DE19962583A1

DE19962583A1 - Antikörper gegen Plasmazellen

Info

Publication number: DE19962583A1
Application number: DE19962583A
Authority: DE
Inventors: Hans Konrad Mueller-Hermelink; Axel Greiner
Original assignee: MUELLER HERMELINK HANS KONRAD
Current assignee: MUELLER HERMELINK HANS KONRAD
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2001-06-28
Also published as: WO2001047953A3; US20030180799A1; WO2001047953A2; JP2004500070A; CA2394295A1; AU2369101A; EP1261627A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung eines Antikörpers sowie auf einen Antikörper, wie er in der Therapie von Auto-Immunkrankheiten oder Tumoren wie Plasmazytomen oder Lymphomen verwendet werden kann. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird zur Herstellung eines Antikörpers gegen reife Plasmazellen gerade nicht mit dem gewünschten Antigen, nämlich den Plasmazellen, geimpft, sondern mit deren Vorstadien. Hierdurch werden Antikörper gewonnen, die dennoch spezifisch reife Plasmazellen markieren, ohne die jeweiligen Vorläuferstadien zu markieren. Ein derartig hergestellter Antikörper wird angegeben.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung eines Antikörpers, auf einen Antikörper, auf Gene, die derartige Antikörper kodieren, auf Antigene, das durch einen derartigen Antikörper markiert werden, weitere Antikörper und Verfahren zu deren Herstellung, die gegen die genannten Antigen gerichtet sind, sowie auf Verwendungen derartiger Antikörper.

Derartige Antikörper werden insbesondere im Bereich der biologischen und medizinischen Diagnostik sowie in der Therapie von Autoimmunkrankheiten oder Tumoren wie Plasmazytomen oder Lymphomen, benötigt.

In tierischen Organismen und auch in Menschen erfolgt die Reaktion des Immunsystems auf Stimuli (Antigene) in zwei verschiedenen Weisen. Zum einen erfolgt eine humorale Immunantwort, bei der Antikörper von Plasmazellen (ausdifferenzierte B-Lymphozyten) produziert werden, die gegen das als fremd erkannte Antigen gerichtet sind. Zum anderen kann eine zelluläre Immunantwort erfolgen über T-Lymphozyten, die ihrerseits B-Zellen stimulieren.

Die Antikörper, die durch die humorale Immunantwort erzeugt werden, sind gegen eine antigene Determinante, d. h. eine spezielle Region (Epitop) auf dem Antigen gerichtet und binden an diese. Diese Antikörper sind globuläre Proteine (Immunglobuline Ig, beispielsweise IgM oder IgG), die aus je zwei identischen Ketten einer schweren Kette (H-Kette) und einer leichten Kette (L-Kette) bestehen, wobei jeweils eine der L-Ketten mit einer der H-Ketten über Disulfidbrücken verbunden sind und jedes derartige Paar eine spezifische Bindungsstelle für die antigene Determinante ausbildet.

Antikörper gegen beliebige Antigene werden in herkömmlicher Weise dadurch erzeugt, daß ein tierischer Organismus mit dem Antigen geimpft wird und dessen humorale Immunabwehr anschließend gegen das zugeimpfte Antigen Antikörper ausbildet. Diese Antikörper können anschließend isoliert werden. Weiterhin ist es heutzutage möglich sogenannte monoklonale Antikörper zu erzeugen. Hierzu wird eine proliferierende Myelomzelle mit einer B-Zelle aus einem immunisierten tierischen Organismus fusioniert, die den entsprechenden Antikörper wie die B-Zelle produziert. Dadurch entstehen Hybridomazellen, die einerseits wie die Myelomzelle proliferieren und andererseits den Antikörper wie die Plasmazelle bilden. Diese Hybridomazellen werden kultiviert und aus der Kultur der erzeugte monoklonale Antikörper gewonnen. Zu diesen allgemein bekannten und vielfach angewandten Verfahren wird beispielhaft auf Greiner A. et al. Laboratory Investigation (1994) Bd. 70, S. 572-578 und darin enthaltene weitere Quellenangaben verwiesen.

Mittels der Technik der monoklonalen Antikörper ist es folglich möglich, identische Antikörper in großer Menge herzustellen.

Bei der Ausdifferenzierung von B-Zellen zu Antikörper erzeugenden Plasmazellen können verschiedene Störungen auftreten, die im Menschen und bei Tieren zu schwerwiegenden Krankheiten führen. So kann es auf B-Zellenniveau zu einer falschen Erkennung von körpereigenen Zellen durch Antikörper kommen, wodurch beispielsweise Autoimmunkrankheiten erzeugt werden, bei denen Antikörper gegen körpereigene Zellen in großer Zahl von entsprechenden Plasmazellen erzeugt und sezerniert werden. Andererseits ist es möglich, daß B-Zellen beginnen, sich unkontrolliert zu teilen, wodurch Tumoren gebildet werden (Lymphom). Weiterhin ist eine derartige unbegrenzte Proliferation auch auf der Ebene der Plasmazellen bekannt (Krankheitsbild Plasmazytom, multiples Myelom).

Um in das Krankheitsgeschehen einzugreifen, ist es nun notwendig, die beteiligten entarteten Zellen immunologisch zu erkennen.

Nach dem Stand der Technik sind zwar Antikörper für Plasmazellen bekannt, die sämtliche Plasmazellen erkennen. Allerdings liegt das zu diesen Antikörpern gehörige Antigen lediglich intrazellulär vor, so daß vor einer Erkennung es erforderlich ist, die Zellen zu zerstören (siehe hierzu Anderson et al. (1984) J. Immunol., Bd. 132, 3172-3179) Eine nicht zerstörungsfreie Erfassung von Plasmazellen ist daher nicht möglich.

Weiterhin sind Antikörper gegen Oberflächenantigene bekannt (siehe hierzu Anderson et al. (1984) J. Immunol., Bd. 132, 3172-3179, Anderson et al. (1983) J. Immunol., Bd. 130, 1132-1138, Tong et al. (1987) Blood, Bd. 69, 238-145 oder Turley et al. (1994), J. Clin. Pathol., Bd. 47, 416-422), diese weisen jedoch keine Spezifität auf und erkennen sowohl unreife Vorläuferzellen als auch reife Plasmazellen. Nach diesen Untersuchungen verlieren Plasmazellen als ausdifferenziertes, Antikörper sezernierendes Stadium die typischen Oberflächenantigene des B-Zellen-Stadiums. Eine Sortierung zwischen unreifen Vorläuferzellen (Knochenmarkzellen oder B-Zellen) und reifen Zellen (ausdifferenzierte Plasmazellen, die selbst Antikörper bilden) ist daher nicht möglich.

Bei Plasmazellen konnten folglich bisher keine spezifischen Oberflächenmoleküle (cluster of differentation, CD) nachgewiesen werden, die als Antikörperrezeptoren (antigene Determinanten) dienen könnten. Aufgrund ihres vollständig ausdifferenzierten Zustandes sind intakte Plasmazellen immunologisch kaum erkennbar oder unterscheidbar.

Eine Therapie der genannten Krankheitsbilder, die spezifisch bei den reifen Plasmazellen angreift, ist daher nicht bekannt.

Als Therapie für die oben genannten Krankheitsbilder steht daher bisher lediglich die Chemotherapie, insbesondere in Form der multimodalen Chemotherapie, zur Verfügung. Diese ist jedoch mit den allgemein bekannten Nachteilen einer Chemotherapie verbunden. Eine Übersicht über die bisher bekannten Therapiekonzepte findet sich beispielsweise bei Lokhorst H. M, et al. Br. J. Haematol. (1999) Bd. 106, S. 18-27.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sowie Antikörper anzugeben, die Plasmazellen spezifisch markieren. Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, für entsprechende Antikörper kodierende Gene sowie Verwendungen derartiger Antikörper anzugeben. Weiterhin ist es Aufgabe, ein durch derartige Antikörper markiertes Antigen anzugeben.

Die Aufgabe wird durch den Antikörper nach Anspruch 1, 2 oder 12, die Nukleotidsequenz nach Anspruch 8, die Verwendungen nach den Ansprüchen 15 bis 18, das Antigen nach Anspruch 10 sowie die Verfahren zur Herstellung von weiteren Antikörpern nach den Ansprüchen 9 oder 13 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen werden jeweils in den abhängigen Ansprüchen gegeben.

Nach dem Stand der Technik werden zur Gewinnung von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen tierische Organismen mit dem jeweiligen Antigen geimpft (beispielsweise gespritzt), so daß diese aufgrund ihrer humoralen Immunantwort Antikörper gegen dieses Antigen ausbilden, wobei die erzeugten Antikörper anschließend separiert und aufgereinigt werden können. Dieses Verfahren war bislang bei intakten reifen Plasmazellen nicht erfolgreich, da diese wenig antigene Determinanten auf ihrer Oberfläche aufweisen, mit denen es möglich gewesen wäre, spezifische Antikörper speziell für Plasmazellen herzustellen. Versuche der Impfung mit Plasmazellen waren daher nicht erfolgreich.

Hier setzt nun die vorliegende Erfindung ein, bei der ein tierischer Organismus abweichend von der herrschenden Lehre mit B-Zellen der Plasmazelldifferenzierungslinie bis einschließlich des lymphoplasmazytoiden Zellstadiums immunisiert wird. Abweichend vom Stand der Technik wird folglich gerade nicht mit dem gewünschten Antigen, nämlich den Plasmazellen geimpft, sondern mit deren Vorstadien. Überraschenderweise können jedoch gerade mit diesem Verfahren Antikörper gewonnen werden, die spezifisch Plasmazellen markieren, ohne die jeweiligen Vorläuferstadien zu markieren. Dies liegt unter Umständen darin begründet, daß die entsprechenden Vorläuferzellen sich nach der Impfung in dem tierischen Organismus zu Plasmazellen weiterentwickeln und dort eine spezifische Antikörperreaktion auslösen, die durch direkte Immunisierung mit Plasmazellen nicht erzeugt werden kann. Aus einem derartig immunisierten tierischen Organismus ist es nun ohne weiteres möglich, die erzeugten Antikörper mittels Fusion von entsprechenden Milzzellen aus diesem tierischen Organismus mit Myelomzellen zu Hybridomazellen als monoklonale Antikörper zu gewinnen. Hierzu wird auf den allgemein bekannten Stand der Technik zur Erzeugung monoklonaler Antikörper verwiesen (siehe oben).

Antikörper sind im wesentlichen durch die variablen Regionen (Fw) ihrer L- und H-Ketten definiert. Die anderen Bereiche (F_C) der L-Kette bzw. H-Kette tragen nicht zur Antigen-Spezifität des Antikörpers bei und sind in verschiedenen Antikörperklassen jeweils weitgehend invariant.

Die erfindungsgemäßen Antikörper sind dadurch gekennzeichnet, daß die variable Region (Fw(L)) zumindest einer seiner leichten Ketten (L-Kette) zumindest eine der folgenden Aminosäuresequenzen oder einen Teil hiervon aufweist:
DIVMTQTPLTLSVTIGQPASLSC (variable Region FW-1),
KSSQSLLDSDGKTYLN (komplementaritätsbest. Region CDR-1),
WLLQRPGQSPKRLIS (variable Region FW-2),
LVSKLDS (komplementaritätsbestimmende Region CDR-2),
GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC (variable Region FW-3),
WQGTHLPWT (komplementaritätsbestimmende Region CDR-3)
und/oder
FGGGTKLEIKR (variable Region FW-4)
und/oder die variable Region (Fw(H)) zumindest einer seiner schweren Ketten (H-Kette) zumindest eine der folgenden Aminosäuresequenzen oder einen Teil hiervon aufweist:
QVQLQQSGPELVKTGASVKISCKGSGYSFS (variable Region FW-1),
GYYMH (komplementaritätsbestimmende Region CDR-1),
WVKQSHGKRLEWIG (variable Region FW-2),
YISGYNGDTRYNQKFRG (komplementaritätsbest. Region CDR-2),
KATFIVDISSRTAYMQFNSLTSEDSAVYYCAR (variable Region FW-3),
GGYYGYVDY (komplementaritätsbestimmende Region CDR-3)
und/oder
WGQGTTLTVSS (variable Region FW-4).

Diese Antikörper können auch dadurch gekennzeichnet werden, daß das Gen, das für die einzelnen Ketten (L- und H-Kette) des Antikörpers kodieren, die folgenden Nukleotidsequenzen oder entsprechende Abschnitte hieraus enthält:
für die L-Kette

und/oder für die H-Kette

Die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz enthält jeweils eben die oben genannten Nukleotidsequenzen oder einen Teil hiervon und stellt jeweils eines der für den oben genannten Antikörper erforderlichen Gene dar.

Der Antikörper kann ein herkömmliches Immunglobulin, beispielsweise ein Immunglobulin G (IgG), sein, bei dem beide leichten Ketten und beiden schweren Ketten jeweils dieselbe Aminosäuresequenz aufweisen. Es sind jedoch erfindungsgemäß auch Antikörper umfaßt, die bispezifisch sind und beispielsweise nur eine schwere und eine leichte Kette wie oben beschrieben enthalten, so daß nur eine Bindungsstelle für die Plasmazellen ausgebildet wird.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch als Antikörper-Konjugate, beispielsweise mit Proteinen wie Toxinen, Cytokinen, Antikörperfragmenten oder Enzymen, und/oder mit Fluorophoren, Biotin und/oder, Radioisotopen vorliegen. Derartige Antikörper- Konjugate und deren Herstellung sind beispielsweise beschrieben in "G. T. Hermanson "Bioconjugate Techniques" Academic Press ISBN 0-12-342336-8, 1995", insbesondere in den Kapiteln 8, 10, 11 und 13 oder in "J. E. Coligan et al. "Current Protocols in Immunology", J. Wiley and Sons, Inc. ISBN 0-471- 52276-7, 1991", die sämtlich hiermit durch Referenz in den Offenbarungsgehalt dieser Anmeldung aufgenommen werden.

Die Konjugation von Radioisotopen wird vermittelt durch heterobifunktionale chelatbildende Wirkstoffe (siehe oben unter G. T. Hermanson, Kapitel 8).

Geeignete Radioisotope sind dabei unter anderem Ytrium-88, Yttrium-90, Indium-111, Iod-125, Iod-131, Samarium-153, Lutetium-177, Renium-186, Wismut-212 oder Wismut-213.

Geeignete Toxine sind dabei unter anderem Ricin, rekombinantes Ricin, bakterielle Toxine PE (Pseudomonas Exotoxin) oder DT (Diphterietoxin), die einkettige Toxine sind, die sich zur Herstellung rekombinanter Fusionstoxine eignen.

Antikörper, die mit toxischen Antibiotika konjugiert sind, sind beispielsweise in der US 5013547 und der WO 92/07466 offenbart.

Einen Überblick über den Stand der Technik, der hiermit in diese Anmeldung aufgenommen wird, wird gegeben:
für Radioimmunotherapie durch S. J. DeNardo et al. "A new era for radiolabeled antibodies in cancer?" in Current Opinion in Immunology, 1999, Bd. 11, S. 563-569,
für Immunotoxine in R. J. Kreitman in "Immunotoxins in Cancer", Current Oppinion in Immunology, 1999, Bd. 11, S. 570-78,
für bispezifische Antikörper in D. M. Segal et al. in "Bispecific antibodies in cancer therapy", Current Opinion in Immunology, 1999, Bd. 11, S. 558-562,
für die Herstellung von Einketten-Fv-Antikörpern in der US 5260203,
für die Herstellung von Antikörperfragmenten, konjugiert oder exprimiert als einfache Polypeptidkette in der WO 91/19739,
für die Erzeugung von humanisierten Antikörpern in der US 5859205,
für die Erzeugung von chimären Antikörpern ("CDR grafting") in EP 0620276,
für die Erzeugung von quervernetzten (crosslinked) Antikörpern in der US 5714149
für die Erzeugung von Antikörper-Cytokin- Fusionsproteinen in S. D. Gillies et al. in "Antibody targeted interleukin 2 stimulates T-cell killing of autologous tumor cells", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, Bd. 89, S. 1428-1432 oder in T. Dreier et al. in "Recombinant immunocytokines targeting the mouse trasferrin receptor: construction and biological activities", Bioconjug. Chem., 1998, Bd. 9, S. 482-489.

Die genannten Antikörper können dazu verwendet werden, Plasmazellen zu identifizieren und beispielsweise auszusortieren. Hierzu ist es beispielsweise lediglich erforderlich, in herkömmlicher Weise die verwendeten erfindungsgemäßen Antikörper mit einem Fluorochrom zu markieren und eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) durchzuführen. Weitere Trennverfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt(siehe beispielsweise Greiner A. et al. (1997) American Journal of Pathology Bd. 150, S. 1583-1593).

Auf diese Weise ist es möglich, aus einer Blutprobe oder Gewebe sämtliche Plasmazellen abzutrennen und zu isolieren. Dabei werden dann auch die entarteten Plasmazellen mitentfernt und die den Tumor bzw. die Autoimmunerkrankung verursachenden Plasmazellen zu beseitigen.

Insbesondere kann die Markierung und Entfernung der Plasmazellen auch extrakorporal, beispielsweise in einem äußeren künstlichen Blutkreislauf ähnlich wie bei der Dialyse, erfolgen.

Das erfindungsgemäße Antigen wird durch den erfindungsgemäßen Antikörper markiert. Eines dieser Antigene ist dadurch gekennzeichnet, daß es ein Oberflächenprotein von Plasmazellen ist und ein Molekulargewicht von ca. 94 Kilodalton aufweist. Dabei wurde festgestellt, daß dieses Antigen nicht nur an der Oberfläche der Plasmazellen sondern auch in deren Zellplasma zu finden ist.

Mit der Kenntnis dieses Antigens ist es nunmehr auf einfache herkömmliche Weise, z. B. Gelelektrophorese, möglich, dieses Antigen aufzureinigen und mittels dieses Antigens wiederum einen tierischen Organismus zu immunisieren, um weitere Antikörper gegen dasselbe Antigen zu erzeugen. Diese so erzeugten Antikörper markieren dann selbstverständlich wiederum spezifisch nur Plasmazellen, da diese ja das 94 kDa-Antigen auf ihrer Oberfläche präsentieren, und können wie oben beschrieben verwendet werden.

Damit steht ein definiertes und mit herkömmlichen Techniken der Immunologie, wie sie in vielen Lehrbüchern beschrieben sind (beispielsweise Janeway et al., Immunologie, 1995, Spektrum-Verlag Heidelberg Berlin Oxford), durchführbares Verfahren zur Herstellung von beliebigen weiteren spezifisch gegen Plasmazellen gerichteten Antikörpern zur Verfügung. Selbstverständlich kann nach Immunisierung dieses Tieres ebenfalls wieder der entsprechende Antikörper als monoklonaler Antikörper, wie aus dem Stand der Technik bekannt in herkömmlicher Weise, erzeugt werden.

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß bezüglich Plasmazellen nach dem Stand der Technik bisher lediglich spezifische Antikörper zur Verfügung standen, die gegen zytoplasmische Bestandteile gerichtet waren und folglich keine Oberflächenerkennung der Plasmazellen durchführen konnten. Die erfindungsgemäßen Antikörper sind erstmals gegen Antigene gerichtet, die auf der Zelloberfläche von Plasmazellen exprimiert sind und sind spezifisch für Plasmazellen. Damit stehen erstmals Antikörper zur Verfügung, die für die Diagnostik und für die Therapie von beispielsweise Autoimmunkrankheiten, Lymphomen oder Plasmazytomen eingesetzt werden können und es ermöglicht, die bisher im Stand der Technik alleinig vorhandene Chemotherapie mit all ihren Nebenwirkungen zu ersetzen.

Im folgenden wird ein Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Antikörpers sowie ein erfindungsgemäßer Antikörper gegeben.

Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers ("Wue-1")

1. Immunisierung einer Maus:
BALB/c-Mäuse wurden mit Zellen einer Zellinie immunisiert, die aus einem Lymphom vom MALT-Typ (Zelliniennummer H3302/88, Dr. A. Greiner, Institut für Pathologie, Universität Würzburg) gewonnen wurden. Diese Zellen sind in vitro fähig, in Plasmazellen zu differenzieren.

2. Gewinnung von Milzzellen der immunisierter Maus:
Die steril entnommene Milz wurde in eine Petrischale mit 5 ml RPMI ohne Serum gegeben und durch ein Netz aus Nylongaze (Porengröße 100 µm) gedrückt. Danach wurde die Zellsuspension mit einer 5 ml Pipette mehrmals resuspendiert und in ein 50 ml Röhrchen überführt. Die so erhaltenen Milzzellen wurden zweimal mit 20 ml HBSS gewaschen. D. h. die Zellen wurden jeweils 5 Minuten bei 1500 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Pellet in jeweils 20 ml HBSS resuspendiert.

3. Vorbereitung des Fusionspartners (Myelomazellen):
Die Myeloma-Zellen (P3 × 63 Ag8.653, vgl. Kearny J. F. et al. (1979) Journal of Immunology Bd. 123, S. 1548-1550) wurden einige Tage vor der Fusion in Azaguanin-Medium(1 mg/ml RPMI + 10% FKS) gehalten. Für die Fusion von einer Mäuse-Milz wurden ca. 4 × 10⁷ Myelomazellen benötigt (dies ist der Inhalt von ca. einer Zellkulturflasche 175 cm² konfluent gewachsen). Die Myeloma-Zellen wurden mit Hilfe von EDTA-Puffer vom Boden der Flasche abgelöst und anschließend wie die Milzzellen mit HBSS gewaschen, erneut abzentrifugiert und der Überstand über dem Pellet abgesaugt.

4. Zellfusion:
Die Suspension mit Milzzellen aus Schritt 2 wurde auf das Pellet aus Myelomazellen aus Schritt 3 gegeben und mit diesem gemischt.

Die Fusion fand bei +37°C gemäß Standardverfahren statt (s. beispielsweise Greiner et al. (1994) "Monoclonal gammapathies III. Clinical significance and basic mechanism (Hrsg. Radl et al.), S. 187-190, EURAGE, Leiden, Niederlande). Dazu wurden alle benötigten Medien auf +37°C in einem Wasserbad vorgewärmt.

Innerhalb einer Minute nach Mischung der Milzzellen mit den Myelomazellen wurde der Zellmischung 1 ml PEG 50% langsam unter Rühren zugetropft, damit keine Klumpen entstehen. Nach 1,5 Minuten Wartezeit wurden erst 15 ml RPMI ohne Serum und dann 20 ml RPMI + 10% FKS langsam unter Rühren zugetropft. Das Zellgemisch aus Myeloma-Fusionspartnerzellen und Mausmilzzellen wurden 5 Minuten bei 1500 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Pellet in 125 ml RPMI + 10% FKS + 200 Einheiten pro Milliliter IL-6 + 0,5 ml pro 100 ml Gentamycin resuspendiert. Die so erhaltene Zellsuspension wurde milliliterweise in fünf 24-Lochplatten verteilt. Nach ca. 24 Stunden Kultur wurde pro Loch 1 ml RPMI + 10% FKS + 200 Einheiten pro Milliliter IL-6 + 0,5 ml pro 100 ml Gentamycin + 2× HAT zugegeben.

5. Kultivierung der Hybridomazellen:
Die fusionierten Hybridomazellen wurden alle 4 Tage mit neuem Medium (RPMI + 10% FKS + 200 Einheiten pro Milliliter IL-6 + 0,5 ml pro 100 ml Gentamycin + 1× HAT) versorgt. Dazu wurde der Kulturüberstand der Wells vollständig abgesaugt (Hybridomazellen wachsen adhärent), und 2 ml neues Medium pro Well zugegeben. Nach 14 Tagen wurde das 'HAT-Medium' gegen 'HT- Medium' (RPMI + 10% FKS + 200 Einheiten pro Milliliter IL-6 + 0,5 ml pro 100 ml Gentamycin + 1× HT) ausgetauscht. Wenn wachsende Klone das Gesichtsfeld im Mikroskop ausfüllten, wurden sie auf Immunglobulinproduktion getestet. Alle positiven Klone wurden in kleine Kulturflaschen (25 cm²) umgesetzt.

6. Spezifitätstestung:
Alle positiven Klone wurden immunhistochemisch auf Spezifität durch Gefrierschnitte mit Hilfe von Immunfärbung ausgetestet (siehe unten).

Nach mehrfacher Reklonierung wurde eine stabile Zelllinie erhalten.

7. Isolation der erzeugten Antikörper:
Aus Kulturen der genannten Zelllinie wurde der Überstand abgenommen und durch Fällung mit Ammoniumsulfat und einer anschließenden Protein A Affinitätschromatographie gereinigt und mit FITC oder Biotin unter Verwendung von N-Hydroxy-succimid-ester (Fa. Sigma, Deutschland) entsprechend Standardverfahren (Greiner et al. (1994) Lab. Invest., Bd. 70, S. 572-578) markiert. Der von dieser Zelllinie erzeugte Antikörper, im folgenden "Wue-1" genannt, wurde und identifiziert mit dem Isotyp IgG2a.

8. Die Antikörper Wue-1 wurde bzgl. seiner Aminosäuresequenz charakterisiert. Die variable Region Fw(L) seiner leichten Ketten (L-Ketten) weist folgende Sequenz auf:

Dabei entsprechen die Teilsequenzen
DIVMTQTPLTLSVTIGQPASLSC der variablen Region FW-1,
KSSQSLLDSDGKTYLN der komplementaritätsbest. Region CDR-1
WLLQRPGQSPKRLIS der variablen Region FW-2
LVSKLDS der komplementaritätsbestimmenden Region CDR-2
GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC der var. Region FW-3
WQGTHLPWT der komplementaritätsbestimmenden Region CDR-3
und
FGGGTKLEIKR der variablen Region FW-4

Die variable Region Fw(H) seiner schweren Ketten (H- Ketten) weist folgende Sequenz auf:

Dabei entsprechen die Teilsequenzen
QVQLQQSGPELVKTGASVKISCKGSGYSFS der var. Region FW-1,
GYYMH der komplementaritätsbestimmenden Region CDR-1,
WVKQSHGKRLEWIG der variablen Region FW-2,
YISGYNGDTRYNQKFRG der komplememtaritätbest. Region CDR-2,
KATFIVDISSRTAYMQFNSLTSEDSAVYYCAR der var. Region FW-3,
GGYYGYVDY der komplementaritätsbestimmenden Region CDR-3
und
WGQGTTLTVSS der variablen Region FW-4.

Weiterhin wurde die Nukleotidsequenz der den Antikörper Wue-1 kodierenden Gensequenzen analysiert. Das Gen, das für die leichten L-Ketten des Antikörpers Wue-1 kodiert, enthält die folgende Nukleotidsequenz:

Das Gen, das für die schweren H- Ketten des Antikörpers Wue-1 kodiert, enthält die folgende Nukleotidsequenz:

9. Die oben genannten, verwendeten Materialien sind wie folgt definiert:
Nylongaze Fa. NORAS 8-Azaguanin Fa. Sigma Nr. A1007 HBSS (Hank's Salze) Fa. Linaris Nr. F1431 KG EDTA-Puffer Fa. Linaris Nr. L1253 GG PEG (Polyethylenglycol 1500) Fa. Boehringer FKS (Fötales Kälberserum) Fa. Linaris Nr. S3181 KG RPMT Fa. Linaris Nr. F2613 KG HAT-Supplement 50× Fa. Linaris Nr. K1931 GG HT-Supplement 50× Fa. Linaris Nr. K1932 GG Gentamycin Fa. Linaris Nr. F1141 FG IL-6 (Interleukin-6) Fa. Pharmingen, Hamburg.

Untersuchungen des so gewonnenen Antikörpers

Für die Spezifitätstests wurde der Antikörper aus dem Zellkulturüberstand durch Ammoniumsulphatpräzipi tation und anschließender Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die Spezifitätstestung erfolgte an Frischgewebeschnittpräparaten sowie an Zellzentri fugaten und Zellsuspensionslösungen mittels Immunhistochemie.

Ergebnisse

Wue-1-positive Zellen wurden mittels Immunhistochemie innerhalb von sekundären Keimzentren sowie der Marginalzone und unterhalb des Tonsillenkryptenepithels eindeutig und reproduzierbar identifiziert (Fig. 1A und 1B). Die Morphologie und Immunhistochemie entspricht reifen Plasmazellen entweder vom Marschalko-Typ oder lymphoplasmozytoiden Typ (Fig. 1C mit Bildeinschub).

In Teilbild a von Fig. 1A erkennt man sekundäres lymphatisches Gewebe mit einem Keimzentrum in der Mitte (Stern) und einzelnen braun gefärbten Plasmazellen im oberen Drittel dieses Keimzentrums. Dieses ist die typische Ausreifungszone fuer B- Lymphocyten zu Plasmazellen. Zusätzlich erkennt man auch ausserhalb des Follikels einige positv markierte Zellen (Pfeile) nahe dem Oberflächenepithel am oberen Rand der Aufnahme. Teilbild b von Fig. 1A zeigt eine Immunfärbung der Plasmazellinie NCI-923, bei der alle Zellen immunhistochemisch kräftig positv mit Wue-1 markiert sind. Das Markierungsmuster ist jeweils cytoplasmatisch und membranständig wie mit Hilfe der in Fig. 1C dargestellten, nicht- permeabilisierenden FACS-Färbung gezeigt wurde.

Wue-1 reagierte nicht mit Makrophagen oder anderen lymphatischen Zellen wie T-Lymphocyten oder Makrophagen und zeigt keine Bindung im peripheren Blut, Lebergewebe, Niere, Muskel, Haut, Harnblase, Hoden, Ovar und reagierte schwach und inkonstant mit sekretorischem Epithel im Gastrointestinaltrakt (Magen, Dünndarm).

WUE-1 reagierte jedoch mit allen von Plasmazellen abgeleiteten malignen Tumoren. Dagegen reagierten normale T- und B-Lymphocyten und Tumoren aus der frühen B-Zelldifferenzierungsphase negativ (Fig. 1B). In Teilbild a von Fig. 1B erkennt man einen in Plasmazellen ausdifferenzierenden B-Zelltumor (sog. niedrig-malignes MALT-Lymphom) mit einem diffusen Schwarm positiv markierter Plasmazellen neben den noch nicht ausdifferenzierten Tumoranteil des Lymphoms, das Wue-1 - negativ reagiert. In Teilbild b von Fig. 1B ist ein hochmalignes Lymphom mit Wue-1 markiert, das malignen Plasmazellen entspricht (sog. anaplastisches Plasmocytom) und eine Cytoplasma- und Membranfärbung aufweist.

In Fig. 1C ist in der linken Bildhälfte eine FACS- Darstellung von einer normalen Tonsillen- Lymphocytenzellsuspension dargestellt. Die x-Achse stellt jeweils die Zellgrösse dar, die y-Achse die Zellgranularität. Mit R1 und R2 wurden zwei Zellpopulationen definiert, wobei nach allgemeinen Erfahrungen in R1 die ruhenden Lymphocyten, in R2 die aktivierten Lymphocyten sind. Eine Vorstellung davon erhällt man durch das eingelegte Innenbild Zellsuspensionszentrifugenpräparat, das mit Wue-1 gefärbt wurde. Hier erkennt man kleine, positive Zellen, die lymphoplasmocytoiden Plasmazellen entsprechen (Pfeil) und in R1 auftreten sowie grossen Plasmazellen vom Marschalko-Typ aus R2.

In der rechten Bildhälfte von Fig. 1C erkennt man vier Histogramme, wobei auf der x-Achse die Färbeintensität, auf der y-Achse die Zellanzahl dargestellt wird. Die oberen zwei Histogramme stellen die Wue-1 positiven Zellen aus R1 dar. Links oben/unten wurden die Zellen zusätzlich gegen Leichtkettenantigene kappa und lambda, rechts oben/unten gegen das Oberflächenantigen CD54 gefärbt. Eine Färbung gegen ein irrelevantes Antigen wurde als sog. Isotypkontrolle den Bildern überlagert, um das Ausmass unspezifischer Hintergrundfärbung darzustellen. Auffällig ist, daß sich lymphoplasmocytische Zellen (obere Reihe) von der reifen Plasmazellen (untere Reihe) hinsichtlich der Expression von Leichtkettenexpression und CD54 unterscheiden, da reife Plasmazellen beides jeweils nicht exprimieren im Vergleich zur Isotypkontrolle.

Fig. 1D zeigt einen Western-Blot, bei dem eine Plasmazellinie (NCI-H929) als Antigenquelle diente. Es ergab sich eine positive Bande bei etwa 94 kDa (Fig. 1D), d. h. das durch wue-1 markierte Antigen weist ein apparentes Molekulargewicht von 94 kDa auf.

Bildbeschreibung Fig. 2 (Videoprint)

Alle Teilbilder a bis h aus Fig. 2 beschreiben das spezifische und für Plasmazellen selektive Bindungsmuster am Beispiel der humanen Tonsille. Als Nachweistechnik diente ein Cy3-Fluorochrom- konjugierter Wue-1 mAk (rote Färbung) im wahlweisen Einsatz gegen andere definierte Antigene (grüne Färbung) mit Hilfe der Doppelimmunfluoreszenz, wobei ein überlappendes Färbesignal dann Gelb erscheint. (Farbsumme aus Grün und Rot). Die Immunfärbung wurde nach gängigen und allseits gebräuchlichen Methoden durchgeführt (Details siehe einschlägige Literatur wie Janeway, Immunologie, Spektrum-Verlag, 1995). Zusammengefasst färbt man zunächst indirekt mit dem unkonjugierten Antikörper (hier: die grün dargestellten Antigene) und stellt diesen mit einem Grünfluoreszenz-markierten zweiten Sekundärantikörper dar. In einem nächsten Schritt werden alle freien Valenzen des Sekundärantikörpers mit Mausserum abgeblockt, damit Wue-1 hieran nicht unspezifisch binden kann. Abschliessend wird mit der zweiten Spezifität gefärbt (in diesem Fall rot markierter Wue-1). Mehrere Spezifitäts- und Sensitivitätskontrollen werden parallel zu jedem Ansatz mitgeführt und beinhalten das Färbeverhalten des Gewebes unter Auslassen der jeweiligen Einzelschritte.

In Fig. 2a erkennt man eine Doppelfärbung von Wue-1 (rot) mit CD44 (grün). Das Keimzentrum eines Lymphfollikels ist in der Darstellung nur schattenhaft zu erkennen und daher mit einem Stern gekennzeichnet. CD44 markiert reife B-Zellen (keimzentrumsnah) und Plasmazellen (keimzentrumsfern gelegen), wobei in der Doppelfärbung nur das überlappende Spektrum der keimzentrumsfernen Population auffällt. Ein Pfeil markiert einzelne im Keimzentrum gelegene Plasmazellen, die charakteristischerweise aber CD44 negativ sind.

In Fig. 2b wird dieser Befund noch einmal besonders hervorgehoben. Hier wurde ein Keimzentrum selektiv dargestellt. Grün sind die Zellen markiert, die außerhalb der G0-Phase sind (dargestellt durch Ki-67- Positivität) und daher proliferieren, was ein Charakteristikum für Keimzentren in lymphatischem Gewebe ist. Wue-1 positive Zellen sind ausdifferenziert und proliferieren nicht mehr, eine Doppelfärbung ist also nicht zu erkennen.

In Fig. 2c wurde eine Abgrenzung gegen eine weitere wichtige Zellpopulation im lymphatischen Gewebe mit Hilfe der CD3-Färbung durchgeführt. Wue-1-Zellen grenzen demnach in der Tonsille an die T- Zellaußenzone (typische Lokalisation für Plasmazellen), sind aber für den Pan-T-Zellmarker negativ.

In Fig. 2d wurde eine Doppelfärbung mit einem bekannten Plasmazellantikörper VS-38 durchgeführt, der aber nur cytoplasmatisches Antigen erkennt. Es ergibt sich demnach eine hohe Übereinstimmung mit fast vollständiger Gelbfärbung. Einzelne Zellen werden aber zudem von VS38 erkannt und konnten als T- Zellen beschrieben werden, ein Umstand also, der zeigt, dass VS38 gegenüber Wue-1 eine geringere Spezifität besitzt.

Fig. 2e zeigt eine Färbung, welche die Tonsillenoberfläche grün kennzeichnet (Epithelmarker Cytokeratin 8). Auch hier zeigt sich, dass Wue-1 keine Kreuzreaktivität aufweist, auch nicht bei den Zellen, die charakteristischerweise in das Epithel einwandern.

In Fig. 2f wurde ein Koexpression mit einem funktionell wichtigen Antigen CD95 (FAS) untersucht. Daten über eine Expression für Plasmazellen sind bislang nicht veröffentlicht worden.

In Fig. 2g wurde eine Kombination aus Wue-1 und einem Antikörper 4D12 ausgewählt, der Marginalzonen B- Zellen erkennt, d. h. solche Zellen, die die direkten Vorläuferzellen für Plasmazellen darstellen. Konsequenterweise erkennt man neben der jeweiligen Einzelfärbung auch doppelt markierte Zellen, die den Übergang kennzeichnen.

In Fig. 2h wurde demgegenüber eine Doppelfärbung mit CD23 durchgeführt, das auf Keimzentrums- und unreifen B-Zellen (sog. Mantelzonenzellen) ausgebildet wird. Man erkennt grün die Keimzentrums- und Mantelzonenstrukturen eines Lymphfollikels mit einem Streifen unmarkierter Zellen (T-Zellzone vgl. Fig. 2c und Marginalzone vgl. Fig. 2g) und Wue-1 positiver Außenzone.

Auch wenn bislang viel über B-Zelldifferenzierung in den Anfangsstadien der B-Zellentwicklung gearbeitet wurde ist wenig über die terminale Differenzierung auf dem Weg zur Plasmazelle bekannt. Dieses liegt im wesentlichen daran, dass zu deren Identifizierung kaum für Plasmazellen spezifische Antikörper verfügbar sind. Für Plasmazellen bislang publizierte Antikörper, wie CD44, CD38, PC-1, PCA-1, MM4, BB-1 oder VS38 haben den Nachteil einer breiten Reaktion auch mit verschiedenen anderen Geweben und reagieren mit cytoplasmatischen Antigen aber nicht mit Membranantigen. Daß Wue-1 Plasmazellen spezifisch erkennt wurde mit Hilfe zahlreicher Untersuchungen morphologisch wie immunhistochemisch mit Hilfe von Mehrfachfärbungen nachgewiesen (Fig. 1A und 2 (Videoprint)). Insbesondere die Spezifität und die Eigenschaft von Wue-1 an der Membranoberfläche von normalen und malignen Plasmazellen zu binden macht Wue-1 zu einem wertvollen immunologischen Hilfsmittel, weil umgekehrt Wue-1 auch an Träger- oder Botenstoffe gekoppelt werden kann und dann in vitro als auch in vivo diagnostische oder therapeutische Substanzen an die Plasmazelle herantragen kann, was durch seine Eigenschaft an die Zellmembran der Plasmazellen zu binden gewährleistet wird. Auch ist Wue-1 therapeutisch einsetzbar als ein extrakorporaler Filter (sog. purging), bei dem Blut oder das Knochenmark eines Plasmocytompatienten von seinen Tumorzellen während einer Knochenmarktransplantation befreit wird.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß die variable Region (Fw(L)) zumindest einer seiner leichten Ketten (L-Kette) zumindest eine der folgenden Aminosäuresequenzen oder einen Teil hiervon aufweist:
und/oder die variable Region (Fw(H)) zumindest einer seiner schweren Ketten (H-Kette) zumindest eine der folgenden Aminosäuresequenzen oder einen Teil hiervon aufweist:

2. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er durch ein Gen kodiert wird, das für zumindest eine seiner leichten Kette (L-Kette) die folgende Nukleotidsequenz oder einen Teil hiervon enthält:
und/oder das für zumindest eine seiner schweren Ketten (H-Kette) die folgende Nukleotidsequenz oder einen Teil hiervon enthält:

3. Antikörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Immunglobulin G ist.

4. Antikörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß beide leichten Ketten und/oder beide schweren Ketten dieselbe Aminosäuresequenz aufweisen.

5. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein multifunktionaler Antikörper ist.

6. Antikörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Antikörper-Konjugat mit Proteinen, wie Toxinen oder Cytokinen oder Antikörperfragmenten oder Enzymen, oder mit Hormonen, Fluoreszenzfarbstoffen, Biotin und/oder Radioisotopen ist.

7. Antikörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Fusionsprotein mit Toxinen, Enzymen, Cytokinen und/oder Hormonen ist.

8. Für einen Antikörper kodierende Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgende Nukleotidsequenz oder einen Teil hiervon enthält:
und/oder die folgende Nukleotidsequenz oder einen Teil hiervon enthält:

9. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gerichtet gegen Plasmazellen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Tier mit B-Zellen der Plasmazelldifferenzierungslinie bis einschließlich des lymphoplasmacytoiden Zellstadiums immunisiert wird und aus dem Blut des Tieres der gebildete Antikörper in herkömmlicher Weise isoliert wird.

10. Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bindet.

11. Antigen nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es von humanen Plamazellen an deren Oberfläche präsentiert wird und ein Molekulargewicht von ca. 94 Kilodalton aufweist.

12. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Antigen nach einem der Ansprüche 10 oder 11 bindet.

13. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gerichtet gegen Plasmazellen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Tier mit einem Antigen nach einem der Ansprüche 10 oder 11 immunisiert wird und aus dem Blut des Tieres der gebildete Antikörper in herkömmlicher Weise isoliert wird.

14. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern nach einem der Ansprüche 9 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß mittels Zellen des immunisierten Tieres in herkömmlicher Weise eine Zelllinie erzeugt wird, die diesen Antikörper als monoklonalen Antikörper erzeugt, diese Zelllinie kultiviert und der erzeugte Antikörper isoliert wird.

15. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 12 zur Identifizierung des zugehörigen Antigens.

16. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 12 zur spezifischen Markierung von Plasmazellen.

17. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 12 zur anschließenden Herstellung weiterer Plasmazellen markierender Antikörper.

18. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 12 zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten und/oder Tumoren, beispielsweise von multiplen Myelomen, Lymphomen und/oder Plasmozytomen.

19. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 12 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Autoimmunkrankheiten, von Tumoren, beispielsweise von multiplen Myelomen und/oder Lymphomen.