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WO2019187602A1 - 改変型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド - Google Patents

改変型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド Download PDF

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Publication number
WO2019187602A1
WO2019187602A1 PCT/JP2019/002950 JP2019002950W WO2019187602A1 WO 2019187602 A1 WO2019187602 A1 WO 2019187602A1 JP 2019002950 W JP2019002950 W JP 2019002950W WO 2019187602 A1 WO2019187602 A1 WO 2019187602A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
variable region
immunoglobulin
chain variable
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2019/002950
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
吉田　慎一
大 村田
史憲 鴻池
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kaneka Corp
Original Assignee
Kaneka Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kaneka Corp filed Critical Kaneka Corp
Priority to JP2020509744A priority Critical patent/JPWO2019187602A1/ja
Publication of WO2019187602A1 publication Critical patent/WO2019187602A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to an immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide with improved chemical stability to an alkaline solution, an affinity separation matrix having the peptide as a ligand, and an immunoglobulin ⁇ chain variable region-containing protein using the affinity separation matrix.
  • the present invention relates to a production method, DNA encoding the peptide, a vector containing the DNA, and a transformant transformed with the vector.
  • Protein A affinity separation matrix (hereinafter referred to as “SpA”) is used to capture and purify antibody drugs from animal cell cultures at a high purity at a time.
  • Monoclonal antibodies are basically developed as antibody drugs and are produced in large quantities using recombinant cultured cell technology.
  • “Monoclonal antibody” refers to an antibody obtained from a clone derived from a single antibody-producing cell.
  • Most antibody drugs currently on the market are immunoglobulin G (IgG) subclass in terms of molecular structure.
  • antibody drugs composed of fragment antibodies having a molecular structure obtained by fragmenting immunoglobulin have been actively clinically developed, and clinical development of various fragment antibody drugs is progressing (Non-patent Document 3).
  • SpA affinity separation matrix is used for the initial purification step in the antibody drug manufacturing process.
  • SpA is basically a protein that specifically binds to the Fc region of IgG. Therefore, a fragment antibody that does not contain an Fc region cannot be captured using the SpA affinity separation matrix. Therefore, from the viewpoint of developing a platform for antibody drug purification process, there is a great industrial need for an affinity separation matrix capable of capturing a fragment antibody that does not contain the Fc region of IgG.
  • Non-Patent Document 4 A plurality of peptides that bind to regions other than the Fc region of IgG are already known (Non-Patent Document 4). Among them, a peptide that can bind to a variable region (antigen-binding domain) is most preferable from the viewpoint of the variety of fragment antibody formats that can be bound and the ability to bind to IgM and IgA.
  • protein L is sometimes abbreviated as “PpL”).
  • PpL is a protein containing a plurality of ⁇ chain variable region binding domains (hereinafter, the ⁇ chain variable region may be abbreviated as “VL- ⁇ ”), and the amino acid sequences of individual VL- ⁇ binding domains are different. .
  • the number of VL- ⁇ binding domains and individual amino acid sequences differ depending on the type of strain. For example, the number of VL- ⁇ binding domains contained in PpL of the Peptostreptococcus magnus 312 strain is 5, and the VL- ⁇ binding domains contained in the PpL of the Peptostreptococcus magnus strain 3316 are five. Is 4 (Non-patent Documents 5 to 7, Patent Documents 1 and 2). Among these nine VL- ⁇ binding domains, there are no domains having the same amino acid sequence.
  • Non-patent Documents 1 and 8, Patent Documents 3 to 8 protein engineering research has been actively conducted to introduce a site-specific mutation and improve the function as a ligand for affinity separation matrix.
  • Patent Documents 3 to 8 Patent Documents 3 to 8
  • amino acid substitution mutations to asparagine residues known to be susceptible to deamidation reactions under alkaline conditions and glycine residues after asparagine residues are effective in improving chemical stability. is there.
  • such a mutation does not show an alkali resistance improving effect (Non-patent Document 8).
  • Non-patent Documents 7, 9, and 10 There are several reports of mutation introduction aimed at analyzing the binding force and binding mode of PpL (Non-patent Documents 7, 9, and 10), and there are also reports of studies intended to modify the function as an affinity ligand ( Patent Documents 9 and 10).
  • Patent Documents 9 and 10 there are limited reports of mutation introduction of PpL.
  • the chemical stability to alkaline solution is 0.1 to 0.5M by the improvement of SpA in the case of SpA affinity separation matrix. While washing with sodium hydroxide is possible, in the case of a PpL affinity separation matrix, 0.02-0.05M sodium hydroxide is recommended (Non-patent Document 11).
  • Novel modified protein L that exhibits binding to immunoglobulin kappa chain and has excellent chemical stability to alkaline solution, and affinity separation matrix having the modified PpL as a ligand, and affinity separation It is an object of the present invention to provide a method for producing a protein containing a kappa chain variable region using a matrix.
  • the inventors of the present invention designed a mutant of a VL- ⁇ binding domain of PpL, and transformed the mutant using a protein engineering technique and a genetic engineering technique. Studies were conducted to compare the physical properties of the mutants obtained from the cells. The present invention completed as a result is shown below.
  • An immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide having the amino acid sequence of any one of the following amino acid sequences (I) to (III): (I) An amino acid sequence in which at least one or more amino acid substitution mutations of (a) to (h) are introduced in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (provided that the mutation of (b) or (e) and the mutation of (g) And (c) or (d) mutation and (h) mutation are not introduced simultaneously): (A) Replacing Lys at position 3 with Arg; (B) replacing Lys at position 9 with Arg; (C) replacing Asp at position 16 with Glu; (D) replacing Thr at position 18 with Lys or Arg; (E) replacing Thr at position 23 with Glu; (F) Replacing Lys at position 25 with Arg; (G) Replacing Lys at position 9 with Asp or Glu, and Thr at position 23 with Lys or Arg; (H) Replacing Asp at position 16 with Lys or
  • a method for producing a protein comprising an immunoglobulin ⁇ chain variable region Contacting the affinity separation matrix according to the above [5] with a liquid sample containing a protein containing an immunoglobulin ⁇ chain variable region; and Separating the protein comprising the immunoglobulin kappa chain variable region bound to the affinity separation matrix from the affinity separation matrix.
  • the chromatographic support for affinity purification obtained by immobilizing the modified PpL obtained in the present invention has little decrease in ⁇ chain binding activity due to damage due to alkali treatment, organic substances remaining on the chromatographic support during cleaning during repeated use, etc. Effective cleaning with sodium hydroxide having a high impurity removal effect (specifically, at a high concentration or for a long time) is possible.
  • the present invention relates to an immunoglobulin ⁇ chain variable region binding peptide having any one of the following amino acid sequences (I) to (III).
  • immunoglobulin ⁇ chain variable region binding peptides having amino acid sequences (I) to (III) are referred to as “immunoglobulin ⁇ chain variable region binding peptides (I) to (III)” and “VL- ⁇ binding peptides ( I) to (III) ”may be abbreviated.
  • Immunoglobulin (Ig) is a glycoprotein produced by B cells of lymphocytes and has a function of recognizing and binding molecules such as specific proteins.
  • the immunoglobulin has a function of specifically binding to this specific molecule (antigen) and a function of detoxifying and removing factors having the antigen in cooperation with other biomolecules and cells.
  • Immunoglobulin is generally called “antibody”, which is a name that focuses on such a function. All immunoglobulins basically have the same molecular structure, and have a basic structure of a “Y” -shaped four-chain structure (two polypeptide chains each consisting of a light chain and a heavy chain).
  • Immunoglobulin G is a monomeric immunoglobulin and is composed of two heavy chains ( ⁇ chains) and two light chains, and has two antigen-binding sites.
  • the place corresponding to the vertical bar of the lower half of the “Y” of immunoglobulin is called the Fc region, and the “V” of the upper half is called the Fab region.
  • the Fc region has an effector function that induces a reaction after the antibody binds to the antigen, and the Fab region has a function of binding to the antigen.
  • the heavy chain Fab region and the Fc region are connected by a hinge part, and the proteolytic enzyme papain contained in papaya decomposes this hinge part and cleaves it into two Fab regions and one Fc region.
  • the portion near the tip of the “Y” in the Fab region is called a variable region (V region) because various changes in the amino acid sequence are seen so that it can bind to various antigens.
  • the variable region of the light chain is called the VL region, and the variable region of the heavy chain is called the VH region.
  • the Fab region and the Fc region other than the V region are regions with relatively little change, and are called constant regions (C regions).
  • the constant region of the light chain is referred to as the CL region, and the constant region of the heavy chain is referred to as the CH region.
  • the CH region is further divided into three, CH1 to CH3.
  • the heavy chain Fab region consists of a VH region and CH1, and the heavy chain Fc region consists of CH2 and CH3.
  • the hinge part is located between CH1 and CH2.
  • Protein L binds to a variable region whose light chain is a kappa chain (may be abbreviated as “VL- ⁇ ” in the present specification) (Non-patent Documents 5 to 7).
  • the peptide according to the present invention binds to the ⁇ chain variable region (VL- ⁇ region) of immunoglobulin.
  • VL- ⁇ region-containing protein to be bound by the peptide obtained in the present invention is not limited as long as it contains a VL- ⁇ region, and may be IgG containing a Fab region and an Fc region without deficiency, or IgM It may be other Igs such as IgD and IgA, or may be a derivative of an immunoglobulin molecule that has been modified by protein engineering.
  • the immunoglobulin molecule derivative to which the VL- ⁇ region-binding peptide according to the present invention binds is not particularly limited as long as it is a derivative having a VL- ⁇ region.
  • Fab fragments fragmented only in the Fab region of immunoglobulin G, scFv consisting only of the variable region of immunoglobulin G, and partial domains of human immunoglobulin G are replaced with immunoglobulin G domains of other species.
  • Examples include fused chimeric immunoglobulin G, immunoglobulin G obtained by molecular modification of the sugar chain of the Fc region, and scFv fragment covalently bound to a drug.
  • peptide includes all molecules having a polypeptide structure, and includes not only so-called proteins, but also fragments and those in which other peptides are linked by peptide bonds. Shall be.
  • peptide and protein are basically synonymous.
  • a “domain” is a unit of protein conformation, consisting of tens to hundreds of amino acid residues, sufficient to express a protein unit sufficient to express any physicochemical or biochemical function.
  • a “variant” of a protein or peptide refers to a protein or peptide in which at least one substitution, addition or deletion is introduced at the amino acid level with respect to the sequence of a wild-type protein or peptide.
  • the amino acid of a wild type or a non-mutation type is attached
  • the mutated amino acid is attached
  • G29A a mutation that replaces Gly at position 29 with Ala.
  • Protein L is a protein derived from the cell wall of anaerobic gram-positive cocci belonging to the genus Peptostreptococcus.
  • PpL derived from Peptostreptococcus magnus is preferable, and two types of PpL derived from Peptostreptococcus magnus 312 and Peptostreptococcus magnus 3316 are preferable, but are not limited thereto.
  • PpL of the Peptostreptococcus magnus 312 strain may be abbreviated as “PpL312”
  • PpL derived from the Peptostreptococcus magnus 3316 strain may be abbreviated as “PpL3316”.
  • PpL contains a plurality of VL- ⁇ binding domains consisting of 70 to 80 residues.
  • the number of VL- ⁇ binding domains contained in PpL312 is five, and the number of VL- ⁇ binding domains contained in PpL3316 is four.
  • the VL- ⁇ binding domains of PpL312 are called B1, B2, B3, B4, and B5 domains in this order from the N terminus, and the VL- ⁇ binding domains of PpL3316 are C1, C2, C3, C4 in order from the N terminus. This is called a domain (Non-Patent Documents 5 to 6).
  • the B5 domain among these VL- ⁇ binding domains is preferable for applying the present invention.
  • the present invention is preferably applied to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in which the mutation described in Patent Document 6 is introduced into the B5 domain.
  • the amino acid sequence of the wild-type B5 domain (SEQ ID NO: 2) may be used, and PpL312 It may be the amino acid sequence of the B5 domain (SEQ ID NO: 3) including everything after the B4 domain, or the amino acid sequence of the B5 domain (SEQ ID NO: 4) described in Patent Document 12 with a different number of amino acids.
  • the reason why the number of amino acids in the amino acid sequence of the B5 domain varies depending on the literature is that about 20 residues at the N-terminus do not take a specific secondary structure.
  • Non-patent Document 7 Even when the N-terminal region is deleted, it retains a three-dimensional structure as a VL- ⁇ binding domain and exhibits VL- ⁇ binding (Non-patent Document 7). Therefore, it is possible to delete 1 to 5 residues in the N-terminal region of the B5 domain represented by SEQ ID NO: 1.
  • the first position of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 becomes the 16th position when a residue number is assigned according to Non-Patent Documents 7 to 8 and Patent Document 9.
  • the present invention shows that the chemical stability to alkaline aqueous solution is improved by introducing a specific amino acid substitution mutation in the VL- ⁇ binding domain of wild-type PpL as compared to that before the mutation introduction. It is a technology to create a characteristic mutant.
  • the modified VL- ⁇ binding peptide is less damaged by alkali after being treated (infiltrated) with an alkaline aqueous solution, and the binding performance is maintained at a high level, as confirmed in Examples described later.
  • the amino acid residue substitution site according to the present invention is one selected from the 3rd, 9th, 16th, 18th, 23rd, and 25th positions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. These amino acid residues.
  • the third position of SEQ ID NO: 1 is Lys
  • the ninth position is Lys
  • the 16th position is Asp
  • the 18th position is Thr
  • the 23rd position is Thr
  • the 25th position is Lys. Even when the number of amino acids in the B5 domain before mutagenesis is different, when the sequence identity is 90% or more, the 3rd, 9th, 16th, 18th, Those skilled in the art can easily identify the positions corresponding to the 23rd and 25th positions.
  • Non-Patent Documents 7 to 8 and Patent Document 9 the substitution sites of amino acid residues according to the present invention are the 18th position, 24th position, 31st position and 33rd position, respectively. , 38th and 40th positions.
  • the VL- ⁇ binding peptides (I) to (III) according to the present invention are selected from the above-mentioned third, ninth, sixteenth, eighteenth, twenty-third, and twenty-fifth positions. It has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with one or more amino acid residues substituted.
  • the substituted positions are preferably the 3rd, 9th, 16th, 18th and 25th positions, the 3rd, 9th, 16th and 25th positions are even more.
  • the 3rd, 9th and 25th positions are even more preferred, and the 9th and 25th positions are even more preferred.
  • the number of amino acid mutations to be substituted is not particularly limited, but is preferably 1 or more, more preferably 2 or more, still more preferably 3 or more, and still more preferably 4 or more.
  • the upper limit of the number of mutations is not particularly limited, and may be 6.
  • the phrase “having a (specific) amino acid sequence” means that the peptide only needs to contain the specified amino acid sequence, and the function of the peptide is maintained. To do.
  • sequences other than the amino acid sequence specified in the peptide include a histidine tag, a linker sequence for immobilization, and a cross-linked structure such as an —SS— bond.
  • the type of amino acid to be mutated is not particularly limited, including substitution with non-protein constituent amino acids or non-natural amino acids, but natural amino acids can be suitably used from the viewpoint of genetic engineering production.
  • natural amino acids are classified into neutral amino acids; acidic amino acids of Asp and Glu; basic amino acids of Lys, Arg, and His.
  • Neutral amino acids are classified as aliphatic amino acids; Pro imino acids; Phe, Tyr, Trp aromatic amino acids.
  • Aliphatic amino acids are further classified into Gly; Ala; branched amino acids of Val, Leu and Ile; hydroxy amino acids of Ser and Thr; sulfur-containing amino acids of Cys and Met; and acid amide amino acids of Asn and Gln.
  • Tyr since Tyr has a phenolic hydroxyl group, it may be classified not only as an aromatic amino acid but also as a hydroxy amino acid.
  • natural amino acids are Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Cys, Met, Pro, Phe highly non-polar amino acids; Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr Neutral polar amino acids; acidic polar amino acids such as Asp and Glu; basic polar amino acids such as Lys, Arg and His.
  • the amino acid at the specific position may be substituted with an amino acid classified into the same group, or may be substituted with an amino acid classified into a different group.
  • the amino acid substitution mutations (a) to (f) can be expected to improve the chemical stability against alkali even when used alone, but the same effect can be expected even when a plurality of amino acid substitution mutations are introduced.
  • the side chains of amino acids are close in three-dimensional structure, and a synergistic effect is expected by introducing a plurality of amino acid side chains. Therefore, mutations such as (g) and (h) can be expected to have the same effect.
  • one or two amino acids at the N-terminal and / or C-terminal are deleted and / or from the amino acid sequence (I) into which the amino acid substitution mutation is introduced. It may have a substituted amino acid sequence and / or an amino acid sequence (II) to which 1 or more and 20 or less amino acid residues are added at the N-terminal and / or the terminal.
  • the number of mutations in the above deletion and / or substitution is preferably 1 or 2, more preferably 1.
  • the number of additional mutations is preferably 15 or less, 10 or less, more preferably 7 or less, 5 or less, or 3 or less, more preferably 1 or 2, and particularly preferably 1.
  • amino acid residue deletion / substitution / addition positions include the N-terminus and / or the C-terminus. These sites are particularly preferred as deletion and / or addition sites.
  • mutations can be applied to the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, but are not limited thereto.
  • sequence of the N-terminal region of the B1-B4 domain of PpL312 may be added.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 in which the N-terminal region of SEQ ID NO: 1 is replaced with the amino acid sequence of the N-terminal region of the B2 domain It may be a peptide having In this case, the first position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the seventh position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the additional sequence Gly, Ser, Cys, and / or the addition of Met corresponding to the start codon to the N-terminus and the role of linker residue or matrix-immobilized residue Examples include addition of an amino acid sequence containing Lys to the N-terminus and / or C-terminus.
  • the VL- ⁇ binding peptide according to the present invention may have an amino acid sequence (III) having a sequence identity of 90% or more with respect to the amino acid sequence into which the amino acid substitution mutation is introduced.
  • it may be a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid residues at one or more positions selected from the 3rd position, the 9th position, the 16th position, the 18th position, the 23rd position, and the 25th position in SEQ ID NO: 1 are not further mutated. To do. Therefore, as long as it has 90% or more sequence identity to the amino acid sequence obtained in the present invention, mutations may be further introduced.
  • sequence identity is preferably 90% or more or 92% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more or 99.5% or more.
  • sequence identity can be evaluated using Clustal or the like.
  • a VL- ⁇ binding peptide having an amino acid sequence in which at least one or more amino acid substitution mutations (i) to (j) are further introduced into the amino acid sequence into which the specific amino acid substitution mutation is introduced is also present. Included in the invention. (I) Replacing Lys at position 44 in SEQ ID NO: 1 with Arg; (J) Replacing Lys at position 48 in SEQ ID NO: 1 with Arg.
  • Lys in the amino acid sequence can be limited to control the manner of immobilization to the matrix.
  • VL- ⁇ binding peptide according to the present invention is characterized in that its chemical stability to an alkaline aqueous solution is improved as compared with that before introduction of substitution.
  • Alkaline aqueous solution refers to alkalinity that can achieve the purpose of cleaning or sterilization. More specifically, an aqueous solution of sodium hydroxide of 0.01M to 1.0M or 0.01N to 1.0N is applicable, but not limited thereto.
  • the lower limit of the concentration is preferably 0.01M, more preferably 0.02M, and even more preferably 0.05M.
  • the upper limit of the concentration of sodium hydroxide is preferably 1.0M, more preferably 0.5M, even more preferably 0.3M, still more preferably 0.2M, and even more preferably 0.1M.
  • the alkaline aqueous solution is not necessarily a sodium hydroxide aqueous solution, but the pH is preferably 12 or more and 14 or less.
  • the pH is preferably 12 or more and 14 or less.
  • pH 12.0 or more is preferable, and pH 12.5 or more is more preferable.
  • pH of 14 or less is preferable, pH of 13.5 or less is more preferable, and pH of 13.0 or less is even more preferable.
  • “Chemical stability” refers to the property that a protein retains its function against chemical modifications such as chemical changes of amino acid residues and chemical modifications such as amide bond transfer and cleavage.
  • maintaining the function of a protein refers to maintaining the binding activity to VL- ⁇ . That is, the higher the “chemical stability”, the more the VL is retained after the immersion treatment in an alkaline aqueous solution. The degree of decrease in the binding activity to - ⁇ is small.
  • the binding activity to VL- ⁇ refers to the proportion of the polypeptide that retains affinity for VL- ⁇ without undergoing chemical denaturation.
  • alkali resistance is also synonymous with “chemical stability under alkaline conditions”.
  • the time for immersion in alkali is not particularly limited because the damage to the peptide varies greatly depending on the concentration of alkali and temperature at the time of immersion.
  • the concentration of sodium hydroxide is 0.05M and the temperature during immersion is room temperature
  • the lower limit of the time for immersion in alkali is preferably 1 hour, more preferably 2 hours, more preferably 4 hours, and more preferably 10 hours. Is more preferable, and 20 hours is more preferable, but there is no particular limitation.
  • the upper limit of the said time is not specifically limited, For example, it can be set as 50 hours.
  • Affinity for immunoglobulin can be tested with biosensors such as Biacore system (GE Healthcare) using surface plasmon resonance principle and Octet (Paul) using biolayer interferometry. It is not limited.
  • a binding signal when the peptide of the present invention binds to VL- ⁇ may be detected.
  • the temperature is a constant temperature of 20 to 40 ° C.
  • the pH when the binding state is observed is a neutral condition of 5 or more and 8 or less.
  • the buffer component include, but are not limited to, phosphoric acid, tris, bistris, and the like when neutral.
  • the concentration of sodium chloride in the buffer solution is not particularly limited, but is preferably about 0 to 0.15M.
  • the affinity constant (K A ) or the dissociation constant (K D ) can be used as a parameter indicating the binding to VL- ⁇ (Nagata et al., “Real-time analysis experiment method of biological substance interaction” "Springer Fairlark Tokyo, 1998, page 41).
  • the affinity constant for VL- ⁇ of the protein of the present invention is determined by immobilizing human IgG on the sensor chip using the Biacore system and passing each domain variant through the flow path under the conditions of temperature 25 ° C. and pH 7.4. It can be determined in the experimental system to be added.
  • a protein having an affinity constant (K A ) for human VL- ⁇ of preferably 1 ⁇ 10 5 (M ⁇ 1 ) or more, more preferably 1 ⁇ 10 6 (M ⁇ 1 ) or more. It can be used suitably.
  • the affinity constant varies depending on the type of VL- ⁇ -containing peptide and the number of domains of the VL- ⁇ -binding peptide, and is not limited thereto.
  • K A and the K D is inappropriate. This is because even if the ratio of molecules capable of binding to VL- ⁇ is changed by alkali treatment, if the binding ability of one peptide molecule to VL- ⁇ does not change, no change is observed as a parameter.
  • the peptide is immobilized on a sensor chip (Biacore) or biosensor (Octet), and before and after chemical treatment of the peptide, the same concentration of VL- ⁇ -containing protein is added. The magnitude of the binding response when added is an index.
  • the unit indicating the magnitude of the binding response is a resonance unit (RU) in Biacore and nanometer (nm) in Octet, but is not limited thereto.
  • the size of the binding response may be compared by adding an alkali-treated peptide and an alkali-treated peptide at the same concentration to a system in which a VL- ⁇ -containing protein is immobilized.
  • the residual binding activity is a comparison before and after alkali treatment, it can be basically expressed as a ratio (percentage) with the binding activity before alkali treatment as the denominator and the binding activity after alkali treatment as the numerator.
  • the numerical value is not particularly limited as long as it is higher than that of the peptide in which the mutation of the present invention treated with alkali under the same conditions is not introduced, but the ratio is preferably 5% or more, and preferably 10% or more. It is preferably 20% or more, more preferably 30% or more, even more preferably 40% or more, and even more preferably 50% or more. Of course, the upper limit of the ratio is preferably 100%.
  • the sample to be compared is different only in that it does not contain the mutation of the present invention, the other amino acid sequences are the same, and the alkali treatment and residual binding activity are measured. It is to make all of the conditions together.
  • an appropriate treatment such as neutralization with an acid after neutralization with an acid is required. It is.
  • the VL- ⁇ binding peptide according to the present invention also includes, as one embodiment, two or more, preferably three or more, more preferably, the VL- ⁇ binding peptide that is a monomer or a single domain. It may be a multimer of multiple domains linked by 4 or more, more preferably 5 or more.
  • the upper limit of the number of domains to be linked is 10 or less, preferably 8 or less, more preferably 6 or less.
  • These multimers may be a homopolymer such as a homodimer or homotrimer that is a conjugate of a single VL- ⁇ -binding peptide, or a heteropolymer that is a conjugate of a plurality of types of VL- ⁇ -binding peptides. It may be a heteropolymer such as a dimer or heterotrimer.
  • Examples of how to link multiple domains in the VL- ⁇ binding peptide multimer according to the present invention include a method of connecting with one or a plurality of amino acid residues, and a method of directly connecting without interposing amino acid residues. However, it is not limited to these methods.
  • the number of amino acid residues to be linked is not particularly limited, but is preferably 20 residues or less, more preferably 15 residues or less, still more preferably 10 residues or less, and even more preferably 5 residues. Or even more preferably 2 residues or less.
  • These amino acid sequences are preferably those that do not destabilize the three-dimensional structure of the monomeric protein.
  • a fusion peptide characterized in that the VL- ⁇ binding peptide or multimer thereof obtained by the present invention is fused with another peptide having different functions as one component.
  • fusion peptides include, but are not limited to, peptides fused with albumin or glutathione S-transferase (GST).
  • GST glutathione S-transferase
  • a nucleic acid such as a DNA aptamer
  • a drug such as an antibiotic
  • PEG polyethylene glycol
  • the present invention includes the use of the peptide of the present invention as an affinity ligand characterized by having affinity for immunoglobulins and fragments thereof, particularly VL- ⁇ .
  • an affinity separation matrix characterized in that the ligand is immobilized on a water-insoluble carrier is also included as one embodiment.
  • the affinity separation matrix according to the present invention is characterized in that the VL- ⁇ binding peptide or the VL- ⁇ binding peptide multimer according to the present invention is immobilized on a water-insoluble carrier as a ligand. .
  • the term “ligand” refers to a substance or a function that selectively collects or binds a target molecule from a set of molecules based on specific affinity between molecules represented by binding of an antigen and an antibody.
  • the term refers to a group, and in the present invention, refers to a peptide that specifically binds to VL- ⁇ .
  • the expression “ligand” is also synonymous with “affinity ligand”.
  • affinity ligand refers to a substance that selectively collects or binds a target molecule from a set of molecules based on the affinity between specific molecules represented by the binding of an antigen and an antibody.
  • the term refers to a functional group, and in the present invention, refers to a peptide that specifically binds to VL- ⁇ .
  • the expression “ligand” is also synonymous with “affinity ligand”.
  • Examples of the water-insoluble carrier used in the present invention include an inorganic carrier, an organic carrier, and a composite carrier such as an organic carrier-organic carrier or an organic carrier-inorganic carrier obtained by a combination thereof.
  • Examples of the inorganic carrier material include glass beads and silica gel.
  • Examples of organic carrier materials include synthetic polymers and polysaccharides. Synthetic polymers include crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene. Polysaccharides include crystalline cellulose and crosslinked polymers. Cellulose, cross-linked agarose, cross-linked dextran and the like can be mentioned.
  • GCL2000 a porous cellulose gel
  • Sephacryl (registered trademark) S-1000 obtained by covalently crosslinking allyldextran and methylenebisacrylamide
  • Toyopearl registered trademark
  • an acrylate-based carrier an acrylate-based carrier
  • agarose-based crosslinking examples include Sepharose (registered trademark) CL4B, which is a carrier, and Cellufine (registered trademark), which is a cellulose-based crosslinked carrier.
  • the water-insoluble carrier in the present invention is not limited to these exemplified carriers.
  • the water-insoluble carrier used in the present invention desirably has a large surface area in view of the purpose and method of use of the affinity separation matrix, and is preferably a porous material having a large number of pores of an appropriate size.
  • the form of the carrier can be any of beads, monoliths, fibers, membranes (including hollow fibers), and any form can be selected.
  • the ligand is immobilized on the water-insoluble carrier by a covalent bond, directly or via a linker group.
  • the affinity separation matrix according to the present invention can be produced by immobilizing the ligand on the water-insoluble carrier.
  • the method for immobilizing the ligand may be bound to the carrier by a conventional coupling method using an amino group, a carboxy group or a thiol group present in the ligand.
  • the carrier is activated by reacting the carrier with cyanogen bromide, epichlorohydrin, diglycidyl ether, tosyl chloride, tresyl chloride, hydrazine or sodium periodate, or the surface of the carrier.
  • the immobilization method include addition of a reagent having a plurality of functional groups in the molecule such as glutaraldehyde, condensation, and crosslinking.
  • a spacer molecule composed of a plurality of atoms may be introduced between the ligand and the carrier, or the ligand may be directly immobilized on the carrier. Therefore, for immobilization, the VL- ⁇ binding peptide according to the present invention may be chemically modified, or an amino acid residue useful for immobilization may be added.
  • amino acids useful for immobilization include amino acids having functional groups useful for immobilization chemical reactions in the side chain, such as Lys containing an amino group in the side chain, and thiol groups in the side chain. Cys containing is mentioned.
  • VL- ⁇ binding property imparted to a peptide in the present invention is similarly imparted to a matrix in which the peptide is immobilized as a ligand. Modifications are within the scope of the present invention.
  • VL- ⁇ -containing proteins proteins containing immunoglobulin ⁇ chain variable regions by affinity column chromatography purification methods.
  • the purification method of these VL- ⁇ -containing proteins can be achieved by a procedure according to an immunoglobulin affinity column chromatography purification method, for example, a purification method using an SpA affinity separation matrix (Non-patent Document 1).
  • the solution is passed through an affinity column packed with the affinity separation matrix of the present invention to adsorb the VL- ⁇ -containing protein.
  • an appropriate amount of pure buffer is passed through the affinity column, and the inside of the column is washed.
  • the desired VL- ⁇ -containing protein is adsorbed to the affinity separation matrix according to the present invention in the column.
  • the affinity separation matrix in which the peptide obtained in the present invention is immobilized as a ligand is excellent in the ability to adsorb and retain the target VL- ⁇ -containing protein from the sample addition step to the matrix washing step.
  • an acidic buffer adjusted to an appropriate pH is passed through the column to elute the desired VL- ⁇ -containing protein, thereby achieving high-purity purification.
  • a substance that promotes dissociation from the matrix may be added to the acidic buffer used to elute the peptide.
  • the affinity separation matrix of the present invention can be reused by washing by passing it through a pure buffer having a suitable strong acidity or strong alkali that does not completely impair the function of the ligand compound or the carrier substrate. Is possible.
  • An appropriate denaturing agent or an organic solvent may be added to the regeneration buffer.
  • the affinity separation matrix of the present invention is excellent in chemical stability against an alkaline aqueous solution, it is preferably reused by passing it through a strong alkaline pure buffer and washing.
  • the timing of regeneration with a strong alkaline pure buffer does not have to be every time after use. For example, it may be once every five times and once every ten times.
  • the present invention also relates to DNA encoding the modified VL- ⁇ binding peptide.
  • the base sequence of such DNA can be determined, for example, by back-translating the amino acid sequence of the peptide.
  • the DNA encoding the peptide of the present invention may be any one as long as the amino acid sequence obtained by translating the base sequence constitutes the peptide.
  • Such a base sequence can be obtained by using a commonly used known method, for example, a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as “PCR”) method. It can also be synthesized by a known chemical synthesis method, and can also be obtained from a DNA library.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the base sequence may not be the same as the original base sequence as long as the codon may be substituted with a degenerate codon and it encodes the same amino acid when translated.
  • a genetically modified organism into which the DNA has been introduced, or a cell-free protein synthesis system using the DNA as a template DNA for transcription can be obtained.
  • the VL- ⁇ binding peptide according to the present invention can be obtained as a fusion peptide with a known protein having an advantage of assisting protein expression or facilitating purification. That is, a microorganism or cell containing at least one recombinant DNA encoding a fusion peptide containing the VL- ⁇ binding peptide according to the present invention can be obtained.
  • the protein include maltose binding protein (MBP) and glutathione-S-transferase (GST), but are not limited to these proteins.
  • site-specific mutations for modifying the DNA encoding the peptide of the present invention can be carried out using recombinant DNA techniques, PCR methods and the like as follows.
  • the introduction of mutations by recombinant DNA technology is performed, for example, when there are appropriate restriction enzyme recognition sequences on both sides of the target site where mutations are desired in the gene encoding the peptide of the present invention.
  • the recognition sequence can be cleaved with the restriction enzyme, and after removing the region containing the site desired to be mutated, the cassette mutation method can be used in which a DNA fragment mutated only at the desired site is inserted by chemical synthesis or the like. .
  • site-specific mutation by PCR for example, using a double-stranded plasmid encoding the peptide of the present invention as a template and two synthetic oligo primers containing mutations complementary to the + strand and the ⁇ strand.
  • the double primer method can be used.
  • a DNA encoding a multimeric peptide can also be prepared by linking a desired number of DNAs encoding the monomer peptide (one domain) in series.
  • an appropriate restriction enzyme site can be introduced into a DNA sequence, and a double-stranded DNA fragmented with a restriction enzyme can be ligated with a DNA ligase.
  • the sequence identity between the nucleotide sequences of DNA encoding the peptide is 90% or less, preferably 85% or less, more preferably 80% or less, and even more preferably 75% or less.
  • the identity of the base sequence can be determined by a conventional method as in the case of the amino acid sequence.
  • the “expression vector” of the present invention includes a base sequence encoding the aforementioned peptide of the present invention or a partial amino acid sequence thereof, and a promoter operable in a host operably linked to the base sequence.
  • the gene encoding the peptide of the present invention can be obtained by linking or inserting into a suitable vector, and the vector for inserting the gene is not particularly limited as long as it can autonomously replicate in the host.
  • plasmid DNA or phage DNA can be used as a vector.
  • vectors such as pQE vectors (Qiagen), pET vectors (Merck), and pGEX vectors (GE Healthcare Bioscience) may be mentioned.
  • the transformed cell of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell.
  • methods for introducing recombinant DNA into a host include a method using calcium ions, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, an Agrobacterium infection method, a particle gun method, and a polyethylene glycol method.
  • examples of a method for expressing the function of the obtained gene in a host include a method for incorporating the gene obtained in the present invention into a genome (chromosome).
  • the host cell is not particularly limited, but for mass production at low cost, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Coryne Bacteria (eubacteria) such as Corynebacterium can be preferably used.
  • the VL- ⁇ binding peptide according to the present invention is obtained by culturing the above-described transformed cells in a culture medium, and culturing them in a cultured cell (including the cell periplasm region) or in a culture solution (outside the cell).
  • the peptide according to the invention can be produced and accumulated, and the desired peptide can be collected from the culture.
  • the peptide of the present invention comprises the peptide of the present invention in the cultured cells (including the periplasm region) or in the culture solution (outside the cells) by culturing the above-described transformed cells in a medium. It can be produced by producing and accumulating a fusion peptide, collecting the fusion peptide from the culture, cleaving the fusion peptide with an appropriate protease, and collecting the desired peptide.
  • the method of culturing the transformed cell of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for host culture.
  • the medium used for culturing the obtained transformant is not particularly limited as long as it can produce the peptide of the present invention with high efficiency and high yield.
  • carbon sources and nitrogen sources such as glucose, sucrose, glycerol, polypeptone, meat extract, yeast extract, and casamino acid can be used.
  • inorganic salts such as potassium salt, sodium salt, phosphate, magnesium salt, manganese salt, zinc salt, iron salt and the like are added as necessary.
  • an auxotrophic host cell a nutrient substance required for growth may be added. If necessary, antibiotics such as penicillin, erythromycin, chloramphenicol, neomycin may be added.
  • protease inhibitors ie, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamideline, 4- (2-aminoethyl) -benzonesulfonyl. Fluoride (AEBSF), Antipain, Chymostatin, Leupeptin, Pepstatin A, Phosphoramidon, Aprotinin, Ethylenediaminetic acid acid (EDTA) and / or other commercially available protease inhibitors may be used.
  • molecular chaperones such as GroEL / ES, Hsp70 / DnaK, Hsp90, Hsp104 / ClpB may be used.
  • Such a molecular chaperone is allowed to coexist with the peptide of the present invention by a technique such as co-expression or fusion proteinization.
  • there are techniques such as adding an additive that promotes correct folding to the medium and culturing at a low temperature, but it is not limited thereto. Absent.
  • LB medium tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%) or 2 ⁇ YT medium (tryptone 1.6%, yeast extract) 1.0%, NaCl 0.5%) and the like.
  • the culture temperature is 15 to 42 ° C., preferably 20 to 37 ° C.
  • the peptide of the present invention is cultured aerobically for several hours to several days under aeration and stirring conditions. Or accumulated in the culture solution (extracellular) and collected. In some cases, the culture may be performed anaerobically by blocking aeration.
  • the assembly produced by separating the cultured cell and the supernatant containing the secreted peptide by a general separation method such as centrifugation or filtration after the completion of the culture. The replacement peptide can be recovered.
  • the cells when accumulated in cultured cells (including in the periplasm region), for example, the cells are collected from the culture solution by a method such as centrifugation or filtration, and then the cells are sonicated.
  • the peptide accumulated and produced in the cells can be recovered by crushing by a French press method and / or solubilizing by adding a surfactant or the like.
  • the peptide according to the present invention can be purified by affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, gel filtration chromatography or the like alone or in combination. Confirmation that the obtained purified substance is the target peptide can be carried out by usual methods such as SDS polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequence analysis, Western blotting and the like.
  • the mutant peptide obtained in the following examples is expressed in the form of “peptide name—introduced mutation”, and the wild-type peptide that does not introduce displacement is expressed in the form of “peptide name—Wild”.
  • the B5 domain of wild type PpL312 shown in SEQ ID NO: 3 is indicated by “LB5-Wild”.
  • the B5 domain of PpL312 represented by SEQ ID NO: 1 was mainly used in the experiment.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is obtained by deleting 7 residues that do not form a secondary structure at the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and introducing a mutation of T21H.
  • LB5m-T21H is basically a sequence before mutation and the number of domains is 1, only mutations other than T21H may be described.
  • Table 1 LB5m-T21H / K25R.
  • the 1d mutant peptide is simply denoted as K25R.
  • Example 1 Preparation of various modified VL- ⁇ binding peptides (1) Preparation of expression plasmid LB5m-T21H. Back translation was performed from the amino acid sequence of 1d (SEQ ID NO: 1), the base sequence (SEQ ID NO: 6) encoding the peptide was designed, and the plasmid pEX-LB5m in which this encoded DNA was fully synthesized and inserted into the vector was purchased. (Eurofin Genomics). Next, a PCR reaction using the oligo DNAs shown in Table 1 as primers was performed to prepare expression plasmids of various mutants.
  • Blend Taq-Plus- (TOYOBO)
  • PCR was performed according to the attached protocol, using 5′-primer (B) and 3′-primer in Table 1 as primers and pEX-LB5m as a template plasmid. Reaction was performed.
  • the same PCR reaction was carried out using a reaction solution containing the double-stranded DNA generated by the previous PCR reaction as a template using two kinds of 5′-primer (A) and 3′-primer in Table 1 as primers. went.
  • LB5m-K03R Only in the case of 1d, the first PCR reaction was omitted, and a PCR reaction was carried out using 5′-primer (A) and 3′-primer in Table 1 as primers and pEX-LB5m as a template.
  • the synthesized and extracted double-stranded DNA was cleaved with restriction enzymes SpeI and XhoI (both from Takara Bio Inc.).
  • double-stranded DNA treated with restriction enzymes was subcloned into the SpeI / XhoI sites in the multicloning site of the plasmid vector pET-49b (+) (Merck Millipore).
  • the ligation reaction in subcloning was performed using Ligation High Ver. 2 (TOYOBO) was used in accordance with the protocol attached to the product.
  • transformation of competent cells DH5 ⁇ was performed according to the protocol attached to this competent cell product.
  • a plasmid purification kit (“Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System” manufactured by Promega) according to the standard protocol attached to the kit, the transformed cells were cultured, and plasmid DNA was amplified and extracted. Confirmation of the base sequence of the coding DNA of the expression plasmid was carried out using a DNA sequencer (“3130xl Genetic Analyzer” manufactured by Applied Biosystems).
  • a sequencing PCR reaction was performed using a gene analysis kit (“BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit” manufactured by Applied Biosystems) and a DNA primer for sequencing (SEQ ID NO: 45) according to the attached protocol.
  • the sequencing product was purified using a plasmid purification kit (“BigDye XTerminator Purification Kit” manufactured by Applied Biosystems) according to the attached protocol, and used for base sequence analysis.
  • Competent cells BL21 (DE3) (Biodynamics) were transformed with an expression plasmid whose base sequence of the coding DNA was confirmed, and transformed cells for expression of various modified VL- ⁇ binding peptides were prepared. .
  • the GST fusion peptide was roughly purified from each cell-free extract containing the GST fusion peptide by affinity chromatography using a GSTrap HP column (GE Healthcare Bioscience) having affinity for GST. Specifically, each cell-free extract is added to a GSTRap HP column, and the column is washed with a standard buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, pH 7.4), followed by The target GST fusion peptide was eluted with an elution buffer (50 mM Tris-HCl, 20 mM glutathione, pH 8.0).
  • an elution buffer 50 mM Tris-HCl, 20 mM glutathione, pH 8.0.
  • an amino acid sequence of Ile-Glu-Gly-Arg is added between the N-terminus of the target peptide sequence and GST.
  • This amino acid sequence is a recognition sequence for the sequence-specific protease Factor Xa (Merck Millipore). When this protease is acted on, it is cleaved after Arg. Therefore, the N-terminal vector-derived sequence containing GST is cleaved. Can be removed.
  • the eluate containing the GST fusion peptide was dialyzed against Factor Xa digestion buffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 , pH 8.0), and an enzyme reaction was performed according to the attached protocol.
  • the target peptide was purified from this reaction solution by gel filtration chromatography using a Superdex 75 10/300 GL column (GE Healthcare Bioscience). Specifically, each reaction solution was added to a Superdex 75 10/300 GL column equilibrated with a standard buffer, and the target peptide was separated and purified from the cleaved GST-containing vector-derived sequence and Factor Xa. In addition, the peptide purification by chromatography using the above columns was all performed using the AKTAprime plus system (GE Healthcare Bioscience).
  • Comparative Example 1 Acquisition and Evaluation of Peptide (LB5m-T21H.1d) Before Mutagenesis Using pEX-LB5m as a template, 5′-primer (A) of SEQ ID NO: 8 and 3′-primer of SEQ ID NO: 19 as primers Then, the PCR reaction described in Example 1 was carried out, and then, following the flow described in Example 1, the peptide LB5m-T21H. 1d was prepared.
  • Example 2 Evaluation of residual binding activity after alkali treatment using IgG binding response of various modified VL- ⁇ binding peptides as an indicator Octet RED 384 system (Pole) for analyzing intermolecular interaction using biolayer interferometry ⁇ ForteBio Co., Ltd.) used to immobilize various peptides on biosensors, and the ratio of the binding response to the same concentration of IgG before and after immersing those biosensors in an alkaline solution for a certain period of time after alkali treatment. Binding activity was evaluated.
  • Octet RED 384 system Poly
  • an AR2G biosensor capable of covalently immobilizing the peptide to the sensor via the amino group of the peptide was used.
  • Various purified peptide solutions purified in Example 1 and Comparative Example 1 were adjusted to a concentration of 10 ⁇ M based on UV absorbance and dialyzed against 10 mM AcOH-AcONa, pH 4.5.
  • Various peptides were immobilized according to the biosensor standard protocol (TECHNICAL NOTE 26).
  • a standard buffer solution (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, pH 7.4) was used as a measurement buffer, and an anti-IgE monoclonal IgG preparation (generic name: omalizumab, product name: light chain consisting of ⁇ chain) Zolea (hereinafter abbreviated as aIgE-IgG) was adjusted to a concentration of 10 ⁇ M with a standard buffer.
  • a baseline was taken with a standard buffer, and then contacted with aIgE-IgG at 1000 rpm for 2 minutes to obtain a binding response (calculated as Response with the attached analysis software), which was defined as a binding response before alkali treatment.
  • the sensor after the above measurement was immersed in 20 mM NaOH at room temperature for 8 hours, and then immersed in a standard buffer solution. Then, the binding response to aIgE-IgG was determined in the same flow.
  • a graph plotting the residual activity values of each peptide is shown in FIG.
  • the peptide obtained in Comparative Example 1 was referred to as Cont. Is written.
  • the measurement was divided into two sets and performed on two different days on two sets.
  • the graph was also divided into two sections with spaces, and the residual activity value of the comparative example (LB5m-T36H.1d, Cont.) was measured at the left end. It was shown to. Cont.
  • the difference in the value is considered to be due to the alkali treatment at room temperature, so that the difference occurred depending on the day of implementation, but it is guaranteed that the same processing conditions are in the same set.
  • Patent Document 15 shows an example in which a Lys residue conserved between B1 to B5 of PpL312 and C1 to C4 of PpL3316 (for example, Lys at position 25 of SEQ ID NO: 1) was mutated.
  • this document states that the effect of the mutation was observed only in C1 to C4, and that B1 to B5 had no mutation effect.

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Abstract

本発明は、免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質に特異的に結合し、かつ、特にアルカリ溶液に対する化学的安定性に優れた、免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、および当該アフィニティ分離マトリックスを用いたκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。ペプトストレプトコッカス・マグヌス株由来プロテインＬのκ鎖可変領域結合ドメインに対して、適切な部位に変異を導入したペプチドをアフィニティ・リガンドとして利用することで、上記課題を解決する。

Description

改変型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド
　本発明は、アルカリ溶液に対する化学的安定性が改良された免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、当該アフィニティ分離マトリックスを用いる免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および、当該ベクターにより形質転換された形質転換体に関するものである。
　タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たしている。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度でキャプチャリングして精製するために利用されるプロテインＡアフィニティ分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と略記する場合がある）が挙げられる（非特許文献１，２）。
　抗体医薬として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術などを用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。また、免疫グロブリンを断片化した分子構造を有する断片抗体からなる抗体医薬も盛んに臨床開発されており、様々な断片抗体医薬の臨床開発が進んでいる（非特許文献３）。
　抗体医薬製造工程における初期精製工程には、先述のＳｐＡアフィニティ分離マトリックスが利用されている。しかし、ＳｐＡは基本的にＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質である。よって、Ｆｃ領域を含まない断片抗体は、ＳｐＡアフィニティ分離マトリックスを利用したキャプチャリングができない。従って、抗体医薬精製プロセスのプラットフォーム開発の観点から、ＩｇＧのＦｃ領域を含まない断片抗体をキャプチャリング可能なアフィニティ分離マトリックスに対する産業的なニーズは高い。
　ＩｇＧのＦｃ領域以外に結合するペプチドはすでに複数知られている（非特許文献４）。それらの中でも、結合できる断片抗体フォーマットの種類の多さ、および、ＩｇＭやＩｇＡなどにも結合可能という観点からは、可変領域（抗原結合ドメイン）に結合できるペプチドが最も好ましく、例えば、プロテインＬ（以下、プロテインＬを「ＰｐＬ」と略記する場合がある）がよく知られている。ＰｐＬは、複数のκ鎖可変領域結合ドメイン（以下、κ鎖可変領域を「ＶＬ－κ」と略記する場合がある）を含むタンパク質であり、個々のＶＬ－κ結合性ドメインのアミノ酸配列は異なる。また、菌株の種類によっても、ＶＬ－κ結合性ドメインの数、および個々のアミノ酸配列は異なる。例えば、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｇｎｕｓ）３１２株のＰｐＬに含まれるＶＬ－κ結合性ドメインの数は５個であり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス株３３１６のＰｐＬに含まれるＶＬ－κ結合性ドメインの数は４個である（非特許文献５～７，特許文献１～２）。そして、それら計９個のＶＬ－κ結合性ドメインの中に、互いに同じアミノ酸配列であるドメインは無い。
　ＳｐＡの場合には、部位特異的に変異を導入し、アフィニティ分離マトリックス用リガンドとしての機能を改良するタンパク工学研究が盛んに進められており（非特許文献１，８，特許文献３～８）、特にＳｐＡアフィニティ分離マトリックスの洗浄に広く用いられる水酸化ナトリウム溶液に対する化学的安定性の向上を目的とした研究が多い。具体的には、アルカリ性条件下で脱アミド化反応を受け易いことが知られるアスパラギン残基、および、アスパラギン残基の後ろのグリシン残基へのアミノ酸置換変異が化学的安定性の向上に効果がある。しかし、ＳｐＡ中の全てのアスパラギン残基に関し、このような変異がアルカリ耐性向上効果を示すわけではない（非特許文献８）。
　ＰｐＬをリガンドとするアフィニティ分離マトリックスもすでに複数市販されている。ＰｐＬの結合力や結合様式を解析することを目的とした変異導入の報告は複数存在し（非特許文献７，９，１０）、アフィニティリガンドとしての機能改変を意図した研究の報告も存在する（特許文献９，１０）。しかし、ＳｐＡの場合に比較するとＰｐＬの変異導入報告例は限られており、特にアルカリ溶液に対する化学的安定性は、ＳｐＡアフィニティ分離マトリックスの場合には、ＳｐＡの改良によって０．１～０．５Ｍ水酸化ナトリウムでの洗浄が可能となっているのに対し、ＰｐＬアフィニティ分離マトリックスの場合には、０．０２～０．０５Ｍ水酸化ナトリウムが推奨されている（非特許文献１１）。近年になって、ＰｐＬのアルカリ溶液に対する化学的安定性が高いＶＬ－κ結合性ドメインのアミノ酸配列（特許文献１１，１２，１３）、および、当該特性を改良する変異（特許文献１４，１５，１６）に関する報告もなされている。しかし、ＳｐＡの化学的安定性を指標とした場合には、ＰｐＬのアルカリ溶液に対する化学的安定性は、更なる改良が必要と言える。
特表平７－５０６５７３号公報 特表平７－５０７６８２号公報 米国特許第５１４３８４４号公報 特表２００６－３０４６３３号公報 欧州特許第１１２３３８９号公報 国際公開第０３／０８０６５５号パンフレット 米国公開第２００６／０１９４９５０号公報 国際公開第２０１１／１１８６９９号パンフレット 国際公開第２０１６／１２１７０３号パンフレット 国際公開第２００８／１１５１５１号パンフレット 特開２０１６－０７９１４９号公報 国際公開第２０１６／１２１７０３号パンフレット 国際公開第２０１６／０９６６４３号パンフレット 国際公開第２０１６／０９６６４４号パンフレット 国際公開第２０１７／０６９１５８号パンフレット 国際公開第２０１７／１９１７４８号パンフレット
Hober S．ら，J．Chromatogr．B，2007，848巻，40-47頁 Shukla A．A．ら，Trends Biotechnol．，2010，28巻，253-261頁 Nelson A．N．ら，Nat．Biotechnol．，2009，27巻，331-337頁 Bouvet P．J．，Int．J．Immunopharmac．，1994，16巻，419-424頁 Kastern W．ら，J．Biol．Chem．，1992，267巻，12820-12825頁 Murphy J．P．ら，Mol．Microbiol．, 1994，12巻，911-920頁 Housden N．G．ら，Biochemical Society Transactions，2003，31巻，716-718頁 Linhult M. ら, PROTEINS, 2004, 55巻, 407-416頁 Housden N．G．ら，J．Biol．Chem．，2004，279巻，9370-9378頁 Tadeo X．ら，Biophys．J．，2009，97巻，2595-2603頁 Rodrigo G．ら，Antibodies，2015，4巻，259-277頁
　免疫グロブリンのκ鎖に結合性を示し、アルカリ溶液に対する化学的安定性に優れた、新規な改変型プロテインＬ（ＰｐＬ）、および、当該改変型ＰｐＬをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、および当該アフィニティ分離マトリックスを用いたκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法を提供することが、本発明の課題である。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、ＰｐＬのＶＬ－κ結合性ドメインの変異体を分子設計し、タンパク質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて、該変異体を、形質転換細胞から取得し、取得した該変異体の物性を比較する検討を行った。
　その結果として完成した本発明を以下に示す。
　［１］　下記アミノ酸配列（Ｉ）～（ＩＩＩ）のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
　（Ｉ）　配列番号１のアミノ酸配列において、（ａ）～（ｈ）の少なくとも１つ以上のアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列（但し、（ｂ）または（ｅ）の変異と（ｇ）の変異、および、（ｃ）または（ｄ）の変異と（ｈ）の変異を同時に導入しないものとする）：
　（ａ）　第３位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
　（ｂ）　第９位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
　（ｃ）　第１６位のＡｓｐをＧｌｕに置換；
　（ｄ）　第１８位のＴｈｒをＬｙｓまたはＡｒｇに置換；
　（ｅ）　第２３位のＴｈｒをＧｌｕに置換；
　（ｆ）　第２５位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
　（ｇ）　第９位のＬｙｓをＡｓｐまたはＧｌｕ、かつ、第２３位のＴｈｒをＬｙｓまたはＡｒｇに置換；
　（ｈ）　第１６位のＡｓｐをＬｙｓまたはＡｒｇ、かつ、第１８位のＴｈｒをＡｓｐまたはＧｌｕに置換；
　（ＩＩ）　上記（Ｉ）に規定されるアミノ酸配列において、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の１個もしくは２個のアミノ酸が欠失および／もしくは置換されたアミノ酸配列、並びに／または、Ｎ末端および／もしくはＣ末端に１個以上２０個以下のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列；
　（ＩＩＩ）　上記（Ｉ）に規定されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（但し、配列番号１における第３位、第９位、第１６位、第１８位、第２３位、および、第２５位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基は、さらに変異しないものとする）。
　［２］　上記（Ｉ）～（ＩＩＩ）のいずれかに規定されるアミノ酸配列において、（ｉ）～（ｊ）の少なくとも１つ以上のアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有する上記［１］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
　（ｉ）　配列番号１における第４４位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
　（ｊ）　配列番号１における第４８位のＬｙｓをＡｒｇに置換。
　［３］　上記［１］または［２］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドを２個以上有することを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体。
　［４］　２個以上の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドが、単一の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドである上記［３］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体。
　［５］　上記［１］もしくは［２］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは上記［３］もしくは［４］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体、および水不溶性担体を有し、免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティ分離マトリックス。
　［６］　免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
　上記［５］に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
　アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
　［７］　上記［１］もしくは［２］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは上記［３］もしくは［４］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
　［８］　上記［７］に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
　［９］　上記［８］に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
　本発明で得られた改変型ＰｐＬを固定化したアフィニティ精製用クロマトグラフィ担体は、アルカリ処理のダメージによるκ鎖結合活性の低下が少ないため、繰返し使用に際してのクリーニング時に、クロマトグラフィ担体に残留した有機物等の不純物除去効果が高い水酸化ナトリウムでの効果的な（具体的には高濃度または長時間での）洗浄が可能となる。
各々のペプチドのアルカリ処理後の残存活性値をプロットしたグラフである。
　本発明は、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）のいずれかのアミノ酸配列を有する免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドに関する。以下、アミノ酸配列（Ｉ）～（ＩＩＩ）を有する免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドを「免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド（Ｉ）～（ＩＩＩ）」や「ＶＬ－κ結合性ペプチド（Ｉ）～（ＩＩＩ）」と略記する場合がある。
　（Ｉ）　配列番号１のアミノ酸配列において、（ａ）～（ｈ）の少なくとも１つ以上のアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列（但し、（ｂ）または（ｅ）の変異と（ｇ）の変異、および、（ｃ）または（ｄ）の変異と（ｈ）の変異を同時に導入しないものとする）：
　（ａ）　第３位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
　（ｂ）　第９位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
　（ｃ）　第１６位のＡｓｐをＧｌｕに置換；
　（ｄ）　第１８位のＴｈｒをＬｙｓまたはＡｒｇに置換；
　（ｅ）　第２３位のＴｈｒをＧｌｕに置換；
　（ｆ）　第２５位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
　（ｇ）　第９位のＬｙｓをＡｓｐまたはＧｌｕ、かつ、第２３位のＴｈｒをＬｙｓまたはＡｒｇに置換；
　（ｈ）　第１６位のＡｓｐをＬｙｓまたはＡｒｇ、かつ、第１８位のＴｈｒをＡｓｐまたはＧｌｕに置換；
　（ＩＩ）　上記（Ｉ）に規定されるアミノ酸配列において、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の１個もしくは２個のアミノ酸が欠失もしくは置換されたアミノ酸配列、並びに／または、Ｎ末端および／もしくはＣ末端に１個以上２０個以下のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列；
　（ＩＩＩ）　上記（Ｉ）に規定されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（但し、配列番号１における第３位、第９位、第１６位、第１８位、第２３位、および、第２５位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基は、さらに変異しないものとする）。
　「免疫グロブリン（Ｉｇ）」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、この特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、“Ｙ”字型の４本鎖構造（軽鎖・重鎖の２本のポリペプチド鎖が２本ずつ）を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）には、λ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖のという構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
　免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１～ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。プロテインＬは、軽鎖がκ鎖である可変領域（本明細書では「ＶＬ－κ」と省略する場合がある）に結合する（非特許文献５～７）。
　本発明に係るペプチドは、免疫グロブリンのκ鎖可変領域（ＶＬ－κ領域）に結合する。本発明で得られたペプチドが結合すべきＶＬ－κ領域含有タンパク質は、ＶＬ－κ領域を含むものであればよく、Ｆａｂ領域とＦｃ領域を不足なく含有するＩｇＧであってもよいし、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡなどの他のＩｇ類であってもよいし、それらをタンパク質工学的に改変した免疫グロブリン分子の誘導体であってもよい。本発明に係るＶＬ－κ領域結合性ペプチドが結合する免疫グロブリン分子誘導体は、ＶＬ－κ領域を有する誘導体であれば特に制限されない。例えば、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域のみに断片化されたＦａｂフラグメント、免疫グロブリンＧの可変領域のみからなるｓｃＦｖ、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、薬剤を共有結合したｓｃＦｖ断片などを挙げることができる。
　本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。本明細書においては、ペプチドとタンパク質は基本的に同義である。「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。タンパク質やペプチドの「変異体」は、野生型のタンパク質やペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の置換、付加または欠失が導入されたタンパク質またはペプチドをいう。アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型または非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、第２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異は、Ｇ２９Ａと記載する。
　「プロテインＬ（ＰｐＬ）」は、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する嫌気性グラム陽性球菌の細胞壁に由来するタンパク質である。好ましくは、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｇｎｕｓ）に由来するＰｐＬであり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株、および、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３３１６株に由来する２種類のＰｐＬが好ましいが、これらに限定されない（非特許文献４～６）。なお、本明細書では、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株のＰｐＬを「ＰｐＬ３１２」、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３３１６株由来のＰｐＬを「ＰｐＬ３３１６」と省略することがある。
　ＰｐＬは、７０～８０残基からなる複数のＶＬ－κ結合性ドメインを含有する。ＰｐＬ３１２に含まれるＶＬ－κ結合性ドメインの数は５個であり、ＰｐＬ３３１６に含まれるＶＬ－κ結合性ドメインの数は４個である。ＰｐＬ３１２のＶＬ－κ結合性ドメインは、Ｎ末端から順に、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５ドメインと呼び、ＰｐＬ３３１６のＶＬ－κ結合性ドメインは、Ｎ末端から順に、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４ドメインと呼ぶ（非特許文献５～６）。本発明を適用するのは、これらのＶＬ－κ結合性ドメインの中のＢ５ドメインが好ましい。
　本発明を適用するのは、Ｂ５ドメインに特許文献６に記載の変異を導入した配列番号１に示すアミノ酸配列が好ましいが、例えば、野生型Ｂ５ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）でもよく、ＰｐＬ３１２のＢ４ドメインより後ろを全て含んだＢ５ドメインのアミノ酸配列（配列番号３）でもよく、特許文献１２に記載のアミノ酸数が異なるＢ５ドメインのアミノ酸配列（配列番号４）でもよい。Ｂ５ドメインのアミノ酸配列のアミノ酸数が文献によって異なるのは、Ｎ末端の約２０残基は特定の二次構造を取らないことが要因である。Ｎ末端領域を欠失させた場合にも、ＶＬ－κ結合性ドメインとして三次元構造を保持し、ＶＬ－κ結合性を示す（非特許文献７）。したがって、配列番号１で示すＢ５ドメインについても、Ｎ末端領域１～５残基を欠失させることは可能である。配列番号１で示すアミノ酸配列の第１位は、非特許文献７～８および特許文献９に倣って残基番号を付与すると第１６位となる。
　本発明は、野生型のＰｐＬのＶＬ－κ結合性ドメインに対し、特定のアミノ酸置換変異を導入することによって、アルカリ性水溶液に対する化学的安定性が、変異導入前に比べて向上していることを特徴とする変異体を創製する技術である。
　改変型ＶＬ－κ結合性ペプチドは、後記の実施例において確かめられている通り、アルカリ性水溶液で処理（浸潤）した後の、アルカリによるダメージがより少なく、結合性能を高いレベルで維持している。
　本発明に係るアミノ酸残基の置換部位は、配列番号１のアミノ酸配列における第３位、第９位、第１６位、第１８位、第２３位、および、第２５位から選択される１つ以上のアミノ酸残基である。配列番号１の第３位はＬｙｓ、第９位はＬｙｓ、第１６位はＡｓｐ、第１８位はＴｈｒ、第２３位はＴｈｒ、および、第２５位はＬｙｓである。変異導入前のＢ５ドメインのアミノ酸配列のアミノ酸数が異なる場合においても、配列同一性が９０％以上である場合に、配列番号１の第３位、第９位、第１６位、第１８位、第２３位、および、第２５位に相当する位置を同定することは、当業者であれば容易に可能である。具体的には、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）、または、遺伝情報処理ソフトウエアであるＧＥＮＥＴＹＸ（https://www.genetyx.co.jp/）で、アラインメントをとって確かめることが可能である。なお、非特許文献７～８および特許文献９に記載の残基番号に従えば、本発明に係るアミノ酸残基の置換部位はそれぞれ、第１８位、第２４位、第３１位、第３３位、第３８位、および、第４０位に相当する。
　本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチド（Ｉ）～（ＩＩＩ）は、上述の第３位、第９位、第１６位、第１８位、第２３位、および、第２５位から選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換された配列番号１のアミノ酸配列を有する。置換される位置は、第３位、第９位、第１６位、第１８位、および、第２５位が好ましく、第３位、第９位、第１６位、および、第２５位がさらにより好ましく、第３位、第９位、および、第２５位がさらにより好ましく、第９位、および、第２５位がさらにより好ましい。置換されるアミノ酸変異の数は、特に限定されないが、１つ以上が好ましく、２つ以上がより好ましく、３つ以上がさらにより好ましく、４つ以上がさらにより好ましい。当該変異数の上限は特に制限されず、６であってもよい。
　本発明においてペプチドが「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、そのペプチドのアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、そのペプチドの機能が維持されていることを意味する。ペプチドにおいて特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、－Ｓ－Ｓ－結合などの架橋構造などが挙げられる。
　変異するアミノ酸の種類は、非タンパク質構成アミノ酸や非天然アミノ酸への置換を含め、特に限定されるものではないが、遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸を好適に用いることができる。さらに、天然型アミノ酸は、中性アミノ酸；ＡｓｐとＧｌｕの酸性アミノ酸；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性アミノ酸に分類される。中性アミノ酸は、脂肪族アミノ酸；Ｐｒｏのイミノ酸；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐの芳香族アミノ酸に分類される。脂肪族アミノ酸は、さらに、Ｇｌｙ；Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの分枝アミノ酸；Ｓｅｒ、Ｔｈｒのヒドロキシアミノ酸；Ｃｙｓ、Ｍｅｔの含硫アミノ酸；Ａｓｎ、Ｇｌｎの酸アミドアミノ酸に分類される。また、Ｔｙｒはフェノール性水酸基を有することから、芳香族アミノ酸のみでなくヒドロキシアミノ酸に分類してもよい。さらに、別の観点からは、天然アミノ酸を、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅの疎水性の高い非極性アミノ酸類；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒの中性の極性アミノ酸類；Ａｓｐ、Ｇｌｕの酸性の極性アミノ酸類；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性の極性アミノ酸類に分類することもできる。本発明においては、上記特定位置のアミノ酸を同一の群に分類されるアミノ酸に置換してもよいし、異なる群に分類されるアミノ酸に置換してもよい。
　（ａ）～（ｆ）のアミノ酸置換変異については、単独でもアルカリに対する化学的安定性の向上に効果が期待できるが、複数導入しても同様の効果が期待できる。特に、（ｂ）と（ｅ）、および／または、（ｃ）と（ｄ）は、アミノ酸の側鎖が立体構造上近接しており、複数導入することで相乗効果が期待される。ゆえに、（ｇ）や（ｈ）のような変異も同様の効果が期待できる。
　本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドは、上述のアミノ酸置換変異が導入されたアミノ酸配列（Ｉ）に対し、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の１個または２個のアミノ酸が欠失および／もしくは置換されたアミノ酸配列、並びに／または、Ｎ末端および／もしくは末端に１個以上２０個以下のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列（ＩＩ）を有していても良い。
　上記の欠失および／もしくは置換の変異の数としては、１または２が好ましく、１がより好ましい。付加の変異の数としては、１５以下または１０以下が好ましく、７以下、５以下または３以下がより好ましく、１または２がさらに好ましく、１が特に好ましい。アミノ酸残基の欠失／置換／付加の位置としては、例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端を挙げることができる。これら部位は、特に欠失および／または付加の部位として好ましい。したがって、例えば、かかる変異を配列番号３や配列番号４のアミノ酸配列に適用できるが、これらに限定されない。例えば、ＰｐＬ３１２のＢ１～Ｂ４ドメインのＮ末端領域の配列を付加してもよく、例えば、配列番号１のＮ末端領域をＢ２ドメインのＮ末端領域のアミノ酸配列に置き換えた配列番号５に示すアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。この場合、配列番号１のアミノ酸配列の第１位は、配列番号５のアミノ酸配列においては第７位となる。付加配列の実施形態の一つとして、開始コドンに相当するＭｅｔのＮ末端への付加、および、リンカー残基やマトリックス固定化残基の役割を期待して、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、および／またはＬｙｓを含むアミノ酸配列のＮ末端および／もしくはＣ末端への付加が挙げられる。
　本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドは、上述のアミノ酸置換変異が導入されたアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ＩＩＩ）を有していても良い。例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。但し、配列番号１における第３位、第９位、第１６位、第１８位、第２３位、および、第２５位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基は、さらに変異しないものとする。したがって、本発明で得られたアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する限りにおいては、さらに変異を導入しても良い。上記配列同一性としては、９０％以上または９２％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がさらに好ましく、９９％以上または９９．５％以上がより更に好ましい。上記の配列同一性は、上述の通り、Ｃｌｕｓｔａｌなどを使って評価することができる。
　上述の特定のアミノ酸置換変異が導入されたアミノ酸配列に対して、更に（ｉ）～（ｊ）の少なくとも１つ以上のアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有するＶＬ－κ結合性ペプチドもまた本発明に含まれる。
（ｉ）　配列番号１における第４４位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
（ｊ）　配列番号１における第４８位のＬｙｓをＡｒｇに置換。
　本変異によって、例えば特許文献１０で開示されるような、アミノ酸配列中のＬｙｓを限定して、マトリックスへの固定化のされ方を制御することが可能となる。
　本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドは、そのアルカリ性水溶液に対する化学的安定性が、置換導入前に比べて向上していることを特徴とする。
　「アルカリ性水溶液」とは、洗浄または殺菌の目的を達成し得る程度のアルカリ性を指す。より具体的には、０．０１Ｍ以上１．０Ｍ以下または０．０１Ｎ以上１．０Ｎ以下の水酸化ナトリウム水溶液などが該当するが、これに限定されるものではない。水酸化ナトリウムを例とした場合、その濃度の下限は、０．０１Ｍが好ましく、０．０２Ｍがより好ましく、０．０５Ｍがさらにより好ましい。一方、水酸化ナトリウムの濃度の上限は、１．０Ｍが好ましく、０．５Ｍがより好ましく、０．３Ｍがさらにより好ましく、０．２Ｍがさらにより好ましく、０．１Ｍがさらにより好ましい。アルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液である必要はないが、そのｐＨは１２以上１４以下が好ましい。ｐＨの下限に関し、ｐＨ１２．０以上が好ましく、ｐＨ１２．５以上がより好ましい。ｐＨの上限に関し、ｐＨ１４以下が好ましく、ｐＨ１３．５以下がさらにより好ましく、ｐＨ１３．０以下がさらにより好ましい。
　「化学的安定性」とは、タンパク質がアミノ酸残基の化学変化などの化学修飾、および、アミド結合の転移や切断などの化学変性に対して、タンパク質の機能を保持する性質を指す。本発明においては、タンパク質の機能保持とは、ＶＬ－κへの結合活性の維持を指すものであり、すなわち、「化学的安定性」が高い程、アルカリ性水溶液への浸漬処理の後も、ＶＬ－κへの結合活性が低下する度合いが小さい。ＶＬ－κへの結合活性は、具体的には、化学変性を受けずにＶＬ－κへの親和性を保持しているポリペプチドの割合をいう。なお、本明細書中における「アルカリ耐性」という用語も、「アルカリ性条件下における化学的安定性」と同義である。
　アルカリに浸漬する時間は、アルカリの濃度や浸漬時の温度によってペプチドの受けるダメージは大きく異なるので、特に限定はされない。例えば、水酸化ナトリウムの濃度が０．０５Ｍで、浸漬時の温度が室温の場合、アルカリに浸漬する時間の下限は、１時間が好ましく、２時間がより好ましく、４時間がより好ましく、１０時間がより好ましく、２０時間がより好ましいが、特に限定はされない。上記時間の上限も特に限定されないが、例えば５０時間とすることができる。
　免疫グロブリンに対する親和性は、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム(ＧＥヘルスケア社)や、バイオレイヤー干渉法を用いたＯｃｔｅｔ（ポール社）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。測定条件としては、本発明のペプチドがＶＬ－κに結合した時の結合シグナルが検出できれば良い。測定条件としては、温度は２０～４０℃の一定温度にし、結合状態を見るときのｐＨは５以上、８以下の中性条件にすることが好ましい。緩衝液の成分としては、中性の場合には、リン酸、トリス、ビストリスなどが挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、特に限定はされないが、０～０．１５Ｍ程度が好ましい。
　ＶＬ－κに結合していることを示すパラメータとしては、例えば、親和定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田他　著、「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」、シュプリンガー・フェアラーク東京、１９９８年、４１頁）。本発明のタンパク質のＶＬ－κに対する親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにヒトＩｇＧを固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、各ドメイン変異体を流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係るタンパク質について、ヒトＶＬ－κへの親和定数（ＫA）が好ましくは１×１０5（Ｍ-1）以上、より好ましくは１×１０6（Ｍ-1）以上であるタンパク質を好適に用いることができる。しかし、親和定数は、ＶＬ－κ含有ペプチドの種類や、ＶＬ－κ結合性ペプチドのドメイン数によっても変わるので、これに限定されない。
　ただし、アルカリ処理後の残存結合活性を求める場合には、結合パラメータとして、ＫAやＫDは不適切である。アルカリ処理によって、ＶＬ－κに結合できる分子の比率が変化しても、ペプチド１分子のＶＬ－κに対する結合能は変化しない場合には、パラメータとしては変化が見られないからである。ペプチドの残存結合活性を求める場合には、例えば、ペプチドを、センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）またはバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ）に固定化し、ペプチドを化学処理する前と後で、同一濃度のＶＬ－κ含有タンパク質を添加したときの、結合レスポンスの大きさを指標とするのが良い。結合レスポンスの大きさを示す単位は、Ｂｉａｃｏｒｅではレゾナンスユニット（ＲＵ）であり、Ｏｃｔｅｔではナノメートル（ｎｍ）であるが、これらに限定されるものではない。例えば、ＶＬ－κ含有タンパク質を固定化した系に対し、同じ濃度のアルカリ処理していないペプチドとアルカリ処理したペプチドを添加して、結合レスポンスの大きさを比較しても良い。
　残存結合活性は、アルカリ処理前後の比較なので、基本的には、アルカリ処理前の結合活性を分母とし、アルカリ処理後の結合活性を分子とする、比率（パーセンテージ）で表すことができる。その数値は、同じ条件でアルカリ処理した本発明の変異が導入されていないペプチドと比較して高ければ、特に限定はされないが、その比率が５％以上であるのが好ましく、１０％以上であるのが好ましく、２０％以上であるのがより好ましく、３０％以上であるのがさらにより好ましく、４０％以上であるのがさらにより好ましく、５０％以上であるのがさらにより好ましい。上記比率の上限は、勿論１００％が好ましい。
　この際に重要なことは、比較対照とするサンプルは、本発明の変異が含まれていないという点だけが異なり、それ以外のアミノ酸配列は同じであり、かつ、アルカリ処理および残存結合活性の測定の条件を全て一緒にすることである。また、本発明のペプチドは、アルカリ性水溶液中（アルカリ条件下）ではＶＬ－κ結合性は示さないので、アルカリ処理の後で酸による中和によってｐＨを中性にするなどの適切な処理が必要である。
　ＰｐＬは、ＶＬ－κ結合性ドメインが４個または５個タンデムに並んだ形で含んだタンパク質である。したがって、本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドも、実施形態の１つとして、単量体または単ドメインである当該ＶＬ－κ結合性ペプチドが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限としては、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは６個以下である。これらの多量体は、単一のＶＬ－κ結合性ペプチドの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、複数種類のＶＬ－κ結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
　本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチド多量体における複数ドメインの連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法、および、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下であり、さらにより好ましくは５残基以下であり、さらにより好ましくは２残基以下である。これらのアミノ酸配列は、単量体タンパク質の３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
　その他、実施形態の１つとして、本発明により得られるＶＬ－κ結合性ペプチドまたはその多量体が、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドが挙げられる。融合ペプチドの例としては、アルブミンやグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたペプチドの有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
　本発明は、本発明ペプチドを、免疫グロブリンやその断片、特にＶＬ－κに親和性を有することを特徴とするアフィニティリガンドとして利用することも、実施形態の１つとして包含する。同様に、当該リガンドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするアフィニティ分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。
　本発明に係るアフィニティ分離マトリックスは、本発明に係る上記ＶＬ－κ結合性ペプチドまたは上記ＶＬ－κ結合性ペプチド多量体が、リガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とする。
　本発明において「リガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集または結合する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、ＶＬ－κに対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティリガンド」と同意である。
　本発明において「アフィニティリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集または結合する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、ＶＬ－κに対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティリガンド」と同意である。
　本発明に用いる水不溶性担体としては、無機担体、有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機担体－有機担体、有機担体－無機担体などの複合担体などが挙げられる。無機担体の材料としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどが挙げられる。有機担体の材料としては合成高分子や多糖類などが挙げられ、合成高分子としては架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどが挙げられ、多糖類としては結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）　Ｓ－１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）　ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅ（登録商標）などを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
　また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティ分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
　上記リガンドは、直接またはリンカー基を介して、共有結合により上記水不溶性担体に固定化されている。当該リンカー基としては、例えば、Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基（－ＮＨ－）、エーテル基（－Ｏ－）、カルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）、エステル基（－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（＝Ｏ）－）、アミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－または－ＮＨＣ（＝Ｏ）－）、ウレア基（－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－）；Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される２以上１０以下の基が連結された基；アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される基を一端または両端に有するＣ1-6アルキレン基を挙げることができる。上記の連結数としては、８以下または６以下が好ましく、５以下がより好ましく、４以下がさらに好ましい。また、上記Ｃ1-6アルキレン基は、水酸基などの置換基などにより置換されていてもよい。
　本発明に係るアフィニティ分離マトリックスは、上記リガンドを上記水不溶性担体に固定化することにより製造することができる。
　リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシ基またはチオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
　また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与したＶＬ－κ結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
　本発明のアフィニティ分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのκ鎖可変領域を含むタンパク質（ＶＬ－κ含有タンパク質）をアフィニティカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。これらのＶＬ－κ含有タンパク質の精製法は、免疫グロブリンのアフィニティカラム・クロマトグラフィ精製法、例えばＳｐＡアフィニティ分離マトリックスを利用した精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。
　即ち、ＶＬ－κ含有タンパク質の溶液を調製（ｐＨは中性付近）した後、当該溶液を本発明のアフィニティ分離マトリックスを充填したアフィニティカラムに通過させ、ＶＬ－κ含有タンパク質を吸着させる。次いで、アフィニティカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望のＶＬ－κ含有タンパク質はカラム内の本発明に係るアフィニティ分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明で得られたペプチドをリガンドとして固定化したアフィニティ分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とするＶＬ－κ含有タンパク質を吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望のＶＬ－κ含有タンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。ペプチドを溶出するために用いられる上記酸性緩衝液には、マトリックスからの解離を促進する物質を添加してもよい。
　本発明のアフィニティ分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。上記の再生用緩衝液には、適当な変性剤や有機溶剤を配合してもよい。本発明のアフィニティ分離マトリックスは、アルカリ性水溶液に対する化学的安定性に優れるので、強アルカリの純粋な緩衝液を通過させて洗浄することで再利用することが好ましい。しかし、強アルカリの純粋な緩衝液で再生する操作をするタイミングは、使用後に毎回である必要は無く、例えば、５回に１回、１０回に１回でも構わない。
　本発明は、上記改変型ＶＬ－κ結合性ペプチドをコードするＤＮＡにも関する。かかるＤＮＡの塩基配列は、例えば、上記ペプチドのアミノ酸配列を逆翻訳することにより決定することができる。本発明ペプチドをコードするＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、当該ペプチドを構成するものであればいずれでもよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、「ＰＣＲ」と略記する）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。当該塩基配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、当該組換えＤＮＡを含む、プラスミドおよびファージなどのベクター、さらには、当該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換微生物／細胞、または、当該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、または、当該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることができる。
　また、本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。即ち、本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドを含む融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物、または、細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。
　本発明のペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
　即ち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
　また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および－鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。
　また、本発明の単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法として、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。
　本発明の「発現ベクター」は、前述した本発明ペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、本発明ペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。
　本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
　本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明に係るペプチドを生成蓄積させ、該培養物から所望のペプチドを採取することにより製造することができる。また、本発明ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明ペプチドを含む融合ペプチドを生成蓄積させ、当該培養物から当該融合ペプチドを採取し、当該融合ペプチドを適切なプロテアーゼによって切断し、所望のペプチドを採取することにより製造することができる。
　本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、本発明ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することができる。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
　さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
　さらに、本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい。かかる分子シャペロンは、例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のペプチドと共存させる。なお、本発明ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
　大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）、または、２×ＹＴ培地（トリプトン　１．６％，酵母エキス１．０％，ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。
　また、培養温度は、１５～４２℃、好ましくは２０～３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間～数日培養することにより本発明ペプチドを、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。
　本発明に係るペプチドの精製はアフィニティクロマトグラフィ、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ等を単独で、または、適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のペプチドであることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
　本願は、２０１８年３月２９日に出願された日本国特許出願第２０１８－６４８９０号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１８年３月２９日に出願された日本国特許出願第２０１８－６４８９０号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　以下の実施例で取得した変異ペプチドは「ペプチド名－導入した変異」の形で表記し、変位を導入しない野生型ペプチドは「ペプチド名－Ｗｉｌｄ」の形で表記する。例えば、配列番号３で示される野生型ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインは「ＬＢ５－Ｗｉｌｄ」で示す。また、本実施例においては、配列番号１で示されるＰｐＬ３１２のＢ５ドメインを実験でメインに利用した。配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端において二次構造を形成しない７残基を欠失させ、且つＴ２１Ｈの変異を導入したものである。配列番号１で示されるＰｐＬ３１２のＢ５ドメインを配列番号３のＢ５ドメインと区別するため、「ＬＢ５ｍ－Ｔ２１Ｈ」と表記する。複数の変異を同時に導入した変異体の表記については、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｔ２１ＨおよびＫ２５Ｒを導入した場合は、「ＬＢ５ｍ－Ｔ２１Ｈ／Ｋ２５Ｒ」と表記する。また、ドメイン数に関しては、ピリオドに続けて連結した数に「ｄ」をつけて併記する。単ドメインからなる変異体の場合には、「ＬＢ５ｍ－Ｔ２１Ｈ．１ｄ」と表記する。ただし、本明細書では、基本的にはＬＢ５ｍ－Ｔ２１Ｈが変異前の配列であり、かつ、ドメイン数も１なので、単にＴ２１Ｈ以外の変異のみを記載する場合がある。例えば表１では、ＬＢ５ｍ－Ｔ２１Ｈ／Ｋ２５Ｒ．１ｄの変異体ペプチドを単にＫ２５Ｒと表記している。
　実施例１：　各種改変型ＶＬ－κ結合性ペプチドの調製
　（１）発現プラスミド調製
　ＬＢ５ｍ－Ｔ２１Ｈ．１ｄ（配列番号１）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号６）を設計し、本コードＤＮＡを全合成してベクターに挿入したプラスミドｐＥＸ－ＬＢ５ｍを購入した（ユーロフィンジェノミクス社）。次に表１に示すオリゴＤＮＡをプライマーとして用いるＰＣＲ反応を行い、各種変異体の発現プラスミドを調製した。まず、Ｂｌｅｎｄ　Ｔａｑ　－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、表１の５’－ｐｒｉｍｅｒ（Ｂ）と３’－ｐｒｉｍｅｒの２種をプライマーとし、ｐＥＸ－ＬＢ５ｍを鋳型プラスミドとして、添付のプロトコルに従いＰＣＲ反応を行った。次に、表１の５’－ｐｒｉｍｅｒ（Ａ）と３’－ｐｒｉｍｅｒの２種をプライマーとし、先のＰＣＲ反応によって生成した二本鎖ＤＮＡを鋳型として含む反応液を用い、同様のＰＣＲ反応を行った。なお、表１のＬＢ５ｍ－Ｋ０３Ｒ．１ｄの場合のみ、最初のＰＣＲ反応は省略し、表１の５’－ｐｒｉｍｅｒ（Ａ）と３’－ｐｒｉｍｅｒの２種をプライマーとし、ｐＥＸ－ＬＢ５ｍを鋳型としたＰＣＲ反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＳｐｅＩとＸｈｏＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＥＴ－４９ｂ（＋）（メルクミリポア社）のマルチクローニングサイト中のＳｐｅＩ／ＸｈｏＩサイトに制限酵素処理した二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ　Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。
　上記ライゲーション反応液を用いて、コンピテント細胞ＤＨ５α（タカラバイオ社）の形質転換を、本コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製「Ｗｉｚａｒｄ　Ｐｌｕｓ　ＳＶ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、形質転換した細胞を培養し、プラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ．１．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ」）と、シークエンシング用ＤＮＡプライマー（配列番号４５）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「ＢｉｇＤｙｅ　ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。コードＤＮＡの塩基配列を確認した発現プラスミドを用いて、コンピテント細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）（バイオダイナミクス社）の形質転換を行い、各種改変型ＶＬ－κ結合性ペプチドの発現用形質転換細胞を調製した。
　（２）タンパク質の発現と精製
　上記（１）で得られた各種形質転換細胞を、カナマイシンを３０μｇ／ｍＬの濃度で含有するオート・インダクション培地Ｍａｇｉｃ　Ｍｅｄｉａ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、３０℃で２４時間培養した。培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＥＴ－４９ｂ（＋）ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。
　ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ　ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティクロマトグラフィにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。具体的には、各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ　ＨＰカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。
　表１の５’－ｐｒｉｍｅｒ（Ａ）を用いてサブクローニングすると、目的のペプチド配列のＮ末端とＧＳＴとの間に、Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇというアミノ酸配列が付加される。このアミノ酸配列は、配列特異的プロテアーゼＦａｃｔｏｒ　Ｘａ（メルクミリポア社）の認識配列であり、このプロテアーゼを作用させるとＡｒｇの後ろで切断されるため、ＧＳＴを含むＮ末端側のベクター由来配列を切断して除去することが可能である。ＧＳＴ融合ペプチド含有溶出液をＦａｃｔｏｒ　Ｘａ消化用緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＣａＣｌ2、ｐＨ８．０）にて透析し、添付プロトコルに従い酵素反応を行った。
　本反応液から、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィにて、目的のペプチドを精製した。具体的には、標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のペプチドを、切断したＧＳＴ含有ベクター由来配列やＦａｃｔｏｒ　Ｘａから分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。
　比較例１：　変異導入前のペプチド（ＬＢ５ｍ－Ｔ２１Ｈ．１ｄ）の取得・評価
　ｐＥＸ－ＬＢ５ｍを鋳型とし、配列番号８の５’－ｐｒｉｍｅｒ（Ａ）と配列番号１９の３’－ｐｒｉｍｅｒをプライマーとし、実施例１に記載のＰＣＲ反応を行い、その後は実施例１に記載の流れに沿って、配列番号１に示す変異導入前のペプチドＬＢ５ｍ－Ｔ２１Ｈ．１ｄを調製した。
　実施例２：　各種改変型ＶＬ－κ結合性ペプチドのＩｇＧ結合レスポンスを指標としたアルカリ処理後の残存結合活性評価
　バイオレイヤー干渉法を用いて分子間相互作用を解析する装置Ｏｃｔｅｔ　ＲＥＤ　３８４システム（ポール・フォルテバイオ社）を用いて、各種ペプチドをバイオセンサーに固定化し、それらのバイオセンサーを一定時間アルカリ溶液に浸漬した前後での、同一濃度のＩｇＧに対する結合レスポンスの比から、アルカリ処理後の残存結合活性を評価した。
　バイオセンサーとして、ペプチドのアミノ基を介して、ペプチドをセンサーに共有結合で固定化できるＡＲ２Ｇバイオセンサーを用いた。実施例１および比較例１で精製した各種精製ペプチド溶液を、ＵＶ吸光度を基に１０μＭに濃度調整し、１０ｍＭ　ＡｃＯＨ－ＡｃＯＮａ、ｐＨ４．５に透析した。各種ペプチドを、バイオセンサー標準のプロトコル（ＴＥＣＨＮＩＣＡＬ　ＮＯＴＥ　２６）に従って固定化した。標準緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を測定用緩衝液とし、軽鎖がκ鎖からなる抗ＩｇＥモノクローナルＩｇＧ製剤（一般名：オマリズマブ，製品名：ゾレア，以後ａＩｇＥ－ＩｇＧと略す）を標準緩衝液で１０μＭに濃度調整した。標準緩衝液でベースラインを取り、その後、１０００ｒｐｍの条件でａＩｇＥ－ＩｇＧと２分間接触させ、結合レスポンス（付属の解析ソフトでＲｅｓｐｏｎｓｅとして算出）を求め、これをアルカリ処理前の結合レスポンスとした。各種ペプチドを固定化したセンサーについて、測定ごとに再生用酸性緩衝液（５０ｍＭ　ＡｃＯＨ－ＡｃＯＮａ，ｐＨ３．０）で再生し、それぞれのセンサーについて３サイクル（Ｎ＝３）で測定した。そして、上記測定後のセンサーを２０ｍＭ　ＮａＯＨに室温下で８時間浸漬し、その後標準緩衝液に浸漬した。そして、同様の流れでａＩｇＥ－ＩｇＧに対する結合レスポンスを求めた。そして、アルカリ処理後の残存結合活性を、アルカリ処理後の結合レスポンス値をアルカリ処理前の結合レスポンスで除算した値とした。各サイクルごと（１番目、２番目、３番目）で分けて、それぞれ残存活性を求め、計Ｎ＝３の残存活性の平均値を各ペプチドの残存活性値とした。
　各々のペプチドの残存活性値をプロットしたグラフを図１に示す。なお、比較例１で得られたペプチドを、変異導入前の対照用ペプチドという意味で、Ｃｏｎｔ．と表記する。測定は２回に分けて２セットで別の日に行っており、グラフもスペースで２つに分割し、それぞれのセットで比較例（ＬＢ５ｍ－Ｔ３６Ｈ．１ｄ，Ｃｏｎｔ．）の残存活性値を左端に示した。２セットでＣｏｎｔ．の値が違うのは、室温下でアルカリ処理したため、実施した日によって違いが出たと考えられるが、同一セット内では同一の処理条件になっていることは担保されている。全てのペプチドがａＩｇＥ－ＩｇＧへの結合活性を示し、かつ、アルカリ処理後の残存活性値が変異導入前のペプチドよりも有意に高い値（アルカリ耐性）を示すことが分かった。Ｋ０３Ｒ/Ｋ０９Ｒ/Ｔ１８Ｒ/Ｋ２５Ｒなど、複数の変異を導入したペプチドも高いアルカリ耐性を示し、かつ、変異を単独で導入した場合よりもアルカリ耐性が高い傾向を示した。また、４４位や４８位に変異を導入しても、高いアルカリ耐性は維持されることも分かった。
　特許文献１５には、ＰｐＬ３１２のＢ１～Ｂ５、および、ＰｐＬ３３１６のＣ１～Ｃ４の間で保存されているＬｙｓ残基（例えば、配列番号１の第２５位のＬｙｓ）を変異した例が示されているが、同文献では、当該変異の効果が見られたのはＣ１～Ｃ４のみであって、Ｂ１～Ｂ５では変異の効果が無かったと明記されている。そのような知見がある中で、変異の効果が見い出せる配列を特定し、さらに、似たような部位に対して適切な置換アミノ酸の種類も特定したことは、容易に着想・想定できないと考えられ、本発明が単なる最適化に止まらない重要な発見であることの証左と言える。

Claims (9)

  1. 　下記アミノ酸配列（Ｉ）～（ＩＩＩ）のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
    　（Ｉ）　配列番号１のアミノ酸配列において、（ａ）～（ｈ）の少なくとも１つ以上のアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列（但し、（ｂ）または（ｅ）の変異と（ｇ）の変異、および、（ｃ）または（ｄ）の変異と（ｈ）の変異を同時に導入しないものとする）：
    　（ａ）　第３位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
    　（ｂ）　第９位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
    　（ｃ）　第１６位のＡｓｐをＧｌｕに置換；
    　（ｄ）　第１８位のＴｈｒをＬｙｓまたはＡｒｇに置換；
    　（ｅ）　第２３位のＴｈｒをＧｌｕに置換；
    　（ｆ）　第２５位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
    　（ｇ）　第９位のＬｙｓをＡｓｐまたはＧｌｕ、かつ、第２３位のＴｈｒをＬｙｓまたはＡｒｇに置換；
    　（ｈ）　第１６位のＡｓｐをＬｙｓまたはＡｒｇ、かつ、第１８位のＴｈｒをＡｓｐまたはＧｌｕに置換；
    　（ＩＩ）　上記（Ｉ）に規定されるアミノ酸配列において、Ｎ末端および／もしくはＣ末端の１個もしくは２個のアミノ酸が欠失および／もしくは置換されたアミノ酸配列、並びに／または、Ｎ末端および／もしくはＣ末端に１個以上２０個以下のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列；
    　（ＩＩＩ）　上記（Ｉ）に規定されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（但し、配列番号１における第３位、第９位、第１６位、第１８位、第２３位、および、第２５位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基は、さらに変異しないものとする）。
  2. 　上記（Ｉ）～（ＩＩＩ）のいずれかに規定されるアミノ酸配列において、（ｉ）～（ｊ）の少なくとも１つ以上のアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有する請求項１に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
    　（ｉ）　配列番号１における第４４位のＬｙｓをＡｒｇに置換；
    　（ｊ）　配列番号１における第４８位のＬｙｓをＡｒｇに置換。
  3. 　請求項１または２に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドを２個以上有することを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体。
  4. 　２個以上の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドが、単一の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドである請求項３に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体。
  5. 　請求項１もしくは２に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは請求項３もしくは４に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体、および水不溶性担体を有し、免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティ分離マトリックス。
  6. 　免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
    　請求項５に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
    　アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
  7. 　請求項１もしくは２に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは請求項３もしくは４に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
  8. 　請求項７に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
  9. 　請求項８に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
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