MX2011004001A - Variantes de inmunoglobulinas y sus usos. - Google Patents

Abstract

Se proveen variantes de inmunoglobulinas con una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc que tienen aumento de las vidas medias in vivo, y métodos para usarlos.

Description

VARIANTES DE IN UNOGLOBULINAS Y SUS USOS SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud es una solicitud no provisoria presentada según 37 CFR 1.53(b)(1 ), que reivindica la prioridad según 35 USC 1 19(e) sobre la solicitud provisoria número 61/105.086 presentada el 14 de octubre de 2008, la solicitud provisoria número 61/152.131 presentada el 12 de febrero de 2009, la solicitud provisoria número 61/171.768 presentada el 22 de abril de 2009, y la solicitud provisoria número 61/220.514 presentada el 25 de junio de 2009, cuyos contenidos se incorporan en la presente por referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular. Más específicamente, la presente invención se refiere a variantes de inmunoglobulina IgG con propiedades biológicas alteradas, y métodos para usarlas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Con el transcurrir de los años, ha aumentado notablemente el uso de las inmunoglobulinas como agentes terapéuticos. Las moléculas de inmunoglobulina (Ig) que constituyen una parte importante del sistema inmune son de gran interés debido a que 1 ) reaccionan con una familia diversa de ligandos, (2) poseen diferentes funciones efectoras y (3) tienen gran importancia biológica. En la actualidad, los usos de fármacos basados en anticuerpos incluyen el tratamiento de cáncer, enfermedades autoinmunes así como diversas enfermedades sistémicas e infecciosas. Además, las inmunoglobulinas son útiles como herramientas de diagnóstico ¡n vivo, por ejemplo, en procedimientos de diagnóstico por imágenes.

La IgG es la clase de inmunoglobulinas más importante en humanos y otros mamíferos y es utilizada en diversos tipos de inmunoterapias y procedimientos de diagnóstico. La IgG-i humana es el anticuerpo más comúnmente usado con fines terapéuticos. En la actualidad, muchos anticuerpos de estudios clínicos están dirigidos contra antígenos asociados a tumor. En particular, los anticuerpos neutralizantes anti-VEGF han demostrado suprimir el crecimiento de una variedad de líneas celulares de tumor humano en ratones desnudos (Kim et al. Nature 362:841-844 (1993); Warren et al. J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgstróm ef al. Cáncer Res. 56:4032-4039 (1996); y Melnyk ef al. Cáncer Res. 56:921-924 (1996)) y también inhiben angiogénesis intraocular en modelos de trastornos isquémicos retiñíanos (Adamis et al. Arch. Ophthalmol. 1 14:66-71 (1996)). De hecho, un anticuerpo anti-VEGF humanizado, bevacizumab (AVASTIN®, Genentech, South San Francisco, CA) es la primera terapia aprobada por la FDA de los estados Unidos diseñada para inhibir la angiogénesis.

A pesar de su potencial, uno de los problemas de la inmunoterapia con inmunoglobulinas ha sido la persistencia de inmunoglobulinas en la circulación. La tasa de depuración de las inmunoglobulinas afecta directamente la cantidad y la frecuencia de la dosis de la inmunoglobulina. El aumento de la dosis y la frecuencia de la dosificación pueden causar efectos adversos en el paciente y también aumentan los costos médicos.

El mecanismo de catabolismo de la IgG en la circulación ha sido dilucidado mediante estudios relacionados con la transferencia de inmunidad pasiva de la madre al feto/recién nacido a través de la placenta o el saco vitelino o a través del calostro (transferencia maternofetal de IgG por transcitosis) en roedores (Brambell, Lancet, i¡:1087-1093, 1966; Rodewaid, J. Cell Biol., 71 :666-670, 1976; Morris et al., en: Antigen Absorption by the Gut, pp. 3-22, 1978, University Park Press, Baltimore; Jones et al., J. Clin. Invest., 51 :2916-2927, 1972). El receptor de Fe neonatal (FcRn) juega un papel Importante en la transcitosis y la homeostasis de IgG en mamíferos. FcRn es estructuralmente homólogo a las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y consiste de una cadena a transmembrana y p2-microglobulina (ß2?t?). Los estudios previos en ratones knockout mostraron que la vida media sérica de IgG en ratones deficientes de FcRn o ß2?t? estaba muy reducida (Roopenian ef al., J Immunol 170(7), 3528-3533, 2003; Israel et al., Immunology 89(4), 573-578, 1996), lo cual demuestra el papel protector de FcRn en la regulación del nivel de IgG circulante. Diversos experimentos de mutagénesis específica de sitio en la región Fe de las IgG murinas condujeron a la identificación de ciertos residuos de aminoácidos críticos que intervienen en la interacción entre IgG y FcRn (Kim ef al., Eur. J. Immunol., 24:2429-2434, 1994; Medesan et al., Eur. J. Immunol., 26:2533, 1996; Medesan et al., J. Immunol., 158:2211-2217, 1997). Además, diversas publicaciones describen métodos para obtener moléculas fisiológicamente activas cuyas vidas medias están modificadas por la introducción o la modificación de una región fijadora de FcRn de las IgG (documento WO 97/43316; patente de los Estados Unidos N.° 5.869.046; patente de los Estados Unidos N.° 5.747.035; documento WO 96/32478; documento WO 2006053301 ; patente de los Estados Unidos N.° 7.083.784; patente de los Estados Unidos N.° 7.371.826).

En el nivel molecular, FcRn se fija a la porción Fe de la IgG en la región del dominio CH2-CH3. La interacción Fc-FcRn es altamente dependiente del pH; las IgG se fijan a FcRn con gran afinidad a pH 6, pero a medida que el pH se eleva a 7,4, la afinidad de unión disminuye considerablemente. Esta interacción dependiente del pH es responsable de proteger la IgG de la degradación. Específicamente, la IgG sometida a pinocitosis es capturada por FcRn en el endosoma ácido, vuelve a ser reciclada a la superficie celular y luego es liberada a la circulación con el pH sérico fisiológico de 7,4 (Ober eí al. Proc Nati Acad Sci U S A 101(30), 11076-1 1081 , 2004; Ober ef al. J Immunol 172(4), 2021-2029, 2004; Prabhat ef al. Proc Nati Acad Sci U S A 104(14), 5889-5894, 2007). La IgG que no está unida a FcRn es dirigida al lisosoma y degradada. Dado que FcRn es importante en la regulación de la homeostasis de la IgG, la modulación de la interacción entre Fe y FcRn mediante ingeniería de proteínas es un método para mejorar la farmacocinética de los anticuerpos terapéuticos (Shields ef al. J Biol Chem 276(9), 6591-6604, 2001 ; Dall'Acqua ef al. Nat Biotechnol 15(7), 637-640, 1997; Dall'Acqua et al., J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002; Hinton ef al. J Biol Chem 279(8), 6213-6216, 2004; Hinton ef al. J Immunol 176(1 ), 346-356, 2006; Datta-Mannan ef al. Drug Metab Dispos 35(1 ), 86-94, 2007; Datta-Mannan ef al. J Biol Chem 282(3), 1709-1717, 2007). Numerosos estudios en ratones, monos rhesus y cinomolgus han demostrado que el incremento de la afinidad de unión de las IgG a pH 6 puede prolongar la vida media (Dall'Acqua et al. Nat Biotechnol 15(7), 637-640, 1997; Dall'Acqua et al., J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002; Hinton ef al. J Biol Chem 279(8), 6213-6216, 2004; Hinton ef al. J Immunol 176(1 ), 346-356, 2006). Además, otros estudios también demostraron que la afinidad de unión de FcRn a pH 7,4 - es un determinante adicional de la farmacocinética de las IgG. Específicamente, ciertas variantes con aumento de la afinidad de unión a pH 7,4 para FcRn murino exhibieron aumento de depuración (es decir, disminución de la vida media) en ratones (Dall'Acqua ef al., J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002). No obstante, la relación detallada entre la afinidad por FcRn y la vida media no ha sido dilucidada, dado que todos los estudios previos incluyeron una pequeña cantidad de variantes, dentro de un rango limitado de afinidades de FcRn. Se desconoce la máxima extensión de la vida media que se puede obtener mediante ingeniería de interacción Fc:FcRn.

A pesar de que la adherencia (cumplimiento) del tratamiento farmacológico es importante, se estima que la mitad de aquellos a quienes se prescriben las medicinas no las toman en la forma recomendada. Por ejemplo, una investigación reciente demostró que hasta un tercio de las mujeres que reciben fármacos contra el cáncer de mama desarrollado en los últimos 10 años no completan su curso recomendado de cinco años. Algunas de las causas de escaso cumplimiento incluyen olvidos, dificultad física del cumplimiento (por ejemplo viajes o mudanzas del lugar de tratamiento), inconveniencia, efectos secundarios adversos, régimen complicado y costo de los fármacos. La escasa adherencia al tratamiento con fármacos puede conducir a que se obtengan menos beneficios de salud respecto del máximo que pueden proveer los medicamentos a los pacientes. Por ejemplo, la falta de cumplimiento del curso recomendado de tratamiento de cáncer podría conducir a la recurrencia de la enfermedad y una reducción de las posibilidades de supervivencia.

Las estrategias para mejorar el cumplimiento de los fármacos incluyen hacer más conveniente para los pacientes la compleción del curso recomendado de tratamiento. Una de las formas para lograr esto en los pacientes en tratamiento por inmunoterapia consiste en incrementar la duración de la circulación de las inmunoglobulinas. La tasa de depuración de las inmunoglobulinas afecta directamente la cantidad y la frecuencia de dosis de las inmunoglobulinas. En consecuencia, el desarrollo de una inmunoglobulina que confiera aumento de la vida media in vivo puede reducir la cantidad y/o la frecuencia de dosis, en consecuencia se minimiza la inconveniencia, además de cualquier costo médico adicional.

En consecuencia, sería altamente ventajoso contar con ¡nmunoglobulinas modificadas que confieran aumento de la vida media in vivo con fines terapéuticos. La presente invención está dirigida a estas y otras necesidades, tal como será aparente luego de la revisión de la siguiente descripción.

SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN La invención provee nuevas variantes de IgG y sus usos. Una cantidad de variantes de IgG se proveen en la invención. Por ejemplo, la presente invención describe nuevas variantes de IgG que comprenden una región de Fe de IgG humana que comprende dos o más sustituciones de aminoácidos respecto de la región Fe de IgG humano de tipo silvestre en dos o más de los residuos de aminoácidos 251 , 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 y 436, numerados de acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la IgG variante tiene una vida media incrementada comparada con la vida media de una IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre, y en donde al menos dos de las sustituciones de aminoácidos están en los residuos de aminoácidos 251 , 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434, o 436, y una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 251 es una sustitución por ácido aspártico o ácido glutámico, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 252 es una sustitución por tirosina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 307 es una sustitución por glutamina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 308 es una sustitución por prolina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 378 es una sustitución por valina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 428 es una sustitución por leucina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 430 es una sustitución por alanina o lisina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 434 es una sustitución por alanina, serina o tirosina, y una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 436 es una sustitución por isoleucina.

En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG humana comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 251 , en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 251 es la sustitución con ácido aspártico o ácido glutámico. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG humana comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 307, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 es la sustitución con glutamina. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG humana comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 308, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 308 es la sustitución con prplina. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG humana comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 378, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 378 es la sustitución con valina. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG humana comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 436, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 436 es la sustitución con isoleucina. En ciertas formas de realización, las IgG variantes tienen mayor afinidad de unión para FcRn que la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre.

En una forma de realización, la región Fe de la IgG humana comprende la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 con glutamina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 con alanina. En una forma de realización, la región Fe de la IgG humana comprende la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 con glutamina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 con serina. En una forma de realización, la región Fe de la IgG humana comprende la sustitución de aminoácido en el aminoácido 308 con prolina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 con alanina. En una forma de realización, la región Fe de la IgG humana comprende la sustitución de aminoácido en el aminoácido 252 con tirosina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 con alanina. En una forma de realización, región Fe de la IgG humana comprende la sustitución de aminoácido en el aminoácido 378 con valina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 con alanina. En una forma de realización, la región Fe de la IgG humana comprende la sustitución de aminoácido en el aminoácido 428 con leucina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 con alanina. En una forma de realización, la región Fe de la IgG humana comprende la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 con alanina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 436 con isoleucina. En una forma de realización, la región Fe de la IgG humana comprende la sustitución de aminoácido en el aminoácido 308 con prolina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 con tirosina. En una forma de realización, la región Fe de la IgG humana comprende la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 con glutamina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 436 con isoleucina.

La presente invención también describe nuevas variantes de IgG que comprenden una región Fe de la IgG humana que comprende tres o más sustituciones de aminoácidos respecto de una región Fe de la IgG humana de tipo silvestre en tres o más de residuos de aminoácidos 251 , 252, 307, 308, 378, 380, 428, 430, 434 y 436, numerados de acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la IgG variante tiene una vida media incrementada comparada con la vida media de una IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre, y en donde al menos tres de las sustituciones de aminoácidos están en los residuos de aminoácidos 251 , 252, 307, 308, 378, 380, 428, 430, 434, o 436, y una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 251 es una sustitución por ácido aspártico o ácido glutámico, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 252 es una sustitución por tirosina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 307 es una sustitución por glutamina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 308 es una sustitución por prolina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 378 es una sustitución por valina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 380 es una sustitución por alanina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 428 es una sustitución por leucina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 430 es una sustitución por alanina o lisina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 434 es una sustitución por alanina, serina, tirosina o histidina, y una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 436 es una sustitución por isoleucina.

En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG humana comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 251 , en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 251 es la sustitución con ácido aspártico o ácido glutámico. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG humana comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 307, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 es la sustitución con glutamina. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG humana comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 308, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 308 es la sustitución con prolina. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG humana comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 378, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 378 es la sustitución con valina. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG humana comprende una sustitución de aminoácido en el aminoácido 436, en donde la sustitución de aminoácido en el aminoácido 436 es la sustitución con ¡soleucina. En ciertas formas de realización, las IgG variantes tienen mayor afinidad de unión con FcRn comparadas con la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre.

En una forma de realización, la región Fe de la IgG humana comprende la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 con glutamina, la sustitución de aminoácido en el aminoácido 380 con alanina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 con serina. En una forma de realización, la región Fe de la IgG humana comprende la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 con glutamina, la sustitución de aminoácido en el aminoácido 380 con alanina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 con alanina. En una forma de realización, la región Fe de la IgG humana comprende la sustitución de aminoácido en el aminoácido 252 con tirosina, la sustitución de aminoácido en el aminoácido 308 con prolina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 con tirosina. En una forma de realización, la región Fe de la IgG humana comprende la sustitución de aminoácido en el aminoácido 251 con ácido aspártico, la sustitución de aminoácido en el aminoácido 307 con glutamina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 con histidina.

En ciertas formas de realización, la presente invención provee las IgG variantes o sus fragmentos que también comprenden una sustitución de aminoácido en posición 297 a alanina.

En ciertas formas de realización, la IgG variante de la presente invención tiene mayor afinidad de unión por FcRn que la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre. En ciertas formas de realización, la IgG variante tiene mayor afinidad de unión por FcRn a pH 6,0 que a pH 7,4. En ciertas formas de realización, la IgG variante es una IgG humana o humanizada. En ciertas formas de realización, la IgG variante es IgG-i, lgG2, lgG3 0 lgG4. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG de la IgG variante es una región Fe de Igd, lgG2, lgG3 o lgG4 Fe. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG de la IgG variante es una región Fe de IgGi .

En ciertas formas de realización, la IgG variante es un anticuerpo anti-VEGF. En ciertas formas de realización, la IgG variante es una variante de bevacizumab. En ciertas formas de realización, la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre es bevacizumab. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre es la región Fe de bevacizumab. En ciertas formas de realización, la IgG variante comprende el dominio variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:1 ) y el dominio variable de la cadena liviana (SEQ ID NO:2). En ciertas formas de realización, la IgG variante comprende el dominio variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:3) y el dominio variable de la cadena liviana (SEQ ID NO:4). En ciertas formas de realización, la IgG variante comprende el dominio variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:7) y el dominio variable de la cadena liviana (SEQ ID NO:8).

La presente invención también describe composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las IgG variantes descritas en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable. Un kit que comprende cualquiera de las IgG variantes descritas en la presente, en un contenedor, e instrucciones para su uso también se provee en la presente.

En ciertas formas de realización, la vida media de la IgG variante está incrementada en al menos 50%, 100%, 150%, 200%, 300% o más, comparada con una IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre. En ciertas formas de realización, la vida media de la IgG variante está incrementada en al menos 2 veces comparada con una IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre. En ciertas formas de realización, la vida media de la IgG variante está incrementada en al menos 3 veces comparada con una IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre. En ciertas formas de realización, la vida media de la IgG variante está incrementada en al menos 4 veces comparada con una IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre. En ciertas formas de realización, la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre es bevacizumab. En ciertas formas de realización, la vida media de la IgG variante es la vida media promedio de bevacizumab. En ciertas formas de realización, la vida media promedio de bevacizumab es de aproximadamente 10 a 12 días, medida en monos cinomolgus, o de aproximadamente 3 semanas, medida en humanos.

En ciertas formas de realización, se proveen IgG variantes que comprenden una región Fe de la IgG humana, en donde la región Fe de la IgG humana comprende sustituciones de aminoácidos respecto de una región Fe de la IgG humana de tipo silvestre en los residuos de aminoácidos 307 y 434, numerados de acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la IgG variante tiene una vida media incrementada comparada con la vida media de una. IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre, y en donde la sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 307 es una sustitución por glutamina, y la sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 434 es una sustitución por alanina. En una forma de realización, la IgG variante es IgGi variante que comprende el dominio variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:1 ) y el dominio variable de la cadena liviana (SEQ ID NO:2), y que comprende una región Fe de IgGi humána que comprende sustituciones de aminoácidos respecto de una región Fe de IgGi humana de tipo silvestre en los residuos de aminoácidos 307 y 434, numerados de acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la IgG variantei tiene una vida media incrementada comparada con la vida media de una IgGi que tiene la región Fe de IgGi humana de tipo silvestre, y en donde la sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 307 es una sustitución por glutamina, y la sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 434 es una sustitución por alanina.

En otra forma de realización, se proveen IgG variantes que comprenden una región Fe de la IgG humana, en donde la región Fe de la IgG humana comprende sustituciones de aminoácidos respecto de una región Fe de la IgG humana de tipo silvestre en los residuos de aminoácidos 307 y 434, numerados dé acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la IgG variante tiene una vida media incrementada comparada con la vida media de una IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre, y en donde la sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 307 es una sustitución por glutamina, y la sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 434 es una sustitución por serina.

En otra forma de realización, se proveen IgG variantes que comprenden una región Fe de la IgG humana, en donde la región Fe de la IgG humana comprende sustituciones de aminoácidos respecto de una región Fe de la IgG humana de tipo silvestre en los residuos de aminoácidos 308 y 434, numerados de acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la IgG variantei tiene una vida media incrementada comparada con la vida media de una IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre, y en donde la sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 308 es una sustitución por prolina, y la sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 434 es una sustitución por alanina.

En otra forma de realización, se proveen IgG variantes que comprenden una región Fe de la IgG humana, en donde la región Fe de la IgG humana comprende sustituciones de aminoácidos respecto de una región Fe de la IgG humana de tipo silvestre en los residuos de aminoácidos 307, 380 y 434, numerados de acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la IgG variante tiene una vida media incrementada comparada con la vida media de una IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre, y en donde la sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 307 es una sustitución por glutamina, la sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 380 es una sustitución por alanina, y la sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 434 es una sustitución por serina.

En ciertas formas de realización, la IgG variante que comprende una región Fe de la IgG humana descrita con anterioridad tiene mayor afinidad de unión para FcRn que la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre. En ciertas formas de realización, la IgG variante tiene mayor afinidad de unión por FcRn a pH 6,0 que a pH 7,4. En ciertas formas de realización, la IgG variante es una IgG humana o humanizada. En ciertas formas de realización, la IgG variante es IgG-i, lgG2, lgG3 o lgG4. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG de la IgG variante es una región Re de IgG-i, lgG2, lgG3 0 lgG4. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG de la IgG variante es una región Fe de IgGi. En ciertas formas de realización, la IgG variante es un anticuerpo anti-VEGF. En ciertas formas de realización, la IgG variante es una variante de bevacizumab. En ciertas formas de realización, la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre es bevacizumab. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre es la región Fe de bevacizumab. En ciertas formas de realización, la IgG variante comprende el dominio variable de la cadena pesada (SEQ ID N0:1 ) y el dominio variable de la cadena liviana (SEQ ID NO:2). En ciertas formas de realización, una composición farmacéutica que comprenden cualquiera de las IgG variantes que comprenden una región Fe de la IgG humana y un portador farmacéuticamente aceptable se proveen en la presente. También se provee en la presente un kit que comprende cualquiera de las IgG variantes que comprenden una región Fe de la IgG humana, en un contenedor, e instrucciones para su uso.

En ciertas formas de realización, se proveen IgG variantes que comprenden una región Fe de IgGi humana, en donde las IgG variantes comprenden el dominio variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:1 ) y el dominio variable de la cadena liviana (SEQ ID NO:2) y en donde la región Fe de lgG1 humana comprende una sustitución de aminoácido respecto de una región Fe de lgG1 humana de tipo silvestre en el residuo de aminoácido 434, numerados de acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la IgG variante tiene una vida media incrementada comparada con la vida media de una IgG que tiene la región Fe de lgG1 humana de tipo silvestre, y la IgG variante tiene mayor afinidad de unión por FcRn comparada con la afinidad de unión por FcRn de la IgG que tiene la región Fe de lgG1 humana de tipo silvestre, y en donde la sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 434 es una sustitución por histidina. En ciertas formas de realización, la IgG variante es IgGi variante.

En ciertas formas de realización, la vida media de una IgG variante de la presente invención está incrementada en al menos 50, 55. 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100% comparada con la vida media de la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre. En una forma de realización, la vida media de una IgG variante de la presente invención está incrementada en al menos 50% comparada con la vida media de IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre. En otra forma de realización, la vida media de una IgG variante de la presente invención está incrementada en al menos 75% comparada con la vida media de la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre. En aún otra forma de realización, la vida media de una IgG variante de la presente invención está incrementada en al menos 100% comparada con la vida media de la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre.

En ciertas formas de realización, la vida media de una IgG variante de la presente invención es de al menos aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, o 40 días. En una forma de realización, la vida media de una IgG variante de la presente invención es de al menos aproximadamente 15 días. En otra forma de realización, la vida media de una IgG variante de la presente invención es de al menos aproximadamente 20 días. En otra forma de realización, la vida media de una IgG variante de la presente invención es de al menos aproximadamente 25 días. En otra forma de realización, la vida media de una IgG variante de la presente invención es de al menos aproximadamente 30 días. En otra forma de realización, la vida media de una IgG variante de la presente invención es de al menos aproximadamente 35 días. En otra forma de realización, la vida media de una IgG variante de la presente invención es de al menos aproximadamente 40 días. En ciertas formas de realización, la IgG variante es IgG! variante.

En ciertas formas de realización, la vida media de una IgG variante de la presente invención es la vida media medida en humanos. En ciertas formas de realización, la vida media de una IgG variante de la presente invención es la vida media medida en monos cinomolgus. En ciertas formas de realización, la IgG de tipo silvestre o la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre es bevacizumab. En ciertas formas de realización, la vida media de bevacizumab es de aproximadamente 10 a 12 días medida en monos cinomolgus, o de aproximadamente 20 días medida en humanos.

Numerosos métodos para usar las variantes de IgG se proveen en la invención. Se proveen métodos para tratar un tumor en un sujeto. Por ejemplo, los métodos comprenden administrar al sujeto una cantidad efectiva de cualquier IgG variante descrita con anterioridad y en la presente. En ciertas formas de realización, la IgG variante es un anticuerpo anti-VEGF. En ciertas formas de realización, la IgG variante es una variante de bevacizumab. En ciertas formas de realización, los métodos también comprenden administrar al sujeto una cantidad efectiva de un agente quimioterápico.

Se proveen métodos para inhibir la actividad de VEGF en un sujeto en la invención. Por ejemplo, los métodos comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de cualquier IgG variante descrita con anterioridad y en la presente. En ciertas formas de realización, la actividad de VEGF es la angiogénesis.

Se proveen métodos para modular la permeabilidad vascular en un sujeto en la invención. Por ejemplo, los métodos comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de cualquier IgG variante descrita con anterioridad y en la presente.

Se proveen métodos para tratar un trastorno no neoplásico en un sujeto en la invención. Por ejemplo, los métodos comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de cualquier IgG variante descrita con anterioridad y en la presente. En ciertas formas de realización, el trastorno no neoplásico es una enfermedad autoinmune. En ciertas formas de realización, el trastorno no neoplásico es enfermedad de Alzheimer. En ciertas formas de realización, el sujeto tiene diagnóstico de degeneración macular relacionada con la edad.

Se proveen métodos para tratar un tumor que expresa HER en un sujeto en la invención. Por ejemplo, los métodos comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de cualquier IgG variante descrita con anterioridad y en la presente. En ciertas formas de realización, la IgG variante comprende el dominio variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:7) y el dominio variable de la cadena liviana (SEQ ID NO:8).

Se proveen métodos para inhibir o prevenir el crecimiento de células cancerosas en un sujeto en la invención. Por ejemplo, los métodos comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de cualquier IgG variante descrita con anterioridad y en la presente.

Se proveen métodos para administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una IgG variante en la invención. Estos métodos de administración se pueden usar en combinación con otros métodos (por ejemplo, métodos de tratamientos) descritos en la presente. En ciertas formas de realización, los métodos comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de cualquier IgG variante descrita con . anterioridad y en la presente, y en donde la IgG variante es administrada al sujeto cada 4 semanas o con mayores intervalos. En ciertas formas de realización, la IgG variante es administrada cada 5 semanas o más. En ciertas formas de realización, la IgG variante es administrada cada 6 semanas o más. En ciertas formas de realización, la IgG variante es administrada cada 7 semanas o más. En ciertas formas de realización, la IgG variante es administrada cada 8 semanas o más. En ciertas formas de realización, la IgG variante es administrada cada 9 semanas o más. En ciertas formas de realización, la IgG variante es administrada cada 10 semanas o más. En ciertas formas de realización, la IgG variante es administrada cada 11 semanas o más. En ciertas formas de realización, la IgG variante es administrada cada 12 semanas o más.

En ciertas formas de realización, métodos comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de cualquier IgG variante, en donde la IgG variante es administrada con menor frecuencia que la frecuencia de dosis recomendada o prescripta de la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre. En ciertas formas de realización, la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre es bevacizumab. En ciertas formas de realización, la IgG variante, por ejemplo, una variante de bevacizumab, es administrada con menor frecuencia que la frecuencia de dosis prescripta de bevacizumab.

En ciertas formas de realización, la IgG variante es inicialmente administrada cada 2 semanas, y luego administrada cada 4 semanas o más. En ciertas formas de realización, la IgG variante es inicialmente administrada cada 3 semanas, y luego administrada cada 6 semanas o más. En ciertas formas de realización, la IgG variante es inicialmente administrada cada 4 semanas, y luego administrada cada 8 semanas o más. En ciertas formas de realización, la IgG variante es inicialmente administrada cada 5 semanas, y luego administrada cada 10 semanas o más. En ciertas formas de realización, la IgG variante es inicialmente administrada cada 6 semanas, y luego administrada cada 12 semanas o más. En ciertas formas de realización, la IgG variante, por ejemplo, una variante de bevacizumab, es inicialmente administrada con la frecuencia de dosis prescripta de bevacizumab, y luego administrada con menor frecuencia que la dosis prescripta de bevacizumab.

En ciertas formas de realización de los métodos descritos en la presente, la IgG variante es un anticuerpo anti-VEGF. En una forma de realización, el anticuerpo anti-VEGF comprende el dominio variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:1 ) y el dominio variable de la cadena liviana (SEQ ID NO:2). En otra forma de realización, el anticuerpo anti-VEGF es una variante de bevacizumab.

En ciertas formas de realización, las IgG variantes de la invención son administradas al sujeto por vía intravenosa. En ciertas formas de realización, las IgG variantes de la invención son administradas al sujeto por vía subcutánea.

En ciertas formas de realización de los métodos descritos en la presente, el sujeto es humano. En ciertas formas de realización, el sujeto tiene diagnóstico de cáncer. En ciertas formas de realización, el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células renales, cáncer de ovario, glioblastoma, cáncer de mama, y cáncer colorrectal.

También se proveen en la presente métodos para tratar un cáncer benigno, precanceroso o no metastático en un sujeto, los cuales comprenden administrar al sujeto una cantidad efectiva de una IgG variante. En ciertas formas de realización, la administración de la IgG variante impide que el cáncer benigno, precanceroso o no metastático se transforme en cáncer invasivo o metastático. Por ejemplo, el cáncer benigno, precanceroso o no metastático puede ser cáncer de estadio 0, estadio I, o estadio II, y en ciertas formas de realización, la administración de la IgG variante impide la progresión del cáncer benigno, precanceroso o no metastático al(os) siguiente(s) estadio(s), por ejemplo, a cáncer de estadio I, estadio II, estadio III o estadio IV. En ciertas formas de realización, la IgG variante es administrada durante un tiempo y en una cantidad suficiente para tratar el tumor benigno, precanceroso o no metastático en el sujeto o impedir que el tumor benigno, precanceroso o no metastático se transforme en un cáncer invasivo o metastático. En ciertas formas de realización, al administrar la IgG variante se reduce el tamaño del tumor, la carga del tumor, o la cantidad de tumores del tumor benigno, precanceroso o no metastático. La IgG variante también se puede administrar en una cantidad y durante un tiempo para disminuir la densidad vascular en el tumor benigno, precanceroso o no metastático.

Tal como se describe en la presente, los métodos de la invención se pueden usar para tratar, por ejemplo, un cáncer de estadio 0 (por ejemplo, un carcinoma en situ), de estadio I, o de estadio II. Los métodos de terapia neoadyuvante y coadyuvante se pueden usar para tratar cualquier tipo de cáncer, por ejemplo, benigno o maligno. En ciertas formas de realización de la invención, el cáncer es un tumor sólido, incluso, sin limitaciones, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas), melanoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado y cánceres de tejidos blandos (por ejemplo, linfomas de células B tales como NHL y mieloma múltiple y leucemias tales como leucemia linfocítica crónica). En otra forma de realización, el tumor benigno, precanceroso o no metastático es un pólipo, adenoma, fibroma, lipoma, gastrinoma, insulinoma, condroma, osteoma, hemangioma, linfangioma, meningioma, leiomioma, rabdomioma, papiloma de células pavimentosas, neuromas acústicos, neurofibroma, cistanoma de conductos biliares, leiomiomas, mesoteliomas, teratomas, mixomas, tracomas, granulomas, hamartomas, papiloma de células de transición, adenoma pleiomórfico de la glándula salival, tumor desmolde, cistopapiloma dermoide, cistadenoma, hiperplasia focal nodular, o una hiperplasia nodular regenerativa. En otra forma de realización, el método de preferencia se usa para tratar un adenoma. Los ejemplos no limitantes de adenomas incluyen adenoma de células hepáticas, adenoma renal, adenoma metanéfrico, adenoma bronquial, adenoma alveolar, renal adadenoma, adenoma pituitario, adenoma paratiroideo, adenoma pancreático, adenoma de glándulas salivales, adenoma hepatocelular, adenoma gastrointestinal, adenoma tubular, y adenoma de conductos biliares.

La invención también presenta métodos que comprenden administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una IgG variante para impedir que ocurra o recurra un cáncer benigno, precanceroso o no metastático en el sujeto. En ciertas formas de realización de la invención, el sujeto está en situación de riesgo de tener cáncer, pólipos, o un síndrome canceroso. En un ejemplo, el sujeto tiene antecedentes familiares de cáncer, pólipos, o un síndrome de cáncer heredado. En ciertos aspectos de la invención, el sujeto está en situación de riesgo de desarrollar un tumor benigno, precanceroso o no metastático. En ciertas formas de realización, el método impide que ocurra o recurra dicho cáncer benigno, precanceroso o no metastático en un sujeto que nunca tuvo un tumor, un sujeto que nunca desarrolló un cáncer clínicamente detectable, o un sujeto que sólo ha tenido un tumor benigno.

En otro aspecto, se proveen métodos para prevenir o reducir la probabilidad de recurrencia de cáncer en un sujeto que incluye administrar al sujeto una IgG variante durante un tiempo y en una cantidad suficiente para impedir o reducir la probabilidad de recurrencia de cáncer en el sujeto. La invención incluye un método para prevenir la recurrencia de un cáncer en un sujeto que tiene un tumor que incluye las etapas de extraer el tumor (por ejemplo, mediante el uso de cirugía definitiva) y luego administrar al sujeto una IgG variante. La invención incluye métodos para prevenir el recrecimiento de un tumor en un sujeto que incluye las etapas de extraer el tumor (por ejemplo, mediante el uso de cirugía definitiva) y luego administrar al sujeto una IgG variante. En un aspecto relacionado, la invención incluye un método para prevenir la recurrencia de un. cáncer en un sujeto o reducir la probabilidad de recurrencia de cáncer en un sujeto que opcionalmente incluye administrar al sujeto una cantidad efectiva de una IgG variante antes de la cirugía, realizar cirugía definitiva, y administrar una cantidad efectiva de una IgG variante después de la cirugía, en donde la administración de la IgG variante después de la cirugía impide la recurrencia del cáncer o reduce la probabilidad de recurrencia de cáncer. En otro aspecto relacionado, la invención incluye un método para impedir la recurrencia de cáncer en un sujeto o reducir la probabilidad de recurrencia de cáncer en un sujeto que incluye administrar al sujeto una cantidad efectiva de una IgG variante en ausencia de cualquier otro agente terapéutico anticáncer adicional, en donde la administración impide la recurrencia de cáncer en un sujeto o reduce la probabilidad de recurrencia de cáncer en un sujeto.

Para cada uno de los aspectos anteriores, el tumor puede ser cualquier tipo de tumor incluso sin limitaciones los tumores sólidos, y particularmente los tumores y adenomas, descritos en la presente. El sujeto puede tener un tumor latente o micrometástasis, los cuales pueden o no ser clínicamente detectables. En una forma de realización de este aspecto, la IgG variante es administrada durante un tiempo y en una cantidad suficiente para reducir la neovascularización de un tumor latente o micrometástasis. En otra forma de realización, la IgG variante es administrada durante un tiempo y en una cantidad suficiente para impedir la recurrencia de un tumor clínicamente detectable, o su metástasis, o incrementar la duración de la supervivencia del sujeto.

En una forma de realización, la IgG variante es una monoterapia. En otra forma de realización, el sujeto ha sido tratado previamente por el tumor, por ejemplo, mediante el uso de una terapia anticáncer. En un ejemplo, la terapia anticáncer es cirugía. En otra forma de realización, el sujeto también se puede tratar con' una terapia anticáncer adicional antes, durante (por ejemplo, simultáneamente), o después de la administración de la IgG variante. Los ejemplos de terapias anticáncer incluyen, sin limitación, cirugía, terapia con radiación (radioterapia), bioterapia, inmunoterapia, quimioterapia, o una combinación de estas terapias.

En formas de realización en las cuales el sujeto ha sido sometido a cirugía definitiva, la IgG variante generalmente es administrada después de un periodo en el cual el sujeto se ha recuperado de la cirugía. Este periodo puede incluir el periodo requerido para la curación de heridas o la curación de la incisión quirúrgica, el periodo requerido para reducir el riesgo de dehiscencia de la herida, o el periodo requerido para que el sujeto retorne al nivel de salud esencialmente similar o mejor que el nivel de salud previo a la cirugía. El periodo entre la compleción de la cirugía definitiva y la primera administración de la IgG variante también puede incluir el periodo necesario para una interrupción del fármaco, en donde el sujeto requiere o solicita un periodo entre los regímenes terapéuticos. Generalmente, el periodo entre la compleción de la cirugía definitiva y el comienzo de la terapia con IgG variante puede incluir menos de una semana, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas (28 días), 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 1 1 meses, 1 año, 2 años, 3 años, o más. En una forma de realización, el periodo entre la cirugía definitiva y la administración de la IgG variante es mayor de 2 semanas y menos de 1 año. En una forma de realización, el periodo entre la cirugía definitiva y la administración de la IgG variante es mayor de 4 semanas (28 días).

En ciertas formas de realización, cada uno de los aspectos anteriores también puede incluir el monitoreo del sujeto por recurrencias del cáncer.

La invención también provee métodos de terapia neoadyuvante antes de la extirpación quirúrgica del cáncer operable en un sujeto, por ejemplo, un paciente humano, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una IgG variante cuando el paciente ha sido diagnosticado con un tumor o cáncer. La IgG variante se puede administrar sola o en combinación con al menos un agente quimioterápico.

La invención también incluye un método para tratar un sujeto con cáncer operable que incluye administrar al sujeto una cantidad efectiva de una IgG variante antes de la cirugía y luego realizar cirugía, por la cual se extirpa el cáncer. En una forma de realización, el método también incluye la etapa de administrar al sujeto una cantidad efectiva de una IgG variante después de la cirugía para impedir la recurrencia del cáncer.

En otro aspecto, la invención se ocupa de un método de terapia neoadyuvante que comprende administrar a un sujeto con cáncer operable una cantidad efectiva de una IgG variante y al menos un agente quimioterápico antes de la cirugía definitiva.

En otro aspecto, la invención incluye un método para reducir el tamaño del tumor en un sujeto que tiene un tumor no extirpable que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una IgG variante en donde la administración reduce el tamaño del tumor, lo cual permite la completa resección del tumor. En una forma de realización, el método también incluye administrar al sujeto una cantidad efectiva de una IgG variante después de la completa resección del tumor.

En otro aspecto, la invención se ocupa de un método para tratar cáncer en un sujeto que comprende los siguientes estadios: a) un primer estadio que comprende una pluralidad de ciclos de tratamiento, en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una IgG variante y al menos un agente quimioterápico en un intervalo predeterminado; b) una cirugía definitiva por la cual se extirpa el cáncer; y c) un segundo estadio que comprende una pluralidad de ciclos de mantenimiento en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una IgG variante sin un agente quimioterápico en un intervalo predeterminado. En una forma de realización, el primer estadio comprende una primera pluralidad de ciclos de tratamiento en donde una IgG variante y un primer régimen de quimioterapia se administran seguidos de una segunda pluralidad de ciclos de tratamiento en donde se administran una IgG variante y un segundo régimen de quimioterapia.

La invención provee métodos que comprenden administrar a un sujeto con cáncer metastático o no metastático, después de la cirugía definitiva, una cantidad efectiva de una IgG variante. En ciertas formas de realización, el método también incluye el uso de al menos un agente quimioterápico.

En un aspecto, el método comprende los siguientes estadios: a) un primer estadio que comprende una pluralidad de ciclos de tratamiento en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una IgG variante y al menos un agente quimioterápico en un intervalo predeterminado; y b) un segundo estadio que comprende una pluralidad de ciclos de mantenimiento en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una IgG variante sin un agente quimioterápico en un intervalo predeterminado. En una forma de realización, el primer estadio comprende una primera pluralidad de ciclos de tratamiento en donde se administran una IgG variante y un primer régimen de quimioterapia, seguido de una segunda pluralidad de ciclos de tratamiento en donde se administran una IgG variante y un segundo régimen de quimioterapia.

En ciertas formas de realización, la IgG variante es un anticuerpo anti-VEGF que se fija a VEGF o reduce la expresión de VEGF o la actividad biológica. El anticuerpo anti-VEGF, o su fragmento fijador de antígeno, puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo totalmente humano, o un anticuerpo humanizado. En ciertas formas de realización, los ejemplos de anticuerpos de utilidad en los métodos de la invención incluyen bevacizumab (AVASTIN®), G6-31 , B20-4.1 , B20-4.1.1 , y sus fragmentos.

En ciertas formas de realización, la IgG variante es anticuerpo monoclonal humanizado anti-HER2 HERCEPTIN®. En ciertas formas de realización, la IgG variante es anticuerpo quimérico anti-CD20 Rituxan®, anticuerpo anti-lgE XOLAIR®, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-CD11a Raptiva®, anticuerpo anti-Her2 Omnitarg®, un anticuerpo anti-oxLDL, anticuerpo anti-CD4 MTRX1011A, un anticuerpo anti-HCV, un anticuerpo anti- IL-17A/F, un anticuerpo anti-A-beta, un anticuerpo anti-DR6, anticuerpo anti-citomegalovirus humano (HCMV), anticuerpo anti-receptor de la familia HER, un anticuerpo de factor antitisular, anticuerpo MLN-02, anticuerpo humanizado anti-CD 18 F(ab')2, o un anticuerpo a humanizado anti-lgE IgGi rhuMab-E25. En ciertas formas de realización, la IgG variante es un anticuerpo biespecífico en donde los antígenos blanco son IL— 4 y IL-13. En ciertas formas de realización, la IgG variante es un anticuerpo dirigido a un epitopo de Staph. aureus.

Si bien el sujeto puede ser tratado de numerosas formas diferentes antes, durante o después de la administración de la IgG variante, en ciertas formas de realización, el sujeto es tratado sin cirugía o quimioterapia. En otras formas de realización, el tratamiento con la IgG variante es una monoterapia o una monoterapia para la duración del periodo de tratamiento de la IgG variante, según el criterio del médico o descrito en la presente.

En otras formas de realización, el tratamiento con la IgG variante es en combinación con una terapia anticáncer adicional, incluso sin limitaciones, cirugía, radioterapia, quimioterapia, terapia de diferenciación, bioterapia, inmunoterapia, un inhibidor de angiogénesis, y un compuesto antiproliferativo. El tratamiento con la IgG variante también puede incluir cualquier combinación de los tipos anteriores de regímenes terapéuticos. En ciertas formas de realización, se pueden usar agentes citotóxicos, antiangiogénicos y antiproliferativos en combinación con la IgG variante. En una forma de realización, la terapia anticáncer es quimioterapia. En ciertas formas de realización, el agente quimioterápico y la IgG variante se administran concurrentemente.

En ciertas formas de realización, los métodos de la invención son ventajosos para el tratamiento y la prevención de los tumores en estadios iniciales, para así impedir la progresión a los estadios más avanzados que dan por resultado la reducción de la morbilidad y de la mortalidad asociada al cáncer avanzado. Los métodos de la invención también son ventajosos para prevenir la recurrencia de un tumor o el recrecimiento de un tumor, por ejemplo, un tumor latente que persiste después de la extirpación del tumor primario, o en la reducción o prevención de la aparición o proliferación de micrometástasis.

Para los métodos de la invención, el cáncer puede ser un tumor sólido, por ejemplo, tal como cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de pulmón, cáncer de células renales, un glioma (por ejemplo, astrocitoma anaplásico, oligoastrocitoma anaplásico, oligodendroglioma anaplásico, glioblastoma multiforme), cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, y cáncer de ovario.

Los métodos de la invención también pueden incluir el monitoreo del sujeto por la recurrencia del cáncer o tumor.

Otras propiedades y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente Descripción detallada, los dibujos, y las reivindicaciones.

Cualquier forma de realización descrita en la presente o cualquiera de sus combinaciones se aplica a todas y cualquiera de las IgG variantes y los métodos de la invención descritos en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1A-B: fijación de anti-VEGF de tipo silvestre (WT) y anti-VEGF variantes a FcRn humano a pH 6,0. Se realizaron dos corridas experimentales separadas con diferentes niveles de FcRn acoplado en los chips. Para cada corrida, la unidad de respuesta de estado estable se gráfica como función de concentraciones variantes para estimar las constantes de disociación.

Fig. 2: Constantes de disociación del anti-VEGF de tipo silvestre (WT) y variantes anti-VEGF contra FcRn humano a pH 6,0. Se estimó KD a partir de las dos corridas diferentes mostradas en la Figura 1.

Fig. 3: Fijación de anti-VEGF de tipo silvestre (WT) y anti-VEGF variantes a FcRn humano a pH 7,4. La unidad de respuesta de estado estable se gráfica como función de las concentraciones de anti-VEGF variante.

Fig. 4A-D: Fijación de anti-VEGF de tipo silvestre y anti-VEGF variantes a (A) FcRn humano a pH 6,0, (B) FcRn humano a pH 7,4, (C) ciño FcRn a pH 6.0 y (D) ciño FcRn a pH 7,4.

Fig. 5: Parámetros cinéticos y constantes de disociación monovalentes (KD) de diversos anti-VEGF variantes contra FcRn humano a pH 6,0 y 25 °C. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.

Fig. 6 Parámetros cinéticos y constantes de disociación monovalentes (KD) de diversos anti-VEGF variantes contra ciño FcRn a pH 6,0 y 25 °C. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.

Fig. 7A-B: Velocidad de disociación (k0ff) de (A) FcRn humano y (B) FcRn ciño contra diferentes anti-VEGF variantes a diferentes pH.

Fig. 8: Síntesis de mejoramiento de afinidad de FcRn humano de los anti-VEGF variantes respecto de anti-VEGF de tipo silvestre. Los datos se sintetizan de las Figuras 4 y 5.

Fig. 9A-B: Fijación a VEGF de (1 ) anti-VEGF de tipo silvestre y anti-VEGF variantes (2) N434H, (3) T307Q N434A, (4) T307Q/N434S, (5) T307Q/E380A N434S y (6) V308P/N434A. (A) La fijación de VEGF de los anticuerpos determinados por inyección de anti-VEGF de tipo silvestre y anti-VEGF variantes respecto de un chip sensor recubierto por VEGF-A109 a 37 °C mediante el uso de BIAcore® 3000. (B) Sensogramas para las inyecciones de 50 nM y 100 nM. La línea de base de cada sensograma se compensó por 4RU para una mejor visualización.

Fig. 10: Inhibición ¡n?itro de proliferación de HUVEC por AVASTIN®, anti-VEGF wildtype (bevacizumab) y anti-VEGF variantes. Se cultivaron células endoteliales vasculares umbilicales humanas (HUVEC) en presencia de VEGF y diversas concentraciones de anticuerpos anti-VEGF. Se evaluó la viabilidad después de 4 días de cultivo.

Fig. 11 : Perfiles farmacocinéticos de anti-VEGF tipo silvestre y cinco anti-VEGF variantes en monos cinomolgus después de una única dosis IV de 5 mg/kg. Las concentraciones séricas de los anticuerpos se midieron por ELISA. Los datos se representan como media ± desvío estándar (n= 12 animales/grupo excepto para el grupo V308P/N434A que tenía 11 animales).

Fig. 12: Parámetros farmacocinéticos para anti-VEGF tipo silvestre y cinco anti-VEGF variantes después de una única dosis IV de 5 mg/kg a monos cinomolgus.

Fig. 13: Gráfico que muestra la relación entre la vida media terminal en monos cinomolgus y afinidad por FcRn a pH 6,0 para el anti-VEGF tipo silvestre y cinco anti-VEGF variantes. Las barras de error representan desvíos estándar de 11 o 12 animales por grupo.

Fig. 14A-B: Perfiles farmacocinéticos de anti-VEGF tipo silvestre y anti- VEGF variante T307Q/N434A en ratones transgénicos VEGF humanizados después de una única dosis IV de 0,3 o 5 mg/kg. Las concentraciones séricas de los anticuerpos se midieron mediante el uso de (A) captura de VEGF por ELISA o (B) captura de Fe humano por ELISA. Los datos se representan como la media ± desvío estándar.

Fig. 15: Parámetros farmacocinéticos para anti-VEGF tipo silvestre y anti-VEGF variante T307Q/N434A después de una única dosis intravenosa de 0,3 o 5 mg/kg a ratones transgénicos VEGF humanizados.

Fig. 16A-B: Perfiles farmacocinéticos de anti-VEGF variante T307Q/N434A en ratones transgénicos VEGF humanizados después de una dosis múltiple de 0,3 o 5 mg/kg. El anticuerpo se administró los días 0, 3, 6, y 9. Se midieron las concentraciones séricas de los anticuerpos mediante el uso de (A) captura de VEGF por ELISA o (B) captura de Fe humano por ELISA. Los datos se representan como la media ± desvío estándar.

Fig. 17: Parámetros farmacocinéticos para T307Q/N434A después de cuatro dosis intravenosas de 0,3 o 5 mg/kg los días 0, 3, 6, y 9 a ratones transgénicos VEGF humanizados.

Fig. 18A-C: Eficacia de anti-VEGF tipo silvestre y T307Q/N434A (QA) variante en el tratamiento de xenoinjertos HM-7 implantados s.c. en ratones RAG2 KO; hum-X VEGF Kl doble homocigotos. 5 mg/kg y 0,5 mg/kg de tipo silvestre y T307Q/N434A variante y 5mg/kg de control antiambrosía se administraron por vía intraperitoneal dos veces por semana. (A) Curvas de crecimiento de tumores HM-7. Los datos se representan como la media ± error estándar. (B) Curvas de crecimiento de tumores HM-7 para los grupos de tratamiento de 0,5 y 0,05 mg/kg. (C) Concentraciones séricas de anticuerpo anti-VEGF al final del tratamiento (día 18 para antiambrosía y día 21 para los grupos de tratamiento anti-VEGF). Las concentraciones se midieron mediante el uso de captura de VEGF por ELISA. Los datos se representan como la media ± desvío estándar.

Fig. 19A-E: Estudio repetido de la eficacia de anti-VEGF tipo silvestre y T307Q/N434A (QA) variante en el tratamiento de xenoinjertos HM-7 implantados s.c. en ratones RAG2 KO; hum-X VEGF Kl doble homocigotos. 5, 0,5 y 0,05 mg/kg de tipo silvestre y T307Q/N434A variante y 5 mg/kg de control antiambrosía se administraron por vía intraperitoneal dos veces por semana. (A) Curvas de crecimiento de tumores HM-7. Los datos se representan como la media + error estándar. (B) Curvas de crecimiento de tumores HM-7 para los grupos de tratamiento de 0,5 y 0,05 mg/kg. Los datos se representan como la media ± error estándar. (C) Pesos terminales de los tumores HM-7 determinados al final del tratamiento (día 16 para antiambrosía, día 19 para el grupo de 0,05 mg/kg, y día 22 de los grupos restantes). Los datos se representan como la media ± error estándar. (D) Concentraciones séricas de anticuerpo anti-VEGF al final del tratamiento. Las concentraciones se midieron mediante el uso de captura de Fe humano por ELISA. Los datos se representan como la media ± desvío estándar. (E) Proporción de concentración de anticuerpo en tumores respecto de la sangre. Las concentraciones de anticuerpo antitumoral se determinaron mediante la medición de la cantidad total de lisados de tumor y la cantidad de anticuerpo anti- VEGF en los lisados de tumor. Los datos se representan como la media ± desvío estándar.

Fig. 20A-D: El tercer estudio de eficacia de anti-VEGF tipo silvestre y T307Q/N434A (QA) en el tratamiento de xenoinjertos HM-7 implantados s.c. en ratones RAG2 KO; hum-X VEGF Kl doble homocigotos. 5, 0,5 y 0,05 mg/kg de tipo silvestre y T307Q/N434A y 5 mg/kg de control antiambrosía se administraron por vía intraperitoneal dos veces por semana. (A) Volumen medio de tumor para cada grupo al final del tratamiento (día 22). Los datos se representan como la media ± error estándar. (B) Pesos terminales de los tumores HM-7. Los datos se representan como la media ± error estándar. (C) Concentraciones séricas de anticuerpo anti-VEGF al final del tratamiento. Las concentraciones se midieron mediante el uso de captura de Fe humano por ELISA. Los datos se representan como la media ± desvío estándar. (D) Proporción de concentración de anticuerpo en tumores respecto de la sangre. Las concentraciones de anticuerpo antitumoral se determinaron mediante la medición de la cantidad total de lisados de tumor y la cantidad de anticuerpo anti-VEGF en los lisados de tumor. Los datos se representan como la media ± desvío estándar.

Fig. 21A-D: Eficacia de anti-VEGF tipo silvestre y T307Q/N434A (QA) variante en el tratamiento de xenoinjertos HT-55 implantados s.c. en ratones RAG2 KO; hum-X VEGF Kl doble homocigotos. 5, 0,5 y 0,05 mg/kg de tipo silvestre y T307Q/N434A y 5 mg/kg de control antiambrosía se administraron por vía intraperitoneal dos veces por semana. (A) Curvas de crecimiento de los tumores HT-55. Los datos se representan como la media ± error estándar. (B) Pesos terminales de tumores HT-55 determinados al final del tratamiento (día 35). Los datos se representan como la media ± error estándar. (C) Concentraciones séricas de anticuerpo anti-VEGF al final del tratamiento. Las concentraciones se midieron mediante el uso de captura de Fe humano por ELISA. Los datos se representan como la media ± desvío estándar. (D) Proporción de concentración de anticuerpo en tumores respecto de la sangre. Las concentraciones de anticuerpo antitumoral se determinaron mediante la medición de la cantidad total de lisados de tumor y la cantidad de anticuerpo anti-VEGF en los lisados de tumor. Los datos se representan como la media ± desvío estándar.

Fig. 22A-E: Eficacia de anti-VEGF tipo silvestre y T307Q/N434A (QA) variante en el tratamiento de xenoinjertos Colo-205 implantados s.c. en ratones RAG2 KO; hum-X VEGF Kl doble homocigotos. 5, 0,5 y 0,05 mg/kg de tipo silvestre y T307Q/N434A y 5 mg/kg de control antiambrosía se administraron por vía intraperitoneal dos veces por semana. (A) Curvas de crecimiento de los tumores Colo-205. Los datos se representan como la media ± error estándar. (B) Curvas de crecimiento de los tumores Colo-205 en los grupos de tratamiento de 0,5 y 0,05 mg/kg. (C) Pesos terminales de tumores Colo-205 determinados al final del tratamiento (día 38). Los datos se representan como la media ± error estándar. (D) Concentraciones séricas de anticuerpo anti-VEGF al final del tratamiento. Las concentraciones se midieron mediante el uso de captura de Fe humano por ELISA. Los datos se representan como la media ± desvío estándar. (E) Proporción de concentración de anticuerpo en tumores respecto de la sangre. Las concentraciones de anticuerpo antitumoral se determinaron mediante la medición de la cantidad total de lisados de tumor y la cantidad de anticuerpo anti-VEGF en los lisados de tumor. Los datos se representan como la media ± desvío estándar.

Fig. 23A-D: Un estudio repetido de la eficacia de anti-VEGF tipo silvestre y T307Q/N434A (QA) variante en el tratamiento de xenoinjertos Colo-205. 5, 0,5 y 0,05 mg/kg de tipo silvestre y T307Q/N434A y 5 mg/kg de control antiambrosía se administraron por vía intraperitoneal dos veces por semana. (A) Curvas de crecimiento de los tumores Colo-205. Los datos se representan como la media ± error estándar. (B) ) Curvas de crecimiento de los tumores Colo-205 en los grupos de tratamiento de 0,5 y 0,05 mg/kg. (C) Pesos terminales de tumores Colo-205 determinados al final del tratamiento (día 32). Los datos se representan como la media ± error estándar. (D) Concentraciones séricas de anticuerpo anti-VEGF al final del tratamiento. Las concentraciones se midieron mediante el uso de captura de Fe humano por ELISA. Los datos se representan como la media ± desvío estándar.

Fig. 24: Constantes de disociación monovalentes (KD) de anti-HER2 (traztuzumab) Igd Fe variantes de FcRn humano a pH 6,0 y 25 °C mediante el uso de BIAcore. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.

Fig. 25: Niveles de expresión de FcRn en diferentes líneas celulares de tumores humanos. Se usaron cinco millones de células de cada línea celular para el experimento. Se usaron células Raji (linfoma de células B humanas) como control negativo, mientras que la proteína soluble FcRn humana, en la cual faltan las regiones 7kDa transmembrana y citoplasmática, se gráfico como control positivo. Se usaron diluciones de proteína soluble FcRn como estándar para cuantificar el nivel de expresión de FcRn. Los resultados mostrados aquí son representativos de al menos tres experimentos independientes.

Fig. 26: Fijación dependiente de pH de anti-HER2 (traztuzumab) Igd Fe variantes a FcRn humano. Las variantes se construyeron con mutaciones en L251 , L314, y E430. La fijación se midió a un pH que varió desde 6 hasta 7,2 mediante el uso de BIAcore a 25 °C. Las proporciones de afinidad de las variantes respecto de anti-HER2 IgGi tipo silvestre se determinaron y graficaron como función del pH.

Fig. 27A-C: Fijación de anti-HER2 (traztuzumab) IgG-i tipo silvestre, variante T307Q/N434A, variante L251 D/T307Q/N434H y variante L251 D/T307Q/M428L/N434H/Y436I a FcRn humano a (A) pH 6,0, (B) pH 7,1 , y (C) pH 7,4. La fijación se midió mediante el uso de BIAcore a 25 °C. No hubo fijación detectable de variante L251 D/T307Q/N434H a FcRn humano a pH 7,4 en la Fig. 27C.

Fig. 28: La velocidad de disociación (koff) de FcRn humano contra diversos anti-VEGF y anti-HER2 variantes a diferentes pH. Los anti-VEGF variantes son T307Q/N434A, T307Q/N434S. T307Q/E380A N434S y V308P/N434A. El anti-HER2 variante es L251 D/T307Q/M428L/N434H/Y436I. Los valores de ^ a los diferentes pH se ajustaron según el pH para cada variante a fin de obtener la pendiente de la línea mejor adaptada (ecuación: log(koff) = pendiente x pH + intersección de y).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente. invención se refiere a nuevas variantes de los dominios de Fe, incluso los hallados en anticuerpos, fusiones de Fe, e inmunoadhesinas, que tienen incremento de la vida media in vivo. Estas variantes comprenden una región Fe de la IgG humana, o uno de sus fragmentos que se fija a un FcRn, que contiene una o más modificaciones de aminoácidos respecto de una región Fe de tipo salvaje de la IgG humana en donde las modificaciones incrementan la afinidad de la región Fe de la IgG, o uno de sus fragmentos, por FcRn.

Las técnicas y los procedimientos descritos o referidos en la presente son generalmente bien comprendidos y comúnmente empleados mediante el uso de metodología convencional por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3o. edición (2001 ) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); la series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lañe, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, AND ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Celland Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, y D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley y Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991 ); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lañe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cáncer: Principies and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

' A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el comúnmente conocido por los expertos en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Singleton ef al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2o ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, N.Y. 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4o ed., John Wiley & Sons (Nueva York, N.Y. 1992), proporcionan al experto en la técnica una guía general de muchos de los términos usados en la presente solicitud. Todas las referencias citadas en la presente, incluso las solicitudes de patente y publicaciones, se incorporan por referencia en su totalidad.

Definiciones A los fines de" interpretar la presente memoria descriptiva, se aplican las siguientes definiciones y siempre que corresponda, los términos usados en singular también incluyen el plural, y viceversa. Se debe entender que la terminología usada en la presente sólo tiene por finalidad describir formas de realización particulares, y no pretende ser limitante. En el caso de que cualquier definición establecida a continuación esté en conflicto con cualquier documento incorporado en la presente por referencia, la definición establecida más adelante prevalecerá.

En toda la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, la numeración de una cadena pesada de inmunoglobulina es la del índice de EU según Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5° Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesdá, Md. (1991 ), expresamente incorporado en la presente por referencia. El "índice de EU según Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo human Igd EU.

El término " vida media in vivo " o "la vida media del anticuerpo in vivo" tal como se usa en la presente se refiere a la vida media biológica de un tipo particular de molécula de IgG o sus fragmentos que contienen sitios de fijación de FcRn en la circulación de un animal determinado y es representado por el tiempo requerido para que la concentración circulante de una molécula disminuya en un 50%. En ciertas formas de realización, cuando la concentración de determinada IgG se gráfica como función del tiempo, la curva usualmente es bifásica con una fase a rápida que representa la equilibración de las moléculas inyectadas de IgG entre el espacio intra y extravascular, y una fase ß más prolongada que representa la eliminación de las moléculas de IgG del espacio intravascular. En ciertas formas de realización, el término "vida media in vivo" corresponde a la vida media de las moléculas de IgG en la fase ß. En ciertas formas de realización, la curva de concentración versus tiempo de determinada IgG es trifásica, con la correspondiente distribución en una fase a y una fase ß, y la eliminación terminal representada por una fase ?. En consecuencia, en ciertas formas de realización, la vida media in vivo corresponde a la vida media de la fase terminal de eliminación, o la fase ?. En ciertas formas de realización, la curva de concentración versus tiempo curve de determinada IgG es monofásica, con una única fase de eliminación. En consecuencia, en ciertas formas de realización, la vida media in vivo corresponde a la vida media de la fase única de eliminación.

Por "polipéptido original" o "polipéptido tipo silvestre" tal como se usa en la presente se entiende un polipéptido no modificado, un polipéptido tal como aparece en la naturaleza, o una versión modificada por ingeniería de un polipéptido tal como se encuentra en la naturaleza que carece de una o más de las modificaciones de aminoácidos de la región Fe descrita en la presente y el cual difiere en la función efectora comparado con la IgG variante descrita en la presente. El polipéptido original puede comprender una secuencia nativa de la región Fe o una región Fe con modificaciones preexistentes de la secuencia de aminoácidos (tales como adiciones, deleciones y/o sustituciones). El polipéptido original también puede comprender aminoácidos no naturales tales como los descritos más adelante. El polipéptido original se puede referir al propio polipéptido, las composiciones que comprenden el polipéptido original, o la secuencias aminoácidos que lo codifica. El polipéptido original incluye, son limitación, la ¡nmunoglobulina original, la inmunoglobulina tipo silvestre, el anticuerpo original y el anticuerpo tipo silvestre.

En consecuencia, por "inmunoglobulina original", "IgG original", "inmunoglobulina tipo silvestre" o "IgG tipo silvestre" tal como se usa en la presente se entiende una inmunoglobulina no modificada, una inmunoglobulina tal como se encuentra en la naturaleza o una versión modificada por ingeniería de una inmunoglobulina tal como se encuentra en la naturaleza que carece de una o más de las modificaciones de aminoácidos de la región Fe descrita en la presente y que difiere de la función efectora en comparación con la IgG variante tal como se describe en la presente. La inmunoglobulina original puede comprender una secuencia nativa de la región Fe o una región Fe con modificaciones preexistentes de la secuencia de aminoácidos (tales como adiciones, deleciones y/o sustituciones). La inmunoglobulina original también puede comprender aminoácidos no naturales tal como se describe más adelante. La inmunoglobulina original se puede referir a la propia inmunoglobulina, composiciones que comprenden la ¡nmunoglobulina original, o la secuencia de aminoácidos que la codifica.

Por "anticuerpo original" o "anticuerpo de tipo silvestre" tal como se usa en la presente se entiende un anticuerpo no modificado, un anticuerpo tal como se encuentra en la naturaleza o una versión modificada por ingeniería de un anticuerpo tal como se encuentra en la que carece de una o más de las modificaciones de aminoácidos de la región Fe descrita en la presente y que difiere de la función efectora en comparación con la IgG variante tal como se describe en la presente. El anticuerpo original puede comprender una secuencia nativa de la región Fe o una región Fe con modificaciones preexistentes de la secuencia de aminoácidos (tales como adiciones, deleciones y/o sustituciones). El anticuerpo original también puede comprender aminoácidos no naturales tal como se describe más adelante. El anticuerpo original se puede referir al propio anticuerpo, composiciones que comprenden el anticuerpo original o la secuencia de aminoácidos que lo codifica.

En ciertas formas de realización, "IgG original", "anticuerpo original", "IgG tipo silvestre" o "anticuerpo tipo silvestre" incluye, sin limitaciones, anticuerpos comerciales conocidos, producidos en forma recombinante tal como se describe en la presente. En ciertas formas de realización, la IgG tipo silvestre es una IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre se refiere a la región Fe que carece de una o más de las modificaciones de aminoácidos de la región Fe descritas en la presente. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre se refiere a la región Fe con una o más modificaciones de aminoácidos de la región Fe no descritas en la presente. En ciertas formas de realización, la IgG de tipo silvestre es bevacizumab. En cierta forma de realización, el anticuerpo de tipo silvestre es un fragmento de anticuerpo que no contiene una región Fe. En ciertas formas de realización, la IgG variante de dicho anticuerpo de tipo silvestre es una proteína de fusión Fe que comprenden fragmentos del dominio Fab del anticuerpo de tipo silvestre, o el dominio o los dominios de una proteína no de anticuerpo, y un fragmento de dominio de Fe que comprende una o más de las modificaciones de la región Fe descritas en la presente. En ciertas formas de realización, la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre se refiere a una región Fe de IgG con mutación L251 D o L251 D/434H de Fe, pero que no tiene otras modificaciones de aminoácidos de la región Fe descritas en la presente.

Por "variante", "proteína variante" o "variante de proteína" tal como se usa en la presente se entiende una proteína que difiere de una proteína original en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. La proteína variante se puede referir a la propia proteína, una composición que comprende la proteína, o la secuencia de aminoácidos que la codifica. En ciertas formas de realización, la proteína variante tiene al menos una modificación de aminoácidos comparada con el polipéptido original, por ejemplo desde aproximadamente una hasta aproximadamente diez modificaciones de aminoácidos. En ciertas formas de realización, la proteína variante tiene al menos , dos modificaciones de aminoácidos en la región Fe de la IgG. En ciertas formas de realización, la proteína variante tiene al menos tres modificaciones de aminoácidos en la región Fe de la IgG. La secuencia de proteína variante en la presente de preferencia posee al menos aproximadamente 80% de homología con una secuencia de proteína original, y con máxima preferencia al menos aproximadamente 90% de homología, con mayor preferencia al menos aproximadamente 95% de homología. Las proteínas variantes también pueden comprender aminoácidos no naturales, tal como se define más adelante. El término "proteína variante" incluye , inmunoglobulina variante y anticuerpo variante tal como se describe en la presente.

El término "inmunoglobulina variante", "variante de inmunoglobulina," "IgG variante" o "variante de IgG " tal como se usa en la presente significa una secuencia de inmunoglobulina que difiere de una secuencia de inmunoglobulina original o tipo silvestre en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. En ciertas formas de realización, la IgG variante tiene al menos dos modificaciones de aminoácidos en la región Fe respecto de la IgG tipo silvestre. En ciertas formas de realización, la IgG variante tiene al menos tres modificaciones de aminoácidos en la región Fe respecto de la IgG tipo silvestre. En ciertas formas de realización, la IgG variante es un anticuerpo variante. En ciertas formas de realización, la IgG variante es un anticuerpo anti-VEGF. En una forma de realización, la IgG variante es una variante de bevacizumab que comprende una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe del anticuerpo.

Por "anticuerpo variante" o "variante de anticuerpo" tal como se usa en la presente se entiende un anticuerpo que difiere de un anticuerpo original en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. En ciertas formas de realización, el anticuerpo variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe respecto del anticuerpo de tipo silvestre.

Por "posición" tal como se usa en la presente se entiende una ubicación en la secuencia de una proteína. Las posiciones se pueden numerar en secuencia, o de acuerdo con un formato establecido, por ejemplo el índice EU según Kabat.

El término "polipéptido que contiene la región Fe" o "polipéptido Fe" se refiere a un polipéptido que comprende la totalidad o parte de una región Fe. Por ejemplo, los polipéptidos Fe incluyen anticuerpos, fusiones de Fe, Fe aislados, y fragmentos de Fe.

El término "anticuerpo que comprende la región Fe" se refiere a un anticuerpo que comprende una región Fe. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fe se puede eliminar, por ejemplo, durante la purificación del anticuerpo o por ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica el anticuerpo. En consecuencia, una composición que comprende un anticuerpo que tiene una región Fe puede comprender un anticuerpo con K447, con la totalidad de K447 eliminada, o una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447.

Una "modificación de aminoácidos" se refiere a un cambio de la secuencia de aminoácidos de una secuencia predeterminada de aminoácidos. Los ejemplos de modificaciones incluyen una sustitución, inserción y/o deleción de aminoácidos. En ciertas formas de realización, la modificación de aminoácidos es una sustitución.

Una "modificación de aminoácidos en" una posición específica, por ejemplo de la región Fe, se refiere a la sustitución o deleción del residuo especificado, o la inserción de al menos un residuo de aminoácido adyacente al residuo específico. Por inserción "adyacente" a un residuo específico se entiende la inserción dentro de uno a dos residuos correspondientes. La inserción puede ser N-terminal o C-terminal al residuo específico.

Una "sustitución de aminoácidos" se refiere al reemplazo de al menos un residuo existente de aminoácido en una secuencia predeterminada de aminoácidos por otro residuo diferente de aminoácido de "reemplazo". El residuo o los residuos de reemplazo pueden ser "residuos de aminoácidos que se encuentran en la naturaleza" (es decir codificados por el código genético) y seleccionados del grupo que consiste de: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gln); ácido glutámico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (lie): leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptófano (Trp); tirosina (Tyr); y valina (Val). En ciertas formas de realización, el residuo de reemplazo no es cisteína. La sustitución por uno o más residuos de aminoácidos no naturales también es abarcada por la definición de una sustitución de aminoácido en la presente.

Un "residuo de aminoácido que no se encuentra en la naturaleza" se refiere a un residuo distinto de los residuos de aminoácidos que se encuentran en la naturaleza enumerados con anterioridad, el cual es capaz de unirse covalentemente a residuos de aminoácidos adyacentes en una cadena de polipéptido. Los ejemplos de residuos de aminoácidos que se encuentran en la naturaleza incluyen norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuos de aminoácidos tales como los descritos en Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991 ); la patente de los Estados Unidos N.° 6.586.207; los documentos WO 98/48032; WO 03/073238; la Publicación de los Estados Unidos N.° 2004-0214988A1 ; los documentos WO 05135727A2; WO 05/74524A2; J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11 :1135-1137; y J. W. Chin, et al., (2002), PICAS United States de America 99:1 1020-11024, todos totalmente incorporados por referencia.

Una "inserción de aminoácidos" se refiere a la incorporación de al menos un aminoácido en una secuencia predeterminada de aminoácidos. Si bien la inserción usualmente consiste de la inserción de uno o dos residuos de aminoácidos, la presente solicitud contempla "inserciones peptídicas" más grandes, por ejemplo la inserción de aproximadamente tres a aproximadamente cinco o hasta aproximadamente diez residuos de aminoácidos. El(os) residuo(s) insertado (s) pueden encontrarse en la naturaleza o no encontrarse en la naturaleza tal como se describió con anterioridad.

Una "deleción de aminoácido" se refiere a la eliminación de al menos un residuo de aminoácido de una secuencia predeterminada de aminoácidos.

En ciertas formas de realización, el término "incremento", "incremento de vida media" o "incremento in vivo de vida media" se refiere a un incremento global de al menos aproximadamente 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300% o mayor, de la vida media in vivo de una IgG variante de la invención detectada por la métodos conocidos en la técnica estándar tales como los descritos en la presente, comparados con una IgG tipo silvestre o una IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre. En ciertas formas de realización, el término incremento se refiere al incremento in vivo de la vida media de la IgG variante, en donde el incremento es de al menos aproximadamente 1.25X, 1 ,5X, 1 ,75X, 2X, 3X, 4X, 5X, o 10X o mayor comparado con la IgG tipo silvestre o una IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre. En ciertas formas de realización, la IgG tipo silvestre o la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre es bevacizumab. En ciertas formas de realización, la media de la vida media de bevacizumab es de aproximadamente 10 a 12 días medida en monos cinomolgus, o de aproximadamente 20 días medida en humanos.

La "región bisagra" se define generalmente extendida de Glu216 a Pro230 de la lgG1 humana (Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)). Las regiones bisagra de ptrps isotipos de IgG se pueden alinear con la secuencia de lgG1 al colocar el primero y el último residuo de cisteína que forman enlaces S— S entre las cadenas pesadas en las mismas posiciones.

La "región inferior de la bisagra" de una región Fe normalmente se define como la extensión de los residuos inmediatamente C-terminal a la región bisagra, es decir los residuos 233 a 239 de la región Fe. Antes de la presente invención, la fijación FcyR generalmente era atribuida a los residuos de aminoácidos en la región inferior de la bisagra de una región Fe de IgG.

"C1 q" es un polipéptido que incluye un sitio de unión para la región Fe de una inmunoglobulina. C1q junto con dos serina proteasas, C1r y C1s, forman el complejo C1 , el primer componente de la vía de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). El C1q humano se puede adquirir comercialmente, por ejemplo de Quidel, San Diego, Calif.

El término "dominio de unión" se refiere a la región de un polipéptido que se une a otra molécula. En el caso de un FcR, el dominio de unión puede comprender una porción de una de sus cadenas de polipéptido (por ejemplo, su cadena a correspondiente) la cual es responsable de la fijación de una región Fe. Un dominio de unión útil es el dominio extracelular de una cadena a FcR.

El término "anticuerpo" en la presente se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales (incluso los anticuerpos monoclonales de longitud total), los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos), y los fragmentos de anticuerpo siempre que exhiban la actividad biológica deseada.

Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con los usos en investigación, diagnóstico o terapéutica del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En algunas formas de realización, un anticuerpo se purifica (1 ) a más del 95% en peso de anticuerpo determinado, por ejemplo, por el método de Lowry, y en algunas formas de realización, a más del 99% en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia N-terminal o interna de aminoácidos mediante el uso, por ejemplo, de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras que usan, por ejemplo, tinción con Coomassie blue o plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes, dado que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, en condiciones comunes, el anticuerpo aislado se prepara mediante al menos una etapa de purificación.

Los "anticuerpos nativos" son usualmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas livianas idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena liviana está ligada a una cadena pesada mediante un enlace covalente disulfuro, mientras que la cantidad de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y liviana también tiene puentes disulfuro intracatenarios a espacios regulares. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de una cantidad de dominios constantes. Cada cadena liviana tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena liviana está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena liviana está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de las cadenas livianas y las cadenas pesadas.

El término "dominio constante" se refiere a la porción de una molécula de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos más conservada respecto de la otra porción de la inmunoglobulina, el dominio variable, el cual contiene el sitio de fijación del antígeno. El dominio constante contiene los dominios CH1 , CH2 y CH3 de la cadena pesada y el dominio CHL de la cadena liviana.

La "región variable" o el "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios amino terminales de la cadena pesada o la cadena liviana del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada se puede referir como "VH." El dominio variable de la cadena liviana se puede referir como "VL." Estos dominios generalmente son la parte más variable de un anticuerpo y contienen los sitios de fijación del antígeno.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos y se usan para la fijación y la especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida en forma pareja por todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables (HVR) tanto en los dominios variables de la cadena liviana como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones marco (FR). Los dominios variables de las cadenas livianas y pesadas nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, generalmente adoptan una configuración de lámina beta, conectadas por tres HVR, las cuales forman lazos que conectan y en algunos casos forman parte de la estructura de la lámina beta. Las HVR de cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por otras regiones FR y, con las HVR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio fijador de antígeno del anticuerpo (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991 )). Los dominios constantes no intervienen directamente en la fijación de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

Las "cadenas livianas" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) provenientes de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente diferenciados, denominados kappa (?) y lambda (?), sobre la base de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

El término "isotipo" o "subclase" de IgG tal como se usa en la presente significa cualquiera de las subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes.

Según las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de ellas se pueden subdividir a su vez en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-i, lgG2, lgG3, lgG4, IgA-i, y lgA2. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y están descritas en general, por ejemplo, em Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4o ed. (W.B. Saunders, Co., 2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o más proteínas o péptidos.

El término "modificación de subclase de IgG" tal como se usa en la presente significa una modificación de aminoácido que convierte un aminoácido de un isotipo de IgG en el correspondiente aminoácido en un diferente isotipo IgG alineado. Por ejemplo, dado que IgGi comprende una tirosina e lgG2 una fenilalanina en la posición EU 296, una sustitución F296Y en lgG2 es considerada una modificación de subclase de IgG.

Por "modificación que no se encuentra en la naturaleza" tal como se usa en la presente se entiende una modificación de aminoácido que no es isotípica. Por ejemplo, dado que ninguna IgG comprende un ácido glutámico en la posición 332, la sustitución en la posición 332 con ácido glutámico (332E) en IgGi, lgG2, lgG3, o lgG4 es considerada una modificación que no se encuentra en la naturaleza.

Los términos "anticuerpo de longitud total", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" se usan en la presente indistintamente para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta. Los términos se refieren particularmente a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región Fe.

Un "anticuerpo desnudo" a los fines de la presente es un anticuerpo que no está conjugado a un resto citotóxico o marca radiactiva.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, con preferencia que comprende su región fijadora de antígeno. En ciertas formas de realización, los fragmentos de anticuerpo comprenden una región Fe o una porción de la región Fe que comprende una o más modificaciones de la región Fe descritas en la presente. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarios; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos fijadores de antígeno, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio fijador de antígeno, y un fragmento residual "Fe", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar con facilidad. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación con el antígeno y aún es capaz de formar enlaces cruzados con el antígeno.

"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio fijador de antígeno completo. En una forma de realización, una especie de dos cadenas Fv consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y una cadena liviana en estrecha asociación no covalente. En una especie monocatenaria de Fv (scFv), un dominio variable de cadena pesada y de cadena liviana se puede ligar covalentemente a través de un ligador peptídico flexible de manera tal que las cadenas livianas y pesadas se pueden asociar en una estructura "dimérica" análoga a la de las especies de dos cadenas Fv. En esta configuración las tres HVR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio fijador de antígeno en la superficie del dímero de VH-VL. Colectivamente, las seis HVR confieren especificidad fijadora de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y fijar el antígeno, aunque con menor especificidad que todo el sitio de fijación.

El fragmento Fab contiene los dominios variables de las cadenas livianas y pesadas y también contiene el dominio constante de la cadena liviana y el primer dominio constante (CH1 ) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos escasos residuos en el carboxiterminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisternas proveniente de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en la cual el(os) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de anticuerpo originalmente fueron producidos como pares de fragmentos Fab' que tienen cisternas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

Los fragmentos "Fv monocatenarios" o "scFy" de anticuerpo comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena de polipéptido. Generalmente, el polipéptido scFv también comprende un ligador polipéptido entre los dominios VH y VL, los cuales permiten que scFv forme la estructura deseada para la fijación del antígeno. Para una revisión de scFv, ver, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y oore eds., (Springer-Verlag, Nueva York, 1994), pp. 269-315.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo con dos sitios fijadores de antígeno, en donde los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena liviana (VL) en la misma cadena del polipéptido (VH-VL). Al usar un ligador que es demasiado • corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios fijadores de antígenos. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo en los documentos EP 404.097; WO 1993/01161 ; Hudson et aL, Nal Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444- 6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

El término "monoclonal anticuerpo" tal como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones que se encuentran en la naturaleza, que pueden estar presentes en cantidades menores. En consecuencia, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por no ser una mezcla de anticuerpos definidos. En ciertas formas de realización, dicho anticuerpo monoclonal generalmente incluye un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptido que se fija a un objetivo, en donde la secuencia de polipéptido fijadora del objetivo se obtiene por un proceso que incluye la selección de una única secuencia de polipéptido fijadora de objetivo de una pluralidad de secuencias de polipéptido. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon singular de una pluralidad de clones, tales como un pool de clones de hibridoma, clones de fagos, o clones de ADN recombinante. Se debe entender que una secuencia fijadora de objetivo seleccionada puede luego ser alterada, por ejemplo, para mejorar la afinidad por el objetivo, para humanizar la secuencia fijadora del objetivo, para mejorar su producción en cultivos celulares, para reducir su inmunogenicidad ¡n vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia fijadora de objetivo también es un anticuerpo monoclonal de la presente invención. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, los cuales generalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido a un único determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas por cuanto generalmente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas.

El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por ser obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar por requerir la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales usados de acuerdo con la presente invención se pueden fabricar por diversas técnicas, incluso, por ejemplo, el método de hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2o ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antbodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981 )), métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N.° 4.816.567), tecnologías de presentación de fago (ver, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991 ); Marks er al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee er a/., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o símil humanos en animales que tienen partes o la totalidad de los sitios de ¡nmunoglobulina humana o los genes codificadores de las secuencias de inmunoglobulina human (ver, por ejemplo, los documentos WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741 ; Jakobovits er al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits er al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); las patentes de los Estados Unidos N.° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016; Marks er al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente los anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o liviana es idéntica u homologa a las correspondientes secuencias de anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos incluyen los anticuerpos PRIMATIZED® en donde la región fijadora de antígeno del anticuerpo deriva de un anticuerpo producido, por ejemplo, al inmunizar monos macacos con el antígeno de interés.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murina) son anticuerpos quiméricos que contienen mínima secuencia derivada de inmunoglobulina no humana. En una forma de realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la cual los residuos de una HVR del receptor son reemplazados por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de FR de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los correspondientes residuos no humanos. Asimismo, los anticuerpos humanizados pueden comprender, residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones pueden realizarse para mejorar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todo de al menos uno, y por lo general dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los lazos hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y todos o sustancialmente todos los FRs son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprende además, opcionalmente, al menos una parte de una región constante de ¡nmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina. Para mayor información, véase, por ejemplo, Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véase también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-1 15 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y las patentes estadounidenses Nos. 6.982.321 y 7.087.409.

Un "anticuerpo humano" es aquél que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que ha sido formado usando cualquiera de las técnicas para formar los anticuerpos que se revelan en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano específicamente excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humano. Los anticuerpos humanos pueden ser producidos usando varias técnicas conocidas en el arte, con inclusión de genoteca de visualización de fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991 ); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991 ). También se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos los métodos descritos en Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner er a/., J. Immunol., 147(1 ):86-95 (1991 ). Véase, además, van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001 ). Los anticuerpos humanos se pueden preparar al administrar el antígeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a una prueba antigénica, pero cuyos loci endógenos han sido deshabilitados, por ejemplo, los ratones transgénicos inmunizados (véase, por ejemplo, patentes estadounidenses Nos. 6.075.181 y 6.150,584 con respecto a la tecnología XENOMOUSE™). Ver además, por ejemplo, Li et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) con respecto a los anticuerpos humanos generados mediante una tecnología de hibridoma de linfocito B humano.

Un "anticuerpo dependiente de la especie" es aquél que tiene una afinidad de unión más fuerte para un antígeno de una primera especie mamífera que para un homólogo de ese antígeno de una segunda especie mamífera. Normalmente, el anticuerpo dependiente de la especie se "une específicamente" a un antígeno humano (es decir, tiene un valor de afinidad de unión (Kd) de no más de alrededor de 1 x 10-7 M, preferentemente no más de alrededor de 1 x 10-8 M y más preferentemente no más de alrededor de 1 x 10-9 ) pero tiene una afinidad de unión para un homólogo del antígeno de una segunda especie mamífera no humana que es al menos alrededor de 50 veces, o al menos alrededor de 500 veces, o al menos alrededor de 1000 veces, más débil que su afinidad de unión para el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de la especie puede ser cualquiera de los varios tipos de anticuerpos como se definió con anterioridad, pero preferentemente es un anticuerpo humanizado o humano.

El término "región hipervariable", "HVR" o "HV", cuándo se usa en la presente, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman lazos estructuralmente definidos. Por lo general, los anticuerpos comprenden seis HVRs; tres en la VH (H1 , H2, H3), y tres en la VL (L1 , L2, L3). En los anticuerpos nativos, H3 y L3 exhiben la mayor diversidad de las seis HVRs, y en particular se cree que H3 tiene un papel único al conferir buena especificidad a los anticuerpos. Véase, por ejemplo, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu, en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). De hecho, los anticuerpos camélidos de ocurrencia natural que consisten de una cadena pesada solamente son funcionales y estables en ausencia de la cadena liviana. Véase, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

Un número de delineaciones de HVR se encuentran en uso y están comprendidas en la presente. Las regiones determinantes de complementariedad (CDRs, del inglés Complementarity Determining Regions) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las usadas con más frecuencia (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991 )). Chothia, en cambio, hace referencia a la ubicación de los lazos estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las HVRs de AbM representan un compromiso entre las HVRs de Kabat y los lazos estructurales de Chothia, y son usados por el programa informático de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las HVRs "de contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas HVRs se destacan a continuación.

Lazo Kabat AbM Chothia Contacto L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Enumeración Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Enumeración Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 Las HVRs pueden comprender "HVRs extendidas" de la siguiente manera: 24-36 o 24-34 (L1 ), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 o 89-96 (L3) en la VL y 26-35 (H1 ), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102, o 95-102 (H3) en la VH. Los residuos de los dominios variables se enumeran de acuerdo con Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones.

Los residuos "estructurales" o "FR (del inglés, Framework)" son los residuos de los dominios variables diferentes a los residuos de la HVR como se definen en la presente.

El término "enumeración de residuos de dominios variables como en Kabat" o "enumeración de las posiciones de los aminoácidos como en Kabat", y variaciones del mismo, se refiere al sistema de enumeración usado para los dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena liviana de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Usando este sistema de enumeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener más o menos aminoácidos correspondientes al acortamiento de, o inserción en, una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una única inserción de aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo residuos 82a, 82b, y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de FR de cadena pesada. La enumeración de Kabat de los residuos puede ser determinada para un determinado anticuerpo por alineación en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia enumerada de Rabat "estándar".

El sistema de enumeración de Kabat se usa generalmente cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente residuos 1-107 de la cadena liviana y residuos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat et ai, Sequences of Immunological Interest. 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). El "sistema de enumeración EU" o "índice EU" se usa por lo general cuando se hace referencia a un residuo en una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, el índice EU informado en Kabat et al., supra). El "índice EU como en Kabat" se refiere a la enumeración de residuos del anticuerpo EU Igd humano. A menos que se establezca lo contrario en la presente, las referencias a los números de residuos en el dominio variable de los anticuerpos significa la enumeración de residuos mediante el sistema de enumeración de Kabat. A menos que se indique lo contrario en la presente, las referencias a los números de residuos en el dominio constante de anticuerpos significa la enumeración de residuos mediante el sistema de enumeración EU (véase, por ejemplo, la publicación PCT No. WO2006073941 ).

Un anticuerpo "madurado por afinidad" es aquél con una o más alteraciones en una o más HVRs del mismo que genera una mejora en la afinidad del anticuerpo para el antígeno, a comparación con un anticuerpo madre que no posee esa alteración o alteraciones. En una forma de realización, un anticuerpo madurado por afinidad tiene afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno blanco. Los anticuerpos madurados por afinidad pueden ser producidos usando ciertos procedimientos conocidos en el arte. Por ejemplo, arks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad mediante barajado de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de HVR y/o residuos estructurales es descrita, por ejemplo, por Barbas eí al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91 :3809-3813 (1994); Schier eí al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. ¦ Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson eí al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins eí al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es aquél que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno que une. Ciertos anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno.

Un "anticuerpo agonista", como se usa en la presente, es un anticuerpo que imita parcial o totalmente al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.

Los anticuerpos "inhibidores del crecimiento" son aquéllos que previenen o reducen la proliferación de una célula que expresa un antígeno al cual se une el anticuerpo.

Las "funciones efectoras" del anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuíbles a la región Fe (una región Fc.de secuencia nativa o una región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de las funciones efectoras del anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, del inglés Complement Dependent Cytotoxicity); unión a receptor Fe; citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC, del inglés Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity); fagocitosis; regulación descendiente de los receptores de superficie celular (por ejemplo receptor de linfocito B); y activación de linfocito B.

El término "región Fe" se usa en la presente para definir una región C— terminal de una cadena pesada de inmunoglóbulina, con inclusión de las regiones Fe de secuencia nativa y regiones Fe variantes. Si bien los límites de la región Fe de una cadena pesada de inmunoglóbulina pueden variar, la región Fe de cadena pesada de IgG humana por lo general se define abarcando un residuo de aminoácidos en posición Cys226, o de Pro230, al término carboxilo de la misma.

La lisina C— terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de enumeración EU) de la región Fe puede ser extraída, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o al manipular de manera recombinante el ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 extraídos, poblaciones de anticuerpos sin ningún residuo K447 extraídos, y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447. En ciertas formas de realización, la región Fe de una inmunoglobulina comprende dos dominios constantes, CH2 y CH3.

El "dominio CH2" de un región Fe de IgG humana (también conocido como dominio "Cv2") se extiende generalmente aproximadamente desde el aminoácido 231 hasta aproximadamente el aminoácido 340. El dominio CH2 es único por el hecho de que no está íntimamente emparejado con otro dominio. Por el contrario, dos cadenas de carbohidratos ramificadas N-ligadas son interpuestas entre los dos dominios CH2 de la molécula de IgG nativa intacta. Se ha especulado que el carbohidrato puede proveer un sustituto para el emparejamiento dominio-dominio y ayuda a estabilizar el dominio CH2. Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985).

El "dominio CH3" comprende el tramo de residuos C-terminales a un dominio CH2 en una región Fe (es decir, de aproximadamente el residuo de aminoácido 341 a aproximadamente el residuo de aminoácido 447 de una IgG).

Una "región Fe funcional" posee una "función efectora" de una región Fe de secuencia nativa. Las "funciones efectoras" ejemplificativas incluyen unión a receptor Fe; unión a C1q; CDC; ADCC; fagocitosis; regulación descendente de los receptores de superficie celular (por ejemplo receptor de linfocito B; BCR), etc. Dichas funciones efectores requieren en general que la región Fe se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y puede ser evaluada usando varios ensayos.

Una "región Fe de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fe encontrada en la naturaleza. Las regiones Fe humanas de secuencias nativas incluyen una región Fe de IgGi humana de secuencia nativa (alotipos A y no A); región Fe de lgG2 humana de secuencia nativa; región Fe de lgG3 humana de secuencia nativa; y región Fe de lgG4 humana de secuencia nativa así como también variantes de ocurrencia natural de las mismas (véase por ejemplo, SEQ ID NO:11 a SEQ ID NO:17).

Una "región Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquélla de una región Fe de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. En ciertas formas de realización, la región Fe variante comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquélla de una región Fe de secuencia nativa por una o más sustituciones de aminoácidos. En ciertas formas de realización, la región Fe variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos comparada con la región Fe de una IgG silvestre o un anticuerpo silvestre. En ciertas formas de realización, la región Fe variante tiene dos o más sustituciones de aminoácidos en la región Fe del anticuerpo silvestre. En ciertas formas de realización, la región Fe variante tiene tres o más sustituciones de aminoácidos en la región Fe del anticuerpo silvestre. En ciertas formas de realización, la región Fe variante tiene al menos una, dos o tres sustituciones de aminoácidos de región Fe descritas en la presente. En ciertas formas de realización, la región Fe variante en la presente posee al menos alrededor del 80% de homología con una región Fe de secuencia nativa y/o con una región Fe de un polípéptido madre. En ciertas formas de realización, la región Fe variante en la presente posee al menos alrededor, del 90% de homología con una región Fe de secuencia nativa y/o con una región Fe de un polipéptido madre. En ciertas formas de realización, la región Fe variante posee en la presente al menos alrededor del 95% de homología con una región Fe de secuencia nativa y/o con una región Fe de un polipéptido madre.

"Receptor Fe" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. En algunas formas de realización, un FcR es un FcR humano nativo. En algunas formas de realización, un FcR es aquél une un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRIl y FcyRIII, con inclusión de variantes alélicas y formas alternativamente empalmadas de aquellos receptores. Los receptores FcyRIl incluyen FcyRIl A (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor de activación FcyRI IA contiene un motivo de activación de inmunoreceptor basado en tirosina (ITAM, del inglés Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation Motif) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición FcyRIIB contiene un motivo de inhibición de inmunorreceptor basado en tirosina (ITIIVI, del inglés Immunoreceptor Tyrosine-Based Inhibition Motif) en su dominio citoplásmico. (Véase, por ejemplo, Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcRs son descritos, por ejemplo, en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991 ); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas ef al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcRs, con inclusión de los que han de ser identificados más adelante, están comprendidos dentro del término "FcR" en la presente.

El término "receptor Fe" o "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternales al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) y regulación de homeostasis de inmunoglobulinas. Los métodos para medir la unión al FcRn son conocidos (véase, por ejemplo, Ghetie y Ward., Immunol. Jodia 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.).

La vida media in vivo o en suero de los polipéptidos de unión de alta afinidad de FcRn humano puede ser evaluada, por ejemplo, en ratones transgénicos, en humanos o en primates no humanos a los cuales los polipéptidos con una región Fe variante son administrados. Véase, además, por ejemplo, Petkova et al. International Immunology 18(12): 1759- 769 (2006).

Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. En ciertas formas de realización, las células expresan al menos FcyRIII y realizan una función o funciones efectoras de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC, del inglés Peripheral Blood Mononuclear Cells), células exterminadoras naturales (NK, del inglés Natural Killer), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos. Las células efectoras puede aislarse de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre.

La "citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual la Ig segregada unida a receptores Fe (FcRs) presente en ciertas células citotóxicas (por ejemplo células NK, neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula blanco que porta antígeno y posteriormente exterminen la célula blanco con citotoxinas. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan FcyRIII únicamente, mientras que los monolitos expresan FcyRI, FcyRI I y FcyRI II. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resumen en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991 ). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vitro, tal como el que se describe en la patente estadounidense No. 5.500.362 o 5.821.337 o patente estadounidense No. 6.737.056 (Presta). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células NK y PBMC. En forma alternativa, o en forma adicional, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede ser evaluada in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el revelado en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

"Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula blanco en presencia de un complemento. La activación de la ruta del complemento clásico se inicia al unir el primer componente del sistema del complemento (C1q) a los anticuerpos (de la subclase apropiada), que son unidos a su antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Las variantes de polipéptidos con secuencias de aminoácidos de región Fe alterada (polipéptidos con una región Fe variante) y capacidad de unión a C1 q incrementada o reducida se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense No. 6.194.551 B1 y WO 1999/51642. Véase además, por ejemplo, Idusogie er al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Una variante de polipéptido con actividad de unión a FcR o actividad de ADCC "alteradas" es aquélla que tiene actividad de unión a FcR o actividad de ADCC ya sea reforzadas o bien disminuidas a comparación con un polipéptido madre o con un polipéptido que comprende una región Fe de secuencia nativa. El variante de polipéptido que "exhibe unión incrementada" a un FcR une al menos un FcR con mejor afinidad que el polipéptido madre. La variante de polipéptido que "exhibe unión reducida" a un FcR, une al menos un FcR con menor afinidad que un polipéptido madre. Dichas variantes que muestran unión reducida a un FcR pueden poseer poca o ninguna unión apreciable a un FcR, por ejemplo, 0-20% de unión al FcR a comparación con una región Fe de IgG de secuencia nativa.

La variante de polipéptido que "media citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) en presencia de células efectoras humanas de manera más efectiva" que un anticuerpo madre es aquella que, in vitro o in vivo, es sustancialmente más efectiva para mediar ADCC, cuando las cantidades de variante de polipéptido y anticuerpo madre usadas en el ensayo son esencialmente las mismas. Por lo general, dichas variantes se identifican usando el ensayo de ADCC in vitro como se revela en la presente, pero se contemplan otros ensayos o métodos para determinar actividad de ADCC, por ejemplo en un modelo animal, etc.

"Afinidad de unión" se refiere generalmente a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en la presente, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1 :1 entre miembros de un par de enlace (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X para su compañero Y puede representarse en general mediante la constante de disociación (Kd), recíproco de la constante de asociación (Ka). La afinidad se puede medir por métodos comunes en el arte, con inclusión de los descritos en la presente. Los anticuerpos de baja afinidad por lo general unen antígenos en forma lenta y/o tienden a disociarse rápidamente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad por lo general unen antígenos más rápido y/o tienden a permanecer unidos por más tiempo. Una variedad de métodos para medir la afinidad son conocidos en el arte, cualquiera de los cuales se puede usar a los fines de la presente invención. Las formas de realización ilustrativas y ejemplificativas específicas para medir la afinidad de unión se describen a continuación.

En ciertas formas de realización, el "KD," "Kd," "Kd" o "valor Kd" de acuerdo con esta invención se mide usando ensayos de resonancia de plasmón de superficie que usen BIACORE®-2000 o BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25° C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU, del inglés Response Units). En resumen, los chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) son activados con clorhidrato de N-etil-A/'- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y /V-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 pg/ml (-0,2 µ?) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto para alcanzar aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos no reaccionados. Para las mediciones cinéticas, las diluciones en serie del polipéptido, por ejemplo, anticuerpo de longitud completa, son inyectadas en PBS con 0,05% de agente tensioactivo TWEEN-20™ (PBST) a 25 °C a una velocidad de lujo de aproximadamente 25 µ?/min. Las velocidades de asociación (kon) y las velocidades de disociación (k0ff) son calculadas usando un modelo de unión simple uno a uno Langmuir (BIACORE®, programa informático de evaluación, versión 3.2) al ajustar de manera simultánea los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la proporción k0ff/kon Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la velocidad de asociación excede 10^ M-1 s_1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón de superficie establecido con anterioridad, entonces la velocidad de asociación se puede determinar usando una técnica de neutralización fluorescente que mide el incremento o reducción en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de paso de banda) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con freno de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro de serie 8000 SLM-AMINCO ™ (ThermoSpectronic) con una cubeta de agitación.

Una "on-rate" "tasa de asociación", o "kon" de acuerdo con esta invención también se puede determinar como se describe con anterioridad usando un sistema BIACORE®-2000 o BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, J).

El término "sustancialmente similar" o "sustancialmente el mismo", como se usa en la presente, denota un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos de manera que una persona versada en el arte considere la diferencia entres los dos valores como de poca o ninguna significancia biológica . y/o estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd). En ciertas formas de realización, la diferencia entre dichos valores es, por ejemplo, menor a alrededor del 50%, menor a alrededor del 40%, menor a alrededor del 30%, menor a alrededor del 20%, y/o menor a alrededor del 10% como una función del valor de referencia / comparación.

La frase "sustancialmente reducido" o "sustancialmente diferente", como se usa en la presente, denota un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos de manera tal que la persona versada en el arte considere la diferencia entre los dos valores como de significancia estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd). En ciertas formas de realización, la diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, de más de alrededor del 10%, más de alrededor del 20%, más de alrededor del 30%, más de alrededor del 40%, y/o más de alrededor del 50% como una función del valor para la molécula de referencia / comparación.

Una "estructura humana aceptora" para los fines de la presente es una estructura que comprende la secuencia de aminoácidos de un estructura de VL o VH derivada de una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura de consenso humana. Una estructura humana aceptora "derivada de" una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura de consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios de secuencias de aminoácidos preexistentes. En algunas formas de realización, el número de cambios de aminoácidos preexistentes son 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. Cuando los cambios de aminoácidos preexistentes están presentes en VH, estos cambios preferentemente ocurren solamente en tres, dos o una de las posiciones 71 H, 73H y 78H; por ejemplo, los residuos de aminoácidos en esas posiciones pueden ser 71 A, 73T y/o 78A. En una forma de realización, la estructura humana aceptora de VL es idéntica en secuencia a la estructura de inmunoglobulina humana de VL o secuencia de estructura de consenso humana.

Una "estructura de consenso humana" es una estructura que representa los residuos de aminoácidos de ocurrencia más común en una selección de VL de inmunoglobulina humana o secuencias de estructura de VH. Por lo general, la selección de VL de inmunoglobulina humana o secuencias de VH es de un subgrupo de secuencias de dominios variables. Por lo general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., supra. En una forma de realización, para VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En una forma de realización, para VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.

Una "estructura de consenso de subgrupo III de VH" comprende la secuencia de consenso obtenida a partir de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo III de variable pesada de Kabat et al.

Una "estructura de consenso de subgrupo I de VL" comprende la secuencia de consenso obtenida a partir de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo I de variable liviana kappa de Kabat ef al.

"Purificada" significa que una molécula está presente en una muestra en una concentración de al menos 95% en peso, o al menos 98% en peso de la muestra en la cual está contenida.

Un molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se separa de al menos otra molécula de ácido nucleico con la cual está comúnmente asociada, por ejemplo, en su ambiente natural. Una molécula de ácido nucleico aislada incluye, además, una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente expresan la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente fuera del cromosoma o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.

El término "vector," como se usa en la presente, hace referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha ligado. Un tipo de vector es un "plásmido", que hace referencia a un ADN bicatenario circular en el cual pueden estar ligados segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector de fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos adicionales de ADN pueden estar ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) pueden estar integrados en el genoma de una célula huésped ante la introducción en la célula huésped, y así son replicados junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los cuales están ligados en forma operativa. Dichos vectores son conocidos como "vectores de expresión recombinantes" o simplemente "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en la forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, el "plásmido" y "vector" pueden usarse en forma intercambiable ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada.

"Polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usa en la presente, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases, y/o sus análogos, o cualquier substrato que pueda ser incorporado en un polímero por ADN o ARN polimerasa o por una reacción sintética. Un polinucleótido puede , comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. De estar presente, la modificación a la estructura del nucleótido puede ser impartida antes o después de ensamblar el polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede comprender modificación o modificaciones después de la síntesis, tales como conjugación a una etiqueta. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "caps," sustitución de uno o más de los nucleótidos de ocurrencia natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquéllas con ligamientos no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con ligamientos cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, efe), aquéllas que contienen fracciones pendientes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, pli— L— Usina, etc.), aquéllas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquéllas que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquéllas que contienen alquilantes, tales como ligamientos modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como también las formas no modificadas del o los polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo generalmente presentes en los azúcares puede ser reemplazado, por ejemplo, por grupos fosfonatos, grupos fosfató, protegido por grupos protectores estándares, o activado para preparar ligamientos adicionales a nucleótidos adicionales, o puede ser conjugado a soportes sólidos o semisólidos. El OH 5' y 3' terminal puede ser fosforilado o sustituido con aminas o fracciones de grupos de protección (capping) orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos pueden ser derivados a grupos protectores estándares. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que son generalmente conocidas en el arte, con inclusión de, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2 -O-alil-, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclicos, azúcares a-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos nucleósidos básicos tales como metil ribósido. Uno o más ligamientos de fosfodiéster pueden ser reemplazadas por grupos de ligamiento alternativos. Estos grupos de ligamiento alternativos incluyen, mas no se limitan a, las formas de realización en donde el fosfato se reemplaza por P(0)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)OR', CO, o CH2 ("formacetal"), en donde cada R o R' es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un ligamiento de éter (-0-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los ligamientos en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción precedentes se aplica a todos los polinucleotidos referidos en la presente, con inclusión de ARN y ADN.

"Oligonucleótido", como se usa en la presente, se refiere en general a polinucleotidos cortos, generalmente monocatenarios, usualmente sintéticos que son generalmente, mas no necesariamente, de menos de alrededor de 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no se excluyen mutuamente. La descripción anterior para los polinucleotidos es igual y totalmente aplicable a los oligonucleótidos.

La expresión "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora ligada en forma operativa en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para las procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosoma. Las células eucariotas se conocen por utilizar promotores, señales de poliadenilacion y potenciadores.

El ácido nucleico se "liga en forma operativa" cuando se encuentra en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder segregante se liga en forma operativa al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido, un promotor o potenciador se liga en forma operativa a una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma se liga en forma operativa a una secuencia codificadora si se posiciona a fin de facilitar la traducción. Por lo general, "ligado en forma operativa" significa que las secuencias de ADN que están siendo ligadas son contiguas y, en el caso de un líder segregante, contiguas y en fase de lectura. No obstante, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El ligamiento se logra por ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los ligadores o adaptadores de oligonucleótidos sintéticos se usan de acuerdo con la práctica convencional.

Como se usa en la presente, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan en forma intercambiable y todas dichas designaciones incluyen la progenie. Por ende, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula en cuestión primaria y los cultivos derivados de la misma independientemente del número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica tal como se cribó en la célula originalmente transformada. Cuando se hace referencia a las distintas designaciones, queda claro a partir del contexto.

Como se usa en la presente, "conjunto de codones" se refiere a un conjunto de diferentes secuencias tripletes de nucleótidos usadas para codificar los aminoácidos variantes deseados. Un conjunto de oligonucleótidos puede ser sintetizado, por ejemplo, por síntesis en fase sólida, con inclusión de secuencias que representan todas las posibles combinaciones de tripletes de nucleótidos provistos por el conjunto de codones y que codifican el grupo deseado de aminoácidos. Una forma estándar de designación de codones es aquélla del código IUB, que se conoce en el arte y se describe en la presente. Un conjunto de codones por lo general se representa por 3 letras en mayúsculas, por ejemplo, NNK, NNS, XYZ, DVK y similares. Un "conjunto de codones no aleatorios", como se usa en la presente, se refiere, por ende, a un conjunto de codones que codifica aminoácidos seleccionados que satisfacen parcialmente - preferentemente completamente - los criterios para la selección de aminoácidos como se describe en la presente. La síntesis de oligonucleótidos con "degeneración" de nucleotidos seleccionada en ciertas posiciones es conocida en el arte, por ejemplo el enfoque TRIM (Knappek et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57-86); Garrard & Henner (1993) Gene 128:103). Dichos conjuntos de oligonucleótidos que tienen ciertos conjuntos de codones pueden ser sintetizados usando sintetizadores de ácido nucleico comerciales (disponibles de, por ejemplo, Applied Biosystems, Foster City, CA), o se pueden obtener comercialmente (por ejemplo, de Life Technologies, Rockville, MD). Por ende, un conjunto de oligonucleótidos sintetizados que tiene un conjunto de codones particular incluye por lo general una pluralidad de oligonucleótidos con diferentes secuencias, las diferencias establecidas por el conjunto de codones en la secuencia general. Los oligonucleótidos, como se usan de acuerdo con la invención, tienen secuencias que permitan la hibridación a un templado de ácido nucleico de dominio variable y también pueden - mas no necesariamente - incluir sitios enzimáticos de restricción útiles para, por ejemplo, fines de clonación.

La expresión "anticuerpos lineales" se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata ef al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062). En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en conjunto (VH-CH1-VH-CH1 ) que, junto con polipéptidos de cadena liviana complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

Como se usa en la presente, "genoteca" se refiere a una pluralidad de secuencias de fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, variantes de IgG de la invención), o los ácidos nucleicos que codifican estas secuencias, siendo estas secuencias diferentes en la combinación de aminoácidos variantes que se introducen en estas secuencias de acuerdo con los métodos de la invención.

La "visualización de fagos" es una técnica por la cual los polipéptidos son visualizados como proteínas de fusión a al menos una parte de la proteína de cobertura sobre la superficie del fago, por ejemplo, fago filamentoso, partículas. Una utilidad de la visualización de fagos reside en el hecho de que grandes genotecas de variantes proteicas aleatorias pueden ser elegidos de manera rápida y eficiente en cuanto a aquellas secuencias que se unen a un antígeno blanco con alta afinidad. La visualización de las genotecas de péptidos y proteínas en el fago se han usado para cribar millones de polipéptidos para los que tienen propiedades de unión específicas. La visualización de fagos polivalentes ha sido usada para visualizar pequeños péptidos aleatorios y pequeñas proteínas a través de las fusiones ya sea al gen III o bien al gen VIII del fago filamentoso. Wells y Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:355-362, y referencias citadas. En una visualización de fagos monovalentes, una genoteca de proteínas o péptidos se fusiona a un gen III o una porción del mismo, y se expresa a niveles bajos en presencia de proteína de gen III silvestre a fin de que las partículas de fagos visualizan una copia o ninguna de las proteínas de fusión. Los efectos de avidez son reducidos con relación al fago polivalente de manera que la elección se realice sobre la base de la afinidad de ligando intrínseca, y se usan vectores fagómidos, que simplifican las manipulaciones del ADN. Lowman y Wells (1991 ) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216.

Un "fagómido" es un vector plasmídico que tienen un origen bacteriano de replicación, por ejemplo, Co1 E1 , y una copia de una región intergénica de un bacteriófago. El fagómido se puede usar en cualquier bacteriófago conocido, con inclusión de bacteriófago filamentoso y bacteriófago lambdoide. El plásmido también contiene en general un marcador seleccionare para resistencia antibiótica. Los segmentos de ADN clonados en estos vectores se pueden propagar como plásmidos. Cuando las células que alojan estos vectores son provistas con todos los genes necesarios para la producción de partículas de fagos, el modo de replicación del plásmido cambia a replicación en círculo giratorio para generar copias de una cadena del ADN plasmídico y partículas de fagos. El fagómido puede formar partículas de fagos infecciosas o no infecciosas. Este término incluye fagómidos que contienen un gen proteico de cobertura de fago o fragmento del mismo ligado a un gen polipeptídico heterólogo como una fusión génica de manera que el polipéptido heterólogo se visualice sobre la superficie de la partícula de fago.

El término "vector de fago" hace referencia a una forma replicatíva bicatenaria de un bacteriófago que contiene un gen heterólogo y capaz de replicación. El vector de fago tiene un origen de replicación del fago que permite la replicación del fago y la formación de partículas del fago. El fago es preferentemente un bacteriófago filamentoso, tal como un fago M13, f1 , fd, Pf3 o un derivado del mismo, o un fago lambdoide, tal como lambda, 21 , phi80, phi81 , 82, 424, 434, etc., o un derivado del mismo.

Como se usa en la presente, "posición accesible del solvente" se refiere a una posición de un residuo de aminoácido en las regiones variables de las cadenas pesadas y livianas de un fragmento de unión a antígeno o anticuerpo fuente que es determinada, sobre la base de la estructura, conjunto de estructuras y/o estructura modelada del fragmento de unión a antígeno o anticuerpo, tal como se encuentra potencialmente disponibles para acceso y/o contacto del solvente con una molécula, tal como antígeno específico de anticuerpo. Estas posiciones se encuentran típicamente en las CDRs y sobre el exterior de la proteína. Las posiciones accesibles del solvente de un fragmento de unión a antígeno o anticuerpo, como se define en la presente, se pueden determinar usando cualquiera de un número de algoritmos conocidos en el arte. En una forma de realización, las posiciones accesibles del solvente se determinan usando coordenadas de un modelo tridimensional de un anticuerpo, preferentemente usando un programa de computación tal cómo el programa Insightll (Accelrys, San Diego, CA). Las posiciones accesibles del solvente también se pueden determinar usando algoritmos conocidos en el arte (por ejemplo, Lee y Richards (1971 ) J. Mol. Biol. 55, 379 y Connolly (1983) J. Appl. Cryst. 16, 548). La determinación de las posiciones accesibles del solvente se puede realizar usando un programa informático adecuado para la modelación de proteínas y la información estructural tridimensional obtenida a partir de un anticuerpo. El programa informático que se puede utilizar para estos propósitos incluye el SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). En general, cuando un algoritmo (programa) requiere un parámetro de tamaño de entrada del usuario, el "tamaño" de una sonda que se usa en el cálculo se establece a alrededor de 1 ,4 Angstrom o menos en radio. Además, los métodos de determinación del área y las regiones accesibles del solvente que usan el programa informático para las computadoras personales han sido descritos por Pacios (1994) Comput. Chem. 18(4): 377-386.

"Identidad porcentual (%) de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptidos de referencia se define como el porcentaje de los residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario, para alcanzar porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa cerno parte de la identidad de secuencia. La alineación a los fines de determinar la identidad porcentual de la secuencia de aminoácidos se puede alcanzar de varias maneras que se encuentran dentro de las enseñanzas del arte, por ejemplo, usando un programa de computación disponible a nivel comercial tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (ADNSTAR). Las personas versadas en el arte pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, con inclusión de cualquier algoritmo necesario para alcanzar la alineación máxima con respecto a la longitud total de las secuencias que están siendo comparadas. A los fines de la presente, no obstante, los valores de porcentaje de identidad de las secuencias de aminoácidos son generados usando el programa de computación de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de computación de comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc., y el código fuente ha sido presentado con documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos, Washington D.C., 20559, donde está registrado bajo el No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible por parte de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede ser compilado a partir de un código fuente. El programa ALIGN-2 debería ser compilado para uso en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.

En las situaciones donde se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos de una determinada secuencia de aminoácidos A para, con, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B (que puede ser denominada de manera alternativa como una determinada secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un cierto porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos para, con, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula de la siguiente manera: 100 multiplicado por la fracción X/Y donde X es el número de residuos de aminoácidos clasificados como coincidencias Idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 por el hecho de que la alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos de A con respecto a B no iguala el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente lo contrario, todos los valores de porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos que se usan en la presente se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente, usando el programa de computación ALIGN-2.

El término "VEGF" o "VEGF-A" como se usa en la presente se refiere a un factor de crecimiento celular endotelial vascular de 165 aminoácidos y los factores de crecimiento de células endoteliales vasculares humanos relacionados de 121 , 189 y 206 aminoácidos, descriptos por Leung et al. (1989) Science 246:1306, y Houck et al. (1991 ) Mol. Endocrin, 5:1806, junto con sus formas alélicas naturales y procesadas. El término "VEGF" también se refiere a los VEGF de especies no humanas tales como ratón, rata o primate. Algunas veces el VEGF de una especie específica se indica con términos tales como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF murino, etc. El término "VEGF" también se usa para las formas truncadas del polipéptido que comprende los aminoácidos 8 a 109 o 1 a 109 del factor de crecimiento celular endotelial vascular de 165 aminoácidos. La referencia a dichas formas de VEGF se puede identificar en la presente solicitud, por ejemplo, por "VEGF (8- 09)," "VEGF (1-109)", "VEGF-AW o "VEGF165." Las posiciones de aminoácidos para un VEGF nativo "truncado" se numeran como se indica en la secuencia nativa de VEGF; Por ejemplo, la posición de aminoácido 17 (metionina) en el VEGF nativo truncado es también la posición 17 (metionina) del VEGF nativo. El VEGF nativo truncado tiene afinidad de unión por los receptores DR y Flt-1 comparables con el VEGF nativo.

Un "antagonista de VEGF" se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir en las actividades de VEGF que incluyen, pero sin limitación, su unión a uno o más receptores de VEGF. Los antagonistas de VEGF incluyen, sin limitación, anticuerpos anti-VEGF y sus fragmentos de unión al antígeno, moléculas del receptor y derivados que se unen específicamente a VEGF, de este modo secuestran su unión a uno o más receptores, anticuerpos del receptor anti-VEGF, antagonistas del receptor de VEGF tales como inhibidores de molécula pequeña de las tirosinas quinasas del VEGFR e inmunoadhesinas que se unen al VEGF tal como un bloqueador del VEGF. El término "antagonista de VEGF", como se usa en la presente, incluye específicamente moléculas, que incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, otros polipéptidos, péptidos y moléculas pequeñas no peptídicas de unión, que se unen al VEGF y son capaces de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir en las actividades de VEGF. En consecuencia, el término "actividades de VEGF" incluye específicamente las actividades biológicas mediadas por VEGF de VEGF.

Los términos "actividad biológica" y "biológicamente activo" con respecto a un polipéptido de VEGF o "actividad de VEGF", se refiere a las propiedades físicas/químicas y funciones biológicas asociadas con VEGF de longitud completa y/o truncado. En ciertas formas de realización, la actividad de VEGF es inducir y/o estimular y/o promover la angiogénesis. En ciertas formas de realización, La actividad de VEGF es inducir y/o estimular y/o promover la neovascularización. En ciertas formas de realización, La actividad de VEGF es inducir y/o estimular y/o promover la permeabilidad vascular. En ciertas formas de realización, la actividad de VEGF es inducir y/o estimular y/o promover la migración de células endoteliales y/o proliferación de las células endoteliales.

Los anticuerpos neutralizantes anti-VEGF suprimen el crecimiento de una variedad de líneas celulares tumorales humanas en ratones desnudos (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgstrom et al., Cáncer Res. 56:4032-4039 (1996); Melnyk et al., Cáncer Res. 56:921-924 (1996)) y también inhiben la angiogénesis intraocular en modelos de trastornos retiñíanos isquémicos. Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 1 14:66-71 (1996).

El término "anticuerpo anti-VEGF" o "un anticuerpo que se une al VEGF" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse al VEGF con suficiente afinidad y especificidad ya que el anticuerpo es útil como agente diagnóstico y/o agente terapéutico para dirigirse al VEGF. Por ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF de la invención se puede usar como agente terapéutico para dirigir e interferir en las enfermedades o condiciones patológicas en donde está involucrada la actividad de VEGF, Ver, por ejemplo, Patentes U.S. 6.582.959, 6.703.020; W098/45332; WO 96/30046; WO94/10202, WO2005/044853; EP 0666868B1 ; solicitudes de patente US 20030206899, 20030190317, 20030203409, 20050112126, 20050186208, y 20050112126; Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004); y WO2005012359. El anticuerpo seleccionado normalmente tendrá una afinidad de unión suficientemente fuerte para VEGF. Por ejemplo, el anticuerpo puede unir hVEGF con un valor de Kd de entre 100 nM-1 pM. Las afinidades del anticuerpo se pueden determinar por ejemplo, por un ensayo basado en resonancia del plasmón superficial (tal como el ensayo Bl Acore que se describe en la solicitud PCT Publicación N.° WO2005/012359); ensayo ¡nmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA); y ensayos de competencia (por ejemplo RIA). El anticuerpo se puede someter a otros ensayos de actividad biológica, por ejemplo, a fin de evaluar su efectividad como agente terapéutico. Dichos ensayos son conocidos en la técnica y dependen del antígeno blanco y uso deseado para el anticuerpo. Los ejemplos incluyen el ensayo de inhibición de HUVEC; ensayos de inhibición de crecimiento celular tumoral (por ejemplo, descriptos en WO 89/06692); ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad mediada por complemento (CDC) (patente US 5.500.362); y ensayos de actividad agonista o hematopoyesis (ver WO 95/27062). Un anticuerpo anti-VEGF usualmente no se unirá a otros homólogos de VEGF tales como VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D o VEGF-E, ni otros factores de crecimiento tales como PIGF, PDGF o bFGF. En una forma de realización, los anticuerpos anti-VEGF incluyen un anticuerpo monoclonal que se une al mismo epitope que el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709; un anticuerpo a anti-VEGF monoclonal humanizado recombinante (ver Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599), que incluye pero sin limitación al anticuerpo conocido como "bevacizumab (BV)", también conocido como "rhuMAb VEGF" o "AVASTIN®." AVASTIN® en la actualidad está disponible en el comercio. Bevacizumab comprende regiones estructurales de IgGi humana mutada y regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo murino A.4.6.1 que bloquea la unión del VEGF humano a sus receptores. Aproximadamente el 93% de la secuencia de aminoácidos de bevacizumab, que incluye la mayoría de las regiones estructurales, deriva de la lgG1 humana y aproximadamente 7% de la secuencia deriva del anticuerpo anticuerpo murino A4.6.1. Bevacizumab tiene una masa molecular de aproximadamente 149.000 dalton y está glicosilado. Bevacizumab y otros anticuerpos anti-VEGF humanizados se describen adicionalmente en la patente U.S. N.° 6.884.879, presentada el 26 de febrero de 2005. Los anticuerpos anti-VEGF adicionales incluyen los anticuerpos de la serie G6 o B20 (por ejemplo, G6-23, G6-31 , B20-4.1 ), como se describe en la solicitud PCT N.° WO2005/012359. Para anticuerpos preferidos adicionales ver patentes U.S. Nros. 7.060.269, 6.582.959, 6.703.020; 6.054.297; W098/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1 ; publicación de solicitud de patente U.S. Nros. 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409, y 200501 12126; y Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004).

El término "polipéptido de la serie B20" como se usa en la presente se refiere a un polipéptido, que incluye un anticuerpo que se une al VEGF. Los polipéptidos de la serie B20 incluyen pero sin limitación, anticuerpos derivados de una secuencia del anticuerpo B20 o un anticuerpo derivado de B20 descripto en la publicación US N.° 20060280747, publicación US N.° 20070141065 y/o publicación US N.° 20070020267, el contenido de estas solicitudes de patente está expresamente incorporado en la presente como referencia. En una forma de realización, el polipéptido de la serie B20 es B20-4.1 como se describe en la publicación US N.° 20060280747, publicación US N.° 20070141065 y/o publicación US N.° 20070020267. En otra forma de realización, el polipéptido de la serie B20 es B20-4.1.1 se describe en la publicación PCT N.° WO 2009/073160, cuya descripción completa está expresamente incorporada en la presente por referencia.

El término "polipéptido de la serie G6" como se usa en la presente se refiere a un polipéptido, que incluye un anticuerpo que se une al VEGF. Los polipéptidos de la serie G6 incluyen pero sin limitación, anticuerpos derivados de una secuencia del anticuerpo G6 o un anticuerpo derivado G6 descripto en la publicación US N.° 20060280747, publicación US N.° publicación US N.° 20070141065 y/o publicación US N.° 20070020267. Los polipéptidos de la serie G6, descriptos en la publicación US N.° 20060280747, publicación US N.° 20070141065 y/o publicación US N.° 20070020267 incluyen, pero sin limitación, G6-8, G6-23 y G6-31.

Un "factor o agente angiogénico" es un factor de crecimiento que estimula el desarrollo de los vasos sanguíneos, por ejemplo, promueve la angiogénesis, crecimiento de células endoteliales, estabilidad de los vasos sanguíneos y/o vasculogénesis, etc. Por ejemplo, los factores angiogénicos, incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, VEGF y miembros de la familia VEGF (VEGF-B, VEGF-C y VEGF-D), PIGF, familia PDGF, familia del factor de crecimiento fibroblástico (FGF), ligandos de TIE (angiopoyetinas), efrinas, ligando tipo Delta 4 (DLL4), Del-1 , factores de crecimiento fibroblástico: ácido (aFGF) y básico (bFGF), folistatina, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersión (SF), interleuquina 8 (IL-8), leptina, midkina, neuropilinas, factor de crecimiento de placenta, factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas, especialmente PDGF-BB o PDGFR-beta, pleiotrofina (PTN), progranulina, proliferina, factor de crecimiento transformante alfa (TGF- alfa), factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alpha), etc. También se deben incluir los factores que aceleran la cura de heridas, tales como la hormona de crecimiento, factor de crecimiento tipo insulina I (IGF-I), VIGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), CTGF y miembros de su familia y TGF-alfa y TGF-beta. Ver, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore (1991 ) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit y Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179; Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (por ejemplo, la Tabla 1 lista factores angiogénicos conocidos); y Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206.

Un "agente anti-angiogénesis" o "inhibidor de la angiogénesis" se refiere a una sustancia de bajo peso molecular, un polinucleótido (que incluye, por ejemplo, un ARN inhibidor (ARNi o ARNsi)), un polipéptido, una proteína aislada, una proteína recombinante, un anticuerpo, o sus conjugados o proteínas de fusión, que inhiben la angiogénesis, vasculogénesis, o permeabilidad vascular no deseada, tanto en forma directa como indirecta. Se debe considerar que el agente anti-angiogénesis incluye los agentes que se unen y bloquean la actividad angiogénica del factor angiogénico o su receptor. Por ejemplo, un agente anti-angiogénesis es un anticuerpo u otro antagonista o un agente angiogénico como se definió anteriormente, por ejemplo, anticuerpos para VEGF-A o para el receptor de VEGF-A (por ejemplo, receptor de KDR o receptor de Flt-1 ), inhibidores de anti-PDGFR tales como Gleevec™ (mesilato de Imatinib), moléculas pequeñas que bloquean la señalización del receptor de VEGF (por ejemplo, PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT®/SU 11248 (malato de sunitinib), AMG706, o los descriptos en, por ejemplo, solicitud de patente internacional WO 2004/113304). Los agentes anti-angiogénesis también incluyen inhibidores de angiogénesis nativos, por ejemplo, angiostatina, endostatina, etc. Ver, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore (1991 ) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit y Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (por ejemplo, Tabla 3 que enumera la terapia anti-angiogénica en melanoma maligno); Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (por ejemplo, La Tabla 2 que lista factores antiangiogénicos conocidos); y, Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206 (por ejemplo, la Tabla 1 lista agentes antiangiogénicos usados en ensayos clínicos) Un "trastorno" es cualquier condición patológica o enfermedad que se debería beneficiar con el tratamiento con una composición o método de la invención. Esto incluye trastornos o enfermedades agudos y crónicos que incluyen las condiciones patológicas, que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos que se pueden tratar usando los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención incluyen varias enfermedades y trastornos provistos en la presente bajo "Definiciones".

Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a los trastornos que se asocian con algún grado de proliferación celular anormal. En una forma de realización, el trastorno proliferativo celular es cáncer.

"Tumor," como se usa en la presente, se refiere a todo crecimiento o proliferación celular neoplásico, sea maligno o benigno, y todas las células y los tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso" "trastorno proliferativo celular" "trastorno proliferativo" y "tumor" no son mutuamente exclusivos como se menciona en la presente.

El tumor puede ser un tumor sólido o no sólido o de tejido blando. Los ejemplos de tumores de tejido blando incluyen leucemia (por ejemplo, leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda adulta, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda de células B maduras, leucemia linfocítica crónica, leucemia polilinfocítica o leucemia de células pilosas), o linfoma (por ejemplo, linfoma no Hodgkin, linfoma de células T cutáneas o linfoma de Hodgkin). Un tumor sólido incluye cualquier cáncer de los tejidos blandos diferentes de sangre, médula ósea o el sistema linfático. Los tumores sólidos pueden separar adicionalmente en los de origen de células epiteliales y los de origen de células no epiteliales. Los ejemplos de tumores sólidos incluyen tumores de colon, mamas, próstata, pulmón, riñon, hígado, páncreas, ovario, cabeza y cuello, cavidad oral, estómago, duodeno, intestino delgado, intestino grueso, aparato gastrointestinal, ano, vesícula biliar, labio, nasofaringe, piel, útero, órganos genitales masculinos, órganos urinarios, vejiga y piel. Los tumores sólidos de origen no epitelial incluyen sarcomas, tumores cerebrales y tumores óseos.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición patológica fisiológica que normalmente se caracteriza por el crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemia o neoplasias linfoides. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen pero sin limitación, cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, y carcinoma escamoso de pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago, que incluye cáncer gastrointestinal y cáncer de estroma gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de vejiga, cáncer del aparato urinario, hepatoma, cáncer de mamas, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer tiroideo, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, melanoma, melanoma, melanoma superficial diseminante, melanoma léntigo maligno, melanomas lentiginoso acral, melanomas nodulares, mieloma múltiple y linfoma de células B (que incluyen linfoma no Hodgkin de bajo grado/folicular (NHL), NHL linfocítico pequeño (SL), NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no escindidas pequeñas de grado alto; NHL de la enfermedad de masa; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno lifoproliferativo postrasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con los tumores cerebrales), y síndrome de Meig, así como cáncer de cabeza y cuello y membranas asociadas.

En ciertas formas de realización, los cánceres que pasibles del tratamiento con la variante de las IgG de la invención incluyen cáncer de mamas, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer pulmonar de células no pequeñas, glioblastoma, linfoma no Hodgkins (NHL), cáncer de células renales, cáncer prostático, cáncer hepático, cáncer pancreático, sarcoma de tejido blando, sarcoma de kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, cáncer ovárico, cáncer gástrico, mesotelioma, y mieloma múltiple. En algunas formas de realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células pequeñas, glioblastoma, neuroblastomas, melanoma, carcinoma de mamas cáncer gástrico, cáncer colorrectal (CRC), y carcinoma hepatocelular. Aún, en algunas formas de realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal, glioblastoma y carcinoma de mamas, que incluyen formas metastásicas de estos cánceres.

El término cáncer abarca una colección de trastornos proliferativos, que incluyen, pero sin limitación crecimientos precancerosos, tumores benignos, tumores malignos y tumores inactivos. Los tumores benignos permanecen localizados en el sitio de origen y no tienen la capacidad de infiltrar, invadir o invade, o producir metástasis en sitios distantes. Los tumores malignos invadirán y dañarán otros tejidos alrededor de ellos. Estos también pueden aumentar la capacidad de desprenderse de donde comienzan y difundirse a otras partes del cuerpo (producir metástasis), usualmente a través del torrente sanguíneo o a través del sistema linfático donde se localizan los nodos. Los tumores inactivos son tumores quiescentes en los que las células tumorales están presentes pero la progresión del tumor no es clínicamente evidente. Los tumores primarios se clasifican por el tipo de tejido del cual se originan; los tumores metastáticos se clasifican por el tipo de tejido del que derivan las células cancerosas. Con el transcurso del tiempo, las células de un tumor maligno se vuelven más anormales y aparecen menos como células normales. Este cambio en la apariencia de las células cancerosas se llama grado del tumor y las células cancerosas se describen como bien diferenciadas, moderadamente diferenciadas, escasamente diferenciadas o no diferenciadas. Las bien diferenciadas son de aspecto relativamente normal y se asemejan a las células normales de las que se originan. Las células no diferenciadas son células que se vuelto tan anormales que ya no es posible determinar el origen de las células.

Los cánceres epiteliales generalmente evolucionan de un tumor benigno a una etapa preinvasiva (por ejemplo, carcinoma in situ), a un cáncer maligno, que ha penetrado en la membrana basal e invadido el estroma subepitelial.

Por "displasia" se entiende cualquier crecimiento o desarrollo anormal de tejido, órgano o células. En ciertas formas de realización, la displasia es de alto grado o precancerosa.

Por "metástasis" se entiende la difusión del cáncer desde su sitio primario a otros lugares del cuerpo. Las células cancerosas pueden desprenderse de u tumor primario, penetrar en los vasos linfáticos y sanguíneos, circular a través del torrente sanguíneo y crecer en un foco distante (producir metástasis) en tejidos normales de otra parte del cuerpo. La metástasis puede ser local o distante. La metástasis es un proceso secuencial, sujeto al desprendimiento de células tumorales del tumor primario, que viajan a través del torrente sanguíneo y se detienen en un sitio distante. En el nuevo sitio, las células establecen una irrigación sanguínea y pueden crecer para formar una masa riesgosa para la vida. Tanto las vías moleculares estimuladoras como inhibidoras de las células tumorales regulan este comportamiento y las interacciones entre la célula tumoral y las células huésped también son significativas.

Por "micrometástasis" se entiende un pequeño número de células que se ha propagado del tumor primario a otras partes del cuerpo. La micrometástasis puede detectarse o no en una prueba de detección o diagnóstico.

Por "no metastático" se entiende un cáncer que es benigno o que permanece en el sitio primario y no ha penetrado en el sistema vascular linfático o sanguíneo o en los tejidos diferentes del sitio primario. En general, un cáncer no metastático es cualquier cáncer que está en estadio 0, I, o II del cáncer, ocasionalmente en cáncer de estadio III.

La referencia a un tumor o cáncer como "estadio 0", "estadio I", "estadio II", "estadio III" o "estadio IV" indica la calcificación del tumor o cáncer usando los métodos de agrupamiento de estadio global o estadificación con números romanos conocidos en la técnica. Si bien el estadio real del cáncer es dependiente del tipo de cáncer, en general, un cáncer en estadio 0 es una lesión in, un cáncer en estadio I es un tumor localizado pequeño, un cáncer en estadio II y III es un tumor local avanzado que exhibe compromiso de los ganglios linfáticos locales, y un cáncer en estadio IV representa cáncer metastático. Los estadios específicos de cada tumor son conocidos por los médicos expertos.

Por "tumor primario" o "cáncer primario" se entiende el cáncer original y no una lesión metastática localizada en otro tejido, órgano o localización del cuerpo del sujeto.

Por "tumor benigno" o "cáncer benigno" se entiende un tumor que permanece localizado en el sitio de origen y no tiene la capacidad de infiltrar, invadir o producir metástasis en un sitio distante.

"Recurrencia del cáncer" en la presente se refiere a un retorno del cáncer después del tratamiento e incluye el retorno del cáncer en el órgano primario, así como recurrencia distante, donde el cáncer retorna fuera del órgano primario.

Por "latencia del tumor" se entiende un estado inactivo prolongado en que las células tumorales están presentes pero la progresión del tumor no es clínicamente evidente. Un tumor inactivo se puede detectar o no en una prueba de detección o diagnóstico.

Por "carga tumoral" se entiende la cantidad de células cancerosas, el tamaño de un tumor, o la cantidad de cáncer en el cuerpo. La carga tumoral también se denomina carga del tumor.

Por "número de tumores" se entiende la cantidad de tumores.

Las enfermedades no neoplásicas que son pasibles de tratamiento con los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, hipertrofia no deseada o aberrante, hipertrofia prostética benigna, artritis, artritis reumatoide (RA), artritis psoriática, enfermedades neurodegenerativas {por ejemplo enfermedad de Alzheimer, demencia relacionada con el SIDA, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentaria, atrofia muscular espinal y degeneración cerebelar), enfermedad autoinmune, psoriasis, placas psoriáticas, sarcoidosis, aterosclerosis, placas arterioscleróticas, tiroiditis de Hashimoto, trastornos angiogénicos, enfermedad ocular tal como síndrome de histoplasmosis ocular presunta, vascularización retiniana, retinopatías diabéticas y otras proliferativas que incluyen retinopatía de premadurez, nefropatía diabética, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, neovascularización corneano, neovascularización del injerto corneano, rechazo del injerto de córnea, neovascularización retiniana/coroideo, neovascularización del ángulo (rubeosis), enfermedad neovascular ocular, enfermedad vascular, patologías que incluye proliferación anormal de células epiteliales vasculares, restenosis vascular, síndrome de Guillain-Barre, pólipos tales como pólipos de colon, poliposis por adenomatosis familiar, pólipos nasales o pólipos gastrointestinales, úlceras gastrointestinales, estenosis pilórica hipertrófica infantil, síndrome obstructivo urinario, enfermedad de Menetrier, adenomas secretores o síndrome de pérdida de proteína, fibroadenoma, enfermedad respiratoria, colecistitis, neurofibromatosis, malformaciones arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias tiroideas (que incluyen la enfermedad de Grave), trasplante de córnea y otros tejidos, enfermedades inflamatorias, inflamación crónica, inflamación pulmonar, lesión pulmonar aguda/ARDS, sepsis, enfermedad pulmonar oclusiva crónica, hipertensión pulmonar primaria, efusiones pulmonares malignas, ateroma, edema después de quemaduras, trauma, radiación, accidente cerebrovascular, hipoxia o isquemia, edema del infarto de miocardio, lesión isquémica, daño después de un evento isquémico cerebral, edema cerebral (por ejemplo, asociada con accidente cerebrovascular agudo/ lesión cerebral cerrada/ trauma), trombos causados por agregación plaquetaria, enfermedades fibróticas o edema tales como cirrosis hepática, fibrosis pulmonar, carcoidosis, tiroiditis, síndrome sistémico de hiperviscosidad, inflamación sinovial, formación de pannus en RA, miosotis osificante, formación de hueso hipertrófico, patologías asociadas con hueso tales como osteoartritis, raquitismo y osteoporosis, ascitis refractaria, inflamación de hueso o articulaciones, síndrome mielodisplásico, anemia aplásica, riñon o hígado; enfermedad de hipersensibilidad mediada por células T, enfermedad de Paget, enfermedad renal poliquístico, tercer espacio de enfermedades del fluido (pancreatitis, síndrome del compartimiento, quemaduras, enfermedad intestinal), inflamación crónica tal como IBD (enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa), trastornos renales, rechazo de aloinjerto renal, enfermedad de injerto versus huésped o rechazo de trasplante, enfermedad intestinal inflamatoria, nefropatías agudas y crónicas (que incluye glomerulonefritis proliferativa y enfermedad renal inducida por diabetes), síndrome nefrótico, crecimiento de masa de tejido no deseado o aberrante (no cáncer), obesidad, crecimiento de masa de tejido adiposo, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficos, inhibición del crecimiento del pelo, síndrome de Osler Weber-Rendu, fibroplasias retrolentales de granuloma piogénico, esclerodermia, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, reacción de hipersensibilidad de la piel, trastornos cutáneos que incluyen psoriasis y dermatitis, eczema, fotoenvejecimiento (por ejemplo causada por radicación UV de la piel humana), formación de cicatriz hipertrófica, patologías reproductivas tales como endometriosis, síndrome de hiperestimulación ovárico, enfermedad ovárica poliquístico, preeclampsia, hemorragia uterina disfuncional o menometroragia, fibroides uterinos, parto prematura, ascitis, efusión pericárdica (tales como los asociadas con pericarditis), efusión pleural, shock endotóxico e infección fúngica, ciertas infecciones microbianas que incluyen patógenos microbianos seleccionados de adenovirus, hantavirus, Borrelia burgdorferi, Yersinia spp., Bordetella pertussis y trastornos psiquiátricos (por ejemplo esquizofrenia, depresión bipolar, autismo y trastorno de déficit de atención).

Una "enfermedad respiratoria" involucra el sistema respiratorio e incluye bronquitis crónica, asma que incluye asma agudo y asma alérgica, fibrosis quística, bronquiectasia, alergia u otra rinitis o sinusitis, deficiencia de alfal-antitripsina, tos, enfisema pulmonar, fibrosis pulmonar o vías respiratorias hiperreactivas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y trastorno pulmonar obstructivo crónico.

Una "enfermedad autoinmune" de la presente es una enfermedad o trastorno maligno proveniente y dirigida contra los tejidos propios del individuo. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunes incluyen, pero sin limitación, respuestas inflamatorias tales como enfermedades cutáneas inflamatorias que incluyen psoriasis y dermatitis (por ejemplo, dermatitis atópica y dermatitis por contacto); esclerodermia sistémico y esclerosis; respuestas asociadas con enfermedad intestinal inflamatoria (tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa); síndrome de distrés respiratorio (que incluye síndrome de distrés respiratorio adulto; ARDS); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveítis; colitis; glomerulonefritis; enfermedades alérgicas tales como eczema y asma y otras enfermedades que incluyen la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas; aterosclerosis; deficiencia de adhesión de leucocito; artritis reumatoide; lupus eritematoso sistémico (SLE); diabetes mellitus (por ejemplo diabetes mellitus Tipo I o diabetes mellitus dependiente de insulina); esclerosis múltiple; síndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmune; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjorgen; diabetes de comienzo juvenil; y respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por citoquinas y linfoeitos T normalmente hallados en tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis, granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison); enfermedades que incluyen diapedesis leucocitaria; trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC); síndrome de lesión orgánica múltiple; anemia hemolítica (que incluyen, pero sin limitación a crioglobinemia o anemia positiva a Coombs); miastenia gravis; enfermedades mediadas por el complejo anticuerpo-antígeno; enfermedad de la membrana basal antiglomerular; síndrome antifosfolípido; neuritis alérgica; enfermedad de Graves; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; penfigoide bulloso; pénfigo; poliendocrinopatías autoinmunes; enfermedad de Reiter; síndrome del hombre rígido; enfermedad de Behcet; arteritis de células gigantes; nefritis por complejo inmune; nefropatía por IgA; polineuropatías por IgM; púrpura trombocitopénica inmune (ITP) o trombocitopenia autoinmune, etc.

El término "enfermedad o trastorno vascular" de la presente se refiere a las diversas enfermedades o trastornos que impactan el sistema vascular, que incluye el sistema cardiovascular. Los ejemplos de estas enfermedades incluyen arteriosclerosis, reobstrucción vascular, arterosclerosis, estenosis vascular posquirúrgico, restenosis, oclusión vascular o enfermedad obstructiva de la carótida, enfermedad arterial coronaria, angina, enfermedad de vasos pequeños, hipercolesterolemia, hipertensión, y enfermedades que incluyen proliferación o función anormal de las células epiteliales vasculares.

Como se usa en la presente, "tratamiento" (y variaciones tales como "tratar" o "que trata") se refieren a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo o célula tratada, y se puede realizar tanto para la profilaxis como durante el tratamiento de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen prevenir la aparición o recurrencia de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquiera de las consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, prevención de la metástasis, disminución de la tasa de avance de la enfermedad, mejora o paliativo del estado de enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno o para lentificar el avance una enfermedad o trastorno.

Un "individuo" "sujeto" o "paciente" es un vertebrado. En ciertas formas de realización, el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen pero sin limitación, animales de granja (tales como vacas), animales de deporte, mascotas (tales como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas. En ciertas formas de realización, un mamífero es un ser humano, El término "formulación farmacéutica" o "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea efectiva, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se debe administrar la formulación. Dichas formulaciones pueden ser estériles. Ver también sección titulada Dosis, formulaciones y duración.

Una formulación "estéril" es aséptica o libre de todo microorganismo vivo y sus esporas.

El término "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un fármaco efectivo para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto. En ciertas formas de realización, una cantidad efectiva se refiere a una cantidad efectiva en dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de una sustancia/molécula de la invención puede variar de acuerdo con factores tales el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad de la sustancia/molécula, para estimular una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva abarca una cantidad en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la sustancia/molécula es superado por los efectos de terapéuticamente beneficiosos. En el caso del cáncer, la cantidad efectiva del fármaco puede reducir la cantidad de células cancerosas; reducir el tamaño del órgano; inhibir (es decir, lentificar en alguna medida y normalmente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, lentificar en alguna medida y normalmente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en alguna medida, el crecimiento tumoral; permitir el tratamiento del tumor, y/o aliviar en alguna medida uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida que el fármaco pueda evitar el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico.

Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, pero no necesariamente, ya que se usa una dosis profiláctica en los sujetos antes o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva debe ser menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.

En el caso de tumores de estadio temprano o tardío, benignos, precancerosos, la cantidad terapéuticamente efectiva del inhibidor angiogénico puede reducir la cantidad de células cancerosas; reducir el tamaño del órgano; inhibir (es decir, lentificar en alguna medida y con preferencia detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, lentificar en alguna medida y con preferencia detener) la metástasis tumoral; inhibir o retrasar, en alguna medida, el crecimiento tumoral o progresión del tumor; permitir y/o aliviar en alguna medida uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida que el fármaco pueda evitar el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico.

El término "eficacia" se usa en la presente en el sentido más amplio y se refiere a la capacidad de la inmunoglobulina, anticuerpo o proteína de fusión de Fe para producir un efecto deseado. En ciertas formas de realización, la eficacia se refiere al efecto máximo observado de una inmunoglobulina, anticuerpo o proteína de fusión de Fe en niveles de saturación. En ciertas formas de realización, la eficacia se refiere a la EC50 de una inmunoglobulina, anticuerpo o proteína de fusión de Fe. En ciertas formas de realización, la eficacia se refiere a la . potencia de una inmunoglobulina, anticuerpo o proteína de fusión de Fe. En ciertas formas de realización, la eficacia se refiere a la capacidad de la inmunoglobulina, anticuerpo o proteína de fusión de Fe para producir efectos beneficiosos en el tratamiento o duración de una enfermedad, que incluye el beneficio clínico como se define en la presente.

El término "EC50" se refiere a la concentración de una inmunoglobulina, anticuerpo o proteína de fusión de Fe que induce una respuesta intermedia entre la basal y la máxima. En ciertas formas de realización, EC50 representa la concentración de una inmunoglobulina, anticuerpo o proteína de fusión de Fe donde se observa 50% de su efecto máximo. En ciertas formas de realización, EC50 representa la concentración plasmática o sérica necesaria para obtener el 50% del efecto máximo in vivo.

La eficacia para tratar cáncer se puede demostrar por la detección de la capacidad de un anticuerpo, una proteína de fusión, una molécula conjugada, o una composición de la invención para inhibir o reducir el crecimiento o metástasis de las células cancerosas o para mejorar o aliviar uno o más síntomas asociados con cáncer. El tratamiento se considera terapéutica si existe, por ejemplo, una reducción del crecimiento o metástasis de las células cancerosas, mejora de uno t o más síntomas asociados con cáncer, o una disminución de la mortalidad y/o morbilidad después de la administración de un anticuerpo, una proteína de fusión, una molécula conjugada, o una composición de la invención. Los anticuerpos, las proteínas de fusión o las composiciones de la invención se pueden analizar en cuanto a su capacidad para reducir la formación de tumor en ensayos in vitro, ex vivo e in vivo. En la terapia del cáncer, la eficacia in vivo, por ejemplo, también se puede medir por la evaluación de la duración de la supervivencia, tiempo a la progresión de la enfermedad (TTP), las tasas de respuesta (RR), duración de la respuesta y/o calidad de la vida. Ver también sección titulada Eficacia del tratamiento.

La eficacia para tratar trastornos inflamatorios se puede demostrar por la detección de la capacidad de un anticuerpo, una proteína de fusión, una molécula conjugada, o una composición de la invención para reducir o inhibir la inflamación en un animal o para mejorar o aliviar uno o nás síntomas asociados con un trastorno inflamatorio. El tratamiento se considera terapéutico si existe, por ejemplo, a reducción de la inflamación o mejora de uno o más síntomas después de la administración de un anticuerpo, una proteína de fusión, una molécula conjugada, o una composición de la invención.

La eficacia para tratar o evitar infección viral se puede demostrar por la detección de la capacidad de un anticuerpo, una proteína de fusión, una molécula conjugada, o una composición de la invención para inhibir la replicación del virus, para inhibir la transmisión o evitar que el virus se establezca por sí mismo en su huésped, o para evitar, mejorar o aliviar uno o más síntomas asociados con viral infección. El tratamiento se considera terapéutico si existe, por ejemplo, una reducción de la carga viral, mejora de uno o más síntomas o una disminución de la mortalidad y/o morbilidad después de la administración de un anticuerpo, una proteína de fusión, una molécula conjugada, o una composición de la invención. Los anticuerpos, las proteínas de fusión, las moléculas conjugadas o las composiciones de la invención también se pueden analizar en cuanto a su capacidad para inhibir la replicación viral o reducir la carga viral en los ensayos in vitro, ex vivo e in vivo La eficacia para tratar o evitar la infección bacteriana se puede demostrar por la detección de la capacidad de un anticuerpo, una proteína de fusión o una composición de la invención para inhibir la replicación bacteriana, o para evitar, mejorar o aliviar uno o más síntomas asociados con la infección bacteriana. El tratamiento se considera terapéutico si existe, por ejemplo, una reducción de las cantidades de bacterias, mejora de uno o más síntomas o una disminución de la mortalidad y/o morbilidad después de la administración de un anticuerpo, una proteína de fusión o una composición de la invención.

El beneficio clínico se puede medir por la evaluación de varios criterios de valoración, por ejemplo, inhibición, en alguna medida, de la progresión de la enfermedad, que incluye la lentificación y detención completa; reducción de la cantidad de episodios y/o síntomas de enfermedad; reducción del tamaño de la lesión; inhibición (es decir, reducción, lentificación o detención completa) de la infiltración de células de la enfermedad en órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; inhibición (es decir reducción, lentificación o detención completa) de la propagación de la enfermedad; disminución de la respuesta autoinmune, que puede, pero no debe producir la regresión o ablación de la lesión de la enfermedad; alivio, en alguna medida, de uno o más síntomas asociados con el trastorno; incremento de la duración de la presentación libre de enfermedad después del tratamiento, por ejemplo, supervivencia libre de progresión; aumento de la supervivencia total; mayor tasa de respuesta; y/o disminución de la mortalidad en un punto determinado después del tratamiento.

"Reducir o inhibir" es disminuir o reducir una actividad, función y/o cantidad en comparación con una referencia. En ciertas formas de realización, por "reducir o inhibir" se entiende la capacidad de causar una reducción total de 20% o más. En otra forma de realización, por "reducir o inhibir" se entiende la capacidad de causar una reducción total de 50% o más. En aún otra forma de realización, por "reducir o inhibir" se entiende la capacidad de causar una reducción total de 75%, 85%, 90%, 95%, o más. Reducir o inhibir puede referir a los síntomas del trastorno tratado, la presencia o tamaño de metástasis, el tamaño del tumor primario, o el tamaño o cantidad de los vasos sanguíneos en trastornos angiogénicos.

Cáncer "operable" es cáncer que se confina al órgano primario y adecuado para cirugía.

"Supervivencia" se refiere al paciente que permanece vivo, e incluye supervivencia libre de enfermedad (DFS), supervivencia libre de progresión (PFS) y supervivencia total (OS). La supervivencia se puede estimar por el método de Kaplan-Meier, y cualquiera de las diferencias de supervivencia se calculan usando la prueba de rango logarítmico estratificado.

"Supervivencia libre de enfermedad (DFS)" se refiere al paciente que permanece vivo, sin retorno del cáncer, durante un período definido de tiempo tal como aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años, aproximadamente 10 años, efe, desde la iniciación del tratamiento o desde el diagnóstico inicial. En un aspecto de la invención, la DFS se analiza de acuerdo con el principio de intención de tratar, es decir, los pacientes se evalúan sobre la base de su terapia asignada. Los eventos usados en el análisis de la DFS pueden incluir la recurrencia local, regional y distante del cáncer, la aparición de cáncer secundario y la muerte por cualquier causa de los pacientes sin un evento previo {por ejemplo, recurrencia de cáncer de mamas o segundo cáncer primario).

"Supervivencia total" se refiere al paciente que permanece vivo durante un período de tiempo definido, tal como aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años, aproximadamente 10 años, efe, desde la iniciación del tratamiento o desde el diagnóstico inicial.

Por "extensión de la supervivencia" se entiende el incremento de la DFS y/o OS en un paciente tratado respecto de un paciente no tratado, o respecto de un protocolo de tratamiento control, tal como tratamiento solo con el agente quimioterapéutico. La supervivencia se controla durante al menos aproximadamente seis meses, o al menos aproximadamente 1 año, o al menos aproximadamente 2 años, o al menos aproximadamente 3 años, o al menos aproximadamente 4 años, o al menos aproximadamente 5 años, o al menos aproximadamente 10 años, efe, después de la iniciación del tratamiento o después del diagnóstico inicial.

El término "en forma concurrente" se usa en la presente para referirse a la administración de dos o más agentes terapéuticos, donde al menos parte de la administración se superpone en el tiempo. Por consiguiente, la administración concurrente incluye un régimen de dosis cuando la administración de uno o más agentes continúa después de discontinuar la administración de uno o más agentes diferentes.

Por "monoterapia" se entiende un régimen terapéutico que incluye solo un agente terapéutico solo para el tratamiento del cáncer o tumor durante el ciclo del período de tratamiento. En ciertas formas de realización, la monoterapia mediante una variante de IgG significa que la variante de IgG se administra ausencia de una terapia anticáncer adicional durante el período de tratamiento.

Por "terapia de mantenimiento" se entiende un régimen terapéutico que se administra para reducir la probabilidad de recurrencia o progresión de la enfermedad. La terapia de mantenimiento se puede proporcionar durante cualquier duración de tiempo, que incluye períodos de tiempo extendido de hasta la esperanza de vida del sujeto. La terapia de mantenimiento se puede proporcionar después de la terapia inicial o en conjunto con terapias iniciales o adicionales. Las dosis usadas para la terapia de mantenimiento pueden variar y pueden incluir dosis disminuidas en comparación con las dosis usadas para otros tipos de terapia.

"Terapia neoadyuvante" o "terapia preoperatoria" en la presente se refieren a la terapia dada antes de la cirugía. El objetivo de la terapia neoadyuvante es proporcionar tratamiento sistémico inmediato, erradicar potencialmente micrometástasis que de otro modo podrían proliferar si se siguiera la secuencia estándar de cirugía seguida por la terapia sistémica. La terapia neoadyuvante también puede ayudar a reducir el tamaño del tumor, de este modo permite la resección completa de los tumores inicialmente no resecables o que conservan porciones de los órganos y sus funciones. Por otra parte, la terapia neoadyuvante permite una evaluación in vivo de la eficacia del fármaco, que pueden guiar la elección de los posteriores tratamientos.

"Terapia adyuvante" en la presente se refiere a la terapia dada después de la cirugía, donde no se puede detectar evidencia de enfermedad residual, de modo de reducir el riesgo de recurrencia de enfermedad. El objetivo de la terapia adyuvante es prevenir la recurrencia del cáncer, y en consecuencia reducir la posibilidad de muerte relacionada con el cáncer.

En la presente, en la "atención médica estándar" quimioterapia se refiere a los agentes quimioterapéuticos usados habitualmente para tratar un cáncer particular.

"Cirugía definitiva" se usa como el término se emplea la comunidad médica. La cirugía definitiva incluye, por ejemplo, procedimientos, quirúrgicos o de otro tipo, que produce la extracción o resección del tumor, incluyendo los que producen la extracción o resección del total de tumor marcadamente visible. La cirugía definitiva incluye, por ejemplo, resección completa o curativa o resección macroscópica completa del tumor. La cirugía definitiva incluye procedimientos que se producen en uno o más estadios, e incluye, por ejemplo, procedimientos quirúrgicos de múltiples etapas donde se realizan uno o más procedimientos quirúrgicos u otros antes de la resección del tumor. La cirugía definitiva incluye procedimientos para extraer o extirpar el tumor que incluye órganos involucrados, partes de órganos y tejidos, así como órganos vecinos, tales como ganglios linfáticos, partes de órganos o tejidos.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

Administración "crónica" se refiere a la administración del agente en un modo continuo a diferencia de un modo agudo, de modo de mantener el efecto terapéutico inicial (actividad) durante un período de tiempo extendido. Administración "intermitente" es el tratamiento que no se realiza en forma consecutiva sin interrupción, sino más bien de naturaleza cíclica.

"Portadores" como se usa en la presente incluyen los portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que son no tóxicos para la célula o mamífero expuestos a ellos en las dosis y concentraciones empleadas. A menudo el portador fisiológicamente aceptable es una solución amortiguada a pH acuoso. Los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen buffer tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos, antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menor de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG), y PLURONICS™, Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivo que es de utilidad para la administración de un fármaco (tal como una variante de IgG) a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas.

El término "composición antineoplásica" se refiere a una composición útil para tratar cáncer que comprende al menos un agente terapéutico activo, por ejemplo, "agente anticáncer". Los ejemplos de agentes terapéuticos (agentes anticáncer) incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes usados en la terapia de radiación, agentes anti-angiogénesis, agentes apoptóticos, agentes anti-tubulina y otros agentes para tratar cáncer, tales como anticuerpos anti-HER-2, anticuerpos anti-CD20, un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de tirosina quinasa), inhibidor de HER1/EGFR {por ejemplo, erlotinib (Tarceva™), inhibidores dell factor derivado de plaquetas (por ejemplo, Gleevec™ (Imatinib Mesilate)), un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), interferones, citoquinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se unen a uno o más de los siguientes blancos ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA o receptores de VEGF, TRAIUApo2, y otros agentes químicos bioactivos y orgánicos, etc. Sus combinaciones también están incluidas en la invención.

El término "agente citotóxico" como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o impide una función celular y/o causa muerte o destrucción celular. El término incluye los isótopos radiactivos (por ejemplo, At21 , I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 y los isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes de intercalantes, enzimas y sus fragmentos tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas tales como toxinas de pequeñas moléculas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico o animal, que incluyen sus fragmentos y/o variantes, y los diversos agentes antitumorales o anticancerosos que se describen a continuación. Otros agentes citotóxicos se describen a continuación. Un agente tumoricida causa la destrucción de las células tumorales. En ciertas formas de realización, la variante de IgG se puede conjugar con un agente citotóxico.

Una "toxina" es cualquier sustancia capaz de tener un efecto perjudicial sobre el crecimiento o proliferación celular.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil para el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®); alquilsulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOLO); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (que incluye el análogo sintético de topotecano (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecano, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC— 1065 (que incluyen sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido, criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (que incluyen los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1 ); eleutherobina; pancratistatina; una sarcodictiína; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustine; antibióticos tales como los antibióticos de enedíina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gammal l y calicheamicina omegaH (ver. por ejemplo, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engi, 33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor de alfa-4 integrina oral; dinemicina, que incluyen dinemicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibiótico enedíina cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (que incluyen ADRIAMICINA®, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, inyección liposómica de doxorrubicina HCI (DOXIL®), doxorrubicina TLC D-99 liposómica (MYOCET®), doxorrubicina liposómica pegilada (CAELYX®), y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato, gemcitabina, tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), un epotilón, y 5-fluorouracilo (5-FU); combretastatina; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propirionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; restaurador de ácido fólico tal como ácido frolíinico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; * amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinana; lonidainina; maytansinoides tales como maytansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; , procarbazina; complejo de polisacáridos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, O); razoxana; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico, triaziquona; 2,2',2'-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinoósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulación en nanopartículas de albúmina manipuladas genéticamente de paclitaxel (ABRAXANE™), y docetaxel (TAXOTERE®); cloranbucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino tales como cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo, ELOXATIN®), y carboplatino; vincas, que impiden la polimerización de tubulina a partir de la formación de microtúbulos, que incluyen vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®), y vinorelbina (NAVELBINE®); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico, que incluyen bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®), o risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (un análogo de citosina nucleosídico de 1 ,3-dioxolano); oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión de los genes en las vías de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tal como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™)); y VEGF-A que reduce la proliferación celular; vacunas tales como vacuna THERATOPE® y vacuna de terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-1 1248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib), inhibidor de proteosoma (por ejemplo, PS341 ); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2 tai como oblimersen de sodio (GENASENSE®); pixantrona; inhibidores de EGFR; inhibidores de tirosina quinasa; inhibidores de serina-treonina quinasa tales como rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®); inhibidores de famesiltransferasa tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables para uso farmacéutico de cualquiera de los anteriores; así como las combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura para el régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina, y sales, ácidos o derivados aceptables para uso farmacéutico de cualquiera de los anteriores; así como las combinaciones de dos o más de los anteriores Los agentes quimioterapéuticos definidos en la presente incluyen "agentes anti-hormonales" o "agentes terapéuticos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de las hormonas que puedan promover el crecimiento del cáncer. Estas pueden ser las hormonas mismas, que incluyen pero sin limitación: antiestrógenos y moduladores del receptor selectivo de estrógenos (SERM), que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno (que incluyen NOLVADEX® tamoxifeno), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y FARESTON- toremifeno; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos de las glándula adrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-¡midazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, AROMASIN® exemestano, formestano, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol, y ARIMIDEX® anastrozol; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; así como troxacitabina (un análogo de citosina nucleosídico 1 ,3-dioxolano); oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión de los genes en las vías de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tal como, por ejemplo, PKC—alfa, Raf y H-Ras; ribozimas tales como un inhibidor de la expresión de VEGF (por ejemplo, ANGIOZYME® ribozima) y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas tales como vacunas de terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rlL-2; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; vinorelbina y esperamicinas (ver patente estadounidense No. 4.675.187), y sales, ácidos o derivados aceptables para uso farmacéutico de cualquiera de los anteriores; así como las combinaciones de dos o más de los anteriores.

Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula (tal como una célula que expresa VEGF) sea ¡n vitro o in vivo. En consecuencia, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce en forma significativa el porcentaje de las células (tal como una célula que expresa el VEGF) en la fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance del ciclo celular (en un lugar diferente que la fase S), tal como agentes que inducen la detención de G1 y la detención de la fase M. Los bloqueadores clásicos de la fase M incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de la topoisomerasa II tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido, y bleomicina. Estos agentes que detienen G1 también se extienden a la detención de la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Información adicional se puede hallar en Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cáncer, Capítulo 1 , titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" de Murakami et al. (W.B. Saunders, Filadelfia 1995), por ejemplo, p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticáncer derivados del árbol tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de los microtúbulos a partir de los dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos al impedir la despolimerización, que produce la inhibición de la mitosis en las células.

Por "terapia de radiación" se entiende el uso de rayos gamma dirigidos o rayos beta para inducir daño suficiente a una célula de modo de limitar su capacidad de funcionar normalmente o destruir las células totalmente. Se apreciará que existirán muchas formas conocidas en la técnica de determinar la dosis y duración del tratamiento. Los tratamientos típicos se dan como una administración de una vez y las dosis típicas varían de 10 a 200 unidades (Grays) por día.

La "patología" de una enfermedad incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Para el cáncer, estos incluye, sin limitación, crecimiento celular anormal o incontrolable, metástasis, interferencia en el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citoquinas u otros productos secretores en niveles anormales, supresión o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, etc.

Una "pequeña molécula" definida en la presente tiene un peso molecular inferior de aproximadamente 500 Dalton.

El término "infusión intravenosa" se refiere a la introducción de un fármaco en la vena de un paciente animal o humano durante un período de más de aproximadamente 5 minutos, con preferencia entre aproximadamente 30 a 90 minutos, si bien de acuerdo con la invención, la infusión intravenosa se administra alternativamente durante 10 horas o menos.

El término "bolo intravenoso" o "choque intravenoso" se refiere a la administración del fármaco en la vena de un paciente animal o humano de modo que el cuerpo reciba el fármaco en aproximadamente 15 minutos o menos-, con preferencia 5 minutos o menos.

El término "administración subcutánea" se refiere a la introducción de un fármaco bajo la piel de un paciente animal o humano, con preferencia dentro de una bolsa entre la piel y el tejido subyacente, por aplicación sostenida relativamente lenta de un receptáculo de fármaco. La bolsita se puede crear al comprimir o tomar la piel hacia arriba y fuera del tejido subyacente.

El término "infusión subcutánea" se refiere a la introducción de un fármaco bajo la piel de un paciente animal o humano, con preferencia con preferencia dentro de una bolsa entre la piel y el tejido subyacente, por aplicación sostenida relativamente lenta de un receptáculo de fármaco durante un período de tiempo que incluye, pero sin limitación, 30 minutos o menos, o 90 minutos o menos.

Opcionalmente, la infusión se puede realizar por la implantación subcutánea de una bomba de administración de fármaco implantada bajo la piel de un paciente animal o humano, en donde la bomba libera una cantidad predeterminada de fármaco durante un período predeterminado de tiempo, tal como 30 minutos, 90 . minutos, o un período de tiempo que abarca la duración del régimen de tratamiento.

El término "bolo subcutáneo" se refiere a la administración del fármaco debajo de la piel de un paciente animal o humano, donde la administración de fármaco del bolo con preferencia es menos de aproximadamente 15 minutos, con más preferencia menos de 5 minutos, y con máxima preferencia menos de 60 segundos. La administración con preferencia está dentro de una bolsita entre la piel y el tejido subyacente, donde la bolsita se forma al comprimir o tomar la piel hacia arriba y fuera del tejido subyacente.

La palabra "marca" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto detectable o composición que se conjuga en forma directa o indirecta con el polipéptido. La marca puede detectable por sí misma (por ejemplo, marcas de radioisótopo o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable.

Anticuerpos Los anticuerpos son proteínas que exhiben especificidad de unión a un antígeno específico. Los anticuerpos nativos son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas livianas idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena liviana está unida a una cadena pesada por un enlace covalente disulfuro, mientras que el número de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada una de las cadenas pesadas y livianas también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene un dominio variable (VH) en un extremo seguido por una cantidad de dominios constantes. Cada cadena liviana tiene un dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante en el otro extremo; el dominio constante de la cadena liviana se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena liviana se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se considera que los residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena liviana y la cadena pesada.

De acuerdo con las secuencias de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, anticuerpos o inmunoglobulinas se pueden asignar a clases diferentes. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de estas se pueden dividir adicionalmente en cinco subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-i, lgG2, lgG3, lgG4, IgAi e lgA2. Una variedad de alotipos de IgG-i , lgG2, lgG3, y lgG4 humanos se han descripto eny M.-P. LeFranc y G. LeFranc ¡n: "The Human IgG Subclasses," F. Shakib (ed.), pp. 43-78, Pergamon Press, Oxford (1990)). Los diferentes isotipos de la clase IgG, que incluye IgG-i, IG2s, lgG3 e lgG4, presentan propiedades físicas, biológicas y clínicas únicas. La Gi humana es el anticuerpo más comúnmente usado para fines terapéuticos y la mayoría de los estudios de manipulación genética se han construido en este contexto.

La presente aplicación se refiere a las variantes de inmunoglobulinas IgG que incluyen modificaciones de aminoácidos que alteran las propiedades biológicas de la IgG. Las variantes de inmunoglobulinas de la presente aplicación incluyen anticuerpos que comprenden una región Fe modificada que exhibe vidas medidas más largas in vivo en comparación con los anticuerpos tipo salvaje.

En ciertas formas de realización, la vida media de una variante de IgG de la presente invención aumenta en al menos 50% en comparación con la vida media de la IgG que tiene la región de Fe humana de tipo salvaje. En ciertas formas de realización, la vida media de una variante de IgG de la presente invención aumenta en al menos 75% en comparación con la vida media de la IgG que tiene la región de Fe humana de tipo salvaje. En ciertas formas de realización, la vida media de una variante de IgG de la presente invención aumenta en al menos 100% en comparación con la vida media de la IgG que tiene la región de Fe humana de tipo salvaje.

En ciertas formas de realización, la vida media de una variante de IgG de la presente invención es al menos aproximadamente 15 días. En ciertas formas de realización, la vida media de una variante de IgG de la presente invención es al menos aproximadamente 20 días. En ciertas formas de realización, la vida media de una variante de IgG de la presente invención es al menos aproximadamente 25 días. En ciertas formas de realización, la vida media de una variante de IgG de la presente invención es al menos aproximadamente 30 días. En ciertas formas de realización, la vida media de una variante de IgG de la presente invención es al menos aproximadamente 35 días. En ciertas formas de realización, la vida media de una variante de IgG de la presente invención es al menos aproximadamente 40 días. En ciertas formas de realización, la variante IgG es la variante IgGi.

En ciertas formas de realización, la vida media de la variante IgG de la presente invención es la vida media medida en seres humanos. En ciertas formas de realización, la vida media de la variante IgG de la presente invención es la vida media medida en monos cynomolgus.

Fragmentos de anticuerpo La presente invención abarca los fragmentos de anticuerpo. De particular interés son los anticuerpos que comprenden regiones Fe, fusiones de Fe y la región constante de la cadena pesada. En ciertas formas de realización, los fragmentos de anticuerpo son los fragmentos de variantes de inmunoglobulina (IgG) que comprenden regiones Fe. Los fragmentos de anticuerpo se pueden generar por medios tradicionales, tales como digestión enzimática o por técnicas recombinantes.

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de los fragmentos de anticuerpo. En forma tradicional, estos fragmentos se derivaron por digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir directamente por células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv se pueden expresar y secretar en E. coli, de este modo se permite la producción fácil de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de las bibliotecas de fagos de anticuerpo. En ciertas formas de realización, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar los fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro método, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente del cultivo de célula huésped recombinante. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el profesional experto. El fragmento del anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe, por ejemplo en la patente estadounidense No. 5.641.870. Dichos anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

Anticuerpos humanizados La invención abarca anticuerpos humanizados. En ciertas formas de realización, los anticuerpos humanizados son variantes humanizadas de las IgG con una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe respecto a la IgG de tipo salvaje. Varios métodos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos de aminoácidos introducidos en este, provenientes de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan como residuos de "importación", que normalmente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321 :522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), por la sustitución de las secuencias de la región hipervariable para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente estadounidense No. 4.816.567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido con la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente y anticuerpos humanos en los que se sustituyen algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR con residuos provenientes de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de los dominios variables humanos, tanto pesados como livianos, que se usan para obtener los anticuerpos humanizados puede ser importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se analiza frente a la biblioteca completa de las secuencias conocidas del dominio variable humano. La secuencia humana que está más próxima a la del roedor, luego se acepta como la estructura humana para el anticuerpo humanizado. Ver, por ejemplo, Sims et al. (1993) J. Immunol. 151 :2296; Chothia ef al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Otro método usa una estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo de cadena liviana o pesada particular. La misma estructura se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes. Ver, por ejemplo, Cárter et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151 :2623.

Además en general es deseable que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para obtener este objetivo, de acuerdo con un método, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias originales y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Se dispone de programas de computación que ilustran y despliegan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias seleccionadas de la inmunoglobulina candidata. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis de semejanza de roles de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influye en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antígeno. De este modo, los residuos FR se pueden seleccionar y combinar a partir del receptor e importar las secuencias de modo de obtener las características del anticuerpo deseado, tal como aumento de afinidad para los antígenos blanco. En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y más sustancialmente involucrados para influir en la unión al antígeno.

Anticuerpos humanos En ciertas formas de realización, los anticuerpos humanos de la invención son variantes de IgG humanas con una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe respecto de la IgG de tipo salvaje. Los anticuerpos humanos se pueden construir por la combinación de las secuencias del dominio variable del clon de Fv seleccionados de las bibliotecas de despliegue de fagos derivadas humanas con las secuencias conocidas del dominio constante humano como se describió con anterioridad. Alternativamente, se pueden obtener anticuerpos humanos monoclonales de la invención por el método de hibridoma. Se han descripto líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de los anticuerpos humanos monoclonales, por ejemplo, por Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boerner ef al., J. Immunol., 147: 86 (1991 ).

Actualmente es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, después de la inmunización de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de ¡nmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descripto que la supresión homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal produce una inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz del gen de ¡nmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal originará la producción de anticuerpos humanos tras el estímulo con el antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci U.S.A, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993).

La transposición génica también se puede usar para derivar anticuerpos humanos de anticuerpos no humanos, por ejemplo, roedores, en donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo no humano de partida. De acuerdo con este método, que también se llama "huellas de epitope" la región variable de cadena pesada o liviana de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido por técnicas de despliegue de fagos como se describe en la presente se reemplaza con un repertorio de genes del dominio V humano, lo que origina una población de scFv de cadena no humana/cadena humana o quimeras Fab. La selección con el antígeno produce el aislamiento de una scFv o Fab de cadena no humana/cadena humana quimérica en donde la cadena humana restaura el sitio de unión al antígeno destruido después de la eliminación de la correspondiente cadena no humana del. clon de despliegue de fagos primarios, es decir el epitope gobierna (imprime) la elección del compañero de la cadena humana. Cuando el proceso se repite con el fin de reemplazar la cadena no humana restante, se obtiene un anticuerpo humano (ver PCT WO 93/06213 publicado el 1 de abril, 1993). A diferencia de la humanización tradicional de los anticuerpos no humanos por injerto del CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen residuos FR o CDR de origen no humano.

Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En ciertas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos biespecíficos con una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe respecto del anticuerpo de tipo salvaje. En ciertas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos humanos o humanizados. En ciertas formas de realización, una de las especificidades de unión es para VEGF y el otro es para . cualquier otro antígeno. En ciertas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos diferentes de VEGF. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden usar para localizar agentes citotóxicos en las células que expresan el VEGF. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión al VEGF y un brazo que se une a un agente citotóxico, tal como, por ejemplo, saporina, anti-interferón-a, alcaloides de vinca, cadena de ricina A, metotrexato o hapteno con isótopo radiactivo. En ciertos anticuerpos, las especificidades de unión son para IL-4 y IL-13. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo que comprenden la región de Fc_ Los métodos para obtener anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada -cadena liviana de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Debido a la distribución aleatoria de las cadenas pesada y liviana de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que usualmente se realiza con etapas de cromatografía de afinidad, es más bien engorrosa, y los rendimientos de producto son bajos. Se describen procedimientos similares en WO 93/08829 publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991 ).

De acuerdo con un método diferente, los dominios variables del anticuerpo se fusionan la especificidad de unión deseada (sitio de combinación del anticuerpo-antígeno) a las secuencia del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión, por ejemplo, es con un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. En ciertas formas de realización, la primera región constante de la cadena pesada (CH1 ), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena liviana, está presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena liviana de la inmunoglobulina se insertan en los vectores de expresión separados y se co-transfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos, en las realizaciones en que se usan relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos en la construcción se obtienen los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificadoras para dos o tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en relaciones iguales produce altos rendimientos o cuando las relaciones no son de significación particular.

En una forma de realización de este método, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena liviana de inmunoglobulina híbrida que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se halló que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado proveniente de las combinaciones no deseadas de cadenas de inmunoglobulina, ya que la presencia de una cadena liviana de la inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera fácil de separación. Este método se describe en WO 94/04690. Para mayores detalles de la generación de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh ef al., Methods in Enzymology, 121 :210 (1986).

De acuerdo con otro método, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos se puede manipular genéticamente para maximizar el porcentaje de los heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La interfaz comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano). Las "cavidades" compensadoras de tamaño idéntico o similar en las cadenas laterales grandes se crean en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales de aminoácidos mayores con las más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímeró respecto de otros productos finales no deseados tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos del heteroconjugado se puede acoplar con avidina, el otro a biotina. Se han propuesto dichos anticuerpos, por ejemplo, para dirigirse a las células del sistema inmune a las células no deseadas (patente estadounidense No. 4.676.980), y para el tratamiento de la infección con HIV (WO 91/00360, WO 92/00373, y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden obtener usando cualquier medio de entrecruzamiento conveniente. Los agentes de entrecruzamiento son bien conocidos en la técnica, y se describen en la patente estadounidense No. 4.676.980, junto con numerosas técnicas de entrecruzamiento.

La tecnología "diacuerpo" descripta por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A, 90:6444-6448 (1993) ha provisto un mecanismo alternativo para obtener fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena liviana (VL) por un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, de este modo se forman dos sitios de unión al antígeno. También se ha informado otra estrategia para obtener fragmentos de anticuerpos biespecíficos por el uso de dímeros de cadena única Fv (sFv). Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991 ). Anticuerpos multivalentes Un anticuerpo multivalente se puede incorporar (y/o catabolizar) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes de los de la clase IgM) con tres o más sitios de unión de antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que se pueden producir fácilmente por la expresión recombinante del ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión al antígeno. En ciertas formas de realización, el dominio de dimerización comprende (o consiste) una región Fe o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de unión al amino-terminal del antígeno a la región Fe. En ciertas formas de realización, un anticuerpo multivalente comprende (o consiste) tres a aproximadamente ocho sitios de unión al antígeno. En una de dichas formas de realización, un anticuerpo multivalente comprende (o consiste) cuatro sitios de unión al antígeno.

El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena polipeptídica (por ejemplo, dos cadenas polipeptídicas), en donde la cadena polipeptídica(s) comprende dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena polipeptídica(s) puede comprender VD1-(X1)n -VD2-(X2)n -Fe, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena polipeptídica de una región Fe, X1 y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la cadena polipeptídica(s) puede comprender: cadena de la región de Fe de VH-CH1-ligador VH-CH1-flexible; o la cadena de la región Fe de VH-CH1-VH-CH1. El anticuerpo multivalente de la presente además puede comprender al menos dos (por ejemplo, cuatro) polipéptidos del dominio variable de la cadena liviana. El anticuerpo multivalente de la presente, por ejemplo, puede comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos del dominio variable de la cadena liviana. Los polipéptidos del dominio variable de la cadena liviana aquí contemplados comprende un dominio variable de cadena liviana y, opcionalmente, además comprenden un dominio CL. Anticuerpos de dominio único En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo de dominio único, que comprende una región Fe. En ciertas formas de realización, el anticuerpo de dominio único tiene una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe respecto de la IgG de tipo salvaje Un anticuerpo de dominio único es una cadena polipeptídica única que comprende el total o una porción del dominio variable de cadena pesada o el total o una porción del dominio variable de la cadena liviana de un anticuerpo. .

Modificaciones del anticuerpo En ciertas formas de realización, se contemplan las modificaciones de la secuencia de aminoácidos de las inmunoglobulinas descriptas en la presente. En ciertas formas de realización, las modificaciones comprenden una o más modificaciones de aminoácidos en las variantes de IgG de la presente invención. En ciertas formas de realización, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión in vivo y/u otras propiedades de las variantes de IgG de la presente invención. En ciertas formas de realización, modificaciones de aminoácidos comprende una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe no descriptas en la presente. Las secuencias de aminoácidos modificadas de las variantes de IgG se pueden preparar por la introducción de cambios apropiados en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo, o por la síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se pueden realizar alguna combinación de supresión, inserción, y sustitución para obtener la construcción final, con la condición que la construcción final posea las características deseadas. Las alteraciones de aminoácidos se pueden introducir en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo sujeto en el momento que se obtiene la secuencia.

Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son localizaciones preferidas para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" descripto por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Aquí, se identifican un residuo o un grupo de residuos blanco (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplaza con un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno.^ Estas localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones luego se refinan por la introducción adicional o de otras variantes, o para los sitios de sustitución. En consecuencia, mientras que el sitio de introducir una variación de la secuencia de aminoácidos variación está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio determinado, se realiza una mutagénesis de barrido de ala o aleatoria en el codón o región blanco y las inmunoglobulinas expresadas se analizan para determinar la actividad deseada.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen las fusiones de amino- y/o carboxilo-terminal que varían de extensión desde un residuo a los polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como las inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal. Otras modificaciones por inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión a los extremos N- o C terminales del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media sérica del anticuerpo.

En ciertas formas de realización, la variante de IgG de la presente invención se altera para aumentar o disminuir el grado de glicosilación del anticuerpo. La glicosilación de los polipéptidos normalmente es ligada a N o ligada a O. Ligado a N se refiere a la unión de un residuo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del residuo carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. En consecuencia, la presencia de cada una de estas secuencias tripeptídicas de un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5— hidroxilisina.

La adición o supresión de sitios de glicosilación del anticuerpo se obtiene en forma conveniente por la alteración de la secuencia de aminoácidos de modo de crear o eliminar una o más de las secuencias tripeptídicas anteriormente descriptas (para sitios de glicosilación ligados a N). La alteración también se puede realizar por la adición, supresión o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación ligados a O).

El carbohidrato unido a la región Fe de las variantes de IgG se puede alterar. Los anticuerpos nativos producidos por las células de mamífero normalmente comprenden un biantenario ramificado que en general está unido por una ligadura N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Ver, por ejemplo, Wright et al. (1997) TIBTECH 15:26-32. Los oligosacáridos pueden incluir varios carbohidratos, por ejemplo, mañosa, N-acetilglucosamina (GIcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a un GIcNAc en el "tallo" de la estructura del oligosacárido biantenario. En algunas realizaciones, las modificaciones del oligosacárido de una variante de IgG de la invención se pueden realizar a fin de crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas. En ciertas formas de realización, una variante de IgG además comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 297 a alanina.

Por ejemplo, se proporcionan modificaciones de anticuerpo que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (en forma directa o indirecta) a una región Fe. Dichas modificaciones pueden tener función de ADCC mejorada. Ver, por ejemplo, publicación de patentes estadounidenses Nos. US 2003/0157108 (Presta, L); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosiladas" o "deficientes en fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621 ; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki eí al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lec13 deficientes en la fucosilación de proteínas (Ripka er al. Arch. Biochem. Biofís. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108 A1 , Presta, L; y WO 2004/056312 A1 , Adams et al., especialmente en el Ejemplo 11 ), y líneas de células inactivadas tales como el gen de alfa— 1 ,6-fucosiltransferasa FUT8, células CHO inactivadas (ver, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. er al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y WO2003/085107).

También se proporcionan modificaciones de anticuerpos con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en el que un oligosacárido biantenario fijado a la región Fe del anticuerpo se bisecan con GIcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener fucosilación reducida y/o función de ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas modificaciones de anticuerpos, por ejemplo, en WO 2003/01 1878 (Jean-Mairet et al.); patente estadounidense No. 6.602.684 (Umana et al.); y US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan modificaciones de anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fe. Dichas modificaciones de anticuerpos pueden tener mejor función de CDC. Dichas modificaciones de anticuerpos se describen, por ejemplo, en WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).

En ciertas formas de realización, la invención modificaciones de anticuerpos que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que la convierte en una candidata deseable que para muchas aplicaciones en las que la vida media del anticuerpo in vivo es importante, ya que ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesaria o perjudiciales. En ciertas formas de realización, las actividades de Fe del anticuerpo se miden para asegurar que solo se mantienen las propiedades deseadas. Los ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo se pueden realizar para confirmar la reducción/privación de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión al receptor de Fe (FcR) se pueden realizar para asegurar que el anticuerpo carezca de la unión a FcyR (por consiguiente probablemente que carece de actividad ADCC), pero retiene la capacidad de unión al FcRn. Las células principales para la mediación de ADCC, las células NK, expresan solo Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII: La expresión de FcR en las células hematopoyéticas se sintetiza en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991 ). Los ejemplos no limitantes de los ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describe en la patente estadounidense No. 5.500.362 (ver, por ejemplo Hellstrom, I., et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5.821.337 (ver Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). En forma alternativa, se pueden emplear métodos de ensayo no radiactivos (ver, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radiactiva ACTI™ por citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96® (Promega, Madison, Wl). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células citolíticas naturales (NK). En forma alternativa o adicional, se puede evaluar la actividad de ADCC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como se describió en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Los ensayos de unión C1q también se pueden llevar a cabo para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a C1q y por consiguiente carece de actividad de CDC. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro ef al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. ef al., Blood 101 :1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). También se pueden realizar determinaciones de la unión de FcRn y la depuración/vida media in vivo usando métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).

Se proporcionan otras modificaciones de anticuerpos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan las alteraciones de la FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el título de "sustituciones preferidas". Los cambios más sustanciales, denominados "ejemplos de sustituciones" se proporcionan en la Tabla 1 , o como también se describe más adelante con referencia a las clases de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos se pueden introducir en un anticuerpo de interés y los productos se analizan, por ejemplo, para determinar una actividad deseada, tal como mejor unión al antígeno, reducción de la inmunogenicidad, mejora de ADCC o CDC, etc.

TABLA 1 Residuo Ejemplos de sustituciones Sustituciones original preferidas Ala (A) Val; Leu; lie Val Arg (R) Lys; GIn; Asn Lys Asn (N) GIn; His; Asp, Lys; Arg GIn Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser GIn (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; GIn Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; GIn; Lys; Arg Arg "e (I) Leu; Val; Met; Ala; Leu Phe; Norleucina Leu (L) Norleucina; lie; Val; He Met; Ala; Phe Lys (K) Arg; GIn; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; lie Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; He; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Residuo Ejemplos de sustituciones Sustituciones original preferidas Val (V) He; Leu; Met; Phe; Leu Ala; Norleucina Las modificaciones de las propiedades biológicas de un anticuerpo se pueden obtener por la selección de sustituciones que afectan (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio blanco, o (c) la masa de la cadena lateral. Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con las semejanzas de las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en Biochemistry, segunda ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)),: (1 ) no polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), lie (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) polar no cargado: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) (3) ácido: Asp (D), Glu (E) (4) básico: Lys (K), Arg (R), His(H) En forma alternativa, los residuos naturales se pueden dividir en grupos sobre la base de las propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras supondrán el intercambio un miembro de uno de estas clases por otra clase. Dichos residuos sustituidos también se pueden introducir en sitios de sustitución conservadora o en los sitios restantes (por ejemplo, no conservados).

Un tipo de modificaciones por sustitución involucra sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En ciertas formas de realización, el anticuerpo original es la variante de IgG contraparte tipo salvaje (por ejemplo, una variante de IgG de la invención sin ninguna alteración adicional en su secuencia de aminoácidos). En general, los anticuerpos resultantes seleccionados para posterior desarrollo tendrán propiedades biológicas modificadas (por ejemplo, mejoradas) con respecto al anticuerpo original del cual se generan. Un ejemplo de modificación por sustitución es un anticuerpo de afinidad madura, que se puede generar en forma conveniente usando técnicas de maduración de afinidad basadas en despliegue de fagos. En breves palabras, varios sitios de la región (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Los anticuerpos así generados se despliegan en las partículas del fago filamentoso como fusiones en al menos parte de una proteína de cubierta del fago (por ejemplo, el producto del gen III de M 13) empaquetado en cada partícula. Los anticuerpos desplegados en el fago luego se analizan para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión). Con el fin de identificar los sitios de la región hipervariable candidata para la modificación, se puede realizar mutagénesis de barrido (por ejemplo, barrido de alanina) para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen en forma significativa a la unión del antígeno. En forma alternativa o adicional, puede ser beneficioso analizar la estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas conocidas en la técnica, que incluyen los elaborados en la presente. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de los anticuerpos se somete a análisis usando las técnicas conocidas en la técnica, que incluyen las descriptas en la presente, y se pueden seleccionar los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para desarrollo posterior.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican la secuencia de aminoácidos del anticuerpo modificado (por ejemplo, variante de IgG modificada) se preparan por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen pero sin limitación, aislamiento de una fuente natural (en el caso de las variantes naturales de la secuencia de aminoácidos) o la preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigido al sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis de cásete de una variante preparada antes o una versión no variante del anticuerpo.

De acuerdo con esta descripción y las enseñanzas de la técnica, se contempla que en ciertas formas de realización, una modificación del anticuerpo de la invención puede comprender una o más alteraciones en comparación con la contraparte de la variante de IgG de tipo salvaje (por ejemplo, una variante de IgG de la invención sin alteración adicional en su secuencia de aminoácidos). Estas modificaciones de anticuerpo que comprenden alteraciones adicionales que no obstante retendrían sustancialmente las mismas características necesarias para utilidad terapéutica en comparación con contraparte de la variante de IgG de tipo salvaje. En ciertas formas de realización, la contraparte de la variante de IgG de tipo salvaje es una variante de bevacizumab.

En otro aspecto, la invención proporciona modificaciones de anticuerpo que comprenden modificaciones en la interfaz de los polipéptidos de Fe que comprenden la región Fe, en donde las modificaciones facilitan y/o promueven la heterodimerización. Estas modificaciones comprenden la introducción de una protuberancia en un primer polipéptido de Fe y una cavidad en un segundo polipéptido de Fe, en donde la protuberancia se puede ubicar en la cavidad para promover la formación del complejo del primer y segundo polipéptidos de Fe. Los métodos de generar anticuerpos con estas modificaciones son conocidos en la técnica, por ejemplo, se describen en la patente estadounidense No. 5.731.168.

En aún otro aspecto, se puede desear crear anticuerpos manipulados genéticamente con cisteína, por ejemplo, "tioMAbs", en los que uno p más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En ciertas formas de realización, los residuos sustituidos aparecen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir estos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos en consecuencia se ubican en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo con otros residuos, tales como residuos de fármaco o residuos de fármaco-ligador, como se describe adicionalmente en la presente. En ciertas formas de realización, alguno o más de los siguientes residuos se puede sustituir con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena liviana; A118 (numeración de EU) dé la cadena pesada; y S400 (numeración de EU) de la cadena pesada de la región Fe.

Derivados de anticuerpos En ciertas formas de realización, las variantes de IgG de la presente invención se pueden modificar para contener residuos no proteináceos adicionales que son conocidos en la técnica y fácilmente disponibles. En ciertas formas de realización, la variante de IgG puede conjugar con un agente citotóxico.

En ciertas formas de realización, la variante IgG a la que se une el agente citotóxico se incorpora en la célula, que produce aumento de eficacia terapéutica del conjugado para destruir las células cancerosas a las que se une. En una forma de realización, el agente citotóxico se dirige o interfiere al ácido nucleico en la célula cancerosa.

En ciertas formas de realización, los residuos adecuados para la derivatización del anticuerpo son polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen pero sin limitación, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1 ,3-dioxolano, poli— 1 ,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli(n— vinil pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y sus mezclas. El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas para la fabricación debida a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y si más de un polímero se une, estos pueden ser moléculas ¡guales o diferentes. En general, se puede determinar el número y/o el tipo de los polímeros usados para la derivatización sobre la base de las consideraciones que incluyen pero sin limitación, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo mejorado, si el derivado del anticuerpo se usará en una terapia en condiciones patológicas definidas, etc.

En otra forma de realización, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y residuo no proteináceo que se pueden calentar selectivamente por la exposición a la radiación. En una forma de realización, el residuo no proteináceo es un nanotubo de carbono (Kam er a/., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye pero sin limitación, longitudes de onda que no dañan las células comunes, pero que calientan el residuo no proteináceo a una temperatura en la que se destruyen las células próximas al anticuerpo-residuo no proteináceo.

Formación de variantes de IgG Las variantes de IgG se pueden formar por medio de cualquier método conocido en el arte. En ciertas formas de realización, las secuencias de variantes de IgG se usan para crear ácidos nucleicos que codifican las secuencias miembro, y que pueden clonarse en células huésped, expresarse y evaluarse, de ser deseado. Estas prácticas se llevan a cabo usando procedimientos conocidos, y una variedad de métodos que pueden ser útiles se describen en Molecular Cloning— A Laboratory Manual, 3ra Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001 ), y Current Protocole in Molecular Biology (John Wiley & Sons), que se incorporan en la presente a modo de referencia en su totalidad. Los ácidos nucleicos que codifican las variantes de IgG se pueden incorporar en un vector de expresión a fin de expresar la proteína. Los vectores de expresión incluyen en general una proteína ligada en forma operativa, es decir, se encuentran en relación funcional, con secuencias reguladoras o de control, marcadores seleccionabas, cualquier compañero de fusión y/o elementos adicionales. Las variantes de IgG se pueden producir al cultivar una célula huésped transformada con ácido nucleico, preferentemente un vector de expresión, que contiene ácido nucleico que codifica las variantes de IgG, bajo las condiciones apropiadas para inducir o causar la expresión de la proteína. Una amplia variedad de células huésped apropiadas pueden ser usadas, que incluyen sin limitaciones las células mamíferas, células de insectos, y levadura. Por ejemplo, una variedad de líneas celulares que pueden ser útiles en el catálogo de líneas celulares de ATCC, disponible por parte del Type Culture Collection, se incorporan en la presente a modo de referencia en su totalidad. Los métodos para introducir ácido nucleico exógeno en células huésped son conocidos en el arte, y varían con la célula huésped usada.

En ciertas formas de realización, las variantes de IgG se purifican o aislan después de la expresión. Los anticuerpos pueden ser aislados o purificados en una variedad de maneras conocidas por las personas versadas en el arte. Los métodos de purificación estándares incluyen técnicas cromatográficas, electroforéticas, inmunológicas, de precipitación, diálisis, filtración, concentración y cromatoenfoque. Como se conoce en el arte, una variedad de proteínas naturales unen anticuerpos, por ejemplo proteínas bacterianas A, G, y L, y estas proteínas encuentran uso en la purificación. A menudo, la purificación puede posibilitarse por medio de un compañero de fusión particular. Por ejemplo, las proteínas pueden ser purificadas usando resina glutationa si se emplea una fusión de GST, la cromatografía por afinidad de Ni+2 si se emplea His-tag, o anticuerpo anti-flag inmovilizado si se usa flag-tag. Para los lineamientos generales de las técnicas de purificación adecuadas, véase Antibody Purífication: Principies and Practice, 3ra Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994, que se incorpora a modo de referencia en la presente en su totalidad.

Cribado de IgGs Variantes Las variantes de IgG de la presente invención pueden ser cribadas usando una variedad de métodos, con inclusión, mas sin limitarse a los que usan ensayos in vitro, ensayos in vivo y ensayos basados en células, y tecnologías de selección. Las tecnologías de automatización y cribado de alto rendimiento pueden ser usadas en los procedimientos de cribado. El cribado puede emplear el uso de un compañero de fusión o etiqueta, por ejemplo, una etiqueta inmune, una etiqueta isotópica, o una etiqueta de molécula pequeña tal como una tintura fluorescente o calorimétrica.

En ciertas forma de realización, las propiedades funcionales y/o biofísicas de las variantes de IgG son examinados en ensayo in vitro. En ciertas formas de realización, la proteína es cribada en cuanto a la funcionalidad, por ejemplo, su habilidad para catalizar una reacción a su afinidad de unión a su blanco.

Un subconjunto de métodos de cribado es aquél que selecciona miembros favorables de una genoteca. Los métodos son referidos en la presente como "métodos de selección", y estos métodos encuentran uso en la presente invención para cribar las variantes de IgG. Cuando las genotecas de proteínas son cribadas usando un método de selección, solamente aquellos miembros de una genoteca que son favorables, es decir, que satisfacen algunos criterios de selección, son propagados, aislados y/u observados. Una variedad de métodos de selección es conocida en el arte, que puede encontrar uso en la presente invención para cribar genotecas de proteínas. Otros métodos de selección que pueden encontrar uso en la presente invención incluyen métodos que no dependen de la visualización, tal como métodos in vivo. Un subconjunto de métodos de selección conocidos como métodos de "evolución dirigida" son aquellos que incluyen la unión o creación de secuencias favorables durante la selección, a veces con la incorporación de nuevas mutaciones.

En ciertas formas de realización, las variantes de IgG son cribadas usando uno o más ensayos in vivo o basados en células. Para dichos ensayos, las proteínas purificadas o no purificadas se agregan típicamente de manera exógena de manera que las células se expongan a las variantes individuales o conjuntos de variantes que pertenecen a una genoteca. Estos ensayos se basan típicamente, mas no siempre, en la función de la variante de IgG; es decir, la habilidad de la variante de IgG de unirse a su blanco y mediar un evento bioquímico, por ejemplo, función efectora, inhibición de unión a ligando/receptor, apoptosis, y similares. Dichos ensayos a menudo implican monitorear la respuesta de las células a la IgG, por ejemplo proliferación celular, migración celular, angiogenesis, supervivencia celular, muerte celular, cambio en la morfología celular, o activación transcripcional tal como expresión celular de un gen natural o gen informante. Por ejemplo, dichos ensayos pueden medir la habilidad de variantes de IgG para obtener ADCC, ADCP, o CDC. Para algunos ensayos puede ser necesario agregar células o componentes adicionales, es decir, además de las células blanco, por ejemplo complemento sérico, o células efectoras tales como monocitos sanguíneos periféricos (PBMCs, del inglés Peripheral Blood Monocytes), células NK, macrófagos, y similares. Dichas células adicionales pueden ser de cualquier organismo, preferentemente humanos, ratones, ratas, conejos y monos. En ciertas formas de realización, los anticuerpos pueden inhibir angiogenesis y los métodos para monitorear dicha actividad son conocidos en el arte. En otra forma más de realización, los anticuerpos pueden causar apoptosis de ciertas líneas celulares que expresan el blanco, o pueden mediar el ataque en células blanco por parte de células inmunes que han sido agregadas en el ensayo. Los métodos para monitorear la muerte o viabilidad celular son conocidos en el arte e incluyen el uso de tinturas, reactivos inmunoquímicos, citoquímicos y radiactivos radioactivos. La activación transcripcionales también puede servir como un método para evaluar la función en ensayos basados en células. En forma alternativa, se realiza el cribado basado en células usando células que han sido transformadas o transfectadas con ácidos nucleicos que codifican las variantes. Es decir, las variantes de IgG no se agregan de manera exógena en las células.

Las propiedades biológicas de las variantes de IgG se pueden caracterizar en experimentos de células, tejidos y del organismo completo. A menudo de evalúan los fármacos en los animales, con inclusión, mas sin limitación a ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y monos, a fin de medir la eficacia del fármaco para el tratamiento contra una enfermedad o modelo de enfermedad, o para medir la farmacocinética, toxicidad del fármaco, y otras propiedades. Los animales pueden denominarse modelos de enfermedad. A menudo se evalúan los agentes terapéuticos en los ratones, con inclusión de ratones desnudos, ratones SCID, ratones injertados y ratones transgénicos (con inclusión de ratones knock-in y ratones knock-out). Dicha experimentación puede proveer datos significativos para la determinación del potencial de la proteína a ser usada como agente terapéutico. Cualquier organismo, preferentemente mamíferos, puede ser usado para la evaluación. Por ejemplo, a causa de su similitud genética con humanos, los monos pueden ser modelos terapéuticos adecuados, y por ende se pueden usar para evaluar la eficacia, toxicidad, farmacocinética u otra propiedad de las variantes de IgG. Las evaluaciones en humanos son requeridas en último lugar para la aprobación de los fármacos y, por ende, estos experimentos están contemplados. Por ende, las variantes de IgG pueden ser evaluadas en humanos para determinar su eficacia terapéutica, toxicidad, inmunogenicidad, farmacocinética y/u otras propiedades clínicas.

Usos terapéuticos de variantes de IgG Las variantes de IgG encuentran uso en un amplio rango de productos. En ciertas formas de realización, la variante de IgG es un reactivo terapéutico, de diagnóstico o de investigación. La variante de IgG puede encontrar uso en una composición de anticuerpos que es monoclonal o policlonal. En ciertas formas de realización, las variantes de IgG son usadas para bloquear, antagonizar o agonizar el antígeno blanco, tal como VEGF. En ciertas formas de realización, las variantes de IgG se usan para bloquear o neutralizar la actividad de VEGF. En una forma de realización, la actividad de VEGF es angiogenesis.

Las variantes de IgG se pueden usar para varios propósitos terapéuticos, con inclusión, mas sin limitarse a tratar pacientes con enfermedades neoplásicas y/o no-neoplásicas como se define en la presente bajo "Definiciones". En ciertas formas de realización, la enfermedad neoplásica es cáncer. En ciertas formas de realización, los pacientes se tratan primero con IgG silvestre y se tratan después con variante de IgG. En una forma de realización, los pacientes se tratan primero con bevacizumab y luego se tratan con la variante de IgG, por ejemplo, una variante de bevacizumab. En ciertas formas de realización, los pacientes se tratan con bevacizumab durante alrededor de 6 meses y luego se tratan con la variante de IgG, por ejemplo, una variante de bevacizumab.

Un número de anticuerpos y fusiones Fe que son aprobadas para uso, en ensayos clínicos, o en desarrollo, se denominan en la presente "productos y candidatos clínicos". En ciertas formas de realización, las variantes de IgG de la presente invención pueden encontrar uso en un rango de productos y candidatos clínicos. Los ejemplos de anticuerpos que pueden ser modificados incluyen, mas no se limitan a, un anticuerpo que se puede unir a un antígeno blanco tal como VEGF, EGFR (ErbB-1 ), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), CD20, IgE, CD11 , lipoproteína de baja densidad (LDL, del inglés Low Density Lipoprotein), interleuquina 4 (IL— 4), interleuquina 13 (IL-13), un epítope de hepatitis C, A-beta, IL-17A, IL-17F, DR6, DR5, un epítope de citomegalovirus humano, un epítope de staph aureus, factor del tejido, alfa4beta7 integrina, alfa5beta1 integrina, CTLA4, CD3, un epítope del RSV, NFalfa, CD147, IL8, UC18, MUC1 , alfa4beta1 (VLA-4) integrina, alfa receptor de linfotoxina, beta receptor de linfotoxina (LTBR), TGF-32, IL-12, TGF i , Eotaxinl , BAFF, TRAIL-R1 , IL15, Heparanasa I; CD40, CD154, CD80, CD23, factor de migración del macrófago ( IF, del inglés Macrophage Migration Factor), KDR, flk-1 , VE caderina, antígeno carcinoembriónico (CEA, del inglés Carcinoembryonic Antigen), CD22, CTLA4, CD30, molécula-1 de adhesión intercelular, receptor 3 de factor de crecimiento anti-fibroblasto (FGFR-3, del inglés Anti-Fibroblast Growth Factor Receptor 3), gamma interferón, IL-12, anticuerpo Ep-CAM y beta2 integrina.

Los ejemplos de productos y candidatos clínicos que se pueden modificar incluyen, mas no se limitan a, anticuerpo anti-VEGF AVASTIN® (bevacizumab, Genentech) (ver por ejemplo, la patente estadounidense No. 7.169.901 , incorporada a modo de referencia en su totalidad); anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado HERCEPTIN® (trastuzumab, Genentech) (ver por ejemplo, la patente estadounidense No. 6.489.447, incorporada en la presente a modo de referencia en su totalidad); anticuerpo anti-CD20 quimérico RITUXAN® (rituximab, IDEC/Genentech/Roche); anticuerpo anti-lgE XOLAIR® (omalizumab, Genentech); otros anticuerpos anti-CD20; anticuerpo anti-CD11a RAPTIVA® (efalizumab, Genentech/Xoma); anticuerpo anti-Her2 OMNITARG® (pertuzumab, Genentech); un anticuerpo anti-oxLDL (ver por ejemplo, la publicación estadounidense No. 20040202653 y WO 2004030607, ambas incorporadas en la presente a modo de referencia en su totalidad); anticuerpo anti-CD4 MTRX101 1A (véase, por ejemplo, la publicación WO 02/102853, incorporada en la presente a modo de referencia en su totalidad); anticuerpos biespecíficos en donde los antígenos blanco son IL— 4 y IL-13; un anticuerpo anti-HCV; un anticuerpo anti-IL-17A/F; un anticuerpo anti-A-beta; un anticuerpo anti-DR6; anticuerpo de citomegaluvirus anti-humano (HCMV, del inglés Anti-Human Cytomegalovirus); anticuerpos de la familia del receptor anti-HER; un anticuerpo del factor antitejido; anticuerpo MLN-02, un anticuerpo monoclonal IgGi humanizado a a4ß7 integrina (anteriormente LDP-02, Genentech/Millennium Pharmaceuticals); anticuerpo anti-CD 18 F(ab')2 humanizado; y un anticuerpo anti-lgE IgGi humanizado rhuMab-E25 (Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems).

Los candidatos y productos clínicos adicionales que pueden ser modificados de esta manera incluyen, mas no se limitan a, un anticuerpo anti-CD20 quimérico aprobado para tratar linfoma No Hodgkin; un anticuerpo anti-CD20 HuMax-CD20 (Genmab); anticuerpo anti-CD20 AME-133 (ver por ejemplo, patente estadounidense No. 5.500.362, incorporada a modo de referencia en su totalidad, Applied Molecular Evolution); hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel), y PRO70769 (PCT/US2003/040426, incorporadas a modo de referencia en su totalidad). Un número de anticuerpos que dirigen miembros de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico, con inclusión de EGFR (ErbB-1 ), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), también se pueden beneficiar de las modificaciones a la región Fe descrita en la presente invención. Por ejemplo, las variantes IgG pueden encontrar uso en un anticuerpo que es sustancialmente similar a ERBITUX® (cetuximab, Imclone) (patente estadounidense No. 4.943.533; WO 96/40210, ambas incorporadas a modo de referencia en su totalidad); un anticuerpo anti-EGFR quimérico en ensayos clínicos para una variedad de cánceres; ABX-EGF (patente estadounidense No. 6,235,883, incorporada a modo de referencia en su totalidad, Abgenix/lmmunex Amgen); HuMax-EGFr (solicitud de patente estadounidense No. 10/172.317, incorporada a modo de referencia en su totalidad, Genmab); 425, EMD55900, EMD62000 y EMD72000 (Merck KGaA) (patente estadounidense No. 5.558.864; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough ef al., 1991 , Protein Eng. 4(7):773-83, incorporadas a modo de referencia en su totalidad); ICR62 (Institute of Cáncer Research) (WO 95/20045; Modjtahedi eí al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1 -3):129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cáncer. 1993, 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cáncer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cáncer, 105(2):273-80, incorporadas a modo de referencia en su totalidad); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canadá and Centro de Immunologia Molecular, Cuba (patentes estadounidenses Nos. 5.891.996; 6.506.883; Mateo ef al, 1997, Immunotechnology, 3(1 ):71— 81 ), incorporadas a modo de referencia en su totalidad); mAb-806 (Ludwig Institute for Cáncer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Nati Acad Sci U S A. 100(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix, incorporada a modo de referencia en su totalidad); MR1-1 (I AX, National Cáncer Institute) (WO 0162931 A2, incorporada a modo de referencia en su totalidad); y SC100 (Scancell) (WO 01/88138, incorporada a modo de referencia en su totalidad). En ciertas formas de realización, las variantes de IgG de la presente invención pueden encontrar uso en CAMPATH® (alemtuzumab, Genzyme Corporation), un anticuerpo monoclonal humanizado actualmente aprobado para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica de linfocito B. Las variantes de IgG de la presente invención pueden encontrar uso en una variedad de anticuerpos o fusiones Fe que son sustancialmente similares a otros productos y candidatos clínicos, que incluyen, mas no se limitan a VEGF-Trap (Regeneron); muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3®), un anticuerpo anti-CD3 (Ortho Biotech/Johnson & Johnson); anticuerpo anti-CD20 ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, IDEC/Schering AG); anticuerpo anti-CD33 MYLOTARG®, un anticuerpo (proteína p67) gemtuzumab ozogamicina (Celltech/Wyeth); un anticuerpo de fusión anti-LFA-3 Fe AMEVIVE® (alefacept, Biogen); REOPRCr (abciximab, Centocor/Lilly); SIMULECT® (basiliximab, Novartis); SYNAGIS® (palivizumab, Medlmmune); anticuerpo anti-TNFalfa REMICADE® (infliximab, Centocor); anticuerpo anti-TNFalfa HUMIRA®, (adalimumab, Abbott); anticuerpo anti-TNF lgG4 humanizado HUMICADE® (Celltech); anticuerpo de fusión Fe anti-TNFalfa ENBREL® (etanercept, Immunex/Amgen); anticuerpo anti-CD147 ABX-CBL (Abgenix); anticuerpo anti-IL8 ABX-IL8 (Abgenix); anticuerpo anti-MUC18 ABX-MA1 (Abgenix); anticuerpo anti-MUC1 pemtumomab (R1549, 90Y-muH FGI ) (Antisoma); anticuerpo anti-MUC1 therex (R1550) (Antisoma); AngioMab (AS1405) (Antisoma); HuBC-1 (Antisoma); Tioplatina (AS1407) (Antisoma); TYSABRI® (anteriormente ANTEGREN®, natalizumab), un anticuerpo anti-alfa-4-beta-1 (VLA-4) y anticuerpo alfa-4-beta-7 (Biogen); anticuerpo anti-VLA-1 integrina VLA-1 mAb (Biogen); anticuerpo del receptor beta anti-linfotoxina (LTBR, . del inglés Anti-Lymphotoxin Beta Receptor) LTBR mAb (Biogen); anticuerpo anti-TGF- 2 CAT-152 (Cambridge Antibody Technology); J695, un anticuerpo anti-IL-12 (Cambridge Antibody Technology/Abbott); CAT-192, un anticuerpo anti-TGF 1 (Cambridge Antibody Technology/Genzyme); CAT-213, un anticuerpo anti-Eotaxin1 (Cambridge Antibody Technology); LYMPHOSTAT-B®, un anticuerpo anti-Blys (Cambridge Antibody Technology/ Human Genome Sciences Inc.; TRAIL-R1mAb, un anticuerpo anti-TRAIL-R1 (Cambridge Antibody Technology/Human Genome Sciences, Inc.); HUMAX-CD4, un anticuerpo ant¡-CD4 (Genmab); HuMax-IL15, un anticuerpo anti— IL15 (Genmab/Amgen); HuMax-Inflam (Genmab/ Medarex); HuMax-Cancer, un anticuerpo anti-Heparanasa I (Genmab/Medarex/Oxford GlycoSciences); HuMax-Lymphoma (Genmab/Amgen); HuMax-TAC (Genmab); IDEC-131 , anticuerpo anti-CD40L (IDEC Pharmaceuticals); IDEC-151 (clenoliximab), anticuerpo anti- CD4 (IDEC Pharmaceuticals); IDEC-114, anticuerpo anti-CD80 (IDEC Pharmaceuticals); IDEC-152, anticuerpo anti-CD23 (IDEC Pharmaceuticals); anticuerpos del factor de migración anti-macrófagos (MIF del inglés, Anti-Macrophage Migration Factor) (IDEC Pharmaceuticals); BEC2, anticuerpo anti-¡diotípico (Imclone); IMC—1C11 , anticuerpo anti-KDR (Imclone); DC101 , anticuerpo anti-flk-1 (Imclone); anticuerpos de caderina anti-VE (Imclone); CEA-CIDE® (labetuzumab), anticuerpo de antígeno anti-carcinoembriónico (CEA, del inglés Anti-Carcinoembryonic Antigen) (Immunomedics); LYMPHOCIDE® (Epratuzumab), anticuerpo anti-CD22 (Immunomedics); AFP-Cide (Immunomedics); MyelomaCide (Immunomedics); LkoCide (Immunomedics); ProstaCide (Immunomedics); MDX-010, anticuerpo anti-CTLA4 (Medarex); MDX-060, anticuerpo anti-CD30 (Medarex); MDX-070 (Medarex); MDX-018 (Medarex); OSIDEM® (IDM-1 ), anticuerpo anti-Hér2 (Medarex /Moléculas inmunodiseñadas); CNTO 148, un anticuerpo anti-TNFa (Medarex/Centocor/J&J); CNTO 1275, anticuerpo anti-citoquina (Centocor/J&J); MOR101 y MOR102, anticuerpos de molécula-1 de adhesión anti-intercelular (ICAM-1 , conocido además como CD54) (MorphoSys); MOR201 , anticuerpo del receptor 3 de factor de crecimiento anti-fibroblasto (FGFR-3, del inglés Anti-Fibroblast Growth Factor Receptor 3) (MorphoSys); NUVION® (visilizumab), anticuerpo anti-CD3 (Protein Design Labs); HuZAF®, anticuerpo anti-gamma ¡nterferón (Protein Design Labs); anticuerpos a a5ß1 integrina (Protein Design Labs); anti-IL-12 (Protein Design Labs); ING-1 , anticuerpo anti-Ep-CAM (Xoma); y MLN01 , anticuerpo anti-beta2 integrina (Xoma). Todas las referencias citadas arriba en este párrafo se incorporan expresamente en la presente a modo de referencia.

Las variantes de IgG con modificaciones en la región Fe de IgG de la presente invención se pueden incorporar en los candidatos y productos clínicos mencionados con anterioridad, o en anticuerpos y fusiones de Fe que son sustancialmente similares a los mismos. Las variantes de IgG de la presente invención también se pueden incorporar en las versiones de los candidatos y productos clínicos mencionados con anterioridad que son humanizados, madurados por afinidad, manipulados o modificados en alguna otra forma.

En ciertas formas de realización, las variantes de IgG de la presente invención pueden encontrar uso en el tratamiento de cánceres benignos, pre-cancerosos o no metastásicos; para el tratamiento de tumores latentes o micrometástasis; para Ja prevención de la reaparición del tumor o re-crecimiento; o para el tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto en riesgo de desarrollar cáncer. Por ejemplo, las variantes de IgG que comprenden modificaciones de Fe como se describen en la presente se pueden usar para terapia adyuvante para el tratamiento de un sujeto con cáncer no metastásico, después de la cirugía definitiva o para terapia neoadyuvante para el tratamiento de un sujeto con un cáncer operable donde la terapia es provista antes de la extracción quirúrgica del cáncer operable en el sujeto. Si bien las aplicaciones terapéuticas se separan por prevención, terapia neoadyuvante y terapia adyuvante, la persona versada en el arte aprecia que estas categorías no son necesariamente mutuamente exclusivas.

Clasificación de tumores Los sistemas que miden las etapas del cáncer describen hasta qué punto el cáncer se ha diseminado de manera anatómica e Intentan englobar a los pacientes con pronóstico y tratamiento similares dentro del mismo grupo. Se pueden realizar varias evaluaciones para ayudar a clasificar el cáncer, con inclusión de biopsia y ciertas pruebas de imágenes tales como rayos X en pecho, mamógramo, escaneo óseo,- escaneo CT, y escaneo MRI. Las pruebas sanguíneas y una evaluación clínica también se usan para evaluar la salud general de un paciente y detectar si el cáncer se ha diseminado a ciertos órganos.

Para clasificar el cáncer, el American Joint Committee on Cáncer primero localiza el cáncer, particularmente tumores sólidos, en una categoría de letras que usa el sistema de clasificación de TNM. Los cánceres se designan con la letra T (tamaño del tumor), N (nodulos palpables), y/o M (metástasis). T1 , T2, T3 y T4 describen el tamaño creciente de la lesión primaria; NO, N1 , N2, N3 indica que está implicado un nodulo que avanza en forma progresiva; y MO y M1 reflejan la ausencia o presencia de metástasis distante.

En el segundo método de clasificación, también conocido como agrupamiento por etapas generales {Overall Stage Grouping) o clasificación de etapas en números romanos (Román Numeral Staging), los cánceres se dividen en etapas 0 a IV, incorporando el tamaño de lesiones primarias así como también la presencia de la diseminación del nodulo y de metástasis distante. En este sistema, los casos se agrupan en cuatro etapas denotadas por los números romanos I a IV, o se clasifican como "recurrente". Para algunos cánceres, la etapa 0 se denomina "in situ" o "Tis", tal como carcinoma ductal in situ o carcinoma lobular in situ para cánceres de mama. Los adenomas de grado alto se pueden clasificar como etapa 0. En general, los cánceres de etapa I son cánceres localizados pequeños que son usualmente curables, mientras que los de etapa IV por lo general representan cáncer inoperable o metastásico. Los cánceres de etapa II y III por lo general avanzan localmente y/o exhiben la participación de nodulos linfáticos locales. En general, los números de etapas superiores indican enfermedad más extensiva, con inclusión de mayor tamaño del tumor y/o diseminación del cáncer a nodulos linfáticos cercanos y/u órganos adyacentes al tumor primario. Estas etapas se definen de manera precisa, pero la definición es diferente para cada clase de cáncer y es conocida para la persona versada en el arte.

Muchos registros de cáncer, tales como NCI's Surveillance, Epidemiology, y End Results Program (SEER), usan la clasificación por resumen. Este sistema se usa para todos los tipos de cáncer. Agrupa los casos de cáncer en cinco categorías principales: In situ es el cáncer temprano que está presente solamente en la capa de las células en las cuales ha comenzado.

Localizado es el cáncer que se limita al órgano en el cual ha comenzado, sin evidencia de diseminación.

Regional es el cáncer que se ha diseminado más allá del sitio original (primario) a los nodulos linfáticos cercanos, u órganos y tejidos.

Distante es el cáncer que se ha diseminado desde el sitio primario a los órganos distantes o nodulos linfáticos distantes.

Desconocido se usa para describir casos para los que no existe suficiente información para indicar la etapa.

Asimismo, es común que el cáncer reaparezca meses o años después de que el tumor primario ha sido extraído. El cáncer que reaparece después de que todo tumor visible haya sido erradicado, se denomina enfermedad recurrente. La enfermedad que recurre en el área del tumor primario es localmente recurrente, y la enfermedad que recurre como metástasis se denomina recurrencia distante. Un tumor latente es un tumor que existe en un estado inactivo en el cual las células tumorales están presentes pero la progresión del tumor no es clínicamente advertida. Las micrometástasis son pequeñas metástasis o un número de células que se han diseminado desde el tumor primario hacia otras partes del cuerpo. Las micrometástasis pueden o no ser detectadas én un examen o evaluación de diagnóstico. Los métodos de la invención son útiles para prevenir la aparición de tumores latentes o micrometástasis o la recurrencia del tumor, por ejemplo, en un escenario donde un tumor latente o micrometástasis se encuentran presentes pero pueden o no ser clínicamente detectados.

Los métodos de la invención también son útiles para el tratamiento de cánceres tempranos pero no se limitan a tumores benignos, pre-cancerosos o no metastásicos. Esto incluye cualquier tumor en etapa 0, I, o II; cualquier tumor de etapa no metastásica II; cualquier condición que típicamente precede o se desarrolla en un cáncer, con inclusión mas sin limitarse a, displasia, y cualquier tumor que permanece localizado en el sitio de origen y no se ha infiltrado, invadido, o metastizado a sitios distantes. Los ejemplos de tumores benignos, pre-cancerosos o no metastásicos incluyen un pólipo, adenoma, fibroma, lipoma, gastrinoma, insulinoma, condroma, osteoma, hemangioma, linfangioma, meningioma, leiomioma, rabdomioma, papiloma de célula escamosa, neuromas acústicos, neurofibroma, cistadenoma del conducto biliar, leiomiomas, mesoteliomas, teratomas, mixomas, tracomas, granulomas, hamartoma, papiloma celular transitorio, adenoma pleomórfico de la glándula salival, tumor desmolde, quiste dermoide, cistadenoma, hiperplasia nodular focal e hiperplasia nodular regenerativa.

Como la angiogenesis está implicada tanto en el crecimiento del tumor primario como en la metástasis, el tratamiento anti-angiogénico provisto por la invención es capaz de inhibir el crecimiento neoplásico del tumor en el sitio primario así como también prevenir la metástasis de tumores en los sitios, secundarios, permitiendo de esta manera el ataque de los tumores por parte de otros agentes terapéuticos.

La información adicional con respecto a las terapias adyuvante y neoadyuvantes y el tratamiento de tumores en etapa temprana se revelan en la solicitud estadounidense No. 12/002.605 y solicitud PCT/US2007/088000, cuyos contenidos se incorporan expresamente en la presente a modo de referencia.

Prevención En ciertas formas de realización, las variantes de IgG se pueden usar para el tratamiento de cánceres en etapa temprana, pre-cancerosos o benignos, o para el tratamiento o prevención de la recurrencia del tumor. En ciertas formas de realización, la variante de IgG es un anticuerpo anti-VEGF. En una forma de realización, la variante de IgG es una variante de bevacizumab. En una forma de realización, la variante de IgG comprende la regiones determinantes de complementariedad de bevacizumab. En otra forma de realización, la variante de IgG comprende el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO:1 ) y el dominio variable de cadena liviana (SEQ ID NO:2). En otra forma de realización, la variante de IgG comprende el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO:7) y el dominio variable de cadena liviana (SEQ ID NO:8).

Los métodos se pueden usar para tratar cáncer en sí mismos o para prevenir la progresión del cáncer a una etapa invasiva o metastásica o a un grado o etapa mayor. Por ejemplo, los métodos de la invención se pueden usar para tratar un sujeto con pólipos o cáncer de Etapa 0 a fin de prevenir la progresión a una Etapa I o tumor de etapa mayor. En forma similar, en un paciente que tiene cáncer de Etapa II, los métodos se pueden usar para prevenir la presión del cáncer a una Etapa III o Etapa IV.

Las variantes de IgG también se pueden usar para prevenir la recurrencia de un tumor. Por ejemplo, si un tumor ha sido identificado y tratado (por ejemplo, con quimioterapia, o ha sido extraído en forma quirúrgica), se puede usar una variante de IgG para prevenir la recurrencia del tumor colorrectal localmente o una metástasis del tumor colorrectal. Para la prevención de la recurrencia del tumor, las variantes de IgG pueden ser usadas, por ejemplo, para tratar un tumor latente o micrometástasis, o para prevenir el crecimiento o re-crecimiento de un tumor latente o micrometástasis, que pueden o no ser clínicamente detectables.

En ciertas formas de realización, variantes de IgG se pueden usar para la prevención del cáncer en un sujeto que nunca ha tenido cáncer o quien se encuentra en riesgo de desarrollar cáncer. Existe una variedad de factores de riesgo conocidos por estar asociados con el cáncer, y muchos de ellos se describen en la presente. Además, un sujeto que se conoce padece del síndrome de cáncer hereditario es considerado como en riesgo de desarrollar cáncer.

Terapia neoadyuvante La invención provee métodos de terapia neoadyuvante antes de la extracción quirúrgica del cáncer operable en un sujeto, por ejemplo, un paciente humano, que comprende administrar al paciente (por ejemplo, donde el paciente ha sido diagnosticado con un tumor y/o cáncer) una cantidad efectiva de una variante de IgG. En ciertas formas de realización, la variante de IgG es un anticuerpo anti-VEGF. En una forma de realización, la variante de IgG es una variante de bevacizumab. En una forma de realización, la variante de IgG comprende las regiones determinantes de complementariedad de bevacizumab. En otra forma de realización, la variante de IgG comprende el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO:1) y el dominio variable de cadena liviana (SEQ ID NO:2). En otra forma de realización, la variante de IgG comprende el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO:7) y el dominio variable de cadena liviana (SEQ ID NO:8).

En ciertas formas de realización, la variante de IgG se administra en combinación con al menos un agente quimioterapéutico. El paso adicional de administrar al sujeto una cantidad efectiva de una variante de IgG después de la cirugía para prevenir la recurrencia del cáncer también se puede emplear con las terapias neoadyuvantes descritas en la presente. Para los métodos que incluyen el paso adicional de administrar al sujeto una cantidad efectiva de una variante de IgG después de la cirugía, cualquiera de los métodos adyuvantes descritos en la presente pueden ser usados.

Por ejemplo, un método incluye tratar el cáncer en un sujeto, que comprende los siguientes pasos: a) una primera etapa que comprende una pluralidad de ciclos de tratamiento, en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una variante de IgG y, en forma opcional, al menos un agente quimioterapéutico a un intervalo predeterminado; b) una cirugía definitiva por la cual el cáncer es extraído; y, en forma opcional, c) una segunda etapa que comprende una pluralidad de ciclos de mantenimiento en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una variante de IgG con o sin un agente quimioterapéutico a un intervalo predeterminado.

En una forma de realización de un esquema de administración, la terapia neoadyuvante comprende un primer paso en donde una variante de IgG y uno o más agentes quimioterapéuticos son administrados a los pacientes en una pluralidad de ciclos neoadyuvantes, seguido de una cirugía para extraer definitivamente el tumor. En ciertas formas de realización, la terapia neoadyuvante dura menos de un año, en una forma de realización, menos de seis meses antes de la cirugía.

Terapia adyuvante La invención provee métodos de terapia adyuvante que comprenden administrar una variante de IgG a un sujeto con cáncer no metastásico, después de la cirugía definitiva. En ciertas formas de realización, la variante de IgG es un anticuerpo anti-VEGF. En una forma de realización, la variante de IgG es una variante de bevacizumab. En una forma de realización, la variante de IgG comprende las regiones determinantes de complementariedad de bevacizumab. En otra forma de realización, la variante de IgG comprende el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO:1 ) y el dominio variable de cadena liviana (SEQ ID NO:2). En otra forma de realización, la variante de IgG comprende el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO:7) y el dominio variable de cadena liviana (SEQ ID NO:8).

Por ejemplo, un método puede incluir los siguientes pasos: a) una primera etapa que comprende una pluralidad de ciclos de tratamiento en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una variante de IgG y, en forma opcional, al menos un agente quimioterapéutico a un intervalo predeterminado; y b) una segunda etapa que comprende una pluralidad de ciclos de mantenimiento en donde cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una variante de IgG sin un agente quimioterapéutico a un intervalo predeterminado; en donde la primera y la segunda etapa combinadas duran al menos un año después de el tratamiento postoperatorio inicial. En una forma de realización, la primera etapa comprende una primera pluralidad de ciclos de tratamiento en donde una variante de IgG y un primer régimen quimioterapéutico son administrados, seguido por una segunda pluralidad de ciclos de tratamiento en donde una variante de IgG y un segundo régimen quimioterapéutico son administrados.

La variante de IgG por lo general se administra después de un período de tiempo en el cual el sujeto se ha recuperado de la cirugía. Este período de tiempo puede incluir el período requerido para el sanado de la herida o sanado de la incisión quirúrgica, el período de tiempo requerido para reducir el riesgo de dehiscencia de la herida, o el período de tiempo requerido para que el sujeto retome un nivel de salud esencialmente similar o mejor al nivel de salud antes de la cirugía. El período entre la finalización de la cirugía definitiva y la primera administración de la variante de IgG también puede incluir el período necesario para la suspensión del fármaco, en donde el sujeto requiere un período de tiempo entre los regímenes terapéuticos. Por lo general, el período de tiempo entre la finalización de la cirugía definitiva y el comienzo de la terapia de variante de IgG puede incluir menos de una semana, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas (28 días), 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año, 2 años, 3 años, o más. En una forma de realización, el período de tiempo entre la cirugía definitiva y la administración de la variante de IgG es mayor a 4 semanas (28 días) y menor a 1 año.

En un esquema de administración, la terapia adyuvante comprende una primera etapa en donde una variante de IgG y uno o más agentes quimioterapéuticos se administran a los pacientes en una pluralidad de ciclos de tratamiento; y una segunda etapa en donde una variante de IgG se usa como un agente único en una pluralidad de ciclo de mantenimiento. En ciertas formas de realización, la variante de IgG es variante de bevacizumab y un ciclo de tratamiento puede ser de ocho semanas, lo que significa que los pacientes reciben una dosis de quimioterapia y una dosis de variante de bevacizumab cada ocho semanas. En ciertas formas de realización, el ciclo de tratamiento también puede ser de doce semanas, lo que significa que los pacientes reciben una dosis de quimioterapia y una dosis de variante de bevacizumab, cada doce semanas. En ciertas formas de realización, la terapia adyuvante dura al menos un año desde el inicio del tratamiento, y el progreso del sujeto es seguido después de ese momento. El progreso de la terapia se monitorea fácilmente mediante ensayos y técnicas convencionales.

Dosis, formulaciones y duración La composición de variante de IgG se formula, dosifica y administra en una manera consistente con buena práctica médica. Los factores para la consideración en este contexto incluyen, mas no se limitan a, el trastorno particular a ser tratado, el mamífero particular a ser tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el esquema de administración, y otros factores conocidos para los empleados médicos. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de una variante de IgG, por ejemplo, un anticuerpo, de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales) depende del tipo de enfermedad a ser tratada, el tipo de anticuerpo, la severidad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico a cargo. La variante de IgG se administra adecuadamente al paciente en un momento o en una serie de tratamientos.

Las formulaciones farmacéuticas en la presente también pueden contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular a ser tratada, preferentemente aquéllas con actividades complementarias que no se afectan una a otra en forma adversa. Dichas moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son efectivas a los fines destinados.

La "cantidad terapéuticamente efectiva" de la variante de IgG, por ejemplo, un anticuerpo, a ser administrado, será supeditada por las consideraciones discutidas en la presente, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar o tratar una enfermedad o trastorno. En ciertas formas de realización, la "cantidad terapéuticamente efectiva" de la variante de IgG a ser administrada es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar o tratar o estabilizar un cáncer benigno, precanceroso o en etapa temprana, o para tratar o prevenir la aparición o recurrencia de un tumor, un tumor latente, o una micrometástasis, por ejemplo, en un escenario de terapia neoadyuvante o adyuvante. La variante de IgG no necesita pero es opcionalmente formulada con uno o más agentes actualmente usados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de dichos otros agentes depende de la cantidad de variante de IgG presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores discutidos con anterioridad. Por lo general se usan en las mismas dosis y con vías de administración como se usó en la presente con anterioridad o alrededor de 1 a 99% de las dosificaciones empleadas. Por lo general, el alivio o tratamiento de una enfermedad o trastorno implica el alivio de uno o más síntomas o problemas médicos asociados con la enfermedad o trastorno. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede cumplir uno o una combinación de los siguientes: reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, reducir hasta cierto punto y/o detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Al punto que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o exterminar las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. En algunas formas de realización, una composición de esta invención sé puede usar para prevenir el desencadenamiento o reaparición de la enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero.

En ciertas formas de realización, la duración de la terapia continúa todo lo que se indique a nivel médico o hasta que se alcance un efecto terapéutico deseado (por ejemplo, los descritos en la presente). En ciertas formas de realización, la terapia de variante de IgG continúa durante 2 meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses, 10 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, 10 años o durante un período de años durante la vida del sujeto.

Por lo general, el alivio o tratamiento de un cáncer benigno, precanceroso o de etapa temprana o la terapia adyuvante o neoadyuvante de un cáncer (benigno o maligno) implica el alivio de uno o más síntomas o problemas médicos asociados con el cáncer. La cantidad terapéuticamente efectiva de la droga puede cumplir uno o una combinación de los siguientes (por ejemplo, en 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o más) reducir el número de células cancerosas en el tumor; reducir el tamaño del tumor, reducir la carga del tumor; inhibir (es decir, reducir hasta un punto y/o detener) la Infiltración de las células cancerosas en órganos periféricos; reducir la densidad del vaso en el tumor; inhibir la metástasis tumoral; reducir o inhibir el crecimiento tumoral o proliferación celular tumoral; reducir o prevenir el crecimiento de un tumor- latente, reducir o prevenir el crecimiento o proliferación de una micrometástasis; reducir o prevenir el re-crecimiento de un tumor después del tratamiento o extracción (por ejemplo, en terapia adyuvante); incrementar o extender el DFS o OS de un sujeto susceptible a o diagnosticado con un tumor benigno, precanceroso, o no metastásico, o un tumor maligno; reducir el tamaño de un tumor para permitir que se somete a cirugía (por ejemplo, en terapia neoadyuvante); y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En algunas formas de realización adicionales, la variante de IgG se puede usar para prevenir la aparición o recurrencia del cáncer en el sujeto.

Para la prevención o tratamiento de una enfermedad, la dosis apropiada de una variante de IgG de la invención (cuando se usa sola o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales) depende del tipo de enfermedad a ser tratada, el tipo de anticuerpo, la severidad y curso de la enfermedad, independientemente de si la variante de IgG se administra con fines preventivos o terapéuticos, la historia clínica del paciente y la respuesta a la variante de IgG, y la discreción del médico a cargo. En ciertas formas de realización, la variante de IgG se administra adecuadamente al paciente en un momento o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, alrededor de 1 pg/kg a 20 mg/kg (por ejemplo, 0.1 mg/kg-15mg/kg) de la variante de IgG puede ser una dosis candidata - inicial para administración al paciente, independientemente, por ejemplo, que sea mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica podría oscilar entre alrededor de 1 pg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados con anterioridad. Para las administraciones repetidas en varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostendría generalmente hasta que apareciera la reducción deseada de los síntomas de la enfermedad. En una forma de realización, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que se trata el cáncer, como se mide por lo métodos descritos en la presente, o conocidos en el arte. Una dosis ejemplificativa de la variante de IgG estaría en el rango de alrededor de 0,05 mg/kg a alrededor de 20 mg/kg. Por ende, una o más dosis de alrededor de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg o 15 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) puede ser administrada al paciente. Dichas dosis pueden ser administradas en forma intermitente, por ejemplo, cada tres, cada ocho o cada doce semanas (por ejemplo, de manera tal que el paciente recibe de alrededor de dos a alrededor de veinte, o por ejemplo, alrededor de seis dosis del anticuerpo). En ciertas formas de realización, se puede administrar una dosis de carga superior inicial, seguida de una o más dosis inferiores. En ciertas formas de realización, el régimen de dosificación comprende administrar una dosis de carga inicial de alrededor de 4 mg/kg, seguida por una dosis de mantenimiento semanal de alrededor de 2 mg/kg del anticuerpo. No obstante, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente mediante ensayos y técnicas convencionales.

En ciertas formas de realización, la variante de IgG es un anticuerpo anti-VEGF. En ciertas formas de realización, la variante de IgG es una variante de bevacizumab.

En ciertas formas de realización, la frecuencia de administración de la variante de IgG se reduce a comparación con la frecuencia de administración de la IgG silvestre debido a la vida media incrementada de la variante de IgG. En ciertas formas de realización, la variante de IgG se administra con menos frecuencia que la frecuencia de dosificación recomendada o prescrita de la IgG silvestre.

En ciertas formas de realización, en donde la variante de IgG es una variante de bevacizumab, la variante de IgG puede ser administrada cada 4 semanas o en intervalos mayores. En otra forma de realización, la variante de IgG puede ser administrada cada 6 semanas o más. En otra forma de realización, la variante de IgG puede ser administrada cada 8 semanas o más. En otra forma de realización, la variante de IgG puede ser administrada cada 10 semanas o más. En otra forma de realización, la variante de IgG puede ser administrada cada 12 semanas o más.

En ciertas formas de realización, la variante de IgG puede ser administrada inicialmente cada 2 semanas, y posteriormente cada 4 semanas o a intervalos mayores. En otra forma de realización, la variante de IgG puede ser administrada inicialmente cada 2-3 semanas, y posteriormente cada 6 semanas o más. En otra forma de realización, la variante de IgG puede ser administrada inicialmente cada 2-4 semanas, y posteriormente cada 8 semanas o más. En otra forma de realización, la variante de IgG puede ser administrada inicialmente cada 2-5 semanas, y posteriormente cada 10 semanas o más. En otra forma de realización, la variante de IgG puede ser administrada inicialmente cada 2-6 semanas, y posteriormente cada 12 semanas o más. En ciertas formas de realización, la variante de IgG, por ejemplo, una variante de bevacizumab, es administrada inicialmente con la frecuencia de dosificación prescrita de bevacizumab, y administrada posteriormente con menos frecuencia que la frecuencia de dosificación prescrita de bevacizumab. En ciertas formas de realización, el bevacizumab es administrado inicialmente con la frecuencia de dosificación prescrita y una variante de bevacizumab es administrada posteriormente con menos frecuencia que la frecuencia de dosificación prescrita de bevacizumab.

En ciertas formas de realización, la variante de IgG es administrada cada 14 días o a mayores intervalos. En ciertas formas de realización, la variante de IgG se administra cada 21 días o más. En ciertas formas de realización, la variante de IgG se administra cada 28 días o más. En ciertas formas de realización, la variante de IgG se administra cada 60 días o más. En ciertas formas de realización, la variante de IgG se administra cada mes o a intervalos mayores. En ciertas formas de realización, la variante de IgG se administra cada dos meses o más. En ciertas formas de realización, la variante de IgG se administra cada tres meses o más.

En ciertas formas de realización, el paciente es tratado con una combinación de la variante de IgG y uno o más otros agente(s) terapéutico(s). La administración combinada incluye la co-administración o administración concurrente, usando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única, y administración consecutiva en cualquier orden, en donde existe opcionalmente un período de tiempo mientras ambos (o todos) agentes activos ejercen sus actividades biológicas en forma simultánea. Las cantidades efectivas de agentes terapéuticos administrados en combinación con una variante de IgG dependen de la discreción del médico o veterinario. La administración y ajuste de la dosis se realiza para lograr el máximo manejo de las condiciones a ser tratadas. La dosis depende además de factores tales como el tipo de agente terapéutico a ser usado y el paciente específico que está siendo tratado. En ciertas formas de realización, las dosis adecuadas para la variante de IgG son las usados en la actualidad para su IgG silvestre y pueden ser reducidas debido a la vida media incrementada y/o la acción combinada (sinergia) de la variante de IgG y el agente terapéutico adicional usado. En ciertas formas de realización, la combinación de los inhibidores potencia la eficacia de un único inhibidor. El término "potenciar" se refiere a una mejora en la eficacia de un agente terapéutico en su dosis común o aprobada.

En ciertas formas de realización, los regímenes de dosificación discutidos en la presente se usan en combinación con un régimen quimioterapéutico. En ciertas formas de realización, el régimen quimioterapéutico implica la administración intermitente de altas dosis tradicional. En ciertas formas de realización, los agentes quimioterapéuticos se administran usando dosis más pequeñas y con más frecuencia sin descansos programados ("quimioterapia metronómica").

En ciertas formas de realización, el paciente es tratado con una combinación de la variante de IgG y uno o más agente(s) quimioterapéutico(s). En ciertas formas de realización, el agente quimioterapéutico puede ser administrado antes, o después, de la administración de la variante de IgG. En una forma de realización, el tiempo entre al menos una administración del agente quimioterapéutico y al menos una administración de la variante de IgG es de aproximadamente 1 mes o menos. En una forma de realización, el tiempo entre al menos una administración del agente quimioterapéutico y al menos una administración de la variante de IgG es aproximadamente 2 semanas o menos. Alternativamente, el agente quimioterapéutico y la variante de IgG son administrados concurrentemente al paciente, en una única formulación o formulaciones separadas. El tratamiento con la combinación del agente quimioterapéutico y la variante de IgG puede generar un beneficio terapéutico sinérgico, más que aditivo, al paciente.

De administrarse, el agente quimioterapéutico se administra por lo general en dosis conocidas, u opcionalmente reducidas debido a la acción combinada de los fármacos o efectos colaterales negativos atribuibles a la administración del agente quimioterapéutico de antimetabolito. La preparación y esquemas de dosificación para dichos agentes quimioterapéuticos se pueden usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como lo determine empíricamente el profesional a cargo.

Varios agentes quimioterapéuticos que pueden ser combinados se revelan en la presente, por ejemplo, bajo las Definiciones. Los ejemplos de los agentes quimioterapéuticos a ser combinados con la variante de IgG incluyen, mas no se limitan a, por ejemplo, un taxoide (con inclusión de docetaxel y paclitaxel), vinca (tal como vinorelbina o vinblastina), compuesto de platino (tal como carboplatino o cisplatino), inhibidor de aromatasa (tal como letrozol, anastrazol o exemestano), anti-estrógeno (por ejemplo fulvestrant o tamoxifeno), etopósido, tiotepa, ciclofosfamida, metotrexato, doxorubicina liposomal, doxorubicina liposomal pegilada, capecitabina, gemcitabina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), o inhibidor de proteosoma (por ejemplo PS342). Se pueden administrar "cócteles" de diferentes agentes quimioterapéuticos.

El progreso de la terapia de la invención es fácilmente monitoreado por ensayos y técnicas convencionales.

En ciertas formas de realización, el tratamiento o prevención de la aparición o recurrencia de un tumor, un tumor latente, o. una micrometástasis implica la prevención de la formación del tumor o metástasis, en general después del tratamiento inicial o extracción de un tumor (por ejemplo, usando una terapia anticáncer tal como cirugía, quimioterapia o terapia por radiación). La cirugía puede dejar atrás células tumorales residuales, o nodulos micrometastásicos latentes, que tienen el potencial de reactivar el "programa angiogénico" y facilitar el crecimiento tumoral más exponencial. Si bien la presencia de un tumor latente o micrometástasis no es necesariamente detectable usando mediciones y exámenes clínicos, una cantidad terapéuticamente efectiva es aquélla que es suficiente para prevenir o reducir la detección del tumor latente, micrometástasis, metástasis, o recurrencia tumoral usando técnicas conocidas para el médico. En un ejemplo, un sujeto que es tratado por un tumor al extraer de manera quirúrgica el tumor es tratado luego con una variante de IgG y monitoreado en el tiempo en cuanto a la detección de un tumor latente, micrometástasis, o recurrencia tumoral. La variante de IgG, por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF, se puede administrar en combinación con otra terapia anti-cáncer (por ejemplo, antes de, junto con, o después de la variante de IgG) y una o más terapias pueden continuar como terapia de mantenimiento.

Las mediciones adicionales de eficacia terapéutica en el tratamiento de cánceres se describen en la publicación de solicitud de patente estadounidense No. 20050186208.

La variante de IgG de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) puede ser administrado por cualquier medio adecuado, con inclusión de administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intracerobroespinal, intrapulmonar e intranasal, y, si se desea tratamiento local, administración intralesional. La infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, ¡ntraarterial, intraperitoneal o subcutánea. En ciertas formas de realización, la variante de IgG, por ejemplo, un anticuerpo, se administra en forma adecuada por infusión de pulso, particularmente con dosis reducida de la variante de IgG. La dosificación puede realizarse por cualquier vía adecuada, por ejemplo mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo den parte de si la administración es breve o crónica. En ciertas formas de realización, la variante de IgG se administra a un sujeto en forma intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusión continua en un período de tiempo.

La localización del blanco de unión de una variante de IgG, por ejemplo, un anticuerpo, de la invención puede ser tenida en cuenta al preparar y administrar la variante de IgG. Cuando el blanco de unión de una variante de IgG está localizado en el cerebro, ciertas formas de realización de la invención proveen la variante de IgG para atravesar la barrera sangre-cerebro. En el arte existen varios enfoques conocidos para transportar moléculas a través de la barrera sangre-cerebro, con inclusión, mas sin limitación de métodos físicos, métodos basados en lípidos, métodos basados en células madre y métodos basados en canales y receptores.

Los métodos físicos para transportar una variante de IgG, por ejemplo, un anticuerpo, a través de la barrera sangre-cerebro incluyen, mas no se limitan a, circunvenir la barrera sangre-cerebro en forma completa, o creando aberturas en la barrera sangre-cerebro. Los métodos de circunvención incluyen, mas no se limitan a, inyección directa en el cerebro (véase, por ejemplo, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)), infusión intersticial / suministro afianzado por convección (véase, por ejemplo, Bobo et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 2076-2080 (1994)), e implante de un dispositivo de suministro en el cerebro (véase, por ejemplo, Gilí et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); y Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical). Los métodos para crear aberturas en la barrera incluyen, mas no se limitan a, ultrasonido (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense No. 2002/0038086), presión osmótica (por ejemplo, por administración de manitol hipertónico (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)), permeabilización por, por ejemplo, bradiquinina o permeabilizador A-7 (véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 5.112.596, 5.268.164, 5.506.206, y 5.686.416), y transfección de neuronas que atraviesan la barrera sangre-cerebro con vectores que contienen genes que codifican la variante de IgG (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense No. 2003/0083299).

. Los métodos basados en lípidos para transportar una variante de IgG, por ejemplo, un anticuerpo, a través de la barrera sangre-cerebro incluyen, mas no se limitan a, encapsular la variante de IgG en liposomas que se acoplan a los fragmentos de unión a anticuerpo que se unen a receptores en el endotelio vascular de la barrera sangre-cerebro (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud patente estadounidense No. 20020025313), y cubren la variante de IgG en partículas lipoproteicas de baja densidad (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense No. 20040204354) o apolipoproteína E (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense No. 20040131692).

Los métodos basados en células madre para transportar una variante de IgG, por ejemplo, un anticuerpo, a través de la barrera sangre-cerebro abarcan células progenitoras neurales (NPCs, del inglés Neural Progenitor Cells) genéticamente manipuladas para expresar el anticuerpo de interés y luego implantar las células madre en el cerebro del individuo a ser tratado. Véase, Behrstock et al. (2005) Gene Ther. 15 Dec. 2005, publicación adelantada en línea (que informa que las NPCs genéticamente manipuladas para expresar el factor neurotrófico GDNF redujeron los síntomas de la enfermedad de Parkinson cuando se implantaron en los cerebros de modelos roedores y primates).

Los métodos basados en canales y receptores para transportar una variante de IgG, por ejemplo, un anticuerpo, a través de la barrera sangre-cerebro incluyen, mas no se limitan a, usar bloqueadores glucocorticoides para incrementar la permeabilidad de la barrera sangre-cerebro (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense No. 2002/0065259, la No. 2003/0162695 y la No. 2005/0124533); activar los canales de potasio (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense No. 2005/0089473), inhibir los transportadores de fármacos ABC (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense No. 2003/0073713); cubrir los anticuerpos con una transferían y modular la actividad de uno o más de los receptores de transferrina (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense No. 2003/0129186), y cationizar los anticuerpos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.004.697).

Las formulaciones farmacéuticas que comprenden una variante de IgG, por ejemplo, un anticuerpo, de la invención se preparan para almacenamiento al mezclar la variante de IgG que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables óptimos (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20ma edición (2000)), en la forma de soluciones acuosas, liofilizadas u otras formulaciones secas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones de formación de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o agentes tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

Los ingredientes activos también pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización . interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y poli— (metilmetacilato) microcápsula, respectivamente, en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se revelan en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20ma edición (2000).

Las formulaciones a ser usadas para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por . medio de la filtración a través de membranas de filtración estériles.

Las preparaciones de liberación sostenida pueden ser preparadas. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la invención, cuyas matrices están en la forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de las matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente estadounidense No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradaba, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido glicólicc— ácido láctico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Si bien los polímeros tales como acetato de etileno-vinilo y ácido glicólico-ácido láctico permiten la liberación de moléculas en más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando las inmunoglobulinas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un tiempo largo, pueden desnaturalizarse o acumularse como resultado de exposición a humedad a 37 °C, lo que genera la pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Las estrategias racionales pueden ser contempladas para la estabilización, dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de acumulación es formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, la estabilización se puede alcanzar por modificación de los residuos de sulfhidrilo, liofilización a partir de soluciones ácidas, control del contenido de humedad, uso de aditivos apropiados y desarrollo de composiciones de matrices de polímeros específicas.

Eficacia del tratamiento La eficacia de las variantes de IgG se puede medir en varias formas, que incluyen mas no se limitan a los medios descritos en la presente bajo "Definiciones". Por ejemplo, la eficacia para tratar el tumor se puede medir al detectar la habilidad de una variante de IgG para inhibir o reducir el crecimiento o metástasis del tumor. En ciertas formas de realización, una variante de IgG tienen mayor eficacia a comparación con una IgG silvestre si la variante de IgG es capaz de reducir la velocidad del crecimiento tumoral a comparación con el crecimiento tumoral alcanzado con el tratamiento usando IgG silvestre. En ciertas formas de realización, una variante de IgG tiene mayor eficacia a comparación con la IgG silvestre si la variante de IgG puede alcanzar máxima inhibición de crecimiento tumoral a una dosis de IgG inferior que la dosis necesaria para que la IgG silvestre alcance la misma inhibición máxima del crecimiento del tumor. En ciertas formas de realización, una variante de IgG tiene mayor eficacia a comparación con la IgG silvestre si la variante de IgG tiene la habilidad de inhibir o reducir el crecimiento o metástasis de células cancerosas a una dosis de IgG inferior que la dosis necesaria para la IgG silvestre. En ciertas formas de realización, las variantes de IgG de la presente invención tienen igual o mayor eficacia a comparación con las IgGs silvestres. En ciertas formas de realización, las variantes de IgG de la presente invención no tienen menor eficacia a comparación con las IgGs silvestres.

La eficacia del tratamiento de la invención también se puede medir mediante varios puntos de referencia comúnmente usados para evaluar trastornos neoplásicos o no neoplásicos. Por ejemplo, los tratamientos del cáncer pueden ser evaluados mediante, por ejemplo, mas sin limitarse a, regresión tumoral, peso del tumor o reducción del tamaño, tiempo del progreso, duración de la supervivencia, supervivencia libre de progresión, velocidad de respuesta general, duración de la respuesta, calidad de vida, expresión y/o actividad proteicas. Como ciertos agentes descritos en la presente, tales como agentes anti-angiogénicos, se dirigen a la vasculatura del tumor y no necesariamente a las células neoplásicas en sí mismas, los mismos representan una clase única de fármacos anti-cáncer, y por ende pueden necesitar medidas únicas y definiciones de respuestas clínicas a fármacos. Por ejemplo, la reducción del tumor de más del 50% en un análisis bidimensional es el corte estándar para declarar una respuesta. No obstante, los inhibidores de la invención pueden causar inhibición de la diseminación metastásica sin reducción del tumor primario, o pueden simplemente ejercer un efecto tumoristático. Por consiguiente, se pueden emplear los enfoques para determinar la eficacia de la terapia, con inclusión de, por ejemplo, medición de marcadores urinarios o plasmáticos de angiogenesis y medición de respuesta a través de imágenes radiológicas.

Terapias de combinación Los agentes terapéuticos descritos en la presente se pueden administrar con otros agentes terapéuticos en forma concomitante, es decir, los agentes terapéuticos descritos en la presente pueden ser co-administrados con otras terapias o agentes terapéuticos que incluyen, por ejemplo, moléculas pequeñas, otros agentes biológicos, terapia de radiación, cirugía, etc.

En ciertas formas de realización, una variante de IgG es el único agente terapéuticamente activo administrado a un paciente. En ciertas formas de realización, la variante de IgG se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos, que incluyen, mas no se limitan a agentes anti-angiogénicos, agentes quimioterapéuticos, citoquinas, agentes inhibidores del crecimiento, agentes anti-hormonales, inhibidores de kinasa, agentes citotóxicos, cardioprotectores u otros agentes terapéuticos. Las variantes IgG pueden ser administradas en forma concomitante con uno o más de otros regímenes terapéuticos. En ciertas formas de realización, la variante de IgG puede ser administrada en conjunto con uno o más anticuerpos, que pueden o no ser una variante de IgG. En ciertas formas de realización, las variantes de IgG se pueden emplear en combinación con incluso otras técnicas terapéuticas tales como cirugía.

En ciertas formas de realización, también se pueden administrar agentes adicionales - por ejemplo, agentes anti-cáncer o agentes terapéuticos, o agentes anti-angiogenesis - en combinación con una variante de IgG para tratar varias condiciones neoplásicas o no neoplásicas. En una forma de realización, la condición neoplásica o no neoplásica se caracteriza por un trastorno patológico asociado con angiogenesis aberrante o indeseada. Las variantes de IgG de la invención se pueden administrar en serie o en combinación con otro agente que es efectivo para dichos fines, ya sea en la misma composición o como composiciones separadas usando las mismas vías de administración, o diferentes.

La terapia anti-angiogénica en relación con el cáncer es una estrategia para el tratamiento del cáncer que apunta a inhibir el desarrollo de los vasos sanguíneos tumorales necesarios para proveer los nutrientes para sustentar el crecimiento tumoral. En ciertas formas de realización, como la angiogenesis participa tanto en el crecimiento del tumor primario como en la metástasis, el tratamiento anti-angiogénico provisto por la invención es capaz de inhibir el crecimiento neoplásico del tumor en el sitio primario así como también prevenir la metástasis de tumores en sitios secundarios, permitiendo así el ataque de los tumores por parte de otros terapéuticos. En una forma de realización de la invención, el agente anti-cáncer o agente terapéutico es un agente anti-angiogénico. En otra forma de realización, el agente anti-cáncer es un agente quimioterapéutico.

Muchos agentes anti-angiogénicos han sido identificados y son conocidos en el arte, con inclusión de los listados en la presente, por ejemplo, bajo el título de "Definiciones", y por, por ejemplo, Carmeliet y Jain, Nature 407:249-257 (2000); Ferrara et al., Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004); y Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003). Véase, además, la publicación de patente estadounidense No. 20030055006. En ciertas formas de realización, dos o más inhibidores de angiogenesis pueden opcionalmente co-administrarse al paciente además de la variante de IgG de la invención.

En ciertas formas de realización, otros agentes terapéuticos que pueden combinarse con la variante de IgG son el antagonista de VEGF o antagonistas del receptor VEGF. En ciertas formas de realización, otros agentes terapéuticos útiles para la terapia tumoral de combinación con la variante de IgG incluyen antagonistas de otros factores que participan en el crecimiento tumoral, tales como EGFR, ErbB2 (conocido también como Her2) ErbB3, ErbB4, o TNF. En ciertas formas de realización, la variante de IgG se puede usar en combinación con inhibidores de receptor de tirosina kinasa (RTKIs, del inglés Receptor Tyrosine Kinase ¡nhibitors) de moléculas pequeñas que dirigen una o más receptores de tirosina kinasa tales como receptores de VEGF, receptores de FGF, receptores de EGF y receptores de PDGF. Muchos RTKIs de moléculas pequeñas terapéuticos son conocidos en el arte, con inclusión de, mas sin limitarse a, vatalanib (PTK787), erlotinib (TARCEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, sunitinib (SUTENT®), semaxanib (SU5416), AMG706, AG013736, Imatinib (GLEEVEC®), MLN-518, CEP-701 , PKC- 412, Lapatinib (GSK572016), VELCADE®, AZD2171 , sorafenib (NEXAVAR®), XL880, y CHIR-265.

La invención también contempla el uso de una combinación de dos o más variantes de IgG de la invención o la combinación de al menos una variante de IgG con una o más terapias anti-cáncer adicionales. Los ejemplos de terapias anti-cáncer incluyen, sin limitación, cirugía, terapia de radiación (radioterapia), bioterapia, inmunoterapia, quimioterapia o una combinación de estas terapias. En una forma de realización, la terapia anti-cáncer para el cáncer de próstata, cáncer de ovario y cáncer de mama puede ser una terapia de hormonas. Además, los agentes citotóxicos, agentes anti-angiogénicos y agentes anti-proliferativos se pueden usar en combinación con la variante de IgG. En ciertas formas de realización, una variante de IgG se administra al paciente junto con quimioterapia, terapia de radiación, o tanto quimioterapia como terapia de radiación.

En ciertas formas de realización, la variante de IgG se usa como terapia adyuvante para el tratamiento de cáncer no metastásicoo después de la cirugía definitiva. En este ejemplo, la variante de IgG puede estar provista con o sin . al menos un agente quimioterapéutico adicional.

En ciertas formas de realización, la variante de IgG se usa como terapia neoadyuvante para el tratamiento de un cáncer operable antes de la cirugía. En este ejemplo, la variante de IgG puede estar provista antes de la cirugía con o sin al menos un agente quimioterapéutico adicional.

En ciertas formas de realización, la variante de IgG y dichos uno o más otros agentes terapéuticos se pueden administrar en forma simultánea o secuencial en una cantidad y por un tiempo suficientes para reducir o eliminar la aparición o recurrencia de un tumor, un tumor latentes, o una micrometástasis. La variante de IgG y dichos uno o más otros agentes terapéuticos se pueden administrar como terapia de mantenimiento para prevenir o reducir la posibilidad de recurrencia del tumor.

En ciertas formas de realización, la invención contempla el uso de una variante de IgG con uno o más agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, un cóctel). Los ejemplos no limitativos de agentes quimioterapéuticos se describen en la presente bajo el título de "Definiciones". Los esquemas de preparación y dosificación para dichos agentes quimioterapéuticos se pueden usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante o se pueden determinar empíricamente por parte del profesional versado en el arte; véase , además, la sección intitulada "Dosis, Formulaciones y Duración".

Artículos fabricados En otro aspecto de la invención, se provee un artículo fabricado que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos con anterioridad. El artículo fabricado comprende un contenedor y una etiqueta o rótulo sobre o asociado con el contenedor. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los contenedores se pueden formar a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El contenedor aloja una composición que es en sí misma o combinada con otra composición, efectiva para tratar, prevenir y/o diagnosticar la condición y que puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa o saco de solución intravenosa que tiene un sello perforable por una aguja de inyección hipodérmica). La etiqueta o rótulo indica que la composición se usa para tratar la condición elegida. En ciertas formas de realización, el artículo fabricado puede comprender (a) un primer contenedor con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende una variante de IgG de la invención; y (b) un segundo contenedor con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un agente citotóxico adicional u otro agente terapéutico. El artículo fabricado puede comprender, además, un rótulo que indica que las composiciones se pueden usar para tratar una condición particular. En forma alternativa, o en forma adicional, el artículo fabricado puede comprender, además, un segundo (o tercer) contenedor que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, del inglés Bacteriostatic Water For Injection), solución salina tamponada en fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, con inclusión de otros tampones, diluyentes, filtros; agujas y jeringas.

En ciertas formas de realización, la variante de IgG se puede envasar sola „ o en combinación con otros compuestos terapéuticos como un kit. En una forma de realización, el compuesto terapéutico es un agente anti-cáncer. El kit puede incluir componentes opcionales que ayudan a la administración de la dosis unitaria a los pacientes, tales como frascos para reconstituir formas en polvo, jeringas para inyección, sistemas de suministro IV a medida, inhaladores, etc. En forma adicional, el kit de dosis unitaria puede contener instrucciones para la preparación y administración de las composiciones. El kit puede ser fabricado como una dosis unitaria para uso único para un paciente, múltiples usos para un paciente particular (a una dosis constante o en la cual los compuestos individuales pueden variar en potencia a medida que progresa la terapia); o el kit puede contener múltiples dosis adecuadas para la administración a múltiples pacientes ("envase a granel"). Los componentes del kit pueden estar integrados en cartones, envases blíster, botellas, tubos y similares.

EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que otras varias formas de realización pueden ser llevadas a la práctica, dada la descripción general provista con anterioridad.

Ejemplo 1 : Producción de variantes de anti-VEGF (Bevacizumab) Las regiones Fv de IgGi de anti-VEGF silvestre (Bevacizumab) pesada y liviana se clonaron en forma separada en dos plásmidos de transfección transitoria basados en pRK que contenían dominios constantes de IgGi humana. La mutagenesis dirigida a sitio basada en Kunkel se usó luego para generar todas las variantes de IgGi de anti-VEGF en las cuales mutaron los dominios CH2 y CH3. Las variantes de anti-VEGF generadas en este estudio se resumen en la Tabla 2 a continuación. Cada variante contiene mutaciones ya sea simples, dobles o triples en los dominios CH2 y CH3. Las variantes se enumeran de acuerdo con el índice ELI como en Kabat.

Tabla 2 Variante de IgGi T307Q A378V N434A N434H N434S Y436I T307Q/A378V T307Q/N434A T307Q/N434S T307Q/Y436I T307Q/A378V/Y436I T307Q/E380A/N434S V308P/N434A N434A/Y436I Los plásmidos que contenían la cadena liviana silvestre y cadena pesada de las variantes se co-transfectaron en línea celular de riñon embriónico humano adenovirus-transformado 293 de FUGENE® (Roche, Basel, Switzerland) de acuerdo con el protocolo de fabricación. Después de 24 horas de incubación con los complejos de transfección, las células transfectadas fueron luego cultivadas ya sea con medio PS04 libre de suero complementado con 10mg/L de insulina y oligoelementos durante 5 días o 1 ,3X de medio GEM N con 5mM de glutamina. Se recolectó el sobrenadante, y se acondicionó con 1M TRIS pH 8,0 y 5M cloruro de sodio (NaCI) para obtener una concentración final de 30mM TRIS y 50mM NaCI. El sobrenadante acondicionado se purificó luego usando cromatografía de Proteína A. La Igd unida se eludió de la columna de Proteína A con 0,1 M tampón de glicina, pH 3,0. A continuación, la IgG-i purificada se concentró y se inyectó en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño Superdex-200 para extraer cualquier agregado. Las fracciones de IgGi monoméricas fueron reunidas y usadas posteriormente para los estudios de unión. Las concentraciones de variantes de IgGi de anti-VEGF y anti-VEGF silvestres se calcularon usando lectura de absorbancia a 280nM, y se estimó una absorbencia de 1 ,5 de 1 mg/ml de lgGi .

Ejemplo 2: Producción de FcRn de mono cinomolqo (cvnó) y humano El FcRn humano es un heterodímero de una cadena alfa y una subunidad de P2-microglobulina. Estas dos subunidades se clonaron por separado en dos plásmidos de transfeccion transitoria basados en pRK. Los plásmidos que contenían tanto la cadena alfa como la P2-microglobulina se co-transfectaron en 293 células usando FUGENE® (Roche, Basel, Switzerland) de acuerdo con el protocolo de fabricación. Después de 24 horas de incubación con los complejos de transfeccion, la célula transfectada fue luego cambiada a medio PS04 libre de suero complementado con 10mg/L de insulina y oligoelementos durante 5 días. El sobrenadante recolectado se filtró, y se acondicionó con 1 M ácido clorhídrico y 5M NaCI para obtener un pH final de 6,0 y una concentración de 50mM NaCI. El sobrenadante acondicionado se purificó usando cromatografía de IgG-sefarosa. El FcRn unido se eluyó de la columna usando un tampón de pH 8,0 que contenía 30mM TRIS y 150mM NaCI. El FcRn eludido se purificó además usando una columna de cromatografía de exclusión de tamaño Superdex-75 para extraer cualquier agregado. La concentración de FcRn se calculó usando lectura de absorbancia a 280nM, y una absorbancia de 1 ,9 correspondió a 1 mg/ml de FcRn.

El FcRn de mono cinomolgo se produjo y purificó de manera similar al FcRn de humano, salvo que se usaron para la transfección plásmidos que contenían la cadena alfa de mono cinomolgo y P2-microglobulina de mono cinomolgo.

Ejemplo 3: estudios de unión de FcRn: Invección de variantes de IqGi en FcRn La unión de las variantes anti-VEGF contra FcRn humano fue estudiada por resonancia de plasmón de superficie usando un instrumento BIAcore 3000 (GE healthcare, Piscataway, NJ). El FcRn humano fue acoplado al chip sensor usando un kit de acoplamiento de amina. Específicamente, el chip sensor CM5 fue activado con EDC/NHS durante 7min a dµ?/min. Se inyectó 100µg/ml de FcRn humano durante 30 segundos a 2 minutos a una velocidad de flujo de ??µ?/min en un chip activado para brindar una unidad de respuesta (RU) de unión máxima de 50 a 200. Después de la conjugación, el chip acoplado a FcRn fue bloqueado por una inyección de 35µ? de clorhidrato de etanolamina 1 M a 5µ?/?-???.

Se determinó la unión de las variantes de anti-VEGF y anti-VEGF silvestres (WT, del inglés Wild-Type) a FcRn humano a pH 6,0 o pH 7,4. El tampón usado para el experimento de unión es PBS de pH 6,0 o pH 7,4 que contiene 0,01 % de P20 y 0,02% de azida de sodio. Las variantes de anti-VEGF (Bevacizumab) y anti-VEGF WT fueron intercambiadas por tampón en tampón de pH 6,0 o pH 7,4. Todos los experimentos se realizaron a 25 °C. Para la tanda de pH 6,0, las variantes, con concentraciones entre 15µ? y 0,7nM, fluyeron sobre un chip cubierto de FcRn a 30µ?/p?? durante varias veces para alcanzar un estado estable y luego se dejaron disociar del chip durante 5min. Para la tanda de pH 7,4, las variantes, con concentraciones entre 30µ? y 30nM, se inyectaron en el chip cubierto de FcRn a 20µ?/???? durante varias veces para alcanzar un estado estable y luego se liberaron durante 2min. Las variantes también fluyeron sobre una mancha no conjugada sobre el chip sensor para permitir la sustracción de la unión no específica de fondo de la unión al chip acoplado a FcRn. El chip se regeneró con pulso de 30 segundos de 0,1 M TRIS pH 8,3 entre inyecciones. La RU en estado estable para cada inyección se registró al final de cada fase de inyección, y luego se estimaron la constantes de disociación aparentes (KD aparente) como las concentraciones de IgG que alcanzaron 50% de RU máxima.

Los resultados en la Figura 1A y 1B, generados de dos tandas diferentes, muestran que todas las variantes tienen afinidad de FcRn mejorada sobre las silvestres a pH de 6. Los estimativos de las constantes de disociación aparentes (KD) se ilustran en la Figura 2. Como la densidad de acoplamiento a FcRn difirió para las dos tandas, el nivel de avidez fue diferente, lo que generó valores KD aparentes ligeramente diferentes para la misma variante. Sin embargo, el ranking de afinidad de estas variantes permaneció igual para las diferentes tandas. La Figura 3 muestra que todas las variantes de anti-VEGF evaluadas exhibieron mayor unión de pH neutro al FcRn humano a comparación de las silvestres. El ranking de afinidad de las variantes basado en unión de pH 7,4 correspondió con el ranking de afinidad determinado usando unión de pH 6.

Tabla 3 Variante de IgGi N434H T307Q/N434A T307Q/N434S T307Q/E380A/N434S V308P/N434A La unión de FcRn de mono cinomolgo y de humano de las variantes de anti-VEGF y anti-VEGF silvestres (WT) ilustrada en la Tabla 3 se evalúa adicionalmente usando este formato de ensayo. El FcRn de mono cinomolgo y de humano se cubrió sobre chips sensores. Las variantes de anti-VEGF y anti-VEGF silvestres (WT) fueron inyectadas en los chips cubiertos de FcRn a 25 °C ya sea en tampón de pH 6,0 o de pH 7,4. Las unidades de respuesta de estado estable se registraron y trazaron como una función de las concentraciones de las inyecciones. Todas las variantes de anti-VEGF mostraron unión mejorada a FcRn de mono cinomolgo y humano por sobre los anti-VEGF silvestres tanto en pH 6,0 como pH 7,4 (ver la Fig. 4A-4D). El ranking de afinidad para las variantes de anti-VEGF determinado en este ensayo fue el mismo que el ranking determinado usando KD monovalente.

El unión a FcRn humano de las variantes anti-HER2 y anti-HER2 silvestres (WT) ilustradas en la Figura 26 también fueron evaluadas usando este formato de ensayo. Las variantes estudiadas en la Figura 26 son L251A, L314A, L314D, L314K, E430A, E430K, L251 D/N434H y L314D/N434H. El FcRn humano se cubrió sobre chips sensores. Las variantes anti-HER2 y anti-HER2 silvestres fueron inyectadas en los chips cubiertos de FcRn a 25 °C en tampones con pH de 6,0 a 7,2. Las unidades de respuesta en estado estable se registraron y trazaron como una función de concentraciones de las inyecciones para cada pH. Las afinidades de cada variante y silvestre fueron estimadas luego para cada pH de inyección, y la proporción de afinidad de la variante con respecto al silvestre fue trazada como una función del pH -en la Figura 26. Las proporciones de afinidad para las variantes E430A, E430K y L251 D/N434H se reducen con pH creciente; mientras que las proporciones de afinidad para todas las otras variantes se incrementan con pH creciente.

La uniones de IgGi de anti-HER2 (traztuzumab) silvestre, variante T307Q/N434A, variante L251 D/T307Q/N434H y variante L251 D/T307Q/M428L/N434H/Y436I con FcRn humano a pH 6,0 (Fig. 27 A), pH 7,1 (Fig. 27B), y pH 7,4 (Fig. 27C) se evaluaron también usando un formato de ensayo similar. Las variantes de anti-HER2 y anti-HER2 silvestres se inyectaron en los chips cubiertos de FcRn a 25 °C en tampón de pH 6,0, pH 7,1 o pH 7,4. Las unidades de respuesta en estado estable se registraron y trazaron como una función de las concentraciones de las inyecciones para cada variante. Los resultados muestran que a pH 6,0 (Fig. 27 A), la variante L251 D/T307Q/N434H tiene afinidad de FcRn similar al silvestre, y la variante L251 D/T307Q/M428L/N434H Y436I tiene afinidad de FcRn similar a la variante T307Q/N434A. A pH 7.1 (Fig. 27B), la variante L251 D/T307Q/N434H tiene afinidad de FcRn mucho más inferior que el tipo silvestre; y la variante L251 D/T307Q/M428L/N434H Y436I tiene afinidad de FcRn similar al silvestre y afinidad de FcRn mucho más inferior que la variante T307Q/N434A. A pH 7,4 (Fig. 27C), la variante L251 Dn"307Q/M428L/N434H/Y436l tiene afinidad de FcRn menor que el tipo silvestre y la variante T307Q/N434A.

Ejemplo 4: Estudios de unión a FcRn: Invección de FcRn de mono cinomolqo o de humano en variantes de IqGi En el formato de unión que usa un instrumento BIAcore 3000 (GE healthcare, Piscataway, NJ), se conjugaron las variantes de anti-VEGF y anti-VEGF silvestres (Bevacizumab) con diferentes células de flujo del chip sensor usando una kit de acoplamiento de amina. Específicamente, se activó un chip sensor CM5 con EDC/NHS durante 7 min a dµ?/????. Se inyectaron 10 a d?µ?/??? de anticuerpos durante 30 segundos a 2 minutos a una velocidad de flujo de ??µ?/min en el chip activado para brindar una unidad de respuesta (RU) de unión máxima de 50 a 200. Después de la conjugación, el chip acoplado a FcRn fue bloqueado por una inyección de 35µ? de clorhidrato de etanolamina 1 M A 5µ?/????.

El tampón para los experimentos de unión fue PBS de pH 6,0/0,01 % P20/0,02% azida de sodio (NaN3). Las diluciones de FcRn de mono cinomolgo o de humano solubles de 20 µ? a 0,15 nM fueron inyectadas a una velocidad de flujo de 30µ?/???? durante 10 min en el chip sensor cubierto por anticuerpo a 25 °C. Las RUs en estado estable se registraron al final de la inyección. El chip se regeneró con un pulso de 30 segundos de 0,1 M TRIS pH 8,5/0,15 M NaCI. También se inyectó el FcRn sobre una superficie no conjugada para la sustracción de fondo. Los parámetros cinéticos y las constantes de unión de equilibrio monovalente (KD) fueron calculadas usando el programa informático BIAevaluation (GE healthcare, Piscataway, NJ).

Los resultados en la Figura 5 y Figura 6 muestran que todas las variantes de anti-VEGF tienen afinidad de FcRn mejorada sobre el tipo silvestre tanto con el FcRn de humano como con el FcRn de mono cinomologo a pH 6,0. Las mejoras en la afinidad se deben tanto a los incrementos en las constantes de velocidad de asociación como a los descensos en las constantes de velocidad de disociación. En general, las mejoras en la afinidad de FcRn de las variantes de anti-VEGF por sobre el tipo silvestre usando diferentes ensayos de unión se resumen en la Figura 8. La Figura 8 muestra que la variante V308P/N434A tiene la mayor afinidad de FcRn entre las variantes listadas en la Tabla 3, seguida por las variantes T307Q/E380A/N434S, T307Q/N434S y T307Q/N434A. La variante N434H tiene la menor cantidad de afinidad de FcRn por sobre el tipo silvestre.

Ejemplo 5: Velocidades de disociación de las variantes de anti-VEGF y anti-HER2 a diferentes pH Para medir las velocidades de disociación a varios pH, se inyectó primero 200nM a 2µ? de FcRn de humano o mono cinomolgo en célula de flujo conjugada por anticuerpo a 30µ?/?t??? en PBS pH 6,0/0,01 % de P20/0,02% NaN3 durante 5 minutos para alcanzar un estado estable. Luego se inyectó tampón PBS a pH de entre 6 y 7,4 a 30µ?/???? en la célula de flujo durante 8 minutos para dejar que el complejo se disociara. También se inyectó FcRn en una superficie no conjugada para sustracción de fondo. Las constantes de velocidad de disociación se determinaron ajusfando la fase de disociación del sensograma usando el programa informático BIAevaluation (GE healthcare, Piscataway, NJ). Los resultados en la Figura 7 muestran que las k0ff de las variantes con respecto al FcRn de humano (Fig. 7A) y al FcRn de mono cinomolgo (Fig. 7B) se incrementan con pH creciente, y que la velocidad de la k0ff incrementada para cada variante fue similar.

La velocidad de disociación (koff) de la variante de anti-HER2 L251 D/T307Q/M428L/N434H/Y436I con respecto al FcRn de humano a diferentes pH se midió en forma similar. La koff de la variante de anti-HER2 L251 D/T307Q/M428L/N434H/Y436I con respecto al FcRn de humano se trazó como una función del pH en la Figura 28. La koff de las variantes de anti-VEGF T307Q/N434A, T307Q/N434S. T307Q/E380A/N434S y V308P/N434A con respecto al FcRn de humano de la Figura 7 también se trazaron en la Figura 28 para comparación, los valores koff a diferentes pH se ajustaron con respecto al pH para cada variante para obtener una pendiente de la línea de mejor forma (ecuación: log(koff) =pendiente x pH +y-intercept). Las pendientes de las variantes de anti-VEGF oscilan entre 0,75 y 0,84; mientras que la pendiente de la variante de anti-HER2 L251 D/T307Q/ 428L/N434H/Y436I es de alrededor de 1 ,2.

Ejemplo 6: Unión a VEGF de humano Se conjugó una forma recombinante de VEGF-A109 sobre un chip CM5 usando un kit de acoplamiento de amina. Específicamente, se activó el chip sensor CM5 con EDC/NHS durante 7 min a 5µ?/?t???. Se inyectaron 1 a 2µg/ml de VEGF-A109 durante 30 segundos a una velocidad de flujo de ? ?µ?/min por sobre el chip activado para brindar una unidad de respuesta (RU) de unión máxima de 100 a 400. Después de la conjugación, el chip acoplado a FcRn fue bloqueado por una inyección de 35µ? de clorhidrato de etanolamina 1 M a 5µ?/????. Las diluciones en dos veces de anticuerpos de 100nM a 6nM fueron inyectadas en el chip VEGF-conjugado durante 4 min en PBS/0,05% de Tween/0,02% de NaN3 a 37 °C. Se dejaron disociar los complejos durante 18 min. El chip se regeneró con pulso de 30 segundos de 20mM de ácido clorhídrico. También se inyectaron anticuerpos en una superficie no conjugada para sustracción de fondo. Los resultados en la Figura 9 muestran que las mutaciones de Fe no alteran la unión de VEGF y que todas las variantes tienen la misma respuesta de unión que el tipo silvestre.

Ejemplo 7: Inhibición in-vitro de la proliferación celular Se pre-incubaron varias concentraciones de variantes de anti-VEGF y anti-VEGF silvestres (Bevacizumab) con VEGF humano recombinante a temperatura ambiente durante 1 hora. Las concentraciones de las variantes de anti-VEGF y anti-VEGF silvestres (Bevacizumab) oscilaron entre 33nM y 0,05nM. La concentración de VEGF humano recombinante fue de 0,26nM. Los complejos se presentaron luego a las células endoteliales vasculares umbilicales humanas (HUVEC, del inglés Human Umbilical Vascular Endothelial Cells) en cultivo a 37 °C y 5% de CO2. Las viabilidad de HUVEC después de 4 días de cultivo se evaluaron al incubar las células con 20% de tintura ALAMAR BLUE® (Trek Diagnostic Systems, Cleveland, OH) durante 6 hr a 37 °C y 5% de CO2. Luego se detectó la fluorescencia de ALAMAR BLUE® con una lectora de microplacas de Molecular Devices (Sunnyvale, CA). Como se ilustra en la Figura 10, todas las variantes tienen el mismo nivel de inhibición de la proliferación que el tipo silvestre y AVASTIN®, confirmando nuevamente que las mutaciones de Fe no afectan la habilidad de la variante de neutralizar el VEGF.

Ejemplo 8: Estudios farmacocinéticos en monos cinomolqos Treinta y seis monos cinomolgos machos y treinta y cinco hembras que no habían sido expuestos a experimentación previa, de un peso entre 2 - 5 kg y de 2 a 7 años de vida en el examen físico pre-estudio, fueron asignados a seis grupos de tratamiento, cada uno consistiendo de seis machos y seis hembras. Los animales fueron asignados a los grupos de tratamiento usando un procedimiento de bloqueo computarizado diseñado para alcanzar un equilibrio en el peso corporal con respecto a los grupos de tratamiento. Solamente los animales que parecían estar sanos y libres de anormalidades obvias fueron usados en el estudio. Todos los animales recibieron una dosis de bolo intravenoso única por vena safenosa, seguido de una purga de solución salina al 0,9% el día 1. El nivel de dosis para todos los grupos fue de 5 mg/kg. Las muestras sanguíneas (aproximadamente 1 ,0 mL) de la vena femoral se recolectaron antes y después de las dosis a 0,5, 2, 4, 8 horas, 1 , 2, 4, 7, 10, 14, 21 , 28, 35, 42, 49, 56 y 70 días. Las curvas de concentración de suero - tiempo para todos los grupos se formaron usando la concentración de suero media de n=11 a 12 animales por grupo. Las muestras de suero recolectadas en este experimento se analizaron usando un protocolo ELISA descrito en el Ejemplo 9.

Ejemplo 9: Detección de concentración de anticuerpo en suero de mono cinomolqo por ELISA Se cubrieron placas para ELISA de Maxisorp (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY) con 0,5 µg/ml de VEGF humano recombinante en 50mM tampón de carbonato, pH 9,6, a 4 °C toda la noche. Las placas se bloquearon con PBS, 0,5% de BSA, 10ppm de Proclin, pH 7,2 durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavaron con tampón de lavado (PBS/0,05% de Tween 20/pH 7,2). Muestras estándares diluidas en series de dos veces (IgGi de anti-VEGF silvestre (Bevacizumab)) así como también muestras de suero de mono cinomolgo diluidas en series de tres veces (comenzando a 1 :10) en tampón de PBS con un contenido de 0,5% de albúmina de suero bovino, 0,05% de Tween 20, 5mM de EDTA pH 8,0, 0,25% de CHAPS, 0,2% de gamma globulina bovina, 10ppm de Proclin y 0.35M NaCI se agregaron a las placas bloqueadas y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron 6 veces, y el fármaco unido fue detectado con IgG anti-humana de oveja (Fe específico )-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluida 1:10K en un tampón de ensayo (PBS, pH 7,4, 0,5% de BSA, 0,05% de Tween 20, 10ppm de Proclin) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron luego otras 6 veces, seguido por adición de substrato de benzidina de tetrametilo (Moss, Pasadera, MD) para el desarrollo de color. La reacción se detuvo después de 20 minutos por adición de ácido fosfórico 1 M (H3PO4). Las placas se leyeron en una lectora de placas de Molecular Devices a una longitud de onda de 450-620 nm. Los perfiles de suero del tipo silvestre y de cinco variantes de anti-VEGF en monos cinomolgos después de una dosis IV simple de 5 mg/kg se ilustran en la Figura 11. Todas las cinco variantes exhibieron aclaración reducida y vida media prolongada a comparación con el tipo silvestre.

Ejemplo 10: Análisis de datos farmacocinéticos Los parámetros farmacocinéticos se estimaron usando WinNonLin-Enterprise, versión 5.1.1 (Pharsight Corporation; Mountain View, CA). Un modelo de dos compartimientos con entrada de bolo IV, eliminación de primera orden, y constantes de micro-velocidades (Modelo 7) fue usado para describir los datos observados. Las concentraciones se pesaron usando pesaje iterativo (predicho a n=-1 ) y el algoritmo de minimización de Gauss-Newton con modificación de Levenberg y Hartley. Los siguientes parámetros farmacocinéticos fueron informados usando un WinNonLin Modelo 7: AUC» = exposición total del fármaco definida como el área bajo la curva concentración-tiempo extrapolada a infinito; ??/2, a = vida media de la fase alfa (vida media alfa); ¡2, p - vida media de la fase beta (vida media beta); Cmax = concentración máxima observada; CL = aclaración; Vi = volumen del compartimiento central; Vss = volumen de distribución en estado estable.

Para todos los grupos de dosis, la selección del modelo se basó sobre el estado óptimo por inspección visual del perfil concentración de suero-tiempo predicho versus el observado para cada animal, examen de la suma de cuadrados de residuos pesados y examinar de error estándar y coeficiente de variación para cada parámetro. Los parámetros farmacocinéticos se presentaron como la media ± desviación estándar (SD del inglés Standard Deviation) de cada grupo.

La Figura 12 muestra los parámetros farmacocinéticos tabulados para el anti-VEGF silvestres y las cinco variantes, N434H, T307Q/N434A, T307Q/N434S, T307Q/E380A/N434S y V308P/N434A, después de una dosis IV única de 5 mg/kg a monos cinomolgos. Las vidas media ß (terminales) de las variantes son de alrededor de 1 ,6- a 2,2 veces superiores a la vida media del tipo silvestre, siendo la variante T307Q/N434A la que tiene la vida media más larga, de 24,9 días. Para nuestro conocimiento, la vida media de la variante T307Q/434A, de alrededor de 25 días, representa la vida media más larga de una IgG humana en mono cinomolgo informada hasta el momento.

La relación entre la vida media y la afinidad de FcRn se ilustra en la Figura 13. El incremento modesto en afinidad de FcRn de pH 6.0 genera una vida media terminal prolongada, como queda evidenciado por las variantes N434H y T307Q/N434A. No obstante, el incremento adicional en la afinidad de FcRn de pH 6,0 (T307Q/N434S, T307Q/E380A/N434A y V308P/N434A) no mejora en forma adicional la vida media, ya que una velocidad de disociación más lenta y una afinidad incrementada en pH neutro pueden compensar el beneficio obtenido a partir del incremento de afinidad a pH ácido. En cambio, existe la tendencia hacia la vida media reducida en afinidades altas de FcRn a pH 6,0.

Ejemplo 11 : Estudios farmacocinéticos en ratones transaénicos La clase de ratones usada en el estudio son ratones Mu.VEGFhuX.KI.R1.B6.129. MuVEGFhuMUTX (+/+) knock-in, RAG2 (-/-) knock-out que contienen dos alelos de formas humanizadas de VEGF, que pueden ser neutralizadas por anticuerpo anti-VEGF silvestre (Bevacizumab). Los ratones RAG2 (-/-) son inmunodeficientes y no generan células funcionales T y B. Los tumores humanos pueden ser injertados en estos ratones, que expresan formas humanizadas de VEGF en ausencia de una respuesta inmune presente hacia las células tumorales. Por ende, el VEGF derivado del tumor humano y células estromales de ratón se neutraliza . por anticuerpo anti-VEGF silvestre (Bevacizumab), que no neutraliza VEGF de murina. La farmacocinética de anti-VEGF silvestre y variante de anti-VEGF T307Q/N434A se evaluó en estos ratones transgénicos que no portan tumores.

Dos estudios farmacocinéticos diferentes fueron realizados. El primer estudio es un estudio farmacocinético de dosis única. Existen 4 grupos con 8-9 animales por grupo, cada uno de ellos recibe una dosis única intravenosa de 0,3 o 5 mg/kg del tipo silvestre y variante T307Q/N434A en PBS. El volumen de dosis a ser administrada varió de 5 a 15ml/kg dependiendo de la concentración de la solución de dosificación y el peso de cada animal. La dosificación IV se realizó por medio de la vena de la cola. Las muestras de 3 ratones fueron extraídas en cada punto temporal y alrededor de 125uL de muestras de sangre para los análisis farmacocinéticos fueron recolectadas en 15 minutos, 8 horas, 24 horas, 2, 4, 7, 10, 14, 21 y 28 días después de la dosis. Las muestras de sangre fueron recolectadas bajo anestesia por el seno periorbital. En dichos puntos temporales, los ratones fueron desangrados por punción cardíaca bajo anestesia de isoflurano.

El segundo estudio es un estudio farmacocinético de dosis múltiples. Existen 9 animales por grupo. Cada animal recibió 0,3 o 5 mg/kg de variante T307Q/N434A en PBS en los días 0, 3, 6 y 9. Los métodos de inyección y recolección de muestras fueron similares al estudio farmacocinético de dosis única. No obstante, las muestras de sangre fueron recolectadas 15 minutos después de la primera dosis, día 3 (antes de la dosis), día 6 (antes de la dosis), día 9 (antes de la dosis), 15min antes de la dosis del día, día 11 , día 14, día 21 , día 28 y día 35.

Las muestras de suero recolectadas de los estudios farmacocinéticos fueron analizadas usando ELISA como se describió en el Ejemplo 13. Las Figuras 14A y 14B muestran los perfiles farmacocinéticos del tipo silvestre y variante T307Q/N434A determinados usando ya sea ELISA de captura de, VEGF (Fig. 14A) o captura de Fe humano (Fig. 14B), respectivamente. La variante T307Q/N434A que tiene perfiles farmacocinéticos similares son de tipo silvestre después de una dosis IV única de 0,3 o 5 mg/kg. La Figura 15 confirma que las vidas media del tipo silvestre y variante de T307Q/N434A en ratones transgénicos son comparables. No obstante, se observaron las respuestas farmacocinéticas no lineales, ya que los anticuerpos dosificados a 0,3 mg/kg tienen vidas media más cortas que los dosificados a 5 mg/kg, posiblemente debido a la aclaración dependiente de antígeno. La Figura 16 muestra los perfiles farmacocinéticos de la variante T307Q/N434A en ratones transgénicos de VEGF humanizado después de una dosis múltiple de 0,3 o 5 mg/kg y los parámetros farmacocinéticos se resumen en la Figura 17. .Los resultados muestran que las concentraciones de suero medidas experimentalmente correspondieron bien con las concentraciones predichas por una simulación usando los parámetros farmacocinéticos de dosis única.

Ejemplo 12: Estudios de eficacia in vivo Las células HT-55 humanas, Colo-205 (carcinoma colorrectal) y Calu-6 (carcinoma de pulmón) fueron obtenidas de American Type Culture Collection (Manassas, VA). La línea celular HM-7 de carcinoma colorrectal humano es un derivado de LS 174T. Las células Calu-6 y HM-7 se cultivaron en medio F12 de Ham, DMEM de baja glucosa 1 :1. Las células Colo-205 y HT-55 se cultivaron en medio RPMI 1640. Ambos medios fueron complementados con 10% v/v de FBS, 1 % v/v de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2 mM de L-glutamina (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 1 µg/ml FUNGIZONE™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se cultivaron las células a 37 °C en 5% de CO2 hasta confluirse, cosecharse y resuspenderse en Matrigel estéril a 50 x 106 células por mi. Los xenoinjertos se establecieron en ratones doble homocigotos RAG2 KO; hum-X VEGF Kl de 6 a 8 semanas de vida (Genentech, South San Francisco, CA) por inyección s.c. dorsal de 5 x10 células por ratón y se permitió que crecieran. El tratamiento con anticuerpo i.p. en la dosis de 5, 0,5 y 0,05 mg/kg dos veces por semana fue iniciado 24 h después de inoculación de células tumorales. Los tumores transplantados fueron medidos dos veces por semana en el eje más largo y el eje perpendicular, como se describe. Para cada día en los cuales se midieron los tumores, el volumen del tumor para cada ratón fue calculado, y los volúmenes de los tumores promedios del grupo de anticuerpos de control (anti-Ragweed) y cada grupo anti-VEGF fueron comparados por el test de r Student, a un nivel de P < 0,05. Se exterminaron los ratones cuando el volumen del tumor alcanzó 2.000 mm3 Los resultados de los primeros estudios de los xenoinjertos HM-7 se ilustran en la Figura 18. Las Figuras 18A y 18B muestran que la variante T307Q/N434A pudo alcanzar inhibición máxima del crecimiento tumoral tanto en 0,5 mg/kg como de 5 mg/kg de los grupos de tratamiento. Si bien el tipo silvestre no inhibió el crecimiento tumoral en ambas dosis, no alcanzó inhibición máxima de crecimiento tumoral en 0,5 mg/kg. Estos resultados sugieren que la variante T307Q/N434A es más eficaz que el tipo silvestre a 0,5mg/kg para tratar xenoinjertos HM-7, a pesar de los niveles similares de concentración de IgG sérica (Fig. 18C). Un estudio de eficacia de repetición de xenoinjertos HM-7 ilustrado en la Figura 19 confirma que la variante T307Q/N434A es más eficaz que el tipo silvestre en 0,5 y 0,05mg/kg de los grupos de tratamiento. De hecho, la variante T307Q/N434A mostró mayor inhibición del crecimiento tumoral en todos los grupos de tratamiento comparados con el tipo silvestre (Fig. 19A y 19B). La eficacia incrementada puede deberse a la concentración de anticuerpo normalizado en sangre superior en tumores para el grupo tratado por T307Q/N434A a comparación con el tipo silvestre (Fig. 19E). El tercer estudio de eficacia de xenoinjertos HM-7 ilustrado en la Figura 20 valida adicionalmente la eficacia superior de T307Q/N434A por sobre el tipo silvestre en 0,5 y 0,05mg/kg de los grupos de tratamiento.

Para el estudio de xenoinjertos HT-55, la variante T307Q/N434A mostró mayor inhibición de crecimiento tumoral a comparación con el tipo silvestre en 0,05mg/kg de los grupos de tratamiento (Fig. 21 ) lo que sugirió que la T307Q/N434A es más eficaz que el tipo silvestre en 0,05mg/kg de los grupos de tratamiento. Para el estudio de Colo-205, la Figura 22B muestra una diferencia significativa en las curvas de crecimiento entre 0,5mg/kg de tipo silvestre y 0,5mg/kg de variante T307Q/N434A. La Figura 22A y 22B también muestran un incremento en la inhibición del crecimiento tumoral por T307Q/N434A en 0,5 y 0,05mg/kg de los grupos de tratamiento, lo que sugiere una eficacia levemente superior para la T307Q/N434A en 0,5 y 0,05mg/kg de los grupos. Un estudio de Colo-205 de repetición ilustrado en la Figura 23 indica que la T307Q/N434A es levemente más eficaz que el tipo silvestre para tratar Colo-205 xenoinjertos. Por último, las eficacias de la variante T307Q/N434A y del tipo silvestre en el estudio de xenoinjertos Calu-6 fueron similares.

Pueden existir varias razones posibles para la eficacia incrementada de las variantes Fe. Por ejemplo, la potencia incrementada de una variante podría deberse a la retención y/o reciclado incrementados del anticuerpo variante mediados por el FcRn de humano expresados en ciertos tumores (por ejemplo, HM-7). Esto puede generar un efecto masa-acción incrementado de bloqueo del VEGF producido localmente, o puede proveer un mecanismo para la degradación reforzada del VEGF en el tumor. No obstante, encontramos que la concentración de variante incrementada detectadas en los tumores HM-7 con relación a los tumores HT-55 y Calu-6 no se correlaciona directamente con el nivel de expresión de FcRn celular, ya que las células HM-7 expresan menores cantidades de FcRn que las células HT-55 o las células Calu-6 (Figura 25). Otros factores en el microambiente del tumor tal como pH del tumor, velocidad de crecimiento y otros constituyentes del tumor pueden jugar también roles colaborativos con el FcRn al determinar la distribución de las IgGs. Por ejemplo, el microambiente del tumor es mayormente ácido, con un pH de entre 6,0 y 7,6 (media=7,1 ), mientras que el de los tejidos normales oscila entre 7,3 y 7,8 (media=7.55), véase Song, C.W. et al., "Influence of Tumor pH on Therapeutic Response" en Cáncer Drug Resistance, 21-42 (2007). Además, los diferentes tipos de tumores pueden tener un amplio rango de pH debido al suministro vascular heterogéneo y la perfusión sanguínea, ver Song, C.W. ef .a/., Cáncer Drug Resistance, 21-42 (2007), supra; Gillies, R.J. et al., J Magn Reson Imaging 16, 430-450 (2002). Los estudios in-vitro múltiples indican que la cantidad de Fc/lgG asociados a células se incrementa cuando las células se incuban a pH ácido, ver Praetor, A. et al., Journal of cell science 112 (Pt 14), 2291-2299 ( 999); cCarthy, K.M., Yoong, Y. & Simister, N.E. Bidirectional transcytosis of lgG by the rat neonatal Fe receptor expressed in a rat kidney cell Une: a system to study protein transpon across epithelia. Journal of cell science 113 ( Pt 7), 1277-1285 (2000); Tesar, D.B. et al., Traffic 7, 1 127-1 142 (2006). Por. ende, es concebible que las diferencias en el pH entre las líneas tumorales evaluadas pueda afectar el nivel de acumulación del anticuerpo en cada tumor. Además, el microambiente del tumor ácido también activa la expresión del VEGF (ver Song, C.W. et al., Cáncer Drug Resistance, 21-42 (2007), supra), que podría mediar la retención de estos anticuerpos anti-VEGF en forma específica. Además, los tumores HM-7 en ratones mostraron previamente que tenían estroma escaso (véase Liang, W. C. er al., J Biol Chem 281 , 951-961 (2006)), mientras que los tumores Calu-6 indujeron respuesta estromal de huésped más firme y fueron relativamente ricas en estroma (véase Tejada, M. L. et al., Clin Cáncer Res 12, 2676-2688 (2006)). La presencia de las células estromales de ratón, que expresan FcRn de murina, pueden disfrazar el reciclado mejorado de una variante de IgG por parte de células tumorales humanas. Esto puede generar el efecto de concentración menor en xenoinjertos humanos que tienen un componente mayor de estroma de murina, por ejemplo, Calu-6.

Ejemplo 13: Detección de concentraciones de anticuerpo en sueros v tumores de ratones transgénicos por ELISA Se usaron dos formatos de ensayos de ELISA diferentes con dos reactivos de captura de anticuerpos diferentes (VEGF o Fe de Igd anti-humana) cubiertos en placas para detectar concentraciones de anticuerpos en ratones transgénicos. Las placas de ELISA de Maxisorp (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY) se cubrieron con 0,5 µg/ml de VEGF recombinante humano o bien con 0,25µg/ml (Fab'2) de Fe de IgGi anti-humano de conejo (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) en 50mM de tampón de carbonato, pH 9,6, a 4 "C toda la noche. Las placas se bloquearon con PBS, 0,5% BSA, 10ppm Proclin, pH 7,2 durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavaron con tampón de lavado (PBS/0,05% de Tween 20/pH 7,2). Se agregaron estándares diluidos en series de dos veces (Bevacizumab para formato de VEGF o Igd humana para formato de Fe) hasta 12,5ng/ml así como también muestras de suero de mono cinomolgo diluidas en series de tres veces (comenzando a 1 :10) en tampón de PBS con un contenido de 0,5% de albúmina de suero bovino, 0,05% de Tween 20, 5mM EDTA pH 8,0, 0,25% de CHAPS, 0,2% de gamma globulina bovina, 10ppm Proclin y 0.35M NaCI a las placas bloqueadas y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron 6 veces, y el fármaco unido fue detectado con conjugado de (Fe específico )-HRP de IgG anti-humana de cabra (Fab'2) (Jackson) diluido 1 :20K a 1 :60K en tampón de ensayo (PBS, pH 7,4, 0,5% de BSA, 0,05% de Tween 20, 10ppm Proclin) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron 6 veces nuevamente, seguido por la adición de substrato de benzidina de tetrametilo (Moss, Pasadena, MD) para el desarrollo del color. La reacción se detuvo después de 20 minutos mediante la adición de ácido fosfórico 1 M (H3PO4). Las placas se leyeron en una lectora de microplacas de Molecular Devices a una longitud de onda de 450-620 nm.

Ejemplo 14: Variantes Fe de IqGi con varias mejoras de afinidad por sobre los tipos silvestres y sus funcionamientos farmacocinéticos in-vivo Las combinaciones adicionales de las mutaciones Fe, ilustradas en la Figura 24, se incorporaron en anti-HER2 humano (tratuzumab) para construir variantes de IgG. Las variantes de IgGi se expresaron usando los métodos descritos en el Ejemplo 1. Las constantes de disociación de la IgGi anti-HER2 silvestre y las variantes de IgGi anti-HER2 se midieron como se describe en el Ejemplo 4 y los resultados se ilustran en la Fig. 24. Los resultados muestran que al combinar diferentes mutaciones, podemos construir una variante de IgG tal como M252Y/V308P/N434Y que es capaz de unir FcRn humano con afinidad nanomólar de un dígito, lo que representa una mejora de alrededor de 450 veces con respecto a la IgGi silvestre.

No obstante, las variantes de alta afinidad no necesariamente tiene comportamientos farmacocinéticos mejorados in vivo. Por ejemplo, se incorporaron dos mutaciones Fe, N434A t N434W, en un anticuerpo humano diferente para construir dos variantes de IgG!. Las dos variantes de IgGi, variante N434A y variante N434W, generaron afinidad de FcRn superior de aproximadamente 3 a 40 veces a pH 6,0 en comparación con el anticuerpo silvestre, respectivamente, como se ilustra en la Fig. 24. Su comportamiento farmacocinético se evaluó en monos cinomolgos, como se describe en los Ejemplos 8 y 9, y comparó con el del tipo silvestre (aproximadamente 6 a 9 días). La vida media de N434W (alrededor de 9,7 +/- 2.4 días) fue menos mejorada que la de la variante modestamente mejorada en afinidad, N434A (alrededor de 14,5 +/-2,2 días). Estos resultados sugieren que demasiado incremento en la afinidad de FcRn puede tener un efecto perjudicial sobre la vida media de una variante Fe, y es difícil predecir a priori si una variante de Fe con afinidad de FcRn mejorada tendrá o no vida media mejorada.

Ejemplo 15: Inmunoprecipitación de FcRn usando una variante de IqGi de alta afinidad.

Cinco millones de células/cada una de las líneas HM-7, HT-55, Calu-6 o Raji (linfoma de linfocito B) fueron lisadas al incubar en 25mM de tampón de fosfato de sodio pH 6,0 con un contenido de 1% de Nonidet P-40, 0,5% de desoxicolato de sodio, 0,1 % de SDS, 2mM de EDTA, 150mM de NaCI y 1X de inhibidor de proteasa (Pierce, Rockland, IL) durante 1 hr a 4 °C. Las células lisadas fueron centrifugadas a 12000g durante 30 minutos a 4 °C, y luego se agregó 50 nM de variante Fe de trastuzumab M252Y/V308P/N434Y (Yeung et al., presentado) al sobrenadante para capturar el FcRn. Después de incubación toda la noche a 4 °C, se agregó resina Protein-L (Pierce) y se permitió que se uniera al complejo durante 4 horas a 4 °C. La resina se lavó luego cinco veces con el tampón de lisis y las proteínas unidas se fluyeron con un tampón de carga 2X (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las proteínas se separaron en un gel BIS-TRIS (Invitrogen) al 4-12% y se depositan como manchas sobre una membrana de nitrocelulosa (Invitrogen). La membrana se bloqueó con 3% de leche sin grasa en PBS y se sondeó con 1 ng/ml de anticuerpo de FcRn anti-humano de conejo (Santa Cruz, Santa Cruz, CA) a temperatura ambiente durante 1 hora, luego con conjugado de IgG-peroxidasa antl-conejo de cabra a 1 :104 de dilución (Pierce) durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana se lavó con PBS/0,05% de Tween entre los pasos de bloqueo e incubación de anticuerpos. La proteína de FcRn se visualizó por el kit de detección de ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Ver la Figura 25.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se realizaron dos experimentos de unión separados con diferentes variantes anti-VEGF en cada pH, pH 6,0 y pH 7,4. La unidad de respuesta (RU) de unión en estado estable como una función de concentración para pH 6,0 y pH 7,4 fue trazada en la Figura 1 y la Figura 2, respectivamente. Las constantes de disociación (KD) a pH 6,0 se estimaron a partir de la Figura 1 y se resumieron en la Figura 2. Las constantes de disociación de la misma variante calculada a partir de dos tandas diferentes fueron levemente diferentes. Por ejemplo, la variante N434A tuvo una KD de 550nM en la primera tanda, pero su KD de la segunda tanda fue de 250nM. La diferencia se debió al efecto de avidez en el formato del ensayo que implicó el flujo de un anticuerpo bivalente por sobre un chip acoplado a FcRn. El nivel de contribución de avidez a la constante de disociación dependió · del nivel de FcRn acoplado sobre los chips, generando mayor nivel de acoplamiento a FcRn más avidez. Esto podría explicar la mayor afinidad observada en la segunda tanda, que tuvo RU de alrededor dos veces más que la primera tanda. Si bien existió un efecto de avidez al realizar el ensayo, este formato se asemejó mayormente al proceso de unión natural dentro de las células, donde los anticuerpos bivalentes pinocitosados se dejan unir al FcRn unido a la membrana. Si bien la KD absoluta podría diferir de tanda en tanda, el ranking de afinidad de estas variantes fue consistente incluso con diferentes niveles de FcRn acoplado. Tanto la Figura 1 como la Figura 2 mostraron que la V308P/N434A tuvo consistentemente la mayor afinidad entre las variantes evaluados y todas las variantes evaluadas tienen unión mejorada a FcRn a pH 6,0.

Las afinidades de las variantes anti-VEGF a FcRn a pH 7,4 son mucho menores que sus afinidades a pH 6,0. Como la afinidad de unión a pH 7,4 fue muy baja, las constantes de disociación de las variantes a pH 7,4 no fueron determinadas. No obstante, la Figura 3 mostró que el ranking de afinidad de estas variantes a pH 7,4 fue el mismo que el ranking a pH 6,0, lo que indicó que la unión de las variantes a FcRn a pH 6,0 y pH 7,4 fue acoplada. A medida que la unión a pH 6,0 de las variantes es mejorada, también lo es la unión a pH 7,4. Existe un delicado equilibrio entre cómo la unión a pH 6,0 y 7,4 a FcRn afecta la vida media de la variante. Se sugiere que la unión mejorada a pH 6,0 tiene un rol beneficioso en la vida media de la variante in vivo, ya que las variantes de mayor afinidad pueden unirse a FcRn mejor y por ende pueden ser recicladas más por el FcRn. Por otro lado, se propone que la unión sustancialmente alta a pH 7,4 no es favorable para la vida media de las variantes, ya que los anticuerpos unidos a FcRn pueden no liberarse de manera rápida nuevamente a la circulación si se unen de manera demasiado ajustada..

La afinidad incrementada a pH alto puede negar los efectos favorables de afinidad incrementada a bajo pH. Por ejemplo, DalPAcqua ef al., J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002, mostraron que las variantes de IgGi humana tales como M252Y/S254T/T256E y G385D/Q386P/N389S no tuvieron vidas media mejoradas en los ratones, aparentemente a causa de su afinidad de unión a pH alto a FcRn de murina. Por ende, ha sido poco claro cuánta mejora en la unión a pH alto se puede tolerar en las variantes de IgGi mientras sus vidas media farmacocinéticas se siguen mejorando.

Si bien la presente invención ha sido descrita en cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo a los fines de claridad de entendimiento, las descripciones y ejemplos no deberían considerarse limitativos del alcance de la invención. Las divulgaciones de toda la literatura científica y patentes citadas en la presente se incorporan expresamente en su totalidad a modo de referencia.

Claims (22)

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descrito y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:

1. Una IgG variante que comprende una región Fe de la IgG humana que comprende dos o más sustituciones de aminoácidos respecto de una región Fe de la IgG humana de tipo silvestre en dos o más de residuos de aminoácidos 251 , 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434, y 436, numerados de acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la IgG variante tiene una vida media incrementada comparada con la vida media de una IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre, y en donde al menos dos de las sustituciones de aminoácidos están en los residuos de aminoácidos 251 , 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434, o 436, y una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 251 es una sustitución por ácido aspártico o ácido glutámico, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 252 es una sustitución por tirosina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 307 es una sustitución por glutamina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 308 es una sustitución por prolina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 378 es una sustitución por valina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 428 es una sustitución por leucina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 430 es una sustitución por alanina o lisina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 434 es una sustitución por alanina, serina o tirosina, y una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 436 es una sustitución por isoleucina.

2. La IgG variante de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende la sustitución de aminoácido en el aminoácido 308 por prolina y la sustitución de aminoácido en el aminoácido 434 por alanina.

3. Una IgG variante que comprende una región Fe de la IgG humana que comprende tres o más sustituciones de aminoácidos respecto de una región Fe de la IgG humana de tipo silvestre en tres o más de residuos de aminoácidos 251 , 252, 307, 308, 378, 380, 428, 430, 434, y 436, numerados de acuerdo con el índice de ELI como en Kabat, en donde la IgG variante tiene una vida media incrementada comparada con la vida media de una IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre, y en donde al menos tres de las sustituciones de aminoácidos están en los residuos de aminoácidos 251 , 252, 307, 308, 378, 380, 428, 430, 434, o 436, y una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 251 es una sustitución por ácido aspártico o ácido glutámico, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 252 es una sustitución por tirosina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 307 es una sustitución por glutamina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 308 es una sustitución por prolina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 378 es una sustitución por valina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 380 es una sustitución por alanina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 428 es una sustitución por leucina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 430 es una sustitución por alanina o lisina, una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 434 es una sustitución por alanina, serina, tirosina o histidina, y una sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 436 es una sustitución por isoleucina.

4. La IgG variante de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, la cual tiene mayor afinidad de unión por FcRn que la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre.

5. La IgG variante de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, la cual tiene mayor afinidad de unión por FcRn a pH 6,0 que a pH 7,4.

6. La IgG variante de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, la cual tiene igual o mayor eficacia que la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre.

7. La IgG variante de acuerdo con la reivindicación 6, la cual tiene mayor eficacia que la IgG que tiene la región Fe de la IgG humana de tipo silvestre.

8. La IgG variante de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, la cual es una IgG humana o humanizada.

9. La IgG variante de acuerdo con la reivindicación 8, la cual es IgGi, lgG2, lgG3 o lgG4.

10. La IgG variante de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, en donde la región Fe de la IgG es una región Fe de lgG1.

11. La IgG variante de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, en donde la IgG variante es un anticuerpo anti-VEGF.

12. La IgG variante de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, en donde la IgG variante es una variante de bevacizumab.

13. La IgG variante de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, la cual comprende el dominio variable de la cadena pesada (SEQ ID NO:1) y el dominio variable de la cadena liviana (SEQ ID NO:2).

14. Una composición farmacéutica que comprenden la IgG variante de acuerdo con la reivindicación 1 o 3 y un portador farmacéuticamente aceptable.

15. Un kit que comprende la IgG variante de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, en un contenedor, e instrucciones para su uso.

16. Una IgGi variante que comprenden una región Fe de lgG1 humana que comprende sustituciones de aminoácidos respecto de una región Fe de lgG1 humana tipo silvestre en los residuos de aminoácidos 308 y 434, numerados de acuerdo con el índice de EU como en Kabat, en donde la Igd variante tiene una vida media incrementada comparada con la vida media de una IgGi que tiene la región Fe de lgG1 humana de tipo silvestre, y en donde la sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 308 es una sustitución por prolina, y la sustitución de aminoácido en el residuo de aminoácido 434 es una sustitución por alanina.

17. El uso de una cantidad efectiva de una IgG variante de acuerdo con la reivindicación 1 o 3 para preparar un medicamento para tratar un tumor en un sujeto.

18. El uso de una cantidad efectiva de una IgG variante de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, para preparar un medicamento para inhibir la actividad de VEGF en un sujeto.

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la actividad de VEGF es angiogénesis.

20. El uso de una cantidad efectiva de una IgG variante de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, para preparar un medicamento modular la permeabilidad vascular en un sujeto.

21. El uso de una cantidad efectiva de una IgG variante de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, para preparar un medicamento para inhibir o prevenir el crecimiento de células cancerosas en un sujeto.

22. El uso de acuerdo con la reivindicación 17, 18, 20 o 21 , en donde la IgG variante es administrable al sujeto cada 4 semanas o más.