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WO2012133349A1 - アフィニティー分離マトリックス用タンパク質 - Google Patents

アフィニティー分離マトリックス用タンパク質 Download PDF

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WO2012133349A1
WO2012133349A1 PCT/JP2012/057824 JP2012057824W WO2012133349A1 WO 2012133349 A1 WO2012133349 A1 WO 2012133349A1 JP 2012057824 W JP2012057824 W JP 2012057824W WO 2012133349 A1 WO2012133349 A1 WO 2012133349A1
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WO
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protein
domain
amino acid
affinity
lys
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吉田　慎一
大 村田
俊一 平良
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Kaneka Corp
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Kaneka Corp
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to a protein that specifically binds to a target substance, a ligand affinity separation matrix on which the protein is immobilized, and a separation and purification method using the matrix.
  • One of the important functions of a protein is a function of specifically binding to a specific molecule. This function plays an important role in immune responses and signal transduction in vivo. On the other hand, technology development that uses this function for separation and purification of useful substances has been actively conducted.
  • One example that is actually used industrially is a protein A affinity separation matrix that is used to purify (capturing) antibody drugs from animal cell cultures with high purity at once.
  • the antibody drugs that have been developed are basically monoclonal antibodies, and are produced in large quantities using recombinant cultured cell technology.
  • “Monoclonal antibody” refers to an antibody obtained from a clone derived from a single antibody-producing cell.
  • Most antibody drugs currently on the market are immunoglobulin G (IgG) subclass in terms of molecular structure.
  • Protein A is one of the cell wall proteins produced by the Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus.
  • Signal sequence S five immunoglobulin binding domains (E domain, D domain, A domain, B) Domain, C domain) and an XM region which is a cell wall binding domain (Non-patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 In the initial purification step (capture step) in the antibody drug manufacturing process, an affinity chromatography column obtained by immobilizing protein A as a ligand on a water-insoluble carrier is generally used (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 1). Document 2, Non-Patent Document 3).
  • the amino acid sequence before substitution mutation introduction is any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 5, or the amino acid sequences shown by SEQ ID NOs: 1 to 5 below (1) to (4): (1) The amino acid residue corresponding to position 29 of the C domain in each domain is Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Thr, Ser, Asp, Glu, Arg, His, or Met, (2) The amino acid residue corresponding to position 33 of the C domain in each domain is Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Thr, Asp, Glu, Asn, Gln, Arg, His, or Met, (3) The amino acid residue corresponding to position 36 of the C domain in each domain is Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Glu, Arg, His, or Met, (4) The amino acid residue corresponding to position 37 of the C domain in each domain is Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Glu, Arg, His, or Met, It is preferable that
  • a plurality of domains of protein A are preferably linked by a linker.
  • the linker preferably includes Lys.
  • the present invention also relates to a cell-free protein synthesis system using the DNA or a method for producing the protein by using the transformant.
  • linker means a linker between domains, that is, a linking portion of linked monomeric proteins (single domains), that is, a C-terminal region and a C-terminal of a domain sequence on the N-terminal side. This refers to a region formed by joining the N-terminal regions of the side domain sequence.
  • the “linker” in the present specification is a region consisting of at least two amino acid residues of the C-terminal amino acid of the N-terminal domain to be linked and the N-terminal amino acid of the C-terminal domain.
  • an immunoglobulin-binding protein obtained by the present invention or a multimeric protein in which two or more of the proteins are linked is fused as a constituent component with another protein having different functions.
  • albumin or GST glutathione S-transferase
  • PEG polyethylene glycol
  • a mutation that substitutes Lys corresponding to position 58 of the C domain with Arg or Gly is preferable, and a mutation that substitutes with Arg is preferable.
  • this amino acid residue when this amino acid residue is located at the C-terminus (near the ligand) of the ligand, it may be left without introducing a mutation as described above.
  • an affinity ligand having high chemical stability under alkaline conditions can be provided.
  • the amino acid sequence before introducing the mutation of the present invention is preferably an amino acid sequence derived from the C domain of SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence before introducing the mutation of the present invention is an amino acid sequence derived from the C domain of SEQ ID NO: 5, and the amino acid residue corresponding to position 29 is Ala, Arg, Glu, Ile, Leu , Met, Phe, Trp, and Tyr are more preferable.
  • it is preferable that more than half of the amino acid residues introduced into all Lys are substitution mutations to Arg, and it is more preferred that all are substitution mutations to Arg.
  • chemical stability under alkaline conditions can be improved as compared to that before mutation introduction.
  • the host cell is not particularly limited, but for mass production at low cost, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Coryne Bacteria (eubacteria) such as Corynebacterium can be preferably used.
  • TM medium peptone 1%, meat extract 0.5%, yeast extract 0.2%, glucose 1%, pH 7.0
  • 2SL medium peptone 4%, yeast extract 0.5%, glucose 2%, pH 7.2
  • the culture temperature is 15 to 42 ° C., preferably 20 to 37 ° C.
  • the protein of the present invention is cultured in the cultured cells (in the periplasm region) by aerobically culturing for several hours to several days under aeration and stirring conditions. Or accumulated in a culture solution (extracellular) and collected. In some cases, the culture may be performed anaerobically by blocking aeration.
  • Confirmation that the obtained purified substance is the target protein can be performed by usual methods such as SDS polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequence analysis, Western blotting and the like.
  • the present invention includes the use of the above-mentioned protein as an affinity ligand characterized by having affinity for immunoglobulin as one of the embodiments.
  • an affinity separation matrix characterized in that the ligand is immobilized on a carrier comprising a water-insoluble substrate is also included as one embodiment.
  • the affinity constant (KA) for human IgG is 1 ⁇ 10 5 (M ⁇ 1 ) or more, more preferably 1 ⁇ 10 6 (M ⁇ 1 ) or more, and even more preferably 1 ⁇ 10 7 ( A protein that is M ⁇ 1 ) can be preferably used.
  • GCL2000 which is a porous cellulose gel
  • Sephacryl S-1000 in which allyl dextran and methylene bisacrylamide are covalently crosslinked
  • Toyopearl which is a methacrylate-based carrier
  • Sepharose CL4B which is an agarose-based crosslinked carrier
  • Cellufine which is a cellulosic crosslinking carrier.
  • the water-insoluble carrier in the present invention is not limited to these exemplified carriers.
  • the method for immobilizing the ligand is not particularly limited as long as it is a method of covalently binding to the carrier by the conventional coupling method via the ⁇ -amino group of lysine present in the ligand. As a result, even if a part of the ligand is immobilized on the carrier via the N-terminal ⁇ -amino group, the ligand is immobilized at the end of the protein, so that the effect of the present invention is not reduced.
  • the purification method of the protein containing the Fc region of these immunoglobulins can be achieved by a procedure according to an affinity column / chromatography purification method using a protein A column already present as a commercial product (Non-patent Document 3). That is, after adjusting a buffer containing a protein containing an immunoglobulin Fc region to be neutral, the solution is passed through an affinity column packed with the affinity separation matrix of the present invention, and the immunoglobulin Fc region is passed through. Adsorb protein containing. Next, an appropriate amount of pure buffer is passed through the affinity column, and the inside of the column is washed. At this point, the protein containing the Fc region of the desired immunoglobulin is adsorbed to the affinity separation matrix of the present invention in the column. Next, an acidic buffer adjusted to an appropriate pH (which may contain a substance that promotes dissociation from the matrix) is passed through the column, and the protein containing the Fc region of the desired immunoglobulin is eluted, High purity purification is achieved.
  • a period is added, and the number of linked domains is appended with “d”.
  • a protein in which a mutation G29E and a C domain mutant introduced with the mutation S13L are linked in five is represented as “C-G29E / S13L.5d”.
  • Table 1 summarizes the relationship between the oligonucleotide primer sequences of SEQ ID NOs: 11 to 20, the combination of two kinds of primers used in the quick change method, and the introduced amino acid mutation. All oligonucleotide primers were prepared by commissioned synthesis unless otherwise specified (Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.).
  • a new expression plasmid obtained by the quick change method can be used as a template for the quick change method. Therefore, various expression plasmids were prepared by changing the combination of template plasmid and primer (five ways) and repeating quick changes 1 to 3 times. These expression plasmids were transformed into HB101 to obtain transformed cells for expressing the mutant. Preliminary confirmation of expression / purification and the like was performed, and expression plasmids and transformed cells used in the following examples were narrowed down to those encoding the following mutants. C-K04R / K07R / G29A / K35R / K42R / K49R / K50R / K58G.
  • the cells were collected by centrifugation and resuspended in 5 mL of PBS buffer.
  • the cells were disrupted by ultrasonic disruption, centrifuged, and fractionated into a supernatant fraction (cell-free extract) and an insoluble fraction.
  • GST is expressed as a fusion protein attached to the N-terminus.
  • SDS electrophoresis all of the various cell-free extracts prepared from the respective transformed cell cultures were protein bands that were thought to be induced by IPTG at a molecular weight of about 33,000. It was confirmed.
  • the GST fusion protein is purified (crude) by affinity chromatography using a GSTrap FF column (manufactured by GE Healthcare Japan Co., Ltd.) having affinity for GST. Purified).
  • a GSTrap FF column manufactured by GE Healthcare Japan Co., Ltd.
  • Each cell-free extract is added to a GSTrap FF column, the column is washed with a standard buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, pH 7.4), followed by an elution buffer (50 mM).
  • the target GST fusion protein was eluted with Tris-HCl, 20 mM Glutathione, pH 8.0).
  • Example 4 Large-scale preparation of ligand for immobilization experiment C-K04R / K07R / G29A / K35R / K42R / K49R / K50R / K58G.
  • 1d SEQ ID NO: 21
  • a Brevibacillus expression system capable of expressing a large amount of protein.
  • a 1d Brevibacillus expression plasmid was constructed. Using this plasmid vector, Brevibacillus choshinensis FY-1 strain was transformed. Transformation was carried out by an electrophoretic method according to a known method (“Biosci. Biotech. Biochem.”, 1997, 61, 202-203).
  • the Brevibacillus choshinensis FY-1 strain is a Phe ⁇ Tyr auxotrophic strain obtained by mutation treatment of the Brevibacillus choshinensis HPD31-OK strain (Japanese Patent Laid-Open No. 6-296485).
  • anion exchange buffer A After washing with anion exchange buffer A, in the middle of a salt concentration gradient using anion exchange buffer A and anion exchange buffer B (50 mM Tris-HCl, 0.3 M NaCl, pH 8.0)
  • anion exchange buffer B 50 mM Tris-HCl, 0.3 M NaCl, pH 8.0
  • the target protein to be eluted was collected.
  • the collected target protein solution was dialyzed again against ultrapure water, and an aqueous solution containing only the target protein was used as the final purified sample.
  • protein purification by chromatography using the above columns was all performed using the AKTAprime plus system.
  • Step 4 The reaction purified products obtained in Step 2 and Step 3 are mixed, and C-K04R / K07R / G29A / K35R / K42R / K49R / K50R / K58G. 4d_type. Two expression plasmids were constructed.
  • FIG. 2 shows an electronic image of SDS-PAGE.
  • polypeptide of the present invention exhibits excellent stability even under severe alkaline conditions.
  • C-K04R / K07R / G29A / K35R / K42R / K49R / K50R / K58R. 2d_type The polypeptide of No. 2 is a highly practical polypeptide in various aspects because the band intensity hardly changes even after incubation for 4 hours at 0.5 M NaOH at 25 ° C. (99.8%). I can say that.
  • Example 9 Characterization of Linked C Domain Mutant by Gel Filtration Chromatography
  • C-K04R / K07R / G29A / K35R / K42R / K49R / K50R / K58G. 4d (or .2d) type The apparent molecular weight of No. 1 was analyzed by gel filtration chromatography based on the retention time (peak elution position).
  • the prototype affinity separation matrix showed significantly higher antibody dBC despite a comparable amount of ligand immobilization relative to the control. Even when a plurality of amino acids other than Lys contained in the immunoglobulin binding domain of protein A are substituted, the effect of the present invention can be achieved by introducing amino acid substitution mutations for all Lys residues. Indicated.
  • Example 14 Evaluation of Alkali Resistance of Prototype Affinity Separation Matrix
  • the alkali resistance of an affinity separation matrix on which a ligand is immobilized was evaluated based on the antibody binding capacity after alkali treatment.
  • the matrix of Trial 4 in Table 6 obtained in Example 10 and the matrix of Trial 5 to 7 (including Comparative 3) in Table 11 obtained in Example 13 were used.
  • a cycle in which 0.5 M NaOH was flowed at 0.1 mL / min for 1 hour and then equilibrated by flowing 5 CV of standard buffer was repeated 5 times, and then antibody dBC was measured in the same manner as in Example 6.
  • the antibody dBC measurement results after the alkali treatment are shown in Table 12 in comparison with the antibody dBC before the alkali treatment.
  • the expression plasmid was transformed into HB101 and prepared in the same manner as in Example 2.
  • the binding strength to human IgG was evaluated by the same method as in Example 3.
  • C-G29A / S33E. 1d, C-G29A. 2d, C-G29A. 4d and C-G29A / S33E. 2d was prepared in the same manner as in Example 4 using each expression plasmid.
  • the immobilization carrier was made in a trial by the same method as in Example 5, and human IgG binding ability of the trial affinity separation matrix was evaluated in the same manner as in Example 6.
  • the concentration of the ligand solution used for the trial production of the affinity separation matrix was not always 10 mg / mL.

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Abstract

タンパク質リガンドを、効率的な担体固定化反応を可能とするリジン残基（側鎖のεアミノ基）を介して固定化した際の、目的分子に対する結合容量・結合効率を最大化する、新規改変タンパク質リガンドを創出する技術の開発を課題とする。最も代表的なアフィニティー精製用タンパク質リガンドであるプロテインＡについて、タンパク質中の全てのリジン残基を他のアミノ酸に置換変異し、末端にリジンを付与した配列を含む改変タンパク質、および、その改変タンパク質が還元アミノ化等によって水不溶性担体に固定化されたアフィニティー分離マトリックスを提供する。このアフィニティー分離マトリックスは、少ないリガンド固定化量にて、目的分子に対する結合容量が高いという特徴を示す。　

Description

アフィニティー分離マトリックス用タンパク質
本発明は、目的物質に特異的に結合するタンパク質、該タンパク質を固定化したリガンドアフィニティー分離マトリックス、および、該マトリックスを用いた分離精製方法に関する。
タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。一方、この機能を、有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度で精製（キャプチャリング）するために利用される、プロテインＡアフィニティー分離マトリックスが挙げられる。
抗体医薬として開発されているのは、基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。プロテインＡは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であり、シグナル配列Ｓ、５つの免疫グロブリン結合性ドメイン（Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン）、および、細胞壁結合ドメインであるＸＭ領域から構成されている（非特許文献１）。抗体医薬製造工程における初期精製工程（キャプチャー工程）には、プロテインＡをリガンドとして水不溶性担体に固定化して得られるアフィニティークロマトグラフィー用カラムが一般的に利用されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
プロテインＡカラムの性能を改良するために、様々な技術開発がなされてきた。リガンドの側面からの技術開発も進んでいる。最初は天然型のプロテインＡがリガンドとして利用されてきたが、タンパク質工学的に改変を加えた組換えプロテインＡをリガンドとして、カラムの性能を改良する技術も多数見られるようになった。特に、プロテインＡリガンドの水不溶性担体に対する固定化され方を意識した、プロテインＡ改変技術もいくつか開発されてきた。
プロテインＡに１個のＣｙｓ（システイン残基）を変異導入した組換えプロテインＡは、Ｃｙｓを介して、プロテインＡを位置特異的に担体へ固定化されている（特許文献１）。プロテインＡの抗体結合面と非結合面のＬｙｓ（リジン残基）の数の割合を変えた組換えプロテインＡは、固定化時のリガンド配向をゆるやかに制御しながら、多点で担体へ固定化されている（特許文献２）。また、アミノ酸配列中のＬｙｓやＣｙｓを完全に無くした組換えプロテインＡは、そのＮ末端（αアミノ基）やＣ末端（特殊タグ）を介して担体へ固定化されている（特許文献３、特許文献４）。このように、タンパク質リガンドをアフィニティー分離マトリックスに固定化する上での技術進展は、産業的な利用価値が高いゆえに高い性能が要求される、プロテインＡカラムに関連する技術を中心に発展してきた。
国際公開第１９９７／０１７３６１号パンフレット 特開２００７－２５２３６８号公報 特開２００８－１１５１５１号公報 特開２００８－２６６２１９号公報
Ｈｏｂｅｒ　Ｓ．他　著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ」２００７年、８４８巻、４０－４７頁 Ｌｏｗ　Ｄ．他　著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ」、２００７年、８４８巻、４８－６３頁 Ｒｏｑｕｅ　Ａ．Ｃ．Ａ．他　著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ」、２００７年、１１６０巻、４４－５５頁
目的分子に対する結合容量・結合効率を最大化する、新規改変タンパク質リガンドを創出する技術の開発が、本発明が解決しようとする課題である。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、最も代表的なアフィニティー精製用タンパク質リガンドであるプロテインＡについて数多くの組換えプロテインＡ変異体を分子設計し、タンパク質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて変異体を取得し、取得した該変異体の物性、および、該変異体を水不溶性担体に固定化して得られる抗体アフィニティー分離マトリックスの性能を比較検討した。その結果、プロテインＡに複数存在するＬｙｓを全て無くし、かつ、新たに末端に付与したＬｙｓ（側鎖のεアミノ基）を介して固定化すると、効率的な担体固定化反応が可能となり、目的分子に対する結合容量・結合効率が最大化できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインのいずれかのドメインに由来したアミノ酸配列の全てのＬｙｓ（リジン残基）にアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有し、かつ、末端にＬｙｓを付与した配列を有するタンパク質に関する。
置換変異導入前のアミノ酸配列は、プロテインＡの複数のドメインに由来したアミノ酸配列を有していることが好ましい。
置換変異導入前のアミノ酸配列が、配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列、または、配列番号１～５で示されるアミノ酸配列に、下記（１）～（４）；
（１）各ドメインにおけるＣドメインの２９位に対応するアミノ酸残基が、
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（２）各ドメインにおけるＣドメインの３３位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（３）各ドメインにおけるＣドメインの３６位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（４）各ドメインにおけるＣドメインの３７位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
の少なくとも１つの変異を導入されたアミノ酸配列であることが好ましい。
全てのＬｙｓに対して導入されるアミノ酸置換変異について、半数以上がＡｒｇへの置換変異であることが好ましく、全てがＡｒｇへの置換変異であることがより好ましい。
前記タンパク質において、以下に示すアミノ酸残基；
Ｇｌｎ－９、Ｇｌｎ－１０、Ｐｈｅ－１３、Ｔｙｒ－１４、Ｌｅｕ－１７、Ｐｒｏ－２０、Ａｓｎ－２１、Ｌｅｕ－２２、Ｇｌｎ－２６、Ａｒｇ－２７、Ｐｈｅ－３０、Ｉｌｅ－３１、Ｌｅｕ－３４、Ｐｒｏ－３８、Ｓｅｒ－３９、Ｌｅｕ－４５、Ｌｅｕ－５１、Ａｓｎ－５２、Ｇｌｎ－５５、およびＰｒｏ－５７（残基番号はＣドメインに対応する）のうち、
９０％以上が保持されており、かつ、変異導入前のアミノ酸配列と比較した配列同一性が８０％以上であることが好ましい。
プロテインＡの複数のドメインが、リンカーにより連結されていることが好ましい。リンカーはＬｙｓを含むことが好ましい。
また、本発明は、前記タンパク質をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを含むベクター、このベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体に関する。
また、本発明は、前記ＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成系、または、前記形質転換体を用いることによる、前記タンパク質の製造方法に関する。
また、本発明は、前記タンパク質をアフィニティーリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化して得られる、アフィニティー分離マトリックスに関する。
前記アフィニティー分離マトリックスは、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合することが好ましく、前記免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質は、免疫グロブリンＧ、または、免疫グロブリンＧ誘導体のいずれかであることが好ましい。
また、本発明は、前記タンパク質をアフィニティーリガンドとして水不溶性の基材からなる担体に固定することからなる、前記アフィニティー分離マトリックスの製造方法に関する。
また、本発明は、アフィニティー分離マトリックスに免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を吸着させることを含む、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質の精製方法に関する。
本発明の新規改変タンパク質リガンドを、タンパク質中のアミノ酸であるＬｙｓ（リジン残基）を介して還元アミノ化等の方法を利用して水不溶性担体に固定化して得られるアフィニティー分離マトリックスは、少ないリガンド固定化量でも目的分子に対する結合容量が高いという効果を奏する。
Ｌｙｓ側鎖のεアミノ基は、リガンドの固定化反応に極めて利用しやすい一級アミノ基であり、この反応を利用しながら、目的分子に対する結合容量を向上させる技術は、非常に実用性が高い。また、製造に多大なコストを要するタンパク質を最大限に機能させる技術であるため、コスト（リガンド固定化量）削減を目的とした場合にも顕著な効果を示す。また、プロテインＡをリガンドとするアフィニティー分離マトリックスの基材開発は盛んになされており、特に実用性が高い。
本発明のタンパク質は、プロテインＡの配列に複数存在するＬｙｓを全て無くし、かつ、新たに末端にＬｙｓを付与した改変タンパク質であるが、このようなタンパク質について、改変前のタンパク質の機能、特に必要な目的分子へのアフィニティー機能を維持することは、容易なことではない。
同様に、このような改変を施したタンパク質を末端のＬｙｓを介して担体に固定化したときに、所望の配向性を維持したまま固定できるとは限らない。Ｌｙｓを全て置換するという大幅な改変を加えて得られた本発明のタンパク質を、特に複数ドメインとした場合に、全体としてどのような三次元立体構造を取るか予測することは容易ではない。実際に、発明者等は、本発明の複数ドメインからなるタンパク質に関して、全体としての三次元立体構造に変化が生じている可能性を示唆する実験データを得ている。
本発明のタンパク質は、タンパク質中の１０％以上を占める複数のＬｙｓを置換変異によって全て無くし、かつ、新たにＬｙｓを末端に付与するという大幅な改変を施したにもかかわらず、驚くべきことに、本来の目的分子へのアフィニティー機能を維持し、かつ、固定化された時に目的分子の結合容量向上に寄与する。
スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインの配列比較表である。 実施例８の結果を示す。アルカリ処理（０、４、８、および、２４時間）後のポリペプチドのＳＤＳ－ＰＡＧＥの図である。 実施例１２の結果を示す。アルカリ処理（０、４、および、２４時間）後のポリペプチドのＳＤＳ－ＰＡＧＥの図である。
本明細書において、アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型、または、非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異は、Ｇ２９Ａと記載する。
「タンパク質」という用語は、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、断片化された、または、ペプチド結合によって連結されたポリペプチド鎖も、「タンパク質」という用語に包含される。
一般的に、「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。本発明においてドメインとは、特に、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合するドメインのことをいい、具体的には、スタフィロコッカス属の微生物のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインのいずれかのドメイン、ストレプトコッカス属のプロテインＧのＢ１、Ｂ２ドメイン、ペプトストレプトコッカス属のプロテインＬのＢ１～Ｂ４ドメイン（Ｋｉｈｉｌｂｅｒｇ　Ｂ．Ｍ．、他、著、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、１９９２年、２６７巻、２５５８３－２５５８８頁）が挙げられる。なお、プロテインＧのＣ１およびＣ２ドメインは、文献によっては、Ｂ１およびＢ２、または、Ｇ１およびＧ２と呼ぶことがある。このうちでも、配列番号１～５に示すスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインのいずれかのドメイン、およびそれらに由来したアミノ酸配列が好ましい。各々のドメインは、図１に示すような形でアラインメントすることができる。例えば、Ｃドメインの３１位に対応するアミノ酸残基は、Ａ、Ｂドメインでは３１位であり、Ｅドメインでは２９位、Ｄドメインでは３４位に相当する。
プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインは、免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができる免疫グロブリン結合性タンパク質であり、免疫グロブリンのＦｃ領域、Ｆａｂ領域、および、Ｆａｂ領域中の特にＦｖ領域の、各々の領域に対して結合する。一般的には、各々のドメインは、Ｆａｂ（Ｆｖ）領域よりもＦｃ領域に対してより強く結合する（非特許文献３）。したがって、プロテインＡ、および、各々のドメインの「免疫グロブリンに対する親和性」は、本質的にはＦｃ領域に対する親和性を指す表現であり、Ｆａｂ領域に対する結合力のみが変化しても、免疫グロブリンに対する親和性の強さは大きく変化しない。
プロテインＡは、免疫グロブリン結合性ドメイン、つまり、免疫グロブリン結合性タンパク質が、５個つながった形で構成されるタンパク質である。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質についても、複数のドメインを連結して得られるタンパク質であることが好ましく、実施形態の１つとして、単量体タンパク質（単ドメイン）の連結数の下限は、２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、さらにより好ましくは５個以上であり、上限は、２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは８個以下、さらにより好ましくは６個以下である。これらのタンパク質は、単一の免疫グロブリン結合性ドメインの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーの末端にＬｙｓが付与されたタンパク質であっても良いし、複数種類の免疫グロブリン結合性ドメインの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーの末端にＬｙｓが付与されたタンパク質であってもよい。
単量体タンパク質の連結方法としては、リンカーとなるアミノ酸残基を介さず連結する方法、または、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。リンカーとなるアミノ酸残基数に特に制限は無い。単量体タンパク質の３次元立体構造を不安定化しないものであることが好ましい。
なお、本明細書中における「リンカー」は、ドメイン間のリンカーを意味し、連結された単量体タンパク質（単ドメイン）の連結部、すなわち、Ｎ末端側のドメイン配列のＣ末端領域とＣ末端側のドメイン配列のＮ末端領域がつながって出来る領域を指し、ドメインがタンデムにＮ個連結されたタンパク質において、リンカーはＮ－１個存在する。つまり、本明細書中における「リンカー」は、連結するＮ末端側のドメインのＣ末端アミノ酸と、Ｃ末端側のドメインのＮ末端アミノ酸の、少なくとも２個以上のアミノ酸残基からなる領域である。
特定の二次構造をとらない、または、ドメインの境界に位置する、ドメインのＮ末端側／Ｃ末端側の配列を、リンカーとすることが可能である。この場合、リンカーは、例えばプロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインのＮ末端側については、Ｃドメインの１位～６位、好ましくは１～５位、より好ましくは１～４位、さらにより好ましくは１～３位、特に好ましくは１～２位に対応するアミノ酸残基であり、少なくともＮ末端のアミノ酸残基はリンカーに含まれる。なお、ＥドメインとＤドメインは、Ｃドメインと全長が異なるが、Ｃドメインにおける上記アミノ酸と対応するアミノ酸残基がリンカーに該当する。同様に、リンカーは、例えばプロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインのＣ末端側については、Ｃドメインの５５位～５８位、好ましくは５６～５８位、より好ましくは５７位～５８位に対応するアミノ酸残基であり、少なくともＣ末端である５８位のアミノ酸残基はリンカーに含まれる。
また、実施形態の１つとして、本発明により得られる免疫グロブリン結合性タンパク質、または、該タンパク質が２個以上連結された多量体タンパク質が、１つの構成成分として、機能の異なる他のタンパク質と融合されていることを特徴とする融合タンパク質が挙げられる。融合タンパク質の例としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）が融合したタンパク質を挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたタンパク質の有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
本発明における「いずれかのドメインに由来したアミノ酸配列からなるタンパク質」は変異を導入する前のタンパク質を指す。変異を導入する前のタンパク質のアミノ酸配列は、Ｆｃ領域への結合能を有している限り、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインのいずれかの野生型アミノ酸配列には限られず、部分的なアミノ酸残基の置換、挿入、欠失、および、化学修飾により改変されたアミノ酸配列であってもよい。例えば、ＢドメインにＡ１ＶとＧ２９Ａという変異を導入したＺドメインはＢドメインに由来する配列に該当し、Ｚドメインに本発明における変異を導入して得られるタンパク質も、本発明のタンパク質に含まれる。
本発明のタンパク質は、その末端にＬｙｓが付与されていることを特徴とする。付与されるＬｙｓの個数の下限は、１個以上、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上であり、上限は、１０個以下、好ましくは５個以下である。また、Ｌｙｓが複数ある場合には各々のリジンが連続（隣接）している必要はない。また、リジンを含むタンパク質末端のアミノ酸残基数についても、特に制限は無く、リジン残基１個からなる配列であっても構わない。リジンを含むタンパク質末端のアミノ酸残基数の下限は、１個以上、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上であり、上限は、２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。「末端に付与」とは、基本的には、アミノ酸配列のＮ末端、または、Ｃ末端への付与を意味する。
Ａ～ＥドメインのＣ末端はＬｙｓである。単ドメイン型の場合には、Ｌｙｓ－５８（残基番号はＣドメインに対応）のみ、変異を導入せずに残しても構わない。複数ドメイン型の場合には、各ドメインのＬｙｓ－５８のみ、変異を導入せずに残しておくことができる。例えば、複数ドメイン型の各ドメインのＣ末端をＬｙｓとしない場合には、リガンドのＣ末端側のドメインのＬｙｓ－５８は必須である。リガンドのＣ末端側のドメイン以外のリンカー部分に１つ以上のＬｙｓが存在しても良い。また、Ｃ末端側のドメインのＬｙｓ－５８のみを残して、リンカー部分にＬｙｓが存在しなくても良い。いずれの場合においても、「全てのＬｙｓに対してアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有し、かつ、末端にＬｙｓを付与した配列」と、実質的に同等である。
各ドメインに由来するアミノ酸配列について、好ましくは、配列番号１～５で示されるアミノ酸配列に対して、以下の（１）～（４）の少なくとも１つの条件に合致するアミノ酸残基置換が導入されたアミノ酸配列である。
（１）各ドメインにおけるＣドメインの２９位に対応するアミノ酸残基が、
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（２）各ドメインにおけるＣドメインの３３位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（３）各ドメインにおけるＣドメインの３６位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（４）各ドメインにおけるＣドメインの３７位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである。
さらに、より好ましくは、以下の（１）～（４）の少なくとも１つの条件に合致するアミノ酸残基置換が導入されたアミノ酸配列である。
（１）各ドメインにおけるＣドメインの２９位に対応するアミノ酸残基が、
Ａｌａ、Ｇｌｕ、または、Ａｒｇのいずれかである、
（２）各ドメインにおけるＣドメインの３３位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、または、Ｈｉｓのいずれかである、
（３）各ドメインにおけるＣドメインの３６位に対応するアミノ酸残基が、
Ｉｌｅ、または、Ａｒｇのいずれかである、
（４）各ドメインにおけるＣドメインの３７位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、または、Ｈｉｓのいずれかである。
「全てのＬｙｓ（リジン残基）」は、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂドメインにおける、Ｃドメインの４、７、３５、４９、５０、および、５８位に対応する６つのＬｙｓのことを指す。プロテインＡのＣドメインの場合のみ、４、７、３５、４２、４９、５０、および、５８位の７つのＬｙｓのことを指す。ただし、変異を導入する前のアミノ酸配列が欠失変異を受けた配列の場合、例えば１～４位が欠失した配列の場合は、上述の数に限定されない。
Ｌｙｓ部位に置換変異として導入されるアミノ酸の種類は、特に限定されず、天然型アミノ酸、非タンパク質構成アミノ酸や非天然アミノ酸であってもよい。遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸を好適に用いることができる。ただし、固定化時のカップリング反応での反応性が高い官能基を側鎖に有するアミノ酸、例えば、チオール基（－ＳＨ）を側鎖に有するシステイン（Ｃｙｓ）は、置換するアミノ酸としては不適である。
具体的なアミノ酸置換変異の例を、以下に示す。
（１）Ｄ、Ｂ、および、Ｃドメインにおける、Ｃドメインの４位に対応するＬｙｓを、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、またはＡｓｎに置換する変異が挙げられ、Ａｒｇに置換する変異であることが好ましい。
（２）Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインにおける、Ｃドメインの７位に対応するＬｙｓを、Ａｓｐ、Ａｒｇ、またはＧｌｕに置換する変異が挙げられ、Ａｒｇに置換する変異であることが好ましい。
（３）Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインにおける、Ｃドメインの３５位に対応するＬｙｓを、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、またはＨｉｓに置換する変異が挙げられ、Ａｒｇ、またはＨｉｓに置換する変異であることが好ましい。
（４）Ｃドメインにおける４２位に対応するＬｙｓを、Ａｒｇに置換する変異である。
（５）Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインにおける、Ｃドメインの４９位に対応するＬｙｓを、ＡｒｇまたはＧｌｎに置換する変異が挙げられる。
（６）Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインにおける、Ｃドメインの５０位に対応するＬｙｓを、ＡｒｇまたはＨｉｓに置換する変異が挙げられ、Ａｒｇに置換する変異であることが好ましい。
（７）Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインにおける、Ｃドメインの５８位に対応するＬｙｓを、Ａｒｇ、またはＧｌｙに置換する変異が挙げられ、Ａｒｇに置換する変異であることが好ましい。ただし、このアミノ酸残基がリガンドのＣ末端（付近）に位置する場合においては、先述の通り、変異を導入せずに残しても構わない。
さらに、Ｌｙｓ部位に置換変異として導入されるアミノ酸のうち、半数以上がアルギニン（Ａｒｇ）への置換変異であることが好ましく、全てがＡｒｇへの置換変異であることがより好ましい。これは、ＡｒｇはＬｙｓと物性が似た塩基性アミノ酸であり、ＬｙｓをＡｒｇに置換する場合には、タンパク質全体の物性に与える影響が比較的小さいからである。
また、実施形態の一つとして、アルカリ条件下での化学的安定性の高いアフィニティーリガンドも提供し得る。この場合、本発明の変異を導入する前のアミノ酸配列が、配列番号５のＣドメインに由来するアミノ酸配列であることが好ましい。さらには、本発明の変異を導入する前のアミノ酸配列が、配列番号５のＣドメインに由来するアミノ酸配列であり、かつ、２９位に対応するアミノ酸残基がＡｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒから選択されるいずれかであることが、より好ましい。また、全てのＬｙｓに対して導入されるアミノ酸残基について、半数以上がＡｒｇへの置換変異であることが好ましく、全てがＡｒｇへの置換変異であることがより好ましい。全てがＡｒｇへの置換変異である場合に、アルカリ条件下での化学的安定性が、変異導入前に比べて向上し得る。
アルカリ性条件下における化学的安定性は、免疫グロブリンに対する結合活性を指標として決定することもできるし、ポリペプチド自体の物質としての安定性を指標として決定することもできる。ポリペプチド自体の物質としての安定性を指標とする場合、例えば、電気泳動法によって、アルカリ処理前後のポリペプチドの泳動バンドを比較することで、アルカリ性条件下における化学的安定性を評価することが可能である。具体的には、ごく一般的なＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、デンシトメトリーによるバンド強度を解析することによって化学的安定性を比較可能である。デンシトメトリーによって分析したバンド強度を基準にすると、本発明のポリペプチドは、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中で、２５℃で２４時間静置した後、当該処理をする前と比較して、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることが最も好ましい。
本発明において得られた上述の変異体に対して、配列同一性が極めて高いタンパク質は、本発明の範囲に含まれる。その配列同一性の基準としては、各ドメインで保存されている、次に示す２０個のアミノ酸残基が、９０％以上保持されていることが好ましく、９５％以上保持されていることがより好ましい。
Ｇｌｎ－９、Ｇｌｎ－１０、Ｐｈｅ－１３、Ｔｙｒ－１４、Ｌｅｕ－１７、Ｐｒｏ－２０、Ａｓｎ－２１、Ｌｅｕ－２２、Ｇｌｎ－２６、Ａｒｇ－２７、Ｐｈｅ－３０、Ｉｌｅ－３１、Ｌｅｕ－３４、Ｐｒｏ－３８、Ｓｅｒ－３９、Ｌｅｕ－４５、Ｌｅｕ－５１、Ａｓｎ－５２、Ｇｌｎ－５５、Ｐｒｏ－５７（残基番号はＣドメインに対応する）。
さらに、タンパク質全体としてのアミノ酸配列の同一性が、変異導入前のアミノ酸配列と比較して８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることが最も好ましい。
本発明は、上記方法により得られたタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡにも関する。ＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、上述のタンパク質を構成するものであればいずれでも良い。そのようなＤＮＡは、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該ＤＮＡを構成する塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていても良く、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。
ＤＮＡの塩基配列を改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、タンパク質をコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋および－鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により、行うことができる。
また、本発明の単量体タンパク質（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体タンパク質をコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体タンパク質をコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素認識配列を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素認識配列は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素認識配列を導入することもできる。
多量体タンパク質をコードするＤＮＡを作製する方法は、これら連結する方法に限らない。例えば、プロテインＡをコードするＤＮＡ（例えば、国際公開第ＷＯ２００６／００４０６７号パンフレット）に上記の変異導入法を適用することで作製することも可能である。なお、多量体タンパク質をコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体タンパク質をコードする塩基配列が同一の場合には、形質転換した際に宿主細胞内でＤＮＡの相同組換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下であることが好ましく、８５％以下であることがより好ましい。
本発明の「ベクター」は、前述したタンパク質、または、その部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、前述したタンパク質をコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができる。遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社製）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社製）、および、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）のベクターなどが挙げられる。ブレビバチルス属細菌の遺伝子の発現に有用なプラスミドベクターとしては、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、または、ｐＨＹ５００（特開平２－３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４－２７８０９１号公報）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７－１７０９８４号公報）、ｐＨＴ２１０（特開平６－１３３７８２号公報）、または、大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＭＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）などが挙げられる。
本発明のタンパク質は、タンパク質発現を補助する作用、または、精製を容易にする作用がある公知の蛋白質との融合タンパク質として取得することができる。該タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。本発明のＤＮＡとＭＢＰ或いはＧＳＴ等をコードするＤＮＡとを連結した状態で含むベクターを使用して、融合タンパク質を生産することができる。
本発明の形質転換体は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、または、ポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。
宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
本発明のタンパク質は、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物から所望のタンパク質を採取することにより製造することができる。
また、本発明のタンパク質は、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明のタンパク質を含む融合タンパク質を生成蓄積させ、該培養物から該融合タンパク質を採取し、該融合タンパク質を適切なプロテアーゼによって切断し、所望のタンパク質を採取することによっても製造することができる。
本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、該タンパク質を高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されても良い。
さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的蛋白質の分解、低分子化を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわちＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）、および／または、その他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加しても良い。
さらに、本発明のタンパク質を正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用しても良い（例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のタンパク質と共存させる）。なお、本発明のタンパク質の正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン　１％、酵母エキス　０．５％、ＮａＣｌ　１％）、または、２ｘＹＴ培地（トリプトン　１．６％、酵母エキス　１．０％、ＮａＣｌ　０．５％）等が挙げられる。
ブレビバチルス属細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、ＴＭ培地（ペプトン　１％、肉エキス　０．５％、酵母エキス　０．２％、グルコース　１％、ｐＨ　７．０）、または、２ＳＬ培地（ペプトン　４％、酵母エキス　０．５％　、グルコース　２％、ｐＨ　７．２）等が挙げられる。
また、培養温度は、１５～４２℃、好ましくは２０～３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間～数日培養することにより本発明のタンパク質を、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。
組換えタンパク質が分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたタンパク質を含む上清を分離することにより生産された組換えタンパク質を回収することができる。
また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたタンパク質を回収することができる。
本発明のタンパク質の精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。
得られた精製物質が目的のタンパク質であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
本発明のタンパク質は、前記ＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成系を用いて製造することもできる。このような無細胞タンパク質合成系の例として、原核細胞由来、植物細胞由来、高等動物細胞由来の合成系が挙げられる。
本発明は、上述のタンパク質を、免疫グロブリンに対して親和性を有することを特徴とするアフィニティーリガンドとして利用することを、実施形態の１つとして包含する。同様に、該リガンドを水不溶性の基材からなる担体に固定化したことを特徴とする、アフィニティー分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。
ここで、「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集（結合）する物質（官能基）を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するタンパク質を指す。本明細書においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同意である。
免疫グロブリンに対する親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。測定条件としては、プロテインＡが免疫グロブリンのＦｃ領域に結合した時の結合シグナルが検出できれば良く、温度２０～４０℃（一定温度）にて、ｐＨ６～８の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。
結合パラメータとしては、例えば、親和定数（ＫＡ）や解離定数（ＫＤ）を用いることができる（永田他　著、「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」、シュプリンガー・フェアラーク東京、１９９８年、４１頁）。本発明のタンパク質のＦｃに対する親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにヒトＩｇＧを固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、各ドメイン変異体を流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係るタンパク質について、ヒトＩｇＧへの親和定数（ＫＡ）が１×１０５（Ｍ－１）以上、より好ましくは１×１０６（Ｍ－１）以上、さらに好ましくは１×１０７（Ｍ－１）であるタンパク質を好適に用いることができる。
本発明に用いる水不溶性の基材からなる担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機－有機、有機－無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１０００、メタクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。ただし、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
リガンドの固定化方法については、リガンドに存在するリジンのεアミノ基を介して、従来のカップリング法で担体に共有結合する方法であれば、特に限定されない。また、結果的に、一部のリガンドがＮ末端のαアミノ基を介して担体に固定化されても、タンパク質の末端で固定化されるので、本発明の効果が低下することはない。カップリング法としては、担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、および、過ヨウ素酸ナトリウムなどと反応させて担体を活性化し（あるいは担体表面に反応性官能基を導入し）、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入しても良いし、担体にリガンドを直接固定化しても良い。
本発明のアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質をアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。免疫グロブリン結合性ドメインが結合する領域をＦａｂ領域（特にＦｖ領域）、および、Ｆｃ領域、というように広く定義したが、抗体の立体構造はすでに既知であるので、タンパク質工学的に、プロテインＡが結合する領域の立体構造を保持しつつＦａｂ領域やＦｃ領域にさらなる改変（断片化など）を施すことは可能であり、本発明は、Ｆａｂ領域、および、Ｆｃ領域を、不足なく含有する免疫グロブリン分子、および、その誘導体に限定されるものでもない。したがって、「免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質」とは、プロテインＡが結合するＦｃ領域側の部位を含むタンパク質のことであり、プロテインＡが結合できれば、Ｆｃ領域を完全に含むタンパク質である必要はない。
代表的な免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質としては、免疫グロブリンＧ、または、免疫グロブリンＧ誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ここで、「免疫グロブリンＧ誘導体」とは、例えば、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧや、ヒト免疫グロブリンＧのＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｇ　Ｒｅｇｉｏｎｓ）部分を他生物種抗体のＣＤＲ部分に置き換えて融合させたヒト型化免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、ヒト免疫グロブリンＧのＦｖ領域とＦｃ領域とを融合させた人工免疫グロブリンＧなどの、プロテインＡが結合し得る改変型人工タンパク質を総称する名称である。
これらの免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質の精製法は、すでに市販品として存在するプロテインＡカラムを用いたアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献３）。すなわち、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を含有する緩衝液を中性となるように調整した後、該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質はカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液（該マトリックスからの解離を促進する物質を含む場合もある）をカラムに通液し、所望の免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。
本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液（適当な変性剤、または、有機溶剤を含む溶液の場合もある）を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。
また、本発明は、上記のアフィニティー分離マトリックスを使用した分離方法により得られる、タンパク質に関する。このタンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質であることが好ましい。上記のアフィニティー分離マトリックスを使用して得られるタンパク質は、高純度かつ高濃度の溶液として得られ、抗原に対する結合力などの本来有する活性を損なうことなく保持しているという性質を有する。
以下に実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例で取得した各種タンパク質について、「ドメインを示すアルファベット‐導入した変異（野生型ではＷｉｌｄ）」の形で表記する。例えば、プロテインＡの野生型Ｃドメインは「Ｃ－ｗｉｌｄ」、変異Ｇ２９Ｅを導入したＣドメイン変異体は「Ｃ－Ｇ２９Ｅ」という形で表記する。２種類の変異を同時に導入した変異体の表記については、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｇ２９Ｅ、および、変異Ｓ１３Ｌを導入したＣドメイン変異体については、「Ｃ－Ｇ２９Ｅ／Ｓ１３Ｌ」という形で表記する。また、単ドメインを複数連結したタンパク質については、ピリオドをつけて、連結した数に「ｄ」をつけて併記する。例えば、変異Ｇ２９Ｅ、および、変異Ｓ１３Ｌを導入したＣドメイン変異体を５連結したタンパク質は、「Ｃ－Ｇ２９Ｅ／Ｓ１３Ｌ．５ｄ」と表記する。
（実施例１）単ドメイン型各種Ｃドメイン変異体の発現プラスミド調製
配列番号６および７に記載のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを混合し、ポリメラーゼにＢｌｅｎｄ　Ｔａｑ（東洋紡績株式会社製）を用い、添付のプロトコルに従ってオーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物である二本鎖ＤＮＡをアガロース電気泳動で抽出・精製し、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ（いずれもタカラバイオ株式会社製）により切断した。同様の手法で、配列番号８および９に記載のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドから、ＰＣＲ反応にて目的の二本鎖ＤＮＡを得て、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ（タカラバイオ株式会社製）により切断した。
プラスミドベクターｐＧＥＸ－２Ｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに、上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。ライゲーション反応は、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩによる切断反応とＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）による脱リン酸化反応を行ったベクターｐＧＥＸ－２Ｔと、上記２種の制限酵素処理済み二本鎖ＤＮＡを混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡績株式会社製）を用い、添付のプロトコルに従って行った。なお、上記２種の二本鎖ＤＮＡが、ＨｉｎｄＩＩＩ切断サイトで結合し、ｐＧＥＸ－２Ｔにサブクローニングしたときに、配列番号１０（Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｅ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｈ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ）をコードするように、配列番号６、７、８、９のＤＮＡを設計した。この配列番号１０をコードするＤＮＡを含むｐＧＥＸ－２Ｔ（ライゲーション反応液）を用いて、大腸菌ＨＢ１０１細胞（タカラバイオ株式会社製）の形質転換を行い、定法によって、プラスミドＤＮＡを増幅・抽出した。
このサブクローニング後の発現プラスミドを鋳型として、配列番号１１～２０のオリゴヌクレオチドプライマーの中から２種類のプライマーを用いて、クイックチェンジ法を実施し、新たな変異を含む発現プラスミドを取得した。クイックチェンジ法は、ＤＮＡポリメラーゼのＰｆｕ　Ｔｕｒｂｏ、および、メチル化ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）切断酵素ＤｐｎＩ（ともにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のプロトコルに従い実施した。
配列番号１１～２０のオリゴヌクレオチドプライマーの配列、クイックチェンジ法に使われる２種類のプライマーの組み合わせ、および、導入されるアミノ酸変異との関係を表１にまとめた。なお、オリゴヌクレオチドプライマーについては、特記しない限り、全て委託合成にて調製した（シグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社製）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　
クイックチェンジ法を行う鋳型については、クイックチェンジ法で得られた新たな発現プラスミドを用いることが可能である。したがって、鋳型プラスミド、プライマーの組み合わせ（５通り）を変えて、１～３回クイックチェンジを繰り返して、各種発現プラスミドを作製した。これらの発現プラスミドをＨＢ１０１に形質転換し、変異体発現用の形質転換細胞を得た。発現・精製等に関して予備的な確認を行い、後の実施例に用いる発現プラスミドおよび形質転換細胞は、以下の変異体をコードするものに絞った。
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ（配列番号２１）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ（配列番号２２）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｅ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｈ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ（配列番号２３）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｄ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｈ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ（配列番号２４）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｅ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ（配列番号２５）
各々の発現プラスミドＤＮＡ塩基配列の確認は、ＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ．１．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、付属のプロトコルに従い、各々のプラスミドＤＮＡのシークエンシングＰＣＲ反応を行い、そのシークエンシング産物を精製し、配列解析に用いた。ｐＧＥＸ－２Ｔをベクターとする各種発現プラスミドについて、市販のｐＧＥＸ　３’Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）をプライマーとして用いた。確認した配列番号２１～２５のタンパク質をコードする各々のＤＮＡ配列を配列番号２６～３０に記載する。
（実施例２）各種単ドメイン型Ｃドメイン変異体の発現・精製
実施例１で得られた、各種単ドメイン型Ｃドメイン変異体をＧＳＴ融合タンパク質として発現する各々の形質転換細胞を、アンピシリンを含むＬＢ培地にて、３７℃で終夜培養した。これらの培養液を、２×ＹＴ培地（アンピシリン含有）に接種し、３７℃で約２時間培養し、終濃度０．１ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル１－チオ－β－Ｄ－ガラクシド）を添加し、さらに、３７℃にて１８時間培養した。
培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ－２Ｔベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入するとＧＳＴがＮ末端に付与した融合タンパク質として発現される。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動により分析したところ、各々の形質転換細胞培養液から調製した各種無細胞抽出液のすべてについて、分子量約３３，０００の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられるタンパク質のバンドを確認した。
ＧＳＴ融合タンパク質を含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ　ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、ＧＳＴ融合タンパク質を精製（粗精製）した。各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ　ＦＦカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ　Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合タンパク質を溶出した。
ｐＧＥＸ－２Ｔベクターのマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）でＧＳＴを切断することが可能なアミノ酸配列が、ＧＳＴと目的タンパク質の間に導入される。Ｔｈｒｏｍｂｉｎを用いて、添付プロトコルに従いＧＳＴ切断反応を行った。最後にＳｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて、目的のタンパク質の精製を行った。標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のタンパク質を、切断したＧＳＴやＴｈｒｏｍｂｉｎから分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィーによるタンパク質精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を利用して実施した。
これらの精製が完了した各種タンパク質溶液をトリシン－ＳＤＳ電気泳動にて分析したところ、分子量約７，０００の位置に目的のタンパク質と考えられるバンドを確認した。トリシン－ＳＤＳ電気泳動による分析の結果、９０％以上の高純度で存在すると考えられた。本実施例で得られる各々のタンパク質の一次配列は、配列番号２１～２５で示される各種単ドメイン型Ｃドメイン変異体のアミノ酸配列に対して、Ｎ末端側にベクターｐＧＥＸ－２Ｔ由来のＧｌｙ－Ｓｅｒが、Ｃ末端側にＳｅｒが付加された配列である。
（実施例３）各種単ドメイン型Ｃドメイン変異体のヒトＩｇＧとの親和性の解析
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ　３０００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を用いて、実施例２で取得した各種単ドメイン型Ｃドメイン変異体の免疫グロブリンとの親和性を解析した。本実施例では、ヒト血漿から分画したヒト免疫グロブリンＧ製剤（以後は、ヒトＩｇＧと記する）をセンサーチップに固定化し、各種タンパク質をチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。
ヒトＩｇＧのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）、および、Ｎ－ｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）。ヒトＩｇＧ溶液としてガンマガード（バクスター社製）を使用し、標準緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１．０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解して調製した。このヒトＩｇＧ溶液を、固定化用緩衝液（１０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＨ－ＣＨ３ＣＯＯＮａ、ｐＨ４．５）で１００倍に希釈した。ヒトＩｇＧは、Ｂｉａｃｏｒｅ　３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。
各種単ドメイン型Ｃドメイン変異体は、ランニング緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．００５％　Ｐ－２０、ｐＨ７．４）を用いて、１０～１０００ｎＭの範囲で適宜調製し（各々について、異なるタンパク質濃度の溶液を３種類調製）、各々のタンパク質溶液を、流速２０μＬ／ｍｉｎで３０秒間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相、９０秒間）、および、添加終了後（解離相、９０秒間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、４０ｍＭ　ＮａＯＨ（１５秒間）を添加してセンサーチップを再生した。この操作は、センサーチップ上に残った添加タンパク質の除去が目的であり、固定化したヒトＩｇＧの結合活性がほぼ完全に戻ることを確認した。得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ヒトＩｇＧに対する親和定数（ＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）を算出した。その結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　
表２に示すように、各種単ドメイン型Ｃドメイン変異体のヒトＩｇＧに対する結合パラメータは、Ｃ－Ｇ２９Ａ．１ｄ（比較例１）と同程度であった。具体的には、ヒトＩｇＧに対する親和定数は、いずれのタンパク質に関しても、１．０×１０７Ｍ－１～５．０×１０７Ｍ－１の範囲（１０の７乗オーダー）に収まった。
（実施例４）固定化実験用リガンドの大量調製
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ（配列番号２１）をＩｇＧアフィニティーリガンドとして固定化した担体を作製する上で、タンパク質の大量発現が可能なブレビバチルス発現系を用いて発現・精製を行った。
まず、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄをコードするｐＧＥＸ－２Ｔ発現プラスミドを鋳型とし、配列番号３１および３２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応精製産物を、制限酵素ＰｓｔＩ（タカラバイオ株式会社製）とＥｃｏＲＩで処理し、インサート用二本鎖ＤＮＡを調製した。
鋳型に用いたベクターは、ｐＮＫ３２６０という公知のブレビバチルス発現ベクター（国際公開第２００６／００４０６７号パンフレット）に対し、発現したいタンパク質コードＤＮＡをＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩサイトで挿入できるよう変異処理したｐＮＫ３２６０’を用いた。制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩによる切断反応と、Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅによる脱リン酸化反応を行ったｐＮＫ３２６０’に、上記インサート用二本鎖ＤＮＡを混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈを用いたライゲーション反応を行い、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄのブレビバチルス発現プラスミドを構築した。このプラスミドベクターを用いて、ブレビバチルス・チョウシネンシスＦＹ－１株の形質転換を行った。形質転換は、公知の方法による電気導入法にて実施した（「Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、１９９７年、６１号、２０２－２０３頁）。なお、ブレビバチルス・チョウシネンシスＦＹ－１株は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１－ＯＫ株（特開平６－２９６４８５号公報）に変異処理をして得られたＰｈｅ・Ｔｙｒ要求性株である。
ブレビバチルス・チョウシネンシスＦＹ－１組換え菌を、６０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含む５ｍＬの３ＹＣ培地（ポリペプトン　３％、酵母エキス　０．２％、グルコース　３％、硫酸マグネシウム　０．０１％、硫酸鉄　０．００１％、塩化マンガン　０．００１％、塩化亜鉛　０．０００１％）にて、３０℃で３日間の振盪培養を行った。
培養物を遠心処理して菌体を分離し、得られた培養上清から、ＳＰ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を利用した陽イオン交換クロマトグラフィーにて、目的のタンパク質を精製した。具体的には、酢酸ナトリウムを終濃度５０ｍＭになるように添加し、さらに塩酸でｐＨ４．０に調整した培養上清を、陽イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＨ－ＣＨ３ＣＯＯＮａ，　ｐＨ４．０）にて平衡化したＳＰ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラムに添加し、陽イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陽イオン交換緩衝液Ａと陽イオン交換緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＨ－ＣＨ３ＣＯＯＮａ，１Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ４．０）を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出される目的タンパク質を分取した。次に、ＤＥＡＥ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を利用した陰イオン交換クロマトグラフィーにて、目的のタンパク質を精製した。具体的には、分取した目的タンパク質溶液を、超純水に透析し、陰イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０）にて平衡化したＤＥＡＥ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラムに添加し、陰イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陰イオン交換緩衝液Ａと陰イオン交換緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，０．３Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出される目的タンパク質を分取した。分取した目的タンパク質溶液を、再び超純水に透析し、目的タンパク質のみを含む水溶液を最終精製サンプルとした。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィーによるタンパク質精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステムを利用して実施した。
この発現系を利用して得られるリガンド用タンパク質の一次配列は、配列番号２１で示されるＣ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄに対して、Ｃ末端側にＳｅｒ－Ｌｙｓが付加された配列である。すなわち、リガンド中において、リジン残基はＣ末端に１個のみ存在する。
（実施例５）リガンドを担体に固定化したアフィニティー分離マトリックスの試作
カップリング目的官能基をアミノ基とする市販のリガンド固定化用カップリングカラムを利用して、実施例４で得られたリガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスを作製した。
水不溶性基材として、市販のプレパックカラム「Ｈｉｔｒａｐ　ＮＨＳ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰ」１ｍＬ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を使用した。このカラムは、架橋アガロースをベースとし、カップリング目的官能基をアミノ基とするタンパク性リガンド固定化用の活性基が導入済みなので、製品マニュアルに従ってリガンドを固定化した。リガンドをカップリング緩衝液（０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３，０．５Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．３）で終濃度約１０ｍｇ／ｍＬに希釈した溶液を１ｍＬ調製した。氷浴で冷やした１ｍＭ　ＨＣｌを、流速１ｍＬ／ｍｉｎで２ｍＬ分流す操作を３回行い、カラム中のイソプロパノールを除去した。その後すぐに、先に調製したサンプル希釈溶液を同じ流速で１ｍＬ添加し、カラムの上下に栓をして２５℃で３０分間静置することで、取得したリガンドをカラムに固定化した。その後開栓し、カップリング緩衝液を同じ流速で３ｍＬ流して、未反応リガンドを回収した。その後、ブロッキング用緩衝液（０．５Ｍ　ｅｔｈａｎｏｌ　ａｍｉｎｅ，０．５Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．３）を２ｍＬ流す操作を３回実施し、洗浄用緩衝液（０．１Ｍ　Ａｃｅｔａｔｅ，０．５Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ４．０）を２ｍＬ流す操作を３回実施し、最後に標準緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を２ｍＬ流してアフィニティー分離カラムの作成を完了した。
固定化反応で置換されたＮＨＳは２８０ｎｍに吸収を持つ。脱塩カラムＨｉＴｒａｐ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　５ｍＬ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を用いてＮＨＳを除去し、未反応リガンドのみの２８０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ２８０）を測定し、固定化収率を算出した。ＨｉＴｒａｐ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇを利用することで、分子量５，０００以上の成分（ここではリガンド）と分子量１，０００以下の成分（置換されたＮＨＳ）を分離することが可能である。未反応リガンド５００μＬをＨｉＴｒａｐ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　５ｍＬに通液し、カップリング緩衝液を１ｍＬ添加した後、さらにカップリング緩衝液を１．５ｍＬ添加して、この時の溶出液１．５ｍＬを回収し、２８０ｎｍの吸光度を測定した。ＨＰＬＣやビウレット法による検討で事前に導いた算出式（Ａｂｓ２８０＝０．３４３のときに１ｍｇ／ｍＬ）を用いて濃度を算出した。その結果、リガンド固定化量は、６．６ｍｇ／ｍＬ－ｇｅｌであり、固定化収率は６７％であった。
（実施例６）試作アフィニティー分離マトリックスのヒトＩｇＧ結合容量評価
試作アフィニティー分離マトリックスのヒトＩｇＧ結合容量を評価するために、アフィニティークロマトグラフィー実験による抗体ｄＢＣ測定を行った。ヒトＩｇＧとしては、ガンマグロブリン（ニチヤク株式会社製）を、標準緩衝液（２０ｍＭ　Ｎａ－Ｐｉ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で１５０倍に希釈して１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した溶液を用いた。また、クロマトシステムＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓのセルをこの溶液が１００％通過しているときのＡｂｓ２８０（１００％　Ａｂｓ２８０）をあらかじめ測定した。なお、ＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰ（１　ｍＬ）はφ０．７×２．５ｃｍ（０．９６ｍＬ）なので、一連の操作では１ｍＬを１ＣＶとした。
クロマトシステムＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓに試作アフィニティー分離マトリックスを接続し、流速２．０ｍＬ／ｍｉｎで標準緩衝液を５ＣＶ流して平衡化した。次に、流速１．９ｍＬ／ｍｉｎ（２９６ｃｍ／ｈ）でヒトＩｇＧ溶液を流し、モニタリング吸光度が１００％　Ａｂｓ２８０の５％を超えるまで続けた。その後、流速２．０ｍＬ／ｍｉｎで標準緩衝液を１３ＣＶ流し、続いて、溶出緩衝液（３５ｍＭ　Ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ３．５）を１５ＣＶ流し、ヒトＩｇＧを溶出した。モニタリング吸光度が１００％　Ａｂｓ２８０の５％を超えたときまでに流したヒトＩｇＧの総量を抗体ｄＢＣ（抗体５％　ｄＢＣ）とした。
試作したアフィニティー分離マトリックスの評価結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　
試作したアフィニティー分離マトリックスの抗体５％　ｄＢＣは、２５．７ｍｇ／ｍＬ－ｇｅｌであった。比較例１で試作したアフィニティー分離マトリックスの抗体５％　ｄＢＣは、ほぼ同じ固定化量において、１７．５ｍｇ／ｍＬ－ｇｅｌであった。本発明で得られたリガンドは、リガンド固定化量あたりの抗体結合容量を有意に向上させることが可能であるということを示す実験結果と考えられる。なお、試作１のリガンドの抗体への親和定数は実施例３（表２）と若干異なるが、これは、測定したときのサンプルが若干違う（実施例４での、発現系の変更、および、Ｃ末へのＬｙｓ付与）ことによるもので、それに伴う誤差範囲と言える。また、表の抗体への親和定数は、実施例３に従って測定した値である。
（実施例７）連結型Ｃドメイン変異体の調製
本発明の技術は、複数のドメインがタンデムに連結された場合にも、適応が可能である。さらに、ドメイン間のリンカー部分の配列が変わった場合、担体への固定化に利用される末端の配列が変わった場合、および、他の変異が入った場合にも、適応が可能である。以下の（１）～（４）に、今回取得した連結型Ｃドメイン変異体の発現プラスミド調製方法を示した。
（１）Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．４ｄ（ｏｒ　２ｄ）＿ｔｙｐｅ．１
以下のＳＴＥＰ．１～２を経て得られた発現プラスミドを用いて、実施例４と同様にリガンドとなるタンパク質を取得したとき、その一次配列は、配列番号３３に示す通りであり、各ドメインの後ろにＳｅｒが付与された形で（Ｓｅｒがリンカーとなって）連結され、さらに、Ｃ末端にＬｙｓが付与された配列となる。この発現プラスミドのコードＤＮＡ配列は配列番号３４に示す。
［ＳＴＥＰ．１］単ドメイン型→２ドメイン型
工程１）実施例１で得られたＣ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ（配列番号２１）をコードする発現プラスミドを鋳型として、配列番号３１および３５のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ反応精製産物を制限酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨＩで処理し、インサート用二本鎖ＤＮＡを調製した。
工程２）同じ鋳型を用いて、配列番号３２および３６のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ反応精製産物を制限酵素ＢｇｌＩＩ（タカラバイオ株式会社製）とＥｃｏＲＩで処理し、インサート用二本鎖ＤＮＡを調製した。
工程３）これら２種のインサート用二本鎖ＤＮＡを、実施例４で用いた、制限酵素（ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ）処理と脱リン酸化処理を施したｐＮＫ３２６０’と混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈを用いたライゲーション反応によって、Ｃドメイン変異体が２個タンデムに連結されたＣ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．２ｄ＿ｔｙｐｅ．１の発現プラスミドを構築した。
［ＳＴＥＰ．２］２ドメイン型→４ドメイン型
工程１）Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．２ｄ＿ｔｙｐｅ．１の発現プラスミドを鋳型として、配列番号３５および３７のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ反応精製産物を制限酵素ＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで処理し、インサート用二本鎖ＤＮＡを調製した。
工程２）Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．２ｄの発現プラスミド（つまりＰＣＲの鋳型に用いたものと同じ）を、制限酵素（ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ）処理し、脱リン酸化処理を施した。
工程３）工程１と工程２で得られた各々の反応精製物を混合し、ライゲーション反応によって、Ｃドメイン変異体が４個タンデムに連結された、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．４ｄの発現プラスミドを構築した。
（２）Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．４ｄ（ｏｒ　２ｄ）＿ｔｙｐｅ．２
以下のＳＴＥＰ．１～２を経て得られた発現プラスミドを用いて、実施例４と同様にリガンドとなるタンパク質を取得したとき、その一次配列は、配列番号３８に示す通りであり、リンカー残基を介さずドメイン同士が直接連結され、さらに、Ｃ末端のＧｌｙをＬｙｓに置換変異することで、末端にＬｙｓが付与された配列となる。つまり、見方を変えれば、一番Ｃ末端側（４番目）のドメインのみ、Ｌｙｓを変異せず残した配列となるが、本発明の本質を変える改変ではない。比較対照となるＬｙｓが変異されず残ったままの連結型Ｃドメイン変異体とリガンドとアミノ酸残基数を揃えるため、つまり、比較対照との余計な相違点を極力減らすために便宜上行った改変である。この発現プラスミドのコードＤＮＡ配列は配列番号３９に示す。
［ＳＴＥＰ．１］単ドメイン型→２ドメイン型
工程１）（１）と同じ発現プラスミドを鋳型として、配列番号３１および４０のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ反応精製産物を制限酵素ＰｓｔＩとｃｆｒ１３Ｉ（タカラバイオ株式会社製）で処理し、インサート用二本鎖ＤＮＡを調製した。
工程２）同じ鋳型を用いて、配列番号４１および４２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ反応精製産物を制限酵素ｃｆｒ１３ＩとＥｃｏＲＩで処理し、インサート用二本鎖ＤＮＡを調製した。
工程３）これら２種のインサート用二本鎖ＤＮＡを、実施例４で用いた、制限酵素（ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ）処理と脱リン酸化処理を施したｐＮＫ３２６０’と混合し、ライゲーション反応によって、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．２ｄ＿ｔｙｐｅ．２の発現プラスミドを構築した。
［ＳＴＥＰ．２］２ドメイン型→４ドメイン型
工程１）Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．２ｄ＿ｔｙｐｅ．２の発現プラスミドを鋳型として、配列番号４３および４４のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、クイックチェンジ法を行い、ｃｆｒ１３Ｉサイトを無くするモディフィケーションを施した発現プラスミドを調製した。
工程２）同じ鋳型を用いて、配列番号４０および４５のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ反応精製産物を制限酵素ＰｓｔＩとｃｆｒ１３Ｉで処理し、インサート用二本鎖ＤＮＡを調製した。
工程３）工程２と同じ鋳型を用いて、配列番号４１および４２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ反応精製産物を制限酵素ｃｆｒ１３ＩとＥｃｏＲＩで処理し、インサート用二本鎖ＤＮＡを調製した。
工程４）工程２と工程３で得られた各々の反応精製物を混合し、ライゲーション反応によって、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．４ｄ＿ｔｙｐｅ．２の発現プラスミドを構築した。
（３）Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．４ｄ（ｏｒ　２ｄ）＿ｔｙｐｅ．２
以下のＳＴＥＰ．１～２を経て得られた発現プラスミドを用いて、実施例４と同様にリガンドとなるタンパク質を取得したとき、その一次配列は、配列番号４６に示す通りであり、（２）と一番Ｃ末端側（４番目）のドメインを除いて、Ｋ５８ＧがＫ５８Ｒになった配列となる。つまり、リジンを全てアルギニンに変異したＣドメイン変異体である。固定化のためのＬｙｓを付与したことによって、結果的には、２８個あるリジン残基をアルギニンに置換する変異について、Ｃ末端に位置する１個のリジン残基のみ、置換せずに残した配列となった。この発現プラスミドのコードＤＮＡ配列は配列番号４７に示す。
［ＳＴＥＰ．１］単ドメイン型→２ドメイン型
工程自体は（２）の［ＳＴＥＰ．１］と同じ。使うオリゴヌクレオチドプライマーについて、工程１）では配列番号３１および４８を、工程２）では配列番号４２および４９を使用した。制限酵素については、工程１）ではＰｓｔＩとＸｈｏＩ（タカラバイオ株式会社製）、工程２）では、ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩを使用した。最終的に、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ．２の発現プラスミドを構築した。
［ＳＴＥＰ．２］２ドメイン型→４ドメイン型
工程自体は（２）の［ＳＴＥＰ．２］と同じ。（３）の［ＳＴＥＰ．１］で構築した発現プラスミドを、工程１）の鋳型とした。使うオリゴヌクレオチドプライマーについては、工程１）では配列番号５０および５１を、工程２）では配列番号４５および４８を、工程３）では配列番号４２および４９を使用した。制限酵素については、工程２）ではＰｓｔＩとＸｈｏＩ、工程３）では、ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩを使用した。最終的に、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ．２の発現プラスミドを構築した。
（４）Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．４ｄ（ｏｒ　２ｄ）＿ｔｙｐｅ．２
以下のＳＴＥＰ．０～２を経て得られた発現プラスミドを用いて、実施例４と同様にリガンドとなるタンパク質を取得したとき、その一次配列は、配列番号５２に示す通りであり、（３）のコンストラクトの全てのドメインに変異Ｓ３３Ｅが導入された配列となる。この発現プラスミドのコードＤＮＡ配列は配列番号５３に示す。
［ＳＴＥＰ．０］単ドメイン型への変異の導入
実施例１で得られた発現プラスミド、配列番号２１をコードするＤＮＡを含むｐＧＥＸ－２Ｔ、を鋳型として、配列番号５４および５５のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、クイックチェンジ法にて、変異が導入された発現プラスミドを構築した。
［ＳＴＥＰ．１］単ドメイン型→２ドメイン型
工程自体は（３）のＳＴＥＰ．１と同じである。最終的に、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ．２の発現プラスミドを構築した。
［ＳＴＥＰ．２］２ドメイン型→４ドメイン型
工程自体は（３）のＳＴＥＰ．２と同じである。最終的に、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．４ｄ＿ｔｙｐｅ．２の発現プラスミドを構築した。
上記の発現プラスミドを用いて、実施例４と同様の方法でブレビバチルス・チョウシネンシスＦＹ－１株を形質転換した。得られた形質転換体を用いて、実施例４と同様の方法で連結型Ｃドメイン変異体の大量調製を行った。
（実施例８）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析による新規ポリペプチドのアルカリに対する安定性評価
実施例７で取得したポリペプチドについて、アルカリ性条件下で一定時間インキュベートする処理を行った後の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上のバンドの状態を比較することでアルカリに対する安定性を評価した。
アルカリ処理は次の方法で行った。２００μＭの各種ポリペプチドに対して、最終濃度が０．５ＭとなるようにＮａＯＨを加えて、２５℃にて４、８、および、２４時間インキュベートし、０．５Ｍ　ＨＣｌ（あらかじめｐＨが中性に戻ることを確認した一定容量）をポリペプチド溶液に対して添加することで中和し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルとした。アルカリ処理前（処理後０時間）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルは、ポリペプチド濃度、溶液の組成が同じになるように、アルカリ処理時に加えるＮａＯＨ溶液、および、中和処理時に加えるＨＣｌ溶液を、あらかじめ混合させた溶液を加えることで調製した。電源搭載型ミニスラブ電気泳動槽パジェランに１５％ポリアクリルアミド・プレキャストゲル「ｅ・ＰＡＧＥＬ」（共にアトー株式会社製）を用いて、付属のマニュアル（定法）に従いＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。染色・脱色処理後の電気泳動ゲルを画像読取装置ＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ（バイオ・ラッドラボラトリ－ズ株式会社製）を用いて電子画像化し、バンドの解析（デンシトメトリー）付属のソフトＱｕａｎｔｉｔｙ　Ｏｎｅ（バイオ・ラッドラボラトリ－ズ株式会社製）にて、マニュアルに従って行った。図２にＳＤＳ－ＰＡＧＥの電子画像を示す。
アルカリ処理から２４時間後のバンド強度比（アルカリ処理前を１００％としたときの残存率）について、公知の高アルカリ耐性ポリペプチド（比較例１、Ｃ－Ｇ２９Ａ．２ｄ）が５５．０％であったのに対し、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．２ｄ＿ｔｙｐｅ．２のポリペプチドが６０．９％、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ．２のポリペプチドが９１．６％であった。
本発明のポリペプチドは、厳しいアルカリ条件下でも優れた安定性を示すことが分かった。特に、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ．２のポリペプチドは、０．５Ｍ　ＮａＯＨ、２５℃で４時間インキュベートしても、バンド強度がほとんど変化しない（９９．８％）ことから、様々な局面で極めて実用性の高いポリペプチドであると言える。
（実施例９）連結型Ｃドメイン変異体のゲル濾過クロマトグラフィーによるキャラクタリゼーション
実施例７で得られたＣ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．４ｄ（ｏｒ　．２ｄ）ｔｙｐｅ．１について、ゲル濾過クロマトグラフィーにて、保持時間（ピーク溶出位置）を基にした見かけの分子量の分析を行った。
ゲル濾過カラムとして、「Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬ」（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を、クロマトシステムＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓに接続し、標準緩衝液にて平衡化後、サンプルを添加し、その後再び標準緩衝液を通液し、保持時間（ピーク溶出位置）を求めた。全ての操作は、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎに固定し、連続的に実施した。見かけの分子量を保持時間から算出するための検量線を作成するため、上述と同じ操作にて３種類の分子量マーカー・タンパク質（表４参照）の保持時間を求めた。縦軸ｙをｌｏｇ（ＭＷ）、横軸ｘを保持時間（ｍｉｎ）として、分子量マーカーのデータをプロットしたところ、検量線ｙ＝－０．０８３４ｘ＋６．５７９４が作成できた（ＭＷは分子量［Ｄａ］）。この検量線に従って、見かけの分子量も求めた。
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．２ｄ＿ｔｙｐｅ．１およびＣ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．４ｄ＿ｔｙｐｅ．１の保持時間、並びに見かけの分子量を、同じ２ドメイン型、４ドメイン型のＣ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅと比較する形で、表４にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　
本発明のタンパク質は、Ｌｙｓを置換していないＣドメイン変異体に比べて、保持時間が長くなる傾向が見られた。一般に、実際の分子量と、保持時間から見積もられた見かけの分子量はその値が近ければ近いほど、標準的な球状タンパク質であると考えられる。一方、実際の分子量よりも見かけの分子量が大きければ大きい程、標準的な球状タンパク質から外れた形状（例えば立体的に広がっている）であると考えられる。プロテインＡ（複数ドメイン型Ｃドメイン）は、標準的な球状タンパク質からは外れた形状と推測されており、本発明で得られた変異体もその傾向は変わらない。しかし、変異導入によって見かけの分子量が小さくなっている傾向が明確に認められ、変異導入によって全体として少しコンパクトな三次元構造を取る可能性が示唆された。本発明のタンパク質は、コンパクトな三次元構造を取るために、より複雑に折りたたまれている可能性がある。
（実施例１０）連結型Ｃドメイン変異体固定化担体の試作および評価
実施例７で得られた各種変異体に関して、実施例５と同様の手法にて、固定化担体を試作し、実施例６と同様の手法にて、試作アフィニティー分離マトリックスのヒトＩｇＧ結合能評価を実施した。実施例６の発現プラスミドについては、２連結型（２ｄ）と４連結型（４ｄ）の両方を調製したが、ブレビバチルス発現系での調製は、（１）は４連結型、（２）～（４）は２連結型のみ、リガンド調製を実施した。なお、アフィニティー分離マトリックスの試作に用いたリガンド溶液の濃度については、常に１０ｍｇ／ｍＬではなかった。詳細については省略し、重要なリガンド固定化量についてのみ、表中に記載する。
実施例７の（１）Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．４ｄ＿ｔｙｐｅ．１の試作アフィニティー分離マトリックスのヒトＩｇＧ結合能評価結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　
本発明によって得られた連結型Ｃドメイン変異体を固定化した試作アフィニティー分離マトリックスは、比較対照に対して、リガンド固定化量が有意に低いにもかかわらず、有意に高い抗体ｄＢＣを示した。
実施例７の（２）Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．２ｄ＿ｔｙｐｅ．２、および、（３）Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ．２を固定化した、各々の試作アフィニティー分離マトリックスのヒトＩｇＧ結合能評価結果を表６に示す。なお、表の抗体への親和定数は、実施例３に従って測定した値である。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　
各々の試作アフィニティー分離マトリックスは、比較３に対して、ほぼ同等のリガンド固定化量でありながら、有意に高い抗体ｄＢＣを示した。本発明で得られた連結型リガンドは、連結様式（ドメイン間のリンカー残基）が多少異なっても、また、リジン置換変異の種類が多少異なっても、一定のリガンド固定化量あたりの抗体結合容量を有意に向上させることが可能であるという点で、同様の効果をもたらすことを示す実験結果と考えられる。さらに、連結するドメイン数が変わっても、抗体ｄＢＣを向上する効果は発揮されることを示す実験結果と考えられる。単ドメインのときに比べて抗体ｄＢＣの向上の度合いはやや低いが、比較している数値は、抗体が結合する容量（キャパシティー）なので、向上の度合いがドメイン数や固定化用基材などによって異なるのは、むしろ当然の結果と考えられる。なお、表の抗体への親和定数は、実施例３に従って測定した値である。
（実施例１１）２ドメイン型各種Ｃドメイン変異体の調製
実施例１において取得した、配列番号１０（Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｅ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｈ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ）をコードする発現プラスミドを鋳型として、実施例１の表１に示したプライマー、および、表７に示したプライマーを利用して、実施例１に記載の配列番号２１～２５の変異体とは配列が異なる新たな変異体の発現プラスミドを取得した。変異の導入は、実施例１と同様にクイックチェンジ法によって導入した。表７には、表１に未記載の、２種類のプライマーの組み合わせ、および、導入されるアミノ酸変異との関係をまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　
　
発現される変異体は、以下の通りである。
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｉ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ（配列番号５８）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｄ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ（配列番号５９）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｉ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ（配列番号６０）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｈ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ（配列番号６１）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｅ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ（配列番号６２）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｈ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ（配列番号６３）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｄ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｇ．１ｄ（配列番号６４）
上記の変異体を発現する発現プラスミド、および、実施例１に記載の配列番号２２、２４、および、２５の発現プラスミドを利用して、実施例７の（３）の［ＳＴＥＰ．１］に記載の手法にて、２ドメイン型（２ｄ＿ｔｙｐｅ．２）の発現プラスミドを調製した。以後の実施例に用いた連結型Ｃドメイン変異体は、実施例７で取得済みのプラスミドを加えて、以下の通りである。
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号６５）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号６６）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｄ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｈ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号６７）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｅ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号６８）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｉ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号６９）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｄ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号７０）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｉ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号７１）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｈ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号７２）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｅ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号７３）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｈ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号７４）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｄ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号７５）
上記の発現プラスミドを用いて、実施例４と同様の方法で、ブレビバチルス・チョウシネンシスＦＹ－１組換え菌を用いて変異体を発現・精製した。
（実施例１２）２ドメイン型各種Ｃドメイン変異体のヒトＩｇＧとの親和性の解析
２ドメイン型各種Ｃドメイン変異体のヒトＩｇＧとの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、実施例３に記載の手法に従って解析した。なお、２ドメイン型各種Ｃドメイン変異体は、ランニング緩衝液を用いて、０．１～１０００ｎＭの範囲で異なる濃度の溶液を３～６種類調製し、センサーチップに添加した。２ドメイン型は単ドメイン型とは結合モード（量論比）が異なるが、実施例３と同様に、１：１の結合モデルと仮定してフィッティングを行った。算出したヒトＩｇＧに対する親和定数を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　
ヒトＩｇＧに対する親和定数は、いずれのタンパク質に関しても、５．０×１０８Ｍ～５．０×１０９Ｍの範囲に収まった。この結果は、リジン残基を他のアミノ酸で置換する変異の組み合わせが多様性に富むことが示された。なお、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２の抗体親和定数の値が表５（７．５×１０８Ｍ－１）と異なるが、これは実験のセンサーチップを新しく作り直したことが原因と考えられ、抗体親和定数においては想定される範囲の誤差にすぎない。
実施例１１で得られた２ドメイン型Ｃドメイン変異体について、実施例８と同様に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を利用した方法で、アルカリ耐性を評価した。図３にＳＤＳ－ＰＡＧＥの電子画像を示す。
アルカリ処理から２４時間後のバンド強度比は、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２は７３．４％、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｉ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２は７９．０％、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｉ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２は８５．６％、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｈ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２は８２．８％であった。これらのポリペプチドが、厳しいアルカリ条件下でも優れた安定性を有することが示された。
（実施例１３）Ｓｅｒ－３３／Ａｓｐ－３６に変異が導入された連結型Ｃドメイン変異体の調製および評価
Ｓｅｒ－３３やＡｓｐ－３６に変異が入った連結型Ｃドメイン変異体をコードする、複数種のコンストラクトを、実施例７の（４）と同様の手法で調製した。導入した変異の種類と、実施例７の（４）の［ＳＴＥＰ．０］の工程で利用したオリゴヌクレオチドプライマーの配列を、表９に示す。なお、本実施例における、当該ステップで利用した鋳型プラスミドの配列は、配列番号２１、２２、および６３のいずれかのコンストラクトの発現プラスミドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 　
実際に調製した２ドメイン型各種Ｃドメイン変異体、および、４ドメイン型各種Ｃドメイン変異体は、実施例７の（４）で調製した変異体を含めて下記の通りである。
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号８８）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｄ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｌ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号８９）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｅ／Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ｄ３６Ｉ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．２ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号９０）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．４ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号５２）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｑ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．４ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号９１）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｈ／Ｋ３５Ｈ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．４ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号９２）
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｈ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．４ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号９３）
実施例４と同様の方法で、ブレビバチルス・チョウシネンシスＦＹ－１組換え菌を用いて変異体を発現および精製した。
各種Ｃドメイン変異体のヒトＩｇＧとの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、実施例３に記載の手法で解析した。なお、各種Ｃドメイン変異体は、ランニング緩衝液を用いて、０．１～１０００ｎＭの範囲で異なる濃度の溶液を３～６種類調製し、センサーチップに添加した。２ドメイン型は単ドメイン型とは結合モード（量論比）が異なるが、実施例３と同様に、１：１の結合モデルと仮定してフィッティングを行った。算出したヒトＩｇＧに対する親和定数を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 　
２ドメイン型Ｃドメイン変異体については、ヒトＩｇＧに対する親和定数は、いずれのタンパク質に関しても、１．０×１０８Ｍ～１．０×１０９Ｍの範囲に収まった。４ドメイン型Ｃドメイン変異体については、２ドメイン型よりもさらに抗体への結合が強く解離速度が極めて遅いため、解離速度定数（ｋｏｆｆ）の正確な算出が難しく、抗体親和定数（ＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）での比較は難しかった。したがって、結合速度定数（ｋｏｎ）によって比較した。各々の４ドメイン型Ｃドメイン変異体の結合速度定数は、ほぼ同程度であった。この結果は、本発明における変異体が、配列中のＳｅｒ－３３の変異アミノ酸の種類、Ｌｙｓ残基への置換アミノ酸の種類、および、その組み合わせが変わっても、同様の機能を発揮することを示す。
これらの各種２ドメイン型Ｃドメイン変異体を使用して、実施例６と同様の方法でアフィニティー分離マトリックスを作製し、実施例６と同様の方法でアフィニティー分離マトリックスのヒトＩｇＧ結合能を評価した。試作したアフィニティー分離マトリックスの各種２ドメイン型Ｃドメイン変異体の固定化量、および、ヒトＩｇＧ結合能の評価結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 　
試作したアフィニティー分離マトリックスは、比較対照に対して、リガンド固定化量が同等程度であるにもかかわらず、有意に高い抗体ｄＢＣを示した。プロテインＡの免疫グロブリン結合性ドメインに含まれるＬｙｓ以外の複数のアミノ酸が置換されている場合でも、全てのＬｙｓ残基に対してアミノ酸置換変異を導入することにより、本発明の効果を奏することが示された。
（実施例１４）試作アフィニティー分離マトリックスのアルカリ耐性評価
リガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスのアルカリ耐性を、アルカリ処理後の抗体結合容量を基準に評価した。
アフィニティー分離マトリックスは、実施例１０で得られた表６の試作４のマトリックス、および、実施例１３で得られた表１１の試作５～７（比較３も含む）のマトリックスを使用した。０．５Ｍ　ＮａＯＨを０．１ｍＬ／ｍｉｎで１時間流し、その後標準緩衝液を５ＣＶ流して平衡化するサイクルを５回繰返し、その後、実施例６と同様の方法で、抗体ｄＢＣを測定した。アルカリ処理後の抗体ｄＢＣ測定結果を、アルカリ処理前の抗体ｄＢＣと比較して、表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 　
以上の結果から、本発明で得られたアフィニティー分離マトリックスは、０．５Ｍ　ＮａＯＨで５時間処理しても、抗体結合容量の低下が１０％以下に押さえられることが分かった。特許文献２に記載されているように、従来は、リジンのアミノ基を利用してリガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスは、固定化点であるリジン残基数が多ければ多い方がアルカリ等に対する化学的安定性が高いことが定説であった。しかし、固定化点がリガンド中に１４個ある比較３のマトリックスと比較して、固定化点がリガンド中に１個しかない試作４～７のマトリックスが、ほぼ同等のアルカリ耐性を有することが示された。
（実施例１５）３ドメイン型Ｃドメイン変異体の調製及び評価
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｌ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．３ｄ＿ｔｙｐｅ２（ただしＣ末端側（３番目）のドメインはＬｙｓ－５８のまま、配列番号９４）をコードし、５’末端にＮｃｏＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号９５）を外注によって全合成した（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社製）。
同様に、リガンドのＣ末端にＬｙｓが入っており、かつ、Ｎ末端側から１、２番目のドメインのＣ末端（ドメイン間のリンカー部分）にもＬｙｓが入っている、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｌ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ．３ｄ＿ｔｙｐｅ２（配列番号９６）をコードするＤＮＡ（配列番号９７）も外注によって全合成した。
次に、これらのＤＮＡをブレビバチルス発現用ベクターｐＮＫ３２６０’に挿入してリガンド発現プラスミドを調製した。なお、ベクターｐＮＫ３２６０’は、ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩサイトだけでなく、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩ（共にタカラバイオ株式会社製）サイトでも挿入可能である。
この発現プラスミドを用いて、ブレビバチルス・チョウシネンシスＦＹ－１株の形質転換を行い、実施例５と同様の方法で、リガンドを担体に固定化したアフィニティー分離マトリックスを調製した。実施例６と同様の方法で、試作アフィニティー分離マトリックスのヒトＩｇＧ結合能を評価した。ただし、ヒトＩｇＧ溶液を添加するときの流速は、１．０ｍＬ／ｍｉｎとした。その結果を表１３に示す。なお、ヒトＩｇＧへの親和定数は、実施例３に従って測定した値であり、リガンド固定化量は、実施例５に従って測定した値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 　
　
３ドメイン型Ｃドメイン変異体も高い抗体ｄＢＣを有することが示された。また、リガンドのＣ末端で固定化されていれば、ドメイン間のリンカー部分で固定化されても、高い抗体ｄＢＣを有することが示された。
（比較例１）Ｃ－Ｇ２９ＡおよびＣ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ
Ｃ－Ｇ２９Ａ．１ｄ、Ｃ－Ｇ２９Ａ．２ｄ、Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄ、Ｃ－Ｇ２９Ａ．４ｄ、および、Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．２ｄの発現プラスミドの調製方法については、公開特許文献（国際公開第２０１０／１１０２８８号パンフレット）の記載に準ずる。詳細は省略するが、記載のない以下の点について補足する。
（１）Ｃ－Ｇ２９Ａ．１ｄの発現プラスミドは、コードＤＮＡをｐＧＥＸ－２Ｔに挿入する形で調製した。
（２）変異Ｓ３３Ｅの導入は、クイックチェンジ法にて実施した。
（３）２ドメイン型および４ドメイン型の発現プラスミド調製は、５ドメイン型の発現プラスミドを鋳型としたＰＣＲ法で、必要なドメイン数に該当する領域のみ増幅し、ベクターｐＮＫ３２６０’に再挿入することで調製した。
Ｃ－Ｇ２９Ａ．１ｄは、発現プラスミドをＨＢ１０１に形質転換し、実施例２と同様の方法にて調製した。ヒトＩｇＧへの結合力評価は実施例３と同様の方法にて実施した。Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．１ｄ、Ｃ－Ｇ２９Ａ．２ｄ、Ｃ－Ｇ２９Ａ．４ｄ、および、Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．２ｄは、各々の発現プラスミドを用いて、実施例４と同様の手法にて調製した。実施例５と同様の手法にて、固定化担体を試作し、実施例６と同様の手法にて、試作アフィニティー分離マトリックスのヒトＩｇＧ結合能評価を実施した。なお、アフィニティー分離マトリックスの試作に用いたリガンド溶液の濃度については、常に１０ｍｇ／ｍＬではなかった。

Claims (17)

  1. プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインのいずれかのドメインに由来したアミノ酸配列の全てのＬｙｓ（リジン残基）にアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有し、かつ、末端にＬｙｓを付与した配列を有するタンパク質。
  2. 置換変異導入前のアミノ酸配列が、プロテインＡの複数のドメインに由来したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 置換変異導入前のアミノ酸配列が、
    配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列、または、
    配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列に、下記（１）～（４）；
    （１）各ドメインにおけるＣドメインの２９位に対応するアミノ酸残基が、
    Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
    （２）各ドメインにおけるＣドメインの３３位に対応するアミノ酸残基が、
    Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
    （３）各ドメインにおけるＣドメインの３６位に対応するアミノ酸残基が、
    Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
    （４）各ドメインにおけるＣドメインの３７位に対応するアミノ酸残基が、
    Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
    の少なくとも１つの変異を導入したアミノ酸配列である、
    請求項１または２に記載のタンパク質。
  4. 全てのＬｙｓに対して導入されるアミノ酸置換変異の半数以上が、Ａｒｇへの置換変異である、請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  5. 全てのＬｙｓに対して導入されるアミノ酸置換変異の全てが、Ａｒｇへの置換変異である、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質。　
  6. 以下に示すアミノ酸残基；
    Ｇｌｎ－９、Ｇｌｎ－１０、Ｐｈｅ－１３、Ｔｙｒ－１４、Ｌｅｕ－１７、Ｐｒｏ－２０、Ａｓｎ－２１、Ｌｅｕ－２２、Ｇｌｎ－２６、Ａｒｇ－２７、Ｐｈｅ－３０、Ｉｌｅ－３１、Ｌｅｕ－３４、Ｐｒｏ－３８、Ｓｅｒ－３９、Ｌｅｕ－４５、Ｌｅｕ－５１、Ａｓｎ－５２、Ｇｌｎ－５５、およびＰｒｏ－５７（残基番号はＣドメインに対応する）のうち、
    ９０％以上が保持されており、かつ、変異導入前のアミノ酸配列と比較した配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  7. プロテインＡの複数のドメインが、リンカーにより連結されている、
    請求項２～６のいずれかに記載のタンパク質。
  8. リンカーがＬｙｓを含む、
    請求項７に記載のタンパク質。
  9. 請求項１～８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
  10. 請求項９に記載のＤＮＡを含むベクター。
  11. 請求項１０に記載のベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
  12. 請求項９に記載のＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成系、または、請求項１１に記載の形質転換体を用いる、請求項１～８のいずれか１項に記載のタンパク質の製造方法。
  13. 請求項１～８のいずれか１項に記載のタンパク質をアフィニティーリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化して得られる、アフィニティー分離マトリックス。
  14. 免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合することを特徴とする、請求項１３に記載のアフィニティー分離マトリックス。
  15. 免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質が免疫グロブリンＧ、または、免疫グロブリンＧ誘導体である、請求項１４に記載のアフィニティー分離マトリックス。
  16. 請求項１～８のいずれか１項に記載のタンパク質をアフィニティーリガンドとして水不溶性の基材からなる担体に固定することからなる、請求項１３～１５のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックスの製造方法。
  17. 請求項１３～１５のいずれか１項に記載のアフィニティー分離マトリックスに免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を吸着させることを含む、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質の精製方法。
    　
    　
    　
    　
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