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TW202535947A - ＣＤ３３抗體、ＣＤ３３／Ｖδ２多特異性抗體及其用途 - Google Patents

ＣＤ３３抗體、ＣＤ３３／Ｖδ２多特異性抗體及其用途

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TW202535947A
TW202535947A TW113147542A TW113147542A TW202535947A TW 202535947 A TW202535947 A TW 202535947A TW 113147542 A TW113147542 A TW 113147542A TW 113147542 A TW113147542 A TW 113147542A TW 202535947 A TW202535947 A TW 202535947A
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TW
Taiwan
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seq
antigen
antibody
binding fragment
heavy chain
Prior art date
Application number
TW113147542A
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English (en)
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莎拉 埃拉斯卡爾
洛雷娜 卡拉爾
史蒂文 賈各布斯
烏爾麗克 菲力帕
派翠克 杜南
保羅 帕倫
薩布莉娜 梅拉特
羅伯圖斯 羅福斯
約翰尼斯 范德弗利特
寶拉 范赫爾登
Original Assignee
美商健生生物科技公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

描述了CD33抗體及其抗原結合片段，以及CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段。亦描述了編碼該等抗體之多核苷酸、包含該等抗體之組成物、產生該等抗體之方法、及使用該等抗體治療或預防諸如血液癌症之疾病的方法。

Description

CD33抗體、CD33/Vδ2多特異性抗體及其用途
相關申請案之交互參照
本申請案主張2023年12月8日申請之美國臨時專利申請案第63/608,030號之優先權，其揭露內容係以引用方式全文併入本文中。
本文提供了CD33抗體、多特異性CD33/Vδ2抗體、編碼該等抗體之核酸及表現載體、含有該等載體之重組細胞、及包含該等抗體之組成物。亦提供了製造該等抗體之方法及使用該等抗體治療包括血液癌症之疾病的方法。
電子提交序列表之參照
本申請案含有序列表，其係藉由電子方式提交。電子序列表（Sequence Listing JBI6837PCT1 Sequence Listing.xml；大小：132KB；以及創建日期：2024年12月5日）中所含的資訊係以引用方式全文併入本文中。
由於AML癌細胞（母細胞）的不同特徵以及不存在AML特異性抗原，針對急性骨髓性白血病(AML)特異性目標的免疫療法構成了重大的臨床障礙。CD33係一種細胞表面蛋白，其已在85%至90%的呈現AML之患者的母細胞及白血病幹細胞中檢測到。有趣的是，CD33之表現僅限於造血細胞(Paul, Taylor, Stansbury, & McVicar, 2000; Ulyanova, Blasioli, Woodford-Thomas, & Thomas, 1999)，但在正常造血幹細胞上不存在(Andrews, Torok-Storb, & Bernstein, 1983; Griffin, Linch, Sabbath, Larcom, & Schlossman, 1984; Jilani et al., 2002)。
儘管針對CD33之各種抗病毒療法（諸如嵌合抗原受體(CAR)-T及CAR-NK細胞療法）正在進行臨床評估，但已出現挑戰。具體而言，涉及靶向CD33之CD3 T細胞接合劑之療法遇到了與功效、耐受性及非所欲的安全性相關的問題。因此，解決對傳統化學療法不起反應之AML及MDS患者未滿足的醫療需求勢在必行。
在一個大致態樣中，本文提供了結合癌細胞，特別是AML或骨髓增生不良症候群(MDS)細胞之CD33的抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段結合膜結合之CD33 (mCD33)。
在另一大致態樣中，本文提供了結合至癌細胞之CD33及在Vγ9Vδ2 T細胞上表現之T細胞受體之Vδ2鏈的多特異性抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，抗體、多特異性抗體或其抗原結合片段結合mCD33。在某些實施例中，CD33抗體、CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段結合CD33之C2域。在某些實施例中，CD33抗體、CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段特異性結合至CD33，較佳地人類CD33。在某些實施例中，CD33抗體、CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段並不顯著結合至可溶性人類CD33 (sCD33)。
提供了特異性結合至mCD33之抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含： a.     各別包含SEQ ID NO: 12、13、及14之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)；及 各別包含SEQ ID NO: 15、16、及17之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、輕鏈互補決定區2 (CDR2)、及輕鏈互補決定區3 (CDR3)； b.     各別包含SEQ ID NO: 18、19、及14之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 15、16、及17之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3； c.     各別包含SEQ ID NO: 20、21、及14之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 15、16、及17之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3；或 d.     各別包含SEQ ID NO: 22、23、及24之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 25、26、及17之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3。 e.     各別包含SEQ ID NO: 27、28、及29之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 30、31、及32之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3； f.     各別包含SEQ ID NO: 33、34、及29之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 30、31、及32之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3； g.     各別包含SEQ ID NO: 35、36、及29之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 30、31、及32之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3；或 h.     各別包含SEQ ID NO: 37、38、及39之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 40、41、及32之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO: 42或44至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列之重鏈可變區(VH)，或含有與SEQ ID NO: 43或45至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含含有SEQ ID NO: 42之VH或含有SEQ ID NO: 43之VL。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含含有SEQ ID NO: 44之VH或含有SEQ ID NO: 45之VL。
在某些實施例中，CD33抗體之抗原結合片段係單一重鏈可變區(VHH)。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含： a.     各別包含SEQ ID NO: 46、47、及48之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； b.     各別包含SEQ ID NO: 49、50、及48之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； c.     各別包含SEQ ID NO: 51、52、及48之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； d.     各別包含SEQ ID NO: 53、54、及76之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； e.     各別包含SEQ ID NO: 53、54、及111之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； f.     各別包含SEQ ID NO: 55、56、及57之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； g.     各別包含SEQ ID NO: 58、59、及57之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； h.     各別包含SEQ ID NO: 60、61、及57之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；或 i.      各別包含SEQ ID NO: 62、63、及64之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO: 65或66至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列之VVH。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 65之VHH。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 66之VHH。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含IgG Fc域，較佳地人類IgG1 Fc域。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含人類IgG1 Fc域，其包含選自根據EU編號系統之T366S、L368A、T366W、及Y407V的一或多個突變。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包含含有根據EU編號系統之突變T366S、L368A、及Y407V的第一人類IgG1 Fc域，及含有根據EU編號系統之突變T366W的第二人類IgG1 Fc域。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1 Fc域，其包含選自根據EU編號系統之L234A、L235A、及D265S的一或多個突變。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1 Fc域，其包含根據EU編號系統之三重突變L234A/L235A/ D265S。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1 Fc域，其包含根據EU編號系統之突變H435R及/或Y436F。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1 Fc域，其包含根據EU編號系統之三重突變M252Y/S254T/T256E。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段係嵌合的、部分人源化的、或完全人源化的。
本文亦提供了CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段。
適合地，CD33/Vδ2多特異性抗體包含特異性結合人類mCD33之CD33抗體或其抗原結合片段，及特異性結合人類Vγ9Vδ2 T細胞受體之Vδ2鏈之Vδ2或其抗原結合片段。適合地，CD33/Vδ2多特異性抗體之CD33抗體或其抗原結合片段係如本文針對CD33抗體或其抗原結合片段所描述，並且CD33/Vδ2多特異性抗體之Vδ2抗體或其抗原結合片段係如本文針對Vδ2抗體或其抗原結合片段所描述。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體包含含有重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3之CD33抗體或其抗原結合片段，該等CDR包含下列胺基序列： a.     各別地SEQ ID NO: 12、13、14、15、16、及17； b.     各別地SEQ ID NO: 18、19、14、15、16、及17； c.     各別地SEQ ID NO: 20、21、14、15、16、及17；或 d.     各別地SEQ ID NO: 22、23、24、25、26、及17； 以及含有重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3之Vδ2抗體或其抗原結合片段，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： e.     各別地SEQ ID NO: 77、78、及79； f.     各別地SEQ ID NO: 80、81、及79； g.     各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或 h.     各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體包含含有重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3之CD33抗體或其抗原結合片段，該等CDR包含下列胺基序列： a.     各別地SEQ ID NO: 27、28、29、30、31、及32； b.     各別地SEQ ID NO: 33、34、29、30、31、及32； c.     各別地SEQ ID NO: 35、36、29、30、31、及32；或 d.     各別地SEQ ID NO: 37、38、39、40、41、及32； 以及含有重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3之Vδ2抗體或其抗原結合片段，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： e.     各別地SEQ ID NO: 77、78、及79； f.     各別地SEQ ID NO: 80、81、及79； g.     各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或 h.     各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體包含含有重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3之CD33抗體或其抗原結合片段，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： a.     各別地SEQ ID NO: 46、47、及48； b.     各別地SEQ ID NO: 49、50、及48； c.     各別地SEQ ID NO: 51、52、及48； d.     各別地SEQ ID NO: 53、54、及76；或 e.     各別地SEQ ID NO: 53、54、及111； 以及含有重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3之Vδ2抗體或其抗原結合片段，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： f.     各別地SEQ ID NO: 77、78、及79； g.     各別地SEQ ID NO: 80、81、及79； h.     各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或 i.      各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體包含含有重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3之CD33抗體或其抗原結合片段，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： a.     各別地SEQ ID NO: 55、56、及57； b.     各別地SEQ ID NO: 58、59、及57； c.     各別地SEQ ID NO: 60、61、及57；或 d.     各別地SEQ ID NO: 62、63、及64； 以及含有重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3之Vδ2抗體或其抗原結合片段，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： e.     各別地SEQ ID NO: 77、78、及79； f.     各別地SEQ ID NO: 80、81、及79； g.     各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或 h.     各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體包含具有與SEQ ID NO:42或44至少95%同一的胺基酸序列之重鏈可變區(VH)，及具有與SEQ ID NO: 43或45至少95%同一的胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；以及具有與SEQ ID NO:87至少95%同一性的胺基酸序列之僅單一重鏈可變區(VHH)。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體包含： a.     含有SEQ ID NO:42之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列的VL；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH；或 b.     含有SEQ ID NO:44之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列的VL；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體包含具有與SEQ ID NO:65或66至少95%同一的胺基酸序列之VHH，及具有與SEQ ID NO: 87至少95%同一的胺基酸序列之VHH。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體包含： a.     含有SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VHH；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH；或 b.     含有SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VHH；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體包含： a.   含有SEQ ID NO:67之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:70之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:71之胺基酸序列的輕鏈； b.   含有SEQ ID NO:67之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:72之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:73之胺基酸序列的輕鏈； c.   含有SEQ ID NO:67之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:68之胺基酸序列的重鏈； d.   含有SEQ ID NO:74之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:75之胺基酸序列的重鏈，或 e.   含有SEQ ID NO:91之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:92之胺基酸序列的重鏈。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體係雙特異性抗體。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含IgG Fc域，較佳地人類IgG1 Fc域。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1 Fc域，其包含選自根據EU編號系統之T366S、L368A、T366W、及Y407V的一或多個突變。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體包含含有根據EU編號系統之三重突變T366S/L368A/Y407V之第一人類IgG1 Fc域，及含有根據EU編號系統之突變T366W之第二人類IgG1 Fc域。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1 Fc域，其包含選自根據EU編號系統之L234A、L235A、及D265S的一或多個突變。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1 Fc域，其包含根據EU編號系統之三重突變L234A/ L235A/ D265S。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1 Fc域，其包含根據EU編號系統之突變H435R及/或Y436F。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1 Fc域，其包含根據EU編號系統之三重突變M252Y/S254T/T256E。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段係嵌合的、部分人源化的、或完全人源化的。
亦提供了編碼本文所描述之CD33及/或CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之一或多種合成多核苷酸。
亦提供了包含編碼本文所描述之CD33及/或CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之多核苷酸的一或多種載體。
亦提供了宿主細胞，其包含(i)編碼本文所描述之CD33及/或CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之一或多種多核苷酸，或(ii)包含編碼本文所描述之CD33及/或CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之多核苷酸的一或多種載體。
在某些實施例中，提供了包含本文所描述之CD33抗體或其抗原結合部分、及醫藥上可接受之載劑之醫藥組成物。在某些實施例中，提供了包含本文所描述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合部分、及醫藥上可接受之載劑之醫藥組成物。
亦提供了治療有需要之對象之血液癌症的方法，該等方法包含向對象投予本揭露之醫藥組成物。在某些實施例中，血液癌症可係急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生不良症候群（MDS，低或高風險）、急性淋巴球性白血病（ALL，包括所有亞型）、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、或母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤(BPDCN)。在特定實施例中，血液癌症係是AML或MDS。
亦提供了產生本文所描述之CD33、或CD33/Vδ2多特異性抗體、或其抗原結合片段之方法。該等方法包含在產生CD33、或CD33/Vδ2多特異性抗體、或其抗原結合片段之條件下培養包含編碼CD33、或CD33/Vδ2多特異性抗體、或其抗原結合片段之一或多種多核苷酸的細胞，及自細胞或培養物中回收CD33、或CD33/Vδ2多特異性抗體、或其抗原結合片段。
亦提供了產生包含本文所描述之CD33及/或CD33/Vδ2多特異性抗體、或其抗原結合片段之醫藥組成物的方法，該等方法包含將該CD33及/或CD33/Vδ2多特異性抗體、或其抗原結合片段與醫藥上可接受之載劑組合以獲得醫藥組成物。
本揭露係關於特異性靶向CD33（血液癌症之關鍵目標）之抗體、多特異性抗體、或其抗原結合片段。多特異性抗體或其抗原結合片段亦另外地結合Vδ2。 定義
本文所述或參照之技術及程序包括所屬技術領域中具有通常知識者通常熟知及/或經常使用習知方法採用者，諸如例如以下所述之廣泛利用的方法：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3d ed. 2001)；Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed. 2009)；Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar ed. 2010)；及Antibody Engineering Vols 1 and 2 (Kontermann and Dübel eds., 2d ed. 2010)。
除非在本文中另有定義，否則本說明書中所用之技術及科學用語具有所屬技術領域中具有通常知識者通常理解的含義。出於解釋本說明書之目的，用語之以下描述將適用，且於適當時，以單數使用之用語亦將包括複數，且反之亦然。若闡述之用語之任何描述與以引用方式併入本文中之任何文件衝突，則應以下文闡述之用語之描述為準。
為了幫助本申請之讀者，將說明書分隔為不同的段落或部分。該等分隔不應被視為一段或一部分之實質內容與另一段或另一部分之實質內容脫節。相反，本說明書涵蓋了可以考慮的各個部分、段落和句子之所有組合。
用語「多肽(polypeptide)」、及「肽(peptide)」、及「蛋白質(protein)」在本文中可互換使用且指代任何長度之胺基酸之聚合物。聚合物可係線性或分枝的，其可包含經修飾之胺基酸，且其可由非胺基酸中斷。該用語亦涵蓋具有經天然修飾或插入修飾的胺基酸聚合物；例如，雙硫鍵形成、醣基化、脂化、乙醯化、磷酸化、或任何其他操縱或修飾。定義內亦包括例如含有胺基酸（包括但不限於非天然胺基酸）之一或多種類似物以及所屬技術領域中已知的其他修飾之多肽。應理解，因為本揭露之多肽可基於免疫球蛋白超家族之抗體或其他成員，所以在某些實施例中，「多肽」可呈單鏈或呈二或更多個經締合之鏈而存在。
「抗原(antigen)」係抗體可特異性及/或選擇性結合之結構。目標抗原可係多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原、或其他天然存在或合成之化合物。在一些實施例中，目標抗原係多肽。在某些實施例中，抗原與細胞相關聯，例如存在於細胞上或細胞中。
用語「同一性(identity)」係指二或更多個多肽分子或二或更多個核酸分子之序列之間的關係，如藉由比對及比較該等序列來判定。關於參考多肽序列的「胺基酸序列同一性百分比(%) (percent (%) amino acid sequence identity)」係定義為經下列步驟後與參考多肽序列中之胺基酸殘基同一的候選序列中之胺基酸殘基的百分比：比對該等序列並引入缺口(gap)（若有需要），以達到最大序列同一性百分比，且不將任何保守性取代視為該序列同一性的一部分。可採用所屬技術領域中通常知識內的各種方式，例如使用公開可得電腦軟體（諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、或MEGALIGN (DNAStar, Inc.)軟體）來達成以判定胺基酸序列同一性百分比為目的之比對。所屬技術領域中具有通常知識者可判定用於比對序列的適當參數，包括為了在經比較序列全長上達到最大比對而需要的任何演算法。
「實質上相同(substantially the same)」之意義可隨著使用該用語處之上下文而有所不同。由於在重鏈及輕鏈及編碼彼等之基因中可能存在有天然序列變異，可預期在胺基酸序列或編碼本文所述之抗體或抗原結合片段之基因中發現某種程度的變異，此變異對於彼等之獨特結合特性（例如，特異性及親和力）幾乎沒有影響。此預期一部分是由於基因密碼的簡併性(degeneracy of the genetic code)，以及由於保守性胺基酸序列變異（不會可察覺地改變所編碼之蛋白質的本質）之演化成功所致。因此，在提及核酸序列時，「實質上相同(substantially the same)」意指在兩或更多個序列之間有至少65%同一性(identity)。較佳的是，該用語係指在兩或更多個序列間有至少70%同一性，更佳為至少80%同一性，更佳為至少85%同一性，更佳為至少90%同一性，更佳為至少91%同一性，更佳為至少92%同一性，更佳為至少93%同一性，更佳為至少94%同一性，更佳為至少95%同一性，更佳為至少96%同一性，更佳為至少97%同一性，更佳為至少98%同一性，而更佳為至少99%或更高之同一性。兩個序列間之同一性百分比為該等序列所共有之同一性位置數目的函數（即同源性% =同一性位置# /總位置# x 100），並且將需要被導入以最佳排比這兩個序列之缺口(gap)數目及各缺口長度納入考慮。兩個核苷酸或胺基酸序列間的同一性百分比可使用例如E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)之演算法來判定，該演算法已納入ALIGN程式（版本2.0）中，其採用PAM120加權殘基表、缺口長度罰分為12及缺口罰分為4。此外，兩個胺基酸序列間的同一性百分比可使用Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)演算法來判定。
在蛋白質之胺基酸序列內發生不會實質影響蛋白質功能之變異的程度遠低於核酸序列，因為相同的簡併性理論不適用於胺基酸序列。因此，在提及抗體或抗原結合片段時，「實質上相同(substantially the same)」意指抗體或抗原結合片段與所述抗體或抗原結合片段具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。其他實施例所包括的CD33特異性抗體、或抗原結合片段具有不與本文中所述之抗體及抗原結合片段共有顯著同一性之架構、支架、或其他非結合區，但的確包含一或多個CDR或其他賦予結合所需且與本文中所述之此類序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的序列。「載體(vector)」是一種複製子(replicon)，諸如質體、噬菌體、黏質體(cosmid)、或病毒，可將另一個核酸區段可操作地插入其中，從而使該區段複製或表現。
用語「對象(subject)」及「患者(patient)」可互換使用。如本文中所使用，在某些實施例中，對象係哺乳動物，諸如非靈長類或靈長類（例如人類）。在具體實施例中，對象係人類。在一個實施例中，對象係經診斷患有疾病或病症的哺乳動物，例如人類。在另一實施例中，對象係處於發展疾病或病症之風險中的哺乳動物，例如人類。
「投予(administer/administration)」係指將存在於體外之物質注射或以其他物理方式遞送至患者中的動作，諸如經黏膜、皮內、靜脈內、肌內遞送、及/或本文所述或所屬技術領域中已知的任何其他物理遞送方法。
用語「約(about)」及「大約(approximately)」意謂在給定值或範圍之20%內、15%內、10%內、9%內、8%內、7%內、6%內、5%內、4%內、3%內、2%內、1%內、或更少。
如本揭露及申請專利範圍中所用，除非內文另有明確規定，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數形式。
應理解，每當在本文中以用語「包含(comprising)」描述實施例時，亦提供以用語「由……組成(consisting of)」及/或「基本上由……組成(consisting essentially of)」描述之其他類似實施例。亦應理解，每當在本文中以片語「基本上由...組成」描述實施例時，亦提供以用語「由...組成」描述之其他類似實施例。
如在諸如「在A與B之間(between A and B)」或「在A至B之間(between A-B)」之片語中使用之用語「在……之間(between)」係指包括A及B二者之範圍。
如在諸如「A及/或B (A and/or B)」之片語中使用之用語「及/或(and/or)」意欲包括A及B兩者；A或B；A（單獨）；及B（單獨）。同樣地，如在諸如「A、B、及/或C (A, B, and/or C)」之片語中使用之用語「及/或(and/or)」意欲涵蓋以下實施例中之各者：A、及B、及C；A、及B、或C；B、及A、或C；C、及A、或B；A及B；A及C；B及C；A、或B、或C；A或B；A或C；B或C；A（單獨）；B（單獨）；及C（單獨）。 CD33
術語「CD33」係指67 kD單次跨膜（即膜結合的）醣蛋白，其為唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素(Siglec)家族之成員。亦識別為Siglec-3、gp67、或p67之CD33包含負責唾液酸結合之胺基末端V組Ig樣域（CD33之外顯子2）及其細胞外部分中之C2組Ig樣域（外顯子4）(Laszlo GS et al. Expression and functional characterization of CD33 transcript variants in human acute myeloid leukemia. Oncotarget. 2016;7(28):43281-43294)。CD33 RNA之替代剪接生成較短的異構體，缺乏V組，但保留C2組Ig樣域（Laszlo GS, Estey EH, Walter RB. The past and future of CD33 as therapeutic target in acute myeloid leukemia. Blood Rev. 2014;28(4):143-153.；Laszlo et al., 2016,同上)。最近的研究強調，大約50%之AML患者中存在單一核苷酸多型性(SNP) rs12459419，此種剪接程序變得非常重要。此SNP導致CD33中之外顯子2被排除，從而導致V域之缺失(Lamba JK, Chauhan L, Shin M, et al. CD33 splicing polymorphism determines gemtuzumab ozogamicin response in de novo acute myeloid leukemia: report from randomized phase III Children’s Oncology Group trial AAML0531. J Clin Oncol.2017; 35(23):2674-2682)。全長參考人類CD33序列可在Uniprot P20138 (SEQ ID NO: 88)上獲取。 SEQ ID NO: 88 MPLLLLLPLLWAGALAMDPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGAIGGAGVTALLALCLCLIFFIVKTHRRKAARTAVGRNDTHPTTGSASPKHQKKSKLHGPTETSSCSGAAPTVEMDEELHYASLNFHGMNPSKDTSTEYSEVRTQ
CD33，主要被視為骨髓分化抗原。它在骨髓前驅細胞、嗜中性球、及巨噬細胞中展現出低表現，但在循環單核球及樹突細胞中高表現。值得注意的是，在85%至90%之AML患者之母細胞及白血病幹細胞上均檢測到CD33。值得注意的是，它的表現僅限於造血細胞，但在正常造血幹細胞中不存在表現(Paul SP, Taylor LS, Stansbury EK, McVicar DW. Myeloid specific human CD33 is an inhibitory receptor with differential ITIM function in recruiting the phosphatases SHP-1 and SHP-2. Blood. 2000;96(2):483-490; Ulyanova T, Blasioli J, Woodford-Thomas TA, Thomas ML. The sialoadhesin CD33 is a myeloid-specific inhibitory receptor. Eur J Immunol. 1999;29(11):3440-3449)。此種獨特的表現模式表明CD33作為AM及MDS之基於抗體之療法的一個有前景的目標。
如上所述，最近的研究強調約50%之AML患者中存在SNP rs12459419，揭示其與CD33中外顯子2之排除相關，從而導致V域的缺失（上述Lamba et al., 2017）。有趣的是，若干種基於CD33抗體之療法，包括Mylotarg®（INN：吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)）（唯一批准用於AML之抗體），結合並識別CD33之V域。此項研究指示Mylotarg®對表現SNP之患者缺乏功效，因此僅對約50%之AML群體有效（上述Lamba et al., 2017）。考慮到Mylotarg®的資料，可合理地預期其他V結合CD33抗體亦僅對AML患者之子集有效，特別是不具有SNP rs12459419突變之彼等患者。
術語「可溶性CD33蛋白(soluble CD33 protein)」或「sCD33」係指不與細胞膜締合或結合之CD33蛋白之形式，例如人類CD33蛋白。「可溶性CD33蛋白」或「sCD33」涵蓋全長CD33蛋白及其變體之細胞外域(ECD)，該等蛋白及其變體自細胞脫落，即不與細胞膜締合或結合。「可溶性CD33蛋白」或「sCD33」亦涵蓋自細胞脫落之CD33蛋白或其變體之任何片段的ECD；即，該等蛋白或其變體不與細胞膜締合或結合。「可溶性CD33蛋白」或「sCD33」亦涵蓋CD33蛋白之ECD，該等蛋白自細胞脫落（即，不與細胞膜締合或結合）並且缺乏一或多個域，諸如跨膜域及/或細胞質域，例如，作為CD33蛋白（例如，在細胞內體中）之蛋白水解的結果。在一些情況下，「可溶性CD33蛋白」或「sCD33」包含CD33蛋白之IgV域或其片段。在一些情況下，「可溶性CD33蛋白」或「sCD33」包含CD33蛋白之C2域或其片段。在一些情況下，「可溶性CD33蛋白」或「sCD33」包含CD33蛋白之IgV域或其片段，以及CD33蛋白之IgC2域或其片段。CD33之細胞外域(ECD)自細胞脫落；因此，正常及AML患者樣本含有可溶形式之CD33（即，sCD33）。sCD33可競爭血液中之雙特異性抗體，並由於槽效應而影響其功效。發明人已認識到，結合sCD33之抗體可能遭受「抗原槽效應」，由此血液中與sCD33結合之抗體被自系統中移除，減少了可到達目標細胞之抗體的量，從而降低了其功效。 CD33抗體及抗原結合片段
本文描述了能夠特異性結合膜結合之CD33的抗體或抗原結合片段。
用語「抗體(antibody)」、「免疫球蛋白(immunoglobulin)」、或「Ig」在本文中可互換使用，並且係以最廣泛的意義使用，並且具體地涵蓋例如單株抗體（包括促效劑、拮抗劑、中和抗體、全長或完整單株抗體）、具有多表位或單表位特異性之抗體組成物、多株或單價抗體、多價抗體、如下所述由至少兩種完整抗體、單鏈抗體、及其片段（例如，域抗體）形成之多特異性抗體（例如，雙特異性抗體，只要其展現所欲生物活性）。抗體可係人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、及/或親和力成熟抗體、以及來自其他物種（例如，小鼠、兔、駱馬等）之抗體。用語「抗體」意欲包括在多肽之免疫球蛋白類別內的B細胞之多肽產物，其能夠結合至具體分子抗原且由兩對同一的多肽鏈構成，其中各對具有一條重鏈（約50至70 kDa）及一條輕鏈（約25 kDa），各鏈之各胺基端部分包括約100個至約130個或更多個胺基酸之可變區，且各鏈之各羧基端部分包括恆定區。參見例如Antibody Engineering (Borrebaeck ed., 2d ed. 1995)；及Kuby, Immunology (3d ed. 1997)。抗體亦包括但不限於合成抗體、重組產生之抗體、包括來自駱駝科物種（例如，駱馬或羊駝）或其等之人源化變體之抗體（包括VHH或奈米抗體）、細胞內抗體(intrabody)、抗獨特型（抗Id）抗體、及上述任一者之功能片段（例如，抗原結合片段），該功能性片段係指抗體重鏈或輕鏈多肽之一部分，其保留該片段所衍生自之抗體的一些或所有結合活性。功能片段（例如，抗原結合片段）之非限制性實例包括單鏈Fv (scFv)（例如，包括單特異性、雙特異性等）、Fab片段、F(ab')片段、F(ab) 2片段、F(ab’) 2片段、經雙硫鍵連接之Fv (dsFv)、Fd片段、Fv片段、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)、及微抗體(minibody)。特定而言，本文所提供之抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分。本文提供之抗體可屬於免疫球蛋白分子之任何類別（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、及IgA）或任何子類別（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2）。抗體可係促效性抗體或拮抗性抗體。抗體可係非促效性亦非拮抗性。
「抗原結合片段(antigen binding fragment)」係指結合抗原之蛋白質之一部分。抗原結合片段可係合成的、可酶促獲得的、或經基因工程改造之多肽，並且包括免疫球蛋白的結合抗原之部分，諸如VH、VL、VH及VL、Fab、Fab’、F(ab') 2、Fd、及Fv片段、由一個VH域或一個VL域所組成之域抗體(dAb)、鯊可變IgNAR域、駱駝化VH域、VHH域、由模擬抗體之CDR（諸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2、及/或HCDR3、及LCDR1、LCDR2、及/或LCDR3）之胺基酸殘基所組成之最小識別單元、結合抗原之替代支架、及包含該等抗原結合片段之多特異性蛋白質。抗原結合片段（諸如VH及VL）可經由合成連接子連接在一起以形成各種類型之單一抗體設計，其中VH/VL域可進行分子內配對，或者在VH及VL域係由分開之單鏈表現的情況下可進行分子間配對，以形成單價抗原結合域，諸如單鏈Fv (scFv)、經釘合單鏈Fv (spFv)或雙鏈抗體。抗原結合片段亦可接合至可為單特異性或多特異性之其他抗體、蛋白質、抗原結合片段、或替代支架，以工程改造雙特異性及多特異性蛋白質。
用語「結合(bind/binding)」係指分子之間的交互作用，包括例如形成複合物。交互作用可係例如非共價交互作用，其包括氫鍵、離子鍵、疏水性交互作用、及/或凡得瓦交互作用。複合物亦可包括藉由共價或非共價鍵、交互作用、或力保持在一起的二或更多個分子之結合。在抗體上之單一抗原結合位點與目標分子（諸如抗原）之單一表位之間的總非共價交互作用之強度係抗體或功能片段對該表位之親和力。結合分子（例如，抗體）與單價抗原之解離速率(k off)與締合速率(k on)之比率(k off/k on)係解離常數K D，其與親和力逆相關。K D值越低，抗體之親和力越高。K D值因抗體與抗原之不同複合物而不同，且取決於k on及k off兩者。本文提供之抗體之解離常數K D可使用本文提供之任何方法或所屬技術領域中具有通常知識者熟知之任何其他方法判定。在一個結合位點的親和力不總是反映抗體與抗原之間的交互作用之真實強度。當含有多個重複的抗原決定位之複合抗原（諸如多價抗原）與含有多個結合位點之抗體接觸時，抗體與抗原在一個位點的交互作用將增加在第二位點發生反應的可能性。多價抗體與抗原之間的此類多種交互作用之強度稱為親合力(avidity)。
關於本文所述之抗體或抗原結合片段，用語諸如「特異性結合至(specifically binding to)」及類似用語在本文中亦可互換使用，並且係指可特異性結合至抗原（諸如多肽）之抗體或抗原結合片段。結合至或特異性結合至抗原之抗體或抗原結合片段可例如藉由免疫檢定、Octet ®、Biacore ®、或所屬技術領域中具有通常知識者已知之其他技術識別。在一些實施例中，當使用實驗技術（諸如放射免疫檢定(RIA)及酶聯免疫吸附檢定(ELISA)）判定之抗體或抗原結合片段結合至抗原的親和力高於任何交叉反應性抗原時，該抗體或抗原結合片段結合至或特異性結合至抗原。一般而言，特異性或選擇性反應將係背景信號或雜訊之至少兩倍，且可係背景之多於10倍。關於結合特異性之討論，參見例如Fundamental Immunology 332-36 (Paul ed., 2d ed. 1989)。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段與「非目標(non-target)」蛋白質之結合程度小於抗體或抗原結合片段與其特定目標抗原之結合之約10%，例如，如藉由螢光活化細胞分選(fluorescence activated cell sorting, FACS)分析或RIA所判定。結合至抗原之抗體或抗原結合片段包括能夠以足夠的親和力結合該抗原之抗體或抗原結合片段，使得該抗體或抗原結合片段可例如用作靶向該抗原之治療及/或診斷劑。在某些實施例中，結合至抗原之抗體或抗原結合片段具有小於或等於1 μM、800 nM、600 nM、550 nM、500 nM、300 nM、250 nM、100 nM、50 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.9 nM、0.8 nM、0.7 nM、0.6 nM、0.5 nM、0.4 nM、0.3 nM、0.2 nM、或0.1 nM之解離常數(K D)。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段結合至抗原之表位，該抗原在來自不同物種的抗原之間係保守的。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段可包含「完全人類抗體(fully human antibody)」或「人類抗體(human antibody)」之部分，該等用語在本文中可互換使用，並且係指包含人類可變區及例如人類恆定區之抗體。在具體實施例中，該等用語係指包含人類來源之可變區及恆定區之抗體。在某些實施例中，「完全人類(fully human)」抗體亦可涵蓋結合多肽且由核酸序列編碼之抗體，該等核酸序列係人類生殖系免疫球蛋白核酸序列之天然存在之體細胞變體。用語「完全人類抗體(fully human antibody)」包括具有如Kabat等人所述之對應於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體（參見Kabat et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。此Kabat參考文獻定義了免疫球蛋白（抗體）之可變區的編號方案，通常稱為Kabat編號系統或Kabat索引。EU編號系統，亦稱為EU索引，對Ig樣域中之胺基酸殘基進行分類及編號，在Edelman GM et al., Proc Natl Acad Sci USA 63(1):78-85, 1969中進行了解釋。「人類抗體(human antibody)」係具備對應於人類生產之抗體及/或使用任何用於製造人類抗體之技術所製造的胺基酸序列之抗體。人類抗體之此定義明確地排除包含非人類抗原結合殘基之人源化抗體。人類抗體可使用所屬技術領域中已知的各種技術生產，包括噬菌體展示庫(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991))及酵母展示庫(Chao et al., Nature Protocols 1: 755-68 (2006))。亦可用於人類單株抗體之製備係描述於下列中之方法：Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77 (1985)；Boerner et al., J. Immunol.147(1):86-95 (1991)；及van Dijk and van de Winkel, Curr.Opin.Pharmacol.5: 368-74 (2001)。人類抗體可藉由向基因轉殖動物投予抗原來製備，該基因轉殖動物經修飾以回應於抗原挑戰而生產此類抗體，但其內源性基因座已失能，例如小鼠（請參見例如，Jakobovits, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):561-66 (1995)；Brüggemann and Taussing, Curr. Opin. Biotechnol. 8(4):455-58 (1997)；及關於XENOMOUSE™技術之美國專利第6,075,181號及第6,150,584號）。亦參見例如Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-62 (2006)，其係關於經由人類B細胞融合瘤技術所產生之人類抗體。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段可包含「單株抗體(monoclonal antibody)」之一部分，其中如本文中所使用，該用語係指自實質上均質抗體之群體獲得的抗體，例如構成該群體之個別抗體除了可少量存在之可能自然發生的突變或熟知的轉譯後修飾（諸如胺基酸異構化或脫醯胺化、甲硫胺酸氧化、或天冬醯胺酸或麩醯胺酸脫醯胺化）以外係相同的，各單株抗體一般將識別抗原上之單一表位。在具體實施例中，如本文所用，「單株抗體」係由單一融合瘤或其他細胞生產之抗體。用語「單株(monoclonal)」不限於用於製備抗體之任何特定方法。例如，可用於本揭露之單株抗體可藉由首先由Kohler et al., Nature 256:495 (1975)描述之融合瘤方法製備，或可在細菌或真核動物或植物細胞中使用重組DNA方法製造（參見例如美國專利第4,816,567號）。「單株抗體」亦可使用例如下列中所述之技術自噬菌體抗體庫單離：Clackson et al., Nature 352:624-28 (1991)及Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-97 (1991)。用於製備殖株細胞系及由此表現之單株抗體之其他方法係所屬技術領域中熟知的。參見例如Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al.eds., 5th ed. 2002)。
典型的4鏈抗體單元係由兩條同一的輕(L)鏈及兩條同一的重(H)鏈構成之異四聚體醣蛋白。在IgG之情況下，4鏈單元通常係約150,000道耳頓。各L鏈藉由一個共價雙硫鍵連接至H鏈，而兩條H鏈藉由一或多個雙硫鍵（取決於H鏈同型）彼此連接。各H鏈及L鏈亦具有規則間隔的鏈內雙硫橋。各H鏈在N端具有可變域(VH)，接著是對於α及γ鏈中之各者的三個恆定域(CH)及對於μ及ε同型的四個CH域。各L鏈在N端具有可變域(VL)，接著是在其另一端的恆定域(CL)。VL與VH對準，且CL與重鏈之第一恆定域(CH1)對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。VH及VL之配對一起形成單一抗原結合位點。關於不同類別的抗體之結構及性質，參見例如Basic and Clinical Immunology 71 (Stites et al.eds., 8th ed. 1994)；及Immunobiology (Janeway et al.eds., 5 thed. 2001)。
用語「Fab」或「Fab區(Fab region)」係指結合至抗原的抗體區。習知IgG通常包含兩個Fab區，其各自位於Y形IgG結構之兩個臂中之一者上。各Fab區一般由重鏈及輕鏈中之各者之一個可變區及一個恆定區構成。更具體言之，Fab區中重鏈之可變區及恆定區係VH及CH1區，且Fab區中輕鏈之可變區及恆定區係VL及CL區。Fab區中之VH、CH1、VL、及CL可以各種方式配置以賦予根據本揭露之抗原結合能力。例如，VH及CH1區可在一個多肽上，且VL及CL區可在分開的多肽上，類似於習知IgG的Fab區。替代地，VH、CH1、VL、及CL區可全部在同一多肽上且以不同順序定向，如下文各節中更詳細地描述。
用語「可變區(variable region)」、「可變域(variable domain)」、「V區(V region)」、或「V域(V domain)」係指抗體之輕鏈或重鏈之一部分，其通常位於輕鏈或重鏈之胺基端，且其重鏈長度係約120至130個胺基酸且輕鏈長度係約100至110個胺基酸，且用於各特定抗體對其特定抗原的結合及特異性。重鏈之可變區可稱為「VH」。輕鏈之可變區可稱為「VL」。用語「可變(variable)」係指可變區之某些區段之序列於抗體之間廣泛不同。V區介導抗原結合且定義特定抗體對其特定抗原的特異性。然而，變異性未在可變區之110個胺基酸跨度內均勻地分布。取而代之地，V區係由稱為架構區(FR)之約15至30個胺基酸的較不可變（例如，相對不變異的）片段及分開該等片段之具有較高變異性（例如，極度變異性）且稱為「高度變異區(hypervariable region)」之較短區域所組成，該等較短區域各約9至12個胺基酸長。重鏈及輕鏈之可變區各自包含四個FR，其主要採用β褶板構型，由三個高度變異區連接，該等高度變異區形成連接β褶板結構之環，且在一些情況下形成β褶板結構之一部分。各鏈中之高度變異區藉由FR緊密相鄰地保持在一起，且與另一鏈之高度變異區一起有助於形成抗體之抗原結合位點（參見例如Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed. 1991)）。恆定區不直接涉及抗體與抗原的結合，但展現各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞性細胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)及補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity, CDC)。可變區之序列於不同抗體之間廣泛不同。在具體實施例中，可變區係人類可變區。
當用於提及抗體時，用語「重鏈(heavy chain)」係指約50至70 kDa之多肽鏈，其中胺基端部分包括約120至130個或更多個胺基酸之可變區，且羧基端部分包括恆定區。恆定區可係五種不同類型（例如，同型）中之一者，基於重鏈恆定區之胺基酸序列，該等類型被稱為α、δ、ε、γ、及µ。不同的重鏈大小不同：α、δ、及γ含有大約450個胺基酸，而μ及ε含有大約550個胺基酸。當與輕鏈組合時，此等不同類型的重鏈分別產生熟知的五種類別（例如，同型）的抗體IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，包括四種子類別的IgG，即IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。
當用於提及抗體時，用語「輕鏈(light chain)」係指約25 kDa之多肽鏈，其中胺基端部分包括約100至約110個或更多個胺基酸之可變區，且羧基端部分包括恆定區。輕鏈之大約長度係211至217個胺基酸。有兩種不同的類型，基於恆定域之胺基酸序列，該等類型被稱為κ或λ。
如本文所用，用語「高度變異區」、「HVR」、「互補決定區」、及「CDR」可互換使用。「CDR」係指免疫球蛋白（Ig或抗體）VH β褶板架構之非架構區內三個高度變異區（H1、H2、或H3）中之一者，或抗體VL β褶板架構之非架構區內三個高度變異區（L1、L2、或L3）中之一者。VH域中之CDR1、CDR2、及CDR3分別稱為HCDR1、HCDR2、及HCDR3。VL域中之CDR1、CDR2、及CDR3分別稱為LCDR1、LCDR2、及LCDR3。因此，CDR係穿插在架構區序列內的可變區序列。
CDR區係所屬技術領域中具有通常知識者熟知的，且已藉由熟知的編號系統定義。例如，Kabat互補決定區(CDR)係基於序列變異性且係最常使用的（參見例如上述Kabat et al.；Nick Deschacht et al., J Immunol 2010; 184:5696-5704）。Chothia則係指結構環之位置（參見例如Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-17 (1987)）。當使用Kabat編號慣例編號時，Chothia CDR-H1環之末端取決於環之長度而於H32與H34之間變化（此係因為Kabat編號方案將插入放置於H35A及H35B處；若35A及35B均不存在，則環結束於32處；若僅35A存在，則環結束於33處；若35A及35B兩者均存在，則環結束於34處）。AbM高度變異區表示介於Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且藉由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體使用（參見例如Antibody Engineering Vol. 2 (Kontermann and Dübel eds., 2d ed. 2010)）。「contact」高度變異區係基於對可用複合物晶體結構的分析。已開發並廣泛採納的另一通用編號系統係ImMunoGeneTics (IMGT) Information System ®(Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003))。IMGT係專門針對人類及其他脊椎動物之免疫球蛋白(IG)、T細胞受體(TCR)、及主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex, MHC)的整合式資訊系統。在本文中，CDR依據胺基酸序列及在輕鏈或重鏈內的位置兩者進行指稱。由於免疫球蛋白可變域之結構內CDR之「位置」於物種之間係保守的，且存在於稱為環的結構中，因此藉由使用根據結構特徵比對可變域序列的編號系統，容易識別CDR及架構殘基。此資訊可用於將來自一種物種之免疫球蛋白之CDR殘基移植及置換到一般來自人類抗體之受體架構中。Honegger and Plückthun, J. Mol. Biol. 309: 657-70 (2001)已開發額外編號系統(AHon)。編號系統（包括例如Kabat編號及IMGT獨特編號系統）之間的對應性係所屬技術領域中具有通常知識者熟知的（參見例如上述Kabat；上述Chothia and Lesk；上述Martin；上述Lefranc et al.）。下表1例示來自此等高度變異區或CDR中之各者的殘基。 表1.根據各種編號系統之例示性CDR
環 Kabat AbM Chothia Contact IMGT
CDR L1 L24--L34 L24--L34 L26--L32或L24--L34 L30--L36 L27--L38
CDR L2 L50--L56 L50--L56 L50--L52或L50--L56 L46--L55 L56--L65
CDR L3 L89--L97 L89--L97 L91--L96或L89--L97 L89--L96 L105-L117
CDR H1 H31--H35B H26--H35B H26--H32..34 H30--H35B H27--H38
（Kabat編號）
CDR H1 H31--H35 H26--H35 H26--H32 H30--H35
（Chothia編號）
CDR H2 H50--H65 H50--H58 H53--H55或H52--H56 H47--H58 H56--H65
CDR H3 H95--H102 H95--H102 H96--H101或H95--H102 H93--H101 H105-H117
給定CDR之邊界可取決於用於識別之方案而變化。因此，除非另有說明，給定抗體或其區域（諸如可變區）之用語「CDR」及「互補決定區」以及該抗體或其區域之個別CDR（例如，CDR-H1、CDR-H2）應理解為涵蓋由如上文所述之任何已知方案所界定的互補決定區。在一些情況下，指定用於識別一個特定CDR或多個CDR之方案，諸如，如藉由AbM、IMGT、Kabat、Chothia、或Contact方法所定義之CDR。在其他情況下，給定CDR之特定胺基酸序列。應注意CDR區亦可藉由各種編號系統之組合定義，例如Kabat及Chothia編號系統之組合、或Kabat及IMGT編號系統之組合。因此，諸如「如特定VH中所示之CDR1」之用語包括藉由上述例示性CDR編號系統定義之任何CDR1，但不限於此。一旦給定可變區（例如，VH或VL），所屬技術領域中具有通常知識者將理解在該區內之CDR可藉由不同編號系統或其組合來定義。
高度變異區可包含如下之「延伸高度變異區」：VL中之24至36或24至34 (L1)、46至56或50至56 (L2)、及89至97或89至96 (L3)；及VH中之26至35或26至35A (H1)、50至65或49至65 (H2)、及93至102、94至102、或95至102 (H3)。
用語「恆定區(constant region)」或「恆定域(constant domain)」係指輕鏈及重鏈之羧基端部分，其未直接涉及抗體與抗原的結合，但展現各種效應功能（諸如與Fc受體的交互作用）。該用語係指免疫球蛋白分子之一部分，其相對於免疫球蛋白之含有抗原結合位點之另一部分（可變域）具有更保守的胺基酸序列。恆定區可含有重鏈之CH1區、CH2區、及CH3區及輕鏈之CL區。用於恆定重域區之胺基酸編號通常使用Kabat之EU編號系統。
用語「架構(framework)」或「FR」係指側接CDR的可變區殘基。FR殘基存在於例如嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、域抗體、雙鏈抗體、線性抗體、及雙特異性抗體。FR殘基係高度變異區殘基或CDR殘基以外的可變域殘基。
本文中之用語「Fc域(Fc domain)」用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區，包括例如天然序列Fc區、重組Fc區、及變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可不同，但通常將人類IgG重鏈Fc區定義成從在位置Cys226處的胺基酸殘基或從Pro230伸長至其羧基端。Fc區之C端離胺酸（殘基447，根據EU編號系統）可例如在抗體之產生或純化期間，或藉由重組工程改造編碼抗體重鏈之核酸來移除。因此，完整抗體之組成可包含移除所有K447殘基的抗體群體、未移除K447殘基的抗體群體、及具有含及不含K447殘基之抗體之混合物的抗體群體。「功能性Fc區(functional Fc region)」具有天然序列Fc區之「效應功能(effector function)」。功能性Fc區通常係藉由將如本文所述之兩個Fc域（同二聚體或異二聚體）組合在一起而形成。例示性「效應功能」包括：C1q結合；CDC；Fc受體結合；ADCC；吞噬作用；細胞表面受體（例如，B細胞受體）之下調等。此類效應功能通常需要Fc區與結合區或結合域（例如，抗體可變區或可變域）組合且可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的各種檢定評估。「變體Fc區(variant Fc region)」包含與天然序列Fc區有至少一個胺基酸修飾（例如，取代、添加、或缺失）之差異的胺基酸序列。在某些實施例中，相較於天然序列Fc區或親本多肽之Fc區，變體Fc區具有至少一個胺基酸取代，例如在天然序列Fc區中或在親本多肽之Fc區中具有約一至約十個胺基酸取代或約一至約五個胺基酸取代。本文中之變體Fc區可與天然序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區具有至少約80%同源性，或與其具有至少約90%同源性，例如與其具有至少約95%同源性。
當相關於抗原或抗體使用時，用語「變體(variant)」可指相較於天然或未經修飾之序列，包含一或多個（諸如例如約1至約25個、約1至約20個、約1至約15個、約1至約10個、或約1至約5個）胺基酸序列取代、缺失、及/或添加之肽或多肽。例如，CD33抗體之變體可由於天然的或先前未修飾之CD33抗體的胺基酸序列之一或多處（諸如，例如約1至約25、約1至約20、約1至約15、約1至約10、或約1至約5處）變化。變體可係天然存在的，諸如等位變體或剪接變體，或可係人工構築的。多肽變體可係由編碼變體的對應核酸分子製備。在具體實施例中，CD33抗體變體至少各別保留CD33抗體功能活性。在具體實施例中，CD33抗體變體結合CD33。在某些實施例中，變體係由編碼抗CD33抗體VH或VL區或亞區（諸如一或多個CDR）之核酸分子的單核苷酸多型性(SNP)變體編碼。
如本文中所使用，用語「價(valent)」表示在抗原結合蛋白中存在指定數目的結合位點。例如，天然抗體或全長抗體具有兩個結合位點且係二價的。因此，用語「單價(monovalent)」、「三價(trivalent)」、「四價(tetravalent)」、「五價(pentavalent)」、及「六價(hexavalent)」各別表示在抗體中存在一個結合位點、兩個結合位點、三個結合位點、四個結合位點、五個結合位點、及六個結合位點。
所描述之CD33特異性抗體或抗原結合片段包括所有同型（IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM）、及四鏈免疫球蛋白結構之合成性多聚體。所述抗體或抗原結合片段亦包括通常在母雞或火雞血清及母雞或火雞蛋黃中所發現之IgY同型。
CD33特異性抗體及抗原結合片段可藉由重組手段而衍生自任何物種。舉例而言，該等抗體或抗原結合片段可為小鼠、大鼠、山羊、馬、豬、牛、雞、兔、駱駝、驢、人、或其等之嵌合版本。針對投予至人類之用途，非人類衍生性抗體或抗原結合片段可經基因或結構改造以在投予至人類病患時較不具抗原性。
在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段係嵌合者。本文中所用之用語「嵌合(chimeric)」係指抗體、或其抗原結合片段具有衍生自非人類哺乳動物、囓齒動物、或爬蟲動物之抗體胺基酸序列的至少一個可變域之至少一些部分，並且該抗體、或其抗原結合片段之剩餘部分係衍生自人類。
在一些實施例中，該等抗體為人源化(humanized)抗體。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段可包含非人類（例如，駱駝科、鼠類、非人類靈長類）抗體的「人源化(humanized)」形式之部分，其包括來自人類免疫球蛋白（例如接受者抗體）之序列，其中天然CDR殘基被來自具有所欲特異性、親和力、及能力的非人類物種（諸如駱駝科、小鼠、大鼠、兔、或非人類靈長類）之對應CDR（例如供體抗體）的殘基替換。在一些情況下，人類免疫球蛋白序列之一或多個FR區殘基經對應的非人類殘基置換。此外，人源化抗體可包含在接受者抗體或供體抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步改善抗體性能。人源化抗體重鏈或輕鏈可包含實質上全部的至少一或多個可變區，其中全部或實質上全部的CDR對應於非人類免疫球蛋白之CDR，且全部或實質上全部的FR係人類免疫球蛋序列之FR。在某些實施例中，人源化抗體將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，一般為人類免疫球蛋白之該部分。關於進一步細節，參見Jones et al., Nature 321:522-25 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-29 (1988)；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-96 (1992)；Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89 (1992)；美國專利第6,800,738號；第6,719,971號；第6,639,055號；第6,407,213號；及第6,054,297號。
人源化抗體可為含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段（諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體之其他抗原結合子序列）。大體上，人源化抗體為人類免疫球蛋白（接受者抗體(recipient antibody)），其中來自該接受者之互補決定區(CDR)的殘基係經來自具有所欲特異性、親和力、及能力之非人類物種（供體抗體）諸如小鼠、大鼠或兔之CDR的殘基置換。一般而言，該人源化抗體將包含實質上所有至少一個及典型地兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區對應非人類免疫球蛋白之CDR區，並且所有或實質上所有架構區係人類免疫球蛋白序列之架構區。人源化抗體可包括免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型為人類免疫球蛋白之恆定區。
本文中所描述之抗體或抗原結合片段可以各種形式出現，但將包括表2中所示之抗體CDR的一或多者。 表2.代表性CD33抗體之CDR區之清單。
CDR1 (SEQ ID NO:) CDR2 (SEQ ID NO:) CDR3 (SEQ ID NO:)
CD33抗體名稱：C33SB1SC1494
重鏈(AbM) GFTFDDYTMH (12) LVSWSGGSAY (13) ESAYNAYFDY (14)
輕鏈(AbM) KSSQSVLYSSNNKNYLA (15) WASTRES (16) HQFYITPYT (17)
重鏈(KABAT) DYTMH (18) LVSWSGGSAYYVDSVKG (19) ESAYNAYFDY (14)
輕鏈(CHOTHIA) KSSQSVLYSSNNKNYLA (15) WASTRES (16) HQFYITPYT (17)
重鏈(CHOTHIA) GFTFDDY (20) SWSGGS (21) ESAYNAYFDY (14)
輕鏈(CHOTHIA KSSQSVLYSSNNKNYLA (15) WASTRES (16) HQFYITPYT (17)
重鏈(IMGT) GFTFDDYT (22) VSWSGGSA (23) AKESAYNAYFDY (24)
輕鏈(IMGT) QSVLYSSNNKNY (25) WAS (26) HQFYITPYT (17)
CD33抗體名稱：C33F1318
重鏈(AbM) GFTFSRYWMS (27) NIKRDGSEKY (28) NSGTWEFDQ (29)
輕鏈(AbM) TRSSGSIASNDVQ (30) EDKQRPS (31) QSYDNNNQV (32)
重鏈(KABAT) RYWMS (33) NIKRDGSEKYYVDAVRG (34) NSGTWEFDQ (29)
輕鏈(KABAT) TRSSGSIASNDVQ (30) EDKQRPS (31) QSYDNNNQV (32)
重鏈(CHOTHIA) GFTFSRY (35) KRDGSE (36) NSGTWEFDQ (29)
輕鏈(CHOTHIA TRSSGSIASNDVQ (30) EDKQRPS (31) QSYDNNNQV (32)
重鏈(IMGT) GFTFSRYW (37) IKRDGSEK (38) ARNSGTWEFDQ (39)
輕鏈(IMGT) SGSIASND (40) EDK (41) QSYDNNNQV (32)
本文描述了特異性結合至膜結合之CD33之抗體及抗原結合片段。在一些實施例中，CD33特異性抗體或抗原結合片段係人類、人源化IgG、或其衍生物。雖然本文中所例示之CD33特異性抗體或抗原結合片段係人類或人源化的，所例示之抗體或抗原結合片段可經嵌合化。
在一些實施例中提供一種CD33特異性抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈，該重鏈包含表2中所描述之抗體中之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中提供一種CD33特異性抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含表2中所描述之抗體中之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈包含表2中所描述之抗體中之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3。
在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含各別包含SEQ ID NO: 12、13、及14之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)，以及各別包含SEQ ID NO: 15、16、及17之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、輕鏈互補決定區2 (CDR2)、及輕鏈互補決定區3 (LCDR3)。此CD33特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 42實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO: 43實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之CDR、重鏈可變域、及輕鏈可變域係適合納入多特異性構築體中，該多特異性構築體中有一個臂係抗CD33臂。
在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含各別包含SEQ ID NO: 18、19、及14之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)，以及各別包含SEQ ID NO: 15、16、及17之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、輕鏈互補決定區2 (CDR2)、及輕鏈互補決定區3 (LCDR3)。此CD33特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 42實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO: 43實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之CDR、重鏈可變域、及輕鏈可變域係適合納入多特異性構築體中，該多特異性構築體中有一個臂係抗CD33臂。
在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含各別包含SEQ ID NO: 20、21、及14之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)，以及各別包含SEQ ID NO: 15、16、及17之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、輕鏈互補決定區2 (CDR2)、及輕鏈互補決定區3 (LCDR3)。此CD33特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 42實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO: 43實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之CDR、重鏈可變域、及輕鏈可變域係適合納入多特異性構築體中，該多特異性構築體中有一個臂係抗CD33臂。
在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含各別包含SEQ ID NO: 22、23、及24之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)，以及各別包含SEQ ID NO: 25、26、及17之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、輕鏈互補決定區2 (CDR2)、及輕鏈互補決定區3 (LCDR3)。此CD33特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 42實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO: 43實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之CDR、重鏈可變域、及輕鏈可變域係適合納入多特異性構築體中，該多特異性構築體中有一個臂係抗CD33臂。
在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含各別包含SEQ ID NO: 27、28、及29之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)，以及各別包含SEQ ID NO: 30、31、及32之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、輕鏈互補決定區2 (CDR2)、及輕鏈互補決定區3 (LCDR3)。此CD33特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 44實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO: 45實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之CDR、重鏈可變域、及輕鏈可變域係適合納入多特異性構築體中，該多特異性構築體中有一個臂係抗CD33臂。
在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含各別包含SEQ ID NO: 33、34、及29之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)，以及各別包含SEQ ID NO: 30、31、及32之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、輕鏈互補決定區2 (CDR2)、及輕鏈互補決定區3 (LCDR3)。此CD33特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 44實質上相同或與其同一之重鏈可變域、及與SEQ ID NO: 45實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之CDR、重鏈可變域、及輕鏈可變域係適合納入多特異性構築體中，該多特異性構築體中有一個臂係抗CD33臂。
本文亦描述了特異性結合膜結合之CD33的抗體或抗原結合片段，其中其抗原結合片段係單一重鏈可變區(VHH)。
「單一重鏈可變區」、「VHH」、或「dAb片段」係指由VH域構成的抗體片段(Ward et al., Nature 341 :544 546 (1989))。本揭露之抗原結合片段可包含VHH。VHH係所屬技術領域中具有通常知識者熟知的，參見例如Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363:446、Roovers et al. (2007) Curr Opin Mol Ther 9:327、及Krah et al. (2016) Immunopharmacol Immunotoxicol 38:21。VHH包含單一重鏈CDR1、單一重鏈CDR2、及單一重鏈CDR3。VHH可來源於任何物種，包括小鼠、人類、駱駝、駱馬、鯊魚、山羊、兔、及乳牛。例如，天然存在的VHH分子可以來源於駱駝科物種中產生的抗體，例如駱駝、單峰駱駝、駱馬、羊駝和原駝。與完整抗體一樣，VHH能夠選擇性地結合至單一特定抗原。VHH可能僅含有免疫球蛋白鏈之可變域，亦即CDR1、CDR2、及CDR3以及架構區。
包含本文所描述之VHH之抗體或抗原結合片段可以各種形式出現，但將包括表3中所示之抗體CDR中之一或多者。 表3.包含VHH之代表性CD33抗體之CDR區的清單。
CDR1 (SEQ ID NO:) CDR2 (SEQ ID NO:) CDR3 (SEQ ID NO:)
CD33抗體名稱：JL45-VHH
重鏈(AbM) GSIFSIFDMG (46) RITNGGITN (47) DIAANIGSNILYDDY (48)
重鏈(KABAT) IFDMG (49) RITNGGITNYLDSVKG (50) DIAANIGSNILYDDY (48)
重鏈(CHOTHIA) GSIFSIF (51) TNGGI (52) DIAANIGSNILYDDY (48)
重鏈(IMGT) GSIFSIFD (53) ITNGGIT (54) YADIAANIGSNILYDDY (76)或 YADIAANIGSNIL (111)
CD33抗體名稱：AB266_1_CD33_ B12_P09.VR1
重鏈(AbM) GSIFSINAMG (55) RITGGGATD (56) DLVTRVGSDLLYDDY (57)
重鏈(KABAT) INAMG (58) RITGGGATDYVDSVKG (59) DLVTRVGSDLLYDDY (57)
重鏈(CHOTHIA) GSIFSIN (60) TGGGA (61) DLVTRVGSDLLYDDY (57)
重鏈(IMGT) GSIFSINA (62) ITGGGAT (63) YADLVTRVGSDLLYDDY (64)
在一些實施例中提供一種CD33特異性抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈，該重鏈包含表3中所描述之抗體中之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含各別包含SEQ ID NO: 46、47、及48之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)。此CD33特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 65實質上相同或與其同一之單一重鏈可變域(VHH)。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:65至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、96%、97%、98%、99%、或100%同一的胺基酸序列之VHH。此段中所討論之CDR及VHH係適合納入多特異性構築體中，該構築體中有一個臂係抗CD33臂。
在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含各別包含SEQ ID NO: 49、50、及48之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)。此CD33特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 65實質上相同或與其同一之單一重鏈可變域(VHH)。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:65至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、96%、97%、98%、99%、或100%同一的胺基酸序列之VHH。此段中所討論之CDR及VHH係適合納入多特異性構築體中，該構築體中有一個臂係抗CD33臂。
在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含各別包含SEQ ID NO: 51、52、及48之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)。此CD33特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 65實質上相同或與其同一之單一重鏈可變域(VHH)。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:65至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、96%、97%、98%、99%、或100%同一的胺基酸序列之VHH。此段中所討論之CDR及VHH係適合納入多特異性構築體中，該構築體中有一個臂係抗CD33臂。
在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含各別包含SEQ ID NO: 53、54、及76之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)。此CD33特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 65實質上相同或與其同一之單一重鏈可變域(VHH)。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:65至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、96%、97%、98%、99%、或100%同一的胺基酸序列之VHH。此段中所討論之CDR及VHH係適合納入多特異性構築體中，該構築體中有一個臂係抗CD33臂。
在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含各別包含SEQ ID NO: 53、54、及97之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)。此CD33特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 65實質上相同或與其同一之單一重鏈可變域(VHH)。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:65至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、96%、97%、98%、99%、或100%同一的胺基酸序列之VHH。此段中所討論之CDR及VHH係適合納入多特異性構築體中，該構築體中有一個臂係抗CD33臂。
在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含各別包含SEQ ID NO: 55、56、及57之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)。此CD33特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 66實質上相同或與其同一之單一重鏈可變域(VHH)。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:66至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、96%、97%、98%、99%、或100%同一的胺基酸序列之VHH。此段中所討論之CDR及VHH係適合納入多特異性構築體中，該構築體中有一個臂係抗CD33臂。
在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含各別包含SEQ ID NO: 58、59、及57之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)。此CD33特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 66實質上相同或與其同一之單一重鏈可變域(VHH)。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:66至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、96%、97%、98%、99%、或100%同一的胺基酸序列之VHH。此段中所討論之CDR及VHH係適合納入多特異性構築體中，該構築體中有一個臂係抗CD33臂。
在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含各別包含SEQ ID NO: 60、61、及57之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)。此CD33特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 66實質上相同或與其同一之單一重鏈可變域(VHH)。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:66至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、96%、97%、98%、99%、或100%同一的胺基酸序列之VHH。此段中所討論之CDR及VHH係適合納入多特異性構築體中，該構築體中有一個臂係抗CD33臂。
在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含各別包含SEQ ID NO: 62、63、及64之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)。此CD33特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 66實質上相同或與其同一之單一重鏈可變域(VHH)。在一些實施例中，CD33特異性抗體及抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:66至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、96%、97%、98%、99%、或100%同一的胺基酸序列之VHH。此段中所討論之CDR及VHH係適合納入多特異性構築體中，該構築體中有一個臂係抗CD33臂。
在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段係IgG、或其衍生物，例如IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4同型。在抗體係IgG1同型之一些實施例中，該抗體包含IgG1 Fc區或IgG Fc域。
在某些實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段結合CD33之C2域。
在某些實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段結合CD33之V域。
在某些實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段結合mCD33。
在某些實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段並不顯著結合sCD33。 CD33/Vδ2多特異性抗體
T細胞係最豐富（佔血液淋巴球的約75%）並且有效的免疫殺手細胞。效應T細胞在抗癌免疫反應中之作用得到了以下強有力的支持：體外研究和觀察發現，在若干種類型之癌症中CD8+ T細胞的高浸潤與良好的臨床預後相關。
最近，利用T細胞治療癌症的治療潛力取得了實質進展。目前臨床試驗中正在探索兩種不同的重導向T細胞裂解癌細胞的策略：1)供體T細胞，其經工程改造離體藉由使用與癌細胞結合的抗體片段來與嵌合抗原受體(CAR)結合，以及2)由兩個臂所組成的重組雙特異性蛋白治療劑，其中一個臂與T細胞上的CD3結合，而第二臂與癌症相關抗原結合。重點關注後者，雙特異性蛋白允許T細胞與癌細胞有效接合。此會導致由癌症結合之雙特異性分子誘導CD3共受體刺激，其引發不依賴MHC的多株T細胞活化及有效的癌細胞裂解。此種方法繞過了一些癌症特異性耐受機制，並且允許募集的T細胞殺死癌細胞。
事實上，CD3雙特異性蛋白中之一者蘭妥莫單抗(blinatumomab)，其係一種已被FDA批准用於治療難治性B急性淋巴母細胞白血病(ALL)之CD3/CD19雙特異性T細胞接合劑(BiTE)。雖然尚未完全瞭解類BiTE分子如何運作的作用機制，其確實提供證據證明，雙特異性試劑可在兩個細胞之間誘導人工裂解突觸(artificial lytic synapse)之形成，其模擬自然發生的T細胞裂解介導之癌細胞殺滅。使用嵌合抗原受體(CAR) T細胞及蘭妥莫單抗的臨床前實驗已驗證此概念並為此方法提供有力的依據，並且臨床試驗現已在人類患者中提供概念驗證(proof of concept, POC)。由於此方法的臨床成功，CD3導向雙特異性抗體的領域快速成長，並使用各種抗體形式來產生治療劑以靶向大量癌抗原。一些形式仍有望減少蘭妥莫單抗出現的關鍵問題，例如蘭妥莫單抗會自循環中快速清除，而需要在4週治療週期期間連續i.v.輸注。新形式是為了較長的血清半衰期而設計，從而免於連續輸注。
由於T細胞介導之反應極為強效，因此可能藉由誘導細胞介素風暴(storm)或將T細胞導向表現低水平目標抗原之健康組織而產生嚴重副作用。目前臨床試驗中的大多數CD3雙特異性蛋白質係靶向受體，其中表現係侷限於造血譜系（CD19、CD20、CD123等），或高度特異性癌抗原，諸如CEA、PSMA、及MHCI-gp100。因此，基於CD3之重導向之適用性可受限於具有癌症特異性的抗原或血液性癌症，其阻礙了對許多實體癌症類型之應用。另外，以目前可用技術進行之CD3導向T細胞重導向尚未在實體癌症中顯示太多功效，此係歸因於各種原因（例如，募集所有類型之CD3+ T細胞，包括未成熟、CD4+、Treg、泛CD8（無CTL）、耗竭T細胞等，其可能造成癌症去除效率不佳；過早T細胞活化，其可能導致治療指數狹窄；次佳的T細胞活化；T細胞耗竭或T細胞之活化誘導死亡；誘導細胞介素釋放症候群，其可限制最佳給藥水平；抑制癌細胞凋亡；減少抗癌適應性免疫反應之活化；與其他免疫療法組合之能力受限等）。
雖然經由CD3重導向T細胞具有吸引力（因為其導致略過典型抗原特異性T細胞反應之多株細胞毒性反應），其產生兩個關鍵疑慮：1)可能無差別地刺激CD3+ T細胞，其包括各種免疫調節性及免疫抑制性T細胞（其經描述為在免疫逃脫中發揮主動作用）；及2)可能藉由誘導細胞介素風暴，而產生可能導致嚴重副作用的泛T細胞活化。因此，經由CD3之重導向可能導致次佳功效及治療指數狹窄。為了減輕一些CD3重導向限制，必須尋求將T細胞重導向至癌細胞之替代策略。一種方法係選擇僅有細胞毒性細胞（亞群）之重導向，該等細胞毒性細胞能夠裂解癌細胞，而非無差別地刺激並募集泛T細胞。
募集T細胞之另一種方法係靶向T細胞之特異性亞群。最近，γδ T細胞在癌症免疫療法領域中引起大量關注。此等以其先天性免疫為熟知的非習知T細胞僅代表一小部分的周邊CD3+ T細胞（1%至5%），但構成上皮組織中T細胞之主要亞群（20%至50%）。
循環γδ T細胞主要表現Vγ9 (TRGV9)鏈及Vδ2 (TRDV2)鏈之異二聚體，而組織γδ T細胞優先表現與不同Vγ鏈相關聯之Vδ1鏈。
在人類中，γδ T細胞具有強效抗癌功能（高細胞毒性及干擾素　分泌）。此外，γδ T細胞能夠進行吞噬作用（先前專屬於先天性骨髓譜系細胞之功能），並且表現為αβ T細胞之有效抗原呈現細胞，並誘導適應性免疫反應。γδ T細胞已顯示會浸潤癌症，但其存在之臨床相關性仍有爭議。到目前為止，所有研究工作已著重於Vγ9Vδ2 T細胞，並且主要針對體內或離體活化用於過繼轉移之γδT細胞。雖然臨床研究尚不豐富，但初步資料強調在基於T細胞之免疫療法中考慮γδT細胞亞群的重要性。
因此，在此背景下，尋求協助克服基於CD3之重導向之限制、避免泛T細胞活化、及藉由選擇性募集γδT細胞來誘導強效癌裂解的方法。具體而言，當雙特異性抗體療法以一個臂結合至癌症相關抗原，並以另一臂結合至γδT細胞所表現Vδ2 T受體以募集並活化γδT細胞時，集中於該等雙特異性抗體療法的策略可能因具有雙特異性抗體而解決此在癌症治療中未獲滿足的醫療需求，該雙特異性抗體結合至真正(bona fide)細胞毒性T細胞上之抗原、及癌細胞上所表現之抗原。
如本文所用，用於「Vδ2」、「δ2」、或「TRDV2」係指當在γδT細胞表面上表現時能夠與Vγ9鏈一起形成T細胞受體的多肽。表現δ2之γδT細胞係人類胎兒中最早發育的第一T細胞，亦係健康成人周邊血球中之主要γδT細胞亞群。用語「δ2」包括任何δ2變體、異構體、及物種同源物，其係由細胞（包括T細胞）天然表現，或者可表現在經編碼多肽之基因或cDNA轉染的細胞上。在具體實施例中，δ2係人類δ2。UniProtKB條目A0JD36提供了例示性人類δ2胺基酸序列，其中GenBank登錄號為AAB69040.1。
本文亦提供了CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含CD33抗體或其抗原結合片段及Vδ2抗體或其抗原結合片段，其中CD33抗體或其抗原結合片段特異性結合至mCD33，並且其中Vδ2抗體或其抗原結合片段特異性結合至人類Vγ9Vδ2 T細胞受體之Vδ2鏈。
如本文所用，用語「多特異性抗體(multispecific antibody)」係指包含複數個免疫球蛋白可變域序列之抗體，其中該複數個序列之第一免疫球蛋白可變域序列具有對第一表位之結合特異性，且該複數個序列之第二免疫球蛋白可變域序列具有對第二表位之結合特異性。在一實施例中，第一及第二表位不重疊或實質上不重疊。在一實施例中，第一及第二表位係在不同抗原（例如，不同蛋白質（或多聚體蛋白質之不同次單元））上。在一實施例中，多特異性抗體包含第三、第四、或第五免疫球蛋白可變域。在一實施例中，多特異性抗體係雙特異性抗體分子。
如本文所用，用語「雙特異性抗體(bispecific antibody)」係指結合不多於兩個表位或兩種抗原的多特異性抗體。雙特異性抗體之特徵在於具有對第一表位（例如，CD33抗原之表位）的結合特異性之第一免疫球蛋白可變域序列，以及具有對第二表位（例如，Vδ2抗原之表位）的結合特異性之第二免疫球蛋白可變域序列。在一實施例中，第一及第二表位係在不同抗原（例如，不同蛋白質（或多聚體蛋白質之不同次單元））上。在一實施例中，雙特異性抗體包含對第一表位具有結合特異性之重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列、以及對第二表位具有結合特異性之單一重鏈可變域序列。在一實施例中，雙特異性抗體包含對第一表位具有結合特異性的單一重鏈可變域序列及對第二表位具有結合特異性的單一重鏈可變域序列。在一實施例中，雙特異性抗體包含對第一表位具有結合特異性之半抗體或其片段、以及對第二表位具有結合特異性之半抗體或其片段。在一實施例中，雙特異性抗體包含對第一表位具有結合特異性之scFv或其片段、以及對第二表位具有結合特異性之scFv或其片段。在一實施例中，第一表位係位於CD33上，並且第二表位係位於人類Vγ9Vδ2 T細胞受體上之Vδ2鏈上。雙特異性抗體可包含結合第一及第二表位中之一者或另一者的第三、第四、或第五免疫球蛋白可變域（例如，其可具有結合第一表位之兩個免疫球蛋白可變域及結合第二表位之兩個免疫球蛋白可變域，或者其可具有結合第一表位之兩個免疫球蛋白可變域及結合第二表位之一個免疫球蛋白可變域）。
在某些實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段係本文所描述之CD33抗體或其抗原結合片段且Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈HCDR1、HCDR2、及HCDR3，該等重鏈HCDR具有下列胺基酸序列：(1)各別地SEQ ID NO:77、78、及79；(2)各別地SEQ ID NO: 80、81、82；(3)各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或(4)各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
已經描述多特異性抗體之不同格式並且已由下列文獻所回顧：Chames及Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276。
在一些實施例中，本揭露之多特異性抗體係雙鏈抗體、交叉抗體(cross-body)、或經由如本揭露中所述之受控Fab臂交換所獲得之多特異性抗體。
在一些實施例中，多特異性抗體包括具有互補CH3域以迫使異二聚化的IgG樣分子；重組IgG樣雙靶向分子，其中該分子之多側各自含有至少兩種不同抗體之結合片段或該結合片段的一部分；IgG融合分子，其中全長IgG抗體係融合至額外Fab片段或Fab片段之部分；Fc融合分子，其中單鏈Fv分子或穩定化雙鏈抗體係融合至重鏈恆定域、Fc區、或其部分；Fab融合分子，其中不同之Fab片段係融合在一起；基於ScFv之抗體及基於雙價抗體之抗體及重鏈抗體（例如，域抗體、奈米抗體），其中不同單鏈Fv分子或不同雙價抗體或不同重鏈抗體（例如，域抗體、奈米抗體）係融合至彼此或融合至另一個蛋白質或載劑分子。
在一些實施例中，具有互補CH3域分子之類IgG分子包括Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech)、Knobs-into-Holes (Genentech)、CrossMAbs (Roche)及靜電匹配者(electrostatically-matched) (Amgen)、LUZ-Y (Genentech)、股交換工程改造域抗體(Strand Exchange Engineered Domain body, SEEDbody) (EMD Serono)、Biclonic (Merus)及DuoBody (Genmab A/S)。
在一些實施例中，重組類IgG雙靶向分子包括Dual Targeting (DT)-Ig (GSK/Domantis)、二合一抗體(Two-in-one Antibody) (Genentech)、交聯單株抗體(Cross-linked Mabs) (Karmanos Cancer Center)、mAb2 (F-Star)及CovX-body (CovX/Pfizer)。
在一些實施例中，IgG融合分子包括雙可變域(Dual Variable Domain, DVD)-Ig (Abbott)、類IgG雙特異性抗體(IgG-like Bispecific) (InnClone/Eli Lilly)、Ts2Ab (MedImmune/AZ)及BsAb (Zymogenetics)、HERCULES (Biogen Idec)和TvAb (Roche)。
在一些實施例中，Fc融合分子包括ScFv/Fc Fusions (Academic Institution)、SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS)、Dual Affinity Retargeting Technology (Fc-DART) (MacroGenics)及Dual(ScFv).sub.2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine--China)。
在一些實施例中，Fab融合雙特異性抗體包括F(ab)2 (Medarex/AMGEN)、Dual-Action或Bis-Fab (Genentech)、Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics)、Bivalent Bispecific (Biotecnol)及Fab-Fv (UCB-Celltech)。基於ScFv之抗體、基於雙價抗體之抗體及域抗體包括但不限於Bispecific T Cell Engager (BiTE) (Micromet)、Tandem Diabody (Tandab) (Affimed)、Dual Affinity Retargeting Technology (DART) (MacroGenics)、Single-chain Diabody (Academic)、TCR-like Antibodies (AIT, ReceptorLogics)、Human Serum Albumin ScFv Fusion (Merrimack)及COMBODY (Epigen Biotech)、雙靶向奈米抗體(Ablynx)、僅雙靶向重鏈域抗體(dual targeting heavy chain only domain antibody)。
本文所揭示之多特異性抗體可例如使用抗體之間的結合臂交換（或半分子交換）來產生，其藉由於各半分子中之重鏈CH3界面引入取代，以利於具有不同特異性之抗體半分子的多聚體在體外無細胞環境中或者使用共表現形成。該Fab臂交換反應係雙硫鍵異構化反應及CH3域之解離-締合的結果。親本單特異性抗體的鉸鏈區中的重鏈雙硫鍵被還原。其中一個親本單特異性抗體所生成之遊離半胱胺酸與第二親本單特異性抗體分子的半胱胺酸殘基形成重鏈間雙硫鍵，同時該等親本抗體的CH3域藉由解離-締合而釋出及重新形成。該等Fab臂之CH3域可經工程改造以利於異二聚化而非同二聚化。所得產物係具有兩個Fab臂或半分子之雙特異性抗體，該等Fab臂或半分子各自結合不同表位，亦即CD33上之表位及CD3上之表位。
本文中所用之「同二聚化(homodimerization)」係指具有相同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。本文中所用之「同二聚體(homodimer)」係指具有兩個有相同CH3胺基酸序列之重鏈的抗體。
本文中所用之「異二聚化(heterodimerization)」係指具有不同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。本文中所用之「異二聚體(heterodimer)」係指具有兩個有不同CH3胺基酸序列之重鏈的抗體。
「鈕-孔(knob-into-hole)」策略（參見例如PCT國際公開號WO 2006/028936）可用來產生全長多特異性抗體。簡言之，在人類IgG中形成CH3域界面之選定胺基酸可在影響CH3域交互作用的位置處突變，以促進異二聚體形成。將具有小側鏈之胺基酸（孔）引入特異性結合第一抗原之抗體的重鏈中，並將具有大側鏈之胺基酸（鈕）引入特異性結合第二抗原之抗體的重鏈中。在共表現抗體之後，具有「孔」之重鏈與具有「鈕」之重鏈優先交互作用而導致異二聚體形成。形成鈕及孔之例示性CH3取代對係（表現為在第一重鏈之第一CH3域中的經修飾位置/在第二重鏈之第二CH3域中的經修飾位置）：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S、及T366W/T366S_L368A_Y407V。此處的編號係EU編號。
可使用其他策略，諸如使用靜電交互作用促進重鏈異二聚化，其取代一個CH3表面之帶正電荷殘基及第二CH3表面之帶負電荷殘基，如在美國專利公開號US2010/0015133；美國專利公開號US2009/0182127；美國專利公開號US2010/028637或美國專利公開號US2011/0123532中所述。在其他策略中，可藉由下列取代（表現為在第一重鏈之第一CH3域中的經修飾之位置/在第二重鏈之第二CH3域中的經修飾之位置）促進異二聚化：L351Y_F405AY407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美國專利公開號US2012/0149876或美國專利公開號US2013/0195849中所述。此處的編號係EU編號。
除了上述方法之外，本文所提供之多特異性抗體可在無細胞環境中體外產生，此係藉由在至少兩個單特異性同二聚體抗體之CH3區中引入非對稱突變，且在還原條件中（以使雙硫鍵異構化）以至少兩個親本單特異性同二聚體抗體形成該多特異性異二聚體抗體，其係根據描述於國際專利公開號W02011/131746中之方法。在該等方法中，第一抗體（例如，CD33抗體）及第二抗體（例如，Vδ2抗體）經工程改造以在CH3域具有促進異二聚體穩定性之某些取代；該等抗體係在足以讓鉸鏈區中之半胱胺酸進行雙硫鍵異構化的還原條件下一起培養；從而藉由Fab臂交換來產生該雙特異性抗體。培養條件可最佳地被回復為非還原性條件。可使用之例示性還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、二硫赤蘚醇(dithioerythritol, DTE)、麩胱甘肽、參(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸、及β-巰基乙醇，還原劑較佳係選自由下列所組成之群組：2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇、及參(2-羧乙基)膦。舉例而言，可使用在至少20℃之溫度且有至少25 mM之2-MEA存在下或於至少0.5 mM之二硫蘇糖醇存在且在5至8之pH下（例如在7.0之pH下或在7.4之pH下）培養至少90 min。
在某些實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，該等CDR包含下列胺基酸序列： a.     各別地SEQ ID NO: 12、13、14、15、16、及17； b.     各別地SEQ ID NO: 18、19、14、15、16、及17； c.     各別地SEQ ID NO: 20、21、14、15、16、及17； d.     各別地SEQ ID NO: 22、23、24、25、26、及17； e.     各別地SEQ ID NO: 27、28、29、30、31、及32； f.     各別地SEQ ID NO: 33、34、29、30、31、及32； g.     各別地SEQ ID NO: 35、36、29、30、31、及32；或 h.     各別地SEQ ID NO: 37、38、39、40、41、及32； 並且Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： a.     各別地SEQ ID NO: 77、78、及79； b.     各別地SEQ ID NO: 80、81、及79； c.     各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或 d.     各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
在某些實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO: 42或44實質上相同或與其同一之胺基酸序列的VH，及含有與SEQ ID NO: 43或45實質上相同或與其同一之胺基酸序列的VL；並且Vδ2抗體或其抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO:87實質上相同或與其同一之胺基酸序列的VHH。
在某些實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： a.     各別地SEQ ID NO: 46、47、及48； b.     各別地SEQ ID NO: 49、50、及48； c.     各別地SEQ ID NO: 51、52、及48； d.     各別地SEQ ID NO: 53、54、及76； e.     各別地SEQ ID NO: 53、54、及111； f.     各別地SEQ ID NO: 55、56、及57； g.     各別地SEQ ID NO: 58、59、及57； h.     各別地SEQ ID NO: 60、61、及57；或 i.      各別地SEQ ID NO: 62、63、及64； 並且Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： a.     各別地SEQ ID NO: 77、78、及79； b.     各別地SEQ ID NO: 80、81、及79； c.     各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或 d.     各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
在特定實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 46、47、及48； 並且Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 77、78、及79。
在特定實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 49、50、及48； 並且Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 80、81、及79。
在特定實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 51、52、及48； 並且Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 82、83、及79。
在特定實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 53、54、及76； 並且Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
在特定實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 53、54、及111； 並且Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
在特定實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 55、56、及57； 並且Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 77、78、及79。
在特定實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 58、59、及57； 並且Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 80、81、及79。
在特定實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 60、61、及57； 並且Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 82、83、及79。
在特定實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 62、63、及64； 並且Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列：各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
在某些實施例中，CD33抗體或其抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO: 65或66實質上相同或與其同一之胺基酸序列的VHH；並且Vδ2抗體或其抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO:87實質上相同或與其同一之胺基酸序列的VHH。
在某些實施例中，CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO:42之胺基酸序列的VH、及含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的VL；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH。
在某些實施例中，CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO:44之胺基酸序列的VH、及含有SEQ ID NO: 45之胺基酸序列的VL；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH。
在某些實施例中，CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VHH；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH。
在某些實施例中，CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VHH；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH。
在某些實施例中，CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO:67之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:70之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO:71之胺基酸序列的輕鏈。
在某些實施例中，CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO:67之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:72之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO:73之胺基酸序列的輕鏈 在某些實施例中，CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO:67之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:68之胺基酸序列的重鏈。
在某些實施例中，CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO:74之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:75之胺基酸序列的重鏈。
在某些實施例中，CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO:67之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:68之胺基酸序列的重鏈。
在某些實施例中，CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段結合CD33之C2域。
在某些實施例中，CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段結合CD33之V域。
在某些實施例中，CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段結合mCD33。
在某些實施例中，CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段不結合或實質上不結合sCD33。
在某些實施例中，CD33/Vδ2多特異性抗體包含： (A)含有重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3之CD33抗體或其抗原結合片段，該等重鏈CDR包含下列胺基序列： a.     各別地SEQ ID NO: 46、47、及48； b.     各別地SEQ ID NO: 49、50、及48； c.     各別地SEQ ID NO: 51、52、及48； d.     各別地SEQ ID NO: 53、54、及76；或 e.     各別地SEQ ID NO: 53、54、及111； 以及含有重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3之Vδ2抗體或其抗原結合片段，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： f.     各別地SEQ ID NO: 77、78、及79； g.     各別地SEQ ID NO: 80、81、及79； h.     各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或 i.      各別地SEQ ID NO: 84、85、及86；及/或 (B)含有SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VHH及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH；及/或 (C)含有SEQ ID NO:67之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO:68之胺基酸序列的重鏈。 突變、缺失、或插入
CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體之變體旨在涵蓋在本揭露中。變異可係編碼抗體或多肽之一或多個密碼子的突變/取代、缺失、或插入，導致胺基酸序列相較於原始抗體或多肽的變化。取代誘變之所關注位點包括CDR及FR。
胺基酸突變可係用具有類似結構及/或化學特性之另一胺基酸替換一個胺基酸的結果，諸如用絲胺酸替換白胺酸，例如，保守性胺基酸替換。所屬技術領域中具有通常知識者已知的標準技術可用於將突變引入編碼本文所提供之分子的核苷酸序列中，包括例如導致胺基酸突變之定點誘變及PCR介導之誘變。插入或缺失可選地可在約1至5個胺基酸之範圍內。在某些實施例中，相對於原始分子，突變、缺失、或插入（共同地修飾）包括少於25個胺基酸修飾、少於20個胺基酸修飾、少於15個胺基酸修飾、少於10個胺基酸修飾、少於5個胺基酸修飾、少於4個胺基酸修飾、少於3個胺基酸修飾、或少於2個胺基酸修飾。因此，如本文所用，提及「與......實質上相同的胺基酸序列」包括相對於原始分子，具有含少於25個胺基酸修飾、少於20個胺基酸修飾、少於15個胺基酸修飾、少於10個胺基酸修飾、少於5個胺基酸修飾、少於4個胺基酸修飾、少於3個胺基酸修飾、或少於2個胺基酸修飾之胺基酸序列（原始分子）的分子。在特定實施例中，具有「與參考胺基酸序列實質上相同的胺基酸序列」之分子（例如多肽）相對於參考胺基酸序列具有5、4、3、2、或1個胺基酸取代。在一具體實施例中，突變/取代係在一或多個預期非必需胺基酸殘基處所進行的保守性胺基酸突變/取代。允許的變異可藉由在序列中系統性進行胺基酸的插入、缺失、或突變/取代，並針對親本抗體所展現之活性測試所得變體來判定。
胺基酸序列插入包括長度自一個殘基至包含多個殘基之多肽不等的胺基端及/或羧基端融合，也包括序列內插入單一或多個胺基酸殘基。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。
本揭露中包括藉由保守性胺基酸取代所產生的抗體。在保守性胺基酸取代中，胺基酸殘基被側鏈具有類似電荷之胺基酸殘基置換。如上所述，所屬技術領域中已定義側鏈具有類似電荷之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈（例如離胺酸、精胺酸、組胺酸）、酸性側鏈（例如天冬胺酸、麩胺酸）、未帶電極性側鏈（例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸）、非極性側鏈（例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸）、β支鏈側鏈（例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）、及芳族側鏈（例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）之胺基酸。替代地，取代突變可沿著編碼序列的全部或部分隨機引入，諸如藉由飽和誘變，並且可針對生物活性篩選所得突變體以識別保留活性的突變體。誘變後，可表現經編碼之蛋白質，且可判定蛋白質之活性。可進行保守性（例如，在具有類似性質及/或側鏈之胺基酸基團內）取代，以維持或不顯著改變性質。例示性突變係顯示於下表4中。 表4.保守胺基酸取代突變
原始 殘基 例示性 突變 原始 殘基 例示性 突變
Ala (A) Val；Leu；Ile Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys (K) Arg；Gln；Asn
Asn (N) Gln；His；Asp、Lys；Arg Met (M) Leu；Phe；Ile
Asp (D) Glu；Asn Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
Cys (C) Ser；Ala Pro (P) Ala
Gln (Q) Asn；Glu Ser (S) Thr
Glu (E) Asp；Gln Thr (T) Val；Ser
Gly (G) Ala Trp (W) Tyr；Phe
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸
胺基酸可根據其側鏈性質之類似性分組（參見例如Lehninger, Biochemistry 73-75 (2d ed. 1975)）：(1)非極性：Ala (A)、Val (V)、Leu (L)、Ile (I)、Pro (P)、Phe (F)、Trp (W)、Met (M)；(2)未帶電極性：Gly (G)、Ser (S)、Thr (T)、Cys (C)、Tyr (Y)、Asn (N)、Gln (Q)；(3)酸性：Asp (D)、Glu (E)；及(4)鹼性：Lys (K)、Arg (R)、His(H)。替代地，天然存在的殘基可基於常見側鏈性質分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。例如，不涉及維持抗體之適當構形的任何半胱胺酸殘基亦可經取代，例如用另一胺基酸（諸如丙胺酸或絲胺酸）取代，以改善分子的氧化穩定性並防止異常交聯。非保守性突變會涉及將此等類別中之一者的成員交換為另一類別。
一種類型的取代變體涉及取代親本抗體（例如人源化或人類抗體）之一或多個高度變異區殘基。通常，經選擇用於進一步研究之所得（多個）變體相對於親本抗體將具有在某些生物性質（例如增加親和力、減少免疫原性）上之修飾（例如改善）及/或將具有實質上保留親本抗體之某些生物性質。例示性取代變體係親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體展示之親和力成熟技術（諸如本文所述者）方便地產生。簡言之，使一或多個CDR殘基突變且在噬菌體上展示變體抗體並篩選特定生物活性（例如結合親和力）。
可在CDR中製造改變（例如突變）以例如改進抗體親和力。此類改變可在CDR「熱點(hotspot)」進行，亦即由在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變的密碼子編碼之殘基（參見例如Chowdhury, Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008)）、及/或SDR (a-CDR)，其中測試所得變體抗體或其片段之結合親和力。藉由構築及自二級庫再選擇之親和性成熟已描述於例如Hoogenboom等人之 Methods in Molecular Biology178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，將多樣性引入經選擇用於成熟之可變基因中，其藉由各種方法（例如易錯PCR、鏈改組、或寡核苷酸定向誘變）中之任一者。接著產生二級庫。接著篩選庫以識別任何具有所欲親和力的抗體變體。另一引入多樣性之方法涉及CDR定點方案，其中將數個CDR殘基（例如，一次4至6個殘基）隨機分組。涉及抗原結合之CDR殘基可例如使用丙胺酸掃描誘變或建模特異性識別。關於親和力成熟之更詳細說明係提供於以下章節中。
在一些實施例中，取代、插入、或缺失可發生在一或多個CDR內，只要此類改變不實質減少抗體結合抗原之能力即可。例如，可在CDR中製造不實質減少結合親和力之保守性改變（例如，本文提供之保守性取代）。在本文提供之變體抗體序列之一些實施例中，各CDR係未經改變、或含有不超過一、二、或三個胺基酸取代。
一種用於識別可經靶向用於誘變之抗體之殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變(alanine scanning mutagenesis)」，如由Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)所述。在此方法中，識別殘基或目標殘基之群組（例如，帶電殘基諸如Arg、Asp、His、Lys、及Glu）並由中性或帶負電胺基酸（例如，丙胺酸或聚丙胺酸）置換以判定抗體與抗原的交互作用是否受到影響。可在對初始取代顯示功能敏感度之胺基酸位置引入進一步取代。替代地或額外地，抗原-抗體複合物之晶體結構以識別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為取代之候選物被經靶向或消除。可篩選變體以判定其等是否含有所欲性質。
胺基酸序列插入包括長度範圍在一個殘基至含有一百或更多個殘基之多肽內的胺基端及/或羧基端融合、以及單一或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變體包括抗體之N或C端與酶的融合（例如，用於ADEPT）或增加抗體之血清半衰期的多肽。
變異可使用所屬技術領域中已知的方法進行，諸如寡核苷酸介導之（定點）誘變、丙胺酸掃描、及PCR誘變。定點誘變（參見例如Carter, Biochem J. 237:1-7 (1986)；及Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10:6487-500 (1982)）、卡匣誘變（參見例如Wells et al., Gene 34:315--23 (1985)）、或其他已知技術可對經選殖之DNA執行以生產抗體變體DNA。
在一些實施例中，CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段係IgG。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。在一些實施例中，CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段係IgG1同型，或包含人類IgG1 Fc域。
在一些實施例中，CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1 Fc域中之鈕-孔(KiH)取代。一個人類IgG1 Fc域包含T366W取代（「鈕」Fc域），而另一人類IgG1 Fc域包含選自根據EU編號的T366S、L368A、及Y407V之一或多個突變（「孔」Fc域）。適合地，一個人類IgG1 Fc域包含T366W取代（「鈕」Fc域），而另一人類IgG1 Fc域包含根據EU編號的三重突變T366S/L368A/Y407V（「孔」Fc域）。
在一些實施例中，CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1 Fc域中之選自根據EU編號的L234A、L235A、及D265S之一或多個突變。適合地，CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含Fc域或Fc區中之三重突變L234A/L235A/D265S。在一些實施例中，已知人類IgG1 Fc域中之此等突變（稱為AAS突變）限制或消除抗體與Fc受體之交互作用。
在一些實施例中，CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1 Fc域中之突變H435R及/或Y436F。在一些實施例中，已知Fc區中之此等取代會破壞「孔」人類IgG1 Fc域之單體及同二聚化的蛋白質A結合。
在一些實施例中，CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1 Fc域中之三重突變M252Y/S254T/T256E。在一些實施例中，與相同抗體之野生型版本相比，人類IgG1 Fc域中之此等突變（稱為YTE突變）已顯示增加抗體之血清半衰期。
在一些實施例中，CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1 Fc域中之選自根據EU編號的L234A、L235A、及D265S之一或多個突變。
在一些實施例中，CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含至少一個Fc域中之根據EU編號的H435R及Y436F取代。在一些實施例中，此等突變（稱為RF突變）有利於所欲多特異性分子之純化。
已知IgG3 CH3域中可見之435R及436F胺基酸可阻止與蛋白A樹脂之結合(Jedberg et al. J Immunol Methods. 201(1):25-34, 1997)。因此，藉由將H435R及Y436F取代併入異二聚體分子之僅一條重鏈中（例如在IgG1 Fc中產生與IgG3中可見之435R及436F胺基酸等同的取代），此意味著在表現後產生了三種物種，兩種同二聚體及一種異二聚體。自統計角度來看，25%的所表現產物會在兩條重鏈中攜帶雙重突變，並且在純化期間不會與蛋白A管柱產生交互作用。因此，此種非所要的副產物可在流出液中找到。另一物種之表現產物約佔總表現產物之25%，它們的重鏈不攜帶突變，因此將與蛋白A強烈結合。約50%的主要物種係所欲雙特異性的，僅在一條鏈中包含RF雙重突變，其對樹脂展示出中等親和力。
在一些實施例中，CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含鈕及孔突變、AAS突變、及YTE突變。在特定實施例中，CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段進一步包含至少一個Fc域之RF突變。 用於判定 sCD33 水平之方法
本領域已知的任何適合的方法可用於判定樣本中sCD33之水平。例如，樣本（例如，腦脊髓液樣本或血液樣本，諸如全血、血清、或血漿樣本）中之sCD33水平可係使用免疫墨點法（例如西方墨點法）、質譜法、流式細胞術、免疫檢定法（例如，來自Quanterix之SIMOA檢定法，參見例如網站：www.quanterix.com/simoa-technology/）、鄰近延伸檢定法（例如，來自Olink之檢定法，參見例如網站：www.olink.com/our-platform/our-pea- technology）、基於電化學發光之檢定法（例如，來自Meso Scale Diagnostics之檢定法，參見例如網站：www.mesoscale.com/en/technical_resources/our_technology/ecl）、及/或基於適配體之方法，諸如SOMASCAN檢定法（參見例如Candia et al. (2017) Sci Rep 7, 14248）判定。
在一些實施例中，樣本（例如，腦脊髓液樣本或血液樣本，諸如全血、血清、或血漿樣本）中之sCD33水平係使用基於質譜之方法判定。例如，樣本（例如，腦脊髓液樣本或血液樣本，諸如全血、血清、或血漿樣本）中之sCD33水平可係使用定量液相層析多重反應監測質譜(Quantitative Liquid Chromatography Multiple-Reaction Monitoring Mass Spectrometry, LCMRM/MS)檢定法判定。使用定量液相層析多重反應監測質譜(LCMRM/MS)檢定法判定sCD33水平可包含以下步驟中之一或多者或全部，如本文中實例5中所描述：(a)校準標準品之製備（例如，可藉由在替代基質（例如，用於用CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體處理之樣本的替代基質[例如，腦脊髓液、全血、血清、或血漿之替代基質，諸如適合的緩衝溶液]）中摻入[亦即，添加] CD33蛋白（例如，重組CD33蛋白）來製備覆蓋檢定範圍的水平（例如，八個水平）之校準標準品）；(b)品質控制(QC)樣本（例如，可藉由在來自參考個體之混合樣本中[例如，在來自健康個體之腦脊髓液、全血、血清、或血漿之混合樣本中]摻入CD33蛋白（例如，重組CD33蛋白）來製備覆蓋檢定範圍的水平（例如，三個水平）之QC樣本）、及/或內源水平之QC樣本（非加標QC樣本，例如，可由來自未用CD33蛋白加標之參考個體之混合樣本[例如，來自健康個體之腦脊髓液、全血、血清、或血漿之混合樣本]製備非加標QC樣本）、及/或空白樣本之製備；(c)提供來自用抗CD33抗體治療之一或多個個體的樣本，例如腦脊髓液樣本或血液樣本，諸如全血、血清、或血漿樣本；(d)例如用胰蛋白酶或另一種適合的酵素消化校準標準品、QC樣本、非加標QC樣本、空白樣本、及/或來自用抗CD33抗體處理的一或多個個體之樣本；(e)在校準標準品、QC樣本、非加標QC樣本、空白樣本、及/或來自用抗CD33抗體處理之一或多個個體的樣本中摻入（亦即向其中添加）穩定同位素標記的(Stable Isotope Labeled, SIL)內標準肽用於sCD33；(f)使用固相提取(Solid-Phase Extraction, SPE)吸著劑基質對校準標準品、QC樣本、非加標QC樣本、空白樣本、及/或來自用抗CD33抗體處理之一或多個個體的樣本進行脫鹽；(g)使用LC-MRM/MS檢定法分析校準標準品、QC樣本、非加標QC樣本、空白樣本、及/或用CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體處理之樣本，其中監測內源性目標肽及其SIL對應物之轉變；(h)藉由計算內源性目標肽及SIL肽之比率並將該值反算於校準曲線上，判定用CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體處理的樣本中sCD33之濃度。
在一些實施例中，CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段並不結合至sCD33（或其替代物rCD33）。如本文所描述，表述「不結合至sCD33」之含義涵蓋不存在與sCD33（或其替代物rCD33）之顯著結合。不存在與sCD33之顯著結合（例如，如本文所用的「不顯著結合sCD33」）根據其在本領域中的普通含義來理解，並且可藉由所屬技術領域中具有通常知識者認為適合的任何方式來評估。
例如，在置於與0.2 nM之CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段接觸後，人類血清中遊離形式的sCD33並不顯著降低，或降低不大於50%（例如，降低不大於40%）[或降低小於50%（例如，降低小於40%）]。
例如，當置於與含有sCD33之生物樣本（諸如AML人類患者之血清樣本）接觸時，或在已摻有10 ng/ml rCD33之生物樣本中，抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段（例如，以0.2 nM之濃度）不會顯著降低遊離形式之sCD33的水平，或至少不會將其降低大於50%（例如，不會減少大於40%以上）
例如，抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段對腫瘤細胞諸如THP-1細胞系之T細胞細胞毒性EC50值不受10 ng/mL的rCD33之存在的顯著影響（亦即，在不存在或存在10 ng/mL rCD33之情況下具有相同或實質上相同的EC50值；參見實例9之T細胞細胞毒性檢定）。
例如，CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段對sCD33或rCD33之親和力低於非mCD33特異性的抗體（亦即，其結合sCD33或rCD33）。
在特定實施例中，CD33抗體、及/或抗體、及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體、或其抗原結合片段對結合CD33具有比sCD33更大的親和力。 人源化抗體
本文所描述之CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體包括人源化抗體。人源化抗體（諸如本文中所揭示之人源化抗體）可使用所屬技術領域中已知的各種技術來生產，該等技術包括但不限於：CDR移植（歐洲專利第EP 239,400號；國際公開案第WO 91/09967號；及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號、及第5,585,089號）、鑲飾(veneering)或表面重塑(resurfacing)（歐洲專利第EP 592,106號及第EP 519,596號；Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991)；Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994)；及Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)）、鏈改組(chain shuffling)（美國專利第5,565,332號）、及揭示於例如下列中之技術：美國專利第6,407,213號、美國專利第5,766,886號、WO 9317105、Tan et al., J. Immunol. 169:1119 25 (2002)、Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000)、Morea et al., Methods 20(3):267 79 (2000)、Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16):10678-84 (1997)、Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895 904 (1996)、Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s- 5977s (1995)、Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995)、Sandhu JS, Gene 150(2):409-10 (1994)、及Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994)。亦參見美國專利公開第US 2005/0042664 A1號（2005年2月24日），其等各者之全文以引用方式整體併入本文中。
在一些實施例中，本文所提供之抗體可係結合至CD33或CD33及Vδ2（包括人類CD33及人類Vδ2）之人源化抗體。各種用於人源化非人類抗體的方法在此項技術中為已知。舉例而言，人源化抗體可具有自非人類來源引入之一或多個胺基酸殘基。這些非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入(import)」殘基，其一般係取自「輸入」可變域。人源化可遵循例如以下方法執行：Jones et al., Nature 321:522-25 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-27 (1988)；及Verhoeyen et al., Science 239:1534-36 (1988)，藉由以高度變異區序列取代人類抗體之對應序列。
在一些情況下，人源化抗體係藉由CDR移植來建構，其中親本非人類抗體之CDR的胺基酸序列係移植至人類抗體架構上。例如，Padlan等人判定，CDR中僅約三分之一的殘基實際接觸抗原，並將此等稱為「特異性決定殘基(specificity determining residue)」或SDR (Padlan et al., FASEB J. 9:133-39 (1995))。在SDR移植之技術中，僅將SDR殘基移植至人類抗體架構上（參見例如，Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)）。
用於製造人源化抗體之人類可變域的選擇對於減少抗原性而言可係重要的。例如，根據所謂的「最適(best-fit)」方法，非人類抗體之可變域的序列係針對整個已知人類可變域序列庫進行篩選。可選擇與非人類抗體最接近的人類序列作為人源化抗體之人類架構（Sims et al., J. Immunol.151:2296-308 (1993)；及Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-17 (1987)）。另一種方法使用自屬於輕鏈或重鏈特定子群之所有人類抗體之共有序列衍生的特定架構。相同架構可用於若干種不同人源化抗體（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89 (1992)；及Presta et al., J. Immunol. 151:2623-32 (1993)）。在一些情況下，架構係衍生自最豐富人類子類別之共有序列，該等人類子類別為V L6子群I (V L6I)及V H子群III (V HIII)。在另一種方法中，使用人類生殖系基因作為架構區的來源。
在基於稱為超人源化(superhumanization)之CDR比較的替代範例中，FR同源性係不相關的。該方法係由非人類序列與功能性人類生殖系基因貯庫(repertoire)的比較所組成。接著，選擇編碼與鼠類序列相同或密切相關的正則結構(canonical structure)之基因。接下來，在與非人類抗體共有正則結構的基因內，選擇在CDR內具有最高同源性者作為FR供體。最後，將非人類CDR移植至此等FR上（參見例如, Tan et al., J. Immunol. 169:1119-25 (2002)）。
通常進一步所欲的是，抗體在保留其對於抗原的親和力及其他有利生物性質之情況下經人源化。為達成此目的，根據一種方法，藉由使用親本及人源化序列之三維模型對親本序列及各種概念性人源化產物進行分析的程序來製備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型係普遍可取得的且係所屬技術領域中具有通常知識者所熟悉的。電腦程式可用來說明及展示所選候選免疫球蛋白序列之可能的三維構型結構。此等包括例如WAM (Whitelegg and Rees, Protein Eng. 13:819-24 (2002))、Modeller (Sali and Blundell, J. Mol. Biol. 234:779-815 (1993))、及Swiss PDB Viewer (Guex and Peitsch, Electrophoresis 18:2714-23 (1997))。檢測此等展示允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列之功能中的可能作用，例如分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可從接受者及輸入序列選擇並組合FR殘基，以達到所欲抗體特性，諸如對（多種）目標抗原的親和力增加。一般而言，高度變異區殘基係直接且最實質涉及影響抗原結合。
另一種用於抗體人源化之方法係基於抗體人性(humanness)度量，其稱為人類序列含量(Human String Content, HSC)。此方法比較小鼠序列與人類生殖系基因之貯庫，且差異評分為HSC。接著，將目標序列藉由最大化其HSC（而非使用整體同一性指標(global identity measure)）人源化，以產生多種不同人源化變體(Lazar et al., Mol. Immunol. 44:1986-98 (2007))。
除了上述方法之外，可使用實驗方法來產生並選擇人源化抗體。此等方法包括基於下列之方法：使用富集技術或高通量篩選技術來產生大型人源化變體庫並選擇最佳殖株。可自噬菌體、核糖體、及酵母菌展示庫並藉由細菌菌落篩選，將抗體變體單離（參見例如Hoogenboom, Nat. Biotechnol. 23:1105-16 (2005)；Dufner et al., Trends Biotechnol. 24:523-29 (2006)；Feldhaus et al., Nat. Biotechnol. 21:163-70 (2003)；及Schlapschy et al., Protein Eng. Des. Sel. 17:847-60 (2004)）。
在FR庫方法中，在FR中的特定位置處引入殘基變體集合，接著進行庫篩選，以選擇以最佳程度支持經移植CDR的FR。欲取代之殘基可包括一些或所有「游標(Vernier)」殘基，其等經識別為可能促成CDR結構（參見例如, Foote and Winter, J. Mol. Biol. 224:487-99 (1992)）、或來自由Baca et al.J. Biol. Chem. 272:10678-84 (1997)識別之更有限的目標殘基組。
在FR改組中，整體FR係與非人類CDR組合，而不是建立所選殘基變體之組合庫（參見例如，Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)）。可使用單步驟FR改組程序。由於所得抗體展現出趕改進的生物化學及物理化學特性（包括表現增強、親和力增加、及熱穩定性），此程序已顯示有效（參見例如，Damschroder et al., Mol. Immunol. 44:3049-60 (2007)）。
「人類工程改造(humaneering)」方法係基於基本最短特異性決定位(minimum specificity determinant, MSD)的實驗識別，且係基於非人類片段進入人類FR庫的序列置換及結合的評估。此方法一般導致來自多個子類別而具有不同人類V區段CDR之抗體的表位保留及識別。
「人類工程改造」方法涉及藉由對抗體之胺基酸序列進行特定變化來改變非人類抗體或抗體片段，以在人類中產生免疫原性降低的經修飾抗體，該經修飾抗體仍保留原始非人類抗體的所欲結合性質。通常而言，該技術涉及將非人類抗體之胺基酸殘基分類為「低風險(low risk)」、「中度風險(moderate risk)」、或「高風險(high risk)」殘基。分類係使用整體風險/獎勵計算來執行，整體風險/獎勵計算評估進行特定取代的預期效益（例如，就在人類中的免疫原性而言），其係相對於取代將影響所得抗體摺疊的風險。可藉由比對來自非人類抗體之可變區的胺基酸序列與特定或一致人類抗體序列之對應區，以選擇待在非人類抗體序列之給定位置（例如，低或中度風險）處取代的具體人類胺基酸殘基。非人類序列中之低或中度風險位置處之胺基酸殘基可根據比對來取代人類抗體序列中之對應殘基。用於製造經人類工程改造之蛋白質的技術係更詳細描述於Studnicka et al., Protein Engineering 7:805-14 (1994)；美國專利第5,766,886號；第5,770,196號；第5,821,123號；及第5,869,619號；及PCT公開案WO 93/11794。
可使用例如Composite Human Antibody™技術(Antitope Ltd., Cambridge, United Kingdom)來產生複合人類抗體。為了產生複合人類抗體，可變區序列係以避免T細胞表位之方式，自多個人類抗體可變區序列之片段設計出來，從而最小化所得抗體的免疫原性。
去免疫抗體(deimmunized antibody)係其中T細胞表位已被移除的抗體。用於製造去免疫化抗體之方法已經過描述。參見例如，Jones et al.,Methods Mol Biol. 525:405-23 (2009), xiv及De Groot et al., Cell. Immunol. 244:148-153(2006))。去免疫抗體包含經T細胞表位除盡之可變區及人類恆定區。簡言之，抗體之可變區經選殖，且T細胞表位隨後係藉由在T細胞增生檢定中測試衍生自抗體之可變區的重疊肽來識別。T細胞表位係經由電腦模擬( in silico)方法識別，以識別與人類MHC第II型結合的肽。在可變區中引入突變以使與人類MHC第II型的結合無效化。突變的可變區接著用以產生去免疫抗體。 多核苷酸、載體及宿主細胞
在另一大致態樣中，本揭露係關於合成多核苷酸，其編碼本文所描述之CD33抗體或其抗原結合片段。在另一大致態樣中，本揭露係關於一或多種經單離之核酸，其編碼本文所描述之CD33抗體或其抗原結合片段、或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段。
「多核苷酸(polynucleotide)」或「核酸(nucleic acid)」在本文中可互換使用，其係指任何長度之核苷酸的聚合物且包括DNA及RNA。核苷酸可係去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基、及/或其類似物、或任何可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中之受質。多核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如經甲基化之核苷酸及類似物。
除非另有指定，否則「編碼胺基酸序列之多核苷酸序列(polynucleotide sequence encoding an amino acid sequence)」包括所有彼此為簡併版本並且編碼相同胺基酸序列之核苷酸序列。編碼蛋白質或RNA之片語多核苷酸序列亦可包括內含子（在編碼蛋白質之核苷酸序列可在一些版本中含有（多個）內含子之情況下）。
所屬技術領域中具有通常知識者將瞭解的是，可以改變（例如，置換、刪除、插入等）蛋白質之編碼序列而不改變該蛋白質之胺基酸序列。因此，所屬技術領域中具有通常知識者將理解的是，可改變編碼本揭露之CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體之合成多核苷酸而不改變該等蛋白質之胺基酸序列。
在一些實施例中，編碼GD33B273之抗CD33重鏈之核苷酸序列包含： SEQ ID NO: 89： CAAGTGCAACTTGTGGAAAGTGGTGGCGGACTTGTGCAAGCTGGTGGCTCATTGAGGCTGTCTTGTGAAGCATCTGGCTCAATCTTCAGCATCTTTGATATGGGTTGGTATAGAAGACCTCCCGGGGCTCAGAGAGAACTGGTGGCTAGAATCACAAATGGTGGGATTACCAATTACCTCGATTCAGTTAAGGGAAGGTTCTCTATTTCCAGAGACAATGCCAAGAATACTGTGTACTTGCAAATGAACAGCTTGAATGCCGAAGATACAGCCGTGTACTATTGTTACGCAGATATTGCAGCAAACATTGGCTCAAACATTCTGTACGATGACTATTGGGGTCAAGGAACACAAGTTACAGTCAGTTCTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTCCTGCGCCGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGGTTCACGCAGAAGTCTCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
在一些實施例中，編碼GD33B273之抗Vδ2重鏈之核苷酸序列包含： SEQ ID NO: 90： GAAGTTCAGCTGGTTGAAAGTGGTGGTGGCCTTGTGCAAGCCGGTGGCTCATTACGCTTGTCATGTGCAGCCTCTGGAAGACCTTTCAGCAATTATGGGATGGGGTGGTTTAGACAAGCACCCGGAAAGAAACGCGAGTTTGTTGCTGGCATTTCATGGAGTGGCGGAAGTACAGATTATGCAGATTCTGTTAAAGGACGCTTTACAATTAGTCGGGACAACGCAAAGAATACCGTGTATCTCCAGATGAATAGCCTTAAGCCAGAAGATACAGCCGTTTATTATTGTGCCGCTGTTTTCTCTGGTGCTGAAACTGCATACTATCCATCAGACGACTACGATTATTGGGGTCAAGGAACTCAAGTGACAGTTTCTAGTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCTCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
在另一大致態樣中，本揭露係關於一或多種載體，其包含編碼本文所揭示之CD33抗體或其抗原結合片段之一或多個合成多核苷酸序列。在另一大致態樣中，本揭露係關於一或多種載體，其包含編碼本文所揭示之CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之一或多個合成多核苷酸序列。用語「載體(vector)」係指用於攜帶或包括多核苷酸序列之物質，包括例如編碼如本文所描述之抗體或抗原結合片段之多核苷酸序列，以將多核苷酸序列引入宿主細胞中。適於使用之載體包括例如表現載體、質體、噬菌體載體、病毒載體、遊離基因體、及人工染色體，其可包括可操作用於穩定整合至宿主細胞染色體中的選擇序列或標記。此外，載體可包括一或多個可選擇標記基因及適當的表現控制序列。可包括的可選擇標記基因例如提供對抗生素或毒素的抗性，補充營養缺陷型缺陷，或供應不在培養基中的關鍵營養素。表現控制序列可包括組成型及誘導型啟動子、轉錄增強子、轉錄終止子、及類似者，其係所屬技術領域中熟知的。當欲共表現二或更多個多核苷酸分子（例如，抗體重鏈及輕鏈或抗體VH及VL二者）時，可將兩個多核苷酸分子插入至例如單一表現載體中或分開的表現載體中。對於單一載體表現，可將編碼多核苷酸可操作地連接至一個常見的表現控制序列或連接至不同的表現控制序列，諸如一個誘導型啟動子及一個持續性啟動子。多核苷酸分子引入宿主細胞可使用所屬技術領域中熟知之方法來確認。該等方法包括例如核酸分析諸如北方墨點法或聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增mRNA、針對基因產物表現之免疫墨點法、或其他適合的分析方法，以測試引入多核苷酸序列或其對應基因產物之表現。所屬技術領域中具有通常知識者應理解，核酸分子係以足以生產所欲產物的量表現，且應進一步理解，表現水平可使用所屬技術領域中熟知之方法最佳化以獲得足夠表現。
在另一大致態樣中，本揭露係關於一種宿主細胞，其包含編碼本文所揭示之CD33抗體及/或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之合成多核苷酸。如本文所用，用語「宿主細胞(host cell)」係指可用多核苷酸分子轉染的特定對象細胞及該細胞之後代或潛在後代。該細胞之後代可能由於可能發生在後繼世代或多核苷酸分子整合至宿主細胞基因體時發生的突變或環境影響，而不與經多核苷酸分子轉染的親本細胞同一。
如本文中所使用，用語「經轉染(transfected)」或「經轉形(transformed)」或「經轉導(transduced)」係指將外源性核酸轉移或引入至宿主細胞中之程序。「經轉染」或「經轉形」或「經轉導」之細胞係經外源性核酸轉染、轉形或轉導之細胞。該細胞包括初代對象細胞及其後代。
鑒於本揭露，所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何宿主細胞可用於重組表現本文所揭示之抗體或其抗原結合片段。哺乳動物、真菌、細菌、或植物細胞特別適合。哺乳動物細胞（包括人類、猴子、大鼠、小鼠、豚鼠）係常規使用並且適合的。亦可使用真菌細胞，包括酵母（釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)）、畢赤酵母( Pichia pastoris)、粗糙鏈孢菌( Neurospora crassa)。亦可使用細菌，諸如大腸桿菌( E. coli)。然而，哺乳動物細胞系（諸如CHO、HEK、及NS0）係用於重組抗體生產（例如，用於臨床使用）之較佳且最常用的表現系統，並且通常最方便地表現，因為它們容易允許轉譯後修飾並且可產生具有類人類糖基化模式之抗體。在一些實施例中，宿主細胞係大腸桿菌TG1或BL21細胞（用於表現例如scFv或Fab抗體）、CHO-DG44或CHO-K1細胞、或HEK293細胞、或NS0細胞（用於表現例如全長IgG抗體）。根據具體實施例，重組表現載體係藉由習知方法（諸如化學轉染、熱休克、或電穿孔）轉形至宿主細胞中，其中重組表現載體被穩定地整合至宿主細胞基因體中，使得有效表現重組核酸。
在另一大致態樣中，本揭露係關於一種產生本文所描述之CD33抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含在產生本文所揭示之CD33抗體或其抗原結合片段之條件下培養包含編碼CD33抗體或其抗原結合片段之一或多個多核苷酸序列（分子）之細胞，及自細胞或細胞培養物（例如，來自上清液）中回收CD33抗體或其抗原結合片段。在另一大致態樣中，本揭露係關於一種產生本文所揭示之CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含在產生本文所揭示之CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之條件下培養包含編碼雙特異性抗體或其抗原結合片段之一或多個多核苷酸序列（分子）之細胞，及自細胞或細胞培養物（例如，來自上清液）中回收抗體或其抗原結合片段。經表現抗體或其抗原結合片段可自細胞收穫且根據所屬技術領域中已知且如本文所描述之習知技術純化。 醫藥組成物
在另一大致態樣中，本揭露係關於一種醫藥組成物，其包含本文所描述之CD33抗體或其抗原結合片段、及醫藥上可接受之載劑。在另一大致態樣中，本揭露係關於一種醫藥組成物，其包含本文所描述之CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合部分、及醫藥上可接受之載劑。如本文所用之用語「醫藥組成物(pharmaceutical composition)」意指包含本文所描述之抗體與醫藥上可接受之載劑的產品。本揭露之抗體及包含該等抗體之組成物亦可用於製造用在本文提及之治療應用中之藥劑。
本文中所使用之用語「載劑(carrier)」係指任何賦形劑、稀釋劑、填充料、鹽、緩衝劑、穩定劑、助溶劑、油、脂質、含脂質囊泡、微球、脂質體包封、或其他所屬技術領域中已知用於醫藥配方之材料。將理解載劑、賦形劑或稀釋劑之特徵將取決於特定應用之投予途徑而定。如本文所用，用語「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」係指不干擾根據本揭露之組成物的有效性或根據本揭露之組成物的生物活性之非毒性材料。根據鑒於本揭露之特定實施例，任何適合用於抗體醫藥組成物之醫藥上可接受之載劑均可使用。
在另一大致態樣中，本揭露係關於一種產生包含本文所描述之CD33抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物的方法，該方法包含將CD33抗體或其抗原結合片段與醫藥上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組成物。在另一大致態樣中，本揭露係關於一種產生包含本文所描述之CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物的方法，該方法包含將CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段與醫藥上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組成物。 使用方法
在另一大致態樣中，本揭露係關於一種靶向對象之癌細胞表面上之CD33的方法，該方法包含向該對象投予如本文所描述的特異性結合CD33、或CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之CD33抗體或其抗原結合片段，或包含任一者的醫藥組成物。在特定實施例中，以治療有效量向有需要之對象（例如人類）投予CD33抗體或其抗原結合片段、或CD33/ Vδ2抗體或其抗原結合片段、或包含任一者之醫藥組成物。
結合CD33之抗體及其抗原結合片段之功能性活性可藉由所屬技術領域中已知且如本文所描述之方法表徵。用於表徵結合CD33之抗體及其抗原結合片段之方法包括但不限於親和力及特異性檢定，包括Biacore、ELISA、及OctetRed分析；藉由FACS檢測抗體與癌細胞上之CD33結合之結合檢定；根據特定實施例，用於表徵結合CD33之抗體及其抗原結合片段之方法包括以下所述者。
在另一大致態樣中，本揭露係關於一種治療有需要之對象之血液癌症的方法，該方法包含向該對象投予特異性結合CD33之CD33抗體、CD33/ Vδ2多特異性抗體、或其抗原結合片段，或本揭露之醫藥組成物。血液癌症可係例如白血病、淋巴瘤、及骨髓瘤。在某些實施例中，血液癌症可係急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生不良症候群（MDS，低或高風險）、急性淋巴球性白血病（ALL，包括所有亞型）、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、或母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤(BPDCN)。
在另一大致態樣中，本揭露係關於如本文所描述之CD33抗體、CD33/ Vδ2多特異性抗體、或其抗原結合片段、或包含任一者之醫藥組成物，其用於療法中。
在另一大致態樣中，本揭露係關於如本文所描述之CD33抗體、CD33/ Vδ2多特異性抗體、或其抗原結合片段、或包含任一者之醫藥組成物，其用於治療血液癌症。
在另一大致態樣中，本揭露係關於如本文所描述之CD33抗體、CD33/ Vδ2多特異性抗體、或其抗原結合片段、或包含任一者之醫藥組成物在製造用於治療血液癌症之藥劑中之用途。
血液癌症可係例如白血病、淋巴瘤、及骨髓瘤。在某些實施例中，血液癌症可係急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生不良症候群（MDS，低或高風險）、急性淋巴球性白血病（ALL，包括所有亞型）、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、或母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤(BPDCN)。
在特定實施例中，患有血液癌症例如AML或MDS之對象缺乏CD33基因中之單核苷酸多型性(SNP) rs12459419。
在特定實施例中，患有血液癌症例如AML或MDS之對象具有CD33基因中之單核苷酸多型性(SNP) rs12459419。
根據本文中之實施例，醫藥組成物包含治療有效量之CD33抗體、CD33/ Vδ2多特異性抗體、或其抗原結合片段。如本文中所使用，用語「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指活性成分或組分在對象中引起所欲生物或醫學反應之量。
如本文中關於CD33抗體、CD33/ Vδ2多特異性抗體、或其抗原結合片段所用，治療有效量意指調節有需要之對象中之免疫反應之CD33抗體、CD33/ Vδ2多特異性抗體、或其抗原結合片段的量。
根據具體實施例，治療有效量係指足以達成一、二、三、四、或更多個下列效應之療法之量：(i)減少或改善待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的嚴重性；(ii)減少待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的持續時間；(iii)預防待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的進展；(iv)引起待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的迴歸；(v)預防待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的發展或發作；(vi)預防待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的復發；(vii)減少患有待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀之對象的住院；(viii)減少患有待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀之對象的住院長度；(ix)增加患有待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀之對象的存活率（例如整體存活期[OS]或無進展存活期[PFS]）；(xi)抑制或減少對象之待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀；及/或(xii)增強或改善另一療法的（多種）疾病預防或治療效應。
治療有效量或劑量可根據各種因子變化，諸如所欲治療之疾病、病症或病況、投予手段、標靶部位、對象之生理狀態（包括例如年齡、體重、健康）、對象係人類抑或動物、其他投予藥物、及治療係疾病預防性抑或治療性。最佳化滴定治療劑量以最佳化安全性及功效。
根據特定實施例，本文所描述之組成物經調配以適合於投予至對象之預期途徑。例如，本文所述的組成物可經調配成適合靜脈內、皮下、或肌內投予。
如本文中所使用，用語「治療（treat、treating、及treatment）」皆意欲指改善或逆轉至少一個與癌症有關的可測量物理參數，該物理參數未必可在對象中覺察，但可以是可在對象中覺察的。用語「治療」亦可指造成疾病、病症、或病況消退、預防疾病、病症、或病況進展、或至少延緩疾病、病症、或病況之進展。在一具體實施例中，「治療」係指減輕一或多個與疾病、病症、或病況相關之症狀、預防一或多個與疾病、病症、或病況相關之症狀的發展或開始、或減少一或多個與疾病、病症、或病況相關之症狀的期間，該疾病、病症、或病況係諸如腫瘤，或更佳地係癌症。在一具體實施例中，「治療」係指預防疾病、病症、或病況之復發。在一具體實施例中，「治療」係指增加具有疾病、病症、或病況之對象的存活。在一具體實施例中，「治療」係指排除對象之疾病、病症、或病況。
本發明大致上在本文中使用肯定的語言描述多個實施例來揭示。本發明亦具體地包括其中完全或部分排除特定主題之實施例，諸如物質或材料、方法步驟及條件、計劃書、程序、檢定、或分析。因此，即使本發明大致上並未在本文中就本發明所不包括方面明示，但仍在本文中揭示非明示包括在本發明中的態樣。 列舉的實施例
已經描述本發明之數個實施例。儘管如此，將理解的是，在不偏離本發明之精神及範圍下，可做出各種修改。因此，下列實例旨在說明但不限制申請專利範圍中所描述之發明的範圍。
實施例1係一種特異性結合至膜結合之人類CD33 (mCD33)之抗體或抗原結合片段。
實施例2係如實施例1之抗體或其抗原結合片段，其包含： a.     各別包含SEQ ID NO: 12、13、及14之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)；及 各別包含SEQ ID NO: 15、16、及17之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、輕鏈互補決定區2 (CDR2)、及輕鏈互補決定區3 (CDR3)； b.     各別包含SEQ ID NO: 18、19、及14之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 15、16、及17之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3； c.     各別包含SEQ ID NO: 20、21、及14之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 15、16、及17之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3；或 d.     各別包含SEQ ID NO: 22、23、及24之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 25、26、及17之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3。
實施例3係如實施例1之抗體或其抗原結合片段，其包含： a.     各別包含SEQ ID NO: 27、28、及29之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 30、31、及32之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3； b.     各別包含SEQ ID NO: 33、34、及29之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 30、31、及32之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3； c.     各別包含SEQ ID NO: 35、36、及29之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 30、31、及32之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3；或 d.     各別包含SEQ ID NO: 37、38、及39之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 40、41、及32之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3。
實施例4係如實施例1至3中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO: 42或44至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列之重鏈可變區(VH)。
實施例5係如實施例1至4之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO: 42或44之VH。
實施例6係如實施例1至5中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO: 43或45至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)。
實施例7係如實施例1至6中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO: 43或45之VL。
實施例8係如實施例1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO: 42之VH及含有SEQ ID NO: 43之VL。
實施例9係如實施例1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO: 44之VH及含有SEQ ID NO: 45之VL。
實施例10係如實施例1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含免疫球蛋白(IgG) Fc域。
實施例11係如實施例1至10中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該IgG Fc域係人類IgG1 Fc域。
實施例12係如實施例1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域包含選自根據EU編號系統之T366S、L368A、T366W、及Y407V的一或多個突變。
實施例13係如實施例1至12中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含選自根據EU編號系統之L234A、L235A、及D265S的一或多個突變。
實施例14係如實施例1至13中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含根據EU編號系統之突變H435R及/或Y436F。
實施例15係如實施例1至14中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含根據EU編號系統之三重突變M252Y/S254T/T256E。
實施例16係如實施例1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係僅重鏈抗體。
實施例17係如實施例1之抗體或其抗原結合片段，其中其抗原結合片段係單一重鏈可變區(VHH)。
實施例18係如實施例16或實施例17之抗體或其抗原結合片段，其包含： a.     各別包含SEQ ID NO: 46、47、及48之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； b.     各別包含SEQ ID NO: 49、50、及48之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； c.     各別包含SEQ ID NO: 51、52、及48之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； d.     各別包含SEQ ID NO: 53、54、及76之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；或 e.     各別包含SEQ ID NO: 53、54、及111之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3。
實施例19係如實施例16或實施例17之抗體或其抗原結合片段，其包含： a.     各別包含SEQ ID NO: 55、56、及57之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； b.     各別包含SEQ ID NO: 58、59、及57之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； c.     各別包含SEQ ID NO: 60、61、及57之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；或 d.     各別包含SEQ ID NO: 62、63、及64之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3。
實施例20係如實施例16至19中任一項，特別是實施例18之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO: 65至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列之VHH
實施例21係如實施例20之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO: 65之VHH。
實施例22係如實施例16至21中任一項，特別是實施例19之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO: 66至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列之VHH。
實施例23係如實施例22之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO: 66之VHH。
實施例24係如實施例16至23中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含免疫球蛋白(IgG) Fc域。
實施例25係如實施例16至24中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該IgG Fc域係人類IgG1 Fc域。
實施例26係如實施例16至25中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域包含選自根據EU編號系統之T366S、L368A、T366W、及Y407V的一或多個突變。
實施例27係如實施例16至26中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含選自根據EU編號系統之L234A、L235A、及D265S的一或多個突變。
實施例28係如實施例16至27中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含根據EU編號系統之突變H435R及/或Y436F。
實施例29係如實施例16至28中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含根據EU編號系統之三重突變M252Y/S254T/T256E。
實施例30係如實施例1至29中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段結合人類CD33之C2域。
實施例31係如實施例1至30中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段並不結合至可溶性人類CD33 (sCD33)。
實施例32係如實施例1至31中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係嵌合的。
實施例33係如實施例1至32中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係人類或人源化的。
實施例34係一種合成多核苷酸，其編碼如實施例1至33中任一項之抗體或其抗原結合片段。
實施例35係一種載體，其包含如實施例34之合成多核苷酸。
實施例36係一種宿主細胞，其包含如實施例35之載體。
實施例37係一種醫藥組成物，其包含如實施例1至33中任一項之抗體或其抗原結合片段、及醫藥上可接受之載劑。
實施例38係一種治療有需要之對象之血液癌症的方法，其包含向該對象投予如實施例36之醫藥組成物。
實施例39係如實施例38之方法，其中該血液癌症係急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生不良症候群(MDS)、急性淋巴球性白血病(ALL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)或母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤(BPDCN)。
實施例40係一種產生如實施例1至33中任一項之抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含在產生該抗體或抗原結合片段之條件下培養包含編碼該抗體或其抗原結合片段之多核苷酸的細胞，及自該細胞或培養物中回收該抗體或其抗原結合片段。
實施例41係一種產生包含如實施例1至33中任一項之抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物的方法，該方法包含將該抗體或其抗原結合片段與醫藥上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組成物。
實施例42係一種CD33/Vδ2多特異性抗體，其包含CD33抗體或其抗原結合片段及Vδ2抗體或其抗原結合片段， 其中該CD33抗體或其抗原結合片段特異性結合至mCD33，並且 其中該Vδ2抗體或其抗原結合片段特異性結合至人類Vγ9Vδ2 T細胞受體之Vδ2鏈。
實施例43係如實施例42之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3，該等CDR包含下列胺基序列： a.     各別地SEQ ID NO: 12、13、14、15、16、及17； b.     各別地SEQ ID NO: 18、19、14、15、16、及17； c.     各別地SEQ ID NO: 20、21、14、15、16、及17；或 d.     各別地SEQ ID NO: 22、23、24、25、26、及17； 並且其中該Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： e.     各別地SEQ ID NO: 77、78、及79； f.     各別地SEQ ID NO: 80、81、及79； g.     各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或 h.     各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
實施例44係如實施例42之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3，該等CDR包含下列胺基序列： a.     各別地SEQ ID NO: 27、28、29、30、31、及32； b.     各別地SEQ ID NO: 33、34、29、30、31、及32； c.     各別地SEQ ID NO: 35、36、29、30、31、及32；或 d.     各別地SEQ ID NO: 37、38、39、40、41、及32； 並且其中該Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： e.     各別地SEQ ID NO: 77、78、及79； f.     各別地SEQ ID NO: 80、81、及79； g.     各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或 h.     各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
實施例45係如實施例42之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基序列： a.     各別地SEQ ID NO: 46、47、及48； b.     各別地SEQ ID NO: 49、50、及48； c.     各別地SEQ ID NO: 51、52、及48； d.     各別地SEQ ID NO: 53、54、及76；或 e.     各別地SEQ ID NO: 53、54、及111。 並且其中該Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： f.     各別地SEQ ID NO: 77、78、及79； g.     各別地SEQ ID NO: 80、81、及79； h.     各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或 i.      各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
實施例46係如實施例42之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基序列： a.     各別地SEQ ID NO: 55、56、及57； b.     各別地SEQ ID NO: 58、59、及57； c.     各別地SEQ ID NO: 60、61、及57；或 d.     各別地SEQ ID NO: 62、63、及64； 並且其中該Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： e.     各別地SEQ ID NO: 77、78、及79； f.     各別地SEQ ID NO: 80、81、及79； g.     各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或 h.     各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
實施例47係如實施例42至44中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33抗體或其抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO: 42或44至少95%同一的胺基酸序列之重鏈可變區(VH)，及含有與SEQ ID NO:43或45至少95%同一的胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；並且該Vδ2抗體或其抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO: 87至少95%同一的胺基酸序列之僅重鏈可變區(VHH)。
實施例48係如實施例47之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含： a.     含有SEQ ID NO:42之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列的VL；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH；或 b.     含有SEQ ID NO:44之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列的VL；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH。
實施例49係如實施例42、45、及46中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段， 其中該CD33抗體或其抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO: 65或66至少95%同一的胺基酸序列之VHH；及 該Vδ2抗體或其抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO: 87至少95%同一的胺基酸序列之VHH。
實施例50係如實施例49之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含： a.     含有SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VHH；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH；或 b.     含有SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VHH；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH。 實施例51係如實施例42、44、47、及48中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含： a.     含有與SEQ ID NO:67至少90%同一的胺基酸序列之重鏈；以及含有與SEQ ID NO:70至少90%同一的胺基酸序列之重鏈，以及含有與SEQ ID NO:71至少90%同一的胺基酸序列之輕鏈；或 b.     含有與SEQ ID NO:67至少90%同一的胺基酸序列之重鏈；以及含有與SEQ ID NO:72至少90%同一的胺基酸序列之重鏈，以及含有與SEQ ID NO:73至少90%同一的胺基酸序列之輕鏈；或 如實施例42、45、46、49、及50中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含 c.     含有與SEQ ID NO:67至少90%同一的胺基酸序列之重鏈；以及含有與SEQ ID NO:68至少90%同一的胺基酸序列之重鏈；或 d.     含有與SEQ ID NO:74至少90%同一的胺基酸序列之重鏈；以及含有與SEQ ID NO:75至少90%同一的胺基酸序列之重鏈； 實施例51b係如實施例51之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含： a.     含有SEQ ID NO:67之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:70之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:71之胺基酸序列的輕鏈； b.     含有SEQ ID NO:67之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:72之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:73之胺基酸序列的輕鏈； c.     含有SEQ ID NO:67之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:68之胺基酸序列的重鏈； d.     含有SEQ ID NO:74之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:75之胺基酸序列的重鏈，或 e.     含有SEQ ID NO:91之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:92之胺基酸序列的重鏈。
實施例52係如實施例42至51中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該多特異性抗體係雙特異性抗體。
實施例53係如實施例42至52中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含免疫球蛋白(IgG) Fc域。
實施例54係如實施例42至53中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該IgG Fc域係人類IgG1 Fc域。
實施例55係如實施例42至54中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域包含選自根據EU編號系統之T366S、L368A、T366W、及Y407V的一或多個突變。
實施例56係如實施例42至55中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含選自根據EU編號系統之L234A、L235A、及D265S的一或多個突變。
實施例57係如實施例42至56中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含根據EU編號系統之突變H435R及/或Y436F。
實施例58係如實施例42至57中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含根據EU編號系統之三重突變M252Y/S254T/T256E。
實施例59係如實施例42至58中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段結合人類CD33之C2域。
實施例60係如實施例42至59中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段並不結合至sCD33。
實施例61係如實施例42至60中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段係嵌合的。
實施例62係如實施例42至61中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段係人類或人源化的。
實施例63係一種合成多核苷酸，其編碼如實施例42至62中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段。
實施例64係一種載體，其包含如實施例63之合成多核苷酸。
實施例65係一種宿主細胞，其包含如實施例64之載體。
實施例66係一種醫藥組成物，其包含如實施例42至62中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段、及醫藥上可接受之載劑。
實施例67係一種治療有需要之對象之血液癌症的方法，其包含向該對象投予如實施例66之醫藥組成物。
實施例68係如實施例67之方法，其中該血液癌症係急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生不良症候群(MDS)、急性淋巴球性白血病(ALL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)或母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤(BPDCN)。
實施例69係一種產生如實施例42至62中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含在產生該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之條件下培養包含編碼該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之多核苷酸的細胞，及自該細胞或培養物中回收該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段。
實施例70係一種產生包含如實施例42至62中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物的方法，該方法包含將該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段與醫藥上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組成物。
實施例71係如實施例42至62中任一項之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段或如實施例66之醫藥組成物，其用於治療有需要之對象之血液癌症，諸如選自下列之血液癌症：急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生不良症候群(MDS)、急性淋巴球性白血病(ALL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)或母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤(BPDCN)。 實例 實例1.CD33抗原產生
編碼人類CD33細胞外域(extracellular domain, ECD)或其子域之表現構築體係基於骨髓細胞表面抗原CD33（Uniprot登錄號P20138）之序列及其域注釋設計的，該域注釋具有6X His標籤序列(SEQ ID NO: 246)或作為與人類血清白蛋白(human serum albumin, HSA)（C端具有6X His標籤序列）之C34S變體之融合蛋白。基於NCBI登錄號XP_005590138.1，設計了編碼來自石蟹獼猴（cynomolgus monkey，Macaca fascicularis）的CD33（ECD）或其子結構域的相似表現構建體。產生的抗原之胺基酸序列顯示於表5中。
對於瞬時表現，根據製造商的指南使用Expifectamine將人類及食蟹猴CD33全長ECD或子域表現構築體轉染至Expi293細胞（HEK293衍生的）中。在迴轉式震盪器上於37℃和8% CO2下孵育5天後，經由離心分離表現目標蛋白之細胞。然後使用由Ni NTA Sepharose 6 Fast Flow樹脂(GE Healthcare)促進的固定化金屬-離子親和力層析(immobilized metal-ion affinity chromatography, IMAC)自培養基中純化帶有his標籤之可溶性CD33蛋白。隨後，純化包括將緩衝液交換至pH 7.2、不含鈣或鎂的1X Dubelcco磷酸鹽緩衝液中，根據製造商的說明，使用具有7K MWCO、10 mL容量之Zeba™旋轉脫鹽柱完成（ThermoScientific目錄號：89893）。 表5.CD33抗原之胺基酸序列。
蛋白質AA ID 描述 胺基酸序列
C33W1 HSA N末端融合；石蟹獼猴CD33ECD-HSA(C34S)-6xHis DPRVRLEVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPVPYHTRNSPVHGYWFREGAIVSLDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMEKGSTKYSYKSTQLSVHVTDLTHRPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVSYASQNPRTDIFLGDGSGKQGVVQGSGSGSENLYFQGVRSSSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGSHHHHHH (SEQ ID NO: 1)
C33W2 HSA N末端融合；人CD33ECD-Tev-HSA(C34S)-6xHis DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSGSGSENLYFQGVRSSSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGSHHHHHH (SEQ ID NO: 2)
C33W3 HSA N末端融合；hCD33 Ig樣V型結構域（Uniprot P20138，V136-H259）在C末端與HSA和6xHis標籤融合 DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH (SEQ ID NO: 3)
C33W4 HSA N末端融合；hCD33 Ig樣C2型結構域（Uniprot P20138，V136-H259）在C末端與HSA和6xHis標籤融合 VHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH (SEQ ID NO: 4)
C33W8 hCD33_Ig樣V型域及6xHis標籤 DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRGSHHHHHH (SEQ ID NO: 5)
C33W9 hCD33 Ig樣C2型域及6xHis標籤 VHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSHHHHHH (SEQ ID NO: 6)
C33W10 MuIgV_人IgC2嵌合體CD33-6xHis_v1 QDLEFQLVAPESVTVEEGLCVHVPCSVFYPSIKLTLGPVTGSWLRKGVSLHEDSPVATSDPRQLVQKATQGRFQLLGDPQKHDCSLFIRDAQKNDTGMYFFRVVREPFVRYSYKKSQLSLHVTSLSRTPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSHHHHHH (SEQ ID NO: 7)
C33W12 MuIgV_石蟹獼猴IgC2嵌合體CD33-6xHis_v1 QDLEFQLVAPESVTVEEGLCVHVPCSVFYPSIKLTLGPVTGSWLRKGVSLHEDSPVATSDPRQLVQKATQGRFQLLGDPQKHDCSLFIRDAQKNDTGMYFFRVVREPFVRYSYKKSQLSLHVTSLSRTPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVSYASQNPRTDIFLGDGSGRKARKQGVVQGSHHHHHH (SEQ ID NO: 8)
C33W49 來自具有C末端6xHis標籤的Uniprot P20138的人CD33 ECD（D18-H259） DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSHHHHHH (SEQ ID NO: 9)
C33W50 來自具有C末端6xHis標籤的XP_005590138.1的食蟹獼猴CD33 ECD（D37-Q274） DPRVRLEVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPVPYHTRNSPVHGYWFREGAIVSLDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMEKGSTKYSYKSTQLSVHVTDLTHRPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVSYASQNPRTDIFLGDGSGKQGVVQGSHHHHHH (SEQ ID NO: 10)
C33W51 來自具6xHis標籤的Uniprot P20138的人CD33 ECD（D18-G241） DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGHHHHHH (SEQ ID NO: 11)
實例2：抗CD33抗體的產生
抗CD33抗體之產生程序涉及使用Alexis轉殖基因小鼠技術。最初，用重組人類CD33蛋白對經工程改造產生人類/小鼠免疫球蛋白之AlivaMab小鼠進行免疫。自次級淋巴器官獲得淋巴球，並與FO小鼠骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤，或經由FACS進行個別地分選。使用MSD電化學發光對融合瘤上清液進行篩選，以檢測與人類CD33 ECD過度表現HEK細胞之結合。藉由FACS進一步評估陽性樣本，以確認與過度表現的CD33 ECD之結合，並經由ELISA對確認的細胞結合物進行輕鏈同型分型。
經由MSD電化學發光篩選單一細胞分選上清液與重組人類CD33蛋白之結合。選擇展現出所欲結合概況之命中並進行定序以用於進一步分析。隨後進行V區選殖程序，涉及使用Smarter cDNA合成試劑盒自RNA合成cDNA，接著經由PCR擴增VH及VL片段。隨後，使用In-Fusion® HD選殖套組將VH及VL基因導向選殖至Lonza母載體（VH及VL）。經由對小量製備的DNA進行Sanger定序來確認完整的V基因片段。
後續步驟涉及使用編碼蛋白質之經純化質體DNA進行瞬時轉染，在ExpiCHO-S™細胞中表現抗CD33抗體。在具體環境條件下使用ExpiCHO™表現培養基將細胞維持在懸浮液中。使用ExpiFectamine™ CHO轉染套組進行轉染，並且七天後收穫培養物上清液。
藉由將過濾的細胞培養上清液上樣至MabSelect Sure Protein A柱上，接著進行洗滌及洗提步驟來進行蛋白質純化。中和並合併洗提的蛋白質流份，接著過濾。使用分析型粒徑篩析HPLC經由Agilent HPLC系統評定純化的蛋白質之品質。
經由此方法產生的例示性抗體之CDR以及重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列各別概述於表6及表7中。多核苷酸序列概述於表8中。 表6. Ablexis小鼠產生之CD33抗體之CDR區的清單。
CDR1 (SEQ ID NO:) CDR2 (SEQ ID NO:) CDR3 (SEQ ID NO:)
CD33抗體名稱：C33SB1SC1494
重鏈(AbM) GFTFDDYTMH (12) LVSWSGGSAY (13) ESAYNAYFDY (14)
輕鏈(AbM) KSSQSVLYSSNNKNYLA (15) WASTRES (16) HQFYITPYT (17)
重鏈(KABAT) DYTMH (18) LVSWSGGSAYYVDSVKG (19) ESAYNAYFDY (14)
輕鏈(CHOTHIA) KSSQSVLYSSNNKNYLA (15) WASTRES (16) HQFYITPYT (17)
重鏈(CHOTHIA) GFTFDDY (20) SWSGGS (21) ESAYNAYFDY (14)
輕鏈(CHOTHIA KSSQSVLYSSNNKNYLA (15) WASTRES (16) HQFYITPYT (17)
重鏈(IMGT) GFTFDDYT (22) VSWSGGSA (23) AKESAYNAYFDY (24)
輕鏈(IMGT) QSVLYSSNNKNY (25) WAS (26) HQFYITPYT (17)
CD33抗體名稱：C33F1318
重鏈(AbM) GFTFSRYWMS (27) NIKRDGSEKY (28) NSGTWEFDQ (29)
輕鏈(AbM) TRSSGSIASNDVQ (30) EDKQRPS (31) QSYDNNNQV (32)
重鏈(KABAT) RYWMS (33) NIKRDGSEKYYVDAVRG (34) NSGTWEFDQ (29)
輕鏈(KABAT) TRSSGSIASNDVQ (30) EDKQRPS (31) QSYDNNNQV (32)
重鏈(CHOTHIA) GFTFSRY (35) KRDGSE (36) NSGTWEFDQ (29)
輕鏈(CHOTHIA TRSSGSIASNDVQ (30) EDKQRPS (31) QSYDNNNQV (32)
重鏈(IMGT) GFTFSRYW (37) IKRDGSEK (38) ARNSGTWEFDQ (39)
輕鏈(IMGT) SGSIASND (40) EDK (41) QSYDNNNQV (32)
表7.Ablexis小鼠產生之CD33抗體之可變區的清單。
CD33 抗體名稱 可變區之胺基酸序列
C33SB1SC1494 VH： EVQLVESGGDVVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSLVSWSGGSAYYVDSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLKSEDTALYYCAKESAYNAYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 42)
C33SB1SC1494 VL： DIVMTQSPDSLAVSLGERATIYCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKAGQPPELLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVALYYCHQFYITPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 43)
C33F1318 VH： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWMANIKRDGSEKYYVDAVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNSGTWEFDQWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 44)
C33F1318 VL： NFMLTQPHSVSESPGKTVIISCTRSSGSIASNDVQWYQQRPGSSPTIVIYEDKQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDNNNQVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 45)
表8.以下CD33抗體之全鏈多核苷酸序列： C33SB1SC1494_041E121SV7_1.VR1 C33F1318重鏈及輕鏈
C33SB1SC1494_041E121SV7_1.VR1 –重鏈(INS159346) (SEQ ID NO: 97) GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACGTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATACCATGCACTGGGTCCGTCAAGCTCCGGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCTCTTGTTAGTTGGAGTGGTGGTAGCGCATACTATGTAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAAAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAAATCTGAGGACACCGCCCTGTATTACTGTGCAAAAGAAAGTGCATATAATGCCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
C33SB1SC1494_041E121SV7_1.VR1 –輕鏈(INS159345) (SEQ ID NO: 98) GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCTACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAACAGAAGGCAGGACAGCCTCCTGAACTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAGTCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAGGATGTGGCACTTTATTACTGTCACCAATTTTATATTACTCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
C33F1318 –重鏈(INS171943) (SEQ ID NO: 99) GAGGTCCAACTTGTGGAGTCAGGCGGCGGCCTCGTGCAACCAGGGGGTAGTTTGCGCCTGAGTTGCGCTGCCAGCGGGTTTACTTTCTCACGATATTGGATGAGTTGGGTTCGACAGGCACCTGGGAAGGGACTCGAGTGGATGGCTAATATCAAGAGGGATGGATCTGAAAAATACTATGTCGATGCCGTCAGGGGTCGATTTACCATTTCTCGTGACAATGCTAAAAACTCCCTTTACCTGCAAATGAACAGTTTGAGAGCTGAAGATACAGCAGTCTATTATTGTGCTCGCAATAGCGGCACTTGGGAATTTGACCAATGGGGACAAGGTACACTTGTAACAGTCTCCTCA
C33F1318 –輕鏈(INS171944) (SEQ ID NO: 100) AATTTTATGCTTACACAGCCCCATTCTGTTTCCGAAAGCCCAGGCAAGACCGTTATCATCTCTTGCACCCGATCAAGCGGGTCTATAGCTTCCAACGACGTACAATGGTACCAACAGAGGCCAGGCAGCAGTCCCACCATTGTCATTTATGAGGATAAACAGCGTCCATCTGGAGTACCCGACCGTTTTAGTGGATCTATTGATTCCAGCTCAAACTCCGCATCTCTGACTATAAGTGGGCTGAAGACTGAGGATGAAGCCGACTACTATTGTCAATCATACGACAACAACAATCAGGTATTTGGTGGCGGCACCAAGCTCACCGTGCTT
單一重鏈CD33抗體係源自VHH噬菌體展示活動。經由此方法產生的例示性抗體之CDR及重鏈可變區(VHH)之胺基酸序列各別概述於表9及表10。多核苷酸序列概述於表11中。 表9.駱馬產生的CD33抗體之CDR區之清單。
CDR1 (SEQ ID NO:) CDR2 (SEQ ID NO:) CDR3 (SEQ ID NO:)
CD33抗體名稱：JL45-VHH
重鏈(AbM) GSIFSIFDMG (46) RITNGGITN (47) DIAANIGSNILYDDY (48)
重鏈(KABAT) IFDMG (49) RITNGGITNYLDSVKG (50) DIAANIGSNILYDDY (48)
重鏈(CHOTHIA) GSIFSIF (51) TNGGI (52) DIAANIGSNILYDDY (48)
重鏈(IMGT) GSIFSIFD (53) ITNGGIT (54) YADIAANIGSNILYDDY (76)或 YADIAANIGSNIL (111)
CD33抗體名稱：AB266_1_CD33_ B12_P09.VR1
重鏈(AbM) GSIFSINAMG (55) RITGGGATD (56) DLVTRVGSDLLYDDY (57)
重鏈(KABAT) INAMG (58) RITGGGATDYVDSVKG (59) DLVTRVGSDLLYDDY (57)
重鏈(CHOTHIA) GSIFSIN (60) TGGGA (61) DLVTRVGSDLLYDDY (57)
重鏈(IMGT) GSIFSINA (62) ITGGGAT (63) YADLVTRVGSDLLYDDY (64)
表10.駱馬產生的CD33抗體之重鏈可變區。
CD33 抗體名稱 可變區之胺基酸序列
JL45 VHH： QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGSIFSIFDMGWYRRPPGAQRELVARITNGGITNYLDSVKGRFSISRDNAKNTVYLQMNSLNAEDTAVYYCYADIAANIGSNILYDDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 65)
AB266_1_CD33_ B12_P09.VR1 VHH： EVQVVESGGGLVQGGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYHQAPGKQRELVARITGGGATDYVDSVKGRFTISLDSAKSTVYLQMNSLKPEDTAVYHCYADLVTRVGSDLLYDDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 66)
表11.CD33抗體之全鏈多核苷酸序列： B266 _1 _CD33 _B12 _P09.VR1 JL45
ID 多核苷酸序列
AB266_1_CD33_B12_P09.VR1 (INS241328) (SEQ ID NO: 95) GAAGTTCAAGTTGTCGAATCTGGCGGCGGGCTTGTGCAAGGTGGTGGGTCATTGAGGCTGTCTTGTGCTGCATCTGGTTCCATCTTCAGCATTAACGCCATGGGTTGGTATCATCAAGCACCCGGCAAACAGAGGGAACTGGTGGCAAGAATTACTGGAGGAGGAGCTACCGATTATGTGGATTCCGTTAAGGGTCGCTTCACAATCAGTCTGGATTCAGCTAAGTCTACAGTCTATCTGCAAATGAACTCACTCAAACCAGAAGATACAGCAGTCTACCATTGTTATGCAGATCTTGTGACAAGAGTGGGATCTGATCTTCTGTACGACGATTATTGGGGTCAAGGAACTCAAGTTACTGTGTCAAGT
JL45 (INS242239) (SEQ ID NO: 96) CAAGTGCAACTTGTGGAAAGTGGTGGCGGACTTGTGCAAGCTGGTGGCTCATTGAGGCTGTCTTGTGAAGCATCTGGCTCAATCTTCAGCATCTTTGATATGGGTTGGTATAGAAGACCTCCCGGGGCTCAGAGAGAACTGGTGGCTAGAATCACAAATGGTGGGATTACCAATTACCTCGATTCAGTTAAGGGAAGGTTCTCTATTTCCAGAGACAATGCCAAGAATACTGTGTACTTGCAAATGAACAGCTTGAATGCCGAAGATACAGCCGTGTACTATTGTTACGCAGATATTGCAGCAAACATTGGCTCAAACATTCTGTACGATGACTATTGGGGTCAAGGAACACAAGTTACAGTCAGTTCT
實例3.雙特異性CD33 x Vδ2抗體之產生
雙特異性分子係經由實施鈕-孔突變而開發的，產生了由與Fc融合的CD33結合物及與Fc融合的Vδ2結合物組成的異二聚體。在此等構築體中，CD33結合物位於孔Fc上，而Vδ2結合物位於鈕Fc上。為了實現這一點，在一實施例中，CD33 VH及人類CH1恆定區與Fc上之鉸鏈結合，具有若干種突變：L234A/L235A/D265S_M252Y/S254T/T256E_T366S/L368A/Y407V_H435R/Y436F；並且Vδ2結合物與鉸鏈及鈕Fc融合，併入以下突變：C220S_L234A/L235A/D265S_M252Y/S254T/T256E_T366W。關於CD33xVδ2雙特異性抗體，可如專利申請WO 2015/156673A1及WO 2023/037333 A1之實例部分中所描述來製備Vδ2臂。使用的Vδ2結合序列係源自WO2023/037333（參見下表10及表11）。所屬技術領域已為所屬技術領域中具有通常知識者提供了製備本揭露之CD33xVδ2雙特異性抗體之必要教示，其具有如本文所提供之兩個臂的實際序列之知識。
AAS突變(L234A/L235A/D265S)被刻意引入兩條重鏈之Fc部分，以減少Fc受體結合。另外，YTE突變(M252Y/S254T/T256E)被併入兩條重鏈中，以延長雙特異性抗體的半衰期。
將RF突變引入孔重鏈以幫助純化。此等RF突變可被引入至CD33臂之孔重鏈上，如上文所揭示或如SEQ ID NO.34中所揭示的，或引入至Vδ2臂之孔重鏈上，如SEQ ID NO.35.替代地，此等RF突變可被引入至兩條重鏈上。
雙特異性抗體CD33xVδ2可藉由培養重組中國倉鼠卵巢細胞，接著藉由單離、層析純化、及調配來產生。
特定而言，蛋白質分子（各CD33及Vδ2臂）可藉由共轉染編碼表現質體中之每一者而在CHO細胞系中共同產生，並且可使用涉及ProA捕獲，接著CH1親和力捕獲之兩步驟過程進行純化。最初，抗體可經由來自GE Healthcare之Mab Select SuRe Protein A管柱進行純化。管柱可用PBS (pH 7.2)準備好，然後以2 mL/min之流速裝載發酵上清液。裝載後，用4倍管柱體積之PBS清洗管柱，然後使用pH 3.5之30 mM乙酸鈉進行洗提。可合併藉由在280 nm處之吸光度檢測到的含有蛋白質峰之流份，並使用3 M乙酸鈉(pH 9.0)之1%溶液將它們的pH中和至5.0。
本文所揭示之序列之變體較佳包含所揭示序列之保守修飾。「保守性修飾(conservative modification)」係指不會顯著影響或改變含有胺基酸修飾之抗體之結合特性的胺基酸修飾。保守性修飾包括胺基酸取代、添加、及缺失。保守胺基酸取代為胺基酸被具有相似側鏈之胺基酸殘基置換的取代。明確定義了具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族，並且包括具有以下側鏈之胺基酸：酸性側鏈（例如，天冬胺酸、麩胺酸）、鹼性側鏈（例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸）、非極性側鏈（例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）、不帶電荷的極性側鏈（例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、色胺酸）、芳族側鏈（例如，苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸、酪胺酸）、脂族側鏈（例如，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸）、醯胺（例如，天冬醯胺、麩醯胺）、β-分支側鏈（例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）、及含硫側鏈（半胱胺酸、甲硫胺酸）。此外，多肽中之任何天然殘基亦可用丙胺酸取代，如先前丙胺酸掃描誘變中所描述（MacLennan et al., (1988) Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67；Sasaki et al., (1988) Adv Biophys 35:1-24）。可藉由已知方法，例如藉由PCR誘變（美國專利案第4,683,195號）進行本揭露之抗體的胺基酸取代。替代地，可產生變體庫，例如使用隨機(NNK)或非隨機密碼子（例如DVK密碼子），其編碼11種胺基酸（Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp）。所得變體可使用本文所述之檢定來測試其特性。 表12.駱馬產生的Vδ2抗體之CDR區之清單
Vδ2抗體名稱：LAVA177 CDR1 (SEQ ID NO:) CDR1 (SEQ ID NO:) CDR1 (SEQ ID NO:)
重鏈(AbM) GRPFSNYGMG (77) GISWSGGSTD (78) VFSGAETAYYPSDDYDY (79)
重鏈(KABAT) NYGMG (80) GISWSGGSTDYADSVKG (81) VFSGAETAYYPSDDYDY (79)
重鏈(CHOTHIA) GRPFSNY (82) SWSGGS (83) VFSGAETAYYPSDDYDY (79)
重鏈(IMGT) GRPFSNYG (84) ISWSGGST (85) AAVFSGAETAYYPSDDYDY (86)
表13.駱馬產生的Vδ2抗體之重鏈可變區
Vδ2抗體名稱 可變區之胺基酸序列
LAVA177 VHH： EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQAPGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:87)
在此等構築體中，CD33結合物位於孔Fc上，而Vδ2結合物位於鈕Fc上。為達成這一點，CD33 VH及人類CH1恆定區與Fc上的具有若干種突變之鉸鏈合併—L234A/L235A/D265S_M252Y/S254T/T256E_T366S/L368A/Y407V_H435R/Y436F。此等突變被刻意引入兩條重鏈之Fc部分中，以減少Fc受體結合。另外，YTE突變(M252Y/S254T/T256E)被併入兩條重鏈中，以延長雙特異性抗體的半衰期。
在CD33 VHH結合物之情況下，VHH與Fc上的具有若干種突變之鉸鏈合併—L234A/L235A/D265S_M252Y/S254T/T256E_T366S/L368A/Y407V_H435R/Y436F。
Vδ2結合物與鉸鏈及鈕Fc融合，併入以下突變：C220S_L234A/L235A/D265S_M252Y/S254T/T256E_T366W。
將RF突變引入重鏈之Fc區上以幫助純化。
此等分子係藉由共轉染編碼表現質體而在CHO細胞系中產生，並且使用涉及ProA捕獲，接著CH1親和力捕獲之兩步驟程序進行純化。最初，抗體經由來自GE Healthcare之Mab Select SuRe Protein A管柱進行純化。將管柱用PBS (pH 7.2)準備好，然後以2 mL/min之流速裝載發酵上清液。裝載後，用4倍管柱體積之PBS清洗管柱，然後使用pH 3.5之30 mM乙酸鈉進行洗提。合併在280 nm處之吸光度檢測到的含有蛋白質峰之流份，並使用3 M乙酸鈉(pH 9.0)之1%溶液將它們的pH中和至5.0。隨後，在抗CD33臂係Fab之情況下，經由CH1捕獲對抗體進行進一步純化，並使用組胺酸緩衝液進行洗提。
表14呈現了例示性CD33 X Vδ2雙特異性抗體之重鏈及/或輕鏈。 表14：CD33 X Vδ2雙特異性抗體
雙特異性ID： 胺基酸序列
GD33B273 重鏈1 LAVA177（Vδ2臂） (SEQ ID NO: 67) EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQAPGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
重鏈2 JL45（CD33臂） (SEQ ID NO: 68) QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGSIFSIFDMGWYRRPPGAQRELVARITNGGITNYLDSVKGRFSISRDNAKNTVYLQMNSLNAEDTAVYYCYADIAANIGSNILYDDYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
GD33B112 重鏈1 LAVA177（Vδ2臂） (SEQ ID NO: 67) EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQAPGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
重鏈2 C33SB1SC1494 (SEQ ID NO: 70) EVQLVESGGDVVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYTMHWVRQAPGKGLEWVSLVSWSGGSAYYVDSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLKSEDTALYYCAKESAYNAYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
輕鏈2 C33SB1SC1494 (SEQ ID NO: 71) DIVMTQSPDSLAVSLGERATIYCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKAGQPPELLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVALYYCHQFYITPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
GD33B116 重鏈1 LAVA177（Vδ2臂）(SEQ ID NO: 67) EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQAPGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
重鏈2 C33F1318 (SEQ ID NO: 72) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWMANIKRDGSEKYYVDAVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNSGTWEFDQWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
輕鏈2 C33F1318 (SEQ ID NO: 73) NFMLTQPHSVSESPGKTVIISCTRSSGSIASNDVQWYQQRPGSSPTIVIYEDKQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDNNNQVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
GD33B139 重鏈1（Vδ2臂）(SEQ ID NO: 74) EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQAPGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
重鏈2 AB266_1_CD33_B12_P09 (SEQ ID NO: 75) EVQVVESGGGLVQGGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYHQAPGKQRELVARITGGGATDYVDSVKGRFTISLDSAKSTVYLQMNSLKPEDTAVYHCYADLVTRVGSDLLYDDYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
表15.以下CD33抗體之全鏈多核苷酸序列： GD33B273 GD33B112重鏈及輕鏈 GD33B116重鏈及輕鏈 GD33B139
GD33B273 –重鏈1 (PBD203084) (SEQ ID NO: 101) GAAGTTCAGCTGGTTGAAAGTGGTGGTGGCCTTGTGCAAGCCGGTGGCTCATTACGCTTGTCATGTGCAGCCTCTGGAAGACCTTTCAGCAATTATGGGATGGGGTGGTTTAGACAAGCACCCGGAAAGAAACGCGAGTTTGTTGCTGGCATTTCATGGAGTGGCGGAAGTACAGATTATGCAGATTCTGTTAAAGGACGCTTTACAATTAGTCGGGACAACGCAAAGAATACCGTGTATCTCCAGATGAATAGCCTTAAGCCAGAAGATACAGCCGTTTATTATTGTGCCGCTGTTTTCTCTGGTGCTGAAACTGCATACTATCCATCAGACGACTACGATTATTGGGGTCAAGGAACTCAAGTGACAGTTTCTAGTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCTCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
GD33B273 –重鏈2 (PBD203084) (SEQ ID NO: 102) CAAGTGCAACTTGTGGAAAGTGGTGGCGGACTTGTGCAAGCTGGTGGCTCATTGAGGCTGTCTTGTGAAGCATCTGGCTCAATCTTCAGCATCTTTGATATGGGTTGGTATAGAAGACCTCCCGGGGCTCAGAGAGAACTGGTGGCTAGAATCACAAATGGTGGGATTACCAATTACCTCGATTCAGTTAAGGGAAGGTTCTCTATTTCCAGAGACAATGCCAAGAATACTGTGTACTTGCAAATGAACAGCTTGAATGCCGAAGATACAGCCGTGTACTATTGTTACGCAGATATTGCAGCAAACATTGGCTCAAACATTCTGTACGATGACTATTGGGGTCAAGGAACACAAGTTACAGTCAGTTCTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTCCTGCGCCGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGGTTCACGCAGAAGTCTCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
GD33B112 –重鏈1 (PBD142624) (SEQ ID NO: 103) GAAGTGCAATTAGTGGAAAGTGGTGGTGGTCTGGTGCAGGCTGGCGGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCTGCCTCTGGCCGGCCATTTTCCAACTACGGCATGGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCTGGCAAGAAAAGAGAGTTCGTGGCCGGCATCTCCTGGTCCGGCGGCTCTACAGATTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTCGGGATAATGCCAAGAACACCGTCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAAGCCTGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCGCCGTGTTCAGCGGAGCTGAAACCGCCTACTATCCTTCCGACGACTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCAAGTGACCGTGTCCTCTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCTCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
GD33B112 –重鏈2 (PBD167215) (SEQ ID NO: 104) GAAGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGGGACGTAGTGCAACCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCGACGACTACACCATGCACTGGGTGAGACAAGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCCTGGTGAGCTGGAGCGGCGGCAGCGCCTACTACGTGGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGACAACAGCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAAGAGCGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCGCCAAGGAGAGCGCCTACAACGCCTACTTCGACTACTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTCCTGCGCCGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGGTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
GD33B112 –輕鏈2 (PBD167214) (SEQ ID NO: 105) GACATCGTGATGACACAGAGCCCTGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGAGCCACCATCTACTGCAAGAGCTCTCAGAGCGTGCTGTACAGCAGCAACAACAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGGCCGGACAGCCTCCTGAGCTGCTGATCTACTGGGCTAGCACAAGAGAGAGCGGCGTGCCTGACAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAAGCCGAGGACGTGGCCCTGTACTACTGCCATCAGTTCTACATCACCCCTTACACCTTCGGCCAAGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
GD33B116 -重鏈1 (PBD142624) (SEQ ID NO: 106) GAAGTGCAATTAGTGGAAAGTGGTGGTGGTCTGGTGCAGGCTGGCGGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCTGCCTCTGGCCGGCCATTTTCCAACTACGGCATGGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCTGGCAAGAAAAGAGAGTTCGTGGCCGGCATCTCCTGGTCCGGCGGCTCTACAGATTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTCGGGATAATGCCAAGAACACCGTCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAAGCCTGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCGCCGTGTTCAGCGGAGCTGAAACCGCCTACTATCCTTCCGACGACTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCAAGTGACCGTGTCCTCTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCTCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
GD33B116 -重鏈2 (PBD156894) (SEQ ID NO: 107) GAGGTCCAACTTGTGGAGTCAGGCGGCGGCCTCGTGCAACCAGGGGGTAGTTTGCGCCTGAGTTGCGCTGCCAGCGGGTTTACTTTCTCACGATATTGGATGAGTTGGGTTCGACAGGCACCTGGGAAGGGACTCGAGTGGATGGCTAATATCAAGAGGGATGGATCTGAAAAATACTATGTCGATGCCGTCAGGGGTCGATTTACCATTTCTCGTGACAATGCTAAAAACTCCCTTTACCTGCAAATGAACAGTTTGAGAGCTGAAGATACAGCAGTCTATTATTGTGCTCGCAATAGCGGCACTTGGGAATTTGACCAATGGGGACAAGGTACACTTGTAACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTCCTGCGCCGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGGTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
GD33B116 –輕鏈2 (PBD156378) (SEQ ID NO: 108) AATTTTATGCTTACACAGCCCCATTCTGTTTCCGAAAGCCCAGGCAAGACCGTTATCATCTCTTGCACCCGATCAAGCGGGTCTATAGCTTCCAACGACGTACAATGGTACCAACAGAGGCCAGGCAGCAGTCCCACCATTGTCATTTATGAGGATAAACAGCGTCCATCTGGAGTACCCGACCGTTTTAGTGGATCTATTGATTCCAGCTCAAACTCCGCATCTCTGACTATAAGTGGGCTGAAGACTGAGGATGAAGCCGACTACTATTGTCAATCATACGACAACAACAATCAGGTATTTGGTGGCGGCACCAAGCTCACCGTGCTTGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
GD33B139 –重鏈1 (PBD171082) (SEQ ID NO: 109) GAAGTGCAATTAGTGGAAAGTGGTGGTGGTCTGGTGCAGGCTGGCGGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCTGCCTCTGGCCGGCCATTTTCCAACTACGGCATGGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCTGGCAAGAAAAGAGAGTTCGTGGCCGGCATCTCCTGGTCCGGCGGCTCTACAGATTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTCGGGATAATGCCAAGAACACCGTCTACCTGCAGATGAACTCCCTGAAGCCTGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCGCCGTGTTCAGCGGAGCTGAAACCGCCTACTATCCTTCCGACGACTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCAAGTGACCGTGTCCTCTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGGTTCACGCAGAAGTCTCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
GD33B139 –重鏈2 (PBD171087) (SEQ ID NO: 110) GAAGTGCAAGTGGTGGAAAGTGGTGGTGGTCTCGTGCAGGGCGGCGGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCTGCTTCTGGCTCTATCTTCTCCATCAACGCTATGGGCTGGTATCACCAGGCTCCTGGCAAGCAGCGGGAACTGGTGGCCCGGATCACCGGCGGAGGCGCTACCGACTACGTGGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTCTGGATTCTGCCAAGTCCACAGTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAAACCCGAGGACACCGCCGTGTACCACTGCTACGCCGATCTGGTCACCAGAGTGGGCTCCGACCTGCTGTACGACGACTACTGGGGCCAAGGCACCCAGGTGACCGTGTCCAGCGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGTCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTCCTGCGCCGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
合成並測試了另一種分子。GD33B134係與GD33B273同一，不同之處在於H435R及Y436F取代（RF取代）係位於重鏈1上而非重鏈2上。 表16.
雙特異性ID： 胺基酸序列
GD33B134 重鏈1 LAVA177（Vδ2臂） (SEQ ID NO: 91) EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQAPGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
重鏈2 JL45（CD33臂） (SEQ ID NO: 92) QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEASGSIFSIFDMGWYRRPPGAQRELVARITNGGITNYLDSVKGRFSISRDNAKNTVYLQMNSLNAEDTAVYYCYADIAANIGSNILYDDYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
表17.缺乏CD33結合臂並用於與本文所揭示之雙特異性CD33xVδ2抗體進行比較之NullxVδ2抗體具有以下序列：
雙特異性ID： 胺基酸序列
GD33B73 NullxVδ2 重鏈1 (SEQ ID NO: 95) QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
輕鏈1 (SEQ ID NO: 96) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNPESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQIIEDPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重鏈2 LAVA177（Vδ2臂） (SEQ ID NO: 67) EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQAPGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
實例4.靶向CD33 x Vδ2之雙特異性抗體展現出針對Vγ9Vδ2細胞之結合親和力。
採用以下材料及方法：
為了評估Vδ2結合，將Vγ9Vδ2 T細胞與不同濃度（範圍為300 nM至0.00508 nM）之雙特異性抗體GD33B273或與缺乏CD33結合臂NullxVδ2的變體（又稱GD33B73）一起在37℃下孵育60分鐘。藉由與MonoRab™抗兔駱駝抗VHH AF647二級檢測抗體(GenScript, A02019-200)一起在4℃下孵育30分鐘來達成檢測結合的Vδ2抗體。使用FACS Lyric (BD)測量樣本，並採用FlowJo軟體(FlowJo)進行資料分析。
結果揭示CD33 x Vδ2雙特異性抗體GD33B273結合至Vδ2陽性細胞，例如Vγ9Vδ2 T細胞（參見圖1）。nullxVδ2抗體GD33B73亦展現出與Vγ9Vδ2 T細胞結合。 實例5.評定與可溶性CD33之結合
進行實驗以證明CD33 x Vδ2雙特異性抗體與膜結合之CD33 (mCD33)之結合特異性。
材料及方法：將來自患者（例如，AML患者）的含有可溶性CD33 (sCD33)之血清樣本與指定濃度之測試CD33 X Vδ2雙特異性抗體（測試分子）混合。藉由使用塗佈有抗分子抗體之磁珠捕獲與測試分子結合之可溶性CD33來判定測試分子與可溶性CD33之結合。該程序有效地自溶液中移除了形成的複合物。隨後，使用LC-MS（液相層析-質譜法）對血清上清液進行分析，以識別血清樣本中之可溶性CD33。LC-MS檢定專門用以量化添加特定抗體後AML患者血清中未結合的sCD33之數量。在測試分子處理之樣本及未用測試分子處理之樣本（0 nM樣本）中檢測到的可溶性CD33之可比較水平指示測試分子與血清中的可溶性CD33之間缺乏結合。使用抗體JL-5（抗CD33 Ab，其不係mCD33特異性的；WO2023037333以引用方式整體併入本文中）作為陽性對照以確認與血清中可溶性CD33之結合。JL5序列揭示於表18中。 表18：JL5抗體序列
JL5 VH (C33B1517) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSLKSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNGAALFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 93)
JL5 VL (C33B1517) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRVSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGPGTKVTVL (SEQ ID NO: 94)
結果：圖2A至圖2D顯示了各種測試的CD33xVδ2雙特異性抗體與sCD33之有限結合，證明了此等抗體特異性結合至mCD33。相反，參考抗體JL5係非特異性的，並且顯示出與sCD33之結合呈劑量依賴性。 實例6：CD33 x Vδ2抗體可介導針對表現CD33之細胞的細胞毒性
使用以下材料及方法進行細胞毒性檢定：THP1目標細胞（人類白血病單核細胞系，可購自SIGMA ALDRICH或ATCC）係用CellTrace CFSE增殖套組(Thermo Scientific, C34554)標記，然後在存在以10:1 (E:T)比包含200,000個效應細胞及20,000個目標細胞之泛T細胞(E)的情況下與雙特異性CD33xVδ2抗體或陰性對照抗體（nullxVδ2，又稱GD33B73）一起在37℃下孵育。對GD33B112、GD33B116、GD33B134、GD33B273、以及Null x Vδ2陰性對照(GD33B73)測試了自300 nM開始並包括12個4倍稀釋之抗體濃度系列。培養72小時後，使用eBioscience Fixable Viability染料eFluor 780 (Thermo Scientific, 65-0865)對死細胞進行染色。利用流式細胞術進行樣本分析。癌細胞殺滅之判定係基於活癌細胞相對於未處理孔之百分比的計算。使用Prism軟體(GraphPad)進行繪圖及分析。
細胞毒性檢定之結果：進行THP1細胞殺滅之測量。使用陰性對照抗體未檢測到可觀察到的殺滅作用。然而，雙特異性CD33xVδ2抗體展現出誘導THP-1腫瘤細胞之殺滅的能力（圖3及圖6）。 實例7：經由表面電漿共振分析對雙特異性CD33 X Vδ2抗體之評估
利用Biacore 8k儀器(Cytiva, cytivalifesciences.com)藉由將測試抗體捕獲至具有山羊抗Fc之CM4感測器SPR晶片上來進行SPR結合實驗。CD33抗原在單循環動力學模式下以100 nM、33 nM、11 nM、及3.7 nM流過。利用的運行緩衝液係HBSP+0.05%BSA+3 mM EDTA。所有儀器維護及液體供應管線灌注均係根據製造商操作說明進行。 表19. SPR結合結果：
抗體(CD33 x δ2) 親和力K D(M)
GD33B273 1.75 x 10 -8
GD33B112 9.37 x 10 -10
GD33B116 2.76 x 10 -10
GD33B139 2.24 x 10 -9
實例8：經由螢光染色及流式細胞術分析對雙特異性CD33 X Vδ2抗體之CD33細胞結合特異性之表徵
CD33細胞結合之材料及方法：
對於CD33細胞結合實驗，利用96孔板以及來自Sartorius.com之Intellicyt iQue流式細胞儀。培養、收集細胞，並在補充有二級抗體（來自Jackson Immuno Research (jacksonimmuno.com)之Alexa-Fluor 647山羊抗人類IgG或來自Genscript (Genscript.com)之Alexa-Fluor 647兔抗駱駝）之染色緩衝液（BD目錄號554657）中染色以用於檢測抗體測試分子。為了能夠對活細胞進行閘控，使用近IR活/死染色劑（Thermofisher目錄號L10119）對細胞進行預染色。將測試分子與細胞在37℃下一起孵育1小時，接著經由離心洗滌細胞，然後懸浮於染色緩衝液中。隨後，引入檢測二級抗體，將樣本孵育30分鐘，洗滌，再次懸浮，並且最後在iQue儀器上分析樣本以量化螢光染色。
CD33細胞結合分析之結果。GD33B273、GD33B112、GD33B116、及GD33B139與CD33陽性THP-1癌細胞以及與CD33陰性THP-1 CD33剔除細胞系之結合詳述於圖4A至圖4D中。所有分子均展現出與CD33陽性THP-1 WT細胞之特異性結合，而並不與CD33剔除細胞結合。圖4E描繪了GD33B273與特異性表現CD33之IgC2域的同基因型THP-1_C2細胞系之細胞結合。 實例9：在存在sCD33之情況下CD33 X Vδ2雙特異性抗體之功效
為了進一步減輕sCD33對雙特異性抗體功效之潛在影響，利用人類重組CD33 (rCD33; SEQ ID NO: 9) ECD作為sCD33之替代物。使用T細胞細胞毒性檢定，其中THP-1細胞及泛T細胞與增加量之rCD33蛋白一起孵育，之後添加一定劑量範圍之CD33 X Vδ2雙特異性抗體（參見例如，實例3）。在不存在rCD33之情況下，平均EC50細胞細胞毒性值係0.002 nM（n=5個T細胞供體之平均值）。5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、或100 ng/mL rCD33蛋白之存在各別導致可比較的平均EC50值各別為0.001 nM、0.002 nM、0.001 nM、0.001 nM、及0.001 nM（圖5A及圖5C）。類似地，rCD33之添加並不影響Vδ2 T細胞之特異性活化（圖5B及圖5D）。總之，在T細胞細胞毒性檢定中，添加生理濃度(~13.04 ng/mL)或高濃度之rCD33 ECD對雙特異性抗體之功效或T細胞活化均無任何影響。 實例10：CD33 X Vδ2雙特異性抗體之目標上腫瘤外評定
雙特異性CD33 X Vδ2抗體（參見例如，實例3）係在使用MOLM-13共培養之PBMC細胞毒性檢定中進一步評定，以評估癌細胞相對於健康單核球及NK細胞之細胞毒性。雙特異性GD33B134及雙特異性GD33B273均觀察到類似的優先癌細胞細胞毒性，具有可比較的平均細胞毒性EC 50值各別為0.004 nM（95% CI = 0.003 nM至0.02 nM）及0.008 nM（95% CI = 0.0004 nM至0.02 nM）（圖7A）。兩種抗體均未觀察到對健康單核球及NK細胞之顯著效應（圖7B及圖7C）。雖然未觀察到總體T細胞活化（圖7D），但用雙特異性GD33B134及雙特異性GD33B273檢測到Vδ2 T細胞之類似活化（圖7E）。 實例11：CD33 X Vδ2雙特異性抗體介導CD33+癌細胞之選擇性細胞毒性
圖8A、圖8B、圖8C、圖8D顯示了當與缺乏CD33臂之抗體（NullxVδ2，又稱GD33B73）相比，雙特異性CD33xδ2抗體GD33B273如何介導CD33+癌細胞（MOLM-13及THP-1）之選擇性細胞毒性及Vδ2 T細胞之選擇性活化。使用GD33B273及NullxVδ2抗體以及目標細胞系對來自健康供體之T細胞進行T細胞細胞毒性及活化檢定進行評估。使用MOLM-13及THP-1作為目標癌細胞，在72小時時在基於流式細胞術之檢定中判定了GD33B273之癌細胞細胞毒性（圖8A及圖8C）。該檢定係以0.5:1之相對E:T比進行。藉由評估Vδ2 T細胞上CD25之表現來評定T細胞活化（圖8B及圖8D）並在72小時後測量。
圖8E及圖8F顯示了當與缺乏CD33臂之抗體（NullxVδ2，又稱GD33B73）相比，雙特異性CD33xδ2抗體GD33B273如何介導表現CD33 IgC2域之THP-1_C2細胞的選擇性細胞毒性（圖8E）及Vδ2 T細胞之選擇性活化（圖8F）。圖8G及圖8H顯示了當與缺乏CD33臂之抗體（NullxVδ2，又稱GD33B73）相比，雙特異性CD33xδ2抗體GD33B273如何不介導OCI-Ly10 / CD33陰性細胞（即，不表現CD33）之選擇性細胞毒性（圖8G），及不介導Vδ2 T細胞之選擇性活化或顯示最小選擇性活化（圖8H）。OCI-Ly10細胞係人類衍生之細胞系並用作目標癌細胞。 實例12：AML BM母細胞模型中CD33 X Vδ2抗體之功效
使用GD33B273及AML患者衍生之骨髓(BM)細胞進行T細胞細胞毒性檢定，測試來自健康供體之T細胞，在2:1之相對E:T比下進行。24小時評定CD33+母細胞之細胞毒性。DN，供體。觀察到CD33xδ2雙特異性抗體GD33B273誘導來自所有測試供體之AML BM細胞的有效細胞毒性（圖10）。 實例13：雙特異性CD33 X Vδ2抗體對造血細胞之毒性的評估
自健康供體PBMC中單離出初始Vδ2+ T細胞，並且在CFU檢定中以1:1相對E:T比用作效應細胞，並以CD34+ HSPC細胞或THP-1細胞作為目標細胞。HSPC：造血幹細胞及前驅細胞；CD，分化簇；CFU，菌落形成單位；E:T，效應物與目標；PBMC，周邊血液單核細胞。GD33B273顯示了低造血毒性風險，同時顯示了以劑量反應方式對癌細胞THP-1之細胞毒性。（圖11）。CD34+ HSPC係來自健康供體之幹細胞，並且存活的強群落（淺灰色條）顯示抗體不會影響它們。相反，THP-1癌細胞群落（黑色條）以與抗體濃度之劑量依賴性關係降低存活率。 實例14：CD33 X Vδ2抗體在MOLM-13預防模型之功效
評估了預防性MOLM-13混合腫瘤模型中之CD33 X Vδ2雙特異性抗體GD33B134（參見例如，實例3）之抗腫瘤效應，該模型以擴增的泛T細胞或富集的Vδ2 T細胞作為T細胞人源化小鼠之效應細胞。雌性NSG（亦即，非肥胖糖尿病性[NOD]嚴重複合型免疫缺陷[scid] γ或NOD.Cg Prkdc scidIl2rg tm1Wjl/SzJ）小鼠被用來為重構人類CD3+ T細胞區室提供適合的宿主。
在第0天，將1×10 6個MOLM-13 AML細胞及5×10 6個擴增的泛T細胞或2.5×10 6個富集的Vδ2 T細胞於Matrigel中的混合物皮下(SC)接種至小鼠。在雙特異性抗體給藥前至少30分鐘，對T細胞人源化的小鼠進行Fc阻斷抗體（一種商業抗體，用於阻斷免疫受體細胞中之Fc受體）及腹膜內(IP)靜脈內注射免疫球蛋白(IVIg)，以糾正NSG小鼠之低Ig環境。在用擴增的泛T細胞作為效應細胞之群組中，NSG小鼠被隨機分為8隻動物的組，並在細胞植入後第1天起始使用雙特異性抗體GD33B134進行IP治療，劑量為1 mg/kg、3 mg/kg、及10 mg/kg，每週兩次總共11個劑量。用雙特異性抗體治療並不影響動物之體重。然而，在與泛T細胞混合之MOLM-13腫瘤中觀察到一些同種異體反應，從而延遲了腫瘤生長。在腫瘤植入後第35天（當所有組中三分之二的動物繼續接受研究時），計算SC MOLM-13異種移植物之腫瘤生長抑制(tumor growth inhibition, TGI)百分比。與媒劑處理之對照相比，在用1 mg/kg、3 mg/kg、及10 mg/kg雙特異性抗體處理之腫瘤中觀察到統計學上顯著的抗腫瘤效應，各別產生99.2%、99.3%、及91.2% TGI（圖12）。 實例15：CD33 X Vδ2抗體在MOLM-13迴歸模型中之功效
CD33 X Vδ2雙特異性抗體GD33B134之抗腫瘤功效（參見例如，實例3）在播散性MOLM-13迴歸模型中進行評估，其中富集的Vδ2 T細胞作為人源化小鼠（雌性NOG小鼠）之效應細胞。在第0天，向hIL-15 NOG小鼠靜脈內(IV)注射1×10 6個MOLM-13 AML細胞。第3天，IV注射9.4×10 6個富集的Vδ2 T細胞並且在24小時後，T細胞人源化小鼠在雙特異性抗體給藥前至少30分鐘給予Fc阻斷劑及IVIg。將小鼠隨機分為8隻動物的組，並在細胞植入後第4天起始用1 mg/kg、3 mg/kg、及10 mg/kg雙特異性抗體進行IP治療，每週兩次總共8個劑量。在第16天，第二次注射富集的Vδ2 T細胞(7.9×10 6)係IV投予監測小鼠之存活期及體重減輕。與媒劑治療(DPBS)之動物相比，在1 mg/kg、3 mg/kg、及10 mg/kg下觀察到雙特異性抗體GD33B134之壽命(ILS)在統計上顯著增加，各別產生117.9%、112.8%、及102.6% ILS（圖13A）。注射Vδ2 T細胞後，所有接受治療之動物均觀察到體重減輕（達至約23%）。然而，未觀察到其他臨床徵象並且體重減輕在Vδ2 T細胞投予後幾天內恢復（圖13B）。hIL-15，人類介白素-15；NOG，非肥胖糖尿病性(NOD)/Shi-嚴重複合型免疫缺失症(scid) IL2rγ(null)；DPBS，杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水。 實例16：CD33 X Vδ2抗體介導播散性MOLM-13體內模型之抗腫瘤活性
圖14A及圖14B呈現了MOLM-13迴歸小鼠模型中雙特異性CD33xδ2抗體GD33B273之功效。在此測試中，MOLM-13癌細胞係用螢光素酶標記。此種經標記之MOLM-13癌細胞在第0天被植入hIL-15 NOG小鼠體內。在第3天及第16天向相同的小鼠注射T細胞，並在第4、7、10、14、17、21、及24天以所指示劑量（0 mg/Kg、0.3 mg/Kg、及3 mg/Kg）給藥抗體（給藥期係由X軸下方的實線條指示，即對於圖14A及圖14B而言自第4天至第24天）。結果係以平均腫瘤輻射率（圖14A）及存活百分比（圖14B）之形式呈現。僅展示組中三分之二的動物仍存活期間的資料。圖14A顯示了與用0.3 mg/Kg及3 mg/Kg抗體治療之小鼠相比時，未治療的小鼠(0 mg/Kg)之平均輻射率增加。圖14A亦顯示了與未治療的小鼠(0 mg/Kg)相比時，用0.3 mg/Kg及3 mg/Kg之抗體治療的小鼠在第17天之腫瘤生長抑制各別為61%及54.9%。圖14B顯示了與未處理的小鼠(0 mg/Kg)相比，用0.3 mg/Kg及3 mg/Kg之抗體治療的小鼠之存活率增加。ILS，延長的壽命；TGI，腫瘤生長抑制。
無
〔圖1〕顯示了CD33xVδ2雙特異性抗體(GD33B273)與Vγ9Vδ2 T細胞之結合。自健康供體單離並擴增的Vγ9Vδ2 T細胞係與一定劑量範圍之CD33xVδ2雙特異性抗體(GD33B273)或nullxVδ2雙特異性抗體(GD33B73)陰性對照一起孵育。NullxVδ2雙特異性抗體(GD33B73)不具有CD33結合臂。藉由流式細胞術檢測結合。顯示來自5個不同的T細胞供體之資料。MFI：平均螢光強度。 〔圖2A〕、〔圖2B〕、〔圖2C〕、〔圖2D〕、及〔圖2E〕：開發了一種LC-MS檢定，以測量AML患者之血清(AML1-AML30)中摻入所指示抗體後遊離可溶性CD33 (sCD33)之量。CD33xVδ2雙特異性抗體GD33B112、GD33B116、GD33B139、及GD33B134顯示與sCD33之最小結合。作為參考，亦使用來自不同AML患者之血清(Indiv 517-Indiv 532)顯示了JL5與sCD33之結合結果(圖2E)。 〔圖3〕顯示了實驗結果，證明所測試之CD33xVδ2雙特異性抗體（GD33B112、GD33B116、及GD33B134）體外誘導針對THP1癌細胞之T細胞介導的細胞毒性。THP1細胞係源自急性單核球性白血病患者之人類單核球細胞系。在實驗中，將泛T細胞（效應物）與CFSE標記之THP1細胞（目標）在存在各種濃度之雙特異性抗體的情況下以10:1之絕對E:T比共培養持續72小時。在此處表示之細胞毒性值針對在不存在雙特異性抗體的情況下觀察到之基礎細胞毒性進行了糾正。CFSE係羧基螢光素琥珀醯亞胺酯，一種螢光染料。 〔圖4A〕、〔圖4B〕、〔圖4C〕、及〔圖4D〕描繪了CD33xVδ2雙特異性抗體GD33B273（圖4A）、GD33B112（圖4B）、GD33B116（圖4C）、及GD33B139（圖4D）與CD33陽性THP1癌細胞及與CD33陰性THP1 CD33剔除細胞系之細胞結合。圖4E描繪了CD33xVδ2雙特異性抗體GD33B273與特異性表現CD33之IgC2域之同基因型THP1_C2細胞系的細胞結合。CD33之IgC2域係CD33細胞表面受體蛋白之保守區。 〔圖5A〕、〔圖5B〕、〔圖5C〕、及〔圖5D〕呈現了在存在重組CD33 (rCD33)之情況下代表性雙特異性CD33xδ2抗體，GD33B134（圖5A及圖5B）及GD33B273（圖5C及圖5D）之功效。rCD33之存在不會影響GD33B134及GD33B273之細胞毒性及T細胞活化效應。將增加濃度之rCD33添加至細胞毒性檢定中，以泛T細胞作為效應細胞（n = 3個不同的健康供體），並且以THP1細胞作為目標細胞。72小時時藉由流式細胞術以10:1之絕對E:T比（相對E:T比~0.13-0.4:1，供體依賴性）評估細胞毒性及T細胞活化。將增加濃度之rCD33添加至T細胞活化檢定中。藉由判定Vδ2 T細胞上之CD25表現來評定T細胞活化。 〔圖6〕呈現了使用AML衍生之Vδ2+ T細胞之雙特異性抗體GD33B273之功效。Vδ2+ T細胞係自AML患者衍生之PBMC擴增，並以GD33B273及THP-1目標細胞（E:T比為1:1）進行T細胞細胞毒性檢定。24小時後評估了THP-1細胞之細胞毒性。 〔圖7A〕、〔圖7B〕、〔圖7C〕、〔圖7D〕、及〔圖7E〕呈現了代表性雙特異性CD33xδ2抗體GD33B134、GD33B273、及NullxVδ2抗體(GD33B73)之優先癌細胞細胞毒性，顯示針對MOLM-13 AML模型細胞之活性（圖7A）並針對單核球（圖7B）及NK免疫細胞（圖7C）無活性。在96小時時，在基於流式細胞術之檢定中，以MOLM-13作為目標癌細胞（圖7A）及自全血新鮮單離之健康PBMC作為效應細胞（n=7個不同的健康供體），比較了代表性雙特異性CD33xδ2抗體GD33B134與代表性CD33xδ2抗體GD33B273之間的優先癌細胞細胞毒性。顯示的絕對E:T比係20:1（相對E:T比為0.16-3.6:1，供體依賴性）。在存在癌細胞共培養物之情況下評估了對單核球（圖7B）及NK細胞（圖7C）之細胞毒性。亦藉由評估總CD3+ T細胞（圖7D）或Vδ2 T細胞（圖7E）上CD25之表現來評定T細胞活化。結果顯示，當與未活化的CD3+ T細胞相比，Vδ2+ T細胞之特異性活化。CD，分化簇，E:T，效應物與目標比；NK：自然殺手；PBMC，周邊血液單核細胞。 〔圖8A〕、〔圖8B〕、〔圖8C〕、〔圖8D〕顯示了當與缺乏CD33臂之抗體（NullxVδ2，又稱GD33B73）相比，雙特異性CD33xδ2抗體GD33B273如何介導CD33+癌細胞（MOLM-13及THP-1）之選擇性細胞毒性及Vδ2 T細胞之選擇性活化。使用GD33B273及NullxVδ2抗體以及目標細胞系對來自健康供體之T細胞進行T細胞細胞毒性及活化檢定進行評估。使用MOLM-13及THP-1作為目標癌細胞，在72小時時在基於流式細胞術之檢定中判定了GD33B273之癌細胞細胞毒性（圖8A及圖8C）。該檢定係以0.5:1之相對E:T比進行。藉由評估Vδ2 T細胞上CD25之表現來評定T細胞活化（圖8B及圖8D）並在72小時後測量。圖8E及圖8F顯示了當與缺乏CD33臂之抗體（NullxVδ2，又稱GD33B73）相比，雙特異性CD33xδ2抗體GD33B273如何介導表現CD33 IgC2域之THP-1_C2細胞的選擇性細胞毒性（圖8E）及Vδ2 T細胞之選擇性活化（圖8F）。圖8G及圖8H顯示了當與缺乏CD33臂之抗體（NullxVδ2，又稱GD33B73）相比，雙特異性CD33xδ2抗體GD33B273如何不介導OCI-Ly10 / CD33陰性細胞（即，不表現CD33）之選擇性細胞毒性（圖8G），及不介導Vδ2 T細胞之選擇性活化或顯示最小選擇性活化（圖8H）。OCI-Ly10細胞係人類衍生之細胞系並用作目標癌細胞。 〔圖9A〕及〔圖9B〕：雙特異性CD33xδ2抗體GD33B273未顯示出目標上腫瘤外毒性。在圖9A中，健康細胞（如單核球、B細胞、及NK細胞）在存在雙特異性CD33xδ2抗體GD33B273之情況下時，未顯示出抗體對此等健康細胞之細胞毒性有影響。在圖9B中，雙特異性CD33xδ2抗體GD33B273之存在導致不產生細胞介素或產生極少的細胞介素(IFN-γ, TNF-α, IL1-β)。在不存在癌細胞共培養物之情況下，使用GD33B273對來自健康供體之全血進行24或96小時之T細胞細胞毒性檢定。判定並顯示了單核球、B細胞、及NK細胞（圖9A）以及分泌的細胞介素IFN-γ、TNF-α、及IL1-β（圖9B）之細胞毒性百分比。 〔圖10〕顯示了雙特異性CD33xδ2抗體GD33B273如何誘導來自3名不同人類病患之AML骨髓(BM)母細胞之強效細胞毒性。使用GD33B273及AML患者衍生之BM細胞進行T細胞細胞毒性檢定，測試來自健康供體之T細胞，在2:1之相對E:T比下進行。24小時評定CD33+母細胞之細胞毒性。AML、急性骨髓性白血病、BM、骨髓、CD、分化簇、DN、供體、E:T、效應物與目標。 〔圖11〕顯示了雙特異性CD33xδ2抗體GD33B273如何呈現低造血毒性風險，同時顯示了以劑量反應方式對癌細胞THP-1之細胞毒性。CD34+ HSPC係來自健康供體之幹細胞，並且存活的強群落（淺灰色條）顯示抗體不會影響它們。相反，THP-1癌細胞群落（黑色條）以與抗體濃度之劑量依賴性關係降低存活率。自健康供體PBMC中單離出初始Vδ2+ T細胞，並且在CFU檢定中以1:1相對E:T比用作效應細胞，並以CD34+ HSPC細胞或THP-1細胞作為目標細胞。HSPC：造血幹細胞及前驅細胞；CD，分化簇；CFU，菌落形成單位；E:T，效應物與目標；PBMC，周邊血液單核細胞。 〔圖12〕呈現了用代表性雙特異性CD33xδ2抗體GD33B134處理對NSG小鼠中與泛T細胞混合之MOLM-13異種移植物之生長的效應。在不存在抗體之情況下（僅使用緩衝液DPBS），腫瘤之大小會增加，而在存在不同劑量（1 mg/Kg、3 mg/Kg、及10 mg/Kg）之抗體的情況下，腫瘤之大小會減少。T細胞人源化NSG小鼠SC注射與泛T細胞混合之MOLM-13腫瘤，並在第1、4、7、10、13、16、20、23、27、30、及35天IP給藥所指示劑量（給藥期係由X軸下方的實線條指示，即0至35天）。每週測量兩次腫瘤體積並且各組結果係以平均腫瘤體積± SEM呈現。僅顯示組中三分之二的動物仍存活時之資料。DPBS，杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco’s phosphate-buffered saline)；IP，腹膜內；NSG，非肥胖糖尿病性(NOD)嚴重複合型免疫缺失症(scid) γ；SC，皮下；SEM，平均值標準誤差。 〔圖13A〕及〔圖13B〕呈現了代表性雙特異性CD33xδ2抗體GD33B134在以富集的Vδ2 T細胞作為效應物之MOLM-13迴歸小鼠模型中之功效。hIL-15 NOG小鼠IV注射MOLM-13細胞，在第3天及第16天用富集的Vδ2 T細胞人源化(IV)，並且以指定劑量（1 mg/Kg、3 mg/Kg、及10 mg/Kg）在第4、7、10、14、17、21、24、及28天IP給藥DPBS或抗體（給藥期係由X軸下方的實線條指示，即對於圖13A及圖13B而言自第5天至第28天）。自第7天開始，每日觀察體重及疾病相關的臨床體徵，並且結果係以各組之（圖9A）存活百分比或（圖9B）平均體重變化± SEM表示。僅展示組中三分之二的動物仍存活期間的資料。hIL-15，人類介白素-15；IP，腹膜內；IV，靜脈內；NOG，非肥胖糖尿病性(NOD)/Shi-嚴重複合型免疫缺失症(scid) IL2rγ(null)；SEM，平均值標準誤差。 〔圖14A〕及〔圖14B〕呈現了MOLM-13迴歸小鼠模型中雙特異性CD33xδ2抗體GD33B273之功效。在此測試中，MOLM-13癌細胞係用螢光素酶標記。此種經標記之MOLM-13癌細胞在第0天被植入hIL-15 NOG小鼠體內。在第3天及第16天向相同的小鼠注射T細胞，並在第4、7、10、14、17、21、及24天以所指示劑量（0 mg/Kg、0.3 mg/Kg、及3 mg/Kg）給藥抗體（給藥期係由X軸下方的實線條指示，即對於圖14A及圖14B而言自第4天至第24天）。結果係以平均腫瘤輻射率（圖14A）及存活百分比（圖14B）之形式呈現。僅展示組中三分之二的動物仍存活期間的資料。圖14A顯示了與用0.3 mg/Kg及3 mg/Kg抗體治療之小鼠相比時，未治療的小鼠(0 mg/Kg)之平均輻射率增加。圖14A亦顯示了與未治療的小鼠(0 mg/Kg)相比時，用0.3 mg/Kg及3 mg/Kg之抗體治療的小鼠在第17天之腫瘤生長抑制各別為61%及54.9%。圖14B顯示了與未處理的小鼠(0 mg/Kg)相比，用0.3 mg/Kg及3 mg/Kg之抗體治療的小鼠之存活率增加。ILS，延長的壽命；TGI，腫瘤生長抑制。
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Claims (73)

  1. 一種能夠特異性結合至膜結合之人類CD33 (mCD33)之抗體或抗原結合片段，其包含： a. 各別包含SEQ ID NO: 46、47、及48之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； b. 各別包含SEQ ID NO: 49、50、及48之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； c. 各別包含SEQ ID NO: 51、52、及48之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； d. 各別包含SEQ ID NO: 53、54、及76之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；或 e.     各別包含SEQ ID NO: 53、54、及111之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3。
  2. 一種CD33/Vδ2多特異性抗體，其包含CD33抗體或其抗原結合片段及Vδ2抗體或其抗原結合片段， 其中該CD33抗體或其抗原結合片段特異性結合至mCD33，並且 其中該Vδ2抗體或其抗原結合片段特異性結合至人類Vγ9Vδ2 T細胞受體之Vδ2鏈。
  3. 如請求項2所述之CD33/Vδ2多特異性抗體，其中 該CD33/Vδ2多特異性抗體包含： (A)含有重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3之CD33抗體或其抗原結合片段，該等重鏈CDR包含下列胺基序列： a.     各別地SEQ ID NO: 46、47、及48； b.     各別地SEQ ID NO: 49、50、及48； c.     各別地SEQ ID NO: 51、52、及48； d.     各別地SEQ ID NO: 53、54、及76；或 e.     各別地SEQ ID NO: 53、54、及111； 以及含有重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3之Vδ2抗體或其抗原結合片段，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： f.     各別地SEQ ID NO: 77、78、及79； g.     各別地SEQ ID NO: 80、81、及79； h.     各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或 i.      各別地SEQ ID NO: 84、85、及86；及/或 (B)含有重鏈CDR1 (33CDR1)、重鏈CDR2 (33CDR2)、及重鏈CDR3 (33CDR3)之CD33抗體或其抗原結合片段，以及含有重鏈CDR1 (Vδ2CDR1)、重鏈CDR2 (Vδ2CDR2)、及重鏈CDR3 (Vδ2CDR3)之Vδ2抗體或其抗原結合片段，該等重鏈CDR包含： (a) 33CDR1 SEQ ID NO: 46、33CDR2 SEQ ID NO: 47、33CDR3 SEQ ID NO: 48、Vδ2CDR1 SEQ ID NO: 77、Vδ2CDR2 SEQ ID NO: 78、及Vδ2CDR3 SEQ ID NO: 79； (b) 33CDR1 SEQ ID NO: 49、33CDR2 SEQ ID NO: 50、33CDR3 SEQ ID NO: 48、Vδ2CDR1 SEQ ID NO: 80、Vδ2CDR2 SEQ ID NO: 81、及Vδ2CDR3 SEQ ID NO: 79； (c) 33CDR1 SEQ ID NO: 51、33CDR2 SEQ ID NO: 52、33CDR3 SEQ ID NO: 48、Vδ2CDR1 SEQ ID NO: 82、Vδ2CDR2 SEQ ID NO: 83、及Vδ2CDR3 SEQ ID NO: 79； (d) 33CDR1 SEQ ID NO: 53、33CDR2 SEQ ID NO: 54、33CDR3 SEQ ID NO: 76、Vδ2CDR1 SEQ ID NO: 84、Vδ2CDR2 SEQ ID NO: 85、及Vδ2CDR3 SEQ ID NO: 86； (e) 33CDR1 SEQ ID NO: 53、33CDR2 SEQ ID NO: 54、33CDR3 SEQ ID NO: 111、Vδ2CDR1 SEQ ID NO: 84、Vδ2CDR2 SEQ ID NO: 85、及Vδ2CDR3 SEQ ID NO: 86； (f) 33CDR1 SEQ ID NO: 55、33CDR2 SEQ ID NO: 56、33CDR3 SEQ ID NO: 57、Vδ2CDR1 SEQ ID NO: 77、Vδ2CDR2 SEQ ID NO: 78、及Vδ2CDR3 SEQ ID NO: 79； (g) 33CDR1 SEQ ID NO: 58、33CDR2 SEQ ID NO: 59、33CDR3 SEQ ID NO: 57、Vδ2CDR1 SEQ ID NO: 80、Vδ2CDR2 SEQ ID NO: 81、及Vδ2CDR3 SEQ ID NO: 79； (h) 33CDR1 SEQ ID NO: 60、33CDR2 SEQ ID NO: 61、33CDR3 SEQ ID NO: 57、Vδ2CDR1 SEQ ID NO: 82、Vδ2CDR2 SEQ ID NO: 83、及Vδ2CDR3 SEQ ID NO: 79；或 (i) 33CDR1 SEQ ID NO: 62、33CDR2 SEQ ID NO: 63、33CDR3 SEQ ID NO: 64、Vδ2CDR1 SEQ ID NO: 84、Vδ2CDR2 SEQ ID NO: 85、及Vδ2CDR3 SEQ ID NO: 86；及/或 (C)含有SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VHH及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH；及/或 (D)含有SEQ ID NO:67之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO:68之胺基酸序列的重鏈。
  4. 如請求項2所述之CD33/Vδ2多特異性抗體，其中該CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3，該等CDR包含下列胺基序列： a.     各別地SEQ ID NO: 12、13、14、15、16、及17； b.     各別地SEQ ID NO: 18、19、14、15、16、及17； c.     各別地SEQ ID NO: 20、21、14、15、16、及17；或 d.     各別地SEQ ID NO: 22、23、24、25、26、及17； 並且其中該Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： e.     各別地SEQ ID NO: 77、78、及79； f.     各別地SEQ ID NO: 80、81、及79； g.     各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或 h.     各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
  5. 如請求項2所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3，該等CDR包含下列胺基序列： a.     各別地SEQ ID NO: 27、28、29、30、31、及32； b.     各別地SEQ ID NO: 33、34、29、30、31、及32； c.     各別地SEQ ID NO: 35、36、29、30、31、及32；或 d.     各別地SEQ ID NO: 37、38、39、40、41、及32； 並且其中該Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： e.     各別地SEQ ID NO: 77、78、及79； f.     各別地SEQ ID NO: 80、81、及79； g.     各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或 h.     各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
  6. 如請求項2所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基序列： a.     各別地SEQ ID NO: 55、56、及57； b.     各別地SEQ ID NO: 58、59、及57； c.     各別地SEQ ID NO: 60、61、及57；或 d.     各別地SEQ ID NO: 62、63、及64； 並且其中該Vδ2抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該等重鏈CDR包含下列胺基酸序列： e.     各別地SEQ ID NO: 77、78、及79； f.     各別地SEQ ID NO: 80、81、及79； g.     各別地SEQ ID NO: 82、83、及79；或 h.     各別地SEQ ID NO: 84、85、及86。
  7. 如請求項2及4至6中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33抗體或其抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO: 42或44至少95%同一的胺基酸序列之重鏈可變區(VH)，及含有與SEQ ID NO:43或45至少95%同一的胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；並且該Vδ2抗體或其抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO: 87至少95%同一的胺基酸序列之僅重鏈可變區(VHH)。
  8. 如請求項2及4至7中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含： a.     含有SEQ ID NO:42之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列的VL；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH；或 b.     含有SEQ ID NO:44之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列的VL；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH。
  9. 如請求項2至8中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33抗體或其抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO: 65或66至少95%同一的胺基酸序列之VHH；且該Vδ2抗體或其抗原結合片段包含含有與SEQ ID NO: 87至少95%同一的胺基酸序列之VHH。
  10. 如請求項2至9中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含： a.     含有SEQ ID NO:65之胺基酸序列的VHH；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH；或 b.     含有SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VHH；以及含有SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VHH。
  11. 如請求項2至10中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含： a.     含有SEQ ID NO:67之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:70之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:71之胺基酸序列的輕鏈； b.     含有SEQ ID NO:67之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:72之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:73之胺基酸序列的輕鏈； c.     含有SEQ ID NO:67之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:68之胺基酸序列的重鏈； d.     含有SEQ ID NO:74之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:75之胺基酸序列的重鏈，或 e.     含有SEQ ID NO:91之胺基酸序列的重鏈；以及含有SEQ ID NO:92之胺基酸序列的重鏈。
  12. 如請求項2至11中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該多特異性抗體係雙特異性抗體。
  13. 如請求項2至12中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段包含免疫球蛋白(IgG) Fc域。
  14. 如請求項2至13中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該IgG Fc域係人類IgG1 Fc域。
  15. 如請求項2至14中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域包含選自根據EU編號系統之T366S、L368A、T366W、及Y407V的一或多個突變。
  16. 如請求項2至15中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含選自根據EU編號系統之L234A、L235A、及D265S的一或多個突變。
  17. 如請求項2至16中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含根據EU編號系統之突變H435R及/或Y436F。
  18. 如請求項2至17中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含根據EU編號系統之三重突變M252Y/S254T/T256E。
  19. 如請求項2至18中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段結合人類CD33之C2域。
  20. 如請求項2至19中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段並不顯著結合至sCD33。
  21. 如請求項2至20中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段係嵌合的。
  22. 如請求項2至21中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段係人類或人源化的。
  23. 一或多種合成多核苷酸，其編碼如請求項1所述之抗體或抗原結合片段，或如請求項2至22中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段。
  24. 一或多種載體，其包含如請求項23所述之一或多種合成多核苷酸。
  25. 一種宿主細胞，其包含如請求項24所述之一或多種載體或如請求項23之一或多種多核苷酸。
  26. 一種醫藥組成物，其包含如請求項2至22中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段、及醫藥上可接受之載劑。
  27. 一種治療有需要之對象之血液癌症的方法，其包含向該對象投予如請求項26所述之醫藥組成物。
  28. 如請求項27所述之方法，其中該血液癌症係急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生不良症候群(MDS)、急性淋巴球性白血病(ALL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)或母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤(BPDCN)。
  29. 如請求項2至22中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段，其用於治療血液癌症。
  30. 一種如請求項2至22中任一項所述之CD33/ Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段在製造用於治療血液癌症之藥劑中的用途。
  31. 一種產生如請求項2至22中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含在產生該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之條件下培養包含編碼該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之一或多種多核苷酸的細胞，及自該細胞或培養物中回收該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段。
  32. 一種產生包含如請求項2至22中任一項所述之CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物的方法，該方法包含將該CD33/Vδ2多特異性抗體或其抗原結合片段與醫藥上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組成物。
  33. 如請求項1所述之抗體或其抗原結合片段，其包含： a.     各別包含SEQ ID NO: 12、13、及14之胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDR1)、重鏈互補決定區2 (CDR2)、及重鏈互補決定區3 (CDR3)；及 各別包含SEQ ID NO: 15、16、及17之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDR1)、輕鏈互補決定區2 (CDR2)、及輕鏈互補決定區3 (CDR3)； b. 各別包含SEQ ID NO: 18、19、及14之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 15、16、及17之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3； c. 各別包含SEQ ID NO: 20、21、及14之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 15、16、及17之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3；或 d. 各別包含SEQ ID NO: 22、23、及24之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 25、26、及17之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3。
  34. 如請求項1所述之抗體或其抗原結合片段，其包含： a. 各別包含SEQ ID NO: 27、28、及29之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 30、31、及32之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3； b. 各別包含SEQ ID NO: 33、34、及29之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 30、31、及32之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3； c. 各別包含SEQ ID NO: 35、36、及29之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 30、31、及32之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3；或 d. 各別包含SEQ ID NO: 37、38、及39之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；及 各別包含SEQ ID NO: 40、41、及32之胺基酸序列之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3。
  35. 如請求項1、33、或34中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO: 42或44至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列之重鏈可變區(VH)。
  36. 如請求項1及33至35中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO: 42或44之VH。
  37. 如請求項1及33至36中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO: 43或45至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)。
  38. 如請求項1及33至387中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO: 43或45之VL。
  39. 如請求項1及33至38中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO: 42之VH及含有SEQ ID NO: 43之VL。
  40. 如請求項1及33至39中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO: 44之VH及含有SEQ ID NO: 45之VL。
  41. 如請求項1、2、及33至40中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含免疫球蛋白(IgG) Fc域。
  42. 如請求項1、2、及33至41中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該IgG Fc域係人類IgG1 Fc域。
  43. 如請求項1、2、及33至42中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域包含選自根據EU編號系統之T366S、L368A、T366W、及Y407V的一或多個突變。
  44. 如請求項1、2、及33至43中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含選自根據EU編號系統之L234A、L235A、及D265S的一或多個突變，較佳地所有三個。
  45. 如請求項1、2、及33至44中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含根據EU編號系統之突變H435R及/或Y436F。
  46. 如請求項1、2、及33至45中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含根據EU編號系統之三重突變M252Y/S254T/T256E。
  47. 如請求項1、2、及33至46中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係僅重鏈抗體。
  48. 如請求項1、2、及33至47中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中其抗原結合片段係單一重鏈可變區(VHH)。
  49. 如請求項47或請求項48所述之抗體或其抗原結合片段，其包含： a. 各別包含SEQ ID NO: 55、56、及57之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； b. 各別包含SEQ ID NO: 58、59、及57之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3； c. 各別包含SEQ ID NO: 60、61、及57之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3；或 d. 各別包含SEQ ID NO: 62、63、及64之胺基酸序列之重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3。
  50. 如請求項1、2、及47至49中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO: 65至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列之VHH。
  51. 如請求項1、2、及47至50中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO: 65之VHH。
  52. 如請求項1及47至51中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其包含含有與SEQ ID NO: 66至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列之VHH。
  53. 如請求項1及47至52中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO: 66之VHH。
  54. 如請求項1、2、及47至53中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含免疫球蛋白(IgG) Fc域。
  55. 如請求項1、2、及47至54中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該IgG Fc域係人類IgG1 Fc域。
  56. 如請求項1、2、及47至55中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域包含選自根據EU編號系統之T366S、L368A、T366W、及Y407V的一或多個突變。
  57. 如請求項1、2、及47至56中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含選自根據EU編號系統之L234A、L235A、及D265S的一或多個突變，較佳地所有三個。
  58. 如請求項1、2、及47至57中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含根據EU編號系統之突變H435R及/或Y436F。
  59. 如請求項1、2、及47至58中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該人類IgG1 Fc域進一步包含根據EU編號系統之三重突變M252Y/S254T/T256E。
  60. 如請求項1、2、及33至59中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段結合人類CD33之C2域。
  61. 如請求項1、2、及33至60中任一項所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段並不顯著結合至可溶性人類CD33 (sCD33)。
  62. 如請求項1、2、及33至61中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係嵌合的。
  63. 如請求項1、2、及33至61中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係人類或人源化的。
  64. 一或多種合成多核苷酸，其編碼如請求項1、2、及33至63中任一項所述之抗體或其抗原結合片段。
  65. 一或多種載體，其包含如請求項64所述之一或多種合成多核苷酸。
  66. 一種宿主細胞，其包含如請求項655之載體或如請求項64之多核苷酸。
  67. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1、2、及33至63中任一項所述之抗體或其抗原結合片段、及醫藥上可接受之載劑。
  68. 一種治療有需要之對象之血液癌症的方法，其包含向該對象投予如請求項67所述之醫藥組成物。
  69. 如請求項68所述之方法，其中該血液癌症係急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生不良症候群(MDS)、急性淋巴球性白血病(ALL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)或母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤(BPDCN)。
  70. 如請求項1、2、及33至63中任一項所述之CD33抗體或其抗原結合片段，其用於治療血液癌症。
  71. 一種如請求項1、2、及33至63中任一項所述之CD33抗體或其抗原結合片段在製造用於治療血液癌症之藥劑中的用途。
  72. 一種產生如請求項1、2、及33至63中任一項所述之抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含在產生該抗體或抗原結合片段之條件下培養包含編碼該抗體或其抗原結合片段之多核苷酸的細胞，及自該細胞或培養物中回收該抗體或其抗原結合片段。
  73. 一種產生包含如請求項1、2、及33至63中任一項所述之抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物的方法，該方法包含將該抗體或其抗原結合片段與醫藥上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組成物。
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