CH471819A

CH471819A - Verfahren zur Herstellung neuer Tetrakosapeptide

Info

Publication number: CH471819A
Application number: CH524261A
Authority: CH
Inventors: Heini Dr Kappeler; Schwyzer Robert Dr Prof
Original assignee: Ciba Geigy
Priority date: 1961-05-04
Filing date: 1961-05-04
Publication date: 1969-04-30
Also published as: FR2051M

Description


  



  Verfahren zur Herstellung neuer Tetrakosapeptide
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des Tetrakosapeptids der Formel L-Seryl-L  tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutaminyl-(oder    L-glutamyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl - L-tryptophyl  glycyl-L-lySyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lySyl-L- arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- L-lysyl - L-valyl - L-ty-    rosyl-L-prolin.



   Die neuen Verbindungen sowie ihre Säureadditionssalze haben eine hohe adrenocorticotrope Wirksamkeit und können in der Human- und Veterinärmedizin als reine, einheitliche Stoffe anstelle von ACTH verwendet werden. Die Verbindungen können ferner als Zwischenprodukte zur Herstellung von Heilmitteln, die eine längere Kette von Aminosäure aufweisen, wie der adrenocorticotropen Hormone selbst, verwendet werden.



   Die neuen Tetrakosapeptide können nach den für die Peptidherstellung bekannten Methoden, z. B. der Carbodiimidmethode, der Azidmethode, der Methode abtivierten Ester oder der Anhydridmethode, erhalten werden, wobei die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft werden.



   Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Aminosäuren L-Serin, L Tyrosin, L-Serin, L-Methionin, L-Glutamin (oder L Glutaminsäure), L-Histidin, L-Phenylalanin, L-Arginin, L-Tryptophan, Glycin, L-Lysin, L-Prolin, L-Valin, Glycin, L-Lysin, L-Lysin, L-Arginin, L-Arginin, L-Prolin, L-Valin, L-Lysin, L-Valin, L-Tyrosin und L-Prolin in der angegebenen Reihenfolge unter intermediärem Schutz der   Amino- bzw.    Carboxylgruppen miteinander vereinigt. In den Fig. 1 bis 3 sind Ausführungsformen des Verfahrens dargestellt. BOC bedeutet die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, tBu die tertiäre-Butylgruppe, iBu die Isobutylgruppe, Z die Carbobenzyloxygruppe, PZ die para-Phenylazobenzyloxycarbonylgruppe, T den Trityl (Triphenylmethyl-)rest.

   Das gemäss Fig. 1 als Ausgangsstoff verwendete Decapeptid kann nach dem Verfahren des Patentes Nr. 408 948 hergestellt werden; das Tetradecapeptid erhält man beispielsweise nach dem Schema der Fig. 2. Das in Fig. 3 als Ausgangsstoff verwendete Tetrapeptidderivat BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-NH-NH2 kann gemäss dem Verfahren des Patentes Nr. 408 948 hergestellt werden, das Hexapeptidderivat Z-Glu(OtBu)-His Phe-Arg-(NO2)-Try-Gly-OH gemäss dem Verfahren des Patentes Nr. 427 842.



   Die an der Reaktion nicht beteiligten freien funktionellen Gruppen können mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste geschützt werden, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, z. B. mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p Nitrobenzylalkohol, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung des Tosyl-,   Tritylrestes    oder der Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der   p-Phenylazobenzyloxycarbonylgruppe    und der p-(p' Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe, oder insbesondere des   tert.-Butyloxycarbonylrestes.    Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidinogruppierung des Arginins ist die Nitrogruppe geeignet; die genannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden. 
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<tb>    Fig. 3    
Die Umwandlung einer geschützten NH2-Gruppe in eine freie Gruppe sowie die Überführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens zur Herstellung der Tetrakosapeptide und Zwischenprodukte kann nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln erfolgen.



   Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren Salze gewinnen.



   Die verfahrensgemäss erhaltenen Tetrakosapeptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial.



   Die chromatographischen Systeme werden wie folgt bezeichnet: System 43: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser    (100:40:55).   



  System 45: sek.-Butanol-3   O/o    Ammoniak   (100:44).   



  System 49: sek.-Butanol-Triäthylamin-Diäthyl barbitursäure-Wasser-Isopropanol    (100:0,8:1,8 g:60:10).   



  System 54: sek.-Butanol-Isopropanol-Monochlor essigsäure-Wasser   (70:10:3      g:40).   



  System 100:   Sithylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser       (60:20:6:11).   



  System 102: Äthylacetat-Methyläthylketon-Ameisen säure-Wasser (50:30:10:10).



   Beispiel 1    PZ-Lys-(BOC)-Pro- Val-Gly-NH-NH2   
1,15 g (1,5 mMol) PZ-Lys-(BOC)-Pro-Val-Gly  LOCHS    (Patent Nr. 427 841) werden in 15 ml absolutem Methanol mit 0,6 ml Hydrazinhydrat während einer Stunde am Rückfluss gekocht. Das Lösungsmittel dampft man im Vakuum zur Trockene ein und fällt das Hydrazid mit viel   Äther    aus. Das anfänglich gallertige Produkt wird beim Zerkratzen fest. Man filtriert ab und wäscht auf der Nutsche gut mit   Äther    nach. Nach dem Trocknen über Schwefelsäure gewinnt man 1,1 g PZ Tetrapeptidhydrazid, F.   130-1310.   



   Eine Probe aus heissem Wasser umkristallisiert zeigt den gleichen Schmelzpunkt. Das Hydrazid ist in der Kälte noch in 250/oiger Essigsäure gut löslich.



   Beispiel 2    Z-Arg-(NO2)-Pro-OCH3   
3,06 g (23,7 mMol) Prolinmethylester in 20 ml Acetonitril gibt man zur Lösung von 7,18 g (20,3 mMol) Carbobenzoxy-nitro-L-arginin in 20 ml Dimethylformamid, kühlt mit Eiskochsalz auf - 50 bis - 100 und versetzt hierauf mit der Lösung von 4,9 g Dicyclohexylcarbodiimid in 12 ml   Dimethylformamid : Acetonitril      =    1:1.



  Die Reaktionslösung wird noch mit 20 ml eiskaltem Acetonitril verdünnt und 17 Stunden bei   0     belassen.



  Der gebildete Harnstoff wird abfiltriert, mit Acetonnitril gewaschen und zur Lösung 5 Tropfen Eisessig gegeben. Nach 30 Minuten dampft man das Lösungsmittel zur Trockene ein, nimmt den Verdampfungsrückstand in Essigester auf, filtriert nochmals durch Watte vom abgeschiedenen Harnstoff ab und wäscht die Essigesterlösung 3mal mit 10 ml   l-n.    Salzsäure, 2mal mit Wasser, so lange mit 1-n. Natriumbicarbonatlösung, bis beimAnsäuern der alk. Auszüge keine Trübung mehr feststellbar ist, und zum Schluss mit Wasser neutral.



   Beim Eindampfen der getrockneten Essigesterlösung auf ein kleines Volumen fällt   der Carbobenzoxydipeptid-    ester beinahe quantitativ aus. Ausbeute: 6,16 g (65,5   O/o    d. Th.), F.   155-1570    (Sintern   153 ).   



   Beispiel 3    H-Arg-(NO2)-Pro-OCH3   
8,4 g Z-Arg-(NO2)-Pro-OCH3 werden unter Erwärmen in 27 ml Eisessig in der Wärme gelöst und bei Zimmertemperatur mit 27 ml   -    4-n. Bromwasserstoff Eisessiglösung versetzt. Nach einer Stunde dampft man im Vakuum bei 400 auf ein kleines Volumen ein und fällt das Decarbobenzoxylösungsprodukt mit viel absolutem Äther aus. Das anfänglich klebrige Produkt wird so lange mit absolutem Äther behandelt, bis ein feines Pulver resultiert. Zur weiteren Reinigung wird das Dihydrobromid des Dipeptidesters noch einmal aus Methanol/Äther umgefällt. Die leicht gelb gefärbte Verbindung nimmt man in 4 ml Wasser auf, gibt dazu 150 ml Chloroform und kühlt das Gemisch im Eisbad auf   0     ab.

   Unter intensivem Umschwenken gibt man in Portionen so lange festes Kaliumcarbonat dazu, bis alles Wasser verbraucht ist und sich das Kaliumcarbonat fest abscheidet. Das Kaliumcarbonat wird noch ein zweites Mal mit frischem Chloroform extrahiert, die vereinigten Chloroformextrakte über wasserfreiem Kaliumcarbonat getrocknet und durch eine G4-Glasfilternutsche durch wenig Cellit filtriert. Nach dem Verdampfen des Chloroforms bei   40     erhält man 5,5 g (90 O/o d. Th.) Nitro-Larginyl-prolin-methylester. Die Verbindung wird ohne weitere Umsetzung weiterverarbeitet.



   Beispiel 4
Z-A   (NO2)-Arg (NO2)-Pro-OCH3   
8,34 g   (25,2mMol)      H-Arg(NO2)-Pro-OCH3    in 25 ml frisch destilliertem Dimethylformamid werden mit der Lösung von 8,92 g (25,2 mMol)   Z-Arg(NO2)-OH    vereinigt, mit 50 ml Acetonitril verdünnt und im Kältebad   auf - 100    gekühlt. Nach 30minütigem Stehen bei dieser Temperatur gibt man unter Rühren 5,71 g (27,7 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 12,5 ml eiskaltem Acetonitril, dazu und lässt 22 Stunden bei   0     reagieren.



  Der Harnstoff wird abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum bis auf ein kleines Volumen eingedampft. Den sirupösen Rückstand nimmt man in Chloroform auf, wäscht 3mal mit 10 ml 1-n. Salzsäure, 2mal mit 10 ml Wasser und so lange mit 1-n. Natriumbicarbonat und 1-n. Sodalösung, bis beim Ansäuern der alkalischen Auszüge keine Fällung bzw. Trübung mehr nachweisbar ist. Zum Schluss werden die Chloroformauszüge mit Wasser neutral gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhält man 10,4 g (62 O/o) rohen Carbobenzoxy-tripeptidester.



   Eine Probe des Rohproduktes mit 2-n. Bromwasserstoff-Eisessiglösung, eine Stunde bei Zimmertemperatur gespalten, zeigt im Papierchromatogramm in den Systemen 54 und 49 neben dem Tripeptid noch weitere Men gen von Nitroarginin und einem andern Nebenprodukt.



  Zur Reinigung werden 4,6 g Rohprodukt aus 140 ml n-Butanol kristallisiert. Ausbeute: 2,2 g reiner Carbobenzoxy-tripeptidester, F. =   1200    (Zers.).



     [&alpha;]D26    =   43,90    + 10 (c = 1,032 in Methanol).



   Im UV-Spektrum zeigt der Carbobenzoxy-tripeptidester bei 271 m  das für Nitroarginin charakteristische Maximum (E = 32 200).



   Beispiel 5
H-A   rg(NQ)-Arg(NQ)-Prn-OCH3   
2,19 g (3,3 mMol)   Z-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-OCH3    werden in 13,2 ml 2-n. Bromwasserstoffsäure-Eisessiglösung während 1 Stunde bei Zimmertemperatur decarbobenzoxyliert. Nach dem Verdampfen der überschüssigen Säure fällt man das Decarbobenzoxylierungsprodukt mit viel absolutem Äther aus. Das Rohprodukt nimmt man in 2 ml Wasser auf, extrahiert 2mal mit frischem Essigester, wäscht die Essigesterphasen noch einmal mit Wasser und gibt die vereinigten wässrigen Lösungen auf eine   lonenaustauschersäule    Merck II. Den freien Tripeptidester eluiert man mit 200 ml Wasser und dampft das Wasser im Vakuum bei   40     ab. Ausbeute: 1,3 g (74 % d. Th.).



   Im Papierchromatogramm in den Systemen 43, 49 und 54 gibt der freie Tripeptidester mit Ninhydrin nur je einen positiven Fleck. Rf.   43/0,42;    49/0,67 und   54/0,49.   



   Beispiel 6
T-Lys(BOC)-A   rg(NO2)-A      rg (NO2)-Pro-OCH3   
1,07 g (2,01 mMol)   H-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-    OCH3 in 16,5 ml Dimethylformamid/Acetonitril 1:1 werden auf -10  gekühlt. Unter intensivem Rühren trägt man rasch 1,44 g   T-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OH    (Patent Nr. 427 841) in die Lösung ein, verdünnt mit
10 ml vorgekühltem Acetonitril und gibt nach 10 Minuten 456 mg (2,2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml eiskaltem Acetonitril dazu. Nach 20stündiger Re aktionszeit bei   0     filtriert man vom Harnstoff ab und dampft das Lösungsmittel im Vakuum bei 400 ab. Den nicht umgesetzten Tripeptidester fällt man mit viel Essigester aus, dampft hierauf die Essigesterlösung zur Trockene ein und nimmt den Verdampfungsrückstand in wenig Aceton auf.

   Nach dem Filtrieren durch Watte wird der N-Trityl-pentapeptidester mit viel   Äther    ausgefällt.



   Eine mit wasserfreier Trifluoressigsäure gespaltene Probe des Trityl-pentapeptidesters zeigt im Papierchromatogramm im System 49 neben dem Pentapeptidme thylester Rf. 0,29 noch sehr wenig der beiden Ausgangs materialien. (Dipeptid-H-Lys-Lys-OH [Rf. =   0,12]    und
Tripeptidester Nitro-arginyl-nitro-arginyl-prolinmethyl ester [Rf. =   0,53].)   
Zur Analyse werden 200 mg nach Craig zwischen
80 % Methanol und Chloroform:Tetrachlorkohlenstoff
1:1 über 100 Stufen multiplikativ verteilt. Die Haupt menge der Substanz (180 mg) befindet sich in den Ele menten 16-28. Diese werden vereinigt und noch einmal aus   Aceton/Äther    umgefällt. F.   134-136 .   



     [&alpha;]D26    = -41,2    #    0,4  (c = 2,709 in Methanol).



   UV-Spektrum:   #max    271 m    #    = 32 500 in Fein sprit.



   Beispiel 7    H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-A rg (NO2)-A rg (NO2)-   
Pro-OCH3
1,46 g   (1,19    mMol)   Na-Trityl-pentapeptidmethyl-    ester (Beispiel 6) werden in 50 ml 750/oige Essigsäure während 45 Minuten bei   30     gespalten, dann bei   30     die Essigsäure im Hochvakuum abgedampft und der Verdampfungsrückstand zwischen 1%ige Essigsäure und Äther verteilt. Nach dem Verdampfen der Ätherlösung gewinnt man in quantitativer Ausbeute das Triphenylcarbinol. Die Essigsäurelösung wird ebenfalls im Hochvakuum bei 400 verdampft und der Rückstand im Scheidetrichter zwischen n-Butanol und N-Sodalösung verteilt. Der pH der wässrigen Phase muss pH 8,5 sein.



  Die Butanolauszüge wäscht man mit Wasser neutral und trocknet sie über Natriumsulfat. Ausbeute: 1,03 g (880/oig).



   Die Verbindung wird ohne weitere Reinigung direkt weiter verarbeitet.



   Beispiel 8
PZ-Lys(BOC)-Pro-   Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-   
A   rg (NO2)-A      rg (NO2)-Pro-OCH3   
900 mg (1,2   mMol)      PZ-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-    hydrazid werden in 10 ml Dimethylformamid auf -10  gekühlt, dann lässt man langsam 4 ml 1-n. Salzsäure einlaufen und tropft anschliessend   bei 100    unter gutem Rühren 1,4 ml eiskalte 1-n. Natriumnitritlösung dazu.



  Nach 30 Sekunden beginnt sich das Azid als klebrige Verbindung abzuscheiden. Man lässt noch 3 Minuten bei -10  reagieren und versetzt hierauf das Reaktionsgemisch mit 150 ml Eiswasser. Das klebrige schlecht filtrierbare Azid wird mit eiskaltem Essigester extrahiert und die Essigesterphasen mit Wasser neutral gewaschen (3mal), dann in der Kälte über Magnesiumsulfat getrocknet und durch eine kalte G4-Glasnutsche in die   eisgekühlte    Lösung von 1,03 g   ( #    1 mMol) H Lys(BOC) -Lys(BOC)   -Arg(NO2)      -Arg(NO2) - Pro - OCH3    filtriert. Man lässt 22 Stunden bei   0     und 3 Stunden bei   30     reagieren. Die Reaktionslösung wird mit Wasser (40 ml), 4mal mit 10 ml 1%iger Essigsäurelösung, 5mal mit 10 ml 1-n.

   Natriumbicarbonatlösung und zum Schluss mit Wasser und ges. Kochsalzlösung gewaschen.



  Beim Eindampfen der getrockneten Lösung fällt das Nonapeptidderivat aus. Ausbeute: 1,70 g Rohprodukt.



   Zur weiteren Reinigung nimmt man 1,52 g Rohprodukt in wenig Chloroform auf und filtriert durch eine Säule von 45 g Silikagel. Einmaliges Umfällen des Eluates aus 10 ml Chloroform mit Äther ergibt 1,06 g PZ Nonapeptidmethylester. F.   134-140     (Zers.).



   Im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel G; Merck) im System   Dioxan : Wasser    = 9:1 ist nur eine Substanz mit dem Rf.-Wert 0,75 nachweisbar. In den Systemen   Chloroform:Aceton    7:3 und   Benzol:Aceton   
1:1 bleibt die Verbindung am Start. Die Substanz schmilzt, aus Acetonitril kristallisiert, bei 136-138 ; im UV-Spektrum in Äthanol weist sie Maxima auf bei   #    = 272 m    (#    = 26 600) und   #    = 320 m    (#    = 22 400).



   Beispiel 9
PZ-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)
A   rg (NO2)-A      rg (NO2)-Pro-OH   
1,06 g (0,62 mMol) PZ-Nonapeptidester (Beispiel 8) in 6 ml 750/oigem Dioxan werden mit 1,24   ml      1,95-n.   



  Natronlauge während 15 Minuten bei Zimmertempera tur verseift. Anschliessend giesst man die Reaktionslösung in 110 ml Eiswasser, die 2,5 ml 1-n. Salzsäure enthalten, und filtriert die flockige Ausfällung durch eine G3-Glasfritte. Den Niederschlag wäscht man gut mit Wasser und trocknet ihn über Phosphorpentoxyd im Hochvakuum. Ausbeute: 970 mg amorphes Produkt.



  Rf. = 0,52 im Dünnschichtchromatogramm für Dioxan: Wasser =   9:1.   



   200 mg im System   Methanol : Wasser : Chloroform :    Tetrachlorkohlenstoff = 8:2:5:5 über 121 Stufen verteilt geben 162 mg reines Peptidderivat K = 0,65.



   UV-Spektrum:   #max    320 m    #    = 21 700 und 271 m    #    = 37 200 in Feinsprit.



   Die Substanz schmilzt, aus Acetonitril kristallisiert, bei   140-145     (Zers.).



   Beispiel 10
PZ-Val-Lys(BOC)-OH
4,75 g   (13,4    mMol) PZ-Valin in 65 ml absolutem Dioxan werden in Eiswasser so gekühlt, dass ein Teil des Dioxans fest ist. Dann gibt man 3,45 ml (14,4 mMol) N-Tributylamin und nach weitern 5 Minuten 1,38 ml   (13,4mMol)    Chlorameisensäureäthylester dazu und lässt 15 Minuten unter Kühlung reagieren.



   Vorgängig werden 4 g   (17,2    mMol)   N6-BOC-Lysin    unter Rühren langsam in 32 ml Wasser, das 2,45 ml (17,2 mMol) N-Triäthylamin enthält, eingetragen. Die letzten Portionen des   Ne-BOC-Lysins    lösen sich nicht mehr gut. Beim Abkühlen mit Eis scheidet sich wieder wenig feste Substanz aus der wässrigen Lösung aus.



  Diese Lösung gibt man rasch unter intensivem Rühren und Kühlen zu der frisch zubereiteten Lösung des gemischten Anhydrids und lässt 30 Minuten bei Zimmertemperatur reagieren. Die Reaktionslösung wird im Vakuum bei   40     auf ein kleines Volumen eingedampft, unter Eiskühlung mit   100ml    Wasser und   40ml    100/oiger Zitronensäurelösung versetzt. Die schmierige Ausfällung wird beim Zerkratzen mit Äther fest. Das rohe PZ  Valyl-N#-BOC-Lysin    wird abfiltriert, mit viel Wasser und Äther gewaschen und bei 50  im Hochvakuum getrocknet. Ausbeute: 4,41 g; F.   167-1690    (Sintern 1650).



   Die   Ätherphase    wird abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Beim Abdampfen des Äthers scheiden sich noch weitere 1,07 g PZ-Dipeptid aus. F.   167-1690.   



   Die Gesamtausbeute beträgt 5,48 g (70 % d. Th.).



  Die Analysenfraktion schmilzt nach einmaligem Kristallisieren aus Essigester bei   167-169 .   



   Das UV-Spektrum in Feinsprit zeigt bei   #max    230 m    #    = 13 400 und   #max    322 m    #    = 23 000.



   Beispiel 11   
ZVal-Tyr-Pro-OtBu Zu Zu 11,25 g (27,4 mMol) Carbobenzoxy-valyl-tyrosin    (Patent Nr. 358 431) in 100 ml frisch destilliertem Acetonitril gibt man die Lösung von 4,65 g (27,4 mMol) Prolin-tert.-butylester in 25 ml Acetonitril und kühlt im Eisbad auf   0     ab. Dann gibt man die Lösung von   6,21    g Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml kaltem Acetonitril dazu und lässt 15 Stunden bei   0     reagieren. Der auskristallisierte Harnstoff wird abfiltriert   (90 0/0    d. Th.) und die Reaktionslösung mit 1 ml Eisessig versetzt.



  Nach 15 Minuten dampft man das Acetonitril im Vakuum ab, nimmt den Verdampfungsrückstand in Essigester auf und filtriert nochmals vom ausgeschiedenen Harnstoff ab. Die Essigesterlösung wird 2mal mit 10 ml eiskalter 2-n. Salzsäure extrahiert, anschliessend so lange mit 2-n. Sodalösung - bis angesäuerte Proben keine Ausfällung mehr anzeigen - und zum Schluss mit Wasser neutral gewaschen. Die Essigesterextrakte trocknet man über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab. Ausbeute:   14,1    g (88    /o    d. Th.) amorphen Carbobenzoxy-tripeptidester.



   Der Carbobenzoxytripeptidester ist in den meisten organischen Lösungsmitteln, ausser Äther, Petroläther und Benzol, gut löslich. Er wird ohne weitere Reinigung direkt weiter verarbeitet.



   Beispiel 12    H- Val-Tyr-Pro-OtB u   
14,13 g (24,9 mMol) Z-Val-Tyr-Pro-OtBu werden in 250 ml 900/oigem Methanol, enthaltend 4,5 ml Eisessig, in Gegenwart von 2 g 100/oigem Pd-Kohlekatalysator hydrogenolytisch gespalten. Das gebildete Kohlendioxyd wird mit Kalilauge in einer zweiten, dazwischen geschalteten Hydrierente absorbiert. Nach 2 Stunden ist die Wasserstoffaufnahme beendet. Die vom Katalysator befreite Lösung dampft man im Vakuum bei   40     zur Trockene ein und verteilt den Verdampfungsrückstand zwischen 200 ml Essigester und 2mal 20 ml eiskalter 2-n. Sodalösung. Die Sodalösungen werden nochmals mit frischem Essigester extrahiert, die Essigesterphasen mit Wasser neutral gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum gewinnt man 7,69 g   (71 0/o    d.

   Th.) freier Tripeptidester.



   Im Papierchromatogramm in den Systemen 43, 45 und 54 wandert der Tripeptidester mit der Lösungsmittelfront und gibt mit Ninhydrin und Paulyreagens je 1 Fleck.



   Beispiel 13
PZ-Val-Lys(BOC)- Val-Tyr-Pro-OtBu
Die Lösung von   10,36    g   (17,7    mMol) PZ-Val Lys(BOC)-OH und 7,69 g (17,7 mMol) H-Val-Tyr-Pro OtBu in 140 ml frisch destilliertem Dimethylformamid wird bei 0  mit 4,2 g Dicyclohexylcarbodiimid (15%iger Überschuss) in 12 ml Dimethylformamid versetzt und 2 Tage bei   0     belassen. Die vom Harnstoff befreite Lösung lässt man noch weitere 30 Minuten mit 0,5 ml Eisessig stehen, dampft das Lösungsmittel im Vakuum bis auf ein kleines Volumen ab   und nimmt den sirupösen    Rückstand in viel Essigester auf. Die Essigesterphase wird 4mal mit 25 ml 0,2-n. Ammoniumhydroxydlösung, 2mal mit 30 ml Wasser, 2mal mit 30 ml eiskalter 100/oiger Zitronensäurelösung und zum Schluss mit Wasser neutral gewaschen.

   Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat und Verdampfen des Lösungsmittels erhält man 17 g rohes amorphes Reaktionsprodukt. Zur weitern Reinigung gibt man das Rohprodukt, in 100 ml Chloroform gelöst, auf eine mit 100/oigem Wasser desaktivierte Silikagelsäule (570 g;   °    5,6 cm, h = 41 cm).



  Mit Chloroform eluiert, wandert die orangerote Zone nur langsam, während mit   Chloroform : Essigester    2:1 sich 2 Fraktionen auswaschen lassen.



   Die erste Fraktion 4,8 g ist noch stark mit Dicyclohexylharnstoff und PZ-Dipeptid verunreinigt und lässt sich aus Acetonitril nur in schlechter Ausbeute kristallisieren, während die zweite Fraktion (7,2 g) aus 200 ml Acetonitril als gallertiges Produkt wieder ausfällt. Ausbeute: 5,1 g, PZ-Pentapeptidester, F.   154-i580.    



   Die Analysenfraktion schmilzt nach einer weitern Kristallisation bei   157-159 .   



   Im UV-Spektrum (in Feinsprit aufgenommen) zeigt die Verbindung 2 Maxima bei 227 m  und 322 m  mit den   Werten    20 700 und 21 100.



   Im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel G; Merck) sind die Rf.-Werte: 0,23 (Chloroform:Aceton = 95:5) und 0,60 (Benzol:Aceton = 1:1).



   Beispiel 14
H-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu
1,4 g   PZ-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu    werden in 100 ml Methanol in Gegenwart von 400 mg 100/oigem Palladiumkohlekatalysator während 6 Stunden bei 5 Atm mit Wasserstoff im Autoklaven geschüttelt Man filtriert vom Katalysator ab, wäscht ihn wiederholt mit Methanol und dampft das Lösungsmittel im Vakuum ab. Der Verdampfungsrückstand wird mit viel Äther zerkratzt und im Hochvakuum getrocknet. Es resultiert ein feines amorphes Pulver. Ausbeute: 980 mg.



   In den Systemen 54 und 49 wandert die Verbindung mit der Lösungsmittelfront.



   Im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel G) im System   Dioxan : Wasser    = 9:1 ist der Rf.-Wert 0,65.



   Beispiel 15
PZ-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)
Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr
Pro-OtBu
276 mg (0,16 mMol) PZ-Lys-Pro-Val-Gly-Lys   (BOC)-Lys(BOC)-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-OCH3    (über Phosphorpentoxyd im Hochvakuum bei 800 getrocknet) werden im Gemisch 1 ml abs. Dimethylformamid, 2 ml abs. Tetrahydrofuran gelöst und im Eiskochsalz-Kältebad   auf 100    gekühlt. Dann gibt man 0,16 mMol Tri äthylamin in 1,6 ml Tetrahydrofuran dazu und nach weitern 5 Minuten 0,16 mMol Chlorameisensäureisobutylester in 1,6 ml abs. Tetrahydrofuran. Man lässt 15 Minuten im Kältebad reagieren und gibt dann 140 mg   H-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu,    gelöst in 2 ml abs.



  Tetrahydrofuran, dazu. Man rührt noch 15 Minuten im Eisbad und anschliessend eine Stunde bei Zimmertemperatur, dann dampft man das Lösungsmittel im Vakuum bei 400 ab und fällt das Reaktionsprodukt mit viel Äther aus. Das getrocknete Rohprodukt (395 mg) wird in 4 ml alkoholfreiem Chloroform auf eine   Alu-    miniumoxydsäule (Aktivität III; 40 g) gegeben und mit 100 ml Chloroform durchgewaschen. Die gelbe Zone mit dem Peptidderivat wandert dabei nur langsam. Anschliessend wird mit 80 ml Chloroform:Methanol = 95:5 durchgewaschen. Dabei lassen sich 290 mg chromatographisch einheitliches Produkt eluieren. Rf.   =0,75,      Dioxan : Wasser    = 9:1 im Dünnschichtchromatogramm.



   Die Substanz schmilzt, aus Acetonitril kristallisiert, bei   160-165 .    Das UV-Spektrum in Äthanol weist   Maxima bei ;1 (8=36800) undM9m (8=    20 400) auf.



   Beispiel 16   
H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-
Arg-Arg-Pro- rg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu,   
3   CH3COOH   
320 mg PZ-Tetradecapeptid-tert.-butylester (Beispiel 14) werden in 6 ml 900/oiger Essigsäure und in Gegenwart von 100 mg 10%igem Palladiumkohlekatalysator während 5 Stunden bei 5 Atm. mit Wasserstoff geschüttelt. Anschliessend füllt man die Reaktionslösung in eine Hydrierente und schüttelt noch weitere 17 Stunden mit 100 mg frischem Pd-Katalysator unter Normalbedingungen weiter. Zur Absorption des gebildeten Kohlendioxyds wird noch eine 2. Hydrierente mit Kalilauge dazwischengeschaltet. Den abfiltrierten Katalysator wäscht man gut mit 90%iger Essigsäure und Methanol und dampft das Lösungsmittel im Vakuum zur Trockne ein. Nach dem Trocknen erhält man 220 mg eines weissen amorphen Pulvers.



   Das UV-Spektrum zeigt in Feinsprit bei 278 m  das für Tyrosin charakteristische Maximum   (#    = 1500).



   Im Papierchromatogramm in den Systemen 49, 50 und 54 wandert die Verbindung mit der Lösungsmittelwand und gibt positive Reaktionen mit Ninhydrin, Pauly- und Sakaguchi-Reagens.



   Beispiel 17
BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try
Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)
A rg-A   rg-Prn-Val-Lys()3OC)-Val-Tyr-Pm-OiBu   
210 mg Tetradecapeptid-tert.-butylester (Beispiel
16) werden bei   0     in 10 ml   l/ro-n.    Salzsäure rasch gelöst und die resultierende Lösung im Hochvakuum lyophil getrocknet. Den feinen weissen Rückstand trocknet man noch 2 Stunden bei   50     im Hochvakuum über Phosphorpentoxyd. Gleichzeitig werden 160 mg   (0,11 niMol)      BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu Glu(OtBu) -His -Phe -Arg-Try-    Gly-OH (Patent Nr. 408 948) in der Wärme in 1 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst, wieder auf Zimmertemperatur abgekühlt und zum Trihydrochlorid des Tetradecapeptides gegeben.

   Man verdünnt mit weitern 2,5 ml Dimethylformamid und erhält nach 10-15 Minuten eine klare Lösung. Nach 2stündigem Stehen im Eisbad gibt man 42 mg (0,2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 0,6 ml eiskaltem Acetonitril dazu, lässt 13 Stunden bei   0     und 48 Stunden bei Zimmertemperatur reagieren. Das rohe Reaktionsprodukt wird dann mit viel Essigester ausgefällt und im Hochvakuum bei   40     getrocknet, Rohausbeute: 330 mg.



   Beispiel 18    H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-A    rg-Try-Gly-Lys
Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val
Tyr-Pro-OH,   CH3COOH   
100 mg rohes geschütztes Tetrakosapeptid (Beispiel 17), das noch mit Ausgangspeptiden verunreinigt ist, werden 1 Stunde bei Zimmertemperatur mit 2 ml wasserfreier Trifluoressigsäure behandelt. Die überschüssige Säure wird bei Zimmertemperatur im Vakuum abgedampft und der resultierende Rückstand mit viel absolutem Äther zerkratzt. Das amorphe   Spaltprodukt    wird in 4,5 ml   0,5-n.    Essigsäure einer kontinuierlichen Hochspannungselektrophorese unterworfen (700 Volt; 30   mA),      Auftragsgeschwindigkeit:    1 ml/h. Total werden 23 Fraktionen aufgefangen.

   Die Fraktionen 1-9, 10,   1213,    14-15, 16 und 17-23 werden eingedampft. Die elektrophoretische Analyse zeigt, dass in den Fraktionen   1L15    die Hauptmenge des gewünschten Tetrakosapeptides enthalten ist. Zur weitern Reinigung gibt man die vereinigten Fraktionen   1215,    in 2 ml   llioo    molarem Ammoniumacetatpuffer gelöst, auf eine Carboxymethylcellulosesäule   (    1 cm;   1,16    cm; 2,5 g). Die Carboxymethylcellulose wird mit 100 ml   l/roo    mol. Ammonium acetatpuffer in die Säule eingefüllt und noch mit weitern 50 ml des gleichen Puffers durchgewaschen.

   Das Peptid wird dann mit Ammoniumacetatpuffer (pH = 5,4) steigender Molarität   (0,1      m-0,7    m) von der Säule eluiert.



   Es werden Fraktionen von 10 ml Volumen mit einem automatischen Fraktionensammler aufgefangen.



  Nach 15 Fraktionen ist das Peptid wieder quant. von der Säule getrennt. Man erhält total 15 Fraktionen. Die Gläschen 10-13 enthalten elektrophoretisch reines Tetrakosapeptid. Der zurückgelegte Weg nach einer Stunde bei 3000 Volt und pH 1,9 beträgt 13-17 cm.



   Im In-vitro-Test nach Saffran und Schally zeigt das erhaltene Peptid eine starke ACTH-Aktivität.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung des neuen Tetrakosapeptids der Formel L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl L-glutaminyl-(oder L-glutamyl)-L-histidyl-L-phenylala- nyl-l-arginyl- L-tryptophyl-glycyl -L-lysyl-L-prolyl- L- valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin, dadurch gekennzeichnet, dass man die Aminosäuren L-Serin, L Tyrosin, L-Serin, L-Methionin, L-Glutamin (oder L Glutaminsäure), L-Histidin, L-Phenylalanin, L-Arginin, L-Tryptophan, Glycin, L-Lysin, L-prolin, L-Valin, Glycin, L-Lysin, L-Lysin, L-Arginin, L-Arginin, L-Prolin, L-Valin, L-Lysin, L-Valin, L-Tyrosin und L-Prolin in der angegebenen Reihenfolge unter intermediärem Schutz der Amino- bzw. Carboxylgruppen miteinander vereinigt.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man das Decapeptid L-Seryl-L-tyrosyl L-seryl - L-methionyl - L-glutaminyl-(oder L- giutamyl-y- ester)-L-histidyl-L-phenylalanyi-L-arginyl -L-tryptophyl- glycin, dessen a-Aminogruppe geschützt ist, mit dem Tetradecapeptid L-Lysyl-Gprolyl-L-valyl-glycyl-l-lysyl- L4ysyl-L-arginyl-L-arginyl - L-prolyl-L-valyl - L-lysyl - valyl-L-tyrosyl-L-prolin oder dessen Ester, in welchen die E-Aminogruppen der Lysinreste geschützt sind, kondensiert.

2. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man tert.-Butyl oxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L- glutamyl-(y-tert.-butylester)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L- arginyl-L-tryptophyl-glycin mit Ne-tert.-Butyloxycarbo- nyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-Ne-tert.-butyloxycar- bonyl-l- lysyl-N-tert.-butyloxycarbonyl -Llysyl-L argi- nyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-Ne-tert.-butyloxyvarbonyl- L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester kondensiert.

3. Verfahren nach Unteranspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kondensation in Gegenwart eines Carbodiimids ausführt.

4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man das Tetrapeptid L-Seryl-L-tyrosyl-Lseryl-L-methionin, dessen a-Aminogruppe geschützt ist, mit dem Eicosapeptid L-Glutaminyl-(oder L-Glutamyl-y ester) -L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L- tryptophyl- glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L- arginyl- L-arginyl-Lprolyl- Lvalyl-Lclysyl- L-valyl-L tyrosyl-L-prolin oder dessen Ester, in welchen die e- Aminogruppen der Lysinreste geschützt sind, kondensiert.

5. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man tert.-Butyl oxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl - L-methionin-azid mit 3,-tert. -Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L- arginyl-L- tryptophyl-glycyl-L- lysyl-L-prolyl-L-valyl-giy- cyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl - L-valyl L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester, dessen e-Aminogruppen geschützt sind, kondensiert.

6. Verfahren nach Unteranspruch 2 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Schutzgruppen durch saure Hydrolyse abspaltet.

7. Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das Tetracosapeptid in seine Säureadditionssalze überführt.