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CN115850408A - 一种多肽、融合型多聚体蛋白质及其用途 - Google Patents

一种多肽、融合型多聚体蛋白质及其用途 Download PDF

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CN115850408A
CN115850408A CN202211064221.6A CN202211064221A CN115850408A CN 115850408 A CN115850408 A CN 115850408A CN 202211064221 A CN202211064221 A CN 202211064221A CN 115850408 A CN115850408 A CN 115850408A
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polypeptide
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amino acid
acid sequence
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CN202211064221.6A
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李延军
李刚
顾桐年
张建涛
刘龙
雷晓菊
刘琼
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Original Assignee
Sunresin New Materials Co Ltd
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Abstract

本发明涉及蛋白质生物功能技术领域，具体涉及一种多肽、融合型多聚体蛋白质及其用途，多肽选自：(1)、与SEQ ID NO.1所示的蛋白A的天然C结构域相比，在选自第16位、第25位、第29位、第49位和第58位中至少一个位置具有取代突变；第16位取代突变为亮氨或缬氨酸；第25位取代突变为赖氨酸、精氨酸、组氨酸或色氨酸；第29位取代突变为丙氨酸、亮氨酸或苏氨酸；第49位取代突变为精氨酸或组氨酸；第58位取代突变为甘氨酸、异亮氨酸或丙氨酸；(2)、与(1)中的多肽具有至少80％以上同源性并保留第16位、第25位、第29位、第49位和第58位中至少一个位置取代突变的多肽；多肽具有高碱耐受性和高载量。

Description

一种多肽、融合型多聚体蛋白质及其用途
技术领域
本发明涉及蛋白质生物功能技术领域，具体涉及一种多肽、融合型多聚体蛋白质及其用途。
背景技术
截至2022年2月，FDA累计批准109款抗体药物，全球抗体药物市场连续8年保持10％以上的增速，2021年首次突破2000亿美元，相比2020年增长16.5％。抗体的分离在抗体药物的生产中至关重要，蛋白A亲和纯化是抗体分离纯化的关键步骤，目前蛋白A填料对碱性条件比较敏感，洗脱条件过于苛刻，市场对抗体纯化规模的不断扩大，对其载量和耐碱性等的性能要求越来越高。
金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A，SPA)，简称蛋白A，是金黄色葡萄球菌的一种细胞壁蛋白质。1983年SPA基因被Duggleby等克隆并在大肠杆菌中表达(Duggleby，C.J and Jones，SA：cloning and expression of the Staphylococcusaureus protein A gene in Escheric hia coli.Nucl Acids Res.11(1983)3065-3076；Lofdahl，S.，Guss，B.，et al；Gene for Staphylococcal proteinA.Proc.Natl.Acid.Sci.USA 80(1983)697-701)。SPA蛋白分子由E、D、A、B和C五个高度同源的结构域和X结构域共六个结构域组成。由于SPA上的E、D、A、B和C五个高度同源的结构域都具有与IgG结合的能力，且都可以与大多数哺乳动物IgG的Fc和Fab区结合(Jansson B,Uhlén M,Nygren PA.All individual domains of staphylococcal protein A show Fabbinding.FEMS Immunol Med Microbiol.1998Jan；20(1):69-78.)，因此，SPA作为抗体纯化的一种亲和配基偶联到固相载体上，被广泛应用于抗体的分离纯化。
由于在抗体生产过程中，样品中含有脂类、核酸、蛋白质、多糖、细胞碎片等杂质或被病毒细菌污染，此类杂质在纯化抗体的过程中可能被蛋白A亲和填料非特异性吸附，进而污染填料，另外蛋白A层析柱也需要定期原位清洗(Clean In Place,CIP)。为了提高蛋白A填料的使用寿命，保证填料使用过程中的柱效，所以需要对填料进行洗杂和重生。目前使用最广泛的方案是用0.1-1M的NaOH进行层析柱原位清洗。然而，天然蛋白A不能耐受浓度高于0.1M的NaOH(Garshasb,Rigi,Samira,et al.A comprehensive review onstaphylococcal protein A(SpA):Its production and applications.[J].Biotechnology&Applied Biochemistry,2019.)，基因工程的发展使得重组蛋白A的耐碱性逐渐提高，但是工业生产制备抗体药物时消耗量大，使用寿命有限导致生产成本增加，因此更高载量，更高耐碱的蛋白A填料是抗体生产厂家追求的必然趋势，也是填料生产企业发展的方向。
抗体一般是由Fab和Fc结构域组成，抗体Fab区与SPA的相互作用会严重影响洗脱pH值，导致需要更低的pH值才能实现IgG的解离和洗脱，SPA分子的B结构域29位甘氨酸替换为丙氨酸获得的B结构域突变体，几乎不与Fab区发生相互作用，B结构域23位的天冬酰胺被苏氨酸取代时，B结构域突变体的耐碱性明显提高(Amritkar V,Adat S,Tejwani V,etal.Engineering Staphylococcal Protein A for high-throughput affinitypurification of monoclonal antibodies[J].Biotechnology advances,2020:107632.)。然而，改造后的SPA分子仍然难以满足目前对SPA分子更高载量，更高耐碱的需求。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种多肽、融合型多聚体蛋白质及其用途，获得的融合型多聚体蛋白质具有更高的载量，更高耐碱性。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
一种多肽，所述多肽选自：
(1)、与SEQ ID NO.1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽在选自第16位、第25位、第29位、第49位和第58位中的至少一个位置上具有取代突变；
所述第16位取代突变为亮氨酸或者缬氨酸；
所述第25位取代突变为赖氨酸或者精氨酸或者组氨酸或者色氨酸；
所述第29位取代突变为丙氨酸或者亮氨酸或者苏氨酸；
所述第49位取代突变为精氨酸或者组氨酸；
所述第58位取代突变为甘氨酸或者异亮氨酸或者丙氨酸；
(2)、与(1)中所述的多肽具有至少80％以上同源性并保留了所述的第16位、第25位、第29位、第49位和第58位中的至少一个位置上的取代突变的多肽。
可选的，所述第16位取代突变为亮氨酸；和/或
所述第25位取代突变为赖氨酸；和/或
所述第29为取代突变为丙氨酸；和/或
所述第49位取代突变为精氨酸；和/或
所述第58位取代突变为甘氨酸。
可选的，第58位具有所述的取代突变，并在选自所述的第16位、第25位、第29位和第49位中至少一个位置上具有所述的取代突变；或
所述多肽在第49位具有所述的取代突变，并在选自所述的第16位、第25位、第29位和第58位中至少一个位置上具有所述的取代突变；或
所述多肽在第29位具有所述的取代突变，并在选自所述的第16位、第25位、第49位和第58位中至少一个位置上具有所述的取代突变；或
所述多肽在第25位具有所述的取代突变，并在选自所述的第16位、第29位、第49位和第58位中至少一个位置上具有所述的取代突变；或
所述多肽在第16位具有所述的取代突变，并在选自所述的第25位、第29位、第49位和第58位中至少一个位置上具有所述的取代突变；
可选的，所述的多肽在第16位、第25位、第29位、第49位和第58位的位置上具有取代突变；或
可选的，所述的多肽在第16位、第25位、第49位和第58位的位置上具有取代突变；或
可选的，所述的多肽在第49位和第58位的位置上具有取代突变；或
可选的，所述的多肽在第29位、第49位和第58位的位置上具有取代突变；或
可选的，所述的多肽在第16位、第25位和第29位的位置上具有取代突变；或
可选的，所述的多肽在第16位和第25位的位置上具有取代突变；或
可选的，所述的多肽在第49位的位置上具有取代突变；或
可选的，所述的多肽在第25位的位置上具有取代突变。
一种融合型多聚体蛋白质，包括由所述的多肽融合形成的。
所述的融合型多聚体蛋白质，还包括多肽B和/或多肽Zmb；
所述多肽B，选自：
a、具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
b、具有与a中如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％以上同源性的氨基酸序列；
所述多肽Zmb，选自：
c、在a中如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中至少一个位置插入氨基酸序列ML；所述氨基酸序列ML的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
d、在b中所述的氨基酸序列中至少一个位置插入氨基酸序列ML；
可选的，所述的多肽Zmb的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述的融合型多聚体蛋白质，所述的多肽记为多肽Cm；所述融合型多聚体蛋白质包括至少1条所述的多肽Cm，和/或至少1条所述的多肽Zmb；
可选的，所述融合型多聚体蛋白质包括1-6条所述的多肽Cm，和/或1-4条所述的多肽Zmb；
可选的，所述融合型多聚体蛋白质包括4条所述的多肽Cm，和/或2条所述的多肽Zmb。
所述的融合型多聚体蛋白质，还包括至少一条功能性多肽FLD，选自：
A、具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；
B、具有与A中如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列具有至少80％以上同源性的氨基酸序列；
可选的，所述的功能性多肽FLD位于多肽Cm和多肽Zmb之间；
可选的，所述的融合型多聚体蛋白质从N端到C端依次包括4个多肽Cm、1个功能性多肽FLD和2个多肽Zmb。
生物材料，包括如下任意一种：
1)编码所述的多肽或所述的融合型多聚体蛋白质的核酸分子；可选的，所述核酸分子为DNA或RNA；
2)表达所述的多肽或所述的融合型多聚体蛋白质的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；
3)含1)所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；
4)含2)或3)中所述的表达盒的重组载体、重组微生物或转基因细胞系；
5)含2)或3)或4)中所述的重组载体的宿主细胞；
可选的，所述重组载体为由大肠杆菌表达载体pET-30a(+)构建而成；
可选的，所述宿主细胞为大肠杆菌，可选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
所述的多肽或所述的融合型多聚体蛋白质在抗体检测、分离或纯化中的应用。
一种亲和层析介质，包括所述的融合型多聚体蛋白质和亲和层析介质载体；
可选的，所述亲和层析介质载体包括琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、带羟基的高分子聚合物或硅胶。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供的一种多肽，所述多肽选自：(1)、与SEQ ID NO.1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽在选自第16位、第25位、第29位、第49位和第58位中的至少一个位置上具有取代突变；所述第16位取代突变为亮氨酸或者缬氨酸；所述第25位取代突变为赖氨酸或者精氨酸或者组氨酸或者色氨酸；所述第29为取代突变为丙氨酸或者亮氨酸或者苏氨酸；所述第49位取代突变为精氨酸或者组氨酸；所述第58位取代突变为甘氨酸或者异亮氨酸或者丙氨酸；(2)、与(1)中所述的多肽具有至少80％以上同源性并保留了所述的第16位、第25位、第29位、第49位和第58位中的至少一个位置上的取代突变的多肽；采用多肽具有高碱耐受性和高载量，使得采用该多肽制备的融合型多聚体蛋白质具有更高的载量，更高耐碱性。
2、本发明提供的融合型多聚体蛋白质，包括由所述的多肽融合形成的，具有更高的载量，更高耐碱性。
3、本发明提供的融合型多聚体蛋白质，还包括多肽Zmb，多肽Zmb的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，实验结果显示所述的多肽Zmb结构域制备填料纯化抗体时，洗脱缓冲液的pH值由3.3提高至4.3。
4、本发明提供的融合型多聚体蛋白质，还包括至少一条功能性多肽FLD，所述FLD的插入使得融合型多聚体蛋白质三维结构的空间位阻效应降低，从而使其能够重新结合IgG，进而提高融合型多聚体蛋白质的整体载量。
5、本发明提供的亲和层析介质，包括所述的融合型多聚体蛋白质和亲和层析介质载体；所述的融合型多聚体蛋白质可以与层析介质载体偶联成为亲和层析介质用于抗体的检测、分离或纯化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例5中BL21-pET30a-CmZmb菌液SDS-PAGE凝胶电泳结果；图中，泳道1为乳糖诱导前；泳道2为乳糖诱导后；泳道3为裂解液上清1；泳道4为裂解液上清2；泳道5为裂解液上清3；泳道6为洗脱液1；泳道7为洗脱液2；泳道8为蛋白marker(由陕西普罗安蒂生物科技发展有限公司提供，货号：10225-1)；
图2是本发明实施例5中BL21-pET30a-CmZmb菌液的纯化蛋白结果；图中，泳道1为裂解液上清2；泳道2为流穿液；泳道3为淋洗液；泳道4为4％B液洗脱杂质；泳道5为8％B液洗脱杂质；泳道6为40％B液洗脱目标蛋白；泳道7为100％B液洗脱目标蛋白。
图3是本发明实验例1中融合型多聚体蛋白质动态载量测试结果；
图4是本发明实验例2中融合型多聚体蛋白质耐碱性动态载量测试结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中的多肽、融合型多聚体蛋白质的编码基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
在本发明中，氨基酸残基可以为下列简写符号：赖氨酸(K)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)。
实施例1多肽Cm
1、为了探索多肽Cm的耐碱性的方案，本实施例设计了一系列的多肽Cm，所述多肽具体如下：
多肽C(天然)：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
多肽Cm(K58G)：与SEQ ID NO.1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽仅在第58位赖氨酸(K)取代突变为甘氨酸(G)。
多肽Cm(K49R)：与SEQ ID NO.1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽仅在第49位的赖氨酸(K)取代突变为精氨酸(R)。
多肽Cm(G29A)：与SEQ ID NO.1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽仅在第29位甘氨酸(G)取代突变为丙氨酸(A)。
多肽Cm(E25K)：与SEQ ID NO.1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽仅在第25位的谷氨酸(E)取代突变为赖氨酸(K)。
多肽Cm(I16L)：与SEQ ID NO.1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽仅在第16位的异亮氨酸(I)取代突变为亮氨酸(L)。
多肽Cm(K58G，K49R，G29A，E25K，I16L)：与SEQ ID NO.1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽为：
在第58位赖氨酸(K)取代突变为甘氨酸(G)；
在第49位的赖氨酸(K)取代突变为精氨酸(R)；
在第29位甘氨酸(G)取代突变为丙氨酸(A)；
在第25位的谷氨酸(E)取代突变为赖氨酸(K)；
在第16位的异亮氨酸(I)取代突变为亮氨酸(L)。
多肽Cm(K58G，K49R，E25K，I16L)：与SEQ ID NO.1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽为：
在第58位赖氨酸(K)取代突变为甘氨酸(G)；
在第49位的赖氨酸(K)取代突变为精氨酸(R)；
在第25位的谷氨酸(E)取代突变为赖氨酸(K)；
在第16位的异亮氨酸(I)取代突变为亮氨酸(L)。
多肽Cm(K58G，K49R)：与SEQ ID NO.1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽为：
在第58位赖氨酸(K)取代突变为甘氨酸(G)；
在第49位的赖氨酸(K)取代突变为精氨酸(R)。
多肽Cm(K58G，K49R，G29A)：与SEQ ID NO.1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽为：
在第58位赖氨酸(K)取代突变为甘氨酸(G)；
在第49位的赖氨酸(K)取代突变为精氨酸(R)；
在第29位甘氨酸(G)取代突变为丙氨酸(A)。
多肽Cm(G29A，E25K，I16L)：与SEQ ID NO.1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽为：
在第29位甘氨酸(G)取代突变为丙氨酸(A)；
在第25位的谷氨酸(E)取代突变为赖氨酸(K)；
在第16位的异亮氨酸(I)取代突变为亮氨酸(L)。
多肽Cm(E25K，I16L)：与SEQ ID NO.1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽为：
在第25位的谷氨酸(E)取代突变为赖氨酸(K)；
在第16位的异亮氨酸(I)取代突变为亮氨酸(L)；
进一步的，上述多肽Cm中涉及的第16位的取代突变还可以为缬氨酸；
涉及第25位的取代突变还可以为精氨酸或者组氨酸或者色氨酸；
涉及第29位的取代突变为亮氨酸或者苏氨酸；
涉及第49位的取代突变为组氨酸；
涉及第58位的取代突变为异亮氨酸或者丙氨酸。
实施例2
本实施例设计了多肽Zmb，所述多肽Zmb如下：
多肽B：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
多肽Zmb：在如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中的第20位和第21位氨基酸之间插入氨基酸序列ML，所述氨基酸序列ML的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，即多肽Zmb的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例3
本实施例设计了功能性多肽FLD，所述功能性多肽FLD的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。
实施例4融合型多聚体蛋白质
本实施例利用实施例1-3的多肽设计了一系列的融合型多聚体蛋白质，具体如下：
CC：从N端到C端依次由6个多肽C(天然)融合而成的氨基酸序列，即排列方式为：C-C-C-C-C-C。
CmCm(K58G)：从N端到C端依次由6个多肽Cm(K58G)融合而成的氨基酸序列。
CmCm(K49R)：从N端到C端依次由6个多肽Cm(K49R)融合而成的氨基酸序列。
CmCm(G29A)：从N端到C端依次由6个多肽Cm(G29A)融合而成的氨基酸序列。
CmCm(E25K)：从N端到C端依次由6个多肽Cm(E25K)融合而成的氨基酸序列。
CmCm(I16L)：从N端到C端依次由6个多肽Cm(I16L)融合而成的氨基酸序列。
CmCm(K58G，K49R，G29A，E25K，I16L)：从N端到C端依次由6个多肽Cm(K58G，K49R，G29A，E25K，I16L)融合而成的氨基酸序列。
CmCm(K58G，K49R，E25K，I16L)：从N端到C端依次由6个多肽Cm(K58G，K49R，E25K，I16L)融合而成的氨基酸序列。
CmCm(K58G，K49R)：从N端到C端依次由6个多肽Cm(K58G，K49R)融合而成的氨基酸序列。
CmCm(K58G，K49R，G29A)：从N端到C端依次由6个多肽Cm(K58G，K49R，G29A)融合而成的氨基酸序列。
CmCm(G29A，E25K，I16L)：从N端到C端依次由6个多肽Cm(G29A，E25K，I16L)融合而成的氨基酸序列。
CmCm(E25K，I16L)：从N端到C端依次由6个多肽Cm(E25K，I16L)融合而成的氨基酸序列。
CDB：从N端到C端依次由4个多肽C(天然)、1个功能性多肽FLD、2个多肽B融合而成的氨基酸序列，排列方式为：C-C-C-C-FLD-B-B。
CB：从N端到C端依次由4个多肽C(天然)、2个多肽B融合而成的氨基酸序列，排列方式为：C-C-C-C-B-B。
CmZmb：从N端到C端依次由4个多肽Cm、1个功能性多肽FLD、2个多肽Zmb融合而成的氨基酸序列，排列方式为：Cm-Cm-Cm-Cm-FLD-Zmb-Zmb。其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，其基因序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步的，上述融合型多聚体蛋白质中多肽Cm涉及的第16位的取代突变还可以为缬氨酸；
涉及第25位的取代突变还可以为精氨酸或者组氨酸或者色氨酸；
涉及第29位的取代突变为亮氨酸或者苏氨酸；
涉及第49位的取代突变为组氨酸；
涉及第58位的取代突变为异亮氨酸或者丙氨酸。
实施例5融合型多聚体蛋白质的制备
本实施例将实施例4中设计的融合型多聚体蛋白质进行制备，制备的流程如下：
(1)重组载体的构建
将融合型多聚体蛋白质的编码基因和表达载体pET-30a(+)经过NdeI(购自生工生物工程(上海)有限公司，B600120)和HindIII(购自生工生物工程(上海)有限公司，B600184)双酶切切，回收相应片段后连接(DNA凝胶回收试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司，D0056)，连接产物与大肠杆菌TOP10感受态细胞混匀，冰上放置30min，水浴锅42℃热激90s，冰上放置3min进行转化，加入100μl室温LB液体培养基，在摇床中37℃，220转震荡培养60分钟，将菌液混匀后涂至卡那霉素(购自生工生物工程(上海)有限公司，A506636)抗性平板上平板倒置，37℃培养过夜，筛选具有卡那霉素抗性的转化子，从而筛选得到表达融合型多聚体蛋白质的重组载体，如筛选得到的表达融合型多聚体蛋白质CmZmb的重组载体命名为pET-30a-CmZmb，以此类推命名其他融合型多聚体蛋白质的重组载体；
(2)重组菌的构建
新鲜BL21(DE3)菌液冰浴30min，4℃，1000g离心10min，沉淀用0.1mol/L MgCl2-CaCl2(80mmol MgCl2和80mmol CaCl2，MgCl2和CaCl2购自国药集团化学试剂有限公司，分析纯，其余化学试剂纯度相同)重悬，4℃，1000g离心10min，然后0.1mol/L CaCl2溶液重悬制备BL21(DE3)感受态细胞，将步骤(1)中筛选的重组载体(如pET-30a-CmZmb)转化至大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，在含有卡那霉素的LB平板上筛选转化子，经测序验证正确为重组转化子，如命名为BL21-pET30a-CmZmb，以此类推命名其他融合型多聚体蛋白质的重组转化子。
(3)重组菌的发酵
将测序正确的重组转化子(如BL21-pET30a-CmZmb)，接种于LB培养基中，接种量0.5％(体积百分比)，于37℃培养过夜至OD600达到0.8，加入终浓度为10g/L的乳糖诱导，3～5小时后离心收菌；
取40μl菌液(分别为乳糖诱导前的菌液，乳糖诱导后的菌液)加10μl的5×上样缓冲液(由陕西普罗安蒂生物科技发展有限公司提供，货号：10137-1)，沸水煮5min，上样20μl进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果见图1，可以看到，将乳糖诱导的BL21-pET30a-CmZmb菌液在44kD的位置出现一条新的蛋白条带(见图1泳道2)，未经乳糖诱导的BL21-pET30a-CmZmb菌液不出现此带或此带颜色较浅(见图1泳道1)证明融合型多聚体蛋白质CmZmb已在BL21-pET30a-CmZmb中诱导表达，同样的，实施例4中的其他的融合型多聚体蛋白质也成功的诱导表达。
(4)纯化
在含20mM PB(用5.8018g/L的十二水合磷酸氢二钠水溶液，以及0.5928g/L二水合磷酸二氢钠的水溶液配制，缓冲溶液的配制方式都是标准方式)溶液中，加入分析纯氯化钠至浓度为11.688g/L，用酸碱水溶液调pH至pH7.4，得到缓冲液A液。将上述步骤(3)中收集的菌液用缓冲液A液按照重量比1：10悬浮，裂解时间分别为20min、30min、40min，超声破碎，室温离心后收集上清液，得裂解液上清1、2、3。同时将裂解液上清2采用镍柱亲和纯化(按照下述的裂解液上清2(裂解时间30min)进行镍柱亲和纯化操作至40％B液洗脱，收集洗脱液，将得到的洗脱液分为两份，即为洗脱液1和洗脱液2)。经SDS-PAGE电泳检测表明，结果见图1中泳道3-7(采用3种裂解时间的样品显示结果无差异，见图1中泳道3-5，泳道3的裂解液上清1对应裂解时间20min，泳道4的裂解液上清2对应裂解时间30min，泳道5的裂解液上清3对应裂解时间40min，洗脱液1和洗脱液2结果显示无明显差异见图1中泳道6-7)，融合型多聚体蛋白质大部分表达于大肠杆菌胞周质，沉淀中表达量较少。
将裂解液上清2(裂解时间30min)进行镍柱亲和纯化，具体的纯化步骤：调整纯化仪(
Figure BDA0003827623780000161
Purifier)流速为3ml/min，用缓冲液A液平衡层析柱使A280nm(检测波长)、A231nm(检测波长)和A215nm(检测波长)基线走平约10CV，并进行基线调零；通过A泵上样(裂解液上清60-120ml)；用缓冲液A液淋洗层析柱，至基线走平约10CV；用8％(体积百分比)B液(B液为缓冲液A液中加入终浓度为17.02g/L咪唑，咪唑购自国药集团化学试剂有限公司)清洗杂质，至基线走平约10CV；40％(体积百分比)B液洗脱目标蛋白，至基线走平约10CV；用B液(100％(体积百分比))洗脱约3CV，至基线走平(该蛋白A280nm吸收很小，A215nm吸收较高，但是咪唑对A215nm的影响很大，收集蛋白时需要反复确认收集范围，浓度低时根据A215nm或者A231nm起峰时开始收集，浓度高时可以根据A280nm起峰时收集)；用缓冲液A液清洗层析柱和层析系统，至基线走平约10CV。收集特征峰纯化的重组蛋白，如融合型多聚体蛋白质CmZmb纯度可达80％以上(结果见图2中泳道)，同样的，其他的融合型多聚体蛋白质纯度也可达80％以上。
实施例6亲和层析介质的制备
本实施例提供了亲和层析介质的制备，如下：
将实施例5得到的融合型多聚体蛋白质分别制备亲和层析介质，具体步骤如下：取琼脂糖凝胶4FF(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)100g，加入2-30mL(在本实施例中选择15ml)溴化氰，-10℃～10℃(在本实施例中选择0℃)反应15-30min(在本实施例中选择反应22min)，加2-50mL(在本实施例中选择25ml)三乙胺，-10℃～10℃(在本实施例中选择0℃)反应15-60min(在本实施例中选择反应35min)，用丙酮清洗；用纯水溶解融合型多聚体蛋白质0.2～2g(在本实施例中选择1g)，加入上述琼脂糖凝胶4FF中，调pH＝7～11(在本实施例中选择pH＝8)，0～20℃(在本实施例中选择10℃)反应过夜，加pH＝7～11的0.1-10％(体积百分比，在本实施例中5％)乙醇胺溶液，0～40℃(在本实施例中选择20℃)反应过夜，得到亲和层析介质。制备好的亲和层析介质保存至20％(体积百分比)的乙醇溶液中。
实验例1融合型多聚体蛋白质填料动态载量测试
使用
Figure BDA0003827623780000171
pure层析系统编程进行实验，层析柱介质为实施例6制备的亲和层析介质，采用1.1ml亲和层析介质用20％(体积百分比)乙醇水溶液2ml拌匀，用恒流泵(购自上海青浦沪西仪器厂)以8rpm/min流速装入层析柱中，设定检测波长为280nm，柱前压为0.3MPa，将层析柱接入系统，设定流速为1.0ml/min，用流动相B1淋洗10CV，用流动相A1平衡15CV；上样(2mg/ml IgG，购自北京索莱宝科技有限公司，SP031)流速0.2ml/min，上样至280nm处吸收值为90mAu；设定恒定洗脱流动相100％(体积百分比)流动相B1，流速1.0ml/min，洗脱至基线平，收集洗脱液；最后，使用流动相A1再生10ml，流速1.0ml/min。吸收值为动态检测，从程序开启到结束一直监测吸收值。
流动相A1：含20mm的PB，0.15M的NaCl的混合液，pH 7.4；
流动相B1：0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH3.3；
动态载量＝(VA×C0)/VC(mg/ml gel)
C0为样品中目标蛋白的浓度；VA为穿透曲线中目标样品浓度达到5％C0时上样的总体积；VC为总的柱床体积(参见刘莹,曾建成,于淼,等.一种亲和层析填料动态载量的测定方法:CN 114280208 A[P].)
将CmZmb、CC、CDB和CB(CC、CDB和CB中的多肽C均为多肽C(天然))制备的填料按照上述方法检测动态载量，结果如图3所示，CmZmb制备填料的动态载量高于CC、CDB和CB制备的填料。
按照上述方法实施，洗脱缓冲液pH4.3(即流动相B1为pH4.3)时，CmZmb、CC、CDB和CB的洗脱效率分别是86.6％、56.8％、87.9％和62.3％，CmZmb制备的亲和层析介质用pH4.3的缓冲液洗脱目的蛋白的效率与其他亲和层析介质相比相对较高。
实验例2融合型多聚体蛋白质填料耐碱性测试
使用
Figure BDA0003827623780000191
pure层析系统编程进行实验，层析柱介质为实施例6制备的亲和层析介质，采用1.1ml亲和层析介质用20％(体积百分比)乙醇水溶液2ml拌匀，用恒流泵(购自上海青浦沪西仪器厂)以8rpm/min流速装入层析柱中，设定检测波长为280，柱前压为0.3MPa，将层析柱接入系统，用缓冲液A2以1mL/min的流速平衡10min，洗去层析柱中的乙醇，用0.5M的NaOH以0.2mL/min的流速洗涤柱15min，然后用缓冲液A2以0.5mL/min的流速洗涤柱10min，重复以上步骤100个循环，每十次循环后测定一次动态载量(动态载量计算方法参见实验例1)。缓冲液A2：含20mM PB，0.15M的NaCl，pH7.4。
仅由多肽C(天然)或多肽Cm制备融合型多聚体蛋白质的耐碱性测试结果如下表，部分见图4。
表1、融合型多聚体蛋白质制备的填料耐碱性测试结果
Figure BDA0003827623780000192
Figure BDA0003827623780000201
2、CmZmb、CC、CDB和CB制备的填料耐碱性测试结果见图4，由图中可以看到，CmZmb制备的填料耐碱性测试中动态载量百分比高于CC、CDB和CB。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽选自：
(1)、与SEQ ID NO.1所示的蛋白A的天然C结构域相比，所述多肽在选自第16位、第25位、第29位、第49位和第58位中的至少一个位置上具有取代突变；
所述第16位取代突变为亮氨酸或者缬氨酸；
所述第25位取代突变为赖氨酸或者精氨酸或者组氨酸或者色氨酸；
所述第29位取代突变为丙氨酸或者亮氨酸或者苏氨酸；
所述第49位取代突变为精氨酸或者组氨酸；
所述第58位取代突变为甘氨酸或者异亮氨酸或者丙氨酸；
(2)、与(1)中所述的多肽具有至少80％以上同源性并保留了所述的第16位、第25位、第29位、第49位和第58位中的至少一个位置上的取代突变的多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第16位取代突变为亮氨酸；和/或
所述第25位取代突变为赖氨酸；和/或
所述第29为取代突变为丙氨酸；和/或
所述第49位取代突变为精氨酸；和/或
所述第58位取代突变为甘氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述多肽在所述的第58位具有所述的取代突变，并在选自所述的第16位、第25位、第29位和第49位中至少一个位置上具有所述的取代突变；或
所述多肽在第49位具有所述的取代突变，并在选自所述的第16位、第25位、第29位和第58位中至少一个位置上具有所述的取代突变；或
所述多肽在第29位具有所述的取代突变，并在选自所述的第16位、第25位、第49位和第58位中至少一个位置上具有所述的取代突变；或
所述多肽在第25位具有所述的取代突变，并在选自所述的第16位、第29位、第49位和第58位中至少一个位置上具有所述的取代突变；或
所述多肽在第16位具有所述的取代突变，并在选自所述的第25位、第29位、第49位和第58位中至少一个位置上具有所述的取代突变；
可选的，所述的多肽在第16位、第25位、第29位、第49位和第58位的位置上具有取代突变；或
可选的，所述的多肽在第16位、第25位、第49位和第58位的位置上具有取代突变；或
可选的，所述的多肽在第49位和第58位的位置上具有取代突变；或
可选的，所述的多肽在第29位、第49位和第58位的位置上具有取代突变；或
可选的，所述的多肽在第16位、第25位和第29位的位置上具有取代突变；或
可选的，所述的多肽在第16位和第25位的位置上具有取代突变；或
可选的，所述的多肽在第49位的位置上具有取代突变；或
可选的，所述的多肽在第25位的位置上具有取代突变。
4.一种融合型多聚体蛋白质，其特征在于，包括由权利要求1-3任一项所述的多肽融合形成的。
5.根据权利要求4所述的融合型多聚体蛋白质，其特征在于，还包括多肽B和/或多肽Zmb；
所述多肽B，选自：
a、具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
b、具有与a中如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％以上同源性的氨基酸序列；
所述多肽Zmb，选自：
c、在a中如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中至少一个位置插入氨基酸序列ML；所述氨基酸序列ML的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
d、在b中所述的氨基酸序列中至少一个位置插入氨基酸序列ML；
可选的，所述的多肽Zmb的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求4或5所述的融合型多聚体蛋白质，其特征在于，权利要求1-4任一项所述的多肽记为多肽Cm；所述融合型多聚体蛋白质包括至少1条所述的多肽Cm，和/或至少1条所述的多肽Zmb；
可选的，所述融合型多聚体蛋白质包括1-6条所述的多肽Cm，和/或1-4条所述的多肽Zmb；
可选的，所述融合型多聚体蛋白质包括4条所述的多肽Cm，和/或2条所述的多肽Zmb。
7.根据权利要求4-6任一项所述的融合型多聚体蛋白质，其特征在于，还包括至少一条功能性多肽FLD，选自：
A、具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；
B、具有与A中如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列具有至少80％以上同源性的氨基酸序列；
可选的，所述的功能性多肽FLD位于多肽Cm和多肽Zmb之间；
可选的，所述的融合型多聚体蛋白质从N端到C端依次包括4个多肽Cm、1个功能性多肽FLD和2个多肽Zmb。
8.生物材料，其特征在于，包括如下任意一种：
1)编码权利要求1-3任一项所述的多肽或权利要求4-7任一项所述的融合型多聚体蛋白质的核酸分子；可选的，所述核酸分子为DNA或RNA；
2)表达权利要求1-3任一项所述的多肽或权利要求4-7任一项所述的融合型多聚体蛋白质的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；
3)含1)所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；
4)含2)或3)中所述的表达盒的重组载体、重组微生物或转基因细胞系；
5)含2)或3)或4)中所述的重组载体的宿主细胞；
可选的，所述重组载体为由大肠杆菌表达载体pET-30a(+)构建而成；
可选的，所述宿主细胞为大肠杆菌，可选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
9.权利要求1-3任一项所述的多肽或权利要求4-7任一项所述的融合型多聚体蛋白质在抗体检测、分离或纯化中的应用。
10.一种亲和层析介质，其特征在于，包括权利要求4-7任一项所述的融合型多聚体蛋白质和亲和层析介质载体；
可选的，所述亲和层析介质载体包括但不限于琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、带羟基的高分子聚合物或硅胶。
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