MX2007002856A

MX2007002856A - Metodos para el uso de ligandos receptores de muerte y anticuerpos c20.

Info

Publication number: MX2007002856A
Application number: MX2007002856A
Authority: MX
Inventors: Arthur J Huang; Barbara Moffat; Daniel G Yansura
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2004-09-02
Filing date: 2005-09-01
Publication date: 2007-09-25
Also published as: EP1789446A2; WO2006028936A2; WO2006028936A3; JP2008511337A; US20060204493A1; CA2577082A1; AU2005282700A1

Abstract

Metodos para utilizar ligandos receptores de muerte, tales como polipeptidos de ligando Apo-2/TRAIL o anticuerpo receptor de muerte y anticuerpos CD20 para tratar condiciones tales como cancer e enfermedad inmuno relacionadas se proporciona. Modalidades de la invencion incluye metodos para utilizar Apo-2/TRAIL o anticuerpo receptor DR4, en combinacion con anticuerpos CD20.

Description

MÉTODOS PARA EL USO DE LIGANDOS DE RECEPTORES DE MUERTE Y ANTICUERPOS CD20 SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica prioridad bajo la Sección 119 (e) de una solicitud provisional de patente de los E.U.A. Número de Serie 60/607,834 presentada en septiembre 8, 2004 y a una solicitud provisional de patente de los E.U.A. Número de Serie 60/666,550 presentada en marzo 30, 2005, los contenidos de las cuales están siendo incorporadas en la presente por referencia . CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención relaciona los métodos del uso de ligandos receptores de muerte y anticuerpos CD20. Más particularmente, la invención se relaciona con métodos para utilizar ligando Apo-2/TRAIL o anticuerpo receptor de muerte en combinación con anticuerpos CD20 para tratar varios desordenes patológicos, tales como el cáncer y enfermedades relacionadas con la inmunidad. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Varios ligandos y receptores pertenecientes a la súper familia de factor de necrosis tumoral (TNF) han sido identificados en la técnica. Incluidos entre tales ligandos están necrosis tumoral factor-alfa ("TNF-alfa"), necrosis tumoral factor-beta ("TNF-beta" o "linfotoxina-alfa"), linfotoxina-beta ("LT-beta"), ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40, ligando OX-40, ligando 4-1BB, LIGHT, ligando Apo-1 (también referido como el ligando Fas o ligando CD95) , ligando Apo-2 (también referido como Apo2L o TRAIL) , ligando Apo-3 (también referido como TWEAK) , APRIL, ligando OPG (también referido como el ligando RANK, ODF, o TRANCE) , y TALL-1 (también referido como BlyS, BAFF o THANK) (Ver por ejemplo, Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002); Ashkenazi y Dixit, Science, 281 : 1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., lJL:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, págs. 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol . , 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992); WO 97/01633 publicada en enero 16, 1997; WO 97/25428 publicada en julio 17, 1997; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); W098/28426 publicada en julio 2, 1998; W098/46751 publicada en octubre 22, 1998; WO/98/18921 publicada en mayo 7, 1998; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)). La inducción de varias respuestas celulares mediadas por dichas ligandos de familias TNF, es típicamente iniciada por su enlace a receptores específicos de la célula. Algunos, pero no todos, los ligandos de la familia TNF se ligan a, e inducen varias actividades biológicas a través, de "receptores de muerte" de la superficie de la célula para activar a las caspasas, o enzimas que llevan a cabo la ruta de muerte celular o apoptosis (Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997). Incluidos dentro de los miembros de la super familia de los receptores TNF identificados a la fecha son TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, , CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (también referido como Apo-1 o CD95), DR4 (también referido como TRAIL-Rl), DR5 (también referido como Apo-2 o TRAIL-R2), DcRl, DcR2, osteoprotegerina (OPG) , RANK y Apo-3 (también referido como DR3 o TRAMP) (ver por ejemplo, Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Célula Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997); Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Hohman et al., J. Biol. Chem., 264: 14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); EP 417,563, publicada en marzo 20, 1991; Loetscher et al., Célula, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991); Stamenkovic et al., EMBO J.. 8:1403-1410 (1989); Mallett et al., EMBO J., 9:1063-1068 (1990); Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997); Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Tsuda et al., BBRC, 234:137-142 (1997); Nocentini et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997); vonBulow et al., Science, 278:138-141 (1997)).

La mayoría de estos miembros de la familia de receptores TNF comparte la estructura tipica de receptores de superficie celular incluyendo regiones extracelular, transmembrana y intracelular, mientras que otros son encontrados naturalmente como proteinas solubles que carecen de un dominio de transmembrana e intracelular. La porción extracelular de los TNFRs típicos contienen un patrón de secuencia repetitiva de aminoácidos de múltiple dominios ricos en cisteina (CRDs Cysteine-Rich Domains), empezando a partir del término-NH2. El ligando referido como Apo-2L o TRAIL fue identificado hace varios años como un miembro de la familia TNF de citocinas. (Ver por ejemplo, Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); WO 97/01633; WO 97/25428; Patente de los E.U.A. No. 5,763,223 otorgada en junio 9, 1998; Patente de los E.U.A. No. 6,284,236 otorgada en septiembre 4, 2001). La longitud completa del polipéptido de la secuencia humana Apo2L/TRAIL nativa es una proteína transmembrana Tipo II con de 281 aminoácidos de largo. Algunas células pueden producir una forma natural soluble de polipéptido, a través de una escisión enzimática de la región extracelular del polipéptido (Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)). Estudios cristalográficos de las formas solubles del Apo2L/TRAIL revelan una estructura homotrimérica similar a las estructuras de TNF y otras proteínas relacionadas (Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Cha et al., Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)). Apo2L/TRAIL, diferente a otros miembros de la familia TNF sin embargo, se encontró que tiene una característica estructural única en que los tres residuos de cisteína (en la posición 230 de cada subunidad en el homotrímero) juntos coordinan el átomo de zinc, y que la ligadura del zinc es importante para la estabilidad del trímero y la actividad biológica. (Hymowitz et al., supra; Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)). Se ha reportado en la literatura que el Apo2L/TRAIL puede jugar un papel en la modulación de sistema inmune, incluyendo enfermedades auto inmunes tales como la artritis rheu atoide [ver por ejemplo, Thomas et al., J. Immunol . , 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)].

Formas solubles del Apo2L/TRAIL han sido también reportadas que inducen la apoptosis en una variedad de células de cáncer, incluyendo tumores en el colon, pulmón, mama, próstata, vejiga, riñon, de ovarios y cerebro, así también como melanoma, leucemia y mieloma múltiple (ver por ejemplo, Wiley et al., supra; Pitti et al., supra; Patente de los E.U.A. No. 6,030,945 otorgada en February 29, 2000; Patente de los E.U.A. No. 6,746,668 otorgada en June 8, 2004; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cáncer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cáncer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et al., Cáncer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)). Estudios in vivo en modelos de tumor murino además sugieren que el Apo2L/TRAIL, junto o en combinación con quimioterapia o terapia de radiación, pueden ejercer efectos substanciales anti-tumorales (ver por ejemplo, Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra; Gliniak et al., Cáncer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., supra; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999); solicitud del TCP (PCT) US/00/15512; solicitud del TCP (PCT) US/01/23691) . En contraste con michos tipos de las células de cáncer, muchos tipos de célula humanas parecen ser resistentes a la inducción apoptósica por ciertas formas recombinantes del Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra). Jo et al., ha reportado que una forma soluble de polihistidina-etiquetada del Apo2L/TRAIL induce apoptosis in vi tro en hepatocitos humanos normales aislados, pero no en los no humanos, (Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); ver también, Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000) ) . Se cree que ciertas preparaciones de Apo2L/TRAIL recombinantes pueden variar en términos de propiedades bioquímicas y actividades biológicas en células enfermas contra células normales, dependiendo, por ejemplo, de la presencia o ausencia de una molécula de etiqueta, contenido de zinc, y contenido de trímero (ver, Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)). El Apo2L/TRAIL ha sido encontrado que se une a al menos a cinco diferentes receptores. Al menos dos de los receptores que ligan el Apo2L/TRAIL contienen un dominio funcional, de muerte citoplásmico. Uno de tales receptores se ha referido como "DR4" (y alternativamente como TR4 o TRAIL-R1) (Pan et al., Science, 276: 111-113 (1997); ver también W098/32856 publicada en julio 30, 1998; W099/37684 publicada en julio 29, 1999; WO 00/73349 publicada en diciembre 7, 2000; patente de los E.U.A. No. 6,433,147 otorgada en agosto 13, 2002; patente de los E.U.A. No. 6,461,823 otorgada en octubre 8, 2002, y patente de los E.U.A. No. 6,342,383 otorgada en enero 29, 2002) . Otro receptor para Apo2L/TRAIL ha sido referido como el DR5 (también ha sido referido alternativamente como Apo-2; TRAIL-R o TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 o KILLER) (ver por ejemplo, Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Pan . et al., Science, 277:815-818 (1997); W098/51793 publicada en noviembrr 19, 1998; W098/41629 publicada en septiembre 24, 1998; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 2^6:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); W098/35986 publicada en agosto 20, 1998; EP870,827 publicada en octubre 14, 1998; W098/46643 publicada en octubre 22, 1998; WO99/02653 publicada en enero 21, 1999; WO99/09165 publicada en febrero 25, 1999; W099/11791 publicada en March 11, 1999; patente de los E.U.A. No. 2002/0072091 publicada en agosto 13, 2002; patente de los E.U.A. No. 2002/0098550 publicada en diciembre 7, 2001; patente de los E.U.A. No. 6,313,269 otorgada en diciembre 6, 2001; patente de los E.U.A. No. 2001/0010924 publicada en agosto 2, 2001; patente de los E.U.A. No. 2003/01255540 publicada en julio 3, 2003; patente de los E.U.A. No. 2002/0160446 publicada en octubre 31, 2002; patente de los E.U.A. No. 2002/0048785 publicada en abril 25, 2002; patente de los E.U.A. No. 6,342,369 otorgada en febrero, 2002; patente de los E.U.A. No. 6,569,642 otorgada en mayo 27, 2003; patente de los E.U.A. No. 6,072,047 otorgada en junio 6, 2000; patente de los E.U.A. No. 6,642,358 otorgada en noviembre 4, 2003; patente de los E.U.A. No. 6,743,625 otorgada en junio 1, 2004) . Como el DR4, DR5 se ha reportado que contiene un dominio citoplasmático de muerte y puede ser capaz de señalizar la apoptosis en la unión de ligando (o en uniendo una molécula, tal como un anticuerpo agonista, el cual imita la actividad del ligando) . La estructura cristalina del complejo formado entre el Apo-2L/TRAIL y DR5 se describen en Hymowitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1999). Cuando se une el ligand, ambos DR4 y DR5 pueden disparar la apoptosis independientemente al reclutar y activar el iniciador de apoptosis, caspasa-8, a través de la molécula adaptadora que contenga-dominio-de-muerte referido como FADD/Mortl [Kischkel et al., Immunity, 12:611-620 (2000); Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000) ] . Apo2L/TRAIL también ha sido reportado que se une a aquellos receptores referidos como DcRl, DcR2 y OPG, que se cree que funciona como inhibidores, en lugar de transductores de señalización (ver por ejemplo, DCRl (también referido como TRID, LIT o TRAIL-R3) [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); y Mongkolsapaya et al., J^ Immunol . , 160 : 3-6 (1998); DCR2 (también conocido como TRUNDD o TRAIL-R4) [Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)], y OPG [Simonet et al., supra] . En contraste al DR4 y DR5, los receptores DcRl y DcR2 no señalan la apoptosis. Ciertos anticuerpos que se unen a los receptores DR4 y/o DR5 han sido reportados en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos anti-DR4 dirigido al receptor DR4 y teniendo actividad agonística o apoptotica en ciertas células de mamíferos son descritos en, por ejemplo, WO 99/37684 publicada en julio 29, 1999; WO 00/73349 publicada en julio 12, 2000; WO 03/066661 publicada en agosto 14, 2003. Ver, también, por ejemplo, Griffith et al., J. Immunol . , 162:2597-2605 (1999); Chuntharapai et al., J. Immunol . , 166:4891-4898 (2001); WO 02/097033 publicada en diciembre 2, 2002; WO 03/042367 publicada en mayo 22, 2003; W0 03/038043 publicada en mayo 8, 2003; W0 03/037913 publicada en mayo 8, 2003. Ciertos anticuerpos anti-DR5 han sido descritos de forma similar, ver por ejemplo, WO 98/51793 publicada en noviembre 8, 1998; Griffith et al., J. Immunol . , 162:2597-2605 (1999); Ichikawa et al., Nature Med., 7:954-960 (2001); Hylander et al., "An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth de Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown en SCID mice", Abstract, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, Aug . 29-Sept. 1, 2002, Banff, Alberta, Canadá; W0 03/038043 publicada en mayo 8, 2003; W0 03/037913 publicada en mayo 8, 2003. Adicionalmente, ciertos anticuerpos que tienen reactividad cruzada a ambos receptores DR4 y DR5 han sido descritos (ver por ejemplo, Patente de los E.U.A. No. 6,252,050 otorgada en junio 26, 2001) .

El antígeno CD20 (también llamado antígeno de diferenciación restringido-de-linfocito-B humano, Bp35) es una proteína hidrofóbica transmembrana con un peso molecular de aproximadamente 35 kD localizado en los linfocitos pre-B y maduro B (Valentine et al . J. Biol . Chem . 264 (19) :11282-11287 (1989); y Einfeld et al . EMBO J. 1 ( 3 ) -. 111-111 (1988)). El antígeno también se expresa en más que el 90% de la célula de B de los linfomas de no-Hodgkin' s (NHL) (Anderson et al . Blood 63 ( 6) : 1424-1433 (1984)), pero no se encuentra en células madre hematopoyéticas, células pro-B, células de plasma normal o en otros tejidos normales (Tedder et al . J. Immunol . 135(2) : 973-979 (1985)). El CD20 regula la etapa (s) temprana en el proceso de activación para el ciclo de iniciación y diferenciación del ciclo de la célula (Tedder et al . , supra ) y posiblemente funciona como un canal de ion calcio (Tedder et al . J. Cell . Biochem . 14D:195 (1990)). Dada la expresión de CD20 en las células linfoma B, este antígeno puede servir como un candidato para "hacer blanco" en tales linfomas. El anticuerpo rituximab (RITUXAN®) es un anticuerpo monoclonal humano/murino quimérico de manipulación genética dirigido contra el antígeno CD20. El rituximab es el anticuerpo llamado "C2B8" en la Patente de los E.U.A. No. 5,736,137 otorgada en abril 7, 1998 (Anderson et al . ) . RITUXAN® está indicado para el tratamiento de pacientes con recaída o bajo grado refractario o folicular, de linfoma no-Hodgkin de célula B, positivo CD20. Mecanismos de estudios de acción in vi tro han demostrado que RITUXAN® se une al complemento humano y lisa las líneas de célula B linfoides a través de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) (Reff et al . Blood 83 (2 ): 435-445 (1994); Cragg and Marlin, Blood, 103: 2738-2743 (2004). Adicionalmente, tiene una actividad significativa en ensayos para citotoxicidad de células mediadas dependientes de anticuerpos (ADCC) . Más recientemente, RITUXAN® ha mostrado tener efectos antiproliferativos en ensayos con incorporación de timidina de titulación e inducir la apoptosis directamente, mientras que otros anti-CD19 y anticuerpos CD20 no lo hacen (Maloney et al . Blood 88(10) :637a (1996)). Sinergia entre RITUXAN® y ciertas quimioterapias y toxinas también se ha observado experimentalmente. En particular, RITUXAN® sensibiliza las líneas de célula de la célula de linfoma B humana resistente a la droga a los efectos citotóxicos de doxorubicin, CDDP, VP-16, toxina de la difteria y ricina (Demidem et al . Cáncer Chemoterapy & Radiopharmaceuticals 12 (3) : 177-186 (1997)).

Estudios preclínicos in vivo han mostrado que RITUXAN® agota las células B de la sangre periférica, de los nodos linfáticos y de la medula ósea de los monos macacos, supuestamente a través de proceso complementarios y de mediación de células (Reff et al . Blood 83 (2 ): 435-445 (1994) ) . COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Métodos para usar los ligandos receptores de muerte, tales como los polipéptidos Apo-2 ligando/TRAIL o anticuerpos receptores de muerte, y los anticuerpos CD20 se proporcionan en la presente. Modalidades de la invención incluyen métodos para tratar cáncer, que comprende el exponer las células de cáncer a una cantidad efectiva de los anticuerpos Apo2L/TRAIL y CD20. Opcionalmente, las células de cáncer son expuestas a una cantidad efectiva de un anticuerpo receptor de muerte, tal como un anticuerpo agonista DR4 o un anticuerpo agonista DR5 y un anticuerpo CD20. Opcionalmente, la cantidad de anticuerpo receptor de muerte o Apo2L/TRAIL y el anticuerpos CD20 empleados en los métodos son efectivos para alcanzar una sinergia terapéuticamente, por ejemplo, su efecto combinado anti-cáncer es mayor que el efecto anti-cáncer alcanzado cuando el Apo2L/TRAIL o los anticuerpos son empleados individualmente como un agente único terapéutico. Los métodos pueden implicar su uso in vi tro o uso in vivo donde el Apo2L/TRAIL o anticuerpo receptor de muerte y el anticuerpo CD20 son administrados a un mamífero (paciente) . Opcionalmente, en los métodos, las células de cancerosas tratadas con Apo2L/TRAIL o anticuerpo receptor de muerte y el anticuerpo CD20 son células de linfoma. Adicionales modalidades de la invención se incluyen métodos para tratar una enfermedad relacionada con la inmunidad, comprendiendo el administrar a un mamífero una cantidad efectiva de Apo2L/TRAIL y un anticuerpo CD20. Opcionalmente, una cantidad efectiva del anticuerpo del receptor de muerte, tal como el anticuerpo agonista DR4 o anticuerpo agonista DR5, y el anticuerpo CD20 son administrados al mamífero. Opcionalmente, la cantidad de Apo2L/TRAIL o anticuerpo receptor de muerte y un anticuerpo CD20 empleados en los métodos son efectivos para alcanzar la sinergia terapéuticamente, por ejemplo, su efecto combinado en tratar las enfermedades relacionadas con la inmunidad es mayor que le efecto alcanzado cuando el Apo2L/TRAIL o anticuerpos son empleados individualmente como un agente terapéutico solo. Opcionalmente, en los métodos, la enfermedad relacionada con la inmunidad es artritis reumatoide o esclerosis múltiple. Métodos de la invención incluyen métodos para tratar un desorden en un mamífero, tales como una enfermedad relacionada con la inmunidad o cáncer, comprendiendo los pasos de obtener tejidos o muestras de células del mamífero, examinar el tejido o las células para la expresión de CD20, DR4, y/o DR5, y para determinar dichos tejidos o muestras de células donde se expresan dichos uno o más receptores, administrar una cantidad efectiva de Apo2L/TRAIL o anticuerpo del receptor de muerte y anticuerpo CD20 a dicho mamífero. Los pasos en los métodos para examinar la expresión de uno o más de tales receptores pueden ser conducidos en una variedad de formatos de ensayo, incluyendo ensayos para detectar la expresión de mRNA y ensayos inmunohistoquímicos . Opcionalmente, los métodos de la invención comprenden, en adición a la administración de una cantidad efectiva de Apo2L/TRAIL y/o anticuerpos receptores de muerte y anticuerpo CD20, administrar agente (s) quimioterapéutico (s) o terapia de radiación a dicho mamífero. Más modalidades de la invención están ilustradas por medio de los ejemplos en las siguientes reivindicaciones : 1. Método para tratar- células de cáncer, que comprende exponer células mamíferas cancerosas a una cantidad efectiva sinergística de un anticuerpo receptor de muerte agonista y un anticuerpo CD20. 2. El método de la reivindicación 1 donde dicho anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo monoclonal receptor anti-DR5. 3. El método de la reivindicación 1 donde dicho anticuerpo del receptor agonista muerto es un anticuerpo receptor monoclonal anti-DR4. 4. El método de la reivindicación 1 donde dichas células de cáncer se exponen a dicha cantidad efectiva sinergisticamente del anticuerpo receptor de muerte agonista y un anticuerpo CD20 in vivo . 5. El método de la reivindicación 2 o 3 donde dicho anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. 6. El método de la reivindicación 2 o 3 donde dicho anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo humano. 7. El método de la reivindicación 1 donde dicho anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo el cual reacciona de forma cruzada con más de un receptor de ligando Apo-2. 8. El método de la reivindicación 1 donde dichas células de cancerosas son células de linfoma. 9. El método de la reivindicación 1 que más adelante comprende exponer las células de cáncer a uno o más agentes inhibidores de crecimiento. 10. El método de la reivindicación 1 que comprende más adelante exponer las células a radiación. 11. El método de la reivindicación 2 donde dicho anticuerpo DR5 tiene una afinidad de unión al receptor de 108 M"1 a 1012 M"1. 12. El método de la reivindicación 1 donde dicho anticuerpo receptor de muerte y el anticuerpo CD20 están expresados en una célula huésped recombinante seleccionada del grupo que consiste de una célula CHO, célula de levadura y E . coli . 13. El método de la reivindicación 1 donde dicho anticuerpo CD20 es un anticuerpo monoclonal. 14. El método de la reivindicación 13 donde dicho anticuerpo CD20 es el anticuerpo Rituximab. 15. Un método para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inmunidad, que comprende la administrar a un mamífero cantidades efectivas sinergisticamente de un anticuerpo receptor de muerte agonista y un anticuerpo CD20. 16. El método de la reivindicación 15 donde dicho anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo receptor anti-DR5monoclonal . 17. El método de la reivindicación 15 donde dicho anticuerpo del receptor de muerte agonista es un anticuerpo receptor anti-DR4 monoclonal. 18. El método de la reivindicación 16 o 17 donde dicho anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. 19. El método de la reivindicación 16 o 17 donde dicho anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo humano. 20. El método de la reivindicación 15 donde dicho anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo el cual reacciona de forma cruzada o retícula con más de un receptor ligando Apo-2. 21. El método de la reivindicación 15 donde dicha enfermedad relacionada con la inmunidad es artritis reumatoide o esclerosis múltiple. 22. El método de la reivindicación 15 donde dicho anticuerpo DR5 tiene una afinidad de unión al receptor DR5 de 108 M"1 a 1012 M"1. 23. El método de la reivindicación 15 donde dicho anticuerpo receptor de muerte y el anticuerpo CD20 están expresados en una célula huésped recombinante seleccionada del grupo consistente de células CHO, célula de levadura y E . coli . 24. El método de la reivindicación 15 donde dicho anticuerpo CD20 es un anticuerpo monoclonal. 25. El método de la reivindicación 24 donde dicho anticuerpo CD20 es el anticuerpo Rituximab. 26. El método de la reivindicación 1 o 15 donde dicho anticuerpo receptor de muerte y el anticuerpo CD20 son administrados secuenncialmente . 27. El método de la reivindicación 1 o 15 donde dicho anticuerpo receptor de muerte y anticuerpo CD20 son administrados conjuntamente. BREBE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura ÍA muestra la secuencia nucleótido del Apo-2 humano ligando cDNA (SEQ ID NO: 2) y su secuencia deriva de aminoácidos (SEQ ID N0:1). La "N" en la posición nucleótido 447 es usada para indicar la base nucleótido puede ser "T" o "G" . Las Figuras 2A y 2B muestran la secuencia nucleótido del cDNA (SEQ ID NO: 4) para DR4 humana de longitud completa y su secuencia derivada de aminoácidos (SEQ ID NO: 3). El nucleótido respectivo y la secuencia aminoácido para el DR4 humano también han sido reportados en Pan et al., Science, 276:111 (1997). La Figura 3A muestra la secuencia de aminoácidos 411 del DR5 humano (SEQ ID NO: 5) como fue publicada en WO 98/51793 en noviembre 19, 1998. Una variante de la unión transcripcional del DR5 humano es conocida en la técnica, Esta variante de combinación del DR5 codifica la secuencia de aminoácidos 440 del DR5 humano (SEQ ID NO: 6) mostrada en las Figuras 3B y 3C como fueron publicadas en 98/35986 en agosto 20, 1998. La Figura 4 ilustra la expresión de receptores de Apo2L/TRAIL en líneas de células de linfoma B. La Figura 5 ilustra la expresión de CD20 en en líneas de células de linfoma B. La Figura 6 muestra los efectos de Apo2L/TRAIL, RITUXAN®, o tratamientos de combinación en crecimiento de injertos heterólogos de tumores de linfoma subcutáneamente BJAB pre-establecidos en ratones SCID. La Figura 7 muestra más resultados en los efectos del Apo2L/TRAIL, RITUXAN®, o un tratamiento de combinación de Apo2L/TRAIL y RITUXAN® en el crecimiento de injertos heterólogos de tumores de linfoma subcutáneamente BJAB pre-establecidos en ratones SCID. La Figura 8 muestra los efectos de Apo2L/TRAIL, RITUXAN®, o un tratamiento de combinación de Apo2L/TRAIL y RITUXAN® en el procesamiento de caspasa en injertos heterólogos de tumores de leucemia subcutáneamente BJAB pre-establecidos desarrollados en ratones SCID. La Figura 9 muestra los efectos del anticuerpo agonista DR5, RITUXAN®, o un tratamiento de combinación en le crecimiento de los injertos heterólogos de tumores de linfoma subcutáneamente BJAB ' pre-establecidos en ratones SCID.

La Figura 10 muestra los efectos del anticuerpo agonista DR5, RITUXAN®, o un tratamiento de combinación en el procesamiento de la caspasa en injertos heterologos en tumores de leucemia pre-establecidos subcutáneamente BJAB crecidos en ratones SCID.

La Figura 11 ilustra la expresión de receptores CD20 y Apo2L/TRAIL en líneas de células NHL.

La Figura 12 muestra los efectos del Apo2L/TRAIL, Rituximab, o un tratamiento de combinación en el crecimiento de injertos heterólogos de tumores ramos RAÍ pre-establecidos subcutáneamente en ratones SCID.

La Figura 13 muestra los efectos de Apo2L/TRAIL, Rituximab, o un tratamiento de combinación en el crecimiento de injertos heterologos de linfoma folicular DOHH-2 pre-establecidas en ratones SCID.

La Figura 14 ilustra los efectos y mecanismos de la muerte de las células por el Apo2L/TRAIL y Rituximab o tratamientos de combinación en las células BJAB. La Figura 15 muestra los efectos del Apo2L/TRAIL, Rituximab, o un tratamiento de combinación en el crecimiento de injertos heterologos de tumor Ramos Tl en ratones SCID. La Figura 16 muestra los efectos de Apo2L/TRAIL, Rituximab, o un tratamiento de combinación en los injertos heterologos del tumor BJAB-Luc en ratones SCID. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS A menos que de otra forma se defina, todos los términos de la especialidad, rotaciones y otras terminologías científicas utilizadas en la presente se pretende que tengan el significado comúnmente entendido para aquellos con destreza en la técnica para la cual esta invención concierne. En algunos casos, términos con significados comúnmente entendibles son definidos en la presente para claridad y/o rápida referencia, y la inclusión de tales definiciones en la presente necesariamente no deberán ser considerados que representan una diferencia substancial sobre por lo que se entiende generalmente en la técnica. Las técnicas y procedimientos descritos o referidos en la presente, son generalmente conocidos y comúnmente utilizados utilizando metodología convencional por aquellos con destreza en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Apropiadamente, procedimientos que incluyen el uso de equipos y reactivos comercialmente disponibles son generalmente llevadas a cabo de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante a menos que de otra forma se anote. Antes que se describan los presentes métodos, equipos y sus usos, habrá de entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y líneas celulares, especies de animales o géneros construcciones y reactivos descritos particulares ya que estos por supuesto pueden variar. También habrá de entenderse que la tecnología aquí empleada es con el propósito de describir solo modalidades particulares y no se pretende que limite el alcance de la presente invención, que será limitado solo por las reivindicaciones anexas. Habrá de notarse que como se emplea aquí, y en las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un", "uno/una" y "el/la" incluyen referencias en plural a menos de que el contexto claramente lo indique de otra forma. . . Todas las publicaciones aquí mencionadas incorporan por referencia para describir e ilustrar los métodos y/o materiales en conexión con los cuales se citan las publicaciones. Las publicaciones aquí citadas son por su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada aquí habrá de considerarse como una admisión, de que los inventores no tienen derecho a anteponer fecha a las publicaciones en virtud de una fecha de prioridad previa o fecha previa de la invención. Además, las fechas de publicación actuales pueden ser diferentes de aquellas mostradas y requieren verificación independiente. Definiciones Los términos "ligando APO-2", "Apo-2L", "Apo2L", "Apo2L/TRAIL", "ligando AP0-2/TRAIL" y "TRAIL", se emplean aquí en forma intercambiable para referirse a una secuencia de polipéptido que incluye residuos de aminoácidos 114-281, inclusive, 95-281, inclusive residuos 95-281, inclusive residuos 95-281, inclusive residuos 41-281, inclusive residuos 39-281, inclusive residuos 15-281, inclusive residuos 1-281, inclusive de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1, así como fragmentos biológicamente activos, variantes de eliminación, inserción o sustitución de las secuencias anteriores. En una modalidad, la secuencia de polipéptido comprende los residuos 114-281 de la Figura 1. Opcionalmente, la secuencia de polipéptidos comprende los residuos 92-281 o residuos 91-281 de la Figura 1. Los polipéptidos Apo-2L pueden ser codificados por la secuencia nucleótido nativa mostrada en la Figura 1. Opcionalmente, el codón que codifica el residuo Proll9 (Figura 1) puede ser "CCT" o "CCG'J Opcionalmente, los fragmentos o variantes son biológicamente activos si tienen al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferible al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia y aún más preferible al menos 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias anteriores. La definición abarca variantes de sustitución de ligando APO-2 en donde al menos uno de esos aminoácidos nativos, se sustituye por otro aminoácido tal como un residuo alanina. Variantes de sustitución opcional incluyen una o más de las sustituciones de residuos. Variantes opcionales pueden comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de polipéptido de ligando APO-2 de secuencia nativa de la Figura 1 y tiene una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos en la o las posiciones de residuo en la Figura 1: S96C; S101C; S111C; R170C; K179C. La definición también abarca un aislado de ligando APO-2 de secuencia nativa de la fuente de ligando APO-2 o preparado por métodos recombinantes o sintéticos. El ligando APO-2 de la invención incluye los polipéptidos referidos como ligando APO-2 o TRAIL descritos en WO97/01633 publicada en enero 16, 1997, W097/25428 publicada en julio 17, 1997, W099/36535 publicada en julio 22, 1999, WO 01/00832 publicada en enero 4, 2001, WO02/09755 publicada en febrero 7, 2002, y WO 00/75191 publicada en diciembre 14, 2000. Los términos se emplean para referirse en general a formas de ligando APO-2 que incluyen formas monómero, dímero, trímero, hexámero u oligómero superior del polipéptido. Toda la numeración de residuos aminoácidos referidos en la secuencia AP0-2L utiliza la numeración de acuerdo con la Figura 1, a menos que se establezca específicamente de otra forma. Por ejemplo " D203" o "Asp203" se refiere al residuo de ácido aspártico en la posición 203 en la secuencia que se proporciona en la Figura 1. El término "variante selectiva de ligando APO-2" como se emplea aquí, se refiere a un polipéptido ligando APO-2 que incluye una o más mutaciones de aminoácidos en una secuencia de ligando APO-2 nativo y tiene afinidad de enlace selectiva para ya sea el receptor DR4 o el receptor DR5. En una modalidad, la variante de ligando APO-2 tiene una afinidad de enlace selectivo para el receptor DR4 e incluye una o más sustituciones de aminoácidos en cualquier de las posiciones 189, 191, 193, 199, 201 o 209 de una secuencia de ligando APO-2 nativa. En otra modalidad, la variante de ligando APO-2 tiene afinidad de enlace selectiva para el receptor DR5 e incluye una o más sustituciones aminoácido en cualquiera de las posiciones 189, 191, 193, 264, 266, 267 o 269 de una secuencia de ligando APO-2 nativa. Variantes selectivas de ligando APO-2 preferidas incluyen una o más mutaciones de aminoácido y exhiben afinidad de enlace al receptor DR4 que es igual a o mayor (>) que la afinidad de enlace de la secuencia de ligando APO-2 de secuencia nativa al receptor DR4, y aún más preferiblemente, las variantes de ligando APO-2 exhiben menos afinidad de enlace (<) al receptor DR5 que la afinidad de enlace exhibida por el ligando APO-2 de secuencia nativa a DR5. Cuando la afinidad de enlace de esta variante de ligando APO-2 al receptor DR4 es aproximadamente igual (sin cambio) o mayor que (aumentada) en comparación con el ligando APO-2 de secuencia nativa, y la afinidad de enlace de la variante de ligando APO-2 al receptor DR5 es menos que o casi eliminada en comparación con el ligando APO-2 de secuencia nativa, la afinidad de enlace de la variante de ligando APO-2 para los presentes propósitos, se considera "selectiva" para el receptor DR4. Variantes de ligando APO-2 selectivas de DR4 preferidas de la invención, tendrán al menos una afinidad de enlace 10 veces menor al receptor DR5 (en comparación con el ligando APO-2 de secuencia nativa) , y aún más preferible, tendrá cuando menos 100 veces menos de afinidad de enlace al receptor DR5 (en comparación con el ligando APO-2 de secuencia nativa) . La afinidad de enlace respectiva de la variante de ligando APO-2 puede ser determinada y comparada con las propiedades de enlace del APO-2L nativo (tal como la forma 114-281) por ELISA, RÍA y/o ensayos BIAcore conocidos en la especialidad. Variantes de ligando APO-2 selectivo DR4 preferidos de la invención inducirán apoptosis en al menos un tipo de célula de mamífero (de preferencia una célula de cáncer) y esta actividad apoptósica puede determinarse por métodos conocidos en la especialidad tales como el ensayo de violeta cristal o azul alamar. Las variantes de ligando APO-2 selectivas de DR4 pueden o no tener afinidades de enlace alteradas a cualquiera de los receptores señuelo para AP0-2L, aquellos receptores señuelo referidos en la técnica como DcRl, DcR2 y OPG. Variantes selectivas de ligando APO-2 preferidas adicionales incluyen uno o más mutaciones de aminoácidos y exhiben afinidad de enlace al receptor DR5 que es igual a o mayor (>) que la afinidad de enlace de ligando APO-2 de secuencia nativa al receptor DR5 y aún más preferible, estas variantes de ligando APO-2 exhiben menos afinidad de enlace (<) al receptor DR4 que la afinidad de enlace exhibida por el ligando APO-2 de secuencia nativa a DR . Cuando la afinidad de enlace de esta variante de ligando APO-2 al receptor DR5 es aproximadamente igual (sin cambio) o mayor que (aumentada) en comparación con el ligando APO-2 de secuencia nativa, y la afinidad de enlace de la variante de ligando APO-2 al receptor DR4 es menos que o casi eliminada en comparación con el ligando APO-2 de secuencia nativa, la afinidad del enlace de la variante de ligando APO-2, para los presentes propósitos, se considera "selectiva" para el receptor DR5. Variantes de ligando de APO-2 selectivas de DR5 preferidas de la invención, tendrán cuando menos una afinidad de enlace 10 veces menor al receptor DR4 (en comparación con el ligando APO-2 de secuencia nativa) , y aún más preferible, tendrán al menos afinidad de enlace 10 veces menor al receptor DR4 (en comparación con el ligando APO-2 de secuencia nativa) . La afinidad de enlace respectiva de la variante de ligando APO-2 puede determinarse y compararse con las propiedades de enlace del APO-2L nativo (tal como la forma 114-281) por ensayos ELISA, RÍA y/o BIAcore, conocidos en la técnica. Variantes de ligando APO-2 selectivos DR5 preferidas de la invención, inducirán apoptosis en al menos un tipo de células de mamífero (de preferencia células de cáncer) , y esta actividad apoptósica puede determinarse por métodos conocidos en la técnica tales como el ensayo violeta cristal o azul alamar. Las variantes ligando APO-2 selectivas de DR5 pueden o no tener afinidad de enlace alteradas a cualquiera de los receptores señuelo para AP0-2L, aquellos receptores señuelo se refieren en la técnica como DcRl, DcR2 y OPG. Identificación de aminoácidos puede utilizar el alfabeto de una sola letra o alfabeto de tres letras de aminoácidos, es decir: Asp D Ácido aspártico lie I Isoleucina Thr T Treonina Leu L Leucina Ser S Serina Tyr Y Tirosina Glu E Ácido Glutamico Phe F Fenilalanina Pro P Prolina His H Histidina Gly G Glicina Lys K Lisina Ala A Alanina Arg R Arginina Cys C Cisteína Trp W Triptofano Val V Valina Gln Q Glutamina Met M Metionina Asn N Asparagina El término "Dominio extracelular Apo2L/TRAIL" o "Apo2L/TRAIL ECD" se refiere a una forma de Apo2L/TRAIL que está esencialmente libre de dominios tras membrana y citoplásmicos. Ordinariamente, el ECD tendrá menos de 1% de estos dominios tras membrana y citoplásmico y de preferencia tendrá menos de 0.5% de estos dominios. Se entenderá que cualquiera o cualesquiera dominios de transmembrana identificados por los polipéptidos de la presente invención se identifican de acuerdo con criterios empleados rutinariamente en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrofóbico. Las fronteras exactas de un dominio transmembrana pueden variar pero muy probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio, como se identificó inicialmente. En modalidades preferidas, el ECD consistirá de una secuencia de dominio extracelular soluble del polipéptido que está libre de los dominios de transmembrana y citoplásmico o intracelular (y no esto ligado a membrana) . Secuencias de dominio extracelular particulares de Apo2L/TRAIL se describen en las publicaciones del PCT Números WO97/01633 y W097/25428. El término "monómero AP02L/TRAIL" o "monómero AP02L" se refiere a una cadena covalente de una secuencia de dominio extracelular de AP02L. El término "dímero AP02L/TRAIL" o "dímero AP02L" se refiere a dos monómeros APO-2L unidos en un enlace covalente mediante un enlace disulfuro. El término como se emplea aquí, incluye dímero APO-2L auto sustentantes o autónomos y dímeros AP0-2L que están dentro de formas triméricas de APO-2L (es decir asociados entre sí, tercer monómero AP0-2L) .

El término "trímero AP02L/TRAIL" o "trímero AP02L" se refiere a tres monómeros AP0-2L que están asociados en forma no covalente. El término "agregado AP02L/TRAIL" se emplea para referirse a formas oligoméricas superiores auto asociadas de AP02L/TRAIL tales como trímeros AP02L/TRAIL, que forman por ejemplo formas hexamérica y nanomérica de AP02L/TRAIL. Determinación de la presencia y cantidad de monómero, diméro, trímero AP02L/TRAIL (u otros agregados) pueden realizarse utilizando métodos y ensayos conocidos en especialidad (y utilizando materiales comercialmente disponibles) tales como HPLC de exclusión de tamaño nativo ("SEC"), exclusión de tamaño con desnaturalización utilizando dodecil sulfato de sodio ("SDS-SEC"), HPLC de fase inversa y electroforésis capilar. "Receptor de ligando Apo-2" incluye los receptores referidos en la técnica como "DR4" y "DR5" cuyas secuencias polinucleótido y polipéptido se ilustran en las Figuras 2 y 3, respectivamente. Pan et al. han descrito el miembro de familia receptor TNF referido como "DR4" (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997) ver también W098/32856 publicada en julio 30, 1998; WO 99/37684 publicada en julio 29, 1999; WO 00/73349 publicada en diciembre 7, 2000; la patente de los E.U.A.

Número 6,433,147 otorgada en agosto 13, 2002, la patente de los E.U.A. Número 6,461,823 otorgada en octubre 8, 2002 y la patente de los E.U.A. Número 6,342,383 otorgada en enero 29, 2002. Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) y Pan et al., Science, 277:815-818 (1997) describen otro receptor para AP02L/TRAIL (ver también W098/51793 publicada en noviembre 19, 1998; W098/41629 publicada en septiembre 24, 1998) . Este receptor se refiere como DR5 (el receptor también se ha referido en forma alterna como APO-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 o KILLER; Screaton et al., Curr. Biol. , 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17: 141-143 (1997), W098/35986 publicada en agosto 20, 1998; EP870,827 publicada en octubre 14, 1998; W098/46643 publicada en octubre 22, 1998; WO99/02653 publicada en enero 21, 1999, WO99/09165 publicada en febrero 25, 1999, W099/11791 publicada en marzo 11, 1999, patente de los E.U.A. Número 2002/0072091 publicada en agosto 13, 2002, patente de los E.U.A. Número 2002/0098550 publicada en diciembre 7, 2001, patente de los E.U.A. Número 6,313,269 otorgada en diciembre 6, 2001, patente de los E.U.A. Número 2001/0010924 publicada en agosto 2 , 2001, patente de los E.U.A. Número 2003/01255540 publicada en julio 3, 2003, patente de los E.U.A. Número 2002/0160446 publicada en octubre 31, 2002, patente de los E.U.A. Número 2002/0048785 publicada en abril 25, 2002, patente de los E.U.A. Número 6,569,642 expedida en mayo 27, 2003, patente de los E.U.A. Número 6,072,047 expedida en junio 6, 2000, patente de los E.U.A. Número 6,642,358 expedida en noviembre 4, 2003). Como se describió anteriormente, otros receptores para Apo-2L incluyen DcRl, DcR2 ( ver Sheridan et al., supra; Marsters et al., supra; and Simonet et al.,- supra) . El término "receptor APO-2L" cuando se emplea aquí abarca receptor de secuencia nativa y variantes de receptor. Estos términos abarcan receptor APO-2L expresado en una variedad de mamíferos incluyendo humanos. Receptor APO-2L puede ser expresado en forma endógena como ocurre naturalmente en una variedad de linajes de tejido humano, o puede ser expresado por métodos recombinantes o sintéticos. "Un receptor APO-2L de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el receptor APO-2L derivado de la naturaleza. De esta manera, el receptor APO-2L de secuencia nativa puede tener la secuencia aminoácidos del receptor APO-2L de origen natural de cualquier mamífero. Este receptor APO-2L de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término "receptor AP0-2L de secuencia nativa" abarca específicamente formas de origen natural truncadas o secretadas del receptor (por ejemplo una forma soluble que contiene por ejemplo una secuencia de dominio extracelular) , formas variantes de origen natural (por ejemplo formas combinadas de manera alterna) y variantes alélicas de origen natural. Variantes de receptor pueden incluir fragmentos o mutantes de eliminación del receptor APO-2L de secuencia nativa. La Figura 3a muestra la secuencia de 411 aminoácidos de DR5 humano como se publica en WO 98/51793 en noviembre 19, 1998. Una variante de combinación transcripcional de DR5 humano se conoce en la técnica. Esta variante de combinación DR5 codifica la secuencia de 440 aminoácidos de DR5 humano ilustrada en las Figuras 3b y 3c como se publica en WO 98/35986 en agosto 20, 1998. "Anticuerpo receptor de muerte" se emplea aquí para referirse en general a anticuerpo o anticuerpos dirigidos a un receptor en la super familia de receptor de factor de necrosis de tumor y contienen un dominio de muerte capaz de señalar apoptosis y estos anticuerpos incluyen el anticuerpo DR5 y anticuerpo DR4. "Anticuerpo receptor DR5", "anticuerpo DR5", o "anticuerpo anti-DR5", se emplean en amplio sentido para referirse a anticuerpos que ligan a cuando menos una forma de un receptor DR5 o sus dominio extracelular. Opcionalmente, el anticuerpo DR5 se fusiona o enlaza a una secuencia heteróloga o molécula. De preferencia, la secuencia heteróloga permite o ayuda al anticuerpo para formar complejos de orden superior u oligoméricos. Opcionalmente, el anticuerpo DR5 liga al receptor DR5 pero no liga, retícula o reacciona en forma cruzada con ningún receptor APO-2L adicional (DR4, DcRl, o DcR2 ) . Opcionalmente, el anticuerpo es un agonista de una actividad de señalización de DR5. Opcionalmente, el anticuerpo DR5 de la invención liga a un receptor DR5 en un rango de concentración de aproximadamente 0.1 nM a aproximadamente 20 mM, como se mide en el ensayo de enlace BIAcore. Opcionalmente, los anticuerpos DR5 de la invención exhiben un valor IC50 de aproximadamente 0.6 nM a aproximadamente 18 mM, como se mide en un ensayo de enlace BIAcore. "Anticuerpo receptor DR4", "anticuerpo DR4" or "anticuerpo anti-DR4" se emplea en un amplio sentido para referirse a anticuerpos que ligan a cuando menos una forma de un receptor DR4 o su dominio extracelular.

Opcionalmente, el anticuerpo DR4 se fusiona o enlaza a una secuencia o molécula heteróloga. De preferencia, la secuencia heteróloga permite o ayuda al anticuerpo para formar complejos de orden superior u oligoméricos. Opcionalmente, el anticuerpo DR4 liga al receptor DR4 pero no liga, retícula o reacciona en forma cruzada con cualquier receptor APO-2L adicional (por ejemplo DR5, DcRl, o DcR2 ) . Opcionalmente, el anticuerpo es un agonista de actividad de señalización DR4. Opcionalmente, el anticuerpo DR4 de la invención liga a un receptor DR4 a un rango de concentración de aproximadamente 0.1 nM hasta aproximadamente 20 mM medido en un ensayo de enlace BIAcore. Opcionalmente, los anticuerpos DR5 de la invención exhiben un valor IC50 de aproximadamente 0.6 nM a aproximadamente 18 mM, como se mide en un ensayo de enlace BIAcore. El término "agonista" se emplea en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que mejore, estimule o active parcial o completamente una o más actividades biológicas de Apo2L/TRAIL, DR4 o DR5, in vi tro, in si tu, o in vivo . Ejemplos de estas actividades biológicas que enlazan Apo2L/TRAIL con DR4 o DR5, incluyen apoptosis así como aquellas adicionalmente reportadas en la literatura. Un agonista puede funcionar en una forma directa o indirecta. Por ejemplo, el agonista puede funcionar para mejorar, estimular o activar parcial o completamente una o más actividades biológicas de Apo2L/TRAIL con DR4 o DR5, in vi tro, in si tu, o in vivo como resultado de su enlace directo a DR4 o DR5, que provoca activación de receptor o trascripción de señal. El agonista también puede funcionar indirectamente para mejorar, estimular o activar parcial o completamente una o más actividades biológicas de DR4 o DR5, in vi tro, in si tu, o in vivo como resultado por ejemplo de estimular otra molécula efectora que después provoca activación o transducción de señal del DR4 o del DR5. Habrá de contemplarse que un agonista puede actuar como una molécula mejoradora que funciona indirectamente para mejorar o incrementar la activación o actividad del DR4 o DR5. Por ejemplo, el agonista puede mejorar actividad de APO-2L endógeno en un mamífero. Esto puede lograrse, por ejemplo al pre-complejar DR4 o DR5 o por estabilización de complejos del ligando respectivo con el receptor DR4 o DR5 (tal como estabilizar complejo nativo formado entre Apo2L/TRAIL y DR4 o DR5) . El término "DR4" y "receptor de DR4" como se emplea aquí, se refiere a formas de dominio extracelular de longitud íntegra y solubles de receptor descritas en Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); W098/32856 publicada en julio 30, 1998; patente de los E.U.A. Número 6,342,363 otorgada en enero 29, 2002; y W099/37684 publicada en julio 29, 1999. La secuencia de aminoácidos de longitud íntegra del receptor DR4 se proporciona aquí en la Figura 2. El término "DR5" o "receptor DR5" como se emplea aquí, se refiere a las formas de dominio extracelular de longitud íntegra y solubles del receptor descrito por Sheridan et al., Science, 277: 818-821 (1997) patente de los E.U.A. Número 6,072,047 otorgada en junio 6, 2000; patente de los E.U.A. Número 6,342,369, W098/51793 publicada en noviembre 19, 1998; W098/41629 publicada en septiembre 24, 1998; Screaton et al., Curr. Biol. , 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 3^:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); W098/35986 publicada en agosto 20, 1998; EP870,827 publicada en octubre 14, 1998; W098/46643 publicada en octubre 22, 1998; WO99/02653 publicada en enero 21, 1999; WO99/09165 publicada en febrero 25, 1999; W099/11791 publicada en marzo 11, 1999. El receptor DR5 también se ha referido en la técnica como APO-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 o KILLER. El término DR5 aqui empleado incluye el polipéptido de 411 aminoácidos de longitud integral que se proporciona en la Figura 3A y el polipéptido de 440 aminoácidos de longitud íntegra que se proporciona en las Figuras 3B-C. El término "poliol" cuando aquí se emplea se refiere ampliamente a compuestos de alcohol polihídrico. Polioles pueden ser cualquier polímero poli (alquilen óxido) soluble en agua por ejemplo y pueden tener una cadena lineal o ramificada. Polioles preferidos incluyen aquellos sustituidos en una o más posiciones hidroxilo con un grupo químico tal como un grupo alquilo que tiene entre uno y cuatro átomos de carbono. Típicamente, el poliol es un poli (alquilen glicol) de preferencia poli (etilen glicol) (PEG). Sin embargo, aquellos con destreza en la técnica reconocen que otros polioles tales como por ejemplo poli (propilen glicol) y copolímeros de polietilen-polipropilen glicol, pueden emplearse utilizando las técnicas para conjugación aquí descritas para PEG. Los polioles de la invención incluyen aquellos bien conocidos en la técnica y aquellos públicamente disponibles, tales como de fuentes comercialmente disponibles . El término "conjugado" se emplea aquí de acuerdo con su definición más amplia para significar que están unidos o enlazados en conjunto. Moléculas se "conjugan", cuando actúan u operan como si estuvieran unidas . El término " dominio extracelular" o "ECD" se refiere a una forma de ligando o receptor que esencialmente está libre de dominios transmembrana y citoplásmico. Ordinariamente, el ECD soluble tendrá menos de 1% de estos dominios transmembrana y citoplásmico y de preferencia tendrá menos de 0.5% de estos dominios. El término "ion de metal divalente" se refiere a un ion de metal que tiene dos cargas positivas. Ejemplos de iones de iones divalentes para utilizar en la presente invención, incluyen pero no están limitados a zinc, cobalto, níquel, cadmio, magnesio y manganeso. Formas particulares de estos metales que pueden emplearse incluyen formas sal (por ejemplo formas de sal farmacéuticamente aceptables), tales como formas cloruro, acetato, carbonato, citrato y sulfato de los iones de metales divalentes anteriormente mencionados. Iones de metales divalentes como aquí se describe, se emplean de preferencia en concentraciones o cantidades (por ejemplo cantidades efectivas) que son suficientes por ejemplo para (1) mejorar la estabilidad en almacenamiento de trímeros Apo-2L sobre un periodo de tiempo deseado, (2) mejorar la producción o rendimiento de trímero Apo-2L en un cultivo de células recombinantes o método de purificación, (3) mejorar la solubilidad (o reducir la agregación) de trímeros Apo-2L o (4) mejorar la formación de trímero Apo-2L. "Aislado" cuando se emplea para describir las diversas proteínas aquí descritas, significa proteína que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que típicamente interfieren con usos de diagnóstico o terapéuticos para la proteína, y pueden incluir enzimas hormonas y otros solutos proteináceos y no proteináceos. En modalidades preferidas, la proteína será purificada (1) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos interna o N-terminal por el uso de un secuenciador de copa de centrifugado o (2) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o de preferencia tinción con plata. Proteina aislada incluye proteína in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del ambiente natural de la proteína no estará presente. De manera ordinaria sin embargo, la proteína aislada se preparará por al menos una etapa de purificación. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico de ligando Apo-2 aislada, es diferente en el ambiente en el que se encuentra en la naturaleza. Moléculas de ácido nucleico de ligando Apo-2 aisladas, por lo tanto se distinguen de la molécula de ácido nucleico ligando Apo-2 como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico de ligando Apo-2 aislada incluye moléculas de ácido nucleico de ligando Apo-2 contenidas en células que expresan ordinariamente ligando Apo-2 en donde por ejemplo la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosomal diferente a la de las células naturales . "Por ciento (%) de identidad de secuencia de amino ácidos" respecto a la secuencias aquí identificadas, se definen como el porcentaje de residuos aminoácido en una secuencia de candidato, que son idénticos con los residuos aminoácidos en la secuencia de ligando Apo-2, después de alinear las secuencias e introducir separaciones o espacios, de ser necesario para lograr el máximo por ciento de identidad de secuencia y sin considerar ningunas sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. Alineamiento para propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia aminoácidos puede lograrse en diversas formas que están dentro de la destreza en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir alineamiento, incluyendo asignar algoritmos requeridos para lograr máximo alineamiento sobre las secuencias de longitud íntegra comparada. Para los presentes propósitos, valores de por ciento de identidad de aminoácidos pueden obtenerse utilizando el programa de computadora para comparación de secuencias ALIGN-2 del cual es autor Genentech, Inc., y el código fuente del cual se ha presentado con documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los E.U.A. (US Cover Right Office), Washigton, DC, 20559, registrada bajo el Registro de Derechos de Autor de los E.U.A. Número TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible a través de Genentech, Inc, South San Fransisco, CA. Todos los parámetros de comparación de secuencias se ajustan por el programa ALIGN-2 y no varían. El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de DNA necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada operativamente a un organismo anfitrión particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de enlace de ribosoma. Células eucarióticas se conoce que utilizan promotores, señales de poliadenilación y mejoradores. Ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con ' otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, DNA para un líder de pre-secuencia o secretorio se enlaza operativamente a DNA para un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador se enlaza operativamente a una secuencia de codificación si afecta la trascripción de la secuencia; o un sitio de enlace de ribosoma se enlaza operativamente a una secuencia de codificación si se ubica de manera tal que facilite la traducción. En general, "enlazado operativamente" significa que las secuencias de DNA que se enlazan con contiguas y en el caso de un líder secretorio, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los mejoradores no tienen que ser contiguos. El enlace se logra al ligar en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores oligonucleótidos sintéticos se emplean de acuerdo con la práctica convencional . Una "célula B" es un linfocito que madura dentro de la médula ósea e incluye una célula B sin tratamiento previo, célula B de memoria, o células B efectoras (células de plasma). La presente célula B puede ser una célula B normal o no maligna. El antígeno "CD20" es una fosfoproteína no glicosilada de 35 kDa, que se encuentra en la superficie de más de 90% de células B de sangre periférica u órganos linfoides. CD20 está presente tanto en células B normales como en células B malignas pero no se expresa en células madre. Otros nombres para CD20 en la literatura incluyen "antígeno restringido por linfocito B" y "Bp35" el antígeno CD20 se describe por Clark et al . PNAS (USA) 82:1766 (1985), por ejemplo. Ejemplos de anticuerpos que ligan el antígeno CD20 incluyen: "C2B8" que ahora se denomina "Rituximab" ("RITUXAN®") (patente de los E.U.A. Número 5,736,137); el anticuerpo murino 2B8 etiquetado con Itrio- [90] designado "Y2B8" o "Ibritumomab Tiuxetan" ZEVALINMR comercialmente disponible de Idee Pharmaceuticals, Inc. (patente de los E.U.A. Número 5,736,137; 2B8 depositado con ATCC bajo el número de acceso HB11388 en junio 22, 1993; IgG2a "Bl" murino también denominado "Tositumomab" opcionalmente etiquetado con 131I para generar el anticuerpo "131I-B1" (tositumomab yodo 1131, BEXXARMR) comercialmente disponible de Corixa (ver también patente de los E.U.A. Número 5,595,721); anticuerpo monoclonal murino "1F5" (Press et al . Blood 69 (2 ): 584-591 (1987)) y sus variantes incluyendo "parchado de cuadro" o IF5 humanizado (WO 2003/002607, Leung, ATCC Depósito HB-96450); anticuerpo 2H7 murino y 2H7 quimérico (patente de los E.U.A. Número 5,677,180); 2H7 humanizado; anticuerpo de alta afinidad, totalmente humano HUMAX-CD20MR dirigido a la molécula CD20 en la membrana celular de células B (Genmab, Dinamarca; por ejemplo Glennie and van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) y Cragg et al . , Blood 101: 1045-1052 (2003)); los anticuerpos monoclonales humanos establecidos en WO04/035607 (anticuerpos AME-133™) (Applied Molecular Evolution) ; anticuerpo A20 o sus variantes tal como anticuerpo A20 quimérico o humanizado (cA20, hA20, respectivamente) (patente de los E.U.A.

Número 2003/0219433, Immunomedics) ; son anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl o NU-B2 disponibles de International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al . , In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)). Los anticuerpos CD20 preferidos aquí, son anticuerpos CD20 quiméricos humanizados o humanos, mas preferiblemente rituximab, 2H7 humanizado, anticuerpo A20 quimérico o humanizado (Immunomedics) y anticuerpo CD20 humano HUMAX-CD20MR (Genmab) . Los términos "rituximab" o "RITUXAN®" aquí se refieren al anticuerpo monoclonal humano/murino quimérico de . ingeniería genética dirigido contra el antígeno CD20 y designado "C2B8" en la patente de los E.U.A. Número 5,736,137, incluyendo sus fragmentos que retiren la habilidad para ligar CD20. Puramente para los presentes propósitos y a menos que se indique de otra forma "2H7 humanizado" se refiere a un anticuerpo CD20 humanizado o su fragmento de enlace antígeno, en donde el anticuerpo es efectivo para agotar células B de primate in vivo, el anticuerpo comprende la región variable de cadena H (VH) del mismo, al menos una secuencia CDR H3 de un anticuerpo CD20 antihumano y sustancialmente los residuos de marco (FR) de consenso humano del subgrupo III de cadena pesada humana (VHIII) . Un 2H7 humanizado preferido es un anticuerpo intacto o fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de cadena ligera variable: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR ( SEQ I D NO : ) ; y la secuencia de cadena pesada variable: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGD TSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO: 8). Cuando el anticuerpo 2H7 humanizado es un anticuerpo intacto, de preferencia comprende la secuencia aminoácidos de cadena ligera: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 9); y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGD TSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:10) o la secuencia de aminoácidos de cadena pesada: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGD TSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11) . "Citotoxicidad . mediada-por-células-dependientes-de-anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células, en donde células citotóxicas no específicas que expresan receptores FC (FcRs) (por ejemplo células destructoras naturales) (NK=Natural Killer), neutrofilos y macrófagos) reconocen antígeno ligado en una célula diana y subsecuentemente provocan lisis de la célula diana. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresar Fc?lII solo, mientras que monocitos expresan Fc?RI, Fc?RII y Fc?RIII.

La expresión FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu.

Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para estimar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo ADCC ín vi tro tal como el descrito en las patentes de los E.U.A. Números 5,500,362 o 5,821,337. Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC = Peripheral Blood Mononuclear Cells) y células destructoras naturales (NK) . En forma alterna o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede estimarse in vivo, por ejemplo en un modelo de animal tal como aquel • descrito en Clynes et al . PNAS (USA) 95:652-656 (1998). "Células .efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. De preferencia, las células expresan al menos Fc RUI y llevan a cabo funciones efectoras ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células destructoras naturales (NK=Natural Killers) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; con PBMCs y células NK preferidos. Los términos "receptores Fc" o "FcR" se emplean para describir un receptor que liga a la reacción Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Aún más, un FcR preferido es aquel que liga un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases Fc Rl , Fc RII, y Fc RUI, incluyendo variantes alélicas y formas combinadas alternas de estos receptores. Los receptores Fc RII incluyen Fc RIIA (un "receptor de activación") y Fc RIIB un ("receptor de inhibición") que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren primordialmente en sus dominios citoplásmicos. Receptor de activación Fc RIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunoreceptor (ITAM=Inmunoreceptor tyrosin-based activation motif) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición Fc RIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmunoreceptor (ITIM=inmunoreceptor tyrosine-based inhibition) en su dominio citoplásmico. Ver Daéron, Annu . Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)). FcRs se revisan por Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Ipmunol 9:457-92 (1991); Capel et al . , Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al . , J. Lab . Clin . Med. 126:330-41 (1995) . Otros FcRs incluyendo aquellos a identificarse en el futuro, están abarcados por el término "FcR" presente. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn que es responsable por la transferencia IgGs maternales alternos al feto (Guyer et al . , J. Im unol . 117:587 (1976) and Kim et al . , J. Immunol . 24:249 (1994)). FcRs aquí incluyen polimorfismos tales como el dimorfismo genético en el gen que codifica Fc RlIIa que resulta ya sea en una fenilalanina (F) o una valina (V) en la posición aminoácido 158, ubicada en la región del receptor que liga a IgGl . La valina homocigota Fc RlIIa (Fc RIIIa-158V) se ha mostrado que tiene superior afinidad para IgGl humano y media ADCC incrementada in vi tro respecto a fenilalanina homocigota Fc RlIIa (Fc RIIIa-158F) o receptores heterocigotos (Fc RlIIa- 158F/V) . "Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para lisar una diana en la presencia de complemento. La ruta de activación de complemento se inicia por el enlace del primer componente del sistema de complemento (Clq) a una molécula (por ejemplo un anticuerpo) complej ada con un antígeno conato. Para estimar activación de complemento, puede realizarse un ensayo CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al . , J. Immunol . Methods 202:163 (1996) . El término "anticuerpo" aquí se emplea en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmento de anticuerpos siempre que exhiban la actividad biológica deseada.

"Fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de anticuerpo intacto, que de preferencia comprende su región variable o de enlace de antígeno. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadenas sencillas; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos . "Anticuerpos nativos" usualmente son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se enlaza con una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tienen puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por una cantidad de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio varibale de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Residuos aminoácidos particulares se considera que forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables, difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y se emplean en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones marco (FRs) . Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas cada uno comprenden cuatro FRs, sustancialmente adoptando una configuración de hoja , conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan y algunos casos forman parte de la estructura de hoja Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen unidas en proximidad inmediata por los FRs y con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antígeno de la de anticuerpos (ver Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no están involucrados directamente en el enlace de un anticuerpo de antígeno pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADDC) . La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de enlace antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de enlace antígeno sencillo, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. Tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tienen dos sitios de enlace de antígeno y todavía es capaz de entrelazar o reticular antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de antígeno completo y enlace de antígeno. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y de cadena ligera en asociación no covalente, cerrada. Es en ésta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir in sitio de enlace antígeno en la superficie del dímero VH-VL Colectivamente, las 6 regiones hipervariables, confían en especificidad de enlace antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable sencillo (o la mitad de un Fv comprende solo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tienen la capacidad para reconocer y ligar antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio de enlace completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Fragmentos Fab' difieren de fragmentos Fab por la adición de unos cuantos residuos en el extremo carboxi del dominio de cadena pesada CH1 incluyendo uno o más citeínas de la región bisagra de anticuerpos. F(ab')2 es la designación aquí para Fab' en donde el o los residuos cisteína de los dominios constantes contienen al menos un grupo tiol libres. Fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos también se conocen. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos denominados capa ( ) y lamda ( ) con base en la secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes . Dependiendo de la secuencia aminoácido de dominio constante de sus cadenas pesadas, pueden asignar anticuerpos a diferentes clases. Hay 5 clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de estas además pueden ser divididas en subclases (isotipos), por ejemplo IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgA, y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan , , , , y respectivamente. Las estructuras subunitarias y configuraciones tridimencionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Fragmentos de anticuerpo "Fv de cadenas sencilla" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipéptido. De preferencia, polipéptido Fv además comprende un enlazador polipéptido entre los dominios VH y VL que permiten a scFv formar la estructura deseada para enlace antígeno. Para una revisión de scFv ver Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de enlace antígeno, estos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipéptido (VH -VL) . Al utilizar un enlazador que es muy corto para permitir aparear entre estos dos dominios en la misma cadena, los dominios se forzan para aparear con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace antígeno. Los diacuerpos se describan más completamente por ejemplo en EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al . , Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993) . El término "anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpo sustancialmente homogéneo, es decir dos anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones de origen natural posibles que pueden estar presentes en cantidades menores. Anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que sintetizan por el cultivo de hibridoma, sin contaminar por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no habrá de considerarse que requiere producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse por el método de hibridoma primero descrito por Kohier et al . , Na ture, 256:495 (1975) o pueden elaborarse por métodos de DNA recombinante (ver por ejemplo la patente de los E.U.A. Número 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpo fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al . , Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al . , J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991), por ejemplo . Los anticuerpos monoclonales aquí específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas es o son idénticas u homologas con las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo así como fragmentos de estos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente de los E.U.A. Número 4,816,567; Morrison et al . , Proc . Na ti . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)). Anticuerpos quiméricos de interés aquí incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de enlace antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo mono del viejo mundo tales como mandril, resus o mono macaco), y secuencias de región constante humanas (patente de los E.U.A. Número 5,693, 780) Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) . son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina humana. En su mayoría, anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en donde residuos de una región hipervariable del recipiente se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón rata conejo o primate no humano que tienen las deseadas especificidad afinidad y capacidad. En algunos casos, residuos de región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo recipiente o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para reasignar adicionalmente el desempeño de anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables en donde todo o sustancialmente todo de los bucles hipervariables corresponden aquellos de una inmunoglobulina no humana y todo sustancialmente todos los Frs son aquellos de una secuencia inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá cuando menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para adicionales detalles, ver Jones et al . , Na ture 321:522-525 (1986); Riechmann et al . , Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op . Struct . Biol . 2:593-596 (1992). El término "región hipervariable" cuando se utiliza aquí se refiere a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que son responsables para enlace antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región de determinación de complementaridad" o "CDR" (por ejemplo los residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al . , Sequences of Proteins of Im unological Interest, 5ch Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD . (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo los residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia and Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)) . Residuos "marco" o "Fr" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como aquí se define. Un anticuerpo "que liga" es un antígeno de interés, por ejemplo CD20 o DR4 o DR5 , es aquel capaz de ligar ese antígeno con suficiente afinidad y/o avidez de manera tal que el anticuerpo sea útil como un agente terapéutico para hacer diana en una célula que expresa el antígeno. Para los presentes propósitos "inmunoterapia" se referirá a un método para tratar un mamífero (de preferencia un paciente humano) con un anticuerpo, en donde el anticuerpo puede ser un anticuerpo no conjugado o "desnudo", o el anticuerpo puede conjugarse o fusionarse con la o las moléculas o agentes heterólogos tales como uno o más agentes citotóxicos, generando de esta manera una "inmunoconjugado". dix36a40g dix36a40g Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirán con usos de diagnóstico o terapéuticos para el antagonista o anticuerpo, y puede incluir encimas u hormonas y otros solutos proteinaceos o no-proteinaceos . En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más de 95% en peso de anticuerpo como se determina por el método Lowry, y más preferiblemente más de 99% en peso, (2) en un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos interna o N-terminal por el uso de un secuenciador de copa de centrifugado, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o de preferencia tinción de plata. Anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in si tu dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo se preparará anticuerpo aislado por al menos una etapa de purificación. La expresión "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad del Apo2L/TRAIL o anticuerpo receptor de muerte y el anticuerpo CD20 que es efectivo para evitar, mejorar o tratar la enfermedad o condición en cuestión. El término "agente inmunosupresor" como se emplea aquí para terapia auxiliar se refiere a sustancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmune del mamífero que se trata. Esto incluirá sustancias que suprimen producción de citosina, reducción de la expresión o suprimir la expresión de auto-antígeno, o enmascarar los antígenos MHC. Ejemplos de estos agentes incluyen pirimirinas 2-aminos-6-aril-5-sustituidas (ver patente de los E.U.A. Número 4,665,077, la descripción de la cual aquí se incorpora por referencia) ; drogas antiflamatorias no esteroidales (NSAIDs=Non Esteroidal Antiflamatory Drugs); aciatioprina; ciclofosfomida; bromocriptina; danasol; dapsona, gluteral de ido (que enmascara los antígenos MHC, como se describe en la patente de los E.U.A. Número 4,120,649); anticuerpos anti-ideotípicos para antígenos MHC y fragmentos MHC; ciclosporina A; esteroides tales como glucocorticoesteroides, por ejemplo prednisona metilprednisolona, dexametosona e hidrocortizona; metotrexato (oral o subcutáneo) ; hidroxi cloroquina; sulfasalasina; leflunomida; citosina o antagonistas de receptores citosina incluyendo anticuerpos antinterferona ?, ß, o a, anticuerpos de factor de necrosis anti-tumor (inflemab o adalumimab) inmunoadhesina anti-TNF (etanercept) , anticuerpo de factor - ß de necrosis anti- tumor, anticuerpos de anti-interleucina-2 y anticuerpos de receptor a anti-IL-2; anticuerpos anti-LFA-1; incluyendo anticuerpos anti-C/CDlla y anti-CD18; anticuerpos anti-L3T4; globulina antilinfocitos heteróloga; anticuerpos pan-T, de preferencia anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; péptido soluble que contiene un dominio de enlace LFA-3 (WO 90/08187 publicada en 7/26/90) ; extreptocinasa; TGF- ß; extreptodornasa; RNA o DNA del anfitrión; FK506; RS-61443; deoxiespergualina; rapamicina; receptor de célula T (Cohén et al . , patente de los E.U.A. Número 5,114,721); fragmentos receptores de células T (Offner et al . , Science, 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway, Na ture, 341: 482 (1989); y WO 91/01133); y anticuerpos receptores de células T (EP 340,109) tales como T10B9. El término "agente citotóxico" como se emplea aqui, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de células y/o o provoca destrucción de células, el término se pretende que incluye isótopos radioactivos (por ejemplo At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano fungal de plantas o animales o sus fragmentos . "Actividad sinergística" o "sinergia" o "efecto sinergístico" o "cantidad sinergística efectiva" para los presentes propósitos significan que el efecto observado o cuando se emplean una combinación de Apo2L/TRAIL o anticuerpo receptor de muerte y anticuerpo CD20 es (1) mayor que el efecto logrado cuando Apo2L/TRAIL, anticuerpo receptor de muerte o anticuerpo CD20 se emplea solo (o individualmente) y (2) mayor que el efecto de suma -agregada (aditivo) parece Apo2L/TRAIL o anticuerpo receptor de muerte y anticuerpos CD20. Esta sinergia o efectos sinergístico puede determinarse durante una variedad de medios conocidos por aquellos con destreza en la técnica. Por ejemplo, el efecto sinergístico de Apo2L/TRAIL o anticuerpo receptor de muerte y anticuerpos CD20 puede observarse en formatos de ensayo in vi tro o in vivo que examinan reducción de número de células de tumor o masa de tumor. Los términos "apoptosis" y "actividad apoptósica" se emplean en un amplio sentido y se refieren a la forma ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que se acompaña típicamente por una o más cambios de células características, incluyendo condensación de citoplasma, pérdida de micro-vellos de membrana de plasma, segmentación del núcleo, declaración de DNA cromosomal o pérdida de función mitocondrial. Esta actividad puede determinarse y medirse utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo por ensayos de viabilidad celular, análisis FACS o electroforesis de DNA, ligar anexina V, fragmentación de DNA, encogimiento de células, dilatación de retícula endoplásmico, fragmentación de células y/o formación de vesículas de membrana (denominadas cuerpos apoptósicos ) . Ensayos que determinan la capacidad de un anticuerpo (por ejemplo Rituximab) para inducir apoptósis se han descrito en Shan et al . Cáncer Immunol Immunther 48:673-83 (2000); Pedersen et al . Blood 99:1314-9 (2002); Demidem et al . Cáncer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12 (3) : 177-186 (1997), por ejemplo. Los términos "cáncer", "canceroso", y "maligno" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que es típicamente caracterizada por crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a carcinoma incluyendo aderocarcinoma, linfoma, blastoma, melanoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de estos cánceres incluyen cáncer de célula escamosa, cáncer pulmonar de célula pequeña, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer gastrointestinal, linfoma de Hodgkin y no-Hodgkin, cáncer pancreático, glioblastoma, glioma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado tal como carcinoma hepático y hepatoma, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial, mieloma (tal como mieloma múltiple ) , carcinoma de glándula cerebral, cáncer de riñon tal como carcinoma de células renales y tumor de Wilms, carcinoma de células vasales, melanoma, cáncer de próstata, cáncer vulbar, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer esofágico, y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. El término "enfermedad relacionada inmune" significa una enfermedad en donde un componente del sistema inmune de un mamífero provoca, media o de otra forma contribuye a una morbidez en el mamífero. También se incluyen enfermedades en las que el estímulo o intervención de la respuesta inmune tiene un efecto mejorador en el progreso de la enfermedad. Incluidas dentro de este término se encuentran enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias e inmunomediadas, enfermedades inflamatorias no inmunomediadas, enfermedades infecciosas y enfermedades de inmunodeficiencias . Ejemplos de enfermedades inmunorelacionadas e inflamatorias, algunas de las cuales son inmunomediadas o mediadas por células T, que pueden tratarse de acuerdo con la invención, e incluyen lupus sistémico heritematoso, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, espodiloartropatías, esclerosis sistémica (escleroderma) miopatías inflamatorias ideopáticas (dermatomeositis, poliomesitis) , síndrome de Sjogren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia neomolítica autoinmune (pancitoperinmune) , hemoglobinuria paroxismal nocturna (trombocitopenia autoinmune púrpura trombocitopénica ideopática, trombocitopenia inmunomediada) , tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroi'ditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica) diabetes melitus, enfermedad renal inmunomediada (glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial) , enfermedades desmielinantes de los sistemas nerviosos central y periférico tales como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinante ideopática o síndrome de Guillain Barré y polineuropatía desmielinante inflamatoria crónica, enfermedades hepatomiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotróficos) , hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa, y colangitis esclerosante, enfermedades pulmonares inflamatorias y fibrósicas tales como enfermedad intestinal inflamatoria (colitis ulcerativa: enfermedad de Crohn), enteropatías sensible a gluten y enfermedad de Whipple, enfermedades de la piel inmunomediadas o autoinmunes incluyendo enfermedades de piel bulosa, heritema multiforme y dermatitis de contacto, soriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad de alimentos y urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón tales como neomunías eosinofílicas, fibrosis pulmonar ideopática y neumonitis de hipersensibilidad, enfermedades asociadas con transplante incluyendo rechazo de injerto y enfermedad de injerto-contra-anfitrión. Enfermedades infecciosas incluyendo Sida (AIDS, infección HIV) , hepatitis A, B, C, D, y E, infecciones bacterianas, infecciones fúngales, infecciones protozoarias e infecciones parasitarias. Una "malignidad de célula B" es una malignidad que involucra células B. Ejemplos incluyen enfermedad de Hodgkin, incluyendo enfermedad de Hodgkin predominante de linfocitos (LPHD) ; linfoma no-Hodgkin (NHL) ; linfoma de células centrales foliculares (FCC) ; leucemia linfocítica aguda (ALL) ; leucemia linfocítica crónica (CLL) ; leucemia de células pilosas; linfoma linfocítico plasmacitoide; linfoma de células de manto; linfoma relacionado a Sida (AIDS) o (HIV) ; mieloma múltiple; linfoma de sistema nervioso central (CNS) ; desorden linfoproliferativo post-transplante (PTLD); macroglobulinemia de Waldenstrom (linfoma linfoplasmacítico) ; linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa (MALT) ; y linforna/leucemia de zona marginal . Linfoma no-Hodgkin (NHL) incluye pero no está limitado a NHL de bajo grado/folicular, NHL de relapso o refractario, NHL de bajo grado línea frontal; NHL de etapa III/IV, NHL resistente a quimioterapia, NHL linfocitico pequeño (SL), NHL de grado intermedio/folicular, NHL difuso de grado intermedio, linfoma de células grandes difuso, NHL agresivo (incluyendo NHL línea frontal agresivo y NHL de relapso agresivo) , relapso NHL después o refractario a transplante de células madre autólogas, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de células no-escindidas pequeñas de alto grado, NHL de enfermedad voluminosa, etc. Una "enfermedad autoimmune" aquí, es una enfermedad o desorden que surje de y dirigido contra los propio tejidos de un individuo o un co-segregado o su manifestación o condición resultante. Ejemplos de enfermedades autoinmunes o desordenes incluyen pero no están limitados a artritis (arttritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, o osteartritis, artritis soriásica y espondiritis anquilosante) soriasis, dermatitis incluyendo dermatitis atópica; urticaria ideopática crónica, incluyendo urticaria autoinmune crónica, poliomesitis/dermatomeositis, necrolisis epidérmica tóxica, escleroderma sistémico y esclerosis, respuestas asociadas con enfermedades intestinal inflamatorio (IBD) (enfermedad de Crohn, colitis ulceratica) e IBD con co-segregado de bioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangitis eclerosante primaria y/o episcleritis) , síndrome de dificultad respiratoria, incluyendo síndrome de dificultad respiratoria para adultos (ARDS) , meningitis, enfermedades mediadas por IgE tales como anafilaxis y rinitis alérgica, encefalitis tales como encefalitis de Rasmussen, uveitis, colitis tal como colitis microscópica y colitis colagenosa, glomerunonefritis (GN) tal como GN membranosa, GN membranosa ideopática, GN proliferativa membranosa (MPGN), incluyendo tipo I y tipo II, y GN de avance rápido, condiciones alérgicas, hexema asma condiciones que involucran filtración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, artereoesclerosis, miocarditis autoinmune, eficiencia de adhesión de leucocitos, lupus sistémico herimetimatoso (SLE) tal como SLE cutáneo, lupus (incluyendo nefritis, cerebritis, pediátrica no renal discoide alopesia) , diabetes de inicio juvenil, esclerosis múltiple (MS) tal como MS espino-óptica, encefalomielitis alérgica, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y T-linfocitos, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, . vasculitis (incluyendo vasculitis de grandes . vasos) incluyendo polimialgia reumática y artritis de. células gigantes (Takayasu) ) , vasculitis de vasos medios., (incluyendo enfermedad de Kawasaki u poliarteritis • nodosa) , vasculitis de CNS y vasculitis asociada con ANCA, tales como vasculitis o síndrome de Churg-Strauss (CSS) , anemia aplástica, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia inmune hemolítica incluyendo anemia autoinmune hemolítica (AIHA) , anemia pernisiosa, aplasia de glóbulos rojos puros (PRCA), deficiencia de factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmune, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que involucran diapedesis de leucocitos, desórdenes inflamatorios del CNS, síndrome de lesión de múltiples órganos, miastenia gravis, enfermedades mediadas por complejos antígeno-anticuerpo, enfermedad de membrana vasal antiglomerular, síndrome de anticuerpos anti-fosfolípidos, neuritis alérgica, enfermedad Bechet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome Lambert-Eaton miastenico, síndrome de Reinaud, síndrome de Sjorgen, síndrome Stevens-Johnson, rechazo a transplante de órgano sólido (incluyendo pre-tratamiento para altos títulos de anticuerpo reactivos de panel, depósito de IgA en tejidos, y rechazo que surge de transplante renal, transplante de hígado, transplante intestinal, transplante cardiaco, etc) , enfermedad de injerto contra anfitrión (GVHD) , penfigoide bulosa, penfigus (incluyendo vulgaris foliáceo y penfigoide de membrana mucosa penfigus), poliendocrinopatías autoinmunes, enfermedad de Reiter, síndrome de rigidez muscular, nefritis inmunocompleja, polineuropatías IgM o neuropatía mediada por IgM, púrpura trobocitopenica ideopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (ITT), trombocitopenia (es desarrollada por pacientes de infarto al miocardio, por ejemplo), incluyendo trombocitopenia autoinmune, enfermedad autoinmune de los testículos y ovarios incluyendo orquitis autoinmune y/o foritis, hipotiroidismo primario; enfermedades endocrinas autoinmunes incluyendo tiroiditis autoinmune, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), tiroiditis subaguda, hipotiroidismo ideopático, enfermedad de Addison, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares autoinmunes (o síndromes de endocrinopatía poliglandular) , diabetes tipo I también referida como diabetes melitus dependiente de insulina (IDDM), incluyendo IDDM pediátrica y síndrome de Sheehan; hepatitis autoinmune, neumonitis intersticial linfoide (HIV) , bronquiolitis o obliterantes (sin transplante) contra NSIP, síndrome Guillain Barré, enfermedad de • Berger (nefropatía IgA) sirrosis biliar primaria, celeaquia (enteropatía de gluten) , celeaquía refractaria con dermatitis herpetiformis co-segregada, .crioglobulinemia, esclerosis lateral amilotrófica (ALS; enfermedad de Lou Gehrig's), enfermedad de arterías coronarias, enfermedad de oído interno autoinmune (AIED) , pérdida de audición autoinmune, síndrome opsoclonus mioclonus (OMS) policondritis tal como policondritis refractaria, proteinosis alveolar pulmonar, amiloidosis hepatitis de células gigantes, escleritis, gamupatía monoclonal o designificancia incierta/desconocida (MGUS) , neuropatía periférica, síndrome de paraneoplásico, canelopatías tales como epilepsia, migraña, arritmia, desórdenes musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica y canelopatías del CNS; autismo, miopatía inflamatoria y glomeruloesclerosis segmental focal (FSGS) . dix41a45j dix41a45j El termino "prodroga" como se emplea en esta solicitud se refiere a una forma precursor o derivado de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica a células de cáncer en comparación con la droga precursora y es capaz de activarse o convertirse enzimaticamente en la forma precursora más activa. Ver por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transa ctions, 14, pp . 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al . , "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, " Directed Drug Delivery, Borchardt et al . , (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Las prodrogas de esta invención incluyen, pero no están limitadas a, prodrogas que contienen fosfato, prodrogas que contienen tiofosfato, prodrogas que contienen sulfato, prodrogas que contienen péptido, prodrogas modificadas con D-amino ácido, prodrogas glicosiladas, prodrogas que contienen beta-lactama, prodrogas que contienen fenoxiacetamida opcionalmente substituida o prodrogas que contienen fenilacetamida opcionalmente substituida, 5- fluorocitosina y otras prodrogas 5-fluorouridina que pueden convertirse en la droga libre citotóxica más activa. Ejemplos de drogas citotóxicas que pueden derivarse en una forma prodroga para utilizar en esta invención incluyen, pero no están limitadas a, aquellos agentes quimioterapeuticos descritos a continuación. El termino "agente citotóxico" como se emplea aquí se refiere a una substancia que inhibe o evita la función de células y/o provoca destrucción de células. El término se pretende que incluya isótopos radioactivos (por ej emplo At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 • e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapeuticos, y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungal, de planta o animal, incluyendo sus fragmentos y/o variantes. Un "agente quimioterapeutico" es un "agente quimioterapeutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonato tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carbocona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenemelamina, trietylenefosforamida, trietiilenetiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (en especial bulatacina y bulatacinona) ; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1) ; ' eleuterobina; pancratistatina; . una sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, oxido de hidrocloruro de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, - prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos enediina (por ejemplo, caliceamicina, en especial caliceamicina gamall y caliceamicina omegall (ver por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo neocarzinostatina y cromóforos antibióticos de la cromoproteína enediina relacionados), aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIA ICIN® doxorubicina (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino- doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelulaomicina, mitomicinas tales como •mitomicina C, ácido micofenolico, nogalamicina , olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5- fluorouracil (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos purina tales como fludarabina, 6 -mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol , mepitiostane, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tales como ácido frolinico; aceglatona; aldofosfamida glicosido; ácido aminolevulinico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; un epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenameto; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilinico; ' 2-etilhidrazida; procarbazina; complejos polisacáridos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofira o; spirogermanio; ácido tenuazonico; triazicuona; 2 , 2 • , 2 " -triclorotrietilamina; tricotecenos . (en especial toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulación de nanoparticulas de ingeniería de albúmina libre de Cremophor ABRAXANE™, de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) , y TAXOTERE® doxetaxel (Rhóne- Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucil ; GEMZAR® gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurino; metotrexato; análogos platino tales como cisplatina y carboplatina vinblastina; platino; etoposido (VP-16) ; ifosfamida mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE® novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT- 11; inbidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornithina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; y las sales ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables, de cualquiera de los anteriores. . ;. También en esta definición se incluyen agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como anti-estrógenos y moduladores de receptor .de estrógeno selectivos (SERMs) , incluyendo, por ejemplo, tamoxifen (incluyendo tamoxifen NOLVADEX®) , raloxifen, droloxifen, 4-hidroxitamoxifen, trioxifen, keoxifen, LY117018, onapristona, y toremifene FARESTON®; inhibidores aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, megestrol acetato MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanin, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA®, y anastrozol ARIMIDEX®; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; así como troxacitabina (un análogo 1 , 3 -dioxolano nucleosido citosina) ; oligonucleotidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación de células 5 aberrantes, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Ralf y H- Ras; ribozimas tales como inhibidor de expresión VEGF (por ejemplo, la ribozima ANGIOZYME®) e inhibidor de expresión HER2 ; vacunas tales como vacunas de terapia de genes, por ejemplo, la vacuna ALLOVECTIN®, la vacuna 10. LEUVECTIN®, y la vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibidor de topoisomeraza LURTQTECAN® 1; ABARELIX® rmRH; y sales ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables, de cualquiera de los anteriores. Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se 15 emplea aquí se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, ya sea in vi tro o ín vivo . De esta manera, el agente inhibitorio de crecimiento es aquel que reduce significativamente el por ciento de células que sobre expresan estos genes en fase 20 S. Ejemplos de agentes inhibitorios de crecimiento incluyen agentes que bloquean el progreso del ciclo celular (en un sitio diferente a la fase S) , tales como agentes que inducen freno Gl y freno de fase M. Bloqueadores de fase M clásicos incluyen la vincas (vincristina y vinblastina) , taxol, y los inhibidores topo II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido, y bleomicina. Aquellos agentes que frenan Gl también rebosan en el freno fase S, por ejemplo, agentes de alquilación DNA tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazma, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Información adicional puede encontrarse en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn y Israel, eds., Capitulo 1, con titu] o "Cell cycle regulation, oncogens,. ánd antineoplastic drugs" by Murakami et al . (WB. Saünders: Philadelphia, 1995), especially p. 13. E] termino "citosina" es un termino genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan en otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de estas citosinas son linfocinas, monocinas, y hormonas polipéptido tradicionales. Incluidas entre las citosinas están hormona de crecimiento tal como hormona de crecimiento humano, hormona de crecimiento humano N-metionilo, y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormones de glicoproteína tales como hormona estimulo de folículos (FSH), hormona estimulo de tiroides (TSH) , y hormona luteinizante (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento fibroblasto; prolactina; lactogeno placentario; factor necrosis de tumor-a y -ß; sustancia inhibitoria muleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO) ; factores de crecimientos de nervios; factor de crecimiento de plaquetas; factor de crecimientos de transformación (TGFs) tales como TGF-a y TGF-ß; factor de crecimiento tipo insulina -I y -II; eritropoietina (EPO); factores . osteoinductivos; •interferonas tales como interferona -oc, -ß, y - ? ; factores de estimulo de colonia (CSFs) tales como macrofago-CSF (M-CSF) ; macrofago-granulocito-CSF (GM-CSF) ; y granulocitp-CSF (G-CSF); interleucenas (ILs) tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; y otros factores de polipéptidos incluyendo LIF y kit ligando (KL) . Como se emplea aqui, el termino citocina incluye proteínas de fuentres naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citosinas de secuencia nativa. Un "inserto de empaque" se emplea para referirse a instrucciones usualmente incluidas en empaques comerciales de productos terapéuticos, que contienen información respecto a las indicaciones, usos, dosis, administración, contraindicaciones, otros productos terapéuticos al combinarse con el producto de empaque y/o advertencias al uso de estos productos terapéuticos, etcétera . Los términos "tratar", "tratamiento" y "terapia" como se emplea aquí se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica y terapia preventiva. El término "mam. fero" como se emplea aquí se refiere a cualquier mamífero clasificado como un mamífero, incluyendo humanos,, vacas, caballos, perros y gatos. En una modalidad preferida de la invención, en mamífero es un human. II . Composiciones, y Métodos de la Invención Una citosina relacionada a la familia de ligando TNF, la citosina aquí identificada como "ligando Apo-2" o "TRAIL" se ha descrito. La secuencia aminoácidos maduros pronosticada de ligando Apo-2 humano nativo contienen 281 amino ácidos, y tiene un peso molecular calculado de aproximadamente 32.5 kDa. La ausencia de una secuencia de señal y la presencia de una región hidrofobica interna sugieren que el ligando Apo-2 es una proteína transmembrana tipo II. Polipéptidos de ligando Apo-2 de dominio extracelular soluble también se han descritos. Ver por ejemplo, W097/25428 publicada en julio 17, 1997. Variantes de substitución Apo-2L se han descrito adicionalmente. Técnicas de exploración de alanina se han utilizado para identificar diversas moléculas variantes de substitución que tienen actividad biológica. Variantes de substitución particulares del ligando Apo-2 incluye aquellas en donde al menos un aminoácido se substituye por otros aminoácidos tales como un residuo alanina. Estas variantes de substitución se identifican por ejemplo, como "D203A"; "D218A" y "D269A." Esta nomenclatura se emplea para identificar variantes de ligando Apo-2 en donde los residuos de ácido aspartico en las posiciones 203, 218, y/o 269 (utilizando la numeración mostrada en la Figura ,'l) se substituyen por residuos alanina. Opcionalmente, las variantes Apo-2L de la presente invención pueden comprender uno o más de las substituciones de amino ácido. Opcionalmente, estas variantes Apo-2L serán variantes selectivas de receptor DR4 o DR5. La siguiente descripción se refiere a métodos para producir ligando Apo-2, incluyendo variantes de ligando Apo-2, al cultivar células anfitrionas transformadas o transfectadas con un vector que contienen ácido nucleico que codifica ligando Apo-2 y recoperar el polipéptido del cultivo celular. El ligando Apo-2 que codifica DNA puede obtenerse de cualquier biblioteca cDNA preparada de tejido que se considera posee el mRNA ligando Apo-2 y lo exprese a una nivel detectable. De acuerdo con esto, DNA ligando Apo-2 humano puede convenientemente obtenerse de una biblioteca cDNA preparada de tejidos humanos, tales como la biblioteca de bacteriófago de cDNA de placenta humana como se describe en W097/25428. El gen que codifica el ligando Apo-2 también puede obtenerse de una biblioteca genomica o por síntesis de oligonucleotidos. Las bibliotecas pueden supervisarse con sondas (tales como anticuerpos al ligando Apo-2 u oligonucleotidos de al menos aproximadamente 20 a 80 bases) diseñados para identificar el gene de interés o la proteína que lo codifica. La supervisión de la biblioteca cDNA o genomica con la sonda selecta puede conducirse utilizando procedimientos estándar, tales como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un medio alterno para aislar el gene que codifica ligando Apo-2 es utilizar la metodología PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995) ] . Fragmentos de secuencia de aminoácidos o variantes de ligando Apo-2 pueden prepararse al introducir cambios de nucleótido apropiados en el ADN ligando Apo-2 o por sintesis del polipéptido ligando Apo-2 deseado. Estos fragmentos o variantes representan inserciones, sustituciones y/o eliminaciones de residuos dentro o en uno o ambos de los extremos de la región intracelular, la región transmembrana o la región extracelular, o de la secuencia de aminoácidos mostrada para el ligando Apo-2 de longitud integra de la Figura 1. Cualquier combinación de inserción, sustitución y/o eliminación puede realzarse para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea por ejemplo una actividad biológica deseada, tal como actividad apoptósica, como se define aquí. En una modalidad preferida, los fragmentos o variantes tienen al menos aproximadamente 80% identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% identidad de secuencia y aún más preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identidad de secuencia con las secuencias aquí identificadas para los dominios intracelular, transmembrana o extracelular de ligando Apo-2, o la secuencia de longitud íntegra para ligando Apo-2. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos post-traducción del ligando Apo-2 tal como cambiar el número o posición de sitios de glicosilación o alterar las características de anclaje de membrana. Variaciones en la secuencia de ligando Apo-2 como se describió anteriormente pueden realizarse utilizando cualquiera de las técnicas y guías para mutaciones conservadoras y no conservadoras establecidas en la Patente de los E.U.A. número 5,364,934. Éstas incluyen mutagénesis mediada por oligonucléotido (dirigida de sitio) , exploración de alanina y mutagénesis PCR. Análisis de exploración de aminoácidos puede emplearse para identificar uno o más aminoácidos junto con una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de exploración preferidos están aminoácidos neutros relativamente pequeños. Estos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. Alanina típicamente es un aminoácido de exploración preferido entre este grupo, debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de cadena principal de la variante. [Cunningham et al., Science, 244:1081 (1989)]. Alanina también se prefiere típicamente debido a que es el aminoácido más común. Además, ftrecuent5emente se encuentra tanto en posiciones enterrada como expuesta [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., NY) ; Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Pueden agruparse aminoácidos de acuerdo similaridades en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp . 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L) , He (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W) , Met (M) (2) polares sin carga: Gly (G) , Ser (3), Thr (T) , Cys (C), Tyr (Y), Asn (N) , Gln (Q) (3) acídicos: Asp (D), Glu (E) (4) básicos: Lys (K) , Arg (R) , His(H) En forma alterna, residuos de origen natural pueden dividirse en grupos basados en propiedades de cadena lateral comunes: (1) hidrófobicos : Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) neutros hidrofílicos: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídicos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influencian la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe Tabla 1 Variaciones en la secuencia de ligandos Apo-2 también incluidas dentro del alcance de la invención se refieren a derivados amino terminales o formas modificadas. Estas secuencias de ligando Apo-2 incluyen cualquiera de los polipéptidos de ligando Apo-2 aquí descritas que tienen una metionina o metionina modificada (tal como las especies formal metionilo u otro metionilo bloqueado (en el extremo N de la secuencia de polipéptido. El ácido nucleico (por ejemplo cDNA o DNA genómico) que codifica ligando Apo-2 nativo o variante puede insertarse en un vector replicable para mayor clonación (amplificación del DNA) o para expresión.

Diversos vectores están disponibles públicamente. Los componentes vector en general incluyen pero no están limitados a uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un rigen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción, cada una de las cuales se describe a continuación. Secuencias de señal opcionales, orígenes de replicación, genes marcadores, elementos mejoradores y secuencias terminadoras de transcripción que pueden emplearse se conocen en la técnica y describen con mayor detalle en W097/25428. Vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo anfitrión y es enlazado operativamente con la secuencia de ácido nucleico ligando Apo-2. Promotores son secuencias sin traducir ubicadas corriente arriba (5') al codón de inicio de un gen estructural (en general dentro de aproximadamente 100 a 1000 bp) que controlan la transcripción y traducción de una secuencia de ácido nucleico particular, tal como la secuencia de ácido nucleico ligando Apo-2 a la cual se enlazan operativamente. Estos promotores típicamente quedan en dos clases, inducibles y constitutivos. Promotores inducibles son promotores que inician niveles incrementados de transcripción de DNA bajo su control en respuesta a cierto cambio en condiciones de cultivo, por ejemplo en la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en temperatura. En este tiempo, una gran cantidad de promotores reconocidos por una variedad de células anfitrionas potenciales son bien conocidos. Estos promotores se enlazan operativamente a DNA que codifica el ligando Apo-2 al retirar el promotor del ADN fuente por digestión de enzima de restricción e inserción de la secuencia de promotor aislada en el vector. Tanto la secuencia promotora de ligando Apo-2 nativa como muchos promotores heterólogos pueden utilizarse para dirigir amplificación y/o expresión del DNA ligando Apo-2. Promotores adecuados para utilizar con anfitriones procarióticos y eucarióticos se conocen en la técnica y se describen con mayor detalle en W097/25428. Un método preferido para la producción de Apo-2L soluble en E . coli emplea un promotor inducible para la regulación de expresión de producto. El uso de un promotor inducible, controlable, permite crecimiento de cultivo a la densidad celular deseada antes de inducción de expresión de producto y acumulación de cantidades significantes de producto que pueden no ser bien toleradas por el anfitrión. Varios sistemas promotores inducibles (polimerasa T7, trp y fosfatasa alcalina (AP) ) se han evaluado por los solicitantes para la expresión de Apo-2L (forma 114-281) . El uso de cada uno de estos tres promotores resulta en cantidades significantes de trímero Apo-2L biológicamente activo, soluble que se recuperan de la pasta celular cosechada o recolectada. El promotor AP se prefiere entre estos tres sistemas promotores inducibles probados, debido a más firme control de promotor y la superior densidad celular y títulos alcanzados en la pasta celular cosechada. Construcción de vectores convenientes que contienen uno o más de los componentes anteriormente citados emplea técnicas de ligación estándar. Plásmidos aislados o fragmentos de DNA se escinden, ajustan a la medida y re-ligan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos. Para que el análisis confirme secuencias correctas en plásmidos construidos, las mezclas de ligación pueden emplearse para transformar la cepa 294 de E . coli K12 (ATCC 31,446) y transformantes exitosos seleccionados por resistencia a ampicilina o tetraciclina fueron apropiados. Plásmidos de los transformantes se preparan, analizan por digestión de endonucleasa de restricción y/o secuencian utilizando técnicas estándar conocidas en la especialidad (ver Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981); Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499 (1980)]. Vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria en células de mamífero de ligando Apo-2 que codifica DNA pueden emplearse. En general, expresión transitoria involucra el uso de un vector de expresión que es capaz de replicar eficientemente en una célula anfitriona, tal que la célula anfitriona acumula muchas copias del vector de expresión y a su vez sintetiza altos niveles de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión [Sambrook et al., supra] . Sistemas de expresión transitorios, que comprenden un vector de expresión conveniente y una célula anfitriona, permiten la identificación positiva conveniente de polipéptidos codificados por DNAs clonados, así como la rápida supervisión de estos polipéptidos para propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. De esta manera, sistemas de expresión transitorios son particularmente útiles en la invención para propósitos de identificar análogos y variantes de ligando Apo-2 que son ligando Apo-2 biológicamente activos . Otros métodos, vectores y células anfitrionas adecuadas para adaptación a la sintesis de ligando Apo-2 en cultivo de células de vertebrados recombinantes se 5 describen en Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; and EP 117, 058. Células anfitrionas convenientes para clonar y expresar el DNA en los vectores presentes incluyen „?o células procarióticas, de levadura o eucariotas superiores. Procariotas convenientes para este propósito incluyen pero no están limitados a eubacterias tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, por Enterobacteriaceae tales como Escherichia , e.g., E . coli , 15 En terobacter, Erwinia , Klebsiella , Proteus, Salmonella , e.g., Salmonella typhimurium, Serra tia , e.g., Serra tia marcescans, y Shigella , así como bacilos tales como B . subtilis y B . licheniformis (por ejemplo, B . licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicada el 12 20 de abril 1989) , Pseudomonas tal como P. aeruginosa, y Streptomyces . De preferencia, la célula anfitriona deberá secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Además de procariotas, microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levadura son adecuados anfitriones de clonación o expresión para vectores que codifican ligando Apo-2. Células anfitrionas convenientes para la expresión de ligando Apo-2 glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de todas estas células anfitrionas, incluyendo células CHO se describen además en W097/25428. Células anfitrionas se transfectan y de preferencia transforman con la expresión anteriormente descrita o vectores de clonación para producción de ligando Apo-2 y cultivan en medio nutriente según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Transfección se refiere a la absorción de un vector de expresión por una célula anfitriona ya sea que de hecho se expresen o no secuencias de codificación. Numerosos métodos de transfección se conocen para la persona con destreza ordinaria en la especialidad, por ejemplo CaP04 y electroporación. Transfección exitosa en general se reconoce cuando cualquier indicación de la operación de este vector ocurre dentro de la célula anfitriona . Transformación significa introducir DNA en un organismo de manera tal que el DNA sea replicable, ya sea como un elemento extracromosomal o por integrante cromosomal. Dependiendo de la célula anfitriona empleada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas a estas células. El tratamiento de calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en Sambrook et al., supra, o electroporación en general se emplea para procariotas u otras células que contienen barreras de pared celular sustancial. Infección con is Agrobacterium tumefaciens se emplea para transformación de ciertas células de plantas, como se describe por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) -y WO 89/05859 publicada el 29 de junio 1989. Además, plantas pueden transfectarse utilizando tratamiento de ultrasonido como se describe en WO 91/00358 publicada el 10 de enero.1991. Para células de mamífero sin estas paredes celulares, el método de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52 : 456-457 (1978) puede emplearse. Aspectos generales de transformaciones de sistema anfitrión de células de mamífero se han descrito en la Patente de los E.U.A. número 4,399,216. Transformaciones en lavadura se llevan a acabo típicamente de acuerdo con el método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, otros métodos para introducir DNA en células tales como por microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas o policationes, por ejemplo polibreno, poliornitina, también pueden emplearse. Para diversas técnicas para transformar células de mamíferos, ver Keown et al., Methods in Enzymology, 185 : 527-537 (1990) and Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988). Células procarióticas empleadas para producir ligando Apo-2 pueden, cultivarse en medio de cultivo conveniente como se describe en general en Sambrook et al., supra. Formas particulares de medio de cultivo que pueden emplearse para cultivar E . coli se describen además en los siguientes ejemplos. Células anfitrionas de mamífero empleadas para producir el ligando Apo-2 pueden cultivarse en una variedad de medios de cultivo. Ejemplos de medios de cultivo comercialmente disponibles incluyen Ham's FIO (Sigma), medio esencial mínimo ("MEM", Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y medio Tagle modificado con Dulbecco ("DMEM", Sigma). Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio de magnesio y fosfato), amortiguadores (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos tales como la droga GentamicinaMR) , elementos en trazas (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquiera otros suplementos necesarios también pueden incluirse a concentraciones apropiadas que serán conocidas por aquellos con destreza en la técnica. .Las -condiciones de cultivo tales como temperatura, pH y semejantes son aquellas previamente empleadas con la célula anfitriona selecta para expresión y serán aparentes a la persona con destreza ordinaria en la especialidad. En general, principios, protocolos y técnicas prácticas para llevar al máximo la productividad de cultivos de células de mamífero pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) . De acuerdo con un aspecto de la presente invención, uno o más iones de metales divalentes típicamente se agregarán o incluirán en el medio de cultivo para cultivar o fermentar las células anfitrionas. Los iones de metales divalentes de preferencia están presentes en o agregados al medio de cultivo a un nivel de concentración suficiente para mejorar la estabilidad en almacenamiento, mejorar solubilidad o ayudar en formar trímeros Apo-2L estables coordinados por uno o más iones zinc. La cantidad de iones de metales divalentes que pueden agregarse dependerá en parte de la densidad celular anfitriona en el cultivo o sensibilidad de célula anfitriona potencial a estos iones de metales divalentes. A densidades celulares anfitrionas superiores en el cultivo, puede ser benéfico el aumentar la concentración de iones de metales divalentes. Si los iones de metales divalentes se agrega durante o después de expresión de producto por las células anfitrionas, puede ser conveniente el ajustar o aumentar la concentración de ion de metal divalente conforme aumenta la expresión de producto por las células anfitrionas. En general se considera que niveles en trazas de iones de metales divalentes que pueden estar presentes en medios de cultivos de células comúnmente disponibles típicos pueden no ser suficientes para una formación de trímero estable. De esta manera se prefiere adición de más cantidades de iones de metales divalentes como se describe aquí . Los iones de metales divalentes de preferencia se agregan al medio de cultivo a una concentración que no afecta adversa o negativamente al crecimiento de células anfitrionas, si los iones de metales divalentes se agregan durante la fase de crecimiento de la célula anfitriona en el cultivo. En cultivos de matraz de agitación, se observó que ZnS04 agregado a concentraciones mayores a 1 mM puede resultar en menor densidad de célula anfitriona. Aquellos con destreza en la técnica aprecian que células bacterianas pueden secuestrar iones de metales efectivamente al formar complejos de iones de metales con matrices celulares. De esta manera, en los cultivos celulares, se prefiere el agregar los iones de metales divalentes selectos al medio de cultivo después de la fase de crecimiento (después de que se logra la densidad celular anfitriona deseada) o justo antes de expresión de producto por las células anfitrionas. Para asegurar que estén presentes suficientes cantidades de iones de metales divalentes, pueden agregarse o alimentarse iones de metales divalentes adicionales al medio de cultivo celular durante la fase de expresión de producto. La concentración de ion de metal divalente en el medio de cultivo no deberá exceder la concentración que puede ser nociva o toxica a las células anfitrionas.

En los métodos de la invención que emplean la célula anfitriona, E. coli , se prefiere que la concentración del ion de metal divalente en el medio del cultivo no exceda aproximadamente lmM (de preferencia, < lmM) . A un más preferiblemente, la concentración de ion de metal divalente en el medio de cultivo es aproximadamente 50 micro molar a aproximadamente 250 micro molar. Más preferiblemente, el ion de metal divalente empleado en estos métodos es sulfato de zinc. Es conveniente el agregar los iones de metales divalentes al cultivo celular en una cantidad en donde los iones de metal y el trímero ligando Apo-2 puedan estar presentes en una proporción molar uno a uno. Los iones de metal divalentes pueden agregarse al cultivo celular en cualquier forma aceptable. Por ejemplo, una solución del ion de metal pueden elaborarse utilizando agua, y la solución del ion de metal divalente pueden agregarse o alimentarse al medio de cultivo. Expresión del Apo-2L puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo por transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción de mRNA [Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia (análisis DNA) , o hibridización in si tu, utilizando una sonda apropiadamente etiquetada, con base en las secuencias que aquí se proporcionan. Diversas etiquetas pueden emplearse, más comúnmente radioisótopos, y particularmente 32P. Sin embargo, también pueden emplearse otras técnicas, tales como utilizando nucleótidos modificados con biotina para introducir en un polinucleótido. La biotina sirve entonces como el sitio para ligar a avidina o anticuerpos, que pueden etiquetarse con una amplia variedad de etiquetas, tales como ' radionucleótidos, agentes de fluorescencia o enzimas. En forma alterna, pueden emplearse anticuerpos -que puedan reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de DNA, dúplex RNA , y dúplex hibrido de DNA-RNA o dúplex DNA-proteína . Los anticuerpos a su vez pueden ser etiquetados y el ensayo puede llevarse a cabo en donde el dúplex se liga a una superficie, de manera tal que ante la formación de dúplex en la superficie, la presencia de anticuerpo ligado al dúplex puede ser detectada. Expresión de genes, en forma alterna puede medirse por métodos inmunológicos, tales como tensión inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo de cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión de producto de gen. Con técnicas de tensión inmunohistoquímica, se prepara una muestra de células, típicamente por deshidratación y fijado, seguido por reacción con anticuerpos etiquetado específico para el producto de gen acoplado, en donde las etiquetas son detectables en forma visual usualmente, tales como etiquetas enzimáticas, etiquetas fluorescentes, etiquetas luminescente y semejantes. Anticuerpos útiles para tensión inmunohistoquímica y/o ensayo de fluidos muestra ya puede ser monoclonal o policlonal, y puede prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos-pueden prepararse contra un polipéptido ligando Apo-2 nativo o contra un péptido sintético con base en i a secuencias de DNA que aquí se proporcionan o contra secuencia exógena fusionada a DNA ligando Apo-2 y codificar un epitope anticuerpo específico. Ligando Apo-2 de preferencia se recupera del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque también puede recuperarse de lisados de células anfitrionas cuando se producen directamente sin señal secretoria. Si el ligando Apo-2 se liga a membrana, puede liberarse la membrana utilizando una solución detergente conveniente (por ejemplo Triton-X 100) o su región extracelular puede liberarse por esición enzimática. Cuando se produce ligando Apo-2 en una célula recombinante diferente a de origine humano, el ligando Apo-2 esta libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, usualmente es necesario recuperar o purificar ligando Apo-2 de proteínas o polipéptidos de células recombinantes para obtener preparaciones que son substancialmente homogéneas en cuanto a ligando Apo-2. Como una primera etapa, el medio de cultivo o lisado puede centrifugarse para retirar deshechos de células en partícula. El ligando Apo-2 posteriormente se purifica de proteínas y polipéptidos solubles contaminantes, con los siguientes procedimientos que son ejemplares de procedimientos de purificación convenientes: por fraccionación en la columna de intercambio de iones; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio de cationes tal como DEAE o CM; cromato de enfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel utilizando, por ejemplo Sephadex G-75; diafiltración y columnas de proteína A Sefarosa para retirar contaminantes tales como IgG. En una modalidad preferida, el ligando Apo-2 puede aislarse por cromatografía de afinidad. Los fragmentos de ligando Apo-2 o variantes en donde se han eliminado, insertado o substituido residuos se recuperan en la misma forma que el ligando Apo-2 nativo, tomando en cuanta cualesquiera cambios substanciales en propiedades ocasionadas por la variación. Por ejemplo, preparación de una fusión de ligando Apo-2 con otra proteína o polipéptido, por ejemplo un antígeno bacteriano o viral, facilita la purificación; una columna de inmunoafinidad que contienen anticuerpo al antígeno, puede emplearse para adsorber el polipéptido de fusión. Un inhibidor de proteasa tal como fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF) también puede ser útil para inhibir degradación proteolítica durante purificación, y pueden incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios. Una persona con destreza en la técnica apreciara que métodos de purificación adecuados para ligando Apo-2 nativo pueden requerir modificación para tomar encuenta cambios en el carácter de ligando Apo-2 o sus variantes ante expresión en cultivo celular recombinante. Durante cualesquiera de estas etapas de purificación, puede ser conveniente el exponer el Apo-2L recuperado a una solución que contienen ion de metal divalente o a material de purificación (tal como medio de cromatografía o soporte) que contienen uno o más iones de metales divalentes. En una modalidad preferida, los iones de metal divalentes y/o el agente reductor se emplean durante recuperación o purificación del Apo-2L. Opcionalmente, tanto iones de metales divalentes como agentes reductores, tales como DTT o BME, pueden emplearse durante recuperación o purificación del Apo-2L. Se considera que el uso de iones de metal divalentes durante recuperación o purificación, proporcionara la estabilidad de trímero Apo-2L o conserva trímero Apo-2L formado durante la etapa de cultivo celular. La siguiente descripci.ón también se refiere a métodos para producir ligando Apo-2 ligado covalentemente (a continuación "conjugado") con uno o más grupos químicos. Grupos químicos adecuados para utilizar en un conjugado Apo-2L de la presente invención de preferencia no son significativamente tóxicos o inmunogenicos . El grupo químico se elije opcionalmente para producir un conjugado Apo-2L que puede almacenarse y emplearse bajo condiciones adecuadas para almacenamiento. Una variedad de grupos químicos ejemplares que pueden conjugarse a polipéptidos se conocen en la técnica e incluyen por ejemplo carbohidratos, tales como aquellos carbohidratos que ocurren naturalmente en glicoproteínas, poliglutamato, y polímeros no proteínaceos, tales como polioles (ver por ejemplo, patente de los E.U.A. No. 6,245, 901) . Un poliol, por ejemplo puede conjugarse con polipéptidos tal como an Apo-2L en uno o más residuos amino ácido, incluyendo residuos lisina, como se describe en WO 93/00109, supra . El poliol empleado puede ser cualquier polímero de poli (alquilen oxido) soluble en agua y puede tener una cadena lineal o ramificada. Polioles convenientes incluyen aquellos substituidos en uno o más posiciones hidroxilo con un grupo químico, tal como un grupo alquilo que tienen .entre uno y cuatro átomos de carbono. Típicamente, el poliol es un poli (alquilen glicol), tal como poli (etilen glicol) (PEG), y de esta manera, para facilidad de descripción, el resto de la discusión, se -refiere a una modalidad ejemplar en donde el poliol empleado es PEG y el proceso de conjugar el poliol con un polipéptido se denomina "modificación con polietilen glicol" . Sin embargo, aquellos con destreza en la técnica reconocen que otros polioles, tales como por ejemplo copolimeros de poli (propilen glicol) y polietilen-polipropilen glicol, pueden emplearse utilizando técnicas para conjugación descritas aquí pata PEG. El peso molecular promedio del PEG emplado en la pegilación del Apo-2L pueden variar, y típicamente puede estar en el rango de aproximadamente 500 a aproximadamente 30,000 daltons (D). De preferencia, el peso molecular promedio del PEG es de aproximadamente 1,000 a aproximadamente 25,000 D, y más preferiblemente de aproximadamente 1,000 a aproximadamente 5,000 D. En una modalidad, la modificación con polietilen glicol se lleva a cabo con PEG que tienen un peso molecular promedio de aproximadamente 1,000 D. Opcionalmente, el homopolímero de PEG esta sin substituir, pero también puede estar substituido en un extremo con un grupo alquilo. De preferencia, el grupo alquilo es un grupo alquilo C1-C4, y más preferiblemente un grupo metilo. Preparaciones de PEG están comercialmente disponibles, y típicamente aquellas preparaciones de PEG adecuadas para utilizar en la presente invención son preparaciones no homogéneas que se venden de acuerdo con el peso molecular promedio. Por ejemplo, preparaciones de PEG (5000) comercialmente disponibles típicamente contienen moléculas que varían ligeramente en peso molecular, usualmente ± 500 D. El ligando Apo-2 de la invención puede estar en diversas formas, tal como en forma de monómero o trímero (que comprende tres monómeros). Opcionalmente, un trímero Apo-2L será modificado con polietilen glicol en una forma tal que la molécula PEG se enlaza o conjuga con uno, dos o cada uno de los tres monómeros que constituyen el Apo-2L trímerico. En esta modalidad, se prefiere que el PEG empleado tenga un peso molecular promedio de aproximadamente 1,000 a aproximadamente 5,000 D. También se contempla que los trímeros Apo-2L pueden ser modificados con polietilen glicol "parcialmente", es decir cuando solo uno o dos de los tres monómeros que constituyen el trímero se enlazan o conjugan con PEG. Una variedad de métodos para modificar con polietilen glicol proteínas se - conocen en la especialidad. Métodos específicos para producir proteínas conjugadas con PEG incluyen los métodos descritos en la patente de los E.U.A No. 4,179,337, patente de los E.U.A. No. 4,935,465 y- patente de los E.U.A. No. 5,849,535. Típicamente la proteína se liga covalentemente mediante uno o más de los residuos aminoácido de la proteína a un grupo reactivo terminal en le polímero, dependiendo primordialmente en las condiciones de reacción, el peso molecular del polímero, etcétera. El polímero con el o los grupos reactivos se designa aquí como un polímero activado. El grupo reactivo reacciona selectivamente con grupos de amino libre u otros reactivos en la proteína. El polímero PEG puede acoplarse al grupo amino u otro reactivo en la proteína ya sea en una forma aleatoria o específica de sitio. Se entenderá sin embargo, que el tipo y cantidad del grupo reactivo selecto así como el tipo de polímero empleado, para obtener resultados óptimos, dependerá de la proteína o variante de proteína particular empleada para evitar el tener que el grupo reactivo reacciona con demasiados grupos activos particularmente en la proteína. Ya que esto puede no ser posible de evitar por completo, se recomienda que en general de aproximadamente 0.1 a •ílOOO moles, de preferencia 2 a 200 moles, de polímero activado por mole de la proteína, dependiendo de la concentración de la proteína, se empleen. La cantidad final de polímero activado por mole de la proteína es un balance para mantener actividad óptima, mientras que al mismo tiempo la optimizando de ser posible, la vida media en circulación de la proteína. Además se contempla que el Apo2L aquí descrito puede también estar enlazado o fusionado a secuencias cremallera leucina utilizando técnicas conocidas en la especialidad. Métodos para generar anticuerpo receptores muerte y anticuerpos CD20 también se describen aquí. El antígeno a utilizarse para producción de, o supervisión para, anticuerpo puede ser, por ej emplo, una forma soluble del antígeno o una porción del mismo, que contienen el epitope deseado. En forma alterna, o adicionalmente, células que expresan el antígeno en su superficie celular pueden emplearse para generar, o supervisar anticuerpos. Otras formas del antígeno útiles para generar anticuerpo serán aparentes para aquellos con destreza en la técnica. (i) Anticuerpos Policlonales Anticuerpos policlonales de preferencia se desarrollan en animales por inyecciones múltiples subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil para conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmupogenica en la especia a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de erizo de mar, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor tripsina de soya utilizando un agente bifuncional o derivatización, por ejemplo maleimidobenzoil sulfosuccinimida ester (conjugado a través de residuo cisteina) , N-hidroxisuccinimida (a través residuos lisina), glutaraldehido, anhídrido succinico, S0C12, o R1N=C=NR, en donde R y R1 son grupos alquilo diferentes. Animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogenicos, o derivados al combinar, por ej emplo, 100 µg o 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradermicamente en sitios múltiples. Uno mes después los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitos. Siete a 14 días después los animales se sangran y el suero se ensaya para titulo de anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta que el titulo alcanza una meseta. De preferencia, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, paro conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo entrelazamiento diferente. Los conjugados también pueden elaborarse en cultivo celular recombinante como fusiones de proteína. También, agentes de agregación tales como alumbre son empleados convenientemente para mejorar la respuesta inmune. (ii) Anticuerpos Monoclonales Anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. De esta manera, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que no es una mezcla de anticuerpos discretos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden elaborarse utilizando el método de hibridoma primero descrito por Kohier et al . , Na ture, 256:495 (1975), o pueden elaborarse por métodos de DNA recombinante (Patente de los E.U.A. número 4,816,567). En el método de hibridoma, un ratón u otro animal anfitrión apropiado tal como un hámster, se inmuniza como se describió anteriormente para producir linfdcitos que producen > o son capaces de producir anticuerpos que específicamente ligan a la proteína empleada para inmunización. En forma alterna, linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Linfocitos se fusionan entonces con células de mieloma utilizando un agente de fusión conveniente, tal como polietilen glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986) ) . Las células de hibridoma así preparadas se siembran y desarrollan en un medio de cultivo conveniente que de preferencia contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma precursoras sin fusión. Por ejemplo, si las células de mieloma precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , estas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Células de mieloma preferidas son aquellas que fusionan eficientemente, soportan producción de alto • nivel- estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo selectas y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre estas, líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma murino, tales como aquellas derivadas de tumores de MOPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Manassas, Virginia USA. Líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); Brodeur et al . , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applica tions, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) ) .

Medio de cultivo en donde las células de hibridoma se desarrollan se ensaya para producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. De preferencia, la especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma, se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de enlace in vi tro tal como radioinmunoensayo (RÍA) o ensayo inmunoabsorbente enlazado con enzima (ELISA) . La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede por ejemplo ser determinada por el análisis Scatchard de Munson et al . , Anal . Biochem . , 107:220 (198Q) . Después de que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los ciónos pueden ser subclonados por procedimientos de dilución limitada y desarrollados por métodos estándar (Goding, Monoclonal An tibodies : Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986) ) . Medios de cultivo convenientes para este propósito incluyen por ejemplo medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden desarrollarse in vivo como tumores ascitos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclonos se separan convenientemente del medio de cultivo, fluido ascitos o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como por ejemplo proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforésis en gel diálisis o cromatografía de afinidad. DNA que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo al utilizar sondas oligonucleótido que son capaces de ligar específicamente ' a genes que codifican las 'cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de DNA. Una vez aislado, el DNA puede colocarse en vectores de expresión que después se transfectan en células anfitrionas tales como células de E. coli , células COS simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra forma no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células anfitrionas recombinantes. Los artículos de revisión de expresión recombinante en bacterias de DNA que codifica el anticuerpo incluye Skerra et al . , Curr . Opinión in Immunol . , 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol . Revs . , 130:151-188 (1992) . En una modalidad adicional, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de bibliotecas fago de anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al . , Na ture, 348:552-554 (1990). Clackson et al . , Na ture, 352:624-628 (1991) y Marks et al . , J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos respectivamente utilizando bibliotecas fago. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) por entremezclado de cadena (Marks et al . , Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y la combinación m vivo como una estrategia para construcción de muy grandes bibliotecas fago (Waterhouse et al . , Nuc . Acids . Res . , 21:2265-2266 (1993). De esta manera, estas técnicas son alternativas viables para técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para aislamiento de anticuerpos monoclonales. El DNA también puede ser modificado por ejemplo por sustitución de la secuencia de codificación de dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente de los E.U.A. número 4,816,567; Morrison, et al . , Proc . Na ti Acad. Sci . USA, 81:6851 (1984)), o por unión covalente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina de todo o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no-inmunoglobulina . Típicamente, estos polipéptidos sin inmunoglobulina están sustituidos por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno .que tiene especificidad para un antígeno diferente. (ii i) Anticuerpos humanizados Métodos para humanizar anticuerpos no humanos se han descrito en la técnica. De preferencia, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácido introducidos en él de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos a menudo se refieren como residuos de "importación" que típicamente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al . , Na ture, 321:522-525 (1986); Riechmann et al . , Na ture, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al . , Science, 239:1534-1536 (1988)), por sustitución de secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los E.U.A. número 4,816,567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en donde algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La selección de dominios variables humanos tanto ligeros como pesados a utilizarse en constituir los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método así denominado de "mejor ajuste" la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se supervisa contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia humana que es más cercana a la del roedor se acepta entonces como la región marco humano (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al . , J. Immunol . , 151:2296 (1993); Chothia et al . , J. Mol . Biol . , 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región marco particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco puede utilizarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta et al . , J. Immunol . , 151:2623 (1993)). Además es importante que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de secuencias precursoras' y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de,- las - secuencias precursoras y humanizadas. Modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y - son familiares para aquellos con destreza en la técnica. Programas de computadoras están disponibles que ilustran y exhiben estructuras de conformación tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidata selecta. La inspección de estas exhibiciones permite análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir el análisis de residuos que influencian la habilidad de la inmunoglobulina candidato par ligar a su antígeno. De esta manera, residuos FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias de importación del recipiente de manera tal que la característica de anticuerpo deseada, tal como incrementada actividad para el o los antígenos diana, sea lograda. En general, los residuos de región hipervariable están involucrados directa y más sustancialmente en influenciar el enlace de antígeno . (iv) Anticuerpos humanos Como una alterativa .a humanización, pueden generarse anticuerpos humanos Por ejemplo, ahora es -posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que sean capaces ante inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos, humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigoto del gen de región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal, resulta en inhibición completa de producción de anticuerpo endógeno. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en estos ratones mutantes de línea germinal, resultará en la producción de anticuerpos humanos ante prueba con antígeno. Ver por ejemplo Jakobovits et al., Proc. Nati.

Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y las Patentes de los E.U.A. números 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807. En forma alterna, la tecnología de exhibición fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) puede emplearse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vi tro, de repertorios de genes de dominio variables de inmunoglobulina (V) de donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio de anticuerpo V se clonan en-cuadro ya sea en eun gen de proteína de revestimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como ML3. o fd, y exhiben como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de DNA de una sola hebra del genoma fago, selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe estas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La exhibición fago puede realizarse en una variedad de formatos; para su revisión ver por ejemplo Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Varias fuentes de segmentos de gen V pueden emplearse para exhibición fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), aislaron un conjunto diverso de anticuerpos anti-oxazolona de una biblioteca combinatoria al azar pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donadores humanos no inmunizados puede construirse y anticuerpos a un arreglo diverso de antígenos (incluyendo auto-antígenos) pueden aislarse esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver también las Patentes de los E.U.A. números 5,565,332 y 5, 573, 905. Anticuerpos humanos también pueden generarse por células B activadas in vi tro (ver Patentes de los E.U.A. números 5,567,610 y 5,229,275). (v) Fragmentos de anticuerpo Diversas técnicas se han desarrollado para producir fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver por ejemplo Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por células anfitrionas recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas fago de anticuerpo discutidas anteriormente. En forma alterna, fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de cultivo de células anfitrionas recombinantes. Otras, técnicas para la producción de : fragmentos de anticuerpo serán . aparentes a la persona con destreza. En otras modalidades, el: anticuerpo de selección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) .

. Ver WO 93/16185; Patente de los E.U.A. número 5,571,894; y Patente de los E.U.A. número 5,587,458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo linear", por ejemplo como se describe en la Patente de los E.U.A. número 5,641,870 por ejemplo. Estos fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. (vi) Anticuerpos biespecíficos Anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen biespecificidades de enlace para cuando menos dos epítopos diferentes. Anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden ligar a dos epítopos diferentes de los receptores CD20, DR4 o DR5. Anticuerpos biespecíficos también pueden emplearse para localizar agentes citotóxicos para una célula B. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace de marcador de célula B y un brazo que liga el agente citotóxico (por ejemplo saporina, anti-interferona-a, vinca alcaloide, cadena ricina A, metotrexato o isótopo radioactivo hapteno) . Anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud íntegra o fragmentos de anticuerpo (por • ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Métodos para producir anticuerpos biespecíficos se conocen en la especialidad. Producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud íntegra se basa en la coexpresión de dos pares de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina, en donde las dos cadena stienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido al surtido al azar de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. Purificación de la molécula correcta, que usualmente se realiza por etapas de cromatografía de afinidad, es más bien problemática y sus rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) . De acuerdo con un enfoque diferente, dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión de preferencia es con el dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2, y CH3. Se prefiere el tener la primer región constante de cadena pesada (CH1) que contiene ei sitio necesario para enlace de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada inmunoglobulina y si se desea, la cadena ligera inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en un organismo anfitrión conveniente. Esto proporciona gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipéptido en modalidades en donde proporciones distintas de las tres cadenas polipéptido empleadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo es posible el insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipéptido en proporciones iguales resulta en altos rendimientos o cuando las proporciones no son de significancia particular. En una modalidad preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada inmunoglobulina híbrida con una primer especificidad de enlace en un .'brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera inmunoglobulina híbrido (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro. brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadena inmunoglobulina indeseadas, como la presencia de una cadena ligera inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Este enfoque se describe en WO 94/04690. Para mayores detalles de generar anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). De acuerdo con otro enfoque descrito en la patente de los E.U.A. No. 5,731,168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo pueden someterse a ingeniería para llevar al máximo el por ciento de heterodimeros que se recuperan para llevar al máximo el por ciento de heterodímeros se recuperan de cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende cuando menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la inferíase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo tirosina o triptofano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la o las cadenas laterales grandes se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar grandes cadenas laterales aminoácido con más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales indeseados tales como homodímeros. Anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrelazados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse con avidina, el otro con biotina. Estos anticuerpos tienen, por ejemplo se han propuesto para hacer diana en células de sistema immune a células indeseadas (patente de los E.U.A. No. 4,676,980), y para el tratamiento de infección HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089) . Anticerpos heteroconjugados pueden elaborarse utilizando cualesquiera métodos de reticulado convenientes. Agentes de reticulado convenientes son bien conocidos en la técnica y se describen en la patente de los E.U.A. No. 4,676,980, junto con una cantidad de técnicas de reticulado. Técnicas para generar anticuerpos biespecíficos de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos utilizando enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985); Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) . Diversas técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente de cultivo celular recombinante también se han descrito. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos se han producido utiizando cremalleras leucinas. Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después re-oxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollmger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alterno para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es muy corto para permitir apareamiento entre los ' dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con esto, los dominios VH y VL de un fragmento se forzan para aparear con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, de esta manera formando dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos por el uso de dímeros Fv de cadena sencilla (sFv) también se han reportado. Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994). Anticuerpos con más de dos valencias se contempla. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991). Anticuerpos con tres o más sitios de enlace de antígeno se describen en WO01/77342 (Miller and Presta), expresamente incorporada aquí por referencia.

El anticuerpo empleado en los métodos o incluido en los artículos de manufactura aquí, se conjuga opcionalmente a un agente citotóxico. Agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de estos conjugados de anticuerpo-agente citotóxico se han descrito anteriormente. Conjugados y un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como calicheamicina, una maytansina (patente de los E.U.A. No. 5,208,020), un tricoteno, y CC1065 también se contemplaron aquí. En una modalidad de la invención, el anticuerpo se conjuga con una o más moléculas maytansina (por ejemplo aproximadamente 1 a aproximadamente 10 maytansina por molécula de anticuerpo) . La maytansina, por ejemplo puede convertirse a May-SS-Me que puede reducirse a May-SH3 y reaccionar con anticuerpo modificado (Chari et al. Cáncer Research 52: 127-131 (1992)) para generar un conjugado maytansinoide-anticue po. En forma alterna, el anticuerpo se conjuga con una o más moléculas de calicheamicina. La familia calicheamicina de antibióticos es capaz de producir interrupciones de DNA de doble hebra en concentraciones de sub-picomolares . Análogos estructurales de calicheamicina que pueden emplearse incluyen, pero no están limitados a, ? A , a -A , a A , N-acetil- y A , PSAG y ?x? (Hinman et al. Cáncer Research 53: 3336-3342 (1993) y Lode et al. Cáncer Research 58: 2925-2928 (1998)). Toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden emplearse incluyen cadenas difteria A, fragmentos activos sin enlace de toxina difteria, cadena exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena ricina A, cadenas abrina A, cadena modeccina A, alfa-sarcina, proteínas Aleuritas fordii, proteínas diantinas, proteínas de Fitolaca americana (PAPI, PAPH y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officmalis, gelonina, mitogelina, restrictoc na, feno icina,. enomicina y los tricotecenos . Ver, por ejemplo WO 93/21232 publicado en octubre 28, 1993. La presente invención además contempla anticuerpo conjugado con un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo una ribonucleasa o una DNA endonucleasa tal como deoxiribonucleasa; DNasa) . Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de antagonistas radioconjugados o anticuerpos. Ejemplos incluyen At211, T I131 , t1l25, vY90, pRe„ 186, rR¡e„ 188, S e™m153 , B oi.; 212 , P D 32 e „ i •só ¿ 4t-o^-p^os.- radioactivos de Lu.

Conjugados del anticuerpo y agente citotóxico pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL) , esteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutareldehido) , compuestos bis-azido (tales como bis (?-azidobenzoii) hexandiamina) , derivados bis-diazonio - (tales como bis- (p-diazoniumbenzoil) -etilendiamina) , düsocianatos (tal como tolieno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difiuoro-2, -dinitrobenzeno) . Por ejemplo, una inmunotoxina ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). Ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietilen triaminpentaacético etiquetado con carbon-14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugación de radionucleótido con el antagonista o anticuerpo. Ver WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de la droga citotóxica en la célula. Por ejemplo, un enlazador ácido lábil, enlazador sensible a peptidasa, enlazador dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al. Cáncer Research 52: 127-131 (1992)) puede emplearse. En forma alterna, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y agente citotóxico puede elaborarse, por ejemplo por técnicas recombinantes o síntesis de péptido. Los anticuerpos de la presente invención también pueden conjugarse con una enzima de activación de pro-droga que convierte una prodroga (por ejemplo un agente quimioterapéutico peptidilo, ver WO81/0H45) en una droga anti-cáncer activa. Ver,, .por ejemplo, WO 88/Q7378 y la patente de los E.U. A". No. 4,975,278. El componente activo de . estos conjugados incluye cualquier enzima capaz de actuar en una prodroga, de manera tal que la conviertan en su forma citotóxica más activa. Enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no están limitadas a, fosfatasa alcalina útil para convertir prodrogas que contienen fosfato en drogas libres; arilsulfatasa útil para convertir prodrogas que contienen sulfato en drogas libres; citosina deaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en la droga anti-cáncer, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir prodrogas que contienen péptido en drogas libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir prodrogas que contienen substituyentes D-amino ácido; enzimas que escinden carbohidratos tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir prodrogas glicosiladas en drogas libres; /?-lactamasa útil para convertir drogas derivatizadas con ?-lactamas en grupos libres; y penicilina . amidasas, tales • come penicilina V amidasa o penicilina -.G amidasa, útiles para convertir drogas derivatizadas en sus nitrógenos amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en drogas libres. En forma alterna, anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "aczimas", pueden utilizarse para convertir las prodrogas de la invención en drogas activas libres (ver, e.g., Massey, Na ture 328: 457-458 (1987)). Conjugados de anticuerpos-aezima pueden prepararse como se describe aquí, para suministro de la aczima a una población de células de tumor. Las enzimas de esta invención pueden ligarse covalentemente al anticuerpo por técnicas bien conocidas en la especialidad tales como el uso de los reactivos de entrelazamiento heterobifuncionales discutidos anteriormente. En forma alterna, proteínas de fusión que comprenden al menos la región de enlace de antígeno de un anticuerpo enlazado cuando menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención, pueden construirse utilizando técnicas de DNA recombinantes bien conocidas en la especialidad (ver, e.g., Neuberger et al . , Na ture, 312: 604-608 (1984)). Otras modificaciones del anticuerpo aquí se contemplan. Por ejemplo, el anticuerpo puede ligarse con uno-- de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilen glicol, polipropilen glicol, 'polioxialquilenos o copolímeros de polietilen glicol y polipropilen glicol. - Para incrementar la vida media en suero dei anticuerpo, se puede incorporar un epítope de enlace receptor de recuperación en el anticuerpo (en especial un fragmento de anticuerpo) como se describe en la patente de los E.U.A. No. 5,739,277, por ejemplo. Como se emplea aquí, el término "epítope de enlace receptor de recuperación" se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3 o IgG ) que es responsable por incrementar la vida media en suero in vivo de la molécula IgG. En forma alterna o adicionalmente, se puede incrementar o disminuir la vida media en suero alterando la secuencia aminoácido de la región Fc de un anticuerpo para generar variantes con enlace FcRn alterado. Anticuerpos con enlace FcRn alterado y/o vida media en suero se describen en WO00/42072 (Presta, L . ) .

Formulaciones que comprenden Apo2L/TRAIL, anticuerpos receptores de muerte, y/o anticuerpos CD20 también se proporcionan por la presente invención. Se considera que estas formulaciones serán particularmente convenientes para almacenamiento así como para administración terapéutica. Las formulaciones pueden prepararse por técnicas conocidas. Por ejemplo, las • formulaciones pueden prepararse por intercambio de amortiguador en una columna de filtración de gel. Típicamente, una cantidad apropiada de una sal o portador aceptable se utiliza en la formulación para ser isotónica la formulación. Ejemplos de portadores farmacéuticamente-aceptables incluyen salino, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la formulación de preferencia es de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, y más preferable de aproximadamente 7 a aproximadamente 7.5. Será aparente para aquellas personas con destreza en la técnica que ciertos portadores pueden ser más preferibles dependiendo por ejemplo, de la ruta de administración y concentraciones de ligando de Apo-2, anticuerpos de receptor de muerte, 5 y/o anticuerpos CD20. Composiciones terapéuticas pueden prepararse al mezclar las moléculas deseadas que tienen el grado apropiado de pureza con opcionales portadores, excipientes o estabilizantes (Remington's Pharmaceutical 10. Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)), en la forma de- formulaciones liofilizadas, soluciones acuosas o suspensiones acuosas. - Portadores, excipientes o estabilizantes aceptables de preferencia no son tóxicos a los recipientes a las dosis y concentraciones empleadas, 15 - e incluyen amortiguadores tales como Tris, HEPES, PIPES, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbenzil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro 20 de benzetonio; fenol, butil o benzil alcohol; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratoss incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; azúcares tales como sacarosa, mannitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sales tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEENMR, PLURONICSMR o polietilen glicol (PEG) .

Ejemplos adicionales de estos portadores - incluyen intercambiadores de iones, alumina, esterato de . aluminio, lecitina, proteínas de suero, tales como alumina de suero humano, sustancias amortiguadoras tales como glicina, ácido sórbico, sorbato de potacio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos de vegetales saturados, agua sales o electrolitos tales como sulfato de protamina, hidrógeno fosfato disódico, hidrógeno fosfato potásico, cloruro de sodio, silece coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil pirrolidona y sustancias basadas en celulosa. Portadores para formas tópicas o basadas en gel incluyen polisacáridos tales como carboximetil celulosa o metil celulosa de sodio, polivinil pirrolidona, poliacrilatos, polímeros de bloque polioxietileno-polioxipropileno, polietilen glicol y alcoholes de alugustre arbóreo. Para todas las administraciones, se emplean convenientemente formas de depósito convencionales. Estas formas incluyen por ejemplo microcápsulas, nanocápsulas, liposomas, implastos, formas de inhalación, rocíos nasales, tabletas sublinguales y preparaciones de liberación sostenida. Formulaciones para utilizarse para administración in vivo deberán ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estéril, antes de o después de liofilización y reconstitución. La formulación puede almacenarse en forma liofilizada o en solución si se administra sistémicamente. Si esta en forma liofilizada, típicamente se formula en combinación con otros ingredientes para reconstitución con un diluyente apropiado al tiempo de uso. Un ejemplo de una formulación líquida es una solución estéril, clara incolora sin preservar, llena en una ampolleta de una sola dosis para inyección subcutánea. Formulaciones terapéuticas en general se colocan en un recipiente que tiene una compuerta de acceso estéril, por ejemplo una bolsa o ampolleta de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. Las formulaciones de preferencia se administran como inyecciones o infusiones repetidas e intravenosas (i.v.), subcutáneas (s.c.), intramusculares (i.m.) o como formulaciones en aerosol adecuadas para suministro intranasal o intrapulmonar (para suministro intrapulmonar ver e . g. , EP 257,956). Apo2L/TRAIL, anticuerpos receptores de muerte, y anticuerpos CD20 también pueden administrarse en la forma de preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos convenientes de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices . semipermeables de polímeros hidrafóbicos sólidos que contienen la proteína, estas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli (2-hidroxietil-metacrilato) como se describe por Langer et al . , J. Biomed. Mater. Res., 15 : 167-277 (1981) and Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982) o poli (vinilacohol) ) , polilactidas (patente de los E.U.A. Número 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al . , Biopolymers, 22 : 547-556 (1983)), etilen-vinilo acetato no degradable (Langer et al . , supra ) , copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como Lupron Depot (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y leoprolida acetato) y ácido poly-D- (-) -3-hidroxibutirico (EP 133,988) . Los Apo2L/TRAIL, anticuerpos receptores de muerte, y anticuerpos CD20 aquí descritos, pueden emplearse en una variedad de aplicaciones terapéuticas. Entre estas aplicaciones están métodos para tratar diversos cánceres y enfermedades inmunorelacionadas . Diagnóstico en mamíferos de las diversas condiciones patológicas aquí descritas pueden realizarse por el practicante con destreza. Técnica de diagnóstico están disponibles en la especialidad que permiten, por ejemplo el diagnóstico o detección de cáncer o enfermedad inmunorelacionada en un mamífero. Por ejemplo, pueden identificarse cánceres a través de técnicas, incluyendo pero no limitadas a, palpación, análisis de sangre, rayos X, RMN y semejantes. Enfermedades inmunorelacionadas también puede ser fácilmente identificadas. En lupus sistémico eritematoso, el mediador central de la enfermedad es la producción de anticuerpos autoreactivos a autoproteínas/tejidos y la generación subsecuente de inflamación inmunomediada. Múltiples órganos y sistemas se afectan clínicamente incluyendo riñon, pulmón, sistema músculo-esquelético, mucocutáneo, ojo, sistema nervioso central, sistema cardiovascular, tracto gastrointestinal, médula ósea y sangre. Artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria auto inmune sistémica crónica que primordialmente involucra la membrana sinovial de múltiples articulaciones con lesión resultante al cartílago articular. La patogénesis es dependiente de linfocitos T y se asocia con la producción de factores reumatoides, auto-anticuerpos dirigidos contra auto IgG, con la formación resultante de complejos inmune que alcanzan altos niveles en el fluido de articulación y la sangre. Estos complejos en la articulación pueden inducir al infiltrado marcado de linfocitos y monocitos en el sinovio y subsecuentes cambios sinoviales marcados; el espacio/fluido de articulación de infiltrarse por células similares con la adición de numerosos neutrófilos. Tejidos afectados son primordialmente las articulaciones, a menudo en patrón simétrico. Sin embargo, enfermedad extra-articular también ocurre en dos formas principales. Una forma es el desarrollo de lesiones extra-articulares con avance continuo de enfermedad de la articulación y lesiones típicas de fibrosis pulmonar, vasculitis y úlceras cutáneas. La segunda forma de enfermedad extra-articular es el así denominado síndrome de Felty, que ocurre posteriormente en el curso de la enfermedad RA, en ocasiones después de que la enfermedad de la articulación inactiva e involucra la presencia de neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia. esto puede estar acompañado por vasculitis en múltiples órganos con formaciones de infartos, úlceras en la piel y gangrena. Los pacientes a menudo también desarrollan nodulos reumatoides en el tejido subcutáneo superpuesto a las articulaciones afectadas; la etapa tardía de los nodulos tienen centros necróticos circundados por un infiltrado de células inflamatorias mixtas. Otras manifestaciones que pueden ocurrir en RA se incluyen pericarditis, pleuritis, arteritis coronaria, neumonitis intersticial con fibrosis pulmonar, keratoconjuntivitis seca u nodulos reumatoides. Los Apo2L/TRAIL, anticuerpos receptores de muerte, y anticuerpos CD20 pueden administrarse de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa como un bolo o por infusión continua sobre un periodo de tiempo, por rutas intramuscular, intraperitonial, intracerebroespinal y subcutánea, intrarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o de inhalación. Opcionalmente, la administración puede realizarse a través de infusión de mini bomba utilizando diversos dispositivos comercialmente disponibles. Dosis y programas efectivos para administración de Apo2L/TRAIL, anticuerpos receptores de muerte, y anticuerpos CD20 pueden determinarse empíricamente, y hacer estas determinaciones esta dentro de la destreza en la técnica. Dosis sencillas o múltiples pueden emplearse. Actualmente se considera que una dosis o cantidad efectiva de Apo2L/TRAIL utilizado solo puede estar en el rango de aproximadamente 1 :g/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal o más por día. Escala de dosis mterespecies puede realizarse de una forma conocida en la técnica, por ejemplo como se describe en Mordenti et al., Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991). Cuando se emplea administración in vivo de un Apo2L/TRAIL, cantidades de dosis normales pueden variar de aproximadamente 10 ng/kg a hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de mamífero o más por día, de preferencia aproximadamente 1 µg/kg/día a 10 mg/kg/día dependiendo de la ruta de administración. La guía en cuanto a la dosis y métodos particulares de suministro se proporciona en la literatura; ver por ejemplo las patentes de los E.U.A. Números 4,657,760; 5,206,344; or 5,225,212. Se anticipa que serán efectivas diferentes formulaciones para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes desórdenes, que la administración que hace diana en un órgano o tejido o por ejemplo puede requerir suministro en una forma diferente de aquella a otro órgano o tejido. Aquellos conocedores de la técnica comprenderán que la dosis de Apo2L/TRAIL que debe administrarse variará dependiendo por ejemplo del mamífero que recibe el Apo2L/TRAIL, la ruta de administración y otras drogas o terapias que se administran al mamífero. . - El anticuerpo CD20 puede ser un anticuerpo tal como .Rituximab o 2H7 humanizado, que no se conjuga a un - agente citotóxico. Dosis adecuadas para un anticuerpo no conjugado por ejemplo están en el rango de aproximadamente 20 mg/m2 a aproximadamente 1000 mg/m2. En una modalidad, la dosis del anticuerpo difiere de la actualmente recomendada para Rituximab. Regímenes de dosis ejemplares para el anticuerpo CD20 incluyen 375 mg/m2 semanalmente x 4 o 8; o 1000 mg x 2 (por ejemplo los días 1 y 15) . Se contempla que todavía a terapias adicionales pueden emplearse en los métodos. La una o más otras terapias pueden incluir pero no están limitadas a administración de terapia radiación, citocina (s), agente o agentes inhibidores de crecimiento, agente o agentes quimio terapéuticos. Agente o agentes citotóxicos, inhibidores de tirocina cinasa, inhibidores de ras farnesil transferasa, inhibidores de angiogenesis, e inhibidores de cinasa dependientes de ciclina, que son 5 conocidos en la técnica y definen más con la particularidad en la sección I anterior. Anticuerpos terapéuticos ejemplares incluyen los anticuerpos anti-HER2, incluyendo rhuMAb 4D5 (HERCEPTIN.) (Cárter et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 10. . 89:4285-4289 (1992), patente de los E.U.A. Número 5,725,856); anti-IL-8 (St John et al . , Chest, 103:932 (1993), y la publicación internacional Número No. WO 95/23865) ; anticuerpos anti-VEGF incluyendo anticuerpos anti-VEGF humanizados y/o madurados por afinidad tales 15 como el anticuerpo anti-VEGF humanizado huA4.6.1 AVASTIN.

(Kim et al . , Growth Factors, 7:53-64 (1992), la publicación internacional Número WO 96/30046, y WO 98/45331 publicada en octubre 15, 1998); anticuerpos anti-PSCA (WO01/40309) ; anticuerpos anti-CD40, incluyendo 20 S2C6 y sus variantes humanizadas (WO00/75348 ) ; anticuerpos anti-CDlla incluyendo Raptiva™ (patente de los E.U.A. Número 5,622,700, WO 98/23761, Steppe et al . , Transplant In tl . 4:3-7 (1991), y Hourmant et al . , Transplanta tion 58:377-380 (1994)); anticuerpos anti-IgE (Presta et al . , J. Immunol . 151:2623-2632 (1993), y la publicación internacional Número WO 95/19181; patente de los E.U.A. Número 5,714,338 otorgada en febrero 3, 1998 o la patente de los E.U.A. Número 5,091,313 otorgada en febrero 25, 1992, WO 93/04173 publicada en marzo 4, 1993 o la solicitud internacional Número PCT/US98/13410 presentada en junio 30, 1998, patente de los E.U.A. Número 5,714,338; anticuerpos anti-CD18 (patente de los E.U.A. Número 5,622,700, otorgada en abril 22, 1997 o como en WO 97/26912, publicada en julio 31, 1997; anticuerpos de anticuerpo receptor de anti-Apo-2 (WO 98/51793) publicada en noviembre 19, 1998; anticuerpos anti-TNF-alpha (incluyendo cA2 (REMICADE.), CDP571 y MAK-195 (Ver, patente de los E.U.A Número 5,672,347 otorgada en septiembre 30, 1997, Lorenz et al . J. Immunol . 156(4) :1646-1653 (1996), y Dhainaut et al . Cri t . Care Med. 23 (9) : 1461-1469 (1995)); anticuerpos de factor antitejido (TF) (patente europea Número 0 420 937 Bl otorgada en noviembre 9, 1994); anticuerpos a4-ß7 integrina anti-humanos (WO 98/06248 publicada en febrero 19, 1998); anticuerpos anti-EGFR (anticuerpo quimérico o humanizado 225 como en WO 96/40210 publicado en diciembre 19, 1996); anticuerpos anti-CD3 tales como OKT3 (patente de los E.U.A. Número 4,515,893 otorgada en mayo 7, 1985); anti- CD25 o anticuerpos anti-Tac tales como CHI-621 (SIMULECT.) y ZENAPAX . (Ver patente de los E.U.A. Número 5,693,762 otorgada en diciembre 2, 1997); anticuerpos anti-CD4 tales como el anticuerpo cM-7412 (Choy et al . 5 Arthri tis Rheum 39(1): 52-56 (1996)); anticuerpos anti- CD52 tales como CAMPATH-1H (Riechmann et al . Na ture 332:323-337 (1988); anticuerpos de receptor anti-Fc tales como el anticuerpo M22 dirigido contra Fc . Rl como en Graziano et al . J. Immunol . 155 ( 10) : 4996-5002 (1995); 0 anticuerpos de antígeno anti-carcinoembriónico (CEA) tal .como hMN-14 (Sharkey et al . Cáncer - Res . 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995); anticuerpos dirigidos contra células • J ' epiteliales de mama incluyendo huBrE-3, hu-Mc 3 y CHL6 J Cerlani et al . Cáncer Res . 55(23): 5852s-5856s (1995); 5 and Richman et al . Cáncer Res . 55(23 Supp) : 5916s-5920s (1995)); anticuerpos que ligan a células de carcinoma de colon tales como C242 (Litton et al . Eur J. Immunol . 26(1): 1-9 (1996)); anticuerpos anti-CD38, por ejemplo AT 13/5 (Ellis et al . J. Immunol . 155 (2) : 925-937 (1995)); 0 anticuerpos anti-CD33 tales como Hu M195 (Jurcic et al . Cáncer Res 55(23 Suppl) : 5908s-5910s (1995) y CMA-676 o CDP771; anticuerpos anti-CD22 tales como LL2 o LymphoCide (Juweid et al . Cáncer Res 55(23 Suppl) : 5899s-5907s (1995); anticuerpos anti-EpCAM tales como 17-1A (PANOREX.); anticuerpos anti-GpIIb/IIIa tales como abciximab o c7E3 Fab (REOPRO.); anticuerpos anti-RSV tales como MEDI-493 (SYNAGIS.); anticuerpos anti-CMV tales como PROTOVIR.; anticuerpos anti-HIV tales como PR0542; anticuerpos anti-hempatitis tales como el anticuerpos anti-Hep B OSTAVIR.; anticuerpo anti-CA 125 OvaRex; anticuerpo de epitope GD3 anti-idiotípico BEC2; anticuerpo anti-. v.3 VITAXIN.; anticuerpo de carcinoma de células renales anti-humano tal como ch-G250; ING-1; anticuerpo 17-1A anti-humano (3622W94); anticuerpo de tumor colorectal anti-humano (A33); anticuerpo de melanoma anti-humano R24 dirigido contra gangliosido GD3; carcinoma de células escamosas anti-humano (SF-25) y anticuerpo de antígeno de leucocitos anti-humanos (HLA) tales como Smart ID10 y el anticuerpo anti-HLA DR Oncoiym (Lym-1) . Programas de preparación y dosificación para agentes quimioterapéuticos pueden emplearse de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes o como se determina empíricamente por la persona con destreza. Programas de preparación y dosificación para esta quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wiikins, Baltimore, MD (1992). El agente quimioterapéutico puede preceder o seguir la administración del Apo2L/TRAIL, anticuerpo receptor de muerte y/o anticuerpo CD20, o puede suministrarse simultáneamente. En ocasiones, puede ser benéfico también administrar una o más citosinas o agente inhibidor de crecimiento. Los Apo2L/TRAIL, anticuerpo receptor de muerte, y anticuerpos CD20 (y una o más otras terapias) pueden administrarse concurrentemente o secuencialmente. Después de administración, células tratadas in vi tro pueden ser analisadas. Cuando ha habido tratamiento ín vivo, un - ' mamífero tratado puede ser supervisado en diversas formas bien - conocidas para la persona con destreza en la especialidad. Por ejemplo, células de cáncer pueden ser examinadas patológicamente para ensayar necrosis o suero puede analisarse para respuestas del sistema inmune. Para RA, y otras enfermedades auto inmunes, el Apo2L/TRAIL, anticuerpo receptor de muerte, y/o anticuerpo CD20 pueden combinarse con cualquiera uno o más de los agentes inmunosupresores, agentes quimioterapéuticos y/o citocinas citadas en la sección de definiciones anterior; cualquiera uno o más drogas anti reumáticas que modifican la enfermedad (DMARDs=Disease- modifying antirheumatic drugs) tales como hidroxicloroquina, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, azatioprina, D-penicilamina, oro (oral), oro (intramuscular), minociclina, ciclosporina, inmunoadsorción de proteína A de estafilococos; inmunoglobulina intravenosa (IVIG); drogas antiflamatorias no-esteroidales (NSAIDs); glucocorticoide (por ejemplo inyección mediante articulación) ; corticoesteroide (por ejemplo metilprednisolona y/o , prednisona); folato; un anticuerpo de factor de necrosis antitumor (TNF) , por ejemplo etanercept/ENBREL™, infliximab/REMICADE™, D2E7 (Knoll) o CDP-870 (Celltech); antagonista IL-1R (por ejemplo Kineret) ; antagonista IL- 10 (por ejemplo Hodecakin) ; modulador de coagulación de - la sangre (por ejemplo WinRho) ; un antagonista IL-6/ anti-TNF (CBP 1011); antagonista CD40 (por ejemplo IDEC 131); antagonista receptor Ig-Fc (MDX33); inmunomodulador (por ejemplo talidomida o ImmuDyn) ; anticuerpo anti-CD5 (por ejemplo H5gl.l); inhibidor de macrófago (por ejemplo MDX 33) ; bloqueador coestimulatorio (por ejemplo BMS 188667 o Tolerimab) inhibidor de complemento (por ejemplo h5Gl.l, 3E10 o un anticuerpo de factor de aceleración anti-deterioro (DAF=decay accelerating factor) ) ; o antagonista IL-2 (zxSMART). Para malignidades de célula B, por ejemplo, el Apo2L/TRAIL, anticuerpo de receptor de muerte, y/o anticuerpo CD20 pueden combinarse con un agente quimioterapéutico; citosina, por ejemplo una linfocina tal como IL-2, IL-12, o una interferona, tal como interferona alfa-2a; otro anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo radio etiquetado tal como ibritumomab tiuxetan (ZEVALIN®), tositumomab yodo I131 (BEXXAR™) , 131I Lym-1 (ONCOLYM™), 90Y-LYMPHOCIDE™; anticuerpo anti-CD52, tal como alemtuzumab (CAMPATH-1H™) , anti-HLA-DR-ß anticuerpo, tales como apolizumab, anticuerpo anti-CD80 (por ej emplo IDEC-114), epratuzumab, HulDlO (SMART 1D10™) , anticuerpo CD19, anticuerpo CD40 o anticuerpo CD22; un inmunomodulador (por ej emplo talidomida o ImmuDyn) ; un inhibidor de angiogenesis (por ejemplo un anticuerpo factor de crecimiento endotelial anti-vascular (VEGF) tal como AVASTIN™ o talidomida) ; vacuna de idiotipo (EPOCH) ; ONCO-TCS™; HSPPC-96 (ONCOPHAGE™) ; terapia liposomal (por ejemplo daunorubicina citrato liposoma), etcétera. En otra modalidad de la invención, artículos de manufactura que contienen materiales útiles para tratamientos de cáncer o enfermedad inmuno relacionada, descrita anteriormente, se proporcionan. En un aspecto, el artículo de manufactura comprende (a) un recipiente que comprende el anticuerpo CD20 (de preferencia el recipiente comprende el anticuerpo y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable dentro del recipiente) ; (b) un recipiente que comprende Apo2L/TRAIL o anticuerpo receptor de muerte (de preferencia el recipiente comprende el Apo2L/TRAIL o anticuerpo receptor de muerte y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable dentro del recipiente); y (c) un inserto de empaque con instrucciones para tratar cáncer o enfermedad inmuno relacionada en un paciente, en donde las instrucciones indican que cantidades del anticuerpo CD20 y el Apo2L/TRAIL o anticuerpo receptor de muerte se administran al paciente, que son • efectivas para proporcionar actividad sinergística para tratar la enfermedad. En todos estos aspectos, el inserto de empaque esta en o asociado con el recipiente. Recipientes convenientemente incluye, por ejemplo, botellas, ampolletas, jeringas, etcétera. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tal como vidrio o plástico. El recipiente contiene o retiene una composición que es efectiva para tratar el cáncer o enfermedad inmuno relacionada y puede tener una compuerta de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una ampolleta o bolsa de solución intravenosa que tienen un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos uno agente activo en la composición es el anticuerpo CD20, Apo2L/TRAIL o anticuerpo receptor de muerte. Etiqueta o inserto de empaque indica que la composición se emplea para tratar cáncer o enfermedad inmuno relacionada en un paciente o sujeto elegible para tratamiento con guía específica respecto a las cantidades e intervalos de dosis del anticuerpo y cualquier otro medicamento que se proporcione. El artículo de manufactura puede además comprender un recipiente adicional que comprende un amortiguador diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección de (BWFI bacteriostatic water for injection), salina amortiguado con fosfato, solución de Ringer 's, y/o solución dextrosa. El articulo de manufactura puede además incluir otros materiales desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. Los siguientes ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos solamente, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención en forma alguna. Todas las referencias de patente y de literatura citadas en la presente especificación aquí se incorporan por referencia en su totalidad. EJEMPLOS Reactivos comercialmente disponibles referidos en los ejemplos se emplearon de acuerdo las instrucciones del fabricante a menos que se indique de otra forma. La fuente de esas células identificadas en los siguientes ejemplos, y a través de la especificación, a manera de referencia a la ATCC es la colección de cultivos tipo americano (American Tipe Culture Collección, Manassas) , Virginia. • . : > Ejemplo 1 ' . Análisis de expresión de - receptor Apo2L/TRAIL en las líneas celulares de linfoma B Para examinar la expresión de superficie celular de receptores Apo2L/TRAIL ( DR4 , DR5, DcRl, y DcR2 ) en líneas celulares de linfoma humano, las líneas celulares de linfoma B Ramos, Daudi, Raji, y BJAB (ATCC) se analizaron por FACS utilizando anticuerpos monoclonales específicos para DR4 (mAb 4H6.17.8; ATCC HB-12455), DR5 (mAb 3H3.14.5; HB-12534), DcRl (mAb 6G9; Genentech, Inc.), o DcR2 (mAb 1G9, Genentech, Inc.) Para células Ramos, el análisis se llevo a cabo dos veces para asegurar capacidad de reproducción (RAMOS A y B) . Como se ilustra en la Figura 4, DR4 y DR5 se expresaron a niveles significantes (desplazamiento de fluorescencia promedio de aproximadamente 0.5 - 1.7 unidades) en todas las cuatro líneas celulares, mientras que DcRl y DcR2 se expresaron a niveles menores o mínimos (desplazamiento de fluorescencia promedio de aproximadamente 0 - 0.3 unidades). Ejemplo 2 Análisis de expresión CD20 en Líneas celulares de linfoma B Para examinar la expresión de superficie celular de CD20 en líneas celulares de linfoma humano, las líneas celulares de linfoma B Ramos, Daudi, Raji, y BJAB (ATCC) se analizaron por FACS utilizando un anticuerpo monoclonal específico para CD20 (RITUXAN®, Genentech, Inc.). Para células Ramos, el análisis se llevo a cabo dos veces para asegurar capacidad de reproducción (RAMOS A y B) . Como se ilustra en la Figura 5, todas las cuatro líneas celulares expresaron altos niveles de CD20, indicado por un desplazamiento de fluorescencia promedio de aproximadamente 5 - 15 unidades. Ejemplo 3 Efecto de Apo2L/TRAIL, RITUXAN®, o tratamiento en combinación en el crecimiento de xeno injertos de tumor de linfoma BJAB subcutáneo pre-establecidos en ratones SCID Ratones SCID se inyectaron subcutáneamente con líneas de células BJAB no-Hodgkin' s de célula B humano (ATCC) (20 millones de células por ratón) y se dejo que crecieran tumores a ~200 mm3. Los ratones se dividieron entonces en 4 grupos de estudio (8 ratones por grupo) y trataron con cinco dosis intraperitoneales (IP) por semana durante 2 semanas (es decir, los días 0-4 y 7-11) - .de vehículo (Arg-Succinato .0.5M /Tris 20mM/Tween 20 0.02% pH =7.2), Apo2L/TRAIL (amino ácidos 114-281 de la Figura 1) (j60 mg/kg), o con 1 dosis IP por semana durante ,2 semanas (es decir, los, días .0 y 7) de RITUXAN® (4 mg/kg, Genentech, Inc.), o la combinación de estos últimos regimenes Apo2L/TRAIL y RITUXAN® (Figura 6) . Tumores en ratones tratados con vehículo crecieron rápidamente, mientras que tratamiento con un solo agente Apo2L/TRAIL o RITUXAN® retardo marcadamente el crecimiento de tumor. Un ratón en el grupo Apo2L/TRAIL mostró erección de tumor completa, dejando una incidencia de tumor (TI) de 7/8. Tratamiento de RITUXAN® no erosiona ningunos tumores pero mostró un efecto más prolongado. De manera importe, el tratamiento combinado con Apo2L/TRAIL y RITUXAN® provoco una reducción dramática en el volumen de tumor en todos los ratones, con 5 de 8 ratones que mostraron ablación completa del tumor y 3/8 que mostraron mínimo crecimiento de tumor por al menos 28 días. Estos resultados indican que Apo2L/TRAIL y RITUXAN® pueden ejercer actividad anti-tumor sinergística contra xeno injertos de linfoma. Ejemplo 4 Efecto de Apo2L/TRAIL, RITUXAN®, o tratamiento de combinación en el crecimiento de xeno injertos de tumor de linfoma BJAB subcutánea pre-establecidos desatollados en ratones SCID Un estudio similar al descrito en el Ejemplo 3 se realizo. Ratones SCID se inyectaron subcutáneamente con células de linfoma BJAB no-Hodgkin' s de célula B humano (ATCC) (20 millones de células por ratón) y se dejo que crecieran los tumores hasta ~200 mm3. Los ratones se dividieron en 4 grupos de estudio (8 ratones por grupo) y trataron con cinco dosis intraperitoneales (IP) por semana durante 2 semanas (es decir, los días 0-4 y 7-11) de vehículo (Arg-Succinato 0.5M/Tris 20mM/ Tween 20 0.02% pH =7.2), Apo2L/TRAIL ("Apo2L.O"; amino ácidos 114-281 de la Figura 1) (60 mg/kg), o con 1 dosis IP por semana durante 2 semanas (es decir, los días 0 y 7) de RITUXAN® (4 mg/kg), o la combinación de estos últimos regímenes Apo2L/TRAIL y RITUXAN®. Los resultados demuestran en la Figura 7. Tumores en ratones tratados con vehículo crecieron rápidamente, mientras que tratamiento de un solo agente Apo2L/TRAIL o RITUXAN® retrazo marcadamente el crecimiento de tumor. Ninguno de Apo2L/TRAIL ni RITUXAN® solos provocaron regresiones completas, mientras que RITUXAN® mostró un efecto más prolongado. Como en el estudio descrito en el Ejemplo 3, tratamiento combinado con Apo2L/TRAIL y RITUXAN® provoco una reducción marcada en volumen de tumor en todos los ratones, con 6 de 7 • ratones que mostraron erosión completa de tumor. Estos resultados indican que Apo2L/TRAIL y RITUXAN® pueden ejercer actividad anti-tumor sinergística contra xeno - injertos de linfoma. Ejemplo 5 Efecto de Apo2L/TRAIL, RITUXAN®, o tratamiento de combinación en procesamiento de caspasa en xeno injertos de tumor BJAB de linfoma subcutáneos pre-establecidos desarollados en ratones SCID Para examinar el procesamiento de caspasas que median apoptosis en tumores tratados (indicado por procesamiento de caspasa proteolítica) , ratones SCID wse inyectaron subcutáneamente con células de linfoma BJAB no Hodgkin' s de célula B humanos (ATCC) (20 millones de células por ratón) y se dejo que los tumores crecieran a -200 mmJ Los ratones se trataron con vehículo (Arg-Succinato 0.5M/Tris 20mM/Tween 20 0.02% pH =7.2) (n=l), 1 dosis IP de Apo2L/TRAIL (60 mg/kg) (n=l) , o 1 dosis IP de RITUXAN® (4 mg/kg, Genentech, Inc.) (n=2), o la combinación de estas últimas dosis po2L/TRAIL y RITUXAN® (n=2) . Dos días después del tratamiento, los tumores se recolectaron, lisaron en amortiguador de lisis, y sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos específicos contra Caspasa 8, 3, 9, y 7 (con anticuerpo acción anti -beta como un control de carga) para visualizar procesamiento de. caspasa (Figura 8) . Tratamientos de Apo2L/TRAIL (A) induce procesamiento incrementado de caspasa 8, 3, 9, y 7 en comparación al vehículo de control (V) , mientras que RITUXAN® (R) no induce procesamiento de caspasa. En forma notable, el tratamiento de combinación con Apo2L/TRAIL y RITUXAN® (AR) no aumenta adicionalmente el procesamiento de caspasa en comparación con Apo2L/TRAIL solo. Estos resultados sugieren que la actividad anti-tumor sinergística entre Apo2L/TRAIL y RITUXAN® no esta mediado necesariamente por mejora de apoptosis, sugiriendo que la combinación de activación apoptosis mediada por Apo2L/TRAIL y lisis dependiente de complemento junto con ADCC mediada por RITUXAN® puede estar subyacente a la sinergia anti-tumor observada. Ejemplo 6 Ejemplo de anticuerpo DR5 agonista, RITUXAN®, o tratamiento de combinación en el crecimiento de xeno injertos de tumor de linfoma BJAB subcutáneo preestablecidos en ratones SCID Ratones SCID se inyectaron subcutáneamente con células de linfoma BJAB .no. Hodgkin' s de célula B humano (ATOO) (20 millones de células por ratón) y se dejo que crecieran tumores a ~200 mm3. Los ratones se dividieron en 4 grupos de estudio '(7 ratones por grupo) y trataron con una inyección intraperitoneal (IP) por semana durnate 2 semanas (es decir, los días 0 y 7) de vehículo (Arg-Succinato 0.5M/Tris 20mM/Tween 20 0.02%pH =7.2), anticuerpo monoclonal DR5 agonista ( "Apomab" )( 10 mg/kg), o RITUXAN® (4 mg/kg), o la combinación de estos últimos regimenes de anticuerpo DR5 y RITUXAN® (Figura 9) . Tumores en ratones tratados con vehículo crecieron rápidamente, mientras que tratamiento de anticuerpo DR5 de un solo agente o RITUXAN® retardo marcadamente tumor de crecimiento. En forma importe, tratamiento combinado con anticuerpo DR5 y RITUXAN® provoco una reducción dramática en volumen de tumor en todos los ratones, con 5 a 7 ratones que muestran erosión de tumor completa y 2/7 muestran crecimiento de tumor mínimo por al menos 35 días. Estos resultados indican que el anticuerpo agonista DR5 y RITUXAN® puede ejercer actividad anti-tumor sinergística contra xeno injertos linfoma. Ejemplo 7 Efecto de anticuerpo DR5 agonístico, RITUXAN®, o tratamiento de combinación en procesamiento de caspasa en xeno injertos de tumor de linfoma BJAB subcutáneos preestablecidos desarrollados en ratones SCID Para examinar el procesamiento de caspasa que media apoptosis en tumores tratados (indicado por procesamiento de caspasa proteolítica) , ratones SCID se inyectaron subcutáneamente con células de linfoma BJAB no Hodgkin' s célula B human (ATCC) (20 millones de células por ratón) y se dejo que crecieran tumores a ~200 mm3. Los ratones después se trataron con vehículo (Arg-Succinato 0.5M/Tris 20mM/Tween 20 0.02% pH =7.2) (n=l), o 1 dosis IP de RITUXAN® (4 mg/kg) (n=2), o 1 dosis IP de anticuerpo agonista DR5 (10 mg/kg) (n=2), o la combinación de estas últimas dosis de anticuerpo DR5 y RITUXAN® (n=2) . Dos días después de tratamiento, los tumores se recolectaron, Usaron en amortiguador de lisis, y sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos específicos contra Caspasa 8, 3, 9, y 7 (con anticuerpo actina anti-beta como control de carga) para visualizar procesamiento de caspasa (Figura 10). Tratamiento de anticuerpo agonista DR5 (A) induce incrementado procesamiento de caspasa 8, 3, 9, y 7 en comparación con el control de vehículo (V) , mientras que RITUXAN® (R) no induce procesamiento de caspasa. En forma notable, tratamiento de combinación con anticuerpo , DR5 y RITUXAN® (AR) no aumenta más el' procesamiento de caspasa en comparación con el anticuerpo DR5 solo. Estos •. -resultados sugieren que la actividad anti-tumor sinergística entre- el anticuerpo DR5 y RITUXAN® no necesariamente esta mediado por mejora de apoptosis, sino más- bien la combinación de activación de apoptosis mediada por anticuerpo agonista DR5 y lisis dependiente de complemento junto con ADCC mediado por RITUXAN® puede estar subyacente a la sinergia anti-tumor observada. Además datos que ilustran la expresión de receptores CD20 y Apo2L/TRAIL en líneas celulares NHL y sus efectos de Rituximab, Apo2L/TRAIL y combinaciones de los mismos en células de cáncer se proporciona en las Figuras 11-16.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar células de cáncer, caracterizado porque comprende exponer células de cáncer de mamífero a una cantidad sinergísticamente efectiva de anticuerpo receptor de muerte agonista y anticuerpo CD20.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo monoclonal receptor anti-DR5.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo monoclonal receptor anti-DR4.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de cáncer se exponen a la cantidad sinergística efectiva de anticuerpo receptor de muerte agonista y anticuerpo CD20 in vivo.

5. El método de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque el anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

6. El método de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque el anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo humano.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo que reacciona en forma cruzada con más de un receptor de ligando Apo-2.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de cáncer son células de linfoma.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende exponer las células de cáncer a uno o más agentes inhibidores de crecimiento.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende exponer las células a radiación.

11. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo DR5 tiene una afinidad de enlace receptor DR5 de 108 M"1 a 1012 M"1.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo receptor de muerte y el anticuerpo CD20 se expresan en una célula anfitriona recombinante seleccionada del grupo que consiste de una célula CHO, célula de levadura y E. coli .

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo CD20 es un anticuerpo monoclonal.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo CD20 es el anticuerpo Rituximab.

15. Un método para tratar una enfermedad inmuno relacionada, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero una cantidad efectiva sinergística de anticuerpo receptor de muerte agonista y anticuerpo CD20.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo monoclonal receptor anti-DR5.

17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo monoclonal receptor anti-DR4.

18. El método de conformidad con la reivindicación 16 o 17, caracterizado porque el anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

19. El método de conformidad con la reivindicación 16 o 17, caracterizado porque el anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo humano .

20. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo receptor de muerte agonista es un anticuerpo que reacciona en forma cruzada o retícula con más de un receptor ligando Apo-2.

21. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la enfermedad inmuno relacionada es artritis reumatoide o esclerosis múltiple .

22. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo DR5 tiene una afinidad de enlace receptor DR5 de 108 M"1 a 1012 M"1.

23. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo receptor de muerte y el anticuerpo CD20 se expresan en una célula anfitriona recombinante seleccionada del grupo que consiste de una célula CHO, célula de levadura y E. coli .

24. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo CD20 es un anticuerpo monoclonal.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el anticuerpo CD20 es el anticuerpo Rituximab.

26. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 15, caracterizado porque el anticuerpo receptor de muerte y el anticuerpo CD20 se administran secuencialmente .

27. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 15, caracterizado porque el anticuerpo receptor de muerte y el anticuerpo CD20 se administran concurrentemente .