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TW201723174A - 重組蛋白質的製造方法 - Google Patents

重組蛋白質的製造方法 Download PDF

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TW201723174A
TW201723174A TW105128498A TW105128498A TW201723174A TW 201723174 A TW201723174 A TW 201723174A TW 105128498 A TW105128498 A TW 105128498A TW 105128498 A TW105128498 A TW 105128498A TW 201723174 A TW201723174 A TW 201723174A
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TW
Taiwan
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culture
medium
tocilizumab
recombinant protein
protein
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Application number
TW105128498A
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English (en)
Inventor
野野村和彦
內藤克紀
広瀬二郎
Original Assignee
持田製藥股份有限公司
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
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    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract

一種托珠單抗(tocilizumab)的製造方法，其係包含：將分泌托珠單抗之動物細胞以屬於提升重組蛋白質之糖鏈的半乳糖基化度之培養基之含有大豆水解物之培養基進行培養；以及自培養動物細胞所獲得之培養液中單離出托珠單抗。

Description

重組蛋白質的製造方法
本發明係關於重組蛋白質的製造方法、動物細胞培養用培養基、及重組蛋白質的純化方法。
抗體或生理活性物質等許多重組蛋白質已藉由基因重組加以生產，並作為醫藥品加以開發、販售。
重組蛋白質係因應其種類，培養方法或純化方法有所不同，製造並不容易。針對重組蛋白質的製造方法，係列舉托珠單抗(tocilizumab)為例加以說明。
托珠單抗為對抗人類介白素6(IL-6)受體之抗體，其係類風濕性關節炎等涉及IL-6之疾患之治療藥。
托珠單抗係將分泌托珠單抗之動物細胞進行培養，並將其培養液進行純化而獲得。作為用於托珠單抗等的培養之培養基，已知包含魚肉的酵素分解物之培養基(專利文獻1)或使大豆蛋白質水解物與酵母萃取物以特定比例混合而成之培養基(專利文獻2)等。此外，作為自培養液中單離出托珠單抗之方法，已知使用親和層析之方法。具 體而言，已知將用於使結合至親和層析管柱之托珠單抗溶離之酸性溶離液的莫耳濃度、及將該溶離液進行中和所獲得之中性溶液的莫耳濃度調整成特定的範圍，使DNA夾雜物強制性地沉澱，而將托珠單抗進行純化之方法(專利文獻3、4)等。
此外，已知存在於重組蛋白質之分子中之糖鏈會對重組蛋白質的體內動態、活性或免疫原性帶來重要的影響。舉例而言，已知在重組蛋白質之中，在重鏈的Fc部分之天冬醯胺殘基具有N-結合型糖鏈之抗體等係取決於此N-結合型糖鏈的構成，體內動態、安全性等會有所變動(非專利文獻1)。
〔先前技術文獻〕 〔專利文獻〕
〔專利文獻1〕國際公開第99/063058號
〔專利文獻2〕日本專利特表2002-520014號公報
〔專利文獻3〕國際公開第2002/072615號
〔專利文獻4〕日本專利特開2009-62380號公報
〔非專利文獻〕
〔非專利文獻1〕Eon-Duval, A. et. Al. Biotechnol. Prog. 2012, 28, 608-622
在另一方面，已明瞭會發生藉由培養條件附加至重組蛋白質之糖鏈的半乳糖基化度不同等之事態。
此外，若欲進行使DNA夾雜物強制性地沉澱而將重組蛋白質進行純化，則會發生最終所獲得之重組蛋白質的含量減低之問題。
如此，針對重組蛋白質的製造方法，需要更進一步的技術開發。
本發明之課題為提供重組蛋白質的製造方法，其係包含使用提升重組蛋白質之糖鏈的半乳糖基化度之培養基來培養動物細胞之方法。
此外，作為另一課題，本發明之課題為提供可期待能表現出與市售之Actemra(註冊商標)同等的體內動態行為且顯示出特定的糖鏈構成比之托珠單抗。
此外，作為另一課題，本發明之課題為提供能夠利用作為培養基成分之大豆水解物之新用途。
再者，作為另一課題，本發明之課題為提供將由動物細胞所分泌之重組蛋白質輕易地進行純化，並以較高的產率進行回收之方法。
本發明係如下。
<1>一種托珠單抗的製造方法，其係包含將分泌托珠單抗之動物細胞在含有大豆水解物之培養基中進行培 養；以及自培養動物細胞所獲得之培養液中單離出托珠單抗。
<2>如<1>所記載之製造方法，其中，托珠單抗為顯示出26%~56%G(0)、17%~37%G(1)-1、0%~19%G(1)-2及0%~18%G(2)的糖鏈構成比之托珠單抗。
<3>如<1>或<2>所記載之製造方法，其中，培養基不含大豆水解物以外之蛋白質水解物或酵母萃取物。
<4>如<1>至<3>中任一項所記載之製造方法，其中，自培養動物細胞所獲得之培養液中單離出托珠單抗係包含：將培養液供至蛋白A的親和層析管柱；自親和層析管柱溶離出所吸附之托珠單抗；以及將包含托珠單抗之溶離液的鹽濃度調整成110mM~170mM。
<5>如<4>所記載之製造方法，其中，將溶離液的鹽濃度調整成115mM~160mM。
<6>一種動物細胞培養用培養基，其係用於產生顯示出26%~56%G(0)、17%~37%G(1)-1、0%~19%G(1)-2及0%~18%G(2)的糖鏈構成比之托珠單抗者，其係包含大豆水解物、以及完全合成培養基。
<7>如<6>所記載之培養基，其中，不含大豆水解物以外之蛋白質水解物或酵母萃取物。
<8>一種動物細胞培養用培養基，其係用於提升動物細胞所產生之重組蛋白質之糖鏈的半乳糖基化度者，其係含有大豆水解物。
<9>一種重組蛋白質的純化方法，其係包含：將培養分泌重組蛋白質之動物細胞所獲得之培養液供至蛋白A的親和層析管柱；自親和層析管柱溶離出所吸附之重組蛋白質；以及將包含重組蛋白質之溶離液的鹽濃度調整成110mM~170mM。
<10>如<9>所記載之純化方法，其中，將溶離液的鹽濃度調整成115mM~160mM。
根據本發明，係提供下述任一效果。
根據本發明，可提供重組蛋白質的製造方法，其係包含使用提升重組蛋白質之糖鏈的半乳糖基化度之培養基來培養動物細胞之方法。
此外，根據本發明，可提供可期待能表現出與市售之Actemra同等的體內動態行為且顯示出特定的糖鏈構成比之托珠單抗。
此外，根據本發明，可提供能夠利用作為培養基成分之大豆水解物提升動物細胞所產生之重組蛋白質之糖鏈的半乳糖基化度之新用途。
再者，根據本發明，可提供將由動物細胞所分泌之重組蛋白質輕易地進行純化，並以較高的產率進行回收之方法。
以下，針對本發明詳細地進行說明。
<托珠單抗的製造方法>
本發明中之製造方法之特徵為將分泌托珠單抗之動物細胞在含有大豆水解物之培養基中進行培養(培養步驟)。較佳為包含培養步驟、以及自培養動物細胞所獲得之培養液中單離出托珠單抗(單離步驟)之方法。此外，本發明中之製造方法係除了培養步驟及單離步驟以外，亦可包含其他步驟。
本發明中之製造方法能夠顯現出可提升重組蛋白質之糖鏈的半乳糖基化度之效果。
(培養步驟)
在培養步驟中，培養動物細胞時之培養液的溫度、培養液的pH值、培養液中之溶氧濃度、培養液的攪拌數、培養日數等條件係只要依動物細胞的種類予以設定即可。舉例而言，在使用CHO細胞作為分泌托珠單抗之動物細胞之情況，只要在30℃至40℃的溫度、6.5至7.7的pH值、10%至80%溶氧濃度、20rpm至150rpm的攪拌條件下，培養10日至28日即可，但並不限定於此條件。
作為培養溫度，可列舉例如30℃至40℃，較佳為32℃至39℃，更佳為33℃至38℃。
作為培養時之pH值，可列舉例如6.5至7.7的pH值，較佳為6.7至7.5的pH值，更佳為7.0至7.5的pH 值。
作為培養日數，可列舉例如10日至28日，較佳為11日至21日，更佳為13日至15日。
較佳係以動物細胞密度成為1×105個細胞/mL~5×105個細胞/mL之方式進行接種，更佳係以成為2×105個細胞/mL~4×105個細胞/mL之方式進行接種。此外，藉由例如培養10日至28日，細胞密度係暫時上升，然後便降低，在降低至例如動物細胞密度為1×106個細胞/mL時，便可停止培養，較佳係在降低至2×106個細胞/mL時便停止培養，更佳係在降低至3×106個細胞/mL時便停止培養。
動物細胞的培養方法可分類成批次培養法(batch culture)、連續培養法(continuous culture)、饋料批次培養法(fed-batch culture)。在本發明中，可使用任何培養方法，較佳係使用饋料批次培養法或連續培養法，特佳係使用饋料批次培養法。
批次培養法為將少量種培養液加至培養基中，在未於培養中加入新的培養基、排出培養液之情形下，使細胞增殖之培養方法。
連續培養法為將少量種培養液加至培養基中後，於培養中連續地加入培養基，且使其連續地排出之培養方法。另外，在連續法中，亦包含灌流培養(perfusion culture)。
饋料批次培養法亦稱為半批次培養法(semi-batch culture)，其係於培養中連續地或逐次地加入培養基，但並未施行如連續培養法般之連續的培養液排出之培養方 法。在饋料批次培養時所加入之培養基(以下，亦稱為「饋料批次培養基」)不須為與先前培養時所使用之培養基(以下，亦稱為「初始培養基」)相同的培養基，可添加不同的培養基，亦可僅添加特定的成分。
在本發明中，初始培養基係指在細胞培養之最初的階段所使用之培養基。惟，在將饋料批次培養基分成複數次添加之情況，亦可將各自添加饋料批次培養基前之培養基稱為初始培養基。
在本發明中，從能夠提升重組蛋白質之糖鏈的半乳糖基化度之觀點而言，較佳係使用含有大豆水解物之培養基(以下，亦稱為「含大豆水解物培養基」)作為初始培養基。
在本發明中，係使用含大豆水解物培養基作為初始培養基，於33℃至38℃的溫度、7.0至7.5的pH值下，培養至少3日以上，較佳為5日以上，更佳為10日以上，再佳為13日至15日。此外，針對在初始培養基中之大豆水解物的含量，係如後述，只要例如為0.5g/L至30g/L即可。除此以外，較佳係以動物細胞的細胞密度成為1×105個細胞/mL~5×105個細胞/mL之方式進行接種並使用初始培養基進行培養。另外，在本發明中，較佳係施行在開始培養起例如第3、5、7、9、11日分離取得培養液，並添加適量的Feed培養基之饋料批次培養。再者，較佳為在所分離取得之培養液中之葡萄糖濃度降低時，適宜添加葡萄糖(Roche公司等)之培養方法。
在本發明中，在使用饋料批次培養法或連續培養法之情況，作為於培養途中所添加之培養基，可使用含大豆水解物培養基，亦可使用不含大豆水解物之培養基。另外，從培養液中之滲透壓之觀點而言，更佳係使用不含大豆水解物之培養基當作於培養途中所添加之培養基。
托珠單抗只要是具有與一般市售之Actemra(註冊商標)之H鏈的胺基酸序列(Gln1-Gly448)及L鏈的胺基酸序列(Asp1-Cys214)相同的胺基酸序列者即可。另外，Actemra之H鏈的胺基酸序列(Glu1-Gly448)及L鏈的胺基酸序列(Asp1-Cys214)係記載於國際公開第2005/090405號所附之序列表中。
此外，H鏈之N末端殘基亦可為焦麩胺酸(Pyroglutamic acid；pGlu)以代替麩胺酸。H鏈之C末端殘基亦可到447之脯胺酸(Pro)為止以代替448個胺基酸殘基，亦可為在第448個甘胺酸(Gly)附加有離胺酸(Lys)之449個胺基酸殘基。
此外，托珠單抗只要是以下表1所示之G(0)、G(1)-1、G(1)-2及G(2)所表示之糖鏈之中，至少任2者係每1抗體分子結合至重鏈的299位之天冬醯胺殘基(Asn)即可。關於結合至托珠單抗之重鏈的299位之Asn之糖鏈，藉由以含有大豆水解物之培養基培養動物細胞，相較於以不含大豆水解物之培養基培養動物細胞時而言，存在有1個半乳糖之G(1)-1或G(1)-2 的存在量、或存在有2個半乳糖之G(2)的存在量之中，至少1種的存在量係增加。
已知糖鏈會對在體內之代謝、中和活性、效應機能等帶來影響，在糖鏈構成比不同之情況，即便在使用具有相同的胺基酸序列之抗體之情況，亦會有體內動態行為不同之情形。
作為本發明中之較佳態樣，從能夠表現出與一般市售之Actemra同樣的體內動態行為之觀點而言，托珠單抗較佳係顯示出26%~56%G(0)、17%~37%G(1)-1、0%~19%G(1)-2及0%~18%G(2)的糖鏈構成比。此外，更佳係顯示出30%~50%G(0)、19%~35%G(1)-1、1%~17%G(1)-2及0%~16%G(2)的糖鏈構成比。
另外，托珠單抗的糖鏈構成比係只要藉由Synapt G2(Waters公司)、PA800 Plus(Beckman Coulter公司) 等予以測定即可。
藉由PA800 Plus進行分析之後，市售之Actemra的糖鏈構成比為41%G(0)、27%G(1)-1、9%G(1)-2及8%G(2)。
作為動物細胞，只要是能夠分泌托珠單抗者，即無特別限制。具體而言，可列舉以包含編碼出托珠單抗之核酸分子之表現載體轉形而成之動物細胞。在此處，包含編碼出托珠單抗之核酸分子之表現載體的製作方法及轉形方法係只要依據例如國際公開第92/019759號及國際公開第2005/090405號所記載之方法即可。
此外，作為動物細胞，較佳為經株化之細胞，特佳為哺乳動物細胞，可列舉例如由中國倉鼠卵巢組織所樹立之CHO細胞株及其亞種，例如CHO-K1細胞株(Kao F,Chasin L,Puck TT.Proc Natl Acad Sci USA.1969 Dec；64(4)：1284-91)，特定而言，二氫葉酸還原酵素(DHFR)缺損株，例如CHO-DG44細胞株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.：Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980))等。具體而言，可列舉CHO細胞(ATCC No.CRL-9618)、COS-1細胞(ATCC No.CRL-1650)、293細胞(ATCC No.CRL-1573)、BHK-21細胞(ATCC No.CCL-10)。此外，作為市售品，亦可使用CHO DG44(Thermo公司)等。
培養基係只要含有大豆水解物即可。
大豆水解物只要是將大豆、脫脂大豆或大豆成分等 (以下，亦稱為「大豆等」)以蛋白酶等酵素或酸進行水解所獲得之成分即可。此外，大豆水解物亦稱為大豆蛋白水解物、水解大豆蛋白等，在本發明中，將對大豆等進行水解所獲得之成分總稱為大豆水解物。
大豆水解物係固體、粉末、液體皆可，從操作容易性之觀點而言，較佳為粉末或液體。
作為大豆水解物，並無特別限定，可列舉Soy Hydrolysate UF溶液(50X)(SAFC公司製，型錄編號# 58903C)、HyClone HyQ Soy Hydrolysate Solution(GE Healthcare公司製，SH30357.01)等。
培養基中之大豆水解物的含量並無特別限定，從提升半乳糖基化度之觀點而言，較佳係相對於培養基1L而言，為0.5g/L至30g/L，更佳為1g/L至20g/L，再佳為3g/L至10g/L。初始培養基中之大豆水解物的含量從提升半乳糖基化度之觀點而言，較佳係相對於培養基1L而言，為0.5g/L至30g/L，更佳為1g/L至20g/L，再佳為3g/L至10g/L。
此外，培養基較佳係含有完全合成培養基(Chemical-defined培養基)作為基礎培養基。作為完全合成培養基，並無特別限定，可列舉CD FortiCHO(註冊商標)Medium(GIBCO公司，型錄編號A11483-01)、CD OptiCHO(GIBCO公司，型錄編號12681-011)、CD DG44 Medium(GIBCO公司，型錄編號12610-010)、HyCell CHO(GE Healthcare公司，型錄編號 SH30934.01)、BalanCD(註冊商標)CHO GROWTH A(Irvine公司，型錄編號91128)、S CHO-CD XP(註冊商標)(Irvine公司，型錄編號91120)、JX G016(Irvine公司)等。
作為完全合成培養基，可使用1種完全合成培養基，亦可組合使用2種或2種以上之完全合成培養基。
在使用Feed培養基時，Feed培養基的種類並無特別限定，可列舉例如JX Feed001(Irvine公司型錄編號JX F001)、JX Feed002(Irvine公司型錄編號JX F002)、JX Feed003(Irvine公司型錄編號JX F003)、JX Feed004(Irvine公司型錄編號JX F004)、EfficientFeed(註冊商標)A+AGT(註冊商標)Supplement(GIBCO公司，型錄編號A2502304)、EfficientFeed(註冊商標)B+AGT(註冊商標)Supplement(GIBCO公司，型錄編號A2503004)、EfficientFeed(註冊商標)C+AGT(註冊商標)Supplement(GIBCO公司，型錄編號A2503104)、Cell Boost 1(R05.2)Supplement(GE Healthcare公司，型錄編號SH30584.02)、Cell Boost 2(R15.4)Supplement(GE Healthcare公司，型錄編號SH30596.01)、Cell Boost 3(JM3.5)Supplement(GE Healthcare公司，型錄編號SH30825.01)、Cell Boost 4(PS307)Supplement(GE Healthcare公司，型錄編號SH30857.01)、Cell Boost 5(CN-F)Supplement(GE Healthcare公司，型錄 編號SH30865.01)、Cell Boost 6(CN-T)Supplement(GE Healthcare公司，型錄編號SH30866.01)、BalanCD(註冊商標)CHO FEED 1(Irvine公司，型錄編號91127-1L)、BalanCD(註冊商標)CHO FEED 2(Irvine公司，型錄編號91129-1 L)、BalanCD(註冊商標)CHO FEED 3(Irvine公司，型錄編號99471-1L)。
Feed培養基可使用1種或組合使用2種以上。
另外，培養基從減低未知成分，並減少所生成之蛋白質的構造不同等風險之觀點而言，較佳係不含大豆水解物以外之蛋白質水解物或酵母萃取物，更佳係不含大豆水解物以外之蛋白質水解物及酵母萃取物。
培養基係除了大豆水解物以外，亦可含有其他成分。作為其他成分，可列舉胺基酸、維生素類、脂質類、糖類、微量金屬類等。
(單離步驟)
在本發明中之製造方法中，單離步驟係自培養動物細胞所獲得之培養液中單離出托珠單抗，其可包含將培養動物細胞而得之培養液供至蛋白A的親和層析管柱(吸附步驟)；自親和層析管柱溶離出所吸附之托珠單抗(溶離步驟)；以及將包含托珠單抗之溶離液的鹽濃度調整成莫耳濃度為110mM~170mM(調整步驟)。再者，單離步驟亦可包含其他步驟。在此處，單位為M(莫耳濃度)且mM為10-3mol/L。
本發明中之單離步驟並不需要用於使包含DNA夾雜物之沉澱不會生成之沉澱物去除步驟，能夠顯現出可將托珠單抗輕易地進行純化，並以較高的產率進行回收之效果。
吸附步驟只要是將培養液供至蛋白A的親和層析管柱即可，只要依管柱的種類等，適宜設定管柱之平衡化溶液、管柱之洗淨溶液、培養液之流速條件、培養液之吸附條件、培養液之洗淨條件、雜質等之供出條件等即可。
舉例而言，在使用MabSelect SuRe LX(GE Healthcare Japan公司，型錄編號17-5474-02)作為蛋白A的親和層析管柱之情況，在將培養液供至蛋白A的親和層析管柱時，只要設定成pH 5~8等之條件即可。
吸附步驟亦可包含在將培養液供至親和層析管柱前，測定培養液中之托珠單抗濃度。
在吸附步驟中，在將培養液供至親和層析管柱時，只要以培養中之托珠單抗濃度成為例如50mg/mL管柱~100mg/mL管柱之方式進行調整即可。另外，供至管柱之培養液的濃度之範圍只要因應管柱的種類而設定即可，並無特別限制。
培養液中之托珠單抗濃度可藉由ELISA法、表面電漿子共鳴法、Cedex Bio HT(Roche公司)等測定人類IgG濃度予以求出。
吸附步驟亦可包含在將培養液供至親和層析 管柱後，將管柱未吸附之蛋白質洗淨。將管柱未吸附之蛋白質洗淨時所使用之洗淨溶液可依管柱的種類而適宜設定。舉例而言，洗淨溶液只要設定成1mol/L NaCl之條件即可。
此外，吸附步驟係除此以外，亦可包含將微弱地結合至管柱之雜質洗淨。將微弱地結合至管柱之雜質洗淨時所使用之洗淨溶液可依管柱的種類而適宜設定。
溶離步驟只要是自親和層析管柱溶離出所吸附之托珠單抗即可，可依管柱的種類等，設定溶離液的種類、溶離部分的採取、將微弱地結合至管柱之雜質洗淨之條件等。
舉例而言，在使用MabSelect SuRe LX(GE Healthcare Japan公司，型錄編號17-5474-02)作為蛋白A的親和層析管柱之情況，藉由使用pH 4.5以下的溶離液，便可自親和層析管柱溶離出所吸附之托珠單抗。
溶離步驟所使用之溶離液可使用例如100mM Gly-HCl緩衝液(pH 3.5)、100mM檸檬酸緩衝液(pH 3.5)、磷酸檸檬酸緩衝液(MacIlvaine)。此外，溶離液亦可進一步包含變性劑或有機溶媒等。
調整步驟只要是將包含托珠單抗之溶離液的鹽濃度調整成110mM~170mM即可。此外，溶離液的鹽濃度較佳係調整成115mM~160mM，更佳係調整成120mM~150mM。
在使鹽濃度成為高於170mM之濃度之情況，若在調 整步驟以後之步驟中施行經由離子交換層析等之處理，則會有在該處理後雜質(源自宿主細胞之蛋白質、DNA、脂多醣、凝集體等)的含量增加之疑慮。
溶離液的鹽濃度可使用1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.0)、HEPES、MOPS、Tricine、HEPPSO、TAPS等緩衝液進行調整。
另外，調整後之溶離液的pH值較佳為中性附近。調整後之溶離液的pH值從等電點以及除了去除雜質以外尚防止變性之觀點而言，可列舉調整成較佳為pH 6至pH 8之範圍，更佳為pH 7至pH 8之範圍，再佳為pH 7.5至pH 8之範圍。
作為單離步驟所能夠使用之蛋白A的親和層析管柱，種類等並無限制，可使用市售品。
作為市售品，可使用例如MabSelect SuRe LX(GE Healthcare Japan公司，型錄編號17-5474-02)、Prosep Ultra Plus(Merck Millipore公司，型錄編號175118822)。
本發明中之製造方法係除了培養步驟及單離步驟以外，亦可進一步包含例如藉由加溫處理將病毒去活化(病毒去活化步驟)；藉由離子交換層析去除雜質(雜質去除步驟I)；藉由疏水層析、離子交換層析、凝膠過濾、混合模式層析去除雜質(雜質去除步驟II)；去除病毒，並進行過濾滅菌(病毒去除滅菌步驟)；將溶媒進行置換(溶媒置換步驟)；將經純化所獲得之純化液進行濃縮(濃縮步驟)。
此等步驟可因應安定性、回收率、雜質的去除效率等條件，依照常法而適宜設定。
<產生托珠單抗之動物細胞用培養基>
本發明中之產生托珠單抗之動物細胞用培養基(以下，亦稱為「托珠單抗產生用培養基」)係含有大豆水解物、以及完全合成培養基。此外，本發明中之托珠單抗產生用培養基係除了大豆水解物及完全合成培養基以外，亦可含有其他成分。
另外，在托珠單抗產生用培養基中，托珠單抗係意味顯示出26%~56%G(0)、17%~37%G(1)-1、0%~19%G(1)-2及0%~18%G(2)的糖鏈構成比之托珠單抗。
本發明中之托珠單抗產生用培養基係顯現出能夠產生可期待能夠表現出與市售之Actemra同樣地優異的體內動態行為且顯示出特定的糖鏈構成比之托珠單抗之效果。
托珠單抗產生用培養基係只要含有大豆水解物及完全合成培養基即可，從減低未知成分，並減少所生成之蛋白質的構造不同等風險之觀點而言，較佳係不含大豆水解物以外之蛋白質水解物或酵母萃取物，更佳係不含大豆水解物以外之蛋白質水解物及酵母萃取物。
此外，托珠單抗產生用培養基亦可含有胺基酸、維生素類、脂質類、糖類、微量金屬類等其他成分。
針對其他事項，可應用托珠單抗的製造方法之段落中 前述之事項。
<重組蛋白質>
在後述之動物細胞培養用培養基及重組蛋白質的製造方法中，重組蛋白質係指由應用重組DNA技術進行轉形而成之細胞所生產之蛋白質。重組蛋白質只要是動物細胞所表現出之重組蛋白質即可，若為由動物細胞所分泌之重組蛋白質則較佳，重組蛋白質的種類並無特別限制。較佳為例如能夠使用作為醫藥品之重組蛋白質。此外，作為重組蛋白質，較佳為具有糖鏈之重組蛋白質。此外，可為具有糖鏈之抗體，亦可為在分子中包含具有糖鏈之抗體之重組蛋白質。
作為能夠使用作為醫藥品之重組蛋白質，可列舉例如達貝泊汀(darbepoetin)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)、帕利珠單抗(palivizumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、巴利昔單抗(basiliximab)、吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、貝伐單抗(bevacizumab)、替伊莫單抗替坦(ibritumomab tiuxetan)、托珠單抗、阿達木單抗(adalimumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、依庫珠單抗(eculizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、優特克單抗(ustekinumab)、戈利木單抗(golimumab)、卡那單抗(canakinumab)、地諾單抗(denosumab)、莫格穆里 單抗(mogamulizumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、曲妥珠單抗恩星(trastuzumab emtansine)、貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)、那他珠單抗(natalizumab)、納武單抗(nivolumab)、阿倫單抗(alemtuzumab)、蘇金單抗(secukinumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、依那西普(etanercept)、阿巴西普(abatacept)、及阿柏西普(aflibercept)，但並不限定於此等。
此外，作為重組蛋白質，較佳為曲妥珠單抗、利妥昔單抗、帕利珠單抗、英夫利昔單抗、巴利昔單抗、吉妥珠單抗奧唑米星、貝伐單抗、替伊莫單抗替坦、托珠單抗、阿達木單抗、西妥昔單抗、蘭尼單抗、奧馬珠單抗、依庫珠單抗、帕尼單抗、優特克單抗、戈利木單抗、卡那單抗、地諾單抗、莫格穆里單抗、奧法木單抗、帕妥珠單抗、曲妥珠單抗恩星、貝倫妥單抗維多汀、那他珠單抗、納武單抗、阿倫單抗、蘇金單抗、雷莫蘆單抗、伊匹單抗、依那西普、阿巴西普、及阿柏西普，更佳為曲妥珠單抗、托珠單抗、阿達木單抗、優特克單抗、戈利木單抗、及地諾單抗。
作為在此處所謂的糖鏈，可列舉O-結合型糖鏈或N-結合型糖鏈等，重組蛋白質較佳係具有至少N-結合型糖鏈。作為糖鏈，若為抗體則更佳為結合至抗體分子的Fc部分之N-結合型糖鏈。
<動物細胞培養用培養基>
本發明中之動物細胞培養用培養基係含有大豆水解物。此外，動物細胞培養用培養基亦可含有完全合成培養基或其他成分。
本發明中之動物細胞培養用培養基係藉由含有大豆水解物而能夠顯現出提升動物細胞所產生之重組蛋白質之糖鏈的半乳糖基化度之新穎的效果。在此處，提升半乳糖基化度係意味在重組蛋白質中之結合至天冬醯胺殘基之N-結合型糖鏈的非還原末端所表現之半乳糖的存在比例提升。較佳係意味構成N-結合型糖鏈之糖鏈之中，在非還原末端具有半乳糖之糖鏈的比例增加。具體而言，係意味相較於以不含大豆水解物之培養基培養動物細胞時而言，以含有大豆水解物之培養基培養動物細胞係如上述表1所示，相較於不存在有半乳糖之G(0)的存在比例而言，存在有1個半乳糖之G(1)-1或G(1)-2的存在比例、或存在有2個半乳糖之G(2)的存在比例之任1者係提升。半乳糖基化度有無提升係使用不含大豆水解物以外之蛋白質水解物及酵母萃取物之培養基進行確認。
此外，半乳糖基化度的提升可例如為將G(0)、G(1)-1、G(1)-2及G(2)之合計量定為100%時，G(1)-1、G(1)-2及G(2)之合計量的存在比例(以下，亦稱為「合計存在比例」)成為30%~70%，較佳係合計存在比例成為40%~60%，更佳係成為45%~55 %，再佳係成為50%~55%。
如此，藉由使用本發明中之動物細胞培養培養基，能夠顯現出控制糖鏈的半乳糖基化度之效果。此外，動物細胞培養培養基係如實施例中所詳述，能夠與用於進行培養之培養裝置的容量無關地，在不會受到培養環境的變化影響之情形下，顯現出提升半乳糖基化度之效果。
本發明之動物細胞培養用培養基係只要含有大豆水解物及完全合成培養基即可，從減低未知成分，並減少所生成之蛋白質的構造不同等風險之觀點而言，較佳係不含大豆水解物以外之蛋白質水解物或酵母萃取物，更佳係不含大豆水解物以外之蛋白質水解物及酵母萃取物。
本發明之動物細胞培養用培養基可適合用於上述重組蛋白質的培養。
作為動物細胞，只要是能夠表現重組蛋白質者，即無特別限制。具體而言，可列舉以包含編碼出重組蛋白質之核酸分子之表現載體轉形而成之動物細胞。
作為動物細胞培養用培養基中所含有之其他成分，可列舉胺基酸、維生素類、脂質類、糖類、微量金屬類等。
針對動物細胞培養用培養基中所含有之大豆水解物，可依樣地應用托珠單抗的製造方法之段落中前述之事項。另外，動物細胞所產生之重組蛋白質之糖鏈可藉由前述Synapt G2(Waters)、PA800 Plus(Beckman Coulter)進行測定。
針對其他事項，可適用在托珠單抗的製造方法之段落 中前述之事項。
<重組蛋白質的純化方法>
本發明中之重組蛋白質的純化方法係只要包含將培養動物細胞而成之培養液供至蛋白A的親和層析管柱(吸附步驟)；自親和層析管柱溶離出所吸附之重組蛋白質(溶離步驟)；以及將該包含重組蛋白質之溶離液的鹽濃度調整成110mM~170mM(調整步驟)即可。再者，純化方法亦可包含其他步驟。
本發明中之純化方法能夠顯現出可將由動物細胞所分泌之重組蛋白質輕易地進行純化，並以較高的產率進行回收之效果。
本發明之重組蛋白質的純化方法可適合用於上述重組蛋白質的純化。
調整步驟從等電點、雜質的去除能力、回收率、安定性之觀點而言，較佳係將溶離液的鹽濃度調整成115mM~160mM，更佳係調整成120mM~150mM。
動物細胞較佳為以包含編碼出重組蛋白質之核酸分子之表現載體轉形而成之動物細胞。
包含編碼出重組蛋白質之核酸分子之表現載體的製作方法及轉形方法係只要依據例如國際公開第92/019759號所記載之方法即可。
本發明之重組蛋白質的純化方法亦可為進一步包含將分泌重組蛋白質之動物細胞在含有大豆水解物之 培養基中進行培養(培養步驟)之重組蛋白質的製造方法。重組蛋白質的培養方法係除了培養會表現包含托珠單抗或其他重組蛋白質之上述重組蛋白質之動物細胞以外，針對培養步驟、吸附步驟、溶離步驟、pH調整步驟、及其他步驟，可適用在托珠單抗的製造方法之段落中前述之事項。
藉由以下實施例進一步詳述本發明，但本發明不應限定於此等實施例加以理解。在本說明書中，%的標示在沒有特別記載之前提下為質量%。
〔實施例〕
(實施例1)30mL培養
依據國際公開第92/019759號及國際公開第2005/090405號所記載之方法，將使用FuGENE(註冊商標)6 Transfection Reagent(Promega公司)作為轉形體製作試藥調製而成之產生托珠單抗之CHO細胞在包含8mM L-麩醯胺酸及青黴素(penicillin)、鏈黴素(streptomycin)之JX G016(可由Irvine公司購入)培養基中施行培養。
為了確認大豆水解物對所表現之重組蛋白質之效果，準備不含大豆水解物之培養基、以及以所有培養液量成為2%(5g/L)之方式添加Soy Hydrolysate UF溶液(50X)(SAFC公司製，型錄編號# 58903C)而成之培 養基。
產生托珠單抗之CHO細胞係在各培養基中以成為3×105個細胞/mL之方式進行接種，於125mL的艾氏燒瓶(Erlenmeyer flask)中以30mL規模施行振動培養(125rpm)(37℃、5%CO2存在下)。
在培養第3、5、7、9及11日，分離取得1.8mL的培養液，添加Feed培養基(JX Feed003(Irvine公司，型錄編號JX F003))1.8mL。所分離取得之培養液係用於各種成分的分析，在培養液中之葡萄糖濃度降低之情況係適宜添加葡萄糖。
將培養第14日之細胞液施行離心分離操作(2000g×10min)、及過濾器過濾操作，培養上清液中所包含之托珠單抗係藉由詳述於實施例3之方法進行純化，並實施分析。純化蛋白質之糖鏈係藉由Synapt G2(Waters公司)進行分析。將結果示於表2。另外，表中之標記為G0F、G1F、G1F’及G2F之糖鏈係各自具有表1所示之G(0)、G(1)-1、G(1)-2及G(2)之糖鏈構造。
由表2之結果，可確認相較於未添加大豆水 解物之培養基而言，藉由將大豆水解物添加至培養基中，糖鏈的半乳糖基化度係提升。
此外，在使用CD FortiCHO Medium(Gibco公司，型錄編號A11483-01)作為基礎培養基來代替JX G016(Irvine)培養基之情況，亦獲得同樣的結果。
此外，另外對含有大豆水解物0%、1%(2.5g/L)、2%(5g/L)及4%(10g/L)之各培養基中之對於糖鏈的半乳糖基化度之影響進行檢討之結果，可確認相較於大豆水解物的含量為0%及1%之培養基而言，以其為2%及4%之培養基進行培養，糖鏈的半乳糖基化度係提升。另外，將大豆水解物的含量為2%之培養基、與其為4%之培養基進行比較之後，可確認糖鏈的半乳糖基化度係大致同等。
如上述，大豆水解物係顯現出能夠提升糖鏈的半乳糖基化度之新穎的效果。
(實施例2)10L培養
為了確認大豆水解物的效果是否亦可適應大規模培養，依據國際公開第92/019759號及國際公開第2005/090405號所記載之方法，將使用FuGENE(註冊商標)6 Transfection Reagent(Promega公司)作為轉形體製作試藥調製而成之產生托珠單抗之CHO細胞3株(A、B、C)於全容量15L的生物反應器中施行培養。
以包含2%Soy Hydrolysate UF溶液(50X)(SAFC 公司製，型錄編號# 58903C)、8mM L-麩醯胺酸及青黴素、鏈黴素之JX G016(Irvine公司)培養基施行培養。
產生托珠單抗之CHO細胞3株係在各培養基中以成為3×105個細胞/mL之方式進行接種，於全容量15L培養槽(ABLE公司製)中以初期培養液量7.5L施行攪拌培養(37℃、50%DO、25~30rpm、pH 7.05~7.35)。
在培養第3、5、7、9及11日分離取得30mL的培養液，然後，添加Feed培養基(JX Feed003)。Feed培養基係以添加Feed培養基後之濃度成為所有培養液量之6%之方式進行添加。
所分離取得之培養液係用於各種成分的分析，在培養液中之葡萄糖濃度降低之情況係適宜添加葡萄糖。
將培養第14日之細胞液用於純化。培養上清液中所包含之托珠單抗係藉由詳述於實施例3之方法進行純化，並實施純化蛋白質之糖鏈分析。將結果示於表3。
純化蛋白質之糖鏈係藉由PA800 Plus(Beckman Coulter公司)進行分析。另外，藉由PA800 Plus進行分析之後，市售之Actemra的糖鏈構成比為41%G(0)、27%G(1)-1、9%G(1)-2及8%G(2)。
由表3之結果，可確認細胞株A~C所產生之托珠單抗的糖鏈構成比係與市售之Actemra的糖鏈構成比大致同等。
如上述，藉由使用本發明所涉及之製造方法，可製造顯示出與Actemra的糖鏈構成比同等的糖鏈構成比之托珠單抗。
(實施例3)純化方法
使用藉由實施例2所詳述之方法所獲得之培養上清液依以下順序實施托珠單抗的純化。另外，純化係使用AKTA Avant 150(GE Healthcare Japan公司)於室溫實施。
針對所獲得之培養上清液以Millistak+Pod(Merk Millipore公司，型錄# MD0HC027H1或MD0HC054H1)作為前置過濾器，並以Express SHF Opticap XL3囊式(Merck Millipore公司，型錄# KGEPA03HH3)或PES膜囊匣式過濾器(ADVANTEC公司，型錄# CCS-020-E1H)作為滅菌過濾器將培養液進行澄清化。
將所獲得之培養上清液供至預先以1×D-PBS (Sigma-Aldrich公司，型錄# D1408)平衡化之蛋白A的親和層析管柱(MabSelect SuRe LX(GE Healthcare Japan公司，型錄# 17-5474-02)管柱( 4.4cm×19.4cm))。然後，以相同緩衝液將未吸附之成分洗淨後，以100mmol/L Gly-HCl緩衝液(pH 3.5)將托珠單抗進行溶離並加以匯集。於所獲得之溶離液之匯集物中添加1.5mol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)，並以鹽濃度成為120mmol/L之方式進行調整。施行40℃、4小時加熱處理，進行病毒去活化。
加熱處理後，將病毒去活化液之匯集物供至預先以120mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)平衡化之Q-Sepharose FF(GE Healthcare Japan公司，型錄# 17-0510-01)管柱( 4.4cm×19.2cm)，將未吸附之成分以相同緩衝液洗淨並加以匯集為中間純化液(托珠單抗部分)。將此中間純化液之匯集物之溶媒置換成20mmol/L磷酸鈉緩衝液(pH 6.5)，供至陶瓷羥磷灰石Type II 80μm(Bio-Rad Laboratories公司，型錄# 157-8000)管柱( 5cm×21.6cm)，以相同緩衝液將未吸附之成分洗淨後，以包含260mmol/L NaCl之20mmol/L磷酸緩衝液(pH 6.5)將托珠單抗進行溶離並加以匯集為雜質去除液。將所獲得之雜質去除液之匯集物使用截留分子量30kDa的Hydrosart Sartocon Slice Cassette膜(Saltorius Stedim公司，型錄# 3051445901E-SG)進行濃縮後，將溶媒置換成生理食鹽液(大塚製藥工場股份有限公司，型 錄# 1760)，使用Stericup GP過濾器(Merck Millipore公司，型錄# SCGPU05RE)進行滅菌過濾，獲得最終純化液。
測定本純化方法所獲得之最終純化液的單體純度及殘留DNA量。將結果示於表4。單體純度係使用SEC(尺寸排除層析)(東曹公司製管柱)進行測定。殘留DNA量係使用HCDNA(Certal CHO Detection Kit)(QIAGEN公司製)依循實驗程序進行測定。
在單離步驟之過程中，藉由將溶離液的鹽濃度調整成120mM，便不會生成含有DNA夾雜物之粒子之沉澱。此外，可確認藉由此單離步驟所獲得之最終純化液中所包含之托珠單抗亦無混入DNA夾雜物等之問題，在實用化上品質方面並無問題。
此外，在上述步驟中，於溶離液之匯集物中添加1.5mol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)並以鹽濃度成為150mmol/L之方式進行調整之情況，亦獲得同樣的結果。
如上述，藉由使用本發明之製造方法，便可在不需要 進行沉澱物去除之情形下，將托珠單抗輕易地進行純化，並以較高的產率進行回收。

Claims (10)

  1. 一種托珠單抗的製造方法，其係包含：將分泌托珠單抗(tocilizumab)之動物細胞以含有大豆水解物之培養基進行培養；以及自培養動物細胞所獲得之培養液中單離出托珠單抗。
  2. 如請求項1之製造方法，其中，托珠單抗為顯示出26%~56%G(0)、17%~37%G(1)-1、0%~19%G(1)-2及0%~18%G(2)的糖鏈構成比之托珠單抗。
  3. 如請求項1或2之製造方法，其中，培養基不含大豆水解物以外之蛋白質水解物或酵母萃取物。
  4. 如請求項1至3中任一項之製造方法，其中，自培養動物細胞所獲得之培養液中單離出托珠單抗係包含：將培養液供至蛋白A的親和層析管柱；自親和層析管柱溶離出所吸附之托珠單抗；以及將包含托珠單抗之溶離液的鹽濃度調整成110mM~170mM。
  5. 如請求項4之製造方法，其中，將溶離液的鹽濃度調整成115mM~160mM。
  6. 一種動物細胞培養用培養基，其係用於產生顯示出26%~56%G(0)、17%~37%G(1)-1、0%~19%G(1)-2及0%~18%G(2)的糖鏈構成比之托珠單抗者，其係包含大豆水解物、以及完全合成培養基。
  7. 如請求項6之培養基，其係不含大豆水解物以外之蛋白質水解物或酵母萃取物。
  8. 一種動物細胞培養用培養基，其係用於提升動物細胞所產生之重組蛋白質之糖鏈的半乳糖基化度者，其係含有大豆水解物。
  9. 一種重組蛋白質的純化方法，其係包含：將培養分泌重組蛋白質之動物細胞所獲得之培養液供至蛋白A的親和層析管柱；自親和層析管柱溶離出所吸附之重組蛋白質；以及將包含重組蛋白質之溶離液的鹽濃度調整成110mM~170mM。
  10. 如請求項9之純化方法，其中，將溶離液的鹽濃度調整成115mM~160mM。
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