NL8001240A - Plasmide dna en werkwijze voor het verkrijgen daarvan. - Google Patents

Description

ί

V

%

Plasmide DNA en werkwijze voor het verkrijgen daarvan.

Het is bekend, dat bacteriële plasmiden worden gebruikt voor recombinant DNA onderzoek. Voor een goed overzich van de ontwikkeling op dit gebied wordt verwezen naar Science, vdL 196, april 1977. Recombinant DNA onderzoek aan industrieel belangrijke 5 microorganismen van het genus Streptomyces is beschreven door

Bibb, M.J., Ward, J.M., en Hopwood, D.A., 1978: "Transformation of plasmid DNA into Streptomyces at high frequency", Nature 274, 398-400.

Aan verscheidene Streptomyceten is vastgesteld, 10 dat deze DNA plasmiden bevatten. Zie Huber, M.L.B. en Godfrey, 0.

1978: "A general method for lysis of Streptomyces species", Can.

J. Microbiol. 24, 631-632; Schrempf, H., Bujard, H., Hopwood, D.A. en Goebel, W., 1975: "Isolation of covalently closed circular deoxyribonucleic acid from Streptomyces coelicolor A3(2)",' 15 J. Bacteriol. 121, 416-421; Umezawa, H, 1977: "Microbial secondary metabolities with potential use in cancer treatment (Plasmid involvement in biosynthesis and compounds)", Biomedicine 26, 236-249; en Malik, V.S. 1977: Preparative Method for the isolation of supercoiled DNA from a chloramphenicol producing Streptomycete, 20 J. Antibiotics 30, 897-899. Niettemin is tot nog toe slechts een Streptomyceet plasmide geïsoleerd en beschreven door Schrempf supra. Dat in het genus Streptomyces nog meer plasmiden voorkomen, kan worden afgeleid uit resultaten van genetisch onderzoek beschreven door: 25 (1) Akagawa, H., Okanishi, M. en Umezawa, H., 1975: "A plasmid involved in chloramphenicol production 800 1 2 40 r* 2 in Streptomyces venezuelae: Evidence from genetic mapping", J. Gen, Microbiol. 90, 336— 346.

(2) Freeman, R.F. en Hopwood, D.A., 1978: "Unstable 5 naturally occurring resistance to antibiotics in Streptomyces", J. Gen. Microbiol. 106, 377-381.

(3) Friend, E.J., Warren, M. en Hopwood, D.A., 1978: "Genetic evidence for a Plasmid Control- 10 ling fertility in an industrial strain of

Streptomyces rimosus", J. Gen. Microbiol. 106, 201-206.

(4) Hopwood, D.A. en Wright, H.M. 1973: "A plasmid of Streptomyces coelicolor carrying a chromoso- 15 mal locus and its inter-specific transfer", J. Gen. Microbiol. 79, 331-342, (5) Hotta, K., Okami, Y. en Umezawa, H. 1977: "Elimination of the ability of a kanamycin-producing strain to biosynthesize deoxystrepta- 20 mine moiety bij acriflavine", J. Antibiotics 30, 1146-1149.

(6) Kirby, R., Wright, L.F. en Hopwood, D.A., 1975: "Plasmid-determined antibiotic synthesis and resistance in Streptomyces coelicolor", Nature 25 254, 265-267.

(7) Kirby, R. en Hopwood, D.A. 1977: "Genetic determination of methylenomycin synthesis bij the SCPI plasmid of Streptomyces coelicolor A3(2)", J. Gen. Microbiol. 98, 239-252.

30 (8) Okanishi, M., Ohta, T. en Umezawa, H. 1969: "Possible control of formation of aerial mycelium and antibiotic production in Streptomyces bij episomic factors", J. Antibiotics 33, 45-47.

35 80 0 1 2 40 '4.

3

Gevonden is, dat het micro-organisme Streptomyces fradiae NRRL 11443 een niet eerder beschreven plasmide bevat.

Dit plasmide, dat de code p UC1 kreeg, bezit een molekuulgewicht van ongewer 47,1 megadalton, wordt door restrictie endonuleasen 5 afgebroken volgens het fragmentatiepatroon zoals weergegeven in het diagram en komt in 1 copie per cel S.fradiae NRRL 11443 voor.

Het diagram is gebaseerd op plasmide p UC1 met een molekuulge-wicht van ongeveer 47,1 _+ 1,2 megadalton en een molekuullengte van ongeveer 71,1 kilobasen. De restrictieplaatsen zijn aangegeven 10 als kilobase coördinaten ten opzichte van de Xba I restrictieplaats bij 0,0/71,1 kilobasen. De gebruikte afkortingen voor de restrictie endonucleasen zijn: (1) Bgl II, een enzym uit Bacillus globigii; (2) Hind III, een enzym uit Haemophilus influenzae en 15 (3) Xba I, een enzym uit Xanthomonas badrii.

p UC1 wordt uit Streptomyces fradiae NRRL 11443 geïsoleerd door het mycelium van een cultuur te fragmenteren, de fragmenten te incuberen, de cultuur te oogsten, het mycelium te lyseren en het plasmide uit het lysaat te isoleren. Het plasmide 20 is praktisch zuiver.

Omdat p UC1 door verschillende restrictie endonucleasen wordt afgebroken of "geknipt", kan het gemakkelijk worden gerecombineerd en aangepast voor een aantal gastheervektoren, p UC1 kan ook worden gebruikt als een klonerende vektot bij recombinant DNA 25 onderzoek waarbij gekozen genen in het plasmide worden ingebouwd waarna het plasmide in een gastheerbacterie en/of vektor wordt ingebracht.

Karakteristieken van p UC1

Molekuulgewicht: ongeveer 47,1 1,2 megadalton.

30 Aantal copiën per cel: 1.

Restrictie endonuclease plaatsen (zie het diagram).

800 1 2 40 * 4

Aantal restrictieplaatsen Aantal restrictieplaatsen

Enzym pUCl Enzym pUCl 5 BamHI _> 15 Hind III 2

EcoRI 0 Κρη I >_ 15

Pst I j> 18 Xho I 11

Xba I 2 Sma I >_ 15

Bgl II 5 Bel I 6 10

Deze waarden werden verkregen door p UC1 DNA te fragmenteren bij aanwezigheid van een overmaat restrictie endonuclease en het aantal in 0,7 en 1,0%-ige agarose gelen oplosbare fragmenten te bepalen.

15 pUCl kan worden gebruikt voor het verkrijgen van recombinant plasmiden die in gastheerbacteriën kunnen worden ingebracht. Daarbij wordt het DNA van het circulaire vectoriële plasmide met restrictie endonuclease, bijvoorbeeld Hind III of Xba I op specifieke plaatsen opengeknipt waarbij lineair DNA 20 ontstaat. Tussen de uiteinden daarvan wordt een stukje vreemd niet-vectorieel DNA geplakt onder ringsluiting door de lineaire vektor o£ stukjes daarvan, en de niet-lineaire vektor te mengen bij aanwezigheid van een polynucleotide ligase.

Het vreemde DNA, verkregen met hetzelfde enzym kan afkomstig zijn 25 van hogere microorganismen. Zo kan bijvoorbeeld uit kikkers afkomstig DNA dat codeert voor ribosomaal RNA in pUCl worden ingebouwd. Het circulaire recombinant plasmide bestaat dan uit pUCl en een stukje kikker rDNA.

Het recombinant plasmide kan in een gastheerorganis-30 me worden ingebracht en daarin tot expressie komen. Voorbeelden van waardevolle genen zijn die welke coderen voor somatostatine, ratte-proinsuline en proteasen.

pUCl ontleent zijn betekenis daaraan dat het in staat is om als plasmide vector te functioneren in micro-35 organismen die voor industriële toepassingen van belang zijn zoals 800 1 2 40 Μ .

5

Streptomyces. Kloneren van DNA uit Streptomyces in pUCl biedt de mogelijkheid om de vorming van economisch belangrijke produk-ten uit deze organismen, zoals antibiotica, te verhogen. Dit voorstel kan worden vergeleken met het kloneren van genen voor 5 antibiotica in Escherichia coli K-12. Deze Gram-negatieve bacterie heeft echter het bezwaar, dat genen uit bepaalde Gram-positieve bacteriën zoals Baccillus daarin niet goed tot expressie komen. Evenzo komen genen uit Gram-negatieve bacteriën slecht of in het geheel niet tot expressie in Gram-positieve gastheren.

10 Hiermee wordt het voordeel van een Gram-positief gastheervector-systeem en daarmee de bruikbaarheid van pUCl in een dergelijk systeem onderstreept.

Behalve bovengeschetste moeilijkheden met genexpressie, kunnen zich ook moeilijkheden voordoen bij het kweken 15 van het micro-organisme en met de extractie en zuiverheid van het product. Aan deze moeilijkheden zou tegemoet kunnen worden gekomen door een plasmide vector bijvoorbeeld pUCl in te brengen in een gastheer die het produkt vormt en de genen voor het betreffende produkt in het plasmide te kloneren. Aldus zouden de 20 moeilijkheden met fermentatie, extractie en zuivering in elk geval worden verkleind. Bovendien zou het in een dergelijk systeem niet noodzakelijk zijn om al de genen voor de biosynthese te kloneren en te vermenigvuldigen maar alleen de regulerende genen of genen die coderen voor de enzymen die de productiesnelheid 25 beheersen. Omdat pUCl een streptomyceet plasmide is, leent het zich voor deze doeleinden bij uitstek in Streptomyces. Omdat pUC1 verder een plasmide uit een Gram-positief micro-organisme is, kan het bovendien dienen als vector in een aantal andere micro-organismen zoals Bacillus en Arthrobacter.

30 Streptomyces fradiae NRRL 11443 kan in een waterig voedingsmedium onder submerse aerobe omstandigheden worden gekweekt. Het voedingsmedium kan een koolstofbron bijvoorbeeld een assimileerbare koolhydraat bevatten en een stikstofbron bijvoorbeeld een assimileerbare stikstofverbinding of een proteïne.

35 Koolstofbronnen die de voorkeur hebben omvatten glucose, bruine 800 1 2 40 6 suiker, sucrose, glycerol, zetmeel, maïszetmeel, lactose, dextrine en molasse. Stikstofbronnen die de voorkeur hebben omvatten mais-weekvloeistof, gist, geautolyseerde brouwersgist met vaste melk-bestanddelen, soyaboonmeel, katoenzaadmeel, maïsmeel, vaste melk-5 bestanddelen, pancreaties verteerd caseine, gistmeel, vaste destillateurs bestanddelen, dierlijke pepton vloeistoffen en vlees- en beender afval. Combinaties van voornoemde koolstof- en stikstofbronnen komen eveneens in aanmerking. Omdat verder kraanwater en ongezuiverde bestanddelen worden gebruikt alvorens het 10 medium te steriliseren, is het niet nodig om spore-metalen zoals zink, magnesium, mangaan, kobalt en ijzer, toe te voegen.

Het geente medium wordt bij een temperatuur van ongeveer J8-50°C en bij voorkeur 20-37°C geincubeerd. Na ongeveer 3-J5 dagen is de groei van het micro-organisme optimaal. Het 15 medium blijft tijdens de groeicyclus zuur. De eind pH is gedeeltelijk afhankelijk van eventueel aanwezige buffer en gedeeltelijk van de begin pH van het medium.

Wanneer het kweken wordt uitgevoerd in grote vaten of tanks, verdient het voorkeur om in plaats van de spore-vorm 20 de vegetatieve vorm van het micro-organisme te gebruiken voor het enten om een al te grote lag in de groei van het micro-organisme te vermijden en daarmee ondoelmatig gebruik van de apparatuur.

Om een vegetatieve ent te vormen wordt een voedingsbouillon geent met een passend gekozen hoeveelheid van een kweek in een vloei-25 bare agar, of een kweek in een schuine buis. De jonge en actieve vegetatieve ent wordt dan onder aseptische omstandigheden in een kweekvat of kweektank gebracht. Het medium waarin de vegetatieve ent wordt gevormd kan hetzelfde zijn als wordt gebruikt voor de groei van het micro-organisme.

30

Yoorheéld - Isolatie van pUCJ uit een zuivere cultuur van Streptomyces fradiae NRRL 11443

Sporen van een zuivere cultuur van Streptomyces 35 fradiae NRRL 11443 werden geent in 10 ml medium dat 1 gew.% glucose, 800 1 2 40 'ït 7 0,4 gew.% pepton, 0,4 gew.% gist-extrakt, 0,05 gew.% MgSo^.7H20, 0,2 gew.% KH2P0^ en 0,4 gew.% I^HPO^ bevatte.

Het medium was tevoren gesteriliseerd in een 50 ml Erlenmeyerkolf.

Na het enten werd de inhoud van de kolf ongeveer 24-36 uren ge-5 incubeerd bij 32°C in een Gump of New Brunswick rotatie-schud-inrichting bij een snelheid van 100-250 omw./min.

Na afloop werd 0,5 ml van de cultuur in een 50 ml Erlenmeyerkolf gemengd met 10 ml van bovengenoemd medium waaraan 0,5-2,0 gew./vol.%.glycine was toegevoegd. De aanwezigheid van 10 glycine is niet noodzakelijk maar bevordert de lysis van de cellen.

De hoeveelheid glycine in het medium kan overigens variëren maar wordt gewoonlijk zodanig gekozen dat de lysis van de cellen erdoor wordt bevorderd. De inhoud van de kolf werd nog eens 24-36 uren geincubeerd bij 32°C in een Gump rotatieschudinrichting.

15 Na afloop werd het mycelium van de cultuurvloeistof gescheiden door centrifugeren bij lage snelheid zoals 6000 x g gedurende 15 min. bij 4°C gevolgd door afschenken van de bovenstaande vloeistof. Hierna werd het mycelium gesuspendeerd in 1,5 ml TES buffer (0,03 M tris (hydroxymethyl) aminomethaan (Tris), 0,005 M EDTA en 20 0,05 M NaCl, pH 8,0) waaraan 20 gew./vol.% sucrose was toegevoegd.

Na toevoegen van 0,3 ml van een 5 mg/ml oplossing van lysozym en 0,15 ml van een 1 mg/ml RNase in dezelfde buffer werd het mengsel 30 min. geincubeerd bij 37°C waarbij van tijd tot tijd werd geroerd. Na toevoegen van 0,6 ml 0,25 M EDTA (pH 8,0) werd 25 het incuberen bij 37°C nog 15 min. wordt voortgezet en na toevoegen van 0,3 ml 5 mg/ml pronase nog eens 10 min. bij 37°C.

Na afloop werd de celsuspensie gelyseerd door toevoegen van 3,0 ml 2 gew.% sarkosyl bevattende TES buffer en werd 20-30 min. geincubeerd bij 37°C. Het lysaat werd daarna afgeschoven door 30 het 5—J0 keer door een 50 ml injektiespuit zonder naald te halen.

Het ruwe lysaat werd vervolgens gemengd met een zout bijvoorbeeld cesiumsulfaat en bij voorkeur cesiumchloride, en de ingevoegde kleurstof ethidiumbromide om een oplossing met een dichtheid van 1,550 te verkrijgen. De oplossing werd ge-35 centrifugeerd tot evenwicht bij 145.000 x g (isopyknische dicht- 800 1 2 40 8 heidsgradient). Het covalent gesloten circulaire plasmide DNA was in de centrifugeerbuis onder langgolvige ultraviolette straling (320 ma) waarneembaar als een flauwe fluorescerende band onder de intens fluorescerende band van lineaire chromosomale 5 en plasmide DNA's.

Het plasmide DNA werd uit de isopyknische gradiënten verwijderd en het ethidiumbromide wordt geextraheerd door twee keer behandelen met 1/3 volume isopropanol waarna de waterige fase werd gedialyseerd tegen een buffer zoals een 0,1 X SSC 10 buffer (0,015 M NaCl, 0,0015 M Na^gH^^O, pH - 7,4) waarbij praktisch zuiver pUCl wordt verkregen.

Karakterisering van pCIJl

De grootte van pUCl werd bepaald door sedimentatie en in neutrale/basische sucrose gradiënten onder gebruikmaking van 15 een intern markeur plasmide DNA met een molekuulgewicht van ongeveer 28,0 megadalton en een overeenkomstige sedimentatie-waarde van ongeveer 58S. Uit de neutrale sucrose gradiënten werd de sedimentatie waarde van het geïsoleerde pUCl bepaald op 76S.

Het molekuulgewicht werd berekend uit de vergelijkingen van 20 Hudson et al ("Complex mitochondrial DNA", Cold Spring Harbor

Symp. Quant, Biol. _33, 435-442) en was in goede overeenstemming met de bepaling op grond van de basische sucrose gradiënten.

Het molekuulgewicht van pUCl werd ook bepaald door electronenmicroscopie van afzonderlijke DNA molekulen 25 (Kleinschmidt, A.K. (1968): Monolayer techniques in electron microscopy of nucleic acid molecules; "Method in Enzymology" (S.P. Colowick en N.O. Kaplan, eds.) Vol. 12B, biz. 361-377,

Academic Press, New York),

Voor de gemiddelde contour lengte werd een waarde 30 van 24,0 + 0,6 yUm gevonden en een overeenkomstig molekuulgewicht van 47,1 1,2 megadalton.

Het percentage plasmide DNA in Streptomyces fradiae NRRL 11443 werd bepaald door de cultuur te merken met (methyl-^) -thymidine, prepareren van de ruwe lysaten, en monsters van de 35 lysaten te centrifugeren in cesiumchloride ethidiumbromide dicht- 100 1 2 40 9 heidsgradiënten. De gradiënten werden gefractionneerd en de radioactiviteit werd gemeten waarna uit het percentage radioactiviteit in de plasmideband het percentage plasmide DNA en het aantal plasmidecopiën werden berekend (Radloff, R., Bauer, W. en Vinograd, 5 J. 1967: "A dye-buoyant density method for detection and isolation of closed circular duplex DNA: The closed circular DNA in HeLa cells", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 57, 1514-1520).

Restrictie endonuclease fragmentering en agarosegel electroforese.

JO Restrictie endonucleasen werden als handelpreparaten verkregen van Miles Laboratories en New England Biolabs die ook de specifikaties verschaften voor het fragmenteren met ten minste een tweevoudige overmaat endonuclease. Bij sommige bepalingen werd het plasmide DNA gefragmenteerd met meer dan één endonuclease.

15 De bepalingen werden uitgevoerd volgens twee methoden. Volgens de eerste x^erd het plasmide DNA eerst gefragmenteerd met het enzym dat een lagere ionische sterkte behoeft en daarna met het enzym dat een hogere ionische sterkte behoeft na toevoeging van een gelijk volume 2X buffer van het tweede enzym.

20 Volgens de tweede methode werden restrictiefragmenten van een enzym geïsoleerd uit een preparatieve agarosegel zoals beschreven door Tanaka en Weisblum (Tanaka, T., en Weisblum, B. 1975: Construction of a colicin El-R factor composite plasmid in vitro; Means for amplification of deoxyribonucleic acid, J. Bacteriol.

25 354-362) .

De geïsoleerde restrictiefragmenten werden geconcentreerd door ethanol precipitatie en daarna gefragmenteerd met andere restrictie enzymen. In duplo uitgevoerde fragmentaties werden vergeleken met enkelvoudig uitgevoerde fragmentaties om 30 er zeker van te zijn dat geen abnormale restrictiepatronen xxrerden verkregen, dat wil zeggen dat er niet een niet-specifieke splitsing van DNA optreedt na verandering van de ionische sterkte van het voor de fragmentering gebruikte mengsel.

De gefragmenteerde monsters werden opgebracht op 35 0,7 en 1 gew.% agarose gelen en 2 uren onderworpen aan electro- 800 1 2 40 10 forese bij een constante spanning van 10-15 V/cm gel hoogte (Sharp, P.A., Sugden, J. en Sambrook, J., 1973: Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis, 5 Biochemistry 12, 305-3063). De molekuulgewichten van de fragmenten werden bepaald ten opzichte van de standaardmigratiepatronen van bacteriofaag λ DNA gefragmenteerd met enzym EcoRI (Helling, R.B., Goodman, H.M. en Boyer, H.W. 1974: Analysis of endonuclease R.EcoRX fragments of DNA from lambdiod bacteriophages 10 and other viruses bij agarose-gel electrophoresis, J. Virology 14, 1235-1244).

Al de beschreven proefen en bepalingen werden uitgevoerd volgens de specifikaties in de NIH Guidelines.

800 1 2 40

Claims (6)

1. Plasmide DNA met het kenmerk, dat plasmide DNA met de code pUCl in zuivere of praktisch zuivere toestand een 5 molekuulgewicht bezit van ongeveer 47,1 +_ 1,2 megadalton en een restrictie endonuclease fragmenteringspatroon zoals weergegeven in het diagram.

2. Werkwijze voor het isoleren van plasmide DNA uit een micro-organisme, met het kenmerk, zuiver of praktisch 10 zuiver pUCl zoals omschreven in conclusie 1 wordt geïsoleerd uit Streptomyces fradiae NRRL I1443 waarbij (a) S.fradiae NRRL 11443 wordt gekweekt tot het mycelium voldoende is gegroeid, (b) het mycelium wordt gefragmenteerd, 15 (c) het gefragmenteerde mycelium wordt ge- incubeerd, (d) de cultuur wordt geoogst, (e) het geoogste mycelium wordt gelyseerd, en (f) uit het lysaat zuiver of praktisch 20 zuiver pUCl wordt geïsoleerd.

3. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het micro-organisme ongeveer 24 - 48 uren wordt gekweekt bij een temperatuur van ongeveer 32°C.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het gefragmenteerde mycelium wordt geincubeerd in een glycine bevattend groeimedium.

5. Plasmide pUCl verkrijgbaar met de werkwijze zoals beschreven in de beschrijving en het voorbeeld.

6. Produkten en werkwijzen zoals beschreven in de beschrijving en het voorbeeld. 800 1 2 40