MX2014010094A - Anticuerpos anti-homologo relacionado con las convulsiones 6 (anti-sez6) y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan moduladores novedosos, que incluyen anticuerpos y derivados de estos, y métodos de empleo de tales moduladores para tratar trastornos proliferativos.

Description

ANTICUERPOS ANTI-HOMOLOGO RELACIONADO CON LAS CONVULSIONES 6 (ANTI-SEZ6) Y METODOS DE USO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta solicitud se refiere en general a compuestos, composiciones y métodos novedosos para su uso en el diagnóstico, la prevención, el tratamiento o la mejora de trastornos proliferativos y cualquier expansión, recidiva, recaída o metástasis de estos. En un espectro amplio, la presente invención se refiere al uso de moduladores del homólogo relacionado con las convulsiones 6 (SEZ6) , incluidos los anticuerpos anti-SEZ6 y constructos de fusión, para el tratamiento, el diagnóstico o la profilaxis de trastornos neoplásicos. Ciertas modalidades seleccionadas de la presente invención contemplan el uso de tales moduladores de SEZ6 , incluidos los conjugados de anticuerpo- fármaco, para el tratamiento inmunoterapéutico de neoplasias malignas que comprende preferentemente una reducción en la frecuencia de células iniciadoras de tumores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La diferenciación de las células madre y progenitoras y la proliferación celular son procesos continuos normales que actúan de forma concertada para estimular el crecimiento tisular durante la organogénesis y el reemplazo celular, y para reparar la mayoría de los tejidos durante la vida de REF: 250589 todos los organismos vivos. En circunstancias normales, la diferenciación y la proliferación celular están controladas por numerosos factores y señales que generalmente se equilibran para mantener decisiones sobre el destino celular y la arquitectura tisular. De este modo, este microentorno controlado es el que regula en gran medida la división celular y la maduración tisular en las que se generan señales de forma adecuada en función de las necesidades del organismo. A este respecto, la proliferación y la diferenciación celular normalmente se producen solamente según sea necesario para el reemplazo de células dañadas o moribundas, o para el crecimiento. Desafortunadamente, la disrupción de la proliferación y/o la diferenciación celular puede ser consecuencia de multitud de factores que incluyen, por ejemplo, la carencia o abundancia excesiva de diversos compuestos químicos de señalización, la presencia de microentornos alterados, mutaciones genéticas o alguna combinación de estos. Cuando se interrumpe o altera de algún modo la proliferación y/o la diferenciación celular normal, esto puede originar varias enfermedades o trastornos, incluidos trastornos proliferativos tales como el cáncer.

Los tratamientos convencionales para el cáncer incluyen quimioterapia, radioterapia, cirugía, inmunoterapia (por ejemplo, modificadores de la respuesta biológica, vacunas o agentes terapéuticos dirigidos) o combinaciones de estos.

Desafortunadamente, ciertos tipos de cáncer presentan una respuesta mínima o nula a tales tratamientos. Por ejemplo, en algunos pacientes los tumores exhiben mutaciones genéticas que hacen que presenten una respuesta nula a pesar de la eficacia general de las terapias seleccionadas. Además, dependiendo del tipo de cáncer y de la forma que adquiera, puede suceder que algunos tratamientos disponibles, tales como la cirugía, no sean alternativas viables. Las limitaciones inherentes de los agentes terapéuticos actuales utilizados como estándar de atención médica se manifiestan particularmente cuando se intenta tratar a pacientes que han sido sometidos a tratamientos previos y que posteriormente han sufrido una recaída. En tales casos, los regímenes terapéuticos fallidos y el resultante deterioro de los pacientes pueden contribuir a la aparición de tumores refractarios que se manifiestan a menudo como una enfermedad relativamente agresiva que, en última instancia, resulta ser incurable. Aunque se han producido grandes mejoras en el diagnóstico y el tratamiento del cáncer a lo largo de los años, las tasas de supervivencia globales para muchos tumores sólidos han permanecido en gran parte invariables debido al fracaso de las terapias existentes para prevenir la recaída, la recidiva y las metástasis tumorales . Por lo tanto, el desarrollo de terapias más potentes y dirigidas sigue constituyendo un desafío para los trastornos proliferativos .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Estos y otros objetivos se proporcionan en la presente invención, la cual, en un sentido amplio, se refiere a métodos, compuestos, composiciones y artículos de fabricación que se pueden utilizar en el tratamiento de trastornos asociados con SEZ6 (por ejemplo, trastornos proliferativos o trastornos neoplásicos) . Con este fin, la presente invención proporciona moduladores del homólogo relacionado con las convulsiones 6 (o SEZ6) que actúan de forma eficaz sobre células tumorales y/o células madre cancerosas, y se pueden utilizar para tratar a pacientes que padecen una gran variedad de neoplasias malignas. Como se describirá más detalladamente en la presente, existen al menos dos isoformas o variantes de SEZ6 de origen natural y los moduladoras descritos pueden comprender o asociarse selectivamente con una isoforma o la otra o con ambas. Es más, en ciertas modalidades, los moduladores de SEZ6 descritos pueden reaccionar adicionalmente con uno o más miembros de la familia SEZ (por ejemplo, SEZ6L o SEZ6L2) o, en otras modalidades, se pueden generar y seleccionar de modo que se asocien o reaccionen exclusivamente con una o más isoformas de SEZ6. En cualquier caso, los moduladores pueden comprender cualquier compuesto que reconozca, compita, agonice, antagonice, interaccione , se una o se asocie con un gen o polipéptido SEZ6 (o uno de sus fragmentos) y module, ajuste, altere, cambie o modifique el impacto de la proteína SEZ6 sobre una o más vías fisiológicas. Por lo tanto, en un sentido amplio, la presente invención se refiere en general a moduladores de SEZ6 aislados y sus usos. En modalidades preferidas, la invención se refiere más concretamente a moduladores de SEZ6 aislados que comprenden anticuerpos (es decir, anticuerpos que se unen, reaccionan o se asocian inmunopreferencialmente con al menos una isoforma de SEZ6) que, en modalidades particularmente preferidas, se asocian o conjugan con uno o más agentes citotóxicos. Además, tal como se describe extensamente más adelante, estos moduladores se pueden utilizar para proporcionar composiciones farmacéuticas útiles para la profilaxis, el diagnóstico o el tratamiento de trastornos proliferativos .

En modalidades seleccionadas de la invención, los moduladores de SEZ6 pueden comprender un polipéptido SEZ6 o fragmentos de este, ya sea en una forma aislada o fusionados o asociados con otros restos (por ejemplo, Fc-SEZ6, PEG-SEZ6 o SEZ6 asociado con un resto de direccionamiento) . En otras modalidades seleccionadas, los moduladores de SEZ6 pueden comprender antagonistas de SEZ6 que, a los efectos de la presente invención, se debe sobreentender que se refieren a cualquier constructo o compuesto que reconozca, compita, interaccione , se una o se asocie con SEZ6 y neutralice, elimine, reduzca, sensibilice, reprograme, inhiba o controle el crecimiento de células neoplásicas, incluidas las células iniciadoras de tumores. En modalidades preferidas, los moduladores de SEZ6 de la presente invención comprenden anticuerpos anti-SEZ6, o fragmentos o derivados de estos, que se ha descubierto inesperadamente que silencian, neutralizan, reducen, disminuyen, agotan, moderan, merman, reprograman, eliminan o inhiben de otro modo la capacidad de las células iniciadoras de tumores para propagar, mantener, expandir, proliferar o facilitar de otro modo la supervivencia, recidiva, regeneración y/o metástasis de las células neoplásicas. En modalidades particularmente preferidas, los anticuerpos o fragmentos inmunorreactivos se pueden asociar o conjugar con uno o más agentes anticancerosos (por ejemplo, un agente citotóxico) .

En lo que respecta a tales moduladores, se podrá apreciar que los anticuerpos compatibles pueden presentar una cualquiera de entre una serie de formas que incluyen, por ejemplo, anticuerpos mono- y policlonales , quiméricos, con injertos de CDR, humanizados y humanos, y variantes y/o fragmentos inmunorreactivos de cada uno de los anteriores. Las modalidades preferidas comprenderán anticuerpos que sean relativamente no inmunogénicos tales como constructos humanizados o completamente humanos. Obviamente, teniendo en cuenta la presente exposición, los expertos en la técnica podrían identificar fácilmente una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) asociadas con regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los moduladores de SEZ6 de tipo anticuerpo, y emplear tales CDR para modificar o fabricar anticuerpos quiméricos, humanizados o con injertos de CDR sin necesidad de realizar demasiados experimentos. Por consiguiente, en ciertas modalidades preferidas, el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo que incorpora una o más CDR como las que se definen en las FIGS . 10A y 10B, y derivadas de las regiones variables murinas de las cadenas ligera (FIG. 10A) o pesada (FIG. 10B) contiguas (SEQ ID NOS : 20-169) expuestas en las figuras. Tales regiones variables con injertos de CDR que contienen un marco humano y sus variantes también se muestran en la FIG. 10 que comprende las SEQ ID NOS: 170-199. En modalidades preferidas, tales anticuerpos comprenderán anticuerpos monoclonales y, en modalidades incluso más preferidas, comprenderán anticuerpos quiméricos, con injertos de CDR o humanizados.

Las secuencias de ácido nucleico ilustrativas que codifican cada una las secuencias de aminoácidos expuestas en las FIGS. 10A y 10B se adjuntan a la presente en el listado de secuencias y comprenden las SEQ ID NOS: 220-399. A este respecto, se apreciará que la invención comprende además moléculas de ácido nucleico (y constructos, vectores y células hospederas asociados) que codifican las secuencias de aminoácidos de la región variable del anticuerpo descrito que incluyen aquellas expuestas en el listado de secuencias que se adjunta.

Más concretamente, en modalidades seleccionadas, los moduladores de SEZ6 compatibles pueden comprender un anticuerpo que tenga una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada, donde la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO : 62 , SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO : 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO : 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO : 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO : 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, : SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEC i ID NO: 114 , SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO : 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166 y SEQ ID NO: 168 y donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167 y SEQ ID NO: 169. En otras modalidades preferidas, los moduladores seleccionados comprenderán regiones variables de las cadenas pesada y ligera que comprenden una identidad de un 65, 70, 75 o 80% respecto a las secuencias murinas mencionadas anteriormente. En otras modalidades adicionales, los moduladores comprenderán regiones variables de las cadenas pesada y ligera que comprenden una identidad de un 85, 90 o incluso un 95% respecto a las secuencias murinas descritas.

Obviamente, teniendo en cuenta la presente exposición, los expertos en la técnica podrían identificar fácilmente CDR asociadas con cada una de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera mencionadas anteriormente, y emplear tales CDR para modificar o fabricar anticuerpos quiméricos, humanizados o con injertos de CDR sin necesidad de realizar demasiados experimentos. En este sentido, en modalidades seleccionadas, la presente invención se refiere a anticuerpos anti-SEZ6 que comprenden una o más CDR de una secuencia de región variable que se expone en la FIG. 10A o la FIG. 10B. En modalidades preferidas, tales anticuerpos comprenderán anticuerpos monoclonales y, en modalidades incluso más preferidas, comprenderán anticuerpos quiméricos, con injertos de CDR o humanizados. Como se indica más detalladamente a continuación, otras modalidades adicionales comprenderán tales anticuerpos conjugados o asociados con uno o más agentes citotóxicos.

Otro aspecto de la invención comprende moduladores obtenidos o derivados a partir de SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17 .4, SC17.8, SC17.9, SC17, .10, SC17.11, SC17.14, SC17 .15, SC17 .16, SC17 • 17, SC17.18, SC17.19, SC17 .22, SC17 .24, SC17 .27, SC17 .28, SC17.29, SC17.30, SC17 .32, SC17 .34, SC17 .35, SC17 .36, SC17.38, SC17.39, SC17 .40, SC17 • 41, SC17 .42 , SC17 .45, SC17.46, SC17.47, SC17 .49, SC17 .50, SC17 .53, SC17 .54, SC17.56, SC17.57, SC17 .59, SC17 .61, SC17 .63, SC17 .71, SC17.72, SC17.74, SC17 .76, SC17 .77, SC17 •79, SC17 .81, SC17.82 , SC17.84, SC17 .85, SC17 .87, SC17 .89, SC17 .90, SC17.91, SC17.93, SC17 -95, SC17 .97, SC17 •99, SC17. 102 , SC17.114, SC17.115, SC17 .120, SC17121, SC17 .122, SC17 , .140, SC17.151, SC17.156, SC17. 161, SC17. : 166, SC17 .187, SC17. 191, SC17.193 , SC17.199 y SC17.200.

En otras modalidades compatibles más , la presente invención comprenderá los moduladores de SEZ6 humanizados o con injertos de CDR siguientes: hSC17.16, hSC17.17, hSC17.24, hSC17.28, SC17.34, hSC17.46, SC17.151, SC17.155, SC17.156, SC17.161 y SC17.200. Otras modalidades adicionales se refieren a un modulador de SEZ6 que comprende un anticuerpo humanizado, donde el anticuerpo humanizado comprende una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada, donde la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188 y SEQ ID NO: 190 y donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179 y SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189 y SEQ ID NO: 191. De forma adicional, se proporcionan ciertas variantes humanizadas de las regiones variables de las cadenas ligera (SEQ ID NO: 192) y pesada (SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198 y SEQ ID NO: 199) de acuerdo con los principios de la presente. Además, como se ha descrito justo antes, las secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera humanizadas ilustrativas se exponen en el listado de secuencias que se adjunta en la presente como las SEQ ID NOS: 370-399.

Aparte de los aspectos mencionados anteriormente, otras modalidades preferidas de la presente invención comprenderán moduladores de SEZ6 asociados o conjugados con uno o más fármacos para proporcionar conjugados moduladores que puede que sean particularmente efectivos en el tratamiento de trastornos proliferativos (solos o combinados con otros agentes farmacéuticamente activos) . Más generalmente, una vez que se hayan fabricado los moduladores de la invención y se hayan seleccionado, se pueden unir, fusionar, conjugar (por ejemplo, de forma covalente o no covalente) o asociar de otro modo con restos para el diagnóstico o farmacéuticamente activos, o modificadores biocompatibles . Las expresiones "conjugado", "conjugado modulador" o "conjugado de anticuerpo", tal como se utilizan en la presente, se utilizarán en un sentido amplio y se establecerá que se refieren a cualquier molécula biológicamente activa o detectable, o fármaco asociado con los moduladores descritos independientemente del método de asociación. A este respecto, se sobreentenderá que tales conjugados pueden comprender, además de los moduladores descritos, péptidos, polipéptidos, proteínas, profármacos que son metabolizados para obtener un agente activo in vivo, polímeros, moléculas de ácido nucleico, moléculas de bajo peso molecular, agentes de unión, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas y radioisótopos. Además, como se ha indicado anteriormente, el conjugado seleccionado puede estar asociado de forma covalente o no covalente con el modulador o ligado a este y exhibir diversas proporciones molares estequiométricas dependiendo, al menos en parte, del método empleado para conseguir la conjugación.

Los aspectos particularmente preferidos de la presente invención comprenderán conjugados de modulador-anticuerpo o conjugados de anticuerpo-fármaco que se pueden utilizar para el diagnóstico y/o el tratamiento de trastornos proliferativos . Tales conjugados se pueden representar con la fórmula M-[L-D]n, donde M representa un modulador descrito o un resto de unión a la diana, L es un conector opcional o unidad conectora, D es un fármaco o profármaco compatible, y n es un número entero comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20. Se apreciará que, a menos que el contexto dicte lo contrario, se sobreentenderá que las expresiones "conjugado de anticuerpo- fármaco" o "ADC" (por sus siglas en inglés) o la fórmula M- [L-D] n abarcan los conjugados que comprenden restos tanto terapéuticos como de diagnóstico. En tales modalidades, los compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco comprenderán normalmente anti-SEZ6 como la unidad moduladora (M) , un resto terapéutico o de diagnóstico (D) , y opcionalmente un conector (L) que une el fármaco al agente de unión al antígeno. En una modalidad preferida, el anticuerpo es un mAb de SEZ6 que comprende al menos una CDR de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera como las descritas anteriormente.

Como se ha indicado previamente, un aspecto de la invención puede comprender la asociación inesperada de los polipéptidos SEZ6 con células madre cancerosas. Por lo tanto, en ciertas modalidades diferentes, la invención comprenderá un modulador de SEZ6 que reduce la frecuencia de las células iniciadoras de tumores al administrarlo a un sujeto. Preferentemente, la reducción de la frecuencia se determinará utilizando un análisis de dilución limitante in vitro o in vivo. En modalidades particularmente preferidas, el análisis se puede llevar a cabo utilizando un análisis de dilución limitante in vivo que comprenda el trasplante de células tumorales humanas vivas en ratones inmunodeprimidos . Como alternativa, el análisis de dilución limitante se puede llevar a cabo utilizando un análisis de dilución limitante in vitro que comprenda la deposición por dilución limitante de células tumorales humanas vivas en condiciones que estimulen las colonias in vitro. En cualquier caso, el análisis, el cálculo o la cuantificación de la reducción de la frecuencia comprenderá preferentemente el uso del modelo estadístico de la distribución de Poisson para proporcionar un recuento preciso. Se apreciará que, a pesar de que se prefieran estos métodos de cuantificación, también se puede utilizar otra metodología menos laboriosa, tal como la citometría de flujo o la inmunohistoquímica, para proporcionar los valores deseados y, por consiguiente, se contempla expresamente como incluida dentro del alcance de la presente invención. En estos casos, la reducción de la frecuencia se puede determinar utilizando un análisis por citometría de flujo o una detección inmunohistoquímica de los marcadores superficiales de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores .

En este sentido, otra modalidad preferida de la presente invención comprende un método para tratar un trastorno asociado con SEZ6 que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de SEZ6 a un sujeto que lo necesita, mediante el cual se reduce la frecuencia de las células iniciadoras de tumores. Preferentemente, el trastorno asociado con SEZ6 comprende un trastorno neoplásico. De nuevo, la reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores se determinará preferentemente utilizando un análisis de dilución limitante in vitro o in vivo.

A este respecto, se apreciará que la presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que los inmunógenos de SEZ6 se asocian con las células perpetuantes de tumores (es decir, células madre cancerosas) que intervienen en la etiología de diversas neoplasias. Más específicamente, la presente solicitud demuestra inesperadamente que la administración de diversos moduladores de SEZ6 ilustrativos puede mediar, reducir, agotar, inhibir o eliminar la señalización tumorigénica por parte de células iniciadoras de tumores (es decir, reducir la frecuencia de las células iniciadoras de tumores) . Esta señalización reducida, ya sea por agotamiento, neutralización, reducción, eliminación, reprogramación o silenciamiento de las células iniciadoras de tumores o por modificación de la morfología de las células tumorales (por ejemplo, diferenciación inducida, disrupción del nicho (microentorno) ) , a su vez permite el tratamiento más efectivo de trastornos asociados con SEZ6 mediante la inhibición de la tumorigénesis , el mantenimiento, la expansión y/o la metástasis y la recidiva tumoral .

Además de la asociación mencionada anteriormente con células madre cancerosas, existen pruebas de que las informas de SEZ6 pueden intervenir en el crecimiento, la recidiva o el potencial metastásico de tumores que comprenden características neuroendocrinas . A los efectos de la presente invención, este tipo de tumores comprenderán tumores neuroendocrinos y tumores pseudoendocrinos . La intervención en la proliferación de tales células tumorigénicas utilizando los moduladores de SEZ6 novedosos descritos en la presente puede mejorar o tratar de este modo un trastorno mediante más de un mecanismo (es decir, la reducción de las células iniciadoras de tumores y la disrupcion de la señalización de la vía oncogénica) para proporcionar efectos aditivos o sinérgicos. Otras modalidades preferidas adicionales pueden aprovechar la internalización celular de SEZ6 de la superficie celular para proporcionar un agente anticanceroso mediado por un modulador. A este respecto, se apreciará que la presente invención no se limita a ningún mecanismo de acción particular sino que abarca el uso general de los moduladores descritos para tratar trastornos asociados con SEZ6 (incluidas diversas neoplasias) .

Por tanto, en otras modalidades, la presente invención comprenderá el uso de los moduladores descritos para tratar tumores que comprenden características neuroendocrinas en un sujeto que lo necesite. Obviamente, se pueden utilizar los mismos moduladores para la profilaxis, el pronóstico, el diagnóstico, el teragnóstico, la inhibición o la terapia de mantenimiento de estos mismos tumores.

Otras facetas de la presente invención explotan la capacidad de los moduladores descritos para interrumpir potencialmente las vías oncogénicas a la vez que silencian simultáneamente las células iniciadoras de tumores. Tales moduladores de SEZ6 multiactivos (por ejemplo, antagonistas de SEZ6) pueden resultar particularmente efectivos cuando se usan combinados con agentes anticancerosos o agentes citorreductores que se emplean como estándar de atención médica. Por consiguiente, las modalidades preferidas de la presente invención comprenden el uso de los moduladores descritos como agentes antimetastásicos para la terapia de mantenimiento después de tratamientos iniciales. Además, se pueden utilizar dos o más antagonistas de SEZ6 (por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a dos epítopos discretos en SEZ6) combinados de acuerdo con los principios de la presente. Asimismo, como se indica en cierto detalle más adelante, los moduladores de SEZ6 de la presente invención se pueden utilizar en un estado conjugado o no conjugado y, opcionalmente, como un agente sensibilizante, combinados con diversos agentes anticancerosos químicos o biológicos.

Por consiguiente, otra modalidad preferida de la presente invención comprende un método de sensibilización de un tumor en un sujeto para tratarlo con un agente anticanceroso que comprende el paso de administrar un modulador de SEZ6 al sujeto. Otras modalidades comprenden un método para reducir la metástasis o recidiva tumoral después de un tratamiento que comprende administrar un modulador de SEZ6 a un sujeto que lo necesite. En un aspecto particularmente preferido de la invención, el modulador de SEZ6 provocará específicamente una reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores tal como se determina utilizando un análisis de dilución limitante in vitro o in vivo.

Las modalidades más generalmente preferidas de la invención comprenden un método para tratar un trastorno asociado con SEZ6 en un sujeto que lo necesite que comprende el paso de administrar un modulador de SEZ6 al sujeto. En modalidades particularmente preferidas, el modulador de SEZ6 se asociará (por ejemplo, conjugará) con un agente anticanceroso. En otras modalidades más, el modulador de SEZ6 se internalizará después de asociarse o unirse a SEZ6 en o cerca de la superficie de la célula. Además, los aspectos beneficiosos de la presente invención, que incluyen cualquier disrupción de las vías de señalización y beneficios colaterales, se pueden conseguir tanto si el tejido tumoral del sujeto exhibe unos niveles elevados de SEZ6, como unos niveles reducidos o bajos de SEZ6 en comparación con el tejido adyacente no mal. Las modalidades particularmente preferidas comprenderán el tratamiento de trastornos que exhiben unos niveles elevados de SEZ6 en células tumorigénicas en comparación con el tejido normal o células no tumorigénicas.

En otro aspecto más, la presente invención comprenderá un método para tratar a un sujeto que padece un trastorno neoplásico que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador de SEZ6 internalizante. Las modalidades preferidas comprenderán la administración de moduladores de tipo anticuerpo internalizantes donde, en otras modalidades seleccionadas, los moduladores de tipo anticuerpo internalizantes se conjugan o asocian con un agente citotóxico.

Otras modalidades se refieren a un método para tratar a un sujeto que padece un trastorno asociado con SEZ6 que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador de SEZ6 supresor .

En otra modalidad más, la presente invención proporciona métodos de terapia de mantenimiento, donde los efectores o moduladores descritos se administran durante un periodo después de un procedimiento inicial (por ejemplo, quimioterapia, radiación o cirugía) diseñado para eliminar al menos una porción de la masa tumoral . Tales regímenes terapéuticos se pueden administrar durante un periodo de semanas, un periodo de meses o incluso un periodo de años, durante el cual los moduladores de SEZ6 pueden actuar profilácticamente para inhibir la metástasis y/o recidiva tumoral. En otras modalidades más, los moduladores descritos se pueden administrar de forma concertada con regímenes citorreductores conocidos para prevenir o retardar la metástasis, el mantenimiento o la recidiva tumoral.

Además, se apreciará que los moduladores de SEZ6 de la presente invención se pueden generar y/o seleccionar para que reaccionen con una o más isoformas de SEZ6 o con una única isoforma de la proteína o, por el contrario, pueden comprender un modulador de pan-SEZ6 que reaccione o se asocie con al menos un miembro de la familia SEZ6 adicional (por ejemplo, SEZ6L o SEZ6L2 e isoformas de estos) además de SEZ6. Más específicamente, según se describe en la presente, los moduladores preferidos, tales como anticuerpos, se pueden generar y seleccionar de modo que reaccionen con dominios (o epítopos de estos) que exhibe SEZ6 únicamente o con dominios que están conservados al menos en cierto modo entre dos o más de los miembros de la familia SEZ6.

En otras modalidades preferidas más, los moduladores se asociarán o unirán a un epítopo, una porción, un motivo o un dominio específico de SEZ6. Como se indicará en cierto detalle más adelante, ambas isoformas de SEZ6 incorporan una región extracelular idéntica (remítase a la FIG. 1E) que comprende al menos un dominio aminoterminal , dos dominios Sushi y CUB alternos y tres dominios Sushi tándem adicionales. Además, la proteína SEZ6 comprende un dominio transmembrana1 y un dominio citoplasmático . Por consiguiente, en ciertas modalidades, los moduladores se unirán o asociarán con el dominio aminoterminal de SEZ6 (es decir, los aminoácidos 1-335 de la proteína madura) o con un epítopo en este. Otros aspectos de la presente invención comprenden moduladores que se asocian o se unen a un epítopo específico situado en un dominio Sushi particular de SEZ6. A este respecto, el modulador particular se puede asociar o unir a un epítopo situado en el Dominio Sushi 1 (aminoácidos 336-395) , el Dominio Sushi 2 (aminoácidos 511-572) , el Dominio Sushi 3 (aminoácidos 690-748) , el Dominio Sushi 4 (aminoácidos 750-813) o el Dominio Sushi 5 (aminoácidos 817-878) . Otros aspectos de la presente invención comprenden moduladores que se asocian o se unen a un epítopo específico situado en un dominio similar a CUB particular de SEZ6. A este respecto, el modulador particular se puede asociar o unir a un epítopo situado en el Dominio CUB 1 (aminoácidos 397-508) o el Dominio CUB 2 (aminoácidos 574-685) . Obviamente, se apreciará que cada uno de los dominios mencionados anteriormente puede comprender más de un epítopo y se puede asociar con más de una sección.

En lo que respecta a las "secciones" de modulador o anticuerpo, se apreciará que el antígeno SEZ6 se puede analizar o mapear mediante la unión competitiva al anticuerpo utilizando técnicas reconocidas en la técnica para definir secciones específicas situadas a lo largo de la proteína. Como se describe más detalladamente en la presente y se muestra en los Ejemplos 9 y 10 más adelante, se puede considerar que dos anticuerpos (uno de los cuales se puede denominar "anticuerpo de referencia", "anticuerpo delineante de secciones" o "anticuerpo delineante") están en la misma sección si compiten sustancialmente entre sí por la unión al antígeno diana. En tales casos, los epítopos del anticuerpo en cuestión pueden ser idénticos, sustancialmente idénticos o lo suficientemente cercanos (ya sea en un sentido lineal en el que están separados por unos pocos aminoácidos o conformacionalmente) de modo que la unión de ambos anticuerpos al antígeno esté inhibida o impedida estérica o electrostáticamente. Tales secciones definidas se pueden asociar generalmente con ciertos dominios de SEZ6 (por ejemplo, el anticuerpo de referencia se unirá a un epítopo contenido en un dominio específico) aunque la correlación no es siempre precisa (por ejemplo, puede haber más de una sección en un dominio o la sección puede estar definida conformacionalmente y comprender más de un dominio) . Se apreciará que los expertos en la técnica podrán determinar fácilmente la relación entre los dominios de SEZ6 y las secciones determinadas empíricamente.

En lo que respecta a la presente invención, el análisis de la unión competitiva utilizando técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, ELISA, resonancia de plasmones superficiales o interferometría de biocapa) definió al menos siete secciones diferentes, cada una de las cuales se comprobó que contenía múltiples moduladores de tipo anticuerpo. A los efectos de la presente exposición, las siete secciones se denominaron secciones A-F y sección U. Las secciones A-F son secciones únicas y los anticuerpos contenidos en cada una de estas secciones compiten entre sí por la unión a la proteína SEZ6. La sección U contiene anticuerpos que no compiten con los anticuerpos de las secciones A-F, pero que pueden competir entre sí por la unión. De este modo, en modalidades seleccionadas, la presente invención comprenderá un modulador que reside en una sección seleccionada del grupo constituido por la sección A, la sección B, la sección C, la sección D, la sección E, la sección F y la sección U. En otras modalidades, la presente invención comprende un modulador que reside en una sección definida por un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo constituido por SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17 ¦9, SC17.10, SC17 .11, SC17. 14, SC17. 15, SC17.16, SC17 • 17, SC17 .18, SC17 •19, SC17 .22, SC17 .24, SC17 .27, SC17 .28, SC17 .29, SC17 .30, SC17 .32, SC17 .34, SC17 • 35, SC17 .36, SC17 .38, SC17 .39, SC17 .40, SC17 .41, SC17 .42, SC17 .45, SC17 .46, SC17 .47, SC17 •49, SC17 .50, SC17 .53, SC17 .54, SC17 .56, SC17 .57, SC17 • 59, SC17 .61, SC17 .63, SC17 • 71, SC17 .72, SC17 .74, SC17 .76, SC17 •77, SC17 •79, SC17 .81, SC17 .82, SC17 •84, SC17 .85, SC17 .87, SC17 .89, SC17 .90, SC17 .91, SC17. 93, SC17. 95, SC17. 97, SC17. 99, SC17. 102, SC17 .114 , SC17 .115, SC17 .120, SC17121, SC17. 122, SC17. 140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17.200. En otras modalidades adicionales, la invención comprenderá moduladores de la sección A, moduladores de la sección B, moduladores de la sección C, moduladores de la sección D, moduladores de la sección E, moduladores de la sección F o moduladores de la sección U. Otras modalidades preferidas más comprenderán un modulador de tipo anticuerpo de referencia y cualquier anticuerpo que compita con el anticuerpo de referencia.

La expresión "competir" o "anticuerpo que compite", cuando se utiliza en el contexto de los moduladores descritos, se refiere a la competición por la unión entre anticuerpos según se determina con un ensayo en el que un anticuerpo de referencia o un fragmento inmunológicamente funcional previene o inhibe sustancialmente (por ejemplo, más de un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o 90%) la unión específica de un anticuerpo de ensayo a un antígeno común. Los métodos compatibles para determinar la competición comprenden técnicas conocidas en la materia tales como, por ejemplo, interferometría de biocapa, resonancia de plasmones superficiales, citometría de flujo, ELISA competitivo, etc.

En una modalidad seleccionada, la invención comprende un modulador de pan-SEZ6 que se asocia con SEZ6 y al menos un miembro de la familia SEZ6 diferente (por ejemplo, SEZ6L o SEZ6L2) . En otras modalidades seleccionadas, la invención comprende un modulador de SEZ6 que se asocia inmunoespecíficamente con una o más isoformas de SEZ6 pero no se asociada inmunoespecíficamente con ningún otro miembro de la familia SEZ6. En otras modalidades más, la presente invención comprende un método para tratar a un sujeto que lo necesite que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de pan-SEZ6. Otras modalidades adicionales comprenden un método para tratar a un sujeto que lo necesite que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de SEZ6 que se asocia inmunoespecíficamente con una o más isoformas de SEZ6 pero que no se asocia inmunoespecíficamente con ningún otro miembro de la familia SEZ6.

Además de los usos terapéuticos descritos anteriormente, también se apreciará que los moduladores de la presente invención se pueden utilizar para detectar, diagnosticar o clasificar los trastornos relacionados con SEZ6 y, en particular, trastornos proliferativos . En algunas modalidades, el modulador se puede administrar al sujeto y detectar o monitorizar in vivo. Los expertos en la técnica apreciarán que tales moduladores se pueden marcar o asociar con marcadores o indicadores como los que se describen más adelante, y se pueden detectar utilizando cualquiera de numerosas técnicas estándar (por ejemplo, MRI , escaneo CAT, escaneo PET, etc.).

Por lo tanto, en algunas modalidades, la invención comprenderá un método para diagnosticar, detectar o monitorizar un trastorno asociado con SEZ6 in vivo en un sujeto que lo necesite que comprende el paso de administrar un modulador de SEZ6.

En otros casos, los moduladores se pueden utilizar en un contexto de diagnóstico in vitro utilizando procedimientos reconocidos en la técnica. En este sentido, una modalidad preferida comprende un método para diagnosticar un trastorno proliferativo en un sujeto que lo necesite que comprende los pasos de : a. obtener una muestra de tejido del sujeto; b. poner en contacto la muestra de tejido con al menos un modulador de SEZ6 ; y c. detectar o cuantificar el modulador de SEZ6 asociado con la muestra .

Tales métodos se pueden apreciar fácilmente junto con la presente solicitud y se pueden poner en práctica fácilmente utilizando la tecnología comercial generalmente disponible tal como lectores de placas automáticos, sistemas indicadores específicos, etc. En modalidades seleccionadas, el modulador de SEZ6 se asociará con las células perpetuantes de tumores presentes en la muestra. En otras modalidades preferidas, el paso de detección o cuantificación comprenderá una reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores y la detección de esta. Además, se puede realizar un análisis de dilución limitante según se ha mencionado previamente, el cual empleará preferentemente el uso del modelo estadístico de la distribución de Poisson con el fin de proporcionar un recuento preciso para la reducción de la frecuencia.

Del mismo modo, la presente invención también proporciona kits o dispositivos y métodos asociados que son útiles en el diagnóstico y la monitorización de trastornos asociados con SEZ6 tales como el cáncer. Con este fin, la presente invención proporciona preferentemente un artículo manufacturado útil para diagnosticar o tratar trastornos asociados con SEZ6 que comprende un receptáculo que comprende un modulador de SEZ6 y materiales instructivos para utilizar el modulador de SEZ6 para tratar o diagnosticar el trastorno asociado con SEZ6. En modalidades seleccionadas, los dispositivos y los métodos asociados comprenderán el paso de establecer contacto con al menos una célula tumoral circulante .

Otras modalidades preferidas de la invención también explotan las propiedades de los moduladores descritos como un instrumento útil para identificar, caracterizar, aislar, seccionar o enriquecer poblaciones o subpoblaciones de células iniciadoras de tumores mediante métodos tales como el análisis por citometría de flujo, incluida la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o el seccionamiento mediado por láser.

En este sentido, otra modalidad preferida de la presente invención se refiere a un método para identificar, aislar, seccionar o enriquecer una población de células iniciadoras de tumores que comprende el paso de poner en contacto las células iniciadoras de tumores con un modulador de SEZ6.

Lo que antecede es un compendio y, por lo tanto, contiene necesariamente simplificaciones, generalizaciones y omisiones de detalles; por consiguiente, los expertos en la técnica apreciarán que el compendio es únicamente ilustrativo y no se pretende que sea limitante de ningún modo. Otros aspectos, características y ventajas de los métodos, las composiciones y/o los dispositivos y/u otros contenidos que se describen en la presente serán evidentes en vista de los principios que se exponen en la presente. El compendio se proporciona para introducir una selección de conceptos de una forma simplificada, los cuales se describen más detalladamente a continuación en la Descripción detallada. No se pretende que este compendio identifique características clave ni características esenciales del contenido reivindicado, ni tampoco se pretende que se utilice como herramienta para determinar el alcance del contenido reivindicado .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las FIGS. 1A-1F son varias representaciones de SEZ6 que incluyen secuencias de ácido nucleico o aminoácidos, las cuales pertenecen a los moduladores de SEZ6 descritos en la presente. Las FIGS. 1A (SEQ 1) y IB (SEQ 2) representan la secuencia completa de ARNm que contiene los marcos de lectura abiertos (ORF) (subrayados) que codifican las variantes de SEZ6 1 y 2, respectivamente. Las FIGS. 1C (SEQ 3) y ID (SEQ 4) proporcionan las secuencias de aminoácidos correspondientes de los ORF indicados en las FIGS. 1A y IB, respectivamente, donde los residuos aminoacídicos subrayados con una línea indican el dominio de expansión transmembranal preel para cada isoforma de la proteína y los residuos aminoacídicos subrayados con dos líneas indican el péptido señal; la FIG. 1E representa la alineación de las dos isoformas de la proteína (SEQ ID NOS: 3 y 4) para ilustrar las diferencias secuenciales en los extremos citoplasmáticos de cada isoforma, donde los residuos subrayados indican las diferencias entre las dos secuencias; y la FIG. 1F proporciona una representación esquemática de la región extracelular de la proteína SEZ6 que ilustra las posiciones de los diferentes dominios.

Las FIGS. 2A-2C proporcionan una representación tabular del porcentaje de identidad a nivel proteico entre la isoforma de SEZ6 más similar a la humana y las proteínas SEZ6 de mono Rhesus, cinomólogo, ratón o rata (FIG. 2A) ; una enumeración tabular de varios códigos de acceso de secuencias proteicas o de ADNc para cada una de las isoformas descritas de la familia de genes SEZ6 (FIG. 2B) ; y el porcentaje de identidad a nivel proteico entre las isoformas más largas de las proteínas SEZ6, SEZ6L y SEZ6L2 humanas (FIG. 2C) .

Las FIGS. 3A-3C proporcionan varias representaciones de secuencias de ácido nucleico o aminoácidos relacionadas con la producción de las líneas celulares o inmunógenos utilizados para generar o caracterizar los moduladores de SEZ6 descritos en la presente. Para SEZ6 humana, se construyó un clon de ADNc específico (FIG. 3A; SEQ ID NO: 5) que codificaba la proteína SEZ6 humana madura completa (FIG. 3B; SEQ ID NO: 6) a partir de un clon de ADNc comercial (BC146292; SEQ ID NO: 7) con diferencias conocidas (FIG. 3C) procedente de una secuencia de referencia de una base de datos, NP_849191 (SEQ ID NO: 3), para la proteína SEZ6.

Las FIGS. 4A y 4B proporcionan un ADNc (FIG. 4A; SEQ ID NO: 8) utilizado para expresar un constructo de Fc-SEZ6 en células CHO-S y obtener un inmunógeno proteico (FIG. 4B; SEQ ID NO: 9) , que comprende el ECD de SEZ6 humana fusionado con un dominio Fe de IgG2 humana, en el cual las secuencias subrayadas corresponden al dominio Fe de IgG2 humana, las secuencias subrayadas con dos líneas corresponden al péptido señal de IgK y los aminoácidos en negrita corresponden a los residuos proporcionados por los sitios de restricción utilizados para clonar el fragmento hSCRx!7.

Las FIGS. 5A-5J proporcionan varias representaciones de las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos relacionadas con la producción de las líneas celulares o inmunógenos utilizados para generar o caracterizar los moduladores de SEZ6 descritos en la presente, donde las secuencias subrayadas indican el ECD de la proteína para el miembro de la familia SEZ6 o SEZ6 específico que se esté ilustrando, y las figuras comprenden las secuencias de ADNc para los constructos que codifican la proteína SEZ6 murina madura (FIG. 5A, SEQ ID NO: 10) , SEZ6 de rata madura (FIG . 5C, SEQ ID NO: 12), SEZ6 cinomóloga madura (FIG. 5E, SEQ ID NO: 14), el ECD maduro de la proteína SEZ6L humana (FIG. 5G, SEQ ID NO: 16 ) o el ECD maduro de la proteína SEZ6L2 humana (FIG. 51, SEQ ID NO: 18), o las proteínas correspondientes codificadas por estos constructos de ADNc, a saber, SEZ6 murina madura (FIG. 5B, SEQ ID NO: 11) , SEZ6 de rata madura (FIG. 5D, SEQ ID NO : 13) , SEZ6 cinomóloga madura (FIG. 5F, SEQ ID NO: 15), el ECD maduro de la proteína SEZ6L humana (FIG. 5H, SEQ ID NO: 17) o el ECD maduro de la proteína SEZ6L2 humana (FIG. 5J, SEQ ID NO: 19) .

Las FIGS. 6A y 6B son representaciones de los niveles de expresión del ARNm de varios genes según se evaluaron utilizando la secuenciación del transcriptoma completo (SOLiD) de ARNm derivado de subpoblaciones de células tumorales o tejidos normales. La FIG. 6A es una representación tabular de genes asociados con tumores que tienen características neuroendocrinas ; y la FIG. 6B es una representación gráfica de la expresión de ARNm de SEZ6 en tejidos normales y en varios tumores de xenoinjerto no tradicionales (NTX, por sus siglas en inglés) derivados de cánceres de pulmón.

Las FIGS . 7A-7F representan los niveles de expresión de ARNm analizados utilizando una micromatriz. La FIG. 7A es una representación gráfica de una agrupación no supervisada de perfiles micromatriciales para 46 líneas tumorales y 2 tejidos normales; las FIGS. 7B y 7C son representaciones tabulares de los valores de intensidad normalizados correspondientes a los niveles de expresión relativa de genes seleccionados relacionados con fenotipos neuroendocrinos (FIG. 7B) o la vía de señalización Notch (FIG. 7C) , donde las celdas sin sombreado y los números relativamente bajos indican una expresión escasa o nula y las celdas más oscuras y los números relativamente mayores indican unos niveles de expresión más elevados; la FIG. 7D es una representación gráfica que muestra los niveles de expresión relativa del ARNm de HES6 en diversos tumores y te idos normales según se midieron utilizando qRT-PCR; la FIG. 7E es una representación tabular de los valores de intensidad normalizados correspondientes a los niveles de expresión relativa de genes seleccionados que indican neurogénesis , compromiso neural o diferenciación hacia los destinos neurales, donde las celdas sin sombreado indican una expresión escasa o nula y las celdas más oscuras indican unos niveles de expresión más elevados; y la FIG. 7F es una representación gráfica de los valores de intensidad normalizados correspondientes a la expresión relativa de SEZ6 en varias líneas tumorales de NTX.

Las FIGS. 8A y 8B son representaciones gráficas que muestran los niveles de expresión relativa de los transcritos de ARNm de SEZ6 según se midieron por RT-PCR en una serie de muestras de ARN aisladas de tejidos normales o tumores NTX de constitución neuroendocrina (FIG. 8A) y una serie de otros tumores NTX (FIG. 8B) .

Las FIGS. 9A y 9B son representaciones gráficas que muestran los niveles de expresión de ARNm absolutos (FIG. 9A) o normalizados (FIG. 9B) de SEZ6 humana según se midieron por RT-PCR en muestras de tumores enteros (punto gris) o tejido adyacente normal de características similares (NAT, por sus siglas en inglés; punto blanco) de pacientes con uno de entre dieciocho tipos diferentes de tumores sólidos.

Las FIGS. 10A y 10B proporcionan, en un formato tabular, las secuencias de aminoácidos contiguas de las regiones variables de las cadena ligera y pesada de una serie de moduladores de SEZ6 ilustrativos humanizados y murinos aislados, clonados y modificados como se describe en los Ejemplos de la presente.

Las FIGS . 11A-11B exponen varias características de moduladores ilustrativos de la invención. La FIG. 11A muestra las propiedades bioquímicas e inmunológicas de moduladores de SEZ6 ilustrativos, representadas en un formato tabular; y la Figura 11B proporciona una correlación entre el dominio al cual se une el anticuerpo y la eficacia del anticuerpo en un ensayo de aniquilación in vitro.

Las FIGS. 12A y 12B muestran la detección de la expresión de SEZ6. La FIG. 12A muestra la expresión de SEZ6 en células HEK-293T modificadas para que sobreexpresen la proteína SEZ6 humana (h293T-HuSEZ6) utilizando el anticuerpo anti-SEZ6 SC17.33; la FIG. 12B muestra la expresión proteica relativa de SEZ6 humana en varios lisados de tumores NTX y de tejidos normales según se midieron utilizando un ensayo electroquimioluminiscente .

Las FIGS. 13A y 13B muestran la detección por citometría de flujo de la expresión de la proteína SEZ6 en células de tumores NTX utilizando varios anticuerpos anti-SEZ6 (FIG. 13A) ; mientras que la FIG. 13B muestra la expresión mejorada de la proteína SEZ6 en CSC en comparación con subpoblaciones de NTG utilizando varios anticuerpos anti-SEZ6 (FIG. 13B) .

Las FIGS . 14A y 14B muestran que las CSC que expresan SEZ6 exhiben una tumorigenicidad mejorada en comparación con las CSC que no expresan SEZ6. La FIG. 14A es una gráfica de contorno que muestra la clasificación celular según FACS de las células en un tumor pulmonar (LU37) en función de la expresión de CD324 (un marcador de CSC) y SEZ6; la FIG. 14B es una representación gráfica del crecimiento de células tumorales que son o bien CD324+SEZ6+ (círculos negros) o CD324+SEZ6" (círculos blancos) tras implantarlas en ratones inmunodeprimidos . Las células tumorales que expresan tanto CD324 como SEZ6 exhiben una tumorigenicidad mejorada.

Las FIGS. 15A y 15B proporcionan, respectivamente, una representación tabular y gráfica que ilustra que los moduladores descritos se pueden utilizar de manera eficaz como restos de direccionamiento para dirigir cargas útiles citotóxicas hacia células que han sido modificadas para que expresen SEZ6 (FIG. 15A) y hacia tumores pulmonares NTX (LU80, LU37 y LU100) desarrollados in vitro (FIG. 15B) , donde la reducción de las unidades de luminiscencia relativas normalizadas (RLU, por su siglas en inglés) indica la aniquilación de las células a través de la internalización de la toxina saporina.

La FIG. 16 es una representación tabular de los resultados inmunohistoquímicos que muestra la expresión de SEZ6 en varios tumores NTX.

Las FIGS. 17A y 17B representan la capacidad de los anticuerpos anti-SEZ6 de ratón conjugados para retardar el crecimiento in vitro e in vivo de células de tumores NTX. La FIG. 17A muestra los resultados de un ensayo de aniquilación in vi tro utilizando ADC anti-SEZ6 en células HEK293 que sobreexpresan SEZ6; mientras que la FIG. 17B muestra el efecto de ADC anti-SEZ6 sobre el crecimiento in vivo de tumores SCLC (LU86) y LCNEC (LU50) .

Las FIGS. 18A y 18B representan la capacidad de anticuerpos anti-SEZ6 humanizados conjugados para retardar el crecimiento in vivo de cuatro tumores SCLC (LU80, LU64, LU111 y LU117) y conseguir una remisión duradera en ratones inmunodeficientes .

BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se ha presentado en formato ASCII a través de EFS- eb y se incorpora a la presente en su totalidad por referencia. La copia ASCII, creada el 19 de febrero de 2013, se denomina 11200.0014-00304 y tiene un tamaño de 450 013 bytes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I . Introducción A pesar de que la presente invención se pueda materializar de muchas formas diferentes, en la presente se describen modalidades ilustrativas específicas de esta que ejemplifican los principios de la invención. Cabe destacar que la presente invención no se limita a las modalidades específicas ilustradas. Además, todos los títulos de las secciones utilizados en la presente tienen carácter únicamente organizativo y no se deben interpretar como limitantes del contenido descrito. Por último, a los efectos de la presente exposición, todos los números de acceso identificativos de secuencias se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de referencia (RefSeq) del NCBI y/o la base de datos de archivo de secuencias GenBank® del NCBI a menos que se indique lo contrario.

Como se ha mencionado anteriormente, se ha descubierto sorprendentemente que la expresión de SEZ6 está asociada con trastornos proliferativos y de crecimiento neoplásico, particularmente en el caso de tumores con características neuroendocrinas, y que SEZ6 y sus variantes o isoformas proporcionan marcadores tumorales útiles que pueden ser explotados en el tratamiento de enfermedades relacionadas. Además, como se muestra en la presente solicitud, se ha descubierto inesperadamente que los marcadores o determinantes de SEZ6, tales como la proteína SEZ6 de la superficie celular, están asociados con las células madre cancerosas (conocidas también como células perpetuantes de tumores) y pueden ser explotados de forma eficaz para conseguir la eliminación o el silenciamiento de estas. La capacidad para reducir o eliminar de forma selectiva las células madre cancerosas (por ejemplo, mediante el uso de moduladores de SEZ6 conjugados) es particularmente sorprendente ya que existe constancia de que estas células son generalmente resistentes a muchos tratamientos convencionales. Es decir, la efectividad de los métodos de tratamiento dirigidos tradicionales, así como también de los más recientes, se ve limitada a menudo por la existencia y/o la emergencia de células madre cancerosas resistentes que son capaces de perpetuar el cáncer incluso ante estos diferentes métodos de tratamiento. Además, los determinantes asociados con las células madre cancerosas suelen ser malas dianas terapéuticas debido a que su expresión es baja o inestable, a que no se mantienen asociados con la célula tumorigénica o a que no están presentes en la superficie celular. En contraste drástico con los principios de la técnica anterior, los compuestos y métodos descritos en la presente superan de forma efectiva esta resistencia inherente para eliminar, agotar, silenciar o propiciar específicamente la diferenciación de estas células madre cancerosas, y de este modo anulan su capacidad para soportar o reinducir el crecimiento tumoral subyacente.

Más específicamente, se ha descubierto que los moduladores de SEZ6, tales como los que se describen en la presente, se pueden utilizar de forma conveniente en el pronóstico, el diagnóstico, el teragnóstico, el tratamiento o la prevención de trastornos proliferativos (por ejemplo, trastornos neoplásicos) en sujetos que lo necesiten. Por consiguiente, aunque a continuación se expondrán detalladamente las modalidades preferidas de la invención, particularmente en términos de dominios, regiones o epítopos particulares, o en el contexto de células madre cancerosas o tumores que comprenden características neuroendocrinas y sus interacciones con los moduladores descritos, los expertos en la técnica apreciarán que el alcance de la presente invención no se limita a tales modalidades ilustrativas. En cambio, las modalidades más expansivas de la presente invención y las reivindicaciones adjuntas se refieren de forma expresa y amplia a moduladores de SEZ6 (incluidos los moduladores conjugados) y su uso en el pronóstico, el diagnóstico, el teragnóstico, el tratamiento o la prevención de diversos trastornos mediados por SEZ6 o asociados con este, que incluyen trastornos proliferativos o neoplásicos, independientemente de cualquier mecanismo particular de acción o del componente molecular o celular, o tumor al que se dirijan específicamente.

Con tal fin y tal como se demuestra en la presente solicitud, se ha descubierto inesperadamente que los moduladores de SEZ6 descritos se pueden utilizar de forma efectiva para atacar y eliminar o incapacitar de algún otro modo células proliferativas o tumorigénicas y para tratar trastornos asociados con SEZ6 (por ejemplo, neoplasias) . Se sobreentenderá que la expresión "trastorno asociado con SEZ6", tal como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier trastorno o enfermedad (incluidos los trastornos proliterativos) que se marque, diagnostique, detecte o identifique por una aberración fenotípica o genotípica de los componentes genéticos de SEZ6 o su expresión durante el curso o la etiología de la enfermedad o trastorno. A este respecto, un determinante o una aberración fenotípica de SEZ6 puede comprender, por ejemplo, unos niveles elevados o reducidos de expresión de la proteína SEZ6, una expresión anómala de la proteína SEZ6 en ciertas poblaciones de células definibles o una expresión anómala de la proteína SEZ6 en una fase o etapa inadecuada de un ciclo vital celular. Obviamente, se apreciará que también se pueden utilizar patrones de expresión similares de determinantes genotípicos (por ejemplo, niveles de transcripción de ARNm) de SEZ6 para clasificar o detectar trastornos asociados con SEZ6.

Las expresiones "determinante" o "determinante de SEZ6", tal como se utilizan en la presente, se referirán a cualquier rasgo, propiedad, marcador o factor detectable que esté asociado de forma identificable con una célula, una población de células o un tejido particular, o que se encuentre específicamente en o sobre estos, incluidos aquellos identificados en o sobre un tejido, una célula o una población de células afectados por una enfermedad o un trastorno asociado con SEZ6. En modalidades preferidas seleccionadas, los moduladores de SEZ6 se pueden asociar, unir o hacer reaccionar directamente con el determinante de SEZ6 (por ejemplo, la proteína SEZ6 de la superficie celular o el ARNm de SEZ6) y de este modo mejoran el trastorno. Más generalmente, los determinantes pueden ser de naturaleza morfológica, funcional o bioquímica y pueden ser genotípicos o fenotípicos. En otras modalidades preferidas, el determinante es un componente genético o un antígeno de la superficie celular que es expresado (o no) diferencial o preferencialmente por unos tipos de células específicas (por ejemplo, células madre cancerosas) o por células en ciertas condiciones (por ejemplo, durante puntos específicos del ciclo celular o células en un nicho particular) . En otras modalidades preferidas adicionales, el determinante puede comprender un gen o entidad genética que se regule (por aumento o disminución) de forma diferente en una célula o población de células discreta específica, un gen que se modifique diferencialmente respecto a su estructura física y composición química, o una proteína o colección de proteínas asociadas físicamente con un gen que presenten modificaciones químicas diferenciales. Los determinantes contemplados en la presente se consideran específicamente positivos o negativos, y pueden referirse a una célula, una subpoblación de células o un tejido (por ejemplo, tumores), por su presencia (positivos) o ausencia (negativos) .

Del mismo modo, los "moduladores de SEZ6" de la invención comprenden en un sentido amplio cualquier compuesto que reconozca, reaccione, compita, antagonice, interaccione, se una, agonice o se asocie con una variante o isoforma de SEZ6 (o dominios, regiones o epítopos específicos de estas) o su componente genético. Mediante estas interacciones, los moduladores de SEZ6 pueden eliminar, reducir o moderar de forma favorable la frecuencia, actividad, recidiva, metástasis o movilidad de células tumorigénicas (por ejemplo, células perpetuantes de tumores o células madre cancerosas) . Los moduladores ilustrativos descritos en la presente comprenden nucleótidos, oligonucleótidos , polinucleótidos , péptidos o polipéptidos . En ciertas modalidades preferidas, los moduladores seleccionados comprenderán anticuerpos para una isoforma de la proteína SEZ6, o fragmentos inmunorreactivos o derivados de estos. Tales anticuerpos pueden ser de naturaleza antagonista o agonista, y pueden estar opcionalmente conjugados o asociados con un agente terapéutico o de diagnóstico. Además, tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden comprender anticuerpos supresores, neutralizantes o internalizantes. En otras modalidades, los moduladores de la presente invención constituirán un constructo de SEZ6 que comprenderá una isoforma de SEZ6 o un fragmento reactivo de esta. Se apreciará que tales constructos pueden comprender proteínas de fusión y pueden incluir dominios reactivos de otros polipéptidos tales como inmunoglobulinas o modificadores de la respuesta biológica. En otros aspectos adicionales, el modulador de SEZ6 comprenderá un resto de ácido nucleico (por ejemplo, miARN, ARNip, AR hc, constructos complementarios, etc.) que ejerce los efectos deseados a nivel genómico. Más adelante se discutirán detalladamente otros moduladores adicionales compatibles con los principios de la presente.

Más generalmente, los moduladores de SEZ6 de la presente invención comprenden en un sentido amplio cualquier compuesto que reconozca, reaccione, compita, antagonice, interaccione, se una, agonice o se asocie con un determinante (genotípico o fenotípico) de SEZ6, incluida la proteína SEZ6 de la superficie celular. Independientemente de la forma del modulador que se seleccione en última instancia, este se encontrará preferentemente en un estado aislado y purificado antes de introducirlo en un sujeto. A este respecto, se sobreentenderá que la expresión "modulador de SEZ6 aislado" o "anticuerpo de SEZ6 aislado", en un sentido amplio y de acuerdo con la práctica farmacéutica estándar, se refiere a cualquier preparado o composición que comprenda el modulador en un estado sustancialmente exento de contaminantes (biológicos o de otro tipo) no deseados. Además, estos preparados se pueden purificar y formular, según se desee, utilizando diversas técnicas reconocidas en la materia. Obviamente, se apreciará que tales preparados "aislados" se pueden formular o combinar intencionalmente con ingredientes activos o inertes, según se desee, para mejorar los aspectos comerciales, terapéuticos o de fabricación del producto acabado y proporcionar composiciones farmacéuticas. En un sentido más amplio, las mismas consideraciones generales se pueden aplicar a una isoforma o variante "aislada" de SEZ6, o a un ácido nucleico "aislado" que la codifique.

Además, se ha descubierto sorprendentemente que los moduladores que interaccionan, se asocian o se unen a dominios, motivos o epítopos de SEZ6 particulares son especialmente eficaces para eliminar células tumorigénicas y/o silenciar o atenuar los efectos de las células madre cancerosas sobre el crecimiento o la propagación del tumor. Es decir, a pesar de que los moduladores que reaccionan o se asocian con dominios que están próximos a la superficie celular (por ejemplo, uno de los dominios similares a CUB o Sushi) son eficaces para agotar o neutralizar las células tumorigénicas, se ha descubierto inesperadamente que los moduladores que se asocian o se unen a dominios, motivos o regiones que están relativamente más distantes de la superficie celular también son eficaces para eliminar, neutralizar, agotar o silenciar células tumorigénicas. Esto es especialmente cierto en el caso de los moduladores conjugados tales como, por ejemplo, conjugados de anticuerpo anti-SEZ6-fármaco que comprenden un agente citotóxico.

Aunque la presente invención contempla expresamente el uso de cualquier modulador de SEZ6 en el tratamiento de cualquier trastorno asociado con SEZ6, que incluye cualquier tipo de neoplasia, en modalidades particularmente preferidas, los moduladores descritos se pueden utilizar para prevenir, tratar o diagnosticar tumores que comprenden características (genotípicas o fenotípicas) neuroendocrinas , incluidos los tumores neuroendocrinos . Los "tumores neuroendocrinos canónicos" (NET, por sus siglas en inglés) o verdaderos se originan en el sistema endocrino difuso y normalmente son muy agresivos. Los tumores neuroendocrinos aparecen en el riñon, aparato genitourinario (vejiga, próstata, ovario, cuello uterino y endometrio) , tubo gastrointestinal (estómago, colon) , tiroides (cáncer medular de tiroides) y pulmón (carcinoma pulmonar microcítico y carcinoma neuroendocrino de células grandes) . Además, los moduladores descritos se pueden utilizar convenientemente para tratar, prevenir o diagnosticar tumores pseudoneuroendocrinos (pNET, por sus siglas en inglés) que genotípica o fenotípicamente imitan, comprenden, se asemejan o exhiben rasgos comunes respecto a los tumores neuroendocrinos canónicos. Los "tumores pseudoneuroendocrinos" son tumores que se originan a partir de células del sistema neuroendocrino difuso o a partir de células en las que se ha reactivado de forma aberrante una cascada de diferenciación neuroendocrina durante el proceso oncogénico. Tales pNET normalmente comparten ciertas características genotípicas, fenotípicas o bioquímicas con tumores neuroendocrinos definidos tradicionalmente, que incluyen la capacidad para producir subconjuntos de aminas, neurotransmisores y hormonas peptídicas biológicamente activos. Por consiguiente, a los efectos de la presente invención, se sobreentenderá que las frases "tumores que comprenden características neuroendocrinas " o "tumores que exhiben características neuroendocrinas" comprenden tanto tumores neuroendocrinos como tumores pseudoneuroendocrinos a menos que el contexto dicte lo contrario.

Aparte de la asociación con tumores indicada de forma general anteriormente, también existen indicios de la asociación fenotípica o genotípica entre células iniciadoras de tumores (TIC, por sus siglas en inglés) y determinantes de SEZ6. A este respecto, ciertas TIC seleccionadas (por ejemplo, células madre cancerosas) pueden expresar niveles elevados de proteínas SEZ6 cuando se comparan con tejido normal y células no tumorigénicas (NTG) , que juntas constituyen normalmente la mayor parte de un tumor sólido. Por lo tanto, los determinantes de SEZ6 pueden comprender un marcador (o antígeno o inmunógeno) asociado con un tumor, y los moduladores descritos pueden proporcionar agentes eficaces para detectar y suprimir TIC y neoplasias asociadas debido a unos niveles alterados de las proteínas en las superficies celulares o en el microentorno del tumor. Por consiguiente, los moduladores de SEZ6 , incluidos los antagonistas y anticuerpos inmunorreactivos que se asocian, unen o reaccionan con las proteínas, pueden reducir de forma efectiva la frecuencia de las células iniciadoras de tumores, y podrían ser útiles para eliminar, agotar, incapacitar, reducir, promover la diferenciación de estas células iniciadoras de tumores o para impedir o limitar de otro modo su capacidad para permanecer en estado latente y/o continuar fomentando el crecimiento, la metástasis o la recidiva del tumor en un paciente. A este respecto, los expertos en la técnica apreciarán que la presente invención proporciona además moduladores de SEZ6 y su uso para reducir la frecuencia de las células iniciadoras de tumores.

II . Fisiología de SEZ6 SEZ6 (que también se conoce como homólogo relacionado con las convulsiones 6) es una proteína transmembranal de tipo I que se clonó originariamente a partir de células derivadas de la corteza cerebral de ratón tratadas con el agente convulsivo pentilentetrazol (Shimizu-Nishikawa, 1995; PMID: 7723619) . Los ortólogos proteicos de SEZ6 representativos incluyen, sin carácter limitante, los de ser humano (NP_849191; NP_001092105) , chimpancé (XP_511368, NP_001139913) , ratón (NP_067261) y rata (NP_001099224 ) . En los seres humanos, el gen SEZ6 está constituido por 17 exones con una extensión de 51.1 kBp situados en el cromosoma 17qll.2. Los sitios aceptores de corte y empalme alterno separados por tan solo 16 pares de bases dentro del último exón originan dos transcritos procesados, uno de aproximadamente 4210 bases ( M_178860 ; FIG. 1A) y otro de aproximadamente 4194 bases (NM_001098635, FIG. IB) . El primer transcrito codifica una proteína de 994 aminoácidos (NP_849191; FIG. 1C) , mientras que el último codifica una proteína de 993 aminoácidos (NP_001092105 ; FIG. ID) . Estas dos isoformas proteicas de SEZ6 comparten una identidad de un 100% a lo largo de sus dominios extracelulares y sus dominios transmembranales, diferenciándose únicamente en los diez últimos residuos aminoacídicos (FIG. 1E) . Se ha descrito que una tercera variante de corte y empalme genera una forma secretada de SEZ6 (Shimizu-Nishikawa, 1995; PMID: 7723619), sin embargo, esta no se ha incluido en las RefSeqs asociadas que se encuentran en la entrada de la página de genes en la base de datos del NCBI . Los moduladores de la invención se pueden unir a cualquiera de las variantes de corte y empalme.

Se desconoce la relevancia biológica de las isoformas, a pesar de que un estudio ha sugerido acciones opuestas para la membrana frente a las proteínas solubles cuando se reestablece su expresión en las neuronas de ratones con SEZ6 de murino desactivado (Gunnersen et al. 2007, PMID: 18031681) . La identidad de la secuencia proteica entre especies para proteínas SEZ6 se enumera en la FIG. 2A. En el genoma humano, existen dos genes estrechamente relacionados: el similar al homólogo relacionado con las convulsiones 6 (SEZ6L) y el similar al homólogo relacionado con las convulsiones 6-2 (SEZ6L2) , cada uno de los cuales presenta múltiples variantes de corte y empalme que codifican numerosas isoformas (FIG. 2B) . Los porcentajes de identidad para la proteína más larga de cada uno de los miembros de esta familia de proteínas similares a SEZ6 en seres humanos se muestran en la FIG. 2C. A los efectos de la presente solicitud, considerados conjuntamente, SEZ6, SEZ6L y SEZ6L2, incluidas sus diferentes isoformas, se denominarán familia SEZ6. Los moduladores de SEZ6 de la invención comprenden moduladores que son específicos para cada uno de SEZ6, SEZ6L o SEZ6L2. Como alternativa, los moduladores de la invención pueden reaccionar de forma cruzada con SEZ6 y uno o ambos de entre SEZ6L y/o SEZ6L2.

La proteína SEZ6 madura está compuesta por una serie de dominios estructurales: un dominio citoplasmático, un dominio transmembrana1 y un dominio extracelular que comprende un único dominio aminoterminal , seguido de dos dominios similares a CUB y Sushi alternos, y tres repeticiones de dominio Sushi tándem adicionales. Existen dos isoformas del antígeno SEZ6 y difieren únicamente en el extremo carboxiterminal , dominio citoplasmático.

La FIG. 1F proporciona un diagrama esquemático de la región extracelular de la proteína SEZ6, que ilustra la yuxtaposición general de los dominios CUB y Sushi, y el dominio aminoterminal . En general, los dominios se reconocen como los que aparecen en aproximadamente los residuos aminoácidos 336-395 (Dominio Sushi 1) , 397-508 (Dominio CUB 1), 511-572 (Dominio Sushi 2), 574-685 (Dominio CUB 2), 690-748 (Dominio Sushi 3) , 750-813 (Dominio Sushi 4) , 817-878 (Dominio Sushi 5) , con el dominio aminoterminal en aproximadamente los residuos aminoacídicos 1-335 y una preferencia composicional de residuos ricos en prolina en aproximadamente los residuos aminoacídicos 71-169.

Las repeticiones Sushi son similares a las repeticiones consenso cortas que se encuentran en otras proteínas reguladoras del complemento humano (es decir, los sitios de unión C3b/C4b del complemento) . Los dominios similares a CUB son dominios que se asemejan a CUB y que se encuentran en otras proteínas de unión al complemento de mamíferos, los cuales se asocian con una amplia gama de proteínas que participan en numerosos procesos biológicos diferentes de la activación del complemento, que incluyen, sin carácter limitante, el moldeo, la guía de axones, la inflamación y la supresión de tumores (Bork y Beckman, 1993, PMID: 8510165). Tanto los dominios Sushi como CUB implican una función para SEZ6 que implica la unión de otras proteínas extracelularmente . Las proteínas que contienen dominios CUB también se han relacionado con las vías de señalización celular y, de forma coherente con esta función, los dominios citoplasmáticos carboxiterminales de SEZ6 contienen el motivo Asn-Pro-Thr-Tyr (SEQ ID NO: 403) , el cual representa una posible diana para la fosforilación por parte de los miembros de la familia de tirosina-cinasas Src. Si esto fuera cierto, vincularía SEZ6 con una vía de transducción de señales celulares que conduciría a la activación de Ras, lo cual sugeriría que SEZ6 puede ser un receptor neurotrófico .

Cabe destacar que las expresiones "proteína madura" o "polipéptido maduro", tal como se utilizan en la presente, se refieren a la forma o las formas de la proteína SEZ6 producidas sin el péptido señal de 19 aminoácidos que puede ser escindido antes de la expresión en la superficie celular. A menos que se indique de otro modo, la numeración de los aminoácidos de SEZ6 (para los dominios, las regiones, los epítopos, etc.) se realizará en el contexto de una proteína madura sin el líder.

SEZ6 se puede detectar por RT-PCR en niveles bajos en el riñon, el hígado, el corazón, el pulmón y el timo de roedores, aunque se ha observado una fuerte expresión de la proteína únicamente en el cerebro, con un nivel significativo expresado en los testículos (Herbst y Nicklin, 1997, PMID: 9073173). Utilizando suero policlonal para SEZ6 , la expresión de la proteína se detectó el día 13 del desarrollo del prosencéfalo de ratón. Se detectó una tinción fuerte en las neuronas posmitóticas en estado de maduración de la placa y subplaca cortical en estado de desarrollo. Esta tinción es menor en el cerebro adulto, donde la expresión de SEZ6 se puede detectar en otras regiones del cerebro asociadas con la plasticidad morfológica en curso, tales como el hipocampo, el cerebelo y el bulbo olfatorio, así como en neuronas de la retina y la médula espinal (Gunnersen et al., 2007, PMID: 18031681) . Las señales más densas se encuentran en las regiones con una mayor concentración de cuerpos de células neuronales. A pesar de la expresión generalizada de SEZ6 en la retina, la función retinal no se vio afectada en ausencia de SEZ6 (Gunnersen et al., 2009, PMID: 19662096). El patrón de tinción de SEZ6 está estrechamente ligado a la emergencia del hipocampo y las capas neocorticales , e implica una función específica del prosencéfalo para este gen durante el desarrollo. Se ha descubierto que, en seres humanos y ratones, SEZ6 se expresa de forma diferencial en regiones altamente específicas del neocórtex (Gunnersen et al., 2007, mencionado anteriormente) .

Las mutaciones en el gen SEZ6 humano se han relacionado con convulsiones febriles (FS, por sus siglas en inglés) , una convulsión asociada con un aumento de la temperatura corporal y que representa el tipo más habitual de convulsión en la infancia (Yu et al., 2007, PMID : 17086543 ) . Las FS se pueden clasificar como simples o complejas, dependiendo de su duración, recidiva y de la extensión del cuerpo afectada por la convulsión. En un cohorte chino, no se encontraron mutaciones de SEZ6 en 15 controles sanos, pero se encontraron mutaciones en 21 de 60 pacientes con FS, siendo el tipo más habitual de mutación una inserción heterocigótica de citosina (mutación de desplazamiento del marco) en la posición 1435 del ADNc . La incidencia de la mutación fue significativamente más elevada en pacientes con FS complejas y en pacientes con un historial familiar positivo. Debido a que existe una probabilidad de un 80% de que los niños con FS complejas padezcan convulsiones en el futuro, los autores sugieren que el hecho de realizar un cribado para detectar mutaciones en SEZ6 podría resultar valioso para predecir la recidiva de FS o el desarrollo de epilepsia (Yu et al., 2007, mencionado anteriormente) . Estudios posteriores han cuestionado la incidencia, la relevancia y la capacidad de este estudio de tener un poder adecuado que implique la causalidad, pero sí que respaldan el hecho de que SEZ6 podría ser un gen entre muchos que desempeñe una función en trastornos relacionados con convulsiones (Mulley et al., 2011, PMID : 21785725).

Se siguen desconociendo las funciones moleculares específicas de SEZ6. Según se ha indicado anteriormente, el análisis de los módulos estructurales de la proteína identificados por homología y análisis de secuencias sugiere una posible función en la señalización, la comunicación célula-célula y el desarrollo neural. La ramificación dendrítica neuronal y la conectividad que forman las redes de señalización que constituyen el circuito del cerebro se originan y especifican por la acción de programas moleculares intrínsecos en la célula neural, así como también por señales extrínsecas. El proceso de crecimiento dendrítico en neuronas piramidales, la neurona principal en el prosencéfalo de mamíferos, proporciona neuronas con morfologías distintivas -un cuerpo de célula piramidal y dos árboles dendríticos complejos distintos: uno que emerge a partir del ápice y el otro a partir de la base del cuerpo de la célula. Gunnersen et al. (2007, mencionado anteriormente) han demostrado que ratones que carecen de SEZ6 exhiben un exceso de dendritas cortas en los árboles dendríticos de estas neuronas, aunque no presentan ningún incremento en el campo dendrítico global, que representa el intervalo de neuronas con el cual se conecta una neurona determinada. La restauración de la expresión de las isoformas de SEZ6 unidas a la membrana en las neuronas desactivadas provoca un efecto antirramificante . En ensayos de comportamiento, los ratones que carecen de SEZ6 presentan deficiencias cognitivas, motoras y exploratorias específicas. Estos datos sugieren que SEZ6 es importante para conseguir el equilibrio necesario entre la elongación y la ramificación de las dendritas durante la elaboración de un árbol dendrítico complejo durante el desarrollo.

Conjuntamente, los estudios anteriores sugieren encarecidamente que la proteína SEZ6 es importante en el contexto del desarrollo neural y es probable que desempeñe una función en la señalización y la comunicación célula-célula. En los tumores se observa habitualmente una reactivación inadecuada de las vías de señalización del desarrollo o un desequilibrio de las vías de señalización normales (Harris et al., 2012). Una colección de tumores que comparten características que indican una reactivación parcial de los programas de desarrollo son los tumores con fenotipos neuroendocrinos (Yao 2008; PMID: 18565894), en los cuales se expresan y/o secretan varios marcadores endocrinos y hormonas, y se expresan varios marcadores neurales que indican neurogénesis , compromiso neural o diferenciación hacia los destinos neurales. Los tumores con características neuroendocrinas se originan con poca frecuencia en una amplia gama de sitios primarios y, aunque su clasificación exhaustiva sigue siendo problemática (Yao; PMID: 18565894; Klimstra 2010; PMID: 20664470; Klóppel, 2011; PMID: 22005112), se pueden clasificar en cuatro tipos principales: carcinoides benignos de bajo grado, tumores neuroendocrinos bien diferenciados de bajo grado con comportamiento maligno, tumores con características neuroendocrinas y epiteliales mixtas, y carcinomas neuroendocrinos poco diferenciados de alto grado. Entre estas clasificaciones, los carcinomas neuroendocrinos poco diferenciados, que incluyen el carcinoma de pulmón microcítico (SCLC, por sus siglas en inglés) y subconjuntos de cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC, por sus siglas en inglés) , son tipos de cáncer con un pronóstico desalentador. Se ha postulado que el SCLC es de origen broncogénico y se origina en parte a partir de células neuroendocrinas pulmonares (Galluzzo y Bocchetta, 2011; PMID: 21504320) . Independientemente de la fuente celular de origen para estos tumores, es evidente que presentan un fenotipo endocrino poco diferenciado, a menudo son muy proliferativos y agresivos y frecuentemente sobreexpresan proteínas neurales. El aumento resultante de marcadores de expresión neural en estos tumores, que se pueden restringir de otro modo principalmente al sistema nervioso o que pueden presentar una expresión limitada durante el desarrollo, entre los cuales SEZ6 puede ser un ejemplo, puede ofrecer, por consiguiente, una diana terapéutica única para tumores con el fenotipo neuroendocrino .

III. Células madre cancerosas Como se ha indicado anteriormente, se ha descubierto sorprendentemente que la expresión de SEZ6 aberrante (genotípica y/o fenotípica) está asociada con diversas subpoblaciones de células tumorigénicas . A este respecto, la presente invención proporciona moduladores de SEZ6 que pueden ser particularmente útiles para atacar a tales células, y especialmente células perpetuantes de tumores, y de este modo se facilita el tratamiento, el control o la prevención de trastornos neoplásicos. Por lo tanto, en modalidades preferidas, los moduladores de determinantes (fenotípicos o genotípicos) de SEZ6 se pueden utilizar convenientemente para reducir la frecuencia de las células iniciadoras de tumores de acuerdo con los principios de la presente y de este modo se facilita el tratamiento o el control de trastornos proliferativos .

A los efectos de la presente solicitud, la expresión "célula iniciadora de tumores" (TIC) abarca tanto las "células perpetuantes de tumores" (TPC, por sus siglas en inglés; es decir, células madre cancerosas o CSC, por sus siglas en inglés) como las "células progenitoras tumorales" muy proliferativas (denominadas TProg) , que juntas constituyen generalmente una subpoblacion única (es decir, un 0.1-40%) de una masa o volumen tumoral . A los efectos de la presente exposición, las expresiones "células perpetuantes de tumores" y "células madre cancerosas" o "células madre neoplásicas" son equivalentes y se pueden utilizar indistintamente. Las TPC se diferencian de las TProg en que las TPC pueden recapitular por completo la composición de células tumorales existentes en un tumor y tienen una capacidad de autorrenovación ilimitada tal como demuestra el trasplante en serie (dos o más pases a través de ratones) de números reducidos de células aisladas, mientras que las TProg no presentarán una capacidad de autorrenovación ilimitada.

Los expertos en la técnica apreciarán que la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando marcadores de la superficie celular adecuados es un método fiable para aislar subpoblaciones de células madre cancerosas muy enriquecidas (por ejemplo, > 99.5% de pureza) debido, al menos en parte, a su capacidad para diferenciar entre células individuales y grupos de células (es decir, dobletes, etc.). Utilizando estas técnicas se ha demostrado que, cuando se trasplantan números reducidos de células TProg muy purificadas en ratones inmunodeprimidos , estas pueden estimular el crecimiento tumoral en el trasplante primario. Sin embargo, a diferencia de las subpoblaciones de TPC purificadas, los tumores generados por TProg no reflejan por completo el tumor parental en lo que respecta a su heterogeneidad celular fenotípica y se puede demostrar que no son eficaces para reiniciar la tumorigénesis en serie en trasplantes subsecuentes. En cambio, las subpoblaciones de TPC reconstituyen por completo la heterogeneidad celular de los tumores parentales y pueden iniciar tumores de forma eficaz cuando se aislan y trasplantan en serie. Por lo tanto, los expertos en la técnica reconocerán que una diferencia definitiva entre TPC y TProg, aunque ambos tipos de células puedan generar tumores en trasplantes primarios, es la capacidad única de TPC para estimular de forma perpetua un crecimiento tumoral heterogéneo tras un trasplante en serie con números recudidos de células . Otras estrategias habituales para caracterizar TPC incluyen la morfología y el examen de marcadores de la superficie celular, el perfil transcripcional y la respuesta a fármacos, a pesar de que la expresión de los marcadores puede variar dependiendo de las condiciones de cultivo y el pase de la línea celular in vitro.

Por consiguiente, a los efectos de la presente invención, las células perpetuantes de tumores, al igual que las células madre normales que respaldan las jerarquías celulares en los tejidos normales, están definidas preferentemente por su capacidad para autorrenovarse indefinidamente a la vez que mantienen la capacidad para la diferenciación de múltiples linajes. Así pues, las células perpetuantes de tumores son capaces de generar tanto una progenie tumorigénica (es decir, células iniciadoras de tumores: TPC y TProg) como una progenie no tumorigénica (NTG) . La expresión "célula no tumorigénica" (NTG) , tal como se utiliza en la presente, se refiere a una célula tumoral que se origina a partir de células iniciadoras de tumores, pero que no es capaz de autorrenovarse o generar los linajes heterogéneos de células tumorales que constituyen un tumor.

Experimentalmente, las células NTG son incapaces de formar tumores en ratones de forma reproducible , incluso cuando se trasplantan números excesivos de células.

Como se ha indicado, TProg también se clasifican como células iniciadoras de tumores (o TIC) debido a su capacidad limitada para generar tumores en ratones. Las TProg son la progenie de TPC y normalmente son capaces de llevar a cabo un número finito de divisiones celulares que no son autorrenovadoras . Además, las células TProg se pueden dividir a su vez en células progenitoras tumorales tempranas (ETP, por sus siglas en inglés) y células progenitoras tumorales tardías (LTP, por sus siglas en inglés) , cada una de las cuales se puede distinguir por el fenotipo (por ejemplo, marcadores de la superficie celular) y capacidades diferentes para recapitular la arquitectura celular tumoral . A pesar de que estas diferencias técnicas, tanto ETP como LTP se diferencian funcionalmente de TPC en que por lo general tienen una menor capacidad para reconstituir en serie tumores cuando se trasplantan números reducidos de células y normalmente no reflejan la heterogeneidad del tumor parental. Pese a las diferencias anteriores, también se ha observado que diversas poblaciones de TProg pueden, en raras ocasiones, adquirir la capacidad de autorrenovación atribuida normalmente a las células madre y convertirse ellas mismas en TPC (o CSC) . En cualquier caso, es probable que ambos tipos de células iniciadoras de tumores estén representados en la masa tumoral típica de un único paciente y son susceptibles de ser tratadas con los moduladores como se ha descrito en la presente. Es decir, las composiciones descritas generalmente son eficaces para reducir la frecuencia o alterar la quimiosensibilidad de tales células iniciadoras de tumores positivas para SEZ6 independientemente de la modalidad particular o mezcla representada en un tumor.

En el contexto de la presente invención, las TPC son más tumorigénicas, relativamente más quiescentes y a menudo más quimiorresistentes que las células TProg (tanto ETP como LPT) , NTG y las células no derivadas de TPC que se infiltran en los tumores (por ejemplo, fibroblastos/estroma, células endoteliales y hematopoyéticas) que constituyen el grueso de un tumor. Dado que las terapias y los regímenes convencionales han sido diseñados, en gran parte, para reducir el volumen tumoral y atacar rápidamente a las células proliferantes, es probable que las TPC sean más resistentes a las terapias y los regímenes convencionales que las TProg que proliferan más rápido y otras poblaciones de células constitutivas del tumor. Además, las TPC suelen expresar otras características que las hacen relativamente quimiorresistentes a las terapias convencionales, tales como una mayor expresión de transportadores resistentes a múltiples fármacos, unos mecanismos de reparación de ADN mejorados y proteínas antiapoptóticas . Estas propiedades, cada una de las cuales contribuye a la tolerancia a fármacos de TPC, constituyen una razón clave por la que los regímenes de tratamiento oncológico estándar fracasan a la hora de garantizar el beneficio a largo plazo para la mayoría de los pacientes con una neoplasia en estado avanzado; es decir, no consiguen atacar y erradicar de forma adecuada las células que estimulan el crecimiento tumoral continuado y la recidiva (es decir, TPC o CSC) .

A diferencia de muchos tratamientos de la técnica anterior, las composiciones novedosas de la presente invención reducen preferentemente la frecuencia de las células iniciadoras de tumores al administrarlas a un sujeto, independientemente de la forma o diana específica (por ejemplo, material genético, anticuerpo de SEZ6 o constructo de fusión del ligando) del modulador seleccionado. Como se ha indicado anteriormente, la reducción de la frecuencia de células iniciadoras de tumores puede ser el resultado de a) la eliminación, el agotamiento, la sensibilización, el silenciamiento o la inhibición de células iniciadoras de tumores; b) el control del crecimiento, la expansión o la recidiva de células iniciadoras de tumores; c) la interrupción de la iniciación, la propagación, el mantenimiento o la proliferación de células iniciadoras de tumores; o d) la alteración de cualquier otro modo de la supervivencia, la regeneración y/o la metástasis de las células tumorigénicas . En algunas modalidades, la reducción en la frecuencia de las células iniciadoras de tumores se produce como resultado de un cambio en una o más vías fisiológicas. El cambio en la vía, ya sea por reducción o eliminación de las células iniciadoras de tumores o por modificación de su potencial (por ejemplo, diferenciación inducida, disrupción del nicho) o por otro tipo de interferencia en su capacidad para afectar al entorno tumoral u otras células, a su vez permite un tratamiento más efectivo de trastornos asociados con SEZ6 al inhibir la tumorigénesis, el mantenimiento y/o la metástasis y la recidiva del tumor.

Entre los métodos reconocidos en la técnica que se pueden utilizar para evaluar esta reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores se encuentra el análisis de dilución limitante, ya sea in vitro o in vivo, preferentemente seguido de la enumeración utilizando el modelo estadístico de la distribución de Poisson o evaluando la frecuencia de eventos definitivos predefinidos tales como la capacidad para generar o no tumores in vivo. Aunque el análisis de dilución limitante comprende métodos preferidos para calcular la reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores, también se pueden utilizar otros métodos, menos complicados, para determinar de forma eficaz los valores deseados, aunque con una exactitud ligeramente menor, y son totalmente compatibles con los principios de la presente. Por lo tanto, como podrán apreciar los expertos en la técnica, también es posible determinar la reducción de los valores de frecuencia utilizando métodos inmunohistoquímicos o de citometría de flujo conocidos. En lo que respecta a todos los métodos mencionados anteriormente, remítase, por ejemplo, a Dylla et al. 2008, PMID: 18560594 y Hoey et al. 2009, PMID: 19664991; cada uno de los cuales se incorpora a la presente en su totalidad por referencia, en particular, para los métodos descritos.

En lo que respecta al análisis de dilución limitante, la enumeración in vitro de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores se puede conseguir depositando células tumorales humanas fraccionadas o no fraccionadas (por ejemplo, de tumores tratados y no tratados, respectivamente) en condiciones de cultivo in vitro que favorezcan la formación de colonias. De este modo, las células formadoras de colonias se pueden enumerar mediante un simple conteo y caracterización de las colonias o mediante un análisis que consiste en, por ejemplo, depositar células tumorales humanas en placas en diluciones en serie y otorgar a cada pocilio un puntaje positivo o negativo para la formación de colonias al menos 10 días después de la deposición en las placas. Los experimentos o análisis de dilución limitante in vivo, que por lo general son más exactos en lo que respecta a su capacidad para determinar la frecuencia de las células iniciadoras de tumores, incluyen trasplantar células tumorales humanas, ya sean de poblaciones de control sin tratar o tratadas, por ejemplo, en ratones inmunodeprimidos en diluciones en serie y posteriormente otorgar a cada ratón un puntaje positivo o negativo para la formación de tumores al menos 60 días después del trasplante. La derivación de los valores de la frecuencia celular mediante el análisis de dilución limitante in vitro o in vivo se realiza preferentemente aplicando el modelo estadístico de la distribución de Poisson a la frecuencia conocida de eventos positivos y negativos, para proporcionar de este modo una frecuencia para los eventos que se ajustan a la definición de un evento positivo; en este caso, la formación de colonias o tumores, respectivamente.

En lo que respecta a otros métodos compatibles con la presente invención que se pueden utilizar para calcular la frecuencia de las células iniciadoras de tumores, los más comunes comprenden técnicas de citometría de flujo y procedimientos de tinción inmunohistoquímica cuantificables . Aunque no son tan precisos como las técnicas de análisis de dilución limitante descritas justo antes, estos procedimientos son mucho menos laboriosos y proporcionan valores razonables en un plazo relativamente corto. Por lo tanto, se apreciará que un experto podrá utilizar una determinación del perfil de marcadores de la superficie celular por citometría de flujo empleando uno o más anticuerpos o reactivos que se unen a proteínas de la superficie celular reconocidas en la técnica en las cuales se sabe que las células iniciadoras de tumores están enriquecidas (por ejemplo, marcadores potencialmente compatibles como los que se exponen en la solicitud de PCT 2012/031280 que se incorpora a la presente en su totalidad) y de este modo se miden los niveles de TIC de varias muestras. En otro método compatible adicional, un experto en la técnica podrá enumerar la frecuencia de TIC in situ (por ejemplo, en una sección de tejido) por inmunohistoquímica utilizando uno o más anticuerpos o reactivos que son capaces de unirse a proteínas de la superficie celular que se cree que demarcan estas células.

Los expertos en la técnica reconocerán que se han asociado numerosos marcadores (o su ausencia) con diversas poblaciones de células madre cancerosas y estos se han utilizado para aislar o caracterizar subpoblaciones de células tumorales. A este respecto, los marcadores de células madre cancerosas ilustrativos comprenden 0CT4 , Nanog, STAT3 , EPCAM, CD24, CD34, NB84 , TrkA, GD2 , CD133, CD20, CD56, CD29, B7H3, CD46, el receptor de transíerrina , JAM3 , carboxipeptidasa M, ADAM9, oncostatina M, Lgr5, Lgr6 , CD324, CD325, nestina, Soxl, Bmi-1, eed, easyhl, easyh2 , mf2, yyl, smarcA3, smarckA5, smarcD3, smarcEl, mllt3, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4 , FZD6, FZD7 , FZD8 , FZD9 , FZD10, WNT2 , W T2B, WNT3 , NT5A, NT10B, WNT16 , AXIN1, BCL9, MYC, (TCF4) SLC7A8 , IL1RAP, TEM8 , TMPRSS , MUC16 , GPRC5B, SLC6A1 , SLC4A11, PPAP2C, CAVI, CAV2 , PTPN3 , EPHA1, EPHA2 , SLC1A1 , CX3CL1, ADORA2A, MPZLl, FLJ10052, C4.4A, EDG3 , RARRES1 , TMEPAI, PTS, CEACAM6, NID2, STEAP, ABCA3 , CRIM1, IL1R1, OPN3 , DAF, MUC1, MCP, CPD, NMA, ADAM9, GJA1 , SLC19A2 , ABCA1 , PCDH7 , ADCY9 , SLC39A1, NPC1, ENPP1, N33, GP MB, LY6E, CELSR1 , LRP3 , C20orf52, TMEPAI , FLVCR, PCDHA10, GPR54 , TGFBR3 , SEMA4B, PCDHB2 , ABCG2, CD166, AFP , BMP-4, ß-catenina, CD2 , CD3, CD9 , CD14, CD31, CD38, CD44, CD45, CD74 , CD90, CXCR4 , decorina, EGFR, CD105, CD64, CD16, CD16a, CD16b, GLI1, GLI2, CD49b y CD49f. Remítase, por ejemplo, a Schulenburg et al., 2010, PMID: 20185329, la patente de EE. UU. No. 7.632.678 y las patentes de EE . UU. Nos. 2007/0292414, 2008/0175870, 2010/0275280, 2010/0162416 y 2011/0020221, cada uno de los cuales se incorpora a la presente por referencia. Se apreciará además que cada uno de los marcadores mencionados anteriormente también se puede utilizar como antígeno diana secundario en el contexto de los anticuerpos biespecíficos o multiespecífieos de la presente invención.

De forma análoga, los ejemplos no limitantes de fenotipos de la superficie celular asociados con células madre cancerosas de ciertos tipos de tumores incluyen CD 4hlCD24low, ALDH+, CD133+, CD123+, CD34+CD38~, CD44+CD24~, CD46hiCD324+CD66c~, CD133+CD34+CD10~CD19~, CD138~CD34~CD19+, CD133+RC2+, CD44+a2 ß????133+, CD44+CD24+ESA+, CD271+, ABCB5+, así como también otros fenotipos de la superficie de células madre cancerosas conocidos en la técnica. Remítase, por ejemplo, a Schulenburg et al., 2010, mencionado anteriormente, Visvader et al., 2008, PMID: 18784658 y la patente de EE . UU. No. 2008/0138313, cada uno de los cuales se incorpora a la presente por referencia en su totalidad. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden utilizar fenotipos marcadores, como los que se han mencionado como ejemplos justo antes, junto con un análisis por citometría de flujo y técnicas de clasificación de células estándar para caracterizar, aislar, purificar o enriquecer células TIC y/o TPC o poblaciones de células para su análisis posterior. Tiene interés para la presente invención el hecho de que CD46, CD324 y opcionalmente CD66c se expresen en niveles altos o de forma heterogénea en la superficie de muchas células tumorales humanas de cáncer colorrectal ("CR"), de mama ( "BR" del inglés breast) , de pulmón no microcítico (NSCLC) , de pulmón microcítico (SCLC) , pancreático ("PA"), melanoma ("Mel"), de ovario ( "OV" ) , y de cabeza y cuello ( "HN" del inglés head and neck) , independientemente de que las muestras tumorales que se analicen sean muestras del tumor primario del paciente o de tumores NTX derivados del paciente.

Utilizando cualquiera de los métodos a los que se ha hecho referencia anteriormente y marcadores seleccionados como los que se conocen en la técnica, es posible cuantificar la reducción de la frecuencia de TIC (o las TPC en la muestra) proporcionada por los moduladores de SEZ6 descritos (incluidos aquellos conjugados con agentes citotóxicos) de acuerdo con los principios de la presente. En algunos casos, los compuestos de la presente invención pueden reducir la frecuencia de TIC o TPC (mediante diversos mecanismos indicados anteriormente, que incluyen la eliminación, la diferenciación inducida, la disrupción del nicho, el silenciamiento, etc.) un 10%, 15%, 20%, 25%, 30% o incluso un 35%. En otras modalidades, la reducción de la frecuencia de TIC o TPC puede ser del orden de un 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65%. En ciertas modalidades, los compuestos descritos pueden reducir la frecuencia de TIC o TPC un 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o incluso un 95%. Obviamente, se apreciará que cualquier reducción de la frecuencia de TIC o TPC probablemente provocará una reducción correspondiente en la tumorigenicidad, persistencia, recidiva y agresividad de la neoplasia .

IV. Moduladores de SEZ6 En cualquier caso, la presente invención se refiere al uso de moduladores de SEZ6, incluidos los antagonistas de SEZ6, para el diagnóstico, el teragnóstico, el tratamiento y/o la profilaxis de diversos trastornos que incluyen cualquiera de las diferentes neoplasias malignas asociadas con SEZ6. Los moduladores descritos se pueden utilizar solos o junto con una amplia variedad de compuestos anticancerosos tales como agentes quimioterapéuticos o inmunoterapéuticos (por ejemplo, anticuerpos terapéuticos) o modificadores de la respuesta biológica. En otras modalidades seleccionadas, se pueden utilizar dos o más moduladores de SEZ6 discretos combinados para proporcionar efectos antineoplásicos mejorados o se pueden utilizar para fabricar constructos multiespecíficos .

En ciertas modalidades, los moduladores de SEZ6 de la presente invención comprenderán nucleótidos, oligonucleótidos , polinucleótidos , péptidos o polipéptidos . Más particularmente, los moduladores ilustrativos de la invención pueden comprender anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno o derivados de estos, proteínas, péptidos, glicoproteínas , glicopéptidos , glicolípidos , polisacáridos , oligosacáridos , ácidos nucleicos, constructos complementarios, AR ip, miAR , moléculas bioorgánicas , peptidomiméticos , agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control de la transcripción y la traducción, y similares. En ciertas modalidades, los moduladores comprenderán SEZ6 soluble (sSEZ6) o una forma, variante, derivado o fragmento de este, incluidos, por ejemplo, los constructos de fusión de SEZ6 (por ejemplo, SEZ6-Fe , restos de direccionamiento a SEZ6, etc.) o conjugados de SEZ6 (por ejemplo, SEZ6-PEG, SEZ6-agente citotóxico, SEZ6-BRM, etc.). También se apreciará que, en otras modalidades, los moduladores de SEZ6 comprenden anticuerpos o fragmentos inmunorreactivos o derivados de estos. En modalidades particularmente preferidas, los moduladores de la presente invención comprenderán anticuerpos neutralizantes, o derivados o fragmentos de estos. En otras modalidades, los moduladores de SEZ6 pueden comprender anticuerpos internalizantes o fragmentos de estos. En otras modalidades adicionales, los moduladores de SEZ6 pueden comprender anticuerpos supresores o fragmentos de estos. Además, al igual que sucede con los constructos de fusión mencionados anteriormente, estos moduladores de tipo anticuerpo pueden estar conjugados, unidos o asociados de otro modo con agentes citotóxicos, polímeros o modificadores de la respuesta biológica (BRM, por sus siglas en inglés) seleccionados o similares para proporcionar inmunoterapias dirigidas con diversos (y opcionalmente múltiples) mecanismos de acción. Tal como se ha indicado anteriormente, tales anticuerpos pueden ser anticuerpos de pan-SEZ6 y asociarse con dos o más miembros de la familia SEZ6 (por ejemplo, SEZ6 y SEZ6L según se muestra en la FIG. 11A) o pueden ser anticuerpos inmunoespecífieos que reaccionen selectivamente con una o ambas isoformas de SEZ6. En otras modalidades más, los moduladores pueden operar a nivel genético y pueden comprender compuestos como constructos complementarios, AR ip, miAR y similares que interaccionen o se asocien con el componente genotípico de un determinante de SEZ6.

Se apreciará además que los moduladores de SEZ6 descritos pueden agotar, silenciar, neutralizar, eliminar o inhibir el crecimiento, la propagación o la supervivencia de células tumorales, incluidas las TPC, y/o neoplasias asociadas a través de varios mecanismos, que incluyen la agonización o antagonización de vías seleccionadas o la eliminación de células específicas dependiendo, por ejemplo, de la forma del modulador de SEZ6, cualquier carga útil o dosis asociada y el método de suministro. Por lo tanto, aunque las modalidades preferidas descritas en la presente se refieren al agotamiento, la inhibición o el silenciamiento de subpoblaciones de células tumorales específicas, tales como células perpetuantes de tumores, o a moduladores que interaccionan con un epítopo o dominio específico, se debe hacer hincapié en que tales modalidades son meramente ilustrativas y no son limitantes en ningún sentido. En cambio, tal como se expone en las reivindicaciones adjuntas, la presente invención se refiere en un sentido amplio a moduladores de SEZ6 y a su uso en el tratamiento, el control o la profilaxis de diversos trastornos asociados con SEZ6, independientemente de cuál sea el mecanismo, la región de unión o la población de células tumorales diana en particular.

Independientemente de la forma del modulador seleccionado, se apreciará que el compuesto elegido puede ser de naturaleza antagonista. El término "antagonista", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir con las actividades de una diana particular o especificada (por ejemplo, SEZ6) , incluida la unión de receptores a ligandos o las interacciones de enzimas con sustratos. A este respecto, se apreciará que los antagonistas de SEZ6 de la presente invención pueden comprender cualquier ligando, polipéptido, péptido, proteína de fusión, anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo o derivado de este que reconozca, reaccione, se una, se combine, compita, se asocie o interaccione de cualquier otro modo con la proteína SEZ6 o un fragmento de esta, y elimine, silencie, reduzca, inhiba, impida, restrinja o controle el crecimiento de células iniciadoras de tumores u otras células neoplásicas incluidas las células constitutivas del tumor o NTG. Los antagonistas compatibles pueden incluir además inhibidores de bajo peso molecular, aptámeros, constructos complementarios, ARNip, miARN y similares, moléculas de ligando o receptor y sus derivados que reconozcan o se asocien con un determinante genotípico o fenotípico de SEZ6 para alterar de este modo sus patrones de expresión o privarle de su unión o interacción con un sustrato, receptor o ligando.

El término "antagonista", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir con las actividades de una proteína particular o especificada, incluida la unión de receptores a ligandos o las interacciones de enzimas con sustratos. De un modo más general, los antagonistas de la invención pueden comprender anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno o derivados de estos, proteínas, péptidos, glicoproteínas , glicopéptidos , glicolípidos, polisacáridos , oligosacáridos , ácidos nucleicos, constructos complementarios, ARNip, miARN, moléculas bioorgánicas , peptidomiméticos , agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control de la transcripción y la traducción, y similares. Los antagonistas también pueden incluir inhibidores de bajo peso molecular, proteínas de fusión, moléculas receptoras y derivados que se unan específicamente a la proteína de modo que la priven de su unión a su sustrato diana, variantes antagonistas de la proteína, moléculas complementarias dirigidas a la proteína, aptámeros de ARN y ribozimas contra la proteína.

Se sobreentenderá que las expresiones "reconoce" o "se asocia", tal como se utilizan en la presente y se aplican a dos o más moléculas o compuestos, se refieren a la reacción, enlace, unión específica, combinación, interacción, conexión, ligadura, unificación, coalescencia, fusión o unión, de forma covalente o no covalente, de las moléculas, de modo que una molécula ejerce un efecto sobre la otra molécula.

Además, tal como se demuestra en los ejemplos de la presente (por ejemplo, remítase a la FIG. 11) , algunos moduladores de SEZ6 humano pueden, en ciertos casos, presentar reactividad cruzada con SEZ6 de una especie que no sea humana (por ejemplo, de rata o mono cinomólogo) . En otros casos, los moduladores ilustrativos pueden ser específicos para una o más isoformas de SEZ6 humano y no presentarán reactividad cruzada con ortólogos de SEZ6 de otras especies. Obviamente, estas modalidades, junto con los principios de la presente, pueden comprender anticuerpos de pan-SEZ6 que se asocien con dos o más miembros de la familia SEZ6 de una única especie o anticuerpos que se asocien exclusivamente con SEZ6.

En cualquier caso y como se discutirá con más detalle posteriormente, los expertos en la técnica apreciarán que los moduladores descritos se pueden utilizar en una forma conjugada o no conjugada. Es decir, el modulador puede estar asociado o conjugado (por ejemplo, de forma covalente o no covalente) con compuestos farmacéuticamente activos, modificadores de la respuesta biológica, agentes anticancerosos, agentes citotóxicos o citostáticos, restos de diagnóstico o modificadores biocompatibles . A este respecto, se sobreentenderá que tales conjugados pueden comprender péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, moléculas de bajo peso molecular, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas y radioisótopos. Además, como se ha indicado en la presente, el conjugado seleccionado puede estar unido de forma covalente o no covalente con el modulador de SEZ6 en diversas proporciones molares dependiendo, al menos en parte, del método empleado para conseguir la conjugación.

V. Fabricación y suministro de moduladores A. Moduladores de tipo anticuerpo 1. Introducción Como se ha indicado anteriormente, las modalidades particularmente preferidas de la presente invención comprenden moduladores de SEZ6 en forma de anticuerpos que se asocian preferentemente con una o más isoformas de SEZ6 (y, opcionalmente , pueden reaccionar de forma cruzada con otros miembros de la familia SEZ6) . Los expertos en la técnica apreciarán la base de conocimientos debidamente desarrollada sobre anticuerpos tal como la expuesta, por ejemplo, en Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6.a ed. , W.B. Saunders Company (2010) o Murphey et al., Janeway's Immunobiology, 8.a ed., Garland Science (2011), cada uno de los cuales se incorpora a la presente en su totalidad por referencia .

Se pretende que el término "anticuerpo" abarque anticuerpos policlonales , anticuerpos multiclonales , anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y primatizados , anticuerpos humanos, anticuerpos producidos recombinantemente, intracuerpos , anticuerpos multiespecíficos , anticuerpos biespecífieos, anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos antiidiotípicos, anticuerpos sintéticos, incluidas las muteínas y sus variantes; fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), FvFc monocatenarios, Fv monocatenarios; y derivados de estos, incluidas las fusiones de Fe y otras modif caciones, y cualquier otra molécula inmunológicamente activa, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (es decir, asociación o unión al antígeno) . Asimismo, el término comprende además todas las clases de anticuerpos (es decir, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) y todos los isótopos (es decir, IgGl, IgG2 , IgG3, IgG4 , IgAl e IgA2), así como también sus variaciones a menos que el contexto dicte lo contrario. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se indican con la letra griega minúscula OÍ, d, e, ? y µ correspondiente, respectivamente. Las cadenas ligeras de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente diferentes, denominados kappa (?) y lambda (?) , en función de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Aunque los anticuerpos de este tipo estén contemplados por el alcance de la presente invención, en la presente se discutirán en cierto detalle modalidades preferidas que comprenden la clase de inmunoglobulina IgG únicamente a efectos ilustrativos. Se sobreentenderá que, sin embargo, la exposición tiene carácter meramente demostrativo de composiciones y métodos para llevar a la práctica la presente invención que son ilustrativos, y no limita de ningún modo el alcance de la invención o las reivindicaciones que se adjuntan a la presente.

Como se sabe con certeza, los dominios variables de ambas porciones de las cadenas ligera (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad antigénicos, y los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren y regulan propiedades biológicas importantes tales como la secreción, la movilidad transplacentaria, la semivida en circulación, la unión al complemento y propiedades similares.

La región "variable" incluye sitios hipervariables que se manifiestan en tres segmentos denominados habitualmente regiones determinantes de la complementariedad (CDR) , tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables que flanquean las CDR se denominan regiones de entramado (FR) . Por ejemplo, en los anticuerpos de tipo inmunoglobulina G (IgG) monoméricos naturales, las seis CDR presentes en cada brazo de "Y" son secuencias cortas de aminoácidos no contiguas que están situadas específicamente para formar el sitio de unión al antígeno cuando el anticuerpo adopta su configuración tridimensional en un entorno acuoso. Así pues, cada anticuerpo IgG natural comprende dos sitios de unión idénticos próximos al extremo amino de cada brazo de Y.

Se apreciará que un experto en la técnica podrá identificar fácilmente la posición de las CDR utilizando técnicas estándar. Los expertos en la técnica también estarán familiarizados con el sistema de numeración que se describe en Kabat et al. (1991, Publicación del NIH 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.). A este respecto, Kabat et al. definieron un sistema de numeración para secuencias de dominios variables que se puede aplicar a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin recurrir a ningún dato experimental aparte de la propia secuencia. A menos que se especifique lo contrario, las referencias a la numeración de posiciones de residuos aminoacídicos específicas en un anticuerpo se ajustan al sistema de numeración de Kabat .

Por consiguiente, según Kabat, en la VH, los residuos 31-35 constituyen CDR1, los residuos 50-65 constituyen CDR2 y 95-102 constituyen CDR3 , mientras que en VL, los residuos 24-34 son CDR1, 50-56 constituyen CDR2 y 89-97 constituyen CDR3. A modo de contexto, en una VH, FRl corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 1-30; FR2 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 36-49; FR3 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 66-94 y FR4 corresponde al dominio de la región variable desde el aminoácido 103 hasta el final de la región variable. Las FR para la cadena ligera están separadas de forma similar por cada una de las CDR de la región variable de la cadena ligera.

Cabe destacar que las CRD varían considerablemente de un anticuerpo a otro (y por definición no exhibirán homología con las secuencias consenso de Kabat) . Además, la identidad de ciertos residuos individuales en cualquier número de sitio de Kabat puede variar de una cadena de anticuerpo a otra debido a la divergencia alélica o entre especies. En Chothia et al., J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987) y MacCallum et al., J". Mol . Biol. 262:732-745 (1996) , se expone una numeración alternativa, aunque, al igual que en Kabat, los límites de las FR están separados por los extremos CDR respectivos tal como se ha descrito anteriormente. Remítase también a Chothia et al., Nature 342, págs. 877-883 (1989) y S. Dubel, ed. , Handbook of Therapeutic Antibodies, 3.a ed. , ILEY-VCH Verlag GmbH and Co . (2007), donde las definiciones incluyen la superposición o subconjuntos de residuos aminoacídicos cuando se comparan entre sí. Cada una de las referencias mencionadas anteriormente se incorpora a la presente en su totalidad por referencia, y los residuos aminoacídicos que constituyen las regiones de unión o CDR según se definen en cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen a efectos comparativos a continuación.

Definiciones de CDR 1La numeración de los residuos se ajusta a la nomenclatura de Kabat et al., mencionada anteriormente 2La numeración de los residuos se ajusta a la nomenclatura de Chothia et al., mencionada anteriormente 3La numeración de los residuos se ajusta a la nomenclatura de acCallum et al., mencionada anteriormente En el contexto de la presente invención, se apreciará que cualquiera de las CDR de las cadenas pesada y ligera descritas derivadas de las secuencias de aminoácidos de la región variable murina expuestas en la FIG. 10A o la FIG. 10B se puede combinar o reorganizar para proporcionar anticuerpos anti-SEZ6 (por ejemplo, anti-hSEZ6 humanizados, con injertos de CDR o quiméricos) optimizados de acuerdo con los principios de la presente. Es decir, una o más de las CDR derivadas de las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera expuestas en la FIG. 10A (SEQ ID NOS: 20-168, números pares) o las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada expuestas en la FIG. 10B (SEQ ID NOS: 21-169, números impares) se pueden incorporar en un modulador de SEZ6 y, en modalidades particularmente preferidas, en un anticuerpo con injertos de CDR o humanizado que se asocia inmunoespecíficamente con una o más isoformas de SEZ6. También se exponen ejemplos de secuencias de aminoácidos de la región variable de las cadenas ligera (SEQ ID NOS: 170-192, números pares) y pesada (SEQ ID NOS: 171-193, números impares y 194-199) de tales moduladores humanizados en las FIGS. 10A y 10B.

Cabe destacar que hSC17.200vLl (SEQ ID NO: 192) es una variante del constructo de la cadena ligera humanizado hSC17.200 (SEQ ID NO: 190), hSC17.155vHl-vH6 (SEQ ID NOS: 193-198) son variantes del constructo de la cadena pesada hSC.155 (SEQ ID NO: 184) que deriva de SC17.90 (SEQ ID NO: 127) y que hSC161vHl (SEQ ID NO: 199) es una variante del constructo de la cadena pesada hSC17.161 (SEQ ID NO: 189). Como se expondrá con más detalle posteriormente, estas variantes se construyeron y evaluaron para optimizar una o más propiedades bioquímicas del anticuerpo original .

Estas secuencias de aminoácidos novedosas consideradas conjuntamente representan setenta y cinco moduladores murinos y once humanizados ilustrativos (junto con las variantes descritas) de acuerdo con la presente invención. Además, las secuencias de ácido nucleico correspondientes de cada uno de los setenta y cinco moduladores murinos y los once moduladores humanizados ilustrativos y sus variantes expuestos en las FIGS. 10A y 10B se incluyen en el listado de secuencias de la presente solicitud (SEQ ID NOS: 220-399) .

En las FIGS. 10A y 10B, las CDR anotadas se definen utilizando la numeración de Chothia. Sin embargo, tal como se ha indicado en la presente y se demuestra más adelante en el Ejemplo 8, un experto en la técnica podría definir, identificar, derivar y/o enumerar fácilmente las CDR como se define en Kabat et al., Chothia et al. o MacCallum et al. para cada secuencia respectiva de las cadenas ligera y pesada expuesta en la FIG. 10A o la FIG. 10B. Por consiguiente, cada una de las CDR en cuestión y los anticuerpos que comprenden las CDR definidas mediante todas estas nomenclaturas se incluyen expresamente dentro del alcance de la presente invención. En un sentido más amplio, la expresión "residuo aminoacídico de CDR de la región variable" o simplemente "CDR" incluye los aminoácidos de una CDR identificados utilizando cualquier método de base estructural o secuencial como los expuestos anteriormente . 2. Generación de moduladores de tipo anticuerpo a . Anticuerpos policlonales La producción de anticuerpos policlonales en diversos animales huésped, incluidos conejos, ratones, ratas, etc., es muy conocida en la técnica. En algunas modalidades, se obtiene suero que contiene anticuerpos anti-SEZ6 policlonales desangrando o sacrificando al animal. El suero se puede utilizar con fines de investigación en la forma obtenida del animal o, como alternativa, los anticuerpos anti-SEZ6 se pueden purificar parcial o completamente para proporcionar fracciones de i munoglobulina o preparados de anticuerpo homogéneos .

Resumiendo, el animal seleccionado se inmuniza con un inmunógeno de SEZ6 (por ejemplo, SEZ6 soluble o sSEZ6) que puede comprender, por ejemplo, isoformas, dominios y/o péptidos seleccionados, o células vivas o preparados celulares que expresan SEZ6 o fragmentos inmunorreactivos de este. Los adyuvantes conocidos en la técnica que se pueden utilizar para incrementar la respuesta inmunitaria, dependiendo de la especie inoculada, incluyen, sin carácter limitante, Freund (completo e incompleto) , geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Tales adyuvantes pueden proteger al antígeno contra la dispersión rápida al secuestrarlo en una reserva local, o pueden contener sustancias que estimulan al huésped para que secrete factores que son quimiotácticos para los macrófagos y otros componentes del sistema inmunitario. Preferentemente, el programa de inmunización incluirá dos o más administraciones del inmunógeno seleccionado repartidas a lo largo de un periodo predeterminado.

La secuencia de aminoácidos de una proteína SEZ6 como la que se muestra en las FIGS . 1C o ID se puede analizar con el fin de seleccionar regiones específicas de la proteína SEZ6 para generar anticuerpos. Por ejemplo, se utilizan análisis de la hidrofobicidad e hidrofilicidad de una secuencia de aminoácidos de SEZ6 para identificar regiones hidrófilas en la estructura de SEZ6. Se pueden identificar fácilmente regiones de una proteína SEZ6 que presenten una estructura inmunogénica, así como también otras regiones y dominios, utilizando otros métodos diferentes conocidos en la técnica, tales como el análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf . Se pueden generar perfiles de flexibilidad media utilizando el método de Bhaskaran R. , Ponnuswamy P. K. , 1988, Int. J. Pept . Protein Res. 32:242-255. Se pueden generar perfiles de giro beta utilizando el método de Deleage, G. , Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294. Así pues, cada región, dominio o motivo de SEZ6 identificado mediante cualquiera de estos programas o métodos queda contemplado por el alance de la presente invención y se puede aislar o modificar para proporcionar inmunógenos que originen moduladores que comprendan las propiedades deseadas. Los métodos preferidos para generar anticuerpos de SEZ6 se ilustran adicionalmente mediante los Ejemplos que se proporcionan en la presente. Los métodos para preparar una proteína o polipéptido para su uso como un inmunógeno son muy conocidos en la técnica. También se conocen en la técnica métodos para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un portador tal como BSA, KLH u otra proteína portadora. En algunas circunstancias, se utiliza una conjugación directa en la que se emplean, por ejemplo, reactivos carbodiimídicos ; en otros casos, los reactivos conectores son efectivos. La administración de un inmunógeno de SEZ6 se lleva a cabo normalmente por inyección durante un periodo adecuado y utilizando un adyuvante adecuado, como consta en la técnica. Durante el programa de inmunización, se pueden obtener titulaciones de anticuerpos, como se describe más adelante en los Ejemplos, para determinar la idoneidad de la formación de anticuerpos, b . Anticuerpos monoclonales Además, la invención contempla el uso de anticuerpos monoclonales. La expresión "anticuerpo monoclonal" (o mAb) , tal como se conoce en la técnica, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por posibles mutaciones (por ejemplo, mutaciones naturales) que puedan estar presentes en cantidades minoritarias. En ciertas modalidades, un anticuerpo monoclonal de este tipo incluye un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une o asocia con un antígeno, donde la secuencia polipeptídica de unión al antígeno se ha obtenido mediante un proceso que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica de unión a la diana entre una pluralidad de secuencias polipeptídicas .

De un modo más general y como se ejemplifica en el Ejemplo 6 de la presente, se pueden preparar anticuerpos monoclonales utilizando una gran variedad de técnicas conocidas en la materia, que incluyen técnicas recombinantes, hibridomas, tecnologías de presentación en fago, animales transgénicos (por ejemplo, un XenoMouse*) o alguna combinación de estas. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos monoclonales utilizando hibridomas, y técnicas bioquímicas y de ingeniería genética reconocidas en la técnica, como las que se describen más detalladamente en An, Zhigiang (ed. ) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley and Sons, 1.a ed. 2009; Shire et al. (eds.) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science + Business Media LLC, 1.a ed. 2010; Harlow et al., AntiJbodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988; Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), cada uno de los cuales se incorpora a la presente por referencia en su totalidad. Se sobreentenderá que una secuencia de unión seleccionada se puede alterar aún más, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a la diana, para mejorar su producción en cultivos celulares, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprenda la secuencia de unión a la diana alterada también es un anticuerpo de la presente invención, c . Anticuerpos quiméricos En otra modalidad, el anticuerpo de la invención puede comprender anticuerpos quiméricos derivados de segmentos proteicos unidos covalentemente procedentes de al menos dos especies o tipos de anticuerpos diferentes. El término anticuerpos "quiméricos", tal como se conoce en la técnica, se refiere a constructos en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es (son) idéntica (s) u homologa (s) a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como también fragmentos de tales anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente de EE . UU. No. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) ) .

En una modalidad, un anticuerpo quimérico de acuerdo con los principios de la presente puede comprender secuencias de aminoácidos de VH y VL murinas, y regiones constantes derivadas de fuentes humanas. En otras modalidades compatibles, un anticuerpo quimérico de la presente invención puede comprender un anticuerpo humanizado como los que se describen a continuación. En otra modalidad, el anticuerpo denominado "anticuerpo con injertos de CDR" comprende una o más CDR de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) del anticuerpo es (son) idéntica (s) u homologa (s) a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos. Para el uso en seres humanos, se pueden injertar CDR de roedor seleccionadas en un anticuerpo humano, reemplazando una o más de las regiones variables o CDR naturales del anticuerpo humano. Estos constructos generalmente presentan las ventajas de que proporcionan funciones moduladoras máximas (por ejemplo, CDC (siglas en inglés de citotoxicidad dependiente del complemento) , ADCC (siglas en inglés de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos), etc.) a la vez que reducen respuestas inmunitarias al anticuerpo no deseadas en el sujeto. d . Anticuerpos humanizados Un anticuerpo "humanizado" es similar al anticuerpo con injertos de CDR. Las formas "humanizadas", tal como se utiliza el término en la presente, de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de una o más inmunoglobulinas no humanas. En una modalidad, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor o aceptor) en la que se reemplazan residuos de una CDR del receptor por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) , tal como un ratón, rata, conejo o primate no humano, con la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En ciertas modalidades preferidas, se reemplazan residuos en una o más FR en el dominio variable de la inmunoglobulina humana por residuos no humanos correspondientes del anticuerpo donante para ayudar a mantener la configuración tridimensional adecuada de la o las CDR injertadas y de este modo mejorar la afinidad. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante para, por ejemplo, refinar aún más el comportamiento del anticuerpo.

El injerto de CDR y los anticuerpos humanizados se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. Nos. 6,180,370 y 5,693,762. El anticuerpo humanizado opcionalmente también puede comprender al menos una porción de un Fe de inmunoglobulina, normalmente el de una inmunoglobulina humana. Para consultar información más detallada, remítase, por ejemplo, a Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); y las patentes de EE . UU. Nos. 6,982,321 y 7,087,409. Otro método adicional se denomina "humaneering" el cual se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. No. 2005/0008625. Además, un anticuerpo no humano también se puede modificar por deleción específica de epítopos de linfocitos T humanos o "desinmunización" mediante los métodos descritos en WO 98/52976 y WO 00/34317. Cada una de las referencias mencionadas anteriormente se incorpora a la presente en su totalidad.

Los anticuerpos humanizados también se pueden biomodificar utilizando técnicas comunes de biología molecular, tales como el aislamiento, la manipulación y la expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican todas o parte de las regiones variables de inmunoglobulina de al menos una de entre una cadena pesada o ligera. Además de las fuentes de tal ácido nucleico indicadas anteriormente, se dispone de secuencias de la línea germinal humana como las descritas, por ejemplo, en Tomlinson, I. A. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol . Today 16:237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; y Tomlinson et al. (1995) EMBO J 14:4628-4638. El directorio de V-BASE (VBASE2 - Retter et al., Nucleic Acid Res. 33; 671-674, 2005) proporciona un catálogo exhaustivo de secuencias de la región variable de inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, I. A. et al . MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido) . También se pueden utilizar FR humanas consenso, por ejemplo, como las descritas en la patente de EE. UU. No. 6,300,064.

En modalidades seleccionadas y como se detalla más adelante en el Ejemplo 8, al menos un 60%, 65%, 70%, 75% u 80% de los residuos aminoacídicos de la región variable de las cadenas pesada o ligera de los anticuerpos humanizados corresponderá a los residuos de las secuencias de CDR y FR del receptor. En otras modalidades, al menos un 85% o 90% de los residuos de la región variable de los anticuerpos humanizados corresponderá a los residuos de las secuencias de CDR y FR del receptor. En otra modalidad preferida, más de un 95% de los residuos de la región variable de los anticuerpos humanizados corresponderá a los residuos de las secuencias de CDR y FR del receptor. e . Anticuerpos humanos En otra modalidad, los anticuerpos pueden comprender anticuerpos completamente humanos. La expresión "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado utilizando cualquiera de las técnicas de producción de anticuerpos humanos.

Los anticuerpos humanos se pueden producir utilizando diversas técnicas conocidas en la materia. Una técnica es la presentación en fago, en la cual se sintetiza una colección de anticuerpos (preferentemente humanos) en fagos, se criba la colección con el antígeno de interés o una porción de unión al anticuerpo de este y se aisla el fago que se une al antígeno, a partir del cual se pueden obtener los fragmentos inmunorreactivos . Los métodos para preparar y cribar tales colecciones son muy conocidos en la técnica y los kits para generar las colecciones de presentación en fagos se pueden adquirir de proveedores comerciales (por ejemplo, el Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, No. de catálogo 27-9400-01; y el kit de presentación en fagos SurfZAP™ de Stratagene, No. de catálogo 240612) . También existen otros métodos y reactivos que se pueden utilizar para generar y cribar colecciones de presentación de anticuerpos (remítase, por ejemplo, a la patente de EE. UU. No. 5,223,409; las publicaciones de PCT Nos. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; y Barbas et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 88 : 7978-7982 (1991) ) .

En una modalidad, los anticuerpos humanos recombinantes se pueden aislar cribando una colección de anticuerpos combinatoria recombinante preparada como se ha indicado anteriormente. En una modalidad, la colección es una colección de scFv presentados en fagos, generada utilizando ADNc de VL y VH humanas preparados a partir de ARNm aislado de linfocitos B.

Los anticuerpos producidos por colecciones vírgenes (ya sean naturales o sintéticas) pueden tener una afinidad moderada (Ka de entre aproximadamente 106 y 107 NT1) , pero la maduración de la afinidad también se puede simular in vi tro por construcción y reselección a partir de colecciones secundarias como las descritas en la técnica. Por ejemplo, se puede introducir una mutación al azar in vitro utilizando la polimerasa propensa a errores (descrita en Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989) ) . Además, la maduración de la afinidad se puede llevar a cabo mutando al azar una o más CDR, por ejemplo, utilizando PCR con cebadores portadores de una secuencia aleatoria que abarque la CDR de interés, en clones de Fv individuales seleccionados y cribándolos para obtener los clones con mayor afinidad. El documento WO 9607754 describe un método para inducir la mutagénesis en una CDR de una cadena ligera de inmunoglobulina para crear una colección de genes de la cadena ligera. Otra estrategia efectiva consiste en recombinar los dominios VH o VL seleccionados mediante presentación en fagos con repertorios de variantes de dominios V naturales obtenidos a partir de donantes no inmunizados y cribarlos para obtener los de mayor afinidad en varias rondas de retransposición de las cadenas tal como se describe en Marks et al., Biotechnol . , 10: 779-783 (1992) . Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con una constante de disociación D (kasociación/kdisociación) de aproximadamente 10"9 M o inferior.

En otras modalidades, se pueden emplear procedimientos similares utilizando colecciones que comprenden células eucariotas (por ejemplo, levaduras) que expresan pares de unión en su superficie. Remítase, por ejemplo, a la patente de EE. UU. No. 7, 700, 302 y la patente de EE. UU. No. 12/404.059. En una modalidad, el anticuerpo humano se selecciona a partir de una fagoteca, donde la fagoteca expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:6157-6162 (1998). En otras modalidades, se pueden asilar pares de unión humanos a partir de colecciones de anticuerpos combinatorias generadas en células eucariotas tales como levaduras. Remítase, por ejemplo, a la patente de EE. UU. No. 7,700,302. Tales técnicas permiten convenientemente cribar un número elevado de moduladores potenciales y proporcionar una manipulación relativamente sencilla de secuencias potenciales (por ejemplo, por maduración de la afinidad o transposición recombinante) .

También se pueden producir anticuerpos humanos mediante la introducción de locus de inmunoglobulina humana en animales transgénicos , por ejemplo, ratones en los que se han desactivado parcial o completamente los genes de inmunoglobulina endógenos y se han introducido genes de inmunoglobulina humana. Al ser estimulados, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja mucho a la observada en los seres humanos en todos los aspectos, incluidos la reordenación de los genes, el ensamblaje y el repertorio de los anticuerpos. Esta estrategia se describe, por ejemplo, en las patentes de EE . UU. Nos. 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016 y las patentes de EE . UU. Nos. 6,075,181 y 6,150,584 referentes a la tecnología XenoMouse ; y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Como alternativa, el anticuerpo humano se puede preparar mediante la inmortalización de linfocitos B humanos produciendo un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (tales linfocitos B se pueden recuperar a partir de un individuo que padece un trastorno neoplásico o que puede haber sido inmunizado in vi ro) . Remítase, por ejemplo, a Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985) ; Boerner et al., J. Immunol, 147 (l):86-95 (1991); y la patente de EE. UU. No. 5.750.373. 3. Procesamiento posterior Independientemente de cómo se obtengan, las células productoras de moduladores (por ejemplo, hibridomas, colonias de levaduras, etc.) se pueden seleccionar, clonar y después cribar para obtener unas características deseables, que incluyen, por ejemplo, un crecimiento robusto, una alta producción de anticuerpos y, como se indica con más detalle posteriormente, unas características deseables para un anticuerpo. Los hibridomas se pueden expandir in vivo en animales singénicos, en animales que carecen de sistema inmunitario, por ejemplo, ratones atímicos, o en un cultivo celular in vitro. Los expertos en la técnica estarán muy familiarizados con los métodos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas y/o colonias, cada uno de los cuales produce una especie de anticuerpo discreta.

B . Producción de moduladores recombinantes 1. Introducción Una vez perfeccionada la fuente, se puede aislar y secuenciar fácilmente el ADN que codifica los moduladores de SEZ6 deseados utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos) . Las células de hibridoma aisladas y subclonadas (o colonias derivadas de levaduras o fagos) pueden servir como fuente preferida del ADN si el modulador es un anticuerpo. Si se desea, el ácido nucleico se puede manipular adicionalmente tal como se describe en la presente para crear agentes que incluyen proteínas de fusión, o anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos. Más particularmente, el ADN aislado (que puede estar modificado) se puede utilizar para clonar secuencias de regiones constantes y variables para la fabricación de anticuerpos .

Por consiguiente, en modalidades ilustrativas, se pueden producir anticuerpos recombinantemente , utilizando procedimientos convencionales (tales como los que se exponen en Al-Rubeai; An, y Shire et al. todos ellos mencionados anteriormente, y Sambrook J. y Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002)) en los cuales las células de hibridoma aisladas y subclonadas (colonias derivadas de levaduras o fagos) sirven como fuente preferida de moléculas de ácido nucleico.

Se pretende que la expresión "molécula de ácido nucleico", tal como se utiliza en la presente, incluya moléculas de ADN y moléculas de ARN y variantes artificiales de estas (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos), ya sean mono- o bicatenarias . Los ácidos nucleicos pueden codificar una o ambas cadenas de un anticuerpo de la invención, o uno de sus fragmentos o derivados. Las moléculas de ácido nucleico de la invención también incluyen suficientes polinucleótidos para su uso como sondas de hibridación, cebadores de PCR o cebadores de secuenciación con el fin de identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleótido que codifica un polipéptido; ácidos nucleicos complementarios para inhibir la expresión de un polinucleótido, así como también secuencias complementarias. Los ácidos nucleicos pueden tener cualquier longitud. Por ejemplo, pueden tener una longitud de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1500, 3000, 5000 o más nucleótidos, y/o pueden comprender una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o formar parte de un ácido nucleico más grande, por ejemplo, un vector. Se apreciará que tales secuencias de ácido nucleico se pueden manipular adicionalmente para crear moduladores que incluyen anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos. Más particularmente, las moléculas de ácido nucleico aisladas (que pueden estar modificadas) se pueden utilizar para clonar secuencias de regiones constantes y variables para la fabricación de anticuerpos tal como se describe en la patente de EE. UU. No. 7,709,611.

La expresión "ácido nucleico aislado" quiere decir que el ácido nucleico (i) se amplificó in vitro, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , (ii) se produjo de forma recombinante por clonación, (iii) se purificó, por ejemplo, por escisión y fraccionamiento electroforético en gel o (iv) se sintetizó, por ejemplo, mediante una síntesis química. Un ácido nucleico aislado es un ácido nucleico que se puede manipular mediante técnicas de ADN recombinante .

Independientemente de que la fuente del ácido nucleico que codifica la porción inmunorreactiva deseada del anticuerpo se obtenga o derive de una tecnología de presentación en fagos, colecciones de levaduras, tecnología basada en hibridomas o sintéticamente, se debe sobreentender que la presente invención abarca las moléculas de ácido nucleico y las secuencias que codifican los anticuerpos, o los fragmentos de unión al antígeno o derivados de estos. Además, la presente invención se refiere a vectores y células hospederas que comprenden tales moléculas de ácido nucleico. 2. Hibridación e identidad secuencial Tal como se ha indicado, la invención proporciona además ácidos nucleicos que se hibridan con otros ácidos nucleicos en condiciones de hibridación particulares. Más específicamente, la invención abarca moléculas de ácido nucleico que se hibridan en condiciones de hibridación de rigurosidad moderada o alta (por ejemplo, como se define más adelante) con las moléculas de ácido nucleico de la invención. Los métodos para hibridar ácidos nucleicos son muy conocidos en la técnica. Como se sabe con certeza, unas condiciones de hibridación de rigurosidad moderada comprenden una solución de prelavado que contiene 5x cloruro sódico/citrato sódico (SSC) , 0.5% de SDS, EDTA 1.0 mM (pH 8.0), amortiguador de hibridación de aproximadamente un 50% de formamida, 6xSSC y una temperatura de hibridación de 55 °C (u otras soluciones de hibridación similares, tales como una que contenga aproximadamente un 50% de formamida, con una temperatura de hibridación de 42 °C) y condiciones de lavado de 60°C, en 0.5xSSC, 0.1% de SDS. A efectos comparativos, la hibridación en condiciones de hibridación de rigurosidad alta comprenden el lavado con 6xSSC a 45°C, seguido de uno o más lavados en O.lxSSC, 0.2% de SDS a 68°C. Además, un experto en la técnica puede manipular las condiciones de hibridación y/o lavado para aumentar o reducir la rigurosidad de la hibridación, de modo que los ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que tienen una identidad de al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% entre sí normalmente se siguen hibridando entre sí.

La invención también incluye moléculas de ácido nucleico que son "sustancialmente idénticas" a las moléculas de ácido nucleico descritas. En una modalidad, la expresión "sustancialmente idéntica" con respecto a una secuencia de ácido nucleico quiere decir que se puede construir como una secuencia de moléculas de ácido nucleico que exhiben una identidad secuencial de al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o 90%. En otras modalidades, las moléculas de ácido nucleico exhiben una identidad secuencial de un 95% o 98% respecto a la secuencia de ácido nucleico de referencia.

Los parámetros básicos que afectan a la elección de las condiciones de hibridación y las pautas para diseñar condiciones adecuadas se exponen, por ejemplo, en Sambrook, Fritsch y Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11; y Currenfc Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds . , John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4) y un experto en la técnica las podrá determinar fácilmente en función de, por ejemplo, la longitud y/o la composición de bases del ácido nucleico.

La similitud secuencial entre polipéptidos , que también se denomina identidad secuencial, se mide normalmente utilizando un software para el análisis de secuencias. El software para el análisis de proteínas empareja secuencias similares utilizando mediciones de la similitud asignada a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluidas las sustituciones aminoacídicas conservadoras. Por ejemplo, la herramienta para el análisis de secuencias GCG (Accelrys Software Inc.) contiene programas, tales como "GAP" y "BEST-FIT", que se pueden utilizar con parámetros preestablecidos para determinar la homología secuencial o identidad secuencial entre polipéptidos relacionados estrechamente, tales como polipéptidos homólogos de especies de organismos diferentes o entre una proteína natural y una de sus muteínas (remítase, por ejemplo, a GCG Versión 6.1 o Durbin efc al., Biological Seguence Analysis: Probabilistic models of proteins and nucleic acids . , Cambridge Press (1998) ) .

También se pueden comparar secuencias polipeptídicas utilizando FASTA con parámetros preestablecidos o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y el porcentaje de identidad secuencial de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias de referencia y de examen (Pearson (2000) , mencionado anteriormente) . Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de organismos diferentes es el programa informático BLAST, especialmente blastp o tblastn, utilizando parámetros preestablecidos. Remítase, por ejemplo, a Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol . 215: 403 410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402, cada uno de los cuales se incorpora a la presente por referencia.

A este respecto, la invención también incluye moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos que son "sustancialmente idénticos" con respecto a una secuencia polipeptídica de la región variable de un anticuerpo (por ejemplo, ya sea la región variable de la cadena ligera o pesada del donante, la región variable de la cadena ligera o pesada del aceptor o el constructo humanizado resultante) . La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idénticos", tal como se aplica a estos polipéptidos, quiere decir que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como por medio de los programas GAP o BEST-FIT utilizando penalizaciones por hueco preestablecidas, comparten una identidad secuencial de al menos un 60% o 65%, preferentemente una identidad secuencial de al menos un 70%, 75%, 80%, 85% o 90%, incluso más preferentemente una identidad secuencial de al menos un 93%, 95%, 98% o 99%. Preferentemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren en sustituciones aminoacídicas conservadoras. Una "sustitución aminoacídica conservadora" es aquella en la que un residuo aminoacídico se sustituye por otro residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) . En general, una sustitución aminoacídica conservadora no modificará de forma sustancial las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad secuencial o el grado de similitud se puede ajustar al alza para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. 3. Expresión Los diferentes procesos de la expresión recombinante , es decir, la producción de ARN o de ARN y proteína/péptido, están bien definidos tal como se expone, por ejemplo, en Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3.a Ed.), Vol . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (2000); y Current Protocole in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds . , Current Protocole, una colaboración empresarial entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (presentado en suplementos durante el 2006) .

Ciertas expresiones de interés incluyen "secuencia de control de la expresión" que comprende promotores, sitios de unión al ribosoma, potenciadores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de ARNm. Como se sabe con certeza, un "promotor" o una "región promotora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está situada generalmente antes (en el extremo 51 ) de la secuencia de ácido nucleico que se está expresando y controla la expresión de la secuencia al proporcionar un sitio de reconocimiento y unión para la ARN-polimerasa .

Los promotores ilustrativos que son compatibles de acuerdo con la invención incluyen promotores para la polimerasa SP6, T3 y T7, el promotor de ARN U6 humano, el promotor de CMV y promotores híbridos artificiales de estos (por ejemplo, CMV) donde una o varias partes se fusionan con una o varias partes de promotores de genes de otras proteínas celulares tales como, por ejemplo, GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa) humana, y que incluyen o no uno o más intrones adicionales.

En ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico puede estar presente en un vector, cuando proceda con un promotor, que controle la expresión del ácido nucleico. El término conocido "vector" comprende cualquier vehículo intermediario para un ácido nucleico que permite, por ejemplo, introducir el ácido nucleico en células procariotas y/o eucariotas y, cuando proceda, integrarlo en un genoma . Los métodos de transformación de células de mamífero son muy conocidos en la técnica. Remítase, por ejemplo, a las patentes de EE. UU. Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455. Los vectores pueden incluir una secuencia de nucleótidos que codifique un anticuerpo de la invención (por ejemplo, un anticuerpo entero, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, una VH o VL de un anticuerpo, o una de sus porciones, o una CDR de la cadena pesada o ligera, un Fv monocatenario, o fragmentos o variantes de este) , ligada operablemente a un promotor (remítase, por ejemplo, a la publicación de PCT WO 86/05807; la publicación de PCT WO 89/01036; y la patente de EE. UU. No. 5,122,464).

Se comercializan diversos sistemas vectoriales de expresión en el huésped, y muchos son compatibles con los principios de la presente y se pueden utilizar para expresar los moduladores de la invención. Tales sistemas incluyen, sin carácter limitante, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis, estreptomicetos ) transformadas con ADN bacteriófago recombinante , vectores de expresión de ADN plasmídico o ADN cosmídico que contienen secuencias que codifican moduladores; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Píchia) transfectada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias que codifican moduladores; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias que codifican moduladores; sistemas de células vegetales (por ejemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lentejas de agua, maíz, trigo, papa, etc.) infectados con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor; virus del mosaico del tabaco) o transfectados con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias que codifican moduladores; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3 , etc.) que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia) .

La expresión "célula hospedera", tal como se utiliza en la presente, abarca cualquier tipo de sistema celular que se puede modificar por ingeniería genética para que genere los polipéptidos y las moléculas de unión al antígeno de la presente invención. En una modalidad, la célula hospedera se modifica por ingeniería genética para permitir la producción de una molécula de unión al antígeno con glicoformas modificadas. En una modalidad preferida, la molécula de unión al antígeno o la variante de la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo o una proteína de fusión. En ciertas modalidades, las células hospederas han sido manipuladas adicionalmente para que expresen niveles más elevados de uno o más polipéptidos con actividad iV-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIll) . Las células hospederas compatibles incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también las células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica, o planta cultivada o tej ido animal .

Para la producción a largo plazo y de alto rendimiento de proteínas recombinantes se prefiere la expresión estable. Por consiguiente, se pueden modificar genéticamente líneas celulares que expresan de forma estable el modulador seleccionado utilizando técnicas estándar reconocidas en la materia. En vez de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación víricos, las células hospederas se pueden transformar con ADN controlado por elementos para el control de la expresión adecuados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable . Se puede utilizar cualquiera de los sistemas de selección conocidos en la técnica, incluido el sistema de expresión del gen de la glutamina-sintetasa (el sistema GS) que proporciona una estrategia eficiente para incrementar la expresión en ciertas condiciones. El sistema GS se describe entero o en parte en relación con las patentes EP 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997 y 0 338 841, y las patentes de EE. UU. Nos. 5,591,639 y 5,879,936, cada una de las cuales se incorpora a la presente por referencia. Otro sistema de expresión preferido, el kit Freedom™ CHO-S comercializado por Life Technologies (número de catálogo A13696-01) , también facilita el desarrollo de líneas celulares estables que se pueden utilizar para producir moduladores .

Tales sistemas de expresión en el huésped representan vehículos a través de los cuales se pueden producir las secuencias codificantes de interés y posteriormente purificarlas, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos adecuadas, pueden expresar una molécula de la invención in situ. La célula hospedera se puede cotransfectar con dos vectores de expresión de la invención, por ejemplo, donde el primer vector codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector codifica un polipéptido derivado de la cadena ligera.

Por lo tanto, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona células hospederas recom inantes que permiten la expresión de anticuerpos o porciones de estos. Los anticuerpos producidos mediante la expresión en tales células hospederas recombinantes se denominan en la presente anticuerpos recombinantes. La presente invención también proporciona células descendientes de tales células hospederas y anticuerpos producidos por estas .

C . Síntesis química Además, los moduladores se pueden sintetizar químicamente utilizando técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, remítase a Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principies, W.H. Freeman & Co., N.Y. , y Hunkapiller, M . , et al . , 1984, Nature 310:105-111). Es más, si se desea, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos (tales como isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido 2 , 4 -diaminobutírico, ácido a-aminoisobutírico, ácido 4-aminobutírico y similares) como una sustitución o una adición en una secuencia polipeptídica D . Sistemas transgénicos En otras modalidades, los moduladores se pueden producir transgénicamente mediante la generación de un mamífero o una planta que sea transgénico para moléculas recombinantes tales como las secuencias de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, y que produzca los compuestos deseados en una forma recuperable. Esto incluye, por ejemplo, la producción de moduladores proteicos (por ejemplo, anticuerpos) en leche de cabras, vacas u otros mamíferos, y su recuperación a partir de la leche. Remítase, por ejemplo, a las patentes de EE. UU. Nos. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 y 5,741,957. En algunas modalidades, los animales transgénicos no humanos que comprenden locus de inmunoglobulina humana se inmunizan para producir anticuerpos .

Otras técnicas transgénicas se exponen en Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2.a ed. , Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics : A Practical Approach, Oxford University Press (2000) ,- y Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999) y la patente de EE . UU. No. 6,417,429. En algunas modalidades, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado o caballos, y el producto deseado se produce en su sangre, leche, orina, saliva, lágrimas, mucosidad y otros fluidos corporales a partir de los cuales se puede obtener fácilmente utilizando técnicas de purificación reconocidas en la materia.

Otros sistemas de producción compatibles incluyen métodos para crear anticuerpos en plantas tales como los que se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. No. 6,046,037 y 5,959,177, que se incorporan a la presente en lo que respecta a tales técnicas.

E . Aislamiento/purificación Una vez se ha producido un modulador de la invención por expresión recombinante o cualquier otra de las técnicas descritas, este se puede purificar mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de inmunoglobulinas o proteínas. A este respecto, el modulador se puede "aislar" lo cual significa que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural . Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos terapéuticos o de diagnóstico para el polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. Los moduladores aislados incluyen un modulador in si tu dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente .

Si la molécula deseada se produce intracelularmente , como primer paso, los desechos particulados, ya sean células hospederas o fragmentos lisados, se pueden eliminar, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración . Cuando el modulador se secreta al medio, el sobrenadante de tales sistemas de expresión generalmente se concentra primero utilizando un filtro para concentrar proteínas comercializado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Pellicon (Millipore Corp.). Una vez que se eliminan los contaminantes insolubles, el preparado del modulador se puede purificar aún más utilizando técnicas estándar tales como, por ejemplo, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad de interés particular. A este respecto, la proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas de IgGl, IgG2 o IgG4 humana (Lindmark et al., J Immunol Meth 62:1 (1983)), mientras que la proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la IgG3 humana (Guss et al., EMBO J 5:1567 (1986)) . También se dispone de otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación en etanol, HPLC en fase inversa, la cromatografía en sílice, la cromatografía en heparina, la cromatografía de sefarosa en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico) , el cromatoenfoque , SDS-PAGE y la precipitación en sulfato de amonio, dependiendo del anticuerpo que se desee recuperar. En modalidades particularmente preferidas, los moduladores de la presente invención se purificarán, al menos en parte, utilizando cromatografía de afinidad con Proteína A o Proteína G.

VI . Fragmentos y derivados de los moduladores de SEZ6 Independientemente de la metodología de generación y producción que se seleccione, los moduladores de la presente invención reaccionarán, se unirán, se combinarán, formarán complejos, se conectarán, se enlazarán, se adherirán, interaccionarán o se asociarán de otro modo con un determinante diana (por ejemplo, antígeno) y de este modo proporcionarán los resultados deseados. Cuando el modulador comprende un anticuerpo o un fragmento, constructo o derivado de este, tales asociaciones pueden ser a través de uno o más "sitios de unión" o "componentes de unión" expresados en el anticuerpo, donde un sitio de unión comprende una región de un polipéptido que es responsable de la unión selectiva a una molécula o antígeno diana de interés. Los dominios de unión comprenden al menos un sitio de unión (por ejemplo, un anticuerpo IgG intacto tendrá dos dominios de unión y dos sitios de unión) . Los dominios de unión ilustrativos incluyen un dominio variable de un anticuerpo, un dominio de unión al receptor de un ligando, un dominio de unión al ligando de un receptor o un dominio enzimático.

A. Anticuerpos Tal como se ha indicado anteriormente, se pretende que el término "anticuerpo" abarque, al menos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos con injertos de CDR, anticuerpos humanizados y primatizados , anticuerpos humanos, anticuerpos producidos recombinantemente, intracuerpos , anticuerpos multiespecíficos , anticuerpos biespecífieos , anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos antiidiotípicos , así como también anticuerpos sintéticos.

B . Fragmentos Independientemente del modulador (por ejemplo, quimérico, humanizado, etc.) que se seleccione para llevar a la práctica la invención, se apreciará que los fragmentos inmunorreactivos de este se pueden utilizar de acuerdo con los principios de la presente. Un "fragmento de anticuerpo" comprende al menos una porción de un anticuerpo intacto. El término "fragmento" de una molécula de anticuerpo, tal como se utiliza en la presente, incluye fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos y la expresión "fragmento de unión al antígeno" se refiere a un fragmento polipeptídico de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une o reacciona inmunoespecíticamente con un antígeno o determinante inmunogénico de este seleccionado, o compite con el anticuerpo intacto del cual se derivan los fragmentos por la unión específica al antígeno.

Los fragmentos ilustrativos incluyen: VL, VH, scFv, fragmento F(ab')2, fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmentos de un anticuerpo con un dominio único, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenarias y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de un anticuerpo. Además, un fragmento activo comprende una porción del anticuerpo que retiene su capacidad para interaccionar con el antígeno/sustratos o receptores y modificarlos de una forma similar a la de un anticuerpo intacto (aunque quizás de una forma menos eficiente) .

En otras modalidades, un fragmento de un anticuerpo es aquel que comprende la región Fe y aquel que retiene al menos una de las funciones biológicas asociadas normalmente con la región Fe cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como la unión a FcRn, la modulación de la semivida del anticuerpo, la función ADCC y la unión al complemento. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una semivida in vivo sustancialmente similar a la de un anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de este tipo puede comprender un brazo de unión al antígeno enlazado a una secuencia de Fe capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento.

Como reconocerán los expertos en la técnica, se pueden obtener fragmentos por tratamiento químico o enzimático (tal como papaína o pepsina) de un anticuerpo intacto o entero o una cadena de anticuerpo, o por medios recombinantes . Remítase, por ejemplo, a Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed. , Raven Press, N.Y. (1999), para consultar una descripción más detallada de los fragmentos de un anticuerpo.

C. Derivados La invención incluye además derivados de moduladores inmunorreactivos y moléculas de unión al antígeno que comprenden una o más modificaciones. 1. Anticuerpos multivalentes En una modalidad, los moduladores de la invención pueden ser monovalentes o mutivalentes (por ejemplo, bivalentes, trivalentes, etc.). El término "valencia", tal como se utiliza en la presente, se refiere al número de sitios de unión a la diana potenciales asociados con un anticuerpo. Cada sitio de unión a la diana se une específicamente a una molécula diana o posición o locus específico en una molécula diana. Cuando un anticuerpo es monovalente, cada sitio de unión de la molécula se unirá específicamente a una única posición o epítopo antigénico. Cuando un anticuerpo comprende más de un sitio de unión a la diana (multivalente) , cada sitio de unión a la diana se puede unir específicamente a moléculas idénticas o diferentes (por ejemplo, se puede unir a ligandos diferentes o antígenos diferentes, o epítopos o posiciones diferentes en el mismo antígeno) . Remítase, por ejemplo, a la patente de EE . UU. No. 2009/0130105. En cada caso, al menos uno de los sitios de unión comprenderá un epítopo, motivo o dominio asociado con una isoforma de SEZ6.

En una modalidad, los moduladores son anticuerpos biespecíficos en los que las dos cadenas tienen especificidades diferentes, tal como se describe en Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539. Otras modalidades incluyen anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecíficos . Otros constructos multiespecíficos compatibles más sofisticados y métodos para su fabricación se exponen en la patente de EE . UU. No. 2009/0155255, así como también WO 94/04690; Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121:210; y WO96/27011.

Tal como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos multivalentes se pueden unir inmunoespecíficamente a epítopos diferentes de la molécula diana deseada o se pueden unir inmunoespecíficamente tanto a la molécula diana como también a un epítopo heterólogo, tal como un material de soporte sólido o polipéptido heterólogo. Aunque las modalidades preferidas de los anticuerpos anti-SEZ6 se unen solamente a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos) , la presente invención también abarca anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecíficos . Los anticuerpos biespecíficos también incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados " . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas {patente de EE. UU. No. 4,676,980) y para el tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar utilizando cualesquiera métodos de reticulación convenientes. Los agentes reticulantes adecuados son muy conocidos en la técnica y se describen en la patente de EE. UU. No. 4,676,980, junto con múltiples técnicas de reticulación.

En otras modalidades más, los dominios variables de un anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios que combinan anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de un dominio constate de inmunoglobulina, tales como el dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y/o CH3 , utilizando métodos con los que estarán familiarizados los expertos en la técnica. 2. Modificaciones de la región Fe Además de las diferentes modificaciones, sustituciones, adiciones o deleciones de la región variable o de unión de los moduladores descritos (por ejemplo, Fc-SEZ6 o anticuerpos anti-SEZ6) expuestas anteriormente, los expertos en la técnica apreciarán que modalidades seccionadas de la presente invención también pueden comprender sustituciones o modificaciones de la región constante (es decir, la región Fe) . Más particularmente, se contempla que los moduladores de SEZ6 de la invención pueden contener, ínter alia, una o más sustituciones, mutaciones y/o modificaciones de residuos aminoacídicos adicionales que den como resultado un compuesto con características preferidas que incluyen, sin carácter limitante: propiedades farmacocinéticas alteradas, una semivida sérica mayor, una afinidad de unión mayor, una inmunogenicidad reducida, una producción mayor, una unión alterada del ligando de Fe a un receptor Fe (FcR) , una actividad "ADCC" (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) o "CDC" (citotoxicidad dependiente del complemento) mayor o menor, una glicosilación alterada y/o enlaces disulfuro y una especificidad de unión modificada. A este respecto, se apreciará que estas variantes de Fe se puedan utilizar convenientemente para mejorar las propiedades antineoplásicas efectivas de los moduladores descritos.

Con este fin, ciertas modalidades de la invención pueden comprender sustituciones o modificaciones de la región Fe, por ejemplo, la adición de uno o más residuos aminoacídicos, sustituciones, mutaciones y/o modificaciones para producir un compuesto con funciones efectoras de Fe mejoradas o preferidas. Por ejemplo, los cambios en los residuos aminoacídicos que participan en la interacción entre el dominio Fe y un receptor Fe (por ejemplo, FcyRI , FcyRIIA y B, FCYRIII y FcRn) pueden conducir a una citotoxicidad mayor y/o propiedades farmacocinéticas alteradas, tales como una semivida sérica mayor (remítase, por ejemplo, a Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995), cada uno de los cuales se incorpora a la presente por referencia) .

En modalidades seleccionadas, se pueden generar anticuerpos con semividas in vivo mayores mediante la modificación (por ejemplo, sustitución, deleción o adición) de residuos aminoacídicos identificados como participantes en la interacción entre el dominio Fe y el receptor FcRn (remítase, por ejemplo, a las publicaciones internacionales Nos. WO 97/34631; O 04/029207; la patente de EE . UU. No. 6,737,056 y la patente de EE . UU. No. 2003/0190311. En lo que respecta a tales modalidades, las variantes de Fe pueden proporcionar semividas en un mamífero, preferentemente un ser humano, superiores a 5 días, superiores a 10 días, superiores a 15 días, preferentemente superiores a 20 días, superiores a 25 días, superiores a 30 días, superiores a 35 días, superiores a 40 días, superiores a 45 días, superiores a 2 meses, superiores a 3 meses, superiores a 4 meses o superiores a 5 meses. El aumento de la semivida da como resultado una titulación sérica mayor que reduce así la frecuencia de la administración de los anticuerpos y/o reduce la concentración de los anticuerpos que se ha de administrar. La unión a FcRn humano in vivo y la semivida sérica de los polipéptidos de unión de alta afinidad a FcRn humano se pueden evaluar, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transíectadas que expresan FcRn humano, o en primates a los cuales se les administran los polipéptidos con una variante de la región Fe. El documento WO 2000/42072 describe variantes de anticuerpo con una unión mayor o menor a FcRn. Remítase también, por ejemplo, a Shields et al., J. Biol. Chem. 9 (2 ): 6591-6604 (2001).

En otras modalidades, las alteraciones de Fe pueden conducir a una actividad ADCC o CDC mayor o menor. Como consta en la técnica, CDC se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento, y ADCC se refiere a una forma de citotoxicidad en la que la Ig secretada unida a FcR presente en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, linfocitos citolíticos espontáneos, neutrófilos y macrófagos) permite a estas células efectoras citotóxicas unirse específicamente a una célula diana portadora de antígeno y subsecuentemente aniquilar la célula diana con citotoxinas. En el contexto de la presente invención, las variantes de anticuerpo se proporcionan con una afinidad por la unión a FcR "alterada", la cual es una unión mayor o menor en comparación con un anticuerpo original o sin modificar o con un anticuerpo que comprende una secuencia de FcR nativa. Tales variantes que presentan una unión menor pueden poseer una unión baja o inapreciable, por ejemplo, una unión de un 0-20% al FcR en comparación con una secuencia nativa, por ejemplo, según se determina mediante técnicas muy conocidas en la materia. En otras modalidades, la variante exhibirá una mayor unión en comparación con el dominio Fe de inmunoglobulina nativa. Se apreciará que estos tipos de variantes de Fe se puedan utilizar convenientemente para mejorar las propiedades antineoplásicas efectivas de los anticuerpos descritos. En otras modalidades más, tales alteraciones conducen a una mayor afinidad de unión, una inmunogenicidad menor, una producción mayor, una glicosilación alterada y/o puentes disulfuro (por ejemplo, para sitios de conjugación) , una especificidad de unión modificada, una fagocitosis mayor; y/o la reducción de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B; BCR) , etc. 3. Glicosilación alterada Otras modalidades adicionales comprenden una o más glicoformas modificadas, es decir, un modulador de SEZ6 que comprende un patrón de glicosilación alterado o una composición de carbohidratos alterada que está enlazado covalentemente a la proteína (por ejemplo, en el dominio Fe) . Remítase, por ejemplo, a Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol . Chem. 277: 26733-26740. Las glicoformas modificadas pueden ser útiles para diversos propósitos que incluyen, sin carácter limitante, el aumento o la reducción de la función efectora, el aumento de la afinidad del modulador por una diana o el fomento de la producción del modulador. En ciertas modalidades en las que se desea reducir la función efectora, la molécula se puede modificar para que exprese una forma no glicosilada. Las sustituciones que pueden provocar la eliminación de uno o más sitios de glicosilación del entramado de la región variable para suprimir de este modo la glicosilación en el sitio son muy conocidas (remítase, por ejemplo, a las patentes de EE . UU. Nos. 5,714,350 y 6,350,861). En cambio, se pueden conferir unas mejores funciones efectoras o una unión mejorada a la molécula que contiene Fe añadiendo por ingeniería genética uno o más sitios de glicosilación adicionales.

Otras modalidades incluyen una variante de Fe que tiene una composición de glicosilación alterada, tal como un anticuerpo hipofucosilado que contiene cantidades reducidas de residuos fucosílicos o un anticuerpo que tiene unas estructuras GlcNAc bisectrices mayores. Se ha demostrado que los patrones de glicosilación alterados de este tipo incrementan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Se pueden generar glicoformas modificadas mediante cualquier método con el que esté familiarizado un experto en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de cepas de expresión variantes o modificadas, mediante la coexpresión con una o más enzimas (por ejemplo, N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIll) ) , mediante la expresión de una molécula que comprende una región Fe en diversos organismos o líneas celulares de diversos organismos, o mediante la modificación de uno o más carbohidratos después de que la molécula que comprende la región Fe se haya expresado (remítase, por ejemplo, a WO 2012/117002) . 4. Procesamiento adicional Los moduladores se pueden modificar diferencialmente durante o después de la producción, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, ligadura a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Se puede llevar a cabo cualquiera de entre numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas que incluyen, sin carácter limitante, la escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4, acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc.

Diversas modificaciones postraduccionales que la invención también abarca incluyen, por ejemplo, cadenas carbohidratadas unidas a través de N o unidas a través de O, el procesamiento de extremos aminoterminales o carboxiterminales , el acoplamiento de restos químicos al esqueleto aminoacídico, modificaciones químicas de cadenas carbohidratadas unidas a través de N o unidas a través de 0 y la adición o deleción de un residuo de metionina aminoterminal como resultado de la expresión de células hospederas procariotas. Además, los moduladores también se pueden modificar con un marcador detectable, tal como un marcador enzimático, fluorescente, radioisotópico o de afinidad para permitir la detección y el aislamiento del modulador .

VII . Características de los moduladores Independientemente del modo de obtención o de las formas mencionadas anteriormente que el modulador adquiera, varias modalidades de los moduladores descritos pueden exhibir ciertas características. En modalidades seleccionadas, se pueden seleccionar, clonar y cribar posteriormente células productoras de anticuerpos (por ejemplo, hibridomas o colonias de levaduras) para obtener unas propiedades favorables que incluyen, por ejemplo, un crecimiento robusto, una alta producción de moduladores y, como se indica con más detalle posteriormente, unas características deseables para un modulador. En otros casos, se pueden conferir o modificar las características del modulador seleccionando un antígeno particular (por ejemplo, una isoforma de SEZ6 específica o un fragmento de esta) o un fragmento inmunorreactivo del antígeno diana para su inoculación en el animal. En otras modalidades adicionales, los moduladores seleccionados se pueden modificar como se ha descrito anteriormente para mejorar o refinar sus características inmunoquímicas tales como la afinidad o propiedades farmacocinéticas .

A. Moduladores neutralizantes En ciertas modalidades, los moduladores comprenderán anticuerpos "neutralizantes", o derivados o fragmentos de estos. Es decir, la presente invención puede comprender moléculas de anticuerpo que se unen a dominios, motivos o epítopos específicos, y que son capaces de bloquear, reducir o inhibir la actividad biológica de SEZ6. Más generalmente, la expresión "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo que se une o interacciona con una molécula o ligando diana, y evita que la molécula diana se una o asocie con una entidad de unión, tal como un receptor o sustrato, y de este modo se interrumpe una respuesta biológica que de lo contrario provocaría la interacción de las moléculas.

Se apreciará que se pueden utilizar ensayos de unión competitiva conocidos en la técnica para evaluar la unión y la especificidad de un anticuerpo o fragmento o derivado inmunológicamente funcional de este. Con respecto a la presente invención, se sobreentenderá que un anticuerpo o fragmento inhibe o reduce la unión de SEZ6 a una entidad de unión o sustrato (por ejemplo, un ligando neurotrófico) cuando un exceso de anticuerpo reduzca la cantidad de entidad de unión unida a SEZ6 al menos aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o más según se mide, por ejemplo, mediante la actividad del ligando neurotrófico afectado o en un ensayo de unión competitiva in vitro. En el caso de los anticuerpos para SEZ6, por ejemplo, un anticuerpo neutralizante o antagonista preferentemente alterará la actividad del ligando al menos aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o más. Se apreciará que esta actividad modificada se puede medir directamente utilizando técnicas reconocidas en la materia o se puede medir por el impacto que la actividad alterada ejerce posteriormente (por ejemplo, oncogénesis, supervivencia celular o activación de la vía) .

B . Moduladores internalizantes Aunque existen pruebas que indican que SEZ6 o isoformas seleccionadas de este pueden estar presentes en una forma soluble, es probable que al menos parte de SEZ6 permanezca asociada con la superficie celular, lo que permite la internalización de los moduladores descritos. Por consiguiente, los anticuerpos anti-SEZ6 de la presente invención pueden ser internalizados, al menos en cierto grado, por células que expresen SEZ6. Por ejemplo, un anticuerpo anti-SEZ6 que se una a SEZ6 en la superficie de una célula iniciadora de tumores podrá ser internalizado por la célula iniciadora de tumores. En modalidades particularmente preferidas, tales anticuerpos anti-SEZ6 se pueden conjugar o asociar con agentes anticancerosos tales como restos citotóxicos que aniquilan la célula al internalizarlos. En modalidades particularmente preferidas, el modulador comprenderá un conjugado de anticuerpo internalizante-fármaco.

Tal como se utiliza en la presente, un modulador que se "internaliza" es aquel que es captado (junto con cualquier carga útil) por la célula al unirse a un antígeno o receptor asociado. Como se apreciará, el modulador internalizante puede comprender, en modalidades preferidas, un anticuerpo que incluya fragmentos de anticuerpo y derivados de este, así como también conjugados de anticuerpo. La internalización puede tener lugar in vitro o in vivo. Para las aplicaciones terapéuticas, la internalización tendrá lugar preferentemente in vivo en un sujeto que lo necesite. El número de moléculas de anticuerpo internalizadas puede ser suficiente o adecuado para aniquilar una célula que expresa antígeno, especialmente una célula madre cancerosa que expresa antígeno. Dependiendo de la potencia del anticuerpo o el conjugado de anticuerpo, en algunos casos, la captación de una única molécula de anticuerpo en la célula es suficiente para aniquilar la célula diana a la cual se une el anticuerpo. Por ejemplo, ciertas toxinas son tan sumamente potentes que la internalización de unas pocas moléculas de la toxina conjugada con el anticuerpo es suficiente para aniquilar la célula tumoral. El hecho de que un anticuerpo se internalice al unirse a una célula de mamífero se puede determinar mediante diversos ensayos, incluidos los que se describen más adelante en los Ejemplos (por ejemplo, los Ejemplos 15, 17 y 18) . También se describen métodos para detectar si un anticuerpo se internaliza en una célula en la patente de EE. UU. No. 7.619.068, la cual se incorpora a la presente en su totalidad por referencia.

C . Moduladores supresores En otras modalidades, los anticuerpos comprenderán anticuerpos supresores, o derivados o fragmentos de estos. El término anticuerpo "supresor" se refiere a un anticuerpo que se une o asocia preferentemente con un antígeno en o cerca de la superficie celular, e induce, fomenta o provoca la muerte o la eliminación de la célula (por ejemplo, por CDC, ADCC o introducción de un agente citotóxico) . En algunas modalidades, los anticuerpos supresores seleccionados estarán asociados o conjugados con un agente citotóxico.

Preferentemente, un anticuerpo supresor será capaz de suprimir, incapacitar, eliminar o aniquilar al menos un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% de las células tumorigénicas con SEZ6 en una población de células definidas. En algunas modalidades, la población de células puede comprender células perpetuantes de tumores enriquecidas, seccionadas, purificadas o aisladas. En otras modalidades, la población de células puede comprender muestras tumorales enteras o extractos tumorales heterogéneos que comprenden células perpetuantes de tumores . Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden utilizar técnicas bioquímicas estándar como las que se describen más adelante en los Ejemplos (por ejemplo, los Ejemplos 14 y 15) para monitorizar y cuantificar el agotamiento de células tumorigénicas o células perpetuantes de tumores de acuerdo con los principios de la presente.

D . Clasificación en secciones y unión a epítopos Se apreciará además que los moduladores de tipo anticuerpo anti-SEZ6 descritos se asociarán o se unirán a epítopos discretos o determinantes inmunogénicos presentados por la diana seccionada o un fragmento de esta. En ciertas modalidades, los epítopos o determinantes inmunogénicos incluyen agrupaciones químicamente tensioactivas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Por lo tanto, el término "epítopo", tal como se utiliza en la presente, incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente a un receptor de linfocitos T o inmunoglobulina, o que interacciona de otro modo con una molécula. En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente (o se une o reacciona inmunoespecíficamente) con un antígeno cuando reconoce preferencialmente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas . En modalidades preferidas, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación en equilibrio (KD) es inferior o igual a 10"6 M, o inferior o igual a 10~7 M, más preferentemente cuando la constante de disociación en equilibrio es inferior o igual a 10"8 M e incluso más preferentemente cuando la constante de disociación es inferior o igual a 10"9 M.

Más directamente, el término "epítopo" se utiliza con su sentido bioquímico común y se refiere a una porción de un antígeno diana que puede ser reconocida por un modulador de tipo anticuerpo particular y a la que este se une específicamente. Cuando el antígeno es un polipéptido, tal como SEZ6, se pueden formar epítopos generalmente a partir de tanto aminoácidos contiguos como aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína ("epítopos conformacionales" ) . En tales epítopos conformacionales , los puntos de interacción se encuentran entre residuos aminoacídicos en la proteína que están separados linealmente unos de otros. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos (denominados a veces epítopos "lineales" o "contiguos") normalmente se retienen al desnaturalizarse la proteína, mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario normalmente se pierden al desnaturalizarse la proteína. En cualquier caso, un epítopo de un anticuerpo normalmente incluye al menos 3 y más habitualmente al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una única conformación espacial.

A este respecto, se apreciará que, en ciertas modalidades, un epítopo se puede asociar con una o más regiones, dominios o motivos de la proteína SEZ6 o residir en estos (por ejemplo, los aminoácidos 1-906 de la isoforma 1) . Tal como se indica más detalladamente en la presente, la región extracelular de la proteína SEZ6 comprende una serie de dominios generalmente reconocidos que incluyen cinco dominios Sushi y dos dominios CUB junto con un dominio aminoterminal . A los efectos de la presente exposición, el término "dominio" se utilizará de acuerdo con su significado generalmente aceptado y se sobreentenderá que se refiere a una entidad estructural conservada definible o identificable dentro de una proteína que exhibe un contenido estructural secundario característico. En muchos casos, los dominios homólogos con funciones comunes presentarán normalmente similitudes secuenciales y se pueden encontrar en diversas proteínas dispares (por ejemplo, existe constancia de la presencia de dominios Sushi en un gran número de proteínas diferentes) . De forma análoga, el término "motivo" reconocido en la técnica se utilizará de acuerdo con su significado habitual y se referirá en general a una región conservada corta de una proteína constituida normalmente por de diez a veinte residuos aminoacídicos contiguos. Como se indica a lo largo del documento, las modalidades seleccionadas comprenden moduladores que se asocian o unen a un epítopo dentro de regiones, dominios o motivos específicos de SEZ6.

En cualquier caso, una vez que se determina un epítopo deseado en un antígeno, se pueden generar anticuerpos para el epítopo, por ejemplo, por inmunización con un péptido que comprenda el epítopo utilizando técnicas que se describen en la presente invención. Como alternativa, durante el proceso de descubrimiento, la generación y la caracterización de anticuerpos pueden dilucidar información sobre epítopos deseables situados en dominios o motivos específicos. A partir de esta información, se puede entonces cribar anticuerpos competitivamente para la unión al mismo epítopo. Una estrategia para conseguir esto consiste en realizar estudios de competición para encontrar anticuerpos que se unan competitivamente uno respecto al otro, es decir, los anticuerpos compiten por la unión al antígeno. En el documento WO 03/48731 se describe un proceso de alto rendimiento para la clasificación en secciones de los anticuerpos en función de su competición cruzada. Más adelante, en los Ejemplos 9 y 10, se exponen otros métodos para la clasificación en secciones o el mapeo de los epítopos o el nivel de dominios que comprenden la competición entre moduladores o la expresión de un fragmento antigénico en levaduras .

El término "clasificación en secciones", tal como se utiliza en la presente, se refiere a métodos utilizados para agrupar o clasificar anticuerpos en función de sus características de unión al antígeno y competición. Aunque las técnicas son útiles para definir y categorizar los moduladores de la presente invención, las secciones no siempre se correlacionan directamente con epítopos y tales determinaciones iniciales de la unión a epítopos se pueden refinar aún más y confirmar mediante otra metodología reconocida en la técnica como la que se describe en la presente. Sin embargo, tal como se indica y muestra más adelante en los Ejemplos, la asignación empírica de moduladores de tipo anticuerpo a secciones individuales proporciona información que puede ser indicativa del potencial terapéutico de los moduladores descritos.

Más específicamente, se puede determinar si un anticuerpo de referencia seleccionado (o fragmento de este) se une al mismo epítopo o presenta competición cruzada por la unión con un segundo anticuerpo de ensayo (es decir, pertenece a la misma sección) utilizando métodos conocidos en la técnica y que se exponen en los Ejemplos de la presente.

En una modalidad, un modulador de tipo anticuerpo de referencia se asocia con un antígeno SEZ6 en condiciones de saturación y después se determina la capacidad de un modulador de tipo anticuerpo de ensayo o secundario para unirse a SEZ6 utilizando técnicas inmunoquímicas estándar. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse sustancialmente a SEZ6 al mismo tiempo que el anticuerpo anti-SEZ6 de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo o secundario se une a un epítopo diferente al del anticuerpo de referencia o primario. Sin embargo, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse sustancialmente a SEZ6 al mismo tiempo, entonces el anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo, un epítopo superpuesto o un epítopo que se encuentra muy próximo (al menos estéricamente) al epítopo al que se une el anticuerpo primario. Es decir, el anticuerpo de ensayo compite por la unión al antígeno y pertenece a la misma sección que el anticuerpo de referencia.

La expresión "competir" o "anticuerpo que compite", cuando se utiliza en el contexto de los moduladores descritos, se refiere a la competición entre anticuerpos según se determina con un ensayo en el que un anticuerpo de ensayo o un fragmento inmunológicamente funcional objeto de estudio previene o inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común. Normalmente, un ensayo de este tipo supone el uso de antígeno purificado (por ejemplo, SEZ6 o un dominio o fragmento de este) unido a una superficie sólida o células portadoras de cualquiera de estos, una inmunoglobulina de ensayo sin marcar y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o las células en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Habitualmente , la inmunoglobulina de ensayo está presente en exceso y/o se deja que se una primero. Los anticuerpos identificados mediante un ensayo de competición (anticuerpos competitivos) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente lo suficientemente próximo al epítopo al que se une el anticuerpo de referencia para que haya impedimentos estéricos. En los Ejemplos de la presente se proporcionan detalles adicionales referentes a métodos para determinar la unión competitiva. Normalmente, cuando un anticuerpo competitivo esté presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común al menos un 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%. En algunos casos, la unión se inhibe al menos un 80%, 85%, 90%, 95% o 97%, o más.

En cambio, cuando se una el anticuerpo de referencia, inhibirá preferentemente la unión de un anticuerpo de ensayo añadido posteriormente (es decir, un modulador de SEZ6) al menos un 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%. En algunos casos, la unión del anticuerpo de ensayo se inhibe al menos un 80%, 85%, 90%, 95% o 97%, o más.

En lo que respecta a la presente invención y tal como se expone más adelante en los Ejemplos 9 y 10, se ha determinado (mediante resonancia de plasmones superficiales o interferometría biocapa) que el dominio extracelular de SEZ6 define al menos siete secciones por la unión competitiva denominadas en la presente de la "sección A" a la "sección F" y la sección U.

A este respecto y como consta en la técnica y se detalla más adelante en los Ejemplos, los datos sobre la clasificación en secciones o unión competitiva deseados se pueden obtener utilizando una metodología de radioinmunoensayo (RIA) indirecto o directo en fase sólida, enzimoinmunoensayo (EIA o ELISA) indirecto o directo en fase sólida, ensayo de competición de tipo sándwich, un sistema Biacore™ 2000 (es decir, resonancia de plasmones superficiales - GE Healthcare) , un analizador ForteBio1" (es decir, interferometría de biocapa - ForteBio, Inc.) o citometría de flujo. La expresión "resonancia de plasmones superficiales", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un fenómeno óptico que permite analizar interacciones específicas a tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones proteicas dentro de una matriz biosensora. La expresión " interferometría de biocapa" se refiere a una técnica analítica óptica que analiza el patrón de interferencia de la luz blanca reflejada a partir de dos superficies: una capa de proteína inmovilizada en un cabezal biosensor y una capa de referencia interna. Cualquier cambio en el número de moléculas unidas al cabezal biosensor provoca un desplazamiento en el patrón de interferencia que se puede medir a tiempo real. En modalidades particularmente preferidas, el análisis (ya sea resonancia de plasmones superficiales, interferometría de biocapa o citometría de flujo) se realizó utilizando un instrumento Biacore o ForteBio o un citómetro de flujo (por ejemplo, FACSAria II) como se demuestra más adelante en los Ejemplos.

Para caracterizar aún más los epítopos con los que se asocian o unen los moduladores de tipo anticuerpo de SEZ6 descritos, se realizó un mapeo de los epítopos a nivel de dominios utilizando una modificación del protocolo descrito por Cochran et al. (J Immunol Methods . 287 (1-2) : 147-158 (2004) , el cual se incorpora a la presente por referencia) . Resumiendo, se expresaron dominios individuales de SEZ6 que comprendían secuencias de aminoácidos específicas en la superficie de una levadura y se determinó la unión de cada anticuerpo de SEZ6 por citometría de flujo. Los resultados se explican más adelante en el Ejemplo 10 y se muestran en las FIGS. 14A y 14B.

Otras técnicas de mapeo de los epítopos compatibles incluyen mutantes por barrido de alanina, inmunotransferencia peptídica (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63) (incorporado específicamente a la presente en su totalidad por referencia) o análisis de escisión peptídica. Además, se pueden emplear métodos tales como la escisión de epítopos, la extracción de epítopos y la modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496) (incorporado específicamente a la presente en su totalidad por referencia) . En otras modalidades, la creación de perfiles asistida por modificación (MAP) , conocida también como creación de perfiles de anticuerpos basada en la estructura de los antígenos (ASAP) , proporciona un método que categoriza grandes números de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra el mismo antígeno de acuerdo con las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a superficies antigénicas modificadas química o enzimáticamente (patente de EE . UU. No. 2004/0101920, que se incorpora específicamente a la presente en su totalidad por referencia) . Cada categoría puede reflejar un epítopo único ya sea muy diferente a un epítopo representado por otra categoría o que se superponga parcialmente a este. Esta tecnología permite filtrar rápidamente anticuerpos genéticamente idénticos, de modo que la caracterización se puede centrar en anticuerpos genéticamente diferentes. Se apreciará que se puede utilizar MAP para clasificar los moduladores de tipo anticuerpo de hSEZ6 de la invención en grupos de anticuerpos que se unen a epítopos diferentes.

Los agentes útiles para alterar la estructura del antígeno inmovilizado incluyen enzimas tales como enzimas proteolíticas (por ejemplo, tripsina, endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Asp-N, quimotripsina, etc.). Los agentes útiles para alterar la estructura del antígeno inmovilizado también pueden ser agentes químicos, tales como ésteres de succinimidilo y sus derivados, compuestos que contienen aminas primarias, hidrazinas y carbohidrazinas , aminoácidos libres, etc.

La proteína antigénica se puede inmovilizar en las superficies de un chip biosensor o microesferas de poliestireno . Estas últimas se pueden procesar con, por ejemplo, un ensayo tal como un ensayo de detección LUMINEX™ multiplex (Luminex Corp.) . Debido a la capacidad de LUMINEX para gestionar análisis multiplex con hasta 100 tipos diferentes de microesferas, LUMINEX proporciona superficies antigénicas prácticamente ilimitadas con diversas modificaciones, lo cual proporciona una mejor resolución en la creación de perfiles de los epítopos de un anticuerpo en comparación con un ensayo con un biosensor.

E . Características de la unión de los moduladores Aparte de la especificidad epitópica, los anticuerpos descritos se pueden caracterizar utilizando características físicas tales como, por ejemplo, las afinidades de unión. A este respecto, la presente invención abarca también el uso de anticuerpos que tienen una afinidad de unión alta para una o más isoformas de SEZ6 o, en el caso de pan-anticuerpos, más de un miembro de la familia SEZ6.

Se pretende que el término "KD" , tal como se utiliza en la presente, se refiera a la constate de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Se dice que un anticuerpo de la invención se une inmunoespecíficamente a su antígeno diana cuando la constante de disociación KD (kasociación/kdisociación) es = 10~7 M. El anticuerpo se une específicamente a un antígeno con una afinidad alta cuando la KD es = 5xl0"9 M y con una afinidad muy alta cuando la KD es = 5xl0~10 M. En una modalidad de la invención, el anticuerpo tiene una KD = 10"9 M y una velocidad de disociación de aproximadamente lxl0"4/s. En una modalidad de la invención, la velocidad de disociación es < lxl0"5/s. En otras modalidades de la invención, los anticuerpos se unirán a SEZ6 con una KD de entre aproximadamente 10"7 M y 10"10 M, y en otra modalidad más, se unirá con una KD = 2xl0~10 . Otras modalidades seleccionadas adicionales de la presente invención comprenden anticuerpos que tienen una constante de disociación o KD (kasociación/kdisociación) inferior a 10"2 M, inferior a 5xl0"2 M, inferior a 10"3 M, inferior a 5xl0"3 M, inferior a 10"4 M, inferior a 5xl0"4 M, inferior a 10"5 , inferior a 5xl0"5 M, inferior a 10"6 M, inferior a 5xl0"6 M, inferior a 10"7 M, inferior a 5xl0"7 M, inferior a 10~8 M, inferior a 5xl0"8 , inferior a 10"9 M, inferior a 5xl0"9 M, inferior a 10"10 , inferior a 5xl0"10 M, inferior a 10"11 M, inferior a 5X10"11 M, inferior a 10"12 M, inferior a 5xl0"12 M, inferior a 10"13 M, inferior a 5xl0"13 M, inferior a 10"14 M, inferior a 5xl0"14 M, inferior a 10"15 M o inferior a 5xl0"15 M.

En modalidades específicas, un anticuerpo de la invención que se une inmunoespecíficamente a SEZ6 tiene una constante de la velocidad de asociación o velocidad kon (o ka) (SEZ6 (Ab) + antígeno (Ag) kon^-Ab-Ag) de al menos 105 M^s"1, al menos 2xl05 M^s"1, al menos 5xl05 M^s"1, al menos 106 M^s"1, al menos 5xl06 ^s"1, al menos 107 M^s"1, al menos 5xl07 M^s"1 o al menos 108 M' 1.

En otra modalidad, un anticuerpo de la invención que se une inmunoespecíficamente a SEZ6 tiene una constante de la velocidad de disociación o velocidad kdiSOCiación (o kd) (SEZ6 (Ab) + antígeno (Ag) kdisociación<-Ab-Ag) inferior a 10"1 s" , inferior a 5xl0_1 s" 1, inferior a 10"2 s" 1, inferior a 5xl0"2 s" """, inferior a 10"3 s~ ?, inferior a 5xl0"3 s" 1, inferior a 10"4 s" """, inferior a 5xl0"4 s" 1/ inferior a 10~5 s" """, inferior a 5xl0"5 s" 1, inferior a 10"6 s" 1, inferior a 5xl0"6 s" inferior a 10"7 s~ 1, inferior a 5xl0"7 s" 1, inferior a 10"8 s" , inferior a 5xl0"8 s" 1, inferior a 10"9 s" ?, inferior a 5x10" 9 s" 1 o inferior a 10"10 s" 1.

En otras modalidades seleccionadas de la presente invención, los anticuerpos anti-SEZ6 tendrán una constante de afinidad o Ka (k0n/kdisociación) de al menos 102 NT1, al menos 5xl02 M"1, al menos 103 NT1, al menos 5xl03 M"1, al menos 104 M"1, al menos 5xl04 M*1, al menos 105 M"1, al menos 5xl05 M"1, al menos 106 M"1, al menos 5xl06 M"1, al menos 107 M"1, al menos 5xl07 M"1, al menos 108 M"1, al menos 5x10a M"1, al menos 109 M" 1, al menos 5xl09 M"1, al menos 1010 M"1, al menos 5xl010 NT1, al menos 1011 M"1, al menos 5x1o11 M"1, al menos 1012 M"1, al menos 5xl012 M"1, al menos 1013 M"1, al menos 5xl013 NT1, al menos 1014 "1, al menos 5xl014 M"1, al menos 1015 M"1 o al menos 5xl015 M"1.

Aparte de las características de los moduladores mencionadas anteriormente, los anticuerpos de la presente invención se pueden caracterizar además utilizando características físicas adicionales que incluyen, por ejemplo, la estabilidad térmica (es decir, la temperatura de fusión; Tm) y los puntos isoeléctricos (remítase, por ejemplo, a Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis 14:1023; Vermeer et al., 2000, Biophys . J. 78:394-404; Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154, cada uno de los cuales se incorpora por referencia) .

VIII. Moduladores conjugados A. Introducción Una vez que se hayan generado y/o fabricado los moduladores de la invención y se hayan seleccionado de acuerdo con los principios de la presente, se pueden unir, fusionar, conjugar (por ejemplo, de forma covalente o no covalente) o asociar de otro modo con restos de diagnóstico o farmacéuticamente activos, o modificadores biocompatibles . Las expresiones "conjugado", "conjugado modulador" o "conjugado de anticuerpo", tal como se utilizan en la presente, se utilizarán en un sentido amplio y se sobreentenderá que se refieren a cualquier molécula biológicamente activa o detectable, o fármaco asociado con los moduladores descritos independientemente del método de asociación. A este respecto, se sobreentenderá que tales conjugados pueden comprender, además de los moduladores descritos, péptidos, polipéptidos , proteínas, profármacos que son metabolizados para obtener un agente activo in vivo, polímeros, moléculas de ácido nucleico, moléculas de bajo peso molecular, agentes de unión, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas y radioisótopos. Además, como se ha indicado anteriormente, el conjugado seleccionado puede estar asociado de forma covalente o no covalente con el modulador o ligado a este y exhibir diversas proporciones molares estequiométricas dependiendo, al menos en parte, del método empleado para conseguir la conjugación.

Los aspectos particularmente preferidos de la presente invención, comprenderán conjugados de modulador-anticuerpo o conjugados de anticuerpo-fármaco que se pueden utilizar para el diagnóstico y/o el tratamiento de trastornos proliferativos . Se apreciará que, a menos que el contexto dicte lo contrario, se sobreentenderá que las expresiones "conjugado de anticuerpo-fármaco" o "ADC" o la fórmula M- [L-D] n abarcan los conjugados que comprenden restos tanto terapéuticos como de diagnóstico. En tales modalidades, los compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco comprenderán un modulador de SEZ6 (normalmente un anticuerpo anti-SEZ6) como la unidad moduladora o de unión celular (abreviada como CBA, M o Ab en la presente) , un resto terapéutico (por ejemplo, agente anticanceroso) o de diagnóstico (D) , y opcionalmente un conector (L) que une el fármaco al agente de unión al antígeno. A los efectos de la presente exposición, se sobreentenderá que "n" se refiere a un número entero comprendido entre 1 y 20. En una modalidad preferida, el modulador es un mAb de SEZ6 que comprende al menos una CD de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera como las descritas anteriormente.

Los expertos en la técnica apreciarán que se dispone de varias reacciones diferentes para el enlace o la asociación de restos terapéuticos o de diagnostico y/o conectores con agentes de unión. En modalidades seleccionadas, esto se puede conseguir haciendo reaccionar los residuos aminoacídicos del agente de unión, por ejemplo, la molécula de anticuerpo, que incluyen los grupos amino de la lisina, los grupos de tipo ácido carboxílico libres del ácido glutámico y aspártico, los grupos sulfhidrilo de la cisteína y los diferentes restos de los aminoácidos aromáticos. Uno de los métodos no específicos de enlace covalente utilizados más habitualmente es la reacción carbodiimídica para unir un grupo carboxi (o amino) de un compuesto con grupos amino (o carboxi) del anticuerpo. Además, se han utilizado agentes bifuncionales, tales como dialdehídos o imidoésteres , para enlazar los grupos amino de un compuesto con grupos amino de una molécula de anticuerpo. Para el enlace de fármacos con agentes de unión, también se dispone de la reacción que produce una base de Schiff. Este método implica la oxidación con peryodato de un fármaco que contiene grupos glicol o hidroxi, para formar así un aldehido que posteriormente se hace reaccionar con el agente de unión. El enlace tiene lugar mediante la formación de una base de Schiff con grupos amino del agente de unión. También se pueden utilizar isotiocianatos y azolactonas como agentes de acoplamiento para enlazar covalentemente fármacos con agentes de unión.

En otras modalidades, los moduladores descritos de la invención se pueden conjugar o asociar con proteínas, polipéptidos o péptidos que confieren características seleccionadas (por ejemplo, biotoxinas, biomarcadores , marcadores de purificación, etc.). En ciertas modalidades preferidas, la presente invención abarca el uso de moduladores o fragmentos de estos fusionados recombinantemente o conjugados químicamente (incluidas tanto las conjugaciones covalentes como no covalentes) con una proteína o el péptido heterólogo, donde la proteína o el péptido comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos. El constructo no requiere necesariamente estar unido directamente, pero puede que esto ocurra a través de secuencias conectoras de aminoácidos. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos para dirigir polipéptidos heterólogos a tipos de células particulares que expresen SEZ6, ya sea in vitro o in vivo, fusionando o conjugando los moduladores de la presente invención con anticuerpos específicos para receptores de la superficie celular particulares con el fin de proporcionar constructos biespecíficos . Es más, también se pueden utilizar moduladores fusionados o conjugados con polipéptidos heterólogos en inmunoensayos in vitro y pueden ser particularmente compatibles con la metodología de purificación (por ejemplo, marcadores His) conocida en la técnica. Remítase, por ejemplo, a la publicación internacional No. WO 93/21232; la patente europea No. EP 439,095; Naramura et al., 1994, Immunol . Lett . 39:91-99; la patente de EE. UU. No. 5,474, 981; Gillies et al., 1992, PNAS 89:1428-1432; y Fell et al., 1991, J. Immunol . 146:2446-2452.

B . Conectores Aparte de los conectores o espaciadores peptídicos mencionados anteriormente, se apreciará que se pueden utilizar otras variedades o tipos de conector diferentes para asociar los moduladores descritos con restos de diagnóstico o farmacéuticamente activos o modificadores biocompatibles. En algunas modalidades, el conector se puede escindir en condiciones intracelulares , de modo que la escisión del conector libere la unidad correspondiente al fármaco del anticuerpo en el entorno intracelular . En otras modalidades adicionales, la unidad conectora no se puede escindir y el fármaco se libera, por ejemplo, por degradación del anticuerpo.

Los conectores del ADC son preferentemente estables extracelularmente , evitan la agregación de moléculas de ADC y mantienen el ADC soluble libremente en medios acuosos y en un estado monomérico. Antes de su transporte o suministro a la célula, el conjugado de anticuerpo- fármaco (ADC) es preferentemente estable y permanece intacto, es decir, el anticuerpo permanece unido al resto correspondiente al fármaco. Los conectores son estables fuera de la célula diana y se pueden escindir con una cierta tasa eficaz dentro de la célula. Un conector efectivo: (i) mantendrá las propiedades de unión específicas del anticuerpo; (ii) permitirá el suministro intracelular del conjugado o el resto correspondiente al fármaco; (iii) permanecerá estable e intacto, es decir, sin escindirse, hasta que el conjugado se haya suministrado o transportado a su sitio seleccionado como diana; y (iv) mantendrá un efecto de aniquilación de células citotóxico o un efecto citostático del resto correspondiente al fármaco PBD. La estabilidad del ADC se puede medir mediante técnicas analíticas estándar tales como espectrometría de masas, HPLC y la técnica de separación/análisis por LC/MS. La unión covalente del anticuerpo y el resto correspondiente al fármaco requiere que el conector tenga dos grupos funcionales reactivos, es decir, bivalencia en un sentido reactivo. Se conocen reactivos conectores bivalentes que son útiles para enlazar dos o más restos funcionales o biológicamente activos, tales como péptidos, ácidos nucleicos, fármacos, toxinas, anticuerpos, haptenos y grupos indicadores, y ciertos métodos han descrito sus conjugados resultantes (Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: Nueva York, págs . 234-242) .

Con este fin, ciertas modalidades de la invención comprenden el uso de un conector que puede ser escindido por un agente de escisión que esté presente en el entorno intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveola) . El conector puede ser, por ejemplo, un conector peptidílico que sea escindido por una enzima peptidasa o proteasa intracelular, que incluye, sin carácter limitante, una proteasa lisosomal o endosomal . En algunas modalidades, el conector peptidílico tiene una longitud de al menos dos aminoácidos o al menos tres aminoácidos. Los agentes de escisión pueden incluir las catepsinas B y D, y plasmina, cada una de las cuales se sabe que hidroliza derivados de fármacos dipeptídicos , lo cual provoca la liberación del fármaco activo dentro de las células diana. Algunos conectores peptidílicos ilustrativos que pueden ser escindidos por la proteasa catepsina B dependiente de tiol son péptidos que comprenden Phe-Leu, ya que se ha comprobado que la catepsina B se expresa en grandes cantidades en el tejido canceroso. Otros ejemplos de tales conectores se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. No. 6,214,345 y la patente de EE . UU. No. 2012/0078028, cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad por referencia. En una modalidad preferida específica, el conector peptidílico que puede ser escindido por una proteasa intracelular es un conector Val-Cit, un conector Ala-Val o un conector Phe-Lys tal como se describe en la patente de EE. UU. No. 6,214,345. Una ventaja del uso de la liberación proteolítica intracelular del agente terapéutico es que el agente normalmente se atenúa cuando se conjuga y las estabilidades séricas de los conjugados son normalmente altas .

En otras modalidades, el conector escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a ciertos valores de pH. Normalmente, el conector sensible al pH se puede hidrolizar en condiciones ácidas. Por ejemplo, se puede utilizar un conector lábil en medio ácido que se pueda hidrolizar en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, oxima, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal o similar) (remítase, por ejemplo, a las patentes de EE. UU. Nos. 5,122,368, 5,824,805, 5,622,929). Tales conectores son relativamente estables en condiciones de pH neutro, tales como aquellas en la sangre, pero son inestables a un pH inferior a 5.5 o 5.0, el pH aproximado del lisosoma.

En otras modalidades más, el conector se puede escindir en condiciones reductoras (por ejemplo, un conector de tipo disulfuro) . En la técnica se conocen varios conectores de tipo disulfuro, incluidos, por ejemplo, los que se pueden formar utilizando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato) , SPDP (N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato) , SPDB (N-succinimidil-3- (2-piridilditio) butirato) y SMPT (N-succinimidiloxicarbonil -alfa-metil- alfa- (2-piridilditio) tolueno) . En otras modalidades específicas más, el conector es un conector de tipo malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), un conector de tipo maleimidobenzoílo (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3 (10) .- 1299-1304) o un análogo de 3'-iV-araida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3 (10) : 1305-12) . En otras modalidades adicionales, la unidad conectora no se puede escindir y el fármaco se libera por degradación del anticuerpo (remítase a la publicación de EE. UU. No. 2005/0238649, incorporada a la presente en su totalidad por referencia y a todos los efectos) .

Más particularmente, en modalidades preferidas (expuestas en la patente de EE. UU. No. 2011/0256157, que se incorpora a la presente en su totalidad por referencia) , los conectores compatibles comprenderán: donde el asterisco indica el punto de unión con el agente citotóxico, CBA es un agente de unión celular/modulador, L1 es un conector, A es un grupo conector que conecta L1 con el agente de unión celular, L2 es un enlace covalente o junto con -OC(=0)- forma un conector autodestructivo, y L1 o L2 es un conector escindible.

L1 es preferentemente el conector escindible y se puede considerar el detonante de la activación del conector para su escisión.

La naturaleza de L1 y L2, cuando estén presentes, puede variar en gran medida. Estos grupos se eligen dependiendo de sus características de escisión, que pueden venir dictadas por las condiciones en el sitio en el que se suministre el conjugado. Se prefieren aquellos conectores que son escindidos por acción de enzimas, aunque también se pueden utilizar conectores que pueden ser escindidos por cambios en el pH (por ejemplo, lábiles en medio ácido o básico) , la temperatura o por irradiación (por ejemplo, fotolábiles) . Los conectores que se pueden escindir en condiciones reductoras u oxidantes también pueden ser útiles en la presente invención.

L1 puede comprender una secuencia contigua de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos puede ser el sustrato diana de la escisión enzimática, lo cual permite liberar así R10 de la posición N10.

En una modalidad, L1 puede ser escindido por acción de una enzima. En una modalidad, la enzima es una esterasa o una peptidasa .

En una modalidad, L2 está presente y junto con -C(=0)0-forma un conector autodestructivo . En una modalidad, L2 es un sustrato de la actividad enzimática, lo cual permite liberar así R10 de la posición N10.

En una modalidad, donde L1 puede ser escindido por acción de una enzima y L2 está presente, la enzima escinde el enlace entre L1 y L2.

L1 y L2, cuando están presentes, pueden estar conectados por un enlace seleccionado entre: -C(=0)NH-, -C(=0)0-, -NHC(=0)-, -0C(=0)-, -0C(=0)0-, -NHC(=0)0-, -OC(=0)NH- y -NHC(=0)NH-.

Un grupo amino de L1 que conecta con L2 puede ser el N-terminalde un aminoácido o puede derivar de un grupo amino de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido lisina.

Un grupo carboxilo de L1 que conecta con L2 puede ser el C- terminalde un aminoácido o puede derivar de un grupo carboxilo de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido ácido glutámico.

Un grupo hidroxilo de L1 que conecta con L2 puede derivar de un grupo hidroxilo de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido serina.

La expresión "cadena lateral aminoacídica" incluye aquellos grupos que se encuentran en: (i) aminoácidos naturales tales como alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina (ii) aminoácidos poco comunes tales como ornitina y citrulina; (iii) aminoácidos no naturales, beta-aminoácidos, análogos sintéticos y derivados de aminoácidos naturales; y (iv) todos los enantiómeros , diastereómeros , formas protegidas, enriquecidas isoméricamente, marcadas isotópicamente (por ejemplo, 2H, 3H, 14C, 15N) y mezclas racémicas de estos.

En una modalidad, -C(=0)0- y L2 forman juntos el grupo: donde el asterisco indica el punto de unión con la posición del fármaco o el agente citotóxico, la línea ondulada indicada el punto de unión con el conector L1, Y es -N (H) - , -0-, -C(=0)N(H)- o -C(=0)0-, y n es 0-3. El anillo fenileno está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes como los que se describen en la presente. En una modalidad, el grupo fenileno está opcionalmente sustituido con halo, N02, R u OR.

En una modalidad, Y es NH.

En una modalidad, n es 0 o 1. Preferentemente, n es 0.

Cuando Y es NH y n es 0, el conector autodestructivo se puede denominar conector de tipo p-aminobencilcarbonilo (PABC) .

El conector autodestructivo permitirá liberar el compuesto protegido cuando se active un sitio distante, lo cual procederá de la forma que se muestra a continuación (para n=0) : donde L* es la forma activada de la porción remanente del conector. Estos grupos presentan la ventaja de separar el sitio de activación del compuesto que se está protegiendo. Tal como se ha descrito anteriormente, el grupo fenileno está opcionalmente sustituido.

En una modalidad descrita en la presente, el grupo L* es un conector L1 como se ha descrito en la presente, que puede incluir un grupo dipeptídico.

En otra modalidad, -C(=0)0- y L2 forman juntos un grupo seleccionado entre: donde el asterisco, la línea ondulada, Y y n son como se han definido anteriormente. Cada anillo fenileno está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes como los que se describen en la presente. En una modalidad, el anillo fenileno que tiene el sustituyente Y está opcionalmente sustituido y el anillo fenileno que no tiene el sustituyente Y no está sustituido. En una modalidad, el anillo fenileno que tiene el sustituyente Y no está sustituido y el anillo fenileno que no tiene el sustituyente Y está opcionalmente sustituido.

En otra modalidad, -C(=0)0- y L2 forman juntos un grupo seleccionado entre: donde el asterisco, la línea ondulada, Y y n son como se han definido anteriormente, E es 0, S o NR, D es N, CH o CR, y F es N, CH o CR.

En una modalidad, D es N.

En una modalidad, D es CH.

En una modalidad, E es O o S.

En una modalidad, F es CH.

En una modalidad preferida, el conector es un conector lábil a catepsina.

En una modalidad, L1 comprende un dipéptido. El dipéptido se puede representar como -NH-X!-X2-C0- , donde -NH- y -C0-representan los extremos N y C de los grupos aminoacídicos Xi y X2 respectivamente. Los aminoácidos del dipéptido pueden ser cualquier combinación de aminoácidos naturales. Cuando el conector es un conector lábil a catepsina, el dipéptido puede ser el sitio de acción de la escisión mediada por catepsina.

Además, para los grupos aminoacídicos que tienen una funcionalidad en la cadena lateral amino o carboxilo, por ejemplo, Glu y Lys respectivamente, CO y NH pueden representar esa funcionalidad en la cadena lateral.

En una modalidad, el grupo -??-?2- en el dipéptido, -NH-Xi-X2-CO-, se selecciona entre: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-, -Phe-Cit-, -Leu-Cit-, -Ile-Cit-, -Phe-Arg- y -Trp-Cit-, donde Cit es citrulina.

Preferentemente, el grupo -X!-X2- en el dipéptido, -NH-Xi-X2-C0-, se selecciona entre: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys- y -Val-Cit-. Aún más preferentemente, el grupo -Xi-X2- en el dipéptido, -NH-Xi-X2-CO- , es -Phe-Lys- o -Val-Ala-.

Se pueden utilizar otras combinaciones dipeptídicas, incluidas las descritas por Dubowchik et al., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13.855-869, que se incorpora a la presente por referencia.

En una modalidad, la cadena lateral aminoacídica se derivatiza, cuando proceda. Por ejemplo, se puede derivatizar un grupo amino o un grupo carboxi de una cadena lateral aminoacídica .

En una modalidad, un grupo amino NH2 de un aminoácido con cadena lateral, tal como la lisina, es una forma derivatizada seleccionada del grupo constituido por NHR y NRR' .

En una modalidad, un grupo carboxi COOH de un aminoácido con cadena lateral, tal como el ácido aspártico, es una forma derivatizada seleccionada del grupo constituido por COOR, CONH2, CONHR y CONR ' .

En una modalidad, la cadena lateral aminoacídica está protegida químicamente, cuando proceda. El grupo protector de la cadena lateral puede ser un grupo como los que se indican a continuación en relación con el grupo RL. Las secuencias aminoacídicas protegidas pueden ser escindidas por enzimas. Por ejemplo, se ha establecido que una secuencia dipeptídica que comprende un residuo de Lys, cuya cadena lateral está protegida con Boc, puede ser escindida por catepsina.

Los grupos protectores para las cadenas laterales de aminoácidos son muy conocidos en la técnica y se describen en el catálogo de Novabiochem. En Protective Groups in Organic Synthesis, Greene y Wuts, se describen estrategias de grupos protectores adicionales.

A continuación se muestran grupos protectores de cadenas laterales posibles para aquellos aminoácidos que tengan una funcionalidad reactiva en la cadena lateral: Arg: Z, Mtr, Tos; Asn: Trt , Xan; As : Bzl, t-Bu; Cys : Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, Trt; Glu: Bzl, t-Bu; Gln: Trt, Xan; His : Boc , Dnp, Tos , Trt ; Lys : Boc, Z-Cl, Fmoc, Z, Alloc; Ser: Bzl, TBDMS, TBDPS ; Thr : Bz ; Trp: Boc; Tyr : Bzl, Z, Z-Br.

En una modalidad, la protección de las cadenas laterales se selecciona de modo que sea ortogonal respecto a un grupo proporcionado como grupo desactivante o que forme parte de este, cuando esté presente. Por lo tanto, la eliminación del grupo protector de la cadena lateral no elimina el grupo desactivante ni ninguna otra funcionalidad de grupo protector que forme parte del grupo desactivante.

En otras modalidades de la invención, los aminoácidos seleccionados son aquellos que no tienen ninguna funcionalidad reactiva en la cadena lateral. Por ejemplo, los aminoácidos se pueden seleccionar entre: Ala, Gly, lie, Leu, Met, Phe, Pro y Val.

En una modalidad, el dipéptido se utiliza combinado con un conector autodestructivo . El grupo autodestructivo puede estar conectado a -X2- .

Cuando hay un conector autodestructivo presente, -X2-está conectado directamente al conector autodestructivo. Preferentemente, el grupo -X2-C0- está conectado a Y, donde Y es NH, para formar de este modo el grupo -X2-CO-NH- . -??-? - está conectado directamente a A. A puede comprender la funcionalidad -C0- para formar de este modo un enlace amídico con -Xi- .

En una modalidad, L1 y L2 junto con -OC(=0)- comprenden el grupo NH-Xi-X2-CO-PABC- . El grupo PABC está conectado directamente al agente citotóxico. Preferentemente, el conector autodestructivo y el dipéptido forman juntos el grupo -NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC-, que se ilustra a continuación: donde el asterisco indica el punto de unión con el resto citotóxico seleccionado, y la línea ondulada indica el punto de unión con la porción remanente del conector L1 o el punto de unión con A. Preferentemente, la línea ondulada indica el punto de unión con A. La cadena lateral del aminoácido Lys puede estar protegida, por ejemplo, con Boc, Fmoc o Alloc, tal como se ha descrito anteriormente .

Como alternativa, el conector autodestructivo y el dipéptido forman juntos el grupo -NH-Val-Ala-CO- H-PABC- , que se ilustra a continuación: donde el asterisco y la línea ondulada son como se han definido anteriormente.

Como alternativa, el conector autodestructivo y el dipéptido forman juntos el grupo -NH-Val-Cit-CO-NH-PABC- , que se ilustra a continuación: donde el asterisco y la línea ondulada son como se han definido anteriormente.

En algunas modalidades de la presente invención, puede que se prefiera que si el resto correspondiente al fármaco contiene un enlace imínico sin proteger, por ejemplo, si el resto B está presente, entonces el conector no contenga un grupo amino libre (H2N-) . Por lo tanto, si el conector tiene la estructura -A-L1-L2-, entonces esta preferentemente no contendría un grupo amino libre. Esta preferencia es particularmente relevante cuando el conector contiene un dipéptido, por ejemplo, como L1; en esta modalidad, se preferiría que uno de los dos aminoácidos seleccionados no fuera lisina.

Sin que ello suponga ceñirse a ninguna teoría particular, la combinación de un enlace imínico sin proteger en el resto correspondiente al fármaco y un grupo amino libre en el conector puede provocar la dimerización del resto fármaco-conector que puede interferir con la conjugación del resto fármaco-conector con un anticuerpo. La reacción cruzada de estos grupos se puede ver acelerada en el caso en el que el grupo amino libre esté presente como un ión amonio (H3N+-) , tal como cuando se utiliza un ácido fuerte (por ejemplo, TFA) para desproteger el grupo amino libre.

En una modalidad, A es un enlace covalente. Así pues, L1 y el agente de unión celular están conectados directamente. Por ejemplo, cuando L1 comprende una secuencia de aminoácidos contigua, el N- terminalde la secuencia puede estar directamente conectado al agente de unión celular.

Por lo tanto, cuando A sea un enlace covalente, la conexión entre el agente de unión celular y L1 se podrá selecciona entre: -C(=0)NH-, -C(=0)0-, -NHC(=0)-, -0C(=0)-, -0C(=0)0-, - NHC(=0)0-, -OC(=0)NH-, -NHC(=0)NH-, -C (=0) HC (=0) - , -S-, -S- S-, -CH2C(=0)- y =N-NH- .

Un grupo amino de L1 que conecta con el modulador de SEZ6 puede ser el N- terminalde un aminoácido o puede derivar de un grupo amino de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido lisina.

Un grupo carboxilo de L1 que conecta con el modulador puede ser el C- terminalde un aminoácido o puede derivar de un grupo carboxilo de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido ácido glutámico.

Un grupo hidroxilo de L1 que conecta con el agente de unión celular puede derivar de un grupo hidroxilo de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido serina .

Un grupo tiol de L1 que conecta con un agente modulador puede derivar de un grupo tiol de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido serina.

Los comentarios anteriores referentes a los grupos amino, carboxilo, hidroxilo y tiol de L1 también se aplican al agente de unión celular.

En una modalidad, L2 junto con -OC(=0)- representa: donde el asterisco indica el punto de unión con la posición N10, la línea ondulada indica el punto de unión con L1, n es 0-3, Y es un enlace covalente o un grupo funcional, y E es un grupo que puede ser activado, por ejemplo, por acción de una enzima o con luz, para generar de este modo una unidad autodestructiva . El anillo fenileno además está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes como los que se describen en la presente. En una modalidad, el grupo fenileno además está opcionalmente sustituido con halo, N02, R u OR. Preferentemente, n es 0 o 1, aún más preferentemente 0.

E se selecciona de modo que el grupo sea susceptible de activación, por ejemplo, con luz o por acción de una enzima. E puede ser -N02 o ácido glucurónico. El primero puede ser sensible a la acción de una nitrorreductasa, el último a la acción de una ß-glucoronidasa .

En esta modalidad, el conector autodestructivo permitirá liberar el compuesto protegido cuando E se active, lo cual procederá de la forma que se muestra a continuación (para n=0) : donde el asterisco indica el punto de unión con la posición N10, E* es la forma activada de E e Y es como se ha descrito anteriormente. Estos grupos presentan la ventaja de separar el sitio de activación del compuesto que se está puede estar protegiendo. Tal como se ha descrito anteriormente, el grupo fenileno además puede estar opcionalmente sustituido.

El grupo Y puede ser un enlace covalente con L1.

El grupo Y puede ser un grupo funcional seleccionado entre : -C(=0)-, -NH- , -0-, -C(=0)NH-, -C(=0)0-, -NHC(=0)-, -0C(=0)-, -0C(=0)0-, -NHC(=0)0-, -0C(=0)NH-, -NHC(=0)NH-, -NHC(=0)NH, -C(=0)NHC(=0) - y -S- .

Cuando L1 es un dipéptido, se prefiere que Y sea -NH- o -C(=0)-, para formar de este modo un enlace amídico entre L1 e Y. En esta modalidad, no es necesario que la secuencia dipeptídica sea un sustrato para una actividad enzimática.

En otra modalidad, A es un grupo espaciador. Así pues, L1 y el agente de unión celular están conectados indirectamente .

L1 y A pueden estar conectados por un enlace seleccionado entre: -C(=0)NH-, -C(=0)0-, -NHC(=0)-, -0C(=0)-, -0C(=0)0-, -NHC(=0)0-, -0C(=0)NH- y -NHC (=0) NH- .

Preferentemente, el conector contiene un grupo funcional electrófilo para que reaccione con un grupo funcional nucleófilo en el modulador. Los grupos nucleófilos en los anticuerpos incluyen, sin carácter limitante: (i) grupos amino aminoterminales , (ii) grupos amino de la cadena lateral, por ejemplo, lisina, (iii) grupos tiol de la cadena lateral, por ejemplo, cisteína, y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcares donde el anticuerpo está glicosilado.

Los grupos amino, tiol e hidroxilo son nucleófilos y pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos conectores y reactivos conectores que incluyen: (i) grupos maleimida (ii) disulfuros activados, (iii) ésteres activos tales como ésteres de tipo NHS (N-hidroxisuccinimida) , ésteres de tipo HOBt {N-hidroxibenzotriazol) , haloformiatos y haluros de ácido; (iv) haluros alquílieos y bencílicos tales como haloacetamidas ,- y (v) aldehidos, cetonas, carboxilo y algunos que se ejemplifican como se indica a continuación: Ciertos anticuerpos contienen disulfuros entre las cadenas que se pueden reducir, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos se pueden convertir en reactivos para conjugarlos con reactivos conectores por tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol) . Cada puente de cisteína formará así, teóricamente, dos nucleófilos tiólicos reactivos. Se pueden introducir grupos nucleófilos adicionales en los anticuerpos mediante la reacción de Usinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) , lo cual provoca la conversión de una amina en un tiol. Se pueden introducir grupos tiol reactivos en el anticuerpo (o un fragmento de este) introduciendo uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteína (por ejemplo, preparando anticuerpos imitados que comprendan uno o más residuos aminoacídicos de cisteína no nativos) . El documento US 7521541 describe la modificación por ingeniería genética de anticuerpos mediante la introducción de aminoácidos de cisteína reactivos.

En algunas modalidades, un conector tiene un grupo nucleófilo reactivo que reacciona con un grupo electrófilo presente en un anticuerpo. Los grupos electrófilos útiles en un anticuerpo incluyen, sin carácter limitante, grupos carbonilo de aldehidos y cetonas . El heteroátomo de un grupo nucleófilo de un conector puede reaccionar con un grupo electrófilo en un anticuerpo y formar un enlace covalente con una unidad de anticuerpo. Los grupos nucleófilos útiles en un conector incluyen, sin carácter limitante, hidrazida, oxima, amino, hidroxilo, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazid . El grupo electrófilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la unión de un conector.

En una modalidad, el grupo A es: donde el asterisco indica el punto de unión con L1, línea ondulada indica el punto de unión con el agente unión celular y n es 0-6. En una modalidad, n es 5.

En una modalidad, el grupo A es: donde el asterisco indica el punto de unión con L1, la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular y n es 0-6. En una modalidad, n es 5.

En una modalidad, el grupo A es: donde el asterisco indica el punto de unión con L1, la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular, n es 0 o 1 y m es 0-30. En una modalidad preferida, n es 1 y m es 0-10, 1-8, preferentemente 4-8 y aún más preferentemente 4 u 8. En otra modalidad, m es 10-30 y preferentemente 20-30. Como alternativa, m es 0-50. En esta modalidad, m es preferentemente 10-40 y n es 1.

En una modalidad, el grupo A es: donde el asterisco indica el punto de unión con L1, la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular, n es 0 o 1 y m es 0-30. En una modalidad preferida, n es 1 y m es 0-10, 1-8, preferentemente 4-8 y aún más preferentemente 4 u 8. En otra modalidad, m es 10-30 y preferentemente 20-30. Como alternativa, m es 0-50. En esta modalidad, m es preferentemente 10-40 y n es 1.

En una modalidad, la conexión entre el agente de unión celular y A es a través de un residuo tiólico del agente de unión celular y un grupo maleimida de A.

En una modalidad, la conexión entre el agente de unión celular y A es : donde el asterisco indica el punto de unión con la porción remanente de A y la línea ondulada indica el punto de unión con la porción remanente del agente de unión celular. En esta modalidad, el átomo de S deriva normalmente del modulador .

En cada una de las modalidades anteriores, se puede utilizar una funcionalidad alternativa en vez del grupo derivado de maleimida que se muestra a continuación: donde la línea ondulada indica el punto de unión con agente de unión celular como se ha indicado anteriormente el asterisco indica el enlace con la porción remanente del grupo A.

En una modalidad, el grupo derivado de maleimida se reemplaza con el grupo: donde la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular y el asterisco indica el enlace con la porción remanente del grupo A.

En una modalidad, el grupo derivado de maleimida se reemplaza con un grupo, que opcionalmente junto con el agente de unión celular, se selecciona entre: -C(=0)NH-, -C(=0)0-, -NHC(=0)-, -0C(=O)-, -0C(=0)0-, -NHC(=0)0-, -OC(=0)NH-, -NHC(=0)NH-, -NHC (=0) NH, C(=0)NHC(=0) -, -S-, -S-S-, -CH2C(=0)-, -C(=0)CH2-, =N-NH- y -NH-N= .

En una modalidad, el grupo derivado de maleimida se reemplaza con un grupo, que opcionalmente junto con el agente de unión celular, se selecciona entre: donde la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular o el enlace con la porción remanente del grupo A, y el asterisco indica el otro de entre el punto de unión con el agente de unión celular o el enlace con la porción remanente del grupo A.

Otros grupos adecuados para conectar L1 con el modulador seleccionado se describen en WO 2005/082023.

En otra modalidad preferida, los moduladores de la presente invención se pueden asociar con polímeros biocompatibles que comprendan unidades de fármaco-conector . A este respecto, un polímero compatible de este tipo comprende polímeros Fleximer® (Mersana Therapeutics) . Estos polímeros son supuestamente biodegradables , se toleran bien y han sido validados clínicamente. Es más, tales polímeros son compatibles con numerosas tecnologías y técnicas químicas de conectores personalizables , lo cual permite controlar las propiedades farmacocinéticas , el lugar en el que se libere el fármaco y obtener una mejor biodistribución .

Los moduladores seleccionados también pueden ser radioisótopos conjugados directamente o pueden comprender quelatos macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos (como los que se han descrito en la presente) . En ciertas modalidades, el quelato macrocíclico es el ácido 1, 4, 7, lO-tetraazaciclododecano-iV/iV' ,iV' ' ,?' ' -tetraacético (DOTA) que se puede unir al anticuerpo a través de una molécula conectora. Tales moléculas conectoras son de uso común en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cáncer Res. 4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; y Zimmerman et al., 1999, Nucí. Med. Biol . 26 : 943.

Más generalmente, las técnicas para conjugar restos terapéuticos o agentes citotóxicos con moduladores son muy conocidas. Como se ha indicado anteriormente, se pueden conjugar restos con moduladores mediante cualquier método reconocido en la técnica, incluidos, sin carácter limitante, el enlace de aldehído/Schiff , enlace de sulfhidrilo, enlace lábil en medio ácido, enlace de cis-aconitilo, enlace de hidrazona, enlace degradable enzimáticamente (remítase, en general, a Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171). Remítase también, por ejemplo, a Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery" , en Controlled Drug Delivery (2.a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" , en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985) y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119. En modalidades preferidas, un modulador de SEZ6 que está conjugado con un resto terapéutico o agente citotóxico puede ser internalizado por una célula al unirse a una molécula de SEZ6 asociada con la superficie celular y de este modo se libera la carga útil terapéutica.

C . Modificadores biocompatibles En modalidades seleccionadas, los moduladores de la invención se pueden conjugar o asociar de otro modo con modificadores biocompatibles que se pueden utilizar para ajustar, alterar, mejorar o moderar las características de los moduladores según se desee. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos o constructos de fusión con semividas in vivo mayores mediante la adhesión de moléculas poliméricas de peso molecular relativamente alto tales como polietilenglicol (PEG) comercializado o polímeros biocompatibles similares. Los expertos en la técnica apreciarán que el PEG se puede obtener con muchos pesos moleculares y configuraciones moleculares diferentes que se pueden seleccionar para conferir propiedades específicas al anticuerpo (por ejemplo, la semivida se puede adaptar a unas necesidades particulares) . El PEG se puede enlazar con moduladores, o fragmentos o derivados de anticuerpo con o sin un conector multifuncional , ya sea mediante la conjugación específica para el sitio del PEG con el N- o C- terminal de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, o a través de grupos amino épsilon presentes en residuos de lisina. Se puede utilizar una derivatización con polímeros lineales o ramificados que produzca una pérdida de actividad biológica mínima. El grado de conjugación se puede monitorizar estrechamente por SDS-PAGE y espectrometría de masas para garantizar que la conjugación entre las moléculas de PEG y las moléculas de anticuerpo sea óptima. El PEG sin reaccionar se puede separar de los conjugados de anticuerpo-PEG mediante, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaños o de intercambio iónico. De forma análoga, los moduladores descritos se pueden conjugar con albúmina para hacer que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo sea más estable in vivo o para que tenga una semivida más prolongada in vivo. Las técnicas son muy conocidas en la materia, remítase, por ejemplo, a las publicaciones internacionales Nos. WO 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137; y la patente europea No. 0,413,622. Otros conjugados biocompatibles serán evidentes para los expertos y se podrán identificar fácilmente de acuerdo con los principios de la presente.

D . Agentes de diagnóstico o detección En otras modalidades preferidas, se conjugan moduladores de la presente invención, o fragmentos o derivados de estos, con un agente de diagnóstico o detectable, un marcador o indicador que puede ser, por ejemplo, una molécula biológica (por ejemplo, un péptido o nucleótido) , una molécula de bajo peso molecular, un fluoróforo o un radioisótopo. Los moduladores marcados pueden ser útiles para monitorizar el desarrollo o el avance de un trastorno hiperproliferativo o como parte de un procedimiento de un estudio clínico para determinar la eficacia de una terapia particular que incluya los moduladores descritos (es decir, teragnóstico) o para determinar un curso de tratamiento futuro. Tales marcadores o indicadores también pueden ser útiles para purificar el modulador seleccionado, analizar el modulador (por ejemplo, la unión al epítopo o la clasificación en secciones del anticuerpo) , separar o aislar TIC, o en procedimientos preclínicos o estudios toxicológicos .

El análisis de diagnóstico y/o detección se puede conseguir acoplando el modulador a sustancias detectables que incluyen, sin carácter limitante, diversas enzimas que comprenden, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos tales como, sin carácter limitante, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes tales como, sin carácter limitante, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminofluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes tales como, sin carácter limitante, luminol ; materiales bioluminescentes tales como, sin carácter limitante, luciferasa, luciferina y aecuorina; materiales radioactivos tales como, sin carácter limitante, yodo (131I, 125? , 123I, 121I,), carbono (14C) , azufre (35S) , tritio (3H) , indio (11In, 113In, 112In( l In, ) y tecnecio (99Tc), talio ( 01Ti) , galio (68Ga, 67Ga) , paladio (103Pd) , molibdeno (99Mo) , xenón (133Xe) , flúor (18F) , 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Estaño; metales emisores de positrones utilizando diversas tomografías de emisión de positrones, iones metálicos paramagnéticos no radioactivos y moléculas que están radiomarcadas o conjugadas con radioisótopos específicos. En tales modalidades, la metodología de detección adecuada es muy conocida en la técnica y se puede acceder a ella fácilmente a través de numerosos proveedores comerciales .

Como se ha indicado anteriormente, en otras modalidades, los moduladores o fragmentos de estos se pueden fusionar o conjugar con secuencias o compuestos marcadores, tales como un péptido o fluoróforo, para facilitar su purificación o procedimientos de diagnóstico o analíticos tales como la inmunohistoquimica, interferometría de biocapa, resonancia de plasmones superficiales, citometría de flujo, ELISA competitivo, FACs, etc. En modalidades preferidas, el marcador comprende un marcador His tal como el proporcionado por el vector pQE (Qiagen) , entre otros, muchos de los cuales se comercializan. Otros marcadores peptídicos útiles para la purificación incluyen, sin carácter limitante, el marcador hemaglutinínico "HA" , que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37:767), y el marcador "flag" (patente de EE. UU. No. 4.703.004) .

E . Restos terapéuticos Como se ha indicado previamente, los moduladores, o fragmentos o derivados de estos también se pueden conjugar, enlazar, fusionar o asociar de otro modo con un "resto terapéutico" o "fármaco" tal como un agente antiproliferativo o anticanceroso que incluye, sin carácter limitante, agentes citotóxicos, agentes citostáticos , agentes antiangiogénicos, agentes citorreductores , agentes quimioterapéuticos , radioterapia y agentes radioterapéuticos , agentes anticancerosos dirigidos, BRM, anticuerpos terapéuticos, vacunas contra el cáncer, citocinas, terapias hormonales, terapia de radiación, y agentes antimetastásicos y agentes inmunoterapéuticos .

Los agentes anticancerosos ilustrativos preferidos incluyen citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracina, maitansinoides tales como DM-1 y DM-4 (Immunogen, Inc.), diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, epirrubicina y ciclofosfamida, y análogos y homólogos de estos. Las citotoxinas compatibles adicionales comprenden dolastatinas y auristatinas , incluidas la monometilauristatina E (????) y la monometilauristatina F (MMAF) (Seattle Genetics, Inc.), amanitinas tales como alfa-amanitina, beta-amanitina, gamma-amanitina o épsilon-amanitina (Heidelberg Pharma AG) , agentes de unión al surco menor del ADN tales como derivados de duocarmicina (Syntarga, B.V.) y dímeros pirrolobenzodiazepínicos modificados (Spirogen, Ltd.), inhibidores del corte y empalme tales como análogos o derivados de meayamicina (por ejemplo, FR901464 tal como se expone en la patente de EE. UU. No. 7,825,267), agentes de unión tubulares tales como los análogos de epotilona y paclitaxel, y agentes que dañan el ADN tales como calicheamicinas y esperamicinas . Además, en ciertas modalidades, los moduladores de SEZ6 de la presente invención se pueden asociar con moléculas de unión a anti-CD3 para reclutar linfocitos T citotóxicos y hacer que ataquen a las células iniciadoras de tumores (tecnología BiTE; remítase, por ejemplo, a Fuhrmann, S. et al., Congreso anual de la AACR, Resumen No. 5625 (2010) que se incorpora a la presente por referencia) .

Otros agentes anticancerosos compatibles adicionales incluyen, sin carácter limitante, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracildecarbazina) , agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU) , busulfán, dibromomanitol , estreptozotocina y cisdiclorodiaminoplatino (II) (DDP, cisplatino) , antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina y antramicina (AMC) ) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) . Se puede encontrar una lista más exhaustiva de restos terapéuticos en la publicación de PCT WO 03/075957 y la patente de EE. UU. No. 2009/0155255, cada una de las cuales se incorpora a la presente por referencia.

Como se ha indicado anteriormente, ciertas modalidades seleccionadas de la presente invención se refieren a moduladores de SEZ6 conjugados tales como conjugados de anticuerpo anti-SEZ6- fármaco que comprenden pirrolobenzodiazepina (PBD) como agente citotóxico. Se apreciará que las PBD son agentes alquilantes que ejercen actividad antitumoral al unirse covalentemente al ADN en el surco menor e inhibir la síntesis de ácido nucleico. A este respecto, se ha demostrado que las PBD poseen propiedades antitumorales potentes a la vez que exhiben una mielodepresión mínima. Las PBD compatibles con la presente invención se pueden unir al modulador de SEZ6 utilizando cualquiera de los diversos tipos de conector (por ejemplo, un conector peptidílico que comprende un resto meleimido con un sulfhidrilo libre) y, en ciertas modalidades, están en forma dimérica (es decir, dímeros de PBD) . Algunas PBD compatibles (y conectores opcionales) que se pueden conjugar con los moduladores expuestos se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. Nos. 6,362,331, 7,049,311, 7,189,710, 7,429,658, 7,407,951, 7,741,319, 7,557,099, 8,034,808, 8,163,736, la patente de EE. UU. No. 2011/0256157, y las presentaciones de PCT WO2011/130613 , WO2011/128650 y WO2011/130616 , cada una de las cuales se incorpora a la presente por referencia. Por consiguiente, en modalidades particularmente preferidas, el modulador comprenderá un anticuerpo anti-SEZ6 conjugado o asociado con uno o más dímeros de PBD (es decir, un ADC de SEZ6-PBD) .

En modalidades particularmente preferidas, las PBD compatibles que se pueden conjugar con los moduladores expuestos se describen en la patente de EE. UU. No. 2011/0256157. En esta exposición, puede que se prefieran los dímeros de PBD, es decir, aquellos que comprenden dos restos de PBD. Por lo tanto, los conjugados preferidos de la presente invención son aquellos de fórmula (AB) o (AC) : donde : las líneas punteadas indican la presencia opcional de un doble enlace entre Cl y C2 o entre C2 y C3; R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y además se selecciona opcionalmente entre halo o dihalo; donde RD se selecciona independientemente entre R, C02R, COR, CHO, C02H y halo; R6 y R9 se seleccionan independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02 , Me3Sn y halo; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02 , Me3Sn y halo; R10 es un conector que está conectado a un modulador, o fragmento o derivado de este, tal como se ha descrito anteriormente ; Q se selecciona independientemente entre O, S y NH; R11 es H o R o, cuando Q es 0, S03M, donde M es un catión metálico; R y R' se seleccionan cada uno independientemente entre grupos alquilo Ci.i2, heterociclilo C3-2o y arilo C5-2o opcionalmente sustituidos y, opcionalmente en lo que respecta al grupo NRR' , R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están enlazados forman un anillo heterocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido; y donde R2" , Rs" , R7", R9" , X", Q" y R11" son como se han definido de acuerdo con R2, R6, R7, R9, X, Q y R11 respectivamente, y Rc es un grupo desactivante.

Doble enlace En una modalidad, no hay ningún doble enlace presente entre Cl y C2 , ni entre C2 y C3.

En una modalidad, las líneas punteadas indican la presencia opcional de un doble enlace entre C2 y C3, como se muestra a continuación: En una modalidad, hay un doble enlace presente entre C2 y C3 cuando R2 es arilo C5-2o o alquilo Ci-i2.

En una modalidad, las líneas punteadas indican la presencia opcional de un doble enlace entre Cl y C2 , como se muestra a continuación: En una modalidad, hay un doble enlace presente entre Cl y C2 cuando R2 es arilo C5-2o o alquilo Ci-i2.

En una modalidad, R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =0, =CH2, C , R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR, y además se selecciona opcionalmente entre halo o dihalo.

En una modalidad, R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, 0-S02-R, C02R y COR.

En una modalidad, R2 se selecciona independientemente entre H, =0, =CH2, R, =CH-RD y =C(RD)2.

En una modalidad, R2 es independientemente H.

En una modalidad, R2 es independientemente =0.

En una modalidad, R2 es independientemente =CH2.

En una modalidad, R2 es independientemente =CH-RD. Dentro del compuesto PBD, el grupo =CH-RD puede tener cualquiera de las configuraciones que se muestran a continuación: ( (") En una modalidad, la configuración es la configuración (I) . En una modalidad, R2 es independientemente =C(RD)2.

En una modalidad, R2 es independientemente =CF2.

En una modalidad, R2 es independientemente R.

En una modalidad, R2 es independientemente arilo C5-2o opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R2 es independientemente alquilo Ci-12 opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R2 es independientemente arilo C5_2o opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R2 es independientemente arilo C5-7 opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R2 es independientemente arilo C8_10 opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R2 es independientemente fenilo opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R2 es independientemente naftilo opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R2 es independientemente piridilo opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R2 es independientemente quinolinilo o isoquinolinilo opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R2 tiene de uno a tres grupos sustituyentes, con más preferencia por 1 y 2, y siendo los grupos con una única sustitución los más preferidos. Los sustituyentes pueden estar en cualquier posición.

Cuando R2 es un grupo arilo C5-7, un único sustituyente está preferentemente en un átomo anular que no es adyacente al enlace con la parte remanente del compuesto, es decir, está preferentemente en ß o ? respecto al enlace con la parte remanente del compuesto. Por lo tanto, cuando el grupo arilo C5-7 es fenilo, el sustituyente está preferentemente en las posiciones meta o para y más preferentemente está en la posición para.

En una modalidad, R2 se selecciona entre: donde el asterisco indica el punto de unión.

Cuando R2 es un grupo arilo C8-10, por ejemplo, quinolinilo o isoquinolinilo, puede tener cualquier número de sustituyentes en cualquier posición de los anillos quinolínicos o isoquinolínicos . En algunas modalidades, tiene uno, dos o tres sustituyentes, y estos pueden estar en el anillo próximo o distante o en ambos (si hay más de un sustituyente) .

En una modalidad, cuando R2 está opcionalmente sustituido, los sustituyentes se seleccionan entre los sustituyentes que se mencionan más adelante en la sección de los sustituyentes.

Cuando R está opcionalmente sustituido, los sustituyentes se seleccionan preferentemente entre: Halo, Hidroxilo, Éter, Formilo, Acilo, Carboxi, Ester, Aciloxi, Amino, Amido, Acilamido, Aminocarboniloxi , Ureido, Nitro, Ciano y Tioéter.

En una modalidad, cuando R o R2 está opcionalmente sustituido, los sustituyentes se seleccionan del grupo constituido por R, OR, SR, NRR' , N02, halo, C02R, COR, CONH2, CONHR y CONRR' .

Cuando R2 es alquilo Ci-i2, el sustituyente opcional puede incluir además grupos heterociclilo C3-2o y arilo C5-20.

Cuando R2 es heterociclilo C3-20, el sustituyente opcional puede incluir además grupos alquilo Ci-12 y arilo C5-20.

Cuando R2 es un grupo arilo C5-2o/ el sustituyente opcional puede incluir además grupos heterociclilo C3-20 y alquilo Cx-i2.

Se sobreentiende que el término "alquilo" abarca las subclases alquenilo y alquinilo así como también cicloalquilo . Por lo tanto, cuando R2 es alquilo Ci_12 opcionalmente sustituido, se sobreentiende que el grupo alquilo contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces carbono-carbono, que pueden formar parte de un sistema conjugado. En una modalidad, el grupo alquilo Ci_i2 opcionalmente sustituido contiene al menos un doble o triple enlace carbono-carbono, y este enlace está conjugado con un doble enlace presente entre Cl y C2 o entre C2 y C3. En una modalidad, el grupo alquilo Ci-i2 es un grupo seleccionado entre alquilo C1-12, alquenilo C2-i2, alquinilo C2-i2 y cicloalquilo C3-12 saturado.

Si un sustituyente de R2 es halo, será preferentemente F o Cl, más preferentemente Cl .

Si un sustituyente de R2 es éter, en algunas modalidades puede ser un grupo alcoxi, por ejemplo, un grupo alcoxi Ci_7 (por ejemplo, metoxi, etoxi) o, en algunas modalidades, puede ser un grupo ariloxi C5.7 (por ejemplo, fenoxi, piridiloxi, furaniloxi) .

Si un sustituyente de R2 es alquilo C1-7, puede ser preferentemente un grupo alquilo C1-4 (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo) .

Si un sustituyente de R2 es heterociclilo C3-7, en algunas modalidades puede ser un grupo heterociclilo C6 que contiene nitrógeno, por ejemplo, morfolino, tiomorfolino, piperidinilo, piperazinilo. Estos grupos pueden estar enlazados a la parte remanente del resto de PBD a través del átomo de nitrógeno. Estos grupos además pueden estar sustituidos, por ejemplo, con grupos alquilo C!_4.

Si un sustituyente de R2 es bis (oxialquileno C1-3) , este será preferentemente bis (oximetileno) o bis (oxietileno) .

Los sustituyentes particularmente preferidos para R2 incluyen metoxi, etoxi, fluoro, cloro, ciano, bis (oximetileno) , metilpiperazinilo, morfolino y metiltienilo .

Los grupos R2 sustituidos particularmente preferidos incluyen, sin carácter limitante, 4-metoxifenilo, 3-metoxifenilo, 4-etoxifenilo, 3-etoxifenilo, 4-fluorofenilo, 4-clorofenilo, 3 , 4 -bis (oximetilen) fenilo, 4-metiltienilo, 4-cianofenilo, 4 -fenoxifenilo, quinolin-3-ilo y quinolin-6-ilo, isoquinolin-3-ilo e isoquinolin-6-ilo, 2-tienilo, 2-furanilo, metoxinaftilo y naftilo.

En una modalidad, R2 es halo o dihalo. En una modalidad, R2 es -F o -F2, tales sustituyentes se ilustran a continuación como (III) y (IV) respectivamente: (III) (IV) R° En una modalidad, RD se selecciona independientemente entre R, C02R, COR, CHO, C02H y halo.

En una modalidad, RD es independientemente R.

En una modalidad, RD es independientemente halo.

En una modalidad, R6 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02 , Me3Sn- y Halo.

En una modalidad, R6 se selecciona independientemente entre H, OH, OR, SH, NH2, N02 y Halo.

En una modalidad, R6 se selecciona independientemente entre H y Halo.

En una modalidad, R6 es independientemente H.

En una modalidad, R6 y R7 forman juntos un grupo -0-(CH2)p-0-, donde p es 1 o 2.

R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, 0R, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn y halo.

En una modalidad, R7 es independientemente 0R.

En una modalidad, R7 es independientemente 0R7A, donde R7A es independientemente alquilo Ci-6 opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R7A es independientemente alquilo Ci-6 saturado opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R7A es independientemente alquenilo C2-4 opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R7A es independientemente Me.

En una modalidad, R7A es independientemente CH2Ph.

En una modalidad, R7A es independientemente alilo.

En una modalidad, el compuesto es un dímero donde los grupos R7 de cada monómero forman juntos un puente dimérico de fórmula X-R"-X que conecta los monómeros.

En una modalidad, el compuesto es un dímero donde los grupos R8 de cada monómero forman juntos un puente dimérico de fórmula X-R"-X que conecta los monómeros.

En una modalidad, R es independientemente OR , donde R8A es independientemente alquilo Ci-4 opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R8A es independientemente alquilo Ci-6 saturado opcionalmente sustituido o alquenilo C2-4 opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R8A es independientemente Me.

En una modalidad, R8A es independientemente CH2Ph.

En una modalidad, R8A es independientemente alilo.

En una modalidad, R8 y R7 forman juntos un grupo -0- (CH2)p-0-, donde p es 1 o 2.

En una modalidad, R8 y R9 forman juntos un grupo -0- (CH2)p-0-, donde p es 1 o 2.

R_ En una modalidad, R9 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn- y Halo.

En una modalidad, R9 es independientemente H.

En una modalidad, R9 es independientemente R u OR.

R y R' En una modalidad, R se selecciona independientemente entre grupos alquilo Ci-i2, heterociclilo C3_2o y arilo C5-2o opcionalmente sustituidos. Estos grupos se definen cada uno más adelante en la sección de los sustituyentes .

En una modalidad, R es independientemente alquilo Ci-i2 opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R es independientemente heterociclilo C3-20 opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R es independientemente arilo C5_2o opcionalmente sustituido.

En una modalidad, R es independientemente alquilo C1-12 opcionalmente sustituido.

Anteriormente en relación con R2 se han descrito diversas modalidades referentes a grupos alquilo y arilo preferidos, y la identidad y el número de sustituyentes opcionales. Las preferencias indicadas para R2 al aplicarse a R son aplicables, cuando proceda, a todos los demás grupos R, por ejemplo, cuando R6, R7, R8 o R9 es R.

Las preferencias para R también se aplican a R' .

En algunas modalidades de la invención, se proporciona un compuesto que tiene el grupo sustituyente -NRR' . En una modalidad, R y R' junto con el átomo de nitrógeno al cual están enlazados forman un anillo heterocíclico de 4 , 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido. El anillo puede contener otro heteroátomo, por ejemplo, N, 0 o S.

En una modalidad, el propio anillo heterocíclico está sustituido con un grupo R. Cuando hay otro heteroátomo de N presente, el sustituyente puede estar en el heteroátomo de N.

R^_ R" es un grupo alquileno C3-i2, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo, O, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo, benceno o piridina, donde tales anillos están opcionalmente sustituidos .

En una modalidad, R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, por ejemplo, benceno o piridina.

En una modalidad, el grupo alquileno está interrumpido opcionalmente por uno o más heteroátomos seleccionados entre O, S y NMe y/o anillos aromáticos, donde tales anillos están opcionalmente sustituidos.

En una modalidad, el anillo aromático es un grupo arileno C5.2o/ donde el arileno se refiere a un resto divalente obtenido al eliminar dos átomos de hidrógeno de dos átomos anulares aromáticos de un compuesto aromático, donde el resto contiene de 5 a 20 átomos anulares.

En una modalidad, R" es un grupo alquileno C3-i2, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo, 0, S, N(H) , NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo, benceno o piridina, donde tales anillos están opcionalmente sustituidos con NH2.

En una modalidad, R" es un grupo alquileno C3-i2.

En una modalidad, R" se selecciona entre un grupo alquileno C3, C5, C7, C9 y Cu.

En una modalidad, R" se selecciona entre un grupo alquileno C3, C5 y C7.

En una modalidad, R" se selecciona entre un grupo alquileno C3 y C5.

En una modalidad, R" es un grupo alquileno C3.

En una modalidad, R" es un grupo alquileno C5.

Los grupos alquileno enumerados anteriormente pueden estar opcionalmente interrumpidos por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, por ejemplo, benceno o piridina, donde tales anillos están opcionalmente sustituidos.

Los grupos alquileno enumerados anteriormente pueden estar opcionalmente interrumpidos por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, por ejemplo, benceno o piridina.

Los grupos alquileno enumerados anteriormente pueden ser grupos alquileno alifáticos lineales no sustituidos.

X En una modalidad, X se selecciona entre 0, S o N(H) .

Preferentemente, X es 0.

Preferentemente, los conectores compatibles tales como los que se han descrito anteriormente unen un modulador de SEZ6 (CBA/Ab/M) con un resto D correspondiente a un fármaco PBD a través de uno o más enlaces covalentes en la posición de R10 (es decir, N10) . El conector es un resto bifuncional o multifuncional que se puede utilizar para unir uno o más restos correspondientes a un fármaco (D) y un modulador (preferentemente un anticuerpo) para formar conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) . El conector (L) puede ser estable fuera de una célula, es decir, extracelular, o puede ser escindido por acción de una enzima, hidrólisis u otras condiciones metabólicas. Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) se pueden preparar convenientemente utilizando un conector que tenga una funcionalidad reactiva para unir el resto correspondiente al fármaco con el anticuerpo. Un tiol de una cisteína o una amina, por ejemplo, el N- terminal o una cadena lateral de un aminoácido tal como la lisina, del anticuerpo (Ab) puede formar un enlace con un grupo funcional de un conector o reactivo espaciador, el resto (D) correspondiente al fármaco PBD o el fármaco-reactivo conector (D-L) .

Muchos grupos funcionales del conector enlazado en la posición N10 del resto de PBD pueden ser útiles para la reacción con el agente de unión celular. Por ejemplo, se pueden formar enlaces de tipo éster, tioéster, amida, tioamida, carbamato, tiocarbamato, urea, tiourea, éter, tioéter o disulfuro por reacción de los intermedios de conector-fármaco PBD y el agente de unión celular.

En otra modalidad, el conector puede estar sustituido con grupos que modulen la agregación, solubilidad o reactividad. Por ejemplo, un sustituyente sulfonato puede incrementar la hidrosolubilidad del reactivo y facilitar la reacción de acoplamiento del reactivo conector con el anticuerpo o el resto correspondiente al fármaco, o facilitar la reacción de acoplamiento de Ab-L con D o D-L con Ab, dependiendo de la ruta sintética empleada para preparar el ADC.

En una modalidad preferida, R10 es un grupo: donde el asterisco indica el punto de unión con la posición N10, CBA es un agente de unión celular/modulador, L1 es un conector, A es un grupo conector que conecta L1 con el agente de unión celular, L2 es un enlace covalente o junto con -OC(=0)- forma un conector autodestructivo, y L1 o L2 es un conector escindible.

L1 es preferentemente el conector escindible y se puede considerar el detonante de la activación del conector para su escisión .

Como se ha indicado anteriormente en la sección de los conectores, la naturaleza de L1 y L2, cuando estén presentes, puede variar mucho. Estos grupos se eligen dependiendo de sus características de escisión, que pueden venir dictadas por las condiciones en el sitio en el que se suministre el conjugado. Se prefieren aquellos conectores que son escindidos por acción de enzimas, aunque también se pueden utilizar conectores que pueden ser escindidos por cambios en el H (por ejemplo, lábiles en medio ácido o básico) , la temperatura o por irradiación (por ejemplo, fotolábiles) . Los conectores que se pueden escindir en condiciones reductoras u oxidantes también pueden ser útiles en la presente invención.

L1 puede comprender una secuencia contigua de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos puede ser el sustrato diana de la escisión enzimática, lo cual permite liberar así R10 de la posición N10.

En una modalidad, L1 puede ser escindido por acción de una enzima. En una modalidad, la enzima es una esterasa o una peptidasa .

En una modalidad, L2 está presente y junto con -C(=0)0-forma un conector autodestructivo . En una modalidad, L2 es un sustrato de la actividad enzimática, lo cual permite liberar así R10 de la posición N10.

En una modalidad, donde L1 puede ser escindido por acción de una enzima y L2 está presente, la enzima escinde el enlace entre L1 y L .

En lo que respecta al enlace del conector elegido a una PBD seleccionada, el grupo R se puede eliminar de la posición N10 de ciertos restos de PBD para obtener un enlace imínico N10-C11, una carbinolamina, una carbinolamina sustituida, cuando QR11 es 0S03M, un aducto de bisulfito, una tiocarbinolamina, una tiocarbinolamina sustituida o una carbinalamina sustituida.

En una modalidad, Rc puede ser un grupo protector que se puede eliminar para obtener un enlace imínico N10-C11, una carbinolamina, una cabinolamina sustituida o, cuando QR11 es OSO3M, un aducto de bisulfito. En una modalidad, Rc es un grupo protector que se puede eliminar para obtener un enlace imínico N10-C11.

Se pretende que el grupo Rc se pueda eliminar en las mismas condiciones que las requeridas para eliminar el grupo R10, por ejemplo, para obtener un enlace imínico N10-C11, una carbinolamina, etc. El grupo desactivante actúa como grupo protector para la funcionalidad deseada en la posición N10. Se pretende que el grupo desactivante no sea reactivo respecto a un agente de unión celular. Por ejemplo, Rc no es el mismo que RL.

Los compuestos que tienen un grupo desactivante se pueden utilizar como intermedios en la síntesis de dímeros que tengan un monómero imínico. Como alternativa, los compuestos que tienen un grupo desactivante se pueden utilizar como conjugados, donde el grupo desactivante se elimina en la posición diana para obtener una imina, una carbinolamina, una carbinolamina sustituida, etc. Por lo tanto, en esta modalidad, el grupo desactivante se puede denominar grupo protector de nitrógeno que se puede eliminar terapéuticamente, tal como se define en WO 00/12507.

En una modalidad, el grupo Rc se puede eliminar en las condiciones que escinden el conector RL del grupo R10. Así pues, en una modalidad, el grupo desactivante puede ser escindido por acción de una enzima.

En una modalidad alternativa, el grupo desactivante se puede escindir antes de conectar el conector RL con el modulador. En esta modalidad, el grupo desactivante se puede eliminar en condiciones que no escinden el conector RL.

Cuando un compuesto incluye un grupo funcional G1 para formar una conexión con el agente de unión celular, el grupo desactivante se puede eliminar antes de añadir o desenmascarar G1.

El grupo desactivante se puede utilizar como parte de una estrategia de protección de grupos para garantizar que solamente una de las unidades monoméricas de un dímero se conecte a un agente de unión celular.

El grupo desactivante se puede utilizar como enmascarante para un enlace imínico N10-C11. El grupo desactivante se puede eliminar en el momento en el que se necesite la funcionalidad imina en el compuesto. El grupo desactivante también es un enmascarante para una carbinolamina, una carbinolamina sustituida y un aducto de bisulfito, tal como se ha descrito anteriormente.

En una modalidad, Rc es un grupo protector de tipo carbamato.

En una modalidad, el grupo protector de tipo carbamato se selecciona entre: Alloe, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz y PNZ.

Opcionalmente, el grupo protector de tipo carbamato se selecciona además entre Moc .

En una modalidad, Rc es un grupo conector RL que carece del grupo funcional para la conexión con el agente de unión celular.

Esta solicitud se refiere en particular a los grupos Rc que son carbamatos .

En una modalidad, Rc es un grupo: donde el asterisco indica el punto de unión con la posición N10, G2 es un grupo terminal, L3 es un enlace covalente o un conector escindible L1, L2 es un enlace covalente o junto con OC(=0) forma un conector autodestructivo.

Cuando L3 y L2 son ambos enlaces covalentes, G2 y 0C(=0) forman juntos un grupo protector de tipo carbamato como el que se ha definido anteriormente.

L1 es como se ha definido anteriormente en relación con R10.

L2 es como se ha definido anteriormente en relación con R10. A continuación se describen varios grupos terminales, incluidos aquellos basados en grupos protectores conocidos.

En una modalidad, L3 es un conector escindible L1, y L2 junto con OC(=0) forma un conector autodestructivo. En esta modalidad, G2 es Ac (acetilo) o Moc, o un grupo protector de tipo carbamato seleccionado entre: Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz y PNZ . Opcionalmente , el grupo protector de tipo carbamato se selecciona además entre Moc.

En otra modalidad, G2 es un grupo acilo -C(=0)G3, donde G3 se selecciona entre alquilo (incluidos cicloalquilo, alquenilo y alquinilo) , heteroalquilo, heterociclilo y arilo (incluidos heteroarilo y carboarilo) . Estos grupos pueden estar opcionalmente sustituidos. El grupo acilo junto con un grupo amino de L3 o L2, cuando proceda, puede formar un enlace amídico. El grupo acilo junto con un grupo hidroxi de L3 o L2, cuando proceda, puede formar un enlace de tipo éster.

En una modalidad, G3 es heteroalquilo. El grupo heteroalquilo puede comprender polietilenglicol . El grupo heteroalquilo puede tener un heteroátomo, tal como 0 o N, adyacente al grupo acilo, para formar así un grupo carbamato o carbonato, cuando proceda, con un heteroátomo presente en el grupo L3 o L2 , cuando proceda.

En una modalidad, G3 se selecciona entre NH2, NHR y NRR' . Preferentemente, G3 es NRR' .

En una modalidad, G2 es el grupo: donde el asterisco indica el punto de unión con L3, n es 0-6, y G4 se selecciona entre OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CO RR' , NH2, NHR, NRR' , N02 y halo. Los grupos OH, SH, H2 y HR están protegidos. En una modalidad, n es 1-6 y preferentemente n es 5. En una modalidad, G4 es OR, SR, COOR, CO H2/ CONHR, CONRR' y NRR' . En una modalidad, G4 es OR, SR y NRR' . Preferentemente, G4 se selecciona entre OR y NRR' , aún más preferentemente, G4 es OR. Aún más preferentemente, G4 es OMe.

En una modalidad, el grupo G2 es: donde el asterisco indica el punto de unión con L3, y n y G4 son como se han definido anteriormente.

En una modalidad, el grupo G2 es: donde el asterisco indica el punto de unión con L3, n es 0 o 1, m es 0-50, y G4 se selecciona entre OH, OR, SH, SR, COOR, C0NH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', N02 y halo. En una modalidad preferida, n es 1 y m es 0-10, 1-2, preferentemente 4-8 y aún más preferentemente 4 u 8. En otra modalidad, n es 1, m es 10-50 y preferentemente 20-40. Los grupos OH, SH, NH2 y NHR están protegidos. En una modalidad, G4 es OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR' y NRR' . En una modalidad, G4 es OR, SR y NRR' . Preferentemente, G4 se selecciona entre OR y NRR' , aún más preferentemente, G4 es OR. Preferentemente, G4 es OMe.

En una modalidad, el grupo donde el asterisco indica el punto de unión con L3, y n, m y G4 son como se han definido anteriormente.

En una modalidad, el grupo G2 es: donde n es 1-20, m es 0-6, y G4 se selecciona entre OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR' , NH2, NHR, NRR' , N02 y halo. En una modalidad, n es 1-10. En otra modalidad, n es 10-50 y preferentemente 20-40. En una modalidad, n es 1. En una modalidad, m es 1. Los grupos OH, SH, NH2 y NHR están protegidos. En una modalidad, G4 es OR, SR, COOR, C0NH2, CONHR, CONRR' y NRR' . En una modalidad, G4 es OR, SR y NRR' . Preferentemente, G4 se selecciona entre OR y NRR' , aún más preferentemente, G4 es OR. Preferentemente, G4 es OMe .

En una modalidad, el grupo G2 es: donde el asterisco indica el punto de unión con L3, y n, m y G4 son como se han definido anteriormente.

En cada una de las modalidades anteriores, G4 puede ser OH, SH, NH2 y NHR. Estos grupos están preferentemente protegidos .

En una modalidad, OH está protegido con Bzl, TBDMS o TBDPS .

En una modalidad, SH está protegido con Acm, Bzl, Bzl- OMe, Bzl-Me o Trt .

En una modalidad, NH2 o NHR están protegidos con Boc, Moc, Z-Cl, Fmoc, Z o Alloe.

En una modalidad, el grupo G2 está presente combinado con un grupo L3 , donde el grupo es un dipéptido.

El grupo desactivante no está destinado a la conexión con el modulador. Por lo tanto, el otro monómero presente en el dímero actúa como punto de conexión con el modulador a través de un conector. Por consiguiente, se prefiere que la funcionalidad presente en el grupo desactivante no esté disponible para reaccionar con un modulador. Por tanto, preferentemente se evitan grupos funcionales tales como OH, SH, NH2, COOH. Sin embargo, la funcionalidad puede estar presente en el grupo desactivante si está protegida, como se ha descrito anteriormente.

Así pues, de acuerdo con los principios de la presente, una modalidad de la invención comprende un conjugado que comprende un compuesto : donde CBA es un agente de unión celular/modulador y n es 0 o 1. L1 es como se ha definido previamente, y RE y RE" se seleccionan cada uno independientemente entre H o RD.

En otra modalidad, el conjugado comprende un compuesto: donde CBA es un agente de unión celular/modulador, L1 es como se ha definido previamente, Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente arilo C5-2o opcionalmente sustituido, y n es 0 o 1.

Los expertos en la técnica apreciarán que otros dítneros de PBD simétricos y asimétricos y conectores son compatibles con la presente invención, y estos se podrían seleccionar sin necesidad de demasiada experimentación sobre la base de los principios de la presente y la técnica anterior.

Otro aspecto de la invención incluye ADC que comprenden radioisótopos. Los radioisótopos ilustrativos que pueden ser compatibles con tales modalidades incluyen, sin carácter limitante, yodo (131I, 125? , 123I, 121I,), carbono (1C) , cobre (62Cu, 6Cu, 67Cu) , azufre (35S) , tritio (3H) , indio (115In, 113In, 112In, 11:LIn,), bismuto (21Bi, 213Bi) , tecnecio (99Tc) , talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga) , paladio (103Pd) , molibdeno ("Mo) , xenón (133Xe) , flúor (18F) , 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142 Pr, 105Rh, 97Ru, e8Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 3P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 117Sn, 225Ac, 76Br y 211At . También se dispone de otros radionucleidos como agentes terapéuticos y de diagnóstico, especialmente aquellos comprendidos en el intervalo de energía de 60 a 4000 keV. Dependiendo de la afección que se deba tratar y el perfil terapéutico deseado, los expertos en la técnica podrán seleccionar fácilmente el radioisótopo adecuado para utilizar con los moduladores descritos.

Los moduladores de SEZ6 de la presente invención también se pueden conjugar con un resto terapéutico o fármaco que modifique una respuesta biológica determinada (por ejemplo, modificadores de la respuesta biológica o BRM) . Es decir, no se debe interpretar que los agentes o restos terapéuticos compatibles con la presente invención se limiten a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, en modalidades particularmente preferidas, el resto correspondiente al fármaco puede ser una proteína o polipéptido o fragmento de estos que posea una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, Onconasa (u otra RNasa citotóxica) , exotoxina de Pseudomonas, toxina colérica o toxina diftérica; una proteína tal como el factor de la necrosis tumoral, a-interferón, ß-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador tisular del plasminógeno, un agente apoptótico, por ejemplo, TNF- , TNF-ß, AIM I (remítase a la publicación internacional No. O 97/33899) , AIM II (remítase a la publicación internacional No. WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi et al., 1994, J. Immunol . , 6:1567) y VEGI (remítase a la publicación internacional No. WO 99/23105) , un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interleucina-1 ("IL-l"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6") , factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos ("GM-CSF") y factor de estimulación de colonias de granulocitos ("G-CSF")), o un factor de crecimiento (por ejemplo, hormona del crecimiento {"GH" )) . Como se ha expuesto anteriormente, en la técnica se conocen métodos para fusionar o conjugar moduladores con restos polipeptídicos . Además de las referencias en cuestión descritas anteriormente, remítase, por ejemplo, a las patentes de EE . UU. Nos. 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851 y 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; las publicaciones de PCT WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535; Zheng et al., 1995, J I munol 154:5590; y Vil et al., 1992, PNAS USA 89:11337, cada uno de los cuales se incorpora a la presente por referencia. Es más, como se ha expuesto anteriormente, no se requiere que la asociación de un modulador con tales restos sea necesariamente directa, sino que puede tener lugar a través de secuencias conectoras . Como se ha indicado anteriormente, tales moléculas conectoras normalmente se conocen en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cáncer Res 4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10:553; Zimmerman et al., 1999, Nucí Med Biol 26:943; Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171, cada uno de los cuales se incorpora a la presente por referencia.

IX . Diagnósticos y cribado A. Diagnósticos En otras modalidades más, la invención proporciona métodos in vitro o in vivo para detectar, diagnosticar o monitorizar trastornos proliferativos y métodos para cribar células de un paciente con el fin de identificar células tumorigénicas , incluidas las CSC. Tales métodos incluyen la identificación de un individuo que padece cáncer para tratar o monitorizar el avance de un cáncer que comprende poner en contacto al paciente o una muestra obtenida a partir del paciente (es decir, ya sea in vivo o in vitro) con un modulador como los descritos en la presente y detectar la presencia o ausencia, o el nivel de asociación del modulador con moléculas diana ligadas o libres en la muestra. En modalidades particularmente preferidas, el modulador comprenderá un marcador detectable o molécula indicadora como los descritos en la presente.

En algunas modalidades, la asociación del modulador, tal como un anticuerpo, con células particulares en la muestra denota probablemente que la muestra puede contener CSC, lo cual indica que el individuo que padece cáncer puede tratarse de forma eficaz con un modulador como los que se describen en la presente. Los métodos pueden comprender además un paso de comparación del nivel de unión con un control . Por el contrario, cuando el modulador sea un constructo de Fe, las propiedades de unión se pueden aprovechar y monitorizar (directa o indirectamente, in vivo o in vitro) cuando esté en contacto con la muestra para proporcionar la información deseada .

Los métodos de ensayo compatibles ilustrativos incluyen radioinmunoensayos , enzimoinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, inmunoensayo de fluorescencia, ensayos de inmunotransferencia, análisis por inmunotransferencia de Western, ensayos de citometría de flujo y ensayos ELISA. Los diagnósticos o teragnósticos in vivo compatibles pueden comprender técnicas de tomografía o monitorización reconocidas en la materia tales como tomografía por resonancia magnética, tomografía computarizada (por ejemplo, escaneo CAT) , tomografía de positrones (por ejemplo, escaneo PET) , radiografía, ultrasonidos, etc., como sabrán los expertos en la técnica.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para analizar el avance del cáncer y/o la patogénesis in vivo. En otra modalidad, el análisis del avance del cáncer y/o la patogénesis in vivo comprende determinar el alcance del avance del tumor. En otra modalidad, el análisis comprende identificar el tumor. En otra modalidad, el análisis del avance del tumor se lleva a cabo en el tumor primario. En otra modalidad, el análisis se lleva a cabo a lo largo del tiempo dependiendo del tipo de cáncer, como sabrá un experto en la técnica. En otra modalidad, se realiza otro análisis in vivo de los tumores secundarios que se originan a partir de células metastásicas del tumor primario. En otra modalidad, se analizan el tamaño y la forma de los tumores secundarios. En algunas modalidades, se realiza otro análisis ex vivo.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para analizar el avance del cáncer y/o la patogénesis in vivo que incluye la determinación de la metástasis celular o la detección y cuantificación del nivel de células tumorales circulantes. En otra modalidad adicional, el análisis de la metástasis celular comprende la determinación del crecimiento progresivo de células en un sitio que es discontinuo respecto al tumor primario. En otra modalidad, el sitio de análisis de la metástasis celular comprende la ruta de la dispersión neoplásica. En alguna modalidad, las células se pueden dispersar a través de la vasculatura sanguínea, los ganglios linfáticos, dentro de las cavidades corporales o combinaciones de estos. En otra modalidad, el análisis de la metástasis celular se lleva a cabo en vista de la migración, diseminación, extravasación, proliferación celular o combinaciones de estas .

Por consiguiente, en una modalidad particularmente preferida, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar para detectar y cuantificar los niveles de SEZ6 en una muestra de un paciente (por ejemplo, plasma o sangre) , que, a su vez, se puede utilizar para detectar, diagnosticar o monitorizar trastornos asociados con SEZ6, incluidos los trastornos proliferativos . En modalidades relacionadas, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar para detectar, monitorizar y/o cuantificar células tumorales circulantes in vivo o in vitro (remítase, por ejemplo, a O 2012/0128801 que se incorpora a la presente por referencia) .

En otras modalidades preferidas adicionales, las células tumorales circulantes pueden comprender células madre cancerosas .

En ciertos ejemplos, las células tumorigénicas en un sujeto o una muestra de un sujeto se pueden evaluar o caracterizar utilizando los moduladores descritos antes de la terapia o régimen para establecer un punto de referencia. En otros ejemplos, la muestra deriva de un sujeto que ha sido tratado. En algunos ejemplos, la muestra se extrae del sujeto al menos aproximadamente 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 30, 60, 90 días, 6 meses, 9 meses, 12 meses o > 12 meses después de que el sujeto comience o finalice el tratamiento. En ciertos ejemplos, las células tumorigénicas se evalúan o caracterizan después de un número determinado de dosis (por ejemplo, después de 2 , 5, 10, 20, 30 o más dosis de una terapia). En otros ejemplos, las células tumorigénicas se caracterizan o evalúan 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años o un periodo más prolongado después de haber recibido una o más terapias.

En otro aspecto y tal como se indica con más detalle posteriormente, la presente invención proporciona kits para detectar, monitorizar o diagnosticar un trastorno hiperproliferativo, identificar un individuo que padezca un trastorno de este tipo para su posible tratamiento o monitorizar el avance (o la regresión) del trastorno en un paciente, donde el kit comprende un modulador como los descritos en la presente y reactivos para detectar el impacto del modulador en una muestra.

Otro aspecto más de la presente invención comprende el uso de SEZ6 marcado para la inmunohistoquímica (IHC) . A este respecto, se puede utilizar IHC de SEZ6 como herramienta de diagnóstico para facilitar el diagnóstico de diversos trastornos proliferativos y monitorizar la respuesta potencial a tratamientos, incluida la terapia con un modulador de SEZ6. Se pueden realizar ensayos para el diagnóstico compatibles en tejidos que han sido fijados químicamente (que incluyen, sin carácter limitante: formaldehído, gluteraldehído, tetraóxido de osmio, dicromato de potasio, ácido acético, alcoholes, sales de zinc, cloruro mercúrico, tetraóxido de cromo y ácido pícrico) y embebidos (que incluyen, sin carácter limitante: metacrilato de glicol, parafina y resinas) o conservados por congelación. Tal como se indica con más detalle posteriormente, estos ensayos se podrían utilizar como guía para decisiones sobre el tratamiento y para determinar los periodos y los regímenes posológicos .

B . Cribado En ciertas modalidades, los moduladores también se pueden utilizar para cribar o identificar compuestos o agentes (por ejemplo, fármacos) que alteran una función o la actividad de células tumorigénicas o su progenie al interaccionar con un antígeno (por ejemplo, sus componentes genotípicos o fenotípicos) . Tales compuestos y agentes pueden ser fármacos potenciales que se pueden cribar para el tratamiento de un trastorno proliferativo, por ejemplo. En una modalidad, un sistema o método incluye células tumorigénicas que comprenden SEZ6 y un compuesto o agente (por ejemplo, fármaco) , donde las células y el compuesto o agente están en contacto entre sí. En tales modalidades, las células en cuestión pueden haber sido identificadas, monitorizadas y/o enriquecidas utilizando los moduladores descritos .

En otra modalidad más, un método incluye poner en contacto, directa o indirectamente, células tumorigénicas o su progenie con un agente o compuesto de prueba y determinar si el agente o compuesto de prueba modula una actividad o función de las células tumorigénicas asociadas con el antígeno. Un ejemplo de una interacción directa es la interacción física, mientras que una interacción indirecta incluye la acción de una composición sobre una molécula intermedia que, a su vez, actúa sobre la entidad de referencia (por ejemplo, célula o cultivo celular) . Las actividades o funciones ilustrativas que se pueden modular incluyen cambios en la morfología o viabilidad de las células, expresión de un marcador, diferenciación o desdiferenciación, respiración celular, actividad mitocondrial , integridad de la membrana, maduración, proliferación, viabilidad, apoptosis o muerte celular.

Los métodos para cribar e identificar agentes y compuestos incluyen aquellos adecuados para un cribado de alto rendimiento, que incluyen matrices de células (por ejemplo, micromatrices) situadas o colocadas, opcionalmente en posiciones o lugares predeterminados. Por ejemplo, las células se pueden colocar o situar (presiembra) en una cubeta, tubo, matraz, botella rotatoria o placa de cultivo (por ejemplo, una única cubeta o placa de múltiples pocilios tal como una cubeta o placa de 8, 16, 32, 64, 96, 384 y 1536 pocilios) . Los métodos de manipulación manuales o roboticos de alto rendimiento pueden sondear interacciones químicas y determinar los niveles de expresión de muchos genes en un periodo corto. Se han desarrollado técnicas que emplean señales moleculares (por ejemplo, a través de fluoróforos) y análisis automáticos que procesan información a una velocidad muy elevada (remítase, por ejemplo, a Pinhasov et al., Comb. Chem. High Throughput Screen. 7:133 (2004)). Por ejemplo, la tecnología de micromatrices se ha utilizado de forma generalizada para sondear las interacciones de miles de genes a la vez, al tiempo que se proporciona información sobre genes específicos (remítase, por ejemplo, a Mocellin y Rossi, Adv. Exp. Med. Biol . 593:19 (2007)).

Las colecciones que se pueden cribar incluyen, por ejemplo, colecciones de moléculas de bajo peso molecular, colecciones de expresión en fagos, colecciones de expresión en levaduras de anticuerpos completamente humanos (Adimab, LLC) , colecciones de ARNip y vectores de transfección adenovíricos .

X . Preparados farmacéuticos y usos terapéuticos A. Formulaciones y vías de administración Dependiendo de la forma del modulador junto con cualquier conjugado opcional, el modo de administración deseado, la enfermedad que se esté tratando o monitorizando y otras muchas variables, las composiciones de la invención se pueden formular según se desee utilizando técnicas reconocidas en la materia. En algunas modalidades, las composiciones terapéuticas de la invención se pueden administrar puras o con una cantidad mínima de componentes adicionales mientras que otras se pueden formular opcionalmente para que contengan portadores farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que son muy conocidos en la técnica (remítase, por ejemplo, a Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20.a ed. (2003); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7.a ed. , Lippencott Williams and Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipiente, 3.a ed., Pharmaceutical Press (2000)). Muchos portadores farmacéuticamente aceptables, que incluyen vehículos, adyuvantes y diluyentes, se pueden adquirir fácilmente de muchos proveedores comerciales. Es más, también se dispone de un surtido de sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes amortiguadores y reguladores del pH, agentes reguladores de la tonicidad, estabilizantes, agentes humectantes y similares. Ciertos portadores ilustrativos no limitantes incluyen solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de estos.

Más particularmente, se apreciará que, en algunas modalidades, las composiciones terapéuticas de la invención se pueden administrar puras o con una cantidad mínima de componentes adicionales. En cambio, los moduladores de SEZ6 de la presente invención se pueden formular opcionalmente para que contengan portadores f rmacéuticamente aceptables adecuados, que comprenden excipientes y auxiliares que son muy conocidos en la técnica, y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración del modulador o que ayudan a procesar los compuestos activos para obtener preparados que están farmacéuticamente optimizados para el suministro al sitio de acción. Por ejemplo, un excipiente puede conferir forma o consistencia, o actuar como diluyente para mejorar las propiedades farmacocinéticas o la estabilidad del modulador. Los excipientes o aditivos adecuados incluyen, sin carácter limitante, agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes , amortiguadores y potenciadores de la penetración cutánea. En ciertas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar en una forma liofilizada y reconstituir en, por ejemplo, solución salina amortiguada, antes de su administración.

Los moduladores descritos para la administración sistémica se pueden formular para la administración entérica, parenteral o tópica. De hecho, estos tres tipos de formulación se pueden utilizar simultáneamente para conseguir una administración sistémica del principio activo. En Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20.a Ed. Mack Publishing (2000) , se exponen tanto excipientes como formulaciones para el suministro de fármacos parenteral y no parenteral. Mack Publishing (2000). Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble , por ejemplo, sales hidrosolubles . Además, se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos según proceda para suspensiones de inyección oleosas. Los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, poli (láctido) sustituido con hexilo, aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos . Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes. También se pueden utilizar liposomas para encapsular el agente para su suministro a la célula.

Las formulaciones adecuadas para la administración entérica incluyen cápsulas de gelatina dura o blanda, pastillas, comprimidos, incluidos los comprimidos recubiertos, elixires, suspensiones, jarabes o inhalaciones y formas de liberación controlada de estos.

En general, los compuestos y las composiciones de la invención que comprenden moduladores de SEZ6 se pueden administrar in vivo a un sujeto que lo necesite, a través de diversas vías, que incluyen, sin carácter limitante, la vía oral, intravenosa, intraarterial , subcutánea, parenteral, intranasal, intramuscular, intracraneal, intracardíaca, intraventricular, intratraqueal , bucal, rectal, intraperitoneal , intradérmica, tópica, transdérmica e intratecal, o bien por implantación o inhalación. Las composiciones en cuestión se pueden formular como preparados en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas; que incluyen, sin carácter limitante, comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios, enemas, inyecciones, inhaladores y aerosoles. La formulación y la vía de administración adecuadas se pueden seleccionar según la aplicación y el régimen terapéutico deseados.

B . Dosis De forma análoga, el régimen posológico particular, es decir, la dosis, la duración y la repetición, dependerán del individuo particular y de los antecedentes médicos del individuo, así como también de consideraciones empíricas tales como las propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, semivida, tasa de depuración, etc.). La frecuencia de la administración se puede determinar y ajustar durante el curso de la terapia, y se basa en reducir el número de células tumorigénicas o proliferativas , mantener la reducción de tales células neoplásicas, reducir la proliferación de células neoplásicas o retardar el desarrollo de metástasis. En otras modalidades, la dosis administrada se puede ajustar o atenuar para controlar efectos secundarios y/o toxicidad potenciales. Como alternativa, pueden ser adecuadas las formulaciones de liberación continua prolongada de una composición terapéutica en cuestión.

En general, los moduladores de la invención se pueden administrar en diferentes intervalos. Estos incluyen de aproximadamente 10 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por dosis; de aproximadamente 50 yg/kg de peso corporal a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por dosis; de aproximadamente 100 yg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por dosis. Otros intervalos incluyen de aproximadamente 100 µg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dosis y de aproximadamente 0.5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dosis. En ciertas modalidades, la dosis es de al menos aproximadamente 100 ug/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 250 ug/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 750 yg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal.

En modalidades seleccionadas, los moduladores se administrarán en aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 yg/kg de peso corporal por dosis. Otras modalidades comprenderán la administración de moduladores en 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 yg/kg de peso corporal por dosis. En otras modalidades preferidas, los moduladores descritos se administrarán en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg. En otras modalidades adicionales, los moduladores se pueden administrar en 12, 14, 16, 18 o 20 mg/kg de peso corporal por dosis. En otras modalidades más, los moduladores se pueden administrar en 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 o 100 mg/kg de peso corporal por dosis. De acuerdo con los principios de la presente, se apreciará que las dosis mencionadas anteriormente se pueden aplicar tanto a los moduladores sin conjugar como a los moduladores conjugados con un agente citotóxico. Un experto en la técnica podría determinar fácilmente las dosis adecuadas para diversos moduladores conjugados y sin conjugar sobre la base de estudios preclínicos en animales, observaciones clínicas, y técnicas y mediciones médicas y bioquímicas estándar.

En lo que respecta a los moduladores conjugados, las modalidades particularmente preferidas comprenderán dosis de entre aproximadamente 50 g/kg y aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por dosis. A este respecto, los moduladores conjugados se pueden administrar en aproximadamente 50, 75 o 100 µg/kg, o en 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 o 1 mg/kg de peso corporal por dosis. En otras modalidades preferidas, los moduladores conjugados de la presente invención se pueden administrar en 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.25, 2.5, 2.75, 3, 3.25, 3.5, 3.75, 4, 4.25, 4.5, 4.75 o 5 mg/kg de peso corporal por dosis. En modalidades particularmente preferidas, las dosis de moduladores conjugados se administrarán por vía intravenosa durante un periodo. Es más, tales dosis se pueden administrar varias veces durante un ciclo definido del tratamiento.

Se pueden proponer otros regímenes posológicos basados en cálculos del área de la superficie corporal (BSA, por sus siglas en inglés) tal como se describe en la patente de EE. UU. No. 7.744.877. El BSA, como bien se sabe, se calcula utilizando la altura y el peso del paciente, y proporciona una medición del tamaño de un sujeto representado por el área de la superficie de su cuerpo. En ciertas modalidades, los moduladores se pueden administrar en dosis de entre 10 mg/m2 y 800 mg/m2, entre 50 mg/m2 y 500 mg/m2, y en dosis de 100 mg/m2, 150 mg/m2, 200 mg/m2, 250 mg/m2, 300 mg/m2, 350 mg/m2, 400 mg/m2 o 450 mg/m2.

También se apreciará que se pueden utilizar técnicas empíricas y reconocidas en la materia para determinar la dosis adecuada para los moduladores conjugados (es decir, ADC) .

En cualquier caso, los moduladores de SEZ6 (tanto conjugados como sin conjugar) se administran preferentemente según sea necesario a sujetos que lo necesiten. Los expertos en la técnica, tales como un médico responsable del tratamiento, podrán determinar la frecuencia de administración en función de consideraciones sobre la afección que se esté tratando, la edad del sujeto que se esté tratando, la gravedad de la afección que se esté tratando, el estado de salud general del sujeto que se esté tratando y similares. En general, se administra una dosis eficaz del modulador de SEZ6 a un sujeto una o más veces. Más particularmente, se administra una dosis eficaz del modulador al sujeto una vez al mes, más de una vez al mes o menos de una vez al mes. En ciertas modalidades, la dosis eficaz del modulador de SEZ6 se puede administrar varias veces, que incluyen durante periodos de al menos un mes, al menos seis meses, al menos un año, al menos dos años o un periodo de varios años. En otras modalidades más, pueden transcurrir varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7), varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o varios meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o incluso un año o varios años entre las administraciones de los moduladores descritos.

En ciertas modalidades preferidas, el ciclo de tratamiento en el que intervienen los moduladores conjugados comprenderá múltiples dosis del producto correspondiente al fármaco seleccionado (es decir, un ADC) durante un periodo de semanas o meses. Más específicamente, los moduladores conjugados de la presente invención se pueden administrar una vez al día, cada dos días, cada cuatro días, cada semana, cada diez días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada mes, cada seis semanas, cada dos meses, cada diez semanas o cada tres meses. A este respecto, se apreciará que las dosis se pueden alterar o el intervalo se puede ajustar en función de la respuesta del paciente y las prácticas clínicas.

Las dosis y los regímenes también se pueden determinar empíricamente para las composiciones terapéuticas descritas en individuos que han recibido una o más administraciones. Por ejemplo, se pueden administrar a los individuos dosis crecientes de una composición terapéutica producida como se describe en la presente. En modalidades seleccionadas, la dosis se puede incrementar o reducir o atenuar gradualmente basándose respectivamente en efectos secundarios o toxicidad observados o determinados empíricamente. Para evaluar la eficacia de la composición seleccionada, se puede realizar un seguimiento de un marcador de la enfermedad, trastorno o afección específico tal como se ha descrito anteriormente. En modalidades en las que el individuo padece cáncer, estos marcadores incluyen mediciones directas del tamaño del tumor por observación visual o palpación, la medición indirecta del tamaño del tumor por rayos X u otras técnicas tomográficas ; una mejora según se evalúa mediante una biopsia tumoral directa y un examen por microscopía de la muestra tumoral; la medición de un marcador tumoral indirecto (por ejemplo, PSA para el cáncer de próstata) o un antígeno identificado de acuerdo con los métodos descritos en la presente, una disminución del dolor o la parálisis; una mejora en el habla, la visión, la respiración u otra discapacidad asociada con el tumor; un mayor apetito; o un aumento de la calidad de vida según se mide mediante pruebas aceptadas o la prolongación de la supervivencia. Será evidente para un experto en la técnica que la dosis variará dependiendo del individuo, el tipo de afección neoplásica, el estadio de la afección neoplásica, si la afección neoplásica ha comenzado a metastatizarse en otras partes del cuerpo del individuo, y los tratamientos previos y concurrentes que se estén utilizando.

C . Terapias combinadas Las terapias combinadas pueden ser particularmente útiles para reducir o inhibir la proliferación no deseada de células neoplásicas, reducir la aparición del cáncer, reducir o prevenir la recidiva del cáncer, o reducir o prevenir la dispersión o metástasis del cáncer. En tales casos, los moduladores de la presente invención pueden actuar como agentes sensibilizantes o quimiosensibilizantes mediante la eliminación de las CSC, que de lo contrario mantendrían y perpetuarían la masa tumoral, y de este modo se consigue utilizar de forma más eficaz los agentes anticancerosos o citorreductores actuales empleados como estándar de atención médica. Es decir, los moduladores descritos pueden proporcionar, en ciertas modalidades, un efecto mejorado (por ejemplo, de naturaleza aditiva o sinérgica) que potencie el modo de acción de otro agente terapéutico administrado. En el contexto de la presente invención, la expresión "terapia combinada" se interpretará en un sentido amplio y se refiere simplemente a la administración de un modulador y uno o más agentes anticancerosos que incluyen, sin carácter limitante, agentes citotóxicos, agentes citostáticos , agentes antiangiogénicos, agentes citorreductores, agentes quimioterapéuticos , radioterapia y agentes radioterapéuticos , agentes anticancerosos dirigidos (que incluyen tanto anticuerpos monoclonales como entidades de bajo peso molecular) , BRM, anticuerpos terapéuticos, vacunas contra el cáncer, citocinas, terapias hormonales, terapia con radiación y agentes antimetastásicos , y agentes inmunoterapéuticos , que incluyen tanto las estrategias específicas como no específicas .

No es necesario que los resultados combinados sean aditivos respecto a los efectos observados cuando se realiza cada tratamiento (por ejemplo, anticuerpo y agente anticanceroso) por separado. Aunque por lo general sean deseables efectos al menos aditivos, cualquier incremento en el efecto antitumoral que sea superior al de las terapias individuales será beneficioso. Además, la invención no requiere que el tratamiento combinado exhiba efectos sinérgicos. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que con ciertas combinaciones seleccionadas que comprenden modalidades preferidas, se puede observar sinergia .

Al llevar a la práctica la terapia combinada, el modulador y el agente anticanceroso se pueden administrar al sujeto simultáneamente, ya sea en una única composición o como dos o más composiciones diferentes, utilizando las mismas vías de administración o vías diferentes. Como alternativa, el modulador puede preceder o seguir al tratamiento con un agente anticanceroso, por ejemplo, en intervalos que varían entre minutos y semanas . El periodo entre cada suministro es tal que al agente anticanceroso y el modulador son capaces de ejercer un efecto combinado sobre el tumor. En al menos una modalidad, tanto el agente anticanceroso como el modulador se administran en un intervalo de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente dos semanas el uno respecto al otro. En otras modalidades más, pueden transcurrir varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7), varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o varios meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre la administración del modulador y el agente anticanceroso.

La terapia combinada se puede administrar una vez, dos veces o al menos durante un periodo hasta que la afección se trate, palie o cure. En algunas modalidades, la terapia combinada se administra varias veces, por ejemplo, de tres veces al día a una vez cada seis meses. La administración se puede ajustar a un programa tal como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses o se puede administrar de forma continua a través de una minibomba . La terapia combinada se puede administrar por cualquier vía, como las indicadas anteriormente . La terapia combinada se puede administrar en un sitio distante del sitio del tumor.

En una modalidad, se administra un modulador combinado con uno o más agentes anticancerosos durante un ciclo de tratamiento corto a un sujeto que lo necesite. La invención también contempla la administración discontinua o dosis diarias divididas en varias administraciones parciales. El modulador y el agente anticanceroso se pueden administrar indistintamente, en días alternos o semanas alternas; o se puede administrar una secuencia de tratamientos con el anticuerpo, seguida de uno o más tratamientos de terapia con el agente anticanceroso. En cualquier caso, como sobreentenderán los expertos en la técnica, las dosis adecuadas de agentes quimioterapéuticos generalmente serán aproximadamente equivalentes a aquellas ya empleadas en terapias clínicas en las que se administran los agentes quimioterapéuticos solos o combinados con otros agentes quimioterapéuticos .

En otra modalidad preferida, los moduladores de SEZ6 de la presente invención se pueden utilizar en la terapia de mantenimiento para reducir o eliminar la posibilidad de recidiva tumoral después de la presentación inicial de la enfermedad. Preferentemente, el trastorno habrá sido tratado y la masa tumoral inicial habrá sido eliminada, reducida o mejorada de alguna otra forma de modo que el paciente sea asintomático o esté en remisión. En tal momento, se pueden administrar al sujeto cantidades farmacéuticamente eficaces de los moduladores descritos una o más veces, aunque no haya prácticamente indicios o no haya indicios en absoluto de la enfermedad utilizando procedimientos de diagnóstico estándar. En algunas modalidades, los moduladores se administrarán conforme a un programa regular durante un periodo tal como semanalmente, cada dos semanas, mensualmente , cada seis semanas, cada dos meses, cada tres meses, cada seis meses o anualmente. Teniendo en cuenta los principios de la presente, un experto en la técnica podría determinar fácilmente las dosis y los regímenes posológicos favorables para reducir el potencial de recidiva de la enfermedad. Es más, tales tratamientos se podrían prolongar durante un periodo de semanas, meses, años o incluso indefinidamente dependiendo de la respuesta del paciente y los parámetros clínicos y de diagnóstico .

En otra modalidad preferida más, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar para prevenir o reducir, profilácticamente o como una terapia adyuvante, la posibilidad de que se produzca metástasis tumoral después de un procedimiento citorreducto . La expresión "procedimiento citorreductor" , tal como se utiliza en la presente exposición, se define en un sentido amplio y se referirá a cualquier procedimiento, técnica o método que elimine, reduzca, trate o mejore un tumor o la proliferación de un tumor. Los procedimientos citorreductores ilustrativos incluyen, sin carácter limitante, cirugía, tratamientos con radiación (es decir, haz de radiación) , quimioterapia, inmunoterapia o ablación. En los momentos adecuados determinados fácilmente por un experto en la técnica en vista de la presente exposición, los moduladores descritos se pueden administrar según sugieran los procedimientos clínicos, teragnósticos o de diagnóstico para reducir la metástasis tumoral . Los moduladores se pueden administrar una o más veces en dosis farmacéuticamente eficaces según se determine utilizando técnicas estándar. Preferentemente, el régimen posológico irá acompañado por técnicas de monitorización o diagnóstico adecuadas que permitan su modificación .

Otras modalidades más de la invención comprenden administrar los moduladores descritos a sujetos que son asintomáticos pero que corren el riesgo de desarrollar un trastorno proliferativo . Es decir, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar en un sentido realmente preventivo y se pueden administrar a pacientes que hayan sido examinados o se hayan sometido a pruebas y que presenten uno o más factores de riesgo establecidos (por ejemplo, indicios genómicos, antecedentes familiares, resultados de pruebas in vivo o in vitro, etc.) pero que no hayan desarrollado ninguna neoplasia. En tales casos, los expertos en la técnica serían capaces de determinar un régimen posológico efectivo mediante la observación empírica o mediante prácticas clínicas aceptadas .

D . Agentes anticancerosos La expresión "agente anticanceroso" o "agente antiproliferativo" se refiere a cualquier agente que se pueda utilizar para tratar un trastorno proliferativo celular tal como el cáncer e incluye, sin carácter limitante, agentes citotóxicos, agentes citostáticos , agentes antiangiogénicos, agentes citorreductores , agentes quimioterapéuticos, radioterapia y agentes radioterapéuticos , agentes anticancerosos dirigidos, BRM, anticuerpos terapéuticos, vacunas contra el cáncer, citocinas, terapias hormonales, terapia de radiación, y agentes antimetastásicos y agentes inmunoterapéuticos . Se apreciará que, en modalidades seleccionadas como las indicadas anteriormente, tales agentes anticancerosos pueden comprender conjugados y se pueden asociar con moduladores antes de su administración. En ciertas modalidades, el agente anticanceroso descrito estará unido a un modulador de SEZ6 para proporcionar un ADC tal como se ha expuesto en la presente.

La expresión "agente citotóxico", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una sustancia que es tóxica para las células, y reduce o inhibe la función de células y/o provoca la destrucción de células. Normalmente, la sustancia es una molécula natural derivada de un organismo vivo. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, sin carácter limitante, toxinas de bajo peso molecular o toxinas enzimáticamente activas de bacterias (por ejemplo, la toxina diftérica, endotoxina y exotoxina de Pseudomonas, y enterotoxina A de Staphylococcus) , hongos (por ejemplo, a-sarcina, restrictocina) , plantas (por ejemplo, abrina, ricina, modecina, viscumina, proteína antivírica de Phytolacca americana, saporina, gelonina, momoridina, tricosantina, toxina de la cebada, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diatínicas, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitegelina, restrictocina, fenomicina, neomicina y los tricotecenos) o animales, (por ejemplo, RNasas citotóxicas, tales como las Nasas pancreáticas extracelulares ; DNasa I, incluidos sus fragmentos y/o variantes) .

A los efectos de la presente invención, la expresión "agente quimioterapéutico" comprende un compuesto químico que reduce o inhibe de forma no específica el crecimiento, la proliferación y/o la supervivencia de células cancerosas (por ejemplo, agentes citotóxicos o citostáticos) . Tales agentes químicos normalmente se dirigen a procesos intracelulares necesarios para el crecimiento o la división celular y, por lo tanto, son particularmente efectivos contra células cancerosas, que generalmente crecen y se dividen rápidamente. Por ejemplo, la vincristina despolimeriza microtúbulos y de este modo inhibe la entrada de las células en la fase de mitosis. En general, los agentes quimioterapéuticos pueden incluir cualquier agente químico que inhiba o que esté diseñado para inhibir una célula cancerosa o una célula que es probable que se vuelva cancerosa o genere una progenie tumorigénica (por ejemplo, TIC) . Tales agentes normalmente se administran y normalmente son más eficaces combinados, por ejemplo, en regímenes tales como CHOP o FOLFIRI . Nuevamente, en modalidades seleccionadas, tales agentes quimioterapéuticos se pueden conjugar con los moduladores descritos .

Los ejemplos de agentes anticancerosos que se pueden utilizar combinados (o conjugados) con los moduladores de la presente invención incluyen, sin carácter limitante, agentes alquilantes, sulfonatos de alquilo, aziridinas, etileniminas y metilamilaminas , acetogeninas , una camptotecina, briostatina, calistatina, CC-1065, criptoficinas , dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, una sarcodictina, espongistatina, mostazas nitrogenadas, antibióticos, antibióticos enodiínicos, dinemicina, bisfosfonatos, esperamicina, cromóforos de antibióticos enodiínicos cromoproteicos , aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas , cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorr bicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN°, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, mareelomiciña, mitomicinas , ácido raicofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos , erlotinib, vem rafenib, crizotinib, sorafenib, ibrutinib, enzalutamida, análogos del ácido fólico, análogos de la purina, andrógenos, antiadrenales , regenerador del ácido fólico tal como el ácido frolínico, aceglatona, glicósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diazicuona, elfornitina, acetato de eliptinio, una epotilona, etoglúcido, nitrato de galio, hidroxiurea, lentinán, lonidainina, maitansinoides , mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilínico , 2-etilhidrazida, procarbazina, complejo polisacárido PSK° (JHS Natural Products, Eugene, OR) , razoxano; rizoxina; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona ; 2, 2', 2"- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente la toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, cloranbucilo; gemcitabina GE ZAR ; 6-tioguanina ; mercaptopurina; metotrexato ; análogos de platino, vinblastina; platino; etopósido (VP-16) ,· ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (Camptosar, CPT-11) , inhibidor de topoisomerasas RFS 2000; difluorometilornitina ; retinoides; capecitabina; combretastatina; leucovorina; oxaliplatino; inhibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR y VEGF-A que reducen la proliferación celular, y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas sobre tumores tales como antiestrógenos y moduladores de los receptores de estrógeno selectivos, inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas suprarrenales, y antiandrógenos ; así como también troxacitabina (un análogo citosínico del nucleósido de 1,3-dioxolano) ; oligonucleótidos complementarios, ribozimas tales como un inhibidor de la expresión de VEGF y un inhibidor de la expresión de HER2 ; vacunas, rIL-2 PROLEUKIN*; el inhibidor de la topoisomerasa 1 LURTOTECAN*; rmRH ABARELIX¾; Vinorelbina y Esperamicinas, y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

En otras modalidades, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar combinados con cualquiera de los diferentes anticuerpos (o agentes inmunoterapéuticos) que en la actualidad están en fase de ensayos clínicos o se comercializan. Con este fin, los moduladores descritos se pueden utilizar combinados con un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por abagovomab, adecatumumab, afutuzumab, alemtuzumab, altumomab, amatuximab, anatumomab, arcitumomab, bavituximab, bectumomab, bevacizumab, bivatuzumab, blinatumomab, brentuximab, cantuzumab, catumaxomab, cetuximab, citatuzumab, cixutumumab, clivatuzumab, conatumumab, daratumumab, drozitumab, duligotumab, dusigitumab, detumomab, dacetuzumab, dalotuzumab, ecromeximab, elotuzumab, ensituximab, ertumaxomab, etaracizumab, farletuzumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, futuximab, ganitumab, gemtuzumab, girentuximab, glembatumumab, ibritumomab, igovomab, imgatuzumab, indatuximab, inotuzumab, intetumumab, ipilimumab, iratumumab, labetuzumab, lexatumumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, mapatumumab, matuzumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, moxetumomab, narnatumab, naptumomab, necitumumab, nimotuzumab, nofetumomabn, ocaratuzumab, ofatumumab, olaratumab, onartuzumab, oportuzumab, oregovomab, panitumumab, parsatuzumab, patritumab, pemtumomab, pertuzumab, pintumomab, pritumumab, racotumomab , radretumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, satumomab, sibrotuzumab, siltuximab, simtuzumab, solitomab, tacatuzumab, taplitumomab, tenatumomab, teprotumumab, tigatuzumab, tositumomab, trastuzumab, tucotuzumab, ublituximab, veltuzumab, vorsetuzumab, votumumab, zalutumumab, CC49, 3F8 y combinaciones de estos.

Otras modalidades particularmente preferidas adicionales comprenderán el uso de anticuerpos autorizados para la terapia contra el cáncer que incluyen, sin carácter limitante, rituximab, trastuzumab, gemtuzumab ozogamcina, alemtuzumab, ibritumomab tiuxetán, tositumomab, bevacizumab, cetuximab, panitumumab, ofatumumab, ipilimumab y brentuximab vedotina. Los expertos en la técnica serán capaces de identificar fácilmente agentes anticancerosos adicionales que sean compatibles con los principios de la presente.

E . Radioterapia La presente invención también proporciona la combinación de moduladores con radioterapia (es decir, cualquier mecanismo para inducir daño en el DNA localmente en las células tumorales tal como irradiación gamma, rayos X, irradiación UV, microondas, emisiones electrónicas y similares) . También se contempla la terapia combinada en la que se emplea el suministro dirigido de radioisótopos a células tumorales y se puede utilizar en conexión con un agente anticanceroso dirigido u otro medio de direccionamiento. Normalmente, la terapia de radiación se administra en pulsos durante un periodo de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2 semanas . La terapia de radiación se puede administrar a sujetos que padecen cáncer de cabeza y cuello durante aproximadamente 6-7 semanas. Opcionalmente , la terapia de radiación se puede administrar como una única dosis o como múltiples dosis secuenciales .

XI . Indicaciones Se apreciará que los moduladores de la presente invención se pueden utilizar para diagnosticar, tratar o inhibir la aparición o la recidiva de cualquier trastorno asociado con SEZ6. Por consiguiente, los moduladores de la invención, ya sean administrados solos o combinados con un agente anticanceroso o radioterapia, son particularmente útiles para tratar en general afecciones neoplásicas en pacientes o sujetos, que pueden incluir tumores benignos o malignos (por ejemplo, carcinomas de las glándulas suprarrenales, hígado, riñon, vejiga, mama, gástricos, ováricos, colorrectales , de próstata, pancreáticos, de pulmón, tiroides, hepáticos, del cuello uterino, de endometrio, esofágicos y uterinos; sarcomas; glioblastomas; y diversos tumores de cabeza y cuello) ; leucemias y neoplasias malignas linfoides; otros trastornos tales como trastornos neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocélicos ; y trastornos inflamatorios, angiogénicos , inmunológicos y trastornos provocados por patógenos . En particular, las dianas principales del tratamiento son afecciones neoplásicas que comprenden tumores sólidos, aunque las neoplasias malignas hematológicas quedan contempladas por el alcance de la invención. Preferentemente, el "sujeto" o "paciente" que se ha de tratar será un ser humano aunque se sobreentenderá que estos términos, tal como se utilizan en la presente, comprenden cualquier especie de mamífero.

Más específicamente, las afecciones neoplásicas sometidas al tratamiento de acuerdo con la presente invención se pueden seleccionar del grupo que incluye, sin carácter limitante, tumores de las glándulas suprarrenales, cánceres asociados con el SIDA, sarcoma alveolar de partes blandas, tumores astrocíticos, cáncer de vejiga (carcinoma de células escamosas y carcinoma de células transicionales) , cáncer de huesos (adamantinoma, quiste óseo aneurismático, osteocondroma, osteosarcoma) , cánceres de cerebro y de la médula espinal, tumores cerebrales metastásicos , cáncer de mama, tumores del cuerpo carotídeo, cáncer del cuello uterino, condrosarcoma, cordoma, carcinoma de células renales cromófobas, carcinoma de células claras, cáncer de colon, cáncer colorrectal, histiocitomas fibrosos benignos cutáneos, tumores desmoplásicos de células pequeñas y redondas, ependimomas, tumores de Ewing, condrosarcoma mixoide extraesquelético, fibrogénesis imperfecta ósea, displasia fibrosa ósea, cánceres de las vías biliares y la vesícula biliar, enfermedad trofoblástica gestacional, tumores de células germinales, cánceres de cabeza y cuello, tumores de células insulares, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon (nefroblastoma, carcinoma papilar de células renales) , leucemias, lipoma/tumores lipomatosos benignos, liposarcoma/tumores lipomatosos malignos, cáncer de hígado (hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular) , linfornas, cánceres de pulmón (carcinoma microcítico, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes, etc.), meduloblastoma, melanoma, meningiomas, neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, neuroblastoma, tumores neuroendocrinos , cáncer ovárico, cánceres pancreáticos, carcinomas papilares de la tiroides, tumores de paratiroides, cánceres pediátricos, tumores de la vaina de los nervios periféricos, feocromocitoma, tumores de la pituitaria, cáncer de próstata, melanoma uveal posterior, trastornos hematológicos poco frecuentes, cáncer metastásico renal, tumor rabdoide, rabdomisarcoma, sarcomas, cáncer de piel, sarcomas de los tejidos blandos, cáncer de células escamosas, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, carcinoma tímico, timoma, cáncer metastásico de la tiroides y cánceres uterinos (carcinoma del cuello uterino, carcinoma de endometrio y leiomioma) .

En ciertas modalidades preferidas, el trastorno proliferativo comprenderá un tumor sólido, que incluye, sin carácter limitante, carcinomas de las glándulas suprarrenales, hígado, riñon, vejiga, mama, gástricos, ováricos, del cuello uterino, uterinos, esofágicos, colorrectales, de próstata, pancreáticos, de pulmón (tanto microcíticos como no microcíticos) , de la tiroides, sarcomas, glioblastomas y diversos tumores de cabeza y cuello. En otras modalidades preferidas y tal como se muestra más adelante en los Ejemplos, los moduladores descritos son especialmente efectivos en el tratamiento del cáncer de pulmón microcítico (SCLC) y el cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) (por ejemplo, el cáncer de pulmón no microcítico de células escamosas o el cáncer de pulmón microcítico de células escamosas) . En una modalidad, el cáncer de pulmón es refractario, recividante o resistente a un agente basado en platino (por ejemplo, carboplatino, cisplatino, oxaliplatino, topotecán) y/o un taxano (por ejemplo, docetaxel, paclitaxel, larotaxel o cabazitaxel) . Además, en modalidades particularmente preferidas, los moduladores descritos se pueden utilizar en una forma conjugada para tratar el cáncer de pulmón microcítico.

En lo que respecta al cáncer de pulmón microcítico, las modalidades particularmente preferidas comprenderán la administración de moduladores conjugados (ADC) . En modalidades seleccionadas, los moduladores conjugados se administrarán a pacientes que exhiben una enfermedad en estadio limitado. En otras modalidades, los moduladores descritos se administrarán a pacientes que exhiben una enfermedad en estadio extensivo. En otras modalidades preferidas, los moduladores conjugados descritos se administrarán a pacientes refractarios (es decir, aquellos que experimentan una recidiva durante o poco después de finalizar un curso de terapia inicial) . Otras modalidades adicionales comprenden la administración de los moduladores descritos a pacientes sensibles (es decir, aquellos cuya recaída tiene lugar más de 2-3 meses después de la terapia primaria) . En cada caso, se apreciará que los moduladores compatibles pueden estar en un estadio conjugado o sin conjugar dependiendo del régimen posológico seleccionado y el diagnóstico clínico.

Tal como se ha indicado anteriormente, los moduladores descritos se pueden utilizar además para prevenir, tratar o diagnosticar tumores con características o fenotipos neuroendocrinos, que incluyen tumores neuroendocrinos . Los tumores neuroendocrinos (NET) verdaderos o canónicos que se originan en el sistema endocrino difuso son relativamente poco frecuentes, con una incidencia de 2-5 cada 100 000 personas, pero son sumamente agresivos. Los tumores neuroendocrinos aparecen en el riñon, aparato genitourinario (vejiga, próstata, ovario, cuello uterino y endometrio) , tubo gastrointestinal (colon, estómago) , tiroides (cáncer medular de tiroides) y pulmón (carcinoma pulmonar microcítico y carcinoma neuroendocrino de células grandes) . Estos tumores pueden secretar varias hormonas, incluidas la serotonina y/o cromogranina A, que pueden provocar síntomas debilitantes conocidos como el síndrome carcinoide. Estos tumores se pueden detectar mediante marcadores inmunohistoquímicos positivos tales como la enolasa neuroespecífica (NSE, conocida también como enolasa gamma, símbolo génico = EN02), CD56 (o NCAM1) , cromogranina A (CHGA) y sinaptofisina (SYP) o mediante genes que se sabe que exhiben una expresión elevada tales como ASCL1. Desafortunadamente, las quimioterapias tradicionales no han sido particularmente efectivas en el tratamiento de NET y la metástasis hepática es un resultado habitual .

Aunque los moduladores descritos se pueden utilizar convenientemente para tratar tumores neuroendocrinos, también se pueden utilizar para tratar, prevenir o diagnosticar tumores pseudoneuroendocrinos (pNET) que genotípica o fenotípicamente imitan, se asemejan o exhiben rasgos comunes respecto a los tumores neuroendocrinos canónicos . Los tumores pseudoneuroendocrinos o tumores con características neuroendocrinas son tumores que se originan a partir de células del sistema neuroendocrino difuso o a partir de células en las que se ha reactivado de forma aberrante una cascada de diferenciación neuroendocrina durante el proceso oncogénico. Tales pNET normalmente comparten ciertas características fenotípicas o bioquímicas con tumores neuroendocrinos definidos tradicionalmente , que incluyen la capacidad para producir subconjuntos de aminas, neurotransmisores y hormonas peptídicas biológicamente activos. Histológicamente, tales tumores (NET y pNET) comparten una apariencia común que normalmente presenta células pequeñas conectadas densamente con citoplasma mínimo de citopatología blanda y núcleos punteados de redondos a ovales. A los efectos de la presente invención, los marcadores histológicos o marcadores genéticos expresados comúnmente que se pueden utilizar para definir tumores neuroendocrinos y pseudoneuroendocrinos incluyen, sin carácter limitante, la cromogranina A, CD56, sinaptofisina, PGP9.5, ASCLl y enolasa neuroespecífica (NSE) .

Por consiguiente, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar beneficiosamente para tratar tanto tumores pseudoneuroendocrinos como tumores neuroendocrinos canónicos. A este respecto, los moduladores se pueden utilizar como se describe en la presente para tratar tumores neuroendocrinos (tanto NET como pNET) que se originan en el riñon, aparato genitourinario (vejiga, próstata, ovario, cuello uterino y endometrio) , tubo gastrointestinal (colon, estómago) , tiroides (cáncer medular de tiroides) y pulmón (carcinoma pulmonar microcítico y carcinoma neuroendocrino de células grandes). Es más, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar para tratar tumores que expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo constituido por NSE, CD56, sinaptofisina, cromogranina A, ASCL1 y PGP9.5 (UCHL1) . Es decir, la presente invención se puede utilizar para tratar a un sujeto que padece un tumor que es NSE+ o CD56+ o PGP9.5+ o ASCL1+ o SYP+ o CHGA+ o alguna combinación de estos.

En lo que respecta a neoplasias malignas hematológicas, se apreciará además que los compuestos y métodos de la presente invención pueden ser particularmente efectivos en el tratamiento de diversos linfomas de linfocitos B, que incluyen el linfoma de células foliculares de bajo grado/NHL (FCC, por sus siglas en inglés) , linfoma de células del manto (MCL, por sus siglas en inglés) , linfoma difuso de células grandes (DLCL, por sus siglas en inglés) , NHL linfocítico pequeño (LP) , NHL folicular/de grado intermedio, NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de células no escindidas pequeñas de alto grado, NHL de gran masa tumoral, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma linfoplasmacitoide (LPL, por sus siglas en inglés) , linfoma de células del manto (MCL) , linfoma folicular (FL, por sus siglas en inglés) , linfoma difuso de células grandes (DLCL) , linfoma de Burkitt (BL, por sus siglas en inglés) , linfomas relacionados con el SIDA, linfoma monocítico de linfocitos B, linfoadenopatía angioinmunoblástica, linfocitíco pequeño, folicular, difuso de células grandes, difuso de células pequeñas escindidas, linfoblastoma inmunoblástico de células grandes, pequeño, no escindido, de Burkitt y de no Burkitt, folicular, predominantemente de células grandes; folicular, predominantemente de células pequeñas escindidas; y linfomas foliculares mixtos, de células grandes y de células pequeñas escindidas. Remítase a Gaidono et al., "Lymphomas", EN CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, Vol . 2: 2131-2145 (DeVita et al., eds., 5.a ed. 1997). Debería ser obvio para los expertos en la técnica que estos linfomas a menudo tendrán nombres diferentes, debido a que los sistemas de clasificación están sujetos a cambios y a que los pacientes que padecen linfomas clasificados con nombres diferentes también se pueden beneficiar de los regímenes terapéuticos combinados de la presente invención.

La presente invención también proporciona un tratamiento preventivo o profiláctico de sujetos que presentan tumores benignos o precancerosos . Aparte de tratarse de un trastorno asociado con SEZ6, no se cree que se deba excluir ningún tipo particular de tumor o trastorno proliferativo del tratamiento utilizando la presente invención. Sin embargo, el tipo de células tumorales puede ser relevante para el uso de la invención combinado con agentes terapéuticos secundarios, en particular agentes quimioterapéuticos y agentes anticancerosos dirigidos.

XII. Artículos manufacturados También se proporcionan paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes, que comprenden una o más dosis de un modulador de SEZ6. En ciertas modalidades, se proporciona una dosis unitaria, donde la dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de una composición que comprende, por ejemplo, un anticuerpo anti-SEZ6 con o sin uno o más agentes adicionales. Para otras modalidades, la dosis unitaria se suministra en una jeringa desechable prellenada para su inyección. En otras modalidades adicionales, la composición contenida en la dosis unitaria puede comprender solución salina, sacarosa o similares; un amortiguador, tal como fosfato o similares; y/o se puede formular dentro de un intervalo de pH estable y efectivo. Como alternativa, en ciertas modalidades, la composición se puede proporcionar como un polvo liofilizado que se puede reconstituir al añadir un líquido adecuado, por ejemplo, agua estéril. En ciertas modalidades preferidas, la composición comprende una o más sustancias que inhiben la agregación proteica, incluidas, sin carácter limitante, la sacarosa y la arginina. Cualquier etiqueta sobre el o los recipientes o que esté asociada con estos indica que la composición contenida se utiliza para el diagnóstico o el tratamiento de la afección patológica seleccionada .

La presente invención también proporciona kits para producir unidades de administración mono- o multidosis de un modulador de SEZ6 y, opcionalmente , uno o más agentes anticancerosos. El kit comprende un recipiente y una etiqueta o un prospecto sobre o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes se pueden formar a partir de diversos materiales tales como vidrio o plástico y contener una cantidad farmacéuticamente eficaz de los moduladores descritos en una forma conjugada o sin conjugar. En otras modalidades preferidas, el o los recipientes comprenden un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón que puede ser perforado por una aguja de inyección hipodérmica) . Tales kits generalmente contendrán en un recipiente adecuado una formulación farmacéuticamente aceptable del modulador de SEZ6 y, opcionalmente, uno o más agentes anticancerosos en el mismo recipiente o en recipientes diferentes. Los kits también pueden contener otras formulaciones farmacéuticamente aceptables, ya sea para el diagnóstico o la terapia combinada. Por ejemplo, además del modulador de SEZ6 de la invención, tales kits pueden contener uno o más cualesquiera de una serie de agentes anticancerosos tales como fármacos quimioterapéuticos o radioterapéuticos ; agentes antiangiogénicos; agentes antimetastásicos ; agentes anticancerosos dirigidos; agentes citotóxicos; y/u otros agentes anticancerosos. Tales kits también pueden proporcionar reactivos adecuados para conjugar el modulador de SEZ6 con un agente anticanceroso o agente de diagnóstico (por ejemplo, remítase a la patente de EE. UU. No. 7.422.739, la cual se incorpora a la presente en su totalidad por referencia) .

Más preferentemente, los kits pueden contener un único recipiente que contenga el modulador de SEZ6 , con o sin componentes adicionales, o pueden contener recipientes diferentes para cada agente deseado. Cuando se proporcionan agentes terapéuticos combinados para su conjugación, se puede premezclar una única solución, ya sea en una combinación de un equivalente molar o con un componente en exceso respecto al otro. Como alternativa, el modulador de SEZ6 y cualquier agente anticanceroso opcional del kit se pueden mantener separados dentro de recipientes diferentes antes de administrarlos a un paciente. Los kits también pueden comprender un segundo/tercer recipiente que contenga un amortiguador estéril farmacéuticamente aceptable u otro diluyente tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, por sus siglas en inglés) , solución amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) , solución de Ringer y solución de dextrosa.

Cuando se proporcionan los componentes del kit en una o más soluciones líquidas, la solución líquida es preferentemente una solución acuosa, con preferencia en particular por una solución acuosa estéril. Sin embargo, los componentes del kit se pueden proporcionar como polvo (s) seco(s) . Cuando se proporcionan reactivos o componentes como un polvo seco, el polvo se puede reconstituir mediante la adición de un disolvente adecuado. Se contempla que el disolvente también se puede proporcionar en otro recipiente.

Como se ha indicado anteriormente de forma breve, los kits también pueden contener un medio mediante el cual se administre el anticuerpo y cualesquiera componentes opcionales a un animal o paciente, por ejemplo, una o más agujas o jeringas, o incluso un cuentagotas, una pipeta u otro aparato similar, a partir del cual se puede inyectar o introducir la formulación en el animal o aplicarla a una parte del cuerpo afectada por una enfermedad. Los kits de la presente invención también incluirán normalmente un medio que contenga los viales o recipientes similares, y otro componente aislado para su uso comercial, tal como, por ejemplo, recipientes de plástico moldeados por soplado o inyección en los que se colocan y retienen los viales y otros aparatos deseados. Cualquier etiqueta o prospecto indica que la composición del modulador de SEZ6 se utiliza para tratar un cáncer, por ejemplo, el cáncer de pulmón microcítico.

En otras modalidades preferidas, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar junto con o pueden comprender dispositivos terapéuticos o de diagnóstico útiles en el diagnóstico o el tratamiento de trastornos proliferativos . Por ejemplo, en una modalidad preferida, los compuestos y las composiciones de la presente invención se pueden combinar con ciertos dispositivos o instrumentos de diagnóstico que se pueden utilizar para detectar, monitorizar, cuantificar o obtener el perfil de células o compuestos marcadores que participan en la etiología o la manifestación de trastornos proliferativos . Para modalidades seleccionadas, los compuestos marcadores pueden comprender NSE, CD56, sinaptofisina, cromogranina A y PGP9.5.

En modalidades particularmente preferidas, los dispositivos se pueden utilizar para detectar, monitorizar y/o cuantificar células tumorales circulantes in vivo o in vitro (remítase, por ejemplo, a WO 2012/0128801 que se incorpora a la presente por referencia) . En otras modalidades preferidas adicionales y tal como se ha indicado anteriormente, las células tumorales circulantes pueden comprender células madre cancerosas.

XIII. Reactivos para la investigación Otras modalidades preferidas de la invención también explotan las propiedades de los moduladores descritos como un instrumento útil para identificar, monitorizar, aislar, seccionar o enriquecer poblaciones o subpoblaciones de células iniciadoras de tumores mediante métodos tales como la citometría de flujo, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) , la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) o el seccionamiento mediado por láser. Los expertos en la técnica apreciarán que los moduladores se pueden utilizar en diversas técnicas compatibles para caracterizar y manipular TIC, incluidas las células madre cancerosas (por ejemplo, remítase a las patentes de EE. UU. Nos. 12/686,359, 12/669,136 y 12/757,649, cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad por referencia) .

XIV. Disposiciones varias A menos que se defina de otro modo en la presente, los términos científicos y técnicos utilizados en conexión con la presente invención tendrán los significados habituales con los que estarán familiarizados los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán las pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Más específicamente, tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una proteína" incluye una pluralidad de proteínas; la referencia a "una célula" incluye mezclas de células y similares. Además, los intervalos proporcionados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas incluyen ambos límites de los intervalos y todos los puntos entre los límites. Por lo tanto, un intervalo de 2.0-3.0 incluye 2.0, 3.0, y todos los puntos entre 2.0 y 3.0.

En general, las técnicas de cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, y la química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en la presente, así como también la nomenclatura empleada en conexión con estas, son las conocidas y de uso común en la técnica. Los métodos y las técnicas de la presente invención se llevan a cabo generalmente de acuerdo con métodos convencionales muy conocidos en la técnica, y se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y describen a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario. Remítase, por ejemplo, a Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6.a ed. , W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. y Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocole in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow y Lañe Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); y Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, según se realizan habitualmente en la técnica o como se describen en la presente. Los procedimientos y las técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica descritos en la presente, así como también la nomenclatura empleada en conexión con estos, son los conocidos y de uso común en la técnica. Además, todos los títulos de las secciones utilizados en la presente tienen carácter únicamente organizativo y no se deben interpretar como limitantes del contenido descrito.

XV. Referencias de SEZ6 Todas las referencias o documentos descritos o citados en esta memoria descriptiva se incorporan, sin limitación, a la presente en su totalidad por referencia. Además, todos los títulos de las secciones utilizados en la presente tienen carácter únicamente organizativo y no se deben interpretar como limitantes del contenido descrito. 1. Bork P, Beckmann G. (1993). The CUB domain. A widespread module in developmentally regulated proteins . J Mol Biol. 231:539-45. PMID : 8510165. 2. Galluzzo P y Bocchetta M (2011) . Notch signaling in lung cáncer. Expert Rev Anticancer Ther. 11:533-40. PMID: 21504320. 3. Gunnersen JM et al. (2007). Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons . Neuron. 56:621-39. PMID: 18031681. 4. Gunnersen JM et al. (2009). Seizure-related gene 6 (Sez-6) in amacrine cells of the rodent retina and the consequence of gene deletion. PLoS One. 4:e6546. PMID:19662096. 5. Herbst R, Nicklin MJ (1997). SEZ-6: promoter selectivity, genomic structure and localized expression in the brain. Brain Res Mol Brain Res. 44:309-22. PMID: 9073173. 6. Klimstra DS et al. (2010). The pathologic classification of neuroendocrine tumo s : a review of nomenc1ature, grading, and staging systems . Páncreas. 39:707-12. PMID: 20664470. 7. Klóppel G. (2011). Classification and pathology of gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms. Endocr Relat Cáncer. 18 Supl. 1.S1-16. PMID: 22005112. 8. Mulley JC et al. (2011). The Role of Seizure-Related SEZ6 as a Susceptibility Gene in Febrile Seizures . Neurol Res Int. 2011:917565. PMID: 21785725. 9. Shimizu-Nishikawa K et al. (1995). Cloning and expression of 5EZ-6, a brain-specific and seizure-related cDNA. Brain Res Mol Brain Res. 28:201-10. PMID: 7723619. 10. Yao JC et al. (2008). One hundred years after "carcinoid": epidemiology of and prognostic factors for neuroendocrine tumors in 35,825 cases in the United States. J Clin Oncol. 26:3063-72. PMID: 18565894. 11. Yu ZL et al. (2007). Febrile seizures are associated with mutation of seizure-related (SEZ) 6, a brain-specific gene. J Neurosoi Res. 85:166-72. PMID: 17086543.

XVI . Modalidades seleccionadas de la invención Además de la exposición y los Ejemplos de la presente, esta invención se refiere a modalidades seleccionadas que se exponen específicamente justo a continuación.

Reivindicaciones Putativas ; 1. Un modulador de SEZ6 aislado. 2. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 1, donde el modulador de SEZ6 comprende un antagonista de SEZ6. 3. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 1, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 4. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 3, donde el anticuerpo o el fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 5. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 4, donde el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo constituido por anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos. 6. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 4, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo neutralizante. 7. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 4, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo supresor. 8. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 4, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo internalizante. 9. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 8, donde el anticuerpo monoclonal comprende además un agente citotóxico. 10. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 4, donde el anticuerpo monoclonal comprende una región variable de la cadena ligera que contiene tres regiones determinantes de la complementariedad y una región variable de la cadena pesada que contiene tres regiones determinantes de la complementariedad, donde las regiones determinantes de la complementariedad de las cadenas ligera y pesada comprenden al menos una región determinante de la complementariedad expuesta en la FIG. 10A o la FIG. 10B, respectivamente . 11. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 4, donde el anticuerpo monoclonal comprende una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada, donde la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102 , SECi ID NO : 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166 y SEQ ID NO: 168 y donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101 , SEQ ID NO : 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO : 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ 1 ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167 y SEQ ID NO: 169. 12. Un modulador de SEZ6 aislado que comprende una CDR de cualquiera de las regiones variables de la cadena pesada o ligera expuestas en la reivindicación 11. 13. Un modulador de SEZ6 aislado que comprende un anticuerpo competitivo, donde el anticuerpo competitivo inhibe la unión de un modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 10 o 11 a SEZ6 al menos aproximadamente un 40%. 14. Un ácido nucleico que codifica una región variable de la cadena pesada de aminoácidos o una región variable de la cadena ligera de aminoácidos de conformidad con la reivindicación 11. 15. Un vector que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14. 16. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 y fragmentos de estas. 17. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 16, donde el modulador de SEZ6 comprende además al menos una porción de una región constante de inmunog1obu1ina. 18. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 1, donde el modulador reduce la frecuencia de células iniciadoras de tumores al administrarlo a un sujeto que lo necesite. 19. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 18, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis por citometría de flujo de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores . 20. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 18, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando una detección inmunohistoquímica de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores. 21. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 18, donde las células iniciadoras de tumores comprenden células perpetuantes de tumores. 22. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 1 que comprende además un agente citotóxico. 23. Una composición farmacéutica que comprende el modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 1. 24. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 23, donde el modulador de SEZ6 aislado comprende un anticuerpo monoclonal. 25. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 24, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo humanizado. 26. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 25, donde el anticuerpo humanizado comprende un agente citotóxico. 27. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 26, donde el agente citotóxico comprende una pirrolobenzodiazepina . 28. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 26, donde el agente citotóxico comprende una auristatina . 29. Un método para tratar un trastorno asociado con SEZ6 que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de SEZ6 a un sujeto que lo necesite. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, donde el modulador de SEZ6 comprende un antagonista de SEZ6. 31. El método de conformidad con la reivindicación 29, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, donde el anticuerpo o el fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, donde el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo constituido por anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, donde el anticuerpo monoclonal comprende una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada, donde la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ * ID ' NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166 y SEQ ID NO: 168 y donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO : 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO : 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO : 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO : 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO : 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO : 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167 y SEQ ID NO: 169. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado. 36. El método de conformidad con la reivindicación 32, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo neutralizante . 37. El método de conformidad con la reivindicación 32, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo internalizante . 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, donde el anticuerpo internalizante comprende un agente citotóxico. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, donde el agente citotóxico comprende una pirrolobenzodiazepina . 40. El método de conformidad con la reivindicación 38, donde el agente citotóxico comprende una auristatina. 41. El método de conformidad con la reivindicación 39, donde el trastorno asociado con SEZ6 comprende un trastorno neoplásico. 42. El método de conformidad con la reivindicación 41, donde el trastorno neoplásico comprende un tumor que exhibe características neuroendocrinas . 43. El método de conformidad con la reivindicación 42, donde el tumor que exhibe características neuroendocrinas comprende un tumor neuroendocrino . 44. El método de conformidad con la reivindicación 41, donde el sujeto padece un trastorno neoplásico seleccionado del grupo constituido por cáncer suprarrenal, cáncer de vejiga, cáncer del cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer gástrico, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de mama. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, donde el sujeto padece cáncer de pulmón. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, donde el sujeto padece cáncer de pulmón microcítico. 47. El método de conformidad con la reivindicación 41, donde el sujeto que padece el trastorno neoplásico exhibe tumores que comprenden células iniciadoras de tumores. 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, que comprende además el paso de reducir la frecuencia de células iniciadoras de tumores en el sujeto. 49. El método de conformidad con la reivindicación 48, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis por citometría de flujo de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores o una detección inmunohistoquímica de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores. 50. El método de conformidad con la reivindicación 48, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un método del grupo constituido por un análisis de dilución limitante in vitro e in vivo. 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis de dilución limitante in vivo que comprende el trasplante de células tumorales humanas vivas en ratones inmunodeprimidos . 52. El método de conformidad con la reivindicación 51, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis de dilución limitante in vivo que comprende la cuantificación de la frecuencia de células iniciadoras de tumores utilizando el modelo estadístico de la distribución de Poisson. 53. El método de conformidad con la reivindicación 50, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis de dilución limitante in vitro que comprende la deposición por dilución limitante de células tumorales humanas vivas en condiciones que estimulen las colonias in vitro. 54. El método de conformidad con la reivindicación 53, donde la reducción de la frecuencia determinada utilizando un análisis de dilución limitante in vitro comprende la cuantificación de la frecuencia de células iniciadoras de tumores utilizando el modelo estadístico de la distribución de Poisson. 55. El método de conformidad con la reivindicación 29, que comprende además el paso de administrar un agente anticanceroso . 56. El método de conformidad con la reivindicación 29, donde el modulador de SEZ6 comprende una o más CDR de cualquiera de las SEQ ID NOS: 20-169. 57. El método de conformidad con la reivindicación 29, donde el modulador de SEZ6 comprende un modulador de pan-SEZ6. 58. El método de conformidad con la reivindicación 57, donde el modulador de SEZ6 comprende un agente citotóxico. 59. Un método para reducir la frecuencia de células iniciadoras de tumores en un sujeto que lo necesite que comprende el paso de administrar un modulador de SEZ6 al sujeto. 60. El método de conformidad con la reivindicación 59, donde las células iniciadoras de tumores comprenden células perpetuantes de tumores . 61. El método de conformidad con la reivindicación 60, donde las células perpetuantes de tumores se seleccionan entre células que expresan marcadores seleccionadas del grupo constituido por células CD44+, CD324+ y CD133+. 62. El método de conformidad con la reivindicación 59, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo. 63. El método de conformidad con la reivindicación 62, donde el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal. 64. El método de conformidad con la reivindicación 63, donde el anticuerpo monoclonal comprende además un agente citotóxico. 65. El método de conformidad con la reivindicación 59, donde el sujeto padece un trastorno neoplásico seleccionado del grupo constituido por cáncer suprarrenal, cáncer de vejiga, cáncer del cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de mama. 66. El método de conformidad con la reivindicación 65, donde el sujeto padece cáncer de pulmón. 67. El método de conformidad con la reivindicación 66, donde el sujeto padece cáncer de pulmón microcítico. 68. El método de conformidad con la reivindicación 59, donde la frecuencia de células iniciadoras tumorales se reduce al menos un 10%. 69. El método de conformidad con la reivindicación 59, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis por c tometría de flujo de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores o una detección inmunohistoquímica de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores. 70. Un método de sensibilización de un tumor en un sujeto para tratarlo con un agente anticanceroso que comprende el paso de administrar un modulador de SEZ6 al suj eto . 71. El método de conformidad con la reivindicación 70, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo. 72. El método de conformidad con la reivindicación 70, donde el tumor es un tumor sólido. 73. El método de conformidad con la reivindicación 70, donde el agente anticanceroso comprende un agente quimioterapéutico . 74. El método de conformidad con la reivindicación 70, donde el agente anticanceroso comprende un agente inmunoterapéutico . 75. Un método para diagnosticar un trastorno proliferativo en un sujeto que lo necesite que comprende los pasos de: i. obtener una muestra de tejido del sujeto; ii. poner en contacto la muestra de tejido con al menos un modulador de SEZ6; y iii. detectar o cuantificar el modulador de SEZ6 asociado con la muestra. 76. El método de conformidad con la reivindicación 75, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo monoclonal . 77. El método de conformidad con la reivindicación 76, donde el anticuerpo monoclonal está asociado operablemente con un indicador. 78. Un artículo manufacturado útil para diagnosticar o tratar trastornos asociados con SEZ6 que comprende un receptáculo que comprende un modulador de SEZ6 y materiales instructivos para utilizar el modulador de SEZ6 con el fin de tratar o diagnosticar el trastorno asociado con SEZ6. 79. El artículo manufacturado de conformidad con la reivindicación 78, donde el modulador de SEZ6 es un anticuerpo monoclonal. 80. El artículo manufacturado de conformidad con la reivindicación 78, donde el receptáculo comprende una placa legible . 81. Un método para tratar a un sujeto que padece un trastorno neoplásico que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador de SEZ6 internalizante. 82. El método de conformidad con la reivindicación 81, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo. 83. El método de conformidad con la reivindicación 82, donde el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal. 84. El método de conformidad con la reivindicación 83, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo humanizado . 85. El método de conformidad con la reivindicación 83, donde el anticuerpo monoclonal comprende además un agente citotóxico. 86. El método de conformidad con la reivindicación 81, que comprende además el paso de administrar un agente anticanceroso . 87. El método de conformidad con la reivindicación 81, donde el trastorno neoplásico comprende un tumor que exhibe características neuroendocrinas . 88. El método de conformidad con la reivindicación 81, donde el trastorno neoplásico comprende un tumor que exhibe características neurales. 89. El método de conformidad con la reivindicación 81, donde el trastorno neoplásico comprende un cáncer de pulmón. 90. El método de conformidad con la reivindicación 81, donde el trastorno neoplásico comprende un cáncer de pulmón microcítico . 91. Un método para tratar a un sujeto que padece un trastorno neoplásico que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador de SEZ6 neutralizante. 92. El método de conformidad con la reivindicación 91, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo. 93. El método de conformidad con la reivindicación 92, donde el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal. 94. El método de conformidad con la reivindicación 93, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo humanizado. 95. El método de conformidad con la reivindicación 94, donde el anticuerpo humanizado comprende además un agente citotóxico . 96. El método de conformidad con la reivindicación 91, que comprende además el paso de administrar un agente anticanceroso . 97. El método de conformidad con la reivindicación 91, donde el trastorno neoplásico comprende un tumor que exhibe características neurales . 98. El método de conformidad con la reivindicación 91, donde el trastorno neoplásico comprende un tumor que exhibe características neuroendocrinas . 99. El método de conformidad con la reivindicación 91, donde el trastorno neoplásico comprende un cáncer de pulmón. 100. El método de conformidad con la reivindicación 99, donde el trastorno neoplásico comprende un cáncer de pulmón microcítico . 101. Un método para identificar, aislar, seccionar o enriquecer una población de células iniciadoras de tumores que comprende el paso de poner en contacto las células iniciadoras de tumores con un modulador de SEZ6. 102. El método de conformidad con la reivindicación 101, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo. 103. Un modulador de SEZ6 que comprende un anticuerpo humanizado, donde el anticuerpo humanizado comprende una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada, donde la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190 y SEQ ID NO: 192 y donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 60% respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo constituido por la SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198 y SEQ ID NO: 199. 104. Un método para inhibir o prevenir la metástasis en un sujeto que lo necesite que comprende el paso de administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un modulador de SEZ6. 105. El método de conformidad con la reivindicación 104, donde el sujeto se somete a un procedimiento citorreductor antes o después de la administración del modulador de SEZ6. 106. El método de conformidad con la reivindicación 105, donde el procedimiento citorreductor comprende la administración de al menos un agente anticanceroso. 107. Un método para llevar a cabo una terapia de mantenimiento en un sujeto que lo necesite que comprende el paso de administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un modulador de SEZ6. 108. El método de conformidad con la reivindicación 107, donde el sujeto ha sido sometido al tratamiento de un trastorno neoplásico antes de administrar el modulador de SEZ6. 109. Un método para agotar células iniciadoras de tumores en un sujeto que padece un trastorno proliferativo que comprende el paso de administrar un modulador de SEZ6. 110. Un método para diagnosticar, detectar o monitorizar un trastorno asociado con SEZ6 in vivo en un sujeto que lo necesite que comprende el paso de administrar un modulador de SEZ6. 111. Un método para diagnosticar, detectar o monitorizar un trastorno asociado con SEZ6 en un sujeto que lo necesite que comprende el paso de poner en contacto células tumorales circulantes con un modulador de SEZ6. 112. El método de conformidad con la reivindicación 111, donde el paso de puesta en contacto tiene lugar in vivo. 113. El método de conformidad con la reivindicación 111, donde el paso de puesta en contacto tiene lugar in vitro. 114. Un método para tratar un tumor que exhibe características neuroendocrinas en un paciente que lo necesite que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de SEZ6. 115. El método de conformidad con la reivindicación 114, donde el tumor que exhibe características neuroendocrinas es un tumor neuroendocrino . 116. Un modulador de SEZ6 derivado de un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por SC17.1, SC17.2, SC17• 3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10 , SC17.11 , SC17.14, SC17 • 15, SC17 .16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17 .22, SC17 .24, SC17 .27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17 .32, SC17 • 34, SC17 .35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17 .40, SC17 • 41, SC17 .42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17 • 49, SC17 .50, SC17 .53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17 .59, SC17 .61, SC17 .63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17 .76, SC17 • 77, SC17 • 79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17 .85, SC17 .87, SC17 .89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17 • 95, SC17 • 97, SC17. 99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17. 120, SC17121, SC17. 122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17. 161, SC17 .166 , SC17. 187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17.200. 117. Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el Dominio Sushi 1 de SEZ6. 118. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 117, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 119. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 118, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 120. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 119, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC. 121. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 120, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 122. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 121, que comprende además un conector. 123. Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el Dominio Sushi 2 de SEZ6. 124. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 123, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 125. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 124, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 126. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 125, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC. 127. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 126, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 128. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 127, que comprende además un conector. 129. Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el Dominio Sushi 3 de SEZ6. 130. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 129, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 131. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 130, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 132. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 131, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC. 133. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 132, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 134. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 133, que comprende además un conector. 135. Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el Dominio Sushi 4 de SEZ6. 136. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 135, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 137. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 136, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 138. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 137, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC. 139. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 138, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 140. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 139, que comprende además un conector. 141. Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el Dominio Sushi 5 de SEZ6. 142. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 141, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 143. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 142, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 144. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 143, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC. 145. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 144, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 146. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 145, que comprende además un conector. 147. Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el Dominio CUB 1 de SEZ6. 148. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 147, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 149. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 148, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 150. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 149, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC. 151. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 150, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 152. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 151, que comprende además un conector. 153. Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el Dominio CUB 2 de SEZ6. 154. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 153, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 155. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 154, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 156. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 155, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC. 157. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 156, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 158. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 157, que comprende además un conector. 159. Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el dominio aminoterminal de SEZ6. 160. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 159, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 161. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 160, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal. 162. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 161, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC. 163. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 162, donde el ADC comprende una pirrolobenzodiazepina . 164. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 163, que comprende además un conector. 165. Un modulador de SEZ6 aislado que reside en una sección seleccionada del grupo constituido por la sección A, sección B, sección C, sección D, sección E, sección F y sección U. 166. Un modulador de SEZ6 aislado que reside en una sección definida por un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo constituido por SC17.1, SC17.2 , SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17• 41, SC17.42, SC17 ¦ 45, SC17 .46, SC17 • 47, SC17 • 49, SC17 .50, SC17 .53, SC17 .54, SC17 .56, SC17 .57, SC17 • 59, SC17 .61, SC17 .63, SC17 .71, SC17 .72, SC17 .74, SC17 .76, SC17 .77, SC17 • 79, SC17 .81, SC17 .82, SC17 .84, SC17 .85, SC17 .87, SC17 .89, SC17 .90, SC17 .91, SC17 • 93, SC17 • 95, SC17 • 97, SC17 • 99, SC17 .102, SC17 .114, SC17 .115, SC17 .120, SC17121, SC17. 122, SC17 .140, SC17 .151, SC17. 156, SC17. 161, SC17. 166, SC17. 187, SC17 .191, SC17. 193, SC17.199 y SC17.: 200. 167. Un conjugado de anticuerpo- fármaco de fórmula - [L-D] n o una sal farmacéuticamente aceptable de este, donde: a. M comprende un modulador de SEZ6; b. L comprende un conector; c. D es un agente antiproliferativo ; y d. n es un número entero comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20. 168. El conjugado de anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 167, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este . 169. El conjugado de anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 168, donde el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal. 170. El conjugado de anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 169, donde el anticuerpo deriva de un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por SC17.1, SC17 .2, SC17.3, SC17.4, SC17 .8, SC17. 9, SC17.10, SC17 .11, SC17 .14, SC17 •15, SC17 .16, SC17.17, SC17.18, SC17 • 19, SC17 .22, SC17 .24, SC17 .27, SC17.28, SC17.29, SC17 .30, SC17 .32, SC17 • 34, SC17 .35, SC17.36, SC17.38, SC17 • 39, SC17 .40, SC17 • 41, SC17 .42, SC17.45, SC17.46, SC17 • 47, SC17 .49, SC17 .50, SC17 .53 , SC17.54, SC17.56, SC17 .57, SC17 • 59, SC17 .61, SC17 .63, SC17.71, SC17.72, SC17 • 74, SC17 .76, SC17 • 77, SC17 .79, SC17.81, SC17.82, SC17 .84, SC17 .85, SC17 .87, SC17 .89, SC17.90, SC17.91, SC17 • 93, SC17 • 95, SC17. 97, SC17.! 99, SC17.102, SC17.114, SC17. 115, SC17 .120, SC17121, SC17. 122, SC17.140, SC17.151, SC17. 156, SC17 .161, SC17. 166, SC17. 187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17.200. 171. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 169, donde el anticuerpo está humanizado . 172. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 167, donde el conector comprende un conector escindible. 173. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 172, donde el conector escindible comprende un conector peptidílico. 174. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 167, donde el agente antiproliferativo comprende un agente citotóxico. 175. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 174, donde el agente citotóxico comprende una pirrolobenzodiazepina . 176. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 175, donde la pirrolobenzodiazepina comprende un dimero de pirrolobenzodiazepina. 177. Un modulador de SEZ6 aislado que reside en una sección seleccionada del grupo constituido por la sección A, sección B, sección C, sección D, sección E, sección F y sección U. 178. Un modulador de SEZ6 aislado que reside en una sección definida por un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo constituido por SC17.1, SC17. 2, SC17.3, SC17.4, SC17 .8, SC17.9, SC17 .10, SC17. 11, SC17.14 , SC17.15, SC17 .16, SC17 .17, SC17. 18, SC17 • 19, SC17 .22, SC17.24 , SC17 .27, SC17 .28, SC17. 29, SC17 .30, SC17 .32, SC17.34, SC17 .35, SC17 .36, SC17. 38, SC17 .39, SC17 .40, SC17.41, SC17 .42, SC17 .45, SC17. 46, SC17 • 47, SC17 -49, SC17.50, SC17 • 53, SC17 • 54, SC17. 56, SC17 .57, SC17 • 59, SC17.61, SC17 .63, SC17 .71, SC17. 72, SC17 • 74, SC17 .76, SC17.77, SC17 • 79, SC17 .81, SC17. 82, SC17 .84, SC17 .85, SC17.87, SC17 .89, SC17 .90, SC17. 91, SC17 • 93, SC17 • 95, SC17.97, SC17 • 99, SC17 .102 , SC17. 114, SC17 .115, SC17 .120, SC17121, SC17. 122, SC17 .140, SC17. 151, SC17. 156, SC17. 161, SC17.166, SC17. 187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17.200. 179. Un conjugado de anticuerpo- fármaco de fórmula: M- [L-D] n o una sal farmacéuticamente aceptable de este, donde a) M comprende un modulador de SEZ6 ; b) L comprende un conector opcional; c) D es un agente citotóxico seleccionado del grupo constituido por auristatinas , maitansinoides , amanitinas y dímeros de pirrolobenzodiazepina . d) n es un número entero comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20. 180. El conjugado de anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 179, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este. 181. El conjugado de anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 180, donde el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal . 182. El conjugado de anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 181, donde el anticuerpo deriva de un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17 • 49, SC17 .50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17 .59, SC17 .61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17 .76, SC17 • 77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17 .85, SC17 .87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17 .95, SC17. 97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17 .120, SC17121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17 .161, SC17. 166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17.200. 183. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 182, donde el anticuerpo está humanizado . 184. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 183, donde el conector comprende un conector escindible. 185. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 184, donde el conector escindible comprende un conector peptidílico. 186. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 185, donde el agente antiproliferativo comprende un agente citotóxico. 187. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 186, donde el agente citotóxico comprende una pirrolobenzodiazepina . 188. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 187, donde la pirrolobenzodiazepina comprende un dimero de pirrolobenzodiazepina. 189. Un modulador de SEZ6 que comprende una CDR de cualquiera de las SEQ ID NOS: 20-203. 190. El modulador de SEZ6 de conformidad con la reivindicación 189, donde el modulador comprende una pluralidad de CDR de cualquiera de las SEQ ID NOS: 20-203. 191. Un modulador de SEZ6 de tipo anticuerpo que compite por la unión a una proteína SEZ6 con un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo constituido por SC17.1, SC17 .2, SC17.3, SC17.4, SC17 .8, SC17. 9, SC17.10, SC17 .11, SC17 -14, SC17. .15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17 •19, SC17 .22, SC17, .24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17 .30, SC17 .32, SC17 • 34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17 • 39, SC17 .40, SC17 • 41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17 • 47, SC17 • 49, SC17 .50, SC17.53 , SC17.54 , SC17.56, SC17 .57, SC17 • 59, SC17 .61, SC17.63, SC17.71, SC17.72 , SC17 • 74, SC17 .76, SC17 • 77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17 .84, SC17 .85, SC17 • 87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17 .93, SC17 • 95, SC17. 97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17. 115, SC17 .120, SC17121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17. 156, SC17 .161, SC17. 166 , SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17 .200, donde la unión del modulador de SEZ6 de tipo anticuerpo a la proteína SEZ6 se inhibe al menos un 30% .

Un modulador de SEZ6 que se une a un epítopo de proteína SEZ6 que comprende los aminoácidos Q12, P14, 116, E17 y E18 (SEQ ID NO: 401) . 193. Un modulador de SEZ6 que se une a un epítopo de la proteína SEZ6 que comprende los aminoácidos L73, P74 , F75, Q76, P77, D78 y P79 (SEQ ID NO: 402). 194. Un método para tratar a un sujeto que padece un trastorno proliferativo que comprende el paso de administrar un modulador de SEZ6 que se une a un epítopo contenido en un dominio de SEZ6 seleccionado del grupo constituido por el dominio aminoterminal , el dominio Sushi 1, el dominio Cub 1, el dominio Sushi 2, el dominio Cub 2, el dominio Sushi 3, el dominio Sushi 4 y el dominio Sushi 5. 195. Un modulador de SEZ6 de tipo anticuerpo humanizado seleccionado del grupo constituido por hSC17.16, hSC17.17, hSC17.24, hSC17.28, SC17.34, hSC17.46, SC17.151, SC17.155, SC17.156, SC17.161 y SC17.200.

Ej emplos La presente invención, tal como se ha descrito anteriormente de forma general, se comprenderá más fácilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo ilustrativo y no se pretende que limiten la presente invención. No se pretende que los ejemplos representen que los siguientes experimentos son todos o los únicos experimentos realizados. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio en peso, la temperatura está en grados Centígrados y la presión equivale o es próxima a la presión atmosférica.

Ej em lo 1 Identificación de tumores con características neuroendocrinas y análisis de la expresión de marcadores utilizando la secuenciación del transcriptoma completo Los tumores neuroendocrinos (NET) que se originan en el sistema endocrino difuso son poco frecuentes, con una incidencia de 2-5 cada 100 000 personas, pero son sumamente agresivos. Los tumores neuroendocrinos aparecen en las glándulas suprarrenales, riñon, aparato genitourinario (vejiga, próstata, ovario, cuello uterino y endometrio) , páncreas, tubo gastrointestinal (estómago y colon) , tiroides (cáncer medular de tiroides) y pulmón (carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma neuroendocrino de células grandes y carcinoide) . Estos tumores pueden secretar varias hormonas, incluidas la serotonina y/o cromogranina A, que pueden provocar síntomas debilitantes conocidos como el síndrome carcinoide. Estos tumores se pueden detectar mediante marcadores inmunohistoquímicos positivos tales como la enolasa neuroespecífica (NSE, conocida también como enolasa gamma, símbolo génico = EN02) , CD56/NCAM1 y sinaptofisina . Las quimioterapias tradicionales no han tenido éxito en el tratamiento de NET y la mortalidad debida a la dispersión metastásica es un resultado común. Desafortunadamente, en la mayoría de los casos, la cirugía es el único tratamiento curativo potencial, siempre que se lleve a cabo después de una detección temprana y antes de la metástasis tumoral . En este contexto, se han realizado estudios para identificar dianas terapéuticas novedosas asociadas con tumores que comprenden características neuroendocrinas .

Con el fin de identificar y caracterizar los tumores tal como existen en pacientes que padecen cáncer, se desarrolló y mantuvo un banco de tumores de xenoinjerto no tradicionales (NTX) utilizando técnicas conocidas en la materia. El banco de tumores NTX, que comprende un número sustancial de líneas celulares de tumores discretas, se propagó en ratones inmunodeprimidos mediante múltiples pases de células tumorales heterogéneas obtenidas originariamente a partir de numerosos pacientes con cáncer que padecían diversas neoplasias malignas que generaban tumores sólidos (cabe destacar que en algunos de los Ejemplos y las FIGS . de la presente, el número de pases de la muestra evaluada se indica como p0-p#, el cual se adjunta a la designación de la muestra, donde pO indica una muestra sin pases obtenida directamente a partir de un tumor del paciente y p# indica el número de veces que se ha realizado un pase del tumor por un ratón antes de la evaluación) . La disponibilidad continua de un gran número de líneas celulares de tumores NTX de los primeros pases discretas con linajes bien definidos facilita considerablemente la identificación y la caracterización de células purificadas a partir de las líneas celulares. En el estudio, el uso de líneas celulares NTX sometidas a un número mínimos de pases simplifica la experimentación in vivo y proporciona resultados fácilmente verificables . Es más, los tumores NTX de los primeros pases responden a agentes terapéuticos, tales como irinotecán (es decir, Camptosar®) y regímenes de cisplatino/etopósido, lo cual proporciona perspectivas relevantes desde un punto de vista clínico sobre los mecanismos subyacentes que estimulan el crecimiento tumoral, la resistencia a las terapias actuales y la recidiva tumoral .

A medida que se fueron estableciendo las líneas celulares de tumores NTX, su fenotipo se caracterizó de diversas formas para examinar la expresión génica global. Para identificar qué líneas de NTX en el banco pueden ser NET, se generaron perfiles de expresión génica mediante la secuenciación del transcriptoma completo y/o el análisis de micromatrices . Específicamente, los datos se examinaron para identificar tumores que expresaban niveles elevados de genes específicos que se sabe que son altos en NET o se utilizan como marcadores histoquímicos de la diferenciación neuroendocrina (por ejemplo, ASCL1, NCAM1, CHGA) así como también tumores con cambios en los genes de la vía NOTCH indicativos de la supresión de la señalización de NOTCH (por ejemplo, niveles reducidos de receptores NOTCH, y cambios en ligandos y moléculas efectoras) .

Más particularmente, una vez que se establecieron diversas líneas celulares de tumores NTX tal como se realiza comúnmente para tumores humanos en ratones muy inmunodeprimidos , los tumores se extirparon cuando alcanzaron 800-2000 mm3, y las células se disociaron y dispersaron en suspensión utilizando técnicas de digestión enzimática reconocidas en la materia (remítase, por ejemplo, a la patente de EE . UU. No. 2007/0292414 que se incorpora la presente) . A continuación, se agotaron las células murinas de los preparados de células disociadas a partir de estas líneas NTX, y posteriormente se aislaron además subpoblaciones de células tumorales humanas por clasificación de células activadas por fluorescencia y se lisaron en amortiguador de lisis de ARN RLTplus (Qiagen) . Estos lisados se conservaron posteriormente a -80 °C hasta su uso. Tras descongelarlos, se extrajo el ARN total utilizando un kit de aislamiento RNeasy (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante y se cuantificó en un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scientific) y un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) de nuevo siguiendo los protocolos y los ajustes de los instrumentos recomendados por el fabricante. Los preparados del ARN total resultantes fueron adecuados para la secuenciación genética y el análisis de la expresión génica.

Se realizó una secuenciación del transcriptoma completo utilizando el sistema de secuenciación de nueva generación SOLiD (secuenciación por ligamiento/detección de oligonucleótidos) 4.5 o SOLiD 5500x1 de Applied Biosystems (ABI) (Life Technologies) en muestras de ARN de líneas NTX. Se generó ADNc a partir de muestras de ARN total utilizando un protocolo de transcriptoma completo (WT, por sus siglas en inglés) modificado de ABI diseñado para ARN total de bajo insumo o el sistema Ovation RNA-Seq V2™ (NuGEN Technologies Inc.). El protocolo WT de bajo insumo modificado utiliza 1.0 ng de ARN total para amplificar ARNm en el extremo 3', lo cual conduce a una fuerte distorsión en 3 ' de la expresión génica mapeada, mientras que el sistema de NuGen permite una amplificación más uniforme a lo largo de todo el transcrito e incluye la amplificación de tanto el ARNm como el ADNc trascrito no poliadenilado utilizando hexámeros aleatorios. La colección de ADNc se fragmentó y se añadieron adaptadores con códigos de barras para poder combinar colecciones de fragmentos de muestras diferentes .

Las plataformas de secuenciación de nueva generación SOLiD 4.5 y SOLiD 5500x1 de ABI permiten la secuenciación en paralelo de transcriptomas de múltiples líneas NTX y poblaciones clasificadas. Se construye una colección de ADNc a partir de cada muestra de AR , la cual se fragmenta y se le asigna un código de barras. Los códigos de barras de cada colección de fragmentos permiten combinar múltiples muestras en concentraciones iguales y analizarlas conjuntamente garantizando a la vez la especificidad de cada muestra. Las muestras se someten a PCR de emulsión utilizando el sistema robótico de microesferas SOLiD™ EZ Bead™ de ABI, que garantiza la uniformidad de la muestra. La secuenciación de extremos apareados genera una lectura de 50 bases en la dirección de 5' a 3' y una lectura de 25 bases en la dirección de 3' a 5' para cada fragmento amplificado clonalmente en una única microesfera que existe en la combinación. En el caso de la plataforma 5500x1, para cada grupo de 8 muestras combinadas en el método mencionado anteriormente, se depositan microesferas uniformemente en 6 hileras de un único canal en un único chip. Esto generará, de media, más de 50 millones de lecturas de 50 bases y 50 millones de lecturas de 25 bases para cada una de las 8 muestras y genera una representación muy precisa del nivel de transcrito de AR m en las células tumorales. Los datos generados por la plataforma SOLiD mapearon 34 609 genes tal como anota la versión 47 de RefSeq utilizando la versión hgl9.2 de NCBI del genoma humano publicado y proporcionaron mediciones verificables de los niveles de ARN en la mayoría de las muestras.

La plataforma SOLiD no solo es capaz de capturar la expresión, sino también los SNP, eventos de corte y empalme alternativos conocidos y no conocidos, RNA no codificantes pequeños y potencialmente descubrimientos de nuevos exones basándose únicamente en el alcance de la lectura (lecturas mapeadas especialmente para posiciones genómicas no anotadas previamente) . Por tanto, el uso de esta plataforma de secuenciacion de nueva generación acompañada del análisis de datos registrados y el software de visualizacion permitió de este modo descubrir la expresión diferencial de transcritos así como también diferencias y/o preferencias por variantes de corte y empalme específicas de transcritos de AR m expresados. Los datos de secuenciacion de la plataforma SOLiD se representan nominalmente como un valor de la expresión de transcritos utilizando las cifras de RPM (siglas en inglés de lecturas por millón) y RPK (siglas en ingles de lecturas por kilobase por millón) , lo cual permite el análisis básico de la expresión diferencial según la práctica estándar.

La secuenciacion del transcriptoma completo de cuatro tumores (LU73, LU64, LU86 y LU95) debidos al cáncer de pulmón microcítico (SCLC) , un tumor ovárico (OV26) y un carcinoma neuroendocrino de células grandes (LCNEC; LU37) dio como resultado la determinación de los patrones de expresión génica que se encuentran normalmente en NET (FIG. 6A) . Más específicamente, estos tumores presentaron una alta expresión de varios marcadores de NET (ASCL1, NCAM1, CHGA) , así como también unos niveles reducidos de receptores Notch y moléculas efectoras (por ejemplo, HES1, HEY1) , y una alta expresión de marcadores de la supresión de Notch (por ejemplo, DLL3 y HES6) . En cambio, 4 muestras de pulmón normal, 3 tumores debidos a un adenocarcinoma de pulmón (LU137, LU146 y LU153) y 3 carcinomas de pulmón de células escamosas (LU49, LU70 y LU76) presentan todos ellos expresión de varios receptores Notch y moléculas efectoras, y no muestran una alta expresión de supresores de Notch tales como HES6 y DLL3.

Además, tal como se observa en la FIG. 6B, un análisis de los datos del transcriptoma completo que compara muestras de tejidos normales con varias poblaciones de NTX de pulmón con características neuroendocrinas mostró que SEZ6 presentaba una expresión mayor en el nivel del transcrito de ARNm en cuatro poblaciones de cáncer de pulmón con características neuroendocrinas (LU73, LU64 , LU86 y LU95) en comparación con una expresión del transcrito extremadamente baja o nula en los tejidos normales evaluados. Estos resultados sugieren que SEZ6 puede desempeñar una función importante en la tumorigénesis y el mantenimiento de cánceres particulares (incluidos los cánceres de pulmón con características neuroendocrinas) . Basándose en estos resultados, se seleccionó SEZ6 para análisis posteriores como una diana inmunoterapéutica potencial .

Ejemplo 2 Análisis de micromatrices y por RT-PCR de la expresión génica en tumores NTX seleccionados con características neuroendocrinas Para intentar identificar NET adicionales en el banco de NTX mencionado anteriormente, aparte de para los que se dispone de datos del transcriptoma completo obtenidos por SOLiD, se examinó un grupo mayor de líneas NTX utilizando un análisis de micromatrices. Específicamente, se analizaron 2-6 µ9 de muestras de ARN total derivadas de tumores enteros en 46 líneas NTX o de 2 tejidos normales utilizando una plataforma de micromatrices OneArray* (Phalanx Biotech Group) , que contiene 29 187 sondas designadas contra 19 380 genes en el genoma humano. Más específicamente, se obtuvieron muestras de ARN (como se ha descrito en el Ejemplo 1) a partir de 46 tumores NTX enteros derivados de pacientes que comprendían cánceres colorrectales (CR) , melanoma (SK) , de riñon (KD) , pulmón (LU) , ováricos (OV) , de endometrio (EM) , mama (BR) , hígado (LIV) o pancreáticos (PA) . Se utilizaron tejidos colorrectales normales (NormCR) y de páncreas normal (NormPA) como controles. Aún más específicamente, los tumores de pulmón se subclasificaron además como cánceres de pulmón microcíticos (SCLC) , cánceres de células escamosas (SCC) o carcinomas neuroendocrinos de células grandes (LCNEC) . Las muestras de ARN se analizaron por triplicado utilizando los protocolos del fabricante y los datos resultantes se analizaron utilizando prácticas estándar en la industria para normalizar y transformar los valores de intensidad medidos obtenidos para el gen en cuestión en cada muestra. Se utilizó un algoritmo de agrupación jerárquica de Pearson Spearman imparcial en el conjunto de paquetes de R/BioConductor denominado hclust.2 para crear un dendrograma micromatricial estándar para estas 48 muestras. Como se sabe en la técnica, R/BioConductor es un lenguaje de programación estadístico de código abierto de uso extendido entre los círculos académicos, financieros y la industria farmacéutica para el análisis de datos. Por lo general, los tumores se dispusieron y agruparon en función de sus patrones de expresión génica, intensidad de expresión, etc.

Tal como se muestra en la FIG. 7A, el dendograma derivado de las 48 muestras y para todos los 19 380 genes, agrupó líneas NTX juntas en función de su tipo de tumor o tejido de origen. Varios tumores normalmente asociados con fenotipos neuroendocrinos se agruparon juntos en la rama señalada como (1); estos incluían cánceres de piel, numerosos cánceres de pulmón y otros NET. Resulta interesante que una subrama, señalada como (2) , mostró que dos cánceres de pulmón de células granes con características neuroendocrinas (LU50.LCNEC y LU37. LCNEC) y un cáncer de pulmón microcítico (LU102.SCLC) se agruparon con un tumor ovárico (OV26) y un tumor de riñon (KD66) (grupo C) , lo cual sugiere que estos últimos tumores también poseían fenotipos neuroendocrinos . Además, la FIG. 7A muestra un grupo D, el cual está constituido por 3 tumores SCLC adicionales, y a su derecha se encuentra un grupo pequeño (grupo E) que contiene un tumor SCLD adicional (LU100) y un tumor de endometrio neuroendocrino (EM6) . Por lo general, se sobreentiende que todos los tumores de los grupos D y E poseen algunas características neuroendocrinas , basándose en la bibliografía académica y la experiencia patológica en centros sanitarios. El hecho de que el grupo G, que comprende SCC, se pueda encontrar en una rama completamente diferente del dendrograma de la FIG. 7A indica que la agrupación no depende exclusivamente del órgano de origen del tumor.

Una inspección más exhaustiva de una colección de marcadores génicos asociados con NET (FIG. 7B) muestra que estos se expresan en niveles elevados en tumores que forman parte de los grupos C y D, mientras que se expresan en niveles mínimos en tumores del grupo G (carcinoma de células escamosas del pulmón) , lo cual sugiere que los grupos C y D representan NET o tumores con un fenotipo neuroendocrino. Más específicamente, los NET del grupo C expresan niveles elevados de ASCL1, CALCA, CHGA, SST y NKX2-1, mientras que los NET del grupo D expresan niveles elevados de CHGA, EN02 y NCAM1, y es la expresión de estos genes de fenotipo neuroendocrino la responsable en parte de la agrupación de estos tumores. Una característica interesante es la fuerte expresión de KIT en el grupo D, un gen cuya asociación con tumores neuroendocrinos ha sido descrita ocasionalmente, pero que se relaciona claramente con la oncogénesis en otros contextos. Esto contrasta con los tumores SCC del grupo G que carecen de una fuerte expresión de cualquiera de estos genes (FIG. 7B) .

Los tumores del grupo C muestran un fenotipo consonante con una reducción en la señalización Notch: una falta de expresión de cualquier receptor Notch, una falta relativa de expresión de JAG1 y HES1, y niveles elevados de expresión de ASCL1 (FIG. 7C) . Resulta interesante que el grupo D muestre una alta expresión de HES6, un factor de transcripción que puede estimular la actividad de ASCL1 al antagonizar la actividad de HES1 mediante la formación de heterodímeros .

En vista de los resultados mencionados anteriormente, se examinó la expresión de ARNm de HES26 procedente de diversas líneas NTX y tejidos normales utilizando un equipo 7900HT de Applied Biosystems (Life Technologies) para realizar una RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) a tiempo real Taqman de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se aisló ARN como se ha descrito anteriormente y se chequeó para comprobar que su calidad era adecuada para el análisis de la expresión génica.

Se compró ARN de tejidos normales (Agilent Technologies y Life Technologies) . Se utilizaron 200 ng de ARN para sintetizar ADNc utilizando el kit de archivo de ADNc (Life Technologies) . El ADNc se utilizó para el análisis de qRT-PCR en matrices de baja densidad de Taqman (TLDA; Life Technologies) que contenían el ensayo Taqman de HES6 para medir los niveles de ARNm de HES6.

Se muestran los niveles de ARNm de HES6 para cada muestra de las líneas NTX o tejidos normales (un punto en la gráfica) después de la normalización respecto a controles endógenos. Los valores normalizados se representan gráficamente en relación con la expresión media en los tejidos normales de interés para la toxicidad (NormTox). Esta técnica permitió identificar y caracterizar rápidamente diversos tumores con características neuroendocrinas a partir del banco de tumores NTX mediante la medición de HEs6 y otros marcadores relevantes. La FIG. 7D ilustra la sobreexpresión general de HES6 en los tumores con características neuroendocrinas a partir de los cuales se extrajeron muestras (por ejemplo, LU-SCLC, LU-LCNEC) en comparación con tejidos normales, tumores de mama, colon, hígado y otros tumores seleccionados. Es significativo que estos datos micromatriciales y de qPCR muestren que al menos algunos tumores de endometrio, riñon y ováricos pueden exhibir características tumorales neuroendocrinas (FIGS. 7A y 7D) .

Los datos micromatriciales generados como se ha descrito anteriormente no solo mostraron que los tumores en los grupos C, D y E exhibían varios marcadores neuroendocrinos , sino que también mostraron que los tumores en esos grupos expresaban marcadores que indicaban neurogénesis , compromiso neural o diferenciación hacia los destinos neurales (FIG. 7E) . Cabe destacar que los tumores en el grupo D presentan frecuentemente un aumento de la expresión más fuerte y más uniforme de muchos de estos marcadores (por ejemplo, receptores BEX1 y BEX4, CD56, NRCAM, SEMA, factores SOX y ZIC) y presentan frecuentemente un aumento de la expresión hormonal menor en comparación con otros grupos, lo cual sugiere un fenotipo más neural.

Ejemplo 3 Expresión de ARNm de SEZ6 en tumores con características neuroendocrinas y neurales Se utilizaron varias técnicas para identificar tumores con características neuroendocrinas, que incluyeron la secuenciación del transcriptoma completo (Ejemplo 1) , así como también la micromatriz y qRT-PCR (Ejemplo 2) . Los datos generados de este modo se analizaron posteriormente con el fin de establecer dianas terapéuticas potenciales que presenten una expresión muy elevada en tumores neuroendocrinos en comparación con tumores no neuroendocrinos y tejidos normales. Como se ha expuesto en el Ejemplo 1, se ha comprobado que SEZ6, una proteína transmembranal de un único pase que se expresa principalmente en el cerebro normal, presenta una expresión elevada en muchos tumores neuroendocrinos (FIG. 6B) .

Los datos micromatriciales generados en el Ejemplo 2 indicaron que los tumores localizados en los grupos C, D y E expresaban marcadores neuroendocrinos (FIG. 7B) y marcadores neurales (FIG. 7E) . Cabe destacar que los tumores en esos mismos grupos también presentaron niveles elevados del transcrito de SEZ6, lo cual sugiere que SEZ6 está asociado con tumores de características neuroendocrinas y neurales (FIG. 7F) . Esto concuerda con la función conocida de SEZ6 en el desarrollo del prosencéfalo posnatal y la expresión continuada en las regiones específicas del hipocampo en el adulto. Se cree que SEZ6 desempeña funciones importantes en la señalización y el reconocimiento célula-célula. A menudo las vías de desarrollo se expresan de forma inadecuada en los tumores .

Con el fin de determinar los niveles de expresión del ARNm de SEZ6 en líneas de tumores NTX de varias muestras, se realizó una qRT-PCR utilizando el ensayo de Taqman para SEZ6 esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 2 anteriormente. La FIG. 8A muestra la expresión de SEZ6 en comparación con la expresión media en tejidos normales y está normalizada respecto a la expresión del gen de control endógeno ALAS1. La expresión génica de SEZ6 es 10 000 000 de veces superior en poblaciones de NTX neuroendocrino en comparación con los tejidos normales. Cinco de las lineas de NTX SCLC mostradas en la FIG. 8A son muestras de ARNm extraídas directamente de biopsias primarias (pO) . La expresión de SEZ6 en estos tumores sin pases demuestra que la expresión de SEZ6 no es un artefacto que se obtenga como resultado de desarrollar tumores humanos en ratones. En la FIG. 8A también se representan tres subtipos de NSCLC: LU25 es un carcinoma de células fusiformes, LU50 es un carcinoma neuroendocrino de células grandes (LCNEC) y LU85 es un carcinoma de células escamosas (SCC) . KDY66 y OV26, que representan un tumor de riñon y ovario, respectivamente, se agruparon en la micromatriz junto con los tumores SCLC y LCNEC (FIG. 7A) , lo cual sugiere que también presentan características neuroendocrinas .

Para extender el análisis de la expresión de SEZ6 a una matriz más amplia de muestras de tumores, se realizó una qRT-PCR utilizando el sistema Fluidigm BioMark™ HD. Resumiendo, 1 ng de ARN, preparado como se ha descrito en el Ejemplo 1, se convirtió en ADNc utilizando el kit de archivo de ADNc (Life Technologies) . El ADNc se preamplificó utilizando un ensayo de Taqman específico para SEZ6 y a continuación se utilizó para llevar a cabo la qRT-PCR. La expresión en tejidos normales (NormTox o Norm) se comparó con la expresión en las líneas de NTX siguientes, donde el número entre paréntesis indica el número de líneas de NTX únicas evaluadas: BR (5), CR (6) , KDY (9) , OV (16) , PA (9) , adenocarcinoma de pulmón (LU-Adeno) (7), LCNEC (2), SCC (11) y SCLC (15) (FIG. 8B) . El NTX de SCLC y LCNEC presentó la expresión más elevada de SEZ6, aunque también se observó cierta expresión de SEZ6 en líneas de NTX de OV, PA, CR y LU-Adeno en comparación con las muestras de tejido normal.

"NormTox" representa las siguientes muestras de tejido normal: dos muestras de colon, dos de riñon, dos de hígado, dos de pulmón, dos de páncreas, dos de corazón, una de esófago, una de músculo esquelético, una de piel, una de intestino delgado, una de bazo, una de estómago y una de tráquea. Otro conjunto de tejidos normales denominados "Norm" representa las siguientes muestras de tejido normal: cerebro, mama, cuello uterino, ovario, células mononucleares de sangre periférica, placenta, próstata, testículos, timo y tiroides. La mayoría de tejidos normales no presentan expresión de SEZ6, mientras que se observa una expresión baja en el páncreas, colon, hígado y pulmón, y una expresión elevada en el cerebro. Se llevó a cabo un ensayo de Taqman específico para SEZ6 diferente, utilizando esencialmente el mismo método que se ha descrito anteriormente, en varias líneas de tumores NTX. El número de líneas tumorales que se evaluaron para cada tipo de tumor se representa como el denominador, mientras que el número de tumores que expresaron SEZ6 se representa como el numerador: 1/5 CR, 2/2 GA, 1/1 GB (glioblastoma) , 1/1 KDY, 2/6 SK, 2/4 LU-Adeno, 2/2 LCNEC, 3/10 LU-SCC, 10/10 SCLC y 1/2 OV (no se muestran los datos) .

Considerados conjuntamente, estos datos sugieren que la expresión de SEZ6 es mayor en tumores que presentan características neuroendocrinas y neurales, lo cual sugiere que puede servir como una diana terapéutica para el tratamiento de estos tipos de tumores.

Ejemplo 4 Expresión de ARNm de SEZ6 en varias muestras tumorales y de tejido normal utilizando qRT-PCR Para extender el análisis de la expresión de SEZ6 a una matriz más amplia de muestras de tumores, se llevó a cabo una qRT-PCR Taqman sustancialmente como se ha descrito en los Ejemplos previos en una matriz de 384 pocilios para qPCR TissueScan™ (Origene Technologies) . Esta matriz permite comparar la expresión génica de 18 tipos de tumores sólidos diferentes, con múltiples muestras derivadas de pacientes para cada tipo de tumor y de tejido adyacente normal.

A este respecto, las FIGS . 9A y 9B muestran los niveles de expresión génica absoluta y relativa, respectivamente, de SEZ6 en muestras de tumores enteros (puntos grises) o tejido adyacente normal (NAT; puntos blancos) de pacientes con uno de los dieciocho tipos de tumores sólidos diferentes. Más específicamente, la FIG. 9A muestra el nivel de expresión de ARNm absoluto para SEZ6 en varias muestras de tumores enteros o tejido adyacente normal de características similares. La FIG. 9B muestra el nivel de expresión de SEZ6 una vez normalizado respecto a la ß-actina y se representa gráficamente de forma relativa a la expresión en tejido adyacente normal para cada tipo de tumor analizado. A las muestras en las cuales no se detectó SEZ6 se les asignó un valor Ct de 50, que representa el último ciclo de amplificación en el protocolo experimental. Cada punto representa una única muestra de tejido, representándose el valor de la media geométrica como una línea negra.

Utilizando esta matriz de Origene, se observó la sobreexpresión de SEZ6 en un subconjunto de cánceres suprarrenales, de hígado, de pulmón, ováricos y pancreáticos, muchos de los cuales pueden representar tumores neuroendocrinos o tumores con fenotipos neuroendocrinos poco diferenciados. Como indica la expresión génica absoluta en la FIG. 9A, el páncreas y los testículos normales son los únicos tejidos normales con una expresión elevada de SEZ6. Esto sugiere que SEZ6 puede desempeñar una función en la tumorigénesis y/o el avance del tumor en una amplia variedad de tumores, incluidos, sin carácter limitante, aquellos que presentan características neuroendocrinas y neurales.

Ejemplo 5 Clonación y expresión de proteínas SEZ6 recombinantes SEZ6 humana Con el fin de generar y desarrollar todos los materiales moleculares y celulares necesarios en la presente invención con relación a SEZ6 humana, se generó ADNc (FIG. 3A; SEQ ID NO: 5) que codificaba la proteína SEZ6 humana madura completa (FIG. 3B, SEQ ID NO: 6) como se indica a continuación. Se adquirió ADNc humano comercial para SEZ6 de Open Biosystems, donde esta secuencia de ADNc corresponde al número de acceso del NCBI BC146292. Las alineaciones secuenciales indicaron que la proteína codificada por BC146292 difería en varios residuos de la de RefSeq NP_849191 (remítase a los residuos 414, 415 y 417, FIG. 3C) , que codifica la proteína SEZ6 humana endógena. Se utilizó PCR para amplificar dos fragmentos de ADNc diferentes del clon BC146292, donde los cebadores utilizados introdujeron los cambios deseados en el ADNc en los residuos 414-417 durante el proceso de superponer PCR para crear un ADNc que codificara una proteína SEZ6 madura con una secuencia idéntica a la codificada por NM_178860, la secuencia de ARNm que codifica la proteína SEZ6 humana endógena. El clon de ADNc reparado, denominado hSCRxl7 (FIG. 3A) , se utilizó para todas las modificaciones por ingeniería genética posteriores de los constructos que expresaban la proteína SEZ6 humana madura o fragmentos de esta.

Con el fin de generar moduladores inmunorreactivos o inmunoespecífieos para la molécula de SEZ6, se generó un gen de fusión quimérico en el cual la porción ECD de la proteína SEZ6 humana se fusionó con el dominio Fe de IgG2 humana (FIG. 4A, SEQ ID NO: 8) . Esto se llevó a cabo como se indica a continuación: el ADNc que codifica el ECD de SEZ6 se amplificó mediante PCR a partir del clon de ADNc hSCRxl7 (FIG. 3A) y este producto de PCR se subclonó posteriormente en un vector de expresión dirigido por CMV en fase y en dirección 31 respecto a la secuencia del péptido señal de IgK y en dirección 5' respecto al ADNc de Fe de IgG2 humana, utilizando técnicas moleculares estándar. La secuencia de ADNc que codifica la proteína de fusión hSEZ6-Fc, denominada hSCRxl7-Fc ORF, se muestra en la FIG. 4A; la correspondiente secuencia proteica codificada por hSCRxl7-Fc ORF se muestra en la FIG. 4B (SEQ ID NO: 9) . Las regiones subrayadas de las secuencias corresponden a Fe de IgG2 humana. Las regiones subrayadas y en negrita corresponden al péptido señal de IgK y las secuencias en negrita corresponden a las porciones de la proteína de fusión codificadas por los sitios de restricción de la clonación que flanquean el ECD de SEZ6.

Para generar una proteína de ECD hSEZ6 recombinante , se utilizó una estrategia basada en PCR similar. El fragmento de ADNc que codifica el ECD de SEZ6 se amplificó a partir del clon de ADNc hSCRx!7 y se subclonó en un vector de expresión dirigido por CMV en fase y en dirección 3 ' respecto a la secuencia del péptido señal de IgK y en fase y en dirección 5' respecto a una secuencia que codifica un marcador epitópico de 9-histidina (SEQ ID NO: 400) .

El vector de expresión dirigido por CMV permite una expresión transitoria de nivel elevado en células HEK-293T y/o CHO-S. Los cultivos adherentes o en suspensión de células HEK-293T, o células CHO-S en suspensión se transíectaron con constructos de expresión que codificaban proteínas hSEZ6 ECD-Fe o hSEZ6-ECD-His, utilizando un polímero de polietilenimina como reactivo de transfección. De tres a cinco días después de la transfección, las proteínas hSEZ6 ECD-Fc o hSEZ6-ECD-His se purificaron a partir de sobrenadantes celulares clarificados utilizando un explorador AKTA y o bien Proteína A MabSelect SuRe (GE Healthcare Life Sciences) o columnas de níquel-EDTA (Qiagen) , respectivamente.

Se construyó una línea celular estable que sobreexpresaba SEZ6 humana recombinante utilizando vectores lentivíricos para transducir las células HEK-293T como se indica a continuación: se llevó a cabo una amplificación mediante PCR utilizando el clon hSCRxl7 como modelo con el fin de producir un fragmento de ADNc que codificara la proteína SEZ6 humana madura. El fragmento que se generó se subclonó en fase en dirección 31 respecto a una secuencia que codificaba un péptido señal de IgK y un marcador epitópico de DDK modificado por ingeniería genética previamente en dirección 5' respecto al sitio de clonación múltiple de pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP (System Biosciences) utilizando técnicas de clonación molecular estándar. El vector lentivírico bicistrónico resultante se utilizó para modificar por ingeniería genética líneas celulares que sobreexpresaban un péptido SEZ6-T2A humano-polipéptido GFP. La secuencia de T2A fomenta el salto ribosómico de una condensación de enlace peptídico, lo cual da como resultado dos proteínas independientes, en este caso SEZ6 y GFP.

SEZ6 murina Se modificó por ingeniería genética una línea celular estable que sobreexpresaba SEZ6 murina recombinante esencialmente como se ha descrito anteriormente para SEZ6 humana recom inante. Se transdujeron células HEK-293T con un vector lentivírico que expresaba SEZ6 murina. El vector se modificó por ingeniería genética esencialmente como se indica a continuación. Se obtuvo un fragmento de ADNc (FIG. 5A; SEQ ID NO: 10) que codificaba la proteína SEZ6 murina madura enumerada como RefSeq NM_021286 en la base de datos del NCBI (FIG. 5B; SEQ ID NO: 11) mediante amplificación por PCR a partir de ADNc murino comercial para SEZ6 (Origene; # C203634) y se subclonó en dirección 3' respecto a una secuencia del péptido señal de IgK y una secuencia de marcador epitópico de DDK previamente modificada por ingeniería genética en dirección 5' respecto al sitio de clonación múltiple de pCDH-EFl-MCS-IRES-RFP (System Biosciences) utilizando técnicas de clonación molecular estándar. Esto proporcionó un vector lentivírico bicistrónico que se utilizó para producir una línea celular HEK-293T que sobreexpresara SEZ6 y RFP de murino.

SEZ6 de rata Para generar y desarrollar todos los materiales moleculares y celulares necesarios en la presente invención con relación a las proteínas SEZ6 de rata, el ADNc (FIG. 5C, SEQ ID NO: 12) que codificaba la proteína SEZ6 de rata madura completa (FIG. 5D, SEQ ID NO: 13) se obtuvo como se indica a continuación. Se amplificó un ADNc que codificaba la proteína de rata madura completa (es decir, la proteína completa menos el péptido señal natural) a partir de ADNc Marathon-ready de cerebro de rata (Clontech #639412) . Las alineaciones secuenciales indicaron que el ECD de la proteína codificada era homólogo a la proteína SEZ6 de rata endógena enumerada como RefSeq NP_001099224 en la base de datos del NCBI . Este clon de ADNc, denominado rSCRxl7 (FIG. 5D) , se utilizó para la modificación posterior de constructos que expresaban fragmentos de la proteína SEZ6 de rata .

SEZ6 cinomóloga Para generar y desarrollar todos los materiales moleculares y celulares necesarios en la presente invención con relación a las proteínas SEZ6 cinomólogas, el ADNc (FIG. 5E, SEQ ID NO: 14) que codificaba la proteína SEZ6 cinomologa (FIG. 5F, SEQ ID NO: 15) se obtuvo como se indica a continuación: Una secuencia de ORF de SEZ6 cinomóloga prevista se acopló mediante análisis bioinformático del siguiente modo: el ORF del gen SEZ6 humano se obtuvo a partir del número de acceso del NCBI NM_178860 y se comparó, utilizando el algoritmo BLAST, con los cóntigos de secuenciación aleatoria (shotgun) del genoma completo en la base de datos del NCBI. A continuación, los resultados de BLAST se utilizaron para acoplar posibles ORF de SEZ6 cinomólogos. La secuencia que codificaba el péptido señal natural previsto de SEZ6 cinomóloga se eliminó de estas secuencias derivadas de BLAST y se reemplazó con una secuencia que codificaba una secuencia de péptido señal de IgK. Después de la optimización de codones para la producción en células de mamífero, esta secuencia de ORF híbrida completa se clasificó como un gen sintético (GeneWiz) . Este clon de ADNc optimizado, denominado cSCRxl7 (FIG. 3E) , se utilizó para modificar por ingeniería genética posteriormente constructos que expresaban fragmentos de la proteína SEZ6 cinomóloga .

SEZ6L y SEZ6L2 humanas En el genoma humano, existen dos genes estrechamente relacionados con SEZ6 : el gen similar al homólogo relacionado con las convulsiones 6 (SEZ6L) y el gen similar al homólogo relacionado con las convulsiones 6-2 (SEZ6L2) . Aunque el porcentaje global de identidad es relativamente bajo entre las tres proteínas (~42%) , existen tramos más pequeños de identidad perfecta entre dos de las proteínas o entre las tres proteínas. Con el fin de investigar cualquier reactividad cruzada posible de los moduladores anti-SEZ6 con las proteínas humanas SEZ6L y SEZ6L2, los marcos de lectura abiertos que codifican los ECD de la proteína SEZ6L humana (NP_0066938) y la proteína SEZ6L2 humana (NP_001230261) se optimizaron, en cuanto a sus codones, y se sintetizaron (GeneWiz) . Estas secuencias de ADNc optimizadas que codifican los ECD de las proteínas SEZ6L y SEZ6L2 humanas se muestran en las FIGS. 5G y 51.

Material para estudios de reactividad cruzada Se generó material con el fin de estudiar si los moduladores de SEZ6 de la invención presentan reactividad cruzada con los homólogos de SEZ6 de cinomólogo y/o rata, o con las proteínas SEZ6L y SEZ6L2 humanas estrechamente relacionadas. Se diseñaron genes de fusión quiméricos en los cuales la porción ECD de la proteína SEZ6 de cinomólogo o rata (subrayada en las FIGS. 5D y 5F, respectivamente) estaba fusionada con un marcador epitópico de 9-histidina (SEQ ID NO: 400) . Utilizando PCR, el fragmento de ADNc que codificaba el ECD de SEZ6 de cinomólogo o rata se amplificó a partir de rSCRxl7 o cSC xl7, respecti amente, y se subclonó en un vector de expresión dirigido por CMV en fase y en dirección 3 ' respecto a una secuencia de péptido señal de IgK y en fase y en dirección 5' respecto a una secuencia que codificaba un marcador epitópico de 9-histidina (SEQ ID NO: 400) . De forma análoga, se diseñaron genes de fusión quiméricos en los cuales el marco de lectura abierto que codificaba la porción ECD de las proteínas SEZ6L o SEZ6L2 humanas se subclonó en un vector de expresión dirigido por CMV en fase y en dirección 3' respecto a una secuencia de péptido señal de IgK y en marco y en dirección 51 respecto a una secuencia que codificaba un marcador epitópico de 9-histidina (SEQ ID NO: 400) . Las secuencias de proteínas codificadas resultantes para estas proteínas de fusión se muestran en las FIGS. 5H y 5J, respectivamente, donde la secuencia subrayada representa el ECD de la proteína particular que se está considerando.

Los vectores de SEZ6 ECD-His de rata y cinomólogo generados anteriormente se utilizaron para producir y purificar la proteína rSEZ6-ECD-His y la proteína CSEZ6-ECD-His recombinantes , respectivamente, como se indica a continuación: utilizando técnicas reconocidas en la materia, los cultivos adherentes o en suspensión de células HEK-293T, o células CHO-S en suspensión se transíectaron con los vectores de expresión que codificaban la proteína rSEZ6-ECD- His o cSEZ6 -ECD-His . Se utilizó un polímero de polietilenimina como reactivo de transfección. De tres a cinco días después de la transfección, se purificó la proteína rSEZ6 -ECD-His o cSEZ6 -ECD-His a partir de sobrenadantes celulares clarificados utilizando un explorador AKTA y columnas de níquel-EDTA (Qiagen) . De forma análoga, se utilizaron los vectores humanos SEZ6L-ECD-His y SEZ6L2 -ECD-His para producir y purificar la proteína humana recombinante SEZ6L-ECD-His y la proteína humana SEZ6L2 -ECD-His , como se ha descrito para los homólogos de rata y cinomólogo.

Ejemplo 6 Generación de moduladores murinos anti-SEZ6 Se produjeron moduladores de SEZ6 en forma de anticuerpos murinos de acuerdo con los principios de la presente mediante la inoculación con SEZ6-Fc humano. A este respecto, se utilizaron tres cepas de ratón para generar moduladores de tipo anticuerpo monoclonal murino de alta afinidad que se puedan utilizar para asociarse con SEZ6 y/o inhibir su acción con el fin de prevenir y/o tratar varios trastornos proliferativos . Específicamente, se inmunizaron las cepas de ratón Balb/c, CD-1 y FVB con SEZ6-Fc recombinante humano y se utilizaron para producir hibridomas.

El antígeno SEZ6-FC se purificó a partir del sobrenadante de células CHO-S que sobreexpresaban el constructo SEZ6-FC como se ha expuesto en el Ejemplo 5 (FIGS. 4A y 4B) . Se utilizaron 10 ig del inmunógeno SEZ6-FC para la primera inmunización y a continuación se utilizaron 5 pg y 2.5 pg del inmunógeno SEZ6-Fc para las siguientes tres inmunizaciones y cinco inmunizaciones, respectivamente. Todas las inmunizaciones se llevaron a cabo con el inmunógeno emulsionado con un volumen equivalente de TITERMAX* Gold (CytRx Corporation) o adyuvante de alumbre. Los anticuerpos murinos se generaron inmunizando seis ratones hembra (dos de cada uno de los siguientes: Balb/c, CD-1, FVB) a través de la almohadilla plantar para todas las inyecciones.

Se utilizaron ensayos ELISA en fase sólida para cribar los sueros de ratón con el fin de determinar los anticuerpos IgG de ratón específicos para SEZ6 humana. Una señal positiva por encima del ruido de fondo indicaba la presencia de anticuerpos específicos para SEZ6. Resumiendo, se recubrieron placas de 96 pocilios (VWR International, No. de catálogo 610744) con 0.5 g/ml de SEZ6-His recombinante en amortiguador de recubrimiento para ELISA durante toda la noche. Tras lavar con PBS que contenía un 0.02% (v/v) de Tween 20, los pocilios se bloquearon con un 3% (p/v) de BSA en PBS, 200 pL/pocillo, durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). El suero de ratón se tituló (1:100, 1:200, 1:400 y 1:800), se añadió a las placas recubiertas con SEZ6 en una cantidad de 50 L/pocillo y se incubó a TA durante 1 hora. Las placas se lavaron y después se incubaron con 50 µ /pocillo de anticuerpo anti-IgG de ratón producido en cabra marcado con HRP, diluido con un factor de 1:10 000 en un 3% de BSA-PBS o un 2% de FCS en PBS durante 1 hora a TA. Las placas se lavaron nuevamente y se añadieron 40 µ?/pocillo de una solución del sustrato TMB (Thermo Scientific 34028) durante 15 minutos a TA. Tras el revelado, se añadió un volumen equivalente de H2S04 2 N para detener el revelado del sustrato y las placas se analizaron con un espectrofotómetro para una DO de 450.

Los ratones inmunizados cuyo suero era positivo se sacrificaron y se les extirparon los ganglios linfáticos drenantes (poplíteos e inguinales, e ilíacos medios si estaban inflamados) y se utilizaron como fuente de células productoras de anticuerpos. Una suspensión de un único tipo de linfocitos B (228.9xl06 linfocitos) se fusionó con células de mieloma P3x63Ag8.653 no secretoras (ATCC #CRL-1580) en una proporción de 1:1 por electrofusión. La electrofusión se llevó a cabo utilizando el sistema BTX Hybrimmune (BTX Harvard Apparatus) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras el procedimiento de fusión, las células se volvieron a suspender en medio de selección de hibridomas suplementado con azaserina (Sigma #A9666) , medio DMEM de alto contenido de glucosa con piruvato sódico (Cellgro, No. de catálogo 15-017-CM) que contenía un 15% de suero fetal Clone I (Hyclone) , un 10% de BM Condimed (Roche Applied Sciences) , L-glutamina 4 mM, 100 IU de penicilina-estreptomicina y 2-mercaptoetanol 50 µ?, y después se colocaron en tres frascos T225 en 90 mL de medio de selección por frasco. A continuación, los frascos se introdujeron en una incubadora humidificada a 37°C que contenía un 5% de C02 y un 95% de aire durante 6-7 días.

Una vez transcurridos de seis a siete días de cultivo, la colección constituida por las células cultivadas a granel en los frascos T225 se colocó con una concentración de 1 célula por pocilio en placas Falcon de 96 pocilios con fondo en forma de U utilizando el clasificador de células Aria I. Los hibridomas seleccionados se cultivaron posteriormente en 200 µL de medio de cultivo que contenía un 15% de suero fetal Clone I (Hyclone) , un 10% de BM-Condimed (Roche Applied Sciences) , piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 4 mM, 100 IU de penicilina-estreptomicina, 2-mercaptoetanol 50 µ? e hipoxantina 100 µ?. Las posibles células de la colección de hibridomas no utilizadas remanentes se congelaron para pruebas futuras de la colección. Una vez transcurridos de diez a once días de cultivo, se analizaron los sobrenadantes de cada pocilio de las células que se encontraban en las placas para detectar los anticuerpos que reaccionaban con SEZ6 mediante ensayos ELISA y FACS.

Para el cribado con ELISA, se recubrieron placas de 96 pocilios con 0.3 µg/mL de SEZ6-Fc en PBS durante toda la noche a 4°C. Las placas se lavaron y se bloquearon con un 3% de BSA en PBS/Tween durante una hora a 37°C y se utilizaron inmediatamente o se conservaron a 4°C. Los sobrenadantes de los hibridomas sin diluir se incubaron en las placas durante una hora a TA. Las placas se lavaron y se sondearon con el anticuerpo anti-IgG de ratón producido en cabra marcado con HRP, diluido con un factor de 1:10 000 en un 3% de BSA-PBS durante una hora a TA. A continuación, las placas se incubaron con una solución de sustrato tal como se ha descrito anteriormente y la lectura se realizó a una DO de 450. Los pocilios que contenían i munoglobulina que se unió preferentemente a SEZ6 humana, según se determinó con una señal por encima del ruido de fondo, se transfirieron y se extendieron .

Los pocilios con hibridomas positivos del cultivo seleccionados que secretaban inmunoglobulina murina también se cribaron para determinar su especificidad por SEZ6 humana y su reactividad cruzada con SEZ6 de cinomólogo, rata y murino, utilizando un ensayo basado en citometría de flujo con 293 células modificadas para que sobreexpresaran el antígeno seleccionado o constructos fabricados en el Ejemplo previo .

Para los ensayos de citometría de flujo, 50xl04 células h293 transducidas respectivamente con SEZ6 humana, de cinomólogo, rata o murino se incubaron durante 30 minutos con 25-100 iL de sobrenadante de hibridomas. Las células se lavaron con PBS/2% de FCS dos veces y después se incubaron con 50 µ?,? de un fragmento Fe de anticuerpo anti-IgG de ratón producido en cabra específico secundario conjugado con DyLight 649 diluido con un factor de 1:200 en PBS/2% de FCS. Después de 15 minutos de incubación, las células se lavaron dos veces con PBS/2% de FCS, se volvieron a suspender en el mismo amortiguador con DAPI y se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un instrumento FACSCanto II según las instrucciones del fabricante. Los pocilios que contenían inmunoglobulina que se unía preferentemente a células SEZ6+ GFP+ se transfirieron y se expandieron. Los hibridomas clónicos específicos para hSEZ6 resultantes se conservaron criológicamente en medio de congelación CS-10 (Biolife Solutions) y se guardaron en nitrógeno líquido. Los anticuerpos que se unían a células con SEZ6 humanas, de cinomólogo, rata o murino se consideraron anticuerpos con reactividad cruzada (remítase a la FIG. 11A) .

Los análisis de ELISA y de citometría de flujo confirmaron que el anticuerpo purificado a partir de todos o la mayoría de estos hibridomas se unía a SEZ6 de un modo dependiente de la concentración. Los pocilios que contenían inmunoglobulina que se unía a células con SEZ6 y GFP se transfirieron y se expandieron. Los hibridomas clónicos resultantes se conservaron criológicamente en medio de congelación CS-10 (Biolife Solutions) y se guardaron en nitrógeno líquido.

Se realizó una fusión y se sembró en 48 placas (4608 pocilios con una eficiencia de clonación de aproximadamente un 40%) . El cribado inicial proporcionó sesenta y tres anticuerpos murinos que se asociaron con SEZ6 humana. Posteriormente, se realizó un segundo cribado y proporcionó 134 anticuerpos que se asociaron con SEZ6 humana.

Ejemplo 7 Secuenciación de moduladores murinos de SEZ6 Basándose en lo anterior, se seleccionaron varios anticuerpos monoclonales diferentes ilustrativos que se unían a células h293-hSEZ6 o SEZ6 humanas inmovilizadas con una afinidad aparentemente alta para su secuenciación y posterior análisis. Tal como se muestra en forma tabular en las FIGS. 10A y 10B, el análisis de las secuencias de las regiones variables de la cadena ligera (FIG. 10A) y las regiones variables de la cadena pesada (FIG. 10B) de anticuerpos monoclonales seleccionados generados en el Ejemplo 6 confirmó que muchas poseían regiones determinantes de la complementariedad novedosas y habitualmente presentaban disposiciones VDJ novedosas. Cabe destacar que las regiones determinantes de la complementariedad expuestas en las FIGS. 10A y 10B se definen como en Chothia et al., mencionado anteriormente.

Como primer paso en la secuenciación de moduladores ilustrativos, las células hibridómicas seleccionadas se lisaron en reactivo Trizol® (Trizol Plus RNA Purification System, Life Technologies) para preparar el ARN. A este respecto, se volvieron a suspender entre 104 y 105 células en 1 mL de Trizol, y se agitaron enérgicamente después de añadir 200 µL de cloroformo. A continuación, las muestras se centrifugaron a 4°C durante 10 minutos y la fase acuosa se transfirió a otro tubo de microcentrifugación, al cual se añadió un volumen equivalente de isopropanol. Los tubos se agitaron enérgicamente de nuevo y se dejaron incubar a TA durante 10 minutos antes de centrifugarlos a 4°C durante 10 minutos. Los pellets de ARN resultantes se lavaron una vez con 1 mL de etanol al 70% y se secaron brevemente a TA antes de volver a suspenderlos en 40 µL de agua tratada con DEPC. La calidad de los preparados de ARN se determinó fraccionando 3 µL en un gel de agarosa al 1% antes de almacenarlos a -80°C hasta su uso.

Se amplificó la región variable de la cadena pesada de Ig de cada hibridoma utilizando una mezcla de cebadores 5' que comprendía treinta y dos cebadores de la secuencia líder específicos de ratón, diseñados para atacar el repertorio VH completo de ratón, combinados con un cebador Cy de ratón 3' específico para todos los isotipos de Ig de ratón. Se secuenció un fragmento de PCR de 400 bp de la VH desde ambos extremos utilizando los mismos cebadores de PCR. De forma análoga, se utilizó una mezcla de treinta y dos cebadores de la secuencia líder de VK 5' diseñados para amplificar cada una de las familias VK de ratón combinados con un único cebador inverso específico para la región constate kappa de ratón para amplificar y secuenciar la cadena ligera kappa. Los transcritos de VH y VL se amplificaron a partir de 100 ng de ARN total utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) .

Se realizaron ocho reacciones RT-PCR en total para cada hibridoma: cuatro para la cadena ligera VK y cuatro para la cadena pesada V gamma (??) . Se utilizó el kit de RT-PCR de un paso para la amplificación (Qiagen) . Este kit proporciona una combinación de transcriptasas inversas Sensiscript y Omniscript, ADN-polimerasa HotStarTaq, mezcla d TP, amortiguador y Q-Solution, un aditivo novedoso que permite la amplificación eficiente de patrones "difíciles" (por ejemplo, ricos en GC) . Se prepararon mezclas de reacción que incluían 3 de ARN, 0.5 de 100 µ? de cebadores de la cadena pesada o ligera kappa (sintetizados por encargo en IDT) , 5 µ?? de 5x amortiguador de RT-PCR, 1 yL de dNTPs, 1 yL de mezcla de enzimas que contenía transcriptasa inversa y ADN-polimerasa, y 0.4 µ?? del inhibidor de ribonucleasa RNasin (1 unidad). La mezcla de reacción contiene todos los reactivos requeridos tanto para la transcripción inversa (RT, por sus siglas en inglés) como para la PCR. Se fijó el programa del ciclador término para un paso de RT a 50 °C durante 30 minutos, 95 °C durante 15 minutos, seguido de 30 ciclos de PCR (95°C durante 30 segundos, 48°C durante 30 segundos, 72°C durante un minuto) . Posteriormente, se realizó una incubación final a 72 °C durante 10 minutos.

Para preparar los productos de PCR para la secuenciación directa del ADN, se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick™ (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se eluyó el ADN de la columna de centrifugación utilizando 50 µ?? de agua estéril y después se secuenció directamente a partir de ambas hebras. Los productos de PCR extraídos se secuenciaron directamente utilizando cebadores de las regiones V específicos. Las secuencias nucleotídicas se analizaron utilizando IMGT para identificar los miembros de los genes V, D y J de la línea germinal con la mayor homología secuencial . Las secuencias derivadas se compararon con secuencias de ADN de las línea germinal conocidas de las regiones V y J de Ig utilizando V-BASE2 (Retter et al., mencionado anteriormente) y mediante la alineación de los genes de VH y VL respecto a la base de datos de la línea germinal de ratón para proporcionar las secuencias indicadas que se exponen en las FIGS . 10A y 10B.

Más específicamente, la FIG. 10A representa las secuencias de aminoácidos contiguas de setenta y cinco regiones variables de la cadena ligera murina novedosas de anticuerpos anti-SEZ6 (SEQ ID NOS: 20-168, números pares) y once regiones variables de la cadena ligera humanizada (SEQ ID NOS: 170-192, números pares) derivadas de cadenas ligeras murinas representativas. De forma análoga, la FIG. 10B representa las secuencias de aminoácidos contiguas de setenta y cinco regiones variables de la cadena pesada murina novedosas (SEQ ID NOS: 21-169, números impares) de los mismos anticuerpos anti-SEZ6 y once regiones variables de la cadena pesada humanizada (SEQ ID NOS: 171-193, número impares) de los mismos anticuerpos murinos que proporcionan las cadenas ligeras humanizadas. Así pues, consideradas conjuntamente, las FIGS. 10A y 10B proporcionan las secuencias indicadas de setenta y cinco anticuerpos anti-SEZ6 murinos operables (denominados SC17.1, SC17.2, SC17.3 , SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17 .10, SC17 .11, SC17 • 14, SC17 • 15, SC17 .16, SC17 • 17, SC17 .18, SC17 •19, SC17 .22, SC17 .24, SC17 .27, SC17 .28, SC17 .29, SC17 .30, SC17 .32, SC17 .34, SC17 • 35, SC17 .36, SC17 .38, SC17 • 39, SC17 .40, SC17 • 41, SC17 .42, SC17 .45, SC17 .46, SC17 .47, SC17 .49, SC17 .50, SC17 • 53, SC17 .54, SC17 .56, SC17 • 57, SC17 • 59, SC17 .61, SC17 .63, SC17 • 71, SC17 .72, SC17 •74, SC17 .76, SC17 ¦77, SC17 • 79, SC17 .81, SC17 .82, SC17 .84, SC17 .85, SC17 .87, SC17 .89, SC17 .90, SC17 • 91, SC17 .93, SC17. 95, SC17. 97, SC17. 99, SC17. 102, SC17 .114, SC17 .115, SC17. 120, SC17. 121, SC17. 122 , SC17. 140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17.200) y once anticuerpos humanizados (denominados hSC17.16, hSC17.17, hSC17.24, hSC17.28, hSC17.34, hSC17.46, hSC17.151, hSC17.155, hSC17.156, hSC17.161 y hSC17.200). Cabe destacar que estas mismas denominaciones se pueden referir al clon que produce el anticuerpo en cuestión y, en este sentido, el uso de cualquier denominación particular se debe interpretar en el contexto de la exposición relacionada.

Además, hSC17.200vLl (SEQ ID NO: 192) es una variante del constructo de la cadena ligera humanizado hSC17.200 (SEQ ID NO: 190), hSC17.155vHl-vH6 (SEQ ID NOS: 193-198) son variantes del constructo de la cadena pesada hSC.155 (SEQ ID NO: 184) que deriva de SC17.90 (SEQ ID NO: 127) y hSC161vHl (SEQ ID NO: 199) es una variante del constructo de la cadena pesada hSC17.161 (SEQ ID NO: 189). Como se expondrá con más detalle posteriormente, estas variantes se construyeron y evaluaron para optimizar una o más propiedades bioquímicas del anticuerpo original.

Además, las secuencias de ácido nucleico correspondientes de cada uno de los setenta y cinco moduladores murinos ilustrativos y los once moduladores humanizados y sus variantes expuestos en las FIGS. 10A y 10B se incluyen en el listado de secuencias de la presente solicitud (SEQ ID NOS: 220-399) .

A los efectos de la presente solicitud, las SEQ ID NOS de cada anticuerpo particular son secuenciales . Así pues, el mAb SC17.1 comprende las SEQ ID NOS: 20 y 21 para las regiones variables de las cadenas ligera y pesada, respectivamente. A este respecto, SC17.2 comprende las SEQ ID NOS: 22 y 23, SC17.9 comprende las SEQ ID NOS: 24 y 25, y así sucesivamente. Además, las secuencias de ácido nucleico correspondientes para cada secuencia de aminoácidos de las FIGS. 10A y 10B se adjuntan a la presente solicitud en el listado de secuencias que se presenta junto con la presente. En el listado de secuencias en cuestión, las secuencias de ácido nucleico incluidas comprenden SEQ ID NOS que son doscientas veces mayores que la secuencia de aminoácidos correspondiente (cadena ligera o pesada) . Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada del mAb SC17.1 (es decir, las SEQ ID NOS: 20 y 21) constituyen las SEQ ID NOS: 220 y 221 en el listado de secuencias. A este respecto, las secuencias de ácido nucleico que codifican todas las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada descritas, incluidas aquellas que codifican los constructos humanizados y sus variantes, se numeran de forma similar y comprenden las SEQ ID NOS: 220-399.

Ejemplo 8 Generación de moduladores de SEZ6 quiméricos y humanizados Tal como se ha indicado anteriormente, once de los anticuerpos murinos del Ejemplo 7 se humanizaron utilizando injertos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR) . Se seleccionaron entramados humanos para las cadenas pesada y ligera en función de la similitud secuencial y estructural con respecto a genes de la línea germinal humana funcionales. A este respecto, la similitud estructural se evaluó comparando la estructura de CDR canónica de ratón con candidatos humanos con las mismas estructuras canónicas tal como se describe en Chothia et al. (mencionado anteriormente) .

Más particularmente, se humanizaron once anticuerpos murinos SC17.16, SC17.17, SC17.24, SC17.28, SC17.34, SC17.46, SC17.151, SC17.155, SC17.156, SC17.161 y SC17.200 utilizando un método de inserción de injertos de CDR asistido por computadora (Abysis Datábase, UCL Business Pie.) y técnicas de ingeniería molecular estándar para proporcionar los moduladores hSC17.16, hSC17.17, hSC17.24, hSC17.28, hSC17.34, hSC17.46, hSC17.151, hSC17.155, hSC17.156, hSC17.161 y hSC17.200. Las regiones de entramado humano de las regiones variables se seleccionaron en función de su mayor homología secuencial respecto a la secuencia de entramado de ratón en cuestión y su estructura canónica. A los efectos de analizar la humanización, la asignación de aminoácidos a cada uno de los dominios CDR se ajusta a la numeración de Kabat et al. (mencionado anteriormente) .

Los procedimientos de ingeniería molecular se llevaron a cabo utilizando técnicas reconocidas en la materia. Con tal fin, se extrajo ARNm total de los hibridomas y se amplificó como se ha expuesto en el Ejemplo 7 justo antes.

A partir de la información sobre las secuencias de nucleótidos, se obtuvieron datos referentes a los segmentos de los genes V, D y J de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos en cuestión. Basándose en los datos sobre las secuencias, se designaron conjuntos de cebadores nuevos específicos para la secuencia líder de la cadena ligera VK y VH de Ig de los anticuerpos para clonar el anticuerpo monoclonal recombinante . Subsecuentemente, las secuencias V- (D) -J se alinearon con secuencias de la línea germinal de Ig de ratón. Las disposiciones genéticas resultantes para cada uno de los once constructos humanizados se muestran justo a continuación en la Tabla 1.

TABLA 1 Los anticuerpos humanizados enumerados en la Tabla 1 corresponden a las secuencias de las cadenas ligera y pesada indicadas que se exponen en las FIGS . 10A y 10B (SEQ ID NOS: 170-191) . Las secuencias de ácido nucleico correspondientes de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada se exponen en el listado de secuencias. Además, la TABLA 1 muestra que fueron necesarios muy pocos cambios en el entramado para mantener las propiedades favorables de los moduladores de unión. A este respecto, solamente se realizaron cambios en el entramado o retromutaciones en tres de las regiones variables de la cadena pesada y solamente se realizaron dos modificaciones en el entramado en las regiones variables de la cadena ligera.

Cabe destacar que, para algunas regiones variables de las cadenas ligera y pesada (por ejemplo, hSC17.200, hSC17.155 y hSC17.161), se introdujeron mutaciones aminoacídicas conservadoras en las CDR para resolver cuestiones de estabilidad y mantener a la vez la unión al antígeno. En cada caso, se observó que la afinidad de unión de los anticuerpos con CDR modificadas era equivalente a la del correspondiente anticuerpo murino o quimérico. Al final de las FIGS . 10A y 10B (SEQ ID NOS : 192-199) se enumeran las secuencias de nueve cadenas variantes humanizadas ilustrativas (ligeras y pesadas) , las cuales conservan la denominación de la cadena original humanizada con una anotación para indicar que han sido alteradas (por ejemplo, hSC17.200vLl, hSC17.155vHl-6 y hSC17.161vHl) .

Tras la humanización de todos los anticuerpos seleccionados mediante la inserción de injertos de CDR, se analizaron las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada resultantes para determinar su homología con respecto a las regiones variables de las cadenas ligera y pesada aceptoras humanas y donantes murinas . Los resultados, que se muestran a continuación en la Tabla 2, indican que los constructos humanizados exhibieron uniformemente una homología mayor con respecto a las secuencias receptoras humanas que con respecto a las secuencias donantes murinas. Más específicamente, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera humanizadas muestran en general un porcentaje de homología mayor respecto al caso más semejante de los genes de la línea germinal humana (84%-95%) en comparación con la homología de las secuencias de regiones variables humanizadas y las secuencias proteicas de los hibridomas donantes (74%-89%) .

TABLA 2 Al real izar una evaluación y tal como se indicará en el Ej emplo 9 , cada uno de los constructos humanizados exhibieron características de unión favorables más o menos comparables con las que mostraron los anticuerpos originales murinos (no se muestran los datos) .

Independientemente de que sean humanizados o murinos, una vez que se determinan las secuencias de ácido nucleico de las regiones variables, los anticuerpos de la presente invención se pueden expresar y aislar utilizando técnicas reconocidas en la materia. Con este fin, se clonaron fragmentos de ADN sintéticos de la región variable de la cadena pesada elegida (humanizada o murina) en un vector de expresión de IgGl humana. De forma análoga, el fragmento de ADN de la región variable de la cadena ligera (nuevamente humanizada o murina) se clonó en un vector de expresión de la cadena ligera humana. El anticuerpo seleccionado se expresó a continuación por costransfección de los constructos de ácido nucleico de las cadenas pesada y ligera derivados en células CHO.

Más particularmente, un método compatible de producción de anticuerpos comprendió la clonación direccional de genes de las regiones variables murinas y humanizadas (amplificados por PCR) en vectores de expresión de inmunoglobulina humana seleccionados. Todos los cebadores utilizados en la PCR específica para genes de Ig incluían sitios de restricción que permitieron la clonación directa en vectores de expresión que contenían regiones constantes de la cadena pesada y la cadena ligera de IgGl humana. Resumiendo, los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación para PCR Qiaquick (Qiagen) , y después se digirieron con Agel y Xhol (para la cadena pesada) y Xmal y DralII (para la cadena ligera), respectivamente. Los productos de PCR digeridos se purificaron antes de su ligamiento en vectores de expresión. Las reacciones de ligamiento se llevaron a cabo en un volumen total de 10 \iL con 200U de ADN-ligasa T4 (New England Biolabs) , 7.5 pL de producto de PCR con especif cidad génica purificado y digerido, y 25 ng de ADN vectorial linealizado. Se transformaron bacterias DH10B de E. coli competentes (Life Technologies) mediante choque térmico a 42 °C con 3 pL de producto de ligamiento y se colocaron sobre placas de ampicilina (100 g/mL) . El fragmento Agel-EcoRI de la región VH se insertó a continuación en los mismos sitios del vector de expresión pEE6.4HuIgGl mientras que el inserto de VK Xmal-DralII sintético se clonó en los sitios Xmal-DralII del vector de expresión pEE12.4Hu-Kappa respectivo.

Se generaron células que producían el anticuerpo seleccionado por transfección de células HEK 293 con los plásmidos adecuados utilizando 293fectina. A este respecto, se purificó ADN plasmídico con columnas de centrifugación QIAprep (Qiagen) . Se cultivaron células renales embrionarias humanas (HEK) 293T (No. de ATCC CRL-11268) en placas de 150 mm (Falcon, Becton Dickinson) en condiciones estándar en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de FCS desactivado térmicamente, 100 g/mL de estreptomicina, 100 U/mL de penicilina G (todos ellos de Life Technologies) .

Para las transfecciones transitorias, se cultivaron células con una confluencia de un 80%. Se añadieron cantidades equivalentes de IgH y ADN vectorial de una cadena de IgL correspondiente (12.5 pg de cada) a 1.5 mL de Opti-MEM mezclados con 50 L de reactivo de transfección de HEK 293 en 1.5 mL de opti-ME . La mezcla se incubó durante 30 min a temperatura ambiente y se distribuyó uniformemente en la placa de cultivo. Se recogieron los sobrenadantes tres días después de la transfección, se reemplazaron con 20 mL de DMEM fresco suplementado con un 10% de FBS y se recogieron de nuevo 6 días después de la transfección. Se eliminaron los residuos celulares de los sobrenadantes del cultivo mediante centrifugación a 800xg durante 10 min y se conservaron a 4°C. Se purificaron los anticuerpos humanizados y quiméricos recombinantes con microesferas de proteína G (GE Healthcare) y se almacenaron en condiciones adecuadas.

E em lo 9 Características de los moduladores de SEZ6 Se utilizaron varios métodos para analizar las características inmunoquímicas y de unión de moduladores de SEZ6 seleccionados generados como se ha expuesto anteriormente. Específicamente, se caracterizaron una serie de moduladores de tipo anticuerpo según su afinidad, clasificación en secciones y reactividad cruzada respecto al antígeno SEZ6 humano, cinomólogo, de rata y de ratón junto con las proteínas SEZ6L y SEZ6L2 mediante métodos reconocidos en la técnica, que incluyen la citometría de flujo. Las afinidades y las constantes cinéticas kasociación y kdisociación de los moduladores seleccionados se midieron utilizando un análisis de interferometría de biocapa con un instrumento ForteBio RED (ForteBio, Inc.) o una resonancia de plasmones superficiales utilizando un instrumento Biacore 2000, en cada caso de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los resultados de la caracterización se exponen de forma tabular en la FIG. 11A, donde se puede observar que los moduladores seleccionados exhibieron en general unas afinidades relativamente altas en el intervalo nanomolar y, en muchos casos, presentaron reactividad cruzada con uno o más ortólogos de SEZ6. La FIG. 12 indica además la sección determinada empíricamente ocupada por el modulador en cuestión. Considerados conjuntamente, estos datos muestran las propiedades de unión variadas de los moduladores descritos, así como también su idoneidad potencial para el desarrollo farmacéutico basándose en su reactividad en modelos con animales.

A este respecto, se llevó a cabo una citometría de flujo utilizando un instrumento FACSCanto II según las instrucciones del fabricante con el fin de confirmar que los moduladores de tipo anticuerpo SC17 seleccionados se pueden asociar de forma inmunoespecífica con SEZ6 humana y para determinar si los mismos moduladores presentarían reactividad cruzada con SEZ6 cinomóloga, de rata y/o murina, así como también con SEZ6L y SEZ6L2. Más particularmente, los moduladores se evaluaron para determinar su reactividad cruzada con SEZ6 murina y SEZ6 de rata mediante citometría de flujo frente a líneas celulares Neuro2a (ATCC, No. de catálogo CCL131) y RIN-m5F (ATCC, No. de catálogo CRL-11605) , las cuales expresan SEZ6 de ratón y SEZ6 de rata, respectivamente. Para examinar la reactividad cruzada con SEZ6 cinomóloga, se utilizó levadura que presentaba el dominio extracelular de SEZ6 cinomóloga (Boder et al., 1997) para el análisis por citometría de flujo.

Resumiendo, se incubaron lxlO5 células por pocilio de Neuro2a, RIN-5mF o levadura que presentaba células con SEZ6 cinomóloga durante 30 minutos con 50 yL de amortiguador de PBS (2% de FCS) con 5 g/mL de anticuerpo. Las células se lavaron dos veces con el mismo amortiguador y a continuación se incubaron con 50 L por muestra de un fragmento Fe de anticuerpo anti-IgG de ratón producido en cabra marcado con DyLight 649 específico secundario diluido con un factor de 1:200 en amortiguador de PBS. Después de incubar durante 15 minutos, las células se lavaron dos veces con el amortiguador de PBS y se volvieron a suspender en este con DAPI, para el análisis por citometría de flujo de Neuro2a y Rin-m5F, o amortiguador sin DAPI para el análisis por citometría de flujo de las células de levadura con cSEZ6. Se consideró que los anticuerpos que se unieron a las líneas celulares Neuro2a o RIN-m5F, o a la levadura que presentaba SEZ6 cinomóloga mostraron reactividad cruzada con SEZ6 murina, SEZ6 de rata o SEZ6 cinomóloga, respectivamente. La FIG. 11A muestra los resultados de reactividad cruzada. Seis anticuerpos presentaron reactividad cruzada con SEZ6 humana y de ratón (SC17.6, SC17.7, SC17.19, SC17.24, SC17.26 y SC17.42); seis con SEZ6 humana y de rata (SC17.6, SC17.17, SC17.19, SC17.26, SC17.28, SC17.34 y SC17.42); y seis con SEZ6 humana y cinomóloga (SC17.17, SC17.24, SC17.26, SC17.34, SC17.36 y SC17.45). Cabe destacar que SC17.6 es un duplicado de SC17.16 y exhibe las mismas características de unión.

Con el fin de verificar los datos de reactividad cruzada anteriores para SEZ6 de rata y determinar la afinidad y las constantes cinéticas ^asociación y kdisociación de los efectores seleccionados, se llevó a cabo un análisis de interferometría de biocapa con un instrumento ForteBio RED (ForteBio, Inc.) o una resonancia de plasmones superficiales con un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare) . Se determinaron las afinidades tanto para SEZ6-His recombinante humana como para SEZ6-His recombinante de rata generadas en el Ejemplo 5. Tal como se observa en la FIG. 11A, varios de los anticuerpos evaluados presentaron reactividad cruzada con SEZ6 de rata. Los marcadores seleccionados presentaron afinidades relativamente altas para SEZ6 tanto humana como de rata en el intervalo nanomolar .

Para determinar la reactividad cruzada con proteínas que son miembros de la familia, SEZ6L y SEZ6L2, se utilizó un ensayo basado en ELISA. Se recubrieron placas con las proteínas SEZ6, SEZ6L o SEZ6L2 con una concentración de 0.2 yg/mL en PBS durante toda la noche . Tras lavar con PBS que contenía un 0.05% (v/v) de Tween 20 (PBST) , los pocilios se bloquearon con un 2% (p/v) de BSA en PBS (PBSA) , 100 pL/pocillo, durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se añadió el anticuerpo con una concentración de 1 yg/mL en 100 uL de PBSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras lavar con PBST, se añadieron 100 µL/pocillo de anticuerpo anti-IgG de ratón producido en cabra marcado con HRP diluido con un factor de 1:2000 en PBSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se añadieron 100 pL/pocillo de una solución del sustrato TMB (Thermo Scientific 34028) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras el revelado, se añadió un volumen equivalente de H2S0 2 M para detener el revelado del sustrato y se llevó a cabo un análisis con un espectrofotómetro para una DO de 450. La FIG. 11A muestra que un anticuerpo presentó reactividad cruzada con SEZ6L (SC17.7) y cinco presentaron reactividad cruzada con SEZ6L2 (SC17.6, SC17.7, SC17.19, SC17.26 y SC17.28). Como se ha indicado anteriormente, tales anticuerpos pan-SEZ6 son compatibles con los principios de la presente y se pueden utilizar conjuntamente con los métodos descritos.

Las características de unión de los siguientes constructos humanizados del Ejemplo 8, hSC17.16, hSC17.17, hSC17.24, hSC17.28, hSC17.34 y hSC17.46, se analizaron con el fin de determinar si el proceso de inserción de injertos de CDR había alterado de forma apreciable sus características de unión. Los constructos humanizados (con injertos de CDR) se compararon con anticuerpos quiméricos "tradicionales" que comprendían los dominios variables de las cadenas pesada y ligera originales murinos (o donantes) y una región constante humana sustancialmente equivalente a la utilizada en los constructos humanizados. Se llevó a cabo una resonancia de plasmones superficiales con estos constructos utilizando un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare) con el fin de identificar cualesquiera cambios sutiles en las constantes de velocidad provocados por el proceso de humanización. En todos los casos, los anticuerpos humanizados presentaron una afinidad de unión equivalente a la de los anticuerpos murinos correspondientes o mejor (no se muestran los datos) .

Se determinó la clasificación en secciones de los anticuerpos para varios moduladores de SEZ6 , tal como se muestra en la FIG. 11A. Se utilizó un instrumento ForteBio RED siguiendo las instrucciones del fabricante para identificar los anticuerpos competitivos que se unían a la misma sección o a secciones diferentes. Resumiendo, se capturó un anticuerpo de referencia (Abl) en un chip de captura de anticuerpos anti-ratón, a continuación se utilizó una concentración elevada de anticuerpo no enlazante para bloquear el chip y se registró una línea de referencia. Posteriormente, la proteína SEZ6 humana recombinante monomérica (descrita en el Ejemplo 5) fue capturada por el anticuerpo específico (Abl) y la punta se sumergió en un pocilio con el mismo anticuerpo (Abl) como control o en un pocilio con un anticuerpo de prueba diferente (Ab2) . Cuando se observó una unión adicional con un nuevo anticuerpo, entonces se determinó que Abl y Ab2 pertenecían a secciones diferentes. Si no se produjo ninguna unión adicional, lo cual se determinó comparando los niveles de unión con el control Abl, entonces se determinó que Ab2 pertenecía a la misma sección. Como se sabe en la técnica, este proceso se puede expandir para cribar grandes colecciones de anticuerpos únicos, utilizando una hilera entera de anticuerpos que representan secciones únicas en una placa de 96 pocilios. En el presente caso, este proceso de clasificación en secciones mostró que los anticuerpos cribados se unían a al menos siete secciones diferentes de la proteína SEZ6. Las secciones A-F son secciones únicas y los anticuerpos contenidos en cada una de estas secciones compiten entre sí (pero no compiten con los anticuerpos de otras secciones definidas) por la unión con la proteína SEZ6. La sección U contiene anticuerpos que no compiten con los anticuerpos de las secciones A-F, pero que pueden competir entre sí por la unión.

Ejemplo 10 Mapeo de los epítopos de los moduladores de SEZ6 Para caracterizar los epítopos con los que se asocian o unen los moduladores de tipo anticuerpo de SEZ6 descritos, se realizó un mapeo de los epítopos a nivel de dominios utilizando una modificación del protocolo descrito por Cochran et al. (J Immunol Methods . 287 (1-2) : 147-158 (2004)), que se incorpora a la presente por referencia) . Se expresaron dominios individuales de SEZ6 en la superficie de una levadura y se determinó la unión de cada anticuerpo de SEZ6 por citometría de flujo.

Se crearon constructos plasmídicos de presentación en levaduras para la expresión de los siguientes constructos: dominio extracelular de SEZ6 (aminoácidos 1-904) ; Dominio Sushi 1 (aminoácidos 336-395) , Dominio CUB 1 (aminoácidos 297-508), Dominio Sushi 2 (aminoácidos 511-572), Dominio CUB 2 (aminoácidos 574-685) , Dominio Sushi 3 (aminoácidos 690-748) , Dominio Sushi 4 (aminoácidos 750-813) , Dominio Sushi 5 (aminoácidos 817-878) y Dominio Sushi 5 + C-terminal (aminoácidos 817-904). Además, el dominio aminoterminal (aminoácidos 1-335) se dividió en 3 fragmentos, denominados NI (aminoácidos 1-70) , N2 (aminoácidos 71-169) y N3 (aminoácidos 169-335) , cada uno de los cuales se clonó en el plásmido de presentación en levaduras. La numeración de los aminoácidos no incluye el péptido líder. Para consultar información sobre los dominios, remítase en general a la entrada Q53EL9 de la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot . Estos plásmidos se transformaron en levadura, que se cultivó posteriormente y se indujo tal como se describe en Cochran et al. Cabe destacar que toda la numeración de los aminoácidos se basa en la proteína SEZ6 madura sin la secuencia líder de 19 aa.

Para evaluar la unión a un constructo particular, 200 000 células de levadura inducidas que expresaban el constructo deseado se lavaron dos veces en PBS + 1 mg/mL de BSA (PBSA) y se incubaron en 50 µ]., de PBSA con 0.1 µg/mL de anticuerpo anti-c-myc producido en gallina (Life Technologies) y o bien anticuerpo purificado 50 nM o sobrenadante no purificado diluido con un factor de 1:2 procedente de hibridomas cultivados durante 7 días. Las células se incubaron durante 90 minutos sobre hielo y a continuación se lavaron dos veces en PBSA. Posteriormente, las células se incubaron en 50 iL de PBSA con los anticuerpos secundarios adecuados: para los anticuerpos murinos, se añadieron un anticuerpo anti-gallina conjugado con Alexa 488 y un anticuerpo anti-ratón producido en cabra conjugado con Alexa 647 (ambos de Life Technologies) , con una concentración de 1 ug/mL de cada uno, y para los anticuerpos humanizados o quiméricos, se añadieron un anticuerpo anti-gallina conjugado con Alexa 647 (Life Technologies) y un anticuerpo anti-humano producido en cabra conjugado con R-ficoeritrina (Jackson Immunoresearch) , con una concentración de 1 µg/mL de cada uno. Después de veinte minutos de incubación sobre hielo, las células se lavaron dos veces con PBSA y se analizaron en un instrumento FACS Canto II.

Todos los moduladores se unieron únicamente a un solo dominio expresado en las células de levadura. En algunos casos, los clones de los anticuerpos se unieron específicamente a levadura que expresaba el Dominio Sushi 5 + el extremo C, pero no se unieron a levadura que expresaba el Dominio Sushi 5. Se concluyó que estos clones de los anticuerpos se unían únicamente a la región carboxiterminal (aminoácidos 879-904) .

Los epítopos se clasificaron como conformacionales (es decir, discontinuos) o lineales. La levadura que presentaba el constructo SEZ6 ECD se trató con calentamiento durante 30 minutos a 80 °C con el fin de desnaturalizar el antígeno, se lavo dos veces en PBSA enfriado con hielo y a continuación se sometió al mismo protocolo de tinción y análisis por citometría de flujo que se han descrito anteriormente. Los anticuerpos que se unieron tanto a la levadura desnaturalizada como a la nativa se clasificaron como de unión a un epítopo lineal, mientras que los anticuerpos que se unieron a la levadura nativa pero no se unieron a la levadura desnaturalizada se clasificaron como conformacionalmente específicos.

En la TABLA 3 a continuación se presenta un resumen de los datos del mapeo de los epítopos a nivel de dominios para los anticuerpos evaluados. Los anticuerpos que se unen a un epítopo lineal están subrayados y los anticuerpos que se unen a los miembros de la familia SEZ6 SEZ6L y SEZ6L2 se indican con un asterisco y/o una daga, respectivamente.

TABLA 3 Se observó una tendencia interesante y sorprendente cuando se llevó a cabo un ensayo de aniquilación celular in vi tro utilizando los moduladores de tipo anticuerpo de SEZ6 con dominios mapeados descritos en este Ejemplo 10. El ensayo de aniquilación in vitro, que se llevó a cabo esencialmente como se describe más adelante en el Ejemplo 14, determinó la capacidad de un anticuerpo particular para internalizar y aniquilar células HEK-293. La FIG. 11B es una gráfica de la eficacia de los anticuerpos evaluados frente a los dominios a los cuales se unen. Los anticuerpos que se unen a ciertos dominios, incluidos los siguientes: NI, N3, Dominio Sushi 1 y Dominio Sushi 4, presentaron una aniquilación in vitro mejorada. Los anticuerpos que se asocian con el Dominio Sushi 4, los cuales son muy eficaces a la hora de internalizar y aniquilar células, exhiben una fuerte correlación con las regiones de entramado de las líneas germinales murinas IGHVl-34 y IKV4-59.

Además, se realizó un mapeo de los epítopos refinado para anticuerpos seleccionados con el fin de determinar los aminoácidos específicos a los cuales se unían. Los anticuerpos que se unieron a un epítopo lineal se mapearon utilizando el kit para colecciones peptídicas de presentación en fagos Ph.D.-12 (New England Biolabs E8110S) . El anticuerpo seleccionado para el mapeo de los epítopos se utilizó como recubrimiento sobre un tubo Nunc MaxiSorp (Nunc) con una concentración de 50 ug/mL en 3 mL de una solución de bicarbonato de sodio 0.1 M a un pH de 8 y se incubó durante toda la noche. El tubo se bloqueó con una solución al 3% de BSA en una solución de bicarbonato. A continuación, se permitió que se unieran 1011 fagos de insumo en PBS + 0.1% de Tween-20 y después se realizaron 10 lavados consecutivos con Tween-20 al 0.1% para eliminar los fagos que no se hubieran enlazado. Los fagos remanentes se eluyeron con 1 mL de glicina 0.2 M durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación suave y a continuación se neutralizaron con 150 uL de Tris-HCl 1 M a pH 9. Los fagos eluidos se amplificaron y se mezclaron nuevamente con 1011 fagos de insumo, utilizando Tween-20 al 0.5% durante los pasos de lavado para incrementar la rigurosidad de la selección. Se aisló el ADN de 24 placas de los fagos eluidos procedentes de la segunda ronda, utilizando el kit de centrifugación Qiaprep M13 (Qiagen) , y se secuenció. La unión del fago clónico se confirmó utilizando un ensayo ELISA, en el cual el anticuerpo mapeado o un anticuerpo de control se utilizó como recubrimiento sobre una placa para ELISA, se bloqueó y se expuso a cada fago clónico. La unión del fago se detectó utilizando un anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare) y la solución 1-Step Turbo TMB ELISA (Pierce) . Las secuencias peptídicas de fagos correspondientes a fagos de unión específica se alinearon utilizando el vector NTI (Life Technologies) frente a la secuencia peptídica del ECD del antígeno para determinar el epítopo de unión.

Los anticuerpos que se unieron a un epítopo discontinuo se mapearon utilizando la técnica descrita por Chao et al. (2007). Se generaron colecciones de mutantes del ECD de SEZ6 con PCR propensa a errores utilizando los análogos nucleotídicos 8 -oxo-2 ' desoxiguanosina- 5 ' -trifosfato y 2 ' -desoxi -p-nucleósido- 5 ' trifosfato (ambos de TriLink Bio) para una tasa de mutagénesis diana de una mutación aminoacídica por clon. Estos se transformaron en un formato de presentación en levaduras. Utilizando la técnica descrita anteriormente para el mapeo a nivel de dominios, la colección se tiñó con el fin de determinar la unión del anticuerpo y c-myc para una concentración de 50 nM. Utilizando un instrumento FACS Aria (BD) , se seleccionaron los clones que exhibieron una pérdida de la unión en comparación con el ECD de SEZ6 natural . Estos clones se volvieron a cultivar y se sometieron a otra ronda de selección por FACS para determinar la pérdida de la unión al anticuerpo diana. Los clones de ECD individuales se aislaron y secuenciaron utilizando el kit Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep (Zymo Research) . Cuando fue necesario, las mutaciones se reformatearon como clones de ECD de un solo mutante utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quikchange (Agilent) .

A continuación, los clones de ECD individuales se cribaron para determinar si la pérdida de la unión era debida a una mutación en el epítopo o a una mutación que provocaba un plegamiento inadecuado. Las mutaciones en las que intervenían cisteína, prolina y codones de parada se descartaron automáticamente debido a la elevada probabilidad de que se tratara de una mutación que provocaría un plegamiento inadecuado. A continuación, los clones de ECD restantes se cribaron para determinar su unión a un anticuerpo no competitivo conformacionalmente específico. Se concluyó que los clones de ECD que habían perdido capacidad de unión a anticuerpos no competitivos conformacionalmente específicos contenían mutaciones que provocaban un plegamiento inadecuado, mientras que los clones de ECD que conservaban una unión equivalente a la del ECD de SEZ6 natural se plegaban de forma adecuada. Se concluyó que las mutaciones en los clones de ECD del último grupo se encontraban en el epítopo. También se construyeron modelos de homología de dominios aislados utilizando MODELLER para confirmar que los residuos identificados se encontraban en el epítopo: 1) estaban localizados cerca los unos de los otros en el modelo de homología plegado y 2) contenían cadenas laterales que estaban expuestas al disolvente, y no enterradas, ya que existe una probabilidad más elevada de que los residuos enterrados provoquen un plegamiento inadecuado y no es probable que formen parte del epítopo de unión. En la Tabla 4 se muestra un resumen de los anticuerpos con sus epítopos.

TABLA 4 NR indica que no se asignó ninguna SEQ ID NO ya que los epítopos eran discontinuos.

En el caso de SC17.34, SC17.36 y SC17.46, se construyeron mutaciones puntuales en el dominio aislado, el Dominio Sushi 1, que se determinó que era el dominio de unión mediante el mapeo de los epítopos a nivel de dominios. En el caso de SC17.46, las mutaciones potenciales para el cribado no se identificaron en un cribado basado en colecciones; en cambio, se identificaron basándose en el mapeo de dominios, la carencia de reactividad cruzada con el ECD de SEZ6 cinomóloga y el ECD de SEZ6 de rata, así como las alineaciones de secuencias de las diferentes especies para identificar diferencias en la secuencia primaria de cada especie. Estas mutaciones potenciales se sometieron al mismo análisis que los demás anticuerpos para confirmar el epítopo de SC17.46.

Ejemplo 11 Detección de la expresión en superficie de SEZ6 mediante citómetría de flujo Se utilizó citometría de flujo para evaluar la especificidad de los anticuerpos anti-SEZ6 que se generaron para detectar la presencia de la proteína SEZ6 humana en la superficie de líneas celulares HEK-293T modificadas por ingeniería genética, que se construyeron tal como se ha descrito en el Ejemplo 5. Se emplearon controles de tinción de isotipos y de fluorescencia menos uno (FMO, por sus siglas en inglés) para confirmar la especificidad de la tinción. Resumiendo, se disociaron células HEK-293T transducidas con SEZ6 y GFP humanas (remítase al Ejemplo 5) o muestras de tumores NTX recolectadas, y se dispersaron en una suspensión utilizando técnicas de digestión enzimática reconocidas en la materia (remítase, por ejemplo, a la patente de EE. UU. No. 2007/0292414, la cual se incorpora a la presente), se incubaron durante 30 minutos con un anticuerpo anti-SEZ6. Las células se lavaron en PBS (2% de FCS) dos veces y a continuación se incubaron con 50 pL por muestra de un fragmento Fe de anticuerpo anti-IgG de ratón producido en cabra marcado con DyLight 649 específico secundario diluido con un factor de 1:200 en amortiguador de PBS. Después de una incubación de 15 minutos, las células se lavaron dos veces con PBS, se volvieron a suspender en PBS con DAPI y se analizaron mediante citometría de flujo como se ha indicado previamente .

Como queda demostrado con los datos representativos que se muestran en la FIG.12A para SC17.33, el modulador de SEZ6 reconoció fuertemente las células HEK-293T-HuSEZ6. Estos datos demuestran que se produjeron moduladores que reconocían específicamente la proteína SEZ6 humana expresada sobre la superficie celular.

Se evaluó la expresión de la proteína SEZ6 humana sobre la superficie de tumores NTX seleccionados mediante citometría de flujo utilizando varios anticuerpos SC17 ilustrativos. La expresión de SEZ6 en LU37, LU86 y KDY66 se evaluó utilizando el anticuerpo SC17.6, mientras que la expresión de SEZ6 en LU50, LU100 y LU73 se evaluó utilizando los anticuerpos SC17.10, SC17.42 y SC17.28, respectivamente. Los resultados se exponen en la FIG. 13A. Los tumores NTX se recolectaron, disociaron y tiñeron conjuntamente con los anticuerpos comercializados anti-CD45 de ratón, anti-H-2Kd de ratón, anti-EpCAM humana y uno de los anticuerpos anti-SEZ6 humana producidos en ratón descritos anteriormente. Los datos que se muestran en la FIG. 13A se generaron utilizando células que no presentaban una tinción positiva para los anticuerpos anti-ratón mencionados anteriormente pero que presentaban una tinción positiva para el anticuerpo anti-EpCAM humana. De forma análoga a los experimentos de tinción de HEK-293T descritos anteriormente, se emplearon controles de tinción de isotipos y de fluorescencia menos uno (FMO) para confirmar la especificidad de la tinción. Tal como se observa en la FIG. 13A, la tinción anti-SEZ6 fue mayor que la de FMO en todas las células de tumores NTX, tal como indica el desplazamiento del perfil fluorescente hacia la derecha y los cambios en los valores de intensidad de fluorescencia media (MFI, por sus siglas en inglés), para los tumores NTX de pulmón LU37, LU50 y LU86 y el tumor NTX de pulmón de riñon KDY66. Estos datos sugieren que la proteína SEZ6 se expresa en la superficie de varios tumores NTX y, por consiguiente, puede ser modulada utilizando un anticuerpo anti-SEZ6.

Ejemplo 12 Expresión de la proteína SEZ6 en varios tumores Teniendo en cuenta los niveles elevados de transcrito de ARNm de SEZ6 asociados con varios tumores, se realizaron estudios para demostrar el correspondiente aumento en la expresión de la proteína SEZ6 en tumores NTX. La expresión de la proteína SEZ6 se detectó con (i) un ensayo ELISA de tipo sándwich para SEZ6 con electroquimioluminiscencia utilizando la plataforma de descubrimiento MSA (Meso Scale Discovery, LLC) ; y (ii) tinción inmunohistoquímica .

Se extirparon tumores NTX de ratones y se congelaron rápidamente en nieve carbónica/etanol . Se añadió amortiguador para la extracción de proteínas (Biochain Institute, Inc.) a los trozos del tumor descongelados y los tumores se pulverizaron utilizando un sistema lisador de tejidos (Qiagen) . Los lisados se separaron por centrifugación (20 000 g, 20 minutos, 4 °C) y se cuantificó la concentración de proteína total en cada lisado utilizando ácido bicinconínico (BCA) . Los lisados proteicos se conservaron a -80 °C hasta su ensayo. Los lisados de tejido normal se adquirieron de Novus Biologicals .

Se determinaron las concentraciones de la proteína SEZ6 de las muestras de lisado interpolando los valores en una curva de concentración de proteína patrón que se generó utilizando proteína SEZ6 recombinante purificada (Ejemplo 5) . La curva patrón de proteína SEZ6 y el ensayo de cuantificación de la proteína se llevaron a cabo como se indica a continuación: Se recubrieron placas estándar de MSD durante toda la noche a 4 °C con 30 µL de anticuerpo SC17.17 con una concentración de 2 ug/mL en PBS . Las placas se lavaron con PBST y se bloquearon con 150 uL de solución de bloqueador A de MSD al 3% durante una hora. Las placas se lavaron de nuevo con PBST. A continuación, el anticuerpo SC17.36 se conjugó con el sulfomarcador de MSD y se añadieron 25 µL del anticuerpo SC17.36 marcado a las placas lavadas con una concentración de 0.5 ug/mL en bloqueador A de MSD al 1%. También se añadieron 25 µL de lisado diluido lOx en bloqueador A de MSD al 1% o patrón de SEZ6 recombinante diluido en bloqueador A de MSD al 1% que contenía un 10% de amortiguador para la extracción de proteínas a los pocilios y se incubaron durante 2 horas. Las placas se lavaron con PBST. Se diluyó amortiguador de lectura T de MSD con tensioactivo hasta IX en agua y se añadieron 150 il¡ a cada pocilio. Las placas se leyeron con un lector Sector Imager 2400 de MSD que utilizaba un programa de análisis informático integrado para obtener las concentraciones de SEZ6 en las muestras NTX por interpolación a partir de la curva patrón. Posteriormente, los valores se dividieron por la concentración de proteína total para obtener los nanogramos de SEZ6 por miligramo de proteína total en el lisado. Las concentraciones resultantes se exponen en la FIG. 12B, en la que cada punto representa concentraciones de la proteína SEZ6 obtenidas a partir de una única línea tumoral NTX. Aunque cada punto se obtiene a partir de una única línea NTX, en la mayoría de los casos se evaluaron múltiples muestras biológicas de la misma línea NTX y se calculó la media de los valores para proporcionar el dato puntual.

La FIG. 12B muestra que, en comparación con lisados de tejidos normales, las muestras de tumores de riñon, ovario y LCNEC seleccionadas exhibieron una expresión moderada de la proteína SEZ6 , mientras que la expresión más elevada de la proteína SEZ6 se observó en tumores SCLC. Todos los lisados de tejidos normales fueron negativos respecto a la expresión de la proteína SEZ6, con la excepción del lisado ocular y cerebral humano normal .

Se realizó un estudio inmunohistoquímico (IHC) en tumores PDX para confirmar que SEZ6 se expresaba en la superficie de ciertos tumores PDX, y para determinar la localización de la proteína SEZ6 en la arquitectura del tumor .

El estudio IHC se realizó en secciones de tejido embebidas en parafina y fijadas en formalina, utilizando un método de detección indirecta, que incluía un anticuerpo primario monoclonal murino anti-SEZ6 (clon 17.140), anticuerpos secundarios conjugados con biotina específicos de ratón, complejo de avidina/biotina acoplado con peroxidasa de rábano picante y detección de DAB (Nakene PK 1968; 16:557-60) . Cuando se tiñeron tumores PDX de xenoinjerto, se utilizó un agente de bloqueo de IgG de ratón (Vector Laboratories; No. de catálogo PK-2200) . SC17.140 fue validado y se confirmó que era adecuado para el estudio IHC ya que mostró una tinción específica en secciones de los pellets de células HEK-293T que sobreexpresaban SEZ6 en comparación con los pellets de células HEK-293T vírgenes, que se prepararon como es habitual en la técnica. La especificidad se confirmó además mediante la señal competitiva con un exceso molar de 5 de la proteína SEZ6 recombinante purificada en células HEK- 293T que sobreexpresaban SEZ6 humana y tumores de xenoinjerto que se demostró mediante IHC que expresaban SEZ6 (no se muestran los datos) . La FIG. 16 muestra la expresión de SEZ6, que se midió mediante IHC, en tumores NTX SCLC. Se otorgó un puntaje a la intensidad de la tinción, para tener en cuenta la intensidad de la tinción, desde 0 (negativa) hasta 3 (tinción fuerte) . Los resultados muestran que un 64% de los tumores NTX SCLC evaluados expresaron SEZ6.

Estos datos, combinados con los datos de la transcripción de ARNm para la expresión de SEZ6 expuestos anteriormente (Ejemplo 4) y la expresión proteica en la superficie celular de SEZ6 (Ejemplo 11) , respaldan firmemente la teoría de que los determinantes de SEZ6 proporcionan dianas atractivas para la intervención terapéutica.

Ejemplo 13 Enriquecimiento de poblaciones de células iniciadoras de tumores Las células tumorales se pueden dividir en términos generales en dos tipos de subpoblaciones celulares: células no tumorigénicas (NTG) y células iniciadores de tumores (TIC) . Las TIC tienen la capacidad de formar tumores cuando se implantan en ratones inmunodeprimidos . Las células madre cancerosas (CSC) son un subconjunto de TIC y son capaces de autorreplicarse de forma indefinida a la vez que mantienen la capacidad para la diferenciación de múltiples linajes. Para determinar si la expresión de SEZ6 se podría correlacionar con una mayor tumorigenicidad, se realizaron ensayos de secuenciacion del transcriptoma completo, citometría de flujo y tumorigenicidad, todos los cuales se describen a continuación.

Se llevó a cabo un análisis del transcriptoma completo para la expresión de SEZ6 en varias muestras tumorales tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las CSC se identificaron en función de la expresión de CD324, que se ha demostrado que es un marcador de células madre en varios tumores (remítase a la solicitud de PCT 2012/031280) . Los resultados de la FIG. 6A muestran que la expresión del ARNm de SEZ6 era mayor en CSC en comparación con células NTG aisladas de dos líneas de tumores NTX SCLC (LU86 y LU95) .

Se llevó a cabo una citometría de flujo en células procedentes de tumores de pulmón NTX esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 11. Se tiñeron células LU86, LU117 y LU64 conjuntamente con CD324, un marcador de poblaciones CSC (remítase a la solicitud de patente 2012/031280) , y el anticuerpo anti-SEZ6 SC17.10, SC17.28 o SC17.42, respectivamente, para determinar si SEZ6 se expresaba de forma diferente en esas poblaciones. Tal como se indica en la FIG. 13B, las células LU86, LU117 y LU64 que presentaron una tinción positiva tanto para CD324 como para SEZ6 (línea negra continua) se desplazaron más hacia la derecha que las células que presentaron una tinción positiva únicamente para SEZ6 (línea negra de puntos) , lo cual indica que SEZ6 se expresa más en CSC en comparación con la población de células NTG. El control de isotipo constitutivo de la población se muestra como un histograma de relleno gris (MOPC = IgGl) .

Para determinar si la expresión de SEZ6 en la superficie celular se podría correlacionar con una mayor capacidad para generar tumores, se llevó a cabo un estudio de tumorigenicidad. Se disociaron muestras de tumores NTX y se dispersaron en suspensión utilizando técnicas de digestión enzimática reconocidas en la materia (remítase, por ejemplo, a la patente de EE. UU. 2007/0292414 que se incorpora la presente) . Los preparados celulares disociados de estas líneas NTX se tiñeron con anticuerpos conjugados con restos fluorescentes que reconocían específicamente CD45 murina, H2kD, CD324 humana y SEZ6 humana, el clon SC17.42. Se aislaron dos subconjuntos de células humanas, ambos identificados en función de la ausencia de tinción con H2kD o CD45 murina (para agotar los preparados celulares de células murinas) , utilizando un citómetro de flujo FACSAria™ (BD Biosciences) . Un subconjunto se aisló basándose en la expresión de CD324 y SEZ6 , mientras que el otro subconjunto se aisló basándose en un fenotipo CD324+SEZ6". Las subpoblaciones enriquecidas en los diferentes marcadores se trasplantaron posteriormente en ratones hembra inmunodeprimidos NOD/SCID mediante una inyección subcutánea en la masa de grasa mamaria con una dosis de aproximadamente 50 células por ratón.

Las FIGS. 14A y 14B ilustran los resultados de estos experimentos realizados utilizando líneas de células NTX representativas derivadas de tumores NSCLC obtenidos de pacientes. La FIG. 14A es un diagrama de dispersión (formado utilizando CD324 y SEZ6) que muestra la distribución del subconjunto mCD45"H2kD" del tumor original y posibles células tumorigiénicas clasificadas. La FIG. 14B muestra gráficamente el volumen del tumor medido obtenido a partir del implante de subpoblaciones de las células clasificadas en ratones inmunodeprimidos. Los valores entre paréntesis indican el número de tumores generados por ratón implantado.

Cabe destacar que los datos de la FIG. 14 muestran que la tumorigenicidad se asoció de forma uniforme con la subpoblación de células que expresaban SEZ6 junto con unos niveles elevados de CD324. En cambio, estos mismos datos demuestran que las células tumorales que no expresaban SEZ6 o que expresaban unos niveles bajos de SEZ6 eran mucho menos tumorigénicas que sus homologas positivas o con una expresión elevada. Basándose en los datos generados, se ha descubierto sorprendentemente que subpoblaciones de células tumorales que expresan el fenotipo CD324+SEZ6+ contienen en general la gran mayoría de capacidad tumorigénica y sugieren que SEZ6 podría proporcionar una diana terapéutica efectiva para la modulación de células tumorigénicas .

Ejemplo 14 Los moduladores de SEZ6 facilitan el suministro de agentes citotóxicos a células HEK-293T que expresan SEZ6 Para demostrar que los moduladores de SEZ6 de la presente invención son capaces de mediar el suministro de un agente citotóxico a células vivas, se llevó a cabo un ensayo de aniquilación celular in vitro utilizando moduladores de tipo anticuerpo de SEZ6 seleccionados unidos a la toxina saporina. La saporina aniquila células mediante la desactivación de los ribosomas en el citoplasma. Por lo tanto, la muerte celular utilizando el siguiente ensayo es una indicación de que los anticuerpos de SEZ6 son capaces de internalizar y suministrar los agentes citotóxicos al citoplasma de una célula diana.

Un fragmento Fab de un anticuerpo anti-IgG de ratón unido covalentemente a saporina ( "Fab-Saporina" ) (Advanced Targeting Systems, #IT-48) se combinó con anticuerpos de SEZ6 no marcados y se incubó con células HEK-293T que expresaban SEZ6 (remítase al Ejemplo 5) . La capacidad de los complejos de saporina resultantes para internalizar y aniquilar células se midió 72 horas después midiendo la viabilidad celular.

Específicamente, se depositaron 500 células por pocilio en DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal, en placas de 96 pocilios tratadas con cultivo tisular un día antes de la adición de los anticuerpos y la toxina. Las células HEK-293T que expresaban SEZ6 humana se trataron con un control (IgGl, IgG2a o IgG2b) o con moduladores de SEZ6 murinos purificados con una concentración de 100, 50 o 10 pM, junto con Fab-Saporina 2 nM. Las células se cultivaron durante tres días y, una vez transcurrido este tiempo, se enumeraron los números de células viables utilizando un instrumento Cell Titer Glo® (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las unidades de luminiscencia sin procesar (RLU, por sus siglas en inglés) utilizando cultivos que contenían células con el fragmento Fab y saporina se fijaron como valores de referencia del 100% y todos los demás conteos se calcularon de acuerdo con esto (denominados "RLU normalizadas" o "% de células vivas"). La FIG. 15A muestra que muchos de los moduladores de SEZ6 evaluados mediaron la aniquilación de células HEK-293T de un modo dependiente de la concentración. Los controles de isotipos (IgG2a, IgG2b y IgGl) no afectaron a los conteos celulares, tal como muestran los resultados en las primeras tres filas de la FIG. 15A (ND = no determinado) .

Este ensayo demuestra que puede tener lugar la internalización cuando el anticuerpo específico para SEZ6 se une a la superficie celular, sin que sea necesaria la dimerización o reticulación adicional.

Ejemplo 15 Los moduladores de SEZ6 median la citotoxicidad en células de tumores de pulmón in vi tro Para corroborar los resultados del Ejemplo 14 y determinar si los moduladores de SEZ6 pueden mediar la internalización de toxinas y la aniquilación celular de células tumorales humanas (en lugar de células modificadas por ingeniería genética) , se depositaron en placas células NTX con linaje de ratón agotado y posteriormente fueron expuestas a anticuerpos anti-SEZ6 y Fab-saporina .

Se disociaron tumores NTX en una única suspensión celular y se depositaron en placas Primaria™ (BD Biosciences) en medio exento de suero suplementado con factor de crecimiento como es habitual en la técnica. Tras cultivar las células durante un día a 37 °C/5% de C02/5% de 02, estas se trataron con un control (IgGl, IgG2a o IgG2b) o un modulador de SEZ6 murina y Fab-saporina tal como se ha descrito en el Ejemplo 14. Después de siete días, se evaluó la citotoxicidad de la saporina mediada por el modulador mediante la cuantificación del número remanente de células vivas utilizando un instrumento Cell Titer Glo.

Tal como se observa en la FIG. 15B, es evidente que se produjo una reducción en el número de células tumorales cuando LU37, un tumor NSCLC, y LU80, un tumor SCLC, se expusieron a los moduladores de SEZ6 SC17.6 (duplicado de SC17.16) y SC17.33. De forma similar, cuando LU100, un tumor SCLC, se expuso a cuatro moduladores de SEZ6, SC17.6, SC17.19, SC17.33 y SC17.34, con una concentración de 50 y 500 pM, se produjo una reducción de las células tumorales. Por el contrario, los anticuerpos de control de isotipos no tuvieron ningún efecto sobre el número de células vivas después del tratamiento .

Estos datos no solo demuestran que los anticuerpos ilustrativos descritos en la presente son capaces de unirse al antígeno SEZ6 en la superficie celular y facilitar el suministro de una carga útil citotóxica que provoque la muerte celular, sino que los datos anteriores también demuestran que múltiples anticuerpos anti-SEZ6 pueden mediar la aniquilación de varias células de tumores NTX.

Ejemplo 16 Preparación de conjugados de anticuerpo de SEZ6- fármaco Basándose en los ensayos de aniquilación in vitro con saporina de los Ejemplos 14 y 15 y para demostrar adicionalmente la versatilidad de la presente invención, se prepararon conjugados de anticuerpo anti-SEZ6-fármaco con la estructura M- [L-D] tal como se ha definido anteriormente. Es decir, se prepararon conjugados de anticuerpo anti-SEZ6-fármaco (SEZ6-ADC) utilizando agentes citotóxicos enlazados covalentemente . Más específicamente, se prepararon SEZ6-ADC que comprendían un conector como los descritos en la presente o en referencias que se mencionan justo a continuación y dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBD) seleccionados que se enlazaron covalentemente a los moduladores descritos (remítase, por ejemplo, a las patentes de EE. UU. Nos. 2011/0256157 y 2012/0078028, y la patente de EE. UU. No. 6.214.345, cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad por referencia) .

Se sintetizaron combinaciones de fármaco PBD-conector y se purificaron utilizando técnicas reconocidas en la materia teniendo en cuenta las referencias citadas. Aunque se emplearon varios dímeros de PBD y conectores para fabricar las combinaciones de fármaco-conector seleccionadas, cada unidad conectora comprendía un resto maleimido terminal con un sulfhidrilo libre. Utilizando estos conectores, se prepararon conjugaciones mediante la reducción parcial del mAb con tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) , seguida de la reacción de los residuos de Cys reducidos con la carga útil del maleimido del conector.

Más en particular, el modulador de tipo anticuerpo de SEZ6 seleccionado se redujo con 1.3 mol de TCEP por mol de mAb durante 2 h a 37°C en Tris HCl 25 mM a pH 7.5 y amortiguador de EDTA 5 mM. La reacción se dejó enfriar hasta 15 °C y se añadió la carga útil del conector en DMSO con una tasa de 2.7 mol/mol de mAb seguida de una cantidad adicional de DMSO hasta una concentración final del 6% (v/v) . Se dejó que la reacción siguiera su curso durante 1 hora. El fármaco-conector sin reaccionar se desactivó mediante la adición de un exceso de iV-acetilcisteína . A continuación, el SEZ6-ADC (o SC17-ADC) se purificó en una columna de intercambio iónico utilizando un sistema FPLC AKTA Explorer (G.E. Healthcare) para eliminar el anticuerpo de alto peso molecular agregado, el codisolvente y moléculas de bajo peso molecular. Posteriormente, el ADC eluido se sometió a un cambio de amortiguador por filtración de flujo tangencial (TFF) en amortiguador de formulación, a continuación se ajustó su concentración y se añadió un detergente. El ADC final se analizó para determinar la concentración proteica (por medición UV) , la agregación (SEC) , la proporción de fármaco respecto a anticuerpo (DAR) por HPLC en fase inversa (RP) , la presencia de anticuerpo sin conjugar por HPLC con cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) , los materiales no proteínicos por RP HPLC y la citotoxicidad in vitro utilizando una línea celular que expresaba SEZ6.

Utilizando el procedimiento mencionado anteriormente o una metodología sustancialmente similar, se generó una serie de ADC (es decir, M-[L-D]n) que comprendía diversos moduladores de SEZ6 y dímeros de PBD, y se evaluaron en diversos modelos in vivo e in vitro. A los efectos de estos Ejemplos y la presente exposición, tales ADC se pueden denominar en general SEZ6-ADC o SC17-ADC. Los ADC específicos se nombrarán de acuerdo con la denominación del anticuerpo (por ejemplo, SC17.17) y del conector-agente citotóxico específico ADC1, ADC2 , etc. Así pues, los moduladores ilustrativos compatibles con la presente invención pueden comprender SC17.17-ADC1 o SC17.24-ADC2 donde ADC1 y ADC2 representan agentes citotóxicos que son dímeros de PBD individuales (y opcionalmente un conector) .

A modo de referente inicial, se midió la citotoxicidad in vitro de hSC17.17-ADC1 para una CI50 de 11 nM cuando se expuso a células HEK293 que sobreexpresaban SEZ6 (no se muestran los datos) .

Ejemplo 17 Los moduladores de SEZ6 conjugados median la citotoxicidad en células de tumores de pulmón in vitro Se evaluaron los ADC generados en el Ejemplo 16 anterior para determinar si eran capaces de mediar la internalización de toxinas y la aniquilación celular de células tumorales humanas primarias in vitro.

Se expusieron células de tumores NTX con linaje de ratón agotado a ADC anti-SEZ6 o un control de isotipo de ratón (msIgGl) utilizando el mismo método que el descrito en el Ejemplo 15, excepto que no se añadió Fab-saporina . Cuando LU64, un tumor SCLC, y OV26, un tumor ovárico NET, se trataron con ADC anti-SEZ6 (SCI7.24 -ADC2 , SC17.28-ADC2 y SC17.34 -ADC2 ) , se observó una mayor reducción en el porcentaje de células viables en comparación con el control msIgGl (FIG 17A) . A pesar de que msIgGl puede ser citotóxico para las células en concentraciones elevadas, los tres ADC anti-SEZ6 evaluados fueron más potentes, lo cual indica que existe una respuesta inmunoespecífica frente a SEZ6 en lugar de una respuesta general a la citotoxina PBD.

Ejemplo 18 Los moduladores de SEZ6 conjugados suprimen el crecimiento tumoral in vivo Se evaluaron los ADC generados en el Ejemplo 16 anterior para demostrar su capacidad para reducir y suprimir el crecimiento de tumores NTX humanos en ratones inmunodepdrimidos .

Se hicieron crecer subcutáneamente tumores NTX obtenidos a partir de pacientes en los costados de ratones receptores NOD/SCID hembra utilizando técnicas reconocidas en la materia. Se monitorizaron los volúmenes de los tumores y los pesos de los ratones dos veces por semana. Cuando los volúmenes de los tumores alcanzaron 150-250 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento y se les inyectaron dosis de SC17-ADC1 o MsIgGl anti-hapteno-ADCl de control por vía intraperitoneal . Los ratones recibieron tres inyecciones de 1 mg/kg (que se indican con líneas verticales en la FIG. 17B y las FIGS . 18A y 18B) durante un periodo de siete días. Tras el tratamiento, se monitorizaron los volúmenes de los tumores y los pesos de los ratones hasta que los tumores superaron 800 mm3 o los ratones enfermaron.

La FIG. 17B muestra que los ADC anti-SEZ6 son capaces de inhibir in vivo el crecimiento de un tumor SCLC (LU86) y LCNEC (LU50) en ratones. En el caso de LU86, los cinco ADC evaluados (SC17.3-ADC1, SC17.24 -ADC1 , SC17.26-ADC1 , SC17.28-ADC1 y SC17.34 -ADC1) produjeron remisiones duraderas que se prolongaron, en algunos casos, más de 120 días después del tratamiento. En particular, el tratamiento con SC17.34-ADC1 inhibió el crecimiento tumoral durante el transcurso del estudio con esa dosis, mientras que SC17.24-ADC1 proporcionó una inhibición significativa del crecimiento tumoral con un periodo hasta que se produjo un avance de más de 50 días. De forma similar, el tratamiento de LU50 con cinco ADC ilustrativos (SC17.3-ADC1, SC17.17-ADC1 , SC17.24 -ADC1 , SC17.34-ADC1 y SC17.46-ADC1) proporcionó una supresión del crecimiento tumoral que se prolongó hasta incluso 35 días con SC17.46. Además, los ratones tratados con SC17-ADC1 no exhibieron ningún efecto adverso para la salud aparte de los que se observan habitualmente en ratones NOD/SCID portadores de tumores inmunodeprimidos . Estos resultados sugieren que los ADC descritos se pueden utilizar para suprimir eficazmente el crecimiento tumoral y que las características particulares del modulador SC17 que se une pueden ejercer un impacto sobre la eficacia in vivo.

Más concretamente, la capacidad de varios moduladores conjugados para suprimir o ralentizar de forma drástica el crecimiento tumoral in vivo durante periodos prolongados valida adicionalmente el uso de SEZ6 como diana terapéutica par el tratamiento de trastornos proliferativos .

Ejemplo 19 Loe moduladores de SEZ6 conjugados humanizados suprimen el crecimiento tumoral in vivo Teniendo en cuenta los resultados excelentes obtenidos con los moduladores ADC anti-SEZ6, se realizaron experimentos adicionales para demostrar la eficacia de moduladores ADC anti-SEZ6 humanizados ilustrativos en el tratamiento de tumores SCLC in vivo. Se administraron moduladores ADC anti-SEZ6 humanizados seleccionados (utilizando los moduladores hSC17.17, hSC17.24, hSC17.34 y hSC17.46), producidos como se ha expuesto en el Ejemplo 16, y el ADC de control de isotipo de IgGl humana (huIgGl) a ratones inmunodeprimidos portadores de varios tumores NTX. El régimen posológico fue el mismo que el expuesto en el Ejemplo 18.

Los resultados de estos experimentos se presentan en las FIGS. 18A y 18B. Se consiguió la eliminación completa y duradera de la masa tumoral mediante la administración de ADC anti-SEZ6 humanizados en cuatro tumores SCLC. La FIG. 18A muestra la reducción del tumor LU80 por acción de hSC17.17-ADC1 y hSC17.46 -ADC1 ; y la eliminación del tumor LU64 por acción de hSC17.17-ADC1, hSC17.34-ADC1 y hSC17. 6 -ADC1. La FIG. 18B muestra la reducción del tumor LU117 por acción de hSC17.17-ADC1 y hSC17.46-ADC1 ; y la reducción del tumor LU111 por acción de hSC17.34-ADC1 y hSC17.46-ADC1. Se observó ausencia de recidiva del tumor durante más de 50 días en 3 de los 4 estudios de este tipo. En cada estudio, se monitorizaron los volúmenes de los tumores y los pesos de los ratones para los animales de control hasta que los tumores superaron 800 mm3 o los ratones enfermaron.

Estos resultados demuestran la sorprendente aplicabilidad de una serie de moduladores de SEZ6 humanizados para ralentizar de forma eficaz el crecimiento de diferentes tumores .

Los expertos en la técnica apreciarán además que la presente invención se puede materializar de otras formas específicas sin alejarse de la naturaleza ni los atributos centrales de esta. En el hecho de que la descripción anterior de la presente invención expone únicamente modalidades ilustrativas de esta, se debe sobreentender que se contemplan otras variaciones dentro del alcance de la presente invención. Por consiguiente, la presente invención no se limita a las modalidades particulares que se han descrito detalladamente en la presente. En cambio, se debe hacer referencia a las modalidades adjuntas como una indicación del alcance del contenido de la invención.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un modulador de SEZ6 aislado.

2. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este.

3. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclona1.

4. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo constituido por anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos .

5. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con las reivindicaciones 3 o 4, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal o fragmento inmunorreactivo de este se une a un dominio sushi o un dominio cub de la proteína SEZ6.

6. El modulador de SEZ6 de tipo anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-5, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende una región variable de la cadena ligera que contiene tres regiones determinantes de la complementariedad y una región variable de la cadena pesada que contiene tres regiones determinantes de la complementariedad, donde las regiones determinantes de la complementariedad de las cadenas ligera y pesada comprenden al menos una región determinante de la complementariedad expuesta en la FIG. 10A o la FIG. 10B.

7. El modulador de SEZ6 de tipo anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-5, caracterizado porque compite por la unión a una proteína SEZ6 con un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo constituido por SC17.1, SC17 • 2, SC17 .3, SC17.4, SC17.8, SC17 .9, SC17.10 , SC17.11, SC17. 14, SC17. 15, SC17.16, SC17.17, SC17 .18, SC17. 19, SC17 .22, SC17 .24, SC17.27, SC17.28, SC17 .29, SC17. 30, SC17 .32, SC17 • 34, SC17.35, SC17.36, SC17 .38, SC17. 39, SC17 .40, SC17 -41, SC17.42, SC17.45, SC17 .46, SC17. 47, SC17 • 49, SC17 .50, SC17.53 , SC17.54, SC17 .56, SC17. 57, SC17 .59, SC17 .61, SC17.63, SC17.71, SC17 .72, SC17. 74, SC17 .76, SC17 • 77, SC17.79, SC17.81, SC17 .82, SC17. 84, SC17 .85, SC17 .87, SC17.89, SC17.90, SC17 • 91, SC17. 93, SC17. 95, SC17. 97, SC17.99, SC17.102, SC17 .114, SC17. 115, SC17. 120, SC17. 121, SC17.122, SC17.140, SC17 .151, SC17. 156, SC17. 161, SC17. 166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17.200, donde la unión del modulador de SEZ6 de tipo anticuerpo a la proteína SEZ6 se inhibe al menos un 30%.

8. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con las reivindicaciones 2-7, caracterizado porque el anticuerpo comprende un anticuerpo internalizante.

9. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-8, caracterizado porque el anticuerpo comprende además un agente citotóxico.

10. Un ácido nucleico caracterizado porque codifica una región variable de la cadena pesada de aminoácidos o una región variable de la cadena ligera de aminoácidos de un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este de conformidad con las reivindicaciones 1-8.

11. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10.

12. Un conjugado de anticuerpo- fármaco de fórmula: M-[L-D]n o una sal farmacéuticamente aceptable de este, caracterizado porque a) M comprende un modulador de SEZ6 ; b) L comprende un conector opcional; c) D es un agente antiproliferativo ; y d) n es un número entero comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20.

13. El conjugado de anticuerpo- fármaco de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo de este y el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende una región variable de la cadena ligera que contiene tres regiones determinantes de la complementariedad y una región variable de la cadena pesada que contiene tres regiones determinantes de la complementariedad, donde las regiones determinantes de la complementariedad de las cadenas ligera y pesada comprenden al menos una región determinante de la complementariedad expuesta en la FIG. 10A o la FIG. 10B.

14. El conjugado de anticuerpo- fármaco de conformidad con las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado porque el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo internalizante.

15. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o el conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 12 o 14 para usarse en una medicina.

16. El modulador de SEZ6 aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o el conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 12 o 14, caracterizado porque es para el tratamiento de un cáncer en un paciente donde el cáncer se selecciona del grupo constituido por cáncer suprarrenal, cáncer de vejiga, cáncer del cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de mama.

17. El uso de un modulador de SEZ6 para fabricar un medicamento para el tratamiento del cáncer de pulmón microcítico en un sujeto que lo necesite.

18. El medicamento de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo monoclonal.

19. El medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 o 18, caracterizado porque el modulador de SEZ6 se une a un dominio sushi o un dominio cub de la proteína SEZ6.

20. El medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-19, caracterizado porque el modulador de SEZ6 comprende un agente citotóxico.