使用基于抗原捕获的化学发光MSD(Meso Scale Discovery)法分析血清样品。使用WinNonlin通过非区室分析计算药物代谢动力学参数。

实例2.2.1：大鼠血清的制备

外科手术改变的(颈静脉插管的，JVC)和正常雄性Sprague-Dawley大鼠(约7周龄，称重240-390克)购自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)。动物在12小时光/暗周期在维持于恒定温度和湿度的房间中圈养，喂养正常啮齿类动物食物且允许食物和水随意。每天监控动物的水合和临床状况。

在多个时间点收集血样(0.2mL)，允许在室温下凝固30分钟，并且以13,200rpm离心8分钟。随后，将血清转移至eppendorf管且冷冻贮存于-80℃下。

实例2.2.2：用于定量PK血清样品中的SOST抗体的MSD测定

用包含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水(由10X PBS稀释，AbbottBioresearch Center,Media Room,Worcester,MA和Tween-20，Sigma,St.Louis,MO)洗涤MSD链霉抗生物素蛋白板(Meso Scale Discovery)。用150μL/孔封闭溶液(MSD Block，Meso Scale Discovery，在PBS中稀释至3％终浓度)封闭板1小时，覆盖，伴随在室温下的振荡(600rpm)。

在分析前，大鼠血清样品在冰上解冻，轻轻混合，并且以14,000rpm在4℃下在eppendorf离心机中离心3分钟。在大鼠血清中制备标准曲线和对照样品。研究样品、标准曲线样品、空白和质量控制样品在溶液中在分开的2mL深孔96孔板(Corning，Corning，NY)中与生物素化的人SOST(在测定缓冲液中0.1ug/mL)和磺基标记的山羊抗人IgG(Meso Scale Discovery，在测定缓冲液中1μg/mL)1:1:1＝V:V:V在室温下温育1小时。样品随后转移至MSD板且伴随振荡(600rpm)在室温下温育另外1小时。洗涤MSD板且用2xRead Buffer(Meso Scale Discovery)显色。在MSD Sector Imager6000上在10分钟内测量化学发光。

使用四参数逻辑拟合分析标准曲线，并且通过XLfit4软件版本2.2.1Build16,(Microsoft Corporation,Redmond,WA)计算样品浓度。通过非区室分析使用Winonlin软件版本5.0.1(Pharsight Corporation,Mountain View,CA)对于每只动物计算药物代谢动力学参数。

实例3：TNF/SOST DVD结合蛋白的生成

实例3.1：TNF/SOST DVD结合蛋白DNA构建体的构建

通过重叠PCR扩增用间插接头DNA序列使抗TNF抗体可变结构域(来自人抗体D2E7、去免疫的D2E7、小鼠或人源化抗体MAK199、和小鼠或人源化抗体MAK195)与多重SOST抗体可变结构域组合。将扩增的PCR产物亚克隆到适合于在HEK293细胞中瞬时表达的表达载体内，且在DVD结合蛋白表达前通过测序证实开放读码框区域。

实例3.2：TNF/SOST DVD结合蛋白的表达和产生

测序所有DVD结合蛋白cDNA构建体，在大肠杆菌中扩增，且使用Qiagen Hispeed Maxi Preps(目录#12662，QIAGEN)纯化DNA。通过使PEI和DNA以2:1比率与0.2μg/ml重链DNA和0.3μg/ml轻链DNA混合，将DVD结合蛋白DNA转染到对数期293E细胞(0.5x10⁶/ml，生存力>95％)内。在添加到293E细胞前，DNA:PEI复合物在室温下在TC通风橱中形成15分钟。20小时后，将0.5％TN1添加到293E细胞中。在第5天，收集上清液用于人IgG1滴度测量。在第7天收获细胞上清液，并且通过0.2μM PES滤器过滤。通过使用A蛋白琼脂糖凝胶亲和层析(Protein A Sepharose AffinityChromatography)根据制造商的说明书纯化上清液。纯化的DVD结合蛋白通过0.1M甘氨酸(pH2.99)从柱中洗脱，由2M tris-HCl或磷酸盐缓冲，和/或立即透析到15mM组氨酸缓冲液(pH6.0)内。结合蛋白通过A280定量且通过质谱分析法和SEC分析。

实例3.3：TNF/SOST DVD结合构建体的序列

测定能够结合人TNF和SOST的DVD结合蛋白质的重链和轻链的氨基酸序列。TNF/SOST DVD结合蛋白的可变重链、可变轻链和恒定区的氨基酸序列显示于下表(表18)中。

表18：TNF/SOST DVD结合蛋白的可变和恒定区的序列

实例3.4：DVD-Ig的结合亲和力

为了测量两种抗原与DVD的同时结合，将DVD-Ig以5μl/分钟捕获到山羊抗huIgG FC上1分钟。随后将硬化蛋白以50nM以5μl/分钟注射到捕获表面上10分钟，以饱和DVD结合，随后为50nM TNF以5μl/分钟共10分钟的共注射，以检查与已具有硬化蛋白与之结合的DVD的TNF结合。用50mM NaOH的10秒注射之后10mM甘氨酸pH1.5以100μl/分钟流速的10秒注射再生表面。以相反的抗原顺序重复相同实验，其中首先注射TNF，随后为硬化蛋白的共注射。提供了关于MAK199-1-GS-AE10-6AM7DVD-Ig(图7A)和DVD2623(图7B)的示例性结合概况。

与SOST和TNF的DVD-Ig结合的亲和力和动力学参数在下表19中提供。使用方法的详细描述在部分中提供。

表19.与硬化蛋白和TNF的DVD-Ig结合的亲和力和动力学参数

实例3.5：TopFlash Wnt途径硬化蛋白中和测定

如上所述进行证实Wnt途径的硬化蛋白抑制的中和的测定。DVD2603、DVD2605、DVD2606、DVD2607、DVD2608、DVD2610、DVD2611、DVD2623、DVD2627、DVD2628、DVD2630、DVD2631、DVD2642、DVD2643、DVD2645、DVD2646、DVD2647、DVD2648、DVD2650、DVD2651、DVD2657、DVD2658以12-24.4nM的IC50抑制重组人硬化蛋白。MAK199-1-GS-AE10-6AM7、MAK199-1-SS-AE10-6AM7、MAK199-1-GS-AE10-6AM7QL、MAK195/21-GS-AE10-6AM3、MAK195/21-GS-AE10-6AM8、diD2E7ss-GS-AE10-6AM7、D2E7-GS-AE10-6AM7、AE10-6AM7-GSMAK195/21以1.7-6.6nM的IC50抑制重组人硬化蛋白，并以2-9.1nM的IC50抑制重组食蟹猴硬化蛋白。MAK199-1-GS-AE10-6AM7、MAK199-1-SS-AE10-6AM7、MAK195/21-GS-AE10-6AM7、MAK195/21-SS-AE10-6AM7、MAK195/21-GS-AE10-6AM3、MAK195/21-GS-AE10-6AM8、diD2E7ss-GS-AE10-6AM7、D2E7-GS-AE10-6AM7、AE10-6AM7-GS MAK195/21以9.4-27.6nM的IC50抑制重组小鼠硬化蛋白。

实例3.6：重组TNF-α的中和

在重组TNF的L929中和测定中评估DVD-Ig的TNF-a中和效力。使半汇合的L929小鼠成纤维细胞(ATCC，目录#CCL-1^TM)生长，并且使用0.25％胰蛋白酶(Gibco，目录#25200-056)收获。将细胞用PBS(Gibco，目录#14190-144)洗涤，计数且在完全测定培养基中以5×10⁵细胞/mL重悬浮，所述完全测定培养基由下述组成：RPMI1640(Gibco，目录#21870)、10％胎牛血清(Hyclone，目录#SH30070.03)、1％L-谷氨酰胺(Gibco，目录#25030)、1％丙酮酸钠(Gibco，目录#113670)、1％非必需氨基酸(Gibco，目录#11140)、50单位/mL青霉素/50μg/mL链霉素(Gibco，目录#15140)、55μM2-BME(Mercaptoethanol-Gibco，目录#21985)和2x浓度的2μg/mL放线菌素D(Sigma，目录#A1410)。细胞以对应于5×10⁴细胞/孔的100μL体积种植到96孔板(Costar，目录#3599)中。将单克隆抗体(mAb)、DVD-Ig^TM和对照IgG在测定培养基中稀释至4x浓度，并且进行系列稀释。将重组TNF-α在测定培养基中稀释至600pg/mL的4x浓度。所有抗体样品(mAb或DVD-Ig^TM)与重组TNF-α以1:1体积比一起预温育，并且允许在37℃、5％CO₂下温育1小时。在一些情况下，还将重组人硬化蛋白加入预温育步骤中。对于这些条件，使8x稀释的DVD-Ig^TM、重组TNF-α(1200ng/mL)和人硬化蛋白(400nM)和50μL完全测定培养基在37℃、5％CO₂下预温育1小时。

对于150pg/mL重组TNF-α、mAb或DVD-Ig^TM和1μg/mL放线菌素D的1x终浓度，将一百μL mAb或DVD-Ig^TM/重组TNF-α溶液以100μL添加到铺平板的细胞中。在其中添加人硬化蛋白的情况下，对于150pg/mL重组TNF-α、mAb或DVD-Ig^TM、人硬化蛋白(50nM)和1μg/mL放线菌素D的1x终浓度，将100μL DVD-Ig^TM/重组TNF-α/人硬化蛋白/培养基溶液以100μL添加到铺平板的细胞中。使板在37℃、5％CO₂下温育过夜(16-24小时)。为了定量活力，从孔中去除100μL，并且添加10μL WST-1试剂(Roche，目录#11644807001)。使板在37℃、5％CO₂下温育另外3-5小时，并且在Spectromax190ELISA板阅读器上在OD420-600nm处阅读。使用GraphPadPrism标绘中和数据。使用GraphPad Prism S形曲线剂量软件计算报告的IC₅₀值，并且在下表20中提供。

表20.重组TNF-α的中和

为了证实硬化蛋白与DVD-Ig的结合不影响该分子的TNF-a中和特性，首先使DVD-Ig与50nM SOST预温育至少30分钟，随后在实验自始至终用50nM SOST进行L929测定。

该实验的结果在下表21中提供。

表21.连同和不连同50nM SOST的TNF-a中和的比较例子

实例4：用于TNF/硬化蛋白DVD Ig的药物代谢动力学(PK)分析

称重大约280g的雄性Sprague-Dawley JVC大鼠接受在颈静脉中使用以5mg/kg的DVD-Ig或亲本抗体的单次剂量。在给药后15分钟，4和24小时，以及2、3、7、10、14、21和28天时，从尾静脉中收集血清样品。将血清样品冷冻在-80℃下直至分析时。

称重大约28g的雄性CD1小鼠接受经由尾静脉使用以5mg/kg的DVD-Ig或亲本抗体的单次剂量。在给药后1和24小时，以及4、7、10、14和21天时，从尾静脉中收集全血样品。将样品冷冻在-80℃下直至分析时。

使用MSD测定进行样品的生物分析。简言之，将链霉抗生物素蛋白板用生物素化的人抗原包被，并且温育过夜。将板封闭，并且将稀释的血清样品(最终血清浓度为1％)添加到孔中，并且磺基标签标记的山羊抗人IgG用于检测。使用线性梯形拟合，通过非区室分析用WinNonlin软件版本5.2.1计算每只动物的药物代谢动力学参数。在小鼠和大鼠中获得的PK参数分别在下表22和23中提供。

表22.小鼠中的PK参数

化合物	T_1/2(天)	V_ss(mL/kg)	Cl(mL/hr/kg)
				MAK195/24-GS-MSL10-AM2	15	114	0.21
DVD2623	14.1	257	0.56
				MAK199-1-GS-AE10-6AM7	15.3	84	0.16
MAK199-1-GS-AE10-6AM7QL	12.3	105	0.26

表23.大鼠中的PK参数

化合物	T_1/2(天)	V_ss(mL/kg)	Cl(mL/hr/kg)
				MAK195/24-GS-MSL10-AM2	13.3	68	0.16
DVD2603	8.7	80	0.3
				D2E7-GS-MSL10	11.5	67	0.21
DVD2578	10.2	79	0.24
				DVD2580	7.4	65	0.26
DVD2581	10.6	84	0.26
				MAK199-1-GS-AE10-6AM7	6.8	58	0.34
MAK199-1-GS-AE10-6AM7QL	5.6	58	0.33

实例5：DVD结构域的体内功效评估

使用急性PD模型就体内功效评估DVD的抗硬化蛋白结构域。基于骨生物标记PINP的增加，测试的所有DVD-Ig均诱导增加的骨形成。超过10周龄的首次用于实验的DBA/1雄性小鼠用DVD-Ig的单次剂量，i.p进行处理。注射后三天，经由心脏穿刺收集血清，并且通过ELISA测试骨形成生物标记PINP水平。基于骨生物标记PINP的血清水平的增加，测试的所有DVD-Ig均诱导增加的骨形成。参见表24。

表24

在人TNF/D-半乳糖胺致命性模型中就体内功效评估DVD的抗TNF结构域，其中首次用于实验的C57Bl/6雌性小鼠用DVD，i.p进行处理。剂量后十八小时，用0.5μg/小鼠的TNF和20mg/小鼠的D-半乳糖胺腹膜内攻击动物，并且每天两次监控动物的存活。测试的所有DVD-Ig中的TNF结构域均为活性的，并且保护小鼠不受TNF诱导的致死。参见表25。

表25

抗TNF、抗SOST以及组合的抗TNF和抗SOST治疗在诱发性关节炎小鼠模型中的功效

抗TNF、抗SOST以及组合的抗TNF和抗SOST治疗就其在预防诱发性关节炎的小鼠模型中的关节炎中的功效进行评估。小鼠在第0天时用胶原免疫接种，在第21天时用酵母多糖(Zymosan)的腹膜内注射加强，并且从第24–28天起就关节炎的临床体征加以选择。小鼠随后在入选当天时开始用抗TNF治疗剂(抗TNF，12mg/kg，皮下注射，每周两次)、抗硬化蛋白治疗剂(30mg/kg，皮下注射，每周两次)、或组合的两种治疗剂进行处理。小鼠经过20天的时期评估爪厚度的变化，并且在第44–48天时，收集血清和骨用于终点分析。如图2A中所示，用抗TNF或组合疗法处理的小鼠显示出小于用0.9％盐水处理的对照组的足肿胀。另外，用抗TNF和抗硬化蛋白疗法的组合处理分别维持或增加在踝和脊柱两者中的骨厚度，如通过微型CT测量的(图2B和2C)。

在晚期治疗小鼠胶原诱发性关节炎(CIA)模型中测试TNF和SOST的组合中和，其中治疗在炎症发作后五天开始，这是在其时已发生中等骨丢失的时间点。DBA/1小鼠在第0天时用胶原免疫接种，并在第21天时用酵母多糖加强。从第24–28天起，小鼠基于关节炎的第一种临床体征入选研究。入选后五天，小鼠用12mg/kg抗小鼠TNF mAb、30mg/kg抗硬化蛋白mAb、或两种mAb的组合进行给药，每周两次，共两周。使用测径器经由足肿胀监控炎症。踝和脊柱的微型CT分析在研究结束时用于评估骨体积/密度的变化。在第一种炎症体征后的第5天时处死一组免疫接种的小鼠，并且使用微型计算机断层摄影术(μCT)评价在该时间点的骨丢失量。如图(4a)中证实的，当处理在疾病发作后5天开始时，用抗TNF处理的处理在预防炎症方面是无效的。用单独的抗TNF或抗硬化蛋白mAb的处理不预防来自关节炎踝的骨丢失，但两种mAb的组合使免于在该位点处的进一步骨丢失(图4b)。相比之下，虽然TNF抑制不保护骨骼骨，但在单独或与抗TNFmAb组合的抗硬化蛋白mAb处理的动物的脊柱中，骨恢复至在首次用于实验的动物中可见的水平(图4c)。

因为TNF抑制在控制小鼠CIA模型中的炎症方面是无效的，所以可替代的抗炎机制用于测试硬化蛋白抑制恢复关节炎关节中的骨的能力。当给药在炎症发作后五天开始时，组合的IL-1a和IL-1b抑制阻断炎症，因此完成这样的研究，其中小鼠在第0天时用胶原免疫接种，在第21天时用酵母多糖的腹膜内注射加强，并且从第24–28天起就关节炎的临床体征加以选择。在炎症发作后五天开始，每周两次用抗IL1α治疗剂(9mg/kg,ip)和抗IL1β(4.5mg/kg,ip)、抗硬化蛋白(30mg/kg,ip)或所有三种mAb的组合处理小鼠。在20天处理过程中监控足肿胀，这之后收集血清和骨用于终点分析。用IL-1a和IL-1b的组合抑制实现的抗炎活性在图5a中加以证实。关节炎踝的微型CT分析显示与硬化蛋白抑制组合的炎症阻断允许恢复关节炎踝中的骨(图5b)。这些动物的腰椎的小梁骨分析显示硬化蛋白抑制能够恢复单独或与炎症阻断组合的骨骼骨(图5c)。

实例6：抗TNF、抗硬化蛋白以及组合的抗TNF和抗硬化蛋白治疗在克罗恩氏病的小鼠模型中的功效

骨骼骨丢失是患有克罗恩氏病的患者中的常见共病。我们在克罗恩氏病的小鼠模型中测试抗硬化蛋白mAb、抗TNFmAb和两种Ab的组合，并且测量腰椎中的小梁骨的变化。

通过机械破碎收集来自雌性BALB/c小鼠(Taconic)的脾细胞，并且使用负选择磁珠试剂盒(StemCell)富集CD4⁺细胞。纯化的CD4⁺细胞用由荧光素(R&D Systems)标记的抗GITR(糖皮质激素诱导的TNF家族受体)染色。通过FACS(MoFlow Legacy)分析细胞，并且收集最低40％GITR-染色细胞。分选后分析显示群体为CD4⁺GITR^-，具有95-98％纯度。将细胞洗涤，重悬浮并且将5x10⁵细胞i.p.注射到雌性CB-17scid小鼠(Taconic)内。接受者小鼠监控体重、便溏或便血的存在、直肠脱垂和一般状况2-3次/周。动物群组在第27天(处理起始时)时处死，用于结肠的组织学分析和脊柱的μCT检查，以测定基线疾病。处理由每周两次的媒介物(PBS)、抗TNF(15mg/kg ip)、抗硬化蛋白(30mg/kg ip)、或抗TNF和抗硬化蛋白两者的注射组成，并且继续直至研究在细胞注射后第57天时结束。将动物处死；收集血清且贮存于-20℃直至用于测定抗体水平时。收集结肠，用PBS冲洗以去除粪便材料，称重且测量，使用瑞士卷(swiss roll)技术置于组织学盒中，并且贮存于10％福尔马林中直至加工时。在石蜡包埋后，将切片用苏木精和曙红染色，并且就炎症的存在、隐窝损伤、粘膜溃疡和疾病程度评分。每组存在8或9只动物。丧失大于20％起始体重的动物依照IACUC指导实施安乐死。另外，收集脊柱并使用μCT分析在L5椎骨中的小梁骨。单独或与抗硬化蛋白mAb组合的抗TNF抑制肠炎症，而抗硬化蛋白mAb则不抑制(图5a)。相比之下，单独或与抗TNF组合的抗硬化蛋白mAb处理能够使腰椎中的骨丢失恢复至在首次用于实验的动物中可见的水平(图5b)。

以引用的方式并入

分子生物学、药物递送、免疫学、分子生物学和细胞生物学领域中众所周知的技术全部以引用方式并入本文。这些技术包括，但不限于，在下述出版物中描述的技术：Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,NY(1993)；Ausubel,F.M.等人编辑，ShortProtocols In Molecular Biology(第4版，1999)John Wiley&Sons,NY.(ISBN0-471-32938-X)。Controlled Drug Bioavailability Drug Product Design andPerformance,Smolen和Ball(编辑)，Wiley,New York(1984)；Giege,R.和Ducruix,A.Barrett,Crystallization of Nucleic Acids and Proteins,a PracticalApproach，第2版，第201-16页，Oxford University Press,New York,N.Y.,(1999)；Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,第2卷，第115-138页(1984)；Hammerling等人，在Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981；Harlow等人，Antibodies：ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)中；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutesof Health,Bethesda,Md.(1987)和(1991)；Kabat,E.A.等人(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,第五版，U.S.Department of Health andHuman Services,NIH公开号91-3242；Kontermann和Dubel编辑，AntibodyEngineering(2001)Springer-Verlag.New York.第790页(ISBN3-540-41354-5)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)；Lu和Weiner编辑，Cloning and Expression Vectorsfor Gene Function Analysis(2001)BioTechniques Press.Westborough,Mass.第298页(ISBN1-881299-21-X),Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(编辑)CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Old,R.W.&S.B.Primrose,Principles of Gene Manipulation：An Introduction To GeneticEngineering(第3版，1985)Blackwell Scientific Publications,Boston.Studiesin Microbiology；V.2:第409页(ISBN0-632-01318-4)；Sambrook,J.等人编辑，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版1989)Cold Spring HarborLaboratory Press,NY.第1-3卷(ISBN0-87969-309-6)；Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,编辑，Marcel Dekker,Inc.,NewYork,1978；Winnacker,E.L.From Genes To Clones：Introduction To GeneTechnology(1987)VCH Publishers,N.Y.(由Horst Ibelgaufts翻译).第634页(ISBN0-89573-614-4)。

此外，可能在本专利申请自始至终引用的所有引用的参考文献(包括文献参考、专利、专利申请和网站)的内容都为了所有目的在此明确地全文以引用方式并入本文，其中引用的参考文献也如此。

等同方案

本发明在不背离其精神或基本特征的情况下可以其他具体形式具体化。本文描述的前述实施例因此在所有方面被视为是示例性的，而不是限制性的。范围因此由所附的权利要求而不是由前述说明书指出，且在权利要求的等价含义和范围内的所有改变因而预期包含在其中。

Claims

1.一种包含能够结合人硬化蛋白的抗原结合结构域的结合蛋白，所述抗原结合结构域包括包含氨基酸共有序列的至少一个CDR。

2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述至少一个CDR包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:3的残基31-35；SEQ ID NO:3的残基50-66；SEQ ID NO:3的残基99-108；SEQ ID NO:4的残基23-34；SEQ ID NO:4的残基51-57；SEQ ID NO:4的残基90-101；SEQ ID NO:5的残基31-35；SEQID NO:5的残基50-66；SEQ ID NO:5的残基99-115；SEQ ID NO:6的残基23-33；SEQ ID NO:6的残基49-55；SEQ ID NO:6的残基88-96；SEQ ID NO:7的残基31-35；SEQ ID NO:7的残基50-66；SEQ ID NO:7的残基99-107；SEQ ID NO:8的残基23-33；SEQ ID NO:8的残基49-55；SEQ ID NO:8的残基88-95；SEQ ID NO:9的残基31-35；SEQ ID NO:9的残基50-66；SEQID NO:9的残基99-107；SEQ ID NO:10的残基24-39；SEQ ID NO:10的残基55-61；SEQ ID NO:10的残基94-112；SEQ ID NO:11的残基31-35；SEQID NO:11的残基50-66；SEQ ID NO:11的残基99-111；SEQ ID NO:12的残基24-39；SEQ ID NO:12的残基55-61；SEQ ID NO:12的残基94-113；SEQ ID NO:13的残基31-37；SEQ ID NO:13的残基52-69；SEQ ID NO:13的残基102-122；SEQ ID NO:14的残基24-34；SEQ ID NO:14的残基50-56；SEQ ID NO:14的残基89-97；SEQ ID NO:1998的残基31-35；SEQ ID NO:1998的残基50-66；SEQ ID NO:1998的残基99-110；SEQ ID NO.:1999的残基31-35；SEQ ID NO.:1999的残基50-66；SEQ ID NO.:1999的残基99-110；SEQ ID NO.:2000的残基31-35；SEQ ID NO.:2000的残基50-66；SEQ ID NO.:2000的残基99-110；SEQ ID NO.:2001的残基31-35；SEQ IDNO.:2001的残基50-66；SEQ ID NO.:2001的残基99-110；SEQ ID NO.:2002的残基31-35；SEQ ID NO.:2002的残基50-66；SEQ ID NO.:2002的残基99-110；SEQ ID NO.:2003的残基31-35；SEQ ID NO.:2003的残基50-66；SEQ ID NO.:2003的残基99-110；SEQ ID NO.:2004的残基31-35；SEQ IDNO.:2004的残基50-66；SEQ ID NO.:2004的残基99-110；SEQ ID NO.:2005的残基31-35；SEQ ID NO.:2005的残基50-66；SEQ ID NO.:2005的残基99-110；SEQ ID NO.:2006的残基31-35；SEQ ID NO.:2006的残基50-66；SEQ ID NO.:2006的残基99-110；SEQ ID NO.:2007的残基31-35；SEQ IDNO.:2007的残基50-66；SEQ ID NO.:2007的残基99-110；SEQ ID NO.:2008的残基23-36；SEQ ID NO.:2008的残基52–58；SEQ ID NO.:2008的残基101–109；SEQ ID NO.:2009的残基23-36；SEQ ID NO.:2009的残基52–58；SEQ ID NO.:2009的残基101–109；SEQ ID NO.:2008的残基23-36；SEQ IDNO.:2010的残基52–58；SEQ ID NO.:2010的残基101–109；SEQ IDNO.:2011的残基23-36；SEQ ID NO.:2011的残基52–58；SEQ ID NO.:2011的残基101–109；SEQ ID NO.:2012的残基23-36；SEQ ID NO.:2012的残基52–58；SEQ ID NO.:2012的残基101–109；SEQ ID NO.:2013的残基23-36；SEQ ID NO.:2013的残基52–58；SEQ ID NO.:2013的残基101–109；SEQ ID NO.:2014的残基23-36；SEQ ID NO.:2014的残基52–58；SEQ IDNO.:2014的残基101–109；SEQ ID NO.:2015的残基23-36；SEQ IDNO.:2015的残基52–58；SEQ ID NO.:2015的残基101–109；SEQ IDNO.:2016的残基23-36；SEQ ID NO.:2016的残基52–58；SEQ ID NO.:2016的残基101–109；SEQ ID NO.:2017的残基23-36；SEQ ID NO.:2017的残基52–58；SEQ ID NO.:2017的残基101–109；SEQ ID NO:2020的残基31-35；SEQ ID NO:2020的残基50-66；SEQ ID NO:2020的残基99-108；SEQID NO:2021的残基31-35；SEQ ID NO:2021的残基50-66；SEQ ID NO:2021的残基99-108；SEQ ID NO:2022的残基31-35；SEQ ID NO:2022的残基50-66；SEQ ID NO:2022的残基99-108；SEQ ID NO:2023的残基31-35；SEQ ID NO:2023的残基50-66；SEQ ID NO:2023的残基99-108；SEQ IDNO:2024的残基31-35；SEQ ID NO:2024的残基50-66；SEQ ID NO:2024的残基99-108；SEQ ID NO:2025的残基31-35；SEQ ID NO:2025的残基50-66；SEQ ID NO:2025的残基99-108；SEQ ID NO:2026的残基31-35；SEQ ID NO:2026的残基50-66；SEQ ID NO:2026的残基99-108；SEQ IDNO:2027的残基31-35；SEQ ID NO:2027的残基50-66；SEQ ID NO:2027的残基99-108；SEQ ID NO:2028的残基31-35；SEQ ID NO:2028的残基50-66；SEQ ID NO:2028的残基99-108；SEQ ID NO:2029的残基31-35；SEQ ID NO:2029的残基50-66；SEQ ID NO:2029的残基99-108；SEQ IDNO:2030的残基31-35；SEQ ID NO:2030的残基50-66；SEQ ID NO:2030的残基99-108；SEQ ID NO:2031的残基31-35；SEQ ID NO:2031的残基50-66；SEQ ID NO:2031的残基99-108；SEQ ID NO:2032的残基31-35；SEQ ID NO:2032的残基50-66；SEQ ID NO:2032的残基99-108；SEQ IDNO:2033的残基31-35；SEQ ID NO:2033的残基50-66；SEQ ID NO:2033的残基99-108；SEQ ID NO:2034的残基31-35；SEQ ID NO:2034的残基50-66；SEQ ID NO:2034的残基99-110；SEQ ID NO.:2035的残基31-35；SEQ ID NO.:2035的残基51-57；SEQ ID NO.:2035的残基90-101；SEQ IDNO.:2036的残基31-35；SEQ ID NO.:2036的残基51-57；SEQ ID NO.:2036的残基90-101；SEQ ID NO.:2037的残基31-35；SEQ ID NO.:2035的残基51-57；SEQ ID NO.:2037的残基90-101；SEQ ID NO.:2038的残基31-35；SEQ ID NO.:2038的残基51-57；SEQ ID NO.:2038的残基90-101；SEQ IDNO.:2039的残基31-35；SEQ ID NO.:2039的残基51-57；SEQ ID NO.:2039的残基90-101；SEQ ID NO.:2040的残基31-35；SEQ ID NO.:2040的残基51-57；SEQ ID NO.:2040的残基90-101；SEQ ID NO.:2041的残基31-35；SEQ ID NO.:2041的残基51-57；SEQ ID NO.:2041的残基90-101；SEQ IDNO.:2042的残基31-35；SEQ ID NO.:2042的残基51-57；SEQ ID NO.:2042的残基90-101；SEQ ID NO.:2043的残基31-35；SEQ ID NO.:2043的残基51-57；SEQ ID NO.:2043的残基90-101；SEQ ID NO.:2044的残基31-35；SEQ ID NO.:2044的残基51-57；SEQ ID NO.:2044的残基90-101；SEQ IDNO.:2045的残基31-35；SEQ ID NO.:2045的残基51-57；SEQ ID NO.:2045的残基90-101；SEQ ID NO.:2046的残基31-35；SEQ ID NO.:2046的残基51-57；SEQ ID NO.:2046的残基90-101；SEQ ID NO.:2047的残基31-35；SEQ ID NO.:2047的残基51-57；SEQ ID NO.:2047的残基90-101；SEQ IDNO.:2048的残基31-35；SEQ ID NO.:2048的残基51-57；SEQ ID NO.:2048的残基90-101；SEQ ID NO.:2049的残基31-35；SEQ ID NO.:2049的残基51-57；和SEQ ID NO.:2049的残基90-101。

3.根据权利要求2所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含至少3个CDR。

4.根据权利要求3所述的结合蛋白，其中所述至少3个CDR包含选自下述的可变结构域CDR组：

VH MSL10CDR组

VH MSL10CDR-H1 SEQ ID NO:3的残基31-35 VH MSL10CDR-H2 SEQ ID NO:3的残基50-66 VH MSL10CDR-H3 SEQ ID NO:3的残基99-108 VL MSL10CDR组 VL MSL10CDR-L1 SEQ ID NO:4的残基23-34 VL MSL10CDR-L2 SEQ ID NO:4的残基51-57 VL MSL10CDR-L3 SEQ ID NO:4的残基90-101 VH MSL10AM1CDR组 VH MSL10AM1CDR-H1 SEQ ID NO:2020的残基31-35 VH MSL10AM1CDR-H2 SEQ ID NO:2020的残基50-66 VH MSL10AM1CDR-H3 SEQ ID NO:2020的残基99-108 VL MSL10AM1CDR组 VL MSL10AM1CDR-L1 SEQ ID NO:2035的残基23-34 VL MSL10AM1CDR-L2 SEQ ID NO:2035的残基51-57 VL MSL10AM1CDR-L3 SEQ ID NO:2035的残基90-101 VH MSL10AM2CDR组 VH MSL10AM2CDR-H1 SEQ ID NO:2021的残基31-35 VH MSL10AM2CDR-H2 SEQ ID NO:2021的残基50-66 VH MSL10AM2CDR-H3 SEQ ID NO:2021的残基99-108 VL MSL10AM2CDR组 VL MSL10AM2CDR-L1 SEQ ID NO:2036的残基23-34 VL MSL10AM2CDR-L2 SEQ ID NO:2036的残基51-57 VL MSL10AM2CDR-L3 SEQ ID NO:2036的残基90-101 VH MSL10AM3CDR组 VH MSL10AM3CDR-H1 SEQ ID NO:2022的残基31-35 VH MSL10AM3CDR-H2 SEQ ID NO:2022的残基50-66 VH MSL10AM3CDR-H3 SEQ ID NO:2022的残基99-108

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VH MSL10AM10CDR-H1 SEQ ID NO:2029的残基31-35 VH MSL10AM10CDR-H2 SEQ ID NO:2029的残基50-66 VH MSL10AM10CDR-H3 SEQ ID NO:2029的残基99-108 VL MSL10AM10CDR组 VL MSL10AM10CDR-L1 SEQ ID NO:2044的残基23-34 VL MSL10AM10CDR-L2 SEQ ID NO:2044的残基51-57 VL MSL10AM10CDR-L3 SEQ ID NO:2044的残基90-101 VH MSL10AM10CDR组 VH MSL10AM11CDR-H1 SEQ ID NO:2030的残基31-35 VH MSL10AM11CDR-H2 SEQ ID NO:2030的残基50-66 VH MSL10AM11CDR-H3 SEQ ID NO:2030的残基99-108 VL MSL10AM10CDR组 VL MSL10AM11CDR-L1 SEQ ID NO:2045的残基23-34 VL MSL10AM11CDR-L2 SEQ ID NO:2045的残基51-57 VL MSL10AM11CDR-L3 SEQ ID NO:2045的残基90-101 VH MSL10AM1.2CDR组 VH MSL10AM1.2CDR-H1 SEQ ID NO:2031的残基31-35 VH MSL10AM1.2CDR-H2 SEQ ID NO:2031的残基50-66 VH MSL10AM1.2CDR-H3 SEQ ID NO:2031的残基99-108 VL MSL10AM1.2CDR组 VL MSL10AM1.2CDR-L1 SEQ ID NO:2046的残基23-34 VL MSL10AM1.2CDR-L2 SEQ ID NO:2046的残基51-57 VL MSL10AM1.2CDR-L3 SEQ ID NO:2046的残基90-101 VH MSL10AM2.2CDR组 VH MSL10AM2.2CDR-H1 SEQ ID NO:2032的残基31-35 VH MSL10AM2.2CDR-H2 SEQ ID NO:2032的残基50-66 VH MSL10AM2.2CDR-H3 SEQ ID NO:2032的残基99-108

VL MSL10AM2.2CDR组 VL MSL10AM2.2CDR-L1 SEQ ID NO:2047的残基23-34 VL MSL10AM2.2CDR-L2 SEQ ID NO:2047的残基51-57 VL MSL10AM2.2CDR-L3 SEQ ID NO:2047的残基90-101 VH MSL10AM3.2CDR组 VH MSL10AM3.2CDR-H1 SEQ ID NO:2033的残基31-35 VH MSL10AM3.2CDR-H2 SEQ ID NO:2033的残基50-66 VH MSL10AM3.2CDR-H3 SEQ ID NO:2033的残基99-108 VL MSL10AM3.2CDR组 VL MSL10AM3.2CDR-L1 SEQ ID NO:2048的残基23-34 VL MSL10AM3.2CDR-L2 SEQ ID NO:2048的残基51-57 VL MSL10AM3.2CDR-L3 SEQ ID NO:2048的残基90-101 VH MSL10AM4.2CDR组 VH MSL10AM4.2CDR-H1 SEQ ID NO:2034的残基31-35 VH MSL10AM4.2CDR-H2 SEQ ID NO:2034的残基50-66 VH MSL10AM4.2CDR-H3 SEQ ID NO:2034的残基99-108 VL MSL10AM4.2CDR组 VL MSL10AM4.2CDR-L1 SEQ ID NO:2049的残基23-34 VL MSL10AM4.2CDR-L2 SEQ ID NO:2049的残基51-57 VL MSL10AM4.2CDR-L3 SEQ ID NO:2049的残基90-101 VH MSL17CDR组 VH MSL17CDR-H1 SEQ ID NO:5的残基31-35 VH MSL17CDR-H2 SEQ ID NO:5的残基50-66 VH MSL17CDR-H3 SEQ ID NO:5的残基99-115 VL MSL17CDR组 VL MSL17CDR-L1 SEQ ID NO:6的残基23-33 VL MSL17CDR-L2 SEQ ID NO:6的残基49-55

VL MSL17CDR-L3 SEQ ID NO:6的残基88-96 VH MSL9-8CDR组 VH MSL9-8CDR-H1 SEQ ID NO:7的残基31-35 VH MSL9-8CDR-H2 SEQ ID NO:7的残基50-66 VH MSL9-8CDR-H3 SEQ ID NO:7的残基99-107 VL MSL9-8CDR组 VL MSL9-8CDR-L1 SEQ ID NO:8的残基23-33 VL MSL9-8CDR-L2 SEQ ID NO:8的残基49-55 VL MSL9-8CDR-L3 SEQ ID NO:8的残基88-95 VH MSK9CDR组 VH MSK9CDR-H1 SEQ ID NO:9的残基31-35 VH MSK9CDR-H2 SEQ ID NO:9的残基50-66 VH MSK9CDR-H3 SEQ ID NO:9的残基99-107 VL MSK9CDR组 VL MSK9CDR-L1 SEQ ID NO:10的残基24-39 VL MSK9CDR-L2 SEQ ID NO:10的残基55-61 VL MSK9CDR-L3 SEQ ID NO:10的残基94-112 VH MSK13CDR组 VH MSK13CDR-H1 SEQ ID NO:11的残基31-35 VH MSK13CDR-H2 SEQ ID NO:11的残基50-66 VH MSK13CDR-H3 SEQ ID NO:11的残基99-111 VL MSK13CDR组 VL MSK13CDR-L1 SEQ ID NO:12的残基24-39 VL MSK13CDR-L2 SEQ ID NO:12的残基55-61 VL MSK13CDR-L3 SEQ ID NO:12的残基94-113

VH MSK21CDR组 VH MSK21CDR-H1 SEQ ID NO:13的残基31-37 VH MSK21CDR-H2 SEQ ID NO:13的残基52-69 VH MSK21CDR-H3 SEQ ID NO:13的残基102-122 VL MSK21CDR组 VL MSK21CDR-L1 SEQ ID NO:14的残基24-34 VL MSK21CDR-L2 SEQ ID NO:14的残基50-56 VL MSK21CDR-L3 SEQ ID NO:14的残基89-97

VH AE10-6AM1CDR组

VL AE10-6AM1组

VH AE10-6AM2CDR组

VL AE10-6AM2组

VH AE10-6AM3CDR组

VH AE10-6AM3CDR-H1 SEQ ID NO:2000的残基31-37 VH AE10-6AM3CDR-H2 SEQ ID NO:2000的残基52-69

VH AE10-6AM3CDR-H3 SEQ ID NO:2000的残基102-122

VL AE10-6AM3组

VH AE10-6AM4CDR组

VL AE10-6AM4组

VH AE10-6AM5CDR组

VL AE10-6AM5组

VL AE10-6AM5CDR-L1SEQ ID NO:2012的残基24-34

VH AE10-6AM6CDR组

VL AE10-6AM6组

VL AE10-6AM6CDR-L1 SEQ ID NO:2013的残基24-34

VL AE10-6AM6CDR-L2 SEQ ID NO:2013的残基50-56 VL AE10-6AM6CDR-L3 SEQ ID NO:2013的残基89-97

VH AE10-6AM7CDR组

VL AE10-6AM7组

VH AE10-6AM8CDR组

VL AE10-6AM8组

VH AE10-6AM9CDR组

VL AE10-6AM9组

VH AE10-6AM10CDR组

VL AE10-6AM10组

5.根据权利要求4所述的结合蛋白，所述结合蛋白包含至少两个可变结构域CDR组。

6.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述至少两个可变结构域CDR组选自下述：VH MSL10CDR组和VL MSL10CDR组；VH MSL17CDR组和VL MSL17CDR组；VH MSL9-8CDR组和VL MSL9-8CDR组；VHMSK9CDR组和VL MSK9CDR组；VH MSK13CDR组和VL MSK13CDR组；VH MSK21CDR组和VL MSK21CDR组；VH AE10-6AM1CDR组和VL AE10-6AM1CDR组；VH AE10-6AM2CDR组和VL AE10-6AM2CDR组；VH AE10-6AM3CDR组和VL AE10-6AM3CDR组；VH AE10-6AM4CDR组和VL AE10-6AM4CDR组；VH AE10-6AM5CDR组和VL AE10-6AM5CDR组；VH AE10-6AM6CDR组和VL AE10-6AM6CDR组；VHAE10-6AM7CDR组和VL AE10-6AM7CDR组；VH AE10-6AM8CDR组和VL AE10-6AM8CDR组；VH AE10-6AM9CDR组和VL AE10-6AM9CDR组；VH AE10-6AM10CDR组和VL AE10-6AM10CDR组；VH MSL10AM1CDR组和VL MSL10AM1CDR组；VH MSL10AM2CDR组和VL MSL10AM2CDR组；VH MSL10AM3CDR组和VL MSL10AM3CDR组；VHMSL10AM4CDR组和VL MSL10AM4CDR组；VH MSL10AM5CDR组和VL MSL10AM5CDR组；VH MSL10AM6CDR组和VL MSL10AM6CDR组；VH MSL10AM7CDR组和VL MSL10AM7CDR组；VH MSL10AM8CDR组和VL MSL10AM8CDR组；VH MSL10AM9CDR组和VL MSL10AM9CDR组；VH MSL10AM10CDR组和VL MSL10AM10CDR组；VHMSL10AM1.2CDR组和VL MSL10AM1.2CDR组；VH MSL10AM2.2CDR组和VL MSL10AM2.2CDR组；VH MSL10AM3.2CDR组和VL MSL10AM3.2CDR组；以及VH MSL10AM4.2CDR组和VL MSL10AM4.2CDR组。

7.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含具有选自下述的氨基酸序列的至少一个可变结构域：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14；SEQ ID NO1719-1866；SEQ ID NO1867-1997；SEQ ID NO1998-2007；SEQ ID NO2008-2017；SEQ ID NO2020-2034；和SEQ ID NO2035-2049。

8.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含两个可变结构域，其中第一可变结构域包含选自SEQ ID NO3、5、7、9、11、13、1719-1866、1998-2007、2018和2020-2034的序列，并且其中第二可变结构域包含选自SEQ ID NO4、6、8、10、12、1867-1997、2007-2017、2019和2035-2049的序列。

9.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白：

(a)能够调节硬化蛋白的生物学功能；

(b)能够中和硬化蛋白；

(c)其中所述硬化蛋白是前人硬化蛋白；成熟人硬化蛋白或截短的人硬化蛋白；

(d)其中所述结合蛋白降低硬化蛋白与其受体结合的能力；和/或

(e)其中中和结合蛋白能够降低下述中的一种或多种：Th1调节；Th2调节；Nk调节；嗜中性粒细胞调节；单核细胞-巨噬细胞谱系调节；嗜中性粒细胞调节；嗜酸性粒细胞调节；B细胞调节；细胞因子调节；趋化因子调节；粘附分子调节；和细胞募集调节。

10.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中通过表面等离子共振测量，所述结合蛋白具有至少约10²M^-1s^-1；至少约10³M^-1s^-1；至少约10⁴M^-1s^-1；至少约10⁵M^-1s^-1；或至少约10⁶M^-1s^-1的与硬化蛋白的结合速率常数(K_on)。

11.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中通过表面等离子共振测量，所述结合蛋白具有至多约10^-3s^-1；至多约10^-4s^-1；至多约10^-5s^-1；或至多约10^-6s^-1的与硬化蛋白的分离速率常数(K_off)。

12.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白具有至多约10^-7M；至多约10^-8M；至多约10^-9M；至多约10^-10M；至多约10^-11M；至多约10^-12M；和至多约10^-13M的与硬化蛋白的解离常数(K_D)。

13.一种编码根据权利要求1所述的结合蛋白氨基酸序列的分离的核酸。

14.一种包含根据权利要求13所述的分离的核酸的载体。

15.一种包含根据权利要求15所述的载体的宿主细胞。

16.一种产生能够结合硬化蛋白的蛋白质的方法，所述方法包括在足以产生能够结合硬化蛋白的结合蛋白的条件下，在培养基中培养根据权利要求16所述的宿主细胞。

17.一种由根据权利要求16所述的方法产生的蛋白质。

18.一种用于处理哺乳动物的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的根据权利要求17所述的蛋白质的步骤。

19.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1所述的结合蛋白和药学可接受的载体。

20.根据权利要求19所述的药物组合物，所述药物组合物还包含用于治疗硬化蛋白活性有害的疾病的至少一种另外的治疗剂。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述另外的试剂选自治疗剂、显像剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻滞剂；粘附分子阻滞剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；氨甲蝶呤；环孢素；雷帕霉素；FK506；可检测标记或报道物；TNF拮抗剂；抗风湿药；肌肉松弛剂、麻醉药、非类固醇抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛皮癣药、皮质类固醇、同化类固醇、促红细胞生成素、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药物、刺激物、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、口服类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子和细胞因子拮抗剂。

22.一种用于降低人硬化蛋白活性的方法，所述方法包括使人硬化蛋白与根据权利要求1所述的结合蛋白接触，使得人硬化蛋白活性降低。

23.一种用于降低患有硬化蛋白活性有害的疾病的人受试者的人硬化蛋白活性的方法，所述方法包括给所述人受试者施用根据权利要求1所述的结合蛋白，使得所述人受试者的人硬化蛋白活性降低。

24.一种治疗患有硬化蛋白活性有害的疾病或障碍的受试者的方法，所述方法通过给所述受试者施用根据权利要求1所述的结合蛋白，来实现治疗。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述疾病选自下述：呼吸障碍；哮喘；变态反应性和非变态反应性哮喘；感染引起的哮喘；呼吸道合胞病毒(RSV)感染引起的哮喘；慢性阻塞性肺疾病(COPD)、涉及气道炎症的病症；嗜酸性细胞增多症；纤维化和/或粘液产生过多；囊性纤维化；肺纤维化；特应性障碍；特应性皮炎；荨麻疹；湿疹；变应性鼻炎；变应性肠胃炎；皮肤的炎症和/或自身免疫性病症；胃肠道器官的炎症和/或自身免疫性病症；炎性肠病(IBD)；溃疡性结肠炎；克罗恩氏病；肝的炎性和/或自身免疫性病症；肝硬化；肝纤维化；由乙型肝炎和/或丙型肝炎病毒引起的肝纤维化；硬皮病；肿瘤；癌症；肝细胞癌；成胶质细胞瘤；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤；病毒感染；HTLV-1感染(例如来自HTLV-1)；保护性1型免疫应答表达的阻抑、和在疫苗接种过程中保护性1型免疫应答表达的阻抑。

26.一种治疗患有硬化蛋白有害的疾病的患者的方法，所述方法包括在施用第二试剂之前、同时或之后施用根据权利要求1所述的结合蛋白的步骤，其中所述第二试剂选自吸入型类固醇；β-激动剂；短效或长效β-激动剂；白三烯或白三烯受体的拮抗剂；ADVAIR；IgE抑制剂；抗IgE抗体；XOLAIR；磷酸二酯酶抑制剂；PDE4抑制剂；黄嘌呤；抗胆碱能药；肥大细胞稳定剂；色甘酸；IL-4抑制剂；IL-5抑制剂；嗜酸细胞活化趋化因子/CCR3抑制剂；组胺或其受体包括H1、H2、H3和H4的拮抗剂；前列腺素D或其受体DP1和CRTH2的拮抗剂；TNF拮抗剂；TNF受体的可溶片段；ENBREL；TNF酶拮抗剂；TNF转换酶(TACE)抑制剂；毒蕈碱受体拮抗剂；TGF-β拮抗剂；干扰素γ；吡非尼酮；化学治疗剂、氨甲蝶呤；来氟米特；西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物、CCI-779；COX2或cPLA2抑制剂；NSAID；免疫调节剂；p38抑制剂；TPL-2、MK-2和NFkB抑制剂；布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素；柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制剂；美沙拉嗪；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1β抗体；抗IL-6抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF的抗体或激动剂；CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体；FK506；雷帕霉素；霉酚酸酯；布洛芬；泼尼松龙；磷酸二酯酶抑制剂；腺苷激动剂；抗血栓药；补体抑制剂；肾上腺素能剂；IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂；IL-1β转换酶抑制剂；TNF-α转换酶抑制剂；T细胞信号传导抑制剂；金属蛋白酶抑制剂；6-巯嘌呤；血管紧张素转换酶抑制剂；可溶性细胞因子受体；可溶性p55TNF受体；可溶性p75TNF受体；sIL-1RI；sIL-1RII；sIL-6R；抗炎细胞因子；IL-4；IL-10；IL-11；SOST；和TGF-β。

27.一种包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中

VD1是第一重链可变结构域；

VD2是第二重链可变结构域；

C是重链恒定结构域；

X1是接头，条件是它不是CH1；

X2是Fc区；

(X1)n是(X1)0或(X1)1；

(X2)n是(X2)0或(X2)1；和

其中

(a)VD1或VD2包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674和1684，并且所述结合蛋白能够结合硬化蛋白和另一靶标；

(b)VD1和VD2独立地包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674和1684，并且所述结合蛋白能够结合硬化蛋白和硬化蛋白；

(c)VD1包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674和1684，VD2包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、472、482、492、502、512、522、532、542、552、562、572、582、592、602、612、622、632、642、652、662、672、682、692、702、712、722、732、742、752、762、772、782、792、802、812、822、832、842、852、862、872、882、892、902、912、922、932、942、952、962、972、982、992、1002、1012、1022、1032、1042、1052、1062、1072、1082、1092、1102、1112、1122、1132、1142、1152、1162、1172、1182、1192、1202、1212、1222、1232、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1342、1352、1362、1372、1382、1392、1402、1412、1422、1432、1442、1452、1462、1472、1482、1492、1502、1512、1522、1532、1542、1552、1562、1572、1582、1592、1602、1612、1622、1632、1642、1652、1662、1672和1682，并且所述结合蛋白能够结合硬化蛋白和TNF-α；或

(d)VD2包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674和1684，VD1包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、472、482、492、502、512、522、532、542、552、562、572、582、592、602、612、622、632、642、652、662、672、682、692、702、712、722、732、742、752、762、772、782、792、802、812、822、832、842、852、862、872、882、892、902、912、922、932、942、952、962、972、982、992、1002、1012、1022、1032、1042、1052、1062、1072、1082、1092、1102、1112、1122、1132、1142、1152、1162、1172、1182、1192、1202、1212、1222、1232、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1342、1352、1362、1372、1382、1392、1402、1412、1422、1432、1442、1452、1462、1472、1482、1492、1502、1512、1522、1532、1542、1552、1562、1572、1582、1592、1602、1612、1622、1632、1642、1652、1662、1672和1682，并且所述结合蛋白能够结合TNF-α和硬化蛋白。

28.根据权利要求27所述的结合蛋白，其中VD1-(X1)n-VD2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、481、491、501、511、521、531、541、551、561、571、581、591、601、611、621、631、641、651、661、671、681、691、701、711、721、731、741、751、761、771、781、791、801、811、821、831、841、851、861、871、881、891、901、911、921、931、941、951、961、971、981、991、1001、1011、1021、1031、1041、1051、1061、1071、1081、1091、1101、1111、1121、1131、1141、1151、1161、1171、1181、1191、1201、1211、1221、1231、1241、1251、1261、1271、1281、1291、1301、1311、1321、1331、1341、1351、1361、1371、1381、1391、1401、1411、1421、1431、1441、1451、1461、1471、1481、1491、1501、1511、1521、1531、1541、1551、1561、1571、1581、1591、1601、1611、1621、1631、1641、1651、1661、1671和1681。

29.一种包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中

VD1是第一轻链可变结构域；

VD2是第二轻链可变结构域；

C是轻链恒定结构域；

X1是接头，条件是它不是CL；

X2不包含Fc区；

(X1)n是(X1)0或(X1)1；

(X2)n是(X2)0或(X2)1；和

其中

(a)VD1或VD2包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679和1689，并且所述结合蛋白能够结合硬化蛋白和另一靶标；

(b)VD1和VD2独立地包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679和1689，并且所述结合蛋白能够结合硬化蛋白和硬化蛋白；

(c)VD1包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679和1689，VD2包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、387、397、407、417、427、437、447、457、467、477、487、497、507、517、527、537、547、557、567、577、587、597、607、617、627和637，并且所述结合蛋白能够结合硬化蛋白和TNF-α；或

(d)VD2包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679和1689，VD1包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、387、397、407、417、427、437、447、457、467、477、487、497、507、517、527、537、547、557、567、577、587、597、607、617、627、637、647、657、667、677、687、697、707、717、727、737、747、757、767、777、787、797、807、817、827、837、847、857、867、877、887、897、907、917、927、937、947、957、967、977、987、997、1007、1017、1027、1037、1047、1057、1067、1077、1087、1097、1107、1117、1127、1137、1147、1157、1167、1177、1187、1197、1207、1217、1227、1237、1247、1257、1267、1277、1287、1297、1307、1317、1327、1337、1347、1357、1367、1377、1387、1397、1407、1417、1427、1437、1447、1457、1467、1477、1487、1497、1507、1517、1527、1537、1547、1557、1567、1577、1587、1597、1607、1617、1627、1637、1647、1657、1667、1677和1687，并且所述结合蛋白能够结合TNF-α和硬化蛋白。

30.根据权利要求29所述的结合蛋白，其中所述VD1-(X1)n-VD2包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、386、396、406、416、426、436、446、456、466、476、486、496、506、516、526、536、546、556、566、576、586、596、606、616、626、636、646、656、666、676、686、696、706、716、726、736、746、756、766、776、786、796、806、816、826、836、846、856、866、876、886、896、906、916、926、936、946、956、966、976、986、996、1006、1116、1126、1136、1146、1156、1166、1176、1186、1196、1206、1216、1226、1236、1246、1256、1266、1276、1286、1296、1306、1316、1326、1336、1346、1356、1366、1376、1386、1396、1406、1416、1426、1436、1446、1456、1466、1476、1486、1496、1506、1516、1526、1536、1546、1556、1566、1576、1586、1596、1606、1616、1626、1636、1646、1656、1666、1676和1686。

31.根据权利要求28或29所述的结合蛋白，其中(X1)n是(X1)0和/或(X2)n是(X2)0。

32.一种包含第一多肽链和第二多肽链的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含第一VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中

VD1是第一重链可变结构域；

VD2是第二重链可变结构域；

C是重链恒定结构域；

X1是第一接头；

X2是Fc区；

(X1)n是(X1)0或(X1)1；

(X2)n是(X2)0或(X2)1；和

其中所述第二多肽链包含第二VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中

VD1是第一轻链可变结构域；

VD2是第二轻链可变结构域；

C是轻链恒定结构域；

X1是第二接头；

X2不包含Fc区；

(X1)n是(X1)0或(X1)1；

(X2)n是(X2)0或(X2)1；和

其中所述第一X1接头和第二X1接头是相同或不同的；

其中所述第一X1接头不是CH1和/或所述第二X1接头不是CL，和

其中

(a)VD1或VD2重链可变结构域包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674和1684，VD1或VD2轻链可变结构域包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679和1689，并且所述结合蛋白能够结合硬化蛋白和另一靶标；

(b)VD1和VD2重链可变结构域独立地包含选自下述的三个CDR：SEQID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674和1684，VD1或VD2轻链可变结构域包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679和1689，并且所述结合蛋白能够结合硬化蛋白和硬化蛋白；

(c)VD1重链可变结构域包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674和1684，VD2重链可变结构域包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、472、482、492、502、512、522、532、542、552、562、572、582、592、602、612、622、632、642、652、662、672、682、692、702、712、722、732、742、752、762、772、782、792、802、812、822、832、842、852、862、872、882、892、902、912、922、932、942、952、962、972、982、992、1002、1012、1022、1032、1042、1052、1062、1072、1082、1092、1102、1112、1122、1132、1142、1152、1162、1172、1182、1192、1202、1212、1222、1232、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1342、1352、1362、1372、1382、1392、1402、1412、1422、1432、1442、1452、1462、1472、1482、1492、1502、1512、1522、1532、1542、1552、1562、1572、1582、1592、1602、1612、1622、1632、1642、1652、1662、1672和1682；VD1轻链可变结构域包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679和1689，VD2轻链可变结构域包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、387、397、407、417、427、437、447、457、467、477、487、497、507、517、527、537、547、557、567、577、587、597、607、617、627、637、647、657、667、677、687、697、707、717、727、737、747、757、767、777、787、797、807、817、827、837、847、857、867、877、887、897、907、917、927、937、947、957、967、977、987、997、1007、1017、1027、1037、1047、1057、1067、1077、1087、1097、1107、1117、1127、1137、1147、1157、1167、1177、1187、1197、1207、1217、1227、1237、1247、1257、1267、1277、1287、1297、1307、1317、1327、1337、1347、1357、1367、1377、1387、1397、1407、1417、1427、1437、1447、1457、1467、1477、1487、1497、1507、1517、1527、1537、1547、1557、1567、1577、1587、1597、1607、1617、1627、1637、1647、1657、1667、1677和1687，并且所述结合蛋白能够结合硬化蛋白和TNF-α；或

(d)VD2重链可变结构域包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394、404、414、424、434、444、454、464、474、484、494、504、514、524、534、544、554、564、574、584、594、604、614、624、634、644、654、664、674、684、694、704、714、724、734、744、754、764、774、784、794、804、814、824、834、844、854、864、874、884、894、904、914、924、934、944、954、964、974、984、994、1004、1014、1024、1034、1044、1054、1064、1074、1084、1094、1114、1124、1134、1144、1154、1164、1174、1184、1194、1204、1214、1224、1234、1244、1254、1264、1274、1284、1294、1304、1314、1324、1334、1344、1354、1364、1374、1384、1394、1404、1414、1424、1434、1444、1454、1464、1474、1484、1494、1504、1514、1524、1534、1544、1554、1564、1574、1584、1594、1604、1614、1624、1634、1644、1654、1664、1674和1684，VD1重链可变结构域包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、382、392、402、412、422、432、442、452、462、472、482、492、502、512、522、532、542、552、562、572、582、592、602、612、622、632、642、652、662、672、682、692、702、712、722、732、742、752、762、772、782、792、802、812、822、832、842、852、862、872、882、892、902、912、922、932、942、952、962、972、982、992、1002、1012、1022、1032、1042、1052、1062、1072、1082、1092、1102、1112、1122、1132、1142、1152、1162、1172、1182、1192、1202、1212、1222、1232、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1242、1252、1262、1272、1282、1292、1302、1312、1322、1332、1342、1352、1362、1372、1382、1392、1402、1412、1422、1432、1442、1452、1462、1472、1482、1492、1502、1512、1522、1532、1542、1552、1562、1572、1582、1592、1602、1612、1622、1632、1642、1652、1662、1672和1682；VD2轻链可变结构域包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、389、399、409、419、429、439、449、459、469、479、489、499、509、519、529、539、549、559、569、579、589、599、609、619、629、639、649、659、669、679、689、699、709、719、729、739、749、759、769、779、789、799、809、819、829、839、849、859、869、879、889、899、909、919、929、939、949、959、969、979、989、999、1009、1019、1029、1039、1049、1059、1069、1079、1089、1099、1109、1119、1129、1139、1149、1159、1169、1179、1189、1199、1209、1219、1229、1239、1249、1259、1269、1279、1289、1299、1309、1319、1329、1339、1349、1359、1369、1379、1389、1399、1409、1419、1429、1439、1449、1459、1469、1479、1489、1499、1509、1519、1529、1539、1549、1559、1569、1579、1589、1599、1609、1619、1629、1639、1649、1659、1669、1679和1689，VD1轻链可变结构域包含选自下述的三个CDR：SEQ ID NO:27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、387、397、407、417、427、437、447、457、467、477、487、497、507、517、527、537、547、557、567、577、587、597、607、617、627、637、647、657、667、677、687、697、707、717、727、737、747、757、767、777、787、797、807、817、827、837、847、857、867、877、887、897、907、917、927、937、947、957、967、977、987、997、1007、1017、1027、1037、1047、1057、1067、1077、1087、1097、1107、1117、1127、1137、1147、1157、1167、1177、1187、1197、1207、1217、1227、1237、1247、1257、1267、1277、1287、1297、1307、1317、1327、1337、1347、1357、1367、1377、1387、1397、1407、1417、1427、1437、1447、1457、1467、1477、1487、1497、1507、1517、1527、1537、1547、1557、1567、1577、1587、1597、1607、1617、1627、1637、1647、1657、1667、1677和1687，并且所述结合蛋白能够结合TNF-α和硬化蛋白。

33.根据权利要求28、29或32所述的结合蛋白，其中X1或X2为选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:1695、1696、1697、1698、1699、1700、1701、1702、1703、1704、1705、1706、1707、1708、1709、1710、1711、1712、1713、1714、1715、1716、2050、2051、2052、2053、2054、2055、2056、2057、2058和2059。

34.根据权利要求33所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含两条第一多肽链和两条第二多肽链。

35.根据权利要求28、29或32所述的结合蛋白，其中所述Fc区是变体序列Fc区。

36.根据权利要求28、29或32所述的结合蛋白，其中所述Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD。

37.根据权利要求28、29或32所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链的VD1和所述第二多肽链的VD1分别得自相同的第一亲本抗体和第二亲本抗体、或其抗原结合部分。

38.根据权利要求28、29或32中任意一个所述的结合蛋白，其中所述抗TNF-α抗体结合TNF-α的效力不同于所述抗硬化蛋白抗体结合人硬化蛋白的效力。

39.根据权利要求28、29或32中任意一个所述的结合蛋白，其中所述抗TNF-α抗体结合TNF-α的亲和力不同于所述抗硬化蛋白抗体结合人硬化蛋白的亲和力。

40.根据权利要求28、29或32所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白具有由所述抗TNF-α抗体或所述抗硬化蛋白抗体显示出下述至少一种所需特性：抗原特异性、对抗原的亲和力、效力、生物学功能、表位识别、稳定性、可溶性、生产效率、免疫原性、药物代谢动力学、生物利用度、组织交叉反应性或直向同源抗原结合。

41.一种包含四条多肽链的能够结合两个抗原的结合蛋白，其中两条多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中

VD1是第一重链可变结构域；

VD2是第二重链可变结构域；

C是重链恒定结构域；

X1是第一接头；

X2是Fc区；

(X1)n是(X1)0或(X1)1；

(X2)n是(X2)0或(X2)1；和

其中两条多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中

VD1是第一轻链可变结构域；

VD2是第二轻链可变结构域；

C是轻链恒定结构域；

X1是第二接头；

X2不包含Fc区；

(X1)n是(X1)0或(X1)1；

(X2)n是(X2)0或(X2)1；和

其中所述第一X1接头和第二X1接头是相同或不同的；

其中所述第一X1接头不是CH1和/或所述第二X1接头不是CL，和

其中

42.根据权利要求27、29、32或41所述的结合蛋白，其中通过表面等离子共振测量，所述结合蛋白具有至少约10²M^-1s^-1；至少约10³M^-1s^-1；至少约10⁴M^-1s^-1；至少约10⁵M^-1s^-1；或至少约10⁶M^-1s^-1的与一种或多种靶标的结合速率常数(Kon)。

43.根据权利要求27、29、32或41所述的结合蛋白，其中通过表面等离子共振测量，所述结合蛋白具有至多约10^-3s^-1；至多约10^-4s^-1；至多约10^-5s^-1；或至多约10^-6s^-1的与一种或多种靶标的分离速率常数(Koff)。

44.根据权利要求27、29、32或41所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白具有至多约10^-7M；至多约10^-8M；至多约10^-9M；至多约10^-10M；至多约10^-11M；至多约10^-12M；或至多10^-13M的与一种或多种靶标的解离常数(KD)。

45.一种包含根据权利要求27、29、32或41所述的结合蛋白序列的结合蛋白构建体，所述结合蛋白构建体还包含接头多肽和/或免疫球蛋白恒定结构域。

46.根据权利要求45所述的结合蛋白构建体，其中所述结合蛋白是免疫球蛋白分子、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、Fab’、双特异性抗体、F(ab’)2、Fv或DVD结合蛋白。

47.根据权利要求46所述的结合蛋白构建体，其中所述结合蛋白包含人IgM恒定结构域、人IgG4恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgE恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域或人IgA恒定结构域。

48.根据权利要求46所述的结合蛋白构建体，所述结合蛋白构建体包含具有选自SEQ ID NO:1691、SEQ ID NO:1692、SEQ ID NO:1693和SEQID NO:1694的氨基酸序列的免疫球蛋白恒定结构域。

49.一种包含根据权利要求27、29、32或41所述的结合蛋白构建体的结合蛋白缀合物，所述结合蛋白缀合物还包含免疫粘附分子、显像剂、治疗剂或细胞毒性剂。

50.一种编码根据权利要求27、29、32或41所述的结合蛋白氨基酸序列的分离的核酸。

51.一种编码根据权利要求50所述的硬化蛋白结合蛋白构建体氨基酸序列的分离的核酸。

52.一种包含根据权利要求51所述的分离的核酸的载体。

53.一种包含根据权利要求52所述的载体的宿主细胞。

54.一种产生能够结合硬化蛋白的蛋白质的方法，所述方法包括在足以产生能够结合硬化蛋白的结合蛋白的条件下，在培养基中培养根据权利要求53所述的宿主细胞。

55.一种由根据权利要求54所述的方法产生的蛋白质。

56.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求27、29、32或41所述的结合蛋白和药学可接受的载体。

57.一种用于处理哺乳动物的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的根据权利要求56所述的组合物的步骤。

58.根据权利要求56所述的药物组合物，所述药物组合物还包含用于治疗硬化蛋白活性有害的疾病的至少一种另外的治疗剂。

59.根据权利要求58所述的药物组合物，其中所述另外的试剂选自治疗剂、显像剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻滞剂；粘附分子阻滞剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；氨甲蝶呤；环孢素；雷帕霉素；FK506；可检测标记或报道物；TNF拮抗剂；抗风湿药；肌肉松弛剂、麻醉药、非类固醇抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛皮癣药、皮质类固醇、同化类固醇、促红细胞生成素、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药物、刺激物、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、口服类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子和细胞因子拮抗剂。

60.一种用于降低人硬化蛋白活性的方法，所述方法包括使人硬化蛋白与根据权利要求27、29、32或41所述的结合蛋白接触，使得人硬化蛋白活性降低。

61.一种用于降低硬化蛋白活性有害的疾病的人受试者的人硬化蛋白活性的方法，所述方法包括给所述人受试者施用根据权利要求27、29、32或41所述的结合蛋白，使得所述人受试者的人硬化蛋白活性降低。

62.一种治疗硬化蛋白活性有害的疾病或障碍的受试者的方法，所述方法通过给所述受试者施用根据权利要求27、29、32或41所述的结合蛋白，来实现治疗。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述障碍选自下述：呼吸障碍；哮喘；变态反应性和非变态反应性哮喘；感染引起的哮喘；呼吸道合胞病毒(RSV)感染引起的哮喘；慢性阻塞性肺疾病(COPD)、涉及气道炎症的病症；嗜酸性细胞增多症；纤维化和/或粘液产生过多；囊性纤维化；肺纤维化；特应性障碍；特应性皮炎；荨麻疹；湿疹；变应性鼻炎；变应性肠胃炎；皮肤的炎性和/或自身免疫性病症；胃肠道器官的炎性和/或自身免疫性病症；炎性肠病(IBD)；溃疡性结肠炎；克罗恩氏病；肝的炎性和/或自身免疫性病症；肝硬化；肝纤维化；由乙型肝炎和/或丙型肝炎引起的肝纤维化；硬皮病；肿瘤；癌症；肝细胞癌；成胶质细胞瘤；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤；病毒感染；HTLV-1感染(例如来自HTLV-1)；保护性1型免疫应答表达的阻抑、和在疫苗接种过程中保护性1型免疫应答表达的阻抑。

64.一种治疗患有硬化蛋白有害的疾病的患者的方法，所述方法包括在施用第二试剂之前、同时或之后施用根据权利要求27、29、32或41所述的结合蛋白的步骤，其中所述第二试剂选自吸入类固醇；β-激动剂；短效或长效β-激动剂；白三烯或白三烯受体的拮抗剂；ADVAIR；IgE抑制剂；抗IgE抗体；XOLAIR；磷酸二酯酶抑制剂；PDE4抑制剂；黄嘌呤；抗胆碱能药；肥大细胞稳定剂；色甘酸；IL-4抑制剂；IL-5抑制剂；嗜酸细胞活化趋化因子/CCR3抑制剂；组胺或其受体包括H1、H2、H3和H4的拮抗剂；前列腺素D或其受体DP1和CRTH2的拮抗剂；TNF拮抗剂；TNF受体的可溶片段；ENBREL；TNF酶拮抗剂；TNF转换酶(TACE)抑制剂；毒蕈碱受体拮抗剂；TGF-β拮抗剂；干扰素γ；吡非尼酮；化学治疗剂、氨甲蝶呤；来氟米特；西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物、CCI-779；COX2或cPLA2抑制剂；NSAID；免疫调节剂；p38抑制剂；TPL-2、MK-2和NFkB抑制剂；布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素；柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制剂；美沙拉嗪；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1β抗体；抗IL-6抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF的抗体或激动剂；CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体；FK506；雷帕霉素；霉酚酸酯；布洛芬；泼尼松龙；磷酸二酯酶抑制剂；腺苷激动剂；抗血栓药；补体抑制剂；肾上腺素能剂；IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂；IL-1β转换酶抑制剂；TNF-α转换酶抑制剂；T细胞信号传导抑制剂；金属蛋白酶抑制剂；6-巯嘌呤；血管紧张素转换酶抑制剂；可溶性细胞因子受体；可溶性p55TNF受体；可溶性p75TNF受体；sIL-1RI；sIL-1RII；sIL-6R；抗炎细胞因子；IL-4；IL-10；IL-11；SOST；和TGF-β。

65.一种用于生成DVD结合蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：

a)获得能够结合TNF-α的第一亲本抗体或其抗原结合部分；

b)获得能够结合人硬化蛋白的第二亲本抗体或其抗原结合部分；

c)构建根据权利要求27、29、32或41中任一项所述的包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的多肽链；

e)表达所述多肽链；

使得生成DVD结合蛋白。