MX2011010158A

MX2011010158A - Anticuerpos biespecificos anti-erbb-2/anti-c-met.

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Publication number: MX2011010158A
Application number: MX2011010158A
Authority: MX
Inventors: Ulrich Brinkmann; Pablo Umana; Birgit Bossenmaier; Wolfgang Schaefer; Christian Klein; Juergen Michael Schanzer; Gerhard Niederfellner; Claudio Sustmann
Original assignee: Roche Glycart Ag
Priority date: 2009-04-07
Filing date: 2010-03-30
Publication date: 2011-10-17
Also published as: JP5497887B2; SG175080A1; KR20110126748A; US20130273054A1; AU2010233995A1; KR20110124368A; WO2010115551A1; BRPI1014449A2; JP2012522523A; US20100254989A1; BRPI1014474A2; SG175078A1; CN102361884A; AR076194A1; AU2010233993A1; AR076195A1; JP2012522525A; IL214847A0; TW201039848A; CA2757669A1

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos contra la ErbB-2 humana y contra la c-Met humana, a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen tales anticuerpos y a usos de los mismos.

Description

ANTICUERPOS BIESPECIFICOS ANTI -ERBB-2/ANTI-C-MET Campo de la Invención La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos contra la ErbB-2 humana y contra la c-Met humana, a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen tales anticuerpos y a usos de los mismos .

Antecedentes de la Invención Proteínas de la familia ErbB La familia de proteínas ErbB está formada por 4 miembros ErbB-1, también llamada receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés) ErbB-2, también llamada HER2 en humanos y neu en roedores, ErbB- 3, también llamada HER3 y la ErbB-4, también llamada HER4. Las proteínas de la familia ErbB son tirosina-cinasas del receptor y constituyen mediadores importantes del crecimiento, la diferenciación y la supervivencia celular.

ErbB-2 y anticuerpos anti -ErbB-2 El segundo miembro de la familia de proteínas ErbB, ErbB-2 (también conocida como ERBB2, HER2 ; CD340, HER-2/neu, proteína c-erb B2/neu, homólogo de oncogén derivado de neuroblastoma/glioblastoma | homólogo 2 de oncogén derivado de leucemia viral eritroblástica aviar v-erb-b2 SEC ID NO: 14) es una proteína que de por sí no tiene dominio de Ref. 223059 fijación sobre ligando y, por ello, no puede unirse a factores de crecimiento. Sin embargo, se une firmemente a otros miembros de la familia de receptores de EGF unidos a ligandos para formar un heterodímero, estabilizando la unión al ligando e intensificando la activación mediada por cinasa de las trayectorias de señalización en dirección 3', por ejemplo aquellos en los que intervienen la proteína-cinasa activada por mitógeno y la fosfatidilinositol-3-cinasa. Se han publicado las variaciones alélicas en las posiciones de los aminoácidos 654 y 655 de la isoforma a (posiciones 624 y 625 de la isoforma b) , representándose aquí el alelo más frecuente, el Ile654/Ile655. Se ha publicado la amplificación y/o sobreexpresión de este gen en el caso de numerosos tipos de cáncer, incluidos los tumores de mama y de ovarios. El empalme alternativo se traduce en diversas variantes de transcritos adicionales, algunos codifican a isoformas diferentes y otros no se han caracterizado completamente. La ErB-2 se identificó inicialmente como producto del gen transformante de neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. La forma activada del proto-oncogen neu se forma por una mutación puntual (de valina en ácido glutámico) en la región transmembrana de la proteína codificada (Semba, K. y col., PNAS 82, 6497-501, 1985; Coussens, L. y col., Science 230, 1132-9, 1985; Bargmann, C.I. y col., Nature 319, 226-30, 1986; Yamamoto, T. y col., Nature 319, 230-4, 1986).

La amplificación del homólogo humano de neu se observa en el cáncer de mama y de ovarios y guarda relación con un pronóstico desfavorable (Slamon, D.J. y col., Science 235, 177-182, 1987; Slamon, D.J. y col., Science 244 , 707-712, 1989; y US 4,968,603). Hasta la fecha actual no se han publicado mutaciones puntuales similares a la del proto-oncogén neu para tumores humanos. La sobreexpresión de la HER2 (a menudo, pero no siempre, debido a la amplificación genética) se ha observado también en otros carcinomas, incluidos los carcinomas de estómago, endometrio, glándulas salivares, pulmón, ríñones, colon, tiroides, páncreas y vejiga, véase, entre otros, King, C.R. y col., Science 229 , 974-976, 1985; Yokota, J. y col., Lancet 1, 765-767, 1986; Fukushige, S. y col., Mol. Cell. Biol. 6, 955-958, 1986; Guerin, M. y col., Oncogene Res. 3, 21-31, 1988; Cohén, J.A. y col., Oncogene, 4, 81-88, 1989; Yonemura, Y. y col., Cáncer Res. 51, 1034-1038, 1991; Borst, M.P. y col., Gynecol . Oncol . 38 , 364-366, 1990; einer, D.B. y col., Cáncer Res. 50, 421-425, 1990; Kern, J.A. y col., Cáncer Res. 50, 5184-5187, 1990; Park, J.B. y col., Cáncer Res. 49, 6605-6609, 1989; Zhau, H.E. y col., Mol. Carcinog. 3, 254-257, 1990; Aasland, R. y col., Br. J. C ncer 57, 358-363, 1988; Williams, T.M. y col., Pathobiology 5_9, 46-52, 1991; y McCann, A. y col., Cáncer 6_5, 88-92, 1990. La HER2 puede sobre expresarse en el cáncer de próstata (Gu, K. y col., Cáncer Lett. 99, 185-189, 1996; Ross, J.S. y col., Hura. Pathol . 28, 827-833, 1997; Ross, J.S. y col., C ncer 79, 2162-2170, 1997; y Sadasivan, R. y col., J. Urol. 150, 126-131, 1993).

Se han generado anticuerpos dirigidos contra productos de la proteína HER2 humana, por ejemplo en Hudziak, R.M. y col., Mol. Cell. Biol. 9, 1165-1172, 1989, este autor describe la generación de un panel de anticuerpos anti-HER2 que se caracterizan empleando la línea celular SK-BR-3 de tumor de mama humano. Este panel de anticuerpos anti-HER2 incluye, entre otros, los anticuerpos 2C4 (pertuzumab) y 4D5 (trastuzumab, Herceptin™) , que se dirigen contra diferentes epítopos del dominio extracelular de la HER2. La proliferación celular relativa de las células SK-BR-3 después de la exposición a los anticuerpos se determina con una tinción violeta cristalina de las monocapas después de 72 horas. Aplicando este ensayo se obtiene una inhibición máxima con el anticuerpo llamado 4D5 (trastuzumab, Herceptin™) , que inhibe la proliferación celular en un 56%. En este mismo ensayo, otros anticuerpos del panel reducen la proliferación celular en menor grado. Se ha encontrado además que el anticuerpo 4D5 sensibiliza las líneas celulares de tumor de mama que sobre expresan la HER2 hasta, efectos citotóxicos del TNF-alfa (US 5,677,171). Los anticuerpos HER2 descritos por Hudziak, R.M. y col. se han caracterizado también por ejemplo en Fendly, B.M. y col., Cáncer Research 5_0, 1550-1558, 1990. c-Met y anticuerpos anti-c-Met El MET (factor de transición epitelio raesénquima) es un proto-oncogén que codifica a una proteína MET (también conocida como c-Met; receptor del factor de crecimiento de hepatocitos = HGFR; receptor de HGF; receptor del factor de diseminación; receptor del SF; SEC ID NO: 13) (Dean, M. y col., Nature 318 , 385-8, 1985; Chan, A.M. y col., Oncogene 1, 229-33, 1987; Bottaro, D.P. y col., Science 251, 802-4, 1991; Naldini, L. y col., EMBO J. 10, 2867-78, 1991; Maulik, G. y col., Cytokine Growth Factor Rev. 13, 41-59, 2002). El MET es un receptor de membrana que es esencial para el desarrollo embrionario y la curación de heridas. El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es el único ligando conocido del receptor del MET. El MET se expresa normalmente en células de origen epitelial, mientras que la expresión del HGF se restringe a células de origen mesenquimal . Al estimular del HGF, el MET induce diversas respuestas biológicas que colectivamente dan lugar a un programa conocido como crecimiento invasivo. La activación anormal del MET en el cáncer se relaciona con un mal pronóstico, en donde el MET aberrantemente activo desencadena el crecimiento tumoral, la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) que abastecen al tumor con nutrientes y el cáncer se propaga a otros órganos (metástasis) . El MET se desregula en muchos tipos de enfermedades malignas humanas, incluidos el cáncer de riñon, de hígado, de estómago, de mama y de cerebro. Normalmente, solo las células madre y las células progenitoras expresan el MET, lo cual permite que estas células crezcan de modo invasivo, con el fin de generar nuevos tej idos en un embrión o de regenerar tej idos dañados en un adulto. Sin embargo, se cree que las células madre cancerosas secuestran la capacidad de las células madre normales de expresar el MET y de este modo llegan a provocar la persistencia del cáncer y su propagación a otras partes del cuerpo.

El producto del proto-oncogén MET es el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos y codifica la actividad de la tirosina-cinasa . La proteína precursora primaria de cadena simple se descompone después de la traducción para producir las subunidades alfa y beta, que se unen mediante un disulfuro para formar el receptor maduro. Varias mutaciones del gen MET se han asociado con el carcinoma papilar renal.

Los anticuerpos anti-c-Met se conocen por ejemplo por los documentos US 5,686,292, US 7,476,724, O 2004/072117, WO 2004/108766, WO 2005/016382, O 2005/063816, WO 2006/015371, WO 2006/104911, WO 2007/126799 o WO 2009/007427.

Se conocen los péptidos de unión con el c-Met por ejemplo por los documentos de Matzke, A. y col., Cáncer Res 65 (14), 6105-10, 2005; y Tam, Eric M. y col . , J. Mol. Biol . 385, 79-90, 2009.

Anticuerpos multiespecífieos En fechas recientes se ha desarrollado una gran variedad de formatos de anticuerpos recombinantes , por ejemplo anticuerpos biespecífieos tetravalentes por fusión por ejemplo de un formato de anticuerpo IgG con dominios de cadena simple (véase por ejemplo Coloma, M.J. y col., Nature Biotech. 15, 159-163, 1997; WO 2001/077342; y Morrison, S.L., Nature Biotech. 25, 1233-1234, 2007).

Se han desarrollado también varios formatos nuevos, en los que ya no se conserva la estructura del núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) , por ejemplo en los dia-, tria- o tetracuerpos , minicuerpos, varios formatos de cadena simple (scFv, Bis-scFv) , que son capaces de unirse a dos o más antígenos (Holliger, P. y col., Nature Biotech. 23 , 1126-1136, 2005; Fischer, N . , Léger, 0., Pathobiology 74, 3-14, 2007; Shen, J. y col., Journal of Immunological Methods 318, 65-74, 2007; u, C. y col., Nature Biotech. 25, 1290-1297, 2007) .

En todos estos formatos se emplean enlazadores para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) con otra proteína de unión (por ejemplo scFv) o para fusionar por ejemplo dos fragmentos Fab o las scFv (Fischer, N. , Léger, O., Pathobiology 74, 3-14, 2007). Hay que tener en cuenta que puede ser deseable la conservación de las funciones efectoras, por ejemplo la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) , que vienen mediadas por la fijación del receptor del Fe, conservando un grado elevado de similitud con los anticuerpos de origen natural.

En el documento WO 2007/024715 se describen inmunoglobulinas duales de dominio variable diseñadas para que sean proteínas de fijación multiespecífica y multivalente . En la patente US 6,897,044 se describe un proceso para la obtención de dímeros de anticuerpo biológicamente activos. En la patente US 7,129,330 se describe un constructo de anticuerpo multivalente Fv que tiene por lo menos cuatro dominios variables unidos entre sí mediante enlazadores peptídicos. En el documento US 2005/0079170 se describen estructuras de unión de antígenos dímeros y multímeros. La proteína de unión a antígenos monoespecífieos tri- o tetravalentes contiene tres o cuatros fragmentos Fab" unidos entre sí mediante enlace covalente gracias a una estructura conectora, la proteína no es la inmunoglobulina natural, según se describe en US 6,511,663. En WO 2006/020258 se describen anticuerpos biespecíficos tetravalentes que pueden expresarse eficazmente en células procariotas y eucariotas y que son útiles para métodos terapéuticos o de diagnóstico. En US 2005/0163782 se describe un método para separar o, con preferencia, para sintetizar dímeros que están unidos por lo menos un enlazador disulfuro entre cadenas a partir de dímeros que no están unidos por lo menos mediante un enlazador disulfuro entre las cadenas a partir de una mezcla que contiene los dos tipos de polipéptidos dímeros. Los receptores tetravalentes biespecíficos se han descrito en US 5,959,083. Los anticuerpos de ingeniería genética que tienen tres o más sitios funcionales de fijación a antígenos se han descrito en WO 2001/077342.

Los polipéptidos multiespecíficos y multivalentes de fijación sobre antígenos se han descrito en WO 1997/001580. En WO 1992/004053 se describen homoconjugados , obtenidos por ejemplo a partir de anticuerpos monoclonales de la familia IgG, que se fijan sobre el mismo determinante antigénico y que están unidos con enlace covalente mediante una reticulación realizada por síntesis. En el documento WO 1991/06305 se describen anticuerpos monoclonales oligómeros que tienen una gran avidez de antígeno, tales oligómeros, normalmente de la familia IgG, se secretan con dos o más monómeros de inmunoglobulina asociados entre sí para formar moléculas de IgG tetravalentes o hexavalentes . Los anticuerpos derivados de ovejas y los constructos de anticuerpos de ingeniería genética se han descrito en US 6,350,860, pueden utilizarse para tratar enfermedades, en las que la actividad del interferón-gamma sea patogénica. En US 2005/0100543 se describen constructos que pueden tomarse como dianas y que son portadores multivalentes para anticuerpos biespecífieos , es decir, cada molécula de anticuerpo que puede tomarse como diana puede servir de portador para dos o más anticuerpos biespecíficos . En el documento WO 1995/009917 se describen anticuerpos tetravalentes biespecíficos de ingeniería genética. En WO 2007/109254 se describen moléculas de unión estabilizadas, formadas por o constituidas por un scFv estabilizado. US 2007/0274985 se refiere a formatos de anticuerpo que comprenden fragmentos de cadena simple (scFab) .

En WO 2008/140493 se describen anticuerpos pertenecientes a la familia anti-EGFR y anticuerpos biespecíficos que contienen uno o más anticuerpos de la familia anti-EGFR. En US 2004/0071696 se describen moléculas de anticuerpo biespecífico que se unen a miembros de la familia de proteínas EGFR.

El documento WO2009111707 (Al) se refiere a una terapia de combinación con los antagonistas Met y HER. El documento WO2009111691 (A2A3) a una terapia de combinación con antagonistas Met y EGFR.

En el documento WO 2004/072117 se describen anticuerpos c-Met que inducen la regulación descendente/internalización de c-Met y su uso potencial en anticuerpos biespecífieos inter alia con ErbB- 2 como un segundo antígeno.

Breve Descripción de la Invención Un primer aspecto de la presente invención es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a la ErbB-2 humana y a la c-Met humana, constituido por un primer sitio de unión a antígeno, que se une específicamente a la ErbB-2 humana y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a la c-Met humana, caracterizado porque el anticuerpo biespecífico muestra una internalización de c-Met de no más de 15% cuando se mide después de 1 hora en un ensayo citométrico de flujo en células OVCAR-8, según comparada con la internalización de c-Met en la ausencia del anticuerpo .

En una modalidad de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico bivalente o trivalente que se une específicamente a la ErbB-2 humana y a la c-Met humana que consta de uno o dos sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a la ErbB-2 humana y un sitio de fijación a antígeno que se une específicamente a c-Met humana.

En una modalidad de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico trivalente que se une específicamente a la ErbB-2 humana y a la c-Met humana que contiene dos sitios de fijación a antígeno que se unen específicamente a la ErbB-2 humana y un tercer sitio de fijación a antígeno que se une específicamente a la c-Met humana .

En una modalidad de la invención el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico bivalente que se une específicamente a la ErbB-2 humana y a la c-Met humana y que contiene un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la ErbB-2 humana y un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met humana.

Un aspecto de la invención es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a la ErbB-2 humana y a la c-Met humana que contiene un primer sitio de fijación al antígeno que se une específicamente a la ErbB-2 humana y un segundo sitio de fijación al antígeno que se une específicamente a la c-Met humana, caracterizado porque el primer sitio de fijación al antígeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 15, una región CDR2H de SEC ID NO: 16 y una región CDR1H de SEC ID NO: 17, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 18, una región CDR2L de SEC ID NO: 19, y una región CDR1L de SEC ID NO: 20; y el segundo sitio de fijación al antígeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 21, una región CDR2H de SEC ID NO: 22 y una región CDR1H de SEC ID NO: 23, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 24, una región CDR2L de SEC ID NO: 25 y una región CDR1L de SEC ID NO: 26.

El anticuerpo biespecífico se caracteriza con preferencia porque el primer sitio de fijación al antígeno que se une específicamente a ErbB-2 contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 1, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 2; y el segundo sitio de fijación al antígeno que se une específicamente a la c-Met contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 3 y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 4.

Un aspecto más de la invención es un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención caracterizado porque comprende una región constante de la subclase IgGl o IgG3.

En una modalidad el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza porque el anticuerpo está glicosilado con una cadena de azúcar en Asn297 por lo cual la cantidad de fucosa dentro de la cadena de azúcar es 65% o menor.

Otro aspecto de la invención es una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena del anticuerpo biespecífico .

Otros aspectos adicionales de la invención son una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo biespecífico, la composición para el tratamiento del cáncer, el uso del anticuerpo biespecífico para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer, un método de tratamiento de un paciente que tenga un cáncer mediante la administración del anticuerpo biespecífico al paciente que necesite tal tratamiento.

Los tumores de mama expresan a menudo niveles elevados de ErbB2 y en un porcentaje elevado los tumores positivos de ErbB2 son también positivos de c-Met. Se ha demostrado previamente en un gran número de estudios que la expresión de la c-Met en tumores de mama guarda relación con un diagnóstico desfavorable (Kang, J.Y. y col., Cáncer Res. 63, 1101-1105, 2003; Lengyel, E. y col., Int. J. C ncer 113 , 678-82, 2005). Por lo tanto, los anticuerpos biespecífieos <ErbB-2-c-Met> según la invención tienen propiedades valiosas, como son eficacia antitumoral e inhibición de las células cancerígenas .

Los anticuerpos de acuerdo con la invención muestran propiedades altamente valiosas como, por ejemplo, inter alia, inhibición del crecimiento de células cancerígenas que expresan ambos receptores ErbB2 y c-Met, eficacia antitumoral que causa un beneficio para un paciente que sufre de cáncer. Los anticuerpos biespecíficos <ErbB2-c-Met> de acuerdo con la invención muestran una internalizacion reducida del receptor c-Met cuando se comparan con sus anticuerpos <c-Met> bivalentes, monoespecíficos progenitores en células cancerígenas que expresan ambos receptores ErbB2 y c-Met .

Breve Descripción de las Secuencias de aminoácido Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras se presentan para facilitar la comprensión de la presente invención, cuyo verdadero alcance se define en las reivindicaciones adjuntas. Se da por supuesto que pueden introducirse modificaciones a los procedimientos definidos sin apartarse del espíritu de la invención.

SEC ID NO: 1 dominio variable de cadena pesada, trastuzumab <ErbB-2> SEC ID NO: 2 dominio variable de cadena ligera, trastuzumab <ErbB-2> SEC ID NO: 3 dominio variable de cadena pesada, Mab 5D5 <c-Met> SEC ID NO: 4 dominio variable de cadena ligera, Mab 5D5 <c-Met> SEC ID NO: 5 cadena pesada, Mab 5D5 <c-Met> SEC ID NO: 6 cadena ligera, Mab 5D5 <c-Met> SEC ID NO: 7 cadena pesada, Fab 5D5 <c-Met> SEC ID NO: 8 cadena ligera, Fab 5D5 <c-Met> SEC ID NO: 9 región constante de cadena pesada de IgGl humana SEC ID NO: 10 región constante de cadena pesada de IgG3 humana SEC ID NO: 11 región constante kappa de cadena ligera humana SEC ID NO: 12 región constante lambda de cadena ligera humana SEC ID NO: 13 c-Met humana SEC ID NO: 14 ErbB-2 humana SEC ID NO: 15 CDR3H de cadena pesada, trastuzumab <ErbB-2> SEC ID NO: 16 CDR2H de cadena pesada, trastuzumab <ErbB-2> SEC ID NO: 17 CDR1H de cadena pesada, trastuzumab <ErbB-2> SEC ID NO: 18 CDR3L de cadena ligera, trastuzumab <ErbB-2> SEC ID NO: 19 CDR2L de cadena ligera, trastuzumab <ErbB-2> SEC ID NO: 20 CDR1L de cadena ligera, trastuzumab <ErbB-2> SEC ID NO: 21 CDR3H de cadena pesada, Mab 5D5 Met> SEC ID NO: 22 CDR2H de cadena pesada, Mab 5D5 <c- Met> SEC ID NO: 23 CDR1H de cadena pesada, Mab 5D5 <c- Met> SEC ID NO: 24 CDR3L de cadena ligera, Mab 5D5 <c- Met> SEC ID NO: 25 CDR2L de cadena ligera, Mab 5D5 <c- Met> SEC ID NO: 26 CDR1L de cadena ligera, Mab 5D5 <c-Met> Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Estructura esquemática de un anticuerpo de longitud completa sin dominio CH4 que se une específicamente a un primer antígeno 1 con dos pares de cadena pesada y ligera que contienen dominios variables y constantes en un orden típico.

Figuras 2a-2c. Estructura esquemática de un anticuerpo biespecífico bivalente <ErbB-2/c-Met>, que contiene: a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2 humana; y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la c-Met humana, en donde los dominios constantes CL y CH1, y/o los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, que se han modificado con la tecnología "superhélices" Figuras 3a-3d. Representación esquemática de un anticuerpo biespecífico trivalente <ErbB-2/c-Met> según la invención, que contiene un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2, con el que: a) Figura 3a: se han fusionado dos polipéptidos VH y VL (los dominios VH y VL de los dos forman, juntos, un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met; b) Figura 3b: se han fusionado dos polipéptidos VH-CH1 y VL-CL (los dominios VH y VL de los dos forman, juntos, un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met) ; c) Figura 3c: representación esquemática de un anticuerpo biespecífico trivalente según la invención, que contiene un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2, con el que se han fusionado dos polipéptidos VH y VL (los dominios VH y VL de los dos forman, juntos, un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met) con "superhélices" ; d) Figura 3d: representación esquemática de un anticuerpo biespecífico trivalente según la invención, que contiene un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2, con el que se han fusionado dos polipéptidos VH y VL (los dominios VH y VL de los dos forman, juntos, un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met; estos dominios VH y VL contienen un puente disulfuro entre las cadenas, situado entre las posiciones VH44 y VL100) con "superhélices" Figuras 4a-4b. 4a: Estructura esquemática de los cuatro fragmentos posibles Fab de cadena simple 4b: Estructura esquemática de los dos fragmentos Fv de cadena simple Figuras 5a-5b. Estructura esquemática de un anticuerpo biespecífico trivalente <ErbB-2/c-Met> que contiene un anticuerpo de longitud completa y un fragmento Fab de cadena simple (figura 5a) o un fragmento Fv de cadena simple (Figura 5b) - ejemplo biespecífico trivalente con superhélices Figuras 6a-6b. Estructura esquemática de un anticuerpo biespecífico tetravalente <ErbB-2/c-Met> que contiene un anticuerpo de longitud completa y dos fragmentos Fab de cadena simple (Figura 6a) o dos fragmentos Fv de cadena simple (Figura 6b) - los sitios de unión a la c-Met se derivan de anticuerpos que inhiben la dimerización de la c-Met .

Figura 7a. Análisis citométrico de flujo de la expresión de la superficie celular de ErbBl/2/3 y c-Met en la línea celular cancerígena epidermoide A431.

Figura 7b. Análisis citométrico de flujo de la expresión de la superficie celular de ErbBl/2/3 y c-Met en la línea celular cancerígena ovárica OVCAR-8.

Figura 8. Ensayo de internalización en células cancerígenas OVCAR-8 medida a 0, 30, 60 y 120 minutos (= 0, 0.5, 1, y 2 horas) Figura 9a. Ensayo de proliferación en células cancerígenas OVCAR-8. Inhibición de la proliferación de células cancerígenas del anticuerpo biespecífico <HER2/c-Met> BsAB02 (BsAb) de acuerdo con la invención comparado con los anticuerpos progenitores no específicos <HER2> y <c-Met>.

Figura 9b. Ensayo de proliferación en la línea células cancerígenas Ovcar-8 en la presencia de HGF Inhibición de la proliferación de células cancerígenas del anticuerpo biespecífico <HER2/c-Met> BsAB02 (BsAb) de acuerdo con la invención comparado con los anticuerpos progenitores no específicos <HER2> y <c-Met>.

Descripción Detallada de la Invención Un primer aspecto de la presente invención es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a la ErbB-2 humana y a la c-Met humana que contiene un primer sitio de fijación al antígeno que se une específicamente a ErbB-2 humana y un segundo sitio de fijación al antígeno que se une específicamente a la c-Met humana, caracterizado en que el anticuerpo biespecífico muestra una internalización de c-Met de no más de 15% cuando se mide después de 1 hora en un ensayo citométrico de flujo en células OVCAR-8, cuando se compara con la internalización de c-Met en la ausencia de tal anticuerpo biespecífico.

De esta forma la invención se dirige a un anticuerpo biespecífico que específicamente se une a ErbB-2 humano y c-Met humano que comprende un primer sitio de unión a antígeno que específicamente se une a ErbB-2 humano y un segundo sitio de unión a antígeno que específicamente se une a c-Met humano, en donde el anticuerpo biespecífico causa un aumento en la internalización de c-Met en células OVCAR-8 de no más de 15% cuando se mide después de 1 hora de incubación del anticuerpo de las células OVCAR-8 según medido por medio del ensayo citométrico de flujo, cuando se compara con la internalización de c-Met en células OVCAR-8 en la ausencia del anticuerpo.

En una modalidad el anticuerpo biespecífico específicamente se une a ErbB-2 humano y c-Met humano que comprende un primer sitio de unión a antígeno que específicamente se une a ErbB-2 humano y un segundo sitio de unión a antígeno que específicamente se une a c-Met humano se caracteriza en que el anticuerpo biespecífico muestra una internalización de c-Met de no más de 10% cuando se mide después de 1 hora en un ensayo de citometría de flujo en células OVCAR-8, cuando se compara con la internalización de c-Met en la ausencia del anticuerpo biespecífico.

En una modalidad el anticuerpo biespecífico específicamente se une a ErbB-2 humano y c-Met humano que comprende un primer sitio de unión a antígeno que específicamente se une a ErbB-2 humano y un segundo sitio de unión a antígeno que específicamente se une a c-Met humano se caracteriza en que el anticuerpo biespecífico muestra una internalización de c-Met de no más de 7% cuando se mide después de 1 hora en un ensayo de citometría de flujo en células OVCAR-8, cuando se compara con la internalización de c-Met en la ausencia del anticuerpo biespecífico .

En una modalidad el anticuerpo biespecífico específicamente se une a ErbB-2 humano y c-Met humano que comprende un primer sitio de unión a antígeno que específicamente se une a ErbB-2 humano y un segundo sitio de unión a antígeno que específicamente se une a c-Met humano se caracteriza en que el anticuerpo biespecífico muestra una internalización de c-Met de no más de 5% cuando se mide después de 1 hora en un ensayo de citometría de flujo en células OVCAR-8, cuando se compara con la internalización de c-Met en la ausencia del anticuerpo biespecífico.

El término "la internalización de c-Met" se refiere a la internalización del receptor c-Met inducida por el anticuerpo en células OVCAR-8 (designación de la línea celular NCI; comprada de NCI (National Cáncer Institute) OVCAR-8-NCI; Schilder, R.J. y otros, Int. J. Cáncer 45 (1990) 416-422; Ikediobi, O.N. y otros, Mol. Cáncer. Ther. 5 (2006) 2606-2612; Lorenzi, P.L., y otros, Mol. Cáncer Ther. 8 (2009) 713-724) cuando se compara con la internalización de c-Met en la ausencia del anticuerpo. Tal internalización del receptor c-Met es inducida por anticuerpos biespecífieos de acuerdo con la invención y se mide después de 1 hora en un ensayo de citometría de flujo (FACS) como se describe en el Ejemplo 11. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención muestra una internalización de c-Met de no más de 15% en células OVCAR-8 después de 1 hora de exposición del anticuerpo cuando se compara con la internalización de c-Met en la ausencia del anticuerpo. En una modalidad el anticuerpo muestra una internalización de c-Met de no más de 10%. En una modalidad el anticuerpo muestra una internalización de c-Met de no más de 7%. En una modalidad el anticuerpo muestra una internalización de c-Met de no más de 5%.

Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo biespecífico que específicamente se une a ErbB-2 humano y c-Met humano que comprende un primer sitio de unión a antígeno que específicamente se une a ErbB-2 humano y un segundo sitio de unión a antígeno que específicamente se une a c-Met humano, caracterizado en que el anticuerpo biespecífico reduces la internalización de c-Met, comparado con la internalización de c-Met inducida por el anticuerpo c-Met progenitor bivalente, monoespecífico (correspondiente) , en 50% o más (en una modalidad 60% o más; en otra modalidad 70% o más, en una modalidad 80% o más) , cuando se mide después de 1 hora en un ensayo de citometría de flujo en células OVCAR-8. La reducción de la internalización de c-Met se calcula (utilizando el % de valores de internalización medido después de 1 hora en un ensayo de citometría de flujo en células OVCAR-8, en tanto que el % de los valores de internalización por debajo de 0 se establecen como 0% de internalización, por ejemplo, para BsAB02 (-7% de internalización se establece como 0% de internalización) como sigue: 100 x (% de internalización de c-Met inducido por anticuerpo c-Met progenitor bivalente, monoespecífico - % de internalización de c-Met inducido por anticuerpo ErbB-2/cMet biespecifico) /% de internalización de c-Met inducido por anticuerpo c-Met progenitor bivalente, monoespecífico . Por ejemplo: el anticuerpo ErbB-2/cMet biespecifico BsAB02 muestra una internalización de c-Met de -7% que se establece como 0%, y el anticuerpo c-Met progenitor bivalente, monoespecífico Mab 5D5 muestra una internalización de c-Met de 37%. De esta forma el anticuerpo ErbB-2/cMet biespecifico BsAB02 muestra una reducción de la internalización de c-Met de 100 x (40-0) /40% = 100% (ver valores de internalización medidos después de 1 hora en un ensayo de citometría de flujo en células OVCAR-8 en el Ejemplo 11) .

Tal como se emplea aquí, "anticuerpo" indica una proteína de unión que contiene sitios de fijación sobre antígenos. Los términos "sitio de fijación" o "sitio de fijación sobre antígeno" se emplean aquí para indicar la región o regiones de una molécula de anticuerpo a las que actualmente está unido un ligando y se derivan de un anticuerpo. El término "sitio de fijación sobre antígeno" incluye los dominios variables de cadena pesada del anticuerpo (VH) y/o los dominios variables de cadena ligera del anticuerpo (VL) o los pares de VH/VL, y pueden derivarse de anticuerpos enteros o fragmentos de anticuerpo, como son el Fv de cadena simple, un dominio VH y/o un dominio VL, el Fab o el (Fab)2. En una modalidad de la presente invención, cada uno de los sitios de fijación sobre el antígeno contiene un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y/o un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) , y está formado con preferencia por un par constituido por un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) .

Además de los sitios de fijación sobre antígeno derivados de anticuerpo, también los péptidos de unión descritos por ejemplo en Matzke, A. y col., Cáncer Res. 65_ (14) , 6105-10, 2005 (15 de julio de 2005) , pueden fijarse específicamente sobre un antígeno (por ejemplo c-Met) . Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención es una molécula de fijación biespecífica que se une específicamente a la ErbB-2 humana y a la c-Met humana, que contiene un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la ErbB-2 humana y un péptido de unión que se une específicamente a la c-Met humana. Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención es una molécula de fijación biespecífica que se une específicamente a la ErbB-2 humana y a la c-Met humana, que contiene un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met humana y un péptido de unión que se une específicamente a la ErbB-2 humana.

La ErbB-2 (también conocida como ERBB2 , HER2 ; CD340, HER-2/neu, proteína c-erb B2/neu, homólogo de oncogén derivado de neuroblastoma/glioblastoma (v-erb-b2) , homólogo de oncogén derivado de leucemia viral eritroblástica aviar 2; SEC ID NO: 14) es una proteína que de por sí no tiene dominio de fijación sobre ligando y, por ello, no puede unirse a factores de crecimiento. Sin embargo, se une firmemente a otros miembros de la familia de receptores de EGF unidos a ligandos para formar un heterodímero, estabilizando la unión al ligando e intensificando la activación mediada por cinasa de las trayectorias de señalización en dirección 3', por ejemplo aquellos en los que intervienen la proteína-cinasa activada por mitógeno y la fosfatidilinositol-3 -cinasa . Se han publicado las variaciones alélicas en las posiciones de los aminoácidos 654 y 655 de la isoforma a (posiciones 624 y 625 de la isoforma b) , representándose aquí el alelo más frecuente, el Ile654/Ile655. Se ha publicado la amplificación y/o sobreexpresión de este gen en el caso de numerosos tipos de cáncer, incluidos los tumores de mama y de ovarios. El empalme alternativo se traduce en diversas variantes de transcritos adicionales, algunos codifican a isoformas diferentes y otros no se han caracterizado completamente. La ErB-2 se identificó inicialmente como producto del gen transformante de neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. La forma activada del proto-oncogen neu se forma por una mutación puntual (de valina en ácido glutámico) en la región transmembrana de la proteína codificada (Semba, K. y col., PNAS 82, 6497-501, 1985; Coussens, L. y col., Science 230, 1132-9, 1985; Bargmann, C.I. y col., Nature 319 , 226-30, 1986; Yamamoto, T. y col., Nature 319, 230-4, 1986).

El sitio de fijación sobre el antígeno y en especial los dominios variables de cadena pesada (VH) y/o dominios variables de cadena ligera (VL) del anticuerpo, que se unen específicamente a la ErbB-2 humana, pueden derivarse a) de anticuerpos anti-ErbB-2 conocidos, por ejemplo los anticuerpos 2C4 (pertuzumab; el pertuzumab es una versión humanizada recombinante del anticuerpo 2C4 murino anti-HER2, y se ha descrito junto con su correspondiente método de preparación en WO 01/00245 y WO 2006/007398) y el 4D5 (trastuzumab (una versión humanizada recombinante del anticuerpo 4D5 murino anti-HER2, Herceptina™, el trastuzumab y su método de preparación se han descrito en US 5,821,337) (Hudziak, R.M. y col., Mol. Cell. Biol. 9, 1165-1172, 1989; Fendly, B.M. y col., Cáncer Research 50, 1550-1558, 1990) o b) de nuevos anticuerpos anti-ErbB-2 obtenidos por nuevos métodos de inmunización empleando, entre otros, la proteína ErbB-2 humana o el ácido nucleico o los fragmentos de los mismos o por exposición de fago.

El MET (factor de transición epitelio-mesénquima) es un proto-oncogén que codifica a una proteína MET (también conocida como c-Met; receptor del factor de crecimiento de hepatocitos = HGFR; receptor de HGF; receptor del factor de diseminación; receptor del SF; SEC ID NO: 13) (Dean, M. y col., Nature 318 , 385-8, 1985; Chan, A.M. y col., Oncogene 1, 229-33, 1987; Bottaro, D.P. y col., Science 251, 802-4, 1991; Naldini, L. y col., EMBO J. 10, 2867-78, 1991; Maulik, G. y col., Cytokine Growth Factor Rev. 13_, 41-59, 2002). El MET es un receptor de membrana que es esencial para el desarrollo embrionario y la curación de heridas. El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es el único ligando conocido del receptor del MET. El MET se expresa normalmente en células de origen epitelial, mientras que la expresión del HGF se restringe a células de origen mesenquimal. A raíz de la estimulación del HGF, el MET induce diversas respuestas biológicas que colectivamente dan lugar a un programa conocido como crecimiento invasivo. La activación anormal del MET en el cáncer guarda relación con un pronóstico malo, en donde el MET aberrantemente activo desencadena el crecimiento tumoral, la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) que abastecen al tumor con nutrientes y el cáncer se propaga a otros órganos (metástasis) . El MET se desregula en muchos tipos de enfermedades malignas humanas, incluidos el cáncer de riñon, de hígado, de estómago, de mama y de cerebro. Normalmente, solo las células madre y las células progenitoras expresan el MET, lo cual permite que estas células crezcan de modo invasivo, con el fin de generar nuevos tejidos en un embrión o de regenerar tejidos dañados en un adulto. Sin embargo, se cree que las células madre cancerosas secuestran la capacidad de las células madre normales de expresar el MET y de este modo llegan a provocar la persistencia del cáncer y su propagación a otras partes del cuerpo.

El sitio de fijación sobre el antígeno y, en especial, los dominios variables de cadena pesada (VH) y/o dominios variables de cadena ligera (VL) de anticuerpo, que se unen específicamente a la c-Met humana pueden derivarse de a) de anticuerpos anti-c-Met conocidos, descritos por ejemplo en US 5,686,292, US 7,476,724, O 2004/072117, WO 2004/108766, WO 2005/016382, WO 2005/063816, WO 2006/015371, WO 2006/104911, WO 2007/126799, O WO 2009/007427 b) de anticuerpos anti-c-Met nuevos, obtenidos por ejemplo por nuevos métodos de inmunización empleando entre otros la proteína anti-c-Met humana o el ácido nucleico o fragmentos del mismo o por exposición de fagos.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a la ErbB-2 humana y a la c-Met humana, que contiene un primer sitio de fijación al antígeno que se une específicamente a la ErbB-2 humana y un segundo sitio de fijación al antígeno que se une específicamente a la c-Met humana caracterizado porque el primer sitio de fijación al antígeno que se une específicamente a ErbB-2 contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 1, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 2; y el segundo sitio de fijación al antígeno que se une específicamente a la c-Met contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 4.

La especificidad del anticuerpo indica el reconocimiento selectivo que realiza el anticuerpo de un epítopo concreto existente en un antígeno. Los anticuerpos naturales son, por ejemplo, monoespecíficos . Los "anticuerpos biespecíficos" según la invención son anticuerpos que tienen dos especificidades diferentes para la fijación sobre antígenos. Cuando un anticuerpo tiene más de una especificidad, los epítopos reconocidos pueden asociarse con un solo antígeno o con más de un antígeno. Los anticuerpos de la presente invención son específicos de dos antígenos diferentes, es decir, de la ErbB-2 como primer antígeno y de la c-Met como segundo antígeno.

El término anticuerpo "monoespecífico" se emplea aquí para indicar un anticuerpo que tiene uno o más sitios de fijación, cada uno de ellos se une al mismo epítopo del mismo antígeno.

El término "valente" se emplea dentro de la presente solicitud para indicar la presencia de un número determinado de sitios de fijación existentes en una molécula de anticuerpo. Por tanto, los términos "bivalente", "tetravalente", y "hexavalente" indican la presencia de dos sitios de fijación, cuatro sitios de fijación y seis sitios de fijación, respectivamente, en una molécula de anticuerpo. Los anticuerpos biespecíficos según la invención son por lo menos "bivalentes" y pueden ser "trivalentes" o "multivalentes" (por ejemplo ("tetravalentes" o "hexavalentes" ) .

Un sitio de un anticuerpo de la invención para la fijación sobre antígeno puede contener seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) , que en grados variables contribuyen a la afinidad del sitio de fijación para con el antígeno. Hay tres CDR de dominio variable de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) y tres CDR de dominio variable de cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3) . La extensión de las CDR y de las regiones de armazón (FR) se determina comparándolas con una base de datos compilada de secuencias de aminoácidos, en las que estas regiones se hayan definido según la variabilidad entre las secuencias. Se incluye también dentro del alcance de la invención los sitios funcionales de fijación sobre antígeno que constan de pocas CDR (es decir, en los que la especificidad de fijación viene determinada por tres, cuatro o cinco CDR) . Por ejemplo, para la fijación puede ser suficiente con menos de un conjunto completo de 6 CDR. En algunos casos, puede ser suficiente con un dominio VH o un dominio VL.

En las modalidades preferidas de ejecución, los anticuerpos de la invención contienen además regiones constante de inmunoglobulina de uno o más grupos de inmunoglobulina de origen humano. Los grupos de inmunoglobulina incluyen los isotipos IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE y, en el caso de la IgG y de la IgA, sus subtipos. En una modalidad preferida, un anticuerpo de la invención tiene una estructura de dominios constantes de un anticuerpo de tipo IgG, pero tiene cuatro sitios de fijación sobre antígeno. Esto se consigue por ejemplo uniendo uno (o dos) sitios completos de fijación sobre antígeno (por ejemplo un fragmento Fab de cadena simple o un Fv de cadena simple) , que se unen específicamente a la c-Met ya sea N-terminal, ya sea C-terminal, de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo entero, que se una específicamente a la ErbB-2, formándose un anticuerpo biespecífico trivalente (o un anticuerpo biespecífico tetravalente) . Como alternativa pueden utilizarse los anticuerpos bivalente biespecíficos del tipo IgG contra la ErbB-2 humana y la c-Met humana que contienen las regiones constantes de la inmunoglobulina, tal como se ha descrito por ejemplo en solicitud de EP 07024867.9, solicitud de EP 07024864.6, solicitud de EP 07024865.3 o Ridgway, J.B., Protein Eng. 9, 617-621, 1996; WO 96/027011; Merchant, A.M. y col., Nature Biotech. 16, 677-681, 1998; Atwell, S. y col., J. Mol. Biol. 27JD, 26-35, 1997 y EP 1870459A1.

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" se emplean aquí para indicar una preparación de moléculas de anticuerpo que tienen una única composición de aminoácidos.

El término "anticuerpo quimérico" indica un anticuerpo que contiene una región variable, es decir, una región de fijación de una fuente o especie y por lo menos una porción de una región constante derivada de una especie o fuente diferente, obtenida normalmente por técnicas de ADN recombinante . Son preferidos los anticuerpos quiméricos que contienen una región variable murina y una región constante humana. Otras formas preferidas de "anticuerpos quiméricos" contempladas en la presente invención son aquellas, en las que la región constante se ha modificado o cambiado con respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, en especial en lo que respecta a la unión con el Clq y/o la unión con el receptor de Fe (FcR) . Tales anticuerpo quiméricos se denominan también "anticuerpos de clase cambiada" . Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que contienen segmentos de ADN que codifican a las regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN que codifican a las regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos de obtención de anticuerpos quiméricos incluyen las técnicas convencionales de ADN recombinante y de transfección genética, que son bien conocidas en la técnica, véase por ejemplo Morrison, S.L. y col., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 81 , 6851-6855, 1984; US 5,202,238 y US 5,204,244.

El término "anticuerpo humanizado" indica anticuerpos en las que los regiones de estructura o "regiones determinantes de complementariedad" {COR) se han modificado para que contengan la CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente con respecto a la de la inmunoglobulina original. En una modalidad preferida, se injerta una CDR murina en la región de estructura de un anticuerpo humano para obtener el "anticuerpo humanizado" , véase por ejemplo Riechmann, L . y col., Nature 332 , 323-327, 1988; y Neuberger, M.S. y col., Nature 314 , 268-270, 1985. Las CDR especialmente preferidas corresponden a las que representan secuencias que reconocen a los antígenos antes mencionados de los anticuerpos quiméricos. Otras formas de "anticuerpos humanizados" contempladas en la presente invención son aquellas, en las que la región constante se ha modificado o cambiado adicionalmente con respecto al anticuerpo original para generar propiedades según la invención, en especial en lo que respecta a la unión con el Clq y/o a la unión con el receptor de Fe (FcR) .

El término "anticuerpo humano" se emplea aquí para indicar anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobuliná de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos en el estado de la técnica (van Dijk, M.A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol . 5, 368-374, 2001). Los anticuerpos humanos pueden obtenerse también en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que, después de la inmunización, son capaces de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobuliná. La transferencia de la disposición genética de la inmunoglobuliná de la línea germinal humana a tales ratones mutantes de línea germinal puede traducirse en la producción de anticuerpos humanos después del contacto con el antígeno (ver, por ejemplo, Jakobovits, A. y col., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90, 2551-2555, 1993; Jakobovits, A. y col., Nature 362, 255-258, 1993; Bruggemann, M. y col., Year Immunol. 7, 33-40, 1993). Los anticuerpos humanos pueden producirse también en bibliotecas de exposición de fagos (Hoogenboom, H.R. y Winter, G. , J. Mol. Biol. 227, 381-388, 1992; Marks , J.D. y col., J. Mol. Biol. 222 , 581-597, 1991). Se dispone también de las técnicas de Colé, A. y col. y Boerner, P. y col. para la obtención de anticuerpos monoclonales humanos (Colé, A. y col., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Liss, A.L., p. 77, 1985; y Boerner, P. y col., J. Immunol . 147 , 86-95, 1991). Tal como se ha mencionado antes para los anticuerpos quiméricos y humanizados según la invención, el término "anticuerpo humano" se emplea aquí para indicar los anticuerpos que se han modificado en la región constante para generar propiedades según la invención, en especial en lo que respecta a la unión al Clq y/o a la unión al FcR, por ejemplo por "cambio de clase", es decir, cambio o mutación de partes del Fe (por ejemplo de la IgGl a la IgG4 y/o mutación IgGl/lgG4) .

El término "anticuerpo humano recombinante" se emplea aquí para indicar todos los anticuerpos humanos que se obtienen, expresan, crean o aislan por medios recombinantes , como son los anticuerpos aislados de una célula hospedera por ejemplo una célula NSO o CHO o de un animal (por ejemplo un ratón) que sea transgénico en cuanto a los genes de la inmu-noglobulina humana o los anticuerpos expresados empleando un vector de expresión recombinante transfectado a una célula hospedera. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes en una forma reordenada. Los anticuerpos humanos recombinantes según la invención se han sometido a una hipermutación somática "in vivo" . Por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL del anticuerpo recombinante son secuencias que, en cuanto derivadas de y relacionadas con las secuencias VH y VL de línea germinal humana, no pueden existir de modo natural en del repertorio de líneas germinales de anticuerpos humanos "in vivo" .

El "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL) , región variable de una cadena pesada (VH) se emplea aquí para indicar cada uno de los pares de cadenas ligeras y pesadas que intervienen directamente en la fijación del anticuerpo sobre el antígeno. Los dominios de cadenas variables humanas, ligeras y pesadas, tienen la misma estructura general y cada dominio contiene cuatro regiones de estructura (FR) , cuyas secuencias están muy conservadas, conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones determinantes de complementariedad, CDR) . Las regiones estructurales adoptan una conformación de lámina ß y las CDR pueden formar bucles que conecten la estructura de lámina ß. Las CDR de cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional gracias a las regiones de estructura y junto con las CDR de la otra cadena forman el sitio de fijación sobre el antígeno. Las regiones CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo desempeñan un rol especialmente importante en la especificidad de unión/afinidad de los anticuerpos según la invención y por ello constituyen otro objeto de la invención.

Los términos "región hipervariable" o "porción de un anticuerpo que se une al antígeno" se emplean aquí para indicar los residuos aminoácido de un anticuerpo que producen la unión con el antígeno. La región hipervariable contiene residuos aminoácido de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" . Las regiones de "estructura" o "FR" son aquellas regiones de dominio variable distintas de los residuos de región hipervariable que se acaban de definir. Por lo tanto, las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo abarcan desde N-terminal a C-terminal de los dominios FR1 , CDR1, FR2, CDR2, FR3 , CDR3 y FR4. Las CDR de cada cadena están separadas por los aminoácidos de estructura. En especial, la CDR3 de cadena pesada es la región que más contribuye a la fijación sobre el antígeno. Las regiones CDR y FR se determinan de acuerdo a la definición estándar de Kabat y col . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) .

Tal como se emplea aquí, el término "unión" o "fijación específica" indica la unión del anticuerpo a un epítopo del antígeno (la ErbB-2 humana o la c-Met humana) en un ensayo "in vitro", con preferencia en un ensayo de resonancia de plasmón (BIAcore, GE-Healthcare Upsala, Suecia) con el antígeno de tipo silvestre purificado. La afinidad de la unión se define en términos ka (constante de velocidad de asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno) , kD (constante de disociación) y KD (kD/ka) . La unión o fijación específica indica una afinidad de unión (KD) de 10"8 moles/1 o menos, con preferencia de 10"9 a 10"13 moles/1. Por tanto, un anticuerpo biespecífico <ErbB2-c-Met> según la invención se fija específicamente sobre cada antígeno del que es específico con una afinidad de fijación (KD) de 10"8 moles/1 o menos, con preferencia de 10~9 M a 10~13 moles/1.

La fijación del anticuerpo con el FCYRIII puede investigarse mediante un ensayo BIAcore (GE-Healthcare , Upsala, Suecia) . La afinidad de la unión se define mediante los términos ka (constante de velocidad de asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno) , kD (constante de disociación) y KD (kD/ka) .

El término "epítopo" incluye cualquier determinante polipeptídico capaz de la unión específica con un anticuerpo. En ciertas modalidades, el determinante epítopo incluye a grupos de moléculas de superficie químicamente activos, como son los aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo y, en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características específicas de carga. Un epítopo es una región de un antígeno que está unida por un anticuerpo.

En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno si reconoce con preferencia su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas .

El término "región constante" se emplea en la presente solicitud para indicar la suma de los dominios de un anticuerpo distintos a la región variable. La región constante no participa directamente en la fijación sobre un antígeno, pero posee varias funciones efectoras. En función de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se dividen en las clases: igA, IgD, igE, igG e igM y varios de ellos pueden dividirse a su vez en subclases, por ejemplo el IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 , IgAl e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a los diferentes grupos de anticuerpos se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las regiones constantes de cadena ligera, que pueden encontrarse en los cincos grupos de anticuerpo, se denominan (kappa) y ? (lambda) . La región constante se deriva con preferencia de un origen humano.

El término "región constante derivada de un origen humano" se emplea en la presente solicitud para indicar una región constante de cadena pesada de un anticuerpo humano de las subclases IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4 y/o una región constante de cadena ligera kappa o lambda. Tales regiones constantes son bien conocidas en el estado de la técnica y se han descrito por ejemplo en Johnson, G. y Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28, 214-218, 2000; Kabat, E.A. y col., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 72, 2785-2788, 1975.

En una modalidad, los anticuerpos biespecíficos según la invención tienen una región constante de la subclase IgGl o IgG3 (con preferencia de la subclase IgGl) , que se deriva con preferencia de un origen humano. En una modalidad, los anticuerpos biespecíficos según la invención contienen una parte Fe de la subclase IgGl o IgG3 (con preferencia de la subclase IgGl) , que se deriva con preferencia de un origen humano .

Los anticuerpos de la subclase IgG4 presentan una menor fijación sobre el receptor de Fe (FcYRIIIa), mientras que los anticuerpos de otras subclases IgG presentan una unión fuerte. Sin embargo, el Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida del hidrato de carbono de Fe) , Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lis288, Thr307, Gln311, Asn434 y His435 son residuos que, si se alteran, proporcionan también una fijación reducida sobre el receptor del Fe (Shields, R.L. y col., J. Biol. Chem. 276, 6591-6604, 2001; Lund, J. y col., FASEB J. 9, 115-119, 1995; Morgan, A. y col., Immunology 86, 319-324, 1995; EP 0 307 434) .

En una modalidad, un anticuerpo según la invención tiene una fijación reducida sobre el FcR si se compara con un anticuerpo IgGl y el anticuerpo original monoespecífico bivalente de longitud completa es en lo que respecta a la fijación sobre el FcR de la subclase IgG4 o de la subclase IgGl o IgG2 con una mutación en S228, L234, L235 y/o D265, y/o contiene la mutación PVA236. En una modalidad, las mutaciones en el anticuerpo original monoespecífico bivalente de longitud completa son la S228P, L234A, L235A, L235E y/o PVA236. En otra modalidad, las mutaciones en el anticuerpo original monoespecífico bivalente (de longitud completa) son la S228P en la IgG4 y las L234A y L235A en la IgGl.

La región constante de un anticuerpo participa directamente en la ADCC (citotoxicidad mediada por la célula dependiente de anticuerpo) y en la CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) . La activación del complemento (CDC) se inicia con la fijación del factor de complemento Clq sobre la región constante de la mayor parte de las subclases de anticuerpos IgG. La fijación del Clq sobre un anticuerpo viene provocada por interacciones proteína-proteína definidas en el sitio llamada de fijación. Tales sitios de fijación de región constante se conocen en el estado de la técnica y se han descrito por ejemplo en Lukas, T.J. y col., J. Immunol . 127, 2555-2560, 1981; Brunhouse, R. y Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16, 907-917, 1979; Burton, D.R. y col., Nature 288, 338-344, 1980; Thommesen, J.E. y col., Mol. Immunol. 3J7, 995-1004, 2000; Idusogie, E.E. y col., J. Immunol. 164 , 4178- 4184, 2000; Hezareh, M. y col., J. Virol . 75, 12161-12168, 2001; Morgan, A. y col., Immunology 86, 319-324, 1995; y EP 0 307 434. Tales sitios de fijación de región constante son característicos por ejemplo de los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración según el índice EU de Kabat) .

El término "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC)" indica la lisis de células objetivo humanas por acción de un anticuerpo según la invención en presencia de células efectoras. La ADCC se mide con preferencia mediante el tratamiento de una preparación de células que expresan a la ErbB-2 y la c-Met con un anticuerpo según la invención en presencia de células efectoras, por ejemplo las PBMC recién aisladas o las células efectoras purificadas a partir de capas leucocitarias, como son los monocitos o las células asesinas naturales (NK) o una línea celular de NK de crecimiento permanente.

El término "citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) " indica un proceso iniciado con la fijación del factor de complemento Clq sobre la parte Fe de la mayoría de subclases de anticuerpos IgG. La unión del Clq a un anticuerpo es causada por interacciones proteína-proteína definidas en el sitio llamado de fijación. Tales sitios de fijación de la parte Fe son conocidos en el estado de la técnica (ver más arriba) . Tales sitios de fijación de la parte Fe se caracterizan por ejemplo por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración según el índice EU de Kabat) . Los anticuerpos de las subclases IgGl, IgG2 e IgG3 presentan normalmente activación del complemento incluida la fijación sobre el Clq y C3, mientras que el lgG4 no activa el sistema de complemento y no se fija sobre el Clq y/o el C3.

Las funciones efectoras de los anticuerpos monoclonales de mediación celular pueden intensificarse diseñando su componente oligosacárido del modo descrito por Umana, P. y col., Nature Biotechnol. 17, 176-180, 1999, y US 6,602,684. Los anticuerpos de tipo IgGl, que son los anticuerpos más utilizados en el ámbito terapéutico, son glicoproteínas que tienen un sitio de glicosilación N-enlazado conservado en Asn297 en cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos biantenarios complejos unidos al Asn297 están sepultados entre los dominios CH2, formando contactos extensivos con el esqueleto del polipéptído y su presencia es esencial para que el anticuerpo pueda mediar en las funciones efectoras, por ejemplo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (Lifely, M.R. y col., Glycobiology 5, 813-822, 1995; Jefferis, R. y col., Immunol. Rev. 163 , 59-76, 1998; right, A. y Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15, 26-32, 1997) . Umana, P. y col. ha puesto de manifiesto en Nature Biotechnol. 17, 176-180, 1999 y O 99/54342 que la sobreexpresión de la ß ( 1 , 4 ) -N-acetil-glicosaminiltransferasa III ("GnTIII"), una glicosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos biseccionados , en células de ovarios de hámster chino (CHO) , aumenta significativamente la actividad ADCC de los anticuerpos "in vi tro" . Las alteraciones de la composición del hidrato de carbono Asn297 o su eliminación afecta también su fijación sobre el FcyR y Clq (Umana, P. y col., Nature Biotechnol. 17, 176-180, 1999; Davies, J. y col., Biotechnol. Bioeng. 74_, 288-294, 2001; imura, Y. y col., J. Biol . Chem. 276, 45539-45547, 2001; Radaev, S. y col., J. Biol. Chem. 276, 16478-16483, 2001; Shields, R.L. y col., J. Biol. Chem. 276, 6591-6604, 2001; Shields, R.L. y col., J. Biol. Chem. 277, 26733-26740, 2002; Simmons, L.C. y col., J. Immunol . Methods 263 , 133-147, 2002) .

Los métodos para intensificar las funciones efectoras de anticuerpo monoclonales de mediación celular mediante la reducción de la cantidad de fucosa se han descrito por ejemplo en WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/ 065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/ 035835, WO 2000/061739, Niwa, R. y col., J. Immunol. Methods 306, 151-160, 2005; Shinkawa, T. y col., J. Biol. Chem. 278, 3466-3473, 2003; WO 03/055993 O US 2005/0249722.

En una modalidad de la invención, se glicosilá el anticuerpo biespecífico según la invención (subclase IgGl o IgG3) con una cadena azúcar en Asn297, con lo cual la cantidad de fucosa dentro de la cadena azúcar es del 65% o menos (numeración según Kabat) . En otra modalidad, la cantidad de fucosa dentro de la cadena azúcar se sitúa entre el 5% y el 65%, con preferencia entre el 20% y el 40%. "Asn297" según la invención significa el aminoácido asparagina situado en la posición 297 de la región Fe. Basándose en variaciones de secuencia poco importantes de los anticuerpos, el Asn297 puede estar situado en una posición de algunos aminoácidos (por lo general no más de +3 aminoácidos) más arriba o más abajo de la posición 297, es decir entre la posición 294 y la 300.

La glicosilación de la IgGl o IgG3 humana tiene lugar en el Asn297 como glicosilación de oligosacárido complejo biantenario fucosilado, terminada con hasta dos residuos Gal. Las regiones constantes de cadena pesada humanas de la subclase IgGl o IgG3 se han descrito con detalle en Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) , y en Brüggemann, . y col., J. Exp. Med. 166 , 1351-1361, 1987; Love, T. . y col., Methods Enzymol . 178 , 515-527, 1989. Estas estructuras se denominan residuos glicano G0, Gl ( -1,6- o a- 1,3-) o G2, en función de la cantidad de residuos Gal terminales (Raju, T.S., Bioprocess Int. 1, 44-53, 2003). La glicosilación de tipo CHO de las partes Fe del anticuerpo Fe se ha descrito por ejemplo en Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14, 201-207, 1997. Los anticuerpos que se expresan de modo recombinante en células hospederas de CHO no glicomodificadas normalmente se fucosilan en el Asn297 en una cantidad por lo menos del 85%. Los oligosacáridos modificados del anticuerpo original de longitud completa pueden ser híbridos o complejos. Con preferencia, los oligosacáridos biseccionados , no fucosilados o de fucosilación reducida son híbridos. En otra modalidad, los oligosacáridos biseccionados, no fucosilados o de fucosilación reducida son complejos.

Según la invención "cantidad de fucosa" significa la cantidad de azúcar dentro de la cadena azúcar del Asn297, referida a la suma de todas las glicoestructuras unidas al Asn297 (por ejemplo estructuras de complejas, híbridas y de alto contenido de mañosa) , medida por espectrometría de masas MALDI-TOF y calculada como valor promedio. La cantidad relativa de fucosa es el porcentaje de estructuras que contienen fucosa, referidas a todas las glicoestructuras identificadas en una muestra tratada de N-glucosidasa F (por ejemplo estructuras complejas, híbridas, de oligomanosa y de alto contenido de mañosa, respectivamente) , determinada por MALDI-TOF (véase por ejemplo WO 2008/077546 (Al) ) .

Una modalidad es la preparación del anticuerpo biespecífico de la subclase IgGl o IgG3 que está glicosilado con una cadena azúcar en Asn297, con lo cual la cantidad de fucosa dentro de la cadena azúcar es del 65% o menos, aplicando el procedimiento descrito en WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana, P. y col . , Nature Biotechnol. 17, 176-180, 1999, WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/ 027966, WO 97/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835 O WO 2000/061739.

Una modalidad es un método de preparación del anticuerpo biespecífico de la subclase IgGl o IgG3 que se ha glicosilado con una cadena azúcar en Asn297, con lo cual la cantidad de fucosa dentro de la cadena azúcar es del 65% o menos, aplicando el procedimiento descrito en Niwa, R. y col., J. Immunol. Methods 306, 151-160, 2005; Shinkawa, T. y col., J. Biol. Chem. 278, 3466-3473, 2003; WO 03/055993 O US 2005/0249722.

Formatos de anticuerpo biespecífico Los anticuerpos de la presente invención tienen dos o más sitios de fijación y son multiespecíficos y, con preferencia, biespecíficos . Es decir, los anticuerpos pueden ser biespecíficos incluso en los casos, en los que hay más de dos sitios de fijación (es decir que el anticuerpo es trivalente o multivalente) . Los anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen, por ejemplo, a los anticuerpos multivalentes de cadena simple, los diacuerpos y los triacuerpos, así como los anticuerpos que tienen la estructura de dominio constante de los anticuerpos de longitud completa a los que se unen otros sitios de fijación sobre antígeno (por ejemplo Fv de cadena simple, un dominio VH y/o un dominio VL, Fab o (Fab)2,) mediante uno o más enlazadores peptídicos . Los anticuerpos pueden ser de longitud completa de una especie única o pueden ser quimerizados o humanizados. En el caso de un anticuerpo con más de dos sitios de fijación sobre el antígeno, algunos sitios de fijación pueden ser idénticos, en el supuesto de que la proteína tenga sitios de fijación sobre dos antígenos diferentes. Es decir, un primer sitio de fijación es específico para la ErbB-2, mientras que el segundo sitio de fijación es específico de la c-Met, o viceversa.

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico que se une específicamente a la ErbB-2 humana y a la c-Met humana según la invención contiene la región Fe de un anticuerpo (con preferencia de la subclase IgGl o IgG3) .

Formatos biespecíficos bivalentes Pueden utilizarse anticuerpos biespecíficos bivalentes contra la ErbB-2 humana y la c-Met humana que contienen regiones constantes de inmunoglobulina del modo descrito por ejemplo en WO 2009/080251, O 2009/080252, WO 2009/080253 o Ridgway, J.B., Protein Eng. 9, 617-621, 1996; O 96/027011; Merchant, A.M. y col., Nature Biotech. 16, 677-681, 1998; Atwell, S. y col., J. Mol. Biol. 270, 26-35, 1997 y EP 1870459A1.

Por lo tanto, en una modalidad de la invención el anticuerpo biespecífico <ErbB-2-c-Met> según la invención es un anticuerpo biespecífico bivalente, que contiene: a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2; y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la c-Met humana, en donde los dominios constantes CL y CH1, y/o los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí.

En otra modalidad de la invención, el anticuerpo biespecífico <ErbB-2-c-Met> según la invención es un anticuerpo biespecífico bivalente, que contiene: a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la c-Met humana; y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ErbB-2 , en donde los dominios constantes CL y CH1, y/o los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí.

Sobre la estructura esquemática ilustrativa de la tecnología de "superhélices" descrita a continuación véanse las figuras 2a-2c.

Para mejorar los rendimientos de tales anticuerpos biespecíficos anti-ErbB-2/anti-C-met , bivalentes, heterodímeros , pueden alterarse los dominios CH3 del anticuerpo de longitud completa con la tecnología de "superhélices" que se describe con detalle mediante varios ejemplos por ejemplo en O 96/027011, Ridgway, J.B. y col., Protein Eng. 9, 617-621, 1996; y Merchant, A.M. y col., Nat . Biotechnol . 16, 677-681, 1998. En este método se alteran las superficies de interacción de los dos dominios CH3 para aumentar la heterodimerización de las dos cadenas pesadas que contienen estos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "dominio sobre enrrollado" , mientras que el otro será el "dominio en forma de horquilla" . La introducción de un puente disulfuro estabiliza los heterodímeros (Merchant, A.M. y col., Nature Biotech. 16, 677-681, 1998; Atwell, S. y col . , J. Mol. Biol. 270 , 26-35, 1997) y aumenta el rendimiento.

Por tanto, en un aspecto de la invención, el anticuerpo biespecífico bivalente está además caracterizado porque : el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se encuentran entre sí en la interfase que contiene una interfase original entre los dominios CH3 del anticuerpo; la interfase se altera para promover la formación del anticuerpo biespecífico bivalente, la alteración se caracteriza porque: a) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada, de modo que dentro de la interfase original, el dominio CH3 de una cadena pesada que entra en contacto con la interfase original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro del anticuerpo biespecífico bivalente, se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral, generando de este modo una protuberancia dentro de la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada que puede posicionarse dentro de una cavidad existente dentro de la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada y b) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada, de modo que dentro de la interfase original del segundo dominio CH3 que entra en contacto con la interfase original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespecífico bivalente se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un volumen menor de cadena lateral, generando de este modo una cavidad dentro de la interfase del segundo dominio CH3, dentro del cual puede posicionarse una protuberancia existente dentro de la interfase del primer dominio CH3.

Con preferencia, el residuo de aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral se selecciona entre la familia formada por arginina (R) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) , triptófano (W) .

Con preferencia, el residuo de aminoácido que tiene un volumen menor de cadena lateral se selecciona entre La familia formada por alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , valina (V) .

En un aspecto de la invención, los dos dominios CH3 se alteran además con la introducción de la cisteína (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de modo que pueda formarse un puente disulfuro entre los dos dominios CH3.

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico bivalente contiene una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" . Puede recurrirse también a un puente disulfuro adicional entre cadenas (Merchant, A.M y col., Nature Biotech. 16, 677-681, 1998) por ejemplo introduciendo una mutación Y349C en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y una mutación E356C o una mutación S354C en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" . Por tanto, en otra modalidad, el anticuerpo biespecífico bivalente contiene las mutaciones Y349C, T366 en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones E356C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 o el anticuerpo biespecífico bivalente contiene las mutaciones Y349C, T366 en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (la mutación Y349C adicional en un dominio CH3 y la mutación adicional E356C o S354C el otro dominio CH3 forman un puente disulfuro entre las cadenas) (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) . Pero, de forma alternativa o adicional pueden aplicarse también otras tecnologías de superhélices descritas en el documento EP 1870459A1. Un ejemplo preferido del anticuerpo biespecífico bivalente son las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) .

En otra modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico bivalente contiene una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" y además las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" .

En otra modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico bivalente contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T365S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 o el anticuerpo biespecífico bivalente contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y además las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" .

Formatos biespecífieos trivalentes Otro aspecto preferido de la presente invención es un anticuerpo biespecífico trivalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2 humana y consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) un fragmento Fab de cadena simple que se une específicamente a la c-Met humana, en donde el fragmento Fab de cadena simple del apartado b) se fusiona con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico en C- o N- terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

Sobre la estructura esquemática ilustrativa de la tecnología de "superhélices" descrita a continuación véase la figura 5a.

Otro aspecto preferido de la presente invención es un anticuerpo biespecífico trivalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2 humana y consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) un fragmento Fv de cadena simple que se une específicamente a la c-Met humana, en donde el fragmento Fv de cadena simple del apartado b) se fusiona con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico en C- o N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

Sobre la estructura esquemática ilustrativa de la tecnología de "superhélices" descrita a continuación véase la Figura 5b.

En una modalidad preferida, tales fragmentos Fab o Fv de cadena simple que se fijan sobre la c-Met humana se fusionan con el anticuerpo de longitud completa mediante un conector peptídico en C-terminal de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa.

Otro aspecto preferido de la presente invención es un anticuerpo biespecífico trivalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2 humana y consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo; b) un polipéptido que consta de ba) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) ; o bb) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio constante 1 de anticuerpo (CH1) , en donde el polipéptido se fusiona con N-terminal del dominio VH mediante un conector peptídico con C-terminal de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa; c) un polipéptido que consta de ca) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) , o cb) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) ; en donde el polipéptido se fusiona con N-terminal del dominio VL mediante un conector peptídico con C- erminal de la otra de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa; y en donde el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) del polipéptido del apartado b) y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) del polipéptido del apartado c) forman, juntos, un sitio de fijación sobre el antígeno que se une específicamente a la c-Met humana.

Con preferencia, tales conectores peptídicos de los apartados b) y c) son idénticos y son un péptido de por lo menos 25 aminoácidos, con preferencia entre 30 y 50 aminoácidos .

Sobre las estructuras esquemáticas ilustrativas, véanse las figuras 3a-3c.

Opcionalmente, el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) del polipéptido del apartado b) y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) del polipéptido del apartado c) están unidos y estabilizados mediante un puente disulfuro entre las cadenas gracias a la introducción de un enlace disulfuro entre las posiciones siguientes : i) la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera, ii) la posición 105 del dominio variable de cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de cadena ligera, o iii) la posición 101 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) .

Las técnicas para la introducción de puentes disulfuro no naturales con fines de estabilización se describen por ejemplo en WO 94/029350, Rajagopal y col., Prot. Engin. 1453-59, (1997); Kobayashi, H . y col., Nuclear Medicine & Biology 25, 387-393, 1998; o Schmidt, M. y col., Oncogene 18, 1711 -1721, 1999. En una modalidad, el enlace disulfuro opcional entre los dominios variables de los polipéptidos de los apartados b) y c) se sitúa entre la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera. En una modalidad, el enlace disulfuro opcional entre los dominios variables de los polipéptidos de los apartados b) y e) se sitúa entre la posición 105 del dominio variable de cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de cadena ligera (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) . En una modalidad es preferido un anticuerpo biespecífico trivalente sin la estabilización opcional con disulfuro entre los dominios variables VH y VL de los fragmentos Fab de cadena simple.

Por la fusión de un fragmento Fab, Fv, de cadena simple con una de las cadenas pesadas (figuras 5a ó 5b) o por la fusión de diferentes polipéptidos con las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa (figuras 3a-c) se forma un anticuerpo biespecífico trivalente heterodímero .

Para mejorar los rendimientos de tales anticuerpos biespecíficos anti-ErbB-3/anti-C-met trivalentes heterodímeros, pueden alterarse los dominios CH3 del anticuerpo de longitud completa con la tecnología de los "superhélices" , que se describe con detalle mediante varios ejemplos por ejemplo en WO 96/027011, Ridgway, J.B. y col., Protein Eng. 9, 617-621, 1996; y Merchant, A.M. y col., Nat . Biotechnol. 16, 677-681, 1998. En este método se alteran las superficies de interacción de los dos dominios CH3 para aumentar la heterodimerización de las dos cadenas pesadas que contienen estos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "dominio sobre enrrollado" , mientras que el otro será el "dominio en forma de horquilla" . La introducción de un puente disulfuro estabiliza a los heterodímeros (Merchant, A.M. y col., Nature Biotech. 16, 677-681, 1998; Atwell, S. y col., J. Mol. Biol . 270 , 26-35, 1997) y aumenta el rendimiento.

Por tanto, en un aspecto de la invención el anticuerpo biespecífico trivalente está caracterizado además porque el dominio CH3 de una cadena pesada del anticuerpo de longitud completa y el dominio CH3 de la otra cadena pesada del anticuerpo de longitud completa entran en contacto en la interfase que contiene una interfase original entre los dominios CH3 del anticuerpo; en donde la interfase se altera para promover la formación del anticuerpo biespecífico bivalente, la alteración se caracteriza porque: a) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada, de tal modo que dentro de la interfase original el dominio CH3 de una cadena pesada que entra en contacto con la interfase original del dominio CH3 de la otra cadena pesada existente dentro del anticuerpo biespecífico bivalente, se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral, con lo cual se genera una protuberancia dentro de la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada que puede posicionarse en una cavidad dentro de la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada y b) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada, de modo que dentro de la interfase original del segundo dominio CH3 que entra en contacto con la interfase original del primer dominio CH3 existente dentro del anticuerpo biespecífico trivalente se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un volumen menor de cadena lateral, con lo cual se genera una cavidad dentro de la interfase del segundo dominio CH3 dentro del cual puede posicionarse una protuberancia existente dentro de la interfase del primer dominio CH3.

En un aspecto de la invención, los dos dominios CH3 se alteran además con la introducción de la cisteína (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3 de modo que pueda formarse un puente disulfuro entre los dos dominios CH3.

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" . Puede recurrirse también a un puente disulfuro adicional entre cadenas (Merchant, A.M y col., Nature Biotech. 16, 677-681, 1998) por ejemplo introduciendo una mutación Y349C en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y una mutación E356C o una mutación S354C en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" . Por tanto, en otra modalidad, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones E356C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 o el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las mutaciones Y349C, T366 en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (la mutación Y349C adicional en un dominio CH3 y la mutación adicional E356C o S354C el otro dominio CH3 forman un puente disulfuro entre las cadenas) (numeración siempre de acuerdo al índice EÜ de Kabat) . Pero, de forma alternativa o adicional pueden aplicarse también otras tecnologías de superhélices descritas en el documento EP 1870459A1. Un ejemplo preferido del anticuerpo biespecífico trivalente son las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) .

En otra modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" y además las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" .

En otra modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 o el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y además las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" .

Otra modalidad de la presente invención es un anticuerpo biespecífico trivalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2 humana y consta de: aa) dos cadenas pesadas de anticuerpo formadas en la dirección de N-terminal a C-terminal-terminal por un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CH1) , una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3); y ab) dos cadenas ligeras de anticuerpo formadas en dirección de N-terminal a C-terminal por un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) (VL-CL) ; y b) un fragmento Fab de cadena simple que se une específicamente a la c-Met humana) , en donde el fragmento Fab de cadena simple consta de un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio constante 1 de anticuerpo (CH1) , un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) , un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) y un enlazador, y en donde los dominios del anticuerpo y el enlazador tienen uno de los órdenes siguientes en la dirección de N-terminal a C-terminal : ba) VH-CHl-enlazador-VL-CL, o bb) VL-CL-enlazador- VH-CH1; en donde el enlazador es un péptido de por lo menos 30 aminoácidos, con preferencia entre 32 y 50 aminoácidos; y en donde el fragmento Fab de cadena simple del apartado b) se fusiona con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico de C- o N-terminal de la cadena pesada o ligera (con preferencia en C-terminal de la cadena pesada) del anticuerpo de longitud completa; en donde el conector peptídico es un péptido de por lo menos 5 aminoácidos, con preferencia entre 10 y 50 aminoácidos .

Dentro de esta modalidad, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene con preferencia una mutación T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y con mayor preferencia el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C (o E356C) , T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3. Opcionalmente , en la modalidad, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" .

Otra modalidad de la presente invención es un anticuerpo biespecífico trivalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2 humana y consta de: aa) dos cadenas pesadas de anticuerpo formadas en la dirección de N-terminal a C-terminal por un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CH1) , una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3) ; y ab) dos cadenas ligeras de anticuerpo formadas en la dirección de N-terminal a C-terminal por un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) (VL-CL) ; y b) un fragmento Fv de cadena simple que se une específicamente a la c-Met humana) , en donde el fragmento Fv de cadena simple del apartado b) se fusiona con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico de C- o N-terminal de la cadena pesada o ligera (con preferencia en C-terminal de la cadena pesada) del anticuerpo de longitud completa; y en donde el conector peptídico es un péptido de por lo menos 5 aminoácidos, con preferencia entre 10 y 50 aminoácidos .

Dentro de esta modalidad, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene con preferencia una mutación T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y con mayor preferencia el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C (o E356C) , T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3. Opcionalmente, en la modalidad, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" .

Por tanto, una modalidad preferida es un anticuerpo biespecífico trivalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2 humana y consta de: aa) dos cadenas pesadas de anticuerpo formadas en la dirección de N-terminal a C-terminal por un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CH1) , una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3) ; y ab) dos cadenas ligeras de anticuerpo formadas en la dirección de N-terminal a C-terminal por un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) (VL-CL) ; y b) un fragmento Fv de cadena simple que se une específicamente a la c-Met humana) , en donde el fragmento Fv de cadena simple del apartado b) se fusiona con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico en C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa (formándose dos péptidos de fusión de cadena pesada de anticuerpo y Fv de cadena simple) ; y en donde el conector peptídico es un péptido de por lo menos 5 aminoácidos .

Otra modalidad de la presente invención es un anticuerpo biespecífico trivalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2 humana y consta de: aa) dos cadenas pesadas de anticuerpo formadas en la dirección de N-terminal a C-terminal por un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CH1) , una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3) ; y ab) dos cadenas ligeras de anticuerpo formadas en la dirección de N-terminal a C-terminal por un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) ; y b) un polipéptido formado por ba) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) ; o bb) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio constante 1 de anticuerpo (CH1) , en donde el polipéptido se fusiona con N-terminal del dominio VH mediante un conector peptídico con C-terminal de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa (formándose un péptido de fusión de la cadena pesada de anticuerpo y la VH) , en donde el conector peptídico es un péptido de por lo menos 5 aminoácidos, con preferencia entre 25 y 50 aminoácidos; c) un polipéptido formado por: ca) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) , o cb) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) ; en donde el polipéptido se fusiona con N-terminal del dominio VL mediante un conector peptidico con C-terminal de la otra de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa (formándose un péptido de fusión de la cadena pesada de anticuerpo y la VL) ; en donde el conector peptidico es idéntico al conector peptidico del apartado b) ; y en donde el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) del polipéptido del apartado b) y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) del polipéptido del apartado c) forman, juntos, un sitio de fijación sobre el antígeno que se une específicamente a la c- et humana.

Dentro de esta modalidad, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene con preferencia una mutación T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y con mayor preferencia el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C (o E356C) , T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3. Opcionalmente , en la modalidad, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" .

En otro aspecto de la presente invención, el anticuerpo biespecífico trivalente según la invención contiene : a) un anticuerpo de longitud completa que se fija sobre la ErbB-2 humana, que consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo VH-CH1-HR-CH2-CH3 y dos cadenas ligeras de anticuerpo VL-CL; (en donde con preferencia uno de los dos dominios CH3 contiene las mutaciones Y349C, T366W y el otro de los dos dominios CH3 contiene las mutaciones S354C (o E356C) , T366S, L368A, Y407V) ; b) un polipéptido formado por: ba) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) ; o bb) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio constante 1 de anticuerpo (CHl) , en donde el polipéptido se fusiona con N-terminal del dominio VH mediante un conector peptídico con C-terminal de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa: c) un polipéptido formado por: ca) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) , o cb) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) ; en donde el polipéptido se fusiona con N-terminal del dominio VL mediante un conector peptídico con C-terminal de la otra de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa; y en donde el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo (VH) del polipéptido del apartado b) y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) del polipéptido del apartado c) forman, juntos, un sitio de fijación sobre el antígeno que se une específicamente a la c-Met humana.

Formatos biespecífieos tetravalentes En una modalidad, el anticuerpo multiespecífico según la invención es tetravalente, en donde el o los sitios de fijación sobre el antígeno, que se unen específicamente a la c-Met humana, inhiben la dimerización de la c-Met (tal como se describe por ejemplo en WO 2009/007427) .

En una modalidad de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico tetravalente que se une específicamente a la ErbB-2 humana y a la c-Met humana, que contiene dos sitios de fijación a antígeno que se unen específicamente a ErbB-2 humana y dos sitios de fijación sobre antígeno que se unen específicamente a la c-Met humana, tales sitios de fijación sobre antígeno que se unen específicamente a la c-Met humana inhiben la dimerización de la c-Met (tal como se describe por ejemplo en WO 2009/007427) .

Otro aspecto de la presente invención es, pues, un anticuerpo biespecífico tetravalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la c-Met humana y consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) dos fragmentos Fab de cadena simple idénticos que se une específicamente a la ErbB-2, tales fragmentos Fab de cadena simple del apartado b) se fusionan con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico de C- o N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

Otro aspecto de la presente invención es, pues, un anticuerpo biespecífico tetravalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2 humana y consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) dos fragmentos Fab de cadena simple idénticos que se une específicamente a la c-Met humana, tales fragmentos Fab de cadena simple del apartado b) se fusionan con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico de C- o N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

Respecto a la estructura esquemática ilustrativa, véase la figura 6a.

Otro aspecto de la presente invención es, pues, un anticuerpo biespecífico tetravalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2, y consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) dos fragmentos Fv de cadena simple idénticos que se une específicamente a la c-Met humana, tales fragmentos Fv de cadena simple del apartado b) se fusionan con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico de C- o N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

Otro aspecto de la presente invención es, pues, un anticuerpo biespecífico tetravalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la c-Met humana y consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) dos fragmentos Fv de cadena simple idénticos que se une específicamente a la ErbB-2, tales fragmentos Fv de cadena simple del apartado b) se fusionan con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico de C- o N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

Respecto a la estructura esquemática ilustrativa véase la figura 6b.

En una modalidad preferida, tales fragmentos Fab o Fv de cadena simple que se unen a la c-Met humana o a la ErbB-2 humana se fusionan con el anticuerpo de longitud completa mediante un conector peptídico en C-terminal de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa.

Otra modalidad de la presente invención es un anticuerpo biespecífico tetravalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2 humana y consta de: aa) dos cadenas pesadas de anticuerpo idénticas formadas en la dirección de N-terminal a C-terminal por un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CH1) , una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) , y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3) ; y ab) dos cadenas ligeras de anticuerpo idénticas formadas en la dirección de N-terminal a C-terminal por un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) (VL-CL) ; y b) dos fragmentos Fab de cadena simple que se unen específicamente a la c-Met humana, tales fragmentos Fab de cadena simple están formados por un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio constante 1 de anticuerpo (CH1) , un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) , un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) y un enlazador, y tales dominios del anticuerpo y el enlazador tienen uno de los siguientes órdenes en la dirección de N-terminal a C-terminal: ba) VH-CHl-enlazador-VL-CL, o bb) VL-CL-enlazador- VH-CH1; el enlazador es un péptido de por lo menos 30 aminoácidos, con preferencia entre 32 y 50 aminoácidos; y tales fragmentos Fab de cadena simple del apartado b) se fusionan con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico de C-o N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa; el conector peptídico es un péptido de por lo menos 5 aminoácidos, con preferencia entre 10 y 50 aminoácidos.

El término "anticuerpo de longitud completa" se emplea en formato trivalente o tetravalente e indica un anticuerpo formado por dos "cadenas pesadas de anticuerpo de longitud completa" y dos "cadenas ligeras de anticuerpo de longitud completa" (ver la figura 1) . Una "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido formado en la dirección de N-terminal a C-terminal por un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CH1) , una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3) , abreviado por VH-CH1-HR-CH2 -CH3 ; y opcionalmente un dominio constante 4 de cadena pesada de anticuerpo (CH4) en el caso de un anticuerpo de la subclase IgE. Con preferencia, la "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido formado en la dirección de N-terminal a C-terminal por VH, CH1, HR, CH2 y CH3. Una "cadena ligera de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido formado en la dirección de N-terminal a C-terminal por un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) , abreviado por VL-CL. El dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) puede ser el ? (kappa) o el ? (lambda) . Las dos cadenas de anticuerpo de longitud completa están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro entre polipéptidos, es decir entre el dominio CL y el dominio CH1 y entre las regiones bisagra de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de anticuerpos típicos de longitud completa son los anticuerpos naturales del tipo IgG (por ejemplo IgG 1 e IgG2) , IgM, IgA, IgD e IgE . Los anticuerpos de longitud completa según la invención pueden ser de una sola especie, por ejemplo humanos, o pueden ser anticuerpos quimerizados o humanizados. Los anticuerpos de longitud completa según la invención contienen dos sitios de fijación sobre antígeno, cada uno de ellos está formado por un par de VH y VL, estas dos se unen específicamente al mismo antígeno. El C-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa indica el último aminoácido de C-terminal de la cadena pesada o ligera. El extremo N de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa indica el último aminoácido de N-terminal de la cadena pesada o ligera.

El término "conector peptídico" se emplea en la invención para indicar un péptido con secuencias de aminoácidos, que es con preferencia de origen sintético. Estos conectores peptídicos según la invención se emplean para fusionar los fragmentos Fab de cadena simple con C- o N-terminal del anticuerpo de longitud completa para formar un anticuerpo multiespecífico según la invención. Con preferencia, tales conectores peptídicos del apartado b) son péptidos con una secuencia de aminoácidos de una longitud por lo menos de 5 aminoácidos, con preferencia con una longitud de 5 a 100, con mayor preferencia de 10 a 50 aminoácidos. En una modalidad, el conector peptídico es (GxS)n o (GxS)nGm, siendo G = glicina, S = serina, y (x = 3, n = 3, 4, 5 ó 6, y m = 0, 1, 2 ó 3) o (x = 4, n = 2, 3, 4 ó 5 y m = 0, 1, 2 6 3), con preferencia x = 4 y n = 2 ó 3, con mayor preferencia con x = 4, n= 2. Con preferencia, en los anticuerpos biespecíficos trivalentes, en los que un polipéptido VH o VH-CH1 y un polipéptido VL o VL-C L (figuras 7a-7c) se han fusionado mediante dos conectores peptídicos idénticos con C-terminal de un anticuerpo de longitud completa; tales conectores peptídicos son péptidos por lo menos de 25 aminoácidos, con preferencia péptidos entre 30 y 50 aminoácidos y con mayor preferencia el el conector peptídico es (GxS)n o (GxS)nGm, siendo G = glicina, S = serina y (x = 3, n = 6, 7 ú 8, y m = 0, 1, 2 ó 3) o (x = 4 , n = 5, 6 ó 7 y m = 0, 1, 2 ó 3) , con preferencia x = 4 y n = 5, 6, 7.

Un "fragmento Fab de cadena simple" (ver figura 2a) es un polipéptido que consta de un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de anticuerpo (CH1) , un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) , un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) y un enlazador, tales dominios de anticuerpo y el enlazador tienen uno de los órdenes siguientes en la dirección de N-terminal a C-terminal: a) VH-CHl-enlazador-VL-CL, b) VL-CL-enlazador-VH-CHl, c) VH-CL-enlazador-VL-CHl o d) VL-CH1-enlazador-VH-CL; y el enlazador es un polipéptido de por lo menos 30 aminoácidos, con preferencia entre 32 y 50 aminoácidos. Tales fragmentos Fab de cadena simple a) VH-CH1-enlazador-VL-CL, b) VL-CL-enlazador-VH-CHl, c) VH-CL-enlazador-VL-CHl y d) VL-CHl-enlazador-VH-CL, se estabilizan mediante el enlace disulfuro natural entre el dominio CL y el dominio CH1. El término "extremo N" indica el último aminoácido de N-terminal, el término "C-terminal" indica el último aminoácido de C-terminal.

El término "enlazador" se emplea en la invención en relación con los fragmentos Fab de cadena simple e indica un péptido con secuencias de aminoácidos, que es con preferencia de origen sintético. Estos péptidos según la son se emplean para unir a) VH-CH1 con VL-CL, b) VL-CL con VH-CH1, c) VH-CL con VL-CH1 o d) VL-CH1 con VH-CL para formar los siguientes fragmentos Fab de cadena simple según la invención a) VH-CH1-enlazador-VL-CL, b) VL-CL-enlazador-VH-CHl, c) VH-CL-enlazador-VL-CHl o d) VL-CHl-enlazador-VH-CL. El enlazador dentro de los fragmentos Fab de cadena simple es un péptido con una secuencia de aminoácidos que tiene una longitud de por lo menos 30 aminoácidos, con preferencia una longitud de 32 a 50 aminoácidos. En una modalidad, el enlazador es (GxS)n, siendo G = glicina, S = serina, (x = 3, n = 8, 9 6 10 y m = 0, 1, 2 6 3) o (x = 4 y n = 6, 7 ú 8 y m = 0, 1, 2 6 3) , con preferencia siendo x = 4, n = 6 ó 7 y m = 0, 1, 2 ó 3, con mayor preferencia siendo x = 4, n = 7 y m = 2. En una modalidad, el enlazador es (G4S)6G2.

En una modalidad preferida, tales dominios de anticuerpo y el enlazador en el fragmento Fab de cadena simple tienen uno de los órdenes siguientes en la dirección de N-terminal a C-terminal: a) VH-CH1-enlazador-VL-CL, o b) VL-CL-enlazador-VH- CHl, con mayor preferencia VL-CL-enlazador-VH-CHl.

En otra modalidad preferida, tales dominios de anticuerpo y el enlazador en el fragmento Fab de cadena simple tienen uno de los órdenes siguientes en la dirección de N-terminal a C-terminal: a) VH-CL-enlazador-VL-CHl o b) VL-CHl-enlazador-VH- CL.

Opcionalmente en el fragmento Fab de cadena simple, además del enlace disulfuro natural entre el dominio CL y el dominio CH1, también el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) se estabilizan con disulfuro mediante la introducción de un enlace disulfuro entre las posiciones siguientes : i) la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera, ii) la posición 105 del dominio variable de cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de cadena ligera, o iii) la posición 101 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) .

La estabilización adicional con disulfuro de los fragmentos Fab de cadena simple se logra con la introducción de un enlace disulfuro entre los dominios variables VH y VL de los fragmentos Fab de cadena simple. Las técnicas para introducir puentes disulfuro no naturales para la estabilización de un Fv de cadena simple se han descrito por ejemplo en WO 94/029350, Rajagopal, V. y col., Prot . Engin. 1453-59, (1997) ; Kobayashi, H. y col., Nuclear Medicine & Biology 25, 387-393, 1998; o Schmidt, M. y col., Oncogene 1J3, 1711-1721, 1999. En una modalidad, el enlace disulfuro opcional entre los dominios variables de los fragmentos Fab de cadena simple existentes en el anticuerpo según la invención se sitúa entre la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera. En una modalidad, el enlace disulfuro opcional entre los dominios variables de los fragmentos Fab de cadena simple existente en el anticuerpo según la invención se sitúa entre la posición 105 del dominio variable de cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de cadena ligera (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) .

En una modalidad, son preferidos los fragmentos Fab de cadena simple sin la estabilización opcional con disulfuro entre los dominios variables VH y VL de los fragmentos Fab de cadena simple.

Un "fragmento Fv de cadena simple" (ver figura 2b) es un polipéptido que consta de un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un Fv de cadena simple-enlazador, tales dominios de anticuerpo y el Fv de cadena simple-enlazador tienen uno de los órdenes siguientes en la dirección de N-terminal a C-terminal: a) VH-Fv de cadena simple-enlazador-VL, b) VL-Fv de cadena simple-enlazador-VH; con preferencia a) VH-Fv de cadena simple-enlazador-VL, y el Fv de cadena simple-enlazador es un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene una longitud de por lo menos 15 aminoácidos, en una modalidad una longitud de por lo menos 20 aminoácidos. El término "extremo N" indica el último aminoácido de N-terminal. El término "C-terminal" indica el último aminoácido de C-terminal.

El término "enlazador Fv de cadena simple" empleado en el fragmento Fv de cadena simple indica un péptido con secuencias de aminoácidos, que es con preferencia de origen sintético. El enlazador Fv de cadena simple es un péptido con una secuencia de aminoácidos que tiene una longitud de por lo menos 15 aminoácidos, en una modalidad una longitud de por lo menos 20 aminoácidos y con preferencia una longitud entre 15 y 30 aminoácidos. En una modalidad, el enlazador Fv de cadena simple es (GxS)n, en donde G = glicina, S = serina, (x = 3 y n= 4, 5 6 6) o (x = 4 y n = 3, 4, 5 Ó 6), con preferencia con x = 4, n = 3, 4 ó 5, con mayor preferencia con x = 4, n = 3 ó 4. En una modalidad, el enlazador Fv de cadena simple es (G4S)3 o (G4S)4.

Además, tales fragmentos Fv de cadena simple están con preferencia estabilizados con disulfuro. La estabilización adicional con disulfuro de los anticuerpos de cadena simple se realiza mediante la introducción de un enlace disulfuro entre los dominios variables de los anticuerpos de cadena simple y se ha descrito por ejemplo en O 94/029350, Rajagopal, V. y col., Prot . Engin. 10, 1453-59, 1997; Kobayashi, H. y col., Nuclear Medicine & Biology 25, 387-393, 1998; o Schmidt, M. y col., Oncogene 18, 1711 -1721, 1999.

En una modalidad de los fragmentos Fv de cadena simple estabilizados con disulfuro, el enlace disulfuro entre los dominios variables de los fragmentos Fv de cadena simple existentes en el anticuerpo según la invención se selecciona con independencia de cada fragmento Fv de cadena simple entre : i) la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera, ii) la posición 105 del dominio variable de cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de cadena ligera, o iii) la posición 101 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera.

En una modalidad, el enlace disulfuro entre los dominios variables de los fragmentos Fv de cadena simple existente en el anticuerpo según la invención se sitúa entre la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera.

El anticuerpo según la invención se produce por medios recombinantes . Es, pues, un aspecto de la presente invención un ácido nucleico que codifica al anticuerpo según la invención y otro aspecto es una célula que contiene el ácido nucleico que codifica a un anticuerpo según la invención. Los métodos de producción recombinante son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y consisten en la expresión de proteínas en células procariotas y eucariotas y el posterior aislamiento del anticuerpo y normalmente la purificación del mismo hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión recién mencionada de los anticuerpos en una célula hospedera se insertan los ácidos nucleicos que codifican a las respectivas cadenas corta y larga modificadas en vectores de expresión por métodos estándar. La expresión se realiza en células hospederas procariotas o eucariotas apropiadas, por ejemplo las células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levadura o células de E. coli, y se recupera el anticuerpo de las células (líquido sobrenadante o células después de la lisis) . Los métodos generales de producción recombinante de anticuerpos son bien conocidos en el estado de la técnica y se han descrito, por ejemplo, en artículos de revistas científicas, de autores como Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17, 183-202, 1999; Geisse, S. y col., Protein Expr. Purif. 8_, 271-282, 1996; Kaufman, R. , J. Mol. Biotechnol . 16, 151-160, 2000; Werner, R.G., Drug Res. 48, 870-880, 1998.

Los anticuerpos biespecíficos se separan del medio de cultivo de modo conveniente por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina, por ejemplo proteína A-sefarosa, cromatografía a través de hidroxilapatita, electroforesis a través de gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN y el ARN que codifican a los anticuerpos monoclonales se aislan fácilmente y se secuencian aplicando procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como fuentes de tales ADN y ARN. Una vez aislado, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que se transfectan a células hospederas del tipo células HEK 293, células CHO o células de mieloma que de otro modo no producirían proteína de inmunoglobulina para realizar la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células hospederas.

Las variantes de secuencias de aminoácidos (o mutantes) del anticuerpo biespecífico se obtienen introduciendo los cambios apropiados de nucleótidos en el ADN del anticuerpo o por síntesis de nucleótidos. Sin embargo, estas modificaciones pueden realizarse solamente en un intervalo muy limitado, por ejemplo del modo antes descrito. Por ejemplo, las modificaciones no alteran las características del anticuerpo antes mencionadas, por ejemplo el isotipo de IgG y la fijación sobre el antígeno, pero pueden mejorar el rendimiento de la producción recombinante , la estabilidad de la proteína o facilitar la purificación.

El término "célula hospedera" se emplea en la presente solicitud para indicar cualquier tipo de sistema celular que puede diseñarse para generar los anticuerpos según la presente invención. En una modalidad, las células HEK293 y las células CHO se emplean como células hospederas. Tal como se emplea aquí, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se emplean indistintamente y todas las denominaciones incluyen a la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objetivo primaria y los cultivos derivados de la misma con independencia del número de transferencias. Se da también por supuesto que toda la progenie puede que no sea exactamente idéntica en cuanto al contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que se ha explorado en la célula transformada original.

La expresión en células NSO se ha descrito por ejemplo en Barnes, L.M. y col., Cytotechnology 3_2, 109-123, 2000; Barnes, L.M. y col., Biotech. Bioeng. 73_, 261-270, 2001. La expresión transitoria se ha descrito por ejemplo en Durocher, Y. y col., Nucí. Acids. Res. 3_0, E9, 2002. La clonación de los dominios variables se ha descrito en Orlandi, R. y col., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 86, 3833-3837, 1989; C rter, P. y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 8J3, 4285-4289, 1992; y Norderhaug, L. y col., J. Immunol . Methods 204 , 77-87, 1997. Un sistema de expresión transitoria preferido (HEK 293) se ha descrito en Schlaeger, E.-J. y Christensen, K. , en Cytotechnology 3_0, 71-83, 1999 y en Schlaeger, E.-J., en J. Immunol. Methods 194 , 191-199, 1996.

Las secuencias de control idóneas para procariotás, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador y un sitio de unión a un ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, intensificadores y señales de poliadenilación.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una pre-secuencia o líder secretorio está unido operativamente con un ADN de un polipéptido si se expresa como pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está unido operativamente con una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de un ribosoma está unido operativamente con una secuencia codificadora si está posicionado de tal manera que facilita la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se van a unir son contiguas, y, en el caso de un líder secretorio, son contiguas y están dentro del marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen que estar contiguos. La unión se realiza por ligación en sitios de restricción oportunos. Si no existen tales sitios, se emplearán adaptadores o enlazadores oligonucleótidos sintéticos de acuerdo a la práctica convencional .

La purificación de anticuerpos se realiza con el fin de eliminar componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, por técnicas estándar, incluido el tratamiento alcalino/SDS , el contraste con CsCl, la cromatografía de columna, la electroforesis a través de gel de agarosa y otros métodos bien conocidos de la técnica, véase Ausubel, F. y col., coord., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York (1987) . Los diferentes métodos se han consolidado y se emplean con frecuencia para la purificación de proteínas, por ejemplo la cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo cromatografía de afinidad de proteína A o proteína G) , cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo intercambio catiónico (resinas de carboximetilo) , intercambio aniónico (resinas de aminoetilo) y de intercambio mixto) , la adsorción tiófila (por ejemplo con beta-mercapto-etanol y otros ligandos SH) , la interacción hidrófoba o la cromatografía de adsorción aromática (por ejemplo con fenil-sefarosa, resinas aza-arenófilas o con ácido m-aminofenil-borónico) , cromatografía de afinidad con quelatos metálicos (por ejemplo con material de afinidad Ni(II) y Cu(II)), la cromatografía de exclusión de tamaños y los métodos electroforéticos (por ejemplo la electroforesis a través de gel, la electroforesis capilar) (Vij yalakshmi , M.A. , Appl . Biochem. Biotech. 75, 93-102, 1998) .

Tal como se emplean aquí, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se emplean indistintamente y todas las denominaciones incluyen la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objetivo primaria y los cultivos derivados de la misma con independencia del número de transferencias. Se da también por supuesto que toda la progenie puede que no sea exactamente idéntica en cuanto al contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas . Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que se ha explorado en la célula transformada original. Cuando existan distintas denominaciones, su significado resultará claro por el contexto.

El término "transformación" se emplea aquí para indicar un proceso de transferencia de un vector/ácido nucleico a una célula hospedera. Si se emplean como células hospederas células sin barrera de pared celular formidable, la transfección se puede llevar a cabo por ejemplo por el método de precipitación con fosfato cálcico descrito por Graham, F.L., van der Eb, A.J., Virology 52, 456-467, 1978. Sin embargo pueden emplearse también otros métodos de introducción del ADN en las células, como son la inyección nuclear o la fusión de protoplastos . Si se emplean células procariotas o células que contienen construcciones sustanciales de pared celular, por ejemplo un método de transfección el tratamiento con calcio empleando el cloruro calcico, descrito por Cohén, S.N. y col., PNAS . 69, 2110-2114, 1972.

Tal como se emplea aquí, "expresión" indica el proceso por el que un ácido nucleico se transcribe al ARNm y/o el proceso por el que el ARNm transcrito (también llamado transcrito) se traduce seguidamente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados se denominan colectivamente productos genéticos. Si el polinucleótido deriva del ADN genómico, la expresión en una célula eucariota puede incluir el empalme del ARNm.

Un "vector" es una molécula de ácido nucleico, en particular una molécula auto-replicante, que transfiere una molécula de ácido nucleico insertada a y/o entre células hospederas. El término incluye a los vectores que funcionan primariamente para la inserción de ADN o ARN en una célula (por ejemplo, integración cromosómica) , la replicación de vectores que funcionan primariamente para la replicación de ADN o ARN y vectores de expresión que funcionan para la transcripción y/o traducción del ADN o ARN. Se incluyen también los vectores que proporcionan más de una de las funciones descritas.

Un "vector de expresión" es un polinucleótido que, cuando se introduce en una célula hospedera apropiada, puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Un "sistema de expresión" se emplea normalmente para indicar una célula hospedera apropiada que consta de un vector de expresión que puede funcionar para generar un producto de expresión deseado .

Composición farmacéutica Un aspecto de la invención es una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo según la invención. Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo según la invención para la fabricación de una composición farmacéutica. Otro aspecto de la invención es un método para la fabricación de una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo según la invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo una composición farmacéutica, que contiene un anticuerpo según la presente invención, formulado junto con un portador farmacéutico.

Una modalidad de la invención es el anticuerpo biespecífico según la invención para el tratamiento del cáncer .

Otro aspecto de la invención es la composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo según la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es método de tratamiento de un paciente que sufre un cáncer que consiste en administrar un anticuerpo según la invención a un paciente que necesite el tratamiento.

Tal como se emplea aquí, "portador farmacéutico" incluye a todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y retardantes de absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles. Con preferencia, el portador es idóneo para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo por inyección o infusión) .

Una composición de la presente invención puede administrarse por una gran variedad de métodos ya conocidos de la técnica. Los expertos sabrán apreciar que la vía y/o el modo de administración pueden variar en función de los resultados deseados. Para administrar un compuesto de la invención por ciertas vías de administración, puede ser necesario revestir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para impedir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse a un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen la solución salina y las soluciones acuosas tamponadas . Los portadores farmacéuticos incluyen las soluciones o dispersiones acuosas estériles y los polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas ya es conocido en la técnica.

Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" se emplea aquí para indicar los modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, normalmente por inyección e incluyen, sin limitación, la inyección intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradermal, intraperitoneal , transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal , epidural e intraesternal y la infusión.

El término cáncer se emplea aquí para indicar enfermedades proliferativas , por ejemplo linfornas, leucemias linfocíticas , cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no de células pequeñas (NSCL) , cáncer de pulmón de células bronquioloalveolares , cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intra-ocular, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de útero, carcinoma de los tubos de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de glándula tiroides, cáncer de glándula paratiroides , cáncer de cápsula suprarrenales, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de ríñones o de uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasmas del sistema nervioso central (SNC) , tumores del eje espinal, glioma del tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas , sch anomas, ependimonas, meduloblastomas , meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitario y sarcoma de Ewings , incluidas las versiones refractarias de cualquiera de los cánceres recién mencionados o las combinaciones de uno o más de los cánceres anteriores .

Otro aspecto de la invención es el anticuerpo biespecífico según la invención o la composición farmacéutica como agente anti-angiogénico . Tal agente anti-angiogénico puede utilizarse para el tratamiento del cáncer, en especial tumores sólidos y otras enfermedades vasculares.

Una modalidad de la invención es el anticuerpo biespecífico según la invención para el tratamiento de enfermedades vasculares.

Otro aspecto de la invención es la composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades vasculares .

Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo según la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades vasculares.

Otro aspecto de la invención es método de tratamiento de paciente que sufre enfermedades vasculares mediante la administración un anticuerpo según la invención a un paciente que necesite el tratamiento.

El término "enfermedades vasculares" incluye el cáncer, enfermedades inflamatorias, aterosclerosis, isquemia, trauma, septicemia, COPD, asma, diabetes, AMD, retinopatía, apoplejía, adiposidad, lesión pulmonar aguda, hemorragias, derrame vascular, por ejemplo inducido por citocinas, alergia, enfermedad de Graves, tiroiditis autoinmune de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, arteritis de células gigantes, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE) , nefritis por lupus, enfermedad de Cróhn, esclerosis múltiple, colitis ulcerante, en especial los tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares, por ejemplo retinopatías proliferativas o la degeneración macular debida a la edad (AMD) , artritis reumatoide y psoriasis (Folkman, J. y col., J. Biol . Chem. 267, 10931-10934, 1992; Klagsbrun, M. y col., Annu. Rev. Physiol. 53, 217-239, 1991; y Garner, A., Vascular diseases, en: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A. y Klintworth, G.K., (coord. ) , 2a edición, Marcel Dekker, Nueva York 1994, pp . 1625-1710) .

Estas composiciones pueden contener también adyuvantes como son los conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes . La prevención de la presencia de microorganismos puede asegurarse tanto con procedimientos de esterilización, ver más arriba, como por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos , por ejemplo, parabeno, clorobutanol , fenol, ácido sórbico y similares. Puede ser también deseable la inclusión en las composiciones de agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, cloruro sódico y similares. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción, como son el monoesterato de aluminio y la gelatina.

Con independencia de la vía de administración elegida, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales, que los expertos ya conocen.

Los niveles reales de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse con el fin de obtener una cantidad de ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada en un paciente, una composición y un modo de administración concretos, sin ser tóxicos para el paciente. El nivel de dosificación elegido dependerá de un gran número de factores farmacocinéticos , incluida la actividad de las composiciones concretas de la presente invención que se empleen, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto concreto que se emplee, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales que se utilicen en combinación con las composiciones concretas empleadas, la edad, el sexo, el peso, el estado patológico, el estado general de salud y el historial médico previo del paciente a tratar así como los factores bien conocidos en las técnicas médicas .

La composición tiene que ser estéril y líquida en un grado tal que la composición pueda administrarse con una jeringuilla. Además del agua, el portador es con preferencia una solución salina tamponada isotónica.

La fluidez correcta puede mantenerse, por ejemplo, con el uso de recubrimiento, tal como la lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y con el uso de tensioactivos . En muchos casos es preferible incorporar a la composición agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes, tales como la manitol o la sorbitol y cloruro sódico.

Ahora se ha encontrado que los anticuerpos biespecíficos según la presente invención contra la ErbB-2 humana y la c-Met humana tienen características valiosas, por ejemplo su actividad biológica o farmacológica.

Procedimiento experimental Ejemplos Materiales y métodos Técnicas de ADN recom inante Para manipular el ADN se aplican los métodos estándar descritos en Sambrook, J. y col., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Los reactivos de biología molecular se emplean de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Análisis de secuencias de ADN y de proteínas y gestión de los datos de las secuencias La información general respecto a las secuencias de nucleótido de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas se encontrará en: Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta ed., NIH, publicación n° 91-3242. Los aminoácidos de las cadenas de anticuerpo se numeran y nombran según la numeración EU (Edelman, G.M. y col., PNAS 63^ 78-85, 1969; Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta ed. , publicación NIH n° 91-3242) . Para la creación de la secuencia, mapeo, análisis e ilustración se emplean el paquete informático GCG (Genetics Computer Group, Madison, isconsin) , versión 10.2 y el programa Infomax's Vector NTI Advance suite, versión 8.0.

Secuenciación del ADN Se determinan las secuencias de ADN por secuenciación de estructura bicatenaria realizada en SequiServe (Vaterstetten, Alemania) y Geneart AG (Regensburg, Alemania) .

Síntesis genética Los segmentos de genes deseados se preparan en Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR por síntesis genética automatizada. Los segmentos de genes, que están flanqueados por sitios de separación de endonucleasa de restricción singular se clonan en plásmidos pGAl8 (ampR) . Se purifica el ADN plásmido a partir de las bacterias transformadas y la concentración se determina por espectroscopia UV. La secuencia de ADN de los fragmentos de genes subclonados se confirma por secuenciación del ADN. De manera similar se preparan por síntesis genética secuencias de ADN que codifican a la cadena pesada de anticuerpo <ErbB-2> modificada por "superhélices" , que lleva las mutaciones S354C y T366W en el dominio CH3 con o sin una región VH de scFab 5D5 <c-Met> de C-terminal unida mediante un conector peptídico así como la cadena pesada de anticuerpo <ErbB-2> modificada por "superhélices" que lleva las mutaciones Y349C, T366S, L368A y Y407V, con o sin una región VL de scFab 5D5 <c- et> de C-terminal unida mediante un conector peptídico, flanqueadas con sitios de restricción BamHI y Xbal . Finalmente se sintetizan secuencias de ADN que codifican a las cadenas larga y corta sin modificar de anticuerpos <ErbB-2> y anticuerpo 5D5 <c-Met>, flanqueadas con sitios de restricción BamHI y Xbal. Todos los constructos se diseñan con una secuencia de ADN del extremo 5' que codifica a un péptido líder (MG SCIILFLVATATGVHS) , que se dirige a proteínas que se segregan en células eucariotas.

Construcción de plásmidos de expresión Se emplea un vector de expresión Roche para la construcción de todos los plásmidos de expresión que codifican a la proteína de fusión scFv de cadena pesada y ligera. El vector se compone de los elementos siguientes: un gen de resistencia a la higromicina como marcador de selección, un origen de replicación, oriP, de virus de Epstein-Barr (EBV) , - un origen de replicación del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido en E. coli, - un gen de beta-lactamasa que confiere resistente a la ampicilina en E. coli, - el intensificador inmediato anterior y el promotor del citomegalovirus humano (HCMV) , - la secuencia de señal de poliadenilación de 1-inmunoglobulina humana ("poli A") y - sitios de restricción únicos BamHI y Xbal .

Los genes de fusión de inmunoglobulina que contienen los constructos de cadena ligera o pesada así como los constructos de "superhélices" con dominios VH y VL de C-terminal se obtienen por síntesis genética y se clonan en plásmidos pGA18 (ampR) del modo descrito. Los plásmidos pG18 (ampR) que llevan los segmentos de ADN sintetizado y el vector de expresión Roche se digieren con enzimas de restricción BamHI y Xbal (Roche Molecular Biochemicals) y se someten a electroforesis a través de gel de agarosa. Después se ligan los segmentos de ADN codificador de cadena ligera y pesada al fragmento BamHl/Xbal del vector de expresión Roche aislado obteniéndose los vectores de expresión finales. Se transforman los vectores de expresión finales en células de E. coli, se aisla el ADN de plásmido de expresión (Miniprep) y se somete a análisis con enzimas de restricción y a secuenciación del ADN. Se cultivan los clones correctos en 150 mi de medio LB-Amp, se aisla de nuevo el ADN de plásmido (Maxiprep) y se confirma la integridad de secuencia por secuenciación del ADN.

Expresión transitoria de variantes de inmunoglobulina en células HEK293 Se expresan variantes de inmunoglobulina recorabinante por transfeccion transitoria de células 293 -F de riñon embrionario humano empleando el sistema de expresión FreeStyle™ 293 de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Invitrogen, EE.UU.). Resumiendo, se cultivan en suspensión las células FreeStyle™ 293-F en un medio de expresión FreeStyle™ 293 a 37°C con un 8% de C02 y se siembran las células en medio fresco, con una densidad de l-2xl06 células viables/ml el día de la transfeccion. Se preparan complejos de ADN-293fectina™ en medio Opti-MEM® I (Invitrogen, EE.UU.) empleando 325 µ? de la 293fectina™ (Invitrogen, Alemania) y 250 pg de ADN plásmido de cadena pesada y ligera en una proporción molar 1:1 para un volumen final de transfeccion de 250 mi. Se preparan complejos de tipo "superhélices" de ADN-293fectina en medio Opti-MEM® I (Invitrogen, EE.UU.) empleando 235 µ? de la 293fectina™ (Invitrogen, Alemania) y 250 g del ADN plásmido de cadena pesada 1 y 2 y de cadena ligera "superhélices" en una proporción molar de 1:1:2 para un volumen final de transfeccion de 250 mi. Se recogen por centrifugación a 14000 g durante 30 minutos los líquidos sobrenadantes de cultivo celular que contienen anticuerpos a los 7 días de la transfeccion y se filtran en un filtro estéril (0.22 µp?) . Se almacenan los líquidos sobrenadantes a -20°C hasta el momento de la purificación.

Purificación de anticuerpos biespecíficos y de control Se purifican los anticuerpos biespecífieos trivalentes y los de control de los líquidos sobrenadantes de los cultivos celulares por cromatografí de afinidad empleando la Proteína A-Sepharose™ (GE Healthcare, Suecia) y cromatografía de exclusión de tamaños Superdex200. Resumiendo, se depositan los líquidos sobrenadantes de cultivos celulares filtrados en condiciones estériles sobre la parte superior de una columna HiTrap Proteína A HP (5 mi) equilibrada con regulador de pH PBS (10 mM de Na2HP0 , 1 mM de KH2P04, 137 mM de NaCl y 2.7 mM de KC1, de pH = 7.4). Se eliminan por lavado con regulador de pH de equilibrado las proteínas no fijadas. Se eluyen los anticuerpos y las variantes de anticuerpo con regulador de pH citrato 0.1 M, de pH 2.8, y se neutralizan las fracciones que contienen proteínas con 0.1 mi de regulador de pH Tris 1 M, de pH 8.5. Después se recogen las fracciones que contienen proteína eluida, se concentran en un dispositivo de filtro centrifugador Amicon Ultra (MWCO: 30 K, Millipore) hasta un volumen de 3 mi y se depositan en la parte superior de una columna de filtración a través de gel Superdex200 HiLoad 120 mi 16/60 (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con 20 mM histidina, 140 mM NaCl, de pH 6.0. Se recogen las fracciones que contienen anticuerpos biespecífieos y de control purificados, que tienen menos de un 5% de agregados de peso molecular elevado y se almacenan a -80°C en forma de partes alícuotas de 1.0 mg/ml. Se generan los fragmentos Fab por digestión en papaína del anticuerpo monoclonal 5D5 purificado y posterior eliminación de los dominios Fe contaminantes por cromatografía de Proteína A. Se siguen purificando los fragmentos Fab no fijados por cromatografía en columna de filtración a través de gel Superdex 200 HiLoad 120 mi 16/60 (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl, de pH 6.0 , se reúnen y se almacenan a -80°C en forma de partes alícuotas de 1.0 mg/ml.

Análisis de las proteínas purificadas Se determina la concentración de proteína de las muestras de proteína purificada midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, empleando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos . Se analizan la pureza y el peso molecular de los anticuerpos biespecífieos y los de control por SDS-PAGE en presencia y en ausencia de un agente reductor (5 mM de 1, 4 -ditiotreitol) y tinción con el colorante azul brillante Coomassie. Se emplea el sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen, USA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante (geles de Tris-glicina del 4-20%) . Se analiza el contenido de agregados en las muestras de anticuerpos biespecíficos y de control mediante SEC de alta eficacia empleando una columna analítica de exclusión de tamaños Superdex 200 (GE Healthcare, Suecia) en un regulador de pH de trabajo 200 mM de KH2P04, 250 mM de KC1, de pH 7.0 a 25 °C. Se inyectan 25 µg de proteína en la columna con un caudal de 0.5 ml/min y se someten a elución isocrática durante 50 minutos. Para los análisis de estabilidad se incuban concentraciones de 1 mg/ml de proteínas purificadas a 4°C y 40°C durante 7 días y después se evalúan por SEC de alta eficacia. Se verifica la integridad del esqueleto de aminoácidos de las cadenas larga y corta del anticuerpo biespecífico reducido por espectrometría de masas Q-TOF con nanoelectro-aspersión después de haber eliminado los N-glicanos por tratamiento enzimático con la Péptido-N-Glucosidasa F (Roche Molecular Biochemicals) .

Ensayo de fosforilación de la c-Met Se siembran 5xl05 células A549 por cavidad en una placa de 6 cavidades el día antes de la estimulación HGF en un medio RPMI con un 0.5% de FCS (suero fetal bovino) . Al día siguiente se reemplaza el medio de cultivo durante una hora por medio RPMI que contiene un 0.2% de BSA (albúmina de suero bovino) . Después se añaden 5 ig/t?? del anticuerpo biespecífico al medio y se incuban las células durante 10 minutos, después se añade el HGF durante 10 minutos más en una concentración final de 50 ng/ml. Se lavan las células üna vez con PBS enfriado con hielo, que contiene vanadato sódico 1 mM, después se colocan sobre hielo y se lisan en una placa de cultivo celular con 100 µ? de regulador de pH de lisis (50 mM Tris-Cl de pH 7.5, 150 mM de NaCl, 1% de NP40, 0.5% de DOC, aprotinina, 0.5 mM de PMSF, 1 mM de vanadato sódico) . Se transfieren los Usados celulares a tubos eppendorf y se deja que la lisis progrese durante 30 minutos sobre hielo. Se determina la concentración de proteína aplicando el método BCA (Pierce) . Se separan 30-50 g del lisado en un gel Bis-Tris NuPage 4-12% (Invitrogen) y se transfieren las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa. Se bloquean las membranas durante una hora con TBS-T que contiene un 5% de BSA y revelan con un anticuerpo c-Met fosfo-específico dirigido contra Y1230, 1234 , 1235 (44-888, Biosource) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las inmunotransferencias se exploran de nuevo con un anticuerpo que se fija sobre la c-Met no fosforilada (AF276, R&D) .

Ensayo de fosforilación de ErbB2/Her2 Se siembran 5 x 105 células Sk-Br3 por cavidad de una placa de 6 cavidades el día anterior a la adición del anticuerpo en RPMI con 10% de FCS (suero de becerro fetal) . El día siguiente, se agregan 5 g/ml de anticuerpos de control o biespecíficos al medio y las células se incuban una hora más. Las células se lavan una vez con PBS helado contenido de 1 mM de vanadato de sodio después de lo cual se colocan en hielo y lisan en la placa del cultivo celular con 100 µ? de regulador de pH de lisis (50 mM de Tris-Cl pH7.5 , 150 m de NaCl, 1% de NP40, 0.5% de DOC, aprotinina, 0.5 mM de PMSF, 1 mM de vanadato sódico) . Los lisados celulares se transfieren a tubos eppendorf y se deja avanzar la lisis durante 30 minutos en hielo. La concentración de la proteína se determina utilizando el método BCA (Pierce) . Se separan 30-50 yg del lisado en 4-12% de gel Bis-TRis Nupage (Invitrogen) y las proteínas en el gel se transfieren a una membrana de nitrocelulosa . Las membranas se bloquean por una hora con TBS-T contenido de 5% de BSA y se desarrollan con un anticuerpo Her-2 fosfo-específico dirigido contra Y1221/22 (Cell Signaling, 2243) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las inmunotransferencias se exploran de nuevo con un anticuerpo que se une a Her2 no fosforilado (Cell Signaling, 2165) .

Ensayo de fosforilación AKT Se siembran 5 x 10e5 células A431 por cavidad de una placa de 6 cavidades el día anterior a la adición del anticuerpo en RPMI con 10% de FCS (suero de becerro fetal) . El día siguiente, se agregan 5 yg/ml de anticuerpos de control o biespecíficos al medio y las células se incuban una hora más . Un subgrupo de células después se estimula durante 15 minutos más con 25 ng/ml de HGF (R&D, 294-HGN) . Las células se lavan una vez con PBS helado con contenido de 1 mM de vanadato de sodio después de lo cual se colocan en hielo y lisan en la placa del cultivo celular con 100 µ? de regulador de H de lisis (50 m de Tris-Cl pH7.5, 150 mM de NaCl, 1% de NP40, 0.5% de DOC, aprotinina, 0.5 mM de PMSF, 1 mM de vanadato sódico) . Los lisados celulares se transfieren a tubos eppendorf y se deja avanzar la lisis durante 30 minutos en hielo. La concentración de la proteína se determina utilizando el método BCA (Pierce) . Se separan 30-50 yg del lisado en 4-12% de gel Bis-Tris NuPage (Invitrogen) y las proteínas en el gel se transfieren a una membrana de nitrocelulosa . Las membranas se bloquean por una hora con TBS-T con contenido de 5% de BSA y se desarrollan con un anticuerpo AKT fosfo-específico contra Thr308 (Cell Signaling, 9275) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las inmunotransferencias se exploran de nuevo con un anticuerpo que se une a Actina (Abcam, ab20272) .

Ensayo de fosforilación de ERK1/2 Se siembran 5 x 10e5 células A431 por cavidad de una placa de 6 cavidades el día anterior a la adición del anticuerpo en RPMI con 10% de FCS (suero de becerro fetal) . El día siguiente, se agregan 5 g/ml de anticuerpos de control o biespecífieos al medio y las células se incuban una hora más . Un subgrupo de células después se estimula durante 15 minutos más con 25 ng/ml de HGF (R&D, 294-HGN) . Las células se lavan una vez con PBS helado con contenido de 1 mM de vanadato de sodio después de lo cual se colocan en hielo y lisan en la placa del cultivo celular con 100 µ? de regulador de pH de lisis (50 mM de Tris-Cl pH7.5, 150 mM de NaCl, 1% de NP40, 0.5% de DOC, aprotinina, 0.5 mM de PMSF, 1 mM de vanadato sódico) . Los lisados celulares se transfieren a tubos eppendorf y se deja avanzar la lisis durante 30 minutos en hielo. La concentración de la proteína se determina utilizando el método BCA (Pierce) . Se separan 30-50 yg del lisado en 4-12% de gel Bis-Tris NuPage (Invitrogen) y las proteínas en el gel se transfieren a una membrana de nitrocelulosa . Las membranas se bloquean por una hora con TBS-T contenido de 5% de BSA y se desarrollan con un anticuerpo Erkl/2 fosfo-específico contra Thr202/Tyr204 (Cell Signaling, Nr.9106) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las inmunotransferencias se exploran de nuevo con un anticuerpo que se une a Actina (Abcam, ab20272) .

Diseminación de Célula-Célula (ensayo de diseminación) Se siembran A549 (4000 células por cavidad) o A431 (8000 células por cavidad) el día antes del tratamiento con los compuestos en un volumen total de 200 µ? en placas E de 96 cavidades (Roche, 05232368001) en un medio RPMI con un 0.5% de FCS. Se hace el seguimiento de la adhesión y del crecimiento celular durante una noche con la máquina llamada Real Time Cell Analyzer, con barridos cada 15 min para la comprobación de la impedancia. Al día siguiente se pre-incuban las células con 5 µ? de las diluciones de los anticuerpo correspondientes en PBS con barridos cada cinco minutos. Pasados 30 minutos se añaden 2.5 µ? de una solución de HGF que produce una concentración final de 20 ng/ml y se continúa el ensayo durante 72 horas más. Se hace el seguimiento de los cambios inmediatos con barridos cada minuto durante 180 minutos y después con barridos cada 15 minutos durante el tiempo restante.

Ensayo de Proliferación HUVEC (Promocell, C-12200) en 96 cavidades recubiertas con colágeno en 0.5% de FCS conteniendo medio EBM-2 (Promocell, C-22211) . Al día siguiente se agregó una serie de dilución de anticuerpos de control o biespecífieos a las células. Después de 30 minutos de incubación se agregaron 25 ng/ml de HGF (R&D , 294-HGN) y las células se incubaron por otras 72 horas después de lo cual se determinó la proliferación celular en la forma de contenido ATP con el ensayo incandescente de titulación celular (Promega, G7571/2/3) de acuerdo con la recomendación del fabricante.

Ensayo de proliferación Sk-Br3 a) Para los estudios de proliferación se sembraron 10000 células por cavidad de un placa de cultivo de 96 cavidades en medio reducido en suero (RPMI 1640 + 4% FCS) . El día siguiente se agregó el anticuerpo progenitor Her2 o c-Met así como los anticuerpos biespecíficos y las células se cultivaron adicionalmente por 48 horas después de lo cual ATP, como indicador de la proliferación celular, se determinó con el ensayo de luminosidad de concentración celular (Promega) . b) Para los estudios de proliferación en la presencia de HGF, se sembraron 10000 células por cavidad de una placa de cultivo de 96 cavidades en medio reducido en suero (RPMI 1640 + 4% de FCS) . El día siguiente se agregó el anticuerpo progenitor Her2 o c-Met así como el anticuerpo biespecífico, así como 25 ng/ml de HGF (R&D, 294 -HGN) y las células se cultivaron adicionalmente por 48 horas después de lo cual ATP, como indicador de la proliferación celular, se determinó con el ensayo de luminosidad de concentración celular (Promega) .

Ensayo de citometría de flujo (FACS) a) Ensayo de fijación Se destacan y se cuentan las células que expresan la c-Met y la ErbB-2. Se siembran 1.5xl05 células por cavidad de una placa de 96 cavidades cónicas. Se centrifugan las células (1500 rpm, 4°C, 5 min) y se incuban durante 30 min sobre hielo en 50 µ? de una serie de diluciones del correspondiente anticuerpo biespecífico en PBS con 2% de FCS (suero fetal bovino) . Se centrifugan de nuevo las células, se o lavan una vez con 200 µ? de PBS que contienen un 2% de FCS y se someten a una segunda incubación de 30 min con un anticuerpo asociado a ficoeritrina dirigido contra el Fe humano, que se diluye en PBS que contiene un 2% de FCS (Jackson Immunoresearch, 109116098) . Se centrifugan las células, se lavan dos veces con 200 µ? de PBS que contiene un 2% de FCS, se suspenden de nuevo en una solución BD CellFix (BD Biosciences) y se incuban por lo menos durante 10 min sobre hielo. Se determina la fluorescencia media (mfi) de las células por citometría de flujo (FACS Canto, BD) . Se determina la mfi por lo menos por duplicado de dos tinciones independientes. Los espectros de citometría de flujo se procesan después con el programa informático FlowJo (TreeStar) . Se determina la fijación semi-máxima empleando el programa XLFit 4.0 (IDBS) y el modelo 205 de un sitio de dosis-respuesta . b) Ensayo de internalización Se destacan las células y se cuentan. Se depositan 5xl05 células en 50 µ? de medio completo en un tubo eppendorf y se incuban a 37 °C con 5 pg/ml del correspondiente anticuerpo biespecífico . Después del tiempo indicado se almacenan células puntuales sobre hielo hasta que finaliza la cuenta del tiempo. Después se transfieren las células a tubos FACS, se centrifugan (1500 rpm, 4°C, 5 min), se lavan con PBS + 2% de FCS y se incuban durante 30 minutos en 50 µ? de anticuerpo secundario asociado a ficoeritrina, dirigido contra el Fe humano, que se diluye en PBS que contiene un 2% de FCS (Jackson Immunoresearch, 109116098) . Se centrifugan de nuevo las células, se lavan con PBS + 2% de FCS y se determina la intensidad de fluorescencia por citometría de flujo (FACS Canto, BD) .

Ensayo de luminosidad de concentración celular La viabilidad y proliferación celulares se cuantifican aplicando el ensayo de luminosidad de concentración celular (Promega) . Se realiza el ensayo de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Resumiendo, se cultivan las células en placas de 96 cavidades, en un volumen total de 100 µ?, durante el período de tiempo deseado. Para el ensayo de proliferación se sacan las células de la incubadora y se colocan a temperatura ambiente durante 30 min. Se añaden 100 µ? del reactivo de luminosidad de concentración celular y se colocan las placas multi-cavidad en un agitador orbital durante 2 min. Se cuantifica la luminiscencia después de 15 min en un lector de microplacas (Tecan) .

Ensayo Wst-1 Se realiza un ensayo Wst-1 de la viabilidad y proliferación celulares en forma de ensayo de punto final, detectando el número de células metabólicas activas. Resumiendo, se añaden 20 µ? del reactivo Wst-1 (Roche, 11644807001) a 200 µ? de medio de cultivo. Se incuban las placas de 96 cavidades durante un tiempo de 30 min a 1 h, hasta que el colorante tenga un revelado robusto. Se cuantifica la intensidad de la tinción en un lector de microplacas (Tecan) , a una longitud de onda de 450 nm .

Diseño de anticuerpos biespecífieos cErbB2 -c-Met> Todos los anticuerpos biespecífieos <ErbB2-c-Met> purificados que se mencionan a continuación contienen una región constante o por lo menos la parte Fe de la subclase IgGl (región constante de la IgGl humana, de la SEC ID NO: 9) que eventualmente se modifica del modo que se indica a continuación.

En la Tabla 1 : los anticuerpos biespecíficos trivalentes <ErbB2-c-Met> basados en un anticuerpo ErbB-3 de longitud completa (trastuzumab) y un fragmento Fab de cadena simple (en cuanto al esquema de la estructura básica, véase la figura 5a) a partir del anticuerpo c-Met (5D5 cMet) , con las correspondientes características recogidas en la tabla 1, se expresan y purifican de acuerdo a los métodos generales antes descritos. Las VH y VL correspondientes del trastuzumab o del 5D5 cMet humanizado se indican en el listado de secuencias .

Tabla 1: Nombre de la BSAB02 molécula. nomenclatura scFab- Ab-de anticuerpos biespecífieos Características i Mutaciones S354C: superhélices T366W/ Y349 ' C: T366'S: L3681 A: Y407 'V Esqueleto del trastuzumab anticuerpo de longitud completa derivado de Fragmento Fab de 5D5 cMet cadena simple (humanizado) derivado de Posición del scFab cadena pesada sobre unido al anticuerpo enrrollada de C- terminal Enlazador (ScFab) (G4S)BGG Conector peptídico (G4S) 2 VH44/VL100 de ScFab - estabilizado con disulfuro Ejemplo 1 Unión de anticuerpos biespecífieos con ErbB-2 y c et (Resonancia de Plasmón de Superficie) Se determina la afinidad de fijación con un ensayo estándar de fijación a 25°C, por ejemplo la técnica de ® resonancia de plasmón de superficie (BIAcore , GE-Healthcare Upsala, Suecia) . Para las mediciones de afinidad se unen 30 pg/ml de anticuerpos anti-Fcy (de cabra, Jackson Immuno Research) con la superficie de un chip sensor CM-5 por química estándar de condensación de aminas y bloqueo en un instrumento SPR (Biacore T100) . Después de la conjugación, se inyectan a 25 °C anticuerpos mono- o biespecíficos ErbB2/cMet con un caudal de 5 µ?/min, después se realiza una serie de diluciones (de 0 nM a 1000 nM) del ECD de la ErbB2 o c-Met humanas a 30 µ?/min. Como regulador de pH de trabajo para el ensayo de fijación se emplea el PBS/0,1 de BSA. Después se regenera el chip con un pulso de 60 s de una solución 10 mM de glicina-HCl, de pH 2.0.

Tabla 2: Características de fijación de anticuerpos biespecíficos que se unen a la ErbB2/cMet determinadas por resonancia de plasmón de superficie. especificidad BsAB02 de unión [mol] c-Met ka (1/Ms) 8 , 40E+03 kd (1/s) 6, 60E-05 KD (M) 8, 20E-09 ErbB-2 ka (1/Ms) 9, 50E+04 kd (l/s) <1?-06 KD (M) <1E-10 Ejemplo 2 Inhibición de la fosforilación del receptor de c-Met inducida por HGF con los anticuerpos biespecífieos HER2/c-Met Para confirmar la funcionalidad de la parte c-Met de los anticuerpos biespecíficos se realiza un ensayo de fosforilación de la c-Met. En este ensayo se tratan células de cáncer de pulmón A549 o células de cáncer coloreetal HT29 con los anticuerpos biespecíficos o con anticuerpos de control antes de exponerlas al HGF. Después se lisan las células y se examina la fosforilación del receptor de c-Met. Ambas líneas celulares se estimulan con HGF como puede observarse con la aparición de la banda específica de fosfo-c-Met en la inmunotransferencia . La unión de los anticuerpos progenitores o biespecíficos conduce a la inhibición de la fosforilación del receptor. Alternativamente, se pueden utilizar células, por ejemplo U87MG, con un bucle HGF autocrino y evaluar la fosforilación del receptor c-Met en la ausencia o presencia de anticuerpos progenitores o biespecíficos .

Ejemplo 3 Análisis de la fosforilación del receptor Her2 después del tratamiento con anticuerpos biespecíficos Her2/cMet Para confirmar la funcionalidad de la parte de unión de Her2 en los anticuerpos Her2/cMet biespecíficos Sk-Br3 se incubó ya sea con anticuerpos EGFR progenitores o anticuerpos Her2/cMet biespecíficos . La unión de los anticuerpos progenitores o biespecíficos pero no la de un anticuerpo de control IgG no relacionado conduce a la inhibición de la fosforilación del receptor. Alternativamente, también se pueden utilizar células que se estimulan con NRG para inducir la fosforilación del receptor ErbB2/Her2 en la ausencia o presencia de anticuerpos progenitores o biespecíficos .

Ejemplo 4: Análisis de la señalización de PI3K después de tratamiento con anticuerpos Her2/cMet biespecíficos .

Her2 así como el receptor c-Met pueden hacer la señalización a través de la trayectoria PI3K que transporta las señales mitogénicas . Para demostrar simultáneamente la activación de la fosforilación del receptor Her2 y c-Met de AKT, se puede monitorear el objetivo en dirección 3' en la trayectoria PI3K. En este punto, las células no estimuladas, las células tratadas con NRG o HGF o las células tratadas con ambas citocinas se incuban en paralelo con anticuerpos no específicos, de control progenitor o biespecíficos. Alternativamente, se pueden evaluar células que sobre-expresan ErbB2/Her2 y/o tienen un bucle HGF autocrino que activa la señalización de c-Met. AKT es un componente de señalización en dirección 3' principal de la trayectoria PI3K y la fosforilación de esta proteína es un indicador clave de la señalización a través de esta trayectoria.

Ejemplo 5 Análisis de la señalización de MAPK después del tratamiento con anticuerpos biespecíficos Her2/c et El receptor c-Met puede señalizar a través de la trayectoria MAPK. Para demostrar la activación del receptor c-Met, la fosforilación de ERK1/2, puede monitorearse la activación en dirección 3' principal en la trayectoria MAPK. En este punto, las células no estimuladas o las células tratadas con HGF se incuban en paralelo con anticuerpos no específicos, de control progenitor o biespecíficos. Alternativamente, también se pueden evaluar células que sobre-expresan ErbBl/Herl y/o tienen un bucle HGF autocrino que activa la señalización de c-Met.

Ejemplo 6 Inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por HGF con los formatos de anticuerpos biespecíficos Her2/c- et.

Pueden realizarse ensayos de proliferación de HUVEC para demostrar el efecto angiogénico y mitogénico del HGF. La adición de HGF a las HUVEC conduce a un aumento en la proliferación celular que puede inhibirse a través de los anticuerpos de unión c-Met en una forma dependiente de la dosis .

Ejemplo 7 Inhibición de la proliferación de Sk-Br3 a través de anticuerpos Her2/c-Met biespecíficos . a) Las células Sk-Br3 despliegan altos niveles en la superficie celular de Her2 y expresión media alta en superficie celular de c-Met como se confirma independientemente en citometría de flujo. La adición del anticuerpo de unión Her2 progenitor o el anticuerpo Her2/c-Met biespecífico conduce a una disminución en la proliferación, aunque el anticuerpo de unión c-Met tiene solamente efectores menores en la proliferación. b) Para simular una situación en la cual ocurre una red de señalización del receptor Her2-c-Met activo, se realizaron ensayos de proliferación como se describe pero en la presencia de cualquiera de medio condicionado. En esta configuración la adición de cualquiera de los anticuerpos progenitores tiene solamente efectos menores sobre la proliferación celular como determina por el análisis de luminosidad de concentración celular aunque la adición de anticuerpos biespecífieos o la combinación de anticuerpos progenitores conduce a una disminución en la proliferación celular.

Ejemplo 8 Análisis de la inhibición de la diseminación célula-célula inducida por HGF (dispersión) en la línea celular cancerígena DU145 con formatos de anticuerpos biespecífieos Her2/c-Met.

La diseminación inducida por el HGF induce cambios morfológicos de la célula, que se traducen en un redondeo de las células, protuberancias de tipo filópodos, estructuras de tipo husillo y cierta motilidad de las células. Un anticuerpo biespecífico Her2/c-Met suprimió la diseminación de célula-célula inducida por HGF.

Ejemplo 9; Inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por HGF a través de los formatos de anticuerpo HER2/c-Met.

Los ensayos de proliferación HUVEC pueden llevarse a cabo para demostrar el efecto mitogénico de HGF . La adición de HGF a HUVEC conduce a un aumento doble en la proliferación. La adición del anticuerpo de control IgG humano en el mismo intervalo de concentración como los anticuerpos biespecífieos no tiene impacto en la proliferación celular aunque el fragmento Fab 5D5 inhibe la proliferación inducida por HGF.

Ejemplo 10; Análisis de la inhibición de la diseminación de célula-célula inducida por HGF (diseminación) en la línea de células cancerígenas A431 a través del anticuerpo biespecífico HER2/c-Met.

La diseminación inducida por HGF incluyen cambios morfológicos en la célula, que dan como resultado el redondeo de las células, protuberancias de tipo filópodos, estructuras de tipo husillo y una cierta motilidad de las células. El Analizador de Células en Tiempo Real (Roche) mide la impedancia de una cavidad de cultivo celular dado y por consiguiente puede indirectamente monitorear los cambios en la morfología y la proliferación celular. La adición de HGF a células A431 y A549 da como resultado cambios en la impedancia que puede monitorearse como función del tiempo.

Ejemplo 11 Análisis de la inte nalización de receptor mediada por el anticuerpo en líneas celulares cancerígenas que expresan la ErbB-2 y la c-Met Se ha demostrado que la incubación de células con anticuerpos que se unen específicamente con Her2 o c-Met desencadena la internalización del receptor. Con el fin de evaluar la capacidad de internalización de los anticuerpos biespecíficos, se diseña un método experimental para estudiar la internalización del receptor inducida por el anticuerpo. Para este propósito, las células OVCAR-8 ( (designación de la línea celular NCI; comprada de NCI (National Cáncer Institute) OVCAR-8-NCI ; Schilder RJ, y otros, Int J Cáncer. Marzo, 1990, 15; 45 (3) : 416-22 ; Ikediobi ON, y otros, Mol Cáncer Ther. 2006; 5; 2606-12; Lorenzi, P.L., y otros Mol Cáncer Ther 2009; 8 (4) : 713-24) ) (que expresa Her2 así como c-Met como se confirma por citometría de flujo -ver Figura 7b) se incubaron durante diferentes períodos de tiempo (por ejemplo 0, 30, 60, 120 minutos = 0, 0.5, 1, 2 horas (h) ) con el anticuerpo primario respectivo a 37°C. Los procesos celulares se detuvieron enfriando rápidamente las células a 4°C. Un anticuerpo secundario acoplado a fluoróforo específicamente que se une al Fe del anticuerpo primario se utilizó para detectar anticuerpos unidos a la superficie celular. La internalización del complejo de anticuerpo-receptor reduce los complejos de anticuerpo-receptor en la superficie celular y da como resultado una intensidad de fluorescencia media reducida. La internalización se estudió en células Ovcar-8. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla y Figura 9. El porcentaje de internalización del receptor respectivo se midió por medio de la internalización de los anticuerpos respectivos (En la Figura 9, el anticuerpo biespecífico <ErbB2-cMet> BsAB02 se designa como cMet/HER2, los anticuerpos bivalentes, monoespecífieos se designan como <HER2> y <cMet>.) Tabla: % de Internalización del receptor c-Met a través del anticuerpo biespecífico Her2/cMet cuando se compara con el anticuerpo bivalente, monoespecífico progenitor c-Met y HER2 medido con el ensayo FACS después de 1 hora en células OVCAR-8. La medición del porcentaje del receptor c-Met en la superficie celular a Oh (= en la ausencia del anticuerpo) se establece como 100% del receptor c-Met en la superficie celular.

Anticuerpo % del receptor c-Met en % de Internalización la superficie de la de c-Met después de 1 célula OVCAR-8 medido hora en células después de 1 hora OVCAR-8 (ATCC No.

CRL-1555) (= 100% de anticuerpo en superficie celular) A) Anticuerpo progenitor <c-Met> monoespecífico ab 5D5 67 33 B) Anticuerpos <ErbB2-cMet> biespecífieos BSAB02 107 -7 Ejemplo 12 Preparación de versiones glicomodificadas de anticuerpos Her2/c-Met biespecífieos .

Las secuencias de ADN del anticuerpo Her2/c-biespecífico se subclonaron en vectores de expresión de mamífero bajo el control del promotor MPSV y en dirección 5' de un sitio poliA sintético, cada vector llevando una secuencia EBV OriP.

Los anticuerpos biespecífieos se produjeron mediante la co- transíección de células HEK293 -EBNA con los vectores de expresión del anticuerpo biespecífico de mamífero utilizando un método de transfección de fosfato cálcico. Las células HEK293-EBNA que crecieron exponencialmente se transíectaron mediante el método de fosfato cálcico. Para la producción del anticuerpo glicomodificado, las células se co-transfectaron con dos plásmidos adicionales, uno para una expresión de polipéptido GnTIII de fusión (un vector de expresión GnT-III) , y uno para expresión de manosidasa II (un vector de expresión de manosidasa II Golgi) a una relación de 4:4:1:1, respectivamente. Las células se cultivaron como cultivos de monocapa adherentes en matraces T utilizando medio de cultivo DMEM suplementado con 10% de FCS, y se transfectaron cuando estuvieron entre 50 y 80% de confluencia. Para la transfección de un matraz T150, se sembraron 15 millones de células 24 horas antes de la transfección en 25 mi de medio de cultivo DMEM suplementado con FCS (a 10% V/V final) , y las células se colocaron a 37°C en una incubadora con una atmósfera de 5% de C02 durante la noche. Para cada matraz T150 a ser transfectado, se preparó una solución de ADN, CaC12 y agua mezclando 94 yg de ADN de vector de plásmido total dividido igualmente entre los vectores de expresión de cadena ligera y pesada, agua a un volumen final de 469 µ? y 469 yl de una solución 1M de CaC12. A esta solución, se agregaron 938 µ? de 50 mM de HEPES, 280 mM de NaCl, 1.5 mM de solución de Na2HP04 a pH 7.05, se mezcló inmediatamente durante 10 segundos y se dejó reposar a temperatura ambiente por 20 segundos. La suspensión se diluyó con 10 mi de DMEM suplementado con 2% de FCS, y se agregó al T150 en lugar del medio existente. Después se agregaron 13 mi de medio de transfección adicionales . Las células se incubaron a 37°C, 5% de C02 durante aproximadamente 17 a 20 horas, después el medio se reemplazó con 25 mi de DMEM, 10% de FCS. El medio de cultivo condicionado se cosechó 7 días después de la transfección mediante centrifugación durante 15 minutos a 210 x g, la solución se filtro de forma estéril (filtro de 0.22 µ??) y se agregó azida de sodio a una concentración final de 0.01% p/v y se mantuvo a 4°C.

Los anticuerpos glicoraodificados afocusilados biespecíficos secretados se purificaron por cromatografía de afinidad en Proteína A, seguido por cromatografía de intercambio de catión y un paso final de cromatografía de exclusión de tamaño en una columna Superdex 200 (Amersham Pharmacia) cambiando el regulador de pH a 25 mM de fosfato de potasio, 125 mM de cloruro de sodio, 100 mM de solución de glicina de pH 6.7 y se recolectaron los anticuerpos IgGl monoméricos puros. La concentración del anticuerpo se estima utilizando un espectrofotómetro de la absorbencia a 280 nm.

Los oligosacáridos unidos a la región Fe de los anticuerpos se analizaron por MALDI/TOF-MS como se describe. Los oligosacáridos se liberaron enzimáticamente de los anticuerpos mediante digestión PNGaseF, con los anticuerpos estando ya sea inmovilizados en una membrana PVDF o en solución. La solución digerida resultante conteniendo los oligosacáridos liberados ya sea se prepara directamente para el análisis MALDI/TOF-MS o además se digiere con glicosidasa EndoH antes de la preparación de la muestra para el análisis MALDI/TOF-MS.

Ejemplo 13 Análisis de la glicoestructura de los anticuerpos Her2/c-Met biespecíficos Para la determinación de las proporciones relativas de fucosa y no fucosa (fucosa-a) con contenido de estructuras de oligosacárido, los glicanos liberados de material del anticuerpo purificado se analizaron por espectrometría de masa MALDI-Tof. Para este propósito, la muestra del anticuerpo (aproximadamente 50 µ?) se incubó durante la noche a 37°C con 5mU de N-Glicosidasa F (Prozymett GKE-5010B) en 0.1 M de regulador de pH de fosfato sódico, pH 6.0, con el fin de liberar el oligosacárido de la estructura de la proteína. Posteriormente, las estructuras de glicano liberadas se aislaron y desalaron utilizando puntas de pipeta NuTip-Carbón (obtenidas de Glygen: NuTipl-10 µ?, Cat.Nr#NT ICAR) . Como un primer paso, las puntas de pipeta NuTip-Carbón se prepararon para la unión de los oligosacáridos lavándolas con 3 µ? 1 de NaOH seguido por 20 µ? de agua pura (por ejemplo, grado gradiente HPLC de Baker, #4218), 3 µ? de 30% v/v ácido acético y de nuevo 20 µ? de agua pura. Para esto, las soluciones respectivas se cargaron en la parte superior del material cromatográfico en la punta de pipeta NuTip-Carbón y se presionaron a través de la misma. Después, las estructuras de glicano correspondientes a 10 µg del anticuerpo se unieron al material en las puntas de pipeta NuTip-Carbón jalando hacia arriba y abajo la digestión F de N-Glucosidasa descrita anteriormente de cuatro a cinco veces. Los glicanos unidos al material en la punta de la pipeta NuTip-Carbón se lavaron con 20 µ? de agua pura en la forma antes descrita y se eluyeron por pasos con 0.5 µ? de 10% y 2.0 µ? de 20% de acetonitrilo, respectivamente. Para este paso, las soluciones de elución se colocaron en recipientes de reacción de 0.5 mi y se movieron hacia arriba y hacia debajo de cuatro a cinco veces cada uno. Para el análisis a través de espectrometría de masas MALDI-Tof, ambos eluatos se combinaron. Para esta medición, se mexlcaronO .4 µ? de los eluatos combinados en el objetivo MALDI con 1.6 µ? de solución de matriz SDHB (ácido 2.5-dihidroxibenzoico/ácido 2-hidroxi-5-metoxibenzoico [Bruker Daltonics #209813] disuelto en 20% de etanol/5 mM de NaCl a 5 mg/ml) y se analizaron con un instrumento Bruker Ultraflex TOF/TOF adecuadamente calibrado. Rutinariamente, se registraron 50-300 inyecciones y se sumaron a un solo experimento. El espectro obtenido se evaluó por medio del software de análisis flex (Bruker Daltonics) y las masas se determinaron para cada uno de los picos detectados. Posteriormente, los picos se asignaron a fucosa o a-fucosa (no fucosa) con contenido de estructuras de glicol mediante la comparación de las masas calculadas y las masas teóricamente esperadas para las estructuras respectivas (por ejemplo, complejo, híbrido y oligo-o alto en mañosa, respectivamente, con y sin fucosa) .

Para la determinación de la proporción de estructuras híbridas, la muestra del anticuerpo se digirió con N-Glicosidasa F y Endo-Glicosidasa H concomitantemente N-glicosidasa F libera todas las estructuras de glicano N- enlazadas (estructuras en complejo, híbridas y oligo- o altas en mañosa) de la estructura de la proteína y la Endo-Glicosidasa H separa todos los glicanos de tipo híbrido adicionalmente entre los dos residuos GlcNAc en el extremo de reducción del glicano. Esta digestión posteriormente se trata y analiza a través de espectrometría de masas MALDI-Tof en la misma forma como se describe anteriormente para la muestra digerida con N-Glicosidasa F. Al comparar el patrón de la digestión de N-Glicosidasa F y la digestión de N-glucosidasa F / Endo H combinada, el grado de reducción de las señales de una glicoestructura específica se utiliza para estimar el contenido relativo de estructuras híbridas.

La cantidad relativa de cada glicoestructura se calcula de la proporción de la altura del pico de una glicoestructura individual y la suma de las alturas de los picos de todas las glicoestructuras detectadas . La cantidad de fucosa es el porcentaje de fucosa que contiene las estructuras relacionadas con todas las glicoestructuras identificadas en la muestra tratada con N-Glicosidasa F (por ejemplo, estructuras de complejo, híbrida y oligo- y alta en mañosa, resp.). La cantidad de afucosilación es el porcentaje de estructuras que carecen de fucosa relacionadas con todas las glicoestructuras identificadas en la muestra tratada con N-Glicosidasa F (por ejemplo estructuras de complejo, híbrida y oligo- y alta en mañosa, resp.) .

Ejemplo 14; Análisis de la migración celular después del tratamiento con anticuerpos biespecíficos Her2/cMet Un aspecto importante de la señalización de c-Met es la inducción de programa migratorio e invasivo. La eficacia de un anticuerpo c-Met inhibidor puede determinarse midiendo la inhibición de la migración celular inducida por HGF. Para este propósito, la línea de células cancerígenas A431 inducible por HGF se trató con HGF en la ausencia o presencia del anticuerpo biespecífico o un anticuerpo de control IgG y el número de células que migraron a través de un poro de 8 µ?? se midió en una forma dependiente del tiempo en un analizador de células en tiempo real Acea utilizando placas CIM con una lectura de impedancia.

Ejemplo 15 ADCC in vitro de anticuerpos biespecíficos Her2/c- Met Los anticuerpos biespecíficos Her2/cMet de acuerdo con la invención despliegan una internalización reducida (cuando se compara con el anticuerpo c-Met progenitor monoespecífico correspondiente) en células que expresan ambos receptores. La internalización reducida firmemente soporta la racionalización para la glicomodificación de estos anticuerpos como una exposición prolongada del complejo de anticuerpo-receptor en la superficie celular es más probable que sea reconocida por las células Nk. La internalización reducida y la glicomodificación se traducen en una mejorada citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) en comparación con los anticuerpos progenitores. Se puede diseñar una configuración experimental in vitro para demostrar estos efectos utilizando células cancerígenas que expresan ambos Her2 y cMet, en la superficie celular, por ejemplo, células A431, y efectoras como la línea de células Nk o PBMCs. Las células tumorales se pre-incubaron con los anticuerpos monoespecíficos progenitores o los anticuerpos biespecíficos hasta durante 24 horas seguido por la adición de la línea celular efectora. La lisis celular se cuantificó y permitió la discriminación de anticuerpos mono- y biespecíficos .

Las células objetivo, por ejemplo, PC-3 (DSMZ #ACC 465, adenocarcinoma prostático, cultivo en Mezcla de Nutriente F12 de Ham + 2 mM de L-alanil-L-Glutamina + 10% de FCS) se recolectaron con tripsina/EDTA (Gibco # 25300-054) en la fase crecimiento exponencial. Después de un paso de lavado y la verificación del número de células y la viabilidad, la alícuota necesaria se marcó durante 30 min a 37°C en la incubadora celular con calceína (Invitrogen #C3100MP; 1 recipiente se volvió a suspender en 50 µ? de DMSO por 5 Mió células en 5 mi de medio) . Después, las células se lavaron tres veces con medio AIM-V, el número de células y la viabilidad se verificaron y el número de célula se ajustó a O .3 Mio/ml .

Mientras tanto, PBMC como las células efectoras se preparó por centrifugación de gradiente de densidad (Histopaque-1077 , Sigma # H8889) de acuerdo con el protocolo del fabricante (pasos de lavado lx a 400 g y 2x a 350 g 10 min cada uno) . El número y viabilidad de las células se verificó y el número de células se ajustó a 15 Mio/ml. Se plaquearon 100 µ? de células objetivo teñidas con calceína en placas de 96 cavidades de fondo redondo, se agregaron 50 µ? de anticuerpo diluido y 50 µ? de células efectoras. En algunos experimentos las células objetivo se mezclaron con Redimune ® NF Líquido (ZLB Behring) a una concentración de 10 mg/ml de Redimune.

Como control sirve la lisis espontánea, determinada por el co-cultivo de células objetivo y efectoras sin anticuerpo y la lisis máxima, se determinó por 1% de Tritón X-100 lisis de las células objetivo solamente. La placa se incubó por 4 horas a 37 °C en una incubadora de células humidificada.

La aniquilación de las células objetivo se evaluó midiendo la liberación de LDH de las células dañadas utilizando el kit de Detección de Citotoxicidad (LDH Detection Kit, Roche # 1 644 793) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se mezclaron 100 µ? de sobrenadante de cada cavidad con 100 µ? de sustrato del kit en una placa de 96 cavidades de fondo plano transparente. Los valores Vmax de la reacción de color del sustrato se determinaron en un lector ELISA a 490 nm durante al menos 10 min. El porcentaje de la aniquilación mediada por el anticuerpo específico se calcula como sigue: ((A - SR) / (MR - SR)xlO0, en donde A es la media de Vmax a una concentración del anticuerpo específico, SR es la media de Vmax de la liberación espontánea y MR es la media de Vmax de la liberación máxima.

Ejemplo 16 Eficacia in vivo de anticuerpos biespecíficos Her2/cMet en un modelo de xenoinjerto subcutáneo con un bucle HGF de paracrina Un modelo KPL4 subcutáneo, co-inyectado con células Mrc-5, imita un bucle de activación de paracrina para c-Met. KPL4 expresa una cierta cantidad de c-Met así como Her2 en la superficie celular. Las células KPL4 y Mrc-5 se mantienen bajo condiciones de cultivo celular estándares en la fase de cultivo logarítmico. Las células KPL4 y Mrc-5 se inyectaron en una proporción de 10:1 con diez millones de células KPL4 y un millón de células Mrc-5. Las células se injertaron en ratones beige SCID. El tratamiento inició después de establecer los tumores y que habían alcanzado un tamaño de 100- 150 mm3. Los ratones se trataron con una dosis de carga de 20 mg/kg de anticuerpo / ratón y después semanalmente con 10 mg/kg de anticuerpo / ratón. El volumen del tumor se midió dos veces por semana y los pesos de los animales se monitorearon en paralelo. Los tratamientos individuales y de combinación de los anticuerpos individuales se compararon con la terapia con anticuerpo biespecífico.

Ejemplo 17 Inhibición de la proliferación de OVCAR-8 a través de anticuerpos biespecíficos Her2/c- et a) Las células OVCAR-8 (Designación de la Línea Celular NCI; comprada de NCI (National Cáncer Institute) 0VCAR-8-NCI; Schilder RJ, y col. Int J Cáncer. 1990 Mar 15;45 (3) :416-22; Ikediobi ON, y col., Mol Cáncer Ther. 2006;5;2606-12; Lorenzi, P.L., y col. Mol Cáncer Ther 2009; 8 (4) : 713-24) ) despliegan niveles en superficie celular significativos de Her2 y de c-Met como se confirmó independientemente en citometría de flujo (ver Figura 7b) . La inhibición de la proliferación de la célula OVCAR-8 a través de anticuerpos biespecíficos Her2/c-Met se midió en el ensayo CellTiterGlow™ después de 48 horas. Los resultados se muestran en la Figura 9a. El control fue regulador de pH de PBS (Salina regulada con fosfato) .

La medición mostró una inhibición del anticuerpo HER2 trastuzumab de 6% de inhibición (comparado con el control de regulador de pH que se estableció como 0% de inhibición) . El anticuerpo biespecífico Her2/c-Met BsAB02 (BsAb) condujo a una inhibición más pronunciada de la proliferación de células cancerígenas (11% de inhibición) . El anticuerpo c-Met monovalente de un brazo 5D5 (OA5D5) que no mostró ningún efecto en la proliferación. La combinación del anticuerpo HER2 trastuzumab y el anticuerpo monovalente c-Met de un brazo 5D5 (OA5D5) condujo a una disminución menos pronunciada (6% de inhibición) . b) Las células OVCAR-8 dependen de la señalización de HER2. Para simular una situación en donde ocurre una red de señalización del receptor HER - c-Met activa además se realizaron ensayos de proliferación como se describe en el inciso a) (ensayo CellTiterGlow™ después de 48 horas) pero en la presencia de medio condicionado con HGF. Los resultados se muestran en la Figura 9b.

La medición mostró casi nada de efecto inhibidor del anticuerpo Her2 trastuzumab (2% de inhibición) y del anticuerpo monovalente c-Met de un brazo 5D5 (OA5D5) (3% de inhibición) se se compara con células tratadas con HGF que se establecieron con 0% de inhibición. El anticuerpo biespecífico Her2/c-Met BsAB02 (BsAb) (17% de inhibición) mostró una inhibición pronunciada de la proliferación de la célula cancerígena de células Ovcar-8. La combinación del anticuerpo Her2 trastuzumab y el anticuerpo monovalente c-Met de un brazo 5D5 (OA5D5) condujo a una disminución menos pronunciada de la proliferación celular (10% inhibición) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. - Uh anticuerpo biespecifico que se une específicamente a la ErbB-2 humana y a la c-Met humana, que contiene un primer sitio de fijación sobre el antígeno que se une específicamente a la ÉrbB-2 humana y un segundo sitio de fijación sobre el antígeno que se une específicamente a la c-Met humana, caracterizado porque el anticuerpo biespecifico muestra una internalización de c-Met de no más de 15% cuando se mide después de 1 hora en un ensayo citométrico de flujo, cuando se compara con la internalización de c-Met en la ausencia del anticuerpo específico.

2. - El anticuerpo biespecifico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es bivalente o trivalente, que consta de uno o dos sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a la ErbB-2 humana y un tercer sitio de fijación a antígeno que se une específicamente a la c-Met humana.

3. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado porque contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-2, y consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) un fragmento Fab de cadena simple que se une específicamente a la c-Met humana, en donde el fragmento Fab de cadena simple del apartado b) se fusiona con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico de C- o N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

4. - Un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a la ErbB-2 humana y a la c-Met humana que contiene un primer sitio de fijación sobre el antígeno que se une específicamente a la ErbB-2 humana y un segundo sitio de fijación sobre el antígeno que se une específicamente a la c-Met humana, caracterizado porque el primer sitio de fijación sobre el antígeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 15, una región CDR2H de SEC ID NO: 16 y una región CDR1H de SEC ID NO: 17, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 18, una región CDR2L de SEC ID NO: 19 y una región CDRIL de SEC ID NO: 20; y el segundo sitio de fijación al antígeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 21, una región CDR2H de SEC ID NO: 22, y una región CDR1H de SEC ID NO: 23, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 24, una región CDR2L de SEC ID NO: 25 y una región CDRIL de SEC ID NO: 26.

5. - El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el primer sitio de fijación sobre el antígeno que se une específicamente a la ErbB-2 contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 1 y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 2; y el segundo sitio de fijación sobre el antígeno que se une específicamente a la c-Met contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 3 y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 4.

6. - El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1 a 5, caracterizado porque comprende una región constante de la subclase IgGl o IgG3.

7. - El anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1 a 6, caracterizado porque el anticuerpo está glicosilado con una cadena de azúcar en Asn297 por lo que la cantidad de fucosa dentro de la cadena de azúcar es 65% o menor.

8. - Un ácido nucleico, caracterizado porque codifica a un anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7.

9. - Una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene un anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7.

10. - Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9 caracterizada porque es para el tratamiento del cáncer.

11. - Un anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque es para el tratamiento del cáncer.

12. - Uso de un anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.

13.- Un método de tratamiento de un paciente que sufre un cáncer caracterizado porque consiste en administrar un anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7 a un paciente que necesite el tratamiento.