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DE3008647A1 - Plasmid puc1 und verfahren zum isolieren von plasmid puc1 aus streptomyces fradiae - Google Patents

Plasmid puc1 und verfahren zum isolieren von plasmid puc1 aus streptomyces fradiae

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Publication number
DE3008647A1
DE3008647A1 DE19803008647 DE3008647A DE3008647A1 DE 3008647 A1 DE3008647 A1 DE 3008647A1 DE 19803008647 DE19803008647 DE 19803008647 DE 3008647 A DE3008647 A DE 3008647A DE 3008647 A1 DE3008647 A1 DE 3008647A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
plasmid
puc1
dna
streptomyces fradiae
streptomyces
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE19803008647
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English (en)
Inventor
Shiau-Ta Chung
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pharmacia and Upjohn Co
Original Assignee
Upjohn Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Upjohn Co filed Critical Upjohn Co
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Description

3Q08647
lenkel, Kern, Feiler & Hänzel Patentanwälte
Registered Representatives
before the
European Patent Office
Möhlstraße 37
D-8000 München 80
Tel.: 089/982085-87 Telex: 0529802 hnkl d Telegramme: ellipsoid
TUC 3^78 Dr.F/rm
TIiE UPJOHN COMPANY
Kalamazoo, Mich., V.St.A.
Plasmid pUC1 und Verfahren zum Isolieren von Plasmid pUC1
aus Streptomyces fradiae
3 ü 0 A 1 / äj B 8 9
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Beschreibung
Die Entwicklung von Plasmidvektoren für rekombinante DNS-Gentechnologie bei Mikroorganismen ist bekannt. Eine ausführliche Zusammenfassung über die DNS-Forschung findet sich in "Science», Band 196, April 1977.
Ähnliche DNS-Arbeiten sind derzeit bei industriell wichtigen Mikroorganismen der Gattung Streptomyces im Gange (vgl. M.J. Bibb, J.M. Ward und D.A. Hopwood in "Nature", Band 274, Seiten 398 bis 400 (1978) "Transformation of plasmid DNA into Streptomyces at high frequency"). Obwohl in verschiedenen Streptomyceten Plasmid-DNS·en nachgewiesen wurden (vgl. M.L.B. Huber und 0. Godfrey in "Can. J. Microbiol.», Band 24, Seiten 631 und 632 (1978) "A general method for lysis of Streptomyces species"; H. Schrempf, H. Bujard, D.A. Hopwood und W. Goebel in "J. Bacteriol.", Band 121, Seiten 416 bis 421 (1975) "Isolation of covalently closed circular deoxy-ribonucleic acid from Streptomyces coelicolor A3(2)"; H. Umezawa in "Biomedicine", Band 26, Seiten 236 bis 249 (1977) "Microbial secondary metabolities with potential use in cancer treatment (Plasmid involvement in biosynthesis and compounds)" und V.S. Malik in "J. Antibiotics", Band 30, Seiten 897 bis 899 (1977) "Preparative Method for the isolation of super-coiled DNA from a chloramphenicol producing Streptomycete"), wurde lediglich ein Streptomyceten-Plasmid physikalisch isoliert und ausführlich in der Literatur beschrieben (vgl. Schrempf aaO). Das Vorliegen anderer Plasmide in der Gattung Streptomyces wurde aus den in den folgenden Veröffentlichungen veröffentlichten genetischen Daten geschlossen:
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(1) H. Akagawa, M. Okanishi und H. Umezawa in "J. Gen. Microbiol.", Band 90, Seiten 336 bis 346 (1975) "A plasmid involved in chloramphenicol production in Streptomyces venezuelae: Evidence from genetic mapping";
(2) R.F. Freeman und D.A. Plopwood in "J. Gen. Microbiol.", Band 106, Seiten 377 bis 381 (1978) "Unstable naturally occurring resistance to antibiotics in Streptomyces";
(3) E.J. Friend, M. Warren und D.A. Hopwood in "J. Gen. Microbiol.11 ,Band 106, Seiten 201 bis 206 (1978) "Genetic evidence for a plasmid controlling fertility in an industrial strain of Streptomyces rimosus";
(4) D.A. Hopwood und H.H. Wright in »J. Gen. Microbiol.", Band 79, Seiten 331 bis 342 (1973) "A plasmid of Streptomyces coelicolor carrying a chromosomal locus and its inter-specific transfer";
(5) K. Hotta, Y. Okami und H. Umezawa in »J. Antibiotics", Band 30, Seiten 1146 bis 1149 (1977) "Elimination of the ability of a kanamycin-producing strain to biosynthesize deoxystreptamine moiety by acriflavine";
(6) R. Kirby, L.F. Wright und D.A. Hopwood in "Nature", Band 254, Seiten 265 bis 267 (1975) "Plasmiddetermined antibiotic synthesis and resistance in Streptomyces coelicolor";
(7) R. Kirby und D.A. Hopwood in "J. Gen. Microbiol.»,
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Band 98, Seiten 239 bis 252 (1977) »Genetic determination of methylenomycin synthesis by the SCPI plasmid of Streptomyces coelicolor A3(2)" und
(8) M. Okanishi, T. Ohta und H. Umezawa in "J. Antibiotics", Band 33, Seiten 45 bis 47 (1969) "Possible control of formation of aerial mycelium and antibiotic production in Streptomyces by episomid factors".
Das Plasmid pUC1 erhält man aus dem Mikroorganismus Streptomyces fradiae (DSM ). Dieses Plasmid erhält man aus dem Mikroorganismus Streptomyces fradiae (DSM ) durch Züchten der Kultur auf einem geeigneten Medium, Fragmentieren des Mycels, Inkubieren des fragmentierten Mycels, Ernten der Kultur nach einer geeigneten Zeit und anschließendes Lysieren des Mycels. Aus dem erhaltenen Lysat läßt sich im wesentlichen reines Plasmid pUC1 isolieren. Seine Empfindlichkeit gegenüber den verschiedensten Restriktionsendonukleasen sollte es auf einfache Weise Modifizierungen zugänglich machen und an eine Reihe von Wirtvektorsystemen anpassen.
Das Plasmid pUC1 wird durch Standardkennzeichnungstests, z.B. sein Molekulargewicht von etwa 47,1 Megadalton, ein Restriktionsbild bzw. eine Restriktionskarte entsprechend der Zeichnung und die Anwesenheit von einer Kopie pro Streptomyces-fradiae-(DSM )-Zelle, gekennzeichnet.
Das Plasmid pUC1 eignet sich als Klonungsvektor bei DNS-Arbeiten, bei welchen dem Plasmid die gewünschten Gene einverleibt werden und dann eine Transformierung des Plasmids in einen geeigneten Wirt erfolgt.
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In der Zeichnung ist das Restriktionsendonuklease-Spaltungs-MId für das Plasmid pUC1 dargestellt. Das Bild ist auf der Basis des Plasmids pUC1 eines Molekulargewichts von etwa 47,1 - 1,2 Megadalton bzw. einer Moleküllänge von etwa 7^1 Kilobasen konstruiert. Die Bildpositionen der verschiedenen Restriktionsstellen sind als Kilobasekoordinaten relativ zu der Xba-I-Restriktionsstelle bei 0,0/71,1 Kilobasen angegeben. Für die Restruktionsendonukleasen v/erden folgende Abkürzungen benutzt:
(1) BgI II ist ein Enzym aus Bacillus globigii;
(2) Hind III ist ein Enzym aus Haemophilus influenzae; und
(3) Xba I ist ein Enzym aus Xanthomonas badrii.
Wie bereits erwähnt, erhält man das Plasmid pUC1 aus Streptomyces fradiae (NRRL 11443). Die biologisch reine Kultur ist in der Dauersammlung der Worthern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, unter der Hinterlegungsnummer NRRL 11443 hinterlegt.
Charakterisierung des Plasmids pUC1:
Molekulargewicht: etwa 47,1 - 1,2 Megadalton Anzahl Kopien pro Zelle: eine
Empfindlichkeit gegenüber Restruktionsendonukleasen:
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Spaltstellen Plasmid pUC1 Spaltstellen Plasmid pUC1
Enzym > 15 Enzym 2
BamHI 0 Hind III * 15
EcoRI t 18 Κρη Ι 11
Pst I 2 Xho I * 15
Xba I 5 Sma I 6
BgI II Bei I
Diese Ergebnisse wurden durch Digerieren von pUC1-DNS in Gegenwart eines Überschusses an Restriktionsendonuklease erhalten. Die Anzahl der Restriktionsstellen ergibt sich aus der Anzahl der in 0,7- bzw. 1,Obigen Agarosegelen auflösbaren Fragmente.
pUC1 kann zur Schaffung rekombinanter Plasmide, die durch Transformation in Wirtbakterien eingefügt werden können, herangezogen werden. Es ist bekannt, wie rekombinante Plasmide geschaffen werden können. Bei einem solchen Verfahren erfolgt eine Spaltung des isolierten Vektorplasmids, beispielsweise pUC1, an spezifischer (spezifischen) Stelle(n) mit Hilfe einer Restriktionsendonuklease, beispielsweise Hind III, Xba I und dergleichen. Das Plasmid, bei dem es sich um ein ringförmiges DNS-Molekül handelt, wird dabei durch das Enzym, das die beiden DNS-Stränge an einer speziellen Stelle zerschneidet, in ein lineares DNS-Molekül überführt. Eine andere Nicht-Vektor-DNS wird mit demselben Enzym in ähnlicher Weise gespalten. Beim Vermischen des linearen Vektors oder von Teilen desselben mit Nicht-Vektor-DNS'en, können sich ihre einsträngigen oder stumpfen Enden miteinander paaren und in Gegenwart eines als Polynukleotidligase bekannten zweiten Enzyms unter Bildung eines einzigen DNS-Rings kovalent vereinigen.
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Die geschilderten Maßnahmen können auch zum Einbau einer bestimmten DNS-Länge aus einem höheren Tier in pUC1 herangezogen werden. So kann beispielsweise die DNS, die bei Fröschen für eine Ribosomen-RNS-Codierung verantwortlich ist, mit der gespaltenen pUC1-DNS gemischt werden. Die erhaltenen ringförmigen DNS-Moleküle bestehen aus PlasmidpUC1 mit einer eingefügten Länge Frosch-rDNS.
Die unter Verwendung von pUC1 erhaltenen, ein gewünschtes genetisches Element enthaltenden rekombinierten Plasmide können zu Abdruckzwecken in einen Wirtsorganismus eingeschleust werden. Beispiele für wertvolle Gene, die in der geschilderten Weise in Wirtsorganismen eingeschleust werden können, sind Gene mit Somatostatin-, Rattenproinsulin- und Proteasencodierung.
Der Nutzen des Plasmids pUC1 beruht auf seiner Fähigkeit zur Wirkung als Plasmidvektor bei industriell bedeutenden Mikroorganismen, z.B. Streptomyces. So erhält man durch Klonung einer genetischen Information aus Streptomyces in pUC1 eine Möglichkeit zur Steigerung industriell wertvoller Produkte aus diesen Organismen, z.B. von Antibiotika.
Dieser Versu <h ist dem Konzept einer Klonung von Genen für Antibiotikumproduktion in das gut charakterisierte Escherichia-coli-K-12-Wirt/Vektor-System vergleichbar. Das E.-coli-System hat den Nachteil, daß Gene aus einigen gram-positiven Organismen, z.B. Bacillus, in dem gram-negativen E,-coli-Wirt nicht gut abklatschbar sind (do not express well). In gleicher Weise verbleiben Plasmide aus gram-negativen Organismen nicht in gram-positiven Wirten, so daß in grampositiven Wirten gram-negative genetische Information ent-
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weder schlecht oder überhaupt nicht abgeklatscht (expressed) wird. Dies veranschaulicht klar und deutlich den Vorteil eines gram-positiven Wirt/Vektor-Systems und den Nutzen von Plasmid pUC1 in einem solchen System.
In der Regel erfordert die Verwendung eines Wirt/Vektor-Systems zur Herstellung eines für den Wirt fremden Produkts die Einschleusung von Genen für den gesamten biosynthetischen Weg des Produkts in den neuen Wirt. Wie bereits ausgeführt, kann dies zu Problemen beim genetischen Abklatsch (genetic expression) führen. Ferner können auch neue und/ oder verstärkte Probleme bei der Züchtung der Mikroorganismen und bei der Extraktion und Reinigung des Produkts auftreten. Ein vielleicht brauchbarerer Versuch besteht darin, einen Plasmidvektor, z.B. pUC1, in einen normalerweise das Produkt liefernden Wirt einzuschleusen und auf das Plasmid die Gene für die Biosynthese des Produkts zu klonen. Zumindest sollten sich dadurch die Probleme bei der Züchtung und Produktextraktion und -reinigung auf ein Mindestmaß senken lassen. Darüber hinaus dürfte es bei diesem KIonungssystem nicht erforderlich sein, sämtliche Gene des Biosyntheseweges zu klonen und zu verstärken, vielmehr dürfte es lediglich erforderlich sein, Steuergene (regulatory genes) oder Gene mit Codierung für die Geschwindigkeit der Produktbiosynthese begrenzende Enzyme zu klonen. Da das Plasmid pUC1 ein Streptomycetenplasmid darstellt, ist es in dieser Hinsicht für die Gattung Streptomyces ideal geeignet. Da ferner das Plasmid pUC1 ein Plasmid aus einem gram-positiven Organismus darstellt, kann es in einer Reihe anderer Mikroorganismen, z.B. Bacillus, Arthrobacter und dergleichen, als Vektor dienen.
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λα'
Streptomyces frauiae (DSM ) läßt sich in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen züchten. Die Züchtung kann beispielsweise in einem Nährmedium mit einem assimilierbaren Kohlenhydrat als Kohlenstoffquelle, einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweißartigen oder -haltigen Material als Stickstoffquelle wachsen gelassen werden. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glucose, brauner Zucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Laktose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Casein, Fischmehl, Destillationsfeststoffe, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle und dergleichen. Zweckmäßigerweise werden Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verwendet. Spurenmetalle, wie Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, müssen nicht zugesetzt werden, da als Bestandteile des Mediums vor seiner Sterilisierung Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile verwendet werden.
Das beimpfte Medium kann bei jeder Temperatur, bei der ein akzeptables Wachstum des Mikroorganismus möglich ist, beispielsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 18° und 50°, vorzugsweise zwischen etwa 20° und 370C, inkubiert werden, üblicherweise erreicht man ein optimales Wachstum des Mikroorganismus in etwa 3 bis 15 Tagen. Das Medium bleibt während des Wachstumszyklus üblicherweise sauer. Der End-pH-Wert hängt teilweise von den gegebenenfalls vorhandenen Puffern und teilweise vom Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums ab.
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Wenn das Wachstum bzw. die Züchtung in großen Kesseln und Tanks durchgeführt wird, bedient man sich vorzugsweise der vegetativen Form und nicht der Sporenform des Mkr ο Organismus zum Beimpfen, um eine deutliche Verzögerung des Mikroorganismuswachstums und eine darauf zurückzuführende ineffiziente Ausnutzung der Vorrichtung zu vermeiden.
Folglich ist es zweckmäßig, in einer Nährbrühe durch Beimpfen derselben mit einem aliquoten Teil aus einem Boden/ Flüssiger N2-Agarpfropfen oder einer geneigten Kultur ein vegetatives Inokulat zu schaffen. Wenn ein junges, aktives, vegetatives Inokulat gebildet ist, wird es aseptisch in große Gefäße oder Tanks überführt. Das Medium, in dem das vegetative Inokulat erzeugt wird, kann aus demselben oder einem anderen (als es zur Züchtung der Mikroorganismen verwendet wird) Medium bestehen, solange nur ein gutes Mikroorganismuswachstum gewährleistet ist.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nichts anderes angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben "Gew.-Jo" und sämtliche Verhältnisangaben bei Lösungsmittelgemischen "Volumenangaben".
Beispiel
Isolierung des Plasmids pUC1 aus einer biologisch reinen Kultur von Streptomyces fradiae (DSM ):
10 ml eines Mediums mit 1% Glucose, 0,4% Pepton, 0,4% Hefeextrakt, 0,05% MgSO4.7H2O, 0,2% KH2PO4 und 0,4% K2HPO4 werden mit den Sporen einer büogisch reinen Kultur von Streptomyces fradiae (DSM ) beimpft.
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Das Medium war vorher in einem 50 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben sterilisiert worden. Nach der Beimpfung wird der Kolben etwa 24 bis 36 h auf einem mit 100 bis 250 Upm umlaufenden Drehrüttler bei einer Temperatur von 320C inkubiert. Nach beendeter Inkubierung wird 0,5 ml der Kultur in 10 ml des in einem 50 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben befindlichen Mediums der angegebenen Zusammensetzung, das 0,5 bis 2,0% (G/V) Glycin enthält, überführt. Durch den GIycinzusatz wird das anschließende Lysieren der Zellen erleichtert. Die Glycinmenge im Medium kann im Hinblick darauf, daß das anschließende Lysieren der Zellen erleichtert werden soll, routinemäßig eingestellt v/erden. Danach wird der Kolben nochmals 2A- bis 36 h lang bei einer Temperatur von 320C auf dem Drehrüttler inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wird das Mycel durch Zentrifugieren mit niedriger Geschwindigkeit (beispielsv/eise 15 min lang bei einer Temperatur von 40C mit 6000 χ g) von der Brühe abgetrennt. Danach wird die überstehende Flüssigkeit von dem Mycelpellet abgegossen.
Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen, während das Pellet in 1,5 ml eines isotonischen Puffers, z.B. TES-Puffer (0,03m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, O,OO5m-Äthylendiamintetraessigsäure und 0,05m-NaCl; pH-Wert: 8,0) mit 20% (W/V) Saccharose, resuspendiert. Danach werden 0,3 ml eines 5 mg/ml Lysozyms und 0,15 ml einer 1 mg/ml RHase in demselben Puffer zugegeben, worauf das Gemisch unter gelegentlichem Durchmischen 30 min lang bei einer Temperatur von 370C inkubiert wird. Nach Zugabe von 0,6 ml O,25m-Äthylendiamintetraessigsäure (pH-Wert: 8,0) wird das Gemisch 15 min lang bei einer Temperatur von 370C inkubiert. Danach wird 0,3 ml einer 5 mg/ml Pronase zugesetzt
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und das Ganze 10 min lang bei einer Temperatur von 370C inkubiert. Schließlich wird die Zellensuspension durch Zusatz von 3,0 ml einer 2%igen Sarkosyllösung in TES-Puffer und 20- bis 30-minütiges Inkubieren des Gemischs bei einer Temperatur von 37°C lysiert. Das Lysat wird dann einer Scherkraft unterworfen, indem es 5-bis 10-mal durch eine nadelfreie 50 ml fassende Wegwerfspritze laufen gelassen wird.
Das erhaltene Rohlysat wird dann mit einem Salz, z.B. Cäsiumchlorid (bevorzugt) oder Cäsiumsulfat, und dem einschiebenden (intercalating) Farbstoff Äthidiumbromid gemischt, wobei eine Lösung einer Dichte von 1,550 erhalten wird. Diese Lösung wird bis zum Gleichgewicht bei 145000 χ g (isopyknisches Dichtegradientenzentrifugieren) zentrifugiert. Die kovalent geschlossene ringförmige Plasmid-DNS wird dann im Zentrifugenrohr bei Belichtung mit langwelligem Ultraviolett (320 mn) als schwacher fluoreszierender Streifen unter dem intensiv fluoreszierenden Streifen der linearen Chromosomen- und Plasmid-DNSfen sichtbar.
Zur Kennzeichnung wird kovalent geschlossene ringförmige Plasmid-DNS dargestellt, indem sie von den isopyknischen Gradienten entfernt, das Äthidiumbromid durch zwei Behandlungen mit einem Drittel Volumen Isopropanol extrahiert und schließlich die wäßrige Phase gegen einen geeigneten Puffer, beispielsweise 0,1 X SSC-Puffer (0,015m-NaCl, 0,0015111-Na3C6H5O7.2H2O, pH-Wert: 7,4), dialysiert wird. Hierbei erhält man im wesentlichen reines Plasmid pUC1.
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Maßnahmen zur Kennzeichnung und Isolierung von pUC1:
Die Größe des Plasmids pUC1 wird durch Sedimentation in neutralen und alkalischen Saccharosegradienten unter Verwendung einer internen Marker-Plasmid-DNS eines Molekulargewichts von etwa 28,0 Megadalton und einem entsprechenden Sedimentationswert von etwa 58S bestimmt. Aus den neutralen Saccharosegradienten ergibt sich ein Sedimentationswert für pUC1 von 76S. Das Molekulargewicht des Plas mids pUC1 errechnet sich aus den Gleichungen nach Hudson und Mitarbeitern (vgl. B. Hudson, D.A. Clayton und J. Vino grad in "Complex mitochondrial DNA", Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 33, Seiten 435 bis 442 (1968)). Dieses Molekulargewicht stimmt gut mit dem aus den alkalischen Saccharosegradienten geschätzten Molekulargewicht überein.
Eine Schätzung des pUC1-Molekulargewichts ist auch aufgrund elektronenmikroskopischer Untersuchungen einzelner DNS-Moleküle möglich (vgl. A.K. Kleinschmidt (1968) "Monolayer techniques in electron microscopy of nucleic acid molecules" "Method in Enzymology", Herausgeber S.PO Colowick und N.O. Kaplan, Band 12B, Seiten 361 bis 377, Verlag Academic Press, New York). Es hat sich gezeigt, daß das Plasmid pUC1 eine durchschnittliche Umrißlänge von 24,0 i 0,6 um und ein entsprechendes Molekulargewicht von 47,1 - 1,2 Megadalton aufweist.
Die prozentuale Plaemid-DNS in Streptomyces fradiae (DSM
) wird durch Markieren der Kultur mit [Methyl-3H]-thymidin, Herstellen von Rohlysäten und Zentrifugieren der Lysate in Cäsiumchlorid/Äthidiumbromid-Dichtegradienten ermittelt. Die Gradienten werden fraktioniert, worauf
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eine Isotopenzählung erfolgt. Die prozentuale Radioaktivität im Plasmidstreifen dient zur Ermittlung der Menge der Plasmid-DNS und zur Berechnung der Plasmid-Kopienzahl (R. Radioff, W. Bauer und J. Vinograd (1967) "A dye-buoyant density method for detection and isolation of closed circular duplex DNA: The closed circular DNA in HeLa cells" in "Proc. Nat. Acad. Sei. USA», Band 57, Seiten 1514 bis 1520).
Restriktionsendonuklease-Verdauung und Agarosegelelektrophorese:
Als Restriktionsendonukleasen werden Handelsprodukte verwendet. Die Enzymverdauungspräparate werden entsprechend den Vorschriften des jeweiligen Herstellers zubereitet, wobei mindestens ein zweifacher Überschuß an Endonuklease verwendet wird.
Bei einigen Versuchen wird Plasmid-DNS mit mehr als einer Endonuklease verdaut. Bei diesen Versuchen bedient man sich zweier Methoden. Bei der ersten Methode wird die Plasmid-DNS zunächst mit dem Enzym, das eine geringere Ionenstärke erfordert, und dann mit dem Enzym, das eine höhere Ionenstärke erfordert, nach Zusatz eines gleichen Volumens 2XPuffer zu dem zweiten Enzym verdaut. Bei der zweiten Methode werden Restriktionsfragmente einer Enzymverdauung gemäß den Vorschriften von Tanaka und Weisblum aus einem präparativen Agarosegel isoliert (vgl. T. Tanaka und B. Weisblum in "J. Bacteriol.", Band 121, Seiten 354 bis 362 (1975) "Construction of a colicin El-R factor composite plasmid in vitro: Means for amplification of deoxyribonucleic acid."). Die isolierten Restriktionsfragmente wer-
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den durch Äthanolfällung konzentriert und dann mit anderen Restriktionsenzymen verdaut. Doppelverdauungsversuche werden mit Einzelverdauungsversuchen verglichen, um sicherzustellen, daß keine unnormalen Restriktionsmuster erhalten werden, d.h. daß keine nicht-spezifische DNS-Spaltung durch ein Enzym erfolgt, nachdem die Ionenstärke des Verdauungspräparats bzw. -gemischs geändert wird.
Die verdauten Eroben werden auf 0,7- bis 1 %ige Agarosegele appliziert und 2 h lang bei konstanter Spannung von 10 bis 15 V/cm Gelhöhe einer Elektrophorese unterworfen (vgl. PoA. Sharp, J. Sugden und J. Sambrook in "Biochemistry", Band 12, Seiten 3055 bis 3063 (1973) «Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis."). Die Molekulargewichte der Restriktionsfragmente werden, bezogen auf die Standardwanderungsmuster von mit dem Enzym EcoRI verdauter Bakteriophagen-lambda-DNS, bestimmt (vgl. R.B. Helling, H.M. Goodman und H.W. Boyer in "J. Virology«, Band 14, Seiten 1235 bis 1244 (1974) «Analysis of endonuclease R.EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis").
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Claims (4)

Patentansprüche
1. Im wesentlichen reines Plasmid pUCö, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa 47,1 - 1,2 Megadalton und ein Restriktionsendonuklease-Spaltbild entsprechend der Zeichnung.
2. Verfahren zum Isolieren von im wesentlichen reinem Plasmid pUC1 aus Streptomyces fradiae (DSM ), dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) Streptomyces fradiae (DSM ) auf einem für Streptomyces fradiae geeigneten Kulturmedium bis zu einem ausreichenden Mycelwachstum wachsen läßt;
(b) das Mycel fragmentiert;
(c) das fragmentierte Mycel in einem geeigneten Kulturmedium (vgl. Stufe (a)) inkubiert;
(d) die Kultur nach einer geeigneten Zeit erntet;
(e) das geerntete Mycel lysiert und
(f) aus dem Lysat im wesentlichen reines Plasmid pUC1 isoliert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces fradiae (DSM ) etwa 24 bis 48 h lang bei einer Temperatur von etwa 320C in einem Nährmedium züchtet.
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4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das fragmentierte Mycel in einem Glycin enthaltenden Kulturmedium züchtet.
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