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PATENTANSPRUCH
Verwendung von Darm-Salzlake, die durch Einsalzen von vom Darmschleim befreiten Tierdärmen erhalten worden ist, zur Herstellung von reinem Heparin.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Darm-Salzlake, die durch Einsalzen von vom Darmschleim befreiten Tierdärmen erhalten wurde, zur Herstellung von reinem Heparin.
Mit Heparin steht der Medizin seit langem ein natürlich vorkommendes Antikoagulierungsmittel zur Verfügung, das auch in der modernen Medizin nach wie vor unentbehrlich ist und immer breitere Anwendung findet.
In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Verfahren bekannt, die alle zum Ziel haben, den Wirkstoff Heparin auf immer schonendere Weise aus Heparin-haltigem tierischem Gewebe wie Lunge, Leber und in neuerer Zeit vor allem aus Darmschleim (Mucosa) von Schweinen, Rindern und Schafen zu isolieren (britisches Patent 754 885, deutsche Patentschrift 1 228 241, US-Patent 3 058 884, deutsche Patentschrift 1 253 868). Derartige Rohstoffe haben wegen ihrer leichten Verderblichkeit den Nachteil einer begrenzten Lagerfähigkeit, die durch Gefrieren zwar verlängert werden kann, was jedoch neben technischem Mehraufwand auch zu erheblichen Kostensteigerungen führt. Bei der Aufarbeitung werden sowohl das Betriebspersonal als auch Anwohner aus der angrenzenden Umgebung nicht selten wegen der damit verbundenen Geruchsbelästigung vor unzumutbare Probleme gestellt.
In der deutschen Patentschrift 1 253 868 wird die Gewinnung von Heparin für einige übliche Verfahren zusammenfassend beschrieben. Danach bringt man das tierische Gewebe in der Anfangsstufe mit einer heissen wässrigen Salzlösung in Berührung, um das Heparin aus den Zellen herauszulösen.
Der Heparinanteil des dabei anfallenden Mediums ist äusserst gering.
Es wurde nun gefunden, dass die in den Schlachthöfen und Darmschleimereien anfallende Salzlake Heparin enthält. Diese Salzlake entsteht z.B., wenn man Tierdärme, die vorher vom Darmschleim befreit wurden, zur Konservierung und Entwässerung mit festem Kochsalz einstreut.
Es ist deshalb im Hinblick auf DBP 1 253 868 als ausgesprochen überraschend zu bezeichnen, dass die beim blossen Einsalzen von tierischen Därmen entstandene Salzlake grössere Mengen Heparin enthält. Es war auch nicht zu erwarten, dass dieses Heparin fast völlig frei von chemisch verwandten Nebenprodukten vorkommt, so dass Salzlake, bisher nur als umweltbelastendes Abfallprodukt bekannt, eine neue Rohstoffquelle für das durch Rohstoffengpässe bereits sehr knappe Heparin darstellt. Durch das weitgehende Fehlen von Verunreinigungen kann die Aufarbeitung zum Rohheparin besonders schonend vorgenommen werden und es entfallen damit die nach dem bisherigen Stand der Technik bekannten aufwendigen Isolierungsmethoden (siehe US-Patent 3 451 996 und britisches Patent 1 221 784).
Man gelangt schliesslich zu Heparinqualitäten, die in den auf dem Markt verfügbaren Heparinpräparaten bei weitem nicht erreicht werden. Die nach bekannten Aufarbeitungsverfahren aus erfindungsgemäss verwendeter Darm-Salzlake als Rohstoff isolierten Rohheparine liegen bereits in solcher Reinheit vor, dass die sich anschliessende Reinigung zu Heparinen mit weit über 200 USP-Einheiten/mg führt. Die bis jetzt im Handel erhältlichen Heparinpräparate besitzen in der Regel Heparin-Qualitäten von 150 USP-Einheiten/mg, in einigen wenigen Fällen auch 155 USP-Einheiten/mg. Dabei versteht man unter einer USP Einheit/mg die spezifische Aktivität, die sich aus dem U. S. P.
assay ergibt, mit dem die Hemmung der Klümpchenbildung von konserviertem Schafsplasma gemessen wird. 1 USP-Einheit entspricht etwa 1,1 internationalen Einheiten (UJ). Da die Aktivitätswerte der im Handel befindlichen Heparin-Präparate trotz zahlreicher Verfahrensverbesserungen weiterhin unbefriedigend sind, schreibt z.B. USP vor, dass Heparinpräparate (aus Darmschleim) mindestens 140 USP-Einheiten enthalten müssen. Lediglich im Labor gelang es bisher L. W. Kananagh und L. B. Jaques [Arzneimittelforschung (Drug Res.) 24, Nr. 12, 1942 (1974)] Heparin durch wiederholte Kristallisation als Bariumsalz mit maximal 175 USP-E/mg isolieren.
Durch die erfindungsgemässe Verwendung von Darm Salzlalre als Rohstoff gelang es, Heparin in technischem Massstab in einer Reinheit zu isolieren, dass es als nahezu farblose Substanz vorliegt. Alle bis heute aus anderen Rohstoffen verfügbaren Rohheparine müssen dagegen erst durch aufwendige und verlustreiche Verfahren entfärbt werden (US-Patent 3 179 566).
Salzlake ist darüber hinaus ein lagerfähiger, fast geruchsloser Rohstoff, der durch lange Lagerung keine Qualitätseinbussen erfährt. Damit entfallen chemische und andere Konservierungsmethoden.
Die Erfindung betrifft somit die Verwendung von Darm Salzlake als Rohstoffquelle für die Herstellung von reinem Heparin. Das reine Heparin kann aus den Salzlösungen von tierischem Gewebe nach an sich bekannten Verfahren isoliert werden.
Beispiel 1
600 Ltr. Salzlake wurden in einem 1500-Ltr.-Rührwerk bei Raumtemperatur unter Rühren innerhalb einer halben Stunde mit 600 Ltr. Methanol versetzt. Es wurde die gleiche Zeit nachgerührt, wonach die Mischung ca. eine Stunde stehen blieb.
Nun dekantierte man den trüben Überstand in ein zweites Gefäss und liess den ausgefallenen Salzkuchen zurück. Die gewonnene Suspension blieb nun zwei Tage stehen. Danach wurde wieder dekantiert, der Überstand verworfen und der Niederschlag durch Zentrifugieren isoliert. Nach dem Trocknen im Vakuum erhielt man 1,68 kg eines Produkts, das 11 USP-Einheiten/mg besitzt. Es besteht noch zu ca. 60% aus Kochsalz.
Beispiel 2
Ahnlich britischem Patent 754 885 wurden 3 Ltr. Salzlake unter Rühren mit Essigsäure auf pH 3,1-3,2 angesäuert (ca.
50 ml). Nach einigen Stunden wurde dekantiert und der Rest zentrifugiert. Der Niederschlag wurde verworfen, die vereinigten Lösungen wurden mit Natronlauge neutralisiert.
Nun wurde unter Rühren langsam mit dem gleichen Volumen Methanol versetzt. Nach 45 Minuten wurde vom ausgefallenen Kochsalz dekantiert. Diese Suspension liess man mehrere Stunden stehen, dekantierte den Überstand und zentrifu- gierte den Rest. Die Fällung wurde im Vakuum getrocknet.
Man erhielt 3,76 g mit 23 USP-Einheiten/mg.
Beispiel 3
3 Ltr. Salzlake wurden mit 14 Ltr. Wasser verdünnt. Dann wurden 50 g Kieselgur sowie eine Lösung von 7 g Bezethoniumchlorid (3 Hyamin 1622, Rohm & Haas) in 100 ml Wasser zugegeben. Nach einigen Stunden wurde dekantiert und der Rest abgesaugt. Nach dem Waschen mit Wasser wurde der noch feuchte Niederschlag dreimal nach dem Verfahren aus der deutschen Patentschrift 1 228 241 mit je 200 ml 2 molarer Kochsalzlösung extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 2 Volumenteilen Methanol gefällt. Der isolierte und
getrocknete Niederschlag wog 560 mg und besass eine Aktivität von 163 USP-Einheiten/mg.
Beispiel 4
3 Ltr. Salzlake wurden unter Rühren mit Essigsäure auf pH 3,1-3,2 gebracht. Nach mehreren Stunden wurde dekantiert und der Rest zentrifugiert. Die vereinigten Lösungen wurden mit Wasser auf 15,5 Ltr. verdünnt und mit 40 g Kieselgur sowie 7 g Benzethoniumchlorid (Hyamin 1622) in 100 ml Wasser versetzt.
Nach einigen Stunden wurde der Niederschlag wie im Beispiel 3 isoliert und weiterverarbeitet.
Man erhielt schliesslich 796 mg mit 105 USP-Einheiten/mg.
Beispiel 5
3 Ltr. Salzlake wurden mit 13 Ltr. Wasser verdünnt (vgl.
deutsche Patentschrift 1156 938). Dann wurde mit Essigsäure (ca. 50 ml) auf pH 3,2 angesäuert. Nach einigen Stunden hatte sich eine Fällung abgesetzt, die nach dem Dekantieren des klaren Überstandes abzentrifugiert wurde. Nach dem Trocknen erhielt man 16,6 g Rohheparin mit 5,5 USP-Einheiten/ mg.
Beispiel 6
10 Ltr. Salzlake wurden mit 50 Ltr. Wasser verdünnt. Diese Lösung wurde durch ein Filter über eine Ionenaustauschersäule mit einem Durchmesser von 26 mm und einer Länge von 380 mm gepumpt (ca. 3 Ltr./Std.). Es wurde ein mittelbasisches makroporöses Anionenaustauscherharz in der Cl-Form verwendet (Lewatit CA 9249). Es können auch andere Anionenaustauscherharze verwendet werden, wie z.B. das in der deutschen Patentschrift 1 253 868 beschriebene Dowex 1 X-1.
Anschliessend wurde das Harz aus der Säule entfernt, zweimal mit 500 ml 0,9 molarer Kochsalzlösung gewaschen und mit 400 ml 2 molarer Kochsalzlösung 5 Stunden bei 400C unter Rühren eluiert. Diese Lösung wurde mit 1,5 Volumenteilen Methanol gefällt. Der isolierte und getrocknete Niederschlag wog 1,5 g und besass 152 USP-Einheiten/mg.
Beispiel 7
Ein Aliquot des Roliheparins aus Beispiel 1 entsprechend 425 000 USP-E bzw. 38,65 g, wurde dreimal mit je 200 ml zweimolarer Kochsalzlösung extrahiert, wobei jeweils eine Stunde bei 60OC gerührt wurde. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser verdünnt, bis die Lösung ca. 0,9 Mol/l Chloridionen enthielt. Es wurden nun 200 ml eines Anionenaustauschers (Lewatit CA 9249) in der Chlorid-Form zugegeben und man rührte eine Stunde. Anschliessend wurde abgesaugt und mit ca. 200 ml 0,9 molarer Kochsalzlösung nachgewaschen. Der Ionenaustauscher wurde dann fünf Stunden mit zweimolarer Kochsalzlösung bei 400C gerührt und danach abgesaugt und mit zweimolarer Kochsalzlösung nachgewaschen.
Die Elutionslösung wurde mit der Waschlösung vereinigt und mit dem 1,5flachen Volumen Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, erst mit ca. 50 ml Wasser Methanol (1 + 1,5 Volumenteile), dann mit ca. 50 ml Methanol nachgewaschen und getrocknet.
Man erhielt 1,91 g Na-Heparinat mit 202 USP-Einheiten pro mg.
Beispiel 8
15 g eines nach Beispiel 7 erhaltenen Natriumheparinats mit ca. 200 USP-Einheiten pro mg wurden in 200 ml zweimolarer Kochsalzlösung aufgelöst. Die Lösung wurde über eine Nutsche gesaugt und der Rückstand wurde mit zunächst 30 ml zweimolarer Kochsalzlösung, dann mit ca. 250 ml vollentsalztem Wasser gewaschen. Die vereinigten Lösungen wurden nun mit vollentsalztem Wasser auf eine Chlorid-Molarität von 0,9 gebracht. Nun wurde analog zu Beispiel 7 die Reinigung mit einem Liter Lewatit CA 9249 wiederholt.
Die vereinigte Elutions- und Waschlösung wurde wie oben weiterverarbeitet. Nach dem Waschen und Trocknen der Fällung erhielt man 11,1 g Natriumheparinat, das eine Aktivität von 254 USP-Einheiten pro mg besass.
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PATENT CLAIM
Use of intestinal brine, which has been obtained by salting animal intestines freed from intestinal mucus, for the production of pure heparin.
The present invention relates to the use of intestinal brine, which has been obtained by salting animal intestines freed from intestinal mucus, for the production of pure heparin.
With heparin, medicine has long been a naturally occurring anticoagulant, which is still indispensable in modern medicine and is being used more and more.
In recent years, a number of processes have become known, all of which aim to use heparin more and more gently from animal tissue containing heparin, such as lungs, liver and, more recently, primarily from intestinal mucosa (pigs, cattle and Isolate sheep (British Patent 754 885, German Patent 1 228 241, US Patent 3 058 884, German Patent 1 253 868). Because of their perishability, such raw materials have the disadvantage of a limited shelf life, which can be extended by freezing, but this also leads to considerable cost increases in addition to additional technical outlay. During the refurbishment, both the operating staff and residents from the surrounding area are often faced with unreasonable problems due to the associated odor nuisance.
The German patent specification 1 253 868 describes the production of heparin for some common processes in summary. Then the animal tissue is brought into contact with a hot aqueous salt solution in the initial stage in order to remove the heparin from the cells.
The heparin portion of the medium is extremely low.
It has now been found that the brine obtained in the slaughterhouses and intestinal mucilages contains heparin. This brine is created, for example, if animal intestines that have previously been freed from intestinal mucus are sprinkled with solid table salt for preservation and drainage.
With regard to DBP 1 253 868, it is therefore extremely surprising that the brine that results from the mere salting of animal intestines contains large amounts of heparin. It was also not to be expected that this heparin would be almost completely free of chemically related by-products, so that brine, previously only known as an environmentally harmful waste product, represents a new source of raw material for heparin, which is already very scarce due to raw material shortages. Due to the largely lack of impurities, the processing to crude heparin can be carried out particularly gently and the elaborate isolation methods known from the prior art are thus eliminated (see US Pat. No. 3,451,996 and British Pat. No. 1,221,784).
Ultimately, heparin qualities are achieved that are far from being achieved in the heparin preparations available on the market. The crude heparin isolated as raw material from the intestinal brine used according to the invention as known as a raw material is already in such purity that the subsequent purification leads to heparins with well over 200 USP units / mg. The heparin preparations that are commercially available so far generally have heparin qualities of 150 USP units / mg, in a few cases also 155 USP units / mg. One USP unit / mg is the specific activity resulting from the U.S.P.
assay, with which the inhibition of lump formation of preserved sheep plasma is measured. 1 USP unit corresponds to approximately 1.1 international units (UJ). Since the activity values of the commercially available heparin preparations are still unsatisfactory despite numerous process improvements, e.g. USP stipulates that heparin preparations (from intestinal mucus) must contain at least 140 USP units. Only in the laboratory have L. W. Kananagh and L. B. Jaques [Drug Research (Drug Res.) 24, No. 12, 1942 (1974)] been able to isolate heparin by repeated crystallization as a barium salt with a maximum of 175 USP-E / mg.
By using Darm Salzlalre as a raw material according to the invention, it was possible to isolate heparin on a technical scale in a purity that it is present as an almost colorless substance. On the other hand, all crude heparin available from other raw materials to date only have to be decolorized by complex and lossy processes (US Pat. No. 3,179,566).
Brine is also a storable, almost odorless raw material that does not suffer any loss of quality due to long storage. This eliminates the need for chemical and other conservation methods.
The invention thus relates to the use of intestinal brine as a raw material source for the production of pure heparin. The pure heparin can be isolated from the salt solutions of animal tissue by methods known per se.
example 1
600 liters of brine were mixed in a 1500 liter stirrer at room temperature with stirring within half an hour with 600 liters of methanol. The same time was stirred, after which the mixture remained for about an hour.
Now the cloudy supernatant was decanted into a second vessel and the failed salt cake was left behind. The suspension obtained now remained for two days. The mixture was then decanted again, the supernatant discarded and the precipitate isolated by centrifugation. After drying in vacuo, 1.68 kg of a product having 11 USP units / mg was obtained. It still consists of about 60% table salt.
Example 2
Similar to British patent 754 885, 3 liters of brine were acidified to pH 3.1-3.2 with stirring with acetic acid (approx.
50 ml). After a few hours it was decanted and the rest centrifuged. The precipitate was discarded, the combined solutions were neutralized with sodium hydroxide solution.
The same volume of methanol was then slowly added while stirring. After 45 minutes, the precipitated table salt was decanted. This suspension was left to stand for several hours, the supernatant decanted and the rest centrifuged. The precipitate was dried in vacuo.
3.76 g was obtained at 23 USP units / mg.
Example 3
3 liters of brine were diluted with 14 liters of water. Then 50 g of diatomaceous earth and a solution of 7 g of bezethonium chloride (3 Hyamin 1622, Rohm & Haas) in 100 ml of water were added. After a few hours, it was decanted and the rest was suctioned off. After washing with water, the still moist precipitate was extracted three times using the method from German Patent 1,228,241, each with 200 ml of 2 molar saline solution. The combined extracts were precipitated with 2 parts by volume of methanol. The isolated and
dried precipitate weighed 560 mg and had an activity of 163 USP units / mg.
Example 4
3 l of brine were brought to pH 3.1-3.2 with stirring with acetic acid. After several hours it was decanted and the rest centrifuged. The combined solutions were diluted to 15.5 liters with water and 40 g of diatomaceous earth and 7 g of benzethonium chloride (Hyamin 1622) in 100 ml of water were added.
After a few hours, the precipitate was isolated and processed as in Example 3.
Finally 796 mg with 105 USP units / mg were obtained.
Example 5
3 liters of brine were diluted with 13 liters of water (cf.
German patent 1156 938). The mixture was then acidified to pH 3.2 with acetic acid (approx. 50 ml). After a few hours, a precipitate had settled, which was centrifuged off after decanting the clear supernatant. After drying, 16.6 g of crude heparin at 5.5 USP units / mg were obtained.
Example 6
10 liters of brine were diluted with 50 liters of water. This solution was pumped through a filter over an ion exchange column with a diameter of 26 mm and a length of 380 mm (approx. 3 liters / hour). A medium-based macroporous anion exchange resin in the Cl form was used (Lewatit CA 9249). Other anion exchange resins can also be used, e.g. the Dowex 1 X-1 described in German Patent 1,253,868.
The resin was then removed from the column, washed twice with 500 ml of 0.9 molar sodium chloride solution and eluted with 400 ml of 2 molar sodium chloride solution for 5 hours at 400 ° C. with stirring. This solution was precipitated with 1.5 parts by volume of methanol. The isolated and dried precipitate weighed 1.5 g and had 152 USP units / mg.
Example 7
An aliquot of the roliheparin from Example 1, corresponding to 425,000 USP-E or 38.65 g, was extracted three times with 200 ml of two molar saline solution, stirring in each case at 60OC. The combined extracts were diluted with water until the solution contained about 0.9 mol / l chloride ion. 200 ml of an anion exchanger (Lewatit CA 9249) in the chloride form were then added and the mixture was stirred for one hour. It was then suctioned off and washed with about 200 ml of 0.9 molar saline. The ion exchanger was then stirred for five hours with two-molar sodium chloride solution at 40.degree. C. and then suctioned off and washed with two-molar sodium chloride solution.
The elution solution was combined with the washing solution and precipitated with 1.5 times the volume of methanol. The precipitate was centrifuged off, first washed with about 50 ml of water methanol (1 + 1.5 parts by volume), then with about 50 ml of methanol and dried.
1.91 g of Na heparinate with 202 USP units per mg were obtained.
Example 8
15 g of a sodium heparin obtained according to Example 7 with about 200 USP units per mg were dissolved in 200 ml of two-molar saline. The solution was sucked through a suction filter and the residue was washed first with 30 ml of two-molar sodium chloride solution, then with about 250 ml of completely deionized water. The combined solutions were then brought to a chloride molarity of 0.9 with deionized water. The cleaning was then repeated analogously to Example 7 with one liter of Lewatit CA 9249.
The combined elution and washing solution was processed as above. After washing and drying the precipitate, 11.1 g of sodium heparinate was obtained, which had an activity of 254 USP units per mg.