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MX2014003068A - Metodos y composiciones para el control de malezas. - Google Patents

Metodos y composiciones para el control de malezas.

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MX2014003068A
MX2014003068A MX2014003068A MX2014003068A MX2014003068A MX 2014003068 A MX2014003068 A MX 2014003068A MX 2014003068 A MX2014003068 A MX 2014003068A MX 2014003068 A MX2014003068 A MX 2014003068A MX 2014003068 A MX2014003068 A MX 2014003068A
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plant
als
composition
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MX2014003068A
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Nengbing Tao
Dafu Wang
Ronak Hasmukh Shah
Zhaolong Li
Daniel Ader
John J Finnessy
Jennifer Chou Taylor
Lisa Marie Weaver
Christina Marie Taylor
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Monsanto Technology Llc
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Publication date
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Abstract

La presente invención proporciona nuevas composiciones para usar para mejorar el control de malezas; específicamente, la presente invención proporciona métodos y composiciones que modulan acetolactato sintasa en especies de malezas; la presente invención también proporciona combinaciones de composiciones y métodos que mejoran el control de malezas.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA EL CONTROL DE MALEZAS Esta solicitud reclama el beneficio de conformidad con 35 USC § 119(e) de la Solicitud Provisional de Estados Unidos No. de serie 61/534,061 presentada el 13/09/2011 , que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. El listado de secuencias que está contenido en el archivo con nombre "40_21(58635)B seq listing.txt", que tiene 1 ,997,877 bytes (medido en el sistema operativo MS-Windows) y creado el 9 de septiembre del 2012, se presentó con la misma y se incorporó a la presente por referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere en general al campo de control de malezas. Más específicamente, la invención se refiere a genes de acetolactato sintasa en plantas herbáceas y composiciones que contienen moléculas de polinucleótido para modular su expresión. La invención también proporciona métodos y composiciones de utilidad para controlar malezas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las malezas son plantas que compiten con plantas cultivadas en un ambiente agronómico y cuestan a los agricultores billones de dólares anuales en pérdidas de cultivos y gasto de esfuerzos para mantener a las malezas bajo control. Las malezas también sirven como huéspedes para enfermedades en cultivos y plagas de insectos. Las pérdidas causadas por las malezas en ambientes de producción agrícola incluyen reducciones en el rendimiento de los cultivos, menor calidad de los cultivos, mayores costos de irrigación, mayores costos de recolección, menor valor de la tierra, lesiones al ganado y daños a los cultivos provenientes de insectos y enfermedades albergadas por las malezas. Los principales medios por los cuales las malezas causan estos efectos son: 1) competencia con plantas de cultivo para agua, nutrientes, luz solar y otros factores esenciales para el crecimiento y el desarrollo, 2) producción de productos químicos tóxicos o irritantes que causan problemas de salud en humanos o animales, 3) producción de inmensas cantidades de semillas o partes reproductivas vegetativas o ambas que contaminan los productos agrícolas y perpetúan las especies en tierras agrícolas y 4) producción en tierras agrícolas y no agrícolas de vastas cantidades de vegetación que deben ser eliminadas. Las malezas tolerantes a herbicidas son un problema con casi todos los herbicidas en uso, hay una necesidad de controlar efectivamente estas malezas. Hay más de 365 biotipos de malezas actualmente identificadas como resistentes a uno o varios herbicidas por el Herbicide Resistance Action Committee (HRAC), el North American Herbicide Resistance Action Committee (NAHRAC) y el Weed Science Society of America (WSSA).
La enzima ALS (acetolactato sintasa, también conocida como acetohidroxiácido sintasa, AHAS) cataliza la primera etapa en la síntesis de los aminoácidos de cadena ramificada (valina, leucina e isoleucina). ALS incluye un miembro de la subunidad grande y un miembro de la subunidad pequeña que funcionan para proporcionar una producción regulada de los aminoácidos de cadena ramificada. Esta enzima es el blanco de muchos herbicidas inhibidores de ALS que incluyen miembros de las familias químicas de sulfonilureas, imidazolinonas, triazolopirimidinas, pirimidinil(tio)benzoatos y sulfonilaminocarbonil-triazolinonas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención comprende un método de control de plantas herbáceas que comprende una aplicación externa a una planta herbácea de una composición que comprende un polinucleótido y un agente de transferencia, en donde el polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia génica de ALS o al transcripto de ARN de dicha secuencia génica de ALS, en donde dicha secuencia génica de ALS está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-45 y 1692-1788 o su fragmento de polinucleótido, en donde el crecimiento o desarrollo de una planta herbácea o capacidad reproductiva se reduce o la planta herbácea es más sensible a un herbicida inhibidor de ALS respecto a una planta herbácea no tratada con dicha composición. De esta manera, las plantas que se han vuelto más resistentes a la aplicación de glifosato que contienen herbicidas se volvieron más susceptibles a los efectos herbicidas de un herbicida que contiene glifosato, potenciando así el efecto del herbicida. El fragmento de polinucleótido tiene una longitud de al menos 18 nucleótidos contiguos, al menos 19 nucleótidos contiguos, al menos 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y al menos el 85% idéntico a una secuencia génica de ALS seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-45 y 1692-1788 y el agente de transferencia es una composición o compuesto de organosilicio. El fragmento de polinucleótido también puede ser ssADN o ssARN, dsARN o dsADN o híbridos de dsADN/ARN. La composición puede incluir más de un fragmento de polinucleótido y la composición puede incluir un herbicida inhibidor de ALS y/u otros herbicidas que mejoran la actividad de control de malezas de la composición.
En otro aspecto, se proporcionan moléculas de polinucleótido y métodos para modular la expresión génica de ALS en especies de plantas herbáceas. El método reduces expresión de un gen de ALS en una planta herbácea que comprende una aplicación externa a una planta herbácea de una composición que comprende un polinucleótido y un agente de transferencia, en donde el polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia génica de ALS o su fragmento o al transcripto de ARN de la secuencia génica de ALS o su fragmento, en donde la secuencia génica de ALS está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-45 y 1692-1788 o su fragmento de polinucleótido. El fragmento de polinucleótido tiene una longitud de al menos 18 nucleótidos contiguos, al menos 19 nucleótidos contiguos, al menos 20 nucleótidos contiguos al menos 21 nucleótidos contiguos y al menos el 85% idéntico a una secuencia génica de ALS seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-45 y 1692-1788 y el agente de transferencia es un compuesto de organosilicio. El fragmento de polinucleótido también puede ser ssADN o ssARN, dsARN o dsADN o híbridos de dsADN/ARN.
En otro aspecto de la invención, la molécula de polinucleótido que contiene la composición de la invención se puede combinar con otros compuestos herbicidas para proporcionar un control adicional de plantas no deseadas en un campo de plantas cultivadas.
En otro aspecto, la composición de moléculas de polinucleótido se puede combinar con uno o varios productos químicos agrícolas adicionales, tales como, insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, quimioesterilizantes, semioquímicos, repelentes, atrayentes, feromonas, estimulantes de la alimentación, biopesticidas, pesticidas microbianos u otros compuestos biológicamente activos para formar un pesticida multicomponente para dar un espectro incluso más amplio de protección agrícola.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las siguientes figuras forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen además para demostrar determinados aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor por referencia a uno o varios de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de modalidades específicas presentadas en la presente. La invención se puede comprender más completamente a partir de la siguiente descripción de las figuras: Figura 1. Tratamiento de plantas de Amaranthus palmer con polinucleótidos disparadores ssADN y herbicida inhibidor de ALS (Staple®).
Figura 2. Tratamiento de plantas Amaranthus Palmer con la molécula disparadora ALS pro S1 , que demuestra actividad mejorada de los herbicidas Staple® y Classic®.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un método y composiciones que contienen un polinucleótido que proporcionan la regulación de una subunidad grande de ALS (acetolactato sintasa) y expresión génica de subunidad pequeña de ALS y mejor control de especies de plantas herbáceas y, de modo importante, biotipos de malezas resistentes al inhibidor de ALS. Los aspectos del método se pueden aplicar para controlar diversas plantas herbáceas en ambientes agronómicos y otros ambientes cultivados.
Las siguientes definiciones y métodos se proporcionan para definir mejor la presente invención y guiar a los expertos en el arte en la práctica de la presente invención. A menos que se note otra cosa, los términos se han de entender de acuerdo con el uso convencional por los expertos en el arte. Cuando un término se proporciona en singular, los inventores también contemplan aspectos de la invención descritos por el plural de ese término.
Por polinucleótidos "no transcribibles" se entiende que los polinucleótidos no comprenden una unidad de transcripción completa de polimerasa II.
Tal como se usa en la presente, "solución" se refiere a mezclas homogéneas y mezclas no homogéneas tales como suspensiones, coloides, micelas y emulsiones.
Las plantas herbáceas son plantas que compiten con plantas cultivadas, aquellas de particular importancia incluyen, pero sin limitación, importantes malezas invasivas y nocivas en la producción de cultivos, tales como, Amaranthus species -A. albus, A. blitoides, A. hybridus, A. palmeri, A. powellii, A. retroflexus, A. spinosus, A. tuberculatus y A. viridis; especies de Ambrosia - A. trífida, A. artemisifolia; especies de Lolium -L. multiflorum, L. rigidium, L perenne; especies de Digitaria -D. insularis; Euphorbia species -E. heterophylla; especies de Kochia - K. scoparia; especies de Sorghum -S. halepense; especies de Conyza -C. bonariensis, C. canadensis, C. sumatrensis; especies de Chloris -C. trúncate; especies de Echinochola - E. colona, E. crus-galli; especies de Eleusine -E. indica; especies de Poa -P. annua; especies de Plantago -P. lanceolata; especies de Avena - A. fatua; especies de Chenopodium - C. álbum; especies de Setaria - S. viridis, Abutilón theophrasti, especies de Ipomoea, especies de Sesbania, especies de Cassia, especies de Sida, especies de Brachiaria y especies de Solanum.
Las especies adicionales de plantas herbáceas halladas en las áreas cultivadas incluyen Alopecurus myosuroides, Avena sterilis, Avena sterilis ludoviciana, Brachiaria plantaginea, Bromus diandrus, Bromus rigidus, Cynosurus echinatus, Digitaria ciliaris, Digitaria ischaemum, Digitaria sanguinalis, Echinochloa oryzicola, Echinochloa phyllopogon, Eriochloa punctata, Hordeum glaucum, Hordeum leporinum, Ischaemum rugosum, Leptochloa chinensis, Lolium persicum,, Phalaris minor, Phalaris paradoxa, Rottboellia exalta, Setaria faberi, Setaria viridis var, robusta-alba schreiber, Setaria viridis var, robusta -purpurea, Snowdenia polystachea, Sorghum sudanese, Alisma plantago-aquatica, Amaranthus lividus, Amaranthus quitensis, Ammania auriculata, Ammania coccínea, Anthemis cotula, Apera spica-venti, Bacopa rotundifolia, Bidens pilosa, Bidens subalternans, Brassica tournefortii, Bromus tectorum, Camelina microcarpa, Chrysanthemum coronarium, Cuscuta campestris, Cyperus difformis, Damasonium minus, Descurainia sophia, Diplotaxis tenuifolia, Echium plantagineum, Elatine triandra var, pedicellata, Euphorbia heterophylla, Fallopia convolvulus, Fimbristylis miliacea, Galeopsis tetrahit, Galium spurium, Helianthus annuus, Iva xanthifolia, Ixophorus unisetus, Ipomoea indica, Ipomoea purpurea, Ipomoea sepiaria, Ipomoea aquatic, Ipomoea triloba, Lactuca serriola, Limnocharis flava, Limnophila erecta, Limnophila sessiliflora, Lindernia dubia, Lindernia dubia var, major, Lindernia micrantha, Lindernia procumbens, Mesembryanthemum crystallinum, Monochoria korsakowii, Monochoria vaginalis, Neslia paniculata, Papaver rhoeas, Parthenium hysterophorus, Pentzia suffruticosa, Phalaris minor, Raphanus raphanistrum, Raphanus sativus, Rapistrum rugosum, Roíala indica var, uliginosa, Sagittaria guyanensis, Sagittaria montevidensis, Sagittaria pygmaea, Salsola ibérica, Scirpus juncoides var, ohwianus, Scirpus mucronatus, Setaria lutescens, Sida spinosa, Sinapis arvensis, Sisymbrium oriéntale, Sisymbrium thellungii, Solanum ptycanthum, Sonchus asper, Sonchus oleraceus, Sorghum bicolor, Stellaria media, Thlaspi arvense, Xanthium strumarium, Arctotheca caléndula, Conyza sumatrensis, Crassocephalum crepidiodes, Cuphea carthagenenis, Epilobium adenocaulon, Erigeron philadelphicus, Landoltia punctata, Lepidium virginicum, Monochoria korsakowii, Solanum americanum, Solanum nigrum, Vulpia bromoides, Youngia japónica, Hydrilla verticillata, Carduus nutans, Carduus pycnocephalus, Centaurea solstitialis, Cirsium arvense, Commelina diffusa, Convolvulus arvensis, Daucus carota, Digitaria ischaemum, Echinochloa crus-pavonis, Fimbristylis miliacea, Galeopsis tetrahit, Galium spurium, Limnophila erecta, Matricaria perfórate, Papaver rhoeas, Ranunculus acris, Soliva sessilis, Sphenoclea zeylanica, Stellaria media, Nassella trichotoma, Stipa neesiana, Agrostis stolonifera, Polygonum aviculare, Alopecurus japonicus, Beckmannia syzigachne, Bromus tectorum, Chloris ínflate, Echinochloa erecta, Portulaca olerácea y Senecio vulgaris. Se cree que todas las plantas contienen un gen de acetolactato sintasa en su genoma, cuya secuencia se puede aislar y polinucleótidos hechos de acuerdo con los métodos de la presente invención que son de utilidad para la regulación, supresión o retraso de la expresión del gen blanco de ALS (ya sea la subunidad grande o la subunidad pequeña o ambas) en las plantas y el crecimiento o el desarrollo de las plantas tratadas.
Una planta cultivada también puede ser una planta herbácea cuando ocurre en ambientes no deseados. Por ejemplo, las plantas de maíz que crecen en un campo de soja. Los cultivos transgénicos con una o varias tolerancias a herbicidas necesitarán métodos de manejo especializados para controlar malezas y plantas de cultivo voluntarias. La presente invención permite controlar el transgén para tolerancia a herbicidas para permitir que las plantas tratadas se vuelvan sensibles a los herbicidas. Por ejemplo, las secuencias de ADN transgénico de ALS en eventos transgénicos que incluyen DP-356043-5.
Un "disparador" o "polinucleótido disparador" es una molécula de polinucleótido que es homologa o complementaria a un gen de polinucleótido blanco. Las moléculas de polinucleótido disparadoras modulan la expresión del gen blanco cuando se aplican tópicamente a la superficie de una planta con un agente de transferencia, en donde una planta tratada con dicha composición tiene su crecimiento o desarrollo o capacidad reproductiva regulada, suprimida o retrasada o dicha planta es más sensible a un herbicida inhibidor de ALS como resultado de dicho polinucleótido que contiene la composición respecto a una planta no tratada con una composición que contiene la molécula disparadora. Los polinucleótidos disparadores revelados en la presente se describen en general en relación con la secuencia génica blanco y se pueden usar en orientación con sentido (homólogo) o antisentido (complementario) como moléculas monocatenarias o comprenden ambas cadenas como moléculas bicatenarias o variantes de nucleótidos y sus nucleótidos modificados según las diversas regiones de un gen blanco.
Se contempla que la composición de la presente invención contenga múltiples polinucleótidos y herbicidas que incluyen, pero sin limitación, polinucleótidos disparadores de gen ALS y un herbicida inhibidor de ALS y uno o varios genes de herbicida adicional de polinucleótidos disparadores blanco y los herbicidas relacionados y uno o varios polinucleótidos disparadores génicos esenciales adicionales. Los genes esenciales son genes en una planta que proporcionan enzimas clave u otras proteínas, por ejemplo, una enzima biosintética, enzima metabolizante, receptor, proteína de transducción de señales, producto génico estructural, factor de transcripción o proteína de transporte; o ARN de regulación, tales como, microAARN, que son esenciales para el crecimiento o la supervivencia del organismo o célula o están implicados en el crecimiento normal y desarrollo de la planta (Meinke, et al., Trends Plant Sci. 2008; sep. 13(9):483-91). La supresión de un gen esencial mejora el efecto de un herbicida que afecta la función de un producto génico diferente del gen esencial suprimido. Las composiciones de la presente invención pueden incluir diversos polinucleótidos disparadores que modulan la expresión de un gen esencial distinto de gen de ALS.
Los herbicidas, para los cuales se demostraron los transgenes para tolerancia de plantas y el método de la presente invención que se puede aplicar, incluyen, pero sin limitación: herbicidas de tipo auxina, glifosato, glufosinato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinilo, delapon, dicamba, ciclohexandiona, inhibidores de protoporfirinógeno oxidasa, herbicidas inhibidores de 4-hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa. Por ejemplo, transgenes y sus moléculas de polinucleótido que codifican proteínas incluidas en la tolerancia a herbicidas son conocidos en el arte e incluyen, pero sin limitación, una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), por ejemplo, como se describe más exhaustivamente en las patentes U. S. Nros. 7.807.791 (SEQ ID NO:5); 6.248.876 B1 , 5.627.061 , 5.804.425, 5.633.435, 5.145.783, 4.971.908, 5.312.910, 5.188.642, 4.940.835, 5.866.775, 6.225.1 14 B1 , 6.130.366, 5.310.667, 4.535.060, 4.769.061 , 5.633.448, 5.510.471 , patente U. S. N.° RE36.449; patentes U. S. Nros. RE37.287 E y 5.491.288; tolerancia a sulfonilurea y/o imidazolinona, por ejemplo, tal como se describe más exhaustivamente en las patentes U. S. Nros. 5.605.011 , 5.013.659, 5.141.870, 5.767.361 , 5.731.180, 5.304.732, 4.761.373, 5.339.107, 5.928.937 y 5.378.824, y la publicación internacional WO 96/33270; tolerancia a herbicidas inhibidores de hidroxifenilpiruvatodioxigenasas en plantas se describen en las patentes U. S. Nros. 6.245.968 B1 , 6.268.549 y 6.069.115; y US 7.312.379 SEQ ID NO:3; US 7.935.869, US 7.304.209, SEQ ID NO:1 , 3, 5 y 15; polinucleótidos de ariloxialcanoato dioxigenasa, que confieren tolerancia a 2,4-D y otros herbicidas de fenoxiauxina, así como herbicidas de ariloxifenoxipropionato tal como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 2005/107437; US 7.838.733 SEQ ID NO:5;) y polinucleótidos tolerantes a dicamba tal como se describe, por ejemplo, en Hermán et al. (2005) J. Biol. Chem. 280: 24759-24767. Otros ejemplos de rasgos de tolerancia a herbicidas incluyen aquellos conferidos a polinucleótidos que codifican una fosfinotricina acetiltransferasa exógena, tal como se describe en las patentes U. S. Nros. 5.969.213, 5.489.520, 5.550.318, 5.874.265, 5.919.675, 5.561.236, 5.648.477, 5.646.024, 6.177.616 y 5.879.903. Las plantas que contienen una fosfinotricina acetiltransferasa exógena pueden exhibir mejor tolerancia a herbicidas de glufosinato, que inhiben la enzima glutamina sintasa. Adicionalmente, los polinucleótidos de tolerancia a herbicidas incluyen aquellos conferidos por polinucleótidos que confieren actividad alterada de protoporfirinógeno oxidasa (protox), tal como se describe en las patentes U. S. Nros. 6.288.306 B1 , 6.282.837 B1 y 5.767.373 y WO 01/12825. Las plantas que contienen estos polinucleótidos pueden exhibir mejor tolerancia a cualquiera de una variedad de herbicidas que se dirigen a la enzima protox (también mencionada como inhibidores de protox). Los polinucleótidos que codifican una glifosato oxidorreductasa y una glifosato-N-acetiltransferasa (GOX descrita en la patente U. S. 5.463.175 y GAT descrito en la publicación de patente U. S. 20030083480, dicamba monooxigenasa publicación de patente U.S. 20030135879, todos los cuales se incorporan en la presente por referencia); una molécula de polinucleótido que codifica la bromoxinilo nitrilasa (Bxn descrito en la patente U. S. N.° 4.810.648 para tolerancia a Bromoxinilo, que se incorpora en la presente por referencia); una molécula de polinucleótido que codifica fitoeno desaturasa (crtl) describía en Misawa et al, (1993) Plant J. 4:833-840 y Misawa et al, (1994) Plant J. 6:481-489 para tolerancia a norflurazona; una molécula de polinucleótido que codifica acetohidroxiácido sintasa (AHAS, aka ALS) descrita en Sathasiivan et al. (1990) Nucí. Acids Res. 18:2188-2193 para la tolerancia a sulfonilherbicidas de urea; y el gen bar descrito en DeBlock, et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2519 para la tolerancia a glufosinato y bialafos. Las regiones codificantes transgénicas y elementos de regulación de los genes de tolerancia a herbicidas son blancos en los que se pueden incluir polinucleótidos disparadores y herbicidas en la composición de la presente invención.
La composición de la presente invención incluye un componente que es un herbicida inhibidor de ALS que incluye, pero sin limitación, amidosulfurona, azimsulfurona, bensulfurona-metilo, clorimurona-etilo, clorsulfurona, cinosulfurona, ciclosulfamurona, etametsulfurona-metilo, etoxisulfurona, flazasulfurona, flupirsulfurona-metilo-Na, foramsulfurona, halosulfurona-metilo, imazosulfurona, yodosulfurona, metsulfurona-metilo, nicosulfurona, oxasulfurona, primisulfurona-metilo, prosulfurona, pirazosulfurona-etilo, rimsulfurona, sulfometurona-metilo, sulfosulfurona, tifensulfurona-metilo, triasulfurona, tribenurona-metilo, trifloxisulfurona, triflusulfurona-metilo, tritosulfurona, imazapic, imazametabenz-metilo, imazamox, ¡mazapir, imazaquina, imazetapir, cloransulam-metilo, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, bispiribac-Na, piribenzoxim, piriftalida, piritiobac-Na, piriminobac-metilo, flucarbazona-Na y procarbazona-Na.
Numerosos herbicidas (mencionados en la presente como coherbicidas) están a disposición, que se pueden añadir a la composición, por ejemplo, miembros de las familias de herbicidas que incluyen, pero sin limitación, herbicidas de amida, herbicidas de ácidos aromáticos, herbicidas de arsénico, herbicidas de benzotiazol, herbicidas de benzoilciclohexandiona, herbicidas de benzofuranilalquilsulfonato, herbicidas de carbamato, herbicidas de ciclohexenoxima, herbicidas de ciclopropilisoxazol, herbicidas de dicarboximida, herbicidas de dinitroanilina, herbicidas de dinitrofenol, herbicidas de éter difenílico, herbicidas de ditiocarbamato, herbicidas alifáticos halogenados, herbicidas de imidazolinona, herbicidas inorgánicos, herbicidas de nitrilo, herbicidas de organofósforo, herbicidas de oxadiazolona, herbicidas de oxazol, herbicidas de fenoxi, herbicidas de fenilendiamina, herbicidas de pirazol, herbicidas de piridazina, herbicidas de piridazinona, herbicidas de piridina, herbicidas de pirimidindiamina, herbicidas de pirimidiniloxibencilamina, herbicidas de amonio cuaternario, herbicidas de tiocarbamato, herbicidas de tiocarbonato, herbicidas de tiourea, herbicidas de triazina, herbicidas de triazinona, herbicidas de triazol, herbicidas de triazolona, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de uracilo y herbicidas de urea. En particular, las tasas de uso de los herbicidas añadidos se pueden reducir en composiciones que comprenden los polinucleótidos. El uso de reducciones en las tasas de los herbicidas añadidos adicionales puede ser del 10-25%, 26-50%, 51-75% o que mejoran la actividad de los polinucleótidos y la composición herbicida y está contemplado. Los herbicidas representativos de las familias incluyen, pero sin limitación, acetoclor, acifluorfeno, acifluorfeno-sodio, aclonifeno, acroleína, alaclor, aloxidim, alcohol alílico, ametrina, amicarbazona, amidosulfurona, aminopiralida, amitrol, sulfamato de amonio, anilofos, asulam, atraton, atrazina, azimsulfurona, BCPC, beflubutamida, benazolina, benfluralina, benfuresato, bensulfurona, bensulfurona-metilo, bensulide, bentazona, benzfendizona, benzobiciclona, benzofenap, bifenox, bilanafos, bispiribac, bispiribac-sodio, bórax, bromacilo, bromobutide, bromoxinilo, butaclor, butafenacilo, butamifos, butralina, butroxidim, butilato, ácido cacodílico, clorato de calcio, cafenstrol, carbetamida, carfentrazona, carfentrazona-etilo, CDEA, CEPC, clorflurenol, clorflurenol-metilo, cloridazona, clorimurona, clorimurona-etilo, ácido cloroacético, clorotolurona, clorprofam, clorsulfurona, clortal, clortal-dimetilo, cinidona-etilo, cinmetilina, cinosulfurona, cisanilida, cletodim, clodinafop, clodinafop-propargilo, clomazona, clomeprop, clopiralida, cloransulam, cloransulam-metilo, CMA, 4-CPB, CPMF, 4-CPP, CPPC, cresol, cumilurona, cianamida, cianazina, cicloato, ciclosulfamurona, cicloxidim, cihalofop, cihalofop-butilo, 2,4-D, 3,4-DA, daimurona, dalapona, dazomet, 2,4-DB, 3,4-DB, 2,4-DEB, desmedifam, dicamba, diclobenilo, orto-diclorobenceno, para-diclorobenceno, diclorprop, diclorprop-P, diclofop, diclofop-metilo, diclosulam, difenzoquat, metilsulfato de difenzoquat, diflufenicano, diflufenzopir, dimefurona, dimepiperato, dimetaclor, dimetametrina, dimetenamida, dimetenamida-P, dimetipina, ácido dimetilarsínico, dinitramina, dinoterb, difenamida, diquat, dibromuro de diquat, ditiopir, diurona, DNOC, 3,4-DP, DSMA, EBEP, endotal, EPTC, esprocarb, etalfluralina, etametsulfurona, etametsulfurona-metilo, etofumesato, etoxifeno, etoxisulfurona, etobenzanida, fenoxaprop-P, fenoxaprop-P-etilo, fentrazamida, sulfato ferroso, flamprop-M, flazasulfurona, florasulam, fluazifop, fluazifop-butilo, fluazifop-P, fluazifop-P-butilo, flucarbazona, flucarbazona-sodio, flucetosulfurona, flucloralina, flufenacet, flufenpir, flufenpir-etilo, flumetsulam, flumiclorac, flumiclorac-pentilo, flumioxazina, fluometurona, fluoroglicofeno, fluoroglicofeno-etilo, flupropanato, flupirsulfurona, flupirsulfurona-metilo-sodio, flurenol, fluridona, fluorocloridona, fluoroxipir, flurtamona, flutiacet, flutiacet-metilo, fomesafeno, foramsulfurona, fosamina, glufosinato, glufosinato-amonio, glifosato, halosulfurona, halosulfurona-metilo, haloxifop, haloxifop-P, HC-252, hexazinona, imazametabenz, imazametabenz-metilo, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquina, imazetapir, imazosulfurona, indanofano, yodometano, yodosulfurona, yodosulfurona-metil-sodio, ioxinilo, isoproturona, isourona, isoxabeno, isoxaclortol, isoxaflutol, karbutilato, lactofeno, leñadlo, linurona, MAA, MAMA, MCPA, MCPA-thioetilo, MCPB, mecoprop, mecoprop-P, mefenacet, mefluidide, mesosulfurona, mesosulfurona-metilo, mesotriona, metam, metamifop, metamitrona, metazaclor, methabenztiazurona, ácido metilarsónico, metildimrona, isotiocianato de metilo, metobenzurona, metolaclor, S-metolaclor, metosulam, metoxurona, metribuzina, metsulfurona, metsulfurona-metilo, MK-66, molinato, monolinurona, MSMA, naproanilida, napropamida, naptalam, neburona, nicosulfurona, ácido nonanoico, norflurazona, ácido oleico (ácidos grasos), orbencarb, ortosulfamurona, orizalina, oxadiargilo, oxadiazona, oxasulfurona, oxaziclomefona, oxifluorfeno, paraquat, dicloruro de paraquat, pebulato, pendimetalina, penoxsulam, pentaclorofenol, pentanoclor, pentoxazona, petoxamida, aceites de petróleo, fenmedifam, fenmedifam-etilo, picloram, picolinafeno, pinoxadeno, piperofos, arsenito de potasio, azida de potasio, pretilaclor, primisulfurona, primisulfurona-metilo, prodiamina, profluazol, profoxidim, prometona, prometrina, propaclor, propanilo, propaquizafop, propazina, profam, propisoclor, propoxicarbazona, propoxicarbazona-sodio, propizamida, prosulfocarb, prosulfurona, piraclonilo, piraflufeno, piraflufeno-etilo, pirazolinato, pirazosulfurona, pirazosulfurona-etilo, pirazoxifeno, piribenzoxim, piributicarb, piridafol, piridato, piriftalida, piriminobac, piriminobac-metilo, pirimisulfano, piritiobac, piritiobac-sodio, quinclorac, quinmerac, quinoclamina, quizalofop, quizalofop-P, rimsulfurona, setoxidim, sidurona, simazina, simetrina, SMA, arsenito de sodio, azida de sodio, clorato de sodio, sulcotriona, sulfentrazona, sulfometurona, sulfometurona-metilo, sulfosato, sulfosulfurona, ácido sulfúrico, aceites de alquitrán, 2,3,6-TBA, TCA, TCA-sodio, tebutiurona, tepraloxidim, terbacilo, terbumetona, terbutilazina, terbutrina, tenilclor, tiazopir, tifensulfurona, tifensulfurona-metilo, tiobencarb, tiocarbazilo, topramezona, tralkoxidim, tri-alato, triasulfurona, triaziflam, tribenuron, tribenurona-metilo, tricamba, triclopir, trietazina, trifloxisulfurona, trifloxisulfurona-sodio, trifluralina, triflusulfurona, triflusulfurona-metilo, trihidroxitriazina, tritosulfurona, éster etílico del ácido [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(-metil-6-trifluorometil-2,4-d¡oxo-,2,3,4-tetrah¡dropirim^ piridiloxi]acético (CAS RN 353292-3-6), ácido 4-[(4,5-dihidro-3-metox -metil-5-oxo)-H-,2,4-triazol— ilcarbonil-sulfamoil]-5-metiltiofen-3-carboxílico (BAY636), BAY747 (CAS RN 33504-84-2), topramezona (CAS RN 2063-68-8), 4-hidroxi-3-[[2-[(2-metoxietoxi)metil]-6-(trifluoro-metil)-3-piridinil]carbonil]-biciclo[3.2.]oct-3-en-2-ona (CAS RN 35200-68-5) y 4-h¡droxi-3-[[2^-(3-metoxipropil)-6-(difluorometil)-3-piridinil]carbonil]-biciclo[3.2.]oct-3-en-2-ona. Adicionalmente, que incluyen compuestos herbicidas de modos de acción inespecífico tal como se describe en los documentos CN 101279950A, CN 101279951A, DE 10000600A1, DE 10116399A1 , DE 102004054666A1 , DE 102005014638A1 , DE 102005014906A1 , DE 102007012168A1 , DE 102010042866A1 , DE 10204951 A1 , DE 10234875A1 , DE 10234876A1, DE 10256353A1, DE 10256354A1 , DE 10256367A1 , EP 1157991A2, EP 1238586A1 , EP 2147919A1 , EP 2160098A2, JP 03968012B2, JP 2001253874A, JP 2002080454A, JP 2002138075A, JP 2002145707A, JP 2002220389A, JP 2003064059A, JP 2003096059A, JP 2004051628A, JP 2004107228A, JP 2005008583A, JP 2005239675A, JP 2005314407A, JP 2006232824A, JP 2006282552A, JP 2007153847A, JP 2007161701A, JP 2007182404A, JP 2008074840A, JP 2008074841A, JP 2008133207A, JP 2008133218A, JP 2008169121 A, JP 2009067739A, JP 2009114128A, JP 2009126792A, JP 2009137851 A, US 20060111241A1 , US 20090036311A1 , US 0A1, US 20090215628A1, US 20100099561A1, US 3A1, US 20110105329A1, US 20110201501A1, WO A2, WO 2001056975A1, WO 2001056979A1, WO A2, WO 2001090080A1, WO 2002002540A1 , WO A1, WO 2002040473A1, WO 2002044173A2, WO A2, WO 2003006422A1, WO 2003013247A1, WO A1, WO 2003020704A1, WO 2003022051 A1, WO A1, WO 2003022843A1, WO 2003029243A2, WO A1, WO 2003037878A1, WO 2003045878A2, WO A2, WO 2003051823A1, WO 2003051824A1, WO A2, WO 2003076409A1, WO 2003087067A1 , WO A1, WO 2003091217A1, WO 2003093269A2, WO A2, WO 2004002947A1, WO 2004002981A2, WO A1, WO 2004029060A1, WO 2004035545A2, WO A1, WO 2004035564A1, WO 2004037787A1 , WO A1, WO 2004067527A1, WO 2004077950A1, WO A1, WO 2005007627A1, WO 2005040152A1, WO A1, WO 2005047281 A1, WO 2005061443A2, WO A1, WO 2005068434A1, WO 2005070889A1 , WO A1, WO 2005095335A1, WO 2006006569A1 , WO A1, WO 2006029828A1, WO 2006029829A1 , WO A1, WO 2006050803A1, WO 2006090792A1 , WO A2, WO 2006125687A1, WO 2006125688A1, WO 2007003294A1, WO 2007026834A1, WO 2007071900A1, WO 2007077201 A1, WO 2007077247A1, WO 2007096576A1, WO 2007119434A1, WO 2007134984A1, WO 2008009908A1, WO 2008029084A1, WO 2008059948A1, WO 2008071918A1, WO 2008074991A1, WO 2008084073A1, WO 2008100426A2, WO 2008102908A1, WO 2008152072A2, WO 2008152073A2, WO 2009000757A1, WO 2009005297A2, WO 2009035150A2, WO 2009063180A1, WO 2009068170A2, WO 2009068171 A2, WO 2009086041A1, WO 2009090401A2, WO 2009090402A2, WO 2009115788A1, WO 2009116558A1, WO 2009152995A1, WO 2009158258A1, wo 2010012649A1, WO 2010012649A1, WO 2010026989A1, wo 2010034153A1, WO 2010049270A1, WO 2010049369A1, wo 2010049405A1, WO 2010049414A1, WO 2010063422A1, wo 2010069802A1, WO 2010078906A2, WO 2010078912A1, wo 2010104217A1, WO 2010108611A1, WO 2010112826A3, wo 2010116122A3, WO 2010119906A1, WO 2010130970A1, wo 2011003776A2, WO 2011035874A1, WO 2011065451A1, todos los cuales se incorporan en la presente por referencia.
Las composiciones de polinucleótido disparador y molécula de oligonucleótido son de utilidad en composiciones, tales como líquidos que comprenden las moléculas de polinucleótido en bajas concentraciones, solas o en combinación con otros componentes, por ejemplo, una o varias moléculas de herbicida, ya sea en la misma solución o en líquidos aplicados por separado que también proporcionan un agente de transferencia. Si bien no hay un límite superior en las concentraciones y dosis de moléculas de polinucleótido que pueden ser de utilidad en los métodos, concentraciones menos efectivas y dosis se buscar en general por su eficacia. Las concentraciones se pueden ajustar en consideración al volumen de pulverización o tratamiento aplicado a las hojas de plantas u otra parte de una superficie de la planta, tales como pétalos de la flor, tallos, tubérculos, fruta, anteras, polen o semillas. En una modalidad, un tratamiento útil para plantas herbáceas usando moléculas de oligonucleótido 25-mero es de aproximadamente 1 nanomol (nmol) de moléculas de oligonucleótido por planta, por ejemplo, de aproximadamente 0.05 a 1 nmol por planta. Otras modalidades para plantas herbáceas incluyen rangos útiles de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 100 nmol o aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 nmol o aproximadamente 1 nmol a aproximadamente 0 nmol de polinucleótidos por planta. Plantas muy grandes, árboles y viñedos pueden requerir cantidades correspondientemente grandes de polinucleótidos. Cuando se usan moléculas largas de dsARN que se pueden procesar en múltiples oligonucleótidos, se pueden usar menores concentraciones. Para ilustrar las modalidades, el factor 1X, cuando se aplica a moléculas de oligonucleótido se usa arbitrariamente para denotar un tratamiento de 0.8 nmol de molécula de polinucleótido por planta; 10X, 8 nmol de molécula de polinucleótido por planta; y 100X, 80 nmol de molécula de polinucleótido por planta.
Las composiciones de polinucleótido son de utilidad en composiciones, tales como líquidos que comprenden moléculas de polinucleótido, solos o en combinación con otros componentes ya sea en el mismo liquido o en líquidos aplicados por separado que proporcionan un agente de transferencia. Tal como se usa en la presente, un agente de transferencia es un agente que, cuando se combina con un polinucleótido en una composición que se aplica tópicamente a una superficie de planta objeto, permite que el polinucleótido entre en una célula de planta. En determinadas modalidades, un agente de transferencia es un agente que condiciona la superficie del tejido de planta, por ejemplo, hojas, tallos, raíces, flores o frutos, a la permeación por las moléculas de polinucleótido en células de plantas. La transferencia de polinucleótidos en células de plantas se puede facilitar por aplicación anterior o contemporánea de un agente de transferencia de polinucleótido al tejido de la planta. En algunas modalidades, el agente de transferencia se aplica luego de la aplicación de la composición de polinucleótido. El agente de transferencia de polinucleótido permite una vía para los polinucleótidos a través de las barreras de cera de cutícula, estomas y/o pared celular o barreras de membrana en células de plantas. Los agentes de transferencia apropiados para facilitar la transferencia del polinucleótido en una célula de planta incluyen agentes que incrementan la permeablidad del exterior de la planta o que incrementan la permeabilidad de células de planta a oligonucleótidos o polinucleótidos. Estos agentes para facilitar la transferencia de la composición en una célula de planta incluyen un agente químico o un agente físico o sus combinaciones. Los agentes químicos para acondicionamiento o transferencia incluyen (a) tensoactivos, (b) un solvente orgánico o una solución acuosa o mezclas acuosas de solventes orgánicos, (c) agentes oxidantes, (d) ácidos, (e) bases, (f) aceites, (g) enzimas o sus combinaciones. Las modalidades del método pueden incluir opcionalmente una etapa de incubación, una etapa de neutralización (por ejemplo, para neutralizar un ácido, una base o un agente oxidante o para inactivar una enzima), una etapa de enjuague o sus combinaciones. Las modalidades de agentes o tratamientos para acondicionamiento de una planta para la permeación por polinucleótidos incluyen emulsiones, emulsiones inversas, liposomas y otras composiciones de tipo micelar. Las modalidades de agentes o tratamientos para acondicionamiento de una planta a la permeación por polinucleótidos incluyen contraiones u otras moléculas que se conocen para asociarse con moléculas de ácidos nucleicos, por ejemplo, iones amonio inorgánicos, iones alquilamonio, iones litio, poliaminas tales como espermina, espermidina o putrescina y otros cationes. Los solventes orgánicos de utilidad en el acondicionamiento de una planta a la permeación por polinucleótidos incluyen DMSO, DMF, piridina, ?/— pirrolidina, hexametilfosforamida, acetonitrilo, dioxano, polipropilenglicol, otros solventes miscibles con agua o que disolverán fosfonucleótidos en sistemas no acuosos (tal como se usa en reacciones de síntesis). Los aceites naturales o sintéticos con o sin tensoactivos o emulsionantes se pueden usar, por ejemplo, aceites de origen vegetal, aceites de cultivos (tales como los enumerados en el 9th Compendium of Herbicide Adjuvants, disponibles al público en la WorldWide Web (Internet) en herbicide.adjuvants.com, por ejemplo, aceites parafínicos, ésteres de ácido grasos de poliol o aceites con moléculas de cadena corta modificadas con amidas o poliaminas tales como polietilenimina o ?— pirrolidina. Los agentes de transferencia incluyen, pero sin limitación, preparaciones de organosilicio.
Un campo agronómico que requiere de control de plantas se trata por aplicación de la composición de la presente invención directamente a la superficie de las plantas en crecimiento, como por pulverización. Por ejemplo, el método se aplica para controlar las malezas en un campo de plantas de cultivo por pulverización del campo con la composición. La composición se puede proporcionar como una mezcla en tanque, un tratamiento secuencial de componentes (en general, el polinucleótido que contiene la composición seguido del herbicida), o un tratamiento simultáneo o mezcla de uno o varios de los componentes de la composición de recipientes separados. El tratamiento del campo se puede producir cuando se requiera para proporcionar control de malezas y los componentes de la composición se pueden ajustar para dirigirse a especies de malezas o familias de malezas específicas a través de la utilización de polinucleótidos específicos o composiciones de polinucleótido capaces de dirigirse selectivamente especies específicas o familia de plantas por controlar. La composición se puede aplicar en tasas de uso efectivas de acuerdo con el momento de aplicación en el campo, por ejemplo, preplantado, en el plantado, después del plantado, después de la cosecha. Los herbicidas del inhibidor de ALS se pueden aplicar a un campo en tasas de 3 a 150 g ai/ha o más. Los polinucleótidos de la composición se pueden aplicar en tasas de 1 a 30 gramos por acre según la cantidad de moléculas disparadoras necesarias para el alcance de las malezas en el campo.
Las plantas de cultivo en las que se necesita un control de malezas incluyen, pero sin limitación, maíz, soja, algodón, cañóla, remolacha, alfalfa, caña de azúcar, arroz y trigo; ii) plantas vegetales que incluyen, sin limitación, tomate, pimiento morrón, pimiento picante, melón, sandía, pepino, berenjena, coliflor, brócoli, lechuga, espinaca, cebolla, judías, zanahorias, maíz dulce, repollo chino, puerro, hinojo, calabaza o zapallo, rábano, repollos de Bruselas, tomatillo, alubias, frijoles secos o quimbombó; iii) plantas culinarias que incluyen, pero sin limitación, albahaca, perejil, café o té; o, iv) plantas frutales que incluyen, pero sin limitación, manzana, pera, cereza, durazno, ciruela, damasco, banana, plátano, uva de mesa, uva, cítricos, aguacate, mango o bayas; v) un árbol crecido para uso ornamental o comercial, que incluyen, pero sin limitación, un árbol frutal o nogal; or, vi) an una planta ornamental (por ejemplo, una planta de flor ornamental o arbusto o césped). Los métodos y composiciones proporcionados en la presente también se pueden aplicar a plantas producidas por un proceso de corte, clonación o injerto (es decir, una planta no crecida de una semilla) incluyen árboles frutales y plantas que incluyen, sin limitación, citrus, manzanas, aguacates, tomates, berenjena, pepino, melones, sandías y uvas, así como diversas plantas ornamentales.
Mezclas pesticidas Las composiciones de polinucleótido también se pueden usar como mezclas con diversos productos químicos agrícolas y/o agentes insecticidas, miticidas y fungicidas, pesticidas y biopesticidas. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, azinfos-metilo, acefato, isoxationa, isofenfos, etiona, etrinfos, oxidemetona-metilo, oxideprofos, quinalfos, clorpirifos, clorpirifos-metilo, clorfenvinfos, cíanofos, dioxabenzofos, diclorvos, disulfotona, dimetilvinfos, dimetoato, sulprofos, diazinona, tiometona, tetraclorvinfos, temefos, tebupirinfos, terbufos, naled, vamidotiona, piraclofos, piridafentiona, pirimifos-metilo, fenítrotiona, fentiona, fentoato, flupirazofos, protiofos, propafos, profenofos, foxima, fosalona, fosmet, formotiona, forato, malationa, mecarbam, mesulfenfos, metamidofos, metidationa, parationa, metilparationa, monocrotofos, triclorfona, EPN, isazofos, isamidofos, cadusafos, diamidafos, diclofentiona, tionazina, fenamifos, fostiazato, fostietano, fosfocarb, DSP, etoprofos, alanicarb, aldicarb, isoprocarb, etiofencarb, carbarilo, carbosulfano, xililcarb, tiodicarb, pirimicarb, fenobucarb, furatiocarb, propoxur, bendiocarb, benfuracarb, metomilol, metolcarb, XMC, carbofurano, aldoxicarb, oxamilo, acrinatrina, aletrina, esfenvalerato, empentrina, cicloprotrina, cihalotrina, gamma-cihalotrina, lambda-cihalotrina, ciflutrina, beta-ciflutrina, cipermetrina, alfa-cipermetrina, zeta-cipermetrína, silafluofeno, tetrametrina, teflutrina, deltametrina, tralometrina, bifentrina, fenotrina, fenvalerato, fenpropatrina, furametrina, praletrina, flucitrinato, fluvalinato, flubrocitrinato, permetrina, resmetrina, etofenprox, cartap, tiociclam, bensultap, acetamiprid, imidacloprid, clotianidina, dinotefurano, tiacloprid, tiametoxam, nitenpiram, clorfluazurona, diflubenzurona, teflubenzurona, triflumurona, novalurona, noviflumurona, bistrifluorona, fluazurona, flucicloxurona, flufenoxurona, hexaflumurona, lufenurona, cromafenozida, tebufenozida, halofenozida, metoxifenozida, diofenolano, ciromazina, piriproxifeno, buprofezina, metopreno, hidropreno, quinopreno, triazamato, endosulfano, clorfensona, clorobencilato, dicofol, bromopropilato, acetoprol, fipronilo, etiprol, piretrina, rotenona, sulfato de nicotina, agente BT (Bacillus thuringiensis), espinosad, abamectina, acequinocilo, amidoflumet, amitraz, etoxazol, quinometionato, clofentezina, óxido de fenbutatina, dienoclor, cihexatina, espirodiclofeno, espiromesifeno, tetradifona, tebufenpirad, binapacrilo, bifenazato, piridabeno, pirimidifeno, fenazaquina, fenotiocarb, fenpiroximato, fluacripirim, fluazinam, flufenzina, hexitiazox, propargita, benzomato, complejo de polinactina, milbemectina, lufenurona, mecarbam, metiocarb, mevinfos, halfenprox, azadiractina, diafentiurona, indoxacarb, benzoato de emamectina, oleato de potasio, oleato de sodio, clorfenapir, tolfenpirad, pimetrozina, fenoxicarb, hidrametilnona, almidón de hidroxipropilo, piridalilo, flufenerim, flubendiamida, flonicamida, metaflumizol, lepimectina, TPIC, albendazol, oxibendazol, oxfendazol, triclamida, fensulfotiona, fenbendazol, clorhidrato de levamisol, tartrato de morantel, dazomet, metam-sodio, triadimefona, hexaconazol, propiconazol, ipconazol, procloraz, triflumizol, tebuconazol, epoxiconazol, difenoconazol, flusilazol, triadimenol, ciproconazol, metconazol, fluquinconazol, bitertanol, tetraconazol, triticonazol, flutriafol, penconazol, diniconazol, fenbuconazol, bromuconazol, imibenconazol, simeconazol, miclobutanilo, himexazol, imazalilo, furametpir, tifluzamida, etridiazol, oxpoconazol, fumarato de oxpoconazol, pefurazoato, protioconazol, pirifenox, fenarimol, nuarimol, bupirimato, mepanipirim, ciprodinilo, pirimetanilo, metalaxilo, mefenoxam, oxadixilo, benalaxilo, tiofanato, tiofanato-metilo, benomilo, carbendazim, fuberidazol, tiabendazol, manzeb, propineb, zineb, metiram, maneb, ziram, tiuram, clorotalonilo, etaboxam, oxicarboxina, carboxina, flutolanilo, siltiofam, mepronilo, dimetomorf, fenpropidina, fenpropimorf, espiroxamína, tridemorf, dodemorf, flumorf, azoxistrobina, cresoxim-metilo, metominostrobina, orisastrobina, fluoxastrobina, trifloxistrobina, dimoxistrobina, piraclostrobina, picoxistrobina, iprodiona, procimidona, vinclozolina, clozolinato, flusulfamida, dazomet, isotiocianato de metilo, cloropicrina, metasulfocarb, hidroxiisoxazol, hidroxiisoxazol de potasio, ecomezol, D-D, carbam, cloruro de cobre básico, sulfato de cobre básico, nonilfenolsulfonato de cobre, oxina cobre, DBEDC, sulfato de cobre anhidro, sulfato de cobre pentahidrato, hidróxido cúprico, azufre inorgánico, azufre humectable, azufre de cal, sulfato de zinc, fentina, hidrógeno-carbonato de sodio, hidrógeno-carbonato de potasio, hipoclorito de sodio, plata, edifenfos, tolclofos-metilo, fosetilo, iprobenfos, dinocap, pirazofos, carpropamida, ftalida, triciclazol, piroquilona, diclocimet, fenoxanilo, casugamicina, validamicina, polioxinas, blasticideno S, oxitetraciclina, mildiomicina, estreptomicina, aceite de colza, aceite de máquina, bentiavalicarbisopropilo, iprovalicarb, propamocarb, dietofencarb, fluoroimida, fludioxanilo, fenpiclonilo, quinoxifeno, ácido oxolínico, clorotalonilo, captano, folpet, probenazol, acibenzolar-S-metilo, tiadinilo, ciflufenamida, fenhexamida, diflumetorim, metrafenona, picobenzamida, proquinazida, famoxadona, ciazofamida, fenamidona, zoxamida, boscalida, cimoxanilo, ditianona, fluazinam, diclofluanida, triforina, isoprotiolano, ferimzona, diclomezina, tecloftalam, pencicurona, quinometionato, acetato de iminoctadina, albesilato de iminoctadina, ambam, policarbamato, tiadiazina, cloroneb, dimetilditiocarbamato de níquel, guazatina, acetato de dodecilguanidina, quintoceno, tolilfluanida, anilazina, nitrotalisopropilo, fenitropano, dimetirimol, bentiazol, proteína harpina, flumetover, mandipropamida y pentiopirad.
Polinucleótidos Tal como se usa en la presente, la expresión "ADN", "molécula de ADN", "molécula de polinucleótido de ADN" se refiere a una molécula de ADN monocatenaria (ssADN) o ADN bicatenaria (dsADN) de origen genómico o sintético, tales como un polímero de bases de desoxirribonucleótido o una molécula de polinucleótido de ADN. Tal como se usa en la presente, la expresión "secuencia de ADN", "secuencia de nucleótido de ADN" o "secuencia de polinucleótido de ADN" se refiere a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN. Tal como se usa en la presente, la expresión "ARN", "molécula de ARN", "molécula de polinucleótido de ARN" se refiere a una molécula de ARN monocaternaria (ssARN) o una molécula de ARN bicatenaria (dsARN) de origen genómico o sintético, tales como un polímero de bases de ribonucleótido que comprenden regiones monocatenarias o bicatenarias. A menos que se establezca otra cosa, las secuencias de nucleotidos en el texto de esta memoria descriptiva se brindan cuando se lee de izquierda a derecha en la dirección 5' a 3'. La nomenclatura usada en la presente es aquella requerida por el título 37 del Código de los Estados Unidos de Regulaciones Federales § 1.822 y establecida en los cuadros en WIPO Standard ST.25 (1998), Apéndice 2, Cuadros 1 y 3.
Tal como se usa en la presente, "polinucleótido" se refiere a una molécula de ADN o ARN que contiene múltiples nucleotidos y en general se refiere tanto a "oligonucleótidos" (una molécula de polinucleótido de típicamente 50 o menos nucleotidos de longitud) como a polinucleótidos de 51 o más nucleotidos. Las modalidades de esta invención incluyen composiciones que incluyen oligonucleótidos que tienen una longitud de 18-25 nucleotidos (18-meros, 19-meros, 20-meros, 21-meros, 22-meros, 23-meros, 24-meros o 25-meros), por ejemplo, oligonucleótidos de SEQ ID NO:1364-1691 y 4167-4201 o sus fragmentos o polinucleótidos de longitud media que tienen una longitud de 26 o más nucleotidos (polinucleótidos de 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180, aproximadamente 190, aproximadamente 200, aproximadamente 210, aproximadamente 220, aproximadamente 230, aproximadamente 240, aproximadamente 250, aproximadamente 260, aproximadamente 270, aproximadamente 280, aproximadamente 290 o aproximadamente 300 nucleótidos), por ejemplo, polinucleótidos (SEQ ID NO.46-1363 y 1789-4166) o sus fragmentos o polinucleótidos largos que tienen una longitud más largo de aproximadamente 300 nucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos de entre aproximadamente 300 y aproximadamente 400 nucleótidos, entre aproximadamente 400 y aproximadamente 500 nucleótidos, entre aproximadamente 500 y aproximadamente 600 nucleótidos, entre aproximadamente 600 y aproximadamente 700 nucleótidos, entre aproximadamente 700 y aproximadamente 800 nucleótidos, entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 nucleótidos, entre aproximadamente 900 y aproximadamente 1000 nucleótidos, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 500 nucleótidos, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 600 nucleótidos, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 700 nucleótidos, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 800 nucleótidos, entre aproximadamente 300 y aproximadamente 900 nucleótidos o aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud o incluso más de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, por ejemplo, hasta la longitud entera de un gen blanco que incluye las porciones codificantes o no codificantes o ambas del gen blanco), por ejemplo, polinucleótidos del Cuadro 1 (SEQ ID NO:1-45 y 1682-1788), en donde los polinucleótidos seleccionados o sus fragmentos homólogos o complementarios a la SEQ ID NO:1-45y 1692-1788 y suprime, reprime o demora de otro modo la expresión del gen blanco de ALS. Un gen blanco comprende cualquier molécula de polinucleótido en una célula de planta o su fragmento para los que la modulación de la expresión del gen blanco es proporcionado por los métodos y composiciones de la presente invención. Cuando un polinucleótido es bicatenario, su longitud se puede describir de modo similar en términos de pares de bases. Se puede hacer que los oligonucleótidos y polinucleótidos de la presente invención sean esencialmente idénticos o esencialmente complementarios de elementos genéticos adyacentes de un gen, por ejemplo, abarcando la región de unión de un intrón y un exón, la región de unión de un promotor y una región transcripta, la región de unión de una secuencia líder 5' y una secuencia codificadora, la región de unión de una secuencia no traducida 3' y una secuencia codificadora.
Las composiciones de polinucleótido usadas en las diversas modalidades de esta invención incluyen composiciones que incluyen oligonucleótidos o polinucleótidos o una mezcla de ambos, incluyendo ARN o ADN o híbridos de ARN/ADN u oligonucleótidos o polinucleótidos químicamente modificados o una mezcla de ellos. En algunas modalidades, el polinucleótido puede ser una combinación de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, por ejemplo, polinucleótidos sintéticos que consisten principalmente ribonucleótidos pero con uno o varios deoxiribonucleótidos terminales o polinucleótidos sintéticos que consisten principalmente en desoxirribonucleótidos pero con uno o varios didesoxirribonucleótidos terminales. En algunas modalidades, el polinucleótido incluye nucleótidos no canónicos tales como inosina, tiouridina o pseudouridina. En algunas modalidades, el polinucleótido incluye nucleótidos químicamente modificados. Los ejemplos de oligonucleótidos o polinucleótidos químicamente modificados son bien conocidos en el arte; ver, por ejemplo, la publicación de patente U. S. 20110171287, la publicación de patente U. S. 20110171176 y la publicación de patente U. S. 20110152353, la publicación de patente U. S. 20110152346, publicación de patente U. S. 20110160082, incorporadas en la presente por referencia. Por ejemplo, incluyen, pero sin limitación, la estructura de fosfodiéster natural de un oligonucleótido o polinucleótido puede estar parcial o completamente modificado con modificaciones de ligación de internucleótido de fosforotioato, fosforoditioato o metilfosfonato, se pueden usar bases de nucleósidos modificados o azúcares modificados en la síntesis de oligonucleótidos o polinucleótidos y oligonucleótidos o polinucleótidos se pueden rotular con un resto fluorescente (por ejemplo, fluoresceína o rodamina) u otro rótulo (por ejemplo, biotina).
Los polinucleótidos pueden ser ARN monocatenario o bicatenario o un ADN monocatenario o bicatenario o híbridos de ADN/ARN bicatenarios o sus análogos modificados y pueden tener longitudes de oligonucleótidos o más. En algunas modalidades más específicas de esta invención, los polinucleótidos que proporcionan ARN monocatenarios en la célula de planta están seleccionados del grupo que consiste en (a) una molécula de ARN monocatenario (ssARN), (b) una molécula de ARN monocatenaria que se autohibrida para formar una molécula de ARN bicatenaria, (c) una molécula de ARN bicatenaria (dsARN), (d) una molécula de ADN monocatenaria (ssADN), (e) una molécula de ADN monocatenaria que se autohibrida para formar una molécula de ADN bicatenaria y (f) una molécula de ADN monocatenaria que incluye un gen Pol III modificado que se transcribe en una molécula de ARN, (g) una molécula de ADN bicatenaria (dsADN), (h) una molécula de ADN bicatenaria que incluye un gen Pol III modificado que se transcribe en una molécula de ARN, (i) una molécula de ARN/ADN hibridada bicatenaria o combinaciones de ellas. En algunas modalidades, estos polinucleótidos incluyen nucleótidos o nucleótidos no canónicos químicamente modificados. En modalidades del método, los polinucleótidos incluyen ADN bicatenario formado por hibridación intramolecular, ADN bicatenario formado por hibridación intermolecular, ARN bicatenario formado por hibridación intramolecular o ARN bicatenario formado por hibridación intermolecular. En una modalidad, los polinucleótidos incluyen ADN monocatenario o ARN bicatenario que se autohibrida para formar una estructura en horquilla con una estructura al menos parcialmente bicatenaria incluyendo al menos un segmento que hibridará en ARN transcripto del gen dirigido para supresión. Sin pretender quedar ligado por cualquier mecanismo, se cree que tales polinucleótidos son o producirán ARN monocatenario con al menos un segmento que hibridará en ARN transcripto de un gen dirigido para supresión. En ciertas modalidades diferentes, los polinucleótidos también incluyen un promotor, en general, un promotor funcional en una planta, por ejemplo, un promotor de pol II, un promotor de pol III, un promotor de pol IV o un promotor de pol V.
El término "gen" se refiere a componentes que comprenden ADN cromosómico, plásmido ADN, cADN, ADN de intrón y exón, polinucleótido de ADN artificial u otro ADN que codifica un péptido, polipéptido, proteína o molécula de transcripto de ARN y los elementos genéticos que flanquean la secuencia codificante que están implicados en la regulación de expresión, tales como, regiones promotores, regiones líder 5', región no traducida 3' que puede existir como genes nativos o transgenes en el genoma de una planta. El gen o a su fragmento se aisla y se somete a métodos de secuenciación de polinucleótidos que determina el orden de los nucleótidos que comprenden el gen. Cualquiera de los componentes del gen son blancos potenciales para un oligonucleótido y polinucleótido disparador.
Las moléculas de polinucleótido disparadoras se diseñan para modular la expresión al inducir la regulación o la supresión de un gen de ALS endógeno en una planta y se diseñan para tener una secuencia de nucleótidos esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a la secuencia de nucleótidos de un gen de ALS endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcripta de un gen de ALS endógeno de una planta, su secuencia determinada por aislamiento del gen o un fragmento del gen de la planta que incluye un transgén en un aplanta que proporciona una enzima de ALS resistente a herbicida que puede ser la secuencia codificadora o no codificadora. Las moléculas efectivas que modulan la expresión se mencionan como una "molécula disparadora o polinucleótidos disparadores". Por "esencialmente idéntico" o "esencialmente complementario" se entiende que los polinucleótidos disparadores (o al menos una cadena de un polinucleótido bicatenario o una de sus porciones o una porción de un polinucleótido monocatenario) se diseñan para hibridar en la secuencia no codificante del gen endógeno o ARN transcripto (conocido como ARN mensajero o un transcripto de ARN) del gen endógeno para realizar la regulación o la supresión de la expresión del gen endógeno. Las moléculas disparadoras se identificar por "azulejado" de los blancos génicos con sondas parcialmente superpuestas o sondas no superpuestas de polinucleótidos antisentido o consentido que son esencialmente idénticos o esencialmente complementarios a la secuencia de nucleótidos de un gen endógeno. Múltiples secuencias blanco se pueden alinear y regiones de secuencia con homología en común, de acuerdo con los métodos de la presente invención, se identifican como potenciales moléculas disparadoras para los blancos múltiples. Las múltiples moléculas disparadoras de diversas longitudes, por ejemplo 18-25 nucleótidos, 26-50 nucleótidos, 51-100 nucleótidos, 101-200 nucleótidos, 201-300 nucleótidos o más se pueden reunir en pocos tratamientos a fin de investigar moléculas de polinucleótido que cubren una porción de una secuencia génica (por ejemplo, una porción de una porción codificante versus una porción de una región no codificante o una porción 5' versus 3' de un gen) o una secuencia génica entera que incluye las regiones codificantes y no codificantes de un gen blanco. Las moléculas de polinucleótido de las moléculas disparadoras reunidas se pueden dividir en pools más pequeños o moléculas individuales a fin de identificar moléculas disparadoras que proporcionan el efecto deseado.
Las moléculas de polinucleótido de ARN y ADN de gen blanco (Cuadro 1 , SEQ ID NO:1- 5 y 1692-1788) se secuencian por cualquier cantidad de métodos y equipamiento apropiados. Algunas de las tecnologías de secuenciación están disponibles en comercios, tales como la plataforma de secuenciación por hibridación de Affymetrix Inc. (Sunnyvale, Calif.) y las plataformas de secuenciación por síntesis de 454 Life Sciences (Bradford, Conn.), Illumína/Solexa (Hayward, Calif.) y Helicos Biosciences (Cambridge, Mass.) y la plataforma de secuenciación por ligación de Applied Biosystems (Foster City, Calif.), tal como se describe más abajo. Además de la secuenciación de moléculas simples realizada usando secuenciación por síntesis de Helicos Biosciences, están comprendidas otras tecnologías de secuenciación de moléculas simples e incluyen la tecnología SMRT™ de Pacific Biosciences, la tecnología Ion Torrent™ y secuenciación de nanoporos desarrolla, por ejemplo, por Oxford Nanopore Technologies. Un gen blanco de ALS que comprende ADN o ARN se puede aislar usando cebadores o sondas esencialmente complementarias o esencialmente homologas a la SEQ ID NO: 1—45 y 1692-1788 o a su fragmento. Un gen de reacción de polimerasa en cadena (PCR) se puede producir usando cebadores esencialmente complementarios o esencialmente homólogos a SEQ ID NO: 1—45 y 692-1788 o a su fragmento que es de utilidad para aislar un gen de ALS de un genoma de planta. La SEQ ID NO: 1-45 y 1692-1788 o sus fragmentos se pueden usar en diversas tecnologías de captura de secuencias para aislar secuencias génicas blanco adicionales, por ejemplo, que incluyen, pero sin limitación, Roche NimbleGen® (Madison, Wl) y Dynabeads® acopladas con estreptavidina (Life Technologies, Grand Island, NY) y US201 10015084, incorporada en la presente por referencia en su totalidad.
Las modalidades de polinucleótidos monocatenarios tienen una complementariedad de secuencia que no requiere ser del 100%, pero es al menos suficiente para permitir la hibridación en ARN transcripto del gen blanco o ADN del gen blanco para formar un dúplex para permitir un mecanismo de silenciación génica. Así, en modalidades, un fragmento de polinucleótido se diseña para ser esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en la secuencia de gen blanco de ALS o ARN mensajero transcripto del gen blanco. Por "esencialmente idéntico" se entiende que tiene 100% de identidad de secuencia o al menos aproximadamente 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% de identidad de secuencia cuando se compara con la secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos ya sea en el gen blanco o ARN transcripto del gen blanco; por "esencialmente complementario" se entiende que tiene 100% de complementariedad de secuencia o al menos aproximadamente 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% complementariedad de secuencia cuando se compara con la secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos ya sea en el gen blanco o ARN transcripto del gen blanco. En algunas modalidades, las moléculas de polinucleótido se diseñan para tener 100% de identidad de secuencia o complementariedad con un alelo o un miembro de la familia de un gen blanco dado (secuencia codificante o no codificante de un gen de la presente invención); en otras modalidades, las moléculas de polinucleótido se diseñan para tener 100% de identidad de secuencia o complementariedad con múltiples alelos o miembros de la familia de un gen blanco dado.
"Identidad" se refiere al grado de similitud entre dos secuencias de ácido polinucleico o proteína. Una alineación de las dos secuencias se lleva a cabo por medio de un programa de computadora apropiado. Un programa de computadora ampliamente usado y aceptado para realizar alineaciones de secuencias es CLUSTALW v1.6 (Thompson, et al. Nucí. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994). La cantidad de bases o aminoácidos coincidentes se divide por la cantidad total de bases o aminoácidos y se multiplica por 100 para obtener un porcentaje de identidad. Por ejemplo, si dos secuencias de 580 pares de bases tienen 145 bases coincidentes, serán 25% idénticas. Si las dos secuencias comparadas son de diferentes longitudes, la cantidad de coincidencia se divide por la más corta de las dos longitudes. Por ejemplo, si hay 100 aminoácidos coincidentes entre una proteína de 200 y 400 aminoácidos, son 50% idénticos respecto de la secuencia más corta. Si la secuencia más corta es menor a 150 bases o 50 aminoácidos de longitud, la cantidad de coincidencias se dividen por 150 (para bases de ácidos nucleicos) o 50 (para aminoácidos) y se multiplican por 100 para obtener un porcentaje de identidad.
Las moléculas disparadoras para miembros de la familia génica específica se pueden identificar de secuencias codificantes y/o no codificantes de familias de genes de una planta o múltiples plantas, por alineación y selección de 200-300 fragmentos de polinucleótidos de las últimas regiones homologas entre las secuencias alineadas y evaluadas usando polinucleótidos aplicados tópicamente (como ssADN o ssARN, dsARN o dsADN con sentido o antisentido) para determinar su eficacia relativa en la inducción del fenotipo herbicida. Los segmentos efectivos luego se subdividen en 50-60 fragmentos de polinucleótidos, se priorizan por mínima homología y se reevalúan usando los polinucleótidos aplicados tópicamente. Los fragmentos efectivos de 50-60 polinucleótidos se subdividen en 19-30 fragmentos de polinucleótidos, se priorizan por mínima homología y nuevamente se evalúan respecto de la inducción del fenotipo herbicida. Una vez determinada la efectividad relativa, los fragmentos se utilizan individualmente o se evalúan otra vez en combinación con uno o varios fragmentos diferentes para determinar la composición disparadora o mezcla de polinucleótidos disparadores para proporcionar el fenotipo herbicida.
Las moléculas disparadoras para la actividad amplia se pueden identificar de secuencias codificantes y/o no codificantes de familias de genes de una planta o varias plantas, por alineación y selección de 200-300 fragmentos de polinucleótidos de las regiones más homologas entre las secuencias alineadas y evaluadas usando polinucleótidos tópicamente aplicados (como ssADN o ssARN, dsARN o dsADN con sentido o antisentido) para determinar su efectividad relativa en la inducción del fenotipo herbicida. Los segmentos efectivos se subdividen en 50-60 fragmentos de polinucleótidos, se priorizan por la máxima homología y se reevalúan usando polinucleótidos tópicamente aplicados. Los 50-60 fragmentos de polinucleótido se subdividen en 19-30 fragmentos de polinucleótidos, se priorizan por la máxima homología y se reevalúan respecto de la inducción del fenotipo herbicida. Una vez determinada la eficacia relativa, los fragmentos se pueden utilizar de forma individual o en combinación con uno o varios otros fragmentos para determinar la composición disparadora o mezcla de polinucleótidos disparadores para proporcionar el fenotipo herbicida.
Los métodos para preparar polinucleótidos son bien conocidos en el arte. Las síntesis químicas, las síntesis in vivo y métodos de síntesis in vivo y composiciones son conocidos en el arte e incluyen diversos elementos virales, células microbianas, polimerasas modificadas y nucleótidos modificados. La preparación comercial de oligonucleótidos proporciona a menudo dos desoxirribonucleótidos en el extremo 3' de la cadena con sentido. Las moléculas largas de polinucleótido se pueden sintetizar de kits asequibles en comercios, por ejemplo, kits de Applied Biosystems/Ambion (Austin, TX) tuenen ADN ligado en el extremo 5' en un cásete de expresión microbiano que incluye un promotor bacteriano T7 de polimerasa que hace que cadenas de ARN se puedan reunir en un dsARN y kits proporcionados por diversos fabricantes que incluyen T7 RiboMax Express (Promega, adison, Wl), AmpliScribe T7-Flash (Epicentre, Madison, Wl) y TranscriptAid T7 High Yield (Fermentas, Glen Burnie, MD). Las moléculas de dsARN se pueden producir a partir de casetes de expresión microbiano en células bacterianas (Ongvarrasopone et al. ScienceAsia 33:35-39; Yin, Appl. Microbiol. Biotechnol 84:323-333, 2009; Liu et al., BMC Biotechnology 10:85, 2010) que tienen una actividad enzimática regulada o deficiente de ARNasa III o el uso de diversos vectores virales para producir cantidades suficientes de dsARN. Los fragmentos génicos de ALS se insertan en los casetes de expresión microbiana en una posición en donde los fragmentos se expresan para producir ssARN o dsARN de utilidad en los métodos descritos en la presente para regular la expresión en un gen blanco de ALS. Las moléculas largas de polinucleótido también se pueden reunir de múltiples fragmentos de ARN o ADN. En algunas modalidades, parámetros de diseño tales como puntaje de Reynolds (Reynolds et al. Nature Biotechnology 22, 326 - 330 (2004), reglas de Tuschl (Peí y Tuschl, Nature Methods 3(9): 670-676, 2006), puntaje i (Nucleic Acids Res 35: e123, 2007), herramienta de diseño de puntaje i y algoritmos asociados (Nucleic Acids Res 32: 936-948, 2004. Biochem Biophys Res Commun 316: 1050-1058, 2004, Nucleic Acids Res 32: 893-901, 2004, Cell Cycle 3: 790-5, 2004, Nat Biotechnol 23. 995-1001, 2005, Nucleic Acids Res 35: e27, 2007, BMC Bioinformatics 7: 520, 2006, Nucleic Acids Res 35: e123, 2007, Nat Biotechnol 22: 326-330, 2004) se conocen en el arte y se pueden usar en la selección de secuencias de polinucleótido efectivas para la silenciación génica. En algunas modalidades, la secuencia de un polinucleótido se controla contra el ADN genómico de la planta pretendida para minimizar la silenciación no intencional de otros genes.
Los ligandos se pueden mantenerse atados a un polinucleótido, por ejemplo, un dsARN, ssARN, dsADN o ssADN. Los ligandos en general pueden incluir modificadores, por ejemplo, para mejorar la captación; compuestos de diagnóstico o grupos reporteros, por ejemplo, para controlar la distribución; agentes reticulantes; restos que confieren resistencia a nucleasa; y nucleobases naturales o inusuales. Los ejemplos generales incluyen lipófilos, lípidos (por ejemplo, colesterol, un ácido biliar o un ácido graso (por ejemplo, litocólico— oleílo, lauroílo, docosnilo, estearoílo, palmitoílo, miristoílo, oleoílo, linoleoilo), esteroides (por ejemplo, uvaol, hecigenina, diosgenina), terpenos (por ejemplo, triterpenos, por ejemplo, sarsasapogenina, Friedelina, ácido litocólico derivado de epifriedelanol), vitaminas (por ejemplo, ácido fólico, vitamina A, biotina, piridoxal), carbohidratos, proteínas, agentes de unión a proteínas, moléculas blanco de integrina, policatiónicos, péptidos, poliaminas y mímicos peptídicos. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, tales como un polímero sintético, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), PEG-40K, PEG-20K y PEG-5K. Otros ejemplos de ligandos incluyen moléculas lipofílicas, por ejemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adamantanacético, ácido 1-pirenbutírico, dihidrotestosterona, glicerol (por ejemplo, sus ésteres y éteres, por ejemplo, alquilo C 0, Cu, C12, C13, C-| , C15, C16, C17, C18, C19 o C2o; por ejemplo, lauroílo, docosnilo, estearoílo, oleoilo, linoleoilo. 1 ,3-bis-0(hexadecil)glicerol, 1 ,3-bis-0(octadecil)glicerol), grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1 ,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido 03-(oleoil)litocólico, ácido 03-(oleoil)colénico, dodecanoílo, litocolilo, 5.beta.-colanilo, N,N-diestearil-litocolamida, 1 ,2-di-O-estearoilglicérido, dimetoxitritilo o fenoxazina) y PEG (por ejemplo, PEG-5K, PEG-20K, PEG- 0K). Los restos lipofílicos preferidos incluyen lípidos, colesteroles, residuos de oleílo, retinilo o colesterilo.
La conjugación de un ligando a ARNds puede aumentar su absorción celular, los compuestos lipofílicos que se han conjugado a los oligonucleótidos incluyen ácido 1-pireno butírico, 1 ,3-bis-O-(hexadecil)glicerol, y mentol. Un ejemplo de un ligando para endocitosis mediada por receptor es ácido fólico. El ácido fólico entra en la célula mediante la endocitosis radiada por el receptor de folato. Los compuestos de ARNds que portan ácido fólico se pueden transportar de modo eficiente en la célula por medio de la endocitosis mediada por receptor. Otros ligandos que se han conjugado a oligonucleótidos incluyen polietilenglicoles, grupos de carbohidratos, agentes de entrecruzamiento, conjugados de porfirinas, péptidos de liberación y lípidos tales como colesterol. En ciertos casos, la conjugación de un ligando catiónico a oligonucleótidos produce mejor resistencia a las nucleasas. Los ejemplos representativos de ligandos catiónicos son propilamonio y dimetilpropilamonio. De modo interesante, se informó que los oligonucleótidos antisentido retienen su alta afinidad de unión al ARNm cuando el ligando catiónico se dispersó a lo largo del oligonucleótido. Ver M. Manoharan Antisense & Nucleic Acids Drug Development 2002, 12, 103 y las referencias de esta.
Se puede lograr una administración biológica por una variedad de métodos, que incluyen sin limitación, (1) carga de liposomas con una molécula de ácido ARNds provisto en la presente y (2) formación de complejo de una molécula de ARNds con lípidos o liposomas para formar complejos de ácido nucleico-lípido o ácido nucleico-liposoma. El liposoma se puede componer de lípidos catiónicos y neutros comúnmente usados para transfectar células in vitro. Los lípidos catiónicos pueden complejar (por ejemplo, asociar con carga) con ácidos nucleicos con carga negativa para formar liposomas. Los ejemplos de liposomas catiónicos incluyen, sin limitación, lipofectina, lipofectamina, lipofectace, y DOTAP. Los procedimientos para formar liposomas son bien conocidos en la técnica. Se pueden formar composiciones de liposomas, por ejemplo, a partir de fosfatidilcolina, dimiristoil fosfatidilcolina, dipalmitoil fosfatidilcolina, dimiristoil fosfatidil glicerol, dioleoil fosfatidiletanolamina o liposomas que contienen dihidrosfingomielina (DHSM). Numerosos agentes lipofílicos están disponibles en el comercio, que incluyen Lipofectin® (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, Calif.) y Effectene™ (Qiagen, Valencia, Calif.), Además, los métodos de administración sistémica se pueden optimizar usando lípidos catiónicos disponibles en el comercio tales como DDAB o DOTAP, cada uno de los cuales se puede mezclar con un lípido neutro tal como DOPE o colesterol. En algunos casos, se pueden usar liposomas tales como los descriptos por Templeton et al. Nature Biotechnology, 15:647-652 (1997). En otras modalidades, se pueden usar policationes tales como polietilenimina para lograr la administración in vivo y ex vivo (Boletta et al., J. Am Soc. Nephrol. 7:1728, 1996). La información adicional respecto del uso de los liposomas para administrar ácidos nucleicos se puede hallar en la Patente U. S. N.° 6.271.359, Publicación PCT WO 96/40964 y Morrissey, D. et al., 2005. Nat. Biotechnol. 23(8): 1002-7.
En ciertas modalidades, una preparación de organosilicona que está disponible en el comercio como tensoactivo Silwet® L-77 que tiene Número CAS 27306-78-1 y Número EPA: CAL.REG.NO. 5905-50073-AA, y disponible actualmente de Momentive Performance Materials, Albany, New Cork se puede usar para preparar una composición de polinucleótido. En ciertas modalidades cuando se usan una preparación de organosilicona Silwet L-77 como un tratamiento pre-rociado de hojas de planta u otras superficies de plantas, concentraciones recién preparadas en el rango de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en peso) (por ejemplo, aproximadamente 0.01 , 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1 , 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1 , 2.2, 2.3, 2.5 por ciento en peso) son eficaces para preparar una hoja u otra superficie de planta para la transferencia de moléculas de polinucleótidos en células de plantas a partir de una aplicación tópica sobre la superficie. En ciertas modalidades de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente, se usa o proporciona una composición que comprende una molécula de polinucleótido y una preparación de organosilicona que comprende Silwet L-77 en el rango de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en peso) (por ejemplo, aproximadamente 0.01 , 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1 , 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1 , 2.2, 2.3, 2.5 por ciento en peso) .
En ciertas modalidades, alguna de las preparaciones de organosilicona disponibles en el comercio provistas tales como las siguientes Breakthru S 321 , Breakthru S 200 Cat# 67674-67-3, Breakthru OE 441 Cat#68937-55-3, Breakthru S 278 Cat #27306-78-1 , Breakthru S 243, Breakthru S 233 Cat#134180-76-0, disponibles del fabricante Evonik Goldschmidt (Germany), Silwet® HS 429, Silwet® HS 312, Silwet® HS 508, Silwet® HS 604 (Momentive Performance Materials, Albany, New York) se pueden usar como agentes de transferencia en una composición de polinucleótido. En ciertas modalidades cuando una preparación de organosilicona se usa como un tratamiento de pre-rociado de hojas de plantas u otras superficies, las concentraciones recién preparadas en el rango de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en peso) {por ejemplo, aproximadamente 0.01 , 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1 , 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1 , 2.2, 2.3, 2.5 por ciento en peso) son eficaces para preparar una hoja u otra superficie de planta para la transferencia de las moléculas de polinucleótidos en las células vegetales a partir de la aplicación tópica sobre la superficie. En ciertas modalidades de los métodos y composiciones provistos en la presente, se usa o proporciona una composición que comprende una molécula de polinucleótido y una preparación de organosilicona en el rango de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en peso) (por ejemplo, aproximadamente 0.01 , 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1 , 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1 , 2.2, 2.3, 2.5 por ciento en peso).
Las preparaciones de organosilicona usadas en los métodos y composiciones provistos en la presente pueden comprender uno o más compuestos de organosilicona efectivos. Como se usa en la presente, la frase "compuesto de organosilicona efectivo" se usa para describir cualquier compuesto de organosilicona que se halla en una preparación de organosilicona que permite que un polinucleótido entre en una célula de planta. En ciertas modalidades, un compuesto de organosilicona efectivo puede permitir que un polinucleótido entre a una célula de planta de una manera que permite una supresión mediada por polinucleótido de una expresión del gen blanco en la célula de planta. En general, los compuestos de organosilicona efectivos incluyen, pero sin limitación, compuestos que pueden comprender: i) un grupo principal trisiloxano que se une covalentemente a, ii) un ligador alquilo que incluye, pero sin limitación, un ligador n-propilo, que se une covalentemente a, iii) una cadena de poliglicol, que se une covalentemente a, iv) un grupo terminal. Los grupos principales trisiloxano de tales compuestos de organosilicona efectivos incluyen, pero sin limitación, heptametiltrisiloxano. Los ligadores alquilo pueden incluir, pero sin limitación, un ligador n-propilo. Los cadenas poliglicol incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol o polipropilenglicol. Las cadenas de poliglicol pueden comprender una mezcla que proporciona una longitud de cadena promedio "n" de aproximadamente "7.5". En ciertas modalidades, la longitud de cadena promedio "n" puede variar de aproximadamente 5 a aproximadamente 14. Los grupos terminales pueden incluir, pero sin limitación, grupos alquilo tales como un grupo metilo. Se considera que los compuestos de organosilicona efectivos incluyen, pero sin limitación, tensoactivos de etoxilato de trisiloxano o heptametil trisiloxano modificado con óxido de polialquileno.
(Compuesto I: heptametiltrisiloxano con óxido de polialquileno, promedio = 7.5).
En ciertas modalidades se usa una preparación de organosilicona que comprende un compuesto de organosilicona que comprende un grupo principal en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente. En ciertas modalidades, se usa una preparación de organosilicona que comprende un compuesto de organosilicona que comprende un grupo principal heptametiltrisiloxano en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente. En ciertas modalidades, se usa una composición de organosilicona que comprende Compuesto I en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente. En ciertas modalidades, se usa una composición de organosilicona que comprende el Compuesto I en los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente. En ciertas modalidades de los métodos y las composiciones que se proporcionan en la presente, se usa o proporciona una composición que comprende una molécula de polinucleótido y uno o más compuestos de organosilicona efectivo en el rango de aproximadamente 0.015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (por ciento en peso) (por ejemplo, aproximadamente 0.01, 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1 , 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1 , 2.2, 2.3, 2.5 por ciento en peso).
Las composiciones de la presente invención incluyen pero sin limitación componentes que son uno o más polinucleótidos esencialmente idénticos, o esencialmente complementarios a una secuencia del gen ALS (promotor, intrón, exón, región no traducida 5', región no traducida 3'), un agente de transferencia que permite que el polinucleótido entre en una célula de planta, un herbicida que complementa la acción del polinucleótido, uno o más herbicidas adicionales que también potencian la actividad herbicida de la composición o proporcionan un modo de acción adicional diferente del herbicida de complementación, varias sales y agentes estabilizantes que aumentan la utilidad de la composición como una combinación de los componentes de la composición.
En determinados aspectos, los métodos incluyen una o más aplicaciones de una composición de polinucleótido y una o más aplicaciones de un agente de transferencia para acondicionar una planta para la penetración por los polinucleótidos. Cuando el agente para acondicionar la penetración es una composición de organosilicona o compuesto contenida en esta, las modalidades de las moléculas de polinucleótidos son oligonucleótidos de ARN de cadena doble, oligonucleótidos de ARN de cadena simple, polinucleótidos de ARN de cadena doble, polinucleótidos de ARN de cadena simple, oligonucleótidos de ADN de cadena doble, oligonucleótidos de ADN de cadena simple, polinucleótidos de ADN de cadena doble, polinucleótidos de ADN de cadena simple, oligonucleótidos o polinucleótidos de ARN o ADN modificado químicamente o sus mezclas.
Las composiciones y métodos de la invención son de utilidad para modular la expresión de un gen endógeno de ALS o gen transgénico de ALS (por ejemplo, patente U. S. N.° 7.973.218; SEQ ID NO:65 que comprende una secuencia HRA de soja; SEQ ID NO:66 que comprende una secuencia HRA de maíz; SEQ ID NO:67 que comprende una secuencia HRA de Arabidopsis; y SEQ ID NO:86 que comprende una secuencia HRA usada en algodón, incorporada en la presente por referencia) en una célula vegetal. En varias modalidades, un gen de ALS incluye la secuencia codificadora (codificadora de la proteína o traducible), secuencia no codificadora (no traducible) o secuencia codificadora y no codificadora. Las composiciones pueden incluir polinucleótidos y oligonucleótidos diseñador para genes múltiples blanco o múltiples segmentos de uno o más genes. El gen blanco puede incluir múltiples segmentos consecutivos de un gen blanco, múltiples segmentos no consecutivos de un gen blanco, múltiples alelos de un gen blanco, o múltiples genes blanco de una o más especie.
Se proporciona un método para modular la expresión de un gen ALS en una planta que incluye (a) acondicionamiento de una planta para la penetración por polinucleótidos y (b) tratamiento de la planta con las moléculas de polinucleótidos, donde las moléculas de polinucleótidos incluyen al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos clonados de o identificados de otro modo del gen ALS blanco en orientación antisentido o sentido, a través de lo cual las moléculas de polinucleótidos penetran el interior de la planta e inducen la modulación del gen blanco. El acondicionamiento y la aplicación del polinucleótido se pueden realizar de modo separado o en una etapa única. Cuando el acondicionamiento y la aplicación del polinucleótido se realizan en etapas separadas, el acondicionamiento puede preceder o puede seguir a la aplicación del polinucleótido dentro de minutos, horas, o días. En algunas modalidades se pueden realizar más de una etapa de acondicionamiento o más de una aplicación de la molécula de polinucleótido en la misma planta. En modalidades del método, el segmento se puede clonar o identifica de (a) parte codificadora (que codifica una proteína), (b) no codificadora (promotor y otras moléculas relacionadas con el gen), o (c) las partes codificadora y no codificadora del gen blanco. Las partes no codificadoras incluyen ADN, tal como regiones promotoras o el ARN transcripto por el ADN que proporciona moléculas regulatorias de ARN, que incluyen pero sin limitación: intrones, regiones no traducidas 5' o 3' y microARN (miARN), ARNsi de acción actúan trans, ARNsi antisentido natural y otros ARN pequeños con función reguladora o ARN que tienen función estructural o enzimática que incluyen, pero sin limitación: ribozimas, ARN ribosómicos, t-ARNs, aptámeros, y riboswitches.
Las familias químicas de herbicidas que se conocen como herbicidas inhibidores de ALS incluyen miembros de las sulfonilureas, imidazolinonas, triazolopirimidinas, pirimidinil(tio)benzoatos y sulfonilaminocarbonil-triazolinonas.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente se incorporan en la presente por referencia en la misma medida que si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara en forma específica e individual incorporada por referencia.
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar ejemplos de ciertas modalidades preferidas de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que las técnicas descriptas en los siguientes ejemplos representan métodos que los autores han hallado que funcional bien en la práctica de la invención y en consecuencia se puede considerar que constituyen ejemplos de modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente descripción que se pueden realizar muchos cambios en las modalidades específicas descriptas y aún obtienen un resultado " parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Polinucleótidos relacionados con las secuencias génicas de ALS La molécula de polinucleótido de ALS está representada por un gen de subunidad grande y un gen de subunidad pequeña que se produce de forma natural en el genoma de Amaranthus palmeri, Amaranthus rudis, Amaranthus clorostachys, Amaranthus graecizans, Amaranthus hybridus, Amaranthus lividus, Amaranthus spinosus, Amaranthus thunbergii, Amaranthus viridis, Ambrosia trífida, Kochia scoparia, Abutilón theophrasti, Chenopodium álbum, Commelina diffusa, Conyza candensis Digitaria sanguinalis, Euphorbia heterophylla, Lolium multiflorum e incluyen moléculas de polinucleótido relacionadas con la expresión de un polipéptido identificado como una subunidad grande de ALS y una subunidad pequeña de ALS, que incluyen moléculas de regulación, cAADN que comprenden regiones codificantes y no codificantes de un gen de subunidad grande de ALS y sus fragmentos y gen de subunidad pequeña de ALS y sus fragmentos tal como se muestra en el Cuadro 1 y SEQ ID NO:1-45 y 1692-1788.
Las moléculas de polinucleótido se extrajeron de estas especies de plantas por métodos estándar en el campo, por ejemplo, se extrajo el ARN total usando reactivo de trizol (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA Cat. No. 15596-018), de acuerdo con el protocolo del fabricante o sus modificaciones por los expertos en el arte de la extracción de polinucleótido que puede mejorar la recuperación o la pureza del ARN extraído. Brevemente, se inicia con 1 gramo de tejido de planta molido para extracción. Se hacen prealícuotas de 10 mililitros (ml_) de reactivo de trizol en tubos cónicos de 15 mL Se añade polvo molido a tubos y se agita para homogeneizar. Se incuba las muestras homogeneizadas durante 5 minutos (min) a temperatura ambiente (TA) y luego se añaden 3 mL de cloroformo. Se agitan los tubos vigorosamente a mano durante 15-30 segundos (seg) y se incuban a temperatura ambiente durante 3 min. Se centrifugan los tubos a 7.000 revoluciones por minuto (rpm) durante 10 min a 4 grados C. Se transfiere la fase acuosa a un nuevo tubo de 1.5 mL y se añade 1 volumen de isopropanol frío. Se incuban las muestras durante 20-30 min a TA y se centrifugan a 10.000 rpm durante 10 min a 4 grados C. Se lava el pellet con etanol al 80% de grado Sigma. Se elimina el sobrenadante y el pellet se seca brevemente con aire. Se disuelve el pellet de ARN en aproximadamente 200 microlitros de agua tratada con DEPC. Se calienta brevemente a 65 grados C para disolver el pellet y se somete a vórtex o se pipetea para resuspender el pellet de ARN. Se ajusta la concentración de ARN a 1-2 microgramos/microlitro.
El ADN se extrajo usando el kit EZNA SP Plant ADN Mini kit (Omega Biotek, Norcross GA, Cat#D551 1) y tubos Lysing Matrix E (Q-Biogen, Cat#6914), de acuerdo con el protocolo del fabricante o sus modificaciones por los expertos en el arte de extracción de polinucleótidos que puede mejorar la recuperación o la pureza del ADN extraído. Brevemente, se alícuota el tejido molido en un tubo Lysing Matrix E en hielo seco, se añaden 800 µ? de tampón SP1 a cada muestra, se homogeneiza en un batidor de perlas durante 35-45 seg, se incuba en hielo durante 45-60 seg, se centrifuga a >14000 rpm durante 1 min a TA, se añaden 10 microlitros de ARNasa A al lisado, se incuba a 65 °C durante 10 min, se centrifuga durante 1 min a TA, se añaden 280 µ? de tampón SP2 y se somete a vértex para mezclar, se incuba las muestras en hielo durante 5 min, se centrifuga a >10.000 g durante 10 min a TA, se transfiere el sobrenadante a una columna homogeneizadora en uri tubo de colección de 2 mi, se centrifuga a 10.000 g durante 2 min a TA, se transfiere el lisado clarificado en un tubo micrófugo de 1.5 mi, se añaden 1.5 volúmenes de tampón SP3 al lisado clarificado, se somete a vórtex inmediatamente para obtener una mezcla homogénea, se transfiere hasta 650 µ? de sobrenadante a la columna Hi-Bind, se centrifuga a 10.000 g durante 1 min, se repite, se aplican 100 µ? a tampón de elución a 65 °C a la columna, se centrifuga a 10.000 g durante 5 min a TA.
Los secuenciadores de ADN de la próxima generación, tales como 454-FLX (Roche, Branford, CT), SOLiD (Applied Biosystems) y Genome Analyzer (HiSeq2000, lllumina, San Diego, CA) se usaron para proporcionar secuencia de polinucleótidos del ADN y ARN extraído de los tejidos de planta. Los datos en bruto de las secuencias se reunieron en contigs. La secuencia de contigs se usó para identificar moléculas disparadoras que se pueden aplicar a la planta para permitir la regulación de la expresión génica.
EJEMPLO 2 Polinucleótidos relacionados con las moléculas disparadoras del gen ALS Las secuencias génicas y fragmentos del Cuadro 1 se dividieron en longitudes de 200 polinucleótidos (200-meros) con regiones superpuestas de 25 polinucleótidos (SEQ ID NO: 46-1363 y 1789^4166). Estos polinucleótidos se ensayan para seleccionar las regiones disparadoras más eficaces a lo largo de toda secuencia blanco. Los polinucleótidos disparadores se construyen como ssADN o ssARN, dsARN o dsADN o híbridos de dsADN/ARN y se combinan con un agente de transferencia a base de organosilicio para proporcionar una preparación de polinucleótido. Los polinucleótidos se combinan en grupos de dos de tres polinucleótidos por grupo, usando 4-8 nmol de cada polinucleótido. Cada grupo de polinucleótidos se prepara con el agente de transferencia y se aplica a una planta o un campo de plantas en combinación con un herbicida inhibidor de ALS o seguido de un tratamiento con inhibidor de ALS uno a tres días después de la aplicación del polinucleótido, para determinar el efecto sobre la susceptibilidad de la planta al inhibidor de ALS. El efecto se mide impidiendo el crecimiento y/o matando la planta y se mide 8-14 días después del tratamiento con el grupo de polinucleótidos y inhibidor de ALS. Los grupos más eficaces se identifican y los polinucleótidos individuales se ensayan en los mismos métodos que los grupos y se identifican los 200-meros individuales más eficaces. La secuencia de 200-meros se divide en secuencias más pequeñas de regiones de 50-70-meros con regiones de superposición de 10-15 polinucleótidos y los polinucleótidos ensayados de forma individual. El 50-70-mero más eficaz luego se divide en secuencias más pequeñas de regiones de 25-meros con una región de superposición de 12 a 13 polinucleótidos y se ensaya respecto de la eficacia en combinación con tratamiento con inhibidor de ALS. Por este método es posible identificar un oligonucleótido o varios oligonucleótidos que son la molécula disparadora más eficaz para efectuar la sensitividad de la planta a un inhibidor de ALS o modulación de expresión génica de ALS. La modulación de expresión génica de ALS se determina por detección de moléculas de siARN de ALS específicas del gen ALS o por observación de una reducción en la cantidad de transcripto de ARN de ALS producido respecto de una planta no tratada o meramente observando el fenotipo anticipado de la aplicación del disparador con un herbicida inhibidor de ALS. La detección de siARN se puede llevar a cabo, por ejemplo, usando kits tales como mirVana (Ambion, Austin TX) y mirPremier (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).
Las secuencias génicas y fragmentos del Cuadro 1 se comparan y se identifican 21-meros de polinucleótidos contiguos que tienen homología a través de diversas secuencias génicas de ALS. La finalidad consiste en identificar moléculas disparadoras que son de utilidad como moléculas herbicidas o en combinación con un herbicida inhibidor de ALS a través de un rango amplio de especies de malezas. Las secuencias SEQ ID NO: 1364- 1691 y 4167-4201 representan los 21-meros que están presentes en los genes de subunidad grande y subunidad pequeña de ALS de al menos siete de las especies de malezas del Cuadro 1. Se contempla que 21-meros adicionales se pueden seleccionar de las secuencias del Cuadro 1 que son específicos de una única especie de malezas o algunas especies de malezas dentro de un género o moléculas disparadoras que tienen una longitud de al menos 18 nucleótidos contiguos, al menos 19 nucleótidos contiguos, al menos 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y al menos el 85% idéntico a una secuencia génica de subunidad grande de ALS o secuencia génica de subunidad pequeña de ALS o una combinación de ambas seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-45 y 1692-1788.
Por este método es posible identificar un oligonucleótido o varios oligonucleótidos que son la molécula disparadora más eficaz para efectuar la sensitividad de la planta a un inhibidor de ALS o modulación de expresión génica de ALS. La modulación de expresión génica de ALS se determina por detección de moléculas de siARN de ALS específicas del gen ALS o por observación de una reducción en la cantidad de transcripto de ARN de ALS producido respecto de una planta no tratada. La detección de siARN se puede llevar a cabo, por ejemplo, usando kits tales como mirVana (Ambion, Austin TX) y mirPremier (Sigma-Aldrích, St Louis, MO).
EJEMPLO 3 Métodos relacionados con el tratamiento de plantas o partes de plantas con una mezcla tópica de las moléculas disparadoras para la expresión génica de modulación de ALS Fragmentos de ADN o ARN monocaternarios o bicatenarios en orientación con sentido o antisentido se identifican y se mezclan con un agente de transferencia y otros componentes en la composición de la invención. Esta composición se aplica tópicamente a plantas para efectuar expresión de genes blanco de ALS en la planta especificada para obtener el efecto deseado sobre el crecimiento o el desarrollo.
En este ejemplo, se trataron las plantas de Amaranthus palmeri en crecimiento con una composición aplicada tópicamente para inducir la modulación de un gen blanco en una planta que incluye (a) un agente para el acondicionamiento de una planta para transferir de los polinucleótidos y (b) polinucleótidos que incluyen al menos una cadena de polinucleótido de ssADN que incluye al menos un segmento de 18-21 nucleótidos contiguos del gen blanco en orientación con sentido (S). Se trataron plantas de Amaranthus palmeri con una solución adyuvante aplicada tópicamente que comprende un pool de oligonucleótidos ALS2 de ssADN mostrados en el Cuadro 2 que son esencialmente homólogos o esencialmente complementarios de la secuencia promotora del gen ALS2 de Amaranthus palmeri, solución al 0.5% de Silwet L-77, 2% de sulfato de amonio y 20 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 6.8). El nombre de cada molécula disparadora está en la columna izquierda y la secuencia de la molécula disparadora se muestra en la columna derecha.
CUADRO 2 Polinucleótidos disparadores promotores de ssADN-ALS2 Las plantas de Amaranthus palmeri de aproximadamente cuatro semanas de edad cultivadas en invernadero (Palmer amaranth resistente a glifosato, "R-22") se usaron en estos ensayos. Las plantas se trataron por pulverización en un invernadero con la composición de oligonucleótido ssADN ALS2/solución al 0.5% de Silwet L-77/2% de sulfato de amonio/20 mM de fosfato de sodio, la concentración de cada oligonucleótido era de aproximadamente 16 nmol. Las soluciones de pulverización se prepararon el mismo día como pulverización y se aplicaron usando un pulverizador con una boquilla FLATfan 9501 E a 165 psi (libras/pulgadas cuadradas) a una tasa de 93 g/ha (gramos/hectárea). La composición de oligonucleótido ssADN ALS2 se aplicó y fue seguido 24 horas más tarde por el tratamiento con herbicida, Staple® (sal sódica del ácido 2-clorc— 6-{(4,6-dimetoxi-2-pirimidinil)tio}benzoico, piritiobac sodio al 85%, Dupont, Wilmington, DE) a ¼ X tasa (27 g ai/ha (gramos de ingrediente activo por hectárea) para las plantas tratadas con oligonucleótido ssADN ALS2 y 1X tasa (108 g ai/ha) para las plantas no tratadas, cinco replicaciones por tratamiento y los datos se presentan como porcentaje en altura del control no tratado. La altura de la planta se determina siete días después del tratamiento con herbicida.
Las plantas resultantes tratadas con Staple® solo a 27 g ai/ha (1/4X tasa de campo) mostraban un retraso moderado del crecimiento, causando una reducción de entre el 30% y el 35% del crecimiento en comparación con el control no tratado. Las plantas tratadas con Staple® a 108 g ai/ha (1X tasa de campo) mostró una reducción del 40% de crecimiento. Las plantas tratadas con oligonucleótidos ssADN ALS2 seguido de Staple® a 27 g ai/ha a 1 h o 24 h mostraron un significativo aumento de crecimiento en comparación de Staple® solo. De esta manera, el tratamiento con oligonucleótido ssADN ALS2 seguido de Staple® a 1 h y 24 h causó una reducción del crecimiento del 50% y 60%, respecto del control no tratado, mientras que Staple® solo a 27 (1 h y 24 h) y 108 (24 h) g ai/ha provocó una reducción del crecimiento del 35%, 30% y 40%, respectivamente. Una fotografía de las plantas tratadas se muestra en la Figura 1. Moléculas disparadoras individuales que mejoran la actividad del inhibidor herbicida de ALS se seleccionaron repitiendo el ensayo con los oligonucleótidos individuales o sus combinaciones, por ejemplo, se determinó que ALS_pro_S1 (SEQ ID NO:4202) era una molécula disparadora efectiva. La molécula disparadora de ALS_pro_ S1 dsADN se aplicó al inhibidor de plantas resistentes a ALS de Palmer amaranth (A3, herbicida inhibidor de biotipo ALS) seguido de herbicidas del inhibidor de ALS 1X Staple® a 108 g ai/ha o 2X Classic® (Chlorimuron Ethyl 25DF, Dupont, Willmington, DE, 2X tasa es 70 g ai/ha) a + COC (concentrado de aceite de cultivo) 24 horas después de la aplicación del disparador. Los resultados del tratamiento demuestran que la molécula disparadora de ALS_pro_S1 mejoraba sustancialmente la actividad de los herbicidas Staple® y Classic® en plantas resistentes al inhibidor de ALS, Figura 2.
EJEMPLO 4 Ensayo de retraso del crecimiento de molécula disparadora reunida como subunidad grande de ALS Los pools de moléculas disparadoras (ALStile) se ensayaron a través del gen de subunidad grande de ALS para seleccionar las moléculas disparadoras efectivas. Plantas de Amaranthus palmeri crecidas en invernadero de aproximadamente cuatro semanas de edad (3—4 pulgadas de alto) (Palmer amaranth A3) se usaron en estos ensayos. Las plantas se trataron por pulverización en un invernadero con la composición de ALStile, donde cada composición tiene seis oligonucleótidos disparadores (Cuadro 3) y una formulación que comprende solución al 1% de Silwet L-77, 2% de sulfato de amonio y 20 mM de fosfato de sodio y la concentración de cada oligonucleótido era de aproximadamente 4 nmol. Las soluciones de pulverización se prepararon el mismo día como pulverización y se aplicaron usando un pulverizador con una boquilla FLATfan 9501E a 165 psi (libras/pulgadas cuadradas) a una tasa de 93 g/ha (gramos/hectárea). La composición de oligonucleótido reunida de dsADN de ALStile se aplicó y fue seguida 24 horas más tarde por el tratamiento con herbicida, Staple® (sal sódica del ácido 2-cloro-6— {(4,6-dimetoxi-2-pirimidinil)tio}benzoico, piritiobac sodio al 85%, Dupont, Wilmington, DE) a 108 g/ha (gramos por hectárea), cinco replicaciones por tratamiento y los datos se presentan como un puntaje visual de porcentaje de lesión determinado 14 días después de la aplicación de herbicida.
Los resultados de estos ensayos identificaron tres pools con actividad mejoradora de herbicida respecto del control de la formulación sobre el biotipo A3, eran ALStile13-18 (SEQ ID NO:4218-4223), ALStile19-24 (SEQ ID NO:4224^229) y ALStile61-66 (SEQ ID NO:4230^I235) y ALSpro_S1 (SEQ ID NO:4202, identificados como un disparador efectivo del Ejemplo 3). Las moléculas disparadoras individuales efectivas se pueden aislar de los pools y combinar de ser necesario con otras moléculas disparadoras efectivas seleccionadas para mejorar la actividad herbicida inhibidora de ALS.
CUADRO 3 Ensayo de azulejado de moléculas disparadoras para gen de subunidad grande de ALS de Palmer amaranth EJEMPLO 5 Ensayo de azulejado de moléculas disparadoras reunidas en gen de subunidad pequeña de ALS Pools de moléculas disparadoras (ALSprotile) se ensayaron para cuestionar a través del promotor de gen de subunidad pequeña de ALS para seleccionar moléculas disparadoras efectivas. Aproximadamente, plantas de Amaranthus palmeri de 2-4 pulgadas de alto R-22 crecidas en invernadero (R-22) se usaron en estos ensayos. Las plantas se trataron por pulverización en un invernadero con la composición ALSprotile, donde cada composición tiene seis oligonucleótidos disparadores (Cuadro 4) y una formulación que comprende solución al 1% de Silwet L-77, 2% de sulfato de amonio y 20 mM de fosfato de sodio y la concentración de cada oligonucleótido era de aproximadamente 4 nmol. Las soluciones de pulverización se prepararon el mismo día como pulverización y se aplicaron usando un pulverizador con una boquilla FLATfan 9501 E a 165 psi (libras/pulgadas cuadradas) a una tasa de 93 g/ha (gramos/hectárea). La composición oligonucleótido reunida de dsADN ALSprotile se aplicó y fue seguida 24 horas más tarde por el tratamiento con herbicida, Staple® a 108 g/ha (gramos por hectárea), cinco replicaciones por tratamiento y los datos se presentan como un puntaje visual de porcentaje de lesión determinado 14 días después de la aplicación de herbicida. Los resultados de estos ensayos identificaron dos pools con actividad mejoradora de herbicida respecto del control de formulación en el biotipo A3, eran ALSprot¡le1-6 (SEQ ID NO:4236^241) y ALSprotile7-12 (SEQ ID NO:4242-4247) que demostraron una lesión del 67% y 62%, respetuosamente. Las moléculas disparadoras efectivas individuales se pueden aislar de los pools y se combinan de ser necesario con otras moléculas disparadoras efectivas seleccionadas para mejorar la actividad del herbicida inhibidor de ALS.
CUADRO 4 Ensayo de azulejado de moléculas disparadoras para el promotor del gen de subunidad pequeña de ALS de Palmer amaranth EJEMPLO 6 Un método para controlar malezas en un campo Un método para controlar las malezas en un campo comprende el uso de polinucleótidos disparadores que pueden modular la expresión de un gen de ALS en una o varias de especies de plantas herbáceas blanco. Un análisis de secuencias génicas de ALS de 18 especies de plantas dio una colección de polinucleótidos 21-meros que se pueden usar en composiciones para afectar el crecimiento o desarrollo o sensibilidad al herbicida inhibidor de ALS para controlar múltiples especies de malezas en un campo. Una composición con 1 ó 2 ó 3 ó 4 ó más de los polinucleótidos de SEQ ID NO: 1364-1691 y 4167-4201 permitiría una amplia actividad de la composición contra las múltiples especies de malezas que es producen en un ambiente de campo.
El método incluye la creación de una composición que comprende componentes que incluyen al menos un polinucleótido de SEQ ID NO: 1364-1691 y 4167-4201 o cualquier otra expresión génica efectiva que modula polinucleótido esencialmente idéntica o esencialmente complementario de SEQ ID NO:1-45 y 1692-1788 o su fragmento, un agente de transferencia que moviliza el polinucleótido en una célula vegetal y un herbicida inhibidor de ALS y opcionalmente un polinucleótido que modula la expresión de un gen esencial y opcionalmente un coherbicida que tiene un diferente modo de acción respecto a un herbicida inhibidor de ALS o un coherbicida que tiene un similar modo de acción de cualquier herbicida inhibidor de ALS y es un miembro de una familia química diferente. El polinucleótido de la composición incluye a dsARN, ssADN o dsADN o una de sus combinaciones. Una composición con un polinucleótido puede tener una tasa de uso de aproximadamente 1 a 30 gramos o más por acre según el tamaño del polinucleótido y la cantidad de polinucleótidos en la composición. La composición puede incluir uno o varios herbicidas adicionales según se requiera para proporcionar un control efectivo para malezas multiespecies.
Por ejemplo, una composición que comprende un gen de ALS disparador oligonucleótido, la composición también incluyen un coherbicida, pero sin limitación, acetoclor, acifluorfeno, acifluorfeno-sodio, aclonifeno, acroleína, alaclor, aloxidim, alcohol alílico, ametrina, amicarbazona, amidosulfurona, aminopiralida, amitrol, sulfamato de amonio, anilofos, asulam, atraton, atrazina, azimsulfurona, BCPC, beflubutamida, benazolina, benfluralina, benfuresato, bensulfurona, bensulfurona-metilo, bensulide, bentazona, benzfendizona, benzobiciclona, benzofenap, bifenox, bilanafos, bispiribac, bispiribac-sodio, bórax, bromacilo, bromobutide, bromoxinilo, butaclor, butafenacilo, butamifos, butralina, butroxidim, butilato, ácido cacodílico, clorato de calcio, cafenstrol, carbetamida, carfentrazona, carfentrazona-etilo, CDEA, CEPC, clorflurenol, clorflurenol-metilo, cloridazona, clorimurona, clorimurona-etilo, ácido cloroacético, clorotolurona, clorprofam, clorsulfurona, clortal, clorta l-di metilo, cinidona-etilo, cinmetilina, cinosulfurona, cisanilida, cletodim, clodinafop, clodinafop-propargilo, clomazona, clomeprop, clopiralida, cloransulam, cloransulam-metilo, CMA, 4-CPB, CPMF, 4-CPP, CPPC, cresol, cumilurona, cianamida, cianazina, cicloato, ciclosulfamurona, cicloxidim, cihalofop, cihalofop-butilo, 2,4-D, 3,4-DA, daimurona, dalapona, dazomet, 2,4-DB, 3,4-DB, 2,4-DEB, desmedifam, dicamba, diclobenilo, orto-diclorobenceno, para-diclorobenceno, diclorprop, diclorprop-P, diclofop, diclofop-metilo, diclosulam, difenzoquat, metilsulfato de difenzoquat, diflufenicano, diflufenzopir, dimefurona, dimepiperato, dimetaclor, dimetametrina, dimetenamida, dimetenamida-P, dimetipina, ácido dimetilarsínico, dinitramina, dinoterb, difenamida, diquat, dibromuro de diquat, ditiopir, diurona, DNOC, 3,4-DP, DSMA, EBEP, endotal, EPTC, esprocarb, etalfluralina, etametsulfurona, etametsulfurona-metilo, etofumesato, etoxifeno, etoxisulfurona, etobenzanida, fenoxaprop-P, fenoxaprop-P-etilo, fentrazamida, sulfato ferroso, flamprop-M, flazasulfurona, florasulam, fluazifop, fluazifop-butilo, fluazifop-P, fluazifop-P-butilo, flucarbazona, flucarbazona-sodio, flucetosulfurona, flucloralina, flufenacet, flufenpir, flufenpir-etilo, flumetsulam, flumiclorac, flumiclorac-pentilo, flumioxazina, fluometurona, fluoroglicofeno, fluoroglicofeno-etilo, flupropanato, flupirsulfurona, flupirsulfurona-metilo-sodio, flurenol, fluridona, fluorocloridona, fluoroxipir, flurtamona, flutiacet, flutiacet-metilo, fomesafeno, foramsulfurona, fosamina, glufosinato, glufosinato-amonio, halosulfurona, halosulfurona-metilo, haloxifop, haloxifop-P, HC-252, hexazinona, imazametabenz, imazametabenz-metilo, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquina, imazetapir, imazosulfurona, indanofano, yodometano, yodosulfurona, yodosulfurona-metil-sodio, ioxinilo, isoproturona, isourona, isoxabeno, isoxaclortol, isoxaflutol, karbutilato, lactofeno, leñadlo, linurona, MAA, MAMA, MCPA, MCPA-thioetilo, MCPB, mecoprop, mecoprop-P, mefenacet, mefluidide, mesosulfurona, mesosulfurona-metilo, mesotriona, metam, metamifop, metamitrona, metazaclor, methabenztiazurona, ácido metilarsónico, metildimrona, isotiocianato de metilo, metobenzurona, metolaclor, S-metolaclor, metosulam, metoxurona, metribuzina, metsulfurona, metsulfurona-metilo, MK-66, molinato, monolinurona, MSMA, naproanilida, napropamida, naptalam, neburona, nicosulfurona, ácido nonanoico, norflurazona, ácido oleico (ácidos grasos), orbencarb, ortosulfamurona, orizalina, oxadiargilo, oxadiazona, oxasulfurona, oxaziclomefona, oxifluorfeno, paraquat, dicloruro de paraquat, pebulato, pendimetalina, penoxsulam, pentaclorofenol, pentanoclor, pentoxazona, petoxamida, aceites de petróleo, fenmedifam, fenmedifam-etilo, picloram, picolinafeno, pinoxadeno, piperofos, arsenito de potasio, azida de potasio, pretilaclor, primisulfurona, primisulfurona-metilo, prodiamina, profluazol, profoxidim, prometona, prometrina, propaclor, propanilo, propaquizafop, propazina, profam, propisoclor, propoxicarbazona, propoxicarbazona-sodio, propizamida, prosulfocarb, prosulfurona, piraclonilo, piraflufeno, piraflufeno-etilo, pirazolinato, pirazosulfurona, pirazosulfurona-etilo, pirazoxifeno, piribenzoxim, piribufrcarb, piridafol, piridato, piriftalida, piriminobac, piriminobac-metilo, pirimisulfano, piritiobac, piritiobac-sodio, quinclorac, quinmerac, quinoclamina, quizalofop, quizalofop-P, rimsulfurona, setoxidim, sidurona, simazina, simetrina, SMA, arsenito de sodio, azida de sodio, clorato de sodio, sulcotriona, sulfentrazona, sulfometurona, sulfometurona-metilo, sulfosato, sulfosulfurona, ácido sulfúrico, aceites de alquitrán, 2,3,6-TBA, TCA, TCA-sodio, tebutiurona, tepraloxidim, terbacilo, terbumetona, terbutilazina, terbutrina, tenilclor, tiazopir, tifensulfurona, tifensulfurona-metilo, tiobencarb, tiocarbazilo, topramezona, tralkoxidim, tri-alato, triasulfurona, triaziflam, tribenuron, tribenurona-metilo, tricamba, triclopir, trietazina, trifloxisulfurona, trifloxisulfurona-sodio, trifluralina, triflusulfurona, triflusulfurona-metilo, trihidroxitriazina, tritosulfurona, éster etílico del ácido [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(-metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-,2,3,4-tetrahidropm^ piridiloxi]acético (CAS RN 353292-3-6), ácido 4-[(4,5-dihidro-3-metox -metil-5-oxo)-H-,2,4-triazol— ilcarbonil-sulfamoil]-5-metiltiofen-3-carboxílico (BAY636), BAY747 (CAS RN 33504-84-2), topramezona (CAS RN 2063-68-8), 4-hidroxi-3-[[2-[(2-metoxietoxi)metil]-6-(trifluoro-metil)-3-piridinil]carbonil]-biciclo[3.2.]oct-3-en-2-ona (CAS RN 35200-68-5) y 4-hidroxi-3-[[2-(3-metoxipropil)-6-(difluorometil)-3-piridinil]carbonil]-biciclo[3.2.]oct-3-en-2-ona.
Un campo de plantas de cultivo que necesitan de un control de malezas de plantas se trata por aplicación por pulverización de la composición. La composición se puede proporcionar como una mezcla en tanque, un tratamiento secuencial de componentes (en general, el polinucleótido seguido del herbicida), un tratamiento simultáneo o mezcla de uno o varios de los componentes de la composición de recipientes separados. El tratamiento del campo se puede producir cuando se requiera para proporcionar control de malezas y los componentes de la composición se pueden ajustar a especies de malezas específicas blanco o familias de malezas.
EJEMPLO 7 Composiciones herbicidas que comprende agentes pesticidas Se proporciona un método de control de malezas y plagas de plantas y patógenos en un campo de plantas de cultivo tolerantes al inhibidor de ALS, en donde el método comprende la aplicación de una composición que comprende un polinucleótido disparador de ALS, una composición herbicida inhibidora de ALS y una mezcla de un agente de control de plagas. Por ejemplo, la mezcla comprende insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, quimioesterilizantes, semioquímicos, repelentes, atrayentes, feromonas, estimulantes de la alimentación u otros compuestos biológicamente activos o agentes biológicos, tales como, microorganismos.
Por ejemplo, la mezcla comprende un compuesto fungicida para usar en una planta de cultivo tolerante a herbicida ALS para evitar o controlar la fitoenfermedad causada por un patógeno fúngico de planta. El compuesto fungicida de la mezcla puede ser un fungicida sistémico o de contacto o mezclas de cada uno. Más en particular, el compuesto fungicida incluye, pero sin limitación, miembros de los grupos químicos estrobilurinas, triazoles, cloronitrilos, carboxamidas y mezclas de ellos. La composición puede tener una mezcla adicional que comprende un compuesto o agente insecticida.
Los productos químicos agrícolas se proporcionan en recipientes apropiados para almacenamiento, transporte y distribución seguros, estabilidad de las composiciones químicas, mezcla con solventes e instrucciones de uso. Un recipiente de las composiciones de la presente invención pueden incluir una mezcla de un oligonucleótido disparador + herbicida inhibidor de ALS + compuesto fungicida o una mezcla de un oligonucleótido disparador + compuesto herbicida inhibidor de ALS y un compuesto insecticida o un oligonucleótido disparador + a compuesto herbicida inhibidor de ALS y un compuesto fungicida y un compuesto insecticida (por ejemplo, lambda-cihalotrina, Warrier®). El recipiente también puede proporcionar instrucciones acerca del uso efectivo de la mezcla. Los recipientes de la presente invención pueden ser de cualquier material que es apropiado para el almacenamiento de la mezcla química. Los recipientes pueden ser de cualquier material que es apropiado para el embarque de la mezcla química. El material puede ser de cartón, plástico, metal o un compuesto de estos materiales. El recipiente puede tener un volumen de 0.5 litros, 1 litro, 2 litros, 3-5 litros, 5-10 litros, 10-20 litros, 20-50 litros o más según la necesidad. Se proporciona una mezcla en tanque de un oligonucleótido disparador + compuesto herbicida inhibidor de ALS y un compuesto fungicida, los métodos de aplicación al cultivo para obtener una dosis efectiva de cada compuesto son conocidos por los expertos en el arte y se pueden retinar y luego desarrollar según el cultivo, condiciones climáticas y equipamiento de aplicación usado.
Insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, quimioesterilizantes, semioquímicos, repelentes, atrayentes, feromonas, estimulantes de la alimentación u otros compuestos biológicamente activos se pueden añadir al oligonucleótido disparador para formar un pesticida multicomponente para dar un espectro incluso más amplio de protección agrícola. Los ejemplos de tales protectores agrícolas con los que se pueden formular los compuestos de esta invención son: insecticidas tales como abamectina, acefato, azinfos-metilo, bifentrina, buprofezina, carbofurano, clorfenapir, clorpirifos, clorpirifos-metilo, ciflutrina, beta-ciflutrina, cihalotrina, lambda-cihalotrina, deltametrina, diafentiurona, diazinona, diflubenzurona, dimetoato, esfenvalerato, fenoxicarb, fenpropatrina, fenvalerato, fipronilo, flucitiinato, tau-fluvalinato, fonofos, imidacloprida, isofenfos, malation, metaldehído, metamidofos, metidationa, metomilo, metoprene, metoxiclor, 7-cloro-2,5-dihidro-2-[[N-(metoxicarbonil)-N-[4-(trifluorometoxi)fenil]amino]carbonil]indeno[1 ,2-e][1 ,3,4]oxadiazine-4a(3H)-carboxilato de metilo (DPX-JW062), monocrotofos, oxamilo, paration, paration-metilo, permetrina, forato, fosalona, fosmet, fosfamidona, pirimicarb, profenofos, rotenona, sulprofos, tebufenozide, teflutrina, terbufos, tetraclorvinfos, tiodicarb, tralometrina, triclorfona y triflumurona; con máxima preferencia, un compuesto de glifosato se formula con un compuesto fungicida o combinaciones de fungicidas, tales como azoxistrobina, benomilo, blasticidina-S, mezcla de Bordeaux (sulfato de cobre tribásico), bromuconazol, captafol, captano, carbendazim, cloroneb, clorotalonilo, oxicloruro de cobre, sales de cobre, cimoxanilo, ciproconazol, ciprodinilo (CGA 219417), diclomezina, diclorano, difenoconazol, dimetomorf, diniconazol, diniconazol-M, dodina, edifenfos, epoxiconazol (BAS 480F), famoxadona, fenarimol, fenbuconazol, fenpiclonilo, fenpropidina, fenpropimorf, fluazinam, fluquinconazol, flusilazol, flutolanilo, flutriafol, folpet, fosetil-aluminio, furalaxilo, hexaconazol, ipconazol, iprobenfos, iprodiona, isoprotiolano, kasugamicina, kresoxim-metilo, mancozeb, maneb, mepronilo, metalaxilo, metconazol, 7-benzotiazolcarbotioato de S-metilo (CGA 245704), miclobutanilo, neo-asozina (metanarsonato férrico), oxadixilo, penconazol, pencicurona, probenazol, procloraz, propiconazol, pirifenox, piroquilona, quinoxifeno, espiroxamina (KWG4168), azufre, tebuconazol, tetraconazol, tiabendazol, tiofanato-metilo, tiram, triadimefona, triadimenol, triciclazol, trifloxistrobina, triticonazol, validamicina y vinclozolina; combinaciones de fungicidas son comunes, por ejemplo, ciproconazol y azoxistrobina, difenoconazol y metalaxil-M, fludioxonil y metalaxil-M, mancozeb y metalaxil-M, hidróxido de cobre y metalaxil-M, ciprodinilo y fludioxonilo, ciproconazol y propiconazol; formulaciones fungicidas asequibles en comercios para control de la enfermedad de la roña de soja asiática incluyen, pero sin limitación, Quadris® (Syngenta Corp), Bravo® (Syngenta Corp), Echo 720® (Sipcam Agro Inc), Headline® 2.09EC (BASF Corp), Tilt® 3.6EC (Syngenta Corp), PropiMax™ 3.6EC (Dow AgroSciences), Bumper® 41.8EC (MakhteshimAgan), Folicur® 3.6F (Bayer CropScience), Laredo® 25EC (Dow AgroSciences), Laredo™ 25EW (Dow AgroSciences), Stratego® 2.08F (Bayer Corp), Domark™ 125SL (Sipcam Agro USA) y Pristine®38%WDG (BASF Corp) se pueden combinar con composiciones tal como se describe en la presente invención para proporcionar mejor protección de enfermedad de la roña de soja; nematicidas tales como aldoxicarb y fenamifos; bactericidas tales como estreptomicina; acaricidas tales como amitraz, quinometionato, clorobencilato, cihexatina, dicofol, dienoclor, etoxazol, fenazaquina, óxido de fenbutatina, fenpropatrina, fenpiroximato, hexitiazox, propargita, piridabeno y tebufenpirad; y agentes biológicos tales como Bacillus thuringiensis, delta endotoxina de Bacillus thuringiensis, baculovirus y bacterias, virus y hongos entomopatogénicos.
CUADRO 1 Secuencias contig de cADN y gADN de gen de acetolactato sintasa ATTCGATGGAGTAGCGGATCGTTCTTCACTTTTTGCTC GGG AG GTATC AATGGC GTAAATTTTTTTTGGAGACTGA CTCAAATGGGATTCTTTGTGTAGTGTACAGCTTCACTT ACCACAGGAACACAGGTGTTTTTTGCTATATAGGTACA GAAACTCGGAAAAGTCCACATTTACTCTATAACTTCATT TACGGTCTAAAAGTAGTTGAGAAGGTAAAATTTAGGAT GCAATTTTTTGAAAGCTTTCTATGATAGCAAATTCTTAC TTTTTATTTCTACTGGTAATTGTCATTTTGTCAATGTCCT TTGCAAAGACTAATTTTACAGACTTGTTATTTTCGTTTA AAATGTTTCGTATGATACCGAACCAGAAAGAGAAACAA GAAATTCGGGCGAA I I I I I CTCGTCATATGTTAGATCG AAACCATATGATCAGCTTGATCTTGGTTGTACTGGTGT ATTGATTTTCATGGTAAATGTCAATATTTTCATGGTAAA CAACTTGGGTGCCAATTTTGTTAGGGTTAGATTTGGTG CTGCTTTTGAATCAGAGATGAAATCAGCCGAGAAATGA AGATAAATTGGGGTGATTTTGCAAAATAGTTTGTCTGTT AATTTTAACTTATATTTGTTACATTCTTTGTTACTTGCAC CATTGTTGACTTTGGTACTATTCATCAAGCAAATCGACT TTCATATTGTCGGTAATCTATAAAATAAAATATAGTTTTC TGAGATCTTGTTGAATCGTCTCGATTCAACGGTTATTAA I I I I I AGTTTTCATAATTTTTTGATATGTATAATAAAAGA TATTAACAATTGATATCCTGTATTTGGGGTACGAAAAAG CAAATAGTGCAAGTAAAAAAGAACGGAGGAAGTACATG 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Claims (31)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. Un método de control de plantas que comprende: tratamiento de una planta con una composición que comprende un polinucleótido y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia génica de ALS o su fragmento o a un transcripto de ARN de dicha secuencia génica de ALS o su fragmento, en donde dicha secuencia génica de ALS está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-45 y 1692-1788 o su fragmento de polinucleótido, en donde dicho crecimiento o desarrollo de la planta o capacidad reproductiva se reduce o dicha planta es más sensible a un herbicida inhibidor de ALS respecto a una planta no tratada con dicha composición.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho agente de transferencia es una composición o compuesto tensoactivo de organosilicio contenidos dentro.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho fragmento de polinucleótido tiene una longitud de 18 nucleótidos contiguos, 19 nucleótidos contiguos, 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y al menos el 85 por ciento idéntico a una secuencia génica de ALS seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1^5 y 1692-1788.
4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho fragmento de polinucleótido está seleccionado del grupo que consiste en ssADN o ssARN, dsARN o dsADN o híbridos de dsADN/ARN sentido o anti-sentido.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha planta está seleccionada del grupo que consiste en Amaranthus palmeri, Amaranthus rudis, Amaranthus clorostachys, Amaranthus graecizans, Amaranthus hybridus, Amaranthus lividus, Amaranthus spinosus, Amaranthus thunbergii, Amaranthus viridis, Ambrosia trífida, Kochia scoparia, Abutilón theophrasti, Chenopodium álbum, Commelina diffusa, Conyza candensis Digitaria sanguinalis Euphorbia heterophylla y Lolium multiflorum.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha composición también comprende dicho herbicida inhibidor de ALS y aplicación externa a una planta con dicha composición.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicha composición también comprende uno o varios herbicidas diferentes de dicho herbicida inhibidor de ALS.
8. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha composición comprende cualquier combinación de dos o más de dichos fragmentos de polinucleótido y aplicación externa a una planta con dicha composición.
9. Una composición que comprende un polinucleótido y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia génica de ALS o su fragmento o a un transcripto de ARN de dicha secuencia génica de ALS o su fragmento, en donde dicha secuencia génica de ALS está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-45 y 1692-1788 o su fragmento de polinucleótido y en donde una planta tratada con dicha composición tiene su crecimiento o desarrollo o capacidad reproductiva regulada, suprimida o retrasada o dicha planta es más sensible a un herbicida inhibidor de ALS como resultado de dicho polinucleótido que contiene la composición respecto a una planta no tratada con dicha composición.
10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicho agente de transferencia es una composición de organosilicio.
1 1. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicho fragmento de polinucleótido tiene una longitud de 18 nucleótidos contiguos, 19 nucleótidos contiguos, 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y al menos el 85% idéntico a una secuencia génica de ALS seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1^l5 y 1692-1788.
12. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicho polinucleotido está seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 46-1363 y 1789-4166.
13. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicho polinucleotido está seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1364-1691 y 4167-4201.
14. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque también comprende un herbicida inhibidor de ALS.
15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dicha molécula de inhibidor de ALS está seleccionada del grupo que consiste en amidosulfurona, azimsulfurona, bensulfurona-metilo, clorimurona-etilo, clorsulfurona, cinosulfurona, ciclosulfamurona, etametsulfurona-metilo, etoxisulfurona, flazasulfurona, flupirsulfurona-metilo-Na, foramsulfurona, halosulfurona-metilo, imazosulfurona, yodosulfurona, metsulfurona-metilo, nicosulfurona, oxasulfurona, primisulfurona-metilo, prosulfurona, pirazosulfurona-etilo, rimsulfurona, sulfometurona-metilo, sulfosulfurona, tifensulfurona-metilo, tríasulfurona, tribenurona-metilo, trifloxisulfurona, triflusulfurona-metilo, tritosulfurona, imazapic, imazametabenz-metilo, imazamox, imazapir, imazaquina, imazetapir, cloransulam-metilo, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, bispiribac-Na, piribenzoxim, piriftalida, piritiobac-Na, piriminobac-metilo, flucarbazona-Na y procarbazona-Na.
16. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque también comprende un coherbicida.
17. Un método de reducción de la expresión de un gen de ALS en una planta que comprende: aplicación externa a una planta de una composición que comprende un polinucleótido y un agente de transferencia, en donde dicho polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una secuencia génica de ALS o su fragmento o al transcripto de ARN de dicha secuencia génica de ALS o su fragmento, en donde dicha secuencia génica de ALS está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-45 y 1692-1788 o su fragmento de polinucleótido, en donde dicha expresión de dicho gen de ALS está reducida respecto a una planta a la que no se aplicó la composición.
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho agente de transferencia es un compuesto de organosilicio.
19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho fragmento de polinucleótido tiene una longitud de 19 nucleótidos contiguos, 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y al menos el 85 por ciento idéntico a una secuencia génica de ALS seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-45 y 1692-1788.
20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicha molécula de polinucleótido está seleccionada del grupo que consiste en ssADN o ssARN, dsARN o dsADN o híbridos de dsADN/ARN sentido o anti-sentido.
21. Un cásete de expresión microbiana que comprende un fragmento de polinucleótido de una longitud de 18 nucleótidos contiguos, 19 nucleótidos contiguos, 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y es al menos el 85 por ciento idéntico a una secuencia génica de ALS seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-45 y 1692-1788.
22. Un método de preparación de un polinucleótido que comprende a) transformación del cásete de expresión microbiano de acuerdo con la reivindicación 21 en un microbio; b) cultivo de dicho microbio; c) recolección de un polinucleótido de dicho microbio, en donde dicho polinucleótido tiene una longitud de 18 nucleótidos contiguos, 19 nucleótidos contiguos, 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y es al menos el 85 por ciento idéntico a una secuencia génica de ALS seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-45 y 1692-1788.
23. Un método de identificación de polinucleótidos de utilidad en la modulación de expresión génica de ALS cuando se trata externamente una planta que comprende: a) proporcionar una pluralidad de polinucleótidos que comprenden una región esencialmente idéntica o esencialmente complementaria de un fragmento de polinucleótido de una longitud de 18 nucleótidos contiguos, 19 nucleótidos contiguos, 20 nucleótidos contiguos o al menos 21 nucleótidos contiguos y es al menos el 85 por ciento idéntico a una secuencia génica de ALS seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-45 y 1692-1788; b) tratar externamente dicha planta con uno o varios de dichos polinucleótidos y un agente de transferencia; c) analizar dicha planta o extracto para modulación de expresión génica de ALS y en donde una planta tratada con dicha composición tiene su crecimiento o desarrollo o capacidad reproductiva regulada, suprimida o retrasada o dicha planta es más sensible a un herbicida de inhibidor de EPSPS como resultado de dicho polinucleótido que contiene la composición respecto a una planta no tratada con dicha composición.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicha planta está seleccionada del grupo que consiste en Amaranthus palmen, Amaranthus rudis, Amaranthus clorostachys, Amaranthus graecizans, Amaranthus hybridus, Amaranthus lividus, Amaranthus spinosus, Amaranthus thunbergii, Amaranthus viridis, Ambrosia trífida, Kochia scoparía, Abutilón theophrasti, Chenopodium álbum, Commelina diffusa, Conyza candensis Digitaria sanguinalis Euphorbia heterophylla y Lolium multiflorum.
25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicha expresión génica de ALS se reduce respecto a una planta no tratada con dicho fragmento de polinucleótido y un agente de transferencia.
26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicho agente de transferencia es un compuesto de organosilicio.
27. Una composición química agrícola que comprende una mezcla de un polinucleótido y un herbicida de glifosato y un coherbicida, en donde dicho polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una porción de una secuencia génica de ALS o una porción de un transcripto de ARN de dicha secuencia génica de ALS, en donde dicha secuencia génica de ALS está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-45 y 1692-1788 o su fragmento de polinucleótido y en donde una planta tratada con dicha composición tiene su crecimiento o desarrollo o capacidad reproductiva regulada, suprimida o retrasada o dicha planta es más sensible a un herbicida inhibidor de ALS como resultado de dicho polinucleótido que contiene la composición respecto a una planta no tratada con dicha composición.
28. La composición química agrícola de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque dicho coherbicida está seleccionado del grupo que consiste en herbicidas de amida, herbicidas de arsénico, herbicidas de benzotiazol, herbicidas de benzoilciclohexandiona, herbicidas de benzofuranilalquilsulfonato, herbicidas de carbamato, herbicidas de ciclohexenoxima, herbicidas de ciclopropilisoxazol, herbicidas de dicarboximída, herbicidas de dinitroanilina, herbicidas de dinitrofenol, herbicidas de éter difenílico, herbicidas de ditiocarbamato, herbicidas alifáticos halogenados, herbicidas de imidazolinona, herbicidas inorgánicos, herbicidas de nitrilo, herbicidas de organofósforo, herbicidas de oxadiazolona, herbicidas de oxazol, herbicidas de fenoxi, herbicidas de fenilendiamina, herbicidas de pirazol, herbicidas de piridazina, herbicidas de piridazinona, herbicidas de piridina, herbicidas de pirimidindiamina, herbicidas de pirimidiniloxibencilamina, herbicidas de amonio cuaternario, herbicidas de tiocarbamato, herbicidas de tiocarbonato, herbicidas de tiourea, herbicidas de triazina, herbicidas de triazinona, herbicidas de triazol, herbicidas de triazolona, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de uracilo y herbicidas de urea.
29. Una composición química agrícola que comprende una mezcla de un polinucleótido y un herbicida de glifosato y un pesticida, en donde dicho polinucleótido es esencialmente idéntico o esencialmente complementario a una porción de una secuencia génica de ALS o a su fragmento o una porción de un transcripto de ARN de dicha secuencia génica de ALS o a su fragmento, en donde dicha secuencia génica de ALS está seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-45 y 1692-1788 o su fragmento de polinucleótido y en donde una planta tratada con dicha composición tiene su crecimiento o desarrollo o capacidad reproductiva regulada, suprimida o retrasada o dicha planta es más sensible a un herbicida inhibidor de ALS como resultado de dicho polinucleótido que contiene la composición respecto a una planta no tratada con dicha composición.
30. La composición química agrícola de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque dicho pesticida está seleccionado del grupo que consiste en insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, quimioesterilizantes, semioquímicos, repelentes, atrayentes, feromonas, estimulantes de la alimentación y biopesticidas.
31. Una molécula de polinucleótido aplicada a la superficie de una planta que mejora la sensibilidad de dicha planta a una composición herbicida que contiene glifosato, en donde dicho polinucleótido comprende un polinucleótido homólogo o complementario que tiene al menos 85 por ciento de identidad con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:4202 y 4218^1247.
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