CN113785203A

CN113785203A - 改进的竞争性配体结合测定

Info

Publication number: CN113785203A
Application number: CN202080033465.0A
Authority: CN
Inventors: M·A·帕特里奇; G·O·萨姆纳; E·K·卡拉尤苏弗
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2019-05-13
Filing date: 2020-05-12
Publication date: 2021-12-10
Also published as: JP7541534B2; US20200363400A1; IL287913A; WO2020231992A1; AU2020275406A1; KR20220007586A; EP3969908A1; US20260029396A1; SG11202110911RA; CA3135004A1; JP2022532503A; MX2021013519A

Abstract

提供了用于检测和任选地量化样品中抗药物抗体(ADA)的改进测定。公开的测定包括蛋白质药物捕获测定形式和蛋白质药物靶标捕获测定形式，其各自具有优于现有测定的某些优势。在一些实施例中，所述测定被设计成使得药物:抗药物复合物在添加到靶标包被板之前被洗掉。在样品孵育步骤中使用竞争性靶标阻断剂可以潜在地消除或最小化靶标干扰。在示例性靶标捕获测定形式中，使用弱酸方法来最小化游离靶标干扰。

Description

改进的竞争性配体结合测定

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年5月13日提交的美国临时专利申请号62/846,872和2019年6月11日提交的美国临时专利申请号62/859,914的权益和优先权，两者均以其整体通过引用并入本文。

技术领域

本发明的方面总体上涉及用于检测药物相互作用的测定，特别是用于检测样品中的抗药物抗体的测定。

背景技术

向患者施用生物治疗剂可在患者体内诱导不期望的免疫原性反应，这可导致发展抗药物抗体(ADA)(Mire-Sluis,A.R.,等人,《免疫学方法杂志(J Immunol Methods.)》289(1):1-16(2004))。中和抗体(NAb)是ADA的一个子集，其抑制药物与其靶标的结合，使药物失去生物学活性。根据定义，NAb中和药物作用，可能会降低临床活性。此外，如果药物是内源性蛋白质的生物模拟物，则NAb可能会与药物的内源性类似物发生交叉反应，这可对药物安全具有严重影响(Finco,D.,等人,《药学和生物医学分析杂志(J Pharm Biomed Anal)》,54(2):351-358(2011)；Hu,J.,等人,《免疫学方法杂志》,419:1-8(2015))。

免疫原性反应的检测涉及分层方法，其中首先测试样品中ADA的存在，通常使用桥接免疫测定进行测试(Mire-Sluis,A.R.,等人,《免疫学方法杂志》289(1):1-16(2004))。ADA反应的进一步表征可包括确定ADA相对量的滴度测定，以及确定抗体反应是否中和的测定(Wu,B.,等人,《AAPS杂志(AAPS Journal)》,18(6):1335-1350(2016)；Shankar,G,等人,《药学和生物医学分析杂志》48(5):1267-1281(2008)；Gupta,S.,等人,《药学和生物医学分析杂志》,55(5):878-888(2011))。

NAb测定通常对样品中药物的存在非常敏感(Xu,W.,等人,《免疫学方法杂志》,462:34-41(2018)；Xu,W.,等人,《免疫学方法杂志》,416:94-104(2015)；Xiang,Y.,等人,《AAPS杂志》,21(1):4(2019)；Sloan,J.H.,等人,《生物分析(Bioanalysis)》,8(20):2157-2168(2016))。NAb测定中的药物耐受性通常低于最初检测免疫原性反应的ADA测定，并且通常低于患者中的药物谷浓度。因此，由于样品中药物的干扰，在NAb测定中可能无法检测到一些中和抗体反应。

已经报道了多种改善ADA测定中药物耐受性(DT)的方法，包括允许改善药物检测的解离药物:ADA复合物的酸处理，或允许方法中的标记药物替代游离药物:ADA复合物的长时间样品孵育(Sloan,J.H.,等人.《生物分析》8(20):2157-2168(2016)；Patton,A.,等人,《免疫学方法杂志》,304(1-2):189-195(2005)；Butterfield,A.M.,《生物分析》,2(12),1961-1969(2010))。

也已报道若干种提高ADA测定的DT的固相提取或沉淀方法。从广义上讲，这些方法可以分为两组：从样品中提取ADA的方法，以及从样品中去除药物的方法(Zoghbi,J.,等人,《免疫学方法杂志》426:62-69(2015)；Smith,H.W.,等人，《监管毒理学和药理学(RegulToxicol Pharmacol.)》49(3):230-237(2007)；Niu,H.,《免疫学方法杂志》446,30-36(2017)；Muram,T.M.,等人,《皮肤病学研究杂志(J Invest Dermatol)》,136(7):1513-1515(2016)；Chen,Y.Q.,《免疫学方法杂志》,431:45-51(2016)；Bourdage,J.S.,等人,《免疫学方法杂志》327(1-2):10-17(2007))。类似的方法也已应用于改进NAb测定的DT(Xu,W.等人,《免疫学方法杂志》,462:34-41(2018)；Xu,W.,等人,《免疫学方法杂志》,416:94-104(2015)；Xiang,Y.,等人,《AAPS杂志》,21(1):4,(2018)；Xiang,Y.,等人,《AAPS杂志》,21(3):46(2019))。在一种情况下，亲和捕获洗脱方法用于分离和检测ADA，并使用与游离靶标的竞争性抑制来鉴定NAb(Sloan,J.H.,等人,《生物分析》,8(20):2157-2168(2016))。

竞争性配体结合(CLB)测定具有高度可重复性且相对容易执行。在灵敏度、测定变异性和基质干扰方面，它们至少与基于细胞的测定相当，并且在一些情况下优于基于细胞的测定(Finco,D.,等人,《药学和生物医学分析杂志》54(2):351-358(2011))。

因此，本发明的一个目的是提供相对于现有测定具有改善的药物耐受性的测定。

本发明的另一个目的是提供避免或消除蛋白质药物残留问题的改进的测定。

发明内容

提供了用于检测和任选地量化样品中包括中和抗体(NAb)在内的抗药物抗体(ADA)的改进测定。已经发现，仔细选择测定试剂可减轻、减少或消除现有测定中的残留问题。CLB NAb测定是为两个药物程序开发的。该方法针对灵敏度和DT进行了优化，并包括酸解离步骤。在一些实施例中，测定具有显著低于药物谷水平的DT水平。所公开的测定包括药物捕获测定形式和药物靶标捕获测定形式，其各自具有优于现有测定的某些优点。在一些实施例中，靶标捕获测定被设计成使得在添加标记靶标之前洗掉游离药物，从而避免产生假阳性的残留问题。在其他实施例中，测定被设计成使得在添加至靶标包被板之前洗掉药物：抗药物复合物。在样品孵育步骤中使用竞争性靶标阻断剂可以潜在地消除或最小化靶标干扰。在示例性目标捕获测定形式中，使用弱酸方法来最小化游离靶标干扰。

一个实施例提供了一种用于检测样品中针对药物的抗药物抗体如NAb的药物捕获方法。药物可以是小分子或蛋白质药物。代表性的蛋白质药物包括但不限于抗体、融合蛋白和治疗性蛋白质。一种方法包括将样品在酸性条件下孵育一段时间以产生酸化样品的步骤。在某些实施例中，样品在施用之前、施用之后或在用药物治疗期间从受试者获得，例如人类受试者。酸化样品可以具有2.0至4.0的pH。在一些实施例中，酸处理促进复合物的解离，包括但不限于NAb:药物复合物和药物：靶标复合物。将药物的靶标添加至酸化样品中，并将酸化样品的pH升高至中性pH，例如约7.0，使得添加的靶标能够与样品中的药物结合。在一个实施例中，当添加到酸化样品中时，添加的靶标在pH缓冲液如Tris缓冲液中。在一些实施例中，靶标用可选择标记来标记，该标记有助于物理去除在样品中形成的含标记靶标的复合物。代表性的可选择标记包括但不限于质量标签、磁珠、蛋白质标签和金属颗粒，并在下面更详细地讨论。将样品中形成的含标记靶标的复合物从样品中物理去除以产生耗尽样品。含标记靶标的复合物包括靶标:药物复合物。去除靶标:药物复合物可降低耗尽样品中的药物浓度。当靶标被磁珠标记时，磁性用于物理去除靶标:药物复合物以产生耗尽样品。将耗尽样品与抗靶标阻断剂和标记药物如生物素化药物一起孵育以产生测定样品。示例性抗靶标阻断剂包括但不限于抗体或其抗原结合片段、受体分子和可溶性受体。在一些实施例中，抗靶标阻断剂是特异性结合靶标并防止或抑制靶标与药物结合的抗体。然后将测定样品在亲和素包被或链霉亲和素包被的固体支持物上孵育。在一些实施例中，固体支持物在与测定样品一起孵育后被洗涤以去除未结合的试剂。该方法进一步包括将药物的标记靶标添加到固体支持物上。靶标通常用可检测标记来标记，例如荧光团、化学发光探针、电化学发光探针、量子点、稀土过渡金属、金金属颗粒、银金属颗粒或其组合。在一个实施例中，标记是钌。任选地洗涤固体支持物以去除未结合的标记靶标。检测并任选地量化来自与和固体支持物结合的生物素化药物结合的标记靶标的可检测信号。与对照样品相比，来自固体支持物的信号量减少表明样品中存在抗药物抗体。在一些实施例中，抗药物抗体包括特异性结合蛋白质药物并抑制或阻断靶标结合药物的中和抗体。

在一些实施例中，药物是单克隆抗体、双特异性抗体、Fab片段、F(ab')₂片段、单特异性F(ab')₂片段、双特异性F(ab')₂、三特异性F(ab')₂、单价抗体、scFv片段、双链抗体、双特异性双链抗体、三特异性双链抗体、scFv-Fc、微抗体、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。

在一些实施例中，磁性标记是顺磁性标记或超顺磁性标记。磁性标记可以是金属颗粒、金属微粒、金属纳米颗粒、金属珠、磁性聚合物、均匀聚苯乙烯球形珠或超顺磁性球形聚合物颗粒。在一些实施例中，琼脂糖/琼脂糖凝胶珠和重力或离心机用于分离。

在药物捕获测定的一些实施例中，与非耗尽样品相比，耗尽样品中的药物耐受性高至少3至20倍或10倍。在其他药物捕获实施例中，该测定在施用药物至少29天后从受试者采集的样品中鉴定出NAb阳性。在另一个实施例中，该测定在施用药物85天后采集的样品中鉴定出NAb阳性。

应当理解，本文公开的方法任选地包括孵育或洗涤步骤，其中搅动例如旋转样品板、测定板或样品以帮助去除未结合的试剂。

另一个实施例提供了一种用于检测样品中针对药物的抗药物抗体的靶标捕获方法。该方法包括在酸性条件下孵育样品一段时间以产生酸化样品的步骤。酸处理诱导或促进药物：NAb复合物和药物:靶标复合物解离。在一些实施例中，酸化样品具有约2.0-4.0的pH。然后将酸化样品与含有对蛋白质药物具有特异性的标记抗药物抗体的pH缓冲溶液合并以产生抗体:蛋白质药物复合物。在这一步骤中，样品的pH为约4.0-5.5，以最小化游离靶标干扰。在一些实施例中，标记的抗药物抗体用可选择标记来标记，该标记有助于将含有标记的抗药物抗体的复合物从样品中物理分离出。标记的抗药物抗体可以是非阻断性抗独特型抗体或其抗原结合片段。靶标捕获方法包括使用可选择标记从样品中去除非阻断抗体:药物复合物以产生耗尽样品。通常，可选择标记是用于去除具有磁体或磁性的非阻断性抗独特型抗体:药物复合物的磁性标记。在其他实施例中，可选择标记可以是质量标签或琼脂糖珠，并且重力或离心可用于从样品中分离非阻断性抗体:药物复合物。靶标捕获方法包括在约pH 7.0下将耗尽样品与标记药物一起孵育以产生测定样品。标记药物将与样品中存在的NAb结合。在一些实施例中，一些标记药物保持未结合。标记药物通常用可检测的标记来标记。靶标捕获方法中的可检测标记可以是荧光团、化学发光探针、电化学发光探针、量子点、稀土过渡金属、金颗粒、银颗粒或其组合。靶标捕获方法包括在靶标包被的固体支持物上孵育测定样品，其中标记药物特异性地结合靶标包被的固体支持物。靶标捕获方法任选地包括在与测定样品一起孵育后洗涤固体支持物以去除未结合的标记药物。靶标捕获方法还包括测量来自与靶标包被的固体支持物结合的标记药物的可检测信号的步骤，其中相对于对照样品的信号量减少表明样品中存在抗药物抗体。

在靶标捕获方法的一些实施例中，抗药物抗体包括与蛋白质药物特异性结合的中和抗体。蛋白质药物可以是抗体或其抗原结合片段或融合蛋白。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体、双特异性抗体、Fab片段、F(ab')₂片段、单特异性F(ab')₂片段、双特异性F(ab')₂、三特异性F(ab')₂、单价抗体、scFv片段、双链抗体、双特异性双链抗体、三特异性双链抗体、scFv-Fc、微抗体、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。

与药物捕获方法相同，靶标捕获方法中的可选择标记可以是磁性标记。磁性标记可以是顺磁性标记或超顺磁性标记。在一些实施例中，磁性标记是金属颗粒、金属微粒、金属纳米颗粒、金属珠、磁性聚合物、均匀聚苯乙烯球形珠或超顺磁性球形聚合物颗粒。在一些实施例中，可选择标记可以是质量标签或琼脂糖/琼脂糖凝胶珠，并且重力或离心可用于从样品中分离药物复合物。

在靶标捕获方法的一些实施例中，药物用钌可检测地标记。

靶标捕获测定的一些实施例在耗尽样品中具有比非耗尽样品高至少10倍的药物耐受性。在靶标捕获方法的其他实施例中，该方法在施用蛋白质药物至少29天或至少85天后从受试者采集的样品中鉴定出NAb阳性。

另一个实施例提供了一种用于鉴定先导蛋白质药物的方法，该方法包括向一名或多名受试者施用一种或多种蛋白质药物候选物，对从所述一名或多名受试者获得的一个或多个样品进行本文公开的任一种方法，以及选择产生很少或不产生降低药物有效性的ADA的蛋白质药物候选物的步骤。

附图说明

图1A是药物捕获竞争性配体测定的示例性实施例的图示，其示出了阳性和阴性测定。图1B是靶标捕获竞争性配体测定的示例性实施例的图示，其示出了阳性和阴性测定。

图2A是药物捕获形式的药物A的NAb测定的测定信号(计数)的条形图，其中尝试使用对照(无珠)和与链霉亲和素包被的珠(SA-珠)偶联的生物素-药物(Bio-药物)进行NAb富集。图2B是药物捕获形式的药物A的NAb测定的测定信号(计数)的条形图，其中尝试使用对照(无珠)和靶标偶联珠进行药物去除。图2C是靶标捕获形式的药物B的NAb测定的测定信号(计数)条形图，其中尝试使用对照、抗独特型抗体偶联珠和靶标偶联珠进行药物去除。

图3A是示出药物捕获形式的药物A的NAb测定的测定信号(计数)的条形图，其中尝试使用(从左到右，每组三个)对照(空条)、带有抗靶标mAb的靶标-珠(左阴影条)和不带抗靶标mAb的靶标偶联珠(右阴影条)进行药物去除。图3B是示出靶标捕获形式的药物B的NAb测定的测定信号(计数)的条形图，其中尝试施用(从左到右，每组三个)对照(空条)、非阻断性抗独特型抗体偶联珠(左阴影条)和靶标偶联珠(右阴影条)进行药物去除。图3C是利用阻断抗体(顶部迹线；空心圆)和非阻断mAb(底部迹线；阴影圆)(ng/mL)的靶标捕获形式的药物B的NAb测定中抑制百分比的线图。

图4A是利用对照(顶部迹线；空心圆)和药物耗尽(底部迹线；阴影圆)样品的靶标捕获形式的药物B的NAb测定中抑制百分比相对于药物(μg/mL)的线图，其示出了NAb阴性样品中的药物干扰。图4B是利用对照(斜率增加的迹线；空心圆)和药物耗尽样品(斜率减小的迹线；阴影圆)的靶标捕获形式的药物B的NAb测定中抑制百分比相对于药物(μg/mL)的线图，其示出了NAb阳性样品中的药物耐受性。图4C是利用对照(顶部迹线；空心圆)和药物耗尽(底部迹线；阴影圆)样品的药物捕获形式的药物A的NAb测定中抑制百分比相对于药物(μg/mL)的线图，其示出了NAb阳性样品中的药物耐受性。图4D是免疫测定中相对光单位(RLU)相对于药物A(mg/mL)的线图，其检测了对照(顶部迹线；空心圆)和药物耗尽后(底部迹线；阴影圆)，掺有指定浓度药物A的样品中的药物。

图5A是对照的ADA阳性样品的抑制百分比相对于药物(ng/mL)的散点图。图5B是药物耗尽后ADA阳性样品的抑制百分比相对于药物(ng/mL)的散点图。

图6A是图5A中所有样品的对照(圆圈)和药物耗尽(三角形)的抑制百分比相对于时间点(天)的散点图。图6B是药物耗尽后NAb阴性的对照(圆圈)和药物耗尽(三角形)的抑制百分比相对于时间点(天)的散点图。图6C是药物耗尽后NAb阳性的对照(圆圈)和药物耗尽(三角形)的抑制百分比相对于时间点(天)的散点图。

图7A是示例性药物捕获测定的示意图。图7B是示例性靶标捕获测定的示意图。

具体实施方式

I.定义

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述当前要求保护的发明的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)，术语“一(a)”、“一个(an)”、“所述(the)”和类似指代的使用被解释为涵盖单数和复数两者。

除非本文另有说明，否则本文对数值范围的记载仅旨在作为单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且将每个单独值并入说明书中，就好像其在本文中单独记载一样。

术语“约”的使用旨在描述高于或低于所述值约+/-10％范围内的值；在其他实施例中，该值的范围可以是高于或低于所述值约+/-5％范围内的值；在其他实施例中，该值的范围可以是高于或低于所述值约+/-2％范围内的值；在其他实施例中，该值的范围可以是高于或低于所述值约+/-1％范围内的值。前述范围旨在由上下文澄清，并且不暗示进一步限制。除非本文另有说明或以其他方式与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以任何合适的顺序进行。除非另有声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的语言都不应被解释为表明任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必不可少的。

“蛋白质”是指包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基的分子。蛋白质包括多肽和肽并且还可以包括修饰，例如糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、烷基化、羟基化和ADP核糖基化。蛋白质可以具有科学或商业利益，包括基于蛋白质的药物，并且蛋白质包括酶、配体、受体、抗体和嵌合或融合蛋白等。蛋白质由各种类型的重组细胞使用熟知的细胞培养方法产生，并且通常通过基因工程技术(例如编码嵌合蛋白的序列，或密码子优化序列，无内含子序列等)引入细胞中，在细胞中它可以作为附加体存在或整合到细胞的基因组中。

如本文所用，术语“抗体”旨在表示具有“可变区”抗原识别位点的免疫球蛋白分子。术语“可变区”旨在将此类免疫球蛋白结构域与抗体广泛共享的结构域(例如抗体Fc结构域)区分开来。可变区包括“高变区”，其残基负责抗原结合。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，通常在轻链可变结构域中的大约残基24-34(LI)、50-56(L2)和89-97(L3)处和在重链可变结构域中的大约残基27-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处；Kabat等人，“具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)”，第5版，美国国立卫生研究院公共卫生署，贝塞斯达，马里兰州.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即，在轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)处和在重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处；Chothia和Lesk，1987,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917)。“框架区”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。术语抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼化抗体(参见例如，Muyldermans等人,2001,《生物化学科学趋势(Trends Biochem.Sci.)》26:230；Nuttall等人,2000,《当前药物生物技术(Cur.Pharm.Biotech.)》1:253；Reichmann和Muyldermans,1999，《免疫学方法杂志》231:25；国际公开号WO94/04678和WO 94/25591；美国专利号6,005,079)、单链Fv(scFv)(参见例如，Pluckthun，《单克隆抗体药理学(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)》,第113卷,Rosenburg和Moore编辑，施普林格出版社(Springer-Verlag)，纽约,pp.269-315(1994))、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对抗体的抗Id和抗抗Id抗体)。具体地，此类抗体包括任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂)或亚类的免疫球蛋白分子。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个部分，其含有抗体的互补决定区(“CDR”)和任选的包括抗体的“可变区”抗原识别位点的框架残基，并表现出免疫特异性结合抗原的能力。此类片段包括Fab'、F(ab')₂、Fv、单链(ScFv)及其突变体、天然存在的变体和融合蛋白，其包括抗体的“可变区”抗原识别位点，以及异源蛋白质(例如，毒素、不同抗原的抗原识别位点、酶、受体或受体配体等)。

术语“抗药物抗体”也称为“ADA”，是指干扰药物活性的抗体。

术语“中和抗体”或“NAb”是指抑制药物与其靶标结合从而使药物部分或完全失去生物学活性的抗药物抗体的子集。中和抗药物抗体(NAb)对生物治疗的有效性和安全性都具有潜在的重要影响。

术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指哺乳动物，包括但不限于人、啮齿动物如小鼠和大鼠，以及其他实验室动物。

II.改进的竞争性配体结合测定

提供了用于检测和任选地量化样品中抗药物抗体(ADA)的改进测定。所公开的测定包括药物捕获测定形式和药物靶标捕获测定形式。鉴定响应于向患者施用生物治疗剂产生的ADA对于满足与生物治疗剂的生产和销售相关的监管要求以及对于鉴定可由受试者中ADA的产生而导致的潜在剂量问题具有重要意义。

在一些实施例中，用于检测和/或量化样品中的ADA的方法基于从样品中去除游离药物。在药物捕获形式的一个实施例中，游离药物不会产生假阳性，因为它在添加标记靶标之前被洗掉。在药物捕获形式的一个实施例中，在样品孵育步骤中使用竞争性靶标阻断剂最小化靶标干扰。在靶标捕获测定形式中，使用弱酸方法最小化游离靶标干扰。

在一些实施例中，药物是抗体或其抗原结合片段，或融合蛋白。

所公开的测定克服了来自固相提取/纯化步骤的残留问题，该问题可在随后的测定过程中造成干扰。由于这些方法中使用的标记药物浓度低，这对竞争性配体结合(CLB)NAb测定来说是一个特别的挑战(Hu,J.,等人《免疫学方法杂志》419:1-8(2015)；Wu,B.W.,等人.“用于检测中和抗体的竞争性配体结合测定(Competitive Ligand-Binding Assaysfor the Detection of Neutralizing Antibodies)”《抗体与生物药物的检测和定量：实际和应用考虑(Detection and Quantification of Antibodies toBiopharmaceuticals:Practical and Applied Considerations)》,Michael G.Tovey(编辑)，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.)，霍博肯，新泽西州，美国(2011))。通过在药物耗尽程序中使用药物特异性蛋白质，在公开的测定方法中减轻了残留问题。在一些实施例中，基于它们不会干扰随后的NAb测定来选择药物特异性蛋白质。一个实施例使用与珠偶联的靶标，并在NAb测定中添加抗靶标阻断剂。另一个实施例使用非阻断性抗药物抗体偶联珠。在包含药物耗尽步骤后，两种CLB NAb测定的药物耐受性(DT)至少提高了超过10倍。

除了用实例中描述的单克隆抗体阳性对照证明DT改善之外，还在有和没有药物耗尽步骤的情况下测试了治疗水平大于500ng/mL的ADA阳性药物A临床研究样品。当使用药物耗尽步骤进行测试时，这些样品显示出NAb阳性显著增加，表明DT差的测定可能会低估NAb发生率。因此，所公开的测定方法还有助于解决常规测定低估NAb发生率的问题。

A.蛋白质药物

在一些实施例中，药物是蛋白质药物。适用于所公开测定的蛋白质药物包括但不限于抗体及其抗原结合片段(也称为抗体蛋白质药物)。在一些实施例中，抗体蛋白质药物可以是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、三特异性抗体或其抗原结合片段。代表性抗体片段包括但不限于Fab片段、F(ab')₂片段、单特异性F(ab')₂片段、双特异性F(ab')₂、三特异性F(ab')₂、单价抗体、scFv片段、双链抗体、双特异性双链抗体、三特异性双链抗体、scFv-Fc、微抗体、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。

在一些实施例中，蛋白质药物产品(目标蛋白质)是抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体或四链抗体、Fab片段或F(ab')2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在一个实施例中，抗体是IgG1抗体。在一个实施例中，抗体是IgG2抗体。在一个实施例中，抗体是IgG4抗体。在一个实施例中，抗体是嵌合IgG2/IgG4抗体。在一个实施例中，抗体是嵌合IgG2/IgG1抗体。在一个实施例中，抗体是嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗体。

在一些实施例中，抗体选自由以下组成的群组：抗程序性细胞死亡1抗体(例如，如美国专利号9,987,500中所述的抗PD1抗体)、抗程序性细胞死亡配体1(例如，如美国专利号9,938,345中所述的抗PD-L1抗体)、抗Dll4抗体、抗血管生成素2抗体(例如，如美国专利号9,402,898中所述的抗ANG2抗体)、抗血管生成素样3抗体(例如，如美国专利号9,018,356中所述的抗AngPtl3抗体)、抗血小板衍生生长因子受体抗体(例如，如美国专利号9,265,827中所述的抗PDGFR抗体)、抗Erb3抗体、抗催乳素受体抗体(例如，如美国专利号9,302,015中所述的抗PRLR抗体)、抗补体5抗体(例如，如美国专利号9,795,121中所述的抗C5抗体)、抗TNF抗体、抗表皮生长因子受体抗体(例如，如美国专利号9,132,192中所述的抗EGFR抗体或如美国专利号9,475,875中所述的抗EGFRvIII抗体)、抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin-9抗体(例如，如美国专利号8,062,640或美国专利号9,540,449中所述的抗PCSK9抗体)、抗生长分化因子8抗体(例如，如美国专利号8,871,209或9,260,515中所述的抗GDF8抗体，也称为抗肌骨素抗体)、抗胰高血糖素受体(例如，如美国专利号9,657,099中所述的抗GCGR抗体)、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、白介素4受体抗体(例如，如美国专利申请公开号US2014/0271681A1(现已放弃)或美国专利号8,735,095或8,945,559中所述的抗IL4R抗体)、抗白介素6受体抗体(例如，如美国专利号7,582,298、8,043,617或9,173,880中所述的抗IL6R抗体)、抗IL1抗体、抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗体、抗白介素33(例如，如美国专利号9,453,072或9,637,535中所述的抗IL33抗体)、抗呼吸道合胞病毒抗体(例如，如美国专利号9,447,173中所述的抗RSV抗体)、抗分化簇3(例如，如美国专利号9,657,102和申请公开号US20150266966A1以及美国申请号62/222,605中所述的抗CD3抗体)、抗分化簇20(例如，如美国专利号9,657,102和申请公开号US20150266966A1以及美国专利号7,879,984中所述的抗CD20抗体)、抗CD19抗体、抗CD28抗体、抗分化簇48(例如，如美国专利号9,228,014中所述的抗CD48抗体)、抗Fel d1抗体(例如，如美国专利号9,079,948中所述)、抗中东呼吸综合征病毒(例如，如美国专利号9,718,872中所述的抗MERS抗体)、抗埃博拉病毒抗体(例如，如美国专利号9,771,414中所述)、抗寨卡病毒抗体、抗淋巴细胞激活基因3抗体(例如抗LAG3抗体或抗CD223抗体)、抗神经生长因子抗体(例如，如美国专利申请公开号US2016/0017029(现已放弃)和美国专利号8,309,088和9,353,176中所述的抗NGF抗体)和抗激活素A抗体。在一些实施例中，双特异性抗体选自由以下组成的群组：抗CD3x抗CD20双特异性抗体(如美国专利号9,657,102和申请公开号US20150266966A1中所述)、抗CD3x抗粘蛋白16双特异性抗体(例如，抗CD3x抗Muc16双特异性抗体)和抗CD3x抗前列腺特异性膜抗原双特异性抗体(例如，抗CD3x抗PSMA双特异性抗体)。

在一些实施例中，目标蛋白质选自由以下组成的群组：阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿达木单抗-atto(adalimumab-atto)、ado-曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利库单抗(alirocumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝那利珠单抗(benralizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、贝洛托单抗(bezlotoxumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、康纳单抗(canakinumab)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、PEG化塞妥珠单抗(certolizumab pegol)、西米普利单抗(cemiplimab)、西妥昔单抗(cetuximab)、地诺单抗(denosumab)、地努妥昔单抗(dinutuximab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、得瓦鲁单抗(durvalumab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾米希组单抗(emicizumab-kxwh)、厄塔毒素-阿利珠单抗偶联物(emtansinealirocumab)、依维库人单抗(evinacumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、fasinumab、戈利木单抗(golimumab)、塞库单抗(guselkumab)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、依达赛珠单抗(idarucizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、英夫利昔单抗-abda(infliximab-abda)、英夫利昔单抗-dyyb(infliximab-dyyb)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊西贝单抗(ixekizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、雷珠单抗(nesvacumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥必托昔单抗(obiltoxaximab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、瑞西巴库单抗(raxibacumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利努单抗(rinucumab)、利妥昔单抗(rituximab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、塞库单抗(secukinumab)、西妥昔单抗(siltuximab)、塔西单抗(tocilizumab)、塔西单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、特伐单抗(trevogrumab)、乌司他单抗(ustekinumab)和维多珠单抗(vedolizumab)。

在一些实施例中，目标蛋白质是含有Fc部分和另一结构域的重组蛋白质(例如Fc融合蛋白)。在一些实施例中，Fc融合蛋白是受体Fc融合蛋白，其含有与Fc部分偶联的受体的一个或多个胞外结构域。在一些实施例中，Fc部分包含IgG的铰链区、随后是CH2和CH3结构域。在一些实施例中，受体Fc融合蛋白含有与单一配体或多个配体结合的两条或更多条不同的受体链。例如，Fc融合蛋白是TRAP蛋白，诸如例如IL-1陷阱(例如，rilonacept，其含有与融合至hIgG1的Fc的Il-1R1胞外区融合的IL-1RAcP配体结合区；参见美国专利号6,927,004，该专利以其整体通过引用并入本文)或VEGF陷阱(例如，aflibercept或ziv-aflibercept，其包含与融合至hIgG1的Fc的VEGF受体Flk1的Ig结构域3融合的VEGF受体Flt1的Ig结构域2；参见美国专利号7,087,411和7,279,159)。在其他实施例中，Fc融合蛋白是ScFv-Fc融合蛋白，其含有与Fc部分偶联的抗体的一个或多个抗原结合结构域如可变重链片段和可变轻链片段中的一个或多个。

B.药物捕获测定

图7A示出了代表性的药物捕获测定。测定100开始于步骤101，其中在施用药物之前或之后或在用药物治疗期间从受试者获得样品。在该实例中，药物是抗体。步骤101示出了含有与靶标结合的药物、游离中和抗体和与蛋白质药物抗体结合的中和抗体的样品。在步骤102中，将样品酸化以将中和抗体与蛋白质药物分离，并且任选地将靶标与蛋白质药物分离。

将样品酸化至小于约5.0的pH，通常酸化至约2.0至约4.0。在一个实施例中，用酸酸化样品，例如乙酸。酸化后，然后将样品在中性pH(通常约为7.0)下与偶联至可选择标记的靶标一起孵育，如步骤103所示。步骤103的pH可调节至允许标记的靶标与药物结合的pH。在一些实施例中，选择pH使得NAb不结合药物，但标记的靶标可以结合药物。

在一个实施例中，可选择标记是磁性标记、质量标签或琼脂糖/琼脂糖凝胶珠。磁性标记可以是顺磁性标记或超顺磁性标记。在一些实施例中，磁性标记是金属颗粒、金属微粒、金属纳米颗粒、金属珠、磁性聚合物、均匀聚苯乙烯球形珠或超顺磁性球形聚合物颗粒。

该方法包括通过将样品暴露于磁体或磁场并分离不含标记靶标:蛋白质药物复合物的上清液来物理去除标记的靶标:蛋白质药物复合物以产生耗尽样品。耗尽样品在104中示出并且含有中和抗体、任选的游离靶标和任选的与可选择标记偶联的游离靶标。在步骤105中，将生物素化药物和抗靶标阻断剂如结合游离靶标和用可选择标记物标记的靶标的抗体添加至样品中以形成测定样品。在步骤106中，然后将测定样品在亲和素包被的或链霉亲和素包被的固体支持物如亲和素包被的微量滴定板上孵育。任选地洗涤该板以去除不与亲和素包被板结合的复合物。

然后将标记的靶标添加到固体支持物上。靶标通常用可检测标记来标记，该可检测标记包括荧光团、化学发光探针、电化学发光探针、量子点、稀土过渡金属、金金属颗粒、银金属颗粒或其组合。示例性的荧光团包括但不限于Alexa Fluor染料、Atto标记、CF染料、荧光素荧光团、荧光红、荧光橙、罗丹明和衍生物，以及Phycobili蛋白。在一个实施例中，靶标用钌标记。然后检测并任选地量化来自微量滴定板的信号。步骤107示出了在不存在NAb的情况下检测到强信号。步骤108示出了在存在NAb的情况下降低的信号。

应当理解，该方法的孵育步骤之后可以是一个或多个洗涤步骤以去除未结合的试剂。

一个实施例提供了一种用于检测样品中针对药物的抗药物抗体的药物捕获方法，该方法包括在酸性条件下孵育样品一段时间以产生酸化样品，然后将酸化样品与含有药物靶标的pH缓冲溶液结合的步骤。药物靶标与药物结合以产生靶标:药物复合物。在一个实施例中，药物是抗体或其抗原结合片段或融合蛋白。在一些实施例中，药物靶标用可选择标记如磁珠来标记。在该实施例中，该方法包括使用磁性去除靶标：药物复合物以产生耗尽样品。将耗尽样品与抗靶标阻断抗体或其抗原结合片段和标记药物一起孵育以产生测定样品。抗靶标阻断剂通常是特异性结合靶标并阻止或抑制靶标与蛋白质药物结合的抗体。药物用允许标记药物与固体支持物结合的材料标记。示例性标记是生物素。然后将测定样品在亲和素包被的固体支持物上孵育。在一些实施例中，在与测定样品一起孵育后洗涤固体支持物以去除未结合的试剂。该方法进一步包括将标记的蛋白质药物靶标添加到固体支持物上。靶标通常用可检测的标记如钌标记。任选地洗涤固体支持物以去除未结合的标记靶标。检测并任选地量化来自与和固体支持物结合的生物素化药物结合的标记靶标的可检测信号。与对照样品相比，来自固体支持物的信号量减少表明样品中存在抗药物抗体。在一些实施例中，抗药物抗体包括特异性结合蛋白质药物的中和抗体。

在一些实施例中，蛋白质药物是单克隆抗体、双特异性抗体、Fab片段、F(ab')₂片段、单特异性F(ab')₂片段、双特异性F(ab')₂、三特异性F(ab')₂、单价抗体、scFv片段、双链抗体、双特异性双链抗体、三特异性双链抗体、scFv-Fc、微抗体、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。

C.靶标捕获测定

另一个实施例提供了一种靶标捕获测定。图7B示出了示例性靶标捕获测定。测定200开始于步骤201，其中在施用药物之前或之后或在用药物治疗期间从受试者获得样品。在该实例中，药物是抗体。步骤201示出了含有与靶标结合的药物、游离中和抗体、与药物结合的中和抗体和任选的游离靶标的样品。在该实施例中，将样品酸化以将中和抗体与蛋白质药物分离，并将靶标与蛋白质药物分离，从而产生酸化样品，如步骤202所示。

将酸化样品酸化至促进药物与靶标以及药物与NAb的解离的pH。在一个实施例中，将pH降低至小于约5.0，通常降低至约2.0至4.0，甚至更通常降低至约3.0至3.5。在一些实施例中，用酸酸化样品，例如乙酸。酸化后，然后将样品与步骤203中示出的与可选择标记偶联的非阻断性抗药物抗体以及有效量的缓冲液(例如Tris缓冲液)一起孵育，以将pH升高至使与可选择标记偶联的非阻断性抗药物抗体能够与样品中的药物结合。在一个实施例中，将pH升高至约4.0至约5.5，或升高至4.5至5.0。与可选择标记偶联的非阻断性抗药物抗体在这些条件下与药物结合，并且靶标在这些条件下与药物的结合非常差。

在一个实施例中，可选择标记是磁性标记。磁性标记可以是顺磁性标记或超顺磁性标记。在一些实施例中，磁性标记是金属颗粒、金属微粒、金属纳米颗粒、金属珠、磁性聚合物、均匀聚苯乙烯球形珠或超顺磁性球形聚合物颗粒。可选择标记可以是质量标签或琼脂糖/琼脂糖凝胶珠，并且重力或离心可用于从样品中分离含有可选择标记的复合物。

靶标捕获方法的该实施例包括使用选择标记物从样品中物理去除标记药物：抗药物抗体复合物。在一个实施例中，可选择标记物是磁性标记，并且通过将样品暴露于磁体或磁场并分离不含蛋白质药物：抗蛋白质药物抗体复合物的上清液来物理去除药物：抗药物抗体复合物以产生含中和抗体的耗尽样品，如步骤204所示。

在步骤205中，在pH中性条件下将标记药物添加到样品中以产生测定样品。在一些实施例中，通过添加碱或缓冲液如碱性Tris缓冲液将耗尽样品的pH升高至约pH 7.0。缓冲液和标记药物可以同时或依次添加。标记药物可以用可检测标记来标记，该可检测标记包括但不限于荧光团、化学发光探针、电化学发光探针、量子点、放射性同位素、稀土过渡金属、金金属颗粒、银金属颗粒或其组合。示例性荧光团包括但不限于Alexa Fluor染料、Atto标记、CF染料、荧光素荧光团、荧光红、荧光橙、罗丹明和衍生物，以及Phycobili蛋白。在一个实施例中，标记是钌。

将pH约为7.0的测定样品在靶标包被的固体支持物上孵育。在一个实施例中，固体支持物用亲和素或链霉亲和素包被。将生物素化靶标与亲和素或链霉亲和素包被板结合。将测定样品在固体支持物上孵育以允许样品与板结合。任选地洗涤板以除去未结合的试剂，并检测和任选地量化剩余的信号。步骤206示出了标记药物与和固体支持物结合的靶标结合并产生强信号。步骤207示出了被NAb结合的标记药物阻止标记药物与固体支持物结合，导致信号降低。降低的信号与未处理样品中NAb的存在相关。

另一个实施例提供了一种用于检测样品中与药物结合的抗药物抗体的靶标捕获方法，该方法包括将样品在酸性条件如在pH 2.0-4.0下孵育一段时间以产生酸化样品的步骤。然后将酸化样品与含有对蛋白质药物具有特异性的标记抗药物抗体的pH缓冲溶液结合以产生抗体:蛋白质药物复合物并将pH升高至约4.0至5.5，通常升高至4.5至5.0。在一些实施例中，非阻断性抗独特型mAb用可选择标记来标记。标记的抗药物抗体可以是非阻断性抗独特型抗体或其抗原结合片段。靶标捕获方法包括使用可选择标记从样品中物理去除抗体:蛋白质药物复合物以产生耗尽样品。通常，可选择标记是用于利用磁体去除药物:抗药物抗体复合物的磁性标记。靶标捕获方法包括在约7.0的pH下将耗尽样品与标记药物一起孵育以产生测定样品。标记药物通常用可检测标记来标记。靶标捕获方法中的可检测标记可以是荧光团、化学发光探针、电化学发光探针、量子点、稀土过渡金属、放射性同位素、金颗粒、银颗粒或其组合。靶标捕获方法包括在靶标包被的固体支持物上孵育测定样品，其中标记药物特异性结合靶标包被的固体支持物。靶标捕获方法任选地包括在与测定样品一起孵育之后洗涤固体支持物以去除未结合的标记试剂。靶标捕获方法还包括测量来自与靶标包被的固体支持物结合的标记药物的可检测信号的步骤，其中相对于对照样品的信号量减少表明样品中存在抗药物抗体。

在靶标捕获方法的一些实施例中，抗药物抗体包括与蛋白质药物特异性结合的中和抗体。药物可以是抗体或其抗原结合片段或融合蛋白。在一些实施例中，药物是单克隆抗体、双特异性抗体、Fab片段、F(ab')₂片段、单特异性F(ab')₂片段、双特异性F(ab')₂、三特异性F(ab')₂、单价抗体、scFv片段、双链抗体、双特异性双链抗体、三特异性双链抗体、scFv-Fc、微抗体、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。

在靶标捕获方法的一些实施例中，蛋白质药物用钌标记。

靶标捕获测定的一些实施例在耗尽样品中具有比非耗尽样品中高至少10倍的药物耐受性。在靶标捕获方法的其他实施例中，该方法在施用蛋白质药物至少29天后从受试者采集的样品中鉴定出NAb阳性。

实例

实例1：竞争性配体结合NAb测定：形式和药物耐受性

材料和方法

材料和试剂

除非另有说明，否则所有溶液均在测定缓冲液(1％BSA，于1XPBS中)中制备。读出缓冲液T(4X)来自Meso Scale Discovery(MSD,盖瑟斯堡,马里兰)。冰醋酸(17.4M)来自赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)(沃尔瑟姆,马萨诸塞州)。人和猴血清来自BioIVT(韦斯特伯里,纽约州)。完全人单克隆抗体药物、完全人竞争性抗靶标A抗体、重组人靶标、用作阳性对照的单克隆中和抗药物抗体以及抗人单克隆抗体由美国再生元制药公司(Regeneron)(柏油村,纽约州)生产。根据制造商的说明，使用生物素利用EZ-link Sulfo-NHS-LC-生物素(赛默飞世尔科技)和钌NHS酯(MSD)标记抗体和靶标。DyNAbeads^TM抗体偶联试剂盒来自赛默飞世尔科技。根据制造商的说明，将药物特异性蛋白质试剂与磁性

偶联(30μg蛋白质/1mg珠)。多阵列

高结合亲和素(

High Bind Avidin)96孔板来自MSD。Trizma碱(1.5M)来自西格玛(Sigma)(圣路易斯,密苏里州)。洗涤液来自KPL公司。

设备

微孔板清洗机(ELx405)来自美国伯腾仪器(BioTek Instruments)(威努斯基,佛蒙特州)，并且微孔板振荡器来自VWR(拉德诺,宾夕法尼亚州)。QuickPlex SQ 120读取器来自MSD，并且

Pro应用来自美谷分子仪器(Molecular Devices)(森尼韦尔市,加利福尼亚州)。

磁珠药物耗尽程序

将样品在300mM乙酸中以1:5稀释，并在室温(RT)下孵育60分钟。将30mg药物特异性蛋白质偶联

重新悬浮在500mM Tris溶液中(足以用于一个样品板/QC，约0.6mg珠/样品)。然后将酸化样品在含蛋白质偶联的

的1％BSA、500mMTris溶液中以1:2(1:20总最终稀释度)稀释(1小时，700rpm)。将样品靠在磁体上，使珠收集在管/孔壁上，并将上清液转移到单独的管/板中。

竞争性配体结合NAb测定程序

将合并的人血清用作阴性对照(NC)。在室温下用5％BSA洗涤和封闭微量滴定板1小时。以药物捕获形式配置REGN-A药物的测定，以靶标捕获形式配置REGN-B药物的测定(图1)(Wu,B.W.,等人,GG,Shankar G：用于检测中和抗体的竞争性配体结合测定《抗体与生物药物的检测和定量：实际和应用考虑》,M.G.Tovey(编辑)，约翰威利父子公司，霍博肯，新泽西州，美国(2011))。在这两种配置中，标记药物(生物素或钌)在添加到亲和素包被的测定板之前与溶液中的血清样品(有或没有药物耗尽)一起孵育。在药物捕获形式中，在后续步骤中添加钌标记的靶标，而在靶标捕获形式中，生物素化的靶标首先预结合到链霉亲和素包被的微孔板上。

药物捕获形式：

在室温下，在摇动(400rpm)下将样品和QC(有或没有药物消耗)与含有50μg/mL抗靶标阻断抗体的10ng/mL Bio-REGN-A测定缓冲液一起在样品板中孵育90分钟。然后洗涤测定板并添加酸化/中和样品和QC(50μL，2小时，室温)。将钌标记的重组靶标以2μg/mL添加到测定板中，并在测定缓冲液中(50μL，400rpm)在室温下震荡1小时。

靶标捕获形式：

将生物素化的重组靶标以2μg/mL添加到测定板中，在测定缓冲液中(50μL，400rpm)在室温下震荡1小时，并洗涤。将样品和QC(有或没有药物耗尽)以20ng/mL与钌标记药物一起孵育，并在测定缓冲液中(50μL，400rpm)在室温下震荡2小时。然后将溶液添加至测定板中(50μL，400rpm)。

在两种形式中，在最终孵育后，洗涤板并与150μL 2X读出缓冲液一起孵育0-10分钟，并在QuickPlex SQ 120读取器上读取。将计数值导入

Pro软件，并根据阴性对照信号计算板特异性临界点。

药物耐受性计算和临界点确定

使用4PL回归模型在SoftMax Pro中计算药物耐受性(DT)和药物干扰值。通过来自在NAb测定中测试的患病个体的未使用药物血清样品的数据的统计分析来确定临界点。用于分析的统计方法基于行业惯例(Shankar,G.,等人.《药学和生物医学分析杂志》48(5):1267-1281(2008)；Gupta,S.,等人.《免疫学方法杂志》321(1-2):1-18(2007))。

药物A浓度ELISA

向猴血清样品中掺入指定浓度的药物A，然后进行药物耗尽程序，或者作为对照，进行相同的处理步骤，但不添加靶标偶联珠。然后将所得血清样品上清液酸化(300mM乙酸)并中和，然后添加至包被有抗人Igκ轻链特异性mAb的微孔板。用生物素化的抗人Fc特异性mAb检测药物A水平，并由NeutrAvidin-HRP产生测定信号。

结果

开发了两种不同的mAb药物的CLB NAb测定并且针对一系列不同的包括形式、灵敏度和DT在内的参数进行了优化。对于药物A，开发了药物捕获测定，而对于药物B，开发了靶标捕获方法(图1A-1B)。药物捕获CLB NAb测定形式通常是优选的，因为在没有NAb的情况下，游离药物将不会产生假阳性反应，并且可以通过添加抗靶标结合蛋白最小化靶标干扰。然而，即使在没有生物素-药物的情况下，药物B的钌标记重组靶标也粘附在板上，因此选择靶标捕获形式。在这两种形式中，在不存在NAb的情况下，标记药物与标记靶标结合，在测定中产生信号。在NAb存在的情况下，标记靶标与标记药物的结合受到抑制，导致测定信号降低。因此，测定信号与样品中NAb的量成反比(Wu,B.W.,等人.“用于检测中和抗体的竞争性配体结合测定”《抗体与生物药物的检测和定量：实际和应用考虑》,Michael G.Tovey(编辑)，约翰威利父子公司，霍博肯，新泽西州，美国(2011))。

在两种NAb测定形式中，样品中游离药物的存在可以与标记药物竞争结合NAb，并且在靶标捕获形式中，在没有NAb的情况下也会产生假阳性反应。由于这些原因，DT是一个需要优化的关键变量。两种药物程序的测定都包含酸解离步骤以改善DT。然而，每种方法的DT仍显著低于患者的谷药物浓度(未示出)。在一个实施例中，每种方法的DT比谷药物浓度低多达20倍。因此，评估固相提取/纯化方法以进一步改进测定DT。

仅根据ADA阳性和药物浓度选择药物A临床研究样品，不考虑采样时间点。在按采样时间点分组的样品中，NAb阳性本质上是暂时的，72％的NAb阳性样品发生在初次施用后第85天或更晚。相比之下，在初次施用后不到30天的时间点观察到85％的NAb阴性样品。在不添加药物耗尽步骤的情况下，不可能在含有药物的样品中进行此类观察。这与ADA对生物制品和替代因子的反应在治疗过程中成熟的发现一致，NAb反应的IgG4比例高于正常血清中发现的比例，并且IgG4反应发生在较晚的时间点(Van Schouwenburg,P.A.,等人,《临床免疫学杂志(J Clinical Immunol)》,32(5):1000-1006(2012)；Montalvao,S.A.,等人,《世界血友病联合会(Official J World Federation Hemophilia)》,21(5):686-692(2015)；Hofbauer,C.J.,等人,《血液(Blood.)》125(7):1180-1188(2015)；Barger,T.E.,等人.《欧洲肾脏协会(European Renal Assoc)》,27(2):688-693(2012))。

实例II：珠偶联的蛋白质在NAb测定步骤的残留

材料和方法

参见实例I。

结果

最初的实验使用与链霉亲和素珠结合的生物素-药物从样品中提取ADA(和NAb)。然而，在CLB NAb测定中，低标记药物浓度是实现最大灵敏度所必需的(Hu,J.等人,《免疫学方法杂志》419:1-8(2015)；Wu,B.W.,等人,“用于检测中和抗体的竞争性配体结合测定”《抗体与生物药物的检测和定量：实际和应用考虑》,Michael G.Tovey(编辑)，约翰威利父子公司，霍博肯，新泽西州，美国(2011))。因此，任何从富集步骤转移到测定步骤的生物素-药物都可能干扰。图2A中的数据表明，NAb富集步骤中使用的生物素化药物会残留至NAb测定步骤，导致测定信号增加约5倍。事实上，即使在NAb测定中没有添加的生物素-药物，来自富集步骤的生物素-药物的残留也足以产生大量的测定信号(未示出)。

作为从样品中去除NAb的替代方法，还测试了药物去除方法。然而，与生物素-药物NAb富集方法的情况一样，来自用于捕获药物的蛋白质的残留也可能潜在干扰NAb测定步骤。图2B和2C中的数据表明，当使用靶标或阻断性抗独特型抗体来捕获药物时，这些蛋白质会在随后的NAb测定中残留并抑制信号。

实例III：最小化来自药物捕获蛋白的干扰

材料和方法

参见实例I。

结果

尝试减少偶联蛋白质的量或增加洗涤步骤无法充分最小化在将这些蛋白质转移到NAb测定后来自这些蛋白质的干扰。为了减轻残留的干扰，针对每种NAb测定开发了不同的方法。

当在药物去除步骤中使用靶标作为捕获试剂时，蛋白质残留并抑制NAb测定信号(图2B、2C和3A)。然而，在药物捕获测定形式中，添加抗靶标抗体解决了由蛋白质残留引起的问题。在存在抗靶标mAb的情况下，对阳性和阴性对照样品进行了药物去除步骤，靶偶联珠产生的测定信号几乎与没有药物去除步骤的对照样品相同(图3A)。

在靶标捕获NAb测定形式中，不可能添加抗靶标试剂，因为它会与捕获试剂结合并抑制测定信号。尽管靶标阻断性抗独特型抗体显示干扰测定(图2C)，但有可能使用非阻断性抗药物mAb。因此，使非阻断性抗独特型抗体(图3C)与珠偶联以捕获药物。在这种测定形式中，经历药物去除步骤的阳性和阴性对照样品与没有药物去除步骤的对照样品具有相似的测定信号(图3B)。

实例IV：使用磁珠进行药物耗尽

材料和方法

参见实例I。

结果

减少由珠步骤残留的蛋白质造成的干扰是选择特定药物去除试剂的关键标准。为了测试利用珠偶联的蛋白质的药物去除效率，进行了两组实验：NAb阴性样品中的药物干扰和NAb阳性样品中的DT。为了在药物B的靶标捕获测定中测试药物干扰，将药物掺入NAb阴性样品中，并在有和没有药物耗尽步骤的测定中进行测试。与对照相比，添加使用抗独特型mAb偶联珠的药物去除步骤使产生假阳性反应所需的药物浓度增加了近50倍(2μg/mL至93μg/mL，图4A)。

为了测试DT，在含有小鼠单克隆阳性对照抗体(250ng/mL)的样品中掺入浓度增加的药物，并在有和没有药物耗尽步骤的两种测定中进行测试。在药物B的靶标捕获测定形式中，添加使用抗独特型mAb偶联珠的药物去除步骤导致DT比对照增加了10倍(153ng/mL至1.55μg/mL，图4B)。对于药物A的药物捕获形式，通过添加使用靶标偶联珠的药物去除步骤，与对照相比，DT增加了20倍(0.5μg/mL至9.7μg/mL，图4C)。这些实验表明，在两种测定中，通过引入药物耗尽步骤显著改善了DT。

为了确定药物耗尽步骤大约去除了多少药物，向猴血清样品中掺入药物A并进行药物耗尽程序。然后在夹心免疫测定中使用抗人mAb作为捕获和检测试剂分析样品。作为对照，对一式两份的掺药物A样品进行相同的酸化和中和处理步骤，但不添加靶标偶联珠。如图4D所示。与对照样品相比，药物A耗尽样品具有非常差的测定信号。为了量化去除的治疗剂的量，从对照样品产生的回归曲线内插耗尽样品中的药物A浓度。该分析表明，大约99％的药物已通过耗尽步骤去除(例如，将12.5μg/mL药物掺入样品中，耗尽后测量为120ng/mL)。使用药物B耗尽程序也获得了类似的耗尽水平(未示出)。

实例V：有或没有药物耗尽的ADA阳性临床样品的NAb分析材料和方法

数据表明，基于用作阳性对照的小鼠单克隆抗药物抗体，药物耗尽预处理步骤改善了DT。为了用人抗药物抗体证实这一发现，选择了来自药物A(多剂量)临床试验的25个样品，以在有和没有药物耗尽步骤的药物捕获NAb测定中测试。

结果

所有样品均为ADA阳性，并且均具有500至15000ng/mL的可检测药物水平。所有这些样品中的治疗浓度都高于没有药物耗尽步骤的方法的DT。ADA对药物A的反应总体上非常低(未示出)，并且唯一具有可检测药物的ADA阳性样品具有低效价反应(最低稀释度或高一个稀释度)。

在没有药物耗尽步骤的情况下测试的25个样品中，只有两个是NAb阳性，其中抑制百分比大于临界点(图5A)。相比之下，在珠预提取步骤之后，十二个样品为NAb阳性(图5B)。在有或没有珠药物去除步骤的情况下，选择的ADA阴性基线样品的抑制百分比只有很小的变化(未示出)。对于NAb阳性样品，当在有或没有药物耗尽步骤的情况下分析样品时，抑制百分比的平均变化为+24％(图5B)。相比之下，对于NAb阴性样品，当在有或没有药物耗尽步骤的情况下测试时，抑制百分比都没有实质性变化(-2.7％，图5B)。这清楚地表明，药物去除仅影响一个样品子集的NAb结果。重要的是，在包含药物耗尽步骤的情况下，当样品中的药物浓度高达10μg/mL，高于研究中的谷药物水平时，就会检测到NAb。

在25个ADA阳性样品中，NAb阳性样品主要出现在较晚的时间点(图6A-6C)。在测试的两个最早时间点，即初次施用后的第15天和第29天鉴定出13个NAb阴性样品中的11个(85％)。相比之下，在测试的最早时间点即第15天没有鉴定出NAb阳性样品，并且在下一个测试时间点即第29天，仅鉴定出11个NAb阳性样品中的3个。11个NAb阳性反应中的8个(72％)发生在第85天之后的时间点。

虽然在前面的说明书中已经关于本发明的某些实施例描述了本发明，并且为了说明的目的已经提出了许多细节，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明易受另外的实施例的影响并且在不背离本发明的基本原理的情况下，本文描述的某些细节可以有相当大的变化。

本文引用的所有参考文献均通过引用以其整体并入。在不脱离本发明的精神或本质属性的情况下，本发明可以以其他具体形式实施，并且因此应参考所附权利要求而不是前述说明书来指示本发明的范围。

Claims

1.一种用于检测样品中针对药物的抗药物抗体的方法，所述方法包括：

将所述样品在酸性条件下孵育一段时间以产生酸化样品；

将所述酸化样品与包含药物靶标的pH缓冲溶液结合以产生靶标:药物复合物，其中所述药物靶标用可选择标记来标记；

使用所述可选择标记从所述样品中去除所述靶标:药物复合物以产生耗尽样品；

将所述耗尽样品与抗靶标阻断剂或其抗原结合片段和生物素化药物一起孵育以产生测定样品；

将所述测定样品在亲和素包被的固体支持物上孵育；

任选地在与所述测定样品一起孵育后洗涤所述固体支持物；

将标记的药物靶标添加至所述固体支持物；

任选地洗涤所述固体支持物以去除未结合的标记靶标；以及

测量来自与和所述固体支持物结合的所述生物素化药物结合的标记靶标的可检测信号，其中来自所述固体支持物的信号量相对于对照样品减少表明所述样品中存在抗药物抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗药物抗体包括与所述药物特异性结合的中和抗体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述药物是抗体或其抗原结合片段或融合蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体、双特异性抗体、Fab片段、F(ab')₂片段、单特异性F(ab')₂片段、双特异性F(ab')₂、三特异性F(ab')₂、单价抗体、scFv片段、双链抗体、双特异性双链抗体、三特异性双链抗体、scFv-Fc、微抗体、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸性条件包括约2.0至约4.0的pH。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸性条件包括1至3的pH。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述可选择标记包括磁性标记。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述磁性标记是顺磁性标记或超顺磁性标记。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述磁性标记是金属颗粒、金属微粒、金属纳米颗粒、金属珠、磁性聚合物、均匀聚苯乙烯球形珠或超顺磁性球形聚合物颗粒。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗靶标阻断剂或其抗原结合片段与所述蛋白质药物的靶标特异性结合。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在耗尽样品中的药物耐受性比在非耗尽样品中高至少10倍。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在含有在施用所述蛋白质药物至少29天后从所述受试者采集的药物的样品中鉴定出NAb阳性。

13.根据权利要求1所述的方法，其中在所述孵育或洗涤步骤期间搅动所述样品。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记靶标用荧光团、化学发光探针、电化学发光探针、量子点、稀土过渡金属、金金属颗粒、银金属颗粒或其组合标记。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述标记包括钌。

16.一种用于检测样品中针对药物的抗药物抗体的方法，所述方法包括：

将所述样品在酸性条件下孵育一段时间以促进蛋白质复合物的解离从而产生酸化样品；

将所述酸化样品与包含对所述药物具有特异性的标记的非阻断性抗独特型抗体的pH缓冲溶液结合以产生非阻断性抗独特型抗体：药物复合物，其中所述标记的非阻断性抗独特型抗体用可选择标记来标记，并且将pH升高至4.0-5.5；

使用所述可选择标记从所述样品中去除所述非阻断性抗独特型抗体：药物复合物以产生耗尽样品；

在约7.0的pH下将所述耗尽样品与标记的蛋白质药物一起孵育以产生测定样品；

将所述测定样品在靶标包被的固体支持物上孵育，其中所述标记药物特异性结合所述靶标；

任选地在与所述测定样品一起孵育后洗涤所述固体支持物以去除未结合的标记药物；以及

测量来自与所述靶标包被的固体支持物结合的标记药物的可检测信号，其中相对于对照样品的信号量减少表明样品中存在抗药物抗体。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗药物抗体包括与所述药物特异性结合的中和抗体。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述药物是抗体或其抗原结合片段或融合蛋白。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体、双特异性抗体、Fab片段、F(ab')₂片段、单特异性F(ab')₂片段、双特异性F(ab')₂、三特异性F(ab')₂、单价抗体、scFv片段、双链抗体、双特异性双链抗体、三特异性双链抗体、scFv-Fc、微抗体、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。

20.根据权利要求16所述的方法，其中所述酸性条件包括4.5-5.0的pH以最小化游离靶标干扰。

21.根据权利要求16所述的方法，其中所述酸性条件包括2.0-4.0的pH。

22.根据权利要求16所述的方法，其中所述可选择标记包括磁性标记。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述磁性标记是顺磁性标记或超顺磁性标记。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述磁性标记是金属颗粒、金属微粒、金属纳米颗粒、金属珠、磁性聚合物、均匀聚苯乙烯球形珠或超顺磁性球形聚合物颗粒。

25.根据权利要求16所述的方法，其中所述标记药物用荧光团、化学发光探针、电化学发光探针、放射性同位素、量子点、稀土过渡金属、金颗粒、银颗粒或其组合标记。

26.根据权利要求16所述的方法，其中所述标记包括钌。

27.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法在耗尽样品中的药物耐受性比在非耗尽样品中高至少10倍。

28.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法在施用所述蛋白质药物至少29天后从所述受试者采集的样品中鉴定出NAb阳性。

29.根据权利要求16所述的方法，其中在所述孵育或洗涤步骤期间搅动所述样品。

30.一种用于鉴定先导蛋白质药物的方法，所述方法包括：

向受试者施用一种或多种药物候选物；

对从所述受试者获得的样品进行根据权利要求1或权利要求16中任一项所述的方法；以及

选择产生很少或不产生ADA的蛋白质药物候选物。