NL8001381A - Plasmide dna en werkwijze voor het verkrijgen daarvan. - Google Patents

Description

Plasmide DNA en werkwijze voor het verkrijgen daarvan.

Het is bekend, dat bacteriële plasmiden worden gebruikt voor recombinant DNA onderzoek. Voor een goed overzicht van de ontwikkeling op dit gebied wordt verwezen naar Science, vol. 196, april 1977. Recombinant DNA onderzoek aan industrieel belang-5 rijke micro-organismen van het genus Streptomyces is beschreven door Bibb, M.J., V7ard, J.M. en Hopwood, D.A., 1978: "Transformation of plasmid DNA into Streptomyces at high frequency", Nature 274, 398-400.

Aan verscheidene Streptomyceten is vastgesteld, 10 dat deze DNA plasmiden bevatten. Zie Huber, M.L.B. en Godfrey, O. 1978: "A general method for lysis of Streptomyces species", Can.

J. Micriobiol. 24, 631-632; Schrempf, H., Bujard, H., Hopwood, D.A. en Goebel, W., 1975: "Isolation of covalently closed circular deoxyribonucleic acid form Streptomyces coelicolor A3(2)", J. Bateriol.

15 121, 416-421; Umezawa, H., 1977: "Microbial secondary metabolities with potential use in cancer treatment (Plasmid involvement in biosynthesis and compound^", Biomedicine 26, 236-249; en Malik V.S. 1977: Preparative method for the isolation of supercoiled DNA from a chloramphenicol producing Streptomycete, J. Antibiotics 30, 897-20 899. Niettemin is tot nog toe slechts één Streptomyceet plasmide geïsoleerd en beschreven door Schrempf supra. Dat in het genus Streptomyces nog andere plasmiden voorkomen kan worden afgeleid uit resultaten van genetisch onderzoek beschreven door: (1) Akagawa, H., Okanishi, M. en Umezawa, H., 25 1975: "A plasmid involved in chloramphenicol production in Streptomyces venezuelae; Evidence from genetic mapping", J. Gen. Microbiol. 90, 336-346.

(2) Freeman, R.F. en Hopwood, D.A., 1978: 800 1 3 81 J 2 f "Unstabel naturally occurring resistance to antibiotics in Streptomyces*',J. Gen. Microbiol. 106, 377-381.

(3) Friend, E.J., Warren, M. en Hopwood, D.A., 5 1978: "Genetic evidence for a plasmid control ling fertility in an industrial strain of Streptomyces rimosus", J. Gen. Microbiol.

106, 201-206.

(4) Hopwood, D.A. en Wright, H.M. 1973: "A plas- 10 mid of Streptomyces coalicolor carrying a chromosomal locus and its inter-specific transfer", J. Gen. Microbiol. 79, 331-342.

(5) Hotaa, K. Okami, Y. en Umezawa, H., 1977: "Elimination of the ability of a kanamycin- 15 producing strain to biosynthesize deoxy- streptamine moiety by acriflavine", J. Antibiotics 30, 1146-1149.

(6) Kirby, R., Wright, L.F. en Hopwood, D.A., 1975: "Plasmid-determined antibiotic synthe- 20 sis and resistance in Streptomyces coeli-color11

Nature 254, 265-267.

(7) Kirby, R. en Hopwood, D.A., 1977: "Genetic determination of methylenomycin synthesis by the SCPI plasmid of Streptomyces coelicolor 25 A3(2)", J. Gen. Microbiol. 98, 239-252.

(8) Okanishi, M., Ohta, T. en Umezawa, H., 1969: "Possibel control of formation of aerial mycelium and antibiotic production in Streptomyces by episomic factors", J. Anti- 30 biotics 33^, 45-47.

Gevonden is, dat het micro-organisme Streptomyces fradiae NRRL 11446 een niet eerder beschreven plasmide bevat. Dit plasmide, dat de code p UC9 kreeg, bezit een molecuulgewicht van ongeveer 42,4 megadalton, wordt door restrictie endo-nuleasen BamHI 35 -op meer dan 10 plaatsen, Pst I op meer dan 15 plaatsen, Xba op 2 800 1 3 81 3 plaatsen, Bgl II ot> 5 plaatsen, Hind III op 2 plaatsen en Xho op meer dan 14 plaatsen gefragmenteerd, en komt in 2 copiën per cel s. fradiae nrkl 11446 voor.

pUC9 wordt uit Strentomyces fradiae NRRL 11446 5 geïsoleerd door het mvcelium van een cultuur te fragmenteren, de fragmenten te incuberen, de cultuur te oogsten, het mvcelium te lvseren en het plasmide uit het lvsaat te isoleren. Het plasmide is praktisch zuiver.

Omdat p UC9 door verschillende restrictie endonucleasen wordt afge-10 broken of "geknipt", kan het gemakkelijk worden gerecombineerd en aangepast voor een aantal gastheervektoren, p OC9 kan ook worden gebruikt als een klonerende vektor bij recombinant DNA onderzoek waarbij gekozen genen in het plasmide worden ingebouwd waarna het plasmide in een gastheerbacterie en/of vektor wordt ingebracht.

15 Karakteristieken van n UC9 42 4

Molecuulgewicht: ongeveer / jftegadalton.

Aantal copiën per cel: 2.

Restrictie endonuclease plaatsen:

Aantal restrictieplaatsen Aantal restrictieplaatsen 20 Enzym pUC9 Enzym pUC9

BamHI >10 Hind III 2

Pst I >15 Xho I >14

Xba I 2

Bgl II 5 25 Deze waarden werden verkregen door p UC9 DNA te fragmenteren bij aanwezigheid van een overmaat restrictie endonuclease en het aantal in 0,7 en 1,0 %-ige agarose gelen oplosbare fragmenten te bepalen.

püC9 kan worden gebruikt voor het verkrijgen van recombinant plasmiden die in gastheerbacteriën kunnen worden inge-30 bracht. Daarbij wordt het DNA van het circulaire vektoriële plasmide met restrictie endonuclease, bijvoorbeeld Hind III of Xba I op specifieke plaatsen opengeknipt waarbij lineair DNA ontstaat. Tussen de uiteinden daarvan wordt een stukje vreemd niet-vektorieel DNA geplakt onder ringsluiting door de lineaire vektor of stukjes daar-35 van, en de niet-lineaire vektor te mengen bij aanwezigheid van een 800 1 3 81 4 polynucleotide ligase.

Het vreemde DNA, verkregen met hetzelfde enzym kan afkomstig zijn van hogere micro-organismen. Zo kan bijvoorbeeld uit kikkers afkomstig DNA dat codeert voor ribosomaal RNA in pUC9 5 worden ingebouwd. Het circulaire recombinant piasmide bestaat dan uit pUC9 en een stukje kikker rDNA.

Het recombinant plasmide kam in een gastheer-organisme worden ingebracht en daarin tot expressie komen. Voorbeelden van waardevolle genen zijn die welke coderen voor somatostatine, 10 ratte-proinsuline en proteasen.

p(JC9 ontleent zijn betekenis daaraan dat het in staat is om als plasmide vektor te functioneren in micro-organismen die voor industriële toepassingen van belang zijn zoals Streptomyces. Kloneren van DNA uit Streptomyces in pUC9 biedt de mogelijkheid om 15 de vorming van economisch belangrijke produkten uit deze organismen, zoals antibiotica, te verhogen. Dit voorstel kan worden vergeleken met het kloneren van genen voor antibiotica in Escherichia coli K- 12. Deze Gram-negatieve bacterie heeft echter het bezwaar, dat genen uit bepaalde Gram positieve bacteriën zoals Bacillus daarin niet goed 20 tot expressie komen. Evenzo komen genen uit Gram-negatieve bacteriën slecht of in het geheel niet tot expressie in Gram-positieve gastheren. Hiermee wordt het voordeel van een Gram-positief gastheervek-torsysteem en daarmee de bruikbaarheid van püC9 in een dergelijk systeem onderstreept.

25 Behalve bovengeschetste moeilijkheden met gen expressie, kunnen zich ook moeilijkheden voordoen bij het kweken van het micro-organisme en met de extractie en zuiverheid van het pro-dukt. Aan deze moeilijkheden zou tegemoet kunnen worden gekomen door een plasmide vektor bijvoorbeeld pUC9 in te brengen in een gastheer 30 die het produkt vormt en de genen voor het betreffende produkt in het plasmide te kloneren. Aldus zouden de moeilijkheden met fermentatie, extractie en zuivering in elk geval worden verkleind. Bovendien zou het in een dergelijk systeem niet noodzakelijk zijn om al de genen voor de biosynthese te kloneren en te vermenigvuldigen maar 35 alleen de regulerende genen of genen die coderen voor de enzymen die de produktiesnelheid beheersen. Omdat pUC9 een streptomyceet plasmide 80 0 1 3 81 5 is, leent het zich voor deze doeleinden bij uitstek in Strentomyces. Omdat pUC9 verder een plasmide uit een G^am-positief micro-organis-me is, kan het bovendien dienen als vektor in een aantal andere micro-organismen zoals Bacillus en Arthrobacter, 5 Streptomyces fradiae NRRL 11446 kan in een wate rig voedingsmedium onder submerse aerobe omstandigheden worden gekweekt, Het voedingsmedium kan een koolstofbron bijvoorbeeld een assimileerbare koolhydraat bevatten en een stikstofbron bijvoorbeeld een assimileerbare stikstofverbinding of een proteïne. Kool-10 stofbronnen die de voorkeur hebben omvatten glucose, bruine suiker, sucrose, glycerol, zetmeel, maïszetmeel, lactose, dextrine en melasse. Stikstofbronnen die de voorkeur hebben omvatten malsweekvloei-stof, gist, geautolyseerde brouwersgist met vaste melkbestanddelen, sojaboonmeel, katoenzaadmeel, maïsmeel, vaste melkbestanddelen, 15 pancreaties verteerd caseïne, gistmeel, vaste destillateurs bestanddelen, dierlijke nepton vloeistoffen en vlees- en beender afval. Combinaties van voornoemde koolstof- en stikstofbronnen komen eveneens in aanmerking. Omdat verder kraan water en ongezuiverde bestanddelen worden gebruikt alvorens het medium te steriliseren, is het 20 niet nodig om spor-metalen zoals zink, magnesium, mangaan, kobalt en ijzer, toe te voegen.

Het geënte medium wordt bij een temperatuur van ongeveer 18-50° C en bij voorkeur 20-37° C geincubeerd. Na ongeveer 3-15 dagen is de groei van het micro-organisme optimaal. Het medium 25 blijft tijdens de groeicyclus zuur, De eind pH is gedeeltelijk afhankelijk van eventueel aanwezige buffer en gedeeltelijk van de begin pH van het medium.

Wanneer het kweken wordt uitgevoerd in grote vaten of tanks, verdient het voorkeur om in plaats van de spore-30 vorm de vegetatieve vorm van het micro-organisme te gebruiken voor het enten om een al te grote la^g in de groei van het micro-organisme te vermijden en daarmee ondoelmatig gebruik van de apparatuur. Om een vegetatieve ent te vormen wordt een voedingsbouillon geënt met een passend gekozen hoeveelheid van een kweek in een vloeibare 35 agar, of een kweek in een schuine buis. De jonge, actieve vegetatieve 800 1 3 81 6 ent wordt dan onder aseptlsche omstandigheden in een kweekvat of kweektank gebracht. Het medium waarin de vegetatieve ent wordt gevormd kan hetzelfde zijn als wordt gebruikt voor de groei van het micro-organi sme.

5 Voorbeeld - Isolatie van pUC9 uit een zuivere cultuur van Streptomyces fradlae NRHL 11446.

Sporen van een zuivere cultuur van Streptomyces fradlae NRRL 11446 werden geënt in 10 ml medium dat 1 gew.% glucose/ 0,4 gew.% pepton, 0,4 gew.% gist-extract, 0,05 gew.% MgSC>4.7H20, 10 0,2 gew.% kh2P04 en 0,4 gew.% bevatte.

Het medium was tevoren gesteriliseerd in een 50 ml Erlenmeyerkolf.

Na het enten werd de inhoud van de kolf ongeveer 24-36 uren geincu-beerd bij 32° C in een Gump of New Brunswick rotatie-schud-inrich-ting bij een snelheid van 100-250 omw./min.

15 Na afloop werd 0,5 ml van de cultuur in een 50 ml

Erlenmeyerkolf gemengd met 10 ral van bovengenoemd medium waaraan 0,5-2,0 gew,/vol.% glycine was toegevoegd. De aanwezigheid van glycine is niet noodzakelijk maar bevordert de lysis van de cellen. De hoeveelheid glycine in het medium kan overigens variëren maar wordt 20 gewoonlijk zodanig gekozen dat de lysis van de cellen erdoor wordt bevorderd. De inhoud van de kolf werd nog eens 24-36 uren geincu-beerd bij 32° c in een Gump rotatieschudinrichting. Na afloop werd het mycelium van de cultuurvloeistof gescheiden door centrifugeren O' bij lage snelheid zoals 6000 x g gedurende 15 min. bij 4 C gevolgd 25 door afschenken van de bovenstaande vloeistof. Hierna werd het mycelium gesuspendeerd in 1,5 ml TES buffer (0,03 M tris(hydroxymethyl )aminomethaan (Tris), 0,005 M EDTA en 0,05 M NaCl, pH 8,0) waaraan 20 gew./vol.% sucrose was toegevoegd. Na toevoegen van 0,3 ml van een 5 mg/ml oplossing van lysozym en 0,15 ml van een 1 mg/ml 30 KNase in dezelfde buffer werd het mengsel 30 min. geincubeerd bij 37° c waarbij van tijd tot tijd werd geroerd. Na toevoegen van 0,6 ml 0,25 M EDTA (pH 8,0) werd het incuberen bij 37° C nog 15 min. voortgezet en na toevoegen van 0,3 ml 5 mg/ml pronase nog eens 10 min. bij 37° C. Na afloop werd de celsuspensie gelyseerd door toe-35 voegen van 3,0 ml 2 gew.% sarkosyl bevattende TES buffer en werd 800 1 3 81 7 20-30 min. geïncubeerd bij 37° C. Het lvsaat werd daarna afgeschoven door het 5-10 keer door een 50 ml injectiespuit zonder naald te halen.

Het ruwe lvsaat werd vervolgens gemengd met een 5 zout bijvoorbeeld cesiumsulfaat en bij voorkeur cesiumchloride, en de ingevoegde kleurstof ethidiumbromide om een oplossing met een dichtheid van 1,550 te verkrijgen. De oplossing werd gecentrifugeerd tot evenwicht bij 145.000 x g (isopyknische dichtheidsgradiënt). Het covalent gesloten circulaire plasmide DNA was in de centrifu-10 geerbuis onder langgolvige ultraviolette straling (320 nm) waarneembaar als een flauwe fluorescerende band onder de intens fluorescerende band van lineaire chromosomale en plasmide DNA's.

Het plasmide DNA werd uit de isopyknische gradiënten verwijderd en het ethidiumbromide werdt geëxtraheerd door 15 twee keer behandelen met 1/3 volume isopropanol waarna de waterige fase werd gedialyseerd tegen een buffer zoals een 0,1 x SSC buffer (0,015 M NaCl, 0,0015 M Na3C6H507.2H20, dH 7,4) waarbij praktisch zuiver dUC9 wordt verkregen.

Karakterisering van pUC9.

20 De grootte van pUC9 werd bepaald door sedimenta tie in neutrale en basische sucrose gradiënten onder gebruikmaking van een intern markeur plasmide DNA met een molecuulgewicht van ongeveer 28,0 megadalton en een overeenkomstige sedimentatiewaarde van ongeveer 58S. Uit de neutrale sucrose gradiënten werd de sedi-25 mentatiewaarde van het geïsoleerde pUC9 bepaald op 78S. Het molecuulgewicht werd berekend uit de vergelijkingen van Hudson et al (Hudson, B., Clayton, D.A. en Vinograd, J., 1968: "Complex mitochondrial DNA", Cold Spring Harbor Syrap, Ouant, Biol. 33, 435-442) en was in goede overeenstemming met de bepaling op grond van de 30 basische sucrose gradiënten.

Het percentage plasmide DNA in Strentomyces fradiae NRRL 11446 werd bepaald door de cultuur te merken met (methyl -3H) thymidine, prepareren van de ruwe lysaten, en monsters van de lysaten te centrifugeren in cesiumchloride ethidiumbromide dicht-35 heidsgradiënten. De gradiënten werden gefractioneerd en de radio- 800 1 3 81 8 activiteit werd gemeten waarna uit het percentage radio-activiteit in de plasmideband het percentage plasmide DNA en het aantal piasmi-decopiën werden berekend (Radloff, R., Bauer, w. en Vinograd, J., 1967: "A dye-buoyant density method for detection and isolation of 5 closed circular duplex DNA: The closed circular DNA in BeLa cells", Proc. Nat. Acad. Sci. ÜSA 57, 1514-1520).

Restrictie endonuclease fragmentering en agarosegel elektroforese.

Restrictie endonucleasen werden als handelprepa-raten verkregen van Miles laboratories en New England Biolabs die 10 ook de specificaties verschaften voor het fragmenteren met tenminste eèn tweevoudige overmaat endonuclease.

De gefragmenteerde monsters werden opgebracht op 0,7 en 1 gew.% agarose gelen en 2 uren onderworpen aan elektroforese bij een constante spanning van 10-15 V/cm gel hoogte (Sharp, P.A., 15 Sugden, J. en Sambrook, J., 1973: Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilüs parainfluenzas using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis, Biochemistry JL2, 3055-3063). De molecuulgewichten van de fragmenten werden bepaald ten opzichte van de standaardmigratiepatronen van bacteriofaag DNA 20 gefragmenteerd met enzym EcoRI (Helling, R.B., Goodman, H.M. en Boyer, H.W., 1974; Analysis of endonuclease R.EcoRI fragments of DNA from lambdiod bacterophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis, J. Virology 14, 1235-1244).

Al de beschreven proeven en bepalingen werden 25 uitgevoerd volgens de specificaties in de NIH Guidelines.

800 1 3 81

Claims (6)

1. Plasmide DNA met het kenmerk, dat plasmide DNA met de code pUC9 in zuivere of praktisch zuivere toestand een molecuulgewicht bezit van ongeveer 42,4 megadalton en door de re- 5 strictie endonucleasen BamEI op meer dan 10 plaatsen, Pst I op meer dan 15 plaatsen, Xbalop 2 plaatsen, Bgl II op 5 plaatsen, Hind III op 2 plaatsen en Xho I op meer dan 14 plaatsen wordt gefragmenteerd.

2. Werkwijze voor het isoleren van plasmide DNA uit een micro-organisme, met het kenmerk, dat zuiver of praktisch 10 zuiver pUC9 zoals omschreven in conclusie 1 wordt geïsoleerd uit Streotomyces fradiae NRRL 11446 waarbij (a) S.fradiae NRRL 11446 wordt gekweekt tot het mycelium voldoende is gegroeid, (b) het mycelium wordt gefragmenteerd, 15 (c) het gefragmenteerde mycelium wordt geïncu- beerd, (d) de cultuur wordt geoogst, (e) het geoogste mycelium wordt gelyseerd, en (f) uit het lvsaat zuiver of praktisch zuiver 20 pUC9 wordt geïsoleerd.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het micro-organisme ongeveer 24-36 uren wordt gekweekt bij een temperatuur van ongeveer 32° C.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, 25 dat het gefragmenteerde mycelium wordt geïncubeerd in een glycine bevattend groeimedium.

5. Plasmide pUC9 verkrijgbaar met de werkwijze zoals beschreven in de beschrijving en het voorbeeld.

6. Produkten en werkwijzen zoals beschreven in 30 de beschrijving en het voorbeeld. 800 1 3 31