CN120904329A

CN120904329A - 一种抗sez6纳米抗体或抗原结合片段与应用

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Publication number: CN120904329A
Application number: CN202510945431.3A
Authority: CN
Inventors: 杨兴; 张宁; 万五洲; 田新生; 陈雪娇
Original assignee: Yunhe Pharmaceutical Tianjin Co ltd; Yunnan Baiyao Group Co Ltd; Peking University First Hospital
Current assignee: Yunhe Pharmaceutical Tianjin Co ltd; Yunnan Baiyao Group Co Ltd; Peking University First Hospital
Priority date: 2024-10-18
Filing date: 2024-10-18
Publication date: 2025-11-07
Also published as: CN119409821B; CN119409821A

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段与应用。所述抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；各区域的序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：18所示。与常规抗体相比较，本发明的抗SEZ6纳米抗体表达高效、纯化简单，分子量小，亲和力高，特异性较好，可溶性高、耐受性强，可在科研、诊断和治疗治疗领域广泛应用。

Description

一种抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段与应用

本申请是申请日为2024年10月18日、申请号为202411461154.0以及发明名称为“一种抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段与应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地，涉及一种抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段与应用。

背景技术

基于癌细胞与其微环境之间的相互依存、相互作用中特异性靶点的免疫疗法已经成为肿瘤治疗领域的研究热点，包括抗CTLA-4、抗PD-1和抗PD-L1等免疫检查点抑制剂以及嵌合抗原受体(CAR)T细胞等。众多靶向不同靶点的抗体药物现已获准用于临床并取得良好效果，目前针对更多靶点的药物正在研发中。过去30年，传统的单克隆抗体在治疗性生物大分子药物研发中占据了重要地位。随着抗体药物不断应用于更多治疗领域，抗体药物的治疗机理变得更为复杂，同时抗体药物的结构也变得更为多样化，因此需要开发新的技术来解决单克隆抗体的缺陷。

SEZ6家族包括SEZ6(Seizure-related gene 6)，SEZ6L(Seizure-related gene6-like)和SEZ6L2(Seizure-related gene 6-like 2)。所有SEZ6家族成员都含有2-3个CUB结构域和5个补体控制蛋白(CCP)结构域，表明它们可能参与补体调控。SEZ6是一种I型跨膜蛋白，由位于17号染色体[17q11.2]的SEZ6基因编码，它参与了大脑皮层神经元的正常树突分支化。正常生理状态下，SEZ6主要表达在脑内，如大脑皮层、小脑、基底节、下丘脑都有表达。在SCLC和其他神经内分泌肿瘤中高度表达，而在大多数正常组织中表达极少。

SEZ6(Seizure-related gene 6)：SEZ6通常在中枢神经系统中表达。SEZ6蛋白质在神经细胞的发育和突触形成中起重要作用。突触是神经细胞之间的连接点，它们在信息传递中起到关键的作用。SEZ6共994AA。

SEZ6L(Seizure-related gene 6-like)：SEZ6L与SEZ6基因高度相似，因此被称为"SEZ6-like"。SEZ6L基因编码的蛋白质在神经系统中表达，并参与突触形成和神经细胞连接的过程。SEZ6L与SEZ6在序列上有一些相似性，但它们在某些细节上可能存在差异。SEZ6L共1024AA。

SEZ6L2(Seizure-related gene 6-like 2)：SEZ6L2基因编码的蛋白质在中枢神经系统中高度表达，特别是在大脑的皮层区域。SEZ6L2与神经细胞的迁移、突触形成以及神经系统的发育和功能具有关联。SEZ6L2共910AA。

目前，已有关于SEZ6的靶向药物在研，包括单抗药物和ADC等，但进入临床试验的抗体很少。传统的单克隆抗体的制备过程较复杂，生产成本较高，而且分子量较大，组织穿透能力较差。纳米抗体是目前已知的可以结合抗原的最小片段，只有单克隆抗体大小的1/10，具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及结合活性。与传统抗体相比，纳米抗体具有多种独特的优势，如良好的组织穿透能力、快速清除、易于生产和修饰、稳定性高、免疫原性较低等，是一种非常有应用前景的新型抗体分子。

针对SEZ6靶点的纳米抗体还未见报道和临床应用，本领域迫切需要开发新的有效针对SEZ6靶点的特异性纳米抗体。

发明内容

定义

除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。

除非另有说明，否则可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中无论是指重链抗体还是指常规四链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段，分别例如VHH结构域或VH/VL结构域)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。

本发明所要解决的技术问题是提供一种可以阻断SEZ6与其配体结合的抗SEZ6纳米抗体的VHH链，及其进一步的衍生与应用。

为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段，其包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；其中，

CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6之一所示的序列，或为与SEQ IDNO：1～SEQ ID NO：6之一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且功能相同；

CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：12之一所示的序列，或为与SEQID NO：7～SEQ ID NO：12之一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且功能相同；

CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：13～SEQ ID NO：18之一所示的序列，或为与SEQID NO：13～SEQ ID NO：18之一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且功能相同。

本发明中“功能相同”的含义是：能够结合SEZ6蛋白。

抗体或纳米抗体序列中的CDR的位置可由本领域技术人员采用现有技术确定。通常，可以通过对抗体或纳米抗体的DNA进行测序来鉴定CDR，然后使用专用数据库(例如国际ImMunoGeneTics数据库或IMGT)分析由此获得的序列。

在本发明提供的序列中，CDR根据IMGT绘制(https://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results)。

根据本发明一种优选实施方式，所述抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段具有以下任意一种的CDR序列特征：

(1)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：13所示的序列或与上述序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且功能相同；

(2)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14所示的序列或与上述序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且功能相同；

(3)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15所示的序列或与上述序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且功能相同；

(4)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：16所示的序列或与上述序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且功能相同；

(5)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：17所示的序列或与上述序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且功能相同；

(6)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：18所示的序列或与上述序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列且功能相同。

根据本发明，除上述互补决定区外，所述抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段还包含与三个互补决定区交替设置的四个框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中，FR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：19～SEQ ID NO：24之一所示的序列；

FR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：25～SEQ ID NO：30之一所示的序列；

FR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：31～SEQ ID NO：36之一所示的序列；

FR4的氨基酸序列为SEQ ID NO：37～SEQ ID NO：39之一所示的序列。

根据本发明一种优选实施方式，所述抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段具有以下任意一种的FR序列特征：

(a)FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：37所示的序列；

(b)FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：37所示的序列；

(c)FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：37所示的序列；

(d)FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：38所示的序列；

(e)FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：37所示的序列；

(f)FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：39所示的序列。

本发明包括所有满足上述序列特征的序列，具体优选地，

所述纳米抗体或抗原结合片段包含以下序列中的一种或多种：

(i)如SEQ ID NO：40～SEQ ID NO：45之一所示的氨基酸序列；

(ii)与SEQ ID NO：40～SEQ ID NO：45之一所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列且功能相同；

(iii)在SEQ ID NO：40～SEQ ID NO：45之一所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留如SEQ ID NO：40～SEQ ID NO：45之一所示的氨基酸序列的功能，即能够结合SEZ6蛋白。

Ph-2-B3：QVKLEESGGGLVQAGGALNLSCVASGIIFSMYDMGWYRQGSGEARDIVAAIGKGGSTYYADAVKGRFTISRDNAQNTLYLQMNSLKPEDTSMYYCTTVEPYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：40)

Ph-3-A7：AVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCTASDSRFIANIMGWYRQAPGKERELVVAISSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTDMYYCAFFEGGIPDGWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：41)

Ph-3-H7：AVQLVDSGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINTMGWYRQAPGKERELVAAISSHGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTTMYYCAASRDSDYDPGRGSWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：42)

Ph-2-C03：AVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSIEAMGWYRQAPGEVRELVAAISSGNSTYYADNVKGRFTISRDNANNTVYLQMTSLKPEDTAMYYCAAFESSRPWALGKGALVTVSS(SEQ ID NO：43)

Ph-2-E05：QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCTASGSIFSFDALGWYRQAPGSERELVAAVGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDVAMYYCAAFSPHSGIPRLWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：44)

Ph-2-E10：QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSIDTMGWYRSAPGEERRLVAAISTGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAMYYCAGFSSQSDPGVPNLLGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：45)

本发明的第二方面提供一种核酸分子，其编码上述的抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段。

本发明的第三方面提供一种载体，其包含上述第二方面的核酸分子。

本发明的第四方面提供一种宿主细胞，其含有上述第三方面的载体或上述第二方面的核酸分子。

所述宿主细胞包括但不限于细菌细胞、真菌细胞、动物细胞、植物细胞或这些细胞的后代细胞。

本发明的抗SEZ6纳米抗体可通过以下方法获取：

(1)利用人、猴、鼠SEZ6蛋白免疫羊驼，制备噬菌体展示文库。

(2)用人、猴、鼠SEZ6蛋白亲和筛选噬菌体展示文库；

(3)ELISA、FACS鉴定阳性克隆；

(4)表达和纯化SEZ6纳米抗体。

本发明的第五方面提供一种工程化产生抗SEZ6纳米抗体的方法，包括以下步骤：

(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养如本发明第四方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗SEZ6纳米抗体的培养物；以及

(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的抗SEZ6纳米抗体；及任选的

(c)纯化和/或修饰步骤(b)所获得的抗SEZ6纳米抗体。

本发明的第六方面提供一种抗体偶联药物，包括所述的抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段和效应物；优选的，所述效应物包括核素、细胞毒性剂、荧光基团、催化底物显色的酶、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种。

本发明的第七方面提供一种药物组合物，含有上述的抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段，或上述的抗体偶联药物。

本发明的第八方面提供所述抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段的下述用途：

(i)制备检测人SEZ6相关疾病的试剂中的用途；所述试剂优选为检测SEZ6相关疾病的试剂盒；

(ii)制备用于治疗SEZ6相关疾病的药物中的应用。

本发明的所述抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段还可用于治疗SEZ6相关疾病。

所述SEZ6相关疾病包括但不限于癌症，所述癌症包括但不限于小细胞肺癌、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤和高级别中枢神经系统肿瘤中的至少一种。所述的抗SEZ6纳米抗体可作为免疫检查点抑制剂，作为癌症治疗药物单独使用，也可以联合其他抗癌药物，因此所述药物的活性组分包括所述抗SEZ6纳米抗体以及任选的其他抗癌药物。

与常规抗体相比较，本发明的抗SEZ6纳米抗体表达高效、纯化简单，分子量小(约15kDa)，亲和力高，特异性较好，可溶性高、耐受性强，可在科研、诊断和治疗治疗领域广泛应用。此外，纳米抗体更容易识别传统抗体无法捕获的抗原，组织穿透性更好，可进入肿瘤组织和穿过血脑屏障，能够开发作为免疫检查点抑制剂，为肿瘤显像及治疗提供方案。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1为重组蛋白Reduced SDS-PAGE检测凝胶电泳图。

图2a-b分别示出了252#羊驼和297-231#羊驼的酵母展示库VHH片段的扩增过程。

图3a-b分别示出了252#羊驼和297-231#羊驼的酵母展示库QC结果。

图4a-b分别示出了252#羊驼和297-231#羊驼的酵母展示库磁分选结果。

图5a-b分别示出了252#羊驼和297-231#羊驼的酵母展示库二轮流式分选结果。

图6a-d分别示出了252#羊驼单克隆FACS检测的1号板、2号板、3号板和4号板的结果。

图7a-c分别示出了297-231#羊驼单克隆FACS检测的1号板、2号板、3号板的结果。

图8a-c示出了ELISA检测重组抗体与靶蛋白的结合实验中第二批候选抗体的检测结果。

图9示出了FACS检测重组抗体与靶蛋白结合的结果。

图10a-b示出了候选抗体在37℃条件下与过表达细胞的FACS EC₅₀检测结果。

图11a-b示出了候选抗体在4℃条件下与过表达细胞的FACS EC₅₀检测结果。

图12示出了候选抗体内吞检测结果。

图13示出了候选抗体亲和力检测结果。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

实施例

1.抗原制备

根据uniprot数据库中Cynomolgus SEZ6和Mouse SEZ6蛋白氨基酸序列信息(Leu20-His927(Cynomolgus SEZ6)[Accession|A0A2K5WPJ4]&(Leu20-His922)(MouseSEZ6)[Accession|Q7TSK2])，按照哺乳动物的密码子偏好进行密码子优化，合成抗原编码核酸序列后，将核酸序列亚克隆到pCDNA3.4载体中C端添加His Tag，构建真核表达载体；将两个质粒分别转染293F细胞，收集上清并采用镍柱纯化目的蛋白。构建的Cynomolgus SEZ6蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：46所示，构建的Mouse SEZ6蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO：47所示。Human SEZ6-His蛋白购自恺佧生物科技(上海)有限公司。

采用SDS-PAGE检测重组蛋白纯度，结果如图1所示，结果表明：Human SEZ6-His蛋白纯度>95％，可用于免疫和后续的淘选工作。Cyno SEZ6-His和Mouse SEZ6-His蛋白纯度>90％，可以用于交叉结合的验证。

2.重组蛋白抗原与阳性抗体的ELISA结合活性检测

1)使用无菌CBS稀释SEZ6-His重组蛋白至终浓度为1μg/mL，取一块新的96孔板，每孔加入100μL，4℃包被过夜；甩去抗原包被液，使用PBST(含0.5％的吐温)洗涤3次；加入200μL/孔的3％ MPBS 37℃封闭2小时；甩去封闭缓冲液后，使用PBST洗涤孔板3次；

2)阳性对照抗体hSEZ6VH+VL(委托爱康得生物科技公司表达制备，序列信息参考WO 2019/232241A1)使用PBS稀释至10μg/mL，5倍稀释7个点，按100μL/孔加入酶标板中，室温孵育1小时，对照孔为PBS；

3)甩去孔内的液体，并使用PBST洗涤3次；

4)加入二抗HRP-ProteinA(1:10000稀释)，按100μL/孔加入酶标板中，室温孵育1小时；

5)甩去孔内的液体后，使用PBST洗涤孔板3次；

6)加入100μL/孔TMB显色液；

7)室温避光孵育15分钟；

8)加入50μL/孔终止液(2M HCl)；

9)使用酶标仪读取孔内的OD₄₅₀值。

结果如下表1所示：

表1

结果表明：三种种属的蛋白均与阳性对照抗体有较好的结合活性，可用于后续的实验。

3.羊驼免疫

使用采购的Human SEZ6-His重组蛋白以及上述制备的Mouse SEZ6-His重组蛋白对羊驼(Alpaca)进行免疫，羊驼编号分别为297-231#和252#，免疫间隔时间14天，从二免后开始，每次免疫后七天采集外周血监测免疫血清效价；免疫进程表如下表2所示：

表2

4.免疫效价检测

免疫效价检测步骤包括：

1)免疫完成后，采集5mL外周血，将收集有血液样本的离心管置于37℃培养箱内放置1小时；然后将血液样本转移至4℃过夜；

2)将收集有血液样本的离心管置于离心机中，5000rpm离心20min；分离上层血清，将血清转移至一个新的无菌离心管中，收集免疫血清；

3)使用无菌CBS(碳酸盐缓冲液)稀释目标重组蛋白至终浓度为1μg/mL；取一块新的96孔酶标板，加入100μL/孔4℃包被过夜；

4)去掉抗原包被液，使用PBST(含0.05％的吐温20)洗涤5次；

5)加入200μL/孔的3％ MPBS 37℃封闭2小时；

6)去掉封闭缓冲液后，使用PBST洗涤孔板5次；

7)加入100μL梯度稀释的血清(100μL/孔)，室温孵育1小时，对照孔为PBS；

8)去掉孔内的液体，并使用PBST洗涤5次；

9)加入100μL HRP anti-Llama IgG(H+L)抗体(1:50000稀释)，室温孵育1小时；

10)去掉孔内的液体后，使用PBST洗涤孔板5次；

11)加入100μL/孔TMB显色液；

12)室温避光孵育10-15分钟；

13)加入50μL/孔终止液；

14)使用酶标仪读取孔内的OD₄₅₀值。

免疫效价检测结果如下表3和表4所示，样品平行测试2组：

表3

表4

根据ELISA检测效果，免疫血清与目标重组蛋白可以结合，且随着免疫血清的梯度稀释，OD值呈梯度变化，羊驼效价明显提高达到采血建库的要求，各采集100mL外周血进行抗体展示库的构建。

5.酵母展示库的构建

252#羊驼和297-231#羊驼的酵母展示库VHH片段的扩增过程分别如图2a和2b所示：采集外周血分离PBMC细胞，提取RNA后采用逆转录试剂盒制备cDNA文库；使用单域抗体扩增引物进行1轮PCR，分别获得1000bp和750bp左右的PCR条带，胶回收750bp的片段作为二轮PCR的模板；第二轮PCR获得400bp左右的条带，为VHH片段，将VHH片段与线性化的酵母展示载体混合电转酵母细胞，得到酵母库。构建的252#羊驼的酵母库库容为2.63×10⁹，297-231#羊驼的酵母库库容为1.0×10⁹。具体步骤如下：

5.1PBMC分离及VHH抗体片段克隆

1)免疫完成后，采集100mL外周血，使用淋巴细胞分离液分离PBMC。

2)提取RNA，使用PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，制备cDNA。

2-1)在200μL PCR中配制下列反应混合液：

2-2)65℃保温5min后，冰上迅速冷却；

2-3)在上述PCR管中配制下列反应液

2-4)吹打混匀后，分装80μL/管，置于PCR仪中42℃ 1小时，70℃热失活15分钟，最后将cDNA样品置于冰上或-20℃长期保存。

3)VHH片段的扩增

3-1)配置第一轮PCR反应体系(50μL/管)：上游引物结合在信号肽，序列为SEQ IDNO：48所示，下游引物结合在CH2区，序列为SEQ ID NO：49所示。

配置好PCR反应体系后，按照如下程序设置PCR仪：

3-2)PCR产物的琼脂糖电泳

使用1％的琼脂糖进行电泳分析PCR产物，分离分子量大小为750bp左右的片段。使用胶回收试剂盒回收PCR产物，并用NanoDrop测定浓度。

3-3)配置二轮PCR反应体系(50μL/管)：上游引物结合在抗体FR1区，序列为SEQ IDNO：50所示，下游引物结合在抗体Hinge和FR4区，序列为SEQ ID NO：51所示，酶切位点为SfiI。

配置好PCR反应体系后，按照如下程序设置PCR仪：

3-4)二轮PCR产物的琼脂糖电泳分析

使用1％的琼脂糖进行电泳分析PCR产物，分离分子量大小为400bp左右的VHH片段；使用胶回收试剂盒回收VHH PCR产物，并用NanoDrop测定浓度。

3-5)PCR产物沉淀

将回收的二轮PCR产物每个1.5mL离心管分装200μL，加入1/10体积(20μL)3M醋酸钠，1μg/μL糖原(Glycogen)，吹吸混匀，加入880μL无水乙醇，颠倒混匀，-80℃冻存。

5.2酵母展示载体pYDisplay线性化，酶切体系如下：

1)使用SfiI酶切pYDisplay载体，100μL/管分装，50℃酶切过夜；

2)使用1％的琼脂糖凝胶分离pYDisplay载体片段，切取5000bp的载体片段进行胶回收，并用NanoDrop测定浓度；

3)将回收的pYDisplay酶切产物每个1.5mL离心管分装200μL，加入1/10体积(20μL)3M醋酸钠，1μg/μL糖原(Glycogen)，吹吸混匀，加入880μL无水乙醇，颠倒混匀，-80℃冻存。

5.3电转化构建酵母展示库

1)将-80℃冻存的酵母感受态菌株划线到YPD固体培养基平皿上，30℃活化3-5天；

2)接种单菌落酵母感受态到50mL YPD培养基，250rpm、30℃摇培1-2天；

3)制备酵母感受态菌株：将线性化载体片段和PCR产物混合后，加到电击杯中，电击；电击后的酵母感受态转染培养瓶中，220rpm，30℃摇培1h；

4)取20μL重悬液，用SDCAA稀释5000倍，吸取100μL，涂SDCAA平板，培养2-3天，计算库容，其余菌液继续培养24h；

5)保菌：将剩余菌液收集到50mL离心管中，3000×g，离心5min，弃去上清，加入10mL SDCAA重悬，用50％甘油：重悬液＝1:1混合，-80℃冻存。

结果：252#羊驼和297-231#羊驼的酵母展示库QC分别如图3a和3b所示：随机挑取单克隆进行测序分析，去除套峰终止密码子序列，无空载序列和重复序列，且序列差异大，库多样性较好。

6.酵母展示库磁分选

1)取SDCAA中培养的酵母加入含50mL SGCAA培养基的250mL摇瓶中，30℃，240rpm，摇床培养16h。

2)离心后，弃上清，用1mL 0.5％ PBSA重悬，加到1.5mL离心管中，3000×g，离心5min，弃上清。用0.5％ PBSA再洗一次。

3)将与抗原孵育好的链霉亲和素磁珠，用0.5％ PBSA洗两次(每次4℃旋转孵育5分钟)，置于磁力架上，5min，弃去上清。

4)将酵母菌液加到结合了抗原的磁珠中，4℃旋转孵育60分钟，置于磁力架上，15min。

5)弃去酵母菌液留磁珠，用0.5％ PBSA洗三次(每次4℃旋转孵育5分钟)。

6)将磁珠用1mL SDCAA培养基重悬，吸取0.5-5μL重悬液到100μL SDCAA培养基中涂板，将重悬液均分成两份，一份加500μL 50％甘油(-80℃保存)；一份加到摇菌管中，补2mL SDCAA培养基，30℃，240rpm，培养16h。

7)将摇菌管中的菌液转到50mL SDCAA培养基中(250mL摇瓶)，30℃，240rpm培养过夜。

8)测量菌液OD₆₀₀值，根据OD₆₀₀取一部分菌液离心，用SGCAA重悬，转到50mL SGCAA培养基中，使最终OD₆₀₀值为1，30℃，240rpm培养过夜，剩余菌液用SDCAA:50％甘油＝1:1重悬，-80℃冻存。

图4a和4b分别示出了252#羊驼和297-231#羊驼的酵母展示库磁分选结果。

图4a中，A：NC组；B：原始库：一抗：V5-FITC；C：1MACS：一抗：Biotin-Human-SEZ6-His，二抗：APC-streptavidin、V5-FITC；D：1MACS：一抗：Biotin-Mouse-SEZ6-His，二抗：APC-streptavidin、V5-FITC。使用Bio-Human-SEZ6-His蛋白采用磁选方法分选酵母库后，Human SEZ6的阳性占比为4.88％，Mouse SEZ6的阳性占比为1.44％，安排二轮流式分选。

图4b中，A：NC组；B：原始库：一抗：V5-FITC；C：1MACS：一抗：Biotin-Human-SEZ6-His，二抗：APC-streptavidin、V5-FITC；D：1MACS：一抗：Biotin-Mouse-SEZ6-His，二抗：APC-streptavidin、V5-FITC。使用Bio-Human-SEZ6-His蛋白采用磁选方法分选酵母库后，Human SEZ6的阳性占比为1.18％，Mouse SEZ6的阳性占比为1.88％，安排二轮流式分选。

7.酵母展示库二轮流式分选

1)取1mL SGCAA培养的酵母菌液到1.5mL离心管中，离心去上清，用1mL PBS洗2次，用1mL PBS重悬，取100μL菌液到新的1.5mL离心管中(作为NC)，离心，去上清。

2)将Biotin-抗原蛋白用100μL PBS稀释至10μg/mL浓度，重悬实验组菌体，4℃旋转孵育60min，3000×g，离心3min，弃上清，用1mL PBS洗2次。

3)将APC-Streptavidin按照1:1000稀释重悬实验组菌体，4℃旋转孵育60min，3000×g，离心3min，弃上清，用1mL PBS洗2次，用1mL PBS重悬。

4)将重悬的菌体加到流式分选管中，用于流式分选。

5)准备1mL SDCAA培养基到15mL离心管中，作为收集管。

6)上机器流式分选，用NC组调门，分选APC阳性的酵母。

图5a和5b分别示出了252#羊驼和297-231#羊驼的酵母展示库二轮流式分选结果。

图5a中，A：NC组；B：1MACS：一抗：Biotin-Mouse-SEZ6-His，二抗：APC-streptavidin、V5-FITC。分选P3，共获得19006个酵母细胞，安排涂布平板，挑选酵母单克隆扩增诱导后进行酵母单克隆流式检测。

图5b中，A：NC组；B：1MACS：一抗：Biotin-Human-SEZ6-His，二抗：APC-streptavidin、V5-FITC；C：1MACS：一抗：Biotin-Mouse-SEZ6-His，二抗：APC-streptavidin、V5-FITC。分选P3，使用Human SEZ6的蛋白分选获得细胞45046个，使用MouseSEZ6的蛋白分选获得细胞19602个，安排涂布平板，挑选酵母单克隆扩增诱导后进行酵母单克隆流式检测。

8.酵母单克隆流式检测

分选后酵母菌液涂SDCAA平板，挑取单克隆培养，诱导表达48h后，与Biotin-抗原孵育，二抗使用PE-Streptavidin，孵育完成后进行流式检测。将与目标抗原结合的酵母克隆使用0.2％ SDS重悬，95℃孵育10min裂解，离心取菌液上清，取0.5μL作为模板用于PCR扩增送测(剩余菌液-20℃保存)。

从富集后的酵母展示库中，随机挑选单克隆细胞，扩增诱导后分别采用抗原进行检测，确定单克隆酵母细胞表面展示单域抗体与目标抗原结合情况。结果图6a-d、图7a-c所示。

根据实验结果，挑选Human SEZ6和Mouse SEZ6蛋白交叉结合的阳性克隆进行PCR送测，得到的差异序列安排载体构建。

9.抗体真核表达载体的构建

将阳性的酵母克隆进行PCR获得抗体序列，在C端添加His标签，通过SfiI酶切后与真核表达载体pcDNA3.4-human IgG1Fc连接，构建抗体表达载体，经Sanger测序验证无误后，进行质粒抽提。

10.候选单域抗体表达纯化

1)从冰箱中取出LVTransm转染试剂及pcDNA3.4-human IgG1Fc抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入20μg抗体真核表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入60μLLVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

2)将上述DNA/LVTransm复合物加入到20mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％ CO₂，130rpm培养箱中继续培养。

3)连续培养5-7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体。

11.ELISA检测重组抗体与靶蛋白的结合

1)使用无菌CBS稀释重组蛋白至终浓度为1μg/mL。取一块新的96孔酶标板，加入100μL/孔4℃包被过夜。

2)去掉抗原包被液，使用PBST(含0.05％的吐温20)洗涤5次。

3)加入200μL/孔的3％ MPBS 37℃封闭2小时；

4)去掉封闭缓冲液后，使用PBST洗涤孔板5次；

5)加入表达的重组抗体，转染上清50μL/孔或者纯化抗体(起始浓度为10μg/mL，3倍梯度稀释7个点，100μL/孔)，室温孵育1小时，对照孔为PBS；

6)去掉孔内的液体，并使用PBST洗涤5次；

7)加入100μL/孔HRP-Protein A抗体(1:50000稀释)，室温孵育1小时；

8)去掉孔内的液体后，使用PBST洗涤孔板5次；

9)加入100μL/孔TMB显色液；

10)室温避光孵育10-15分钟；

11)加入50μL/孔终止液；

12)使用酶标仪读取孔内的OD₄₅₀值。

第一批候选抗体检测结果如表5～表7所示。

表5

包被Human-SEZ6-His(2μg/mL)，检测候选抗体与Human-SEZ6-His的结合情况。根据检测结果可知，仅297-231-2-A10候选抗体均与靶蛋白弱结合。

表6

包被Mouse-SEZ6-His(2μg/mL)，检测候选抗体与Mouse-SEZ6-His的结合情况。根据检测结果可知，仅297-231-2-A10候选抗体均与靶蛋白弱结合。

表7

包被Cyno-SEZ6-His(2μg/mL)，检测候选抗体与Cyno-SEZ6-His的结合情况。根据检测结果可知，仅297-231-2-A10候选抗体均与靶蛋白弱结合。

第二批候选抗体检测，结果如图8a-8c所示。

如8a所示，包被Human-SEZ6-His(2μg/mL)，检测候选抗体与Human-SEZ6-His的结合情况。根据检测结果可知，候选抗体Ph-2-B3、Ph-3-A7、Ph-3-H7、Ph-1-A03、Ph-2-C02、Ph-2-C03、Ph-2-E05、Ph-2-E10与靶蛋白结合。

如8b所示，包被Mouse-SEZ6-His(2μg/mL)，检测候选抗体与Mouse-SEZ6-His的结合情况。根据检测结果可知，仅Ph-1-A03、Ph-2-E05与靶蛋白结合。

如图8c所示，包被Cyno-SEZ6-His(2μg/mL)，检测候选抗体与Cyno-SEZ6-His的结合情况。根据检测结果可知，仅Ph-3-A7、Ph-1-A03、Ph-2-E05、Ph-2-E10候选抗体均与靶蛋白结合。

12.FACS检测重组抗体与靶蛋白的结合

1)从液氮中复苏293T、293T-SEZ6细胞株，调整细胞状态至对数生长期；

2)将细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为3×10⁵个细胞；

3)将候选抗体(起始浓度为30μg/mL，3倍梯度稀释11个点，100μL/孔)或100μL转染上清与靶细胞孵育，充分混匀后，室温孵育1小时；

4)800×g室温离心3分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次；

5)加入二抗PE anti human IgG(1:500稀释)，充分混匀后，室温避光孵育30分钟；

6)800×g室温离心3分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；

7)使用500μL PBS重悬细胞，进行流式分析。

结果如图9所示，图9中标红的候选抗体(252-1-B03、Ph-2-B3、Ph-3-A7、Ph-3-H7、Ph-1-A03、Ph-2-C02、Ph-2-C03、Ph-2-E05、Ph-2-E10)与过表达细胞株293T-SEZ6特异性结合，安排以上抗体进行FACS EC₅₀检测。

候选抗体在37℃条件下与过表达细胞的FACS EC₅₀检测结果如图10a、图10b、和表8所示：Ph-2-B3、Ph-3-H7、Ph-2-C03、Ph-2-E05、Ph-2-E10这5个候选抗体与细胞结合较强；其中，Ph-2-C03、Ph-2-E05与阳性抗体结合相当，Ph-2-E10抗体结合强于阳性抗体。

表8

注：252-1-B03检测结果为不结合，未在表中示出。

候选抗体在4℃条件下与过表达细胞的FACS EC₅₀检测结果如图11a、图11b、和表9所示：

表9

根据检测结果可知，Ph-2-B3、Ph-3-H7、Ph-2-C03、Ph-2-E05、Ph-2-E10这5个候选抗体与细胞结合较强；其中，Ph-2-C03、Ph-2-E05与阳性抗体结合相当，Ph-2-E10抗体结合强于阳性抗体。

13.候选抗体内吞检测

1)准备靶细胞293T-human SEZ6，每孔细胞为5×10⁵个细胞；

2)加入10μg/mL，100μL/孔单域抗体，4℃孵育30min；

3)4℃，800×g离心3min，去掉含有抗体的上清，使用预冷的2％FBS洗涤细胞3次；

4)将细胞平均分为2组，分别于4℃和37℃孵育240min，孵育结束后，立刻加入冰浴的2％ FBS终止内吞实验，4℃，800×g离心3min，使用预冷的2％ FBS洗涤细胞3次；

5)立刻加入MonoRab^TMRabbit Anti-Camelid VHH Cocktail[iFluor 647](候选抗体)及PE-Goat anti-Human IgG Fc(invitrogen,Cat#:12-4998-82)(阳性抗体)二抗(1:1000稀释)，4℃孵育30min；

6)4℃，800×g离心3min，去掉含有抗体的上清，使用预冷的2％FBS洗涤细胞3次；

7)使用200μL预冷的2％ FBS重悬细胞，准备相应数目的1.5mL EP管，每个EP管中加入300μL预冷的2％ FBS，将对应的样品分别转移至EP管中，放置于冰上，进行流式分析。

8)细胞表面结合抗体内化水平计算：

tx时间点MFI％＝37℃孵育样本MFI/4℃孵育对照样本MFI

tx时间点的内化百分比＝100％-tx时间点MFI％

结果如图12和表10所示：

表10

根据实验数据可知，除Ph-1-F11、252-1-B03与细胞株基本不结合外；其余抗体均具有内吞效果，且Ph-3-A7、Ph-3-H7、Ph-1-A03、Ph-2-C02、Ph-2-C03、Ph-2-E05、Ph-2-E10抗体内吞效果好，其中Ph-2-E10抗体内吞效果与阳性抗体相当。

14.候选抗体亲和力检测

1)使用ForteBio OCTET R2仪器测定抗体亲和力，使用SA传感器固化Biotin-Human TSLP(R127A,R130A)-C-His，固化浓度为5μg/mL，固化时间为60s。

2)缓冲液为PBST(PBS+0.02％tween20)，候选抗体稀释至5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0nM。

3)亲和力检测：平衡60s，结合180s，解离180s，检测温度25℃。

4)使用ForteBio OCTET R2系统进行动力学表征分析。

检测结果如图13所示，可以看出，Ph-2-C03、Ph-3-A7、Ph-3-H7、Ph-2-B3、Ph-2-E05、Ph-2-E10均具有良好的亲和力。

15.候选抗体表位鉴定

包被hSEZ6(阳性抗体)(1μg/mL)；一抗：SEZ6候选抗体(终浓度10μg/mL，3倍梯度稀释7个点)，50μL/孔，与Biotin-SEZ6-His抗原(终浓度1μg/mL)，50μL/孔，37℃共孵育30min后一起加入包被的板子中，37℃孵育30min。二抗：HRP-Streptavidin(1:10000稀释)，检测候选抗体与阳性抗体是否为相同表位。

结果如表11和12所示。

表11

表12

由上述结果可知，筛选得到的候选抗体与阳性抗体均为不同表位。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims

1.一种抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段，其特征在于，其包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；其中，所述抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段具有以下任意一种的CDR序列特征：

(1)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：13所示的序列；

(2)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14所示的序列；

(3)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15所示的序列；

(4)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16所示的序列；

(5)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17所示的序列。

2.根据权利要求1所述的抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段，其特征在于，还包含与三个互补决定区交替设置的四个框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中，

FR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：19～SEQ ID NO：24之一所示的序列；

FR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：25～SEQ ID NO：30之一所示的序列；

FR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：31～SEQ ID NO：36之一所示的序列；

FR4的氨基酸序列为SEQ ID NO：37～SEQ ID NO：39之一所示的序列。

3.根据权利要求1所述的抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述纳米抗体或抗原结合片段包含以下序列中的一种或多种：

(i)如SEQ ID NO：40～SEQ ID NO：44之一所示的氨基酸序列；

(ii)与SEQ ID NO：40～SEQ ID NO：44之一所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列且功能相同；

(iii)在SEQ ID NO：40～SEQ ID NO：44之一所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留如SEQ ID NO：40～SEQ ID NO：44之一所示的氨基酸序列的功能。

4.一种核酸分子，其特征在于，其编码如权利要求1-3中任意一项所述的抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段。

5.一种载体，其特征在于，其包含权利要求4所述的核酸分子。

6.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求5所述的载体或权利要求4所述的核酸分子；所述宿主细胞优选为细菌细胞、真菌细胞或动物细胞。

7.一种产生抗SEZ6纳米抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养如权利要求6所述的宿主细胞，从而获得含所述抗SEZ6纳米抗体的培养物；

(b)从所述培养物中分离和/或回收所述抗SEZ6纳米抗体；以及任选的

(c)纯化和/或修饰步骤(b)所获得的抗SEZ6纳米抗体。

8.一种抗体偶联药物，其特征在于，包括权利要求1-3中任意一项所述的抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段和效应物；优选的，所述效应物包括核素、细胞毒性剂、荧光基团、催化底物显色的酶、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种。

9.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1-3中任意一项所述的抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段，或权利要求8所述的抗体偶联药物。

10.权利要求1-3中任意一项所述的抗SEZ6纳米抗体或抗原结合片段的下述用途：

(ii)制备用于治疗SEZ6相关疾病的药物中的应用；所述SEZ6相关疾病优选为癌症；所述癌症优选为神经内分泌肿瘤，更优选为小细胞肺癌。