NO340900B1

NO340900B1 - Cytotoksiske aktive CD3 spesifikke bindingskonstrukt, fremgangsmåte for fremstilling,nukleinsyresekvens, vektor, vert, sammensetning, farmasøytisk sammensetning og et kit

Info

Publication number: NO340900B1
Application number: NO20062117A
Authority: NO
Inventors: Francis J Carr; Birgit Kohleisen; Ulla Lenkkeri-Schütz; Anita Hamilton; Robert Hofmeister; Christian Itin; Patrick Bauerle; Stephen Williams
Original assignee: Amgen Res Munich Gmbh
Priority date: 2003-10-16
Filing date: 2006-05-11
Publication date: 2017-07-10
Also published as: US20130224205A1; KR20060101485A; KR20120125634A; EP2292664B1; EP1673398B1; WO2005040220A1; US20090022738A1; US8076459B2; MXPA06004035A; NO20062117L; EP1673398A1; IL208795A0; AU2004283850B2; AU2004283850C1; CA2542239C; IL174902A; ZA200601699B; ES2358427T3; EP2292664A2; CA2542239A1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et cytotoksisk aktivt, CD3 spesifikt bindingskonstrukt omfattende et første domene som spesifikt binder til human CD3 og et Ig-avledet andre bindedomene. Videre tilveiebringes det en nukleinsyresekvens som koder et CD3 spesifikt bindekonstrukt ifølge oppfinnelsen. Ytterligere aspekter ved oppfinnelsen er vektorer og vertsceller omfattende nevnte nukleinsyresekvens, en fremgangsmåte for fremstilling av konstruktet ifølge oppfinnelsen og et preparat omfattende nevnte konstrukt. Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelsen av nevnte konstrukter for fremstilling av farmasøytiske preparater for behandling av spesielle sykdommer, en metode for behandling av spesielle sykdommer og et sett omfattende bindings-konstruktet ifølge oppfinnelsen.

Human CD3 angir et antigen som uttrykkes på T-celler som en del av det multimoleky-lære T-cellekompleks og som består av tre forskjellige kjeder: CD3-e, CD3-8 og CD3-y. Kløstring av CD3 på T-celler, for eksempel ved immobiliserte anti-CD3 antistoffer, fører til T-celleaktivering tilsvarende engasjementet av T-cellereseptoren men uavhengig av dens klon-typiske spesifisitet, se WO 99/54440 eller Hoffman (1985) J. Immunol. 135:5-8.

Antistoffer som spesifikt gjenkjenner CD3 antigen er beskrevet i teknikken, for eksempel hos Traunecker, EMBO J 10 (1991), 3655-9 og Kipriyanov, Int. J. Cancer 77

(1998), 763-772.1 den senere tid er antistoffer rettet mot CD3 foreslått ved behandling av et antall sykdommer. Disse antistoffer eller antistoffkonstrukter virker som enten T-celle utarmende midler eller som mitogeniske midler som beskrevet i EP 1 025 854. Human/gnager hybridantistoffer som spesifikt binder til det humane CD3 antigen-kompleks er beskrevet i WO 00/05268 og er foreslått som immunosuppressive midler, for eksempel for behandling av avstøtningsepisoder etter transplantasjon av renale, septiske og kardialetransplantater. WO 03/04648 beskriver et bi-spesifikt antistoff rettet mot CD3 og mot en ovariecancer. Videre beskriver Kufer (1997) Cancer Immunol Immunother 45:193-7 et bispesifikt antistoff som er spesifikt for CD3 og EpCAM for terapi av minimal rest cancer.

Imidlertid er den kjente teknikks antistoffer rettet mot CD3 avledet fra ikke-humane kilder. Dette fører til diverse alvorlige problemer når man benytter slike anti-CD3 antistoffer som en del av et terapeutisk regime i mennesker.

Et slikt problem er "cytokinfrigivningssyndrom (CRS)". CRS er et klinisk syndrom som er observert etter administrering av de første få doser av anti-CD3 antistoffer og henger sammen med det faktum at mange antistoffer som er rettet mot CD3 er mitogene. In vi tro induserer mitogene antistoffer som er rettet mot CD3 T-celle proliferering og cytokinproduksjon. In vivo fører denne mitogene aktivitet til en storskalafrigivning av cytokiner som inkluderer mange T-celle avledede cytokiner innen de første timer etter den første injeksjon av antistoff. Den mitogene kapasitet for CD3 spesifikke antistoffer er monocytt/makrofagavhengige og involverer fremstilling av IL-6 og IL-ip av disse celler.

CRS symptomer strekker seg fra hyppig rapporterte, milde "influensa-liknende" symptomer til mindre hyppig rapporterte, alvorlige "sjokk-liknende" reaksjoner (som kan inkludere kardiovaskulære og sentralnervesystemmanifestasjoner). Symptomer inkluderer, blant annet, hodepine, skjelving, kvalme/oppkast, diaré, abdominal smerte, slapphet og muskel/leddsmerter og pine, generell svekkelse, kardiorespiratoriske hendelser så vel som neuropsykiatriskehendelser. Alvorlig pulmonært ødem har opptrådt hos pasienter med fluidoverlast og hos de som syntes ikke å ha en fluidoverlast. Et annet alvorlig problem som hemmer den terapeutiske anvendelse av særlig murine monoklonale antistoffer er opphopningen av humoral immunrespons mot slike antistoffer, noe som resulterer i produksjon av human anti-muse antistoffer ("HAMA'er") (Schroff (1985). Cancer Res. 45:879-885, Shawler (1985) J. Immunol. 135:1530-1535). HAMA'er genereres typisk i den andre uke av behandlingen med det murine antistoff og nøytraliserer de murine antistoffer og blokkerer derved deres evne til å binde til tilsiktede mål. HAMA responsen kan avhenge av de murine, konstante ("Fc") antistoffområde og/eller arten av de murine variable ("V") områder.

Den tidligere teknikken inneholder forskjellige veier for å redusere eller forhindre produksjonen av HAMA'er ved å modifisere monoklonale antistoffer av ikke-human opprinnelse.

En vei for å redusere immunogeni si teten av slike antistoffer er ved humanisering som for eksempel beskrevet i WO 91/09968 og US 6 407 213. Generelt medfører humanisering å erstatte ikke-humane antistoffsekvenser med tilsvarende humane anti-sekvenser som for eksempel når det gjelder CDR-poding.

En annen vei for å redusere immunogenisiteten av slike antistoffer er ved deimmunisering som for eksempel beskrevet i WO 00/34317, WO 98/52976, WO 02/079415, WO 02/012899 og WO 02/069232. Generelt medfører deimmuni sering å gjennomføre substitusjoner av aminosyrer med potensielle T-celleepitoper. På denne måte vil sannsynligheten at en gitt sekvens vil gi opphav til T-celleepitoper ved intracellulær proteinprosessering, bli redusert. Videre beskriver WO 92/10755 en vei der antigeni ske determinanter på proteiner konstrueres. Særlig blir proteiner epitopmappet og deres aminosyresekvens forandret via genetisk konstruksjon. Imidlertid viser humaniserte antistoffer ofte en redusert bindingsaffinitet med henblikk på deres mål sammenliknet med deres ikke-humaniserte opphavsantistoffer og er altså ofte noe immunogene i en humanvert.

Maletz K. et al., Int J Cancer. 2001, vol.93, no.3, side 409-416 beskriver cytotoksiske aktive CD3 spesifikke enkeltkjede antistioffer som omfatter et første domene som spesifikt binder til CD3 og et lg derivert andre bindingsdomene spesifikt for en tumor spesifikk markør (EpCAM, c-erbB, LeY). Det beskrives her om evnen til disse antistoffene til å lysere tumorceller.

EP 05620276 beskriver problemer assosiert med monoklonale antistoffer som på grunn av deres gnager opprinnelse, forårsaker uønsket immunologisk respons hos menneske.

US 6491916 Bl beskriver om humanisert murin OKT (anti-CD30), der bindingsspesifisiteten til det murine antistoffet er overført til et humant antistoff rammeverk.

WO 02066514 A beskriver generelle metoder for deimmuni sering av terapeutiske proteiner for å redusere immunogenitet ved å eliminere potensielleT-celle epitoper.

Det tekniske problem ved foreliggende oppfinnelse var derfor å tilveiebringe midler og metoder for behandling og/eller lindring av tumorøse sykdommer, proliferative forstyrrelser også kjent som B-celle relaterte sykdommer ved induksjon av T-celle mediert immunrespons. De ovenfor nevnte midler og metoder skulle overvinne de angitte mangler ved de kjente, antistoff-baserte terapier.

Løsningen på det tekniske problem oppnås ved å tilveiebringe de utførelsesformer som karakteriseres i kravene.

Foreliggende oppfinnelse omfatter cytotoksisk aktivt CD3 spesifikt bindingskonstrukt, kjennetegnet ved at det omfatter et første domene som spesifikt binder til human CD3 og et Ig-avledet andre bindingsdomene der nevnte første domene er deimmunisert og omfatter et CDR-H1 område som omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NR.: 88, et CDR-H2 område som omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NR.: 90 eller 92 og et CDR-H3 område som omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NR.: 96, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 eller 127; og

der nevnte første domene i sitt rammeverk Hl ytterligere omfatter sekvensen VKK og der overgangssekvensen mellom rammeverk Hl og CDRHl området omfatter sekvensen Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe (ASGYTF; SEQ ID NR.: 233).

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse nukleinsyresekvens kjennetegnet ved at den koder for et CD3 spesifikt bindingskonstrukt i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 18.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også vektor, kjennetegnet ved at den omfatter en nukleinsyresekvens ifølge krav 19.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også en vert, kjennetegnet ved at den er transformert eller transfektert med en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 20 til 22.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte for fremstilling av et CD3-spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 18, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking av en vert ifølge krav 30 under betingelser som tillater ekspresjon av polypeptidkonstruktet og gjenvinning av det produserte polypeptidkonstrukt fra kulturen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter et CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 18 eller som fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 24, et nukleinsyremolekyl ifølge krav 19, en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 20 til 22 eller en vert ifølge krav 23, og eventuelt en proteinøs forbindelse i stand til å gi et aktiveringssignal for immune effektorceller.

Omfattet av forleiggende oppfinnelse er også anvendelse av et CD3-spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 18 eller som fremstilt ved fremgangsmåten i krav 24, et nukleinsyremolekyl ifølge krav 19, en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 20 til 22, eller en vert ifølge krav 23 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for forebygging, terapi eller lindring av en proliferativ sykdom, en tumorøs sykdom, en inflammatorisk sykdom, en immunologisk forstyrrelse, en autoimmun sykdom, en infeksiøs sykdom, viral sykdom, allergiske reaksjoner, parasittiske reaksjoner, graft-versus-vert sykdommer eller vert-versus-graft sykdommer.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse farmasøytisk sammensetning som omfatter et CD3 spesifikt bindingskonstrukt i henhold til et hvilket som helst av kravene 1 til 18 eller som fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 24, et nukleinsyremolekyl ifølge krav 19, en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 20 til 22 eller en vert ifølge krav 23, for forebygging, terapi eller lindring av en proliferativ sykdom, en tumorøs sykdom, en inflammatorisk sykdom, en immunologisk forstyrrelse, en autoimmun sykdom, en infektiøs sykdom, viral sykdom, allergiske reaksjoner, parasittiske reaksjoner, graft-versus-vert sykdommer eller vert-versus-graft sykdommer Foreliggende oppfinnelse omfatter også kit, kjennetegnet ved at det omfatter et CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 18 eller er som fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 24, et nukleinsyremolekyl ifølge krav 19, en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 20 til 22 eller en vert ifølge krav 23.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse et cytotoksisk aktivt, CD3 spesifikt bindende konstrukt omfattende et første domene som spesifikt binder til human CD3 og et Ig-avledet, andre bindingsdomene, der det første domenet er deimmunisert og omfatter et CDR-H1 område, et CDR-H2 område og et CDR-H3 område idet nevnte CDR-H3 området omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NR.: 96, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 eller 127; og der nevnte første domene videre i sitt rammeverk Hl omfatter sekvensen VKK (Val-Lys-Lys) og der overgangssekvensen mellom rammeverk Hl og CDR-H1 området omfatter sekvensen Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe (ASGYTF; SEQ ID NR.: 233).

Det ble overraskende funnet at de ovenfor nevnte, spesifikke modifikasjoner på kjente CDR områder så vel som rammeverksområder og deres tilsvarende overgangssekvenser førte til deimmuniserte, CD3-spesifikke bindingsmolekyler som viste redusert immunogenisitet men som bibeholdt sin cytotoksiske aktivitet sammenliknet med opprinnelige, ikke-deimmuniserte sekvenser. Dette funn var spesielt overraskende fordi ikke alle mulige deimmuniseringsprotokoller førte til bioaktive, funksjonelle konstrukter som viste distinkt, cytotoksisk aktivitet, se de vedlagte eksempler. Videre viste overraskende deimmuni serte, cytotoksisk aktive CD3 bindingsmolekyler øket produktivitet. Ifølge oppfinnelsen er spesifikke sekvenser av ikke-deimmuniserte antistoffer erstattet med/modifiserte til de sekvenser som er angitt ovenfor. Særlig er i rammeverk Hl områdene den opprinnelige sekvens Leu-Ala-Arg (LAR) erstattet med sekvensen Val-Lys-Lys (VKK). Videre er sekvensen Thr-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe (TSGYTF) som var omfattet i overgangsområdet av rammeverk Hl og CDR-H1 for noen ikke-modifiserte/ikke-deimmuniserte CD3 spesifikke antistoffer modifisert i henhold til oppfinnelsen til Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe (ASGYTF) (SEQ ID NR.: 233)

(se figur 14). Et ønsket CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge oppfinnelsen erkarakteriserttil å omfatte minst to bindingspesifisiteter hvorvidt en andre bindingsspesifisitet er Ig-avledet. Videre er de ønskede konstrukterkarakterisert vedde spesifikke aminosyresekvenser som er vist ovenfor. Som dokumentert i de vedlagte eksempler bibeholder konstruktene som tilveiebrakt her fremdelers bioaktiviteten i deres modifiserte/deimmuniserte form. Eksemplene viser også at ikke alle deimmuniseringer, bestemt ved metoder som kjent i teknikken (WO 92/10755, WO 00/34317, WO 98/52976,WO 02/079415 eller WO 02/012899) fører til bioaktive molekyler, se særlig eksemplene 2 og 5.

Uttrykket "cytotoksisk aktivt CD3 bindingskonstrukt" som benyttet her angår et CD3 spesifikt konstrukt som er i stand til å binde til humant CD3 kompleks uttrykt på T-celler og i stand til å indusere eliminering/lysering av målceller. Binding av CD3 spesifikke bindere for CD3/CD3 komplekset (for eksempel antistoffer, antistoff deri vater eller antistoffragmenter) fører til aktivering av T-celler som velkjent i teknikken, se WO 99/54440.

I henhold til dette må et konstrukt ifølge oppfinnelsen være i stand til å eliminere/lysere målceller in vivo og/eller in vitro. Tilsvarende målceller omfatter celler som uttrykker et overflatemolekyl som gjenkjennes av det andre Ig-avledede bindingsdomene av oppfinnelsens konstrukter. Slike overflatemolekyler karakteriseres nedenfor. Cytotoksisitet kan detekteres ved metoder som velkjente i teknikken og metoder som illustrert nedenfor og i de vedlagte eksempler. I henhold til dette omfatter slike metoder blant annet fysiologiske in vitro analyser. Slike fysiologiske analyser kan følge celledød, for eksempel ved tap av cellemembranintegritet (for eksempel FACS basert propidium Iodid analyse, trypan Blå influksanalyse, fotometriske enzymfrigivnings-analyser (LDH), radiometrisk<51>Cr frigivningsanalyse, fluorometrisk Europium frigivning og Calcein AM frigivningsanalyser). Ytterligere analyser omfatter følging av cellelevedyktighet, for eksempel ved fotometrisk MTT-, XTT-, WST-1- og alamarBlue analyser, radiometriske<3>H-Thd inkorporeringsanalyser, klonogenisk analyse som måler celledelingsaktivitet, og fluorometrisk Rhodamin<123>analyse som måler mitokondrial transmembran gradient. I tillegg kan apoptose følges for eksempel ved FACS-basert fosfatidylserineksponeringsanalyse, ELISA-basert tunneltest, kaspaseaktivitetsanalyse (fotometrisk, fluorometrisk eller ELISA-basert) eller analysering av forandre T-cellemorfologi (krymping, membranblebbing). Det er foretrukket at cytotoksisk aktivitet analyseres ved FACS-baserte målinger eller frigivning av fluoressens baserte fargestoffer. I slike analysefluoressensmerkede fargestoffer som bærer et molekyl som binder til det andre domenet av det cytotoksiske aktive, bispesifikke CD3 bindingskonstrukt ifølge oppfinnelsen (fortrinnsvis NALM-6 celler for CD 19 og Katoceller for EpCAM antigenet) blir inkubert med isolerte PBMCer av tilfeldige donorer eller med en standardisert T-cellelinje i nærvær av det cytotoksisk aktive, bispesifikke CD3 bindingskonstrukt ifølge oppfinnelsen. Etter inkubering blir frigivningen av fargestoff fra de fluoressente målceller til supernatanten bestemt ved et spektrofluorimeter. Et cytotoksisk aktivt, deimmuni sert, bi spesifikt CD3 bindingskonstrukt ifølge oppfinnelsen karakteriseres ved å sammenlikne verdier som oppnås ved å måle bioaktiviteten for et liknende konstrukt som ikke er deimmunisert eller som ikke har noen spesifisitet mot målcellene.

Uttrykket "binding til/interagering med" som benyttet innen oppfinnelsens kontekst definerer en binding/interaksjon av minst to "antigeninteraksjonsseter" med hverandre. Uttrykket "antigen-interaksjonsseter" definerer, ifølge oppfinnelsen, en del av et polypeptid som viser evnen til spesifikk interaksjon med et spesifikt antigen eller en spesifikk gruppe av antigener. Nevnte binding/interaksjon skal også forstås til å definere en "spesifikk gjenkjenning". Uttrykket "spesifikk gjenkjenning" betyr ifølge oppfinnelsen at antistoffmolekylet er i stand til spesifikt å interagere med og/eller binde til minst to aminosyrer av hvert av humanmålmolekylene som definert her. Antistoffer kan gjenkjenne, interagere med og/eller binde til forskjellige epitoper av det samme målmolekyl. Nevnte uttrykk angår spesifisiteten for antistoffmolekylet, det vil si dets evne til å diskriminere mellom de spesifikke områder av humanmålmolekylene som definert her. Den spesifikke interaksjon av antigeninteraksjonssetet med sitt spesifikke antigen kan resultere i initieringen av et signal, for eksempel på grunn av induksjonen av en forandring av konformasjonen av antigenet, en oligomerisering av antigenet, og så videre. Således binder en spesifikk del av aminosyresekvensen av antigeninteraksjonssetet og antigenet, til hverandre, som et resultat av deres primære, sekundære eller tertiære struktur så vel som resultatet av sekundærmodifikasjoner i strukturen.

Uttrykket "spesifikk interaksjon" som benyttet ifølge oppfinnelsen betyr at det CDR3 spesifikke bindingskonstrukt ifølge oppfinnelsen ikke eller i det vesentlige ikke kryssreagerer med (poly)peptider med tilsvarende strukturer. I henhold til dette binder konstruktet ifølge oppfinnelsen spesifikt til/interagerer med human CD3 og er i stand til, på grunn av sitt andre, Ig-avledede domene, å interagere med spesifikke, valgte andre forbindelser, antigener, celleoverflatemarkører, tumormarkører og så videre. Spesifikke eksempler på slike molekyler mot hvilket det andre, Ig-avledede domene er rettet, er gitt nedenfor.

Kryssreaktivitet for et panel av konstrukter under undersøkelse kan testes, for eksempel ved å bedømme binding av nevnte panel av bispesifikke enkeltkjedekonstrukter under konvensjonelle betingelser (se for eksempel Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratoty Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 and Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) til (poly)peptidet av interesse, så vel som til et antall mer eller mindre (strukturelt og/eller funksjonelt) nær beslektede (poly)peptider. Kun disse konstrukter (det vil si antistoffer, (bispesifikke) scFv'er og liknende), som binder til (poly)peptidet/proteinet av interesse men som ikke eller ikke i det vesentlige binder til noen av de andre polypeptider som fortrinnsvis uttrykkes av det samme vev som polypeptidet av interesse, for eksempel ved cellene av hjertevevet, ansees spesifikke for (poly)peptidet/proteinet av interesse og velges for senere studier i henhold til metoden som er beskrevet her og vist i de vedlagte eksempler. Disse metoder kan blant annet omfatte bindingsstudier, blokkering- og kompetisjonsstudier med strukturelt og/eller funksjonelt nær beslektede molekyler. Disse bindingsstudier omfatter også FACS analyse, overflateplasmonressonans (SPR, for eksempel med BIAcore®), analytisk ultrasentrifugering, isotermaltitrerings-kalorimetri, fluoressens anisotropi, fluoressens spektroskopi eller ved radiomerkede ligandbindingsanalyser. Videre kan det gjennomføres fysiologiske analyser som cytotoksiske analyser (som illustrert i eksemplene) og analyser som nevnt ovenfor. I henhold til dette kan eksempler for den spesifikke interaksjon av et antigeninteraksjonssete med et spesifikt antigen omfatte spesifisiteten for en ligand for sin reseptor. Slik definisjon omfatter spesielt interaksjonen av ligander som induserer et signal ved binding til den spesifikke reseptor. Eksempler for de tilsvarende ligander omfatter cytokiner som interagerer/binder med/til sine spesifikke cytokinreseptorer. Også spesielt omfattet av definisjonen er bindingen av et antigeninteraksjonssete til antigenet som antigener av selektinfamilien, integriner og familien av vekstfaktorer som EGF. Et annet eksempel på nevnte interaksjon som også spesielt omfattes av definisjonen er interaksjonen av en antigenisk determinant (epitop) med det antigeniske bindingssete av et antistoff.

Uttrykket "binding til/interagering med" angår ikke bare en lineær epitop men kan også angå en konformasjonell epitop, en strukturell epitop eller en diskontinuerlig epitop bestående av to områder av de humane målmolekyler eller deler derav. Innen oppfinnelsens kontekst er en konformasjonell epitop definert ved to eller flere diskrete aminosyresekvenser som er separert i den primære sekvens som kommer sammen på overflaten av molekylet når polypeptidet folder til det native protein (Sela, (1969) Science 166, 1365 and Laver, (1990) Cell 61, 553-6).

Uttrykket "diskontinuerlig epitop" betyr innen oppfinnelsens kontekst ikke lineære epitoper som er satt sammen fra rester fra distante deler av polypeptidkjeden. Disse rester kommer sammen på overflaten når polypeptidkjeden foldes til en tredimensjonal struktur for å utgjøre en konformasjonell/strukturell epitop.

Konstruktene ifølge oppfinnelsen er også tilsiktet spesifikt å binde til/interagere med en eller flere konformasjonelle/strukturelle epitoper bestående av og/eller omfattende de to områder av det humane CD3 kompleks som her beskrives eller derav som beskrevet nedenfor.

I henhold til dette kan spesifisitet bestemmes eksperimentelt ved metoder som velkjente i teknikken og metoder som beskrevet og forklart her. Slike metoder omfatter, men er ikke begrenset til Western blot, ELISA-, RIA-, ECL- og IRMA-tester og peptidscanning.

Uttrykket "Ig-avledet andre bindingsdomene" henviser til et "immunoglobulin-avledet domene", spesifikt for et antistoff eller fragment derav, enkeltkjedeantistoffer, syntetiske antistoffer, antistoffragmenter som Fab-, F(ab2)'-, Fv- eller scFv fragmenter og så videre, eller et kjemisk modifisert derivat av en hvilken som helst av disse. Disse antistoffmolekyler kan være avledet fra forskjellige spesier eller kan være av kimerisk opprinnelse. Mest foretrukket (som dokumentert nedenfor) er nevnte Ig-avledede, andre domene omfattet i det CD3 spesifikke bindingskonstrukt ifølge oppfinnelsen, en scFv. Antistoffer, antistoffkonstrukter, antistoffragmenter, antistoffderivater (alle Ig-avledede) som skal benyttes ifølge oppfinnelsen eller deres tilsvarende immunoglobulinkjede(r) kan modifiseres videre ved bruk av konvensjonelle teknikker som velkjente i teknikken, for eksempel ved bruk av en eller flere aminosyredelesjon(er), insersjon(er), substitusjon(er), addisjon(er) og/eller rekombinasjon(er) og/eller hvilke som helst andre modifikasjoner som er velkjente i teknikken, enten alene eller i kombinasjon. Metoder for å innføre slike modifikasjoner i DNA sekvensen som ligger under aminosyresekvensen for en immunoglobulinkjede er velkjent for fagmannen på området, se for eksempel Sambrook (1989), loe. Cit. Uttrykket "Ig-avledet domene" angår spesielt (poly)peptidkonstrukter omfattende minst en CDR. Fragmenter eller derivater av de angitte Ig-avledede domener definerer (poly)peptider som er deler av de ovenfor angitte antistoffmolekyler og/eller som er modifisert ved kjemiske/biokjemiske eller molekylære biologiske metoder. Tilsvarende metoder er kjente i teknikken og beskrevet blant annet i laboratoriemanualer (se Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.utg. 1989 og 3.utg. 2001; Gerhardt et al.; Methods for General and Molecular Bacteriology; ASM Press, 1994; Lefkovits; Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002).

Uttrykket "deimmunisert" som benyttet her angår det ovenfor nevnte første domene av oppfinnelsens CD3 bindingskonstrukt der det første domenet er modifisert sammenliknet med et opprinnelig villtype konstrukt ved å gjøre villtypekonstruktet ikke-immunogenisk eller mindre immunogenisk i mennesker. Villtypekonstrukter ifølge oppfinnelsen angår antistoffer eller deler derav (som rammeverk og/eller CDR'er) av ikke-human opprinnelse. Tilsvarende eksempler er antistoffer eller fragmenter derav som beskrevet i US 4 361 549 eller WO 99/54440. Uttrykket "deimmunisert" angår også konstrukter som viser redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper. I henhold til oppfinnelsen angår "redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper" fjerning av T-celleepitoper som fører til spesifikk T-celle aktivering. Videre betyr redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper substituering av aminosyrer som bidrar til dannelsen av T-celleepitoper, det vil si substituering av aminosyrer som er vesentlige for dannelse av en T-celleepitop. Med andre ord angår redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper redusert immunogenisitet eller redusert kapasitet til å indusere antigen uavhengig T-celleproliferering. I tillegg angår redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper deimmuni sering, noe som betyr tap eller reduksjon av potensielle T-celleepitoper av aminosyresekvenser som inkluderer antigen uavhengig T-celleproliferering. I henhold til oppfinnelsen er et CD3 bindingsområde, som har redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper, er mindre eller fortrinnsvis ikke immunogenisk sammenliknet med ikke-deimmunisert molekyl som fremdeles har bibeholdt sin evne til å binde til CD3, det vil si lav- eller ikke-immunogenisk antistofikonstrukt som binder til CD3.

Uttrykket "T-celleepitop" angår korte peptidsekvenser som kan frigis under nedbrytning av peptider, polypeptider eller proteiner i celler og deretter presenteres av molekyler av hovedhistokompatibilitetskomplekset (MHC) for å utløse aktivering av T-celler, se blant annet WO 02/066514. For peptider presentert av MHC klasse II kan slik aktivering av T-celler gi opphav til en antistoffrespons ved direkte stimulering av T-celler for å produsere antistoffene.

I henhold til dette omfatter et deimmunisert første domene som spesifikt binder til en human CD3 minst den ovenfor nevnte CDR-H3 som er lokalisert mellom rammeverk H3 og H4, der det første bindingsdomenet viser en redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper sammenliknet med et ikke-deimmunisert, første domene omfattende uforandret villtype (wt)-CDR-H3 lokalisert mellom rammeverk H3 og H4. Videre omfatter nevnte deimmuniserte første domene i det minste i overgangsområdet mellom rammeverk Hl og CDR-H1 den ovenfor nevnte sekvensdel som gir en redusert tilbøyelighet for å generere T-celleepitoper sammenliknet med et ikke-deimmunisert første domene omfattende uforandret wt-Hl overgangsområde av rammeverk Hl og CDR-H1. "Redusert tilbøyelighet for å generere T-celleepitoper" og/eller "deimmunisering" kan måles ved i og for seg kjente teknikker. Fortrinnsvis kan deimmuni sering av proteiner testes in vitro ved en T-celle prolifereringsanalyse. I denne analyse blir PBMCer fra donorer som representerer mer enn 80 % av HLA-DR alleler i verden bedømt for proliferering som respons på enten villtype- eller deimmuniserte peptider. Ideell celleproliferering detekteres kun ved fylling av de antigen-presenterende celler med villtypepetider. Alternativt kan man teste deimmuni sering ved å uttrykke HLA-DR tetramerer som representerer alle haplotyper. Disse tetramerer kan testes for peptidbinding eller lastes med peptider som erstatning for antigen-presenterende celler i prolifereringsanalyser. For å teste hvorvidt deimmuniserte peptider er presentert på HLA-DR haplotyper kan man måle for eksempel bindingen av fluoressensmerkede peptider på PBMCer. Videre kan deimmuni sering påvises ved å bestemme hvorvidt antistoff mot deimmuniserte molekyler er tildannet etter administrering hos pasienter. En spesielt foretrukket metode er en T-celle prolifereringsanalyse som blant annet vist i det vedlagte eksempel 6.

Fortrinnsvis blir antistoffavledede molekyler deimmunisert i rammeverksområdene og de fleste av CDR områdene er ikke modifisert for å generere redusert tilbøyelighet til å indusere T-celleepitoper slik at bindingsaffiniteten for CDR-områdene ikke er påvirket. Også eliminering av en T-celle epitop resulterer i redusert immunogenisitet. Fortrinnsvis blir molekyler deimmunisert i CDR2 området av VL kjeden og mer foretrukket i CDR2 området av VH kjeden, enda mer foretrukket i CDR1 området av VL kjeden og absolutt mest foretrukket i CDR1 området av VH kjeden, videre fortrinnsvis i rammeverksområdet (FR) av VL-kjedet og mest spesielt i rammeverksområdet av (FR) av VH kjeden.

Uttrykket "CDR" som benyttes her henviser til "komplementært bestemmende område", som er velkjent i teknikken. CDR'ene er deler av immunoglobuliner og T-celle reseptorer som bestemmer spesifisiteten for nevnte molekyler og lager kontakt med spesifikke ligander. CDR'ene er den mest variable del av molekyler og bidrar til diversiteten for disse molekyler. Det er tre CDR-områder, CDR1, CDR2 og CDR3, i hvert V domene. CDR-H viser til et CDR område av et variabelt tungkjede og CDR-L henviser til et CDR område med et variabelt lettkjede. H betyr det variable tunge kjedet og L betyr det variable lette kjedet. CDR områdene av et Ig-avledet område kan bestemmes som beskrevet av Kabat (1991). Sequences of Proteins of Immunologi cal Interest, 5. utg., NIH Publication nr. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services, Chothia (1987). J. Mol. Biol. 196, 901-917 og Ghothia (1989) Nature, 342, 877-883.

Generelt består CDR-L 1 av 10-17 aminosyrerester som starter omtrent ved aminosyrerest 24 av det fulle VL-området av en Ig-avledet sekvens og resten Cys går foran CDR-L1. Fortrinnsvis følger resten Trp CDR-L1. CDR-L2 starter fortrinnsvis 16 aminosyrerester etter CDR-L 1 og består fortrinnsvis av 7 rester. Fortrinnsvis går aminosyrerestene He-Tyr men også Val-Tyr, He-Lys, He-Phe foran CDR-L2. CDR-L3 starter fortrinnsvis 33 aminosyrerester etter CDR-L2 og består fortrinnsvis av 7-11 rester. CDR-L3 følger fortrinnsvis resten Cys og fortrinnsvis følger restene Phe-Gly-Xaa-Gly direkte etter CDR-L3. CDR-H 1 består fortrinnsvis av 10-12 rester og starter fortrinnsvis omtrent ved rest 26 ved begynnelsen av VH-området. Fortrinnsvis følger restene Trp CDR-H1. CDR-H2 starter fortrinnsvis 15 aminosyrerester etter slutten av CDR-H1 og består fortrinnsvis av 16-19 rester. Fortrinnsvis følger restene Lys/Arg-Leii/He/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala etter CDR-H2. CDR-H3 starter 33 aminosyrerester etter CDR-H2 og har en lengde på 2-25 aminosyrerester. CDR-H3 følger sekvensen Cys-Xaa-Xaa (fortrinnsvis Cys-Ala-Arg) og restene Trp-Gly-Xaa-Gly følger CDR-H3. Strukturen av CDR områdene er beskrevet i

http:// www. bioinfore. uk/ abs/.

De ovenfor angitte CDR-H1- og CDR-H2 områder er avledet fra antistoffmolekyler som er i stand til spesifikt å binde til/interagere med human CD3. Slik CD3 spesifikt antistoff er velkjent i teknikken og omfatter særlig de monoklonale antistoffer OKT-3, TR-66 eller X35-3, VIT3, BMA030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, Fl 11-409, CLB-T3.4.2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XHI-Hl, XIII-46, XHI-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, 0KT3D, M-T301, SMC2, F101.01, UCHT-1 eller WT-31. Alle de nevnte anti-CD3 antistoffer er humanspesifikke og det er i henhold til oppfinnelsen mulig å kombinere forskjellige CDR områder, særlig CDRH områder, av antistoffene.

I en mer foretrukket utførelsesform er nevnte CDR-H1- og CDR-H2 områder av nevnte CD3 spesifikke domener med redusert tilbøyelighet for å generere T-celleepitoper avledet fra antistoffkonstruktet beskrevet i WO 99/54440. Enda mer foretrukket (og som vist i de vedlagte eksempler) er nevnte CDR-H1- og CDR-H2 områder, så vel som CDR-H3 området, avledet fra et antistoff/anti stoff derivat med spesifisitet for CD3 molekylet som beskrevet av Traunecker (1991), EMBO J. 10, 3655-3659. Ifølge oppfinnelsen er nevnte CDR-H 1-, CDR-H2 og CDR-H3 områder avledet fra antistoffer/antistoffderivater og liknende som er i stand til spesifikt å gjenkjenne den humane CD3-e kjede i konteksten av andre TCR subenheter, for eksempel i museceller som er transgeniske for humane CD3-S kjeder. Disse transgeniske museceller uttrykker human CD3-e kjede i en nativ eller nær nati v konformasjon.

I henhold til oppfinnelsen angår et rammeverksområde et område i V domene (VH-eller VL domene) av immunoglobuliner og T-celle reseptorer som gir et proteinskjelett for de hypervariable, komplementaritetsbestemmende områder (CDR'er) som gjør kontakt med antigenet. I hvert V domene er det fire rammeverksområder angitt som FRI, FR2, FR3 og FR4. Rammeverk 1 omfatter området fra N-terminus av V-domenet inntil begynnelsen av CDR1, rammeverk 2 relaterer til området mellom CDR1 og CDR2, rammeverk 3 omfatter området mellom CDR2 og CDR3 og rammeverk 4 betyr området fra slutten av CDR3 til C-terminus av V domenet; se blant annet Janeway, Immunobiology, Garland Publishing, 2001, 5. utg. Således omfatter rammeverksområdene alle områdene utenfor CDR områdene i VH- eller VL domenene. Videre henviser uttrykket "overgangssekvens mellom et rammeverk og et CDR område" en direkte forbindelse mellom rammeverket og CDR området. Særlig betyr uttrykket "overgangssekvens mellom et rammeverk og et CDR område" den sekvens som direkte er lokalisert N- og C-terminalt av CDR områdene eller aminosyrer som omgir CDR-områdene. Alternativt kan rammeverkene også omfatte sekvenser mellom forskjellige CDR områder. Fagmannen på området vil lett være i stand til, fra en gitt sekvens av rammeverksområdene, å slutte seg til CDR'ene så vel som de tilsvarende overgangssekvenser, se Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utg., NIH Publication nr. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services, Chothia (1987). J. Mol. Biol. 196, 901-917 og Chothia (1989) Nature, 342, 877-883.

Et foretrukket, cytotoksisk aktivt, CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge oppfinnelsen omfatter videre i nevnte første domene et rammeverk H3 omfattende sekvensen Met-Glu-Leu-Ser (MELS; SEQ ID NR.: 234). Enda mer foretrukket er et konstrukt ifølge oppfinnelsen som i nevnte første domene omfatter et rammeverk H3 omfattende sekvensen He-Thr-Thr-Asp-Lys (ITTDK; SEQ ID NR.: 235).

I henhold til foreliggende oppfinnelse omfatter det første domenet av oppfinnelsens konstrukt som spesifikt binder til/interagerer med human CD3 og har en redusert tilbøyelighet for å generere T-celleepitoper, CDR-H1-, CDR-H2 og CDR-H3 områder som definert her og, i en foretrukket utførelsesform, VH-rammeverk (rammeverkene 1, 2, 3, 4) som definert ovenfor, særlig som vist i en hvilken som helst av SEQ ID NR.: 152 eller 153, 156 eller 157, 160 eller 161 og/eller 164 eller 165. Derfor omfatter det CD3 spesifikke bindingskonstrukt ifølge oppfinnelsen et første domene som spesifikt binder til human CD3 og omfatter et rammeverksområde 1 som vist i SEQ ID NR.: 153 eller 153, et rammeverkområde 2 som vist i SEQ ID NR.: 156 eller 157, et rammeverkområde 3 som vist i SEQ ID NR.: 160 eller 161 og/eller et rammeverkområde 4 som vist i SEQ ID NR.: 164 eller 165.

I en spesielt foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen omfatter det cytotoksisk aktive, deimmuniserte CD3 spesifikke bindingskonstrukt i sitt første domene (a) en CDR-H1 som angitt i SEQ ID NR.: 88; og (b) et CDR-H2 som angitt i SEQ ID NR.: 90 eller 92. I henhold til dette fører de modifiserte CDR-H1- og CDR-H2 områder til en redusert tilbøyelighet for å generere T-celleepitoper og er avledet fra et CD3-e kjede spesifikt antistoff. Mest foretrukket ifølge oppfinnelsen skal nevnte (parentale) antistoffer være i stand til spesifikk binding av epitoper som reflekterer det native eller nær native struktur eller en konformasjonell epitop av human CD3, presentert innen konteksten av TCR komplekset.

Fortrinnsvis omfatter det CD3 spesifikke bindingskonstrukt ifølge oppfinnelsen et VH område som angitt i SEQ ID NR.: 74 eller 76. SEQ ID NR.: 74 viser et deimmunisert, variabelt tungt område og tilsvarende viser SEQ ID NR.: 76 et illustrerende, deimmunisert variabelt tungt område.

Fortrinnsvis omfatter oppfinnelsens CD3-spesifikke bindingskonstrukt en CDRL-1 som angitt i SEQ ID NR.: 98 eller 100, en CDR-L2 som angitt i SEQ ID NR.: 102 og/eller en CDR-L3 som angitt i SEQ ID NR.: 104.

Det CDR3 spesifikke bindingskonstrukt ifølge oppfinnelsen omfatter, i en foretrukket utførelsesform, et VL-område i sin CD3-spesifikke del, der nevnte VL-område er valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NR.: 78, SEQ ID NR.: 80, SEQ ID NR.: 82 og SEQ ID NR.: 112. VL1 somkarakteriserti SEQ ID NR.: 78, VL2 somkarakteriserti SEQ ID NR.: 80 og VL3 somkarakteriserti SEQ ID NR.: 82 angår fulle deimmuniserte VL-områder i henhold til oppfinnelsen og de kan benyttes i forskjellige kombinasjoner med de ovenfor beskrevne VH-områder. Dog er det også tatt sikte på at det ikke deimmuniserte VL-området kan kombineres, ifølge oppfinnelsen, med deimmuniserte VH-områder som definert ovenfor. Et tilsvarende ikke deimmunisert VL-område som fortrinnsvis benyttes i et cytotoksisk aktivt CD3 bindingskonstrukt ifølge oppfinnelsen er vist i SEQ ID NR.: 112.1 henhold til dette kan ikke bare tungkjededelen av det ovenfor nevnte "første domene" av oppfinnelsens CD3 konstrukt modifiseres for å ha redusert tilbøyelighet for å generere T-celleepitoper. Det er også tatt sikte på at nevnte domene omfatter de tilsvarende variable lettkjededeler. SEQ ID NR.: 78, 80 og 82 deimmuniserte VL 1-, VL 2- og VL 3-områder av CD3 bindingsdelen av et konstrukt som beskrevet i WO 99/54440.

Som nevnt ovenfor omfatter det CD3 spesifikke bindingskonstrukt ifølge oppfinnelsen helst et Ig-avledet andre domene som er et scFv. I henhold til dette er en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen et deimmunisert, bi spesifikt, enkeltkjedeantistoffkonstrukt tilveiebrakt med en spesifisitet for human CD3 og en ytterligere spesifisitet som er mediert av en andre scFv, rettet mot/i stand til interagering med et ytterligere molekyl/forbindelse. Disse ytterligere molekyler/forbindelser kan omfatte celleoverflatemolekyler, tumormarkører, tumorantigener og liknende. Slike ytterligere forbindelser/molekyler er eksemplifisert nedenfor og spesifikke konstrukter er også gitt og tilveiebrakt i de vedlagte eksempler.

Uttrykket "bispesifikt enkeltkjedeantistoffkonstrukt" angår et konstrukt omfattende to antistoffavledede bindingsdomener, fortrinnsvis scFv'er. Et av nevnte bindingsdomene består av variable områder (eller deler derav) av et antistoff, antistoffragment eller derivat derav, i stand til spesifikt å binde til/interagere med human CD3 antigen (målmolekyl 1). Det andre bindingsdomene består av variable områder (eller deler derav) av et antistoff, antistoffragment eller derivat derav, i stand til spesifikk binding til/interagering med et annet (humant) antigen (målmolekyl 2) som definert nedenfor. I henhold til dette er nevnte andre bindingsdomene, i følge oppfinnelsen, det Ig-avledede andre domene som er nevnt ovenfor som omfatter et antigen/interaksjonssete med spesifisitet for eT-celleoverflatemolekyl og/eller en tumorspesifikk markør. Nevnte to domener/områder i det bispesifikke konstrukt, fortrinnsvis nevnte bispesifikke enkeltkjedeantistofikonstrukt, er fortrinnsvis kovalent forbundet med hverandre som en enkeltkjede. Denne forbindelse kan bevirkes enten direkte (domene 1 [spesifikt for human CD3 antigen, omfattende en redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper og omfattende CDR-områder eller CDR-områder og rammeverksområder som definert ovenfor] - domene 2 [spesifikt for eT-celleoverflatemolekyl og/eller en tumorspesifikk markør] er domene 1 [spesifikt for eT-celleoverflatemolekyl og/eller en tumorspesifikk markør] - domene 2 [spesifikk for humant CD3 antigen, omfattende en redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper og omfattende CDR-områder og CDR-områder og rammeverksområder som definert ovenfor]) eller via en ytterligere peptidlinkersekvens (domene 1 - linkersekvens - domene 2). I det tilfellet det benyttes en linker er linkeren fortrinnsvis med en lengde og en sekvens som er tilstrekkelig til å sikre at hver av de første og andre domener uavhengig av hverandre kan bibeholde sin forskjellige bindingsspesifisitet. Som nevnt ovenfor og som dokumentert i de vedlagte eksempler er fortrinnsvis det CD3 spesifikke bindingskonstrukt omfattende minst to domener som definert her et "bispesifikt, enkeltkjedeantistofikonstrukt" og mer spesielt et bispesifikt enkeltkjede Fv (scFv). Det er spesielt tatt sikte på at konstruktet benyttes i en kontekst for et farmasøytisk preparat. Bispesifikke enkeltkjedemolekyler er velkjente i teknikken og er beskrevet i WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92,7 021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997),

45, 193-197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2089-2103, Bruhl, J. Immunol., (2001), 166, 2420-2426. Et spesielt foretrukket molekylært format ifølge oppfinnelsen tilveiebringer et polypeptidkonstrukt der det CD3-spesifikke bindingsdomene i konstruktet ifølge oppfinnelsen omfatter minst et Vh- og et VL-område som definert ovenfor. Det skal påpekes at i tillegg til et VH-område som definert her og med en redusert tilbøyelighet eller tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper kan nevnte spesifikke bindingskonstrukt omfatte ytterligere områder/domener med redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper. Som nevnt ovenfor kan også VL-området og/eller de tilsvarende rammeverk omfatte aminosyrestrekk som er konstruert i henhold til oppfinnelsen for å ha redusert tilbøyelighet til T-celleepitopgenerering. Den intramolekylære orientering av VH-domenet og VL-domenet, som er bundet til hverandre via et linkerdomene, i scFv formatet, er ikke avgjørende for de angitte, bi-spesifikke enkeltkjedekonstrukter. Således er scFv'er med begge mulige arrangementer (VH-domene-linkerdomene-VL-domene; VL-domene-linkerdomene-VH-domene) spesielle utførelsesformer av det bi-spesifikke enkeltkjedekonstrukt. Et CD3-spesifikt domene kan være lokalisert N- eller C-terminalt i det bispesifikke molekyl. VH- og VL-områder av hvert domene kan anordnes i forskjellige rekkefølger (Vh-Vleller Vl-Vh).

Uttrykket "enkeltkjede" som benyttet ifølge oppfinnelsen betyr at nevnte første og andre domene av det bispesifikke enkeltkjedekonstrukt kovalent er bundet, fortrinnsvis i form av en ko-lineær aminosyresekvens kodet av et enkelt nukleinsyremolekyl.

Det skal påpekes at konstruktet ifølge oppfinnelsen, i tillegg til det her definerte første domene og det Ig-avledede andre domene kan omfatte ett eller flere ytterligere domener, for eksempel for isolering og/eller fremstilling av rekombinant produserte konstrukter.

Det skal videre påpekes at, ifølge oppfinnelsen, kan ikke bare det ovenfor beskrevne første domene som spesifikt binder til human CD3 ifølge oppfinnelsens CD3 konstrukt ha redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper. Det er også tatt sikte på at det Ig-avledede, andre domene og/eller (a) ett eller flere forbindende linkerområder er modifisert, for eksempel humanisert og/eller også deimmunisert.

Som nevnt ovenfor er deimmuniseringsveier spesielt illustrert i WO 00/34317, WO 98/52976, WO 02/079415 eller WO 02/012899 og de vedlagte eksempler. Disse veier medfører utføring av substitusjoner av aminosyrer innen potensielle T-celleepitoper. På denne måte blir sannsynligheten for at en gitt sekvens vil gi opphav til T-celleepitoper ved intracellulær proteinprosessering, redusert. I tillegg beskriver WO 92/10755 en vei der antigeni ske determinanter på proteiner konstrueres. Særlig blir proteiner epitopmappet og deres aminosyresekvens forandret under genetisk konstruksjon.

Videre er "humaniseringsveier" velkjente i teknikken og særlig beskrevet for antistoffmolekyler, for eksempel Ig-avledede molekyler. Uttrykket "humanisert" henviser til humaniserte former av ikke-humane (for eksempel murine) antistoffer eller fragmenter derav (som Fv, Fab, Fab', F(ab'), scFv'er eller andre antigenbindende partialsekvenser av antistoffer) som inneholder en viss del av sekvensene avledet fra ikke-humant antistoff. Humaniserte antistoffer inkluderer humanimmunoglobuliner der restene fra et komplementært bestemmende område (CDR) av det humane immunoglobulin er erstattet med rester fra en CDR fra en ikke-human spesie som mus, rotte eller kanin, med den ønskede bindingsspesifisitet, -affinitet og -kapasitet. Rent generelt vil det humaniserte antistoff omfatte i det vesentlige alt av minst ett, generelt to variable domener hvori alle eller i det vesentlige alle CDR-områder tilsvarer de til et ikke-humant immunoglobulin og alle eller i det vesentlige alle FR områder er de fra en humanimmunoglobulinkonsensussekvens. Det humaniserte antistoff vil optimalt også omfatte minst en del av et immunoglobulinkonstant område (Fc), typisk det til et humant immunoglobulin; se blant annet Jones et al., Nature 321:522-525 (1986), Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593- 596 (1992). Metoder for humanisering av ikke-humane antistoffer er velkjente i teknikken. Generelt har et humanisert antistoff en eller flere aminosyrer innført i seg fra en kilde som er ikke-human for nærmere å likne et humant antistoff, mens det allikevel opprettholdes en opprinnelig bindingsaktivitet for antistoffet. Metoder for humanisering av antistoffer/antistoffmolekyler er beskrevet nærmere av Jones et al., i Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); og Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988). Spesifikke eksempler på humaniserte antistoffer, for eksempel antistoffer rettet mot EpCAM, er velkjente i teknikken, se for eksempel (LoBuglio, Proceedings of the American Society of Gini cal Oncology (Abstract). 1997, 1562 og Khor, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology (Abstract), 1997, 847).

I henhold til dette tilveiebringes det innen oppfinnelsens kontekst særlig bispesifikke enkeltkjedeantistofikonstrukter som er deimmuniserte og som med hell kan benyttes i farmasøytiske preparater.

Som nevnt ovenfor kan det Ig-avledede, andre domene av det ovenfor beskrevne CD3 spesifikke bindingskonstrukt omfatte et antigeninteraksjonssete med spesifisitet for eT-celleoverflatemolekyl .

Uttrykket "celleoverflatemolekyl" som beskrevet her angir også molekyler som presenteres på overflaten av celler. Uttrykket "celleoverflatemolekyl" angår molekyler som presenteres på overflaten av celler og omfatter domener eller epitoper som er tilgjengelige (in vitro eller in vivo) for Ig-avledede bindingsdomener og særlig antistoffer, antistoffragmenter eller -derivater. Som vist ovenfor er det mest foretrukne av de nevnte Ig-avledede domener et scFv. Eksempler på nevnte celleoverflatemolekyler er membran- og transmembranproteiner, molekyler tilpasset nevnte proteiner eller celleoverflate og så videre. I henhold til en ytterligere foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er det nevnte celleoverflatemolekyl en tumorspesifikk markør. I henhold til oppfinnelsen angår uttrykket "tumorspesifikk markør" molekyler som er presentert og/eller lokalisert på overflaten av tumorceller eller som ubikitøst uttrykkes men kun er tilgjengelige for binding av antistoffer, antistoffragmenter eller antistoffderivater på overflaten av tumorcellene. Eksempler på tumormarkører er gitt nedenfor og omfatter men er ikke begrenset til EpCAM, CD 19, HER-2, HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (mucin), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5b, MUC7, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, CD44v6, Wue-1, plasmacelleantigen (se WO 01/47953), (membran-bunder) IgE, Melonomakondritinsulfatproteoglykan (MCSP), STEAP, mesotelin, prostatastamcelleantigen (PSCA), sTn (sialylert Tn antigen), FAP (fibroplastaktiveringsantigen), EGFRvIU, Iga, IgP, MT-MMP'er, Coraantigen, EphA2, L6 og CO-29.

Det Ig-avledede, andre domene av det CD3 spesifikke bindingskonstrukt ifølge oppfinnelsen kan også omfatte et antigeninteraksjonssete med en spesifisitet for et molekyl valgt fra gruppen bestående av EpCAM, CCR5, CD 19, HER-2, HER-2neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (mucin), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5b, MUC7, phCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, gangliosid GD3, 9-0-Acetyl-GD3, GM2, Globo H, fukosyl GM1, Poly SA, GD2, Karboanhydrase IX (MN/CA IX), CD44v6, Sonic Hedgehog (Shh), Wue-1, plasmacelleantigen (membranbunder) IgE, Melanomakondroitinsulfatproteoglykan (MCSP), CCR8, TNF-a forløper, STEAP, mesotelin, A33 antigen, prostatastamcelleantigen (PSCA), Ly-6; desmoglein 4, E-kadherinneoepitop, føtalacetylkolinreseptor, CD25, CA19-9 markør, CA-125 markør og Muellers inhibitoriske substans (MIS) reseptortype U, sTn (sialylert Tn antigen), FAP (fibroblastaktiveringsantigen), endosialin, EGFRvHJ, L6, SAS, CD63, TAG72, TF-antigen, Coraantigen, CD7, CD22, Iga (CD79a), Igp (CD79b), G250, gplOO, MT-MMP'er, F-19-antigen, CO-29 og EphA2.

Konstruktene som tilveiebringes her er spesielt brukbare i medisinske oppsett. For eksempel kan tallrike sykdommer og/eller lymfomer og særlig ikke-Hodgekins B-cellelymfom behandles med et deimmunisert (bispesifikt) konstrukt ifølge oppfinnelsen mot human CD3 og CD20 (CD3xCD20 eller CD20xCD3). Autoimmune sykdommer kan behandles ved administrering av de deimmuniserte (bispesifikke) konstrukter rettet mot human CD3 og CD30 eller CD19 (for eksempel CD3xCD30 eller CD30xCD3 eller CD3xCD19 eller CD19xCD3). Rheumatoid artritt så vel som andre, inflammatoriske sykdommer, kan behandles med et deimmunisert (bispesifikt) konstrukt ifølge oppfinnelsen rettet mot human CD3 og CCR5 (CD3xCCR5 eller CCR5xCD3). Et deimmunisert CD3 spesifikt bindingskonstrukt som definert her og omfattende et andre Ig-avledet domene rettet mot/binding med TNF-a forløper kan også være brukbar ved behandling eller forebygging av inflammatoriske lidelser. CD3 konstrukter som tilveiebrakt her og omfattende et andre, Ig-avledet domene rettet mot binding til/interaksjon med EpCAM, CD 19, HER-2, HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (mucin), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, CD44v6, Wue-1, plasmacelleantigen (se WO 01/47953), (membranbunder) IgE, Melanoma kondroitinsulfatproteoglykan (MCSP), STEAP, mesotelin, prostatastamcelleantigen (PSCA), sTn (sialylert Tn antigen), FAP (fibroblastaktiveringsantigen), EGFRvIU, Iga, IgP, MT-MMP'er, Coraantigen, EphA2, L6 og CO-29 kan være spesielt nyttige ved den medisinske intervensjon av tumorøse sykdommer som brystcancer, koloncancer, prostatacancer, hode/halscancer, hudcancer (melanom), cancer i genito-urinær kanalen som ovariecancer, endometrialcancer, cervicancer og nyrecancer, lungecancer, gastrisk cancer, cancer i tynntarmen, levercancer, pankreascancer, galleblærecancer, cancer i gallekanalen, esofagøscancer, cancer i spyttkjertlene og cancer i tyroidkjeitlene eller andre tumorøse sykdommer som hematologiske tumorer, gliomer, sarkomer og osteosarkomer. Administreringen av de CD3bindende konstrukter er også indikert for minimal restsykdom og fortrinnsvis for tidlig faste tumorer, avanserte faste tumorer og metastatiske faste tumorer.

Som også vist i eksemplene omfatter et spesielt foretrukket CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge oppfinnelsen det ovenfor definerte første domene med redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper og et andre, Ig-avledet domene omfattende et antigeninteraksjonssete med en spesifisitet for EpCAM.

Epitelialcelleadhesjonsmolekyl (EpCAM, også kalt 17-la antigen, KS A, EGP40, GA733-2, ksi-4 eller esa) er et 40-kDa membran-integrert glykoprotein med 314 aminosyrer med spesifikk ekspresjon i visse epitelier og på mange humankarsinomer (for oversikt henvises det til Balzar, J. Mol. Med. 1999, 77,699-712). EpCAM ble funnet og deretter klonet via dets gjenkjennelse av murin monoklonalt antistoff 17-lA/edrekolomab (Goettlinger, Int J Cancer. 1986; 38, 47-53og Simon, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 1990; 87, 2755-2759). EpCAM tjener til å adhere epitelceller i en orientert og meget velordet modus (Litvinov, J Cell Biol. 1997, 139, 1337-1348). Ved malignanttransformasjon av epitelceller gir de hurtigvoksende tumorceller avkall på den høye cellulære orden for epitel. Som en konsekvens blir overflatefordelingen av EpCAM mindre begrenset og molekylet bedre eksponert på tumorceller og tilgjengelig for bindende antistoffer, antistoffragmenter eller antistoff deri vater på overflaten av tumorceller. På grunn av epitelcelleopprinnelsen vil tumorceller fra de fleste karsinomer fremdeles uttrykke EpCAM på sin overflate.

In vivo er ekspresjonen av EpCAM relatert øket epitelproliferering og korrelerer negativt med celledifferensiering (for en oversikt henvises det til Balzar, 1999, J. Mol. Med. 77, 699-712). Ekspresjon av EpCAM sees i det vesentlige med alle vesentlige karsinomer (for en oversikt henvises det til Balzar, J Mol Med. 1999,77, 699-712 eller dokumentert blant annet av De Bree, Nucl Med Commun. 1994, 15, 613-27; Zhang, Clin Cancer Res. 1998, 4,295-302). På grunn av den utstrakte ekspresjon angis EpCAM som et "pan-karsinom" antigen. I mange tilfeller ble tumorceller observert til å uttrykke EpCAM i meget større grad enn deres parentale epitel eller mindre aggressive former av nevnte cancere. For eksempel representerer øket EpCAM ekspresjon et tidlig evenement ved utviklingen av prostatacancer (Poczatek, J Uroi., 1999, 162, 1462-1644). I tillegg korrelerer i hovedandelen av både skvamøse og adenokarsinomer i cervix en sterk EpCAM ekspresjon med en øket proliferering og en forsvinning av markører for terminal differensiering (Litvinov, Am. J. Pathol.1996, 148, 865-75). I brystcancer er overekspresjon av EpCAM på tumorceller en prediktor for overlevelse (Gastl, Lancet.2000, 356,1981-1982). EpCAM er en markør for detektering av disseminerte tumorceller hos pasienter som lider av skvamøs cellekarsinom i hode, hals og lunge (Chaubal, Anticancer Res 1999, 19, 2237-2242, Piyathilake, Hum Pathol. 2000, 31, 482-487). Normalt skvamøst epitel slik det finnes i epidermis, oralkaviteten, epiglottis, farynx, larynx og esofagus, uttrykker ikke i vesentlig grad EpCAM (Quak, Hybridoma, 1990, 9, 377-387). EpCAM er påvist å uttrykkes på majoriteten av primære, metastatiske og disseminerte NSCLC (ikke små cellelungecancerceller (Passlick, Int J Cancer, 2000, 87, 548-552)), på gastriske og gastisk øseofagleddadenokarsinomer (Martin, J Clin Pathol 1999, 52, 701-4) og i cellelinjer avledet fra kolorektale, pankreatiske karsinomer eller brystkarsinomer (Szala, Proe Nati Acad Sei U S A 1990, 87, 3542-6, Packeisen, Hybridoma, 1999, 18, 37-40).

I en mest foretrukket utførelsesform omfatter det CD3 spesifikke bindingskonstrukt ifølge oppfinnelsen som omfatter et andre Ig-avledet domene rettet mot bindings\ til EpCAM, en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av

(a) en aminosyresekvens som vist i en hvilken som helst av SEQ ID NR.: 31,33, 35, 37, 39, 49, 55, 58, 61, 63, 65, 67, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267,269, 271, 273, 275, 277,279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323 og 325; (b) en aminsyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som vist i en hvilken som helst av SEQ ID NR.: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 54, 57, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240,242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294,296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 og 324; og (c) en aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som er degenerat som et resultat av den genetiske kode, til en nukleotidsekvens ifølge (b).

I henhold til dette tilveiebringer foreliggende oppfinnelse, i en spesiell foretrukket utførelsesform, spesifikke CD3 konstrukter som omfatter en CD3 bindings/interaksjonsdel ("anti-CD3") som har redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper og en ytterligere enkeltkjededel (et Ig-avledet domene) som spesifikt interagerer med/binder til EpCAM ("anti-EpCAM"). De følgende tabeller IA, IB, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, 5A og 5B angår foretrukne konfigurasjoner av slike CD3- og EpCAM bindingskonstrukter.

EpCAM 3-1, EpCAM 3-5, EpCAM 4-1, EpCAM 4-7 og EpCAM 5-10 angår spesifikke enkeltkjedeantistoffer mot EpCAM som er isolert ved fagdisplay i W099/25818. Hvert proteinkonstrukt i tabell IA, 2A, 3A, 4A og 5A omfatter 7 distinkte proteinmoduler angitt som A-G. Proteinmodulene A-G er rettet mot og kovalent bundet til en annen i en enkelt sammenhengende polypeptidkjede ved peptidbindinger i rekkefølgen A-B-C-D-E-F-G med proteinmodulen A ved N-terminus og proteinmodulen G ved C-terminus. Proteinmodulene A, C, E og G angir antistoffVariable domener som kan være enten VH- eller VL-domener av antistoffer med spesifisitet for human CD3- eller EpCAM antigen. Modulene B, D og F er linkere forbundet til VH- og VL-domenene.

Hvis proteinmodul A er et VH antistoffdomene er proteinmodulen C et VL proteindomene og vice versa. Hvis proteinmodulen E er et VH antistoffdomene er proteinmodulen G et VL proteindomene og vice versa.

Deimmuniserte VH domener av antistoffer med spesifisitet for human CD3 antigen kan velges fra sekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 74 eller 76. Deimmuniserte VL domener av antistoffer med spesifisitet for human CD3 antigen kan velges blant sekvensene som angitt i SEQ ID NR.: 78, 80 eller 82. VH proteindomenet av human EpCAM 3-1, 3-5, 4-1, 4-7 og 5-10 antistoffer som angitt i SEQ ID NR.: 137, 141, 145, 149 og henholdsvis 133. VL proteindomenet av human EpCAM 3-1, 3-5, 4-1, 4-7 og 5-10 antistoffer som angitt i SEQ ID NR.: 139, 143, 147, 151 og henholdsvis 135.

Par av antistoffVariable domener som angitt av proteinmodulparene A/C og E/G er forenet ved ytterligere linkerproteinmolekyler der proteinmodul B tjener til direkte å binde modulparet A/C og proteinmodulen F tjener til direkte å binde modulparet E/G. Der enten modulparet A/C eller E/G er et par av deimmuniserte VH/VL- eller VL/VH-proteindomener fra et antistoff med spesifisitet for human CD3 antigen har proteinmodul B henholdsvis F, aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 3. Der enten modulparet A/C eller E/G er et par av VH/VL eller VL/VH fra et antistoff med spesifisitet for EpCAM antigen har proteinmodulen B henholdsvis F aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 168. Modul D forbinder ABC- og EFG modul gruppene.

Kombinasjonen av proteinmoduler A-B-C og kombinasjonen av proteinmoduler E-F-G representerer begge et scFv fragment av et antistoff med spesifisitet for enten human CD3 antigen eller for EpCAM antigen. Hvis modulene A og C viser CD3 bindingssekvensen er de respektive grupper av proteinmoduler A-B-C henholdsvis E-F-G forbundet med hverandre via proteinmodulen D med sekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 176. Hvis på den annen side modulene A og C viser EpCAM bindingssekvensen er de respektive grupper av proteinmodulene A-B-C og E-F-G forbundet til hverandre via en annen proteinmodul D med sekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 174. Således kan et ytterligere serin innføres etter VL kjedet for kloningsformål. Imidlertid kan fagmannen også benytte linkeren som vist i SEQ ID NR.: 174 for å forbinde et VL domene med et etterfølgende V domene i stedet for SEQ ID NR.: 176. Proteinmodulen D tjener til å forbinde den C-terminale ende av proteinmodulen C med den N-terminale ende av proteinmodulen E.

Hvert nukleinsyrekonstrukt i tabellene IB, 2B, 3B, 4B og 5B omfatter 7 distinkte nukleinsyremolekyler, angitt som A-G. Nukleinsyremodulene A-G er direkte og kovalent bundet til hverandre i en enkelt, sammenhengende nukleotidkjede ved fosfatglykosidbindinger i rekkefølgen A, B, C, D, E, F, G der nukleinsyremodulen A er ved 5'-enden og nukleinsyremodulen G er ved 3'-enden av et respektivt nukleinsyrekonstrukt. Nukleinsyremodulene A, C, E og G angir kodende områder for antistoffVariable domener som kan være enten VH- eller VL-domener av antistoffer med spesifisitet for human CD3- eller EpCAM antigen.

Hvis nukleinsyremodulen A koder et VH antistoffdomene koder nukleinsyremodulen C et VL proteindomene og vice versa. Hvis nukleinsyremodulen E koder et VH antistoffdomene koder nukleinsyremodulen G et VL proteindomene, og vice versa. Nukleinsyremolekylene som koder deimmuniserte VH domener av antistoffer med spesifisitet for det humane CD3 antigen kan velges fra sekvenser som angitt i SEQ ID NR.: 73 og 75. Nukleinsyremolekyler som koder deimmuniserte VL domener av antistoffer med spesifisitet for det humane CD3 antigen kan velges fra sekvenser som angitt i SEQ ID NR.: 77, 79 eller 81. Nukleinsyremolekyler som koder VH proteindomene av det humane EpCAM 3-1, 3-5, 4-1, 4-7 og 5-10 antistoff er som angitt i SEQ ID NR.: 136, 140, 144, 148 og henholdsvis 132. Nukleinsyremolekylet som koder VL proteindomene av human EpCAM 3-1, 3-5, 4-1, 4-7 og 5-10 antistoff er som angitt i SEQ ID NR.: 138, 142, 146, 150 og henholdsvis 134.

Par av nukleinsyrer som koder antistoffVariable domener som angitt ved nukleinsyre-modulparene A/C og E/G er forenet ved ytterligere linking av nukleinsyremolekyler der nukleinsyremodul B tjener til direkte å forbinde modulparet A/C og nukleinsyremodulen F tjener til direkte å forbinde modulparet E/G. Når enten modulparet A/C eller E/G angir en nukleinsyre som koder et par av deimmuniserte VH/VL- eller VL/VH proteindomener fra et antistoff med spesifisitet for det humane CD3 antigen, har nukleinsyremodulen B henholdsvis F nukleotidsekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 202. Når enten modulparet A/C eller E/G angir nukleinsyre som koder et par av VH/VL eller VL/VH fra et antistoff med spesifisitet for det humane EpCAM antigen har nukleinsyremodulen B henholdsvis F nukleotidsekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 201.

Kombinasjonen av nukleinsyremoduler A-B-C og kombinasjonen av nukleinsyremoduler E-F-G består hver henholdsvis av et scFv fragment av et antistoff med spesifisitet for enten det humane CD3 antigen eller for EpCAM antigenet. Hvis A- og C modulene omfatter CD3 bindingssekvenser er de respektive grupper av nukleinsyremoduler A-B-C eller E-F-G forbundet med hverandre via nukleinsyremodul D med nukleotidsekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 175. Hvis A- og C-modulene omfatter EpCAM bindingssekvenser er de respektive grupper av nukleinsyremoduler A-B-C og E-F-G forbundet med hverandre via nukleinsyremodul D med nukleotidsekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 173. Som imidlertid nevnt ovenfor kan den ytterligere kodon som koder serin (i SEQ ID NR.: 175) innføres for kloningsformål. Fagmannen på området kan forbinde nukleotidsekvensen som koder VL kjeden direkte med det etterfølgende V domene med linkeren som angitt i SEQ ID NR.: 173 uten det ytterligere kodon som koder serin ved 5'-enden av linkeren. Nukleinsyremodul D tjener til å forbinde 3'-enden av nukleinsyremodul C med 5'-enden av nukleinsyremodul E.

Aller helst tilveiebringer foreliggende oppfinnelse bispesifikke antistoffkonstrukter omfattende en spesifisitetsbinding til CD3 og EpCAM og med SEQ JD NR.: 30, 31 (konstrukt 2 i tabell IA og IB), SEQ ID NR.: 48, 49 (konstrukt 5 i tabell IA, IB), SEQ ID NR.: 64, 65 (konstrukt 2 i tabell i tabell 2A, 2B), SEQ ID NR.: 54, 55 (konstrukt 5 i tabell 2A, 2B), SEQ ID NR.: 66, 67 (konstrukt 2 i tabell 3A, 3B), SEQ ID NR.: 32, 33 (konstrukt 2 i tabell 4A, 4B), SEQ ID NR.: 34, 35 (konstrukt 4 i tabell 4A, 4B), SEQ ID NR.: 60, 61 (konstrukt 5 i tabell 4A, 4B), SEQ ID NR.: 36, 37 (konstrukt 2 i tabell 5A, 5B), SEQ ID NR.: 38, 39 (konstrukt 4 i tabell 5A, 5B) eller SEQ ID NR.: 62, 62 (konstrukt 5 i tabell 5A, 5B).

I henhold til konstruktene som tilveiebringes ovenfor er spesielt foretrukne CD3- og EpCAM bindingskonstrukter ifølge oppfinnelsen, omfattende minst det ovenfor beskrevne første domene med redusert tilbøyelighet til T-celleepitopgenerering og spesifikt for human CD3 og et andre, Ig-avledede domene som er spesifikt for EpCAM, vist i SEQ ID NR.: 31, 33, 35, 37, 39, 49, 55, 58, 61, 63, 65, 67, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323 og 325. Tilsvarende nukleinsyremolekyler som koder nevnte foretrukne CD3- og EpCAM bindingskonstrukter som definert her omfatter SEQ ID NR.: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 54, 57, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 og 324.

I henhold til dette tilveiebringer foreliggende oppfinnelse også CD3-spesifikke bindingskonstrukter omfattende et første domene som spesifikt binder til human CD3 og har redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper og omfatter et Ig-avledet andre domene rettet mot/i stand til binding til EpCAM, valgt fra gruppen bestående av: (a) en aminosyresekvens som vist i en hvilken som helst av SEQ ID NR.: 31, 33, 35, 37, 39, 49, 55, 58, 61, 63, 65, 67, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257,.259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323 eller 325; (b) en aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som vist i en hvilken som helst av SEQ ID NR.: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 54, 57, 60, 62, 64, 66, 236, 238,

240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302,

304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 eller 324;

(c) en aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som er degenerat som et resultat av den genetiske kode, til en nukleotidsekvens ifølge (b); (d) en aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som hybridiserer med den komplementære tråd av en nukleinsyresekvens som angitt under (b) under stringente hybridiseringsbetingelser.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også CD3 spesifikke bindingskonstrukter omfattende et første domene som spesifikt binder til human CD3 og har redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper og omfattende et Ig-avledet, andre domene rettet mot/i stand til binding til EpCAM, omfattende en aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som hybridiserer med den komplementære tråd av en nukleinsyresekvens som angitt under (b) ovenfor, det vil si til en nukleinsyresekvens som vist i en hvilken som helst av 30, 32, 34, 36, 38, 48, 54, 57, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 or 324 under stringente hybridiseringsbetingelser.

Uttrykket "hybridisering" som benyttet her henviser til polynukleotid/nukleinsyre-sekvenser som er i stand til hybridisering til polynukleotidene som koder de deimmuniserte konstrukter som definert her. Derfor kan nevnte polynukleotider være brukbare som prober i Northern og Southern blotanalyser av RNA- og DNA preparater eller kan benyttes som oligonukleotidprimere i PCR analyser avhengig av deres respektive størrelse. Fortrinnsvis omfatter nevnte hybridiseringspolynukleotider minst 10 og helst 15 nukleotider i lengde mens et hybridiseringspolynukleotid ifølge oppfinnelsen som kan benyttes som en probe fortrinnsvis omfatter minst 100 og helst 200, aller helst 500 nukleotider.

Det er velkjent i teknikken hvordan man skal gjennomføre hybridiseringsforsøk med nukleinsyremolekyler, det vil si at fagmannen på området vet hvilke hybridiseringsbetingelser han eller hun må benytte ifølge oppfinnelsen. Slike hybridiseringsbetingelser er angitt i standardlitteraturen som for eksempel i Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y. Foretrukket ifølge oppfinnelsen er polynukleotider som er i stand til hybridisering til polynukleotider ifølge oppfinnelsen eller deler derav under stringente hybridiseringsbetingelser.

"Stringente hybridiseringsbetingelser" henviser blant annet til en inkubering over natten ved 42 °C i en oppløsning omfattende 50 % formamid, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM natriumcitrat), 50 mM natriumfosfat (pH 7,6), 5x Denhardts oppløsning, 10 % dekstransulfat og 20 ug/ml denaturert, skjærbehandlet laksesperm DNA, fulgt av vasking av filtrene i 0,1 x SSC ved rundt 65 °C. Også omfattet er nukleinsyremolekyler som hybridiserer til polynukleotidene ifølge oppfinnelsen ved lavere stringenshybridiseringsbetingelser. Forandringer i stringensen av hybridisering og signaldetektering er primært oppnådd ved manipulering av formamidkonsentrasjonen (lavere prosentandeler av formamid resulterer i redusert stringens); saltbetingelser, eller temperatur. For eksempel inkluderer lavere stringensbetingelser en inkubering over natten ved 37 °C i en oppløsning omfattende 6X SSPE (20X SSPE = 3M NaCl; 0,2 M NaH2P04; 0,02 M EDTA, pH 7,4), 0,5 % SDS, 30 % formamid, 100 ug/ml laksespermblokkerende DNA; fulgt av vaskinger ved 50 °C med 1 X SSPE, 0,1 % SDS. I tillegg og for å oppnå enda lavere stringens kan vasking gjennomført med følgende stringente hybridisering gjennomføres ved høyere saltkonsentrasjon (for eksempel 5 X SSC). Det er verdt å merke seg at variasjoner i betingelsene ovenfor kan oppnås ved å anvende og/eller å erstatte eksisterende med alternerende blokkeringsreagenser som benyttes for å undertrykke bakgrunnen i hybridiseringsforsøkene. Typiske blokkeringsreagensere inkluderer Denhardts reagens, BLOTO, heparin, denaturert laksesperm DNA og kommersielt tilgjengelige fabrikkprodukter. Inklusjonen av spesifikke blokkeringsreagensere kan kreve modifisering av hybridiseringsbetingelsene som beskrevet ovenfor på grunn av problemer med kompatibiliteten.

De angitte nukleinsyremolekyler kan for eksempel være DNA, sDNA, RNA eller syntetisk produsert DNA eller RNA eller et rekombinant produsert kimerisk nukleinsyremolekyl omfattende et hvilket som helst av disse polynukleotider enten alene eller i kombinasjon.

De deimmuniserte CD3- og EpCAM bindingskonstrukter som tilveiebringes ifølge oppfinnelsen er spesielt brukbare i medisinske oppsett som for eksempel ved forebygging, terapi og/eller lindring av tumorøse sykdommer og særlig bryst-, kolon-, prostata-, hode- og hals-, hud- (melanon), cancere, cancere i genito-urinærkanalen, for eksempel ovarie-, endometrial-, cerviks- og nyrecancer, lunge-, gastrisk eller tynntarmscancer, lever-, pankreas, galleblære- eller gallekanalcancere, esofagcancer, cancer i spyttkjertlene og cancer i tyroidkjeitelen. Spesielt kan de deimmuniserte konstrukter som binder CD3 og EpCAM benyttes for behandling av epitelcancer og særlig adenokarsinomer, eller minimalrestsykdom, mer spesielt tidlig fast tumor, avansert fast tumor og metastatisk fast tumor.

I en mer spesielt foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen av det CD3 spesifikke bindingskonstrukt som beskrevet her består dette av et andre Ig-avledet domene som omfatter et antigeninteraksjonssete med en spesifisitet for CCR5.

Den kjemokinreseptor CCR5 er et medlem av en stor familie av G proteinkoblede syv transmembrandomenereseptorer som binder til de proinflammatoriske kjemokiner RANTES, MIPl-a, MIP-ip og MCP-2, kjemokiner virker felles med adhesjonsmolekyler for å indusere ekstravasering av leukocytter og å styre deres migrering mot seter for vevskade. CCR5 uttrykkes på en minoritet av T-celler og monocytter og er videre hoved ko-reseptoren for M-trofiske HIV-1 stammer som overveier tidlig i løpet av en HIV-infeksjon.

Humanimmunodefektvirus (HIV) kan ikke komme inn i humane celler hvis den ikke først binder til tonøkkelmolekyler på celleoverflaten, CD4 og en ko-reseptor. Ko-reseptoren som i utgangspunktet erkjennes er CCR5, senere i vimsens livssyklus blir en annen kjemokinreseptor CXCR4 ko-resptoren for HIV-1 (D'Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996)). HIV-1 stammene som forårsaker de fleste transmisjoner av virus ved seksuell kontakt kalles M-tropiske virus. Disse HIV-lstammer (også kjent som ikke-syncytia induserende (NSI) primærvirus) kan reprodusere i primære CD4+ T-celler og makrofager og bruker kjemokinreseptoren CCR5 (og, ikke så ofte, CCR3) som deres ko-reseptor. De T-tropiske virus (noen ganger kalt syncytia-induserende (NSI) primærvirus) kan også reprodusere i primære CD4+ T-celler men kan i tillegg infisere etablerte CD4+ T-cellelinjer in vitro, noe de gjør via kjemokinreseptoren CXCR4 (fusin). Mange av disse T-celle tropiske stammer kan benytte CCR5 i tillegg til CXCR4 og noen kan gå inn i makrofager via CCR5, i det minste under visse in vitro betingelser (D'Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174;Fauci, Nature384,529 (1996)).

Hvorvidt andre ko-reseptorer bidrar til HIV-1 patogenese er ikke avklart men eksistensen av en annen ko-resptor for noen T-tropiske stammer kan hentes fra in vitro studier. Fordi M-tropiske HIV-1 stammer er implikert i rundt 90 % av seksuelle transmisjoner av HIV er CCR5 den predominante ko-reseptor for viruset hos pasienter; transmisjon (eller systemisk etablering) av CXCR4-benyttende (T-tropiske) stammer er sjeldent (D'Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996), Paxton, Nature Med. 2, 412 (1996); Liu, Cell 86, 367 (1996); Samson, Nature 382, 722 (1996); Dean, Science 273, 1856 (1996); Huang, Nature Med. 2, 1240 (1996)). Når først imidlertid SI virus utvikles in vivo (eller hvis de transmitteres) er de spesielt virulente og forårsaker hurtigere sykdomsprogresjon (D'Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med. 2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996), Schuitemaker, J. Virol. 66, 1354 (1992); Connor, J. Virol. 67, 1772

(1993); Richman, J. Infect. Dis. 169, 968 (1994); R. I. Connor et al., J. Exp. Med. 185, 621 (1997); Trkola, Nature 384, 184 (1996)).

Antallet og identiteten av ko-reseptormolekyler på målceller, og evnen hos HIV-1 stammene til sannsynligvis å tre inn i celler via forskjellige ko-reseptorer, syntes å være kritiske determinanter for sykdomsforløpet. Disse faktorer er hovedinnflytelsen både når det gjelder verts- og virusavhengige aspekter ved HIV-1 infeksjon. For eksempel korrelerer en homozygøs defekt (8 32) i CCR5 sterkt med resistensen mot HIV-1 infeksjon in vivo og in vitro. Individer som er heterozygøse for en defektiv CCR5 allel er høyst dårlig beskyttet mot infeksjon og har kun en moderat vist sykdomsprogresjon (Paxton, Nature Med. 2, 412 (1996); Liu, Cell 86, 367 (1996); Samson, Nature 382, 722

(1996); Dean, Science 273, 1856 (1996); Huang et al., Nature Med. 2, 1240 (1996)). Imidlertid kan andre faktorer påvirke nivået av CCR5 ekspresjonen på aktiverte CD4+ T-celler og derved påvirke effektiviteten av HIV-1 infeksjon in vitro (Trkola, Nature 384, 184 (1996); Bleul, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 94, 1925 (1997)).

For multippel sklerose er det påvist at CCR5 og CXCR3 hovedsakelig uttrykkes på T-celler som infiltrerer demyelinerende hjernelesjoner så vel som det perifere blod for påvirkede pasienter. Eliminering av T-celler skulle blokkere T-cellearmen av den autoimmune sykdom.

Høy ekspresjon av CCR3 og CCR5 ble også observert i T-celler og B-celler av lymfeknuter avledet fra pasienter med Hodgkins sykdom.

Diabetes type I er ansett å være en T-celle mediert, autoimmun sykdom. Ekspresjonen av CCR5 reseptoren i pankreas ble assosiert med progresjonen av type I diabetes i relevante dyremodeller (Cameron (2000) J. Immunol. 165, 1102-1110). Særlig ble CCR5 ekspresjonen assosiert med utviklingen av insulinitt og spontan type I diabetes.

Diverse antistoffer som spesifikt binder til (human) CCR5 er velkjente i teknikken og omfatter MC-1 (Mack (1998) J. Exp. Med. 187, 1215-1224 eller MC-5 (Blanpain

(2002) Mol Biol Cell. 13:723-37, Segerer (1999) Kidney Int. 56:52-64, Kraft (2001) JBiol Chem. 14; 276:34408-18). CCR-5 antistoffene, særlig MC-1 og MC-5, kan tjene som kilde for Ig-avledet annen domene av det CD3 spesifikke konstrukt ifølge oppfinnelsen. Det beskrives et bispesifikt konstrukt omfattende minst to domener der det første domenet gir spesifisiteten for human CD3 og har en redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper og der det Ig-avledede, andre domenet er avledet fra et antistoff spesifikt for (human) CCR5. Mer spesielt er et slikt konstrukt en enkelkjede scFv som definert her. MC-1 ble påvist å binde spesifikt til en første del av den andre ekstracellulære løkke av human CCR5 og kryssreagerte ikke med CCR5 avledet fra rhesus makaker som vist i de vedlagte eksempler. Derfor er det foretrukket at det CD3 spesifikke konstrukt ifølge oppfinnelsen for eksempel omfatter VL- og VH domener av et antistoff (det vil si et Ig-avledet andre domene) som er spesifikt for CCR5, fortrinnsvis det humane CCR5, og VH- og VL domener av et antistoff spesifikt for CD3 antigenet. Nevnte antistoff som er spesifikt for det humane CCR5 er det murine anti-humane CCR5 antistoff MC-1, beskrevet blant annet hos Mack (1998), J. Exp. Med. 187, 1215-1224 og i de vedlagte eksempler. Dog er det tatt sikte på at andre anti-CCR5 antistoffer som MC-5 (somkarakteriserti de vedlagte eksempler og beskrevet hos Blanpain (2002) Mol Biol Cell. 13:723-37, Segerer (1999) Kidney Int. 56:52-64 og Kraft (2001) J Biol Chem. 14; 276:34408-18) kan benyttes innen oppfinnelsens kontekst.

Det er beskrevet at det kan tilveiebringes CD3-spesifikke bindingskonstrukter som omfatter et deimmunisert domene rettet mot/binding mot/interagering med human CD3 og et andre Ig-avledet domene som spesifikt binder til/interagerer med CCR5. Slike konstrukter er vist i tabell 6A og 6B. Modulene A-G i tabellene 6A og 6B kan defineres som nevnt ovenfor for tabellene 1-5. Deimmuniserte VH domener av antistoffer med spesifisitet for det humane CD3 antigen kan velges fra sekvensene som angitt i SEQ ID NR.: 74 eller 76. Deimmuniserte VL- domener av antistoffer med spesifisitet for det humane CD3 antigen kan velges fra sekvensene som angitt i SEQ ID NR.: 78, 80 eller 82. VH proteindomenet av human CCR5 antistoffet er som angitt i SEQ ID NR.: 129. VL proteindomenet av human CCR5 antistoff er som angitt i SEQ ID NR.: 131. Når enten modulparet A/C eller E/G er et par av deimmuniserte VH/VL- eller VL/VH proteindomener fra et antistoff med spesifisitet for det humane CD3 antigen har proteinmodulen B henholdsvis F aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 3. Når enten modulparet A/C eller E/G er et par av VH/VL eller VL/VH fra et antistoff med spesifisitet for EpCAM antigenet har proteinmodulen B henholdsvis F aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 168. De respektive grupper av proteinmoduler A-B-C og E-F-G er forbundet til hverandre via proteinmodulen D med sekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 174. Som imidlertid nevnt ovenfor kan et ytterligere serin innføres for kloningsformål (linker som angitt i SEQ ID NR.: 176) mellom VL- og det etterfølgende V domene.

Nukleinsyremolekyler som koder deimmuniserte VH domener av antistoffer med spesifisitet for det humane CD3 antigen kan velges fra sekvenser som angitt i SEQ ID NR.: 73 eller 75. Nukleinsyremolekyler som koder deimmuniserte VL domener av antistoffer med spesifisitet for det humane CD3 antigen kan velges fra sekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 77, 79 eller 81. Nukleinsyremolekylet som koder VH proteindomenet av det humane CCR5 antistoff er som angitt i SEQ ID NR.: 128. Nukleinsyremolekylet som koder VL proteindomenet av det humane CCR5 antistoff er som angitt i SEQ ID NR.: 130. Når enten modulparet A/C eller E/G angir nukleinsyre som koder et par av deimmunisert VH/VL- eller VL/VH proteindomener fra et antistoff med spesifisitet for det humane CD3 antigen har nukleinsyremodulen B henholdsvis F nukleinsyresekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 202. Når enten modulparet A/C eller E/G angir nukleinsyre som koder et par av VH/VL eller VL/VH fra et antistoff med spesifisitet for CCR5 antigenet har nukleinsyremodulen B henholdsvis F nukleinsyresekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 201. Gruppene av nukleinsyremoduler A-B-C og E-F-G er forbundet med hverandre via proteinmodulen D med en sekvens som angitt i SEQ ID NR.: 173. En alternativ linker SEQ ID NR.: 175 kan også benyttes for å forbinde VL domene med et etterfølgende V domene (inkludert en ytterligere kodon som koder en serinrest for kloningsformål

Fortrinnsvis omfatter nevnte konstrukter en aminosyresekvens valgt fra gruppen:

(a) en aminosyresekvens som vist i en hvilken som helst av SEQ ID NR.: 206, 208,

210, 212, 214 eller 216;

(b) en aminosyresekvens som kodes av en nukleinsyresekvens som vist i en hvilken

Som helst av SEQ ID NR.: 205, 207, 209, 211, 213 eller 215; og

(c) en aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som er degenerat som et

Resultat av den genetiske kode, til en nukleotidsekvens ifølge (b);

(d) en aminosyresekvens som kodes av en nukleinsyresekvens som hybridiserer Med den komplementære tråd av en nukleinsyresekvens som angitt under (b)

under stringente hybridiseringsbetingelser.

De CCR5- og CDR bindende konstrukter SEQ ID NR.: 206, 208, 210 representerer konstrukt 5 og SEQ ID NR.: 212, 214 og 216 representerer konstrukt 13 i tabell 6 og har tre forskjellige VL områder (VL1 (SEQ ID NR.: 78), VL2 (SEQ ID NR.: 80), eller VL3 (SEQ ID NR.: 82).

Det beskrives også CD3 spesifikke bindingskonstrukter omfattende et første domene som spesifikt binder til human CD3 og har redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper og omfattende et Ig-avledet andre domene rettet mot/i stand til binding til CCR5, som omfatter en aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som hybridiserer med den komplementære tråd av en nukleinsyresekvens som definert under (b) ovenfor, det vil si en nukleinsyresekvens som vist i en hvilken som helst av SEQ ID NR.: 205, 207, 209, 211, 213 eller 215 under stringente hybridiseringsbetingelser. Uttrykket "hybridisering" og "stringente betingelser" er beskrevet ovenfor. De tilsvarende definisjoner og utførelsesform er gjelder her mutatis mutandis.

De deimmuniserte CD3- og CCR5 bindingskonstrukter som her tilveiebringes er spesielt brukbare ved den medisinske intervensjon av virale sykdommer og særlig HIV infeksjoner og AIDS, eller intervensjon av autoimmune sykdommer og/eller inflammatoriske sykdommer som rheumatoid artritt.

Det beskrives også CD3 spesifikke bindingskonstrukter som definert ovenfor der det Ig-avledede andre domene av det inventive konstrukt omfatter et antigen-interaksjonssete med spesifisitet for CD 19.

CD19 har vist seg å være et meget brukbart, medisinsk mål. CD19 uttrykkes i hele B-cellelinjen fra pro B-cellen til den mature B-celle og skilles ikke ut, uttrykkes enhetlig på alle lymfomceller og er fraværende fra stamceller (Haagen, Clin Exp Immunol 90

(1992), 368-75; Uckun, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85 (1988), 8603-7). Kombinasjonsterapi som benytter både et antistoff rettet mot CD 19 og et ytterligere, immunoregelatorisk antistoff, er beskrevet for behandling av B-cellemalignacier (WO 02/04021, US2002006404, US2002028178) og autoimmune sykdommer (WO 02/22212, US2002058029). WO 00/67795 beskriver bruken blant annet av antistoffer rettet mot CD 19 for behandling av indolente og aggressive former av B-cellelymfomer så vel som akutte og kroniske former av lymfatiske leukemier. WO 02/80987 beskriver den terapeutiske bruk av immunotoksiner basert på antistoffer mot antigen CD 19 for behandling av sykdommer som B-celle ikke-Hodgkins lymfom, Hodgkins lymfom eller B-celle leukemier (for eksempel B-celle akutt lymfatisk leukemi (B-ALL), (for eksempel hårcelle lymfom) B-celleforløper akutt lymfatisk leukemi (pre-B-ALL), B-celle kronisk lymfatisk leukemi (B-CLL)).

Det beskrives videre CD3 spesifikke bindingskonstrukter som omfatter et deimmunisert domene rettet mot binding til/interagering med human CD3 og et andre Ig-avledet domene som spesifikt binder til/interagerer med CD 19. Slike konstrukter er vist i

tabellene 7A og 7B. Modulene A-G i tabellene 7A og 7B kan defineres som nevnt ovenfor for tabellene 1-5. Deimmuniserte VH-domener av antistoffer med spesifisitet for det humane CD3 antigen kan velges fra sekvenser som angitt i SEQ ID NR.: 74 eller 76. Deimmuniserte VL-domener av antistoffer med spesifisitet for det humane CD3 antigen kan velges fra sekvenser som angitt i SEQ ID NR.: 78, 80 eller 82. VH-proteindomenet av human CD 19 antistoff er som angitt i SEQ ID NR.: 114. VL-proteindomenet av human CCR5 antistoff er som angitt i SEQ ID NR.: 116. Når enten molekylparet A/C eller E/G er et par av deimmuniserte VH/VL- eller VL/VH proteindomener fra et antistoff som har en spesifisitet for det humane CD3 antigen har proteinmodulen A henholdsvis F aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 3. Når enten modulparet A/C eller E/G er et par av VH/VL eller VL/VH fra et antistoff med spesifisitet for CD 19 antigenet har proteinmodul B henholdsvis F aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 168. De respektive grupper av proteinmoduler A-B-C og E-F-

G er forbundet med hverandre via proteinmodulen D som har sekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 174. Som imidlertid nevnt ovenfor kan et ytterligere serin innføres for kloningsformål (linker som angitt i SEQ ID NR.: 176) mellom VL- og det etterfølgende V-domenet.

Nukleinsyremolekyler som koder deimmuniserte VH-domener av antistoffer med spesifisitet for det humane CD3 antigen kan velges fra sekvenser som angitt i SEQ ID NR.: 73 eller 75. Nukleinsyremolekyler som koder deimmuniserte VL-domener av antistoffer med spesifisitet for det humane CD3 antigen kan velges fra sekvensene som angitt i SEQ ID NR.: 77, 79 eller 81. Nukleinsyremolekylet som koder VH-proteindomenet av det humane CD 19 antistoff er som angitt i SEQ ID NR.: 113. Nukleinsyremolekylet som koder VL-proteindomenet av det humane CCR5 antistoff er som angitt i SEQ ID NR.: 115. Når enten molekylparet A/C eller E/G angir nukleinsyre som koder et par av deimmuniserte VH/VL- eller VL/VH proteindomener fra et antistoff med spesifisitet for det humane CD3 antigen har nukleinsyremodulen B henholdsvis F aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 202. Når enten molekylparet A/C eller E/G angir en nukleinsyre som koder et par av VH/VL eller VL/VH fra et antistoff med en spesifisitet for CD 19 antigenet har nukleinsyremodulen B henholdsvis F nukleinsyresekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 201. Gruppene av nukleinsyremoduler A-B-C henholdsvis E-F-G er forbundet med hverandre via proteinmodulen D med sekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 173. En alternativ linker, SEQ ID NR.: 175, kan også benyttes for å forbinde VL-domenet med et etterfølgende V-domene (inkludert en ytterligere kodon som koder en serinrest for kloningsformål). Det beskrives et deimmunisert CD3 spesifikt bindingskonstrukt som omfatter et CD3 bindingsdomene som definert ovenfor og et andre, Ig-avledet domene som spesifikt binder til/interagerer med CD19, fortrinnsvis human CD19, der nevnte CD3 spesifikke bindingskonstrukt omfatter en aminosyresekvens som er valgt fra gruppen bestående av: (a) en aminosyresekvens som vist i en hvilken som helst av SEQ ID NR.: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407 eller 409; (b) en aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som vist i en hvilken som helst av SEQ ID NR.: 189, 191, 193, 195, 197,199, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406 or 408; og (c) en aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som er degenerat som et resultat av den genetiske kode til en nukleotidsekvens ifølge (b); (d) en aminosyresekvens som kodes av en nukleinsyresekvens som hybridiserer med den komplementære tråd av en nukleinsyresekvens som angitt under (b) under stringente hybridiseringsbetingelser.

Foretrukne CD 19- og CD3 bindingskonstrukter er SEQ ID NR.: 190, 192, 194 som representerer konstrukt 5 og SEQ ID NR.: 196, 198 og 200 som representerer konstruktet 13 i tabell 7 og som har tre forskjellige VL områder (VLl SEQ ID NR.: 78, VL2 (SEQ ID NR.: 80) eller VL3 (SEQ ID NR.: 82).

Det beskrives også CD3 spesifikke bindingskonstrukter omfattende et første domene som spesifikt binder til human CD3 og har redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper og omfatter et Ig-avledet andre domene rettet mot/i stand til binding til CD 19, omfattende en aminosyresekvens som kodes av en nukleinsyresekvens som hybridiserer med den komplementære tråd av en nukleinsyresekvens som angitt under (b) ovenfor, det vil si en nukleinsyresekvens som vist i en hvilken som helst av 189, 191, 193, 195, 197,199, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406 eller 408, under stringente hybridiseringsbetingelser. Uttrykkene "hybridisering" og "stringente betingelser" er beskrevet ovenfor. De tilsvarende definisjoner og utførelsesformer gjelder her mutatis mutandis.

De her beskrevne, deimmuniserte CD3- og CD19 bindingskonstrukter er spesielt brukbare ved forebygging, terapi eller lindring av proliferative sykdommer, en tumorøs sykdom, en inflammatorisk sykdom, en immunologisk forstyrrelse, en autoimmun sykdom, en smittende sykdom, en viral sykdom, allergiske reaksjoner, parasittiske reaksjoner, graft-versus-vertssykdommer, vert-versus-graft sykdommer eller B-celle maligniteter, særlig B-celle ikke-Hodgkins lymfom, Hodgkins lymfom eller B-celle leukemi er (for eksempel B-celle akutt lymfostatisk leukemi (B-ALL), (for eksempel hårcellelymfom) B-celle forløper akutt lymfatisk leukemi (pre-B-ALL), B-celle kronisk lymfatisk leukemi (B-CLL) leukemi.

Det beskrives videre et CD3 spesifikt bindingskonstrukt som definert ovenfor omfattende et første domene som spesifikt binder til human CD3 og har redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper, og et andre domene der det andre domenet er Ig-avledet og omfatter et antigeninteraksjonssete med en spesifisitet for CD20.

CD20 er et av celleoverflateproteinene som er til stede på B-lymfocytter. CD20 antigenet finnes i normale og malignante pre-B- og mature B-lymfocytter inkludert de i over 90 % av B-celle ikke-Hodgkins lymfomer (NHL). Antigenet er fraværende i hematopoetiske stamceller, aktiverte B-celle lymfocytter (plasmaceller) og normalt vev. Flere antistoffer, for det meste av murin opprinnelse, er beskrevet i: 1F5 (Press et al., 1987, Blood 69/2, 584-591), 2B8 / C2B8, 2H7, 1H4 (Liu et al., 1987, J Immunol 139, 3521-3526; Anderson et al., 1998, US patent Nr. 5 736 137; Haisma et al., 1998, Blood 92, 184-190; Shan et al., 1999, J. Immunol 162, 6589-6595).

CD20 er beskrevet i immunoterapeutiske strategier for behandling av plasmacellemaligniteter ved bruk av vaksinasjon med DNA som koder scFv linket til bæreprotein (Treon et al., 2000, Semin Oncol 27(5), 598) og i immunoterapeutisk behandling ved bruk av CD20 antistoffer (IDEC-C2B8) og har kunnet vises å være effektiv ved behandling av ikke-Hodgkins B-celle lymfom. CD20 antistoffer har vist seg effektive og tolererbare ved ikke-Hodgkins lymfom å gi en responsgrad på 73 % henholdsvis 48 % i tidligere ikke-behandlede eller relapsert/refraktorisk indolente ikke-Hodgkins lymfom, henholdsvis (Montserrat, 2003, Semin Oncol 30(lsuppl2), 34-39). Videre er CD20 antistoffer utstrakt benyttet for å behandle relapserende eller fremskreden B-celle neoplasmer med en effektivitet på rundt 50 %.

Det er beskrevet CD3-spesifikke bindende konstrukter som omfatter et deimmunisert domene rettet mot binding til/interagering med human CD3 og et andre Ig-avledet domene som spesifikt binder til/interagerer med CD20. Slike konstrukter er vist i tabellene 8A og 8B. Modulene A-G i tabell 8A og 8B kan defineres som nevnt for tabellene 1-5. Deimmuniserte VH-områder av antistoffer med spesifisitet for det humane CD3 antigen kan velges fra sekvensene som angitt i SEQ ID NR.: 74 eller 76. Deimmuniserte VL domener av antistoffer med spesifisitet for det humane CD3 antigen kan velges fra sekvensene som angitt i SEQ ID NR.: 78, 80 eller 82. VH proteindomenet av human CD20 antistoffet er som angitt i SEQ ID NR.: 170. VL-proteindomenet av human CD20 antistoffet er som angitt i SEQ ID NR.: 172. Når enten modulparet A/C eller E/G er et par av deimmuniserte VH/VL eller VL/VH proteindomener fra et antistoff med spesifisitet for det humane CD3 antigen har proteinmodulen B henholdsvis F aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 3. Når enten modulparet A/C eller E/G er et par av VH/VL eller VL/VH fra et antistoff som har spesifisitet for CD20 antigenet har modul B henholdsvis F aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 168. De respektive grupper ev moduler A-B-C henholdsvis E-F-G er forbundet med hverandre via proteinmodulen D som har sekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 174. Som imidlertid nevnt ovenfor kan et ytterligere serin innføres for kloningsformål (linker som angitt i SEQ ID NR.: 176) mellom VL- og det etterfølgende V domenet.

Nukleinsyremolekyler som koder deimmuniserte VH domener av antistoffer som har spesifisitet for det humane CD3 antigen kan velges fra sekvensene som angitt i SEQ ID NR.: 73 og 75. Nukleinsyremolekyler som koder deimmuniserte VL domener av antistoffer med spesifisitet for det humane CD3 antigen kan velges fra sekvensene som angitt i SEQ ID NR.: 77, 79 eller 81. Nukleinsyremolekylet som koder VH proteindomenet av det humane CD20 antistoff er som angitt i SEQ ID NR.. 169. Nukleinsyremolekylet som koder VL proteindomenet av det humane CD20 antistoff er som angitt i SEQ ID NR.: 171. Når enten molekylparet A/C eller E/G angir en nukleinsyre som koder et par av deimmuniserte VH/VL- eller VL/VH proteindomener fra et antistoff med spesifisitet for human CD3 antigenet, har nukleinsyremodulen B henholdsvis F aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 202. Når enten molekylparet A/C eller E/G angir en nukleinsyre som koder et par av VH/VL eller VL/VH fra et antistoff med spesifisitet for CD20 antigenet har nukleinsyremolekylet B henholdsvis F nukleinsyresekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 201. Gruppene av nukleinsyremolekyler A-B-C og E-F-G er forbundet med hverandre via nukleinsyresyremodulen D som har sekvensen som angitt i SEQ ID NR.: 173. En alternativ linker SEQ ID NR.: 175 kan også benyttes for å konjugere VL domene med et derpå følgende V domene (inkludert en ytterligere kodon som koder en serinrest for kloningsformål). Mer spesielt omfatter de deimmuniserte CD3- og CD20 bindingskonstrukter en aminosyresekvens som er valgt fra gruppen bestående av: (a) en aminosyresekvens som vist i en hvilken som helst av SEQ ID NR.: 218,

220, 224, 226 eller 228;

(b) en aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som vist i en hvilken

som helst av SEQ ID NR.: 217, 219, 221, 223, 225 eller 227;og

(c) en aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som er degenerat som

et resultat av den genetiske kode til en nukleinsekvens ifølge (b); (d) og aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som hybridiserer med den komplementære tråd av en nukleinsyresekvens som angitt under (b) under stringente hybridiseringsbetingelser.

Det beskrives også CD3 spesifikke bindingskonstrukter omfattende et første domene som spesifikt binder til human CD3 og har redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper og omfatter et Ig-avledet andre domene rettet mot/i stand til binding til CD20, omfattende en aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som hybridiserer med den komplementære tråd av en nukleinsyresekvens som angitt under (b) ovenfor, det vil si en nukleinsyresekvens som vist i en hvilken som helst av SEQ ID NR.: 217, 219, 221, 223, 225 eller 227, under stringente hybridiseringsbetingelser. Uttrykket "hybridisering" og "stringente betingelser" er beskrevet ovenfor. De tilsvarende definisjoner og utførelsesform er gjelder her mutatis mutandis.

De her beskrevne, deimmuniserte CD3- og CD20 bindingskonstrukter er ment for terapi, forebygging eller lindring av B-celle relaterte forstyrrelser, fortrinnsvis en medisinsk intervensjon av lymfom og helt spesielt behandling av ikke-Hodgkins lymfom.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en nukleinsyresekvens som koder et CD3 spesifikt bindende molekyl ifølge oppfinnelsen.

Det skal være åpenbart for fagmannen at regulatoriske sekvenser kan føyes til nukleinsyremolekylet ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan det benyttes promotere, transkripsjonene enhancere og/eller sekvenser som tillater indusert ekspresjon av polynukleotidet ifølge oppfinnelsen. Et egnet, induserbart system er for eksempel tetrasyklin-regulert genekspresjon som beksrevet for eksempel av Gossen og Bujard

(Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89 (1992), 5547-5551) og Gossen et al. (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62), eller et deksametason-induserbart genekspresjonssystem som beskrevet for eksempel av Crook (1989) EMBO J. 8, 513-519 .

Videre er det for ytterligere formål tatt sikte på at nukleinsyremolekylene for eksempel kan inneholde tioesterbindinger og/eller nukleotidanaloger. Nevnte modifikasjoner kan være brukbare for stabilisering av nukleinsyremolekylet mot endo- og/eller eksonukleaser i cellen. Nevnte nukleinsyremolekyler kan transkriberes ved hjelp av en egnet vektor inneholdende et kimerisk gen som tillater transkripsjon av nevnte nukleinsyremolekyl i cellen. I denne forbindelse skal det også være klart at et slikt polynukleotid kan benyttes for "geninnsikting" eller "genterapi' som behandlingsmetoder. I en annen utførelsesform er nevnte nukleinsyremolekyl merket. Metoder for detektering av nukleinsyrer er velkjent i teknikken, for eksempel Southern og Northern blot, PCR eller primerforlengelse. Denne utførelsesform kan være brukbar for screeningmetoder for å verifisere vellykket innføring av nukleinsyremolekylene som beskrevet ovenfor under genterapiveier.

Nevnte nukleinsyremolekyler kan være rekombinant fremstilt, kimeriske nukleinsyremolekyler som omfatter en hvilken som helst av de ovenfor nevnte nukleinsyremolekyler enten alene eller i kombinasjon. Fortrinnsvis er nukleinsyremolekylet en del av en vektor.

Ifølge oppfinnelsen angår denne derfor også en vektor omfattende nukleinsyremolekylet som beskrevet her.

Mange egnede vektorer er velkjente for fagfolk på området molekylærbiologi og valget vil avhenge av funksjonen som ønskes og inkluderer plasmider, kosmider, virus, bakteriofager og andre vektorer som konvensjonelt benyttes ved genetisk konstruksjon. Metoder som er velkjente i teknikken kan benyttes for å konstruere forskjellige plasmider og vektorer, se for eksempel de teknikker som er beskrevet av Sambrook et al. (loe eit.) og Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Alternativt kan polynukleotidene og vektorene ifølge oppfinnelsen rekonstitueres inni liposomer for avlevering til målceller. Som diskutert i større detalj nedenfor ble det benyttet en kloningsvektor for å isolere individuelle DNA sekvenser. Relevante sekvenser kan overføres til ekspresjonsvektorer der ekspresjonen av et spesielt polypeptid er krevd. Typiske kloningsvektorer inkluderer pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 og pGBT9. Typiske ekspresjonsvektorer inkluderer pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT.

Fortrinnsvis omfatter nevnte vektor en nukleinsyresekvens som er en regulatorisk sekvens som operativt er forbundet med nevnte nukleinsyresekvens som koder et bispesifikt enkeltkjedeantistoffkonstrukt som definert her.

Slike regulatoriske sekvenser (kontrollelementer (er velkjente for fagmannen og kan inkludere en promoter, en splisekassett, en translasjonsinitieringskodon, translasjon- og innføringssete for innføring av et innskudd i vektoren. Fortrinnsvis er nevnte nukleinsyremolekyl operativt forbundet med nevnte ekspresjonskontrollsekvens som tillater ekspresjon i eukaryotiske eller prokaryotiske celler.

Det er tatt sikte på at nevnte vektor er en ekspresjonsvektor omfattende nukleinsyremolekylet som koder et bispesifikt enkeltkjedeantistoffkonstrukt som definert her.

Uttrykket "regulatorisk sekvens" henviser til DNA sekvenser som er nødvendige for å bevirke ekspresjon av kodende sekvenser til hvilke de er ligert. Arten av slike kontroll sekvenser skiller seg avhengig av vertsorganisme. I prokaryoter inkluderer kontroll sekvenser generelt promoter, ribosomalt bindingssete og terminatorer. I eukaryoter inkluderer generelt kontroll sekvenser promotere, terminatorer og i enkelte tilfeller enhancere, transaktivatorer eller transkripsjonsfaktorer. Uttrykket "kontrollsekvens" er ment, som et minimum, å inkludere alle komponenter hvis nærvær er nødvendig for ekspresjon, og kan også inkludere ytterligere, fordelaktige komponenter.

Uttrykket "operativt forbundet" henviser til en sammenheng der komponentene som er beskrevet slik er i et forhold seg i mellom som tillater at de virker på sin tilsiktede måte. En kontroll sekvens som er "operativt forbundet" med en kodende sekvens er ligert på en slik måte at ekspresjonen av den kodende sekvens oppnås under betingelser som er kompatible med kontrollsekvensene. I tilfellet kontroll sekvensen er en promoter skal det være klart for fagmannen at det fortrinnsvis benyttes dobbelt-tråd nukleinsyre.

Således er den angitte vektor fortrinnsvis en ekspresjonsvektor. En "ekspresjonsvektor"

er et konstrukt som kan benyttes for å transformere en valgt vert og gir ekspresjon av en kodende sekvens i den valgte vert. Ekspresjonsvektorer kan for eksempel være kloningsvektorer, binære vektorer eller integreringsvektorer. Ekspresjon omfatter transkripsjon av nukleinsyremolekylet, fortrinnsvis til en transkriberbar mRNA. Regulatoriske elementer som sikrer ekspresjon i prokaryoter og/eller eukaryotiske celler er velkjente for fagfolk på området. Når det gjelder eukaryotiske celler omfatter de normale promotere som sikrer initiering av transkripsjon og eventuelt poly-A signaler som sikrer terminering av transkripsjon og stabilisering av transkriptet. Mulige regulatoriske elementer som tillater ekspresjon i prokaryotiske vertsceller omfatter for eksempel Pl-, lac-, trp eller tac promoteren i E. coli og eksempler på regulatoriske elementer som tillater ekspresjon i eukaryotiske vertsceller er A0X1- eller GALI promoteren i gjær eller CMV-, SV40-, RSV-promoteren (Roussarkom virus), CMV-enhanceren, SV40-enhancer eller en globinintron i mammal- eller andre animalceller.

Ved siden av elementer som er ansvarlige for initieringen av transkripsjon som regulatoriske elementer kan også omfatte transkripsjonstermineringssignaler som SV40-poly-A sete eller tk-poly-A sete, nedstrøms polynukleotidet. Videre og avhengig av ekspresjonssystemet som benyttes kan ledersekvenser som er i stand til å rette polypeptidet mot et cellulært rom eller utskilling i medier, føyes til den kodende sekvens i den angitte nukleinsyresekvens og er velkjent i teknikken, se også det vedlagte eksempel 1. Ledersekvensen(e) er satt sammen i egnet fase med translatering-, initiering- og termineringssekvenser og fortrinnsvis en ledersekvens som er i stand til å styre sekresjon av translatert protein, eller en del derav, til det periplasmiske rom eller det ekstracellulære medium. Eventuelt kan den heterologome sekvens kode et fusjonsprotein som inkluderer et N-terminalt identifiseringspeptid som gir ønskede karakteristika, for eksempel stabilisering eller forenklet rensing av uttrykt rekombinant produkt, se supra. I denne kontekst er egnede ekspresjonsvektorer velkjente i teknikken som for eksempel Okayama-Berg cDNA ekspresjonsvektoren pcDVl (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMW, pcDNAl, pcDNA3 (In-vitrogen), pEF-DHFR, pEF-ADA eller pEF-neo (Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150) eller

pSPORTl (GIBCO BRL).

Fortrinnsvis vil ekspresjonskontrollsekvenser være eukaryote promotersystemer i vektorer i stand til å transformere transfekterende, eukaryotiske vertsceller, men det kan også benyttes kontroll sekvenser for prokaryotiske verter. Når først vektoren er innarbeidet i den egnede vert blir verten holdt under betingelser som er egnet for et høyt nivå ekspresjon av nukleotidsekvensene og etter ønske kan det skje en samling og rensing av polypeptidet ifølge oppfinnelsen, se for eksempel de vedlagte eksempler.

Et alternativt ekspresjonssystem som kan benyttes er et insektsystem. I et slikt system blir Autographa californica nukleærpolyhedrosevirus (AcNPV) benyttet som en vektor for å uttrykke fremmedgener i Spodoptera frugiperdaceller eller i Trichoplusialarver. Den kodende sekvens av et angitt nukleinsyremolekyl kan klones inn i et ikke-vesentlig område av viruset, for eksempel polyhedringenet, og plasseres under kontroll av polyhedrinpromoteren. Vellykket innføring av denne kodende sekvens vil gjøre polyhedringenet inaktivt og produsere rekombinant virus som mangler beleggsproteinbelegget. De rekombinante virus benyttes så for å infisere S. frugiperdaceller eller Trichoplusialarver der proteinet ifølge oppfinnelsen uttrykkes (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 91 (1994), 3224-3227).

Ytterligere regulatoriske elementer kan inkludere transkripsjonelle så vel som translasjonelle enhancere. Fortrinnsvis omfatter de ovenfor beskrevne vektorer ifølge oppfinnelsen en valgbar og/eller bedømbar markør.

Valgbare markørgener som er nyttige for seleksjon av transformerte celler og for eksempel plantevev og planter, er velkjente for fagfolk på området og omfatter for eksempel antimetabolittresistens som basis for valg for dhfr som gir resistens mot metotreksat (Reiss, Plant Physiol.(Life Sei. Adv.) 13(1994), 143-149); npt som gir resistens mot aminoglykosider neomycin, kanamycin og paromycin (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) og hygro, som gir resistens mot hygromycin (Marsh, Gene 32 (1984),481-485). Ytterligere, valgbare gener er beskrevet, nemlig trpB som tillater aT-celler benytter indol i fase av tryptofan; hisD som tillater celler å benytte histinol i stedet for histidin (Hartman, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85 (1988), 8047); mannose-6-fosfatisomerase som tillater celler å benytte mannose (WO 94/20627) og ODC (ornitindekarboksylase) som gir resistens mot ornitindekarboksylaseinhibitoren, 2-(difluorometyl)-DL-ornitin, DFMO (McConlogue, 1987, i: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory utg.) eller deaminase fra Aspergillus terreus som gir resistens mot Blasticidin S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338).

Brukbare bedømbare markører er også velkjente for fagfolk på området og er kommersielt tilgjengelige. Fortrinnsvis er nevnte markør et gen som koder luciferase

(Giacomin, Pl. Sei. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), grønt fluoressent protein (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) eller B-glukuronidase (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). Denne utførelsesform er spesielt brukbar for enkelt og hurtig screening av celler, vev og organismer inneholdende en angitt vektor. Som beskrevet ovenfor kan det angitte nukleinsyremolekyl benyttes alene eller som en del av en vektor for å uttrykke det kodede CD3 spesifikke konstrukt i celler for for eksempel rensing men også for genterapiformål. Nukleinsyremolekylene eller vektorene inneholdende DNA sekvensen(e) som koder et hvilket som helst av de ovenfor beskrevne (bispesifikke) CD3 konstrukter innføres i cellene som i sin tur produserer polypeptidet av interesse. Genterapi som er basert på innføring av terapeutiske gener i celler ved ex-vivo- eller in-vivo teknikker er en av de viktigste anvendelser av genoverføring. Egnede vektorer, metoder eller genavleveringssystemer for in-vitro- eller in-vivo genterapi er beskrevet i litteraturen og er velkjent for fagmannen, se for eksempel Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. NY. Acad. Sei. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,580,859; US 5,589,466; eller Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. De angitte nukleinsyremolekyler og vektorer kan være konstruert for direkte innføring eller for innføring via liposomer, eller virale vektorer (for eksempel adenovirale, retrovirale) i cellen. Fortrinnsvis er cellen en germlinjecelle, embryonisk celle eller eggcelle eller avledet fra disse, helst er cellen en stamcelle. Et eksempel på en embryonisk stamcelle kan blant annet være en stamcelle som beskrevet av Nagy. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90 (1993), 8424-8428.

I henhold til det ovenfor anførte angår foreliggende oppfinnelsen metoder for å avlede vektorer, særlig plasmider, kosmider, virus og bakteriofager som benyttes konvensjonelt i genetisk konstruksjon, omfattende et nukleinsyremolekyl som koder polypeptidsekvensen av et bispesifikt, enkeltkjedeantistoffkonstrukt som definert her. Fortrinnsvis er vektoren en ekspresjonsvektor og/eller en genoverførings- eller målvektor. Ekspresjonsvektorer som er avledet fra virus som retrovirus, vaksinevirus, adeno-assosierte virus, herpesvirus, eller bovinpapillomvirus, kan benyttes for avlevering av de angitte polynukleotider eller vektorer til mål cell epopulasj oner. Metoder som er velkjente for fagfolk på området kan benyttes for å konstruere rekombinante vektorer, se for eksempel de teknikker som er beskrevet av Sambrook et al.(loe eit.), Ausubel (1989, loe eit.) eller andre standardverk. Alternativt kan de angitte nukleinsyremolekyler og -vektorer rekonstitueres inn i liposomer for avlevering til målceller. Vektorene inneholdende nukleinsyremolekylene ifølge oppfinnelsen kan overføres til vertscellen på i og for seg kjent måte som kan variere avhengig av typen av cellulær vert. For eksempel blir kalsiumkloridtransfeksjon vanligvis benyttet for prokaryotiske celler mens kalsiumfosfatbehandling eller elektroporering kan benyttes for andre cellulære verter, se Sambrook supra.

Den angitte vektor kan blant annet være pEF-DHFR, pEF-ADA eller pEF-neo. Vektorene pEF-DHFR, pEF-ADA og pEF-neo er beskrevet i teknikken, for eksempel av Mack et al. i (PNAS (1995) 92, 7021-7025) og av Raum et al. i (Cancer Immunol Immunother(2001) 50(3), 141-150).

Oppfinnelsen tilveiebringer også en vert som er transformert eller transfektert med en vektor som beskrevet her. Nevnte vert kan fremstilles ved å innføre nevnte minst ene ovenfor beskrevne vektor eller minst en av de ovenfor beskrevne nukleinsyremolekyler, i verten. Nærværet av nevnte minst ene vektor eller minst ene nukleinsyremolekyl i verten kan mediere ekspresjon av et gen som koder de ovenfor beskrevne, bispesifikke enkeltkj edeantistoffkonstrukter.

De beskrevne nukleinsyremolekyler eller -vektorer som er innført i verten kan enten integrere inn i vertens genom eller kan holdes ekstrakromosomalt.

Verten kan være en hvilken som helst prokaryotisk eller eukaryotisk celle.

Uttrykket "prokaryot" er ment å inkludere alle bakterier som kan transformeres eller transfekteres med DNA- eller RNA molekyler for ekspresjon av et protein ifølge oppfinnelsen. Prokaryotiske verter kan inkludere gram negative så vel som gram positive bakterier som for eksempel E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens og Bacillus subtilis. Uttrykket "eukaryotisk" er ment å inkludere gjær-, høyere plante-, insekt- og fortrinnsvis pattedyrceller. Avhengig av verten som benyttes i en rekombinant produksjonsprosedyre kan proteinet som kodes av polynukleotidet ifølge oppfinnelsen være glykosilert eller være ikke-glykosilert. Spesielt foretrukket er bruken av et plasmid eller et virus inneholdende den kodende sekvens av polypeptidet ifølge oppfinnelsen og genetisk fusert dertil, en N-terminal FLAG-tag og/eller C-terminal His- tag. Fortrinnsvis er lengden av nevnte FLAG-tag rundt 4 til 8 aminosyrer og helst 8 aminosyrer. Et ovenfor beskrevet polynukleotid kan benyttes for å transformere eller transfektere verten ved bruk av en hvilken som helst av de teknikker som vanligvis er kjent for fagfolk på området. Videre er metoder for fremstilling av fuserte, operativt forbundede gener og ekspresjon av disse, for eksempel i pattedyrceller og bakterier, velkjent i teknikken (Sambrook, loe eit.)

Fortrinnsvis er verten en bakterie., insekt-, fungal-, plante- eller dyrecelle.

Det er spesielt tatt sikte på at den angitte vert kan være en pattedyrcelle og mer spesielt en humancelle eller humancellelinje.

Spesielt foretrukne vertsceller omfatter CHO celler, COS celler, myeloma cellelinjer som SP2/0 eller NS/O. Som illustrert i de vedlagte eksempler er CHO celler spesielt foretrukket som verter.

I en ytterligere utførelsesform angår oppfinnelsen således en fremgangsmåte for fremstilling av et CD3 spesifikt konstrukt som beskrevet ovenfor omfattende dyrking av en celle og/eller verten ifølge oppfinnelsen under betingelser som er egnet for ekspresjon av nevnte konstrukt og så å isolere konstruktet fra cellen eller kulturmediet.

De transformerte verter kan dyrkes i fermentere og dyrkes i henhold til teknikker som er velkjente på området for å oppnå optimal cellevekst. Polypeptidet ifølge oppfinnelsen kan isoleres fra vekstmediet, cellulære lysater eller cellulære membranfraksjoner. Isolering og rensing av de for eksempel mikrobielt uttykte polypeptider ifølge oppfinnelsen kan skje på en hvilken som helst konvensjonell måte som for eksempel ved preparative kromatografiske separasjoner og immunologiske separasjoner som de som involverer bruken av monoklonale eller polyklonale antistoffer rettet for eksempel mot en tag på polypeptidet ifølge oppfinnelsen eller som beskrevet i de vedlagte eksempler.

Videre tilveiebringer oppfinnelsen et preparat omfattende et (humant) CD3 spesifikt bindingskonstrukt som definert her eller et humant CD3 spesifikt bindingskonstrukt som fremstilt ved prosessene som beskrevet ovenfor, et nukleinsyremolekyl ifølge oppfinnelsen, en vektor eller en vert ifølge oppfinnelsen. Nevnte preparater kan eventuelt også omfatte en proteinholdig forbindelse i stand til å gi et aktiveringssignal for immune effektorceller. Helst er nevnte preparat et farmasøytisk preparat som videre

omfatter, eventuelt, egnede formuleringer av bærere, stabilisatorer og/eller eksipienter.

I henhold til foreliggende oppfinnelse angår uttrykket "farmasøytisk preparat" et preparat for administrering til en pasient, fortrinnsvis en human pasient. I en foretrukket utførelsesform omfatter det farmasøytiske preparat et preparat for parenteral, transdermal, intraluminal, intraarterial, intratekal administrering eller ved direkte injeksjon i vevet eller tumoren. Det er spesielt tatt sikte på at nevnte farmasøytiske preparat administreres til en pasient via infusjon eller injeksjon. Administrering av de egnede preparater kan gjennomføres på forskjellige måter, for eksempel ved intravenøs, intraperitoneal, subkutan, intramuskulær, topisk eller intradermal administrering. Det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte en farmasøytisk akseptabel bærer. Eksempler på egnede, farmasøytiske bærere er velkjente i teknikken og inkluderer fosfatbufrede saltoppløsninger, vann, emulsjoner som olje/vannemulsjoner, forskjellige typer fuktemidler, sterile oppløsninger og så videre. Preparater omfattende slike bærere kan formuleres ved velkjente, konvensjonelle metoder. Disse farmasøytiske preparater kan administreres til individet i egnede doser. Dosedietten vil bestemmes av den ansvarlige lege og av kliniske faktorer. Som velkjent i den medisinske teknologi avhenger doseringer for en hvilken som helst pasient av mange faktorer inkludert pasientens størrelse, kroppsoverflateareal, alder, den spesielle forbindelse som administreres, kjønn, tid og administreringsmodus, generell helse eller andre medikamenter som gis samtidig. Generelt vil kuren som en regulær administrering av det farmasøytiske preparat ligge i området rundt 1 ug til rundt 5 g enheter per dag. Videre kan en mer foretrukket dosering for kontinuerlig infusjon ligge i området 0,01 ug til 2 mg og særlig 0,01 ug til 1 mg, spesielt 0,01 ug til 100 ug, mer spesielt 0,01 ug til 50 ug og helt spesielt 0,01 ug til 10 ug enheter per kg kroppsvekt per time. Spesielt foretrukne doseringsformer er angitt nedenfor. Forløpet kan følges ved periodisk bedømmelse. Doseringer vil variere men en foretrukket dosering for intravenøs administrering av DNA er fra rundt IO<6>til IO12 kopier av DNA molekylet. Preparatene ifølge oppfinnelsen kan administreres lokalt eller systemisk. Administreringen vil generelt være parenteral, for eksempel intravenøs; DNA kan også administreres direkte til målsetet, for eksempel ved biolistisk avlevering til et internt eller eksternt målsete eller ved hjelpe av kateter til et sete i en arterie. Preparater for parenteral administrering inkluderer sterile vandige eller ikke-vandige oppløsninger, suspensjoner og emulsjoner. Eksempler på ikke-vandige oppløsningsmidler er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer som olivenolje, og injiserbare, organiske estere som etyloleat. Vandige bærere inkluderer vann, alkoholiske/vandige oppløsninger, emulsjoner og suspensjoner, inkludert saltoppløsning og bufrede medier. Parenterale vehikler inkluderer natriumkloridoppløsning, Ringers dekstrose, dekstrose og natriumklorid, laktert Ringers, eller fikserte oljer. Intravenøse vehikler inkluderer fluid og næringssupplementer, elektrolyttsupplementer (som de som er basert på Ringers dekstrose) og liknende. Preserveringsmidler og andre additiver kan også være tilstede som for eksempel antimikrobielle midler, antioksidanter, gelateringsmidler og inertgasser og liknende. I tillegg kan de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen omfatte proteinbærere som for eksempel serumalbumin eller immunoglobulin, fortrinnsvis av human opprinnelse. Det er tatt sikte på at det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen i tillegg til proteinholdige, bispesifikke enkeltkjedeantistoff-konstrukter eller nukleinsyremolekyler eller -vektorer som koder de samme (som beskrevet ifølge oppfinnelsen), kan inneholde ytterligere biologisk aktive midler avhengig av den tilsiktede bruk av det farmasøytiske preparat. Slike midler kan være medikamenter som virker på det gastrointestinale system, medikamenter som virker som cytostatika, medikamenter som forhindrer hyperurikemi, medikamenter som inhiberer immunreaksjoner (for eksempel kortikosteroider), medikamenter som virker på sirkulasjonssystemet og/eller midler som T-celle ko-stimulatoriske molekyler eller cytokiner som velkjent i teknikken.

Mulige indikasjoner for administrering av preparatet eller preparatene ifølge oppfinnelsen er tumorøse sykdommer og sørlig epitelialcancere/karsinomer som brystcancer, koloncancer, prostatacancer, hode- og halscancer, hudcancer (melanom), cancere i genito-urinærkanalen, for eksempel ovariecancer, endometrialcancer, cervikscancer og nyrecancer, lungekasner, gastrisk cancer, cancer i tynntarmen, levercancer, pankreascancer, galleblærecancer, cancer i gallekanalen, esofagøs cancer, cancer i spyttkjertlene og cancer i tyroidkjeitelen eller andre tumorøse sykdommer som hematologiske tumorer, gliomer, sarkomer eller ostesarkomer. Administreringen av preparatet eller preparatene ifølge oppfinnelsen er spesielt indikert for minimal restsykdom og særlig tidlig faste tumorer, fremskridende faste tumorer og metastatiske faste tumorer, som karakteriseres ved den lokale og ikke-lokale gjenopptreden av tumoren forårsaket av overlevelsen av enkeltceller.

Foreliggende oppfinnelse tar videre sikte på ko-administreringsprotokoller med andre forbindelser, for eksempel molekyler som er i stand til å gi et aktiveringssignal for immune effektorceller, for celleproliferering eller for cellestimulering. Nevnte molekyler kan for eksempel være et ytterligere primært aktiveringssignal for T-celler

(for eksempel et ytterligere ko-stimulatorisk molekyl: molekyler av B7 familien, Ox40L, 4,1 BBL), eller et ytterligere cytokin: interleukin (for eksempel IL-2) eller NKG-2D engasjerende forbindelse.

Preparatet ifølge oppfinnelsen som beskrevet ovenfor kan også være et diagnostisk preparat som videre eventuelt omfatter midler og metoder for detektering.

De CD3 spesifikke konstrukter som tilveiebringes her er også velegnet for anvendelse i immunoanalyser der de kan benyttes i en flytende fase eller bindes til en fast fasebærer. Eksempler på immunoanalyser som kan benytte polypeptidet ifølge oppfinnelsen er kompetitive og ikke-kompetitive aminoanalyser i enten et direkte eller indirekte format. Eksempler på slike aminoanalyser er den enzym-linkede immunosorbent analyse (ELISA), enzymimmunoanalyse (EIA), radioimmunoanalyse (RIA) og sandwich (immunometrisk analyse) og western blot analysen.

De CD3 spesfikke bindingskonstrukter ifølge oppfinnelsen kan være bundet til mange forskjellige bærere og benyttes for å isolere celler som spesifikt er bundet til nevnte polypeptider. Eksempler på velkjente bærere inkluderer glass, polystyren, polyvinylklorid, polypropylen, polyetylen, polykarbonat, dekstran, nylon, amyloser, naturlige og modifiserte stivelser, polyakrylamider, agaroser og magnetitt. Arten av bæreren kan være enten oppløselig eller uoppløselig, for eksempel som kuler, for oppfinnelsens formål.

Det finnes mange forskjellige merkelapper og metoder for merking, velkjente for fagfolk på området. Eksempler på typer av merkelapper som kan benyttes ifølge oppfinnelsen er enzymer, radioisotoper, kolloidmetaller, fluoressente forbindelser, kjemiluminessente forbindelser og bioluminessente forbindelser, det skal også vises til utførelsesformene som er beskrevet ovenfor.

I en mest foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen tas det sikte på anvendelsen av et CD3 spesifikt bindende molekyl ifølge oppfinnelsen, av en vektor eller av en vert ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et farmasøytisk preparat. Nevnte farmasøytiske preparat kan benyttes ved forebygging, terapi eller lindring av en proliferativ sykdom, en tumorøs sykdom, en inflammatorisk sykdom, en immunologisk forstyrrelse, en autoimmun sykdom, en smittende sykdom, viral sykdom, allergiske reaksjoner, parasittiske reaksjoner, graft-versus-vert sykdommer eller vert-versus-graft sykdommer. Videre kan de deimmuniserte konstrukter omfattende CD 19- og CD3 bindende domener og fortrinnsvis kan SEQ ID NR.: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407 eller 409, benyttes for behandling av immunologiske forstyrrelser (forskjelllige B-cellemaligniteter) eller autoimmune sykdommer, der de deimmuniserte konstrukter som omfatter CCR5- og CD3 bindende domener og særlig SEQ ID NR.: 206, 208, 210, 212, 214 eller 216, kan benyttes for behandling av virale sykdommer (HIV), autoimmune sykdommer og/eller inflammatoriske sykdommer (som rheumatoid artritt), der de deimmuniserte konstrukter omfattende CD20- og CD3 bindende domener og særlig SEQ ID NR.: 218, 220, 222, 224, 226, 228, kan benyttes for behandling av tumorøse sykdommer og særlig lymfom, mer spesielt ikke-Hodgkins B-celle lymfom, og de deimmuniserte konstrukter omfattende EpCAM- og CD3 bindende domener og særlig SEQ ID NR.: 31, 33, 35, 37, 39, 49, 55, 58, 61, 63, 65, 67, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323 eller 325 kan benyttes for behandling av tumorøse sykdommer og særlig epitelialcancere.

Det beskrives også en fremgangsmåte forforebygging, terapi eller lindring av en proliferativ sykdom, en tumorøs sykdom, en inflammatorisk sykdom, en immunologisk lidelse, en autoimmun sykdom, en smittende sykdom, viral sykdom, allergiske reaksjoner, parasittiske reaksjoner, graft-versus-vertssykdommer eller vert-versus-graftsykdommer omfattende administrering av et (bispesifikt) CD3 spesifikt bindende molekyl ifølge oppfinnelsen eller et bispesifikt CD3 spesifikt bindende molekyl som fremstilt ved fremgangsmåten som beskrevet her, av et nukleinsyremolekyl, en vektor eller en vert ifølge oppfinnelsen, til et individ som trenger slik forebygging, terapi eller lindring. Fortrinnsvis er individet et menneske.

Fremgangsmåten for forebygging, terapi eller lindring kan også i tillegg omfatte administrering av en proteinforbindelse i stand til å gi et aktiveringssignal for immune effektorceller. Nevnte proteinforbindelse kan administreres samtidig eller ikke-samtidig med det CD3 bindende molekyl, et nukleinsyremolekyl, en vektor eller en vert ifølge oppfinnelsen. Proteinforbindelsen kan blant annet velges fra gruppen bestående av et ytterligere ko-stimulatorisk molekyl: molekyler av B7 familien, Ox40L, 4,1 BBL), eller et ytterligere cytokin: interleukin (for eksempel IL-2) eller NKG-2D engasjerende forbindelser.

Til slutt tileveiebringer oppfinnelsen et sett (kit) omfattende det CD3 spesifikke bindende molekyl, et nukleinsyremolekyl, en vektor eller en vert ifølge oppfinnelsen.

Nevnte sett er spesielt brukbart ved fremstilling av det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen og kan blant annet bestå av en beholder som er brukbar for injeksjoner eller infusjoner. Fortrinnsvis omfatter settet ifølge oppfinnelsen videre eventuelt (a) en eller flere buffere, lagringsoppløsninger og/eller gjenværende reagenser eller materialer som er krevd for gjennomføring av medisinske eller vitenskapelige formål. Videre kan en del av settet ifølge oppfinnelsen være pakket individuelt i vialer eller flasker eller i kombinasjon i beholdere eller flerbeholderenheter. Settet ifølge oppfinnelsen kan med fordel blant annet benyttes for å gjennomføre fremgangsmåten som beskrevet og kan benyttes i et antall applikasjoner som angitt her, for eksempel som forskningsverktøy eller medisinske verktøy. Fremstillingen av settene følger fortrinnsvis standardprosedyrer som er velkjente for fagfolk på området.

Disse og andre utførelsesformer er beskrevet og omfattet av beskrivelsen og eksemplene i foreliggende søknad. Ytterligere litteratur hva angår et hvilket som helst av antistoffene, metodene, anvendelsene og forbindelsene i forbindelse med oppfinnelsen kan hentes fra offentlige bibliotek og databaser ved bruk av for eksempel elektroniske innretninger. For eksempel kan man benytte den offentlige database "Medline", tilgjengelig på internett, for eksempel under adressen http:// www. ncbi. nlm. nih. eov/ PubMed/ medline. html. ytterligere databaser og adresser som http:// www. ncbi. nlm. nih. eov/. http:// www. infobioeen. fr/. http:// www. fmi. ch/ bioloev/ research tools. html. http:// www. tier. ore/. er velkjente for fagfolk på området og kan også oppnås ved bruk av for eksempel., http:// www. lvcos. com.

De vedlagte figurer skal illustrere oppfinnelsene nærmere.

I figurene viser:

Figur 1:

DNA- og aminosyresekvenser av den ikke-deimmuni serte anti-CD3 kassett (SEQ ID NR.: 1 og 2).

Figur 2:

A) Aminosyresekvenser av de tunge kjeder VH2 (SEQ ID NR.: 70), VH3 (SEQ ID NR.: 72), VH5 (SEQ ID NR.: 74) og VH7 (SEQ ID NR.: 76) og lette kjeder VL1 (SEQ ID NR.: 78), VL2 (SEQ ID NR.: 80) og VL3 (SEQ ID NR.: 82), henholdsvis, B) Nukleotidsekvenser av de tunge kjeder VH2 (SEQ ID NR.: 69), VH3 (SEQ ID NR.: 71), VH5 (SEQ ID NR.: 73) og VH7 (SEQ ID NR.: 75) og lette kjeder VL1 (SEQ ID NR.: 77), VL2 (SEQ ID NR.: 79) og VL3 (SEQ ID NR.: 81), henholdsvis, C) Aminosyresekvenser av CDR'ene 1, 2 og 3 av de tunge kjeder av den ikke-deimmuniserte anti-CD3 (SEQ ID NR.: 84, 90, 96), VH2 (SEQ ID NR.: 86, 94, 96), VH3 (SEQ ID NR.: 86, 94, 96), VH5 (SEQ ID NR.: 88, 92, 96) og VH7 (SEQ ID NR.: 88, 90, 96) og av de lette kjeder av de ikke-deimmuni serte anti-CD3 (SEQ ID NR.: 98, 102, 104), kjeder VL1 (SEQ ID NR.: 100, 102, 104), VL2 (SEQ ID NR.: 100, 102, 104) og VL3 (SEQ ID NR.: 98, 102, 104) og D) Nukleotidsekvenser av CDR'ene 1, 2 og 3 av de tunge kjeder av den ikke-deimmuniserte anti-CD3 (SEQ ID NR.: 83, 89, 95), VH2 (SEQ ID NR.: 85, 93, 95), VH3 (SEQ ID NR.: 85, 93, 95), VH5 (SEQ ID NO.: 87, 91, 95) og VH7 (SEQ ID NR.: 87, 89, 95) og av de lette kjeder av den ikke-deimmuni serte anti-CD3 (SEQ ID NR.: 97, 101, 103), kjeder VL1 (SEQ ID NR.: 99, 101, 103), VL2 (SEQ ID NR.: 99, 101, 103) og VL3 (SEQ ID NR.: 97, 101, 103).

Figur 3:

A) Nukleotidsekvens av anti-CD3 (VH2/VL1) (SEQ ID NR.: 4)

B) Aminosyresekvensen av anti-CD3 (VH2/VL1) (SEQ ID NR.: 5)

C) Nukleotidsekvensen av anti-CD3 (VH2/VL2) (SEQ ID NR.: 6)

D) Aminosyresekvens av anti-CD3 (VH2/VL2) (SEQ ID NR.: 7)

E) Nukleotidsekvens av anti-CD3 (VH2/VL3) (SEQ ID NR.: 8)

F) Aminosyresekvens av anti-CD3 (VH2/VL3) (SEQ ID NR.: 9).

Figur 4:

A) Nukleotidsekvens av anti-CD3 (VH3/VL1) (SEQ ID NR.: 10) B) Aminosyresekvens av anti-CD3 (VH3/VL1) (SEQ ID NR.: 11) C) Nukleotidsekvens av anti-CD3 (VH3/VL2) (SEQ ID NR.: 12) D) Aminosyresekvens av anti-CD3 (VH3/VL2) (SEQ ID NR.: 13) E) Nukleotidsekvens av anti-CD3 (VH3/VL3) (SEQ ID NR.: 14) F) Aminosyresekvens av anti-CD3 (VH3/VL3) (SEQ ID NR.: 15).

Figur 5:

A) Nukleotidsekvens av anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NR.: 16) B) Aminosyresekvens av anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NR.: 17) C) Nukleotidsekvens av anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 18) D) Aminosyresekvens av anti-CD3 (VH5xVL2) (SEQ ID NR.: 19) E) Nukleotidsekvens av anti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NR.: 20) F) Aminosyresekvens av anti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NR.: 21).

Figur 6:

A) Nukleotidsekvens av anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NR.: 22) B) Aminosyresekvens av anti-CD3 (VH7xVLl) (SEQ ID NR.: 23) C) Nukleotidsekvens av anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NR.: 24)

D) Aminosyresekvens av anti-CD3 (VH7xVL2) (SEQ ID NR.: 25)

E) Nukleotidsekvens av anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NR.: 26)

F) Aminosyresekvens av anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NR.: 27).

Figur 7:

Binding av bispesifikke anti CD-19 konstrukter med forskjellige deimmuniserte anti-CD3 deler: anti-CD3 (VH2/VL1) (SEQ ID NR.: 178), anti-CD3 (VH2/VL2) (SEQ ID NR.: 180), anti-CD3 (VH2/VL3) (SEQ ID NR.: 182), anti-CD3 (VH3/VL1) (SEQ ID NR.: 184), anti-CD3 (VH3/VL2) (SEQ ID NR.: 186), anti-CD3 (VH3/VL3) (SEQ ID NR.: 188), anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NR.: 190), anti-CD3 (VH5/VK2) (SEQ ID NR.: 192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NR.: 194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NR.: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NR.: 198), anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NR.: 200)

A) CD3 og

B) CD19.

Binding ble målt ved FACS-basert analye ved bruk av CD3 anrikede PBMCer (A) eller CD19-positive NALM-celler (B). CD3 og et sekundært FITC market anti-mus lg antistoff ble benyttet som en negativ kontroll i (A) og CD 19 og et sekundært FITC merket anti-mus lg antistoff ble benyttet som negativ kontroll i (B).

Konstruktene anti-CD19xanti-CD3 og anti-EpCAM (M79)xanti-CD3 ble benyttet som kontroller. MFI antyder midlere fluoressensintensitet.

Figur 8:

Et representativt elueringsmønster av en deimmunisert variant av anti-CD19xanti-CD3 proteinfraksjonen fra en HCIC kolonne ved 280 nm. Bunnlinjen som viser et hovedtrinn ved 700 ml antyder den teoretiske gradient av elueringsbufferen inneholdende 20 mM acetat, pH 3,5. Høy absorpsjon ved 280 nm skyldes ikke-bundet protein i kolonnegjennomløpet. Pilen ved 810, 98 ml antyder den eluerte, deimmuniserte anti-CD3 fraksjon.

Figur 9:

Et representativt elueringsmønster av en deimmunsert variant av anti-CD19xanti-CD3 proteinfraksjonen fra en Ni-gelaterende His Trap® kolonne ved 280 nm. Bunnlinjen som viser et første trinn ved 85 ml og et andre hovedtrinn ved 90 ml indikerer den teoretiske gradient av elueringsbufferen (prikket linje). Pilen ved 93,16 ml antyder proteinfraksjonen som inneholder antiCD19 x antiCD3 konstruktet.

Figur 10:

Et representativt proteinelueringsmøsnter fra en Sephadex S200 gelfiltreringskolonne. Fraksjoner ble samlet fra 0-130 ml retensjonstid. Proteintoppen ved 80,44 ml tilsvarer en MW på ca. 52 kD og inneholder det deimmuniserte antiCD19 x antiCD3 konstrukt.

Figur 11:

A) SDS-PAGE analyse av deimmuniserte varianter av anti-CD19xanti-CD3 proteinfraksjoner. Spor M: Molekylvekstmarkør Spor 1: HCIC gjennomstrømning; spor 2: cellekultursupernatant; spor 3: HCIC eluat; spor 4: IMAC gjennomstrømning; spor 5: IM AC vasking; spor 6: IMAC eluat; spor 7: gelfiltreringseluat; B) Western blotanalyse av rensede, deimmuniserte varianter av anti-CD19xanti-CD3 proteinfraksjoner. Western blotanalyse av det rensede, bispesifikke protein ble gjennomført med antistoffer rettet mot His-Tag (PentaHis, Qiagen) og geit antimus lg merket med alkalisk fosfatase. Spor M: molekylvekstmarkør spor, 1: HCIC gjennomstrømning; spor 2: cellekultursupernatant; spor 3: HCIC eluat; spor 4: IMAC gjennomstrømning; spor 5: IMAC vasking; spor 6: IMAC eluat; spor 7: gelfiltreringseluat.

Figur 12:

Binding av de rensede, bispesifikke anti-CD19 konstrukter med forskjellige, deimmuniserte anti-CD3 deler: anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NR.: 190), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NR.: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NR.: 198) og anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NR.: 200) til A) CD3 og B) CD 19 sammenliknet med vill-type anti-CD19xanti-CD3 konstrukt. Bindingen ble målt ved FACS-basert analyse ved bruk av CD3 anrikede PBMCer (A) eller CD19-positive NALM-celler (B). Et sekundært antistoff med CD3 positive celler ble benyttet som en negativ kontroll i (A) og et sekundært antistoff med CD 19 positive celler ble benyttet som en negativ kontroll i (B). Konstruktene anti-CD19xanti-CD3 og anti-EpCAM (M79)xanti-CD3 ble benyttet som kontroller. Analysen ble gjennomført ved konsentrasjoner på 1 u,g/ml og 5 u,g/ml. MFI antyder midlere fluoressensintensitet.

Figur 13:

Cytotoksisitetsanalyse av bispesifikke anti-CD19 konstrukter med forskjellige, deimmuniserte anti-CD3 deler anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NR.: 190), anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NR.: 194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NR.: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NR.: 198) og anti-CD3 (VH7/VK3) (SEQ ID NR.: 200), sammenliknet med kontroll.

Figur 14:

Sekvensinnretning av variabelt tungt område av ikke-deimmunisert CD3 antistoff, VH5 (SEQ ID NR.: 74), VH7 (SEQ ID NR.: 76), VH2 (SEQ ID NR.: 70) og VH3 (SEQ ID NR.: 72). Rammeverksområde 1 (FRI), kompiementaritetsbestemmende område 1 (CDR1), Rammeverksområde 1 (FRI), komplementaritetsbestemmede område 2 (CDR2), Rammeverksområde 3 (FR3), komplementaritetsbestemmende område 3 (CDR3) og Rammeverksområde 4 (FR4) er angitt. Sekvensen LAR og VKK i FRI, sekvensen ASGYTF og ASGYTA som overgang fra rammeverk 1 området til CDR1 området og sekvensene LTTDK, ITTDK og MTTDT ved FR3 og sekvensen MQLS, MELS og LQMN ved FR3 er lagt i boks. Innretningen ble gjennomført ved bruk av AlingnX programmet fra Vector NTI Advance (Informax, Inc., USA).

Figur 15:

Bindingsanalyse av bispesifikke anti EpCAM konstrukter med forskjellige, deimmuniserte anti-CD3 deler: anti-CD3 (VH5/VL2)x5-10 (SEQ ID NR.: 37)

(A) , deimmunisert anti-CD3 (VH5/VL2)x4-7 (SEQ ID NR.: 33),

(B) , deimmunisert anti-CD3 (VH5/VL2)x3-l (SEQ ID NR.: 31)

(C) , deimmunisert anti-CD3 (VH5/VL2)x4-7 (VL-VH) (SEQ ID NR.: 35)

(D) , og deimmunisert anti-CD3 (VH5/VL2)x5-10 (VL-VH) (SEQ ID NR.: 39)

(E) i CD3-positive Jurkat- og EpCAM-positive Kato Ul celler med en FACS-basert

analyse.

Et skift til høyre viser binding. I Jurkatceller indikerer den prikkede linje skift av negativ kontroll (kun sekundært antistoff), den strekede linje viser bindingen av et anti-EpCAM-anti-CD3 kontrollantistoff, fremhevet linje viser det bispesifikke konstrukt av interesse. I bindingsanalysen ved bruk av EpCAM-positive Kato JJI-celler istedet for monoklonalt antistoff til CD3 ble et monoklonalt antistoff mot EpCAM benyttet som en positiv kontroll.

Figur 16:

Bindingsanalyse av bispesifikke anti EpCAM konstrukter med forskjellige anti-CD3 deler: 3-lxanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 49)

(A) og 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 63)

(B) i CD3-positive Jurkatceller og i EpCAM-positive Katoceller med en FACS basert

analyse. Et skift mot høyre viser binding.

Figur 17:

Cytotoksisitetsanalyse av EpCAM konstrukter med deimmuniserte anti-CD3 deler

(di anti-CD3) ved N-terminal posisjon anti-CD3 (VH5/VL2)x3-l (SEQ ID NR.: 31), anti-CD3 (VH5/VL2)x-5-10 (SEQ ID NR.: 37) og anti-CD3 (VH5/VL2)x4-7 (SEQ ID NR.: 33) sammenliknet med de tilsvarende, ikke-deimmuni serte konstrukter. CB15 T-celleklon og CHO-EpCAM celler ble benyttet i et E:T forhold på 5:1. CHO-EpCAM celle ble farget med PKH26 fargestoff og cellene ble talt etter bispesifkk enkeltkjede-antistoffinkubering med FACS analyse.

Figur 18:

Cytotoksisitetsanalyse av EpCAM konstrukter med deimmuniserte anti-CD3 deles ved den C-terminale delen 3-lxanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 49) og 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 63) sammenliknet med de tilsvarende, ikke-deimmuni serte vill-type konstrukter. Cytotoksisitetsanalysen ble gjennomført på samme måte som i forbindelse med figur 17.

Eksempler og referanseeksempler:

I de følgende eksempler er et antall enkeltkjedeanti-human CD3 antistoffer konstruert for å vise redusert immunogenisitet hos mennesker. De forskjellige, deimmuniserte anti- human CD3 antistoffer omfatter 12 kombinasjoner av 4 forskjellige VH (VH2 (SEQ JD NR.: 69, 70), VH3 (SEQ JD NR.: 71, 72), VH5 (SEQ JD NR.: 73, 74) og VH7 (SEQ JD NR.: 75, 76)) og 3 forskjellige VL (VL1 (SEQ JD NR.: 77, 78), VL2 (SEQ JD NR.: 79, 80) og VL3 (SEQ JD NR.: 81, 82)) områder som er forenet. Aminosyre- og nukleinsyresekvensen av de ovenfor nevnte VH- og VL områder er vist i figurer 3-6. Illustrerende ble de deimmuniserte anti-CD3 enkeltkjedeantistoffer kombinert med anti-CD19 enkeltkjedeanti stoff eller med et anti-EpCAM enkeltkjedeanti stoff for å danne et bispesifikt produkt.

Eksempel 1. Kloning og ekspresjon av deimmuniserte anti-CD3 konstrukter

1.1. Overføring av cDNA som koder enkeltkjedeantistoff

Det DNA som koder anti-CD3 enkeltkjedeantistoff, som ble deimmunisert, er her angitt som anti-CD3 kassetten. Denne anti-CD3 kassett betsår av en SGGGGS linker (SEQ JD NR.: 176), anti-CD3 VH-området (SEQ JD NR.: 110), en 14 aminosyre GS linker (VEGGSGGSGGSGGSGGVD linker (SEQ JD NR.: 68)), og anti-CD3 VL kj edeområdet (SEQ JD NR.: 112) fulgt av 6 histidinrester. Den ovenfor nevnte DNA ble klonet inn i vektoren p-PCR-Script-Amp SK(+) (Stratagene) ved Srf 1 setet. DNA- og aminosyresekvensen for anti-CD3 kassetten er vist i SEQ JD NR.: 1, SEQ JD NR.: 2 og i figur 1.

1.2 Datamaskinanalyse av sekvenser for immunogeniske T-celleepitoper og konstruksjon av deimmuniserte enkeltkjedeantistoffsekvenser Aminosyresekvensen av anti-CD3 kassetten (SEQ JD NR.: 2) ble analysert ved et peptid "threading" program for å indetifisere potensielle T-celleepitoper ved metoden som beksrevet i WO 98/52976. SEQ JD NR.3 viser den deimmuniserte linkersekvens og SEQ JD NR.: 68 den opprinnelige linkersekvens.

1.3 Konstruksjon av deimmuniserte enkeltkjedeantistoffsekvenser De deimmuniserte versjoner av anti-CD3 kassetten ble konstruert ved metoden med overlappende PCR rekombinering. Anti-CD3 kassetten (SEQ JD NR.: 1, 2) i pPCR-S-Amp SK+ ble benyttet som templatet for mutagenesen til de ønskede, deimmuniserte sekvenser. Sett av mutageniske primerpar ble syntetisert omfattende områdene som skulle endres. De fremstilte, deimmunsierte sekvenser inkludert 4 forskjellige VH- og 3 forskjellige VL-områder, ble klonet som Noti til Hindi 11 fragmenter inn i vektoren pPCR-S-Amp SK+ og hele DNA sekvensen ble bekreftet å være korrekt. De 5 forskjellige VH- og 3 forskjellige VH-områder ble forenet i alle kombinasjoner (til

sammen 12), enten ved PCR eller ved bruk av et et unikt BstEl 1 sete innført ved 3'enden av VH-området. Hele DNA sekvensen for hver kombinasjon ble bekreftet å være korrekt. De forskjellige, deimmuniserte VH-områder (SEQ ID NR.: 70, 72, 74 og 76) og VL-områder (SEQ ID NR.: 78, 80 og 82) med de tilsvarende opprinnelige, ikke-deimmuniserte sekvenser (VH:SEQ ID NR.: 110; VL:SEQ ID NR.: 112) av anti-CD3 konstruktene er oppsummert i tabell 9.

1.4 Overføring av deimmuniserte enkeltkjedeantistoffgener inn i en ekspresj onsvektor

De deimmuniserte anti-CD3 kassetter ble skåret ut fra pPCR-S-amp-SK+ med BspEl og Sali og klonet inn i ekspresjonsvektoren pEF omfattende VLcdi9-VHcdi9-VHcd3-VLcD3. CD3 delen av pEF-DHFR vektoren ble erstattet med hver av de deimmuniserte anti-CD3 kassetter fra BspEl setet til Sali setet, noe som ga de følgende 12 konstrukter:

pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH2/VL1) (SEQ ID NR.: 177, 178)

pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH2/VL2) (SEQ ID NR.: 179, 180)

pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH2/VL3) (SEQ ID NR.: 181, 182)

pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH3/VL1) (SEQ ID NR.: 183, 184)

pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH3/VL2) (SEQ ID NR.: 185, 186)

pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH3/VL3) (SEQ ID NR.: 187, 188)

pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NR.: 189, 190)

pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 191, 192)

pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NR.: 193, 194)

pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NR.: 195, 196)

pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NR.: 197, 198)

pEF anti-CD19xanti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NR.: 199, 200).

Konstruktene omfatter videre en murin IgG tungkj edel eder for å muliggjøre sekresjon av proteinet. DNA-sekvensen av de deimmuniserte anti-CD3 kassetter i ekspresjonsvektoren ble bekreftet ved bruk av de sekvenserende primere (SEQ ID NR.: 28 og 29). DNA-og aminosyresekvensene av de 12 deimmuniserte anti-CD3 kassetter i pEF vektoren fra BspEl setet til Sali setet er vist i SEQ ID NR.: 177-200.

1.5 Produksjon av antistoffkonstrukter

Etter transformering av vektoren inn i E. coli K12 ble det preparert transfeksjonskvalitets DNA'er av de forskjellige ekspresjonsvektorer. Utskilte proteiner ble fremstilt i CHO-dhfr- celler. For transient produksjon ble cellekultursupernatanter høstet to dager etter transfeksjon, for generering av stabile, transfekterte celler ble celler brakt i seleksjonsmedium to dager etter transfeksjon. Etter fem passasjer ble det oppnådd stabile masser. Deretter ble enkeltkloner identifisert i begrensende fortynninger. For å lette renseprosessen ble cellene tilpasset serumfritt medium. Antistoffkonstrukter ble renset fra rundt 1 liter supernatant.

Produksjonsnivåene ble testet med ELISA. Ingen vesentlige forskjeller i de utskilte antistoffnivåer ble observert mellom forskjellige konstrukter omfattende anti-CD19- og deimmuniserte anti-CD3 konstrukter.

Eksempel 2: Bindingsanalyser

For å analysere bindingseffektiviteten for de deimmuniserte konstrukter til CD3 og CD 19 ble det gjennomført en FACS-basert analyse. I utgangspunktet ble råsupernatanter testet for binding på CD3 anrikede PBMCer eller CD 19 positive NALM-6 celler. Celler ble inkubert med ikke-fortynnede supernatanter i 3 min ved 8 °C. etter to vasketrinn ble cellene merket med et anti-His antistoff (Qiagen) under de samme betingelser. Etter ytterligere vasketrinn ble binding av konstruktene detektert med et FITC-konjugert saue-anti-muse antistoff (Sigma). Celler ble analysert med et FACS Calibur cytometer (B&D). Som kontroller ble det innarbeidet supernatanter av anti-CD19xanti-CD3- og GFP-transfekterte celler. CD3 og et sekundært antistoff ble benyttet som en negativ kontroll og viste en midlere fluoressensintensitet (MFI) på ca. 3,5. Anti-CD19xanti-CD3 konstruktene omfattende anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NR.: 190), anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NR.: 194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NR.: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NR.: 198) og anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NR.: 200) hadde en MFI på minst 90 og binder således rundt 25 ganger sterkere. Den positive kontroll som var et ikke-deimmunisert anti-CD19xanti-CD3 konstrukt nådde en MFI på rundt 60, noe som viste at de deimmuniserte konstrukter omfattende anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NR.: 190), anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NR.: 194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NR.: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NR.: 198) og anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NR.: 200) bandt CD3 med ekstremt høy effektivitet. I et andre forsøk viste de følgende konstrukter omfattende anti-CD19 og anti-CD3: anti-CD3 (VH2/VL1) (SEQ ID NR.: 178), anti-CD3 (VH2/VL2) (SEQ ID NR.: 180), anti-CD3 (VH2/VL3) (SEQ ID NR.: 182, anti-CD3 (VH3/VL1) (SEQ ID NR.: 184), anti-CD3 (VH3/VL2) (SEQ ID NR.: 186) og anti-CD3 (VH3/VL3) (SEQ ID NR.: 188), noe som viser tilsvarende binding som den negative kontroll (MFI ca. 6).

Den FACS-baserte bindingsanalyse ble også gjennomført for CD 19.1 dette forsøk var CD19 og et sekundært antistoff en negativ kontroll. I dette forsøk oppnådde alle analyserte konstrukter en MFI på minst 80 mens MFI-verdien for den negative kontroll var ca. 3.

Således viste konstruktene omfattende anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NR.: 190), anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 192), anti-CD3 (VH5/VL3) (SEQ ID NR.: 194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NR.: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NR.: 198) og anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NR.: 200) seg å binde både CD3 og CD 19 som ikke-modifisert anti-CD19xanti-CD3 (SEQ ID NR.: 204). Imidlertid hadde konstruktene anti-CD3 (VH2/VL1) (SEQ ID NR.: 178), anti-CD3 (VH2/VL2) (SEQ ID NR.: 180), anti-CD3 (VH2/VL3) (SEQ ID NR.: 182), anti-CD3 (VH3/VL1) (SEQ ID NR.: 184), anti-CD3 (VH3/VL2) (SEQ ID NR.: 186), anti-CD3 (VH3/VL3) (SEQ ID NR.: 188) fullstendig mistet anti-CD3 bindingsevnen mens CD 19 bindingen var fullt bibeholdt (figur 7).

Således ble det påvist at de deimmuniserte tunge kjeder dominerte i bindingsspesifisitet og styrke. Som et resultat ble anti-CD3 konstrukter med VH5- og VH7 grupper renset og analysert for cytotoksisk aktivitet.

Eksempel 3. Ekspresjon og rensing av variantene som viste høy bindingsaffinitet De deimmuniserte anti-CD19xanti-CD3 proteiner anti-CD3 (VH5/VL1)

(SEQ ID NR.: 190), anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 192), anti-CD3 (VH5/VL3)

(SEQ ID NR.: 194), anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NR.: 196), anti-CD3 (VH7/VL2)

(SEQ ID NR.: 198) og anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NR.: 200) ble uttrykt i kinesiske hamsterovarieceller (CHO).

For å rense de bi-spesifikke enkeltkjedekonstrukter omfattende en deimmunisert anti-CD3 del ble CHO-CD19 celler dyrket i rulleflasker med HiClone CHO modifisert DMEM medium (HiQ)® i 7 dager før høsting. Cellene ble fjernet ved sentrifugering og supernatanten, inneholdende de uttrykte protein, ble lagret ved -20 °C.

Akta FPLC System® (Pharmacia) og Unicorn Software® ble benyttet for kromatografi. Alle kjemikalier var av forskningskvalitet og er ervervet fra Sigma (Deisenhofen) eller Merck (Darmstadt).

Hydrofobisk ladningsinduksjonskromatografi ble gjennomført på MEP Hypercel® medium lastet på en XK16/60 kolonne (Pharmacia) som var ekvilibrert med buffer Al (20 mM Tris pH 7,2). 500 ml cellekultursupernatant ble brakt på kolonnen (10 ml) med en strømningshastighet på 3 ml/min. Ikke-bundet prøve ble vasket ut med buffer Al og bundet protein eluert med 100 % buffer Bl (20 mM acetat pH 3,5). Eluerte proteinfraksjoner ble slått sammen for ytterligere rensing.

IMAC ble gjennomført ved bruk av en HisTrap® kolonne (Pharmacia) som var fylt med NiSCM henhold til produsentens protokoll. Kolonnen ble ekvilibrert med buffer A2 (20 mM NaP pH 7,5, 0,4 M NaCl) og prøven fortynnet 2:1 med buffer A2 for å oppnå en pH-verdi på7. Prøven ble brakt på kolonnen (2 ml) med en strømningshastighet på 1 ml/ min og kolonnen ble vasket med buffer A2 for å fjerne ikke-bundet prøve. Bundet protein ble eluert ved bruk av en to-trinnsgradient av buffer B2 (20 mM NaP pH 7,5, 0,4 M NaCl, 0,5 M Imidazol) trinn 1: 20 % buffer B2 i 10 kolonnevolumer; trinn 2: 100 % buffer B2 i 10 kolonnevolumer. Eluerte proteinfraksjoner ble slått sammen for ytterligere rensing.

Gelfiltreringskromatografi ble gjennomført på en Sephadex S200 HiPrep® kolonne (Pharmacia) ekvilibrert med PBS (Gibco). Eluerte proteinprøver (strømningshastighet 1 ml/min) ble underkastet SDS-Page og Western Blot for detektering (figur 11).

Kolonnen ble i utgangspunktet kalibrert for molekylvektsbestemmelse (molekylvekstmarkørkit, Sigma MW GF-200).

De deimmuniserte varianter av anti-CD19xanti-CD3 protein ble isolert i en tre-trinnsrenseprosess som inkluderte hydrofobladningsinduksjonskromatografi (HCIC)

(figur 8), immobilisert metall affinitetskromatografi (IMAC) (figur 9) og gelfiltrering (figur 10). Det bi-spesifikke konstrukt hadde en molekylvekt på 52 kDa under native betingelser som bestemt ved gelfiltrering i PBS.

Det rensede, bi-spesifikke protein ble analysert med SDS-PAGE under reduserende betingelser ved bruk av på forhånd støpte 4-12 % Bis Tris geler (Invitrogen). Prøvepreparering og anvendelse var i henhold til produsentens protokoll. Molekylvekten ble bestemt med MultiMarck® proteinstandard (Invitrogen). Gelen ble farget med kolloidal Coomassie (Invitrogen protokoll). Renheten for det isolerte protein var >95 % (figur 1 la) og molekylet hadde en størrelse på 52 kD.

Videre ble de deimmuniserte varianter av anti-CD19xanti-CD3protein spesifikt detektert ved Western blot. Western blot ble gjennomført med en Optitran BA-S83® membran og Invitrogen Blot Module® i henhold til produsentens protokoll. De benyttede antistoffer var Penta His (Quiagen) og gjete-anti-muse-Ig merket med alkalisk fosfatase (AP) (Sigma), fargeoppløsningen var BCIP/NBT væske (Sigma). Hovedsignalet ble vist å tilsvare hovedbåndet i SDS-PAGE ved 52 kD (figur 1 lb).

Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved bruk av proteinanalysefarge (MicroBCA®, Pierce) og IgG (Biorad) som standard protein. En oppsummering av sluttutbyttene av rensede proteinvarianter er gitt i tabell 10 og viser den høye produktivitet av alle konstruktene og meget godt utbytte av konstrukt med anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NR.: 190) på 924, 8 ug.

Produktiviteten for CD19xanti-CD3 (VH5/VL2)- og CD19xanti-CD3(VH7/VL2) konstruktene ble sammenliknet med de tilsvarende, ikke-deimmuni serte konstrukter. Resultatene er vist i tabell 11.

Tabell 11 viser klart at de bi-spesifikke konstrukter omfattende deimmunisert CD3 bindingsdomene har meget høyere (minst tre ganger) produktivitet enn det tilsvarende, ikke-deimmuni serte konstrukt.

Eksempel 4. FACS baserte bindingsanalyser av anti-CD3 konstruktene Binding av valgte, rensede antistoffkonstrukter omfattende anti-CD19 og anti-CD3 ble detektert som beskrevet ovenfor i eksempel 2 ved forskjellige konsentrasjoner. ICD3 bindingsanalysen viste det negative kontrollsekundæreantistoff (anti-His, FITC-konjugert), som var inkubert med CD3 positive celler, en MFI på rundt 2,5 og den positive kontroll, deimmunisert antiCD19xanti-CD3 bi-spesifikt enkeltkjedeantistoff på rundt 70 ved 1 ug/ml konsentrasjon og 50 ved 5 ug/ml konsentrasjon (figur 12A). Ved en konsentrasjon på 1 ug/ml viste anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NR.: 190), anti-CD3

(VH7/VL1) (SEQ ID NR.: 196), anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NR.: 198) og anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NR.: 200) deimmuniserte, bi-spesifikke antistoffer MFI verdier på 10-20 der anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NR.: 190) hadde den høyeste verdi (20). Ved 5 ug/ml anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NR.: 198) nådde anti MFI en verdi på 25, mens anti-CD3 (VH7/VL1) (SEQ ID NR.: 196), anti-CD3 (VH7/VL3) (SEQ ID NO.: 200) og anti-CD3 (VH5/VL1) (SEQ ID NR.: 190) hadde en MFI på minst 40 og viste derved

den samme bindingseffektivitet som den ikke-deimmuni serte, positive kontroll. Ved en konsentrasjon på 5 ug/ml binder de sterkt bindende konstrukter med deimmunisert anti-CD3 del VH5/VL1 (SEQ ID NR.: 190), VH7/VL1 (SEQ ID NR.: 196), VH7/VL2 (SEQ ID NR.: 198), VH7/VL3 (SEQ ID NR.: 200) til CD3 så vel som ikke-deimmunisert anti-CD19xanti-CD3 (SEQ ID NR.: 204).

Alle antistoffkonstruktene bundet til CD 19 hadde høy effektivitet som var rundt 200 MFI mens ikke-deimmunisert anti-CD19xanti-CD3 konstrukt (SEQ ID NR.: 204) viste 80 MFI. Ingen forskjeller ble observert for CD 19 binding ved de testede konsentrasjoner for de forskjellige konstrukter (figur 12 B)

Eksempel 5. Cytotoksisitetsanalyse

Anti-CD19xanti-CD3 medierer T-celleavhengig cytotoksisitet til CD19-positive målceller. Dette ble analysert in vitro for bestemmelse av den biologiske potens av anti-CD19xanti-CD3.

For dette formål ble fluoressensmerkede CD19-positive NALM-6 målceller inkubert med isolert PBMC fra tilfeldige donorer eller CB15 T-celler (standardisert T-cellelinje) som effektorceller i nærværet av anti-CD19xanti-CD3. Etter inkubering i 4 timer ved 37 °C i en fuktet inkubator ble frigivningen av fluoressensfargestoffet fra målcellene til supernatanten bestemt i et spektrofluorimeter. Målcellene som var inkubert uten anti-CD19xanti-CD3 og målceller som var totalt lysert ved tilsetning av saponin ved slutten av inkuberingen, tjente som negative og positive kontroller. Den spesifikke cytotoksisitet som ble målt ved en viss anti-CD19xanti-CD3 konsentrasjon kan beregnes ved hjelp av den følgende formel:

Doseresponsen ble analysert fra 0,4 pg/ml anti-CD19xanti-CD3 til 100 ng/ml anti-CD19xanti-CD3 for å spesifisere EC50 verdien. Selv om EC50 verdien beskriver den biologiske potens for anti-CD19xanti-CD3 vil den absolutte verdi variere signifikant avhengig av kilden for effektorcellene. Således beregnes en relativ potens sammenliknet med et anti-CD19xanti-CD3 referansemateriale basert på den følgende formel:

De cytotoksiske aktiviteter for konstruktene omfattende anti-CD19 og deimmunisert anti-CD3 er vist i figur 13. Renset, ikke-deimmunisert anti-CD19xanti-CD3 ble benyttet som kontroll. EC50 verdiene for de deimmuniserte konstrukter var i området 21,9-81,6 pg/ml mens EC50 verdien for ikke-deimmunisert anti-CD19xanti-CD3 konstruktet var 22,7 pg/ml. Således viste alle deimmuniserte konstrukter EC50 verdier som var sammenliknbare med det ikke-deimmuni serte molekyl.

Eksempel 6. T-celleprolifereringsanalyse

Tjue friske donorer ble valgt for screening i T-celleanalyser basert på HLA-DR typping (tabell 12). Dette muliggjør screening av peptider i T-celleanalyse mot mer enn 80 % av DR alleler uttykt i den globale populasjon.

6.1 T-celleprolifereringsanalyse

Peptider ble oppnådd fra Pepscan (Nederland) ved en renhet over 90 %. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra de 20 valgte friske donorer (tabell 12) ble benyttet for å screene individuelle peptider i triplikatbrønner ved 1 henholdvis 5 uM. To positive kontrollpeptider (C32 og C49) og nøkkelhullimpet hemocyanin (KLH) ble inkludert i analysen. Etter 7 dagers inkubering av celler og peptider ble en 18 timers puls med 3H-tymidin ved lu Ci/brønn benyttet for å bedømme T-celleprolifereringen. Disse data er uttrykt som stimuleringsindeks der:

Stimuleringsindeks = CPM av testpeptid/CPM av ikke-behandlet kontroll

En T-celleepitop er definert som et peptid som gir en stimuleringsindeks (SI) større enn 2. Resultatene fra to uavhengige forsøk antydet at 5 av de 22 MHC bindingspeptider i den ikke-deimmuni serte anti-CD3 sekvens hadde evnen til å indusere human T-celleproliferering (SI>2). På den annen side induserte ingen av de tilsvarende, deimmuniserte molekyler T-celleproliferering. Tabell 13 oppsummerer T-celleprolifereringsanalyseresultatene som viser midlere SI-verdier for 2 uavhengige forsøk.

Disse data viste også en konsentrasjonsavhengig effekt hvorved hvert av de ikke-deimmuniserte bindingsmolekyler viste SI-verdi > 2 i kun en av de to konsentrasjoner (1 um eller 5 um) som ble benyttet. Differansen i respons ved forskjellige konsentrasjoner er forklart ved det faktum at individuelle peptider vil ha optimale konsentrasjoner ved hvilke de induserer T-celleproliferering. Hvis denne konsentrasjon overskrides kan prolifereringen synke (høye peptidkonsentrasjoner kan ha en inhibitorisk effekt på T-celleproliferering). Dette forklarer hvorfor, i enkelte tilfeller, proliferering sees ved den lavere konsentrasjon og ikke ved den høyere. Erfaring sier at T-celleproliferering vil observeres ved en eller to av peptidkonsentrasjonene som benyttes hvis et peptid inneholder en T-celleepitop. Disse data viser at deimmuni sering med hell fjernet T-celleepitoper fra anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 19) og anti-CD3 (VH7/VL2) (SEQ ID NR.: 25). Det faktum at rundt 75 % av MHC bindingspeptidene fra den ikke-deimmuni serte anti-CD3 sekvens ikke induserte T-celleproliferering kan forklares enten ved toleranse i det humane immunsystem mot disse peptider eller en manglende evne hos det humane T-cellerepertoar å gjenkjenne disse spesielle peptider.

Eksempel 7. Homologiinnretning av anti-CD3 (VH5), anti-CD3 (VH7), anti-CD3 (VH2) og anti-CD3 (VH3) med ikke-deimmunisert anti-CD3 VH

Det variable tunge området av det ikke-deimmuni serte CD3 antistoff, VH5 (SEQ ID NR.: 74), VH7 (SEQ ID NR.: 76), VH2 (SEQ ID NR.: 70) og VH3 (SEQ ID NR.: 72), ble rettet inn ved bruk av AlingnX programmet fra Vector NTI Advance (Imformax, Inc., USA), den klustale W algoritme som ble benyttet er beskrevet i Nucleic Acid Research, 22 (22): 4673-4860, 1994. Innretningen er vist i figur 14. Fra denne innretning kan man se at de variable områder VH5 og VH7, som viser overraskende god binding, har sekvensen ASGYTF i overgangsområdet fra rammeverk 1 til CDR1. Videre viser VH-områdene ingen binding (VH2 (SEQ ID NR.: 70) og VH3 (SEQ ID NR.: 72) omfatter sekvensen ASGYTA ved overgangen fra rammeverk 1 til CDR1. For således å oppnå et konstrukt med redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper og binding til CD3 må konstruktet omfatte sekvensen ASGYTF ved overgangen fra rammeverk 1 til CDR1. Overraskende viser de variable, tunge områder som binder til CD3 og viser redusert tilbøyelighet til å generere T-celleepitoper omfattende den ovenfor nevnte sekvens ASGYTF, god binding.

Eksempel 8. Kloning av konstrukter omfattende deimmunisert anti-CD3 og anti-EpCAM

For å vise at det deimmuniserte anti-CD3 polypeptid ifølge oppfinnelsen kan være en del av et funksjonelt konstrukt med andre mål ble det generert et antall bi-spesifikke konstrukter omfattende deimmuniserte anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 19) og forskjellige anti-EpCAM enkeltkjedeantistoffer (3-1 (SEQ ID NR.: 137, 139), 3-5 (SEQ ID NR.: 141, 143), 4-1 (SEQ ID NR.: 145, 147), 4-7 (SEQ ID NR.: 149, 151), 5-10 (SEQ ID NR.: 133, 135)).

8.1 Kloning av C-terminale EpCAM bindere omfattende deimmunisert anti-CD3 del (SEQ ID NR.: 30,31,32,33,34,35,36,37,38 og 39)

8.1.1 Forsterkning av den deimmuniserte anti-CD3 fra anti-CD19xanti-CD3 (VH5/VL2) konstrukt (SEQ ID NR.: 192)

Den N-terminale deimmuniserte anti-CD3(VH5/VL2) ble oppnådd ved PCR ved bruk av deimmunisert (CD 19 x anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 192) som templat og de følgende primere (DI CD3 5-2 VH BsrGI

8.1.2 Kloning og ekspresjon av de deimmuniserte anti-CD3xanti-EpCAM deimmuniserte konstrukter i VHcd3-VLcd3x VHepcamorientering Det ovenfor nevnte PCR produkt inneholdende det deimmuniserte anti-CD3 ble spaltet med restriksjonsenzymene BsrGI og BspEl og deretter klonet inn i bluescript KS vektoren (Stratagene, La Jolla, CA), innholdende aminosyresekvensen av et eukaryotisk sekresjonssignal (lederpeptid) som et EcoRJ/BsrGI-fragment. Etter spalting av dette konstrukt med EcoRI og BspEl ble det resulterende DNA fragment omfattende den respektive anti-CD3 scFv med lederpeptidet klonet inn i et EcoRJ/BspEI spaltet plasmid inneholdende anti EpCAM scFv 3-1, 4-7 eller 5-10 i den C-terminale del i pEF-DHFR-vektoren. Etter bekreftelse av sekvensen som koder for den bispesifikke enkeltkjede ved sekvensering (Sequiserve, Vaterstetten) ble plasmidet transfektert inn i DHFR defiktive CHO celler for eukaryotisk ekspresjon. Eukaryotisk proteinekspresjon i DHFR defiktive CHO celler ble gjennomført som beskrevet av R. J. Kaufmann (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566). 8.1.3. Kloning og ekspresjon av de deimmuniserte anti-CD3xanti-EpCAM konstrukter i VHcd3-VLcd3x VLepcam-VHepcamorientering Anti-EpCAM 4-7 i VL-VH orientering inneholdende 15 aminosyrestandardlinkeren (SEQ JD NR.: 168) ble oppnådd ved PCR. 4-7 VH-området og 4-7 VL-området ble separat amplifisert ved hjelp av de følgende primere:

4-7 VH Sali REV TTTTAAGTCGACCTAATGATGATGAT-GATGATGTGAGGAGACGGTGACCGTGG (SEQ ID NR.: 43). Overlappende, komplementære sekvenser som ble innført i PCR produktene ble benyttet for å danne kodingssekvensen av en 15. aminosyre (G4S1P (enkelt-bokstav aminosyrekode) linker (standardlinker) (SEQ ID NR.: 168) ved bruk av den etterfølgende fusjons-PCR. Dette forsterkningstrinnet ble gjennomført med primerparet 4-7 VL BspEl FOR og 4-7 VH Sali REV (SEQ ID NR.: 42 og 43).

Anti-EpCAM 5-10 i VL-VH orientering inneholdende 15. aminosyrestandarden ((G4Si)3) linkeren ble oppnådd ved PCR. 5-10 VH-området og 5-10 VL-området ble separat amplifisert ved bruk av de følgende primere:

5-10 VH Sali REV

TTTTAAGTCGACCTAATGATGATGATGATGATGTGAGGAGACGGTGACCGT

GG (SEQ ID NR.: 47). Overlappende komplementære sekvenser som innført i PCR produktene ble benyttet for å danne kodingssekvensen av en 15. aminosyre (G4SO3(enkeltbokstavaminosyrekode) linker (standardlinker) (SEQ ID NR.: 168) under den etterfølgende fusjons-PCR. Forsterkningstrinnet ble gjennomført med primerparet 5-10 VL BspEl FOR og 5-10 VH Sali REV.

PCR produktene 5-10 VL-VH og4-7 VL-VH ble klonet inn i pEF-DHFR vektoren omfattende anti-CD3 konstruktet (VH5/VL). Etter bekreftelse av sekvensen som koder for den bi-spesifikke enkeltkjede ved sekvensering ble plasmidet transfektert til DHFR defiktive CHO celler for eukaryotisk ekspresjon. Eukaryotisk proteinekspresjon i DHFR defiktive CHO celler ble gjennomført som beskrevet hos RJ. Kaufmann (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566).

8.1.4. Binding av de deimmuniserte anti-CD3xanti-EpCAM konstrukter til EpCAM og CD3

Binding av de bi-spesifikke enkeltkjedemolekyler med anti-CD3 del i N-terminal orientering til EpCAM og CD3 ble bekreftet ved FACS analyser. For dette formål benyttet man den EpCAM positive humangastriske cancer cellelinje Kato III (ATCC HTB-103). Binding av anti-CD3 delen ble påvist på Jurkatceller (ATCC TJB152).

Celler ble dyrket i henhold til leverandørens anbefaling og et antall på 200 000 celler ble inkubert med 10 ug/ml av konstruktet i 50 ul PBS med 2 % FCS (føtalkalveserum). Binding av konstruktet ble detektert med et anti-His antistoff (Penta-His antistoff, oppnådd fra Qiagen, Hilden, Tyskland) i en mengde på 2 ug/ml i PBS med 2 % FCS. Som et andre trinn ble det benyttet R-fykoerytrin-konjugert affinitetsrenset F(ab')2avledet fra geiteanti-muse IgG, fortynnet 1:100 i 50 ul PBS med 2 % FCS (Dianova, Hamburg, Tyskland). Prøvene ble målt på en FACS scan (BD biosciences, Heidelberg, Tyskland).

Resultatene av FACS analysen er vist i figur 15. Alle konstrukter omfattende deimmunisert anti-CD3 del viser sterkere binding enn det ikke-deimmuni serte anti-EpCAM (M79)xanti-CD3 bi-spesifikke enkeltkjedeantistoff på EpCAM positive KatoIJJ celler.

8.2 Kloning av N-terminale EpCAM bindere omfattende deimmunisert anti-CD3 del

8.2.1 Kloning av anti-EpCAM x anti-CD3 konstrukter

8.2.1.1 Kloning av deimmunisert 3-lxanti-CD3 (VH5/VL2) konstrukt (SEQ ID NR.: 48, 49): Deimmunisert konstrukt 3-lxanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 48) ble avledet fra ikke-deimmunisert konstrukt anti-EpCAM (3-1) xanti-CD3. VH- og VL-områdene av anti-EpCAM antistoff 3-1 er vist i SEQ ID NR.: 137 og 139. Plasmidene pEF-DHFR-3-lx anti-CD3 og pEFanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 192) ble kuttet med BspEl og Sali (Biolabs) for isolering av vektoren og innskuddet anti-CD3 (VH5/VL2). Den BspEI-Sall-kuttede vektoren ble defosforylert og renset på 0,7 % agarosegel mens innskuddet ble renset på 1,5 % agarosegel.

Det rensede fragment (BspEI-Sall) ble deretter klonet inn i de tilsvarende seter på pEF-DHFR vektoren. Det endelige 3-1 xanti-CD3 (VH5/VL2) konstrukt (SEQ ID NR.: 48, 49) ble verifisert ved restriksjonsdigestering og ved DNA sekvensering for hele innskuddet.

Kloning av det ikke-deimmuniserte 3-lxanti-CD3 konstrukt:

For kloning av det 3-lxanti-CD3 (VH5/VL2) konstrukt ble det følgende, ikke-deimmuniserte konstrukt generert som følger.

Den C-terminale 3-1 i VH-VL orientering ble oppnådd ved PCR for konstruksjon av ikke-deimmunisert 3-1 x anti-CD3 molekyl. Fragmentene I og II omfattende 3-1 VH-VL i to deler ble amplifisert ved PCR ved bruk av primerparene me 91a (SEQ ID NR.: 53) /me 90 (SEQ ID NR.: 52) og me 83 (SEQ ID NR.: 50) /me 84 (SEQ ID NR.: 51). Varm start PCR ble foretatt ved bruk av "Expand High Fidelity System" fra Roche Diagnostics. 20 sykler (94 °C/30 s; 60 °C/1 min; 72 °C/1 min) ble benyttet for forsterkning fulgt av en syklus på 3 min ved 72 °C.

PCR fragmentene I og II ble underkastet elektroforese på en 1,5 % agarosegel. Fragmenter ble blandet (1 ng av hver) og benyttet som templat for den neste PCR reaksjon gjennomført med primerparet me 91a (SEQ ID NR.: 53) og me 84 (SEQ ID NR.: 51) for forsterkning av fragment HI omfattende hele 3-1. PCR ble gjennomført som beskrevet ovenfor men med en anneleringstemperatur på 68 °C. Fragment III ble renset på en agarosegel og kuttet med BsrGI og BspEl (Biolabs), renset og deretter klonet inn i de tilsvarende seter av pEF-DHFR-anti EpCAM (M79) X anti-CD3 konstrukt. Det klonede området ble verifisert ved restriksjonsdigester og ved DANN-sekvensering.

Sekvenser av de benyttede primere:

8.2.1.2 Kloning av deimmunisert 3-5xanti-CD3 (VH5/VL2) konstrukt (SEQ ID NR.: 54, 55)

Den C-terminale 3-5 i VH-VL orientering ble oppnådd ved PCR for konstruksjon av 3-5 xanti-CD3 molekylet. VH- og VL-områdene av anti-EpCAM antistoffet 3-5 er vist i SEQ ID NR.: 141 og 143. Plasmidene pEF-DHFR-3-5-xanti-CD3 og pEF anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 192) ble kuttet med EcoRI og BspEl (Biolabs) for isolering av innskuddet (3-5) og henholdsvis vektoren. Den defosforylerte vektor (EcoRI og BspEl kuttet) og innskuddet, ble renset ved agarosegel-elektroforese.

Det rensede fragment (EcoRI-BspEI) ble deretter klonet inn i de tilsvarende seter av pEF-DHFR vektoren. Det endelige 3-5xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 54) konstrukt ble verifisert ved restriksjonsdigestering.

Kloning av det ikke-deimmuniserte 3-5xanti-CD3 konstrukt:

For kloning av 3-5xanti-CD3 (VH5/VL2) konstruktet ble det tilsvarende ikke-deimmuniserte konstrukt generert som følger.

Fragmentene I og II omfattende 3-5 i to deler ble amplifisert ved PCR i henhold til de betingelser som er beskrevet for 3-lxanti-CD3 ved bruk av primerparene me 81 (SEQ ID NR.: 56) /me 90 (SEQ ID NR.: 52) og me 83 (SEQ ID NR.: 50) /me 84 (SEQ ID NR.: 51). Agarosegelfragmenter omfattende PCR fragmenter I og II ble reamplifisert med primerparet me 81 (SEQ ID NR.: 56) og me 84 (SEQ ID NR.: 51) for forsterkning av fragment TH omfattende hele 3-5. PCR ble gjennomført som beskrevet ovenfor. Fragment in ble renset på en agarosegel og kuttet med BssHII og BspEl (Biolabs), renset og deretter klonet inn i de tilsvarende seter av pEF-DHFR kloningsvektoren. Det klonede området ble verifisert ved restriksjonsdigester og ved DNA-sekvensering.

Sekvens for Me81 primeren (SEQ ID NR.: 56):

8.2.1.3 Kloning av det deimmuniserte 4-lxanti-CD3 (VH5/VL2) konstrukt (SEQ ID NR.: 57, 58): C-terminal 4-1 i VH-VL orientering ble oppnådd ved PCR for konstrukj son av 4-lxanti-CD3 molekyl. VH- og VL-områdene av anti-EpCAM antistoff 4-1 er vist i SEQ ID NR.: 145 og 147. Plasmidene pEF-DHFR-4-1 xanti-CD3 og pEF anti-CD3 (VH5/VL2)

(SEQ ID NR.: 192) ble kuttet med EcoRI ogBspEI (Biolabs) for isolering av innskuddet (4-1) og henholdsvis vektoren. Den defosforylerte vektor (EcoRI ogBspEI kuttet) og innskuddet ble renset ved agarosegel-elektroforese.

Det rensede fragment (EcoRI-BspEI) ble deretter klonet inn i de tilsvarende seter i vektoren. Sluttkonstruktet 4-lxanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 57) ble verifisert ved restriksjonsdigestering.

Kloning av det ikke-deimmuniserte 4-lxanti-CD3 konstrukt:

For kloning av 4-lxanti-CD3(VH5/VL2) konstruktet ble det tilsvarende ikke-deimmuniserte konstrukt generert som følger.

Fragmenter I og II omfattende 4-1 i to deler ble amplifisert ved PCR ved bruk av primerparet me 91a (SEQ ID NR.: 53) /me 90 (SEQ ID NR.: 452) og me 83 (SEQ ID NR.: 50) /me 84 (SEQ ID NR.: 51) med de ovenfor nevnte betingelser.

Agarosegelfragmenter omfattende PCR fragmentene I og II ble reamplifisertamplifisert med primerpar me 92a (SEQ ID NR.: 59) og me 84 (SEQ ID NR.: 51) for forsterkning av fragment m omfattende hele 4-1. PCR ble gjennomført som beskrevet ovenfor men annelering ble gjennomført ved 86 °C. Fragment III ble renset på en agarosegel og kuttet med BsrGI og BspEl (Biolabs), renset og deretter klonet inn i de tilsvarende seter av pEF-DHFR-anti EpCAM (M79) X anti-CD3 kloningsvektorkonstruktet. Det klonede området ble verifisert ved restriksjonsdigestering og ved DNA sekvensering.

Sekvens av Me92a primer (SEQ ID NR.: 59):

8.1.2.4 Kloning av det deimmuniserte 4-7xanti-CD3 (VH5/VL2) konstrukt (SEQ ID NR.: 60, 61): Den C-terminale 4-7 i VH-VL orientering ble oppnådd ved PCR for konstruksjon av 4-7 xanti-CD3. VH- og VL områdende av anti-EpCAM antistoff 4-7 er vist i SEQ ID NR.: 149 og 151. Plasmidene pEF-DHFR-4-7xanti-CD3 og pEF anti-CD3 VH5/VL2 (SEQ ID NR.: 192) ble kuttet med EcoRI og BspEl (Biolabs) for isolering av innskuddet (4-7) og henholdsvis vektoren. Den defosforylerte vektor (EcoRI og BspEl kuttet) og innskuddet ble renset ved agarosegel-elektroforese.

Det rensede fragment (EcoRI-BspEI) ble deretter klonet inn i tilsvarende seter av pEF-DHFR vektoren. Sluttkonstruktet 4-7xanti-CD3(VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 60) ble verifisert ved restriksjonsdigestering.

Kloning av det ikke-deimmuniserte konstrukt 4-7 xanti-CD3:

For kloning av 4-7xanti-CD3 (VH5/VL2) konstruktet ble det tilsvarende ikke-deimmuniserte konstrukt generert som følger.

Fragmentene I og II omfattende 4-7 i to deler ble amplifisert ved PCR ved bruk av primerparet me 81 (SEQ ID NR.: 56) /me 90 (SEQ ID NR.: 52) og me 83 (SEQ ID NR.: 50) /me 84 (SEQ ID NR.: 51) under de ovenfor angitte betingelser.

Agarosegelfragmenter omfattende PCR fragmentene I og II ble reamplifisert med primerparet me 81 (SEQ ID NR.: 56) og me 84 (SEQ ID NR.: 51) for forsterkning av fragment HI omfattende hele 4-7 VH- og VL kjeden. PCR ble gjennomført som beskrevet ovenfor. Fragment in ble renset på en agarosegel og kuttet med BssHII og BspEl (Biolabs), renset og deretter klonet inn i de tilsvarende seter av pEF-DHFR kloningsvektoren. Det klonede området ble verifisert ved restriksjonsdigestering og ved DNA-sekvensering.

8.1.2.5 Kloning av deimmunisert 5-10x anti-CD3 (VH5/VL2) konstrukt (SEQ ID NR.: 62, 63): C-terminale 5-10 i VH-VL orientering ble oppnådd ved PCR for konstruksjon av 5-10 xanti-CD3 molekylet. VH- og VL-områdene av anti-EpCAM antistoffet 5-10 er vist i SEQ ID NR.: 133 og 135. Plasmidene pEF-DHFR-5-10xanti-CD3 og pEF anti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 192) ble kuttet med EcoRI og BspEl (Biolabs) for isolering av innskuddet (5-10) og henholdsvis vektoren. Den defosforylerte vektor (EcoRI og BspEl kuttet) og innskuddet ble renset ved agarosegel elektroforese.

Det rensede fragment (EcoRI-BspEI) ble deretter klonet inn i de tilsvarende seter av pEF-DHFR vektoren. Sluttkonstruktet 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 62) ble verifisert ved restriksjonsdigestering og ved DNA sekvensering.

Kloning av det ikke-deimmuniserte 5-10xanti-CD3 konstrukt:

For kloning av 5-10xanti-CD3(VH5/VL2) konstruktet ble det følgende, ikke-deimmuniserte konstrukt generert som følger.

Fragmenter I og II omfattende 5-10 i to deler ble amplifisert ved PCR ved bruk av primerparene me 92a (SEQ ID NR.: 59) /me 90 (SEQ ID NR.: 52) og me 83 (SEQ ID NR.: 50) /me 84 (SEQ ID NR.: 51) under de ovenfor angitte betingelser. Agarosegelfragm enter omfattende PCR fragmentene I og II ble reamplifisert med primerparene 92a SEQ ID NR.: 59) og me 84 (SEQ ID NR.: 51)for forsterkning av fragmentet HI omfattende hele 5-10. PCR ble gjennomført som beskrevet ovenfor men anneleringen ble gjennomført ved 68 °C. Fragment HI ble renset på en agarosegel og kuttet med BsrGI og BspEl (Biolabs), renset og deretter klonet inn i de tilsvarende seter av pEF-DFIFR-anti EpCAM (M79) x anti-CD3 kloningsvektoren. Det klonede området ble verifisert ved restriksjonsdigestering og ved DNA-sekvensering.

8.2.2 Ekspresjon av anti EpCAMxdeimmunisert-anti-CD3 molekyler med anti-EpCAM i N-terminal posisjon: CHO-celler som mangler DFIFR genet ble holdt i a MEM medium (Life Technologies, kat. nr. 32561) supplert med 10 % føtal kalveserum (Life Technologies, varmeinaktivert ved 65 °C i 30 min) og med HT (Hypoxantin og Tymidin; Life Technologies). Cellene ble transfektert med pEF-DHFR-3-1 xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 48) og pEF-DHFR-5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 62) ved bruk av Lipofectamine 2000 kit® (Invitrogen) i henhold til de instruksjoner som er gitt av produsenten. Etter 48 timer ble seleksjon gjennomført i seleksjonsmedium (a MEM medium inneholdende varmeinaktivert 10 % dialysert føtalkalveserum (Life Technologies)). Etter 3-4 uker ble cellekultursupernatant samlet og sentrifugert ved 4 °C i 10 min ved 300 g for å fjerne celler og celledebris. Supernatanten inneholdende det bi-spesifikke antistoff ble lagret ved -20 °C til ytterligere analyse.

8.2.3 Bindingsanalyser av bi-spesifikke anti-EpCAMxanti-CD3 varianter:

250 000 Jurkatceller (for CD3 binding) og Kato celler (for EpCAM binding) ble uavhengig inkubert med cellekultursupernatanter (50 ul) inneholdende det bi-spesifikke konstrukt (pEF-DHFR-3-l-xanti-CD3 (VH5/VL2) (Nr. 50, SEQ JD NR.: 48) og pEF-DHFR-5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (Nr. 54) (SEQ JD NR.: 62) i 45 min ved 4 °C. Deretter ble cellene vasket to ganger i FACS buffer (fosfatbufret saltoppløsning inneholdende 1 % føtalkalveserum (FCS) og 0,05 % natriumazid) og inkubert med muse anti-His antistoff (Dianova, DIA910) i 60 min ved 4 °C. Vasketrinnene ble gjennomført som ovenfor. Cellene ble til slutt inkubert enten med geite anti-muse Ig-FITC konjugert antistoff (BD 550003) eller med anti-muse IgG konjugert med PE (Sigma, P8547). Etter vasketrinnene ble 10 000 hendelser analysert ved bruk av FACS Calibur (B&D). Resultatene av bindingsanalysene er vist i figur 16. Konstruktene 3-lxanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ JD NR.: 49) og 5-10xanti-CD3 (SEQ JD NR.: 63) viste sterk binding til CD3 på Jurkatceller og til CD 19 på Katoceller.

Eksempel 8.3 Rensing av bi-spesifikke anti EpCAM konstrukter med deimmunisert anti-CD3 del

Konstruktene omfattende et deimmunisert anti-CD3 område og et EpCAM-spesifikt område ble renset med en to-trinnsrenseprosess som inkludert immobiliserte metallaffinitetskromatografi (IMAC) og gelfiltrering. Metallaffinitetskromatografi (IMAC) og gelfiltrering ble gjennomført som vist i eksempel 3.2.

En ytterligere høy oppløsningskationsbyttekromatografi ble gjennomført på en MiniS kolonne (Amersham), ekvilibrert med 20 mM MES buffer pH 5,5. Prøven ble fortynnet 1:3 med den samme buffer før lasting på kolonnen. Bundet protein ble eluert med en 0-30 % gradient av 1 M NaCl i ekvilibreringsbuffer. De eluerte proteinfraksjoner ble testet i bioaktivitetsanalysen. Tabell 14 viser utbyttene av de rensede, deimmuniserte EpCAM konstrukter. Alle konstruktene kunne produseres effektivt. Overraskende hadde konstrukt 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) (SEQ ID NR.: 63) et ekstremt godt utbytte på 2 200 ug/ml.

Eksempel 8.4 Cytotoksiske analyser av bi-spesifikke anti-EpCAM konstrukter med deimmunisert anti-CD3 del

For å bekrefte den høye bioaktivitet for de bi-spesifikke antistoffer ifølge oppfinnelsen ble det gjennomført en FACS basert analyse. CHO celler ble transfektert med epitelcelleadhesjonsmolekyl (EpCAM). En celleklon avledet fra denne transfeksjon, angitt som CHO-EpCAM celler, ble benyttet for forsøkene.

For cytotoksisitetstesten ble CHO-EpCAM (1,5 x IO<7>) celler vasket frie for serum to ganger med PBS og inkubert med PKH26 fargestoff (Sigma-Aldrich Co.) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter farging ble cellene vasket to ganger med RPMI/10 %

FCS.

Cellene ble talt og blandet med CB15 effektorceller. Den CD4-positive T-celleklon CB15 ble velvillig stilt til disposisjon av Dr. Fickenscher, Universitet i Erlangen/Nuernberg, Tyskland. Cellene ble dyrket som anbefalt av leverandørene. Den resulterende cellesuspensjon inneholdt 400 000 mål og 2 x IO<6>effektorceller per ml. 50 ul av blandingen ble benyttet per brønn i en 96 brønners rundbunnplate.

Antistoffer ble fortynnet i RPMJ/10 % FCS til en ønsket konsentrasjon og 50 ul av denne oppløsning ble satt til cellesuspensjonen. En standardreaksjon ble inkubert i 16 timer ved 37 °C/ 5 % CO2. Propidiumiodid ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 ug/ml. Etter 10 min inkubering ved romtemperatur ble cellene analysert ved FACS. PKH26 fluoressens ble benyttet for positiv identifisering av målceller. Cytotoksisitet ble målt som forholdet mellom PI positive celler over alle målceller.

Sigmoidale doseresponskurver hadde typisk R2 verdier > 0,97 som bestemt ved hjelp av Prism Software (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Resultatene av de cytotoksiske analyser er vist i figur 17 og 18.

Eksempel 8.5 Sammenlikning av produktiviteten av bi-spesifikke molekyler omfattende en EpCAM bindingsdel og en deimmunisert CD3 bindingsdel i CHO celler

For å bestemme produktiviteten for et deimmunisert konstruktprotein L ble ELISA gjennomført. Produktivitetsdata ble beregnet fra satskulturer.

8.5.1 Cellekultur

CHO cellelinjer som produserer deimmunisert (CHO-DHFR-) og ikke-deimmunisert (CHO-DHFR- eller CHO-K1) ble dyrket i HyQ PF CHO LS medium + 4 mM L-glutamin i en CO2inkubator ved 37 °C og 5 % CO2. Celletallet og levedyktigheten ble bestemt ved bruk av Trypan Blue. Celledensiteten ble satt til 1-2 x 10<5>celler/ml.

Celler ble overført til spinnerflasker og så justert til betingelser for en omrørt kultur. Driftsparameterinnstillingene var 80 omdreininger per min, 37 °C og 5 % CO2med gass i en CO2inkubator. Cellevolumet var i 100-500 ml område og celledensiteten ved inokulering i området 1-2 x 10<5>celler/ml. Når det gjelder subdyrking i T-flasker ble kulturene sentrifugert og resuspendert i friskt, forvarmet medium ved hver passasje. Celledensiteten ble satt til 1-2 x 10<5>celler/ml.

For analyse av produktivitetsdata (tabell 15) ble celler dyrket opptil 14 dager (d) uten mediumtilsetning eller bytting. Celletallene og levedyktigheten ble bestemt daglig ved bruk av Trypan blåfarging. Produktkonsentrasj onene i supernatanten ble analysert ved Protein L ELISA.

8.5.2 Protein L ELISA

Kvantitativ binding av de bi-spesifikke molekyler ble gjennomført med rProtein L-belagte mikrotiterpklater. rProtein L er en rekombinant form av det immunoglobulin-bindende protein L, produsert av Peptostreptococcus magnus. Det har fire bindende domener og binder immunoglobulin via den lette kjede (k). Bi-spesifikke molekyler som inneholder variable domener fra to forskjellige lette kjeder respektivt opphavsantistoffer, bindes også av rProtein L.

Mikrotiterplater ble belagt med rProtein L i PBS buffer (2 ug rProtein L/ml PBS buffer) over natten ved 2-8 °C. Etter belegning ble gjenværende adsorpsjonsseter blokkert med blokkeringsbuffer (2 % BSA i PBS buffer). Deretter ble platene frosset og lagret ved

< 18 °C. Før bruk ble platene tint og vasket med vaskebuffer (0,05 % Tween 20 i PBS buffer) for å fjerne blanding av beleggsoppløsning og blokkeringsbuffer.

Seriefortynninger av cellefri cellekultursupernatant i 1 % BSA + 0,01 % Tween 20 i PBS (fortynningsbuffer) ble analysert. Bi-spesifikt anti-EpCAM (M79)xanti-CD3 ble benyttet som positiv kontroll i sammenliknbare fortynninger.

lukuberingen ble gjennomført over natten ved 2-8 °C.

Etter vasking ble kanin anti-muse IgG (1:5 000 i fortynningsbuffer) tilsatt og inkubert i 60 min ved romtemperatur. Geite anti-kanin IgG merket med alkalisk fosfatase ble tilsatt (1: 1 000 i fortynningsbuffer; 60 min ved romtemperatur) etter vasking. pNPP substratoppløsning ble tilsatt og reaksjonen stanset ved tilsetning av 3 M NaOH. Absorbansen ble målt med en ELISA leser ved 405 nm (referansefilter 492 nm). Således viser oppfinnelsens 5-10xanti-CD3 (VH5/VL2) konstrukt meget høyere spesifikk produktivitet (minst fem ganger høyere) enn den kjente teknikks bi-spesifikke, ikke-deimmuniserte EpCAM- og CD3 bindingsantistoff.

Claims

1. Cytotoksisk aktivt CD3 spesifikt bindingskonstrukt,karakterisert vedat det omfatter et første domene som spesifikt binder til human CD3 og et Ig-avledet andre bindingsdomene der nevnte første domene er deimmunisert og omfatter et CDR-H 1 område som omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NR.: 88, et CDR-H2 område som omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NR.: 90 eller 92 og et CDR-H3 område som omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEQ ID NR.: 96, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 eller 127; og der nevnte første domene i sitt rammeverk Hl ytterligere omfatter sekvensen VKK og der overgangssekvensen mellom rammeverk Hl og CDRHl området omfatter sekvensen Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe (ASGYTF; SEQ ID NR.: 233)

2. Cytotoksisk aktivt CD3 spesifikk bindingskonstrukt i følge krav 1 ,karakterisert vedat det ytterligere omfatter i nevnte første domene et rammeverk H3 som omfatter sekvensen Met-Glu-Leu-Ser (MELS; SEQ ID NR.: 234).

3. Cytotoksisk aktivt CD3 spesifikk bindingskonstrukt i følge krav 1 eller 2 ,karakterisert vedat det ytterligere omfatter i nevnte første domene et rammeverk H3 som omfatter sekvensen Ue-Thr-Thr-Asp-Lys (ITTDK; SEQ ID NR: 235).

4. CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat nevnte første domene som spesifikt binder til human CD3 omfatter et rammeverk Hl som vist i SEQ ID NR.: 152 eller 153.

5. CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4,karakterisert vedat nevnte første domene som spesifikt binder til humant CD3 omfatter et rammeverk H2 som vist i SEQ ID NR.: 156 eller 157.

6. CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5,karakterisert vedat nevnte første domene som spesifikt binder til humant CD3 omfatter et rammeverk Hl som vist i SEQ ID NR.: 160 eller 161.

7. CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6,karakterisert vedat nevnte første domene som spesifikt binder til humant CD3 omfatter rammeverk H4 som vist i SEQ ID NR.: 164 eller 165.

8. CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7,karakterisert vedat nevnte konstrukt omfatter en Vh-område som angitt i SEQ ID NO.:74 or 76.

9. CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8,karakterisert vedat nevnte konstrukt omfatter en CDR-L1 som angitt i SEQ ID NR.: 98 or 100.

10. CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9,karakterisert vedat nevnte konstrukt omfatter en CDR-L2 som angitt i SEQ ID NR.: 102.

11. CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 10,karakterisert vedat nevnte konstrukt omfatter en CDR-L3 som angitt i SEQ ID NR.: 104.

12. CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11,karakterisert vedat det omfatter et Vlområde i sin CD3-spesifikke del, der nevnte Vl område er valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NR.: 78, SEQ ID NR: 80, SEQ ID NR: 82 og SEQ ID NR.: 112.

13. CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12,karakterisert vedat nevnte Ig-avledede andre område er et scFv.

14. CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13,karakterisert vedat nevnte Ig-avledede, andre domene og/eller forbindende linkerområde(r) er humanisert og/eller deimmunisert.

15. CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14,karakterisert vedat nevnte Ig-avledede, andre domene omfatter et antigeninteraksjonssete med spesifisitet for et celleoverflatemolekyl.

16. CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge krav 15,karakterisertv e d at nevnte celleoverflatemolekyl er en tumorspesifikk markør.

17. CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 16,karakterisert vedat nevnte Ig-avledede, andre bindingsdomene omfatter et antigeninteraksjonssete med en spesifisitet for EpCAM.

18. CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge krav 17,karakterisertv e d at nevnte CD3-spesifikke bindingskonstrukt omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: (a) an aminosyresekvens som vist i en hvilken som helst av SEQ ID NR.: 31, 33, 35, 37, 39, 49, 55, 58, 61, 63, 65, 67, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317,319, 321, 323 og 325; (b) en aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som vist i en hvilken som helst av SEQ ID NR.: 30, 32, 34, 36, 38, 48, 54, 57, 60, 62, 64, 66, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 og 324; og (c) en aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som er degenerert som et resultat av den genetiske kode til en nukleotidsekvens ifølge (b); (d) en aminosyresekvens kodet av en nukleinsyresekvens som hybridiserer med den komplementære tråd av en nukleinsyresekvens som angitt under (b) under stringente hybridiseringsbetingelser.

19. Nukleinsyresekvenskarakterisert vedat den koder for et CD3 spesifikt bindingskonstrukt i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 18.

20. Vektor,karakterisert vedat den omfatter en nukleinsyresekvens ifølge krav 19.

21. Vektor ifølge krav 20,karakterisert vedat den videre omfatter en nukleinsyresekvens som er en regulatorisk sekvens, operativt forbundet med nevnte nukleinsyresekvens ifølge krav 19.

22. Vektor ifølge krav 20 eller 21,karakterisert vedat vektoren er en ekspresjonsvektor.

23. En vert,karakterisert vedat den er transformert eller transfektert med en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 20 til 22.

24. Fremgangsmåte for fremstilling av et CD3-spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 18,karakterisert vedat den omfatter dyrking av en vert ifølge krav 23 under betingelser som tillater ekspresjon av polypeptidkonstruktet og gjenvinning av det produserte polypeptidkonstrukt fra kulturen.

25. Sammensetning,karakterisert vedat det omfatter et CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 18 eller som fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 24, et nukleinsyremolekyl ifølge krav 19, en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 20 til 22 eller en vert ifølge krav 23, og eventuelt en proteinøs forbindelse i stand til å gi et aktiveringssignal for immune effektorceller.

26. Sammensetning ifølge krav 25,karakterisert vedat det er en farmasøytisk sammensetning som videre eventuelt omfatter egnede formuleringer av bærere, stabilisatorer og/eller eksipienter.

27. Sammensetning ifølge krav 25,karakterisert vedat den er en diagnostisk sammensetning som videre eventuelt omfatter midler og fremgangsmåter for detektering.

28. Anvendelse av et CD3-spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 18 eller som fremstilt ved fremgangsmåten i krav 24, et nukleinsyremolekyl ifølge krav 19, en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 20 til 22, eller en vert ifølge krav 23 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for forebygging, terapi eller lindring av en proliferativ sykdom, en tumorøs sykdom, en inflammatorisk sykdom, en immunologisk forstyrrelse, en autoimmun sykdom, en infeksiøs sykdom, viral sykdom, allergiske reaksjoner, parasittiske reaksjoner, graft-versus-vert sykdommer eller vert-versus-graft sykdommer.

29. Anvendelse i følge krav 28, der den farmasøytiske sammensetningen blir adminstrert samtidig eller ikke samtidig med en proteinøs forbindelse i stand til å tilveiebringe et aktivieringssignal for immune effektor celler.

30. Farmasøytisk sammensetningkarakterisert vedat den omfatter et CD3 spesifikt bindingskonstrukt i henhold til et hvilket som helst av kravene 1 til 18 eller som fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 24, et nukleinsyremolekyl ifølge krav 19, en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 20 til 22 eller en vert ifølge krav 23, for forebygging, terapi eller lindring av en proliferativ sykdom, en tumorøs sykdom, en inflammatorisk sykdom, en immunologisk forstyrrelse, en autoimmun sykdom, en infektiøs sykdom, viral sykdom, allergiske reaksjoner, parasittiske reaksjoner, graft-versus-vert sykdommer eller vert-versus-graft sykdommer.

31. Farmasøytisk sammensetning i følge krav 30,karakterisertv e d at den farmasøytiske sammensetningen blir adminstrert samtidig eller ikke samtidig med en proteinøs forbindelse i stand til å tilveiebringe et aktiveringssignal for immune effektor celler.

32. Kit,karakterisert vedat det omfatter et CD3 spesifikt bindingskonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 18 eller er som fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 24, et nukleinsyremolekyl ifølge krav 19, en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 20 til 22 eller en vert ifølge krav 23.