MX2008011785A

MX2008011785A - Metodos de tratamiento de lupus utilizando anticuerpos cd4.

Info

Publication number: MX2008011785A
Application number: MX2008011785A
Authority: MX
Inventors: Bryan Irving
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2006-03-16
Filing date: 2007-03-14
Publication date: 2008-09-25
Also published as: RU2008137765A; EP2001510A4; IL193920A0; NO20084317L; JP2009530290A; US20070218062A1; AU2007227609A1; CA2645322A1; EP2001510A2; BRPI0708902A2; KR20080112300A; WO2007109052A2; WO2007109052A3

Abstract

Se proporcionan métodos para el tratamiento de lupus, en los que se incluyen lupus eritematoso, lupus eritematoso cutáneo y lupus nefritis. Los métodos involucran la administración de una combinación de un anticuerpo CD4 no agotante y otro compuesto usado clínica o experimentalmente para tratar lupus. También se proporcionan métodos para el tratamiento de lupus nefritis mediante la administración de un anticuerpo CD4 no agotante que da como resultado mejora en la función y/o reducción en proteinuria o sedimento urinario activo. Se describen métodos para el tratamiento de esclerosis múltiple mediante la administración de un anticuerpo CD4 no agotante, opcionalmente en combinación con otro compuesto usado clínica o experimentalmente para tratar MS. También se proporcionan métodos para el tratamiento de pacientes de trasplante y sujetos con artritis reumatoide, asma, psoriasis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa y síndrome de Sjogren.

Description

METODOS DE TRATAMIENTO DE LUPUS UTILIZANDO ANTICUERPOS CD4 CAMPO DE LA INVENCION La invención es concerniente con métodos para el tratamiento de lupus y otras alteraciones autoinmunes en sujetos mamíferos utilizando anticuerpos CD4 no agotantes, solos o en combinación con otros compuestos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las enfermedades autoinmunes, tales como lupus eritematoso sistémico (SLE) y miastenia gravis, esclerosis múltiple y púrpura trombocitopenica idiopática, entre otras, siguen siendo enfermedades clínicamente importantes en humanos. Como el nombre lo implica, las enfermedades autoinmunes vuelcan su devastación a través del propio sistema inmune del cuerpo. En tanto que los mecanismos patológicos difieren entre tipos individuales de enfermedades autoinmunes, un mecanismo general involucra el enlace de ciertos anticuerpos (denominados en la presente como anticuerpos auto-reactivos o auto-anticuerpos) presentes en los sueros de pacientes de antígenos auto-nucleares o antígenos celulares. El lupus es una enfermedad autoinmune que involucra anticuerpos que atacan el tejido conectivo. Se estima que la enfermedad afecta casi a un millón de estadounidenses, principalmente mujeres entre las edades de 20-40. La forma principal de lupus es sistémica (lupus eritematoso; SLE) . El SLE está asociado con la producción de anticuerpos antinucleares, complejos inmunes circulantes y activación del sistema de complemento. SLE tiene una incidencia de aproximadamente 1 en 700 mujeres entre las edades de 20 y 60. SLE puede afectar cualquier sistema de órganos y puede provocar daños severos a tejidos. Numerosos auto-anticuerpos de diferente especificidad están presentes en SLE. Los pacientes con SLE frecuentemente producen auto-anticuerpos que tienen especificidad anti-ADN, anti-Ro y anti-plaquetas que son aptos de iniciar aspectos clínicos de la enfermedad, tales como glomerulonefritis , artritis, serositis, bloqueos del corazón completos en neonatos y anormalidades hematológicas . Estos auto-anticuerpos también están posiblemente relacionados con alteraciones del sistema nervioso central. Arbuckle et al describe el desarrollo de auto-anticuerpos antes del inicio clínico de SLE (Arbuckle et al. (2003) N. Engl . J. Med. 349 (16) : 1526-1533) . La presencia de anticuerpos inmunoreact ivos con ADN natural de doble hebra es usada frecuentemente como marcador de diagnostico para SLE. El lupus sin tratar puede ser fatal ya que avanza del ataque de la piel y articulaciones a órganos internos, en los que se incluyen pulmón, corazón y ríñones (la enfermedad renal es la preocupación principal) . El lupus aparece principalmente como una serie de inflamaciones, con períodos intermedios de poca o ninguna manifestación de enfermedad. Los daños al riñon, medidos por la cantidad de proteinuria en la orina, es una de las áreas de daños más agudas asociadas con la patogenicidad en SLE y suma por lo menos 50% de la mortandad y morbidez de la enfermedad . Actualmente, no hay tratamientos curativos para pacientes que han sido diagnosticados con SLE. Desde el punto de vista práctico, los médicos emplean en general un número de fármacos inmunosupresores poderosos tales como corticosteroides de alta dosis, por ejemplo prednisona o azatioprina o ciclofosfamida , que son dados durante periodos de inflamaciones, pero que pueden también ser dados persistentemente para aquellos que han experimentado inflamaciones frecuentes. Aún con el tratamiento efectivo, que reduce los síntomas y prolonga la vida, muchos de estos fármacos tienen efectos secundarios potencialmente peligrosos para los pacientes que son tratados. Además, estos fármacos inmunopresores interfieren con la habilidad de la persona para producir todos los anticuerpos, no solo los anticuerpos anti-ADN auto-reactivos. Los inmunosupresores también debilitan las defensas del cuerpo contra otros patógenos potenciales, haciendo mediante esto al paciente extremadamente susceptible a infección y otras enfermedades potencialmente fatales, tales como cáncer. En algunas de estas instancias, los efectos secundarios de las modalidades de tratamiento actuales, combinadas con la manifestación de bajo nivel continuo de la enfermedad, pueden provocar deterioro serio y muerte prematura. Los regímenes terapéuticos recientes incluyen ciclofosfamida , metotraxato, antimalariales , tratamiento hormonal (por ejemplo, DHEA) y terapia anti-hormonal (por ejemplo, el agente anti-prolactina bromocript ina ) . Métodos para el tratamiento de SLE que involucran anticuerpos también son descritos. Por ejemplo, el método de Diamond et al (patente estadounidense 4,690,905) consiste de generar anticuerpos monoclonales contra anticuerpos anti-ADN (se hace referencia en la presente a los anticuerpos monoclonales como anticuerpos ant i-idiot ípicos ) y luego usar estos anticuerpos anti-idiotípicos para remover los anticuerpos anti-ADN patógenos del sistema del paciente. Sin embargo, la remoción de grandes cantidades de sangre para tratamiento puede ser un proceso peligroso, complicado. La patente estadounidense 6,726,909 revela el tratamiento de SLE, en donde la composición de de anticuerpo administrada al paciente comprende anticuerpos anti-idiotípicos anti-ADN purificados y la administración requiere una inyección u otro modo equivalente de administración. Infusiones de inmunoglobulina intravenosa de alta dosis (IVIG) también se han usado en el tratamiento de ciertas enfermedades autoinmunes. Hasta el tiempo presente, el tratamiento de SLE con IVIG ha proporcionado resultados mezclados, en los que se incluyen tanto resolución de lupus nefritis (Akashi et al., J. Rheumatology 17:375-379(1990) ) y en pocas instancias, exacerbación de proteinuria y daños al riñon (Jordán et al., Clin. Immunol . Immunopathol . 53: S164-169 (1989) ) . Las personas afligidas con lupus, tales como aquellas con SLE que muestran evidencia clínica de lupus nefritis y aquellos con lupus nefritis necesitan un tratamiento eficiente en el costo y seguro que ayudará a mejorar los daños al tejido que conducen finalmente a insuficiencia renal y la necesidad de hemodiálisis crónica y/o transplante renal provocado por su condición. Similarmente , las personas afligidas con otras enfermedades autoinmunes, tales como esclerosis múltiple (MS), artritis reumatoide, miastenia gravis, psoriasis, diabetes de inicio juvenil, enfermedad de Sjogren, enfermedad de tiroides y enfermedad de intestino inflamatorio, también necesitan tratamientos efectivos y seguros.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Una clase general de modalidades proporciona métodos para el tratamiento de lupus en un sujeto mamífero, por ejemplo, un sujeto humano. En los métodos, una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de anticuerpos CD4 no agotante y por lo menos un segundo contexto seleccionado de por ejemplo, el grupo que consiste de ciclofosfamida, mofetil micofenolato, CTLA4-Ig y un anticuerpo a -integrina , etc., es administrada al sujeto. En ciertas modalidades, el sujeto es un humano. En ciertas modalidades, el segundo compuesto es ciclofos famida . En una clase de modalidades, el anticuerpo CD4 no agotante tiene una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 6, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 24. En una clase de modalidades, el anticuerpo CD4 no agotante comprende un fragmento de enlace de CD4 de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 6, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 24.

En una clase de modalidades, el anticuerpo CD4 no agotante comprende CDR1 (SEQ ID NO:25), CDR2 (SEQ ID NO:26) o preferiblemente CDR3 (SEQ ID NO: 27) de la cadena ligera mostrada en la Figura 1A; por ejemplo, el anticuerpo puede incluir CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera mostrada en la Figura 1A (esto es, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:27) . Similarmente , en una clase de modalidades, el anticuerpo comprende CDR1 (SEQ ID NO:28), CDR2 (SEQ ID NO:29) o preferiblemente CDR3 (SEQ ID NO: 30) de la cadena pesada mostrada en la Figura ID; por ejemplo, el anticuerpo puede incluir CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada mostrada en la Figura ID (esto es, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30) . En una modalidad, el anticuerpo comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera mostrada en la Figura 1A y CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada mostrada en la Figura ID (esto es, SEQ ID NOs : 25-30) . Otros anticuerpos ejemplares incluyen pero no están limitados a anticuerpos que se enlazan a un mismo epitopo como un anticuerpo mostrado en cualquiera de las Figuras 1-4. El anticuerpo CD4 no agotante puede ser un anticuerpo humanizado, por ejemplo, en donde el sujeto a ser tratado es un humano. El anticuerpo puede tener una porción Fe aglicosilada . Opcionalmente , el anticuerpo no se enlaza al receptor Fe. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo variante anti-CD4 que se puede enlazar a un receptor de FcRN . El anticuerpo incluye opcionalmente una sustitución de aminoácido en una o más posiciones de aminoácidos 270, 322, 326, 327, 329, 313,333 y/o 334 de la región de Fe que altera el enlace de Clq y/o citotoxicidad dependiente de complemento del anticuerpo (por ejemplo, con respecto a un anticuerpo padre que no incluye tal sustitución) . En ciertas modalidades, el anticuerpo comprende un epitopo de enlace de receptor de salvamento o un péptido de enlace de albúmina de suero. Opcionalmente , el anticuerpo comprende tres o más sitios de enlace de antigeno. El lupus para el cual el sujeto es tratado es comúnmente lupus eritematoso sistémico (SLE) , lupus eritematoso cutáneo (CLE) o lupus nefritis. El lupus a ser tratado puede ser una enfermedad de etapa prematura, media o tardía cuando el tratamiento es iniciado. En modalidades en las cuales se trata lupus nefritis, el lupus nefritis puede ser cualquiera de las clases I-VI. Por ejemplo, el lupus a ser tratado puede ser lupus nefritis clase II, lupus nefritis clase III, lupus nefritis clase IV o lupus nefritis clase V. En una modalidad, después del inicio de tratamiento con la combinación, el sujeto exhibe una reducción en proteinuria y/o una reducción en el sedimento urinario activo, en comparación con el (los) nivel (es) de proteinuria y/o elemento primario activo mostrado por el sujeto antes del inicio del tratamiento. Por ejemplo, la proteinuria puede ser reducida por al menos de 25% por al menos 50%, por al menos 75% o por al menos 90% o la proteinuria puede ser reducida a menos de 1 g/día o menos de 500 mg/día o el sedimento urinario activo puede ser reducido por al menos 25%, por al menos 50%, por al menos 75% o por al menos 90% o solamente el sedimento urinario inactivo puede permanecer después del inicio del tratamiento. En una modalidad, antes del inicio de tratamiento con la combinación, el sujeto exhibe proteinuria, tal proteinuria es mejorada por el tratamiento. Por ejemplo, antes del inicio del tratamiento, el sujeto puede exhibir proteinuria mayor de 500 mg/dia, mayor de 1,000 mg/dia, mayor de 2,000 mg/dia o mayor de 3,500 mg/dia. Después del inicio de tratamiento, la proteinuria puede ser reducida por al menos 25%, por al menos 50$, por al menos 75% o por al menos 90% o la proteinuria puede ser reducida a menos de 1 g por día o menos de 500 mg por día. Como otro ejemplo, antes de inicio de tratamiento, el sujeto puede exhibir una proporción de proteina a creatinina mayor de 0.5, mayor de 1 o mayor de 2; después del inicio del tratamiento, la proporción de proteina a creatinina de la orina del sujeto puede ser producida por al menos 25% o por al menos 50% o la proporción puede ser reducida a menos de 1 o menos d e0.5. En un aspectos, los métodos incluyen tratamiento del sujeto con el anticuerpo CD4 no agotante o no agotante y el segundo compuesto para reducir síntomas y luego antes de seguir el tratamiento del sujeto cuando el anticuerpo CD4 no agotante o con el segundo compuesto (no en combinación entre sí) para mantener la remisión. Por ejemplo, en una clase de modalidades, después del inicio de tratamiento por la combinación, el lupus es mejorado; el tratamiento del sujeto con la combinación es luego descontinuado y en lugar de esto una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo CD4 no agotante es administrada al sujeto. En otra clase ejemplar de modalidades, después del inicio de tratamiento con la combinación, el lupus es mejorado; el tratamiento del sujeto con la combinación es luego descontinuado y en lugar de esto, una cantidad terapéuticamente efectiva del segundo compuesto o uno o más de otros compuestos es administrada al sujeto. Otra clase general de modalidades también proporciona métodos para el tratamiento de lupus nefritis en un sujeto mamífero, por ejemplo, un humano. En los métodos, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo CD4 no agotante es administrada al sujeto. Después del inicio de tratamiento o del anticuerpo no agotante, el sujeto exhibe una mejora en función renal, una reducción en proteinuria y/o una reducción en el sedimento urinario activo, en comparación con el (los) y de (es) de proteinuria y/o sedimento urinario activo mostrado por el sujeto antes del inicio del tratamiento. Por ejemplo, la proteinuria puede ser reducida por al menos 25%, por al menos 50%, por al menos 75% o por al menos 90% o la proteinuria puede ser reducida a menos de 1 g por día o menos de 500 mg por día; la proporción de proteína a creatinina puede ser reducida por al menos 25% o por al menos 50% o la proporción puede ser reducida a menos de uno o menos de 0.5 y/o el sedimento urinario activo puede ser reducido por al menos 25%, por al menos 50%, por al menos 75% o por al menos 90% o solamente el sedimento urinario inactivo puede permanecer después del inicio del tratamiento. El lupus nefritis puede ser cualquiera de las clases I-VI. Por ejemplo, el lupus a ser tratado puede ser lupus nefritis clase II, lupus nefritis III, lupus nefritis IV o lupus nefritis clase V. En una modalidad, antes del inicio del tratamiento, el sujeto exhibe proteinuria mayor de 500 mg/dia, mayor de 1000 mg/dia, mayor de 2000 mg/dia o mayor de 3500 mg/dia. En una modalidad, la proteinuria es reducida después del inicio del tratamiento con el anticuerpo, por ejemplo, por al menos 25%, por al menos 50%, por al menos 75% o por al menos 90% o a menos de 1 mg/dia o menos de 500 mg/dia. En una modalidad, la proporción de proteina a creatinina es reducida después del inicio del tratamiento con el anticuerpo, por ejemplo, por al menos 25% o por al menos del 50% o al menos de 1 o menos de 0.5. El anticuerpo CD4 no agotante puede ser seleccionado del grupo que consiste de (a) un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 6; (b) un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 12; (c) un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en NO: 18; (d) un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en NO: 24; e) un anticuerpo que comprende un fragmento de enlace de CD4 del anticuerpo de (a), (b) , (c) o (d) ; f) un anticuerpo que comprende CDR3 de la cadena ligera mostrada en la Figura 1A (SEQ ID NO: 27) ; (g) un anticuerpo que comprende CDR3 de la cadena pesada mostrada en la Figura ID (SEQ ID NO: 30) ; (h) un anticuerpo que comprende CDRl. CDR2 y CDR3 de la cadena ligera mostrada en la Figura 1A (SEQ ID NOS: 25-27) ; (i) un anticuerpo que comprende CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada mostrada en la Figura ID (SQE ID NOS: 28-30) ; (j) un anticuerpo que comprende CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera mostrada en la Figura 1A y CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada mostrada en la Figura ID (SEQ ID NOS: 25-30) . Similarmente , el anticuerpo puede ser un anticuerpo CD4 que se enlaza al mismo epitopo como el mismo anticuerpo mostrado en cualquiera de las Figuras 1- . Esencialmente todos los aspectos indicados para los métodos anteriores se aplican a estas modalidades también, como sea relevante, por ejemplo con respecto a la combinación opcional del anticuerpo no agotante con por lo menos un segundo compuesto, tipo de anticuerpo y/o los semejantes. Por ejemplo, en una modalidad de la invención, el anticuerpo CD4 no agotante es opcionalmente un anticuerpo humanizado, tiene una porción Fe aglicosilada , no se enlaza al receptor Fe, incluye sustituciones de aminoácidos que alteran el enlace el enlace de Clq y/o citotoxicidad dependiente del complemento, comprende un epitopo de enlace de receptor de fragmento, comprende un péptido de enlace de albúmina de suero y/o tiene tres o mas sitios de enlace de antigeno. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo variante anti-CD4 que se puede enlazar a un receptor de FcRN. Una clase general de modalidades proporciona métodos para el tratamiento de esclerosis múltiple en un sujeto mamífero, por ejemplo, un sujeto humano. En los métodos, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo CD4 no agotante y/o por lo menos un segundo compuesto es administrada al sujeto. Por ejemplo, segundos compuestos apropiados incluyen pero no están limitados a, por ejemplo, un agente citotóxico; un agente inmunosupresor (por ejemplo, ciclofosfamida ) ; un antagonista de marcador de superficie de célula B; un marcador de superficie del anticuerpo a célula B; un anticuerpo CD20 (por ejemplo, Rituximab) ; un anticuerpo o agente de bloqueo CD5, CD28 o CD40; un cort icosteroide (por ejemplo, prednisona) , CTLA4-Ig, un anticuerpo de a4-integrina tal como natalizumab (Tysabri®) , mofetil micofenolato, una estatina, un anticuerpo o agente de bloqueo LFA-1 o CD-11, un anticuerpo interleucina-12 , un interferón ß (por ejemplo, un interferón ß-l tal como Avonex® o Rebif® o un interferón ß-lb tal como Betaseron®) , glatirámero acetato (Copaxone®) , un anticuerpo CD52 tal como alemtuzuman (CamPath®) , un anticuerpo receptor de interleucina tal como daclizumab (Zenapax®, un anticuerpo a la subunidad alfa de receptor de interleucina-2 ) , etc. Una clase relacionada de modalidades proporciona métodos para el tratamiento de una condición en un sujeto mamífero (por ejemplo, un sujeto humano) . La condición puede ser artritis reumatoide, asma, psoriasis, rechazo de trasplante, enfermedad de huésped contra injerto, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome de Sjogen u otra alteración o enfermedad autoinmune. En los métodos, una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de un anticuerpo CD4 no agotante y por lo menos un segundo compuesto es administrada al sujeto. En una clase de modalidades, el segundo compuesto es ciclofosfamida , mofetil micofenolato o CTLA4-Ig. Esencialmente, todos los aspectos indicados para los métodos anteriores se aplican a estas clases de modalidades también, como sea relevante, por ejemplo con respecto al tipo de anticuerpo, tipo de segundo compuesto y/o los semejantes. Por ejemplo, el anticuerpo CD4 no agotante puede ser seleccionado del grupo que consiste de: a) un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en la SEQ ID NO. 3 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en la SEQ ID NO. 6; b) un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en la SEQ ID NO. 9 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en la SEQ ID NO. 12; c) un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en la SEQ ID NO. 15 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en la SEQ ID NO. 18; d) un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en la SEQ ID NO. 21 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en la SEQ ID NO. 24; e) un anticuerpo que comprende un fragmento de enlace de CD4 del anticuerpo de los incisos a) , b) , c) ó d) ; f) un anticuerpo que comprende CDR3 de la cadena ligera mostrada en la Figura 1A (SEQ ID NO. 27) ; g) un anticuerpo que comprende CDR3 de la cadena pesada mostrada en la Figura ID (SEQ ID NO. 30) ; h) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera mostrada en la Figura 1A (SEQ ID NOS. 25-27) ; i) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada mostrada en la Figura ID (SEQ ID NOS. 28-30) ; y j) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de 1 la cadena ligera mostrada en la Figura 1A y CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada mostrada en la Figura ID (SEQ ID NOS. 25-30) . De manera similar, el anticuerpo puede ser un anticuerpo CD4 que se enlaza al mismo epitopo como un anticuerpo mostrado en cualquiera de las Figura 1-4.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-1F muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada y ligera de una modalidad del anticuerpo CD4 no agotante TRX1. La Figura 1A presenta las secuencias de nucleótidos (SEQ ID NO. 1) y aminoácidos (SEQ ID NO. 2) de la cadena ligera, asi como las regiones de CDR y de estructura. La Figura IB presenta la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera (SEQ ID NO. 1) . La Figura 1C presenta la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera con (SEQ ID NO. 2) y sin (SEQ ID NO. 5) la secuencia líder. La Figura ID presenta la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO. 4) y aminoácidos (SEQ ID NO. 5) de la cadena pesada, así como las regiones de CDR y de estructura. La Figura 1E presenta la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada (SEQ ID NO. 4) . La Figura 1F presenta la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada con (SEQ ID NO. 5) y sin (SEQ ID NO. 6) la secuencia 1 ider . Las Figuras 2A-2F muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada y ligera de una modalidad del anticuerpo CD4 no agotante de TRX1. La Figura 2A presenta las secuencias de nucleótidos (SEQ ID NO. 7) y aminoácidos (SEQ ID NO. 8) de la cadena ligera, asi como las regiones de CDR y de estructura. La Figura 2B presenta la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera (SEQ ID NO. 7) . La Figura 2C presenta la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera con (SEQ ID NO. 8) y sin (SEQ ID NO. 9) la secuencia líder. La Figura 2D presenta la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO. 10) y aminoácidos (SEQ ID NO. 11) de la cadena pesada, asi como las regiones de CDR y de estructura. La Figura 2E presenta la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada (SEQ ID NO. 10) . La Figura 2F presenta la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada con (SEQ ID NO. 11) y sin (SEQ ID NO. 12) la secuencia líder. Las Figuras 3A-3F muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada y ligera de una modalidad del anticuerpo CD4 no agotante de TRX1. La Figura 3A presenta las secuencias de nucleótidos (SEQ ID NO. 13) y aminoácidos (SEQ ID NO. 14) de la cadena ligera, así como las regiones de CDR y de estructura. La Figura 3B presenta la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera (SEQ ID NO. 13) . La Figura 3C presenta la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera con (SEQ ID NO. 14) y sin (SEQ ID NO. 15) la secuencia líder. La Figura 3D presenta la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO. 16) y aminoácidos (SEQ ID NO. 17) de la cadena pesada, así como las regiones de CDR y de estructura. La Figura 3E presenta la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada (SEQ ID NO. 16) . La Figura 3F presenta la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada con (SEQ ID NO. 17) y sin (SEQ ID NO. 18) la secuencia líder. Las Figuras 4A-4F muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada y ligera de una modalidad del anticuerpo CD4 no agotante de TRX1. La Figura 4A presenta las secuencias de nucleótidos (SEQ ID NO. 19) y aminoácidos (SEQ ID NO. 20) de la cadena ligera, así como las regiones de CDR y de estructura. La Figura 4B presenta la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera (SEQ ID NO. 19) . La Figura 4C presenta la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera con (SEQ ID NO. 20) y sin (SEQ ID NO. 21) la secuencia líder. La Figura 4D presenta la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO. 22) y aminoácidos (SEQ ID NO. 23) de la cadena pesada, así como las regiones de CDR y de estructura. La Figura 4E presenta la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada (SEQ ID NO. 22) . La Figura 4F presenta la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada con (SEQ ID NO. 23) y sin (SEQ ID NO. 24) la secuencia líder.

La Figura 5 ilustra esquemáticamente el avance de la enfermedad por edad en el modelo de eficacia preclinica NZBxW Fl de SLE. Las Figuras 6A-6F presentan gráficas que ilustran la respuesta a la administración del anticuerpo CD4 no agotante. Las gráficas presentadas son el tiempo al avance (300 mg/dl de proteinuria o muerte) en la Figura 6A, por ciento de supervivencia como función del tiempo después del inicio del tratamiento en la Figura 6B, proteinuria en el quinto mes de tratamiento en la Figura 6C y nitrógeno de urea en la sangre promedio como función del tiempo después del inicio del tratamiento en la Figura 6D, para animales en los cuales el tratamiento fue iniciado a los ocho meses de edad. La Figura 6E muestra el tiempo al avance (300 mg/dl de proteinuria) y la Figura 6F muestra el por ciento de supervivencia como función del tiempo después del inicio del tratamiento, para animales en los cuales el tratamiento fue iniciado a los seis meses de edad. Las Figuras 7A-7B presentan gráficas que ilustran la inversión del lupis nefritis severo mediante el tratamiento con el anticuerpo CD4 sin agotamiento. La Figura 7A presenta una gráfica que muestra el porcentaje de ratones bajo 300 mg/dl de proteinuria a los tiempos indicados después del tratamiento. La Figura 7B muestra el porcentaje de ratones invertidos de >300 mg/dl de proteinuria en el primer mes de tratamiento. Las Figuras 8A-8D presentan gráficas que ilustran la respuesta a la administración del anticuerpo CD4 no agotante. La Figura 8A muestra el titulo de anticuerpo ds-ADN en el reclutamiento, en tanto que la Figura 8B muestra el titulo tres meses después del tratamiento. La Figura 8C muestra el número de células CD4+CD69+ encontradas en el bazo tres semanas posteriores al tratamiento. La Figura 8D muestra el número de células CD4+CD25+ encontradas en el bazo tres semanas posteriores al tratamiento. Las Figuras 9A-9B ilustran múltiples análisis de comparación de proteinuria al mes 6 de tratamiento, utilizando el grupo tratado con ciclofosfamida (Cytoxan®) como el grupo testigo o grupo de control en la Figura 9A, y el grupo tratado con anticuerpo no agotante CD4 como el grupo testigo o grupo de control en la Figura 9B . La Figura 10 ilustra esquemáticamente el avance de la enfermedad con el paso del tiempo en EAE de recaída y remisión mediante inyección del péptido PLP en ratones SJL/J, un modelo de eficacia preclinica de MS . Las Figuras 11A-11B presentan gráficas que ilustran la respuesta a la administración del anticuerpo CD4 no agotante. La Figura 11A presenta una gráfica de la puntuación clínica sobre el tiempo para grupos tratados con el anticuerpo de control, acetato de glatirámero (Copaxone®) , el anticuerpo alfa-4 integrina, CTLA4-Ig, y el anticuerpo CD4 no agotante. La Figura 11B presenta las puntuaciones clínicas diarias promedio para estos grupos. Las Figuras 12A-12B presentan gráficas que ilustran la respuesta a la administración del anticuerpo CD4 no agotante. La Figura 12A presenta una gráfica de la puntuación clínica sobre el tiempo para grupos tratados con el anticuerpo de control, CTLA4-Ig, y el anticuerpo CD4 no agotante. La Figura 12B presenta las puntuaciones clínicas diarias promedio para estos grupos. Las Figuras 13A-13B presentan gráficas que ilustran la respuesta a la administración del anticuerpo CD4 no agotante. La Figura 13A presenta una gráfica de la puntuación clínica sobre el tiempo para grupos tratados con el anticuerpo de control, CTLA4-Ig, y el anticuerpo CD4 no agotante. La Figura 13B presenta las puntuaciones clínicas diarias promedio para estos grupos. La Figura 14 ilustra secciones de médula espinal de ratones tratados con el anticuerpo de control o el anticuerpo CD4 , que muestra que el tratamiento con el anticuerpo CD4 no agotante disminuye la desmielinización en EAE . La Figura 15 presenta gráficas que muestran el número de células T ICOShiCD4 ó ICOShiCD8 por L de sangre para animales tratados con el anticuerpo de control, el anticuerpo CD4 no agotante o CTLA4-Ig. La Figura 16 presenta una gráfica de la puntuación clínica sobre el tiempo que compara el tratamiento de EAE inducido por (MOG) -péptido de glucoproteina de oligodendrocito de mielina con un anticuerpo CD4 no agotante, un anticuerpo CD4 agotante, un anticuerpo de control, CTLA4-Ig, o un anticuerpo CD8 agotante. Las Figuras 17A-17B presentan gráficas que ilustran la respuesta a la administración del anticuerpo CD4 no agotante. La Figura 17A presenta una gráfica que muestra el porcentaje de ratones bajo 300 mg/dl de proteinuria a los tiempos indicados, después del tratamiento indicado. La Figura 17B muestra el porcentaje de ratones invertidos de >300 mg/dl de proteinuria. Las Figura 18A-18D presentan gráficas que ilustran la respuesta al tratamiento. Las gráficas presentadas ilustran el tiempo al avance (300 mg/dl de proteinuria o muerte) en la Figura 18A, y el por ciento de supervi encia como función del tiempo después del inicio del tratamiento en la Figura 18B, para animales tratados con una combinación del anticuerpo CD4 no agotante y 50 mg/kg por día de MMF y el tiempo al avance en la Figura 18C y el por ciento de supervi encia en la Figura 18D para animales tratados con una combinación de anticuerpo CD4 no agotante y 25 mg/kg por día de MMF.

Las Figuras 19A-19B ilustran múltiples análisis de comparación de proteinuria al mes 2 de tratamiento, utilizando el grupo tratado por anticuerpo de control, como el grupo de control o grupo testigo. Los resultados para los grupos tratados con 50 mg/kg de MMF diariamente (solo o en combinación con el anticuerpo CD4 no agotante) son presentados en la Figura 19A, en tanto que los resultados para grupos tratados con 25 mg/kg de MMF diariamente, se presentan en la Figura 19B. Las Figuras 20A-20I presentan gráficas que ilustran la respuesta ai tratamiento. Las gráficas presentadas muestran el número de células CD4 + por pL de sangre (Figura 20A) , células B2 B por L de sangre (Figura 20B) , células T CD4 + por bazo (Figura 20C) , células B2 B por bazo (Figura 20D) , células de IgM+ plasma (Figura 20E) , células de plasma isot ipo-cambiadas (Figura 20F) , células centrales germinales (Figura 20G) y células dendriticas plasmacitoides por bazo (Figura 20H) y el nivel de expresión de MHC II en células dendriticas plasmacitoides (Figura 201) , para animales tratados con el anticuerpo de control, el anticuerpo CD4 no agotante, la dosis indicada de MMF, o una combinación del anticuerpo CD4 no agotante y la dosis indicada de MMF. Las Figuras 21A-21B muestran la secuencia de ácido nucleico y aminoácidos de CD4 humano. La Figura 21A presenta la secuencia de aminoácidos de CD4 humano para proteina madura con lider escindido. La figura 21B presenta la secuencia de ADN de CD4 humana madura.

DEFINICIONES A no ser que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entienden comúnmente para aquel de habilidad ordinaria en el arte con el cual la invención es concerniente. Las siguientes definiciones complementan aquellas en el arte y son concernientes con la presente solicitud y no serán imputadas a cualquier caso relacionado o no relacionado, por ejemplo a cualquier patente o solicitud perteneciente en común. Cualesquier métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden ser usados en la práctica para las pruebas de la presente invención y materiales y métodos no limitantes son descritos en la presente. Así, la terminología utilizada en la presente es por el propósito de describir modalidades particulares solamente y no pretenden ser limitantes. Como se usa en esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "a", "un", "el" incluyen referencias plurales, a no ser que el contexto lo determine claramente de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a "una proteína" incluye una pluralidad de proteínas; la referencia a "una célula" incluye mezclas de células y los semejantes. "Lupus" como se usa en la presente es una enfermedad o alteración autoinmune que involucra anticuerpos que atacan el tejido conectivo. La forma principal de lupus es una forma sistémica, lupus eritematoso sistémico (SLE) , que puede incluir implicación cutánea. "Lupus" como se usa en la presente incluye SLE, también como otros tipos de lupus (en los que se incluyen, por ejemplo lupus eritematoso cutáneo (CLE) , lupus nefritis (LN), extra-renal, cerebritos, pediátrico, no renal, discoide y alopecia) . Un "sujeto" en la presente es comúnmente un humano, pero puede ser un mamífero no humano. Mamíferos no humanos ejemplares incluyen animales de laboratorio, domésticos, mascotas, deportivos y ganado, por ejemplo ratones, gatos, perros, caballos y vacas. Comúnmente el sujeto es elegible para tratamiento, por ejemplo, tratamiento de una alteración autoinmune, tratamiento relacionado con transplante de tejido o los semejantes. En un aspecto, cada sujeto es elegible para tratamiento de lupus. Por propósitos de la presente, tal sujeto elegible es uno que experimenta o ha experimentado uno o más signos, síntomas u otros indicadores de lupus o ha sido diagnosticado con lupus, ya sea, por ejemplo recién diagnosticado, previamente diagnosticado con una nueva inflamación o dependiente crónicamente de esferoides con una nueva inflamación o está en riesgo de desarrollar lupus. Uno elegible para tratamiento de lupus puede opcionalmente ser identificado como uno que es seleccionado mediante biopsia renal y/o es seleccionado utilizando un análisis para detectar anti-anticuerpos , tales como aquellos indicados posteriormente en la presente, en donde la producción de auto-anticuerpo es determinada cualitativamente y de preferencia cuantitativamente. Tales auto-anticuerpos ejemplares asociados con SLE son anticuerpos (Ab) ant i-nuclares , Ab de ADN anti-doble hebra (DsADN), Ab anti-Sm, Ab de ribonucleoproteina anti-nuclear , Ab anti-fosfolipido, AB anti-ribosomal P, Ab anti-Ro/SS-A, Ab anti-Ro Ab y Ab anti-La. La diagnosis de lupus (y determinación de elegibilidad por tratamiento) puede ser efectuada como está establecido en el arte. Por ejemplo, la diagnosis de SLE puede estar de acuerdo con los criterios actuales del American College of Rheumatology (ACR) . La enfermedad activa puede ser definida por uno de los criterios "A" del British Isles Lupus Activity Group' s (BILAG) o los criterios "B" BILAG, por ejemplo como se aplica en la solicitud de patente estadounidense 2006/0024295 por Brunetta intitulada " ethod for treating lupus". Algunos signos, síntomas u otros indicadores usados para diagnosticar SLE adaptados de Tan et al. (1982) "The 1982 Revised Criteria for the Classification of SLE" Arth Rheum 25:1271-1277 pueden ser erupción malar tal como erupción sobre las mejillas, erupción discoide o parches elevados rojos, fotosensibilidad, tal como reacción a la luz del sol, dando como resultado el desarrollo de o incremento en erupción de la piel, úlceras orales tales como ulceras en la nariz o boca, usualmente sin dolor, artritis, tal como artritis no erosiva que involucra dos o más articulaciones periféricas (artritis en la cual los huesos alrededor de las articulaciones no son destruidos) , serositis, pleuritis o pericarditis, alteración renal tal como proteína excesiva en la orina (proteinuria , mayor de 0.5 g ( gramos ) /día 3+ en barras de prueba) y/o vaciados celulares (elementos anormales derivados de la orina y/o células blancas y/o células de túbulo de riñon) , signos neurológicos , síntomas u otros indicadores, ataques (convulsiones) y/o psicosis en ausencia de fármacos o alteraciones metabólicas que se sabe que provocan tales efectos y signos, síntomas u otros indicadores hematológicos tales como anemia hemolítica o leucopenia (conteo de leucocitos menor de 4000 células/milímetro cúbico) o limfopenia (menos de 1,500 limfocitos por milímetro cúbico) o trombocitopenia (menos de 100,000 plaquetas/milímetro cúbico) . La leucopenia y la limfopenia deben ser detectadas en dos o más ocasiones. La trombocitopenia debe ser detectada en ausencia de fármacos que se sabe que la inducen. La invención no está limitada a estos signos, síntomas u otros indicadores de lupus. Una inflamación lupus nefrítica puede ser definida como (1) un incremento de > 30% en Ser en un período de un mes o (2) una recurrencia o aparición de síndrome nefrótico o (3) un incremento de 3 veces en proteína urinaria con proteinuria de referencia > 1 g/24 horas o como se índica en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2006/0024295. Para lupus nefritis, la elegibilidad de tratamiento puede ser evidenciada por una inflamación nefrítica, como es definida por criterios renales como se indica en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2006/0024295. Lupus nefritis es diagnosticado y clasificado opcionalmente como lupus nefritis clase I, clase II, clase III, clase IV, clase V o clase VI por ISN/WHO, por ejemplo como se resume en Weening et al. (2004) "The classi fication of glomerulonephri tis in systemic lupus erythematosus revisited" Kidney International 65:521-530. El "tratamiento" de un sujeto en la presente, se refiere tanto a tratamiento terapéutico y medidas profilácticas o preventivas. Aquéllos en necesidad de tratamiento incluyen aquéllos ya con lupus (u otra condición o alteración autoinmune tal como MS, artritis reumatoide o enfermedad intestinal inflamatoria) , así como aquéllos en los cuales el lupus (u otra alteración) va a ser prevenida. De aquí que, el sujeto puede haber sido diagnosticado por tener lupus (u otra alteración) o puede estar predispuesto o susceptible al lupus (u otra alteración ) . El término "mejora" o "mejoramiento" como se usa en la presente, se refiere a una disminución, reducción o eliminación de una condición, enfermedad, alteración o fenotipo, en los que se incluye una anormalidad o síntoma. Un "síntoma" de una enfermedad o alteración (por ejemplo, lupus) es cualquier fenómeno mórbido o desviación de la normal en estructura, función o sensación, experimentada por un sujeto e indicador de enfermedad. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que es efectiva para prevenir, mejorar o tratar una enfermedad o alteración (por ejemplo, lupus, MS, artritis reumatoide o enfermedad intestinal inflamatoria). Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo se refiere a una cantidad de anticuerpo que es efectiva para prevenir, mejorar o tratar la enfermedad o alteración especificada. De manera similar, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una combinación de un anticuerpo y un segundo compuesto se refiere a una cantidad del anticuerpo y una cantidad del segundo compuesto que, en combinación, son efectivos para prevenir, mejorar o tratar la enfermedad o alteración especi ficada . Se comprenderá que la terminología de "una combinación de" dos compuestos, no significa que los compuestos tienen que ser administrados en mezcla entre si. Asi, el tratamiento con o uso de tal combinación abarca una mezcla de los compuestos o la administración separada de los compuestos, e incluye la administración en el mismo día o días diferentes. Asi, la terminología "combinación" significa dos o más compuestos que son usados para el tratamiento, ya sea indi idualmente o en mezcla entre sí. Cuando un anticuerpo y un segundo compuesto, por ejemplo, son administrados en combinación a un sujeto, el anticuerpo está presente en el sujeto en un tiempo cuando el segundo compuesto está también presente en el sujeto, ya sea que el anticuerpo y el segundo compuesto sean administrados individualmente o en mezcla, al sujeto. El antígeno CD4 ó "CD4" es una glicoproteína expresada sobre la superficie de linfocitos T, así como ciertas otras células. Otros nombres para CD4 en la literatura, incluyen grupo de diferenciación 4 y L3T4. CD4 es descrito, por ejemplo, en la entrada 186940 en la base de datos Online Mendelian Inheritance in Man, en world wide web en www (punto) ncbi (punto) nlm (punto) nih (punto) gov/Omim. Un "anticuerpo CD4" es un anticuerpo que se enlaza a CD4 con suficiente afinidad y especificidad. Por ejemplo, el anticuerpo se enlaza opcionalmente a CD4 con una afinidad y especificidad por CD4 que son comparables a o sustancialmente similares a la afinidad de enlace y especificidad de un anticuerpo TRX1 por CD4. Como se usa en la presente, un "anticuerpo CD4", un "anticuerpo anti-CD4 " y un "anti-CD4" son términos equivalentes y son usados de manera indistinta. Un "anticuerpo CD4 no agotante" es un anticuerpo CD4 que agota menos del 50% de células CD4+, preferiblemente menos del 25% de CD4+ y más preferiblemente menos del 10% de células CD4+. Por el contrario, un "anticuerpo CD4 agotante" es un anticuerpo CD4 que agota el 50% o más de células CD4+ o aún 75% o más ó 90% o más de células CD4+. El agotamiento de células CD4+ (por ejemplo, reducción en niveles de células CD4+ circulantes en un sujeto tratado con el anticuerpo) , puede ser obtenido mediante varios mecanismos, tales como citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo, citotoxicidad dependiente del complemento, inhibición de proliferación de células T y/o inducción de muerte de células T. El término "anticuerpo" en la presente, es usado en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecí fieos (por ejemplo, anticuerpos biespecí fieos ) formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo) , en tanto que exhiban la afinidad biológica deseada (por ejemplo, enlace de CD4 ) .

Un anticuerpo es una proteina que comprende uno o más polipéptidos sustancial o parcialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina . Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, también como una miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. "Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende de preferencia la región de enlace al antígeno del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab ' , F(ab' )2 y fragmentos Fv, diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena y anticuerpos muí tiespecí ficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Un "anticuerpo intacto" es uno que comprende dominios variables pesados y ligeros así como una región de Fe. "Anticuerpos naturales" son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas &H) . Cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada por un enlace de disulfuro covalente, en tanto que el número de enlaces de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y cadena ligera tiene también puentes de disulfuro de intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en el extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primero dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cdadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y son usados en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular por su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida igualmente en todos los dominios variables de anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos llamados regiones hipervariables , tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las regiones más altamente conservadas de dominios variables son llamadas las regiones de estructura (FR) . Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cada uno cuatro FR, que adoptan extensamente una configuración de hoja ß, conectadas mediante tres regiones hipervariables , que forman bucles que conectan y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja ß. Las regiones hipervariables en cada cadena son mantenidas conjuntamente en proximidad estrecha por las FR y con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace-antigeno de anticuerpos (véase Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md . (1991) ) . Los dominios constantes no están involucrados directamente en el enlace de un anticuerpo a un antigeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo. La digestión de papaina de anticuerpos produce dos fragmentos de enlace de antigeno idénticos llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de enlace de antigeno y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su habilidad para cristalizar rápidamente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab' )2 que tiene dos sitios de enlace al antigeno y es todavía capaz de reticular el antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de antigeno y de enlace al antigeno completo. Esta región consiste de un dimero de un dominio variable de cadena pesada y de cadena ligera en fuerte asociación no covalente. Es en esa configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace al antigeno sobre la ' superficie del dimero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de enlace al antigeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres regiones hipervariables especificas para un antigeno) tiene la habilidad de reconocer y enlazar antigeno, aunque a una afinidad más baja que todo el sitio de enlace. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena pesada y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos de Fab' difieren de los fragmentos de Fab por la adición de unos cuantos residuos en el término carboxi del dominio CH1 de cadena pesada, que incluye una o más cisteinas de la región de engozne de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab1 en el cual el (los) residuo (s) de cisteina de los dominios constantes llevan por lo menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab' )2 originalmente fueron producidos como pares de fragmentos de Fab ' que tienen cisteinas de engozne entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo son también conocidos. Véase por ejemplo, Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999) , para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpo . En tanto que varios fragmentos de anticuerpo son definidos en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, aquél de habilidad en el arte apreciará que tales fragmentos pueden ser sintetizados de novo, ya sea químicamente o al utilizar metodología de ADN recombinante . Así, el término "anticuerpo" como se usa en la presente, incluye anticuerpos o fragmentos de los mismos, ya sea producidos por la modificación de anticuerpos enteros o sintetizados de novo utilizando metodologías de ADN recombinante . Las "cadenas ligeras" de anticuerpos ( inmunoglobulinas ) de cualquier especie de vertebrados puede ser asignada a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (?) y lambda (?) , basados en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos pueden ser asignados a diferentes clases. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e Ig , y varios de éstos pueden ser divididos adicionalmente en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos son llamados a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobul inas son bien conocidas . "Fv de una sola cadena" o fragmentos de anticuerpo de "scFv" que comprenden los dominios de VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido Fv además comprende un enlazador de polipéptido entre los dominios de VH y VL, que permite que el scFv forme la estructura deseada para el enlace de antigeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol . 113, Rosenburg y Moore eds . , Springer-Verlag, Nueva York, págs . 269-315 (1994) . El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de enlace al antigeno, tales fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL) . Al utilizar un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antigeno. Los diacuerpos son descritos más plenamente en, por ejemplo, La Patente Europea EP 404,097; Publicación Internacional de Patente WO 1991/11161 y Hollinger et al Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) . El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialment e homogéneos; es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se enlazan al mismo epitopo, excepto por posibles variables que pueden surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, tales variantes generalmente están presentes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen comúnmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos) , cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante sobre el antigeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que están sin contaminar por otras inmunoglobulinas . El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo al ser obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no se interpretará que requiera la producción del anticuerpo mediante algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de conformidad con la presente invención, pueden ser elaborados mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al, Nature, 256:495 (1975) , o pueden ser fabricados mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo la Patente Norteamericana No. 4,816,567) . Los "anticuerpos monoclonales" pueden también ser aislados de bibliotecas de anticuerpo de fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) , por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" ( inmunoglobulinas ) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, en tanto que el resto de la (s) cadena (s) es idéntica con u homologa con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, también como fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada (Patente Norteamericana No. 4,816,567; Morrison et al., Proc . Wat'I Acad. Sel. USA, 81:6851-6855 (1984) ) . Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpo "primat i zados " que comprenden secuencias de enlace al antígeno de dominio variable derivados de un primate no humano (por ejemplo, Mono del Viejo Mundo, tal como babuino, Rhesus o mono cynomolgus) y secuencias de región constante humanas (Patente Norteamericana No. 5,693,780) . Las formas "humanizadas" de anticuerpo no humanos (por ejemplo murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobul ina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los cuales los residuos de una región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) , tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunas instancias, residuos de región de estructura (FR) de la inmunoglobul ina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no son encontrados en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sus tancialmente todos de por lo menos uno y comúnmente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquéllos de una inmunoglobul ina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son aquéllas de una secuencia de inmunoglobulina humana, excepto por sust i tución ( es ) de FR como se indica anteriormente. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, comúnmente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986) ; Riechmann et al., Nautre 332:323-329 (1988) ; y Presta, Curr. Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992) . El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables por el enlace de antigeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región que determina la complementariedad" o "CDR" (véase por ejemplo, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed . Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md . (1991) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (véase, por ejemplo Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) ) . Residuos de "estructura" o residuos "FR" son aquellos residuos del dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como se definen en la presente.

Los términos "receptor de Fe" y "FcR" son usados para describir un receptor que se enlaza a la región de Fe de un anticuerpo. Los FcR son revisados en Ravetch y Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol 9:457-92; Capel et al. (1994) Immunomethods 4:25-34/ y de Haas et al. (1995) J. Lab. Clin. Med . 126:330-41. Otros FcR, en los que se incluyen aquéllos a ser identificados en el futuro, son abarcados por el término "FcR" en la presente. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, el cual es responsable por la transferencia de IgG maternales al feto (Guyer et al. (1976) J. Immunol. 117:587 y Kim et al. (1994) J. Immunol . 24:249) . Un "fragmento de enlace de CD4" de un anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que retiene la habilidad para enlazarse a CD4. Como se indica, el fragmento es producido opcionalmente mediante digestión del anticuerpo intacto o sintetizado de novo. Un "epitopo" es la región especifica de una molécula antigénica que se enlaza a un anticuerpo. La frase " sustancialmente similar" o "sustancialmente el mismo", tal como se utiliza en la presente, denota un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (en general uno asociado con un anticuerpo de la invención, y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparador) de tal manera que 4 aquél de habilidad en el arte consideraría la diferencia entre los dos valores que es de poco o ningún significado biológico y/o estadístico en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd) . La diferencia entre dichos dos valores es preferiblemente menor de aproximadamente 50%, preferiblemente menor de aproximadamente 40%, preferiblemente menor de aproximadamente 30%, preferiblemente menor de aproximadamente 20%, preferiblemente menor de aproximadamente 10%, como función del valor del anticuerpo de referencia/comparador. "Afinidad de enlace" se refiere en general a la intensidad o fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de enlace de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su socio de enlace (por ejemplo, un antígeno) . A no ser que se indique de otra manera, tal como se utiliza en la presente, "afinidad de enlace" se refiere a la afinidad de enlace intrínseca que refleja una interacción de 1:1 entre miembros de un par de enlace (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X por su socio Y puede en general ser representada por la constante de disociación (Kd) . La afinidad puede ser medida mediante métodos comunes conocidos en el arte, en los que se incluyen aquéllos descritos en la presente. Los anticuerpos de baja afinidad se enlazan en general al antígeno lentamente, y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad en general se enlazan al antigeno más rápido y tienden a permanecer enlazados por más tiempo. Una variedad de métodos para medir la afinidad de enlace son conocidos en el arte, cualquiera de los cuales pueden ser usados para propósitos de la presente invención. Modalidades ilustrativas especificas son descritas en lo siguiente . En una modalidad, la "Kd" o "valor de Kd" de conformidad con la presente invención, es medida mediante un análisis de enlace de antigeno radiomarcado (RIA) efectuado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antigeno, como se describe por el siguiente análisis que mide la afinidad de enlace en solución de Fab por el antigeno al equilibrar el Fab con una concentración mínima de antígeno [ 125I ] -marcado en presencia de una serie de titulación de antígeno sin marcar, luego se captura el antígeno enlazado con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (Chen et al. (1999) J. Mol. Biol . 293:865-881) . Para establecer las condiciones para el análisis, las placas de microtitulación (Dynex) son recubiertas durante toda la noche con 5 g/mL de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9.6) , y subsecuentemente bloqueado con albúmina de suero bovino al 2% (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (a aproximadamente 23°C) . En una placa no adsorbente (Nunc #269620) , [ 125I ] -antigeno 100 pM ó 26 pM son mezclados con diluciones seriales de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con la determinación de un anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599) . Luego, el Fab de interés es incubado durante toda la noche; sin embargo, la incubación puede proseguir durante un periodo más largo (por ejemplo, 65 horas) , para asegurar que se llegue al equilibrio. Después de esto, las mezclas son transferidas a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora) . Luego la solución es removida y la placa lavada ocho veces con Tween-20 al 0.1% en PBS. Cuando las placas han secado, se agregan 150 L/cantidad de agente de centelleo (MicroScint™-20 ; Packard) , y las placas son contadas sobre un contador gamma Topcount® (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menor o igual al 20% de enlace máximo, son escogidas para uso en análisis de enlace competitivos. De acuerdo con otra modalidad, la Kd o valor de Kd, es medido al utilizar análisis de resonancia de plasmón superficial utilizando un dispositivo BIAcore®-2000 o un dispositivo BIAcore®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con fragmentos de CM5 de antigeno inmovilizados a -10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips biodetectores de dextrano carboximetilados (CM5, BIAcore Inc.) son activados con clorhidrato de N-etil- '-( 3-dimetilaminopropil ) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de conformidad con las instrucciones del proveedor. El antigeno es diluido con acetato de sodio 10 mM, pH 4.8, a 5 pg/mL (-0.2 pM) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 pL/min., para obtener aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteina acoplada. Enseguida de la inyección de antigeno, se inyecta etanolamina 1M para bloquear los grupos que no reaccionaron. Para mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones seriales dos veces de Fab (0.78 nM a 500 nM) en PBS con Tween-20 al 0.05% (PBST) a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 pL/minuto. Las velocidades de asociación (kencendido) y velocidades de disociación (kapagado) son calculadas utilizando un modelo de enlace de Langmuir de uno a uno simple (Elementos de programación de Evaluación BIAcore®, versión 3.2) al ajustar simultáneamente el sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación al equilibrio (Kd) es calculada como la proporción de kapagado/ ^encendido- Véase por ejemplo, Chen et al. (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Si la velocidad de encendido excede de 106 M'1s"1 por el análisis de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad de encendido puede ser determinada al utilizar una técnica de apagado fluorescente que mide el incremento o disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25°C de un anticuerpo anti-antigeno 20 n (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en presencia de concentraciones incrementadas de antigeno, tal como se mide en un espectrómetro, tal como un espect rofotómetro equipado con retención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro 8000-series SLM-Aminco® (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. Una "secuencia de aminoácidos" es un polímero de residuos de aminoácidos (una proteína, polipéptido, etc.) o una serie de caracteres que representa un polímero de aminoácido, dependiendo del contexto. El término "agente inmunosupresor " como se utiliza en la presente para terapia, se refiere a sustancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmune del mamífero que está siendo tratado en la presente. Esto incluiría sustancias que suprimen la producción de citocina, regulan descendentemente o suprimen la expresión del auto-antí geno o enmascaran los antí genos del MHC . Ejemplos de tales agentes incluyen pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sustituidas (véase la Patente Norteamericana No. 4,665,077) ; fármacos antiinflamatorios no esferoidales (NSAID) ; ganciclovir, tacrolimus, glucocorticoides tales como cortisol o aldosterona, agentes antiinflamatorios tales como un inhibidor de ciclooxigenasa, un inhibidor de 5-lipoxigenasa o un antagonista del receptor de leucotrieno; antagonistas de purina tales como azatioprina o micofenatolato mofetil (MMF) ; agentes alquilantes tales como ciclofosfamida; bromocript ina ; danazol; dapsona; glutaraldehido (que enmascara los antigenos MHC, como se describe en la Patente Norteamericana No. 4,120,649) ; anticuerpos antiidiotipicos para antigenos de MHC y fragmentos de MHC; ciclosporina A; esferoides tales como cort icos teroides o glucocorticosteroides o análogos de glucocorticoide, por ejemplo prednisona, metilprednisolona y dexametasona ; inhibidores de dihidrofolato reductasa tales como metotrexato (oral o subcutáneo) ; hidroxicloroquina ; sulfasalazina; leflunomida; citocina o anticuerpos receptores de citocinas en los que se incluyen anti-interferón-alfa, -beta o anticuerpos -gamma, anticuerpos del factor alfa de necrosis antitumoral (infliximab o adalimumab) , inmunoadhesina anti-TNF-a ( etanercept ) , anticuerpos del factor beta de necrosis antitumoral, anticuerpos anti-interleucina-2- y anticuerpos del receptor anti-IL-2; anticuerpos anti-LFA-1, incluyendo anticuerpos anti-CDlla y anticuerpos anti-CD18; globulina anti-linfocito heteróloga, anticuerpos pan-T, de preferencia anti-CD3; péptido soluble que contiene un dominio de enlace de LFA-3 (Publicación Internacional de Patente WO 1990/08187 publicada el 26 de julio del 1990) ; est reptocinasa ; TGF-beta; est reptodornasa ; ARN o ADN del huésped; FK506; RS-61443; desoxiespergualina ; rapamicina; receptor de células T (Cohoen et al., Patente Norteamericana No. 5,114,721) ; fragmentos del receptor de células T (Offner et al., Science, 251:430-432 (1991) ; Publicación Internacional de Patente 1990/11294; Ianeway, Nature, 341:482 (1989) ; y Publicación Internacional de Patente 1991/01133) ; y anticuerpos del receptor de células T (Patente Europea EP 340,109) tal como T10B9. El término "agente citotóxico" tal como se utiliza en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de células y/o provoca destrucción de células. El término se propone incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Smlb3, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéut icos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimát reamente activas de origen bacteriano, fúngico, de plantas o animales, o fragmentos de las mismas . Un "agente quimioterapéutico " es un compuesto químico comúnmente útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéut icos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida de CYTOXAN®; alqui lsul fonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas en los que se incluyen altretamina, trietilenmelamina , trietilenfosforamida , trietilentiofosforamida y trimetilolmlemina ; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona ) ; una camptotecina (en los que se incluyen el análogo sintético topotecán) ; briostatina; calistatina ; CC-1065 (en los que se incluyen sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bi zelesina ) ; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (en los que se incluyen los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-T 1) ; eleuterobina ; pancratistatina; una sarcodictina ; espongistat ina ; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, est ramust ina , ifosfamida, mecloretamina , clorhidarto de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina , fenesterina, prednimus tina , trifosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, moustina, nimustina y ranimustina ; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gammall y calicheamicina omegall (véase por ejemplo Agnew, Chem Intl. Ed. Engl . , 33: 183-185 (1994) ) ; dinemicina, en los que se incluyen dinemicina A; bifosfonatos , tales como clodronato ; una esperamicina ; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos antibióticos de enediina cromoproteína relacionados, aclacinomisinas , actinomicina , autramicina, azaserina, bleomicinas, cact inomicina , carabicina, carminomicina, carzinofilina, clormomicinas , dactinomicina, daunorubicina , detorubicina , 6-diazo-5-oxo-L-norleucina , doxorubicina de ADRIAMYCIN® (en los que se incluyen morfolino-doxorubicina , cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y desoxidoxorubicina ) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina , mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina , olivomicinas , peplomicina, pot fi romicina , puromicina, quelamicina, rodorubicina , estreptoni trina , estreptozocina , tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina , t rimetrexato ; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina , tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales com ancitabina, azacitidina, 6-azauridina , carmofur, citarabina, didesoxiuridina , doxifluridina, enocitabina, floxoridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona , epitiostanol , mepi t iostano , tes tolactona ; ant i-adrenales tales como aminoglutet imida , mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolinico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida ; ácido aminolevulinico ; eniluracilo; amsacrina; best rabuilo ; bisantreno; edatraxato; defofamina; deraecolcina; diaziquona; el romi t ina ; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lindainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona ; mi toxant roña ; mopidanmol; nitraerina; pentos tat ina ; fenamet; pirarubicina ; losoxant roña ; ácido podofilinico; 3-etilhidrazida ; procarbazina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg. ) ; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio ; ácido tenuazónico ; traiziquona; 2,2' ,2"-triclorotrietilamina ; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobroni tol / mitolactol; pipobromano ; gacitosina; arabinósido ("Ara-C") ; ciclofosfamida ; tiotepa; taxoides, por ejemplo paclitaxel TAXOL® (Bristol-Yers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) ; Cremóforo-libre , formulación de nanoparticulas albúmina-diseñadas de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, III) y doxetaxel TAXOTERE® ( Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clorambucil; gemcitabina GEMZAR®; 6-t ioguanina ; mercaptopurina ; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino ; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); i fos famida ; mitoxantroña ; vincristina ; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina ; aminopterina ; xeloda; ibandronato ; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina ; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores . También incluidos en esta definición se encuentran agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas tales como antiestrógenos y moduladores del receptor de estrógeno selectivo (SER ), en los que se incluyen por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®) , raloxifeno, droloxifeno, 4 -hidroxitamoxi feno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno fareston®; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regulan la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como por ejemplo 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida , acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestano, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® y anastrozol ARIMIDEX®; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida , leuprolida, y goserelina; asi como troxacitabina (un análogo de citosina nucleósido de 1,3-dioxolano) ; oligonucleótidos antisentido, particularmente aquéllos que inhiben la expresión de qenes en rutas de señalización implicadas en proliferación de células aberrantes, tal como por ejemplo PKC-alfa, Raf y H-Ras; vacunas tales como vacunas de terapia genética, por ejemplo vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; rlL-2 PROLEUCIN®; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®, rmRH ABARELIX®; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores . El término " citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población de células que actúa sobre otra célula como mediadores int racelulares . Ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas; interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1A, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-a o TNF-ß y otros factores de polipéptidos en los que incluyen LIF y el ligando kit (KL) . Tal como se utiliza en la presente, el término "citocina" incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia natural, en las que se incluyen entidades de molécula pequeña producidas sintéticamente y derivados y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos . El término "hormona" se refiere a hormonas de polipéptido, que son en general secretadas por órganos glandulares con ductos . Incluidas entre las hormonas, están, por ejemplo, hormona del crecimiento, tal como la hormona del crecimiento humano, hormona del crecimiento humano N-metionilo y la hormona del crecimiento bovino; hormona paratiroides ; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteina tales como hormona estimuladora de folículo (FSH), hormona estimulante de tiroides (TSH), y hormona luteinizante (LH); prolactina, lactógeno placental, péptido gonadotropina-asociado de ratón, inhibina; activina; sustancia inhibidora de muleriano; y trombopoyetina . Tal como se utiliza en la presente, el término "hormona" incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de la hormona de secuencia natural, en las que se incluyen entidades de molécula pequeña producidas sintéticamente y derivados y sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. El término "factor de crecimiento" se refiere a proteínas que promueven el crecimiento e incluyen, por ejemplo, factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; factor de crecimiento endotelial vascular; factores de crecimiento de nervios tales como NGF-ß; factor del crecimiento derivado de plaquetas; factores de crecimiento transformante (TGF) tales como TGF-a y TGF-ß; factor I y II del crecimiento semejante a insulina; eri t ropoyetina (EPO) ; factores osteoinductores ; interferones tales como interferón-a, -ß y -?; y factores estimuladores de colonia (CSF) , tal como macrófago-CSF (M-CSF) ; granuloci to-macrófago-CSF (GM-CSF) ; y granuloci to-CSF (G-CSF) . Tal como se utiliza en la presente el término factor de crecimiento incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos del factor de crecimiento de secuencia natural, en los que se incluyen entidades de molécula pequeña producidas sintéticamente y derivados de sales farmacéuticamente aceptable de las mismas . Para los propósitos de la presente, el término "factor-alfa de necrosis tumoral" (TNF-alfa) " se refiere a una molécula de TNF-a humana que comprende la secuencia de aminoácidos como se describe en Pennica et al., Nature, 312:721 (1984) o Aggarwal et al., JBC, 260:2345 (1985) . Un "inhibidor de TNF-alfa" en la presente, es un agente que inhibe, a alguna extensión, una función biológica de TNF-alfa, en general por medio de enlace a TNF-alfa y que neutraliza su actividad. Ejemplos de inhibidores de TNF contemplados específicamente en la presente, son etanercept (ENBREL®) infliximab (REMICADE®) y adalimumab ( HUMI RA™ ) . Ejemplos de "fármacos antiinflamatorios no esferoidales" o "NSAID" son ácido acetilsalicilico, ibuprofeno, naproxeno, indometacina , sulindac, tolmetina, en los que se incluyen sales y derivados de los mismos, etcétera . El término "integrina" se refiere a una proteina receptora que permite que las células se enlacen a y respondan a la matriz extracelular y está involucrada en una variedad de funciones celulares tal como cicatrización de heridas, diferenciación celular, albergue de células de tumor y apoptosis. Son parte de una gran familia de receptores de adhesión celular que están involucrados en interacciones de matriz célula-ext racelular e interacciones célula-célula. Las integrinas funcionales consisten de dos subunidades de glicoproteina de transmembrana, denominadas alfa y beta, que no están enlazadas covalentemente . Las subunidades alfa comparten todas algo de homología entre sí, como las subunidades beta. Los receptores siempre contienen una cadena alfa y una cadena beta. Ejemplos incluyen aßß?, a3ß1, a7ß1, LFA-1, etcétera. Como se usa en la presente, el término "integrina" incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de la integrina de secuencia natural, en las que se incluyen entidades de molécula pequeña producidas sintéticamente y derivados y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Una "a4-integrina" es la subunidad a4 de a4-ß1 y a4-ß7 integrinas, que son expresadas sobre la superficie de leucocitos diferentes a los neutrófilos. Ejemplos de "antagonistas o anticuerpos de integrina" en la presente, incluyen un anticuerpo LFA-1, tal como efalizumab (RAPTIVA®) disponible comercialmente de Genentech, o un anticuerpo de alfa 4 integrina (por ejemplo, un "anticuerpo a4-integrina" es un anticuerpo que se enlaza a a4 -integrina ) , tal como natalizumab (Tysabri®) disponible de Biogen, o derivados de fenilalanina diazaciclicos (Publicación Internacional de Patente WO 2003/89410) , derivados de fenilalanina (Publicaciones Internacionales de Patente WO 2003/70709, WO 2002/28830, WO 2002/16329 y WO 2003/53926) , derivados de ácido fenilpropiónico (Publicación Internacional de Patente WO 2003/10135) , derivados de enamina (Publicación Internacional de Patente WO 2001/79173), derivados de ácido propanoico (Publicación Internacional de Patente WO 200/37444) , derivados de ácido alcanoico (Publicación Internacional de Patente WO 2000/32575) , derivados fenilsusti tuidos (Patente Norteamericana No. 6,677,339 y 6,348,463) , derivados de amina aromáticos (Patente Norteamericana No. 6,369,229) , polipéptidos de dominio de desintegrina ADAM (Patente Norteamericana No. 2002/0042368) , anticuerpos para alfavbeta3 integrina (Patente Europea EP 633945) , derivados de aminoácidos biciclicos aza-puenteados (Publicación Internacional de Patente WO 2002/02556) , etcétera. El término "corticosteroide" se refiere a cualquiera de varias sustancias sintéticas o que se presentan de manera estable en la naturaleza con la estructura química general de esferoides que imitan o aumentan los efectos de los corticosteroides que se presentan de manera estable en la naturaleza. Ejemplos de corticosteroides sintéticos incluyen prednisona, prednisolona (en los que se incluyen metilprednisolona) , dexametasona t ramcinolona , y betametasona . Un "marcador de superficie de célula B" o "antígeno de superficie de célula B" en la presente, es un antígeno expresado sobre la superficie de una célula B que puede ser dirigido con un antagonista que se enlaza al mismo. Marcadores de superficie de célula B ejemplares, incluyen los marcadores de superficie de leucocitos CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CD 76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 y CD86 (para descripciones, véase The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Edition. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, harcourt Brace & Co . , Nueva York) . Otros marcadores de superficie de célula B incluyen RP105, FCRH2 , B-CELL CRS, CCR6 , P2X5, HLA-DOB, CXCR5 , FCER2, BR3 , Btig, NAG14, SLGC16270, FcRHl , IRTA2, ATWD578, FcRH3 , IRTA1, FcRH6 , BCMA y 239287. El marcador de superficie de célula B de particular interés, es expresado de preferencia sobre las células B en comparación con otros tejidos que no son de célula B de un mamífero y pueden ser expresados tanto sobre células B precursoras como células B maduras. Un "anticuerpo que se enlaza a un marcador de superficie de célula B", es una molécula que, al enlazarse a un marcador de superficie de célula B, destruye o agota las células B en un mamífero, y/o interfiere con una o más funciones de la célula B, por ejemplo al reducir o impedir una respuesta humoral producida por la célula B. El anticuerpo preferiblemente es capaz de agotar células B (es decir, reducir los niveles de célula B circulante) en un mamífero tratado con el mismo. Tal agotamiento puede ser obtenido vía varios mecanismos tales como Citotoxicidad Moderada por la Célula Dependiente de Anticuerpo (ADCC) y/o Citotoxicidad Dependiente de Complemento (CDC) , inhibición de la proliferación de célula B y/o inducción de muerte de células B (por ejemplo, vía apoptosis) . Un "antagonista" se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades de una proteina particular o especificada, en los que se incluyen su enlace a uno o más receptores en el caso de un ligando o enlace a uno o más ligandos en caso de un receptor. Los antagonistas incluyen anticuerpos y fragmentos de enlace de antigeno de los mismos, proteínas, péptidos, glicoproteíñas , glicopéptidos , glicolípidos , polisacáridos , oligosacáridos , ácidos nucleicos, moléculas bioorgánicas , peptidomimét icos , agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control de transcripción y traducción y los semejantes. Los antagonistas también incluyen inhibidores de molécula pequeña de la proteína y proteínas de fusión, moléculas de receptor y derivados que se enlazan específicamente a la proteína, secuestrando mediante esto su enlace a su objetivo, variantes antagonistas de la proteína, moléculas antisentido dirigidas a la proteína, aptámeros de ARN y ribozimas contra la proteína. Un "antagonista de marcador de superficie de célula B" es una molécula que, en el enlace a un marcador de superficie de célula B, destruye o agota la célula B en un mamífero y/o interfiere con una o más funciones de célula B, por ejemplo al reducir o impedir una respuesta humoral producida por la célula B. El antagonista es preferiblemente apto de agotar las células B (esto es, reducir los niveles de célula B circulante) en un mamífero tratado con el mismo. Tal agotamiento puede ser obtenido vía varios mecanismos tales como ADCC y/o CDC, inhibición de proliferación de células B y/o inducción de muerte de célula B (por ejemplo, vía apoptosis) . Los antagonistas incluidos en el alcance de la presente invención incluyen anticuerpos, péptidos de secuencia sintética o secuencia natural, proteínas de fusión y antagonistas de molécula pequeña que se enlazan al marcador de célula B, opcionalmente conjugado con o fusionado a un agente citotóxico. Ejemplos incluyen pero no están limitados a, por ejemplo, anticuerpos CD20, anticuerpos BR3 (por ejemplo Publicación Internacional de Patente WO 0224909) , BR3-Fc, etcétera . Ejemplos de anticuerpos de CD20 incluyen: "C2B8", que es ahora llamado "rituximab" ( "RITUXAN®" ) , (Patente Norteamericana No. 5,736,137) ; el anticuerpo murino 2B8 itrio- [ 90 ] -marcado desgiando "Y2B8" o "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEV7ALIN®) disponible comercialmente de IDEC Pharmaceuticals , Inc. (Patente Norteamericana No. ,736,137; 2B8 depositado en la ATCC con el No. de acceso HB11388 el 22 de junio de 1993) ; IgG2a murina "Bl", también llamado "Toxitumomab" , opcionalmente marcado con 131I para generar el anticuerpo "131I-B1" o "yodo I131 tositumomab" (BEXXAR™) disponible comercialmente de Corixa (véase también Patente Norteamericana No. 5,595,721) ; anticuerpo monoclonal murino "1F5" (Press et al. Blood 69 ( 2 ) : 584-591 (1987) y variantes de los mismos en los que se incluyen 1F5 "estructura-parchado" o humanizado (Publicación Internacional de Patente 2003/002607, Leung, S . ; ATCC depósito HB-96450) ; 2H7 murino y anticuerpo quimérico 2H7 (Patente Norteamericana No. 5,677,180) ; anticuerpo 2H7 humanizado (véase, por ejemplo, Publicación Internacional de Patente WO 04/056312; Patente Norteamericana No. 20060024295) ; anticuerpos HUMAX-CD20™ (Genmab, Dinamarca) ; los anticuerpos monoclonales humanos resumidos en la Publicación Internacional de Patente WO 2004/035607 (Teeling et al.) ; anticuerpos AME-133™ (Applied Molecular Evolution) ; anticuerpo A20 ó variantes del mismo, tales como anticuerpo A20 quimérico o humanizado (cA20, hA20, respectivamente) (Patente Norteamericana No. 2003/0219433, Immunomedics ) , y anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1 B3, B-Cl ó UN-B2 disponibles de la International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., En: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987) ) . Ejemplos de "fármacos antireumáticos modificadores de enfermedad" o "DMARD" incluyen la hidroxicloroquina , sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, etanercept, linflixamb (más metotrexato oral y subcutáneo) , azatioprina, D-penicilamina , Oro (oral) ; Oro (intramuscular) , minociclina, ciclosporina , inmunoadsorción de proteína A estafilococal , en los que se incluyen sales y derivados de los mismos, etcétera. "CTLA" es expresado sobre linfocitos T activados y está involucrado en la regulación descendente de la respuesta inmune. Otros nombres para CTLA4 en la literatura incluyen antígeno 4 T-linfocito-asociado citotóxico, proteína 4 T-linfoci to-asociada citotóxica, antígeno de diferenciación celular CD152 y proteasa 4 de serina de gránulo T-linfocito-asociada citotóxica. Una variedad de términos adicionales son definidos o de otra manera caracterizados en la presente.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION CD4 es unA glicoproteína de superficie expresada principalmente sobre células de linaje de linfocito T, en los que se incluyen una mayoría de timocitos y un subconjunto de células T periféricas. Bajos niveles de CD4 son también expresados por algunas células no linfoides, aunque el significado funcional de tal distribución celular divergente es desconocido. En células T maduras, CD4 sirve para una función de co-reconocimiento por medio de interacción con moléculas Clase II de MHC expresadas en células que presentan antígeno. Las células T CD4+ constituyen principalmente el subconjunto auxiliar que regula las funciones de célula T y B durante respuestas dependientes T a infecciones virales, bacterianas, fúngales y parásitas. Durante la patogénesis de enfermedades autoinmunes, en particular cuando la tolerancia a auto-antigenos se rompe, las células T CD4 + pueden contribuir a respuestas inflamatorias que dan como resultado destrucción de articulación y tejido. Estos procesos son facilitados, por ejemplo, por el reclutamiento de células inflamatorias de linaje hematopoyético , producción de anticuerpos, citocinas inflamatorias y mediadores y mediante la activación de células exterminadoras . Las células T CD4+ han estado implicadas en las patogénesis de lupus. Por ejemplo, células T CD4+ están presentes en sitios de glomerulonefritis . Células T CD4+ de pacientes de SLE son reportadas para ser hiper-sensibles a antigeno y resistencias a apóptosis in vitro. Las células T CD4+ auto-antigeno-especificas se pueden soportar la producción de auto-anticuerpos por células B (células CD4+ efectoras/memoria que producen IFN-?) están presentes en pacientes con SLE. Además, se observa una fuerte asociación entre alelos de Clase II de MHC y el riesgo por SLE. Células T CD4+ han estado implicadas similarmente en la patogénesis de MS . Por ejemplo, células T auxiliares de CD4+ están involucradas en la patogénesis de MS y un modelo de laboratorio correspondiente, encefalomielitis alérgica experimental (EAE) y animales de laboratorio agotados de células T exhiben una pérdida de habilidad por desarrollar EAE (USPN 4,695,459 expedida a Steinman et al. Intitulada "Method of treating autoimmune diseases that are mediated by Leu3/CD4 phenotype T cells", Traugott et al. (1983) "Múltiple sclerosis: distribution of T cell subsets. within active chronic lesions" Science 219:308-310, Arnason et al. (1962) "Role of the thymus in immune reaction in rats: II. Suppressive effect of thymectomy at birth on reactions of delayed (cellular) hypersensit ivity and the circulating small lymphocyte" J Exp Med 116:177-186, y Gonatas and Howard (1974) "Inhibition of experimental allergic encephalomyelitis in rats severely depleted of T cells" Science 186:839-841) . Células T de CD4+ y CD8+ son encontradas en lesiones de MS; se sabe que ambos producen citocinas inflamatorias, aunque su contribución negativa a la patogénesis no ha sido determinada. Se observa un incremento de 4 veces en la frecuencia de células CD4+ mielina-específicas en la sangre de pacientes con MS . Varios fármacos usados actualmente o los cuales la mayoría serán usados para tratamiento de MS se cree que trabajan, en parte, por medio de su acción sobre células T; por ejemplo, Tysabri® (natalizumab, anticuerpo alfa-4 integrina) , CamPath® (alemtuzumab, anticuerpo CD52) y daclizumab (anticuerpo IL-2Ra) . Además, un riesgo incrementado de MS está asociado con alelos II de MHC (3.6 veces) y a una extensión menor, alelos de clase I (2 veces) . En un aspecto, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento de lupus, en los que se incluye SLE ¦o y lupus nefritis, al administrar una combinación de anticuerpo CD4 no agotante y otro compuesto utilizado clínica o experimentalmente para tratar lupus. Otro aspecto de la invención proporciona métodos para el tratamiento de lupus nefritis, en los que se incluyen enfermedad de etapa media a tardía, mediante la administración de un anticuerpo CD4 no agotante que da como resultado una mejora en la función renal y/o una reducción en proteinuria o sedimento urinario activo. Todavía otro aspecto de la invención proporciona métodos de tratamiento de MS mediante la administración de un anticuerpo CD4 no agotante, opcionalmente en combinación con otro compuesto usado clínica o experimentalmente para tratar MS . Todavía otro aspecto de la invención proporciona métodos para el tratamiento de receptores de trasplantes o sujetos con enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide, asma, psoriasis, enfermedad de intestino inflamatorio (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa) y síndrome de Sjógren mediante la administración de un anticuerpo CD4 no agotante, comúnmente en combinación con otro compuesto usado clínica o experimentalmente para tratar enfermedad autoinmune.

ANTICUERPOS CD4 Un número de anticuerpos CD4, tanto agotantes como no agotantes, han sido descritos. El uso de tales anticuerpos para inducir tolerancia a antigenos, en los que se incluyen auto-antigenos, también se ha reportado. Véase, por ejemplo, USPN 4,695,459; USPN 6,056,956 expedidas a Cobbold y Waldmann intitulada "Non-depleting anti-CD4 monoclonal antibodies and tolerance induction"; USPN 5,690,933 expedida Cobbold y Waldmann intitulada "Monoclonal antibodies for inducing tolerance"; publicación de solicitud de patente europea 0240344 por Cobbold et al. intitulada "Monoclonal antibodies and their use"; USPN 6,136,310 expedida a Hanna et al. intitulada "Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy"; USPN 5,756,096 expedida a Newman et al. intitulada "Recombinant antibodies for human therapy"; USPN 5,750,105 expedida a Newman et al. intitulada "Recombinant antibodies for human therapy"; USPN 4,381,295 expedida a Kung y Goldstein intitulada "Monoclonal antibody to human helper T cells and methods of preparing same"; Waldmann (1989) "Manipulat ion of T-cell responses with monoclonal antibodies" Ann Rev Immunol 7:407-44; y Wofsy y Seaman (1987) "Reversal of advanced murine lupus in NZB/NZW Fl mice by treatment with monoclonal antibody to L3T4" J Immunol 138:3247-53. En particular, un anticuerpo CD4 no agotante y su uso para inducir tolerancia ha sido descrito en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2003/0108518 por Frewin et al. intitulada "TRX1 antibody and uses therefor" y publicación de solicitud de patente estadounidense 2003/0219403 por Frewin et al. intitulada "Compositions and methods of tolerizing a primate to an antigen", cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia. Anticuerpos CD4 no agotantes ejemplares apropiados para uso en los métodos incluyen los anticuerpos TRX1 descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2003/0108518 por Frewin et al. intitulada "TRX1 anticuerpo y usos therefor" y publicación de solicitud de patente estadounidense 2003/0219403 por Frewin et al. intitulada "Compositions and methods of tolerizing a primate to an antigen". Estos anticuerpos son anticuerpos humanizados que incluyen regiones constantes modificadas de un anticuerpo humano, regiones de estructura de cadena ligera y pesada de un anticuerpo humano y CDR de cadena ligera y pesada derivadas de un anticuerpo monoclonal de ratón. Asi, en una clase de modalidades, el anticuerpo CD4 no agotante es un anticuerpo TRX1 como se muestra en cualquiera de las Figuras 1- . El anticuerpo puede tener una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 6, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 24. En una clase relacionado de modalidades, el anticuerpo comprende un fragmento de enlace de CD4 de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 6, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 24. Anticuerpos que comprenden una o más CDR de un anticuerpo de TRX1 son también útiles en los métodos. Asi, en una clase de modalidades, el anticuerpo CD4 no agotante comprende CDR1 (SEQ ID NO: 25), CDR2 (SEQ ID NO: 26) o preferiblemente CDR3 (SEQ ID NO: 27) de la cadena ligera mostrada en la Figura 1A. El anticuerpo incluye opcionalmente CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera mostrada en la Figura 1A (SEQ ID NOs : 25-27) . Similarmente, en una clase de modalidades, el anticuerpo comprende CDR1 (SEQ ID NO: 28), CDR2 (SEQ ID NO: 29) o preferiblemente CDR3 (SEQ ID NO: 30) de la cadena pesada mostrada en la Figura ID. El anticuerpo incluye opcionalmente CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada mostrada en la Figura ID (SEQ ID NOs : 28-30) . En una clase de modalidades, el anticuerpo comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera mostrada en la Figura 1A y CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada mostrada en la Figura ID (SEQ ID NOs: 25-30) . El anticuerpo también incluye opcionalmente FR1, FR2 y/o FR3 de la cadena ligera mostrada en la Figura 1A, Figura 2A, Figura 3A o Figura 4A y/o FR1, FR2, FR3 y/o FR4 de la cadena pesada mostrada en la Figura ID, Figura 2D, Figura 3D o Figura 4D. Otros anticuerpos ejemplares incluyen, pero no están limitados a anticuerpos que se enlazan al mismo epitopo como un anticuerpo TRX1 (por ejemplo, como un anticuerpo mostrado en cualquiera de las Figuras 1-4) . En donde el sujeto es un humano, el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo humanizado o humano. Será evidente que para el tratamiento de un mamífero no humano, el anticuerpo es opcionalmente adaptado para uso en aquel animal, por ejemplo, mediante incorporación de secuencias de estructura y secuencias de región constante de una inmunoglobulina de un mamífero de la especie apropiada. El anticuerpo es opcionalmente un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo intacto, un fragmento de anticuerpo y/o un anticuerpo natural.

El anticuerpo tiene opcionalmente una función efectora reducida, por ejemplo en comparación con IgGl humana, de tal manera que su habilidad para inducir activación de complemento y/o citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo es disminuida. Por ejemplo, el anticuerpo puede tener enlace reducido (o ningún enlace) al receptor de Fe. Similarmente, el anticuerpo puede tener una porción de Fe aglicosilada . El anticuerpo puede ser opcionalmente un anticuerpo variante anti-CD4 que tiene la habilidad para enlazarse a FcR .

TRATAMIENTO DE LUPUS En un aspecto, la invención proporciona métodos para el tratamiento de lupus en un sujeto mamífero, por ejemplo un sujeto humano, al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo no agotante anti-CD4 y/o un segundo agente. El lupus por el cual el sujeto es tratado es comúnmente lupus eritematoso sistémico (SLE), lupus eritematoso cutáneo (CLE) o lupus nefritis, pero puede ser otra forma de lupus tal como extra-renal, cerebritis, pediátrico, no renal, discoide o alopecia. El lupus a ser tratado puede ser una enfermedad de etapa prematura, media o tardía cuando el tratamiento es iniciado. En modalidades en las cuales se trata lupus nefritis, el lupus nefritis puede ser cualquiera de las clases I-VI. Por ejemplo, el lupus a ser tratado puede ser lupus nefritis mesangioproliferativo (Clase II) o lupus nefritis membranous (Clase V) . Comúnmente, el lupus es lupus nefritis proliferativo (Clase III o Clase IV), tratado con el objetivo de obtener una reducción en proteinuria, una reducción en sedimento urinario activo y normalización o estabilización de función renal. Por ejemplo, la proteinuria (medida como está establecido en el arte, por ejemplo en una medición de proteina de orina de 24 horas, utilizando una barra de inmersión u otros análisis de rutina, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 1 en la presente) puede ser reducida por al menos 25% o por al menos 50%, o aún por al menos 75% o por al menos 90% o la proteinuria puede ser reducida a menos de 1 g/dia o menos de 500 mg/ día. Como otro ejemplo, la proporción de proteina a creatinina en la orina del sujeto puede ser reducida por al menos 25% o por al menos 50% o la proporción puede ser reducida a menos de 1 o menos de 0.5. Similarmente , el sedimento urinario activo (monitoreado como está establecido en el arte, por ejemplo, mediante observación microscópica) puede ser reducido por al menos 25%, por al menos 50%, por al menos 75% o por al menos 90% o solamente el sedimento urinario inactivo (tal como se evidencia por menos de 10 células de sangre/campo de potencia alto y ausencia de vaciado de célula roja y preferiblemente por lo menos de 5 células de sangre roja/campo de alta potencia) pueden permanecer después de inicio del tratamiento. En un aspecto, cuando se trata lupus nefritis, el sujeto exhibe una reducción en proteinuria y/o una reducción en el sedimento urinario activo después del inicio de tratamiento con la combinación. Por ejemplo, la concentración de proteina en la orina del sujeto puede ser reducida a menos de 75%, menos de 50%, menos de 25% o menos de 10% de la concentración en la orina del sujeto antes del inicio del tratamiento con la combinación o a menos de 1 g/dia o menos de 500 mg/dia y/o el sedimento urinario activo puede ser reducido por al menos 25%, por al menos 50%, por al menos 75% o por al menos 90% o solamente el sedimento urinario inactivo puede permanecer después de inicio del tratamiento (por ejemplo, menos de 10 y preferiblemente menos de 5 células de sangre roja/campo de alta potencia) . En una clase general de modalidades, en los métodos, una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de un anticuerpo CD4 no agotante y por lo menos un segundo compuesto es administrada al sujeto para tratar lupus. El anticuerpo CD4 no agotante puede ser cualquiera de aquellos descritos en la presente. El segundo compuesto es comúnmente uno que es usado para tratar lupus, por ejemplo, un estándar de cuidado o tratamiento experimental. Segundos compuestos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, un agente citotóxico; un agente inmunosupresor ; un fármaco ant i-malarial tal como, por ejemplo, hidroxicloroquina , cloroquina o quinacrina; un agente quimioterapéut ico ; un antagonista o anticuerpo de citocina; un factor de crecimiento; una hormona (por ejemplo, tratamiento de remplazo de hormonas); terapia anti-hormonal ; un antagonista o anticuerpo de integrina, por ejemplo, un anticuerpo o antagonista de 4 -integrina ; un antagonista de marcador de superficie de célula B; un anticuerpo a un marcador de superficie de célula B-célula (por ejemplo, un anticuerpo CD20, por ejemplo, Rituximab, también conocido como Rituxan®) ; un anticuerpo o agente de bloqueo CD5, CD28 ó CD40; un corticosteroide , por ejemplo, met ilprednisolona , prednisona tal como prednisona de baja dosis, dexametasona o glucort icoide , por ejemplo, vía inyección de articulaciones, en los que se incluyen terapia de corticosteroide sistémica; un DMARD; o una combinación de cualquiera de los anteriores, etc. Véase también publicaciones de solicitud de patente estadounidense 2006/0024295 y 2003/0219403. En una clase de modalidades, el segundo compuesto es seleccionado de, por ejemplo, ciclofosfamida , mofetil micofenolato, CTLA4-Ig y BR3-Fc. La ciclofosfamida es también conocida por el nombre de marca Cytoxan®. El mofetil micofenolato es también llamado CellCept®, MF o 2-morfolinoet il (E) -6- (1, 3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-???-5-isobenzofuranil ) - -metil-4 -hexenoato . CTLA4-Ig es un dominio extracelular del anticuerpo 4 T-linfocito-asociado citotóxico humano (CTLA-4) enlazado a una porción de Fe modificada de una inmunoglobulina humana, por ejemplo, 7 abatacept (Orencia® de Bristol-Myers Squibb) o RG2077 de RepliGen. Un anticuerpo de a4-integrina ejemplar es natalizumab (Tysabri®) . BR3-Fc, un antagonista soluble de BAFF, es una proteina de fusión que incluye el dominio extracelular de BR3 humano (un receptor de BAFF encontrado sobre células B) y IgGl Fe humano (véase, por ejemplo, Vugmeyster et al. (2006) American Journal de Patology 168: 476-489 y Kayagaki et al. (2002) Immunity 10: 515-524) . Un tercero, cuarto, etc. compuesto es incluido opcionalmente en la combinación; como solo un ejemplo, un cort icosteroide tal como metilprednisolona y/o prednisona puede ser administrado junto con el anticuerpo CD4 y ciclofosfamida . En una modalidad, el sujeto nunca ha sido tratado previamente con fármaco (s) , tal (es) como agente (s) inmunosupresor (es) , para tratar el lupus y/o nunca ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-CD . En otra modalidad, el sujeto ha sido tratado previamente con fármaco (s) para tratar el lupus y/o ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-CD4. En una modalidad adicional, el sujeto no tiene artritis reumatoide. En todavía una modalidad adicional, el sujeto no tiene esclerosis múltiple. En todavía otra modalidad, el sujeto no tiene una enfermedad autoinmune diferente a lupus. Una "enfermedad autoinmune" en la presente, es una enfermedad o alteración que surge de y dirigida contra los propios tejidos u órganos del individuo o un co-segregado o manifestación del mismo o condición resultante de la misma. En una modalidad, se refiere a una condición que resultada de o es agravada por la producción por células B de anticuerpos que son reactivos con tejidos y antigenos del cuerpo normales. En otras modalidades, la enfermedad autoinmune es una que involucra la secreción de un auto-anticuerpo que es especifico para un epitopo de un auto-antigeno (por ejemplo, un antigeno nuclear) . En una modalidad, antes del inicio del tratamiento con la combinación, el sujeto exhibe proteinuria, tal proteinuria es mejorada por el tratamiento. Por ejemplo, antes del inicio del tratamiento, el sujeto puede exhibir proteinuria mayor de 500 mg/dia, mayor de 1000 mg/dia, mayor de 2000 mg/dia, o mayor de 3500 mg/dia; después del inicio del tratamiento, la proteinuria puede ser reducida por al menos 25% o por al menos 50%, o aún por al menos 75% o por al menos 90% o la proteinuria puede ser reducida a menos de 1 g/dia o menos de 500 mg/dia, por ejemplo, como se determina por una medición de proteina en la orina de 24 horas. Una disminución en la proporción de proteina a creatinina puede ser similarmente monitoreada. Los niveles de proteina y creatinina en la orina pueden ser medidos como está establecido en el arte, por ejemplo, mediante determinación de la proporción de proteina a creatinina en la orina de mancha, por ejemplo, de una muestra de orina aleatoria. En una modalidad, antes del inicio del tratamiento con la combinación, el sujeto exhibe una proporción de proteina a creatinina mayor de 0.5, mayor de 1, o mayor de 2; después del inicio del tratamiento, la proporción de proteina a creatinina puede ser reducida, por ejemplo a menos de 1 (por ejemplo, para una respuesta parcial al tratamiento) o a menos de 0.5 (por ejemplo, para una plena respuesta) . Después del inicio del tratamiento, la proporción de proteina a creatinina puede ser reducida por al menos 25% o por al menos 50%, en comparación con el valor de pre-tratamiento . En una modalidad, antes del inicio del tratamiento con la combinación, el sujeto exhibe proteinuria de intervalo nefrótico, con una proporción de proteina a creatinina mayor de 3; después del inicio del tratamiento, la proporción de proteina a creatinina es reducida a menos de 3 u opcionalmente por al menos 25% o por al menos 50% o a menos de 2 o menos de 1. La respuesta al tratamiento de lupus, en los que se incluyen lupus nefritis, con la combinación puede también ser determinada, por ejemplo, al monitorear los niveles de complemento, niveles de auto-anticuerpo y/o actividad de enfermedad global. Por ejemplo, la normalización de los niveles de complemento (por ejemplo, C3, C4 y CH50) pueden ser indicadores del tratamiento exitoso. Similarmente , después del inicio del tratamiento, los niveles de autoant icuerpos tales como anticuerpos de ADN anti-doble hebra, ANA y anti-Clq pueden ser reducidos, por ejemplo, por al menos 25%, por al menos 50% o por al menos 75%. También se puede observar mejora en biopsia renal como indicadora de tratamiento exitoso. Opcionalmente , antes del inicio del tratamiento con la combinación, el sujeto muestra síndrome nefrótico. La diagnosis de síndrome nefrótico puede ser efectuado como está establecido en el arte. Algunos signos, síntomas u otros indicadores que pueden ser usados para diagnosticar síndrome nefrótico incluyen proteína en la orina de 24 horas mayor de 3.5 g/día, proporción de proteína a creatinina mayor de 3, hipoalbuminemia (bajo nivel de albúmina en la sangre), edema (hinchamiento) , especialmente alrededor de los ojos, pies y manos y/o hipercolesterolemia (alto nivel de colesterol en la sangre) . La invención no está limitada a estos signos, síntomas, u otros indicadores de síndrome nefrótico. El síndrome nefrótico es opcionalmente mejorado mediante tratamiento con la combinación. Por ejemplo, el sujeto exhibe opcionalmente una reducción en proteinuria a menos de 3.5 g/día después del inicio del tratamiento, por ejemplo, a menos de 3 g/día, menos de 2 g/día, menos de 1 g/día, o aún menos de 0.5 g/día y/o una reducción en la proporción de proteína a creatinina a menos de 3 después del inicio del tratamiento, por ejemplo, a menos de 2, menos de 1, o aún menos de 0.5. El tratamiento del sujeto con la combinación puede tener beneficios considerables para el sujeto, por ejemplo en reducción en efectos secundarios indeseables. Por ejemplo, la cantidad del segundo compuesto (por ejemplo, ciclofosfamida ) requerida para el tratamiento en combinación con el anticuerpo CD4 no agotante puede ser considerablemente menor que la cantidad requerida para mejorar síntomas por medio de tratamiento con el segundo compuesto solo. Por ejemplo, la ciclofosfamida puede producir efectos secundarios serios; el uso de menos del fármaco para obtener el tratamiento, por consiguiente, es altamente deseable. En un aspecto, los métodos incluyen tratamiento del sujeto con un anticuerpo CD4 no agotante y el segundo compuesto para reducir síntomas y luego proseguir con el tratamiento del sujeto con el anticuerpo CD4 no agotante (no en combinación con el segundo compuesto) para mantener la remisión. Por ejemplo, el sujeto puede ser tratado con una combinación del anticuerpo CD4 no agotante y ciclofosfamida, mofetil micofenolato o CTLA4-Ig para reducir síntomas y luego tratado con el anticuerpo CD4 no agotante solo (esto es, no en combinación con la ciclofosfamida, mofetil micofenolato o CTLA4-Ig (para mantener la remisión) . Tales métodos pueden también reducir los efectos secundarios, al minimizar la exposición del sujeto al segundo compuesto. En otra modalidad, el sujeto es tratado con el anticuerpo CD4 no agotante y el segundo compuesto para reducir los síntomas y luego el tratamiento del sujeto con el segundo compuesto o uno o más de otros compuestos, pero diferentes a los anticuerpos CD4 no agotantes, es protegido para mantener la remisión . Otra clase general de modalidades también proporciona métodos para el tratamiento de lupus nefritis en un sujeto mamífero, por ejemplo un humano. En los métodos, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo CD4 no agotante es administrada al sujeto. Después del inicio del tratamiento con el anticuerpo, el sujeto muestra una mejora en función renal, una reducción en proteinuria y/o una reducción en sedimento urinario activo, en comparación con el (los) nivel (es) de proteinuria y/o sedimento urinario activo mostrado por el sujeto antes del inicio del tratamiento. Por ejemplo, la proteinuria puede ser reducida por al menos 25%, por al menos 50% por al menos 75% o por al menos 90% o la proteinuria puede ser reducida a menos de lg/día o menos de 500 mg/día; la proporción de proteína a creatinina en la orina puede ser reducida por al menos 25% o por al menos 50% o la proporción puede ser reducida a menos de 1 o menos de 0.5 y/o el sedimento urinario activo puede ser reducido por al menos 25%, por al menos 505, por al menos 75% o por al menos 90% o solamente el sedimento urinario activo puede permanecer después del inicio del tratamiento. El anticuerpo CD4 no agotante puede ser cualquiera de aquellos descritos en la presente. En una modalidad, el sujeto nunca ha sido tratado previamente con fármaco (s) para tratar el lupus nefritis y/o nunca ha sido tratado previamente con anticuerpo anti-CD4. En otra modalidad, el sujeto ha sido tratado previamente con fármaco (s) para tratar lupus nefritis y/o ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-CD4. En otra modalidad, el anticuerpo anti-CD4 no agotante de la invención es el único medicamento administrado al sujeto para tratar el lupus nefritis. En otra modalidad, el anticuerpo CD4 no agotante de la invención es uno de los medicamentos usados para tratar el lupus nefritis. En una modalidad adicional, el sujeto no tiene artritis reumatoide. En todavía una modalidad adicional, el sujeto no tiene esclerosis múltiple. En todavía otra modalidad, el sujeto no tiene una enfermedad autoinmune diferente a lupus y/o lupus nefritis. En una clase de modalidades, los métodos incluyen la alimentación de por lo menos un segundo compuesto tal como cualquiera de aquellos descritos en la presente en combinación con el anticuerpo CD4 no agotante. Por ejemplo, ciclofosfamida , mofetil micofenolato, CTLA4-Ig o un anticuerpo de 4-integrina pueden ser administrados al sujeto en combinación con el anticuerpo CD4 no agotante. Un tercero, cuarto, etc., compuesto es incluido opcionalmente en la combinación; por ejemplo, un corticosteroide tal como metilprednisolona y/o prednisona pueden ser administrados junto con el anticuerpo CD4 no agotante y ciclofosfamida . En una modalidad, antes del inicio del tratamiento con el anticuerpo CD4 no agotante, el sujeto exhibe proteinuria, tal proteinuria es reducida después del inicio del tratamiento con el anticuerpo CD4 no agotante. Por ejemplo, antes del inicio del tratamiento, el sujeto puede exhibir proteinuria mayor de 500 mg/dia, mayor de 1000 mg/dia, mayor de 2000 mg/dia o mayor de 3500 mg/dia; después del inicio del tratamiento, la proteinuria puede ser reducida por al menos 25%, por al menos 50%, por al menos 75% o por al menos 90% o la proteinuria puede ser reducida a menos de 1 mg/dia o menos de 500 mg/dia. Una disminución en la proporción de proteina a creatinina puede ser similarmente monitoreada. En una modalidad, antes del inicio del tratamiento, el sujeto exhibe una proporción de proteina a creatinina mayor de 0.5, mayor de 1 o mayor de 2; después del inicio del tratamiento, la proporción de proteina a creatinina puede ser reducida por al menos 25% o por al menos 50% o a menos de 1 o a menos de 0.5. En una modalidad, antes del inicio del tratamiento con la combinación, el sujeto exhibe proteinuria de intervalo nefrótico, con una proporción de proteina a creatinina mayor de 3; después del inicio del tratamiento, la proporción de proteina a creatinina es reducida a menos de 3 u opcionalmente por al menos 25% o por al menos 50% o a menos de 2 o menos de 1. Opcionalmente, antes del inicio del tratamiento, el sujeto exhibe síndrome nefrótico. El síndrome nefrótico es opcionalmente mejorado por el tratamiento. Por ejemplo, el sujeto exhibe opcionalmente una reducción en proteinuria a menos de 3.5 g/día después del inicio del tratamiento, por ejemplo a menos de 3 g/dia, menos de 2 g/dia, menos de 1 g/dia o aún menos de 1 g/dia o menos de 0.5 g/dia.

TRATAMIENTO DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad degenerativa inflamatoria y desmielinante del sistema nervioso centra humano (CNS) . Es una enfermedad mundial que afecta a aproximadamente 300,000 personas en los estados Unidos de América; es una enfermedad de adultos jóvenes, con el 70%-80% que tienen el inicio entre 20 y 40 años de edad (Anderson et al. Ann Neurology 31(3) : 333-6 (1992) ; Noonan et al. Neurology 58: 136-8 (2002) ) . MS es una alteración heterogénea basada en el curso clínico, determinación por barrido de formación de imagen de resonancia magnética (MRI) y análisis patológico de biopsia y material de autopsia ( (Lucchinetti et al. Ann Neurol 47: 707-17 (2000)) . La enfermedad se manifiesta por sí misma en un gran número de combinaciones posibles de déficit, en los que se incluyen médula espinal, tallo cerebral, nervio craneal, cerebelar, cerebral y síndromes cognoscitivos. La disabilidad progresiva es el destino de la mayoría de los pacientes con MS, especialmente cuando se incluye una perspectiva de 25 años. La mitad de los pacientes con MS requieren un bastón para caminar en el transcurso de 15 años de inicio de la enfermedad. MS es una causa principal de disabilidad neurológica en los adultos jóvenes y adultos de edad media y hasta la década pasada, no tenían ningún tratamiento benéfico conocido. S es difícil de diagnosticar debido a los hallazgos clínicos no específicos, que conducen al desarrollo de criterios de diagnóstico altamente estructurados que incluyen varios avances tecnológicos, que consisten de barridos o exploraciones de MRI, potenciales evocados y estudios de fluido cerebroespinal (CSF) . Todos los criterios de diagnóstico dependen de los principios generales de las lesiones dispersadas en la materia blanca central que ocurre a diferentes tiempos y no explicada por otras etiologías tales como infección, alteración vascular u otra alteración autoinmune (McDonald et al. Ann Neurol 50: 121-7 (2001)) . MS tiene cuatro patrones de enfermedad: MS de recaída-remisión (RRMS; 80%-85% de casos al inicio) , MS progresiva primaria (PPMS; 10%-15% al inicio), MS de recaída progresiva (PRMS; 5% al inicio) y MS progresiva secundaria (SPMS) (Kremenchutzky et al. Brain 122 (Pt 10) : 1941-50 (1999); Confavreux et al. N Engl J Med 343(20) : 1430-8 (2000)) . Un 50% estimado de pacientes con RRMS desarrollarán SPMS en 10 años y hasta el 90% de los pacientes de RRMS desarrollarán inevitablemente SPMS (Weinshenker et al. Brain 112 (Pt 1) : 133-46 (1989) ) . La invención incluye métodos para el tratamiento de esclerosis múltiple en un sujeto mamífero, por ejemplo, un sujeto humano. En un aspecto, los métodos incluyen la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo CD4 no agotante. El anticuerpo CD4 no agotante puede ser cualquiera de estos descritos en la presente. En otro aspecto, los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de un anticuerpo CD4 no agotante y por lo menos un segundo compuesto. Otra vez, el anticuerpo CD4 no agotante puede ser cualquiera de estos descritos en la presente. El segundo compuesto es comúnmente uno que es usado para tratar MS, por ejemplo, un estándar de cuidado o tratamiento experimental. Segundos compuestos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, un agente citotóxico; un agente inmunosupresor (por ejemplo, ciclofosfamida ) ; un antagonista de marcador de superficie de célula B; un marcador de superficie de célula B; un anticuerpo CD20, por ejemplo, Rituximab, véase Patente Estadounidense No. 20060051345; un anticuerpo CD5, CD28 o CD40 o agente de bloqueo; un corticosteroide (por ejemplo, prednisona), CTLA4-Ig, un anticuerpo o antagonista de a4-integrina tal como natalizumab (Tysabri®) , mofetil micofenolato, una estatina, un anticuerpo o agente de bloqueo de LFA-1 o CD-lla (véase Solicitud de Publicación de Patente Estadounidense No. 20050281817 por Jardieu et al., intitulada "Method for treating múltiple sclerosis"), un anticuerpo interleucina-12 , un interferón beta (por ejemplo, un interferón ß-la tal como Avonex® o Rebif® o un 7 interferón ß-lb tal como Betaseron©) , acetato de glat irámero (Copaxone®) , un anticuerpo CD52 tal como alemtuzuman (CamPath®) , un anticuerpo receptor de interleucina tal como daclizumab (Zenapax®, un anticuerpo a la subunidad alfa del receptor de interleucina-2 ) , etc. En una clase de modalidades, los métodos incluyen el tratamiento del sujeto con el anticuerpo CD4 no agotante y el segundo compuesto para reducir síntomas y luego proseguir el tratamiento del sujeto con el anticuerpo CD4 no agotante (no en combinación con el segundo compuesto) para mantener la remisión. Por ejemplo, el sujeto puede ser tratado con una combinación del anticuerpo CD4 no agotante y acetato de glatirámido y luego tratado con el anticuerpo CD4 no agotante solo para mantener la remisión. En otra modalidad, el sujeto es tratado con el anticuerpo CD4 no agotante y el segundo compuesto para reducir síntomas y luego el tratamiento es proseguido con el segundo compuesto o uno o más compuestos usados comúnmente para tratar MS, diferente al anticuerpo CD4 no agotante. En una modalidad, el sujeto nunca ha sido tratado previamente con fármaco (s) tal (es) como agente (s) inmunosupresor (es ) , para tratar la esclerosis múltiple y/o nunca ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-CD . En otra modalidad, el sujeto ha sido tratado previamente con fármaco (s) para tratar la esclerosis múltiple y/o ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-CD4. Comúnmente, el sujeto es elegible para el tratamiento de esclerosis múltiple, esto es, el sujeto es un sujeto de MS . Para los propósitos de la presente, tal sujeto de MS es uno que está experimentando, ha experimentado o es probable que experimente uno o más signos, síntomas u otros indicadores de esclerosis múltiple; ha sido diagnosticado con esclerosis múltiple, ya sea por ejemplo, recién diagnosticado (con MS de "nuevo inicio"), previamente diagnosticado con una recaída o exacerbación, previamente diagnosticado y en remisión, etc., y/o está en riesgo por desarrollar esclerosis múltiple. El que sufre de o está en riesgo de sufrir de esclerosis múltiple puede opcionalmente ser identificado como uno que ha sido seleccionado por niveles elevados de células B CD20-positivas en suero, fluido cerebroespinal (CSF) y/o lesión (es) de MS y/o es seleccionado para usar un análisis para detectar anticuerpos, determinados cualitativamente y de preferencia cuantitativamente. Tales anticuerpos ejemplares asociados con esclerosis múltiple incluyen proteína básica de anti-mielina (MBP) , glicoproteína oligodendrocítica anti-mielina (MOG) , anticuerpos anti-gangliósido y/o anti-neurofilamento . Tales auto-anticuerpos pueden ser detectados en el suero del sujeto, fluido cerebroespinal (CSF) y/o lesión de MS . Nivel (es) de anticuerpo o célula B "elevado (s) " significa nivel (es) de tales anticuerpos o células B que exceden significativamente el (los) nivel (es) en un individuo sin MS . La MS a ser tratada en la presente incluye esclerosis múltiple progresiva primaria (PPMS), esclerosis múltiple de recaída-remisión (RRMS) , esclerosis múltiple progresiva secundaria (SPMS) y esclerosis múltiple de recaída progresiva (PRMS) . La MS puede ser enfermedad en etapa prematura, media o tardía cuando el tratamiento es iniciado. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" con referencia al tratamiento de MS se refiere a una cantidad del anticuerpo (o combinación del anticuerpo y por lo menos el segundo compuesto) que es efectiva para prevenir, mejorar o tratar la esclerosis múltiple. Tal cantidad efectiva dará en general como resultado una mejora en los signos, síntomas u otros indicadores de MS, tal como una velocidad de recaída reducida, prevenirla disabilidad, reducir el número y/o volumen de lesiones de MRI del cerebro, mejorar el tiempo para caminar 25 pies sincronizado, prolongar el tiempo al avance de la enfermedad (por ejemplo, utilizando la escala de estatus de discapacidad expandida, EDSS), etc. En un aspecto, la desmielinación es disminuida en el sujeto tratado. "Esclerosis múltiple progresiva primaria" o "PPMS" está caracterizada por un avance gradual de la enfermedad desde su inicio sin ninguna recaída y remisiones superpuestas. Pueden haber períodos de liberación de la actividad de la enfermedad y pueden haber días o semanas buenos y malos. PPMS difiere de RRMS y SPMS en que el inicio es comúnmente en los finales de los 30 o a principios de los 40 en los hombres, aunque las mujeres es probable que lo desarrollen y la actividad de enfermedad inicial es frecuentemente en la médula espinal y no en el cerebro. PPMS frecuentemente migra al cerebro, pero es menos probable que dañe las áreas del cerebro que RRMS o SPMS, por ejemplo, la gente con PPMS es menos probable de desarrollar problemas cognoscitivos. PPMS es el subtipo de MS que es menos probable de mostrar lesiones inflamatorias (mejora de gadolinio) en exploraciones o barridos de MRI . La forma progresiva primaria de la enfermedad afecta entre el 10 y 15% de toda la gente con esclerosis múltiple. PPMS puede ser definida de acuerdo con lo s criterios de McDonald et al. Ann Neurol 50: 121-7 (2001) . El sujeto con PPMS tratado en la presente es usualmente uno con diagnosis probable o definitiva de PPMS.

"Esclerosis múltiple de recaída-remisión o RRMS" está caracterizada por recaídas (también conocidas como exacerbaciones) tiempo durante el cual nuevos síntomas pueden aparecer y los viejos resurgen o empeoran. Las recaídas son seguidas por períodos de remisión, tiempo durante el cual la persona plena o parcialmente del déficit adquirido durante la recaída. Las recaídas pueden durar días, semanas o meses y la recuperación puede ser lenta y gradual o casi instantánea. La vasta mayoría de la gente que presenta MS es diagnosticada primero con RRMS . Esto es comúnmente cuando están en los 20 o 30, aunque las diagnosis mucho más tempranas o más tarde son conocidas. Dos veces más mujeres que hombres presentan este subtipo de M-S . Durante la recaída, mielina, un envolvente aislante protector alrededor de las fibras del nervio (neuronas) en las regiones de materia blanca en el sistema nervioso central (CNS) , pueden ser dañadas en una respuesta inflamatoria por el sistema inmune del propio cuerpo. Esto provoca una amplia variedad de síntomas neurológicos que varían considerablemente dependiendo de cuáles áreas del CNS sean dañadas. Inmediatamente después de una recaída, la respuesta inflamatoria muere y un tipo especial de célula glial en la remielinación de los promotores de CNS (llamado un oligodendorcito ) - un proceso mediante el cual la envolvente de mielina alrededor del axón puede ser reparado. Es esta remielinación que puede ser responsable por la remisión. Aproximadamente el 50% de los pacientes con RRMS se convierten a SPMS en 10 años de inicio de la enfermedad. Después de 30 años, esta cifra se eleva al 90%. En cualquier tiempo, la forma de recaída-remisión de la enfermedad cuenta alrededor del 56% de toda la gente con MS . "Esclerosis múltiple secundaria progresiva" o "SPMS" está caracterizada por un avance estable de daños neurológicos clínicos con o sin recaídas superpuestas y remisiones menores y mesetas. La gente que desarrollará SPMS habrá experimentado previamente un periodo de RRMS que puede haber durado desde 2 a 40 años o más. Cualesquier recaídas y remisiones superpuestas que hay, tienden a disminuir con el paso del tiempo. Desde el inicio de la fase progresiva secundaria de la enfermedad, la discapacidad inicia avanzando mucho más rápido que durante RRMS aunque el proceso puede todavía ser bastante lento en algunos individuos. Después de 10 años, el 50% de la gente con RRMS habrá desarrollado SPMS. A los 25 a 30 años, aquella cifra se habrá elevado a 90%. SPMS tiende a estar asociada con niveles más bajos de formación de lesión inflamatoria que en RRMS, pero la carga total de enfermedad continua avanzando. En cualquier tiempo, SPMS suma alrededor de 30% de toda la gente con esclerosis múltiple. "Esclerosis múltiple de recaída progresiva" se refiere a "PRMS" que está caracterizada por un avance estable de daños neurológicos clínicos con recaídas y remisiones superpuestas. Hay una recuperación significativa inmediatamente en seguida de una recaída pero entre recaídas hay un empeoramiento gradual de los síntomas. PRMS afecta alrededor del 5% de toda la gente con esclerosis múltiple. Algunos neurólogos creen que PRMS es una variante de PPMS .

TRATAMIENTO DE OTRAS CONDICIONES Los anticuerpos CD4 no agotantes, en los que se incluyen combinaciones de anticuerpos CD4 no agotantes y uno o más- de otros compuestos también son útiles para el tratamiento de alteraciones y condiciones diferentes a lupus o esclerosis múltiple, por ejemplo, condiciones patológicas a las cuales las células T CD4+ contribuyen. Asi, un aspecto de la invención proporciona métodos para el tratamiento de una condición en un sujeto mamífero, por ejemplo, un sujeto humano. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de un anticuerpo CD4 no agotante y por lo menos un segundo compuesto. En una modalidad, el sujeto es un receptor de trasplante de tejido y la condición a ser tratada es rechazo de implante o enfermedad de injerto contra huésped. Otras condiciones que pueden ser tratadas con la combinación incluyen pero no están limitadas a alteraciones o enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide, asma, psoriasis, enfermedad de intestino inflamatorio (por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa) y síndrome de S j ogren . El anticuerpo CD4 no agotante puede ser cualquiera de estos descritos en la presente. El segundo compuesto es opcionalmente uno que es usado para tratar la condición, por ejemplo, un estándar de cuidado o tratamiento experimental. Segundos compuestos ejemplares incluyen pero no están limitados a un agente citotóxico; un agente inmunosupresor (por ejemplo, ciclofosfamida ) ; un antagonista marcador de superficie de célula B; un marcador de superficie de anticuerpo a célula B; un anticuerpo CD20, por ejemplo, Rituximab, véase US 20060051345) ; un anticuerpo o agente de bloqueo CD5 , CD28 o CD40; un corticosteroide (por ejemplo, prednisona) , CDTLA4-Ig, un anticuerpo antagonista de ot4-integrina tal como natalizuman (Tysabri®) , mofetil micofenolato, una estatina, un anticuerpo o agente de bloqueo de LFA-a o CD-11 (véase publicación de solicitud de patente estadounidense 20050281817 por Jardieu et al. intitulada " ethod for treating múltiple sclerosis"), un anticuerpo interleucina-12 , un interferón beta (ñor ejemplo, un interferón ß-la tal como Avonex® o Rebif® o un interferón ß-lb tal como Betaserona®) , acetato de glatirámero (Copaxone®) , un anticuerpo CD52 tal como alemtuziman (CamPath®) , un anticuerpo receptor de interleucina tal como daclizumab (Zenapax®, un anticuerpo a la subunidad alfa del receptor de para la interleucina-2 ) , etc. Segundos compuestos ejemplares adicionales son descritos en la presente y/o conocidos en el arte. Opcionalmente , el segundo compuesto es seleccionado del grupo que consiste de ciclofosfamida, mofetil micofenolato y CTLA4-Ig. En una clase de modalidades, los métodos incluyen el tratamiento del sujeto con un anticuerpo CD4 no agotante y el segundo compuesto para reducir síntomas y luego proseguir el tratamiento del sujeto con el anticuerpo CD4 no agotante (no en combinación con el segundo compuesto) para mantener la remisión. En otra modalidad, el sujeto es tratado con el anticuerpo CD4 no agotante y el segundo compuesto para reducir síntomas y luego el tratamiento es proseguido con el segundo compuesto o uno o más compuestos usados comúnmente para tratar la condición. En una modalidad, el sujeto no ha sido nunca tratado previamente con fármaco (s), tal (es) como agente (s) inmunosupresor ( es ) , para tratar la condición y/o nunca ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-CD . En otra modalidad, el sujeto ha sido tratado previamente con fármaco (s) para tratar la condición y/o ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-CD . Comúnmente, el sujeto es elegible para el tratamiento por la condición. Por los propósitos de la presente, tal sujeto es uno que está experimentando, ha experimentado o es probable que experimente, uno o más signos, síntomas u otros indicadores de la condición; ha sido diagnosticado con la condición, ya sea por ejemplo, recién diagnosticado, previamente diagnosticado con una nueva recaída o exacerbación, previamente diagnosticado y en remisión, etc., y/o está en riesgo de desarrollar la condición. Por ejemplo, un sujeto elegible para tratamiento de rechazo de trasplante o enfermedad de injerto contra huésped puede ser anticipado a un trasplante de tejido o puede tener ya recibido tal trasplante y en el último caso puede ser uno que está experimentando, ha experimentado o es probable que experimente uno o más signos, síntomas u otros indicadores de rechazo de trasplante o enfermedad de injerto contra huésped. Síntomas e indicadores para tales condiciones y de varias enfermedades y alteraciones autoinmunes son bien conocidas en el arte.

PRODUCCIÓN Y ADMINISTRACIÓN DE ANTICUERPO Los métodos de la presente invención usan un anticuerpo que se enlaza a CD4. En un aspecto, los anticuerpos anti-CD4 son anticuerpos - no agotantes. Así, métodos para generar tales anticuerpos serán descritos en la presente. El antígeno de CD4 a ser usado para producción de o selección de anticuerpo ( s ) , pueden ser, por ejemplo una forma soluble de CD4, tal como CD4 humano o una porción del mismo, que contiene el epítopo deseado. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de CD4 humano son mostrados en la Figura 21. Alternativa o adicionalmente , células que expresan CD4 en su superficie celular pueden ser usadas para acelerar o seleccionar anticuerpo ( s ) . Otras formas de CD4 útiles para generar anticuerpos serán evidentes para aquellos experimentados en el arte. A continuación se da una descripción en cuanto a técnicas ejemplares para la producción de anticuerpos usados de acuerdo con la presente invención. Para información adicional, véase Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 2003/0108518 por Frewin et al. intitulada "TRX1 antibody and uses therefor" y Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 2003/0219403 por Frewin et al. intitulada "Compositions and methods of tolerizing a primate to an antigen", ambas de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos, incluyendo con respecto a procedimientos para producir anticuerpos CD4 no agotantes, tal como el anticuerpo TRX1.

Anticuerpos policlonales Anticuerpos policlonales son preferiblemente criados en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales del antigeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antigeno relevante a una proteina que es inmunógena en la especie a ser floculizada, por ejemplo, hemocianina de lapa de bocallave, albúmina de suero, tiroglobulina bobina o inhibidor de tripsina de soya utilizando un agente bifuncional o agente derivati zante , por ejemplo, maleimidobenzoil sulfosuccinimida éster (conjugación por medio de residuos de cisteina) , L-hidroxisuccinimida (por medio de residuos de lisina), glutaraldehido , anhídrido succínico, S0C12 o R'N=C=NR, en donde R y R' son grupos alquilo diferentes. Los animales son inmunizados contra el antígeno, conjugados inmunógenos o derivados al combinar, por ejemplo, 100 ^ig o 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con tres volúmenes de un completo de Freund e inyectar la solución int radérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde, los animales son reforzados con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a catorce días más tarde, los animales son sangrados y el suero es analizado en cuanto a titulo de anticuerpo. Los animales son reforzados hasta que el titulo se estabiliza en una meseta. Preferiblemente, el animal es reforzado con el conjugado del mismo antigeno, pero conjugado a una diferente proteina y/o por medio de un reactivo de reticulación diferente. Conjugados también pueden ser fabricados en cultivos celular recombinante como fusiones de proteina. También, agentes agregantes tales como alumbre son usados apropiadamente para mejorar la respuesta inmune.

Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales · son obtenidos de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se enlazan al mismo epitopo excepto por posibles variantes que surgen durante la producción del anticuerpo monoclonal, tales variantes están en general presentes en cantidades menores. Asi, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por no ser una mezcla de anticuerpos discretos o anticuerpos policlonales . Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden ser elaborados utilizando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) o pueden ser elaborados mediante métodos de ADN recombinante (Patente Estadounidense No. 4,816,567) . En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, es inmunizado como se describe anteriormente para reducir linfocitos que producen o son aptos de producir anticuerpos que se enlazarán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in Vítro. Luego los linfocitos son fusionados a células de mieloma utilizando un agente de fusión apropiado, tal como polietilenglicol , para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Las células de hibridoma así preparadas son sembradas y cultivadas en un medio de cultivo apropiado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de células de mieloma parentales sin fusionar. Por ejemplo, si las células de mieloma padres carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá comúnmente hipoxantina, aminopterina y timidita (medio HAT) , tales sustancias impiden el crecimiento de células HGPRT-deficientes . Las células de mieloma útiles para la preparación de hibridomas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción de alto nivel estable de anticuerpo por las células que producen anticuerpo seleccionado y son sensibles a un medio tal como el medio de HAT. De interés tal, una lista no limitante de lineas de células de mieloma incluyen lineas de mieloma murinas, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EUA y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Md. EUA. Lineas celulares de mielona humano y lineas celulares de heteromieloma de ratón-humano han también sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Imraunol. , 133:3001 (1984) ; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp . 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987) ) . Al medio de cultivo en el cual las células de hibridoma son cultivadas es analizado en cuanto a la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno. La especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma puede ser determinada mediante inmunoprecipitación o mediante un análisis de enlace in tal como radioinmunoensayo (RIA) o análisis inmunoabsorbente enzima-enlazado (ELISA) . La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede por ejemplo ser determinada mediante el análisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980) . Después que las células de hibridoma son identificadas que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden ser subclonados mediante procedimientos de dilución limitante y cultivados mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp . 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, medios de D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden ser cultivadas in vivo como tumores de ascites en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son separados apropiadamente del medio de cultivo, fluido de ascites o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, agarosa reticulada proteina A-Sepharose®, cromatografía de hidroxilapat ita , elect roforesis de gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN que. codifica los anticuerpos monoclonales es aislado fácilmente y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son aptas de enlazarse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma sirven como fuente útil de tal ADN . Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en vectores de expresión, que son luego transceptados a células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otra manera proteina de inmunoglobulina , para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes . Artículos de revisión en cuanto a la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol . , 5:256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs. , 130: 151-188 (1992) . En una modalidad adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de bibliotecas de fago de anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990) . Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fago. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) mediante entremezcla de cadena (Marks et al., Bio/Technology , 10:779-783 (1992) ), también como infección combinatorial y recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fago muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)) . Asi, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. El ADN también puede ser modificado, por ejemplo, al sustituir la secuencia de codificación para dominios constantes de cadena pesada y cadena ligera en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente Estadounidense No. 4,816,567; Morrison, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 81:6851 (1984) ) o al unir covalentemente la secuencia de codificación de inmunoglobulina a todo o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido sin inmunoglobulina. Comúnmente, tales polipéptidos sin inmunoglobulina son sustituidos por los dominios constantes de un anticuerpo o son sustituidos por los dominios variables de un sitio de combinación de antigeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo divalente quimérico que comprende uno o más sitios de combinación de antigeno que tiene especificidad con un antigeno y otro sitio de combinación de antigeno que tiene especificidad con un antigeno diferente.

Anticuerpos humanizados Métodos para humanizar anticuerpos no humanos han sido descritos en el arte. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos al mismo de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos son denominados f ecuentemente como residuos de "importación", que son tomados comúnmente de un dominio variable de "importación". La humanización puede ser efectuada esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986) ; Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988) ; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988) ), al sustituir secuencias de región .hipervariable con las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Asi, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente Estadounidense No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son comúnmente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR son sustituidos por algunos residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a ser usados en la fabricación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la ant igenicidad . De acuerdo con el llamado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor es seleccionada contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que es más cercana a aquellas de alrededor es lueqo aceptada como la región de estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. , 151:2296 (1993) ; Chothia et al., J. Mol. Biol . , 196:901 (1987) ) . Otro método usa una región de estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada. La misma estructura puede ser usada para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993) ) . Es importante además que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad por el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. Para obtener este objetivo, de acuerdo con un método, los anticuerpos humanizados son preparados mediante un proceso de análisis de las secuencias padre y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias padres y humanizadas. Modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos experimentados en el arte. Programas de computadora están disponibles que ilustran y despliegan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estos despliegues permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, esto es, el análisis de residuos que producirían la habilidad de la inmunoglobulina candidata para enlazarse a su antígeno. De esta manera, residuos de EPR pueden ser seleccionados y combinados con las secuencias de receptor y de importación, de tal manera que la característica de anticuerpo deseada (tal como afinidad incrementada por el (los) antígeno(s) objetivo(s) se obtiene. En general, los residuos de nivel hipervariable están directa y más sustancialmente ilustrados en influenciar el enlace de antígeno.

Anticuerpos humanos Como una alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos. Por ejemplo, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son aptos, después de la inmunización, de producir un pleno repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito qlue la cancelación homóciga del gen de región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal dan como resultado la inhibición completa de producción de anticuerpo endógeno. La transferencia del arreglo genético de inmunoglobulina de línea germinal humana en tales ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos después del desafio de antigeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno . , 7:33 (1993) y Patentes Estadounidenses Nos. 5,591,669, 5,589,369 y 5, 545, 807. Alternativamente, se puede usar tecnología de despliegue de fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990) ) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in Vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina a partir de donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio V de anticuerpo son clonados en cuadro ya sea al gen de proteína de recubrimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o Fg y desplegado como fragmentos de anticuerpos funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola hebra del genoma de fago, las selecciones basadas en as propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe aquellas propiedades. Así, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. El despliegue de fago puede ser efectuado en una variedad de formatos; para su revisión, véase Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J. , Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993) . Varios puentes de segmentos de gen V pueden ser usados para el despliegue de fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron un arreglo diverso de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una biblioteca combinatorial aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V a partir de donadores humanos sin inmunizar pueden ser construidos y anticuerpos a un arreglo diverso de antigenos (en los que se incluyen auto-antigenos) pueden ser aislados siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993) . Véase también Patentes Estadounidenses Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Anticuerpos humanos pueden también ser generados mediante células B activadas in vitro (Véanse Patentes Estadounidenses Nos. 5,567,610 y 5,229,275) .

Fragmentos de anticuerpo Varias técnicas han sido desarrolladas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente , estos fragmentos fueron derivados vía digestión proteolitica de anticuerpos intactos (véase por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)) . Sin embargo, estos fragmentos pueden ahora ser producidos directamente mediante células huésped recombinantes . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados a partir de bibliotecas de fago de anticuerpos discutidas anteriormente. Alternativamente, fragmentos de Fab'-SH pueden ser recuperados directamente de E. coli y acoplados químicamente para formar fragmentos de F(ab' ) 2 (Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) ) . De acuerdo con otro procedimiento, fragmentos de F(ab' ) 2 pueden ser aislados directamente del cultivo de célula huésped recombinante . Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el técnico experimentado. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de una sola cadena (scFv) . Véase WO 1993/16185 y Patentes Estadounidenses Nos. 5,571,894 and 5,587,458. El fragmento de anticuerpo puede también ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,641,870. Tales fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecí fieos o biespecificos .

Anticuerpos biespecificos Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para por lo menos dos epítopos diferentes. Anticuerpos biespecificos ejemplares se pueden enlazar a dos epítopos diferentes del antígeno CD . Otros de tales anticuerpos se pueden enlazar a CD4 y analizarse además a un segundo marcador de superficie de célula T. otros anticuerpos biespecificos pueden también ser usados para localizar fármacos o agentes citotóxicos a la célula T; estos anticuerpos poseen un brazo de enlace a CD4 y un brazo que se enlaza al fármaco o agente citotóxico. Anticuerpos biespecificos pueden ser preparados como anticuerpos de plena longitud o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecificos F(ab')2) . Métodos para fabricar anticuerpos biespecificos son conocidos en el arte. La producción tradicional de anticuerpos biespecificos de plena longitud está basada en la co-expresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina , en donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)) . Debido a la clasificación aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadrotas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecifica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se hace usualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es más bien molesta y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares son revelados en O 1993/08829 y en Traunecker et al., EMBO J. , 10:3655-3659 (1991) . De acuerdo con un procedimiento diferente, dominios variables de anticuerpos con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpos-antígeno) son fusionados a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina . La fusión es preferiblemente con un domino constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones de engozne CH2 y CH3. En un procedimiento, la primera región constante de cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para el enlace de cadena ligera, está presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, son insertados a vectores de expresión separados y son co-transfectados a un organismo huésped apropiado. Esto proporciona mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en modalidades cuando proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas de polipéptido en un vector de. expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptidos en proporciones iguales da como resultado alto rendimiento o cuando las proporciones no son de significado particular. En una modalidad de este procedimiento, los anticuerpos biespecificos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrido (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecifico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina indeseables, tal que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solamente la mitad de la molécula biespecifica proporciona una manera fácil de separación. Este procedimiento es revelado en WO 1994/04690. Para detalles adicionales en la generación de anticuerpos biespecificos , véase por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) . De acuerdo con otro procedimiento descrito en la Patente Estadounidense No. 5,731,168, la inferíase entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser diseñada para maximizar el porcentaje de heterodimeros que son recuperados del cultivo de células recombinantes . Una de tales interfases comprende por lo menos parte del dominio de CH3 de un dominio constante de anticuerpos. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas de la inferíase de la primera molécula de anticuerpo son reeemplazadas con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano. "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena (s) lateral (es) grande (s) son creadas sobre la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar cadenas laterales de aminoácidos grandes o más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero con respecto a otros productos finales indeseables tales como homodímeros. Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconj ugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heterodímero conjugado puede ser acoplado a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos han sido por ejemplo, propuestos para apuntar a células del sistema inmune a células indeseables (Patente Estadounidense No. 4,676,980) y para el tratamiento de HIV (WO 1991/00360, WO 1992/200373, y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconj ugados pueden ser elaborados utilizando cualesquier métodos de reticulación convenientes. Agentes de reticulación apropiados son bien conocidos en el arte y son revelados por ejemplo, en la Patente Estadounidense 4,676,980, junto con un número de técnicas de reticulación. Técnicas para generar anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecificos pueden ser preparados utilizando enlace químico. Brennan et al. Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en donde anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para generar fragmentos de F(ab')2- Estos fragmentos son reducidos en presencia del agente acomplejante de ditiol arsenita de sodio para estabilizar los ditioles vecinales e impedir la formación de disulfuro intermolecular. Luego los fragmentos de Fab' generados son convertidos a derivado de tionitrobenzoato (TNB) . Luego uno de los derivados de Fab' -TNB es convertido al Fab' -tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y es mezclado con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecifico . Los anticuerpos biespecificos producidos pueden ser usados como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Varias técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecificos directamente a partir de cultivo celular recombinante también se han descrito. Por ejemplo, anticuerpos biespecificos han sido producidos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992) . Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun fueron enlazados a las porciones de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión genética. Los homodímeros de anticuerpos fueron reducidos en la región de engozne para formar monómeros y luego re-oxidados para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método puede también ser utilizado para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita en Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpo biespecificos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Así, los dominios de VH y VL de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios de VL y VH complementarios de otro fragmento, formando mediante esto dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpo biespecí fieos mediante el uso de dímeros Fv (sFv) de una sola cadena también se ha reportado. Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) . Anticuerpos con más de dos valencias son contemplados. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos . Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) .

Conjugados y otras modificaciones del anticuerpo El anticuerpo usado en los métodos o incluido en los artículos de manufactura en la presente es opcionalmente conjugado a un fármaco, por ejemplo, como se describe en WO 2004/032828 y publicación de solicitud de patente estadounidense No. 2006/0024295. Los anticuerpos de la presente invención pueden también ser conjugados con una enzima profármaco-activadora que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase WO 1981/01145) a un fármaco anti-cáncer activo. Véase, por ejemplo, WO 1988/07378, Patente Estadounidense No. 4,975,278 y publicación de solicitud de patente estadounidense No. 2006/0024295. Otras modificaciones del anticuerpo son contempladas en la presente. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser enlazado a uno de una variedad de polímeros no proteináceos , por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioxialquileno o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. Los anticuerpos revelados en la presente pueden también ser formulados como liposomas. Liposomas que contienen el anticuerpo son preparados mediante métodos conocidos en el arte, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 82:3688 (1985) ; Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 77:4030 (1980) ; Patentes Estadounidenses Nos. 4,485,045 y 4 , 544, 545 y WO 1997/38731 publicada el 23 de octubre de 1997. Liposomas con tiempos de circulación mejorados son revelados en la Patente Estadounidense No. 5,013,556. Liposomas particularmente útiles pueden ser generados mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípido que comprende fosfatidil colina, colesterol y fosfatidil etanolamina PEG-derivada (PEG-PE) . Los liposomas son excluidos a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Fragmentos de Fab' de un anticuerpo de la presente invención pueden ser conjugados a los liposomas como se describe en Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) vía una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico está contenido opcionalmente en el liposoma. Véase Gabizon et al. J. National Cáncer Inst. 81(19)1484 (1989) .

Modificación (es ) de secuencia de aminoácidos de anticuerpos de proteina o péptido descritos en la presente son contempladas. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo son preparadas al introducir cambios de nucleótidos apropiados al ácido nucleico de anticuerpo o mediante síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, cancelaciones de y/o inserciones a y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de cancelación, inserción y sustitución se hace para llegar al constructo final, a condición de que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos pueden también alterar procesos pos-traducción del anticuerpo, tal como cambiar el número o posición de sitios de glicosilación . Un método útil para identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son sitios útiles para mutagénesis es llamado "mutagénesis de barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells Science, 244:1081-1085 (1989) . Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo son identificados (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y reemplazados por unos aminoácidos neutros o cargados relativamente (más preferiblemente alanina o polialanina) para aceptar la interacción de los aminoácidos con antígeno. Aquellos sitios de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones son luego definidos mediante sustitución de variantes adicionales u otras variantes en o para los sitios de sustitución. Asi, en tanto que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos es predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en el sitio dado, se lleva a cabo barrido de alanina o mutagénesis aleatoria en el codón o región objetivo y las variantes de anticuerpo expresadas son seleccionadas en cuanto a la actividad deseada. Inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carbonilo-terminal que fluctúan de longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen 100 o más residuos, también como inserciones de int rasecuencia de un solo o múltiples residuos de aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionil N-terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes insercionales de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al término N o término C del anticuerpo de una enzima o un polipéptido que incrementa la vida media en el suero del anticuerpo. Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Esta variante tiene por lo menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para mutagénesis sust itucional de anticuerpos incluyen las regiones hipervariables , pero alteraciones FR son también contempladas. Sustituciones conservadoras son mostradas en la Tabla 1 bajo el encabezado de "Sustituciones conservadoras". Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares", en la Tabla 1 o como se describe adicionalmente más adelante en la presente con referencia a clases de aminoácidos, pueden ser introducidos y el producto seleccionado . Tabla 1. Sustituciones de aminoácidos Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se llevan a cabo al seleccionar sustituciones que difieren significativamente en su efecto en mantener (a) la estructura de la cadena fundamental del polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) la cadena lateral global. Los aminoácidos pueden ser agrupados de acuerdo con similaridades en las propiedades de las cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en: Biochemistry , segunda edición., pp . 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975) ) : (1) no polares: Ala (A), Val (V) , Leu (L) , lie (I), Pro (P) , Phe (F), Trp (W) , Met (M) ; (2) polares sin cargar: Gly (G) , Ser (S), Thr (T), Cys (C) , Tyr (Y), Asn (N) , Gln (Q) ; (3) ácidos: Asp (D), Glu (E) y (4) básicos: Lys (K) , Arg (R) , His (H) . Alternativamente, los residuos que se presentan de manera estable en la naturaleza pueden ser divididos en grupos en base a propiedades de cadena lateral comunes: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofilicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen la orientación de la cadena: Gly, Pro y (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe . Las sustituciones no conservadoras abarcan intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase, en tanto que las sustituciones conservadoras abarcan intercambiar un miembro de una de estas clases por otro dentro de la misma clase. Los anticuerpos CD4 no agotantes que llevan sustituciones, cancelaciones o adiciones no conservadoras o conservadoras que alteran, agregan o cancelan un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (comúnmente menos de 5%, más comúnmente menos de 4%, 2% o 1%) de los residuos de aminoácidos de cualquiera de los anticuerpos CD4 descritos en la presente son también apropiados para uso en los métodos de la invención. Cualquier residuo de cisteina no involucrado en mantener la conformación apropiada del anticuerpo puede también ser sustituido, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidante de la molécula e impedir la reticulación aberrante. Inversamente, enlace (s) de cisteina puede (n) ser agregado (s) al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento de Fv) . Un tipo de variante sustitucional involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo original. En general, la(s) variante (s) resultante seleccionada para desarrollo adicional tendrá propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo original del cual son generadas. Una manera conveniente para generar tales variantes sust itucionales es maduración por afinidad utilizando despliegue de fago. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) son mutados para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo asi generadas son desplegadas de manera monovalente a partir de partículas de fago filamentosas como fusiones al producto de gen III de M13 empacado dentro de cada partícula. Luego las variantes fago-desplegadas son seleccionadas en cuanto a su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de enlace) como se revela en la presente. Con el fin de identificar sitios de región hipervariable candidatos para modificación, mutagénesis de barrido de alanina se pueden efectuar para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente al enlace de antígeno. Alternativa o adicionalmente , puede ser benéfico analizar la estructura cristalina del complejo de antígeno-ant icuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y antígeno. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que tales variantes son generadas, el panel de variantes establecido a selección como se describe en la presente y anticuerpos con propiedades superiores en uno o más análisis relevantes pueden ser seleccionados para desarrollo adicional. Otro tipo de variante de aminoácidos del anticuerpo altera el patrón de glicosilación adicional del anticuerpo. Tal alteración incluye cancelar una o más porciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo y/o albergar uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de polipéptidos es ya sea N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la anexión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina , en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la anexión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Asi, la presencia ya sea de una u otra de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación O-enlazada se refiere a la anexión de uno de los azúcares N-acet ilgalactosamina , galactosa o xilosa a un oxiaminoácido , más comúnmente serina o treonina, aunque 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina pueden también ser usados. La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se lleva a cabo covalentemente al alterar la secuencia de aminoácidos, de tal manera que contiene una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para sitios de glicosilación N-enlazados. La alteración puede también ser realizada mediante la adición de o sustitución por uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación O-enlazados) .

En donde el anticuerpo comprende una región Fe, el carbohidrato anexado al mismo puede ser alterado o removido. Por ejemplo, en una variante de glicosilación en la presente, una o más sustituciones de aminoácidos son introducidas en una región de Fe de un anticuerpo para eliminar uno o más sitios de glicosilación. Tal anticuerpo aglicosilado puede tener función receptora reducida, por ejemplo, en comparación con IgGl humano, de tal manera que su habilidad para inducir activación de complemento y/o citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo es disminuida y el anticuerpo aglicosilado puede tener enlace reducido (o ningún enlace) al receptor de Fe. Para ciertos anticuerpos, por ejemplo un anticuerpo agotante usado como segundo compuesto en los métodos de la invención, la modificación del anticuerpo para mejorar ADCC y/o CDC del anticuerpo puede ser deseable. Por ejemplo, anticuerpos con una estructura de carbohidrato madura que carece de fucosa anexado a una región de Fe del anticuerpo como se describe en Patente Estadounidense 2003/0157108 (Presta, L.) . Véase también Patente Estadounidense 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) . Los anticuerpos con una N-acetilglucosamina (GlcNAc) de bisección en el carbohidrato anexada a una región Fe del anticuerpo son referidos en WO 2003/011878, Jean-Mairet et al. y patente Estadounidense No. 6,602,684, Umana et al. Anticuerpos con por lo menos en el oligosacárido sacado a una región de Fe del anticuerpo son reportados en WO 1997/30087, Patel et al. Véase también, WO 1998/58964 (Raju, S.) y WO 1999/22764 (Raju, S.) concernientes con anticuerpos con carbohidrato alterado anexado a la región de Fe del mismo. Asi, una variante de glicosilación comprende opcionalmente una región Fe, en donde una estructura de carbohidrato anexada a la región de Fe carece de fucosa. Tales variantes tienen función de ADCC mejorada. Opcionalmente, la región de Fe comprende además una o más sustituciones de aminoácidos en la misma que mejoran adicionalmente la ADCC, por ejemplo, sustituciones en posiciones 298, 333 y/o 334 de la región de Fe (numeración de residuos Eu) . Ejemplos de publicaciones concernientes con anticuerpos "desflucosilados" o " fucosa-dependientes" incluyen: Patente estadounidense 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; Patente estadounidense 2003/0115614; Patente estadounidense 2002/0164328; Patente estadounidense 2004/0093621; Patente estadounidense 2004/0132140; Patente estadounidense 2004/0110704; Patente estadounidense 2004/0110282; Patente estadounidense 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004) y Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004) . Ejemplos de lineas celulares que producen anticuerpos desflucosilados incluyen células Lecl3 CHO deficientes en fucosilación de proteina (Ripka et al. Arch .

Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986) ; Patente estadounidense 2003/0157108, Presta, L y O 2004/056312, Adams et al., especialmente en el Ejemplo 11) y lineas celulares de expulsión, tales como el gen de alfa-1 , 6-fucosiltransferasa , FUT8, células de expulsión CHO ( Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87 : 614 (2004 ) ) . La modificación del anticuerpo con respecto a función efectora, por ejemplo, para mejorar la ADCC y/o CDC del anticuerpo, puede ser obtenida al introducir una o más sustituciones de aminoácidos . en una región de Fe de un anticuerpo. Alternativa o adicionalmente , residuo (s) de cisteina puede (n) ser introducido ( s ) en la región de Fe, permitiendo mediante esto formación de enlace de disulfuro de intercadena de esta región. El anticuerpo homodimérico asi generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o exterminio celular mediado por complemento incrementado y ADCC mejorada. Véase Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol 148:2918-2922 (1992) . Anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada pueden también ser preparados utilizando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al. Cáncer Research 53:2560-2565 (1993) . Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo que tiene regiones de Fe dobles y puede tener mediante esto capacidades de lisis de complemento mejoradas y ADCC mejorada. Véase Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989) . WO 2000/42072 (Presta, L.) describe anticuerpos con función de ADCC mejorada en presencia de células efectoras humanas, en donde los anticuerpos comprenden sustituciones de aminoácidos en la región de Fe de los mismos. Preferiblemente, el anticuerpo con ADCC mejorada comprende sustituciones en posiciones 298, 333 y/o 334 de la región de Fe. Preferiblemente, la región de Fe alterada es una región de Fe de IgGl humana que comprende o consiste de sustituciones en una, dos o tres de estas posiciones. Anticuerpos con enlace de Clq y/o CDC alterada son descritos en WO 1999/51642 y Patentes Estadounidenses Nos. 6,194,551, 6,242,195, 6,528,624 y 6,538,124 (Idusogie et al.) . Los anticuerpos comprenden una sustitución de aminoácido en una o más deposiciones de aminoácidos 270 322, 326, 327, 329, 313, 333 y/o 334 de la región de Fe de los mismos. Anticuerpos anti-CD4 no agotantes que comprenden tales sustituciones de aminoácidos constituyen una modalidad de la invención. Al incrementar la vida media en el suero del anticuerpo, se puede incorporar un epitopo de enlace de receptor de fragmento al anticuerpo (especialmente, un fragmento de anticuerpo) como se describe en la Patente Estadounidense No. 5, 739, 277, por ejemplo. Como se usa en la presente, el término epitopo de enlace de receptor de salvamento se refiere a un epitopo de la región Fe de una molécula de IgG (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable para incrementar la vida media en el suero in vivo de la molécula de IgG. Los anticuerpos con sustituciones en una región Fe de los mismos y vidas medias en el suero incrementadas son también descritos en WO 2004/42072 (Presta L.) · Anticuerpos anti-CD4 no agotantes que comprenden tal epitopo de enlace de receptor de salvamento constituyen una modalidad de la invención. Cualquiera de los anticuerpos no agotantes (u otros) de la invención pueden comprender por 'lo menos una sustitución en la región Fe que mejora el enlace de FcRn o vida media en el suero, por ejemplo, un anticuerpo variante anti-CD4 no agotante. Por ejemplo, la invención proporciona además un anticuerpo que comprende una región de Fe variante con afinidad de enlace de receptor de Fe (FcRn) neonatal alterada. FcRn es estructuralmente similar al complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) y consiste de una cadena alfa enlazada covalentemente a p2-microglobulina . Las múltiples funciones del receptor Fe neonatal FcRn son revisadas en Ghetie y Ward (2000) Annu . Rev. Immunol . 18:39-766. FcRn juega un papel en la administración pasiva de IgG de inmunoglobulina de madre a joven y de la regulación de niveles de IgG en el suero. FcRn actúa como receptor de salvamento, enlace y transporte de IgG pinocitosadas en forma intacta tanto dentro y a través de las células y la rescata de una ruta degradante predeterminada. Aunque los mecanismos responsables por salvar las IgG no son claros, se piensa que la IgG a enlazar es dirigida hacia la proteólisis en lisosomas, mientras que las IgG enlazadas son recicladas a la superficie de las células y liberadas. Este control toma lugar dentro de las células endoteliales localizadas en todos los tejidos adultos. FcRn es expresado en por lo menos el hígado, glándula mamaria e intestino adulto. FcRn se enlaza a IgG; la interacción de FcRn-IgG ha sido estudiada extensamente y parece involucrar residuos en la interfase de dominio CH2, CH3 de la región de Fe de IgG. Estos residuos interactúan con residuos situados principalmente en el dominio a2 de FcRn. En ciertas modalidades de la invención, un anticuerpo variante anti-CD4 no agotante puede exhibir enlace incrementado a FcRn y comprender una modificación de aminoácido en cualquiera de una o más posiciones de aminoácidos 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434 de la región de Fe, en donde la numeración de los residuos en la región de Fe es aquella del índice EU tal como en Kabat. Véase por ejemplo, patente Estadounidense 6,737,056 y Shields et al., J. Biol . Chem. 276: 6591-6604 (2001) . En una modalidad de la invención, un anticuerpo comprende una región de IgG variante que comprende por lo menos una sustitución de aminoácido en Asn 434 a His (N434H) . En una modalidad de la invención, un anticuerpo comprende una región de IgG Fe variante que comprende por lo menos una sustitución de aminoácidos en Asn434 a Ala (N434A) . Comúnmente, estas variantes comprenden una afinidad de enlace superior para FcRN que los polipéptidos que tienen una región de Fe de secuencia natural/secuencia tipo silvestre. Estos polipéptidos de anticuerpos variantes Fe tienen la ventaja de ser salvados y reciclados en lugar de degradados. Estos anticuerpos variantes anti-CD4 no agotantes pueden ser usados en los métodos provistos en la presente. Como solo un ejemplo de un anticuerpo variante CD4 no agotante, cualquiera de los anticuerpos TRX1 descrito en la presente puede incluir una sustitución en la posición de cadena pesada 434, tal como N434A o N434H. La vida media en el suero del anticuerpo puede también ser incrementada mediante incorporación de un péptido de enlace de albúmina de suero al anticuerpo como se revela en la Solicitud de Patente Estadounidense No. de Serie 20040001827 (Dennis, M.) . Anticuerpos anti-CD4 no agotantes que comprenden tales péptidos de enlace de albúmina de suero constituyen una modalidad de la invención. Anticuerpos diseñados con tres o más (preferiblemente cuatro) sitios de enlace de antigenos funcionales son también contemplados (US 2002/0004587 Al, iller et al.) . Anticuerpos anti-CD4 no agotantes que comprenden tales sitios de enlace de antigenos múltiples constituyen una modalidad de la invención. Moléculas de ácidos nucleicos que codifican variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo son preparadas mediante una variedad de métodos conocidos en el arte. Estos métodos incluyen pero no están limitados a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza) o preparación mediante mutagénesis modulada por oligonucleót ido (o dirigida al sitio) , mutagénesis de PCR y mutagénesis de cásete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo. Al llevar a la práctica la presente invención, muchas técnicas convencionales en biología molecular, microbiología y tecnología de ADN recombinante son usadas opcionalmente . Estas técnicas son bien conocidas y son explicadas en, por ejemplo, Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a Edición), Vol . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2000 y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds . , Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (complementado hasta 2006) . Otras referencias útiles, por ejemplo, para aislamiento y cultivo celular (por ejemplo, para aislamiento de ácidos nucleicos o proteínas subsecuentes) incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, iley-Liss, Nueva York y referencias citadas en la presente; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, NY; Gamborg y Phillips (Eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg Nueva York) y Atlas y Parks (Eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL . Métodos de fabricación de ácidos nucleicos (por ejemplo, mediante amplificación in Vitro, purificación de células o síntesis química), métodos para manipular ácidos nucleicos (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, mediante digestión de enzimas de restricción, ligación, etc.) y varios vectores, líneas celulares y los semejantes útiles en la manipulación y fabricación de ácidos nucleicos son descritos en las referencias anteriores. Además, esencialmente cualquier polinucleótido (en los que se incluyen por ejemplo, polinucleót idos marcados o biot inilados ) puede ser ordenado sobre pedido o pedido estándar de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales.

Administración Como se comprenderá por aquellos de habilidad ordinaria en el arte, las dosis apropiadas de anticuerpo CD4 no agotantes serán en general alrededor de aquellas ya empleadas en terapias clínicas, en donde se administran anticuerpos similares solos o en combinación con otros terapéuticos. La variación en dosificación probablemente ocurrirá dependiendo de la condición que es tratada. El médico que administra el tratamiento será apto de determinar la dosis apropiada para el sujeto individuo. La preparación y programas de dosificación para segundos compuestos disponibles comercialmente administrados en combinación con los anticuerpos CD4 no agotantes pueden ser usados de acuerdo con las instrucciones de fabricantes o determinadas empíricamente por el médico experimentado. Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada del anticuerpo y cualquier segundo compuesto administrado en combinación con el anticuerpo no agotante dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, como se define anteriormente, la severidad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo no agotante o combinación es administrado por propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo o combinación y la discreción del médico que atiende. El anotación no agotante o combinación es suministrada apropiadamente al paciente una a la vez o más comúnmente en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 pg/kg a 50 mg/kg (por ejemplo, 0.1-20 mg/kg) de anticuerpo CD4 no agotante es una dosificación candidata inicial para administración al paciente, ya sea por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica podría fluctuará de aproximadamente 1 µ?/kg a aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas en varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que ocurre una supresión deseadas de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. Comúnmente, el médico administrará un anticuerpo (solo o en combinación con un segundo compuesto) de la invención hasta que se alcanza una (s) dosificación (es) que proporciona el efecto biológico requerido. El avance de la terapia de la invención es monitoreado fácilmente mediante técnicas y análisis convencionales. Por ejemplo, un anticuerpo CD4 no agotante de TRXl es administrado opcionalmente como se describe anteriormente o en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2003/0108518 ó 2003/0219403. En una modalidad, 3-5 mg/kg (mg de anticuerpo por kg de peso corporal del sujeto) son administrados al sujeto, solo o en combinación con un segundo compuesto como se describe en la presente y el tratamiento es sostenido hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. El anticuerpo no agotante es administrado opcionalmente en un período de tiempo con el fin de mantener en el sujeto niveles apropiados de anticuerpo (o si el anticuerpo es usado en combinación con un segundo compuesto, niveles apropiados de la combinación del anticuerpo y segundo compuesto) para obtener y mantener la supresión de los síntomas. El anticuerpo CD4 no agotante puede ser administrado mediante cualesquier medios apropiados, en los que se incluyen administración parenteral, tópica, subcutánea, int raperitoneal , intrapulmonar, intranasal, y/o intralesional . Las infusiones parenteral incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal o subcutánea. La administración intratecal también es contemplada (véase, por ejemplo, publicación de solicitud de patente estadounidense 2002/0009444 de Grillo-Lopez ) . Además, el anticuerpo puede ser administrado apropiadamente mediante infusión de impulso, por ejemplo con dosis declinantes del anticuerpo. Preferiblemente, la dosificación es dada intravenosa o subcutáneamente y opcionalmente mediante infusión (es) intravenosa ( s ) . Cada exposición puede ser provista utilizando los mismos medios o medios de administración diferentes. En una modalidad, cada exposición es mediante administración intravenosa. Como se indica, el anticuerpo CD4 no agotante puede ser administrado solo o en combinación con por lo menos un segundo compuesto. Estos segundos compuestos son en general usados en las mismas dosificaciones y con rutas de administración como se usan hasta ahora o aproximadamente 1 a 99% de las dosificaciones hasta ahora empleadas. Si se usan tales segundos compuestos, preferiblemente son usados en cantidades más bajas que si el anticuerpo CD4 no agotante no estuviera presente, para eliminar o reducir efectos secundarios provocados por el mismo. También como se indica, una variedad de segundos compuestos apropiados son conocidos en el arte y dosificaciones y métodos de administración para tales segundos compuestos han sido asimismo descritos como solo un ejemplo, el anticuerpo CD4 no agotante puede ser administrado en combinación con ciclofosfamida para tratamiento de lupus (o MS, artritis reumatoide o enfermedad de intestino inflamatorio, u otra alteración como se describe en la presente) . Una variedad de regímenes de tratamiento de ciclofosfamida han sido descritos en la literatura. Regímenes ejemplares incluyen, pero no están limitados a, administración intravenosa de 0.5-1.0 g/m2 mensualmente para seis meses que cada tres meses hasta 30 meses; y administración intravenosa de 500 mg cada dos semanas por tres meses; administración oral de 1-3 mg/kg/día por doce semanas o seis meses. Véase, por ejemplo, Petri (2004) "Cyclosphosphamide : new approaches for systemic lupus erythematosus" Lupus 13:366-371 and Petri and Brodsky (2006) "High-dose cyclophosphamide and stem cell transplantation for refractory systemic lupus erythematosus" JAMA 295:559-560.

La administración del anticuerpo anti-CD4 no agotante y cualquier segundo compuesto de la invención se puede hacer simultáneamente, por ejemplo como un sola composición o como dos o más composiciones distintas utilizando la misma ruta o diferentes rutas de administración. Adicional o alternativamente, la administración se puede hacer secuencialmente en cualquier orden. En ciertas modalidades, los intervalos que fluctúan de minutos a días, a semanas a meses, pueden estar presente entre las administraciones de las dos o más composiciones. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD4 no agotante puede ser administrado primero, seguido por el segundo compuesto de la invención. Sin embargo, la administración simultánea o administración del segundo compuesto de la invención primero es también contemplada. Como se indica anteriormente, un tercero, cuarto, etc. compuesto es administrado opcionalmente en combinación con el anticuerpo CD4 no agotante y el segundo compuesto. Similarmente , el tratamiento por síntomas secundarios o relacionados con lupus (por ejemplo, espast icidad, incontinencia, dolor, fatiga) o MS, artritis reumatoide, enfermedad de intestino inflamatorio, u otra condición o enfermedad pueden ser administrada al sujeto, por ejemplo, durante el tratamiento con el anticuerpo CD4 no agotante o combinación .

FORMULACIONES FARMACÉUTICAS Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos usados de acuerdo con la presente invención son preparadas para almacenamiento al mezclar un anticuerpo CD4 no agotante que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores aceptables farmacéuticamente opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) ), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen soluciones reguladoras del pH tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes en los que se incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimet ilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butilico o bencílico; alquil parabenes tales como metil o propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menores de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona ; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos u otros carbohidratos en los que se incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteina ) ; y/o surfactantes no iónicos tales como Tween®, Pluronics® o PEG. Formulaciones liofilizadas adaptadas para administración subcutánea son descritas, por ejemplo, en la patente estadounidense No. 6,267,958 (Andya et al.). Tales formulaciones liofilizadas pueden ser reconstituidas con un diluyente apropiado a una alta concentración de proteina y la formulación reconstituida puede ser administrada subcutáneamente al mamífero a ser tratado en la presente. Formas cristalizadas de anticuerpos también son contempladas. Véase, por ejemplo, U.S. 2002/0136719A1 (Shenoy et al.) . La formulación en la presente puede también contener por lo menos un segundo compuesto como sea necesario para la indicación particular que es tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un agente citotóxico (por ejemplo, metotrexato, ciclofosfamida o azatioprina) , agente quimioterapéutico, agente inmunosupresor , citocina, citocina antagonista o anticuerpo, factor de crecimiento, hormona, integrina, antagonista o anticuerpo de integrina (por ejemplo, un anticuerpo LFA-1 o un anticuerpo alfa 4 integrina tal como natalizumab) , fármaco clase interferón tal como IFN-beta-la o IFN-beta-lb, un oligopéptido tal como acetato de glatirámero, inmunoglobulina intravenosa (gamma globulina) , fármaco de agotamiento de linfocito (por ejemplo, mitoxantrona , ciclofosfamida , anticuerpos CamPath® o cladribina), fármaco inmunosupresor no agotante de linfocitos (por ejemplo, MMF o ciclosporina ) , fármaco que disminuye el colesterol de la clase "estatina", estradiol, fármaco que trata síntomas secundarios o relacionadas a lupus, MS, artritis reumatoide o enfermedad de intestino inflamatorio (por ejemplo, espasticidad, incontinencia, dolor, fatiga), un inhibidor de TNF, D ARD, NSAID, corticosteroide (por ejemplo, metiiprednisolona , prednisona, dexametasona o glucocorticoide ) , levotiroxina , ciclosporina A, análogo de somatastatina , anti-metabolito, un antagonista/anticuerpo de superficie de célula T o B, etc., u otros como se indica anteriormente en la formulación. El tipo y cantidades efectivas de tales otros agentes depende, por ejemplo, de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de lupus o MS u otra condición o enfermedad que es tratada y parámetros clínicos de los sujetos. Los ingredientes activos pueden también estar atrapados en microcápsulas preparadas por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocápsulas ) o en macroemulsiones . Tales técnicas son reveladas, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed . (1980) . Preparaciones de liberación sostenida pueden ser preparadas. Ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo no agotante, tales matrices están en forma de artículos formados, por ejemplo películas o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli ( 2-hidroxietil-metacrilato ) o poli (alcohol vinílico) ) , polilacturos (patente estadounidense No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el Lupron Depot® (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuproluro) y ácido poli-D- ( - ) -3-hidroxibut i rico . Las formulaciones a ser usadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles .

ARTÍCULOS DE MANUFACTURA En otra modalidad de la invención, un articulo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento de lupus, MS, artritis reumatoide, enfermedad de intestino inflamatorio, u otra condición o enfermedad descrita anteriormente es proporcionado. Preferiblemente, el articulo de manufactura comprende (a) un recipiente que comprende una composición que comprende un anticuerpo CD4 no agotante y un portador o diluyente aceptable farmacéuticamente dentro del recipiente; y (b) un inserto de empaque con instrucciones para el tratamiento de lupus, MS, artritis reumatoide, enfermedad de intestino inflamatorio, u otra condición o enfermedad en un sujeto mediante administración del anticuerpo, solo o en combinación con por lo menos un segundo compuesto. El inserto de empaque está sobre o asociado con el recipiente. Recipientes apropiados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los recipientes pueden ser formados a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente retiene o contiene una composición que es efectiva para el tratamiento de lupus, MS, artritis reumatoide, enfermedad de intestino inflamatorio, u otra condición o enfermedad y puede tener una compuerta de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Por lo menos un agente activo en la composición es el anticuerpo no agotante. La etiqueta o inserto de empaque indica que la composición es usada para el tratamiento de lupus, S, artritis reumatoide, enfermedad de intestino inflamatorio, u otra condición o enfermedad en un sujeto elegible para tratamiento con guia especifica con respecto a cantidades de dosificación e intervalos de anticuerpo y cualquier otro fármaco que son provistos . El articulo de manufactura puede comprender además un segundo recipiente que comprende una solución reguladora del pH diluyente aceptable farmacéuticamente, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina de pH regulado de fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. El articulo de manufactura comprende opcionalmente un segundo o tercer recipiente que comprende un segundo compuesto, tal como cualquiera de aquellos descritos en la presente, en donde el articulo comprende además instrucciones sobre el inserto de empaque para tratamiento del sujeto con el segundo compuesto. Alternativamente, la composición que comprende el anticuerpo CD4 no agotante puede también comprender el segundo compuesto. El articulo de manufactura puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, en los que se incluyen otras soluciones reguladoras del pH, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

EJEMPLOS Se comprenderá que los ejemplos y modalidades descritas en la presente son por propósitos ilustrativos solamente y que varias modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán sugeridos por las personas experimentadas en el arte y serán incluidos dentro del espíritu y alcance de esta solicitud y alcance de las reivindicaciones adjuntas. Así, los siguientes ejemplos son ofrecidos para ilustrar, pero no limitar, la invención reivindicada.

EJEMPLO 1: TRATAMIENTO DE LUPUS CON ANTICUERPO CP4 NO AGOTANTE, SOLO Y EN COMBINACIÓN Lo siguiente resume una serie de experimentos que demuestran que un anticuerpo CD4 no agotante es eficaz en un modelo preclínico de SLE. El desempeño del anticuerpo es comparado con aquel de tratamiento estándar ejemplares y tratamientos experimentales. Ratones NZBxW Fl exhiben enfermedad de riñon semejante a lupus espontánea, proporcionando un modelo de eficacia preclínica útil de SLE (véase, por ejemplo, Theofilopoulos (1992) "Murine models of systemic lupus erythematosus" in Systemic Lupus Erythematosus , Lahita (ed.) Churchill Livingstone, New York, 121-194) . La Figura 5 ilustra esquemáticamente el avance de la enfermedad por edad en este modelo. Los síntomas observados incluyen la aparición de anticuerpos ds-ADN, proteinuria, histopatología de riñon, nitrógeno de urea de sangre incrementado (BUN) y mortandad incrementada. Las flechas indican los puntos en el tiempo en los cuales el tratamiento con el anticuerpo CD4 no agotante fue iniciado en dos estudios que comparan el anticuerpo con otros tratamientos . En este modelo, eficacia preclinica de un anticuerpo CD4 no agotante de rata YTS177 (Cobbold et al. (1990) "The induction of skingraft tolerance in MHC-mismatched or primed recipients: primed T-cells can be tolerized in the periphery with CD4 and CD8 antibodies"' Eur J Immunol 20:2747-2755) fue comparada con aquella de un anticuerpo testigo o de control sin enlace (Ab de control o Ig de control), CTLA4-Ig (en desarrollo clínico) y ciclofosfamida (Cytoxan®, CTX; un tratamiento de estándar de cuidado actual) . El anticuerpo CD4 no agotante YTS177 una donación de Hermán Waldmann, Oxford. El anticuerpo de control fue un anticuerpo IgGl de ratón irrelevante (un anticuerpo de ratón fue usado por el control puesto que un anticuerpo de rata irrelevante produciría una respuesta inmune contra si mismo, influenciando el curso de la enfermedad; el anticuerpo anti-CD4 de rata impide tal respuesta a sí mismo) . El constructo CTLA4-Ig usado incluye el dominio extracelular de CTLA-4 murino fusionado a los dominios -C3, C4 Ig de engozne IgGl humano y es modelado después de Linsley et al. (1991) J Exp Med 174 (3) : 561.

A los 8 meses de edad, los ratones NZB x NZW fueron seleccionados en cuanto a proteinuria y aleatorizados en 5 grupos en base a sus puntuaciones de proteinuria. A esta edad, se considera que la enfermedad es moderada-severa . Al inicio del experimento, cada grupo de 19 ratones estaba compuesto de la siguiente distribución de concentraciones de proteina en la orina: 32% a >300 mg/dl; 24% a 100-300 mg/dl; y 44% a 30-100 mg/dl. Los ratones fueron tratados continuamente por 6 meses ya sea con anticuerpo de control o testigo (Ab de control o Ig control o testigo), YTS177 (anti-CD4 no agotante), CTLA4-Ig, ciclofosfamida (CTX) , o una combinación de anti-CD4 y CTX. YTS177 y CTLA4-Ig fueron administrados 3x/semana a 5 mg/kg mediante inyección intraperitoneal (IP) ; la ciclofosfamida (CTX) fue dada IP a 50 mg/kg cada 10 días (sola o en combinación con la cantidad indicada de YTS177) . Los ratones fueron monitoreados en cuanto a cambios en concentración de proteina en la orina (por ejemplo, proteinuria) , Nitrógeno en urea de sangre (BUN) y supervivencia. Como se muestra en la Figura 6, la administración del anticuerpo CD4 no agotante retardó el tiempo al avance (Figura 6A) , incrementó la supervivencia (Figura 6B) , disminuyó la proteinuria (datos para el mes 5 después de tratamiento son mostrados, Figura 6C) y BUN media disminuida (Figura 6D) . El tratamiento con el anticuerpo CD4 no agotante puede invertir el lupus nefritis severo, como se muestra en la Figura 7. La Figura 7A ilustra el porcentaje de ratones bajo tratamiento de 300 mg/dl de proteinuria a los tiempos indicados después del tratamiento. La administración del anticuerpo CD4 no agotante solo o en combinación con ciclofosfamida dio como resultado una disminución neta en ratones que exhiben >300 mg/dl de proteinuria, indicando una inversión de síntomas de nefritis en la enfermedad de etapa tardía que no fue observado en grupos tratado con el anticuerpo de control, CTLA4-Ig o ciclofosfamida solos. La Figura 7B muestra el porcentaje de ratones invertidos de 300 mg/dl de proteinuria dentro del primer mes de tratamiento. (La Figura 7B ilustra datos recopilados de cuatro estudios, en los que se incluyen el descrito en la presente y tres estudios similares. Los datos incluyen solamente ratones cuya proteinuria fue >300 mg/dl al tiempo de inicio del tratamiento) . Un efecto sinergístico en la capacidad para invertir la proteinuria fue observado cuando el anticuerpo CD4 fue combinado con ciclofosfamida (CTX) . El tratamiento con una combinación del anticuerpo CD4 no agotante y ciclofosfamida es también efectivo para disminuir la proteinuria. La Figura 9 ilustra múltiples análisis de comparación de proteinuria en el mes 6 de tratamiento, utilizando el método de Dunnett con el grupo tratado con ciclofosfamida como grupo de control de referencia en la Figura 9A y el grupo tratado con anticuerpo CD4 no agotante como el grupo de control de referencia en la Figura 9B. Los controles de referencia son designados en negritas y solamente los valores p para grupos que obtienen significado estadístico contra el control de referencia son designados sobre la gráfica. Los resultados demuestran otra vez que el anticuerpo CD4 no agotante fue superior a CTLA4-Ig para disminuir proteinuria (véase, por ejemplo, Figura 9B) . Los resultados también demuestran que la combinación del anticuerpo CD4 no agotante y ciclofosfamida proporcionan beneficio significativo son respecto a ciclofosfamida sola para disminuir la proteinuria en el modelo (véase, por ejemplo, Figura 9A) . El examen de secciones de riñon teñidas por CD4 y CD8 reveló infiltrados linfocíticos en el intersticio médula renal o pélvico en ratones después de cuatro meses de tratamiento con anticuerpo de control. El tratamiento con el anticuerpo CD4 o con CTLA4-Ig, por otra parte, dio como resultado una reducción en células CD4+ observadas en el intersticio de riñon a cuatro meses post-tratamiento . El tratamiento con anticuerpo CD4 no impactó el número de células T CD8+ observadas en el riñon. El tratamiento de ratones NZBxW Fl que exhiben enfermedad de riñon semejante a lupus espontáneo (modelo de ratón SLE) con el anticuerpo CD4 no agotante también limitó los incrementos en los sitios de anticuerpo de ds-ADN. Como se muestra en la Figura 8, los incrementos en títulos de anticuerpo ds-ADN con respecto al tiempo fueron menos en animales tratados con el anticuerpo CD4 no agotante en comparación con los animales tratados con el anticuerpo de control. Compárese la Figura 8A, que muestra el titulo o titulación en el reclutamiento (un promedio de aproximadamente 3 logaritmos para cada uno de los grupos de tratamiento) , con Figura 8B, que muestra el titulo de tres meses post-tratamiento (aproximadamente 3.5 logaritmos y 4.5 logaritmos para los grupos de tratamiento anti-CD4 no agotante y anticuerpo de control, respectivamente). En este experimento, el tratamiento fue iniciado a seis meses de edad en lugar de ocho meses de edad. Además, el tratamiento con el anticuerpo CD4 disminuyó el número de células CD4+ T activadas encontradas en el bazo, tal como se determina mediante citometria de flujo con anticuerpos dirigidos contra proteínas de superficie asociadas con la activación de célula T. Como se muestra en la Figura 8, el número tanto de células CD4+CD69+ (Figura 8C) y células CD4+CD25+ (Figura 8D) encontradas en bazo tres semanas posttratamiento fue menor en los animales tratados con anticuerpo CD4 no agotante en comparación con los animales tratados con anticuerpo de control (tratamiento iniciado a ocho meses de edad) . El tratamiento con el anticuerpo CD4 no agotante fue también efectivo cuando es introducido en enfermedad suave en lugar en lugar de enfermedad moderada-severa . Ratones NZB x NZ a seis meses de edad, todos con 30-100 mg/dl de proteinuria, fueron tratados con Ab de control, YTS177 (anti-CD4 no agotante) , CTLA4-Ig o ciclofosfamida (Cytoxan®) básicamente como se describe anteriormente. Los ratones fueron monitoreados en cuanto a cambios en proteinuria y supervivencia. Como se muestra en la Figura 6, la administración del anticuerpo CD4 no agotante que comienza a seis meses de edad retardó el tiempo al avance (Figura 6E) e incrementó la supervivencia (Figura 6F) en relación con el control, demostrando que el anticuerpo CD4 no agotante es altamente efectivo cuando es introducido en enfermedad suave. (Todos tratamientos son muy efectivos cuando se comparan con el control: a un tiempo de 7 meses al avance *p<0.025 (Figura 6E) y supervivencia *p<0.04 (Figura 6F) ) . En resumen, el tratamiento con el anticuerpo CD4 no agotante fue eficaz en ratones NZBx Fl cuando es introducido prematuramente o más tarde en la enfermedad. El tratamiento con el anticuerpo prolongó el avance libre de enfermedad y supervivencia, retardó la elevación de BUN y el desarrollo de qlomerulonef itis , limitó los incrementos en títulos anti-dsADN y disminuyó los números de células CD4+ T activadas. El efecto observado con el anticuerpo a 5 ó 6 meses de tratamiento fue comparable con aquel de ciclofosfamida y superior a aquel de CTLA4-Ig para reducir la proteinuria; la distinción entre anti-CD4 y CTLA4-Ig fue más evidente en la enfermedad tardía. Además, la combinación del anticuerpo CD4 no agotante con ciclofosfamida proporcionó beneficio significativo con respecto a ciclofosfamida sola en el modelo de NZB/W Fl de SLE.

Procedimientos experimentales Urinálisis La proteinuria fue medida utilizando un analizador de química de orina Clinitek® 50 (Bayer Corporation, Elkhart, EN, USA) . Una gota de orina recién recolectada fue colocada sobre una banda de reactivo (Multistix® 10 SG, Bayer) y la banda fue insertada inmediatamente al analizador después de la remoción de orina en exceso mediante inmunoabsorción con una esponja de gasa limpia.

Medición de niveles de nitrógeno de urea en sangre El nitrógeno de urea en sangre fue medido utilizando un analizador de química Cobas Integra® 400 (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza) y el reactivo de detección de urea (también suministrado por Roche Diagnostics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los controles de suero humano liofilizado PrecinormTM y Precipath™ (Roche Diagnostics) fueron usados como controles normales y anormales, respectivamente .

Teñido de secciones de riñon en cuanto a CD4 y CD8 Para inmunohistoquimica marcada doble de CD4/CD8, secciones de riñon congeladas de 5 mieras de espesor fueron cortadas y fijadas en acetona helada (-20° C) durante 5 minutos, enjuagadas 2 X 5 minutos en TBS/0.1% Tween 20 (TBST) y luego bloqueadas en cuanto a actividad de peroxidasa endógena con glucosa oxidasa durante 1 hora a 37°C. Luego las secciones fueron enjuagadas en TBST y bloqueadas en cuando a avidina/biot ina endógena utilizando un equipo de bloqueo de avidina/biotina de Vector Labs (Vector Labs, Burlingame, CA) . Después del enjuague en TBST, las inmunoglobulinas endógenas fueron bloqueadas con suero de conejo al 10%/BSA al 3%/TBS durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA) . Para la marcación de CD8, las secciones fueron incubadas con anticuerpo monoclonal CD8 anti-ratón de rata biotinilado (MAb) , clon 53.6-7 (Pharmingen, San Diego, CA) , a 8 ug/ml durante 1 hora a temperatura ambiente. Para el control negativo, un isotipo natural IgG2a de rata, fue usado como el anti-suero primario. Después del enjuague en TBST, las secciones fueron incubadas en reactivo Vectastain ABC-Elite (Vector Labs) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego la reacción de teñido fue visualizada utilizando DAB mejorado de metal como el cromógeno (Pierce Biotechnology , Rockford, IL) .

Para marcación secundaria con anticuerpo CD4, las secciones fueron otra vez bloqueadas en cuanto a avidina/biotina (de la primera reacción) utilizando el equipo de bloqueo de avidina/biotina de Vector Labs. Luego las secciones fueron incubadas con un MAb CD4 anti-ratón de rata, clon RM4-4 (Pharmingen) a 0.5 ug/ml durante 1 hora a temperatura ambiente. Para el control negativo, un isotipo natural, IgG2b de rata, fue usado como el anti-suero primario.

Después del enjuague en TBST, las secciones fueron luego o incubadas con complejo de estreptavidina-HRP de un equipo de TSA™ (amplificación de señal de tiramida) ( Perkin-Elmer LAS Inc., Boston MA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de enjuague en TBST, las secciones fueron luego incubadas con reactivo de amplificación TSATM biotinilado (Perkin-Elmer LAS Inc.) por 3 minutos a temperatura ambiente seguido por una segunda ronda de estreptavidina-HRP durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, la reacción de teñido fue visualizada utilizando Vector® Red (Vector Labs) como el cromógeno . Luego las secciones marcadas dobles fueron contrateñidas ligeramente con hematoxilina de Myer durante 1 minuto, enjuagadas con agua de la llave y cubiertas con cubreobjetos utilizando Crystal/Mount (Biomeda Corporation, Foster City, CA) .

Determinación de títulos de anticuerpo de ADN de doble hebra Títulos de anticuerpo anti-ds-ADN fueron determinados mediante ELISA. Placas de 384 cavidades de inmunoplaca de Nunc MAXIsorb (número 464718) fueron recubiertas con poli-L-lisina (25 µ?/cavidad, 0.01%, Sigma P4707) durante 1 hora a temperatura ambiente, lavados con agua desionizada, secados por aire a temperatura ambiente durante 1 hora y luego recubiertos con ADN de timo de becerro (Sigma D1501, 25 µ?/cavidad, 2.5 pg/ml en PBS) a 4°C durante toda la noche. Luego la solución de ADN de timo de becerro fue decantada de la placa, se agregaron 50µ1 de solución reguladora del pH de bloqueo (PBS, BSA al 0.5% pH 7.2) y la placa fue agitada durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego la placa fue lavada tres veces con solución reguladora del pH de lavado (PBS, Tween™ 0.05% 20 (monolaurato de polioxiet ilen ( 20 ) sorbitan ) , pH7.2) . Se prepararon diluciones seriales de muestras de suero en solución reguladora del pH de análisis (PBS, BSA al 0.5%, Tween™ 20 al 0.05%, Procline 3000 al 0.01%); una dilución de 25 veces inicial fue seguida por diluciones seriales de 3 veces efectuadas con un sistema de pipeteo automatizado Precisión 2000™. Diluciones seriales de suero de control negativo (un cúmulo de suero de ratón con un bajo nivel de anticuerpo o nivel de anticuerpo anti-dsADN de fondo) fueron preparados de la misma manera. Una o más diluciones de un suero de control positivo son también preparadas opcionalmente (por ejemplo, una dilución de 5000 veces de suero NZB Fl) . Las muestras de suero diluidas fueron agregadas a la placa lavada, por ejemplo, utilizando un robot de placa rápido para agregar 25 ul de suero diluido. La placa fue incubada durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación moderada, luego lavada seis veces con solución reguladora del pH de lavado. Anticuerpo Fe anti-ratón HRP (peroxidasa de rábano) conjugado fue agregado a cada cavidad (25 µ? de anti-mu-FcHRP de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Número de catálogo 115-035-071, diluido 5000 veces en solución reguladora del pH de análisis) y la placa fue incubada a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación moderada. La solución de sustrato (25 µ?/cavidad; una parte sustrato TMB más una parte de solución B de peroxidasa, ambas obtenidas de Kirkegaard & Perry) fue agregada y el color fue desarrollado. Se agregó solución de retención (25 µ?/cavidad de 1M H3P04) y la placa fue leída a 450/620 nm. Los títulos de anticuerpo anti-ds-ADN para las muestras de suero fueron calculados utilizando la siguiente formula : Título = - DF2) + DF2 en donde CP (el punto de corte) es 3 veces la absorbancia de la media de suero de control negativo; AltoA45o/62o es la absorbancia (A450/620) que es más cercana a, pero más alta en valor que el punto de corte; BajoA450/62o es la absorbancia (A450/62o) que es más cercana a pero más baja en valor que el punto de corte; DF1 es el factor de dilución para el valor A450/620 bajo, más cercano a pero más bajo en valor que el punto de corte; y DF2 es el factor de dilución del valor A450/620 alto, más cercano a, pero más alto en valor que el punto de corte.

Citometria de flujo Los números de células T CD4+ activadas encontradas en bazo fueron determinados mediante citometria de flujo como sigue. Bazos enteros fueron cosechados y molidos en suspensiones unicelulares, que fueron luego sometidas a lisis con célula de sangre roja utilizando solución reguladora del pH EL (solución reguladora del pH de lisis de eritrocito, de Qiagen, Valencia, CA, catálogo número 79217), se hicieron pasar a través de un colador de células de 70 mieras y luego resuspendidas para los conteos celulares. Un volumen fijo de cada suspensión celular fue mezclado con una solución de perla fluorescente ( Polysciences , Inc., número de catálogo 18862) de concentración conocida. Luego la mezcla se hizo correr sobre un citómetro de flujo FACScan™ de BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) . Al recolectar un número fijo de perlas para cada mezcla, el número total de células vivas podría ser calculado y subsecuentemente usado para determinar los números totales de sub-poblaciones celulares para el bazo de cada ratón después del análisis de FACS adicional. A lxlO6 células, una cantidad de saturación de anticuerpos fluoróforo-conj ugados fueron agregadas e incubadas sobre hielo durante 30 minutos, seguido por lavado con solución reguladora del pH fría. Las células del bazo fueron teñidas con anti-CD4 (BD Pharmingen, número de catálogo 553055, clon RM4-4), anti-CD3 (BD Pharmingen, número de catálogo 555276, clon 17A2) y anti-CD69 (BD Pharmingen, número de catálogo 553237, clon H1.2F3) o con anti-CD4, anti-CD3 y anti-CD25 (Miltenyi Biotec, número de catálogo 130-091-013) . El teñido de CD3 facilitó la separación de células CD4 y CD8 T, puesto que las células CD8 son positivas para CD3 pero negativas para CD4. Las muestras fueron analizadas mediante citometría de flujo en un citómetro de flujo FACSCalibur™ de BD Biosciences.

EJEMPLO 2: TRATAMIENTO DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE CON ANTICUERPO CD4 NO AGOTANTE Lo siguiente resume una serie de experimentos que demuestran que un anticuerpo CD4 no agotante es eficaz en un modelo preclínico de MS . El desempeño del anticuerpo es comparado con aquel de estándares de cuidado ejemplares y tratamientos experimentales.

La encefalitis autoinmune experimental (EAE) es una condición inflamatoria del sistema nervioso central (CNS) con similaridades a MS; en ambas enfermedades, las desmielinación da como resultado conducción de nervio deteriorada y parálisis. La EAE recaída y remitente inducida por inyección de péptido de proteína de proteolípido (PLP) en ratones SJL/J proporciona un modelo de eficacia preclínico útil de MS (véase, por ejemplo, Miller y Karpus (1996) "Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in the Mouse" in Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (eds. ) , John Wiley & Sons, Inc. and Sobel et al. (1990) "Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein" J Neuropathol Exp Neurol . 49(5) : 468-79) . La Figura 10 ilustra esquemáticamente el avance de la enfermedad con el tiempo después de inyección del péptido de PLP este modelo. La inyección en el día 0 es seguida por inicio de la enfermedad (días 0-15) , remisión (días 15-25) y recaída (día 25-terminación del estudio a los días 60-70) . Las puntuaciones neurológicas clínicas estandarizadas son asignadas como sigue: 0 - ninguna enfermedad; 1 - cola limpia o debilidad de extremo impedido, pero no ambos; 2 - cola limpia y debilidad de extremidad impedida; 3 - parálisis de extremidad impedida parcial; 4 - parálisis de extremidad impedida completa; y 5 -estado moribundo, muerte por EAE, sacrificio por razones humanas. En el esquema, las flechas indican los puntos en el tiempo en los cuales el tratamiento con anticuerpo CD4 no agotante fue iniciado en estudios que comparan el anticuerpo con otros tratamientos. Los puntos indican los puntos en el tiempo en los cuales otros tratamientos han mostrado previamente ser efectivos. En este modelo, la eficacia preclinica del anticuerpo CD4 no agotante fue comparada con aquella de un anticuerpo de control (descrito anteriormente) , CTLA4-Ig, un anticuerpo alfa-4 integrina y acetato de glatirámero (Copaxone®) . Los ratones SJL/J fueron inmunizados en el día 0 con el péptido PLP-139-151 en CFA (adyuvante de Freund completo) . Los ratones fueron seleccionados 3 veces/semana por puntuaciones de enfermedad, como se indica anteriormente; en puntos finales terminales, histopatologia (cerebro y médula espinal) fue examinada. Si la terapia comenzó después del inicio de la enfermedad, los ratones fueron monitoreados en cuanto a puntuaciones de enfermedad, luego aleatori zados en grupos con puntuaciones de enfermedad comparables antes del tratamiento. En tres estudios separados, el tratamiento con anticuerpo (u otro) comenzó durante el inicio de la enfermedad al día 8, un máximo de la enfermedad en el día 14 o a través del día 24. El anticuerpo CD4 no agotante, el anticuerpo de control, CTLA4-Ig, el anticuerpo de alfa-4 integrina y acetato de glatirámero fueron administrados 3 veces/semana a 10 mg/kg.

Excepto en donde se indica, en estos experimentos, el anticuerpo CD4 no agotante fue un anticuerpo YTS177 murinizado. YTS177 murinizado incluía las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo YTS177 de rata, clonado corriente arriba de las secuencias constantes de cadena pesada IgG2a y cadena ligera kappa de ratón. La cadena pesada incluía 2 sustituciones de un solo aminoácido en la región de enlace del receptor Fe (residuos correspondientes a los residuos de IgGl humana D265 y N297 han sido cambiados a alanina) . Como se ilustra en la Figura 11, el anticuerpo CD4 no agotante fue superior a CTLA4-Ig y acetato de glatirámero cuando es introducido al comienzo de la enfermedad (tratamiento iniciado en el día 8) . La Figura 11A presenta una gráfica de la puntuación clínica en el tiempo para grupos tratados con el anticuerpo de control, acetato de glatirámero, el anticuerpo de alfa-4-integrina, CTLA4-Ig y el anticuerpo CD4. La Figura 11B presenta las puntuaciones clínicas diarias promedio para estos grupos . El anticuerpo CD4 fue también superior a CTLA4-Ig cuando es introducido en el máximo de la enfermedad (tratamiento iniciado en el día 14), como se ilustra en la Figura 12. La Figura 12A presenta una gráfica de la puntuación clínica sobre el tiempo para grupos tratados con el anticuerpo de control, CTLA4-Ig y el anticuerpo CD4. (Acetato de glatirámero y el anticuerpo de alfa-4-integrina no son efectivos en este punto en el tiempo) . La Figura 12B presenta las puntuaciones clínicas diarias promedio para estos grupos. El efecto observado con el anticuerpo CD4 es representativo de tres experimentos independientes. Como se ilustra en la Figura 13, el anticuerpo CD4 fue también superior a CTLA4-Ig cuando es introducido tardío en la enfermedad (tratamiento iniciado en el día 24) . La Figura 13A presenta una gráfica de la puntuación clínica sobre el tiempo para grupos tratados con el anticuerpo de control, CTLA4-Ig y el anticuerpo CD4. La Figura 13B presenta las puntuaciones clínicas diarias promedio para estos grupos. El efecto observado con el anticuerpo CD4 no agotante es representativo de dos experimentos independientes. El tratamiento con un anticuerpo CD4 no agotante disminuyó la desmielinación en EAE, como se muestra en la Figura 14. El tratamiento con el anticuerpo (YTS177 en lugar del YTS177 murinizado en este experimento) comenzó cerca del máximo de la fase aguda de la enfermedad (día 12) y fue proseguido hasta la terminación del estudio en el día 80. Las médulas espinales fueron cosechadas, fijadas y teñidas con teñido azul Luxol Fast Azul (que tiñe de azul oscuro mielina intacta) . Las áreas contorneadas ilustran áreas de desmielinación. Los ratones seleccionados son representativos de la puntuación de desmielinación promedio por grupo.

El tratamiento con el anticuerpo CD4 (YTS177 murinizado) también redujo el infiltrado de célula T CD4+ en el modelo EAD de recaída/remisión. Por ejemplo, en secciones de médula espinal tomadas de animales en los días 60 después del inicio del tratamiento al día 14 y teñidos en cuanto a CD4 y CD8 como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, el infiltrado de CD4+ pero no CD8+ fue reducido en animales tratados con anticuerpos CD4 en comparación con los animales tratados con anticuerpo de control. Los ratones tratados con el anticuerpo CD4 no agotante siguieron siendo incompetentes, mostrando supervivencia normal enseguida de infección con Listeria. Por ejemplo, en el día 8 enseguida de la infección de Listeria, 10/10 animales tratados con el anticuerpo CD4 no agotante (YTS177 murinizado) sobrevivieron, en comparación con 8/10 animales tratados con el anticuerpo Ig de control, 3/10 animales tratados con CTLA4-Ig y 0/10 animales tratados con TNFRII-Fc ( ooley et al. (1993) J de Immunol 151(11) : 6602) . Los tratamientos comenzaron un día antes de la inoculación con Listeria con una dosis inicial de 20 mg/kg de los terapéuticos, después de lo cual todos los terapéuticos fueron dosificados a 5 mg/kg 3 veces/semana por la duración del estudio. Como se muestra en la Figura 15, el tratamiento con el anticuerpo CD4 redujo selectivamente las células efectoras de CD4+/memoria en la sangre. El número de células T de IC0ShiCD4 o IC0ShlCD8 por µ? de sangre tal como se determina mediante citometria de flujo es mostrado para animales tratado con el anticuerpo de control, el anticuerpo CD4 o CTLA4-Ig. (ICOShl es un marcador de células T efectoras /memoria , que representa menos de 4% de células T en la sangre de ratones normales y se ve que incrementa después del desarrollo de EAE a aproximadamente 15-20%) . A diferencia de CTLA4-Ig, el anticuerpo CD4 no agotante disminuyó el número de células CD4+ sin disminución en el número de células CD8+. En este experimento, el tratamiento fue iniciado en el día 14; las células fueron contadas en el día 46. En resumen, el tratamiento con anticuerpo CD4 no agotante es eficaz en el modelo de SJL/J de EAE de recaída/remisión. El tratamiento con el anticuerpo disminuyó las concentraciones clínicas en todos los puntos en el tiempo de intervención, diminuyó las puntuaciones de histología en cerebro y médula espinal, disminuyó el infiltrado de CD4+ pero no CD8+ en CNS y disminuyó los números de células de ICOShl CD4+ pero no CD8+ T. La eficacia del anticuerpo CD4 fue superior a aquella de CTLA4-Ig y acetato de glatirámero y por lo menos correspondió con aquella del anticuerpo monoclonal de alfa-4-integrina. El tratamiento con anticuerpo CD4 es también efectivo en un modelo de MS diferente, EAE inducido por OG-péptido en ratones C57Blk6. El modelo de MOG no muestra remisiones periódicas y asi es un modelo agudo/crónico de MS . Se observó una inversión rápida en síntomas neurológicos en el modelo de MOG modelo, similar a aquel observado en el modelo de SJL/J, cuando el tratamiento comenzó cerca del máximo de la enfermedad. Como se muestra en la Figura 16, el tratamiento con un anticuerpo CD4 no agotante (o agotante) disminuyó la puntuación clínica en comparación con el tratamiento con anticuerpo de control, CTLA4-Ig o un anticuerpo CD8 agotante.

Procedimientos experimentales Citometría de flujo Los números de células efectoras/de memoria en la sangre fueron determinados mediante citometría de flujo como sigue. Un volumen fijo de sangre fue recolectado retro-orbitalmente a tubos heparinizados , luego la célula de sangre roja fue sometida a lisis y resuspendida para conteos celulares. Un volumen fijo de cada suspensión celular fue mezclado con una solución de perlas fluorescentes de concentración conocida para determinación del número total de subpoblaciones de células para la sangre de cada ratón, como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. A lxlO6 células, una cantidad saturante de anticuerpos fluoróforo-conj ugados fueron agregadas e incubadas sobre hielo durante 30 minutos, seguido por lavado con solución reguladora del pH fría. Las células de sangre fueron teñidas con anti-CD4 (BD Pharmingen, número de catálogo 553055, clon RM4-4), el anti-CD8a (BD Pharmingen, número de catálogo 553033, clon 53-6.7), anti-ICOS biotinilado (BD Pharmingen, número de catálogo 552145, clon 7E.17G9) y luego lavados. Luego las células de sangre fueron teñidas con estreptavidina-APC (BD Pharmingen, número de catálogo 554067) y lavadas otra vez. Las muestras fueron analizadas mediante citometria de flujo sobre un dispositivo FACSCalibur de BD Biosciences.

Teñido azul Luxol Fast de secciones de médula espinal Ei teñido azul de Luxol Fast fue efectuado sobre médula espinal embebida con parafina fija con formalina seccionada a 4 µ??. Las secciones de médula espinal fueron desparafini zadas e hidratadas a 95% de etanol. Luego fueron teñidas durante toda la noche (por lo menos 16 horas) en Luxol Fast Azul a 60°C. El teñido en exceso fue enjuagado en etanol al 95% y los portaobjetos fueron lavados en dH20. Luego los portaobjetos fueron diferenciados rápidamente mediante inmersión en carbonato de litio al 0.05% durante 10 a 20 segundos y luego a través de varios cambios de etanol al 70% hasta que la materia gris y materia blanca podrían ser distinguidas. Luego los portaobjetos fueron teñidos con violeta de cresilo durante 5 minutos a 37°C, enjuagados en etanol al 95%, deshidratado lentamente, despejados y montados. Véase Sheehan (1980) Theory and Practice of Histotechnology, 2a ed, pp. 263-264.

Infección por Listeria Los ratones fueron inoculados intravenosamente con 100,000 unidades formadoras de colonias de monocitógenos de Listeria (cepa #43251 de ATCC) en 100 microlitros de PBS . Una inyección IP de los anticuerpos monoclonales o proteínas de fusión (400 yg por ratón, equivalente a 20 mg/kg, en 100 µ? de PBS) fue iniciada el día antes de la inyección de Listeria; dosis de 100 yg (5 mg/kg) 3 veces por semana fueron proseguidas por 10 días enseguida de las inyecciones de Listeria. Los ratones fueron monitoreados dos veces al día en cuanto a signos de enfermedad.

Generación de Listeria La virulencia de Listeria fue mantenida mediante el pasaje serial en ratones C57B1/6. Aislados recientes fueron obtenidos de bazos infectados, cultivados en infusión de corazón de cerebro líquido (BHI) o sobre placas de agar BHI (Difco Labs, Detroit, MI) . Las bacterias fueron lavadas repetidamente, resuspendidas en PBS estéril, y almacenadas a -80°C en PBS con glicerol al 20%.

EJEMPLO 3: TRATAMIENTO DE LUPUS CON ANTICUERPO CD4 EN COMBINACIÓN CON MMF Lo siguiente resume una serie de experimentos que demuestran que un anticuerpo CD4 no agotante, solo y en combinación con mofetil micofenolato, es eficaz en un modelo preclinico de SLE. El modelo de ratón NZBxW Fl de SLE fue descrito anteriormente en el Ejemplo 1. En este modelo, la eficacia preclinica de un anticuerpo CD4 no agotante (YTS177, descrito anteriormente) fue comparada con aquella de un anticuerpo de control no enlazante (descrito anteriormente) , mofetil micofenolato (CellCept® o MMF, un tratamiento actual) y una combinación de anticuerpo CD4 y MMF. El tratamiento de ratones NZB x NZ fue iniciado a 9 meses de edad. Los ratones fueron seleccionados en cuanto a proteinuria y aleatorizados en grupos en base a sus puntuaciones de proteinuria. Al inicio del experimento, cada grupo de tratamiento incluía 15 ratones, de los cuales 73% exhibían niveles de proteinuria de >300 mg/dl. (Nótese que este es un estado de enfermedad más severo que aquel al cual el tratamiento fue iniciado en los experimentos descritos en el Ejemplo 1 anterior, en los cuales solamente 32% de los ratones estaban a >300 mg/dl de proteinuria) . Los ratones fueron tratados continuamente durante dos meses ya sea Ab de control, el anticuerpo CD4 no agotante (anti-CD4), MMF (CellCept®), o una combinación de anti-CD4 no agotante y MMF. Los ratones fueron monitoreados en cuanto a cambios en proteinuria (se efectuó urianálisis como se describe anteriormente en el Ejemplo 1) , avance de enfermedad y supervivencia. El anticuerpo CD4 no agotante (YTS177) fue administrado 3 veces/semana a 5 mg/kg mediante inyección int raperitoneal (IP) . MMF fue administrado IP ya sea a 25 mg/kg diariamente o 50 mg/kg diariamente (solo o en combinación con el anticuerpo CD4 ) . En este experimento, en el cual el tratamiento fue iniciado en un estado de enfermedad severo, los tratamientos individuales con el anticuerpo CD4 o con MMF no fueron suficientes para invertir la proteinuria severa significativamente (algunos ratones mejoran, but los números son insuficientes para satisfacer el significado) . Sin embargo, combinado los tratamientos sinergizados para mostrar un efecto significativo; como se muestra en la Figura 17, un efecto sinergistico en la capacidad para invertir proteinuria fue observado cuando el anticuerpo CD4 fue administrado en combinación con MMF. La Figura 17A ilustra el porcentaje de ratones bajo 300 mg/dl de proteinuria a los tiempos indicados después del tratamiento. La administración del anticuerpo CD4 en combinación con MMF (CellCept®) dio como resultado una disminución neta en ratones que exhiben >300 mg/dl de proteinuria, indicando una inversión de síntomas de nefritis en un estado de enfermedad muy tardío que no fue observado en grupos tratados con el anticuerpo de control o tratamientos individuales con anticuerpo CD4 o MMF. La Figura 17B muestra el porcentaje de ratones que se invirtieron de 300 mg/dl de proteinuria enseguida de un mes de tratamiento. Como se muestra en la Figura 18, la administración del anticuerpo CD4 no agotante en combinación con MMF retardó el tiempo al avance (Figuras 18A y 18C) e incrementó la supervivencia (Figuras 18B y 18D) , a ambas dosis de MMF (50 mg/kg/dia en las Figuras 18A y 18B y 25 mg/kg/dia en las Figuras 18C y 18D) . La combinación del anticuerpo CD4 no agotante y MMF fue más efectiva ya sea que el anticuerpo CD4 no agotante o MMF solos. En las figuras 18A-18D, los controles de referencia (grupo tratado con anticuerpo de control) son designados en negritas y solamente los valores p para grupos obtienen significado estadístico contra el control de referencia son designados en la gráfica. El tratamiento con una combinación del anticuerpo CD4 y MMF fue efectivo para disminuir proteinuria. La Figura 19 ilustra múltiples análisis de comparación de proteinuria al mes 2 de tratamiento, utilizando el método de Dunnett con el grupo tratado con el anticuerpo de control como el grupo de control de referencia. Los resultados para los grupos tratados con 50 mg/kg diariamente de MMF solo o en combinación con el anticuerpo CD4 son presentados en la Figura 19?, en tanto que los resultados para los grupos tratados con 25 mg/kg diariamente de MMF solo o en combinación con el anticuerpo CD4 son presentados en la Figura 19B. El control de referencia (tratado con anticuerpo de control) es designado en negritas y solamente los valores de p para grupos que obtienen significado estadístico vs . el control de referencia son designados en las gráficas. Los resultados demuestran que la combinación del anticuerpo CD4 y MMF proporciona beneficio significativo para disminuir la proteinuria en el modelo, en tanto que el tratamiento con el anticuerpo de control, anti-CD4 solo o MMF solo no mostraron reducción estadísticamente significativa en proteinuria . El tratamiento con una combinación del anticuerpo CD4 no agotante y MMF disminuyeron el número de células T de CD4 + encontradas en el bazo. Como se muestra en la Figura 20C, el número de células T CD4+ esplénicas fue reducido en animales tratados por dos meses con la combinación en comparación con los animales tratados con anticuerpo de control (p=0.002) . Los efectos del tratamiento con la combinación fueron también observados corriente abajo, por ejemplo, en poblaciones de célula B y células dendríticas. Por ejemplo, el tratamiento con una combinación del anticuerpo CD4 y MMF disminuyó el número de células B B2 encontradas en el bazo, como se muestra en la Figura 20D (en relación con los animales tratados con el anticuerpo de control; p=0.017) . La reducción en células T CD4+ esplénicas y células B B2 no fue debida al agotamiento de las células por el anticuerpo, como se evidencia por los conteos en la sangre de célula T CD4 + y células B B2 totales (Figuras 20A y 20B, respectivamente) . En efecto, se notó un incremento en números de células T de CD4+ en la sangre y célula B B2 en los grupos tratados con 50 mg/kg de MMF en combinación con el anticuerpo CD4 y con 25 mg/kg de MMF, respectivamente (aunque estos incrementos pueden no ser estadísticamente significativo) . Los números de célula T de CD4+ y células B de B2 fueron determinados mediante citometría de flujo básicamente como se describe anteriormente, utilizando anticuerpos para identificar las varias poblaciones celulares y luego utilizando el porcentaje de cada población representada (de linfocitos totales) multiplicado por el total número de linfocitos para determinar el número de cada población. Células B2 (la mayoría de células B) fueron identificadas mediante teñido positivo para B220 (CD45) y CD38. Anti-B220/CD45 y anti-CD38 fueron de BD Pharmingen. El tratamiento con una combinación del anticuerpo CD4 no agotante y MMF también disminuyó el número de células de plasma de IgM+, como se ilustra en la Figura 20E. El número de células de plasma de IgM+ fue determinado mediante citometría de flujo básicamente como se describe anteriormente. Las células de plasma fueron identificadas por su expresión de sindecana-1 ; las células de plasma de IgM fueron aquellas células sindecana-1 positivas que también expresaron IgM sobre su superficie. Anticuerpos para sindecana-1 y IgM fueron de BD Pharmingen. Se efectuaron comparaciones utilizando el método de Dunnett con el grupo tratado con anticuerpo de control como el grupo de control de referencia (designado en negritas) y solamente los valores p para grupos que obtienen significado estadístico vs . el control de referencia son designados en la gráfica . Similarmente , el tratamiento con la combinación del anticuerpo CD4 y MMF disminuyó el número de células de plasma isot ipo-cambiados , como se muestra en la Figura 20F. El número de células de plasma isot ipo-cambiado fue determinado mediante citometría de flujo básicamente como se describe anteriormente. Las células de plasma fueron identificadas por su expresión de sindecana-1; las células sindecana-1 positivas que fueron negativas para expresión de IgM fueron las células de plasma isot ipo-cambiado (que expresan isotipos diferentes a IgM, por ejemplo, IgG, IgE, etc.) . Los anticuerpos para sindecana-1 y IgM fueron de BD Pharmingen. Se efectuaron comparaciones utilizando el método de Dunnett con el grupo tratado con anticuerpo de control como el grupo de control de referencia (designado en negritas) y solamente los valores p para grupos que obtienen significado estadístico vs . el control de referencia son designados en la gráfica. El tratamiento con la combinación también redujo el número de células B centrales germinales, como se muestra en la Figura 20G. El número de células B centrales germinales fue determinado mediante citometria de flujo básicamente como se describe anteriormente. Células B centrales germinales fueron identificadas como aquellas células positivas para B220 y negativas para la expresión superficial de CD38 (distinguiéndolas de las células B2, que co-expresan B220 y CD38) . El anti-B220/CD45 y anti-CD38 fueron de BD Pharmingen. Se efectuaron comparaciones utilizando el método de Dunnett con el grupo tratado con el anticuerpo de control como el grupo de control de referencia (designado en negritas) y solamente los valores de p para grupos que obtienen significado estadístico vs . el control de referencia son designados en la gráfica. Células dendríticas plasmacitoides son impulsores potencialmente importantes de lupus debido a su secreción de altas cantidades de interferones tipo I ( interferones alfa y beta) . Es por consiguiente valioso notar que el tratamiento con el anticuerpo CD4, solo o en combinación con MMF, redujo el número de células dendríticas plasmacitoides esplénicas, como se muestra en la Figura 20H. El número de células dendríticas plasmacitoides fue determinado mediante citometria de flujo básicamente como se describe anteriormente. Las células B y T fueron excluidas utilizando marcadores CD19 y CD3, respectivamente; de las células restantes, las células dendríticas plasmacitoides fueron identificadas en base a su expresión única de pDCA y su expresión intermedia de B220. Los anticuerpos fueron de BD Pharmingen , excepto anti-pDCA que fue de Miltenyi. Se efectuaron comparaciones utilizando el método de Dunnett con el grupo tratado con anticuerpo de control como el grupo de control de referencia (designado en negritas) y solamente los valores de p para grupos que obtienen significado estadístico vs . el control de referencia son designados en la gráfica . Además, el tratamiento con el anticuerpo (solo o en combinación con MMF) redujo los niveles de expresión de MHC Clase II en estas células dendríticas, como se muestra en la Figura 201. Células dendríticas plasmacitoides fueron identificadas mediante citometría de flujo básicamente como se describe anteriormente, utilizando un anticuerpo dirigido a pDCA (Miltenyi) y sus niveles de MHC II fueron determinados con un anticuerpo dirigido a un epítopo común en moléculas de MHC II IAd e IEd (BD Pharmingen) . Se efectuaron comparaciones utilizando el método de Dunnett con el grupo tratado con anticuerpo de control como el grupo de control de referencia (designado en negritas) y solamente los valores de p para grupos que obtienen significado estadístico vs . el control de referencia son designados en la gráfica. Puesto que los niveles de MHC II están usualmente enlazados al estatus de activación de estas células dendríticas, con niveles incrementados que indican un estado de activación incrementado, esta observación indica que el tratamiento con el anticuerpo CD4 puede reducir el estatus de activación de esta población de células dendrit icas . En resumen, el tratamiento con el anticuerpo CD4 no agotante, por ejemplo, en combinación con MMF, fue eficaz en ratones NZBxW Fl aún cuando es introducido tarde en la enfermedad. El tratamiento con la combinación prolongó la supervivencia libre de enfermedad y supervivencia y disminuyó los números de células T CD4+ esplénicas. Además, al combinar el anticuerpo CD4 no agotante con MMF se proporciona un beneficio significativo con respecto a MMF solo para invertir la proteinuria en el modelo de NZB/W Fl de SLE. El anticuerpo CD4 no agotante solo fue también apto de reducir selectivamente los números de células B centrales germinales y células de plasma isot ipo-conmutadas sin afectar significativamente la mayoría de células B (células B2) . Además, anti-CD4 fue apto de reducir los números de células dendríticas plasmacitoides , células que han estado enlazadas a la patogénesis de SLE por medio de su producción de interferones Tipo 1 e IFN-alfa y beta . En tanto que la invención anterior ha sido descrita en algún detalle por propósitos de claridad y entendimiento, será claro para el experimentado en el arte a partir de una lectura de esta revelación que varios cambios en forma y detalles se pueden efectuar sin desviarse del verdadero alcance de la invención. Por ejemplo, todas las técnicas y composiciones descritas anteriormente pueden ser usadas en varias combinaciones. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y/u otros documentos citados en esta solicitud son incorporados por referencia en su totalidad para todos los propósitos a la misma extensión como si cada publicación, patente, solicitud de patente y/u otro documento individual fueran indicados individualmente para ser incorporados por referencia para todos los propósitos.

Claims

REIVINDICACIONES 1. El uso de un anticuerpo CD4 no agotante en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de lupus nefritis en un sujeto mamífero, caracterizado porque el medicamento está adaptado de tal manera que, después del inicio de tratamiento del sujeto con el anticuerpo, el sujeto exhibe una mejora en función renal, una reducción en proteinuria y/o una reducción en sedimento urinario activo.
2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto es un humano.
3. El uso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque, antes del inicio de tratamiento con el anticuerpo, el sujeto exhibe proteinuria mayor de 500 mg/día, mayor de 1000 mg/día, mayor de 2000 mg/día o mayor de 3500 mg/día, tal proteinuria es reducida después del inicio del tratamiento con el anticuerpo.
4. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es seleccionado de: a) un anticuerpo que comprende una CDR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, b) un anticuerpo que comprende una CDR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, c) un anticuerpo que comprende CDR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27, d) un anticuerpo que comprende CDR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, e) un anticuerpo que comprende CDR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, f) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 resumida en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14 ó SEQ ID NO: 20, g) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de FR1, CDR1, FR2, CDR2 , FR3, CDR3 y FR4 resumida en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17 ó SEQ ID NO: 23, h) un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos resumida en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15 ó SEQ ID NO: 21, i) un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 6, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 24, j ) un anticuerpo que comprende un fragmento de enlace de CD4 de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 6, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 24, y k) un anticuerpo CD4 que se enlaza al mismo epitopo como un anticuerpo seleccionado de: un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 6, un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 12, un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 18 y un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 24.
5. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el lupus es seleccionado de lupus nefritis clase II, lupus nefritis clase III, lupus nefritis clase IV y lupus nefritis clase V.
6. Uso de un anticuerpo CD4 no agotante en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de lupus en un sujeto mamífero, caracterizado porque el medicamento está adaptado para ser administrado al sujeto en combinación con por lo menos un segundo compuesto seleccionado del grupo que consiste de ciclofosfamida, mofetil micofenolato y CTLA4-Ig.
7. El uso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el sujeto es un humano.
8. El uso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo es seleccionado de: a) un anticuerpo que comprende una CDR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, b) un anticuerpo que comprende una CDR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, c) un anticuerpo que comprende CDR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27, d) un anticuerpo que comprende CDR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, e) un anticuerpo que comprende CDR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, f) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 resumida en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14 ó SEQ ID NO: 20, g) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 resumida en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17 ó SEQ ID NO: 23, h) un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos resumida en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15 ó SEQ ID NO: 21, i) un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 6, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 24, ) un anticuerpo que comprende un fragmento de enlace de CD4 de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 6, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 12, una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 24, y k) un anticuerpo CD4 que se enlaza al mismo epitopo como un anticuerpo seleccionado de: un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 6, un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 12, un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO: 18 y un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera resumida en SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada resumida en SEQ ID NO : 24.
9. El uso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
10. El uso de conformidad con la rei indicación 6, caracterizado porque el anticuerpo tiene una porción de Fe aglicosilada .
11. El uso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo no se enlaza a un receptor de Fe.
12. El uso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo comprende un epitopo de enlace del receptor de salvamento.
13. El uso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el lupus es seleccionado de lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso cutáneo, lupus nefritis, lupus nefritis clase II, lupus nefritis clase III, lupus nefritis clase IV y lupus nefritis clase V.
14. El uso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque antes del inicio del tratamiento con la combinación, el sujeto muestra proteinuria, tal proteinuria es mejorada por el tratamiento.
15. El uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de un anticuerpo CD4 no agotante y por lo menos un segundo compuesto seleccionado de: ciclofosfamida , mofetil micofenolato y CTLA4-Ig, caracterizado porque es para la producción de un medicamento, útil en el tratamiento de lupus en un sujeto mamífero.
16. Una composición para administración a un sujeto mamífero que tiene lupus nefritis, la composición comprende un anticuerpo CD4 no agotante, caracterizada porque el medicamento está adaptado de tal manera que, después del inicio de tratamiento del sujeto con la composición, el sujeto exhibe una mejora en función renal, una reducción en proteinuria y/o una reducción en sedimento urinario activo.
17. Una composición para administración en combinación con por lo menos un segundo compuesto seleccionado del grupo que consiste de ciclofosfamida , mofetil micofenolato y CTLA4-Ig, a un sujeto mamífero que tiene lupus, la composición está caracterizada porque comprende un anticuerpo CD4 no agotante.
18. El uso de un anticuerpo CD4 no agotante en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una condición en un sujeto mamífero, caracterizado porque el medicamento está adaptado para ser administrado al sujeto en combinación con por lo menos un segundo compuesto seleccionado del grupo que consiste de ciclofosfamida, mofetil micofenolato y CTLA4-Ig, en donde la condición es seleccionada de: artritis reumatoide, asma, psoriasis, rechazo de transplante, enfermedad de injerto contra huésped, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa y síndrome de Sjógren.