Verfahren zur Herstellung von A-MSH
Gegenstand der Erfindung ist & in Verfahren zur Her- stellung des bisher noch nicht synthetisch zugänglichen Hypophysenhormons ¯-MSH sowie der entsprechenden Verbindungen, die statt des Glutamylrestes bzw. einer oder beidler Asparagylreste den Rest des Olutamins bzw.
Asparagins enthalten, und ihren Salzen. Das ¯-MSH des Rindes'hat die Formel
L-seryl-glycyl-L-prolyl-L-tyrosyl-tert.-butyl L-lysyl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-
L-seryl-L-prolyl-L-prolyl-L-lysyl-
L-asparaginsäure.
Im deutschen Patent Nr. 1 126 397 ist ein dem / ?-MSH entsprechendes Oktadekapcptid, d'as an Stell'e des ersten Asparaginsäurerestes den Asparaginrest aufweist, beschrieben. Dieses Produkt war jedoch, wie sich nachtrÏglich herausstellte, nicht in reiner Form erhalten worden, da die Abspaltung darin verwendeter Schutzgruppen (Tosyl, Methylester) mit einer teilweisen Zerstörung des Molek ls verbunden war.
Nach d'em erfindungsgemässen Verfahren wird ¯ MSH in reiner Form und in guter Ausbeute erhalten.
Das neue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man das Hexapeptid Carbobenzoxy-y-tert.-butyl-L-glutamyl- (oder Carbobenzoxy-L-glutammyl-) L-histidyl L-phenylal'anyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin mit dem Pentapeptid
L-Seryl-L-prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester (oder-L-asparagin-tert.-butylester) zum geschützten Undekapepttdester kondensiert, aus diesem die Carbobenzoxygruppe abspaltet und den erhaltenen γ
-tert-Butyl-L-glutamyl-(oder L-Glutaminyl-)
L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl L-tryptophyl-glycyl-L-seryl-L-prolyl- prolyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-
L-asparaginsÏure-di-tert.-butylester (oder-L-asparagin-tert.-butylester) mit tert.-Butyloxycarbonyl-¯-tert.-butyl-L-asparagyl (oder tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-) L-seryl-glycyl-L-pOlyl-L-tyrosyl-tert.-butyl- oxycarbonyl-L-lysyl-L-methionin zum gesdhützten Oktadekapeptidester kondensiert und die Schutzguppen abspaltet, vgl. Fig. 1.
Darin ist BOC = tert.-Butyloxycarbonyl ; Z = Carbobenzoxy ; T = Trityl ; tBu = tert.-Butyl ; NBzy = p-Nikobenzyl.
Die Kondensation des Hexapeptids mit dem Pentapeptid zum Undecapeptid wkd vorteiilhaft in Gegenwart von Toluolsullfonsäure (und einem Carbod'iimid) durchgefu'hrt.
Das als Ausgangsstoff verwendete Hexapeptidderivat Z-Glu (OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH kann nach dem im französisdhen Patent Nr. 85 759 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Das in Fig. 1 gezeigte Tripeptidderivat T-Pro-Tyr-Lys (BOC)-OCH3 kann auch durch Kondensation von Z-Pro-Tyr-OH mit Lys (BOC) OCH3 zum Z-Pro-Tyr-Lys (BOC)-OCHs, Abspaltung der Carbobenzoxygruppe und Tritylierung des Tripeptid- esters erhalten werden.
(Siehe Tabelle auf der nächsten Seite !)
Das erfindungsgemässe Verfahren hat sich als sehr vorteilhaft erwiesen, weil eine grössere Anzahl von Zwischenprodukten in kristallisierter Form gewonnen werden können.
Das verfahrensgemäss erhaltene ss-MSH hat in vitro eine Aktivität von 2-3-109 Einheiten pro Gramm, wie sie auch das natürliche ¯-MSH aufweist. Es kann daher an Stelle von nat rlichem ¯-MSH als Hormon verwendet werden. Dem nat rli ss-MSH gegenüber hat es den Vorteil, dass es frei von anderen Hypophysenhormo- nen und sonstigen Nebenprodukten ist. Man kann das Oktadekapeptid und seine Derivate auch als Zwischen- produkte bei der Synthese von Peptiden mit längerer Aminosäurekette verwenden.
Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit SÏuren, die zur Bildung thera peutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen.
Das verfahrensgemäss erhaltene Oktadekapeptid kann in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten das PeptidimMischung mit einem f r die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorga- nischen Trägermaterial.
Im nachfolgenden Beispiel wird d'ie Temperatur in Celsiusgraden angegeben.
F r die Chromatographie werden die folgenden Systeme benützt : Nr. 42 = n-Propanol-Athylacetat-Wasser 7 : 1 : 2, Nr. 43 = tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser
100 : 40 : 55, Nr. 49 = sek.-Butanol-Isopropanol-Triäthylamin-
Diäthylbarbitursäure-Wasser
100 : 10 : 0, 2 : 1, 8 g : 60, Nr. 52 = n-Butanol-Essigsäure-Wasser 100 : 10 : 30, Nr. 54 = sek.-Butanol-Isopropanol-Monochloressig- säure-Wasser 70 : 10 : 3 g : 40, Nr. 56 = sek.-Butanol-Isopropanol-Diäthylbarbitur- säure-Natriumsalz-Wasser
100 : 15 : 0, 5 g : 60, Nr. 87 = Isopropanol-98 % ige. Ameisensäure-Wasser
20 :
1 : 5, Nr. 101 = n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser
30 : 20 : 6 : 24.
Die Papierchromatographie wurde absteigend auf Whatman-Nr. 3-Papier ausgeführt, die Dünnschichtchromatographie auf Silicagel (Merck). Anfärbung mit Reindel-Hoppe-Reagens, Ninhydrin (nach Abspaltung der BOC-resp. Trit-Gruppen durch Behandlung der Dünn schichtchromatogramme mit einer Lösung von Chlor- wasserstoff in Essigester) und', bei Anwesenheit von Tyrosin, mit Pauly-Reagens.
Beispiel l. tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginsäure- p-tert.-butylester
9, 5 g (50 mMol) L-AsparaginsÏure-¯-tert.-butylester werden in 25 ml 2m Natronlauge gelöst und mit einer Lösung von 8, 6 g (60 mMol) tert.-Butyloxycarbonylazid in 25 ml Methanol versetzt. Dann werden unter R hren bei 40 7, 7 ml (55 mMol) Triäthylamin in 30 ml Me- thanol innert einer Stunde zugetropft. Nach weiterem Rühren während 2 Stunden bei 40 und Stehen über Nacht bei 20 wird die Lösung durch Zugabe von 2n Salzsäure auf pH 7 gestellt und im Vakuum bei höch- stens 30¯ von Methanol befreit.
Man übersclhiehtet die wälSrige Lösung mit Ather und sÏuert bei 0 unter Umschütteln mit 100 ml ln SalzsÏure an. Die Atherphase wird rasch abgetrennt, mehrmals mit gesättigter Na triumchloridlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Rückstand kristallisiert nach Animpfen langsam bei 0 und ergibt nach Verreiben mit Petroläther 12, 9 g (89%) Rohprodukt vom F. 59-63¯ ; nach Umkristallisieren aus Petroläther : 10,0g (69%) verfilzte Nadeln vom F. 63-66 ; [α]25D= +1, 7 ¯0,5¯ (c=1, 9 in Methanol) ; einheitlich im Dünnschichtchromatogramm ; Rfjs = 0, 47 ; Rf101 = 0, 74.
Zur Herstellung von Impfkristallen reinigt man die Verbindung ber das Dicyclohexylammoniumsalz: 2,6 g (9 mMol) Rohprodukt werden in 15 ml ¯ther gel¯st und mit 2, 1 ml (10 mMol) Dicyclohexylamin versetzt. Beim Stehen der Lösung fÏllt langsam ein festes Produkt aus, das nach mehreren Stunden isoliert wird: 3,65 g; F. 142 bis 144¯; umkristallisiert aus Acetonitril: 3,24 g (77%); F. 145-147¯; [α]25D = + 12,7 ¯ 0,5¯(c=2,8 in Me- thanol).
Zur Überführung in d'ie freie SÏure werden 2, 35 g (5 mMol) des Dicyclohexylammoniumsalzes in 50 ml 50% igem Athanol mit 5 ml Dowex 50 X-8 15 Min. gesch ttelt, filtriert, eingedampft und im Vakuum getrocknet. Der Rückstand liefert beim Verreiben mit wenigPetroläther 1, 28 g (89 %) kristallines Produkt vom F. 64-67 .
2. tert.-Butyloxycarbonyl-ss-tert.-butyl-L-asparagyl- L-seryl-glycin-p-nitrobenzylester
10 g (35 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparagin /3-tert.-butylester und 10, 4 g (35 mMol) L-Seryl-glycin p-nitrobenzylester (frisch aus dem Hydrobromid herge- stet) werden in 200 ml Acetonitril gelöst und unter Ruhren bei -5¯ mit einer vorgek hlten L¯sung von 7, 8 g (38 mMol) Dicycldhexylcarbodiimid in 50 ml Acetonitril versetzt. Nach weiterem R hren während 30 Min. bei-5 und über Nacht bei 0 wird 1 ml Eisessig zugegeben und der ausgeschiedene Dicyclohexyl- harnstoff abfiltriert.
Das Filtrat wird im Vakuum ein gedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen, die Lösung bei 0 mit ln Salzsäure, ln Natriumbicar bonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand liefert nach mehrmaligem Verrühren mit ¯ther 14, 2 g kristallines Produkt vom F. 124-128 ; nach Umkristallisieren aus Essigester Nadelh vom F. 131 bis 133 ; [a] D =-15, 8 0, 5 (c = 2, 0 in Methanol).
UV-Absorption : A.,,, 267 m, u, E = 9600 (in Feinsprit) ; einheitlich im Dünnschichtchromatogramm ; Rf43=0, 76 ; Rf in Benzol-Aceton 1 : 1 = 0, 45.
3. tert.-Butyloxycarbonyl--tert.-butyl-L-asparagyl- L-seryl-glycin
5, 7 g (10 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-A-tert.- butyl-L-asparagyl-L-seryl-glycin-p-nitrobenzylester werden in 100 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1 g Palladiumkolhle (10% ig) bei Zimmertemperatur und Normaldruck hydriert, wobei das gebildete Kohlen- dioxyd in Natronlauge absorbiert wird. Nach Aufnahme von etwas mehr als 4 Äquivalenten Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand.
Man dampft die vom Katalysator abfiltrierte Lösung im Vakuum zum Sirup ein, nimmt den Rückstand in Essigester auf und extrahiert die Lösung bei 0 dreimal mit je 10 ml In Kalium- bicarbonatlösung. Die vereinigten alkalischen Extrakte werden mit 150 ml Essigester überschichtet und bei 0 unter Umschütteln tropfenweise mit 10 ml 5n Salzsäure versetzt.
Man trennt die Essigesterphase rasch ab, extrahiert die wässrige Phase noch zweimal mit kaltem Essigester und wÏscht die vereinigten Essigesterlösungen sofort zweimal mit wenig gesättigter Natriumchloridlösung, trocknet und engt im Vakuum auf etwa 10 ml ein ; nach Zugabe von Petroläther bei 50 kristallisiert das Reak tionsprodukt bei langsamem Kühlen in Form von ver filzten Nadele ; 4 g (92%) ;
F. 132 bis 134 ; keine VerÏnderung des Schmelzpunktes nach Umkristallisieren aus Essigester-Hexan ; [Q] 25 =-16, 9 0, 5 (c = 1, 9 in Me thanol),-13, 4 0, 5 (c = 2, 0 in Eisessig) ; einheitlich im Dünnschichtchromatogramm : Rf43 = 0, 32 ; Rf101 = 0, 65.
Die Spaltung mit Trifluoressigsäure (5 mg Substanz in 0, 1 ml Reagens 1 Std. bei 25 , dann eingedampft und Rückstand mit Ather verrieben) ergibt chromatogra phisch einheitliches Tripeptid Asp-Ser-Gly-OH ; im Dünnschichtchromatogramm Rf 0, 20 in System 101 ; im Papierchromatogramm Rf49 =0, 13 ; Rfn4 = 0, 33 ; Rifs7 = 0, 23.
4. Trityl-L-prolin-benzylester
Eine Lösung von 97 g (0, 4 Mol) L-Prolin-benzyl- estcr-hydrochlorid in 800 ml Chloroform wird unter Rüh- ren bei 0 mit 125 ml (0, 88 Mol) Triäthylamin versetzt.
Dann wird bei gleicher Temperatur eine Lösung von
123 g (0, 44 Mol) Tritylchlorid in 1, 2 Liter Chloroform innert 2 Std. zugetropft. Nach Stehen über Nacht bei 25 wäscht man die Lösung unter Eiskühlung mit ln Zitronensäure, In Natriumbicafbonatlösmng und Wasser, trocknet, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Ather : 136 g (76%) ; F. 117-119 ; nach Umkristallisie- ren aus ¯ther-PetrolÏther 124 g, F. 118-119 ; [a] 25 = -67, 9 0, 5 (c = 2, 0 in Chloroform).
5. Trityl-L-prolin
135 g (0, 3 Mol) Trityl-L-prolin-benzylester werden in 800 ml Essigester gelöst und in Gegenwart von 10 g Palladiummohr bei Zimmertemperatur und Normaldruck hydriert. Nach Aufnahme von 8 Liter Wasserstoff innert 7 Std. wird die Hydrierung abgebrochen.
Man engt die vom Katalysator und ausgeschiedenem L-Prolin abfiltrierte Lösung im Vakuum auf etwa 100 ml ein, impft an (Impfkristalle aus Ather) und isoliert nach 30 Min. das ausgeschiedene kristalline Produkt : 44, 6 g (42 %) ; F. etwa 165 , dann Verfestigung g und erneutes Sc'hmelzen bei 218-220 ; aus der Mutterlauge werden nach Einengen weitere 8, 2 g Substanz von gleichem Reinheitsgrad erhalten ; im Dünnschichtchromatogramm Rf43 = 0, 67 (etwa 5 % L-Prolin, Rf43 = 0, 09).
6. Trityl-L-prolyl-L-tyrosin-methylester
90 g (0, 25 Mol) rohes Trityl-L-prolin und 49 g (0, 25 Mol) L-Tyrosin-methylester werden unter leich- tem Erwärmen in 1, 5 Liter Acetonitril gelöst und unter Rühlren'bei-5 mit 58 g (0, 28 Mol) Dicyolohexylcarbodi- imid versetzt. Man rührt weitere 30 Min. bei 0 und über Nacht bei Raumtemperatur und versetzt dann zur Zerstörung von überschüssigem Carbodiimid mit 2 ml Eisessig. Das ausgeschiedene Gemisch von Dicyclohexyl- harnstoff und Dipeptidderivat wird abfiltriert, mit Acetonitril gewaschen und mit 500 ml Dimethylformamid verrührt.
Nach Abfiltrieren des unlöslichen Dicyclohexyl 'harnstoffs wird das Filtrat im Vakuum a'ufetwa. 200 ml eingeengt und mit 1 Liter Methanol versetzt. Nach Stehen ber Nacht bei 0¯ isoliert man das ausgeschiedene kristalline Dipeptidderivat : 47, 5 g (35 %), F. 222-224 ; nach Umkristallisieren aus Dimethylformamid-Methanol : 39 g ; F. 226-228 ; [a] 25 =-85, 2 0, 5 (c = 2 in Di methylformamid) ; im DünnschichtchromatogrammRf4s = 0, 77 ; Rf = 0, 76 in Benzol-Aceton 1 : 1.
7. a) Trityl-L-prolyl-L-tyrosin-hydrazid
Eine Lösung von 0, 8 g (1, 5 mMol) Trityl-L-prolyl- L-tyrosin-methylester in 4 ml Dimethylformamid wird mit 0, 75 ml (15 mMol) Hydrazinhydrat versetzt, 24 Std. bei Raumtemperatur stehengelassen und dann.bei0 allmählich mit 10 ml Wasser versetzt ; das anfänglich ölig ausgeschiedene Hydrazid kristallisiert beim Verrei- ben. Es wird durch Zentrifugieren abgetrennt und mit Wasser gut gewaschen : 0, 78 g, F. 216-218 (Zers.).
Zur weiteren Reinigung wird das Rohprodukt aus viel hei ssem Methanol umkristallisiert : 0, 67 g (84 %) ; F. 217 bis 219 ; [a] 25D=-77, 0 0, 5 (c = 2, 0 in Dimethylform- amid) ; einheitlich im Dünnschichtchromatogramm ; Rf43 = 0, 71. b) Trityl-L-prolyl-L-tyrosin
40 g (75 mMol) Trityl-L-prolyl-L-tyrosin-methyl- ester werden in 400 ml Methanol suspendiert und unter Rühren mit 120 ml 2n Natronlauge versetzt, wobei durch leichte Kühlung d'ie Reaktionstemperatur bei 20 gebalten wird.
Das Ausgangsmaterial geht innert etwa 30 Min. in Lösung ; nach weiteren 30 Min. wird mit 100 ml Wasser verdünnt, das Methanol im Vakuum abdestilliert, die wässrige Lösung mit wenig Essigester ex trahiert, bei 0 mit ln Zitronensäure angesäuert und das ausgeschiedene Produkt mit viel Essigester extrahiert.
Die mit ln Zitronensäure und gesättigter Natriumchloridl¯sung gewaschenen Essigesterausz ge werden getrocknet und im Vakuum eingedampft. Nach Verreiben desfestenRückstands mit wenig Methanol erhält man 34, 7 g (88 %) kristallines Produkt ; F. 163-166 (Zers.).
Nach Umkristallisieren aus Methanol ist der F. 169 bis 171 ; [α]25D= -76, 7 0, 5 (c = 2, 0 in Dimethyform- amid).
Beim Umkristallisieren aus Methanol wird der Tri tylrest teilweise abgespalten.
Beim Umkristallisieren aus Tetrahydrofuran-Äther (1 : 1) erhält man ein Addukt mit 1 Mol Tetrahydro- furan ; F. 157-161¯ (Zers); Rf43= 0, 48 ; beim Umkristallisieren aus Aceton ein AdduktmitlMal Aceton, F. 172-175 ; aus Dimethylformamid-Äther ein Addukt mit 1-2 Mol Dimethylformamid vom F. 132-134 .
8. Trityl-L-prolyl-L-tyrosyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl- L-lysin-methylester a) Nach Azid-Methode
Eine Lösung von 535 mg (1 mMol) Trityl-L-prolyl- L-tyrosin-hydrazid in 7, 5 ml Dimethylformamid wird unter Rühren bei-15 mit 2 ml 2n Salzsäure und anschliessend mit 0, 22 ml einer 5n wässrigen Lösung von Natriumnitrit versetzt. Nach weiterem Rühren während 5 Min. bei-10 wird überschüssiges Nitrit durch Zugabe einer Lösung von 60 mg Ammoniumsulfamat in 0, 3 ml Wasser zerstört und die Reaktionslösung unter Rülhren iln 30 ml Eiswasser eingetropft.
Man filtriert d'as in fester Form ausgeschiedene Azid ab, wäscht mit Eiswasser, l¯st in 30 ml Dimethylformamid und trocknet die Lösung kurz bei 0 über Magnesiumsulfat. Nach Zugabe von 0, 26 g (1 mMol) N@-tert.-Butyloxycarbonyl-L- lysin-methylester in 2 ml Dimefhylformamid 1ϯt man die Reaktionsl¯sung 24 Std. bei 0 stehen, dampft dann bei höchstens 35 und 0, 1 mm Hg ein, nimmt den ¯ligen R ckstand in Essigester auf, wäscht die Lösung bei 0 mit ln ZitronensÏure, 0, 1 n Natronlauge und Wasser und dampft im Vakuum ein.
Verreiben des Rückstandes mit Ather ergibt 510 mg festes Produkt vom F. 178 bis 184 . Nach Umkristallisieren aus Methanol : 360 mg ; F. 204-206 ; [α]25D= -66, 8 0, 5 (c = 1, 9 in Di- methylformamid) ; einheitlich im Dünnschichtchromato- gramm : Rf4s = 0, 81, Rf = 0, 62 in Essigester, Rf = 0, 74 in Benzol-Aceton 1 : 1, Rf = 0, 39 in Benzol-Methanol
9 :
1. b) Nach Carbodiimid-Methode
29, 6 g (50 mMol) Trityl-L-prolyl-L-tyrosin (Tetrahydrofuran-Addukt) und 13 g (50 mMol) Ne-tert.-Butyl- oxycarbonyl-L-lysin-methylester werden unter Rühren in einem Gemisch von 250 ml Acetonitril und 100 ml'
Dimethylformamid gelöst und bei-5 mit 11, 5 g (55 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt ; nach we? terem Rühren während l Std. bei -5¯ und ber Nacht bei 0 und anschliessender Zugabe von 0, 5 ml Eisessig wird der ausgeschiedeneDicyclohexylhamstoffabfiltriert und das Filtrat bei 0, 1 mm Hg eingedampft.
Man nimmt den Rückstand in Essigester auf, wäscht die Lösung wie unter a angegeben, trocknet, dampft im Vakuum ein und verreibt den kristallinen Rückstand mit Ather : 32, 1 g ; F. 188-192 ; umkristallisiert aus Methanol : 27, 6 g ; F. 203-205 ;
Drehung und Dünnschichtchromatogramm identisch mit den unter a angegebenen Werten. c) Ausgehend von Z-Pro-Tyr-Lys (BOC)-OCH3 14, 5 g (35 mMol) Carbobenzoxy-L-prolyl-L-tyrosin und 9, 1 g (35 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin- methylester werden in 500 ml Acetonitril gelöst, bei -55 mit 7, 8 g (38 mMol) Dicyclohexyl-carbod'iimid versetzt und über Nacht bei 0 stehengelassen. Nach Zugabe von 1 ml Eisessig wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff (7, 6 g = 89 %) abfiltriert, das Filtrat im Vakuum eingedampft, der Rückstand in 500 ml Essigester gelöst, die Lösung bei 0 mit In Salzsäure,
In Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen,
getrocknet und auf etwa 150 ml'eingeengt.Dasanfänglich gallertartigausgeschiedeneReaktionsprodüktwird beim Verreiben mit Äther fest : 18, 7 g (82%) amorpher
Carbobenzoxy-L-prolyl-L-tyrosyl-N?-tert-butyl oxycarbonyl-L-lysin-methylester vom F. etwa 95 ; nach Uml¯sen aus Essigester : 15, 8 g ; F. 105-108 (Sintern bei etwa 100 ) ; [a] 2D =-51, 5 0, 3 (c = 4, 0 in Äthanol).
9. 8 g (15 mMol) Carbobenzoxy-L-prolyl-L-tyrosyl-Ne-tert.-butyl- oxycarbonyl-L-lysin-methylester werden in 150 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1, 5 g Palladiumkoble (10% ig) bei Zimmertempe- ratur und Normaldruck hydriert. Nach Aufnahmeder berechneten Menge Wasserstoff innert etwa 1 Std. wird die vom Katalysator abfiltrierte Lösung im Vakuum ein gedampft und der RückGtand mit Ather zum Pulver ver- rieben : 7, 2 g (92%) ; F. etwa 95-100 ; einheitlich im Papierchromatogramm ; Rfr, 4 = 0, 88 ; Rf56 = 0, 83.
Der
L-Prolyl-L-tyrosyl-N?-tert.-butyloxycarbonyl L-lysin-methylester kristallisiert aus Essigester. [α]25D = -16,4¯ ¯ 0,9¯ (c = 1, 9 in ¯thanol).
Eine Lösung von 7, 2 g (14 mMol) L-Prolyl-L-tyrosyl-NE-tert.-butyloxycarbonyl-
L-lysin-methylester in 60 ml Chloroform wird mit 2 ml (14 mMol) Triäthyl- amin versetzt. Unter Rühren bei 0 gibt man eine Lösung von 4 g (14 mMol) reinstem Trityilchlorid in 60 ml Chloroform tropfenweise innert 30 Min. hinzu.
Nach Stehen während 1 Std. bei 0 und über Nacht bei Raumtemperatur wird die Reaktionsl¯sung unter Eiskühlung mit In Zitronensäure, In Natriumbicarbonat- lösung und Wasser gewaschen, getrocknet und im Va kuum eingedampft. Der ölige R ckstand ergibt nach Aufnehmen in Ather, Animpfen und 1Ïngerem Stehen bei 0 4, 7 g kristallinen Trityl-L-prolyl-L-tyrosyl-NP-tert.-butyloxy- carbonyl-L-lysin-methylester vom F. 190-193 ; nach Umkristallisieren aus Methanol
F. 204-206 ; identisch mit den nach a und b her gestellten Produkten.
9. a) Trityl-L-prolyl-L-tyrosyl-Ne-tert.-butyloxy- carbonyl-L-lysin-hydrazid
Eine Suspension von 0, 76 g (1 mMol) Trityl-L-prolyl-L-tyrosyl-Ne-tert.-butyloxy- carbonyl-L-lysin-methylester in 15 ml Methanol wird mit 1, 5 ml Hydrazinhydrat versetzt und bis zur vollständigen Lösung unter R ckflu¯ erhitzt (etwa 30 Min.). Man lässt die Lösung über Nacht stehen, dampft im Vakuum ein, verreibt den Rückstand zur Entfernung von überschüssigem Hydrazin mehrmals mit Wasser und ldst das getrocknete amorphe Produkt (0, 73 g) in 10 ml Essigester ; bei längerem Stehen scheidet sich das Hydrazid in kristalliner Form ab :
0, 53 g (70%), F. 142-150 (Sintern bei etwa 130 ). Im Dünn- schichtchromaitogrammRf4g = 0, 79, Rf =0, 08 in Ben zol-Methanol 9 : 1 (etwa 10% Nebenprodukt mit Rf 0, 17). b) Trityl-L-prolyl-L-tyrosyl-N?-tert.-butyloxy carbonyl-L-lysin
21,5 g (28 mMol) Trityl-L-prolyl-L-tyrosyl-N?-tert.butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester werden in 150 ml Methanol suspendiert und unter Rühren bei etwa 15 mit 45 ml 2n Natrdnl'auge versetzt. Bei weiterem R hren bei Zimmertemperatur geht das Ausgangsmaterial in Lösung.
Nach'l Std. verdünnt man die Lösung mit
100 mlWasser, befreit im Vakuum vom Methanol, überschichtet die wässrige Lösung mit Essigester bei 0 unter Umschütteln, säuert mit überschüssiger In Zitronensäure an, trennt die Essigesterphase ab, wäscht mit
In ZitronensäureundzweimalmitWasser,trocknet und dampft im Vakuum ein. Der erhaltene zähe Schaum wird zweimal mit ¯ther extrahiert und mit Petrolätber zum Pulver verrieben : 19, 5 g (93 %) amorphes farbloses Produkt ; im DünnschichtchromatogrammRfg= 0, 53 [zusätzlich etwa 5 % H-Pro-Tyr-Lys (BOC)-OH, Rf43= 0, 28].
10. Trityl-L-prolyl-L-tyrosyl-N?-tert.-butyloxy carbonyl-L-lysyl-L-methionin-methylester a) Nach der Azid-Methode
762 mg (1 mMol) rohes Trityl-L-prolyl-L-tyrosyl- N-tert.-butyl'oxycairbonyl-L-ilysm-hydrazid werden in der unter 8 a angegebenen Weise in das Azid bergeführt. Man filtriert das mit Wasser ausgefälllte Produkt ab, l¯st es in 40 ml'Essigester,wäschtdieLösung unte Eisk hlung mit In Natriumbicarbonatlösung und Wasser, trocknet kurz über Magnesiumsulfat und engt auf etwa 10 ml ein.
Die Lösung des Azids wird sofort mit 205 mg (1, 25 mMol) L-Methicnin-methylester (frisch aus dem Hydrochlorid hergestellt und destilliert, Kp. o, oie = 58-60 ) versetzt und 24 Std. bei 0 stehengelassen.
Man pre¯t das als Gallerte ausgeschiedene Produkt auf einer kalten Nu'esche gut ab, wäscht mit wenig kaltem Essigester und Ather und kristaliiisiert aus viel Essig- ester um : 340 mg verfilzte Nadeln vom F.'i72-174 ; keine Veränderung des Sdhmelzpunktes bei nochmali- gem Umkristallisieren aus Methanol; [α]25D=-60,1 ¯ 0,5¯ (c = 2,0 in Dimethylformamid); im D nnschichtchromatogramm Rf43 = 0, 87, Rf = 0, 47 in Essigester, Rf = 0, 19 in Benzol-Methanol 9 :
1 (zusätzlich Spuren des Methioninsulfoxydderivats mit den Rf-Werten 0, 80, 0, 03 und 0, 12 m den angegebenen Systemen). b) Nach der Carbodiimid-Methode 20 g (etwa 26 mMol) rohes Trityl-L-prolyl-L-tyro- syl-N?-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin und 6 g (37 mMol) frisch destillierter L-Methionin-methylester werden in einem Gemisch von 200 ml Acetonitril und 25 ml Dimethylformamid bei-5 mit 6, 2 g (30 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und während 1 Std. bei-5¯ und 20 Std.
bei 0 gerührt. Man filtriert das ausgeschiedeneGemischvonReaktibnsproduktundDi- cyclohexylharnstoff ab, verrührt mit 100 ml Dimethylformamid, filtriert vom unlöslichen Dicyclohexylharn- stoff ab umddampftdasFil'tratbai 0, 1 mm Hg ein. Der amorphe Rückstand ergibt nach Lösen in 100 ml warmem Essigester und d langsamem K hlen 9, 6 g verfilzte Nadeln vom F. 169-171 . Die ursprüngliche Mutterlauge wird nach Zugabe von 0, 2 ml Eisessig im Va kuum eingedampft. Man nimmt den RückstandinEssig- ester auf, wäscht die Lösung wie üblich neutral, trocknet und dampft ein.
Der Rückstand wird mehrmals mit Äther extrahiert und darauf aus wenig Methanol umkri stallisiert : 3, 1 g (13 %), F. 170-172 ; nach nochmaligem Umkristallisieren der vereinigten Kristallfraktkmen : 10, 1 g (48%) ; F. 172-174 ; gleiche Drehung und chro- matographische Reinheit im Dünnscbichtchromato- gramm wie das nach a hergestellte Produkt.
11. L-Prolyl-L-tyrosyl-NE-tert.-butyloxycarbonyl- L-lysyl-L-meth.ioni.n-me'thylester
5, 8 g (6, 5 mMd) Trityl-L-prolyl-L-tyrosyl-N@-tert.- butyloxycarbonyl - L-lysyl-L-methionin-methylester werden in 40 ml 75 % iger Essigsäure suspendiert und 1 Std. bei Zimmertemperatur geschüttelt ; dabei geht der Pep tidester in Lösung, und gleichzeitig fällt Tritylcarbihol aus. Nach Zugabe von 20 ml Wasser wird filtriert, das Filtrait im Vakuum eingedampft, der Rückstand bei 0, 1 mm Hg getrocknet und mehrmals mit Ather verrieben : 4, 42 g amorphes Pulver (Acetat).
Zur Uberführung des Salzes in den freien Ester wird das erhaltene Acetat in 25 ml Wasser gelöst, die Lösung mit viel Essigester überschichtet und unter Umschütteln bei 0 mit überschüssiger 2n Kaliumcarbonatlösung alkalisch gestellt. Man trennt die Essigesterphase ab, extrahiert die wässrige Lösung noch zweimal mit Essigesterundwäscht die vereinigten Essigesterextrakte mit wenig In Kaliumcarbonatlösung und zweimal mit gesättigter Kochsalzlösung, trocknet kurz und engt im Vakuum auf etwa 100 ml (beginnendeAbscheidung von festem Produkt) ein.
Durch allmähliche Zugabe von 200 mlÄtherwirddie Abscheidung des Reaktionspro- dukts vervollständigt : 3, 3 g (78%), F. 177-180 ; im Dünnschichtchromatogramm Rf43 = 0, 52, Rf = 0, 32 in System Chloroform-Methanol 5 : 1 (Spuren des Methio- niinsulf oxydderivats mit den Rf-Werten 0, 36 und 0, 12 in n den angegebenen Systemen). Nach Umkristallisieren aus Acetonitril ist das Produkt einheitlich im D nnschichtchromatogramm ; F. 181-183¯ ; [α]25D=-19,2¯ (c = 1, 5 in Dimethylformamid).
12. tert.-Butyloxycarbonyl-p)-tert.-butyl-L-asparagyl-
L-seryl-glycyl-L-prolyl-L-tyrosyl-N?-tert.-butyl oxycarbonyl-L-lysyl-methionin-methylester 1, 52 g (3, 5 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-¯-tert. butyl-L-asparagyl-L-seryl-glycin und r y 1 - gl y c .
n u n d 2, 28 g (3, 5 mMol)
L-Prolyl-L-tyrosyl-N?-tert.-butyloxycarbonyl
L-lysyl-L-methionin-methylester werden in einem Gemisch von 50 ml Acetonitril und 10 ml Dimethylformamid unter Rühren gelost n t e r R i i h r e n g e 1 i i s t und die Lösung bei-10 mit 0, 87 g (4, 2 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt.
Nach weiterem R hren u n t e r Stickstoff wÏhrend 1 Std. bei -10¯ und ber Nacht bei 0¯ wird bersch ssiges Dicyclohexylcarbodiimid durch Zu g a b e von einigen Tropfen Eisessig zerstört, der t , d e r aus- geschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert a b f . tr . e r t und das Fillt'rat tr a t bei 0, 1 mm Hg zum Sirup. eingeengt.
Man nimmt den Rock-stand in viel Essigester auf, wäscht t d . e Lösung unter K hlen mit In Salzsäure, In Natrmmbicarbonat- lösung und gesättigter Natriumchloridlösung,'trocknet und dampft im Vakuum bis zur beginnenden Ausschei- dung g des Reaktionsprodukts ein. Die Lösung (etwa 150 ml) wird auf 40 erwärmt und unter Rühren u n t e r R . . h r e n mit 600 mzl Äther versetzt.
Nach 2 Std. isoliert man das Produkt o d u k t : 3, 21 g, unscharfer F. bei 115-125 ; nach Um fällen aus Essigester-Äther : 3, 13 g (82%) ? ) ; F. 123-130¯ ; [α]25D = -48,3¯¯0,5¯ (c = 1,9 in Methanol); im D nn- schichtchromatogramm Rf43=0,86, R0,75 in System Chloroform-Methanol 5 :
1 (Spuren von Methioninsulfoxydde r , v a t mit Rf-Werten 0, 64 und 0, 45 in den angegebenen Systemen).
13. tert.-Butyloxycarbonyl-¯-tert.-butyl-L-asparagyl
L-seryl-glycyl-L-prolyl-L-tyrosyl-N?-tert.-butyl
Oxycarbonyl-L-lysyl-L-methionin-hydrazid
Eine Lösung e L . . s u n g von 3 g (2, 8 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-¯-tert.-butyl-L-asparagyl
L-seryl-glycyl-L-prolyl-L-tyrosyl-N?-tert.-butyl
Oxycarbonyl-L-lysyl-L-methionin-methylester in 7 ml Méthanol wird mit 0, 7 ml (5 Aquiv.) Hydfrazin- hydrat vea-setzt r a t v e r s e t z t und un'ter Stickstoff 4 Std. stehengelas- sen.
Das als Gallerte ausgeschiedene Reaktionsprodukt wird durch Verrühren mit 40 ml Äther fein suspendiert, abfiltriert, t r . e r t , mit Äther gewaschen und anschliessend zwei- mal mit je 40 ml Wasser verrührt. Nach Trocknen im Vakuum bei 30 : 2, 47 g, F. 178-183¯ ; im D n n s c h . c h t chromato, gramm Rf43 gr a m m R f 4 3 = 0, 77, Rf = 0, 32 in Chloroform- Méthanol h a n o 1 5 : 1 ;
enthält zusätzlich wenig Ausgangsmaterial sowie etwa 10% eines Nebenprodukts % e . n e s N e b e n P r o d u k ts mit Rf-Werten 0, 65 und 0, 0 in den angegebenen e g e b e n e n Systemen. Durch Umkristallisieren aus s t a l l . s ? e r e n a u s 100 ml Wasser-Methanol wird, dieses Nebenprodukt vollstÏndig abgetrennt; das erhaltene Produkt (1,98 g) schmilzt nach nochmaligem UmfÏllen aus Methanol-¯ther bei 187-190¯; [α] 25D = -48,5 ¯ 0,5¯ (c = 1,9 in Methanol).
14. ¯- tert.-Butyl- L- asparaginsÏure- tert.- butylester a) Hydrochlorid
In einem Druckgefäss werden 3, 0 g (22, 5 maul) getrocknete L- AsparaginsÏure, 100 ml trockenes Chloroform und 3 mil konz. Schwefelsäure I> bei-20 mit 100 ml fl ssigem Isobutylen versetzt und die Mischung unter Druckvarschlu¯ bei Raumtemperatur gesch ttelt, bis klare Lösung eintritt (2-3 Targe),
Hierauf wird wieder auf-20 gekühlt und das überschüssige Isobutylen im Vakuum unter FeuchtigkeitsausscMuss abdestilliert. Die verbleibende Lösung wird mit weiteren 200 ml Ch'loro form verdünnt und hierauf bei 0 mit 1/2 gesättigter Kaliumcarbonatlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der ölige Rückstand wird in Methanol gelöst und bei-20 mit der genau berech- neten Menge Salzsäure in Methanol versetzt.
Nach dem
Eindampfen gibt man Ather zu ; man erhält 4, 5 g (71 %) des Hydrochlorids des-tert.-Butyl-L-asparaginsäure- tert.-butylesters in Stäbchen vom F. 152-155 . Zur Analyse wird aus Aceton und Aceton-¯ther kristallisiert, F. 156-158¯; [α] 26D = +6,6 ¯ 1,1¯ (c = 0,913 in Methanol). Im Papierchromatogramm zeigt das Hydrochlorid nur einen Fleck ; Rf4 = 0, 87 ; Rf87 = 0, 85. Der freie Ester wird aus dem Hydrochlorid mittels Ather Pottasche in einer Ausbeute von 90% der Theorie dargestellt.
15.N"-Carbobenzoxy-N'-tert.-butyloxycafbonyl-
L-Iysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester
7, 81 g (31, 9 mMol) -tert.-Butyl-L-asparaginsÏure tert.-butylester und 13, 4 g (35, 2 mMol) N α-Carbobenz- oxy-N-tert.-butyloxyzarbonyl-L-lysin werden in 180 ml Acetonitril gelöst und die auf-20 gek hlte L¯sung mit 8, 6 g (41, 8 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt.
Nach 30 Min. Stehen bei-20 und 3 Tagen bei 2 wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff (7, 0 g) ab- gesaugt und das Filtrat eingedampft. Man nimmt den Riickstand in Essigester auf und wäscht die Lösung bei 0 wie üblich mit ZitronensÏurel¯sung, Wasser, Na triumbicarbonatlösung und Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Nach Abtrennen des über schüssigen Dicyclohexyl'carbodiimids mittels Petroläther wird der Rückstand aus Ather-Petroläther kristaXisiert.
Man kristallisiert aus Methanol-Wasser um und erhält insgesamt 15, 6 g (81 %) Diester vom F. 96-99 ; [a] 25 =-14, 8 0, 5 (c = 2, 003 in Methanol). Im Dünn- schichtchromatogramm zeigt die Verbindung einen Fleck ; Rf=0, 56 in Butylacetat ; Rf=0, 74 in Essigester ; Rf = 0, 81 in Chloroform-Methanol 19 : l.
16. N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-aspara- ginsäure-di-tert.-butylester
Man hydriert eine Lösung von 17, 2 g (28, 3 mMol) N"-Carbobenzoxy-N''-tert.-butylbxycarbo yl-
L- lysyl- L- asparaginsÏure- di- tert.- butylester in 250 ml Äthanol in Gegenwart von 1, 0 g Palladiumkohle (10 % Pd). Das bei der Hydrierung entstehende Kohlendioxyd wird in einem zweiten, mit Natronlauge gefüllten Hydriergefäss aufgefangen. Nach 50 Minuten und Aufnahme von 630 ml Wasserstoff kommt die Hy drierung zum Stills'tand. Der Katalysator wird abgetrennt und das Filtrat eingedampft : 12, 7 g (95 % der Theorie) farbloses Harz, das sofort weiterverarbeitet wird.
17. Carbobenzoxy-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl- L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester
Eine Lösung von 12, 5 g (26, 4 mMol)
N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparagln- säure-di-tert.-butylester und 7.23 g(29, 1 mMol) Carbobenzoxy-L-prolin in 100 mi Acetonitril wird bei-20 mit 6, 53 g (31, 7 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und dann 30 Min. bei-20 und 38 Std. bei 2 belassen. Nach Abnutschen des Dicyclohexylharnstoffs wird das Filtrat eingedampft undderRückstand in Essigester aufgenom men, die Lösung wie üblich gewaschen, getrocknet und eingedampft.
Der Rückstand wird mehrmals mit Petrol äther, dann mit ¯ther zerrieben und die unlöslichen Anteile aus Essigester-Athor umgefällt. Dabei werden ins- gesamt 13, 33 g (72% der Theorie) reiner
Carbobenzoxy-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl-
L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butytester als festes Pulver vom F. 103-105¯ erhalten. Zur Analyse wird aus tert.-Butanol-Wasser kristallisiert, F. 104 bis 105 ; [a] 30D = - 43,6¯ ¯ 0, 6 (c = 1, 738 in ¯tha nol). Die Substanz zeigt im Dünnschichtchromatogramm einen Fleck ; Rf = 0, 46 in Essigester ; Rf = 0, 64 in Ben zol-Aceton 1 : 1 ; Rf = 0, 78 in Chloroform-Methanol
19 : 1.
18. L-Prolyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl- L-asparaginsäure-d'i-tert.-butylester
12, 0 g (17, 0 mMol) Carbobenzoxy-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl-
L-lysyl-L-asparaginsäwre-di-tert.-butylester werden in 700 ml Athanol gelöst und in Gegenwart von
1 g Palladiumkohle (10% Pd) wie unter 16 beschrieben hydriert (H2-Aufnahme : 377 ml innerhalb von 5 S'td.).
Analoge Aufarbeitung. gibt 9, 10 g (94% der Theorie)
L-Prolyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-
L-asparaginsäure-di-tert.-butylester als farbloses Harz, das sofort weiterverarbeitet wird.
19. Carbobenzoxy- L- prolyl- L- prolyl- tert.- butyl oxycarbonyl-L lysyl-L-asparaginsäure-di- te2't.-butylester
9, 10 g (16, 0 mMol) L-Prolyl-tert.-butyloxy-carbo- nyl - L- lysyl - L- asparaginsÏure - di-tert.-butylester und 4, 40 g (17, 7 mMol) Carbobenzoxy-L-prolin werden in 80 ml Acetonitril'gelöst und die Lösung bei-20 mit 4, 0 g (19, 4 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt.
Naeh 1 Std. Stehenbei-20 und 3 Tagen bei 2 wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abgesaugt, das Filtrat eingedampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen. Die Lösung wird wie üblich neutral gewaschen undeingedampft.ZurAbtrennungvonüber- schüssigem Dicyalohexylcarbodiimid verreibt man den Rückstand mit Petroläther, löst die unlöslichen Anteile (12, 81 g) in Benzol-Chloroform 1 : 1 und bringt sie auf eine SÏule von 600 g Silikagel aMesh 200 (Davison).
Man eluiert das Tetrapeptidderivat mit Benzol-Chloro- form 1 : 4 und 1 : 9. Zur Kristallisation werden diese Fralktionen mit etwas Petroläther versetzt und mehrere Tage bei 35-40 belassen, dabei kristallisiert das ungelöste, anfänglich amorphe Material langsam durch.
Nach Abgie¯en der Petrolätherlösungen werden 9, 20 g (72 % der Theorie)
Carbobenzoxy-L-prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxy- carbonyl-L-lysyl-L-asparaginsäure-di- tert.-butylester vom F. 77-84 erhalten. Zur Analyse wird zweimal aus ¯ther umkristallisiert, F. 78-85¯; [α] 25D = -72,9 ¯ 0,5¯ (c = 2,026 in ¯thanol). Im D nnschichtchromatogramm zeigt die Verbindung einen Fleck ; Rf = 0, 17 in Essigester ; Rf = 0, 47 in Benzol-Aceton 1 : 1 ; Rf = 0, 82 in n Dioxan-Wasser 9 : 1.
20. L-Prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl'-
L-asparaginsÏure-di-tert.-butylester
Eine Lösung von 7, 06 g (8, 80 mMol)
Carbobenzoxy-L-prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxy carbonyl-L-lysyl-L-asparaginsÏure-di tert.-butylester in 100 ml Methanol wird wie unter 16 beschrieben, hy- driert (H2-Aufnahme : 185 ml in 90 Min.) und analog aufgearbeitet. Man erhält aus Ather 3, 65 g kristallinen
L-Prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl L4ysy$-L-asparaginsäure-di-tert.--butylester in Nadeln vom F. 146-149 ; aus der Mutter1auge kri stallisierennachEinengennoch weitere 1, 54 g vom gleichen Schmelzpunkt (Ausbeute insgesamt 88 % der Theorie).
Zur Analyse wird aus Methanol-Ätherumkristalli- siert, F. 147-149 ; [a] 25 =-73, 1 0, 7 (c = 1, 381 in Methanol). Im Dünnschichtchromatogramm zeigt die Verbindung einen Fleck ; Rf = 0, 12 in Dioxan-Wasser 9 : 1 ; Rf = 0, 18 in Methanol.
21. Carbobenzoxy-L-seryl-L-prolyl-L-prolyT- tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginsäure- di-tert.-butylester
Eine auf-20 gekühlte Lösung von 5, 18 g (7, 75 mMol) L-Prolyl-L-prolylztert.-butyloxycarbonyl-L 1ysyl- L-asparaginsäure-di-tert.-buty, lester wnd 2, 22 g (9, 30 mMol) Carbobenzoxy-L-serin in 60 ml Acetonitril wird mit 2, 88 g (14, 0 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und dann 65 Std. bei 2 belassen. Hierauf wird wie unter 19 beschrieben aufgearbeitet.
Der Essigesterrück- stand (7, 75 g) wird zur Abtrennungvonüberschüssigem Dicyclbhexylcarbodiimid mit Petroläther zerrieben, die unlöslichen Anteile (7, 40 g) in Benzol-Chloroform 1 : 4 gelöst und auf eine Säule von 350 g Silikagel Mesh 200 gegeben. Nach Eluierung geringer Mengen von Nebenprodukten mit Benzol-Chloroform 1 : 9, Chloroform undChloroform-Met'hanol 99 : 1 wird der
Carbobenzoxy-L-seryl-L-prolyl-L-prolyl- tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparagin- s äuremdi-tert.-butylester mit Chloroform-MeRanol 98 : 2 elu. ie. rt.
Man erhält 5, 36 g (78 % der Theorie) Harz, das nach Dünnschicht- chromatogramm einheitlich ist. Zweimaliges Umfallen aus Ather-Petrolät & er gibt ein analysenreines amorphes Produkt ; [a] 2D =-96, 6 0, 7 (c= 1, 397 in Metha nol). Rf = 0, 22 in Chloroform-Methanol 19 : 1 ; Rf = 0, 62 in Dioxan ; Rf=0, 66 in Chloroform-Methanol 9 : 1.
22. L-Seryl-L-prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl- L-lysyl-L-asparaginsäure-di-tert.-butylester
1, 778 g Carbobenzoxy-L-seryl-L-prolyl-L-prolyl- tert.-butyl'oxycarbonyl-L-lysyl-L-asparagin- säure-diJtert.-butylester werden in 25 niMethanolgelöstumd mit 200 mg Pal : la- diumkohle (10% Pd) in der Schüttelente unter Kohlen dioxydabsorptionhydriert.DieWasserstoffaufnahmeist nach 1 Std. beendet, undnacheinerweiterenStunde wird der Katalysator abfiltriert und die Lösung auf ein kleines Volumen eingeengt.
Durch Zugabe von Essig- ester und Petroläther wird das Peptid als halbfesteMasse ausgefällt und die überstehende L¯sung dekanitiiert und verworfen. Beim Trocknen im Hochvakuum bei 40 erhält man 1, 483 g (98%) chromatographisch einheit- liches H-Ser-Pro-Pro-Lys (BOC)-Asp (OBut)-OBut mit unscharfem Schmelzpunkt bei etwa 80-90 . [α] =-92 0, 5¯ (c = 2, 0 in Methanol).
D nnsch ? c h t c hr o m a t o gramm : Rf6s = 0, 26 ; Rf101 = 0, 71.
23. Carbobenzoxy-γ -tert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl
L-seryl-L-prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl
L-lysyl-L-asparaginsÏure-di-tert.-butylester-acetat 1, 271 g (1, 25 mMol) Carbobenzoxy-γ
-tert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin und 0, 237 g (1, 25 mMol) p-ToluolsulfonsÏure.H2O werden unter Erwärmen auf 50 in 3, 5 ml absolutem Dmiethylformamid gelöst, auf 20 abgekühlt und b g e k ? ? h l t u d mit einer Lösung von 0, 89 g (1, 18 mMol)
L-Seryl-L-prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl
L-lysyl-L-asparaginsÏure-di-tert.-butylester in 3,
5 ml Chloroform versetzt. Unter R hren werden sodann 0, 315 g (1, 53 mMol) Dicyelohexylcarbodiimid in fez'ter Form zugegeben'und u n d die Mischung über s c h un g ? ? b e r Nacht bei 22¯und dann noch während 8 Std. bei 40 gerührt.
Nach Abkühlen auf auf filtriert man den ausgeschiede- nen Dicyclohexylharnstoff ab, engt das Filtrat im Was- serstrahlvakuum bei 40 soweit wie möglich ein und fällt das Reaktionsprodukt durch Zugabe von 35 ml Benzol und 35 ml Petroläther als viskose Masse aus. Sie wi d wieder in 4 ml Methanol gelöst und durch Zugabe von 40 rnl Ather als fempulverige Fällung ausgeschieden, abfiltriert und im Hochvakuum bei 40 getrocknet.
Das so erhaltene Rohprodukt (2, 26 g, Tosylat) wird zur Umwandlung in das Acetat in 32 mil Methanol, und 16 ml Wasser gelöst und durch eine Saule von schwach basischem Ionenaustauscher m I o n e n a u s t a u s c h e r (Merck Nr. II) in der Acetatform filtriert (Säulenlänge 15 cm ; 0 2 cm ; als L¯sungsmittel dient Methanol-Wasser l M e h a n o l ? W a s s e r 1 : 1). Das Eluat wi d auf 50 ml konzentriert und dann lyophilisiert.
Man erhält 2, 08 g Acetat, das durch eine multiplikative Verteilung tuber 230 Stufen im System Methanol,-0, 1-m.- Ammoniumacetat (pH 7)-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (2 : 1 : 1 : 1) mit Phasenvolümina von je 25 ml gereinigt ? g t wird.
Der Inhalt der Verteilungselemente Num- mer 56-85 (Maximum bei Nr. 68 ; K ? = 0 ?, 42) ergibt beim Eindampfen E ? d am p f e n zur Trockene insgesamt 1, 22 g ge schütztes Undekapeptid-acetat (57%, % , bezogen auf eingesetztes Pentapeptid). Das Produkt weist bei der Chro matographie etwa 5 % einer Verunreinigung auf und wird in diesem Zustand weiterverarbeitet. D nnschichtchromatographie : Rf52 = 0, 29 ; Rf101 ? = 0 , 81.
24.γ-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenyl- alanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-seryl
L-prolyl-L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl
L-asparaginsÏure-di-tert.-butylester-acetat 1, 21 g Carbobenzoxy-undekapeptidester werden in 30 rnl Methanol in Gegenwart von 0, 04 ml Eisessig und 300 mg Palladiumkohle (10 % Pd) bei 30 und Normal- N o r m a l druck in einem Kölbchen mit Magnetrühfer hydriert, ohne Absorption des entsprechenden Kohlendioxyds.
Der Verlauf der Reaktion wird anhand von Proben mit- tels Dünnschichtchromatographie verfolgt. Nach 4 Std. ist die Abspaltung der Carbobenzoxygruppe C a r b o b e n z o x y gr u p pe beendet, und die Lösung d . e L¯ s u n g wird nach Abfiltrieren des Katalysators zur Trockene eingeengt, der amorphe Rückstand pul- verisiert und im Hochvakuum bei 40 getrocknet. Man erh ; : 1 t 1, 076 g (96%) Undekapeptidester-acetat, das chromatographisch eine Reinheit von etwa 95%aufweist. D nnschichtchromatographie: Rf52 =0,12; Rf101 = 0, 67.
25. Na-tert.-Butyloxycarbonyl-¯-tert.-butyl
L-asparagyl-L-seryl-glycyl-L-prolyl-L-tyrosyl tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-methionyS-y- tert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl
L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-seryl-L-prolyl
L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl L-asparaginsäure-di-tert.-butylester-acetat 814 mg (0, 763 mMol)
Na tert. Butyloxycarbonyl-¯-tert.-butly L-asparagyl-L-seryl-glycyl-L-prolyl-L-tyrosyl- tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-methionm- hydrazid werden in 8 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und im Eis-Kochsalz-Bad (-12 ) mit 3, 05 ml ln Saltsäure und 0, 632 ml lÖligerNatriumnitritlösung (0, 916 mMol) versetzt.
Die klare Lösung wird 5 Min. bei-12 stehen- gelassen und dann das entstandene Azid durch Zugabe von 38 ml auf-12¯ vorgek hlter 20 % iger Kochsalz- lösung als flockiger Niederschlag ausgefällt. Dieser wird bei 0'abfiltriert, auf der Nutsche mit 10 ml eiskalter 5 Natriumbicarbonatlösung und zuletzt mit 4 ml Wasser gewaschen, dann in noch feuchtem Zustand in 16 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst und mit einer Lösung von 1, 07 g (0, 635 mMol) γ-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-
L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-seryl-L-prolyl
L-prolyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl L-asparaginsäure-di-tert.-butylester-acetat in 10 ml Dimethylformamid vereinigt.
Die klare Lösung wird während 18 Std. bei 0 aufbewahrt,dannwährend
15 Min. bei 20 im Wasserstrahlvakuum evakuiert (Ent- fernung von HN3) und noch während 23 Std. bei 20 stehengelassen. Das Dimethylformamid wird sodann im Hochvakuum bei 40 grösstenteils verdampft, der bonig- artige Rückstand in 60 m'l hei¯em Benzol getost, durch Zugabe von 60 ml PetrolÏther als pulveriger Nieder- schlag wieder ausgefällt, abfiltriert und getrocknet. Die so erhaltenen 1, 88 g werden zur Vorreinigung in 16 ml Methanol gelöst und durch Zugabe von 48 ml Essigester und 80 ml Petroläther wieder ausgefällt.
Man erhält dabei 1, 63gRohprodukt,das zur weiteren Reinigung einer multiplikativen Verteilung über 500 Stufen im System Meth anol-0, 1-m. Ammoniumacetat (pH 7)-Chlbroform- Tetrachlorkohlenstoff (17 : 7 : 8 : 8) mit Phasenvolu- mina von je 25 ml unterworfen wird. Aus den Vertei lungselementen Nrn. 110-149 (Maximum bei Nr. 130 ; K = 0, 35) erhält man beim Eindampfen zur Trockene 952 mg gesch tztes ¯-MSH-acetat (55 %, bezogen auf eingesetztes Undekapeptid) als weisses Pulver vom F. etwa 220-225 (Zers.). Aus dem Dünnschichtchromato- gramm im System 52 ist die Anwesenheit von etwa 10 % eines Nebenproduktes mit kleinerem Rf-Wert ersichtlich. (Maximum des Nebenproduktes etwa Nr. 140 ; K etwa 0, 39).
Die Drehung des geschützten -MSH-Acetats ist Mp =-36 1 (c = 1, 06 in Methanol).
C120H196O36N26S Acetat ; 2719, 1) Ber. : C 56, 98 H 7, 27 O 21, 18 N 13, 39 S 1, 18
Essigsäure 2, 21 % Gef. : C 56, 53 H 7, 55 O 20, 84 N 13, 10 S 1, 28
Essigsäure 2, 1 % UV-Absorption in Methanol-l-n.Natronlauge (9 : 1) : $?ma ux: 283 mu (? = 7550) ; 289 m, l4 (e = 7400) Try : Tyr = 1, 05.
Dünnschichtchromatographie : Rf43 = 0, 56 ; Rf52 = 0, 45.
Nebenprodukt : Rf43 = 0, 56 ; Rfs2 = 0, 39.
26. L-Aspara, gyl-L-seryl-glycyl-L-prolyl-L-tyrosyl- L-lysyl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-
L-seryl-L-prolyl-L-prolyl-L-lysyl-
L-aspafraginsäure
440 mg gesch tztes ¯-MSH-acetat werden in 8, 8 ml 97% iger Trifluoressigsäure gelöst und während l Std. bei 20 imDunkelnstehengelassen. Die Lösung wird sodann schonend auf ein kleines Volumen eingeengt und nach Zugabe von 4 ml Wasser nochmals eingeengt und dann lyophilisiert.
Man efhält 565 mg Trifluoracetat, das wiederum in Wasser gelöst und durch Filtration durch, eine Säule (1=15 cm, Ï = 0, 9 cm) mit schwach basischem Ionenaustauscher (Merck Nr. II) in der Ace tatform zum Acetat umgesetzt wird (389 mg). Bei der Chromatographie (Dünnschichtchromatogramm, System 104) zeigt sich folgendes Bild :
Rf = 0, 07 Spuren
Rf = 0, 18 Spuren
Rf = 0, 26 etwa 10% Nebenprodukt
Rf = 0, 31 etwa 85-90 % ¯-MSH
Rf = 0, 52 Spuren
Dieses Gemisch wird durch. eine multiplikative Verteilung nach Craig im System 0, 5% Trichloressigsäuresek.
Butanol in Stickstoffatmosphäre gereiinigt. Das Pha senvolumen von Ober-und Unterphase beträgt je 10 ml.
Nach 1300 Stufen befindet sich das Maximum bei Verteilungselement Nr. 468 (K = 0, 56). In der Umgebung des Maximums wird die L¯sung in Fraktionen von je 5 Verteilungseinheiten entnommen, im Vakuum scho- nend auf ein kleinesVolumeneingeengtundlyophil'i- siert. Bei der Dünnschichtchromatographie (System 104) zeigen die Proben aus den Verteilungselementen Nummern 453-487 die vollstÏndige Abwesenheit des Nebenproduktes mit Rf = 0, 26. Dieses ist hauptsächlich in den Elementen Nrn. 408-432 angereichert, in Mischfraktio- nen zusammen mit ¯-MSH.
(Maximum f r das Nebenprodukt etwa bei Nr. 16, rmax = 416, K = 0, 47). Sämt- liche e Fraktionen zeigen jedoch wieder, wie schon das eingesetzte Rohprodukt, Spuren von Verunreinigungen mit Rf = 0, 07 und 0, 18 (Sulfoxyd), die offenbar im Laufe der Verteilung bzw. während der Aufarbeitung frisch geb'il'det word'en sind. Die Fraktionen aus den Verteilungselementen Nrn. 453-487 werden vereinigt (Trichloracetat und mit Hilfe von schwach basischem Ionenaustauscher wiederum in. das Acetat umgewandelt.
Zurend:gültigenReinigungwirddieses an einer Säule von schwach saurem Ionenaustauscher auf der Basis von Dextran-Gel (Carboxymethyl-Sephadex C-25, med'ium grade, Pharmacia, Uppsal'a) wie folgt chromatographiert : Die SÏule (l = 17, 5 cm ; Ï = 0, 96 cm) wird vorerst mit 0, 05m Ammoniumacetatpuffer (pH = 5, 5) Ïquilibriert und nach Auftragen der in 0,5ml Wasser gel¯sten Substanz mit weiteren 30ml 0,05m Pufferl¯sung gewaschen (Eluat verworfen).
Danach wird ein linear steigenderKonzentrationsgradient angesetzt, er haltendurchMischen des Inhales von zwei offenen, zylindtischen Gefässen mit je 80 ml 0, 05m bzw. 0, 6m Ammoniumacetatpuffer vom pH 5, 5. Die optische Dichte des Eluats wird mit Hilfe eines Uvico°d -Gerä- tes (LKB Produkter A. B., Stockholm) kontinuierlich registriert. Die verschiedenen Fraktionen werden auf ein kleines Volumen konzentriert, lyophilisiert und chro- matographisch untersucht : Frakt. Nr. Volumen Pufferkonz.
Gewicht Beurteilung (DS, System 104) 151ml0,05-0,22Spuren
2 9 ml 0, 22-0, 25 4,5 mg ¯-MSH (etwa 40%) und Sulfoxyd (etwa 50 %) 3 15 ml 0, 25-0, 3096 mg/ ?-MSH mit etwa 1-2 % Sulfoxyd 4 9 mi 0, 30-0, 33 94 mg reines ¯-MSH
5 8 ml 0, 33-0, 36 6 mg ¯-MSH (etwa 20%) und Nebenprodukt,
Rf = 0, 07 (etwa 80%)
6 9 ml 0, 36-0, 39 4, 5 mg Nebenprodukt, Rf = 0, 07
7 18ml 0, 39-0, 45 5 mg 8 16 ml 0, 45-Q, 51 2 mg Aus der Fraktion 3 kann das Sulfoxyd durch nochmaliges Chromatographieren an Carboxymethyl-Sephadex C-25 entfernt werden.
Das aus Fraktion 4 nach dem Trocknen wÏhrend 15 Std. bei 50¯ und 0,01 mm Hg ber Kaliumhydroxyd erhaltene reine ¯-MSH-Acetat enthältnocheinigeProzent Wasser und ist stark hygro- skopisch. Es nimmt beim Stehen an der Luft 7, 1 % Feuchtigkeit auf (Gleichgewichtszustand). Eine solche Probe zeigt folgende Analysenwerte : UV-Absorption in 0,1n Natronlauge : 2, 134 mg Substanz,gelostin 10 ml (MG = 2134), D294, 4 = 0, 380-0, 011 (Basisabsorption) = 0, 369, Daso = 0, 582-0, 013 (Basisabsorption) = 0, 569.
Daraus ergibt sich durch Berechnung (G. H. Beavan & E. R. Holiday, Advances Protein Chemistry 7, 319 [1952]) : MTry + MTyr = 1,56 . 10-4 Mol/1;
Mtry/M= 1,27 MTyr
1,56 . 100 Peptidgehalt = - =78% 2 Essigsäurebestimmung durch Destilllation mit Schwofel- säure und Titration mit Natronlauge : Gefunden 6, 5%.
Optische Aktivität : [a] D =-57, 5 1 (c = 0, 99mIn Essigsäure).
AminosÏurebestimmung im Totalhydrolysat 16 Std. bei 110¯ in 20%iger SalzsÏure (in Klammern die theoreti- schen Werte) : His (l) 1, 07 Lys (2) 1, 98 Arg (l) 0, 96 Asp (2) 2, 07 Ser (2) 1, 83 G ! lu (l) 0, 97 Pro (3) 3, 20 Gly (2) 2, 03 Met (l) 0, 91 Tyr (l) 1, 05 Phe (l) 1, 00.
D nnschichtchromatographie auf Kieselgel: Rf101 = 0,23; Rf104 = 0,31.
Papierelektrophorese auf Whatman-Papier Nr. 1 : pH 2 (Ameisensäure-Essigsäure) 50 V/cm, l Std.-11 cm, pH 6, 3 (Pyridinacetat) 75 V/cm, 2 Std.-4, 9 cm.