JP2002238569A - 大腸菌とブレビバチルス属細菌間のプラスミドシャトルベクター - Google Patents
大腸菌とブレビバチルス属細菌間のプラスミドシャトルベクターInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】 ブレビバチルス属細菌及び大腸菌のいず
れにおいても複製可能で、ブレビバチルス属細菌におい
て機能し得るプロモーターと大腸菌及びブレビバチルス
属細菌の選択マーカーとして機能し得る配列をコードす
るＤＮＡ配列を有することを特徴とするプラスミドシャ
トルベクター、及び該プラスミドシャトルベクターを用
いたブレビバチルス属細菌の形質転換方法の提供。 【効果】 該プラスミドシャトルベクターは、効率的な
ブレビバチルス属細菌の形質転換を可能にする。特に本
発明のプラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２は、ブ
レビバチルス属細菌中で目的遺伝子を効率的に分泌発現
するが、大腸菌ではその発現が著しく抑えられる遺伝子
発現調節領域を持つため、大腸菌を用いて効率的に組換
え遺伝子発現プラスミドが構築でき、ブレビバチルス属
細菌でのタンパク質生産に適している。
れにおいても複製可能で、ブレビバチルス属細菌におい
て機能し得るプロモーターと大腸菌及びブレビバチルス
属細菌の選択マーカーとして機能し得る配列をコードす
るＤＮＡ配列を有することを特徴とするプラスミドシャ
トルベクター、及び該プラスミドシャトルベクターを用
いたブレビバチルス属細菌の形質転換方法の提供。 【効果】 該プラスミドシャトルベクターは、効率的な
ブレビバチルス属細菌の形質転換を可能にする。特に本
発明のプラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２は、ブ
レビバチルス属細菌中で目的遺伝子を効率的に分泌発現
するが、大腸菌ではその発現が著しく抑えられる遺伝子
発現調節領域を持つため、大腸菌を用いて効率的に組換
え遺伝子発現プラスミドが構築でき、ブレビバチルス属
細菌でのタンパク質生産に適している。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、大腸菌とブレビバ
チルス属細菌間のプラスミドシャトルベクターおよび該
プラスミドシャトルベクターを用いたブレビバチルス属
細菌の形質転換方法に関する。また特には、ブレビバチ
ルス属細菌中で目的遺伝子を効率的に分泌発現するが、
大腸菌ではその発現が著しく抑えられる遺伝子発現調節
領域を持つブレビバチルス属細菌でその遺伝子発現に適
したプラスミドシャトルベクターに関する。更には、該
形質転換方法により形質転換された形質転換体を培養す
ることを特徴とするタンパク質の製造方法に関する。
チルス属細菌間のプラスミドシャトルベクターおよび該
プラスミドシャトルベクターを用いたブレビバチルス属
細菌の形質転換方法に関する。また特には、ブレビバチ
ルス属細菌中で目的遺伝子を効率的に分泌発現するが、
大腸菌ではその発現が著しく抑えられる遺伝子発現調節
領域を持つブレビバチルス属細菌でその遺伝子発現に適
したプラスミドシャトルベクターに関する。更には、該
形質転換方法により形質転換された形質転換体を培養す
ることを特徴とするタンパク質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】鵜高らは、菌体外に多量のタンパク質を
分泌し、また菌体外プロテアーゼ活性が弱いという大腸
菌、枯草菌にない優れた特徴を持つブレビバチルス属
（従来のバチルス属の分類から分離）細菌を宿主とする
遺伝子組み換えタンパク質の発現系の開発に成功した。
（特許第２０８２７２７号、特開昭６２−２０１５８３
号公報、Ｙａｍａｇａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１６９，１２３９−１２４５（１９８７）、
鵜高重三、日本農芸化学会誌６１，６６９−６７６（１
９８７）、Ｔａｋａｏ，Ｍ．ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３０，７５−８０
（１９８９）、Ｙａｍａｇａｔａ，Ｈ，ら，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ８６，３５８９
−３５９３（１９８９））。また、これまでにブレビバ
チルス属細菌を宿主とした発現系によるα−アミラーゼ
（特許第２０８２７２７号）、ヒト上皮細胞増殖因子
（ｈＥＧＦ）（特許第２７８７５８５号）の生産などが
報告されている。
分泌し、また菌体外プロテアーゼ活性が弱いという大腸
菌、枯草菌にない優れた特徴を持つブレビバチルス属
（従来のバチルス属の分類から分離）細菌を宿主とする
遺伝子組み換えタンパク質の発現系の開発に成功した。
（特許第２０８２７２７号、特開昭６２−２０１５８３
号公報、Ｙａｍａｇａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１６９，１２３９−１２４５（１９８７）、
鵜高重三、日本農芸化学会誌６１，６６９−６７６（１
９８７）、Ｔａｋａｏ，Ｍ．ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３０，７５−８０
（１９８９）、Ｙａｍａｇａｔａ，Ｈ，ら，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ８６，３５８９
−３５９３（１９８９））。また、これまでにブレビバ
チルス属細菌を宿主とした発現系によるα−アミラーゼ
（特許第２０８２７２７号）、ヒト上皮細胞増殖因子
（ｈＥＧＦ）（特許第２７８７５８５号）の生産などが
報告されている。
【０００３】一方、これまでに、ブレビバチルス属細菌
の遺伝子の発現に有用なプラスミドベクターとしては、
例えば、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌６
１，６６９−６７６（１９８７））、ｐＮＨ３００（Ｓ
ｈｉｇａ，Ｙ．ら，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉ
ｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５
８，５２５−５３１（１９９２））、ｐＮＨ４００（Ｉ
ｓｈｉｈａｒａ，Ｔ，ら，Ｊ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
１７７，７４５−７４９（１９９５））、ｐＨＹ７００
（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＴ系プラスミ
ド（特許２７２７３９１号）などが報告されている。特
に、本発明者らは、ブレビバチルス属細菌の形質転換に
有用なプラスミドベクターとしてｐＮＹ３０１他のｐＮ
Ｙ系プラスミド（特開平１０−２９５３７８号公報）を
特許出願した。
の遺伝子の発現に有用なプラスミドベクターとしては、
例えば、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌６
１，６６９−６７６（１９８７））、ｐＮＨ３００（Ｓ
ｈｉｇａ，Ｙ．ら，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉ
ｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５
８，５２５−５３１（１９９２））、ｐＮＨ４００（Ｉ
ｓｈｉｈａｒａ，Ｔ，ら，Ｊ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
１７７，７４５−７４９（１９９５））、ｐＨＹ７００
（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＴ系プラスミ
ド（特許２７２７３９１号）などが報告されている。特
に、本発明者らは、ブレビバチルス属細菌の形質転換に
有用なプラスミドベクターとしてｐＮＹ３０１他のｐＮ
Ｙ系プラスミド（特開平１０−２９５３７８号公報）を
特許出願した。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】前記のように、ブレビ
バチルス属細菌を宿主として用いるタンパク質の分泌生
産系は、遺伝子組換えによるタンパク質生産において有
用な系のひとつである。しかしながら、従来、ブレビバ
チルス属細菌の形質転換効率は、大腸菌の形質転換効率
に比べて低く、そのため大腸菌に比較するとブレビバチ
ルス属細菌を用いた組換え遺伝子発現プラスミドの構築
は困難であるという欠点があった。例えば、エレクトロ
ポレーション法（Ｔａｋａｇｉ，Ｔ．ら，Ａｇｒｉｃ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９−３１００（１
９８９））を用いた場合、大腸菌での形質転換効率は１
０10ＣＦＵ／ｕｇＤＮＡに達するが、ブレビバチルス属
のブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）（従来は、
バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉ
ｓ）。Ｓｈｉｄａ Ｏ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．，４６，９３９−９４６（１９９
６）において分類学的位置の変更があった。）の場合、
１０7ＣＦＵ／ｕｇＤＮＡに過ぎなかった。またエレク
トロポレーション法以外の方法を用いた場合、ブレビバ
チルス属細菌の形質転換効率は更に低下することが知ら
れていた。
バチルス属細菌を宿主として用いるタンパク質の分泌生
産系は、遺伝子組換えによるタンパク質生産において有
用な系のひとつである。しかしながら、従来、ブレビバ
チルス属細菌の形質転換効率は、大腸菌の形質転換効率
に比べて低く、そのため大腸菌に比較するとブレビバチ
ルス属細菌を用いた組換え遺伝子発現プラスミドの構築
は困難であるという欠点があった。例えば、エレクトロ
ポレーション法（Ｔａｋａｇｉ，Ｔ．ら，Ａｇｒｉｃ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９−３１００（１
９８９））を用いた場合、大腸菌での形質転換効率は１
０10ＣＦＵ／ｕｇＤＮＡに達するが、ブレビバチルス属
のブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）（従来は、
バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉ
ｓ）。Ｓｈｉｄａ Ｏ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．，４６，９３９−９４６（１９９
６）において分類学的位置の変更があった。）の場合、
１０7ＣＦＵ／ｕｇＤＮＡに過ぎなかった。またエレク
トロポレーション法以外の方法を用いた場合、ブレビバ
チルス属細菌の形質転換効率は更に低下することが知ら
れていた。
【０００５】特に複雑な高次構造を持ったタンパク質、
例えば１つのＡサブユニットと５つのＢサブユニットか
らなるコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）に
よって生産されるコレラトキシン（ＣＴ）（Ｃｌｅｍｅ
ｎｔｓ ａｎｄ Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ｉｎｔｅｃ
ｔ．Ｉｍｍｕｎ．，２４；７６０−７６９（１９７
９））などのタンパク質をコードした遺伝子によるブレ
ビバチルス属細菌の形質転換および該形質転換体による
タンパク質生産には、これまで多大な困難があった。
例えば１つのＡサブユニットと５つのＢサブユニットか
らなるコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）に
よって生産されるコレラトキシン（ＣＴ）（Ｃｌｅｍｅ
ｎｔｓ ａｎｄ Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ｉｎｔｅｃ
ｔ．Ｉｍｍｕｎ．，２４；７６０−７６９（１９７
９））などのタンパク質をコードした遺伝子によるブレ
ビバチルス属細菌の形質転換および該形質転換体による
タンパク質生産には、これまで多大な困難があった。
【０００６】この課題に対する解決策のひとつとして、
形質転換操作が容易な他の宿主細胞、例えば大腸菌内で
も複製可能なプラスミドベクター（以下、「シャトルベ
クター」という。）を用い、まず、その宿主細胞を用い
て組換え遺伝子発現プラスミドの構築を行い、更に、そ
の組換え遺伝子発現プラスミドを用いてブレビバチルス
属細菌の形質転換をエレクトロポレーション法などによ
り行う方法が考えられる。
形質転換操作が容易な他の宿主細胞、例えば大腸菌内で
も複製可能なプラスミドベクター（以下、「シャトルベ
クター」という。）を用い、まず、その宿主細胞を用い
て組換え遺伝子発現プラスミドの構築を行い、更に、そ
の組換え遺伝子発現プラスミドを用いてブレビバチルス
属細菌の形質転換をエレクトロポレーション法などによ
り行う方法が考えられる。
【０００７】シャトルベクターおよびシャトルベクター
を用いた形質転換方法は、当業者に公知の技術である。
たとえば大腸菌と枯草菌間のシャトルベクターとして
は、特許公開昭６３−１９８９８６号公報、特許公開２
０００−１９７４９１号公報などが報告されている。し
かしながら、これまでブレビバチルス属細菌の遺伝子組
換えによる形質転換作業および該形質転換体による組換
え遺伝子発現に利用可能なプラスミドシャトルベクター
および該プラスミドシャトルベクターを用いたブレビバ
チルス属細菌の形質転換方法は知られていなかった。
を用いた形質転換方法は、当業者に公知の技術である。
たとえば大腸菌と枯草菌間のシャトルベクターとして
は、特許公開昭６３−１９８９８６号公報、特許公開２
０００−１９７４９１号公報などが報告されている。し
かしながら、これまでブレビバチルス属細菌の遺伝子組
換えによる形質転換作業および該形質転換体による組換
え遺伝子発現に利用可能なプラスミドシャトルベクター
および該プラスミドシャトルベクターを用いたブレビバ
チルス属細菌の形質転換方法は知られていなかった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ブレビバ
チルス属細菌を宿主とした発現系において、目的タンパ
ク質を菌体外に分泌するという有用性に着目し、また、
上記した欠点を解決する新規宿主−ベクター系の開発の
必要性を痛感し、大腸菌およびブレビバチルス属細菌を
宿主とすることができ、遺伝子組換えに使用可能な新規
プラスミドシャトルベクターを開発することとした。
チルス属細菌を宿主とした発現系において、目的タンパ
ク質を菌体外に分泌するという有用性に着目し、また、
上記した欠点を解決する新規宿主−ベクター系の開発の
必要性を痛感し、大腸菌およびブレビバチルス属細菌を
宿主とすることができ、遺伝子組換えに使用可能な新規
プラスミドシャトルベクターを開発することとした。
【０００９】そこで上記目的を達成するため、本発明者
らは、数多くのプラスミドベクターの中から特に本発明
者らが既に特許出願したプラスミドベクターｐＮＹ３０
１がブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１由来
のプロモーター及び分泌シグナル配列を含有している点
に改めて着目し、このプラスミドベクターｐＮＹ３０１
をもとに、各種のＤＮＡ配列をＰＣＲ法等によって合成
したりあるいは既知の配列から切り出したりし、更にこ
れらのＤＮＡ断片を該プラスミドベクターに組み込み、
組み込まれることを確認しただけでなく、得られたプラ
スミドによる形質転換の確認、形質転換体における発現
の確認等、デリケートにして莫大な数の各種処理、操作
を試行錯誤した結果、遂に目的とする新規なプラスミド
シャトルベクターの創製に成功した。
らは、数多くのプラスミドベクターの中から特に本発明
者らが既に特許出願したプラスミドベクターｐＮＹ３０
１がブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１由来
のプロモーター及び分泌シグナル配列を含有している点
に改めて着目し、このプラスミドベクターｐＮＹ３０１
をもとに、各種のＤＮＡ配列をＰＣＲ法等によって合成
したりあるいは既知の配列から切り出したりし、更にこ
れらのＤＮＡ断片を該プラスミドベクターに組み込み、
組み込まれることを確認しただけでなく、得られたプラ
スミドによる形質転換の確認、形質転換体における発現
の確認等、デリケートにして莫大な数の各種処理、操作
を試行錯誤した結果、遂に目的とする新規なプラスミド
シャトルベクターの創製に成功した。
【００１０】そして、このようにして創製するのに成功
した新規プラスミドシャトルベクターを大腸菌およびブ
レビバチルス属細菌に導入し、得られた細菌を培養した
ところ、何れの宿主においても該プラスミドシャトルベ
クターの複製が行われた。また該プラスミドシャトルベ
クターを用いた組換え遺伝子発現において、ブレビバチ
ルス属細菌中で目的遺伝子を効率的に分泌発現するが、
大腸菌ではその発現が著しく抑えられることを見出した
こと、更に他の公知の方法では、ブレビバチルス属細菌
の形質転換体が得られない場合においても、該プラスミ
ドシャトルベクターの使用により形質転換が可能なこと
を確認し本発明を完成した。
した新規プラスミドシャトルベクターを大腸菌およびブ
レビバチルス属細菌に導入し、得られた細菌を培養した
ところ、何れの宿主においても該プラスミドシャトルベ
クターの複製が行われた。また該プラスミドシャトルベ
クターを用いた組換え遺伝子発現において、ブレビバチ
ルス属細菌中で目的遺伝子を効率的に分泌発現するが、
大腸菌ではその発現が著しく抑えられることを見出した
こと、更に他の公知の方法では、ブレビバチルス属細菌
の形質転換体が得られない場合においても、該プラスミ
ドシャトルベクターの使用により形質転換が可能なこと
を確認し本発明を完成した。
【００１１】すなわち、本発明は、上記課題を解決する
ためにブレビバチルス属細菌の遺伝子組換えによる形質
転換および該形質転換体によるタンパク質生産に有用な
大腸菌とブレビバチルス属細菌との間のプラスミドシャ
トルベクターおよび該プラスミドシャトルベクターを用
いた形質転換方法を提供する。特には、ブレビバチルス
属細菌中で目的遺伝子を効率的に分泌発現するが、大腸
菌ではその発現が著しく抑えられる遺伝子発現調節領域
を持つブレビバチルス属細菌での遺伝子発現およびタン
パク質生産に適したプラスミドシャトルベクターを提供
する。更に該プラスミドシャトルベクターを用いたブレ
ビバチルス属細菌の形質転換方法、および該プラスミド
シャトルベクターを用いて形質転換されたブレビバチル
ス属細菌を培養することを特徴とするタンパク質の製造
方法を提供する。
ためにブレビバチルス属細菌の遺伝子組換えによる形質
転換および該形質転換体によるタンパク質生産に有用な
大腸菌とブレビバチルス属細菌との間のプラスミドシャ
トルベクターおよび該プラスミドシャトルベクターを用
いた形質転換方法を提供する。特には、ブレビバチルス
属細菌中で目的遺伝子を効率的に分泌発現するが、大腸
菌ではその発現が著しく抑えられる遺伝子発現調節領域
を持つブレビバチルス属細菌での遺伝子発現およびタン
パク質生産に適したプラスミドシャトルベクターを提供
する。更に該プラスミドシャトルベクターを用いたブレ
ビバチルス属細菌の形質転換方法、および該プラスミド
シャトルベクターを用いて形質転換されたブレビバチル
ス属細菌を培養することを特徴とするタンパク質の製造
方法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳しく説明
する。
する。
【００１３】本発明のプラスミドシャトルベクターは、
大腸菌およびブレビバチルス属細菌のいずれにおいても
複製可能なプラスミドシャトルベクターであり、ブレビ
バチルス属細菌において機能し得るプロモーター、およ
びブレビバチルス属細菌および大腸菌に対する選択マー
カー遺伝子をコードしたＤＮＡ配列を有する。
大腸菌およびブレビバチルス属細菌のいずれにおいても
複製可能なプラスミドシャトルベクターであり、ブレビ
バチルス属細菌において機能し得るプロモーター、およ
びブレビバチルス属細菌および大腸菌に対する選択マー
カー遺伝子をコードしたＤＮＡ配列を有する。
【００１４】本発明のプラスミドシャトルベクターは、
大腸菌およびブレビバチルス属細菌で自律複製可能であ
る。したがって、大腸菌を用いて本発明のプラスミドシ
ャトルベクターへのＤＮＡ断片の挿入などの操作により
組換え遺伝子発現プラスミドを構築することができ、更
に該組換え遺伝子発現プラスミドを用いてブレビバチル
ス属細菌の形質転換を行うことができる。
大腸菌およびブレビバチルス属細菌で自律複製可能であ
る。したがって、大腸菌を用いて本発明のプラスミドシ
ャトルベクターへのＤＮＡ断片の挿入などの操作により
組換え遺伝子発現プラスミドを構築することができ、更
に該組換え遺伝子発現プラスミドを用いてブレビバチル
ス属細菌の形質転換を行うことができる。
【００１５】本発明のプラスミドシャトルベクターが有
するブレビバチルス属細菌で機能し得るプロモーター
は、ブレビバチルス属細菌で機能するものであれば、特
に限定されないが、好ましくはブレビバチルス属細菌に
由来するプロモーターである。特に好ましい例としてブ
レビバチルス・ブレビス４７（従来は、バチルス・ブレ
ビス４７）由来のＭＷＰプロモーター領域（特公平１−
５８９５０号公報、特公平７−１０８２２４号公報）、
または、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６３）（従来は、バチルス・ブ
レビス、本菌株は、バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１０８７）と同一菌株である。）由来のＨ
ＷＰプロモーター領域（特開平４−２７８０９１号公
報、特開平６−１３３７８２号公報）に含まれるプロモ
ーター、例えばＰ２プロモーター（配列番号１：図１）
などを挙げることができる。
するブレビバチルス属細菌で機能し得るプロモーター
は、ブレビバチルス属細菌で機能するものであれば、特
に限定されないが、好ましくはブレビバチルス属細菌に
由来するプロモーターである。特に好ましい例としてブ
レビバチルス・ブレビス４７（従来は、バチルス・ブレ
ビス４７）由来のＭＷＰプロモーター領域（特公平１−
５８９５０号公報、特公平７−１０８２２４号公報）、
または、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６３）（従来は、バチルス・ブ
レビス、本菌株は、バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１０８７）と同一菌株である。）由来のＨ
ＷＰプロモーター領域（特開平４−２７８０９１号公
報、特開平６−１３３７８２号公報）に含まれるプロモ
ーター、例えばＰ２プロモーター（配列番号１：図１）
などを挙げることができる。
【００１６】更に本発明のプラスミドシャトルベクター
は、ブレビバチルス属細菌で機能するプロモーターの
３′末端側にリボソーム結合領域（ＳＤ配列）、発現タ
ンパク質を分泌するためのシグナルペプチドをコードす
るＤＮＡ配列を含む。ＳＤ配列は、例えばＳＤ１（配列
番号３：図３）やＳＤ２（配列番号４：図４）などのブ
レビバチルス・チョウシネンシスのＨＷＰ遺伝子発現調
整領域に由来する配列を用いることができる。また、分
泌シグナルペプチドとしては、例えば、ブレビバチルス
・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０
８７、ＦＥＲＭＢＰ−６８６３）のＨＷＰプロモーター
領域に含まれるシグナルペプチドなどを使用することが
できる。特に好ましい例として、Ｒ２Ｌ６型などの改変
ＨＷＰシグナル配列（特開平７−１７０９８４号公報）
を挙げることができる（このＲ２Ｌ６型改変シグナルペ
プチドについて、そのアミノ酸配列を配列番号５に示
し、それをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２１
に示す。また両者の配列を図５に示す。図中、上段に塩
基配列、下段にアミノ酸配列を示す。）
は、ブレビバチルス属細菌で機能するプロモーターの
３′末端側にリボソーム結合領域（ＳＤ配列）、発現タ
ンパク質を分泌するためのシグナルペプチドをコードす
るＤＮＡ配列を含む。ＳＤ配列は、例えばＳＤ１（配列
番号３：図３）やＳＤ２（配列番号４：図４）などのブ
レビバチルス・チョウシネンシスのＨＷＰ遺伝子発現調
整領域に由来する配列を用いることができる。また、分
泌シグナルペプチドとしては、例えば、ブレビバチルス
・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０
８７、ＦＥＲＭＢＰ−６８６３）のＨＷＰプロモーター
領域に含まれるシグナルペプチドなどを使用することが
できる。特に好ましい例として、Ｒ２Ｌ６型などの改変
ＨＷＰシグナル配列（特開平７−１７０９８４号公報）
を挙げることができる（このＲ２Ｌ６型改変シグナルペ
プチドについて、そのアミノ酸配列を配列番号５に示
し、それをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２１
に示す。また両者の配列を図５に示す。図中、上段に塩
基配列、下段にアミノ酸配列を示す。）
【００１７】また本発明のプラスミドシャトルベクター
は、細菌中での複製に必要な複製制御領域をコードする
ＤＮＡ配列を含む。複製制御領域は、ブレビバチルス属
細薗および大腸園の両方に対して同ーのものを使用して
も、各々に対して異なったものを使用しても構わない。
ブレビバチルス属細菌における複製制御領域は、Ｒｅｐ
タンパク質遺伝子と複製開始点からなる。ブレビバチル
ス属細菌において複製制御領域として機能し得る配列
は、ブレビバチルス属細菌において複製増殖するプラス
ミドに含まれ、プラスミドの複製制御領域として作用す
るＤＮＡ配列であるならば、特に限定されないが、特に
好ましい例としてプラスミドｐＵＢ１１０由来のＲｅｐ
タンパク質遺伝子および複製開始点をコードするＤＮＡ
配列を挙げることができる。
は、細菌中での複製に必要な複製制御領域をコードする
ＤＮＡ配列を含む。複製制御領域は、ブレビバチルス属
細薗および大腸園の両方に対して同ーのものを使用して
も、各々に対して異なったものを使用しても構わない。
ブレビバチルス属細菌における複製制御領域は、Ｒｅｐ
タンパク質遺伝子と複製開始点からなる。ブレビバチル
ス属細菌において複製制御領域として機能し得る配列
は、ブレビバチルス属細菌において複製増殖するプラス
ミドに含まれ、プラスミドの複製制御領域として作用す
るＤＮＡ配列であるならば、特に限定されないが、特に
好ましい例としてプラスミドｐＵＢ１１０由来のＲｅｐ
タンパク質遺伝子および複製開始点をコードするＤＮＡ
配列を挙げることができる。
【００１８】また大腸菌においては複製制御領域として
複製開始点が必要である。大腸菌において機能し得る複
製開始点をコードするＤＮＡ配列としては、大腸菌にお
いて複製増殖するプラスミドに含まれ、プラスミドの複
製開始点として作用するＤＮＡ配列であるならば、特に
限定されないが、好ましくは、プラスミドの複製開始点
として作用するＯＲｌ領域を含むＤＮＡ配列である。特
に好ましくは、大腸菌を用いた遺伝子組換え操作に通常
用いられている。ＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１
９などのｐＵＣ系又はｐＢＲ３２２などのプラスミドベ
クターのＯＲＩ領域をコードするＤＮＡ配列である。
複製開始点が必要である。大腸菌において機能し得る複
製開始点をコードするＤＮＡ配列としては、大腸菌にお
いて複製増殖するプラスミドに含まれ、プラスミドの複
製開始点として作用するＤＮＡ配列であるならば、特に
限定されないが、好ましくは、プラスミドの複製開始点
として作用するＯＲｌ領域を含むＤＮＡ配列である。特
に好ましくは、大腸菌を用いた遺伝子組換え操作に通常
用いられている。ＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１
９などのｐＵＣ系又はｐＢＲ３２２などのプラスミドベ
クターのＯＲＩ領域をコードするＤＮＡ配列である。
【００１９】更にブレビバチルス属細菌と大腸菌のいず
れにおいても機能し得る複製制御領域をコードするＤＮ
Ａ配列として、グラム陽性菌においてもグラム陰性菌に
おいても機能し得る複製制御領域であるｐＬＳ１／ｐＥ
１９４プラスミドファミリー（Ｄｅｌ Ｓｏｌａｒ，
Ｇ．ら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８，７８９−
７９６（１９９３））に属するプラスミドの複製制御領
域を挙げることができる。たとえばラクトバチルス・ア
シドフィラス（Lactobacillus acidophilus）由来のプ
ラスミドｐＬＡ１０６のｏｒｉ、ＲｅｐＡ、ＲｅｐＢで
構成される複製制御領域（Ｓａｎｏ，Ｋ．ら，ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４
８，２２３−２２６（１９９７））をコードするＤＮＡ
配列などが使用可能である。
れにおいても機能し得る複製制御領域をコードするＤＮ
Ａ配列として、グラム陽性菌においてもグラム陰性菌に
おいても機能し得る複製制御領域であるｐＬＳ１／ｐＥ
１９４プラスミドファミリー（Ｄｅｌ Ｓｏｌａｒ，
Ｇ．ら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８，７８９−
７９６（１９９３））に属するプラスミドの複製制御領
域を挙げることができる。たとえばラクトバチルス・ア
シドフィラス（Lactobacillus acidophilus）由来のプ
ラスミドｐＬＡ１０６のｏｒｉ、ＲｅｐＡ、ＲｅｐＢで
構成される複製制御領域（Ｓａｎｏ，Ｋ．ら，ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４
８，２２３−２２６（１９９７））をコードするＤＮＡ
配列などが使用可能である。
【００２０】更に、本発明のプラスミドシャトルベクタ
ーが有するブレビバチルス属細菌および大腸菌に対する
選択マーカーとして機能し得る配列は、ブレビバチルス
属細菌および大腸菌の両方に対して同一のものを使用し
ても、各々に対して異なったものを使用しても構わな
い。選択マーカーとして機能し得る配列として、薬剤耐
性遺伝子を使用することができる。例えば、ブレビバチ
ルス属細菌に対しては、ブレビバチルス属細菌並びにそ
の近縁関係にあるバチルス属細菌などに由来の薬剤耐性
遺伝子を含むＤＮＡ配列などを使用することができる。
特に好ましい例として、プラスミドベクターｐＮＹ３０
１（特開平１０−２９５３７８号公報）に含まれるネオ
マイシン耐性遺伝子やｐＨＴ１１０に含まれるエリスロ
マイシン耐性遺伝子（特許２７２７３９１号）を挙げる
ことができる。また、大腸菌に対しては、例えば、公知
の大腸菌由来の薬剤耐性遺伝子であるカナマイシン耐性
遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコー
ル耐性遺伝子などをコードするＤＮＡ配列が使用可能で
ある。更にブレビバチルス属細菌と大腸菌のいずれにお
いても機能し得る薬剤耐性遺伝子としてゼオシン耐性遺
伝子などが使用可能である。
ーが有するブレビバチルス属細菌および大腸菌に対する
選択マーカーとして機能し得る配列は、ブレビバチルス
属細菌および大腸菌の両方に対して同一のものを使用し
ても、各々に対して異なったものを使用しても構わな
い。選択マーカーとして機能し得る配列として、薬剤耐
性遺伝子を使用することができる。例えば、ブレビバチ
ルス属細菌に対しては、ブレビバチルス属細菌並びにそ
の近縁関係にあるバチルス属細菌などに由来の薬剤耐性
遺伝子を含むＤＮＡ配列などを使用することができる。
特に好ましい例として、プラスミドベクターｐＮＹ３０
１（特開平１０−２９５３７８号公報）に含まれるネオ
マイシン耐性遺伝子やｐＨＴ１１０に含まれるエリスロ
マイシン耐性遺伝子（特許２７２７３９１号）を挙げる
ことができる。また、大腸菌に対しては、例えば、公知
の大腸菌由来の薬剤耐性遺伝子であるカナマイシン耐性
遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコー
ル耐性遺伝子などをコードするＤＮＡ配列が使用可能で
ある。更にブレビバチルス属細菌と大腸菌のいずれにお
いても機能し得る薬剤耐性遺伝子としてゼオシン耐性遺
伝子などが使用可能である。
【００２１】更に本発明のプラスミドシャトルベクター
は、組換え遺伝子の大腸菌での発現を抑える機能を持つ
ＤＮＡ配列を含むことができる。たとえばｌａｃＩ遺伝
子を有する大腸菌の場合、ブレビバチルス属細菌で機能
するプロモーター配列の３’末端側に大腸菌由来のｌａ
ｃオペレーター配列（配列番号２：図２）を含むことが
できる。
は、組換え遺伝子の大腸菌での発現を抑える機能を持つ
ＤＮＡ配列を含むことができる。たとえばｌａｃＩ遺伝
子を有する大腸菌の場合、ブレビバチルス属細菌で機能
するプロモーター配列の３’末端側に大腸菌由来のｌａ
ｃオペレーター配列（配列番号２：図２）を含むことが
できる。
【００２２】本発明のプラスミドシャトルベクターは新
規であり、例えばｐＮＣＭＯ２は、大きさが５，２２４
ｂｐのプラスミドベクターである。ｐＮＣＭＯ２の制限
酵素地図およびプロモーターを含む一部の塩基配列を図
２１に示した。ｐＮＣＭＯ２のプロモーター領域は、ブ
レビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のＨＷＰプ
ロモーター領域に由来するＰ２プロモーター、大腸菌に
由来するｌａｃオペレーター、ＳＤ配列、分泌シグナル
ペプチドとしてＲ２Ｌ６型改変シグナルペプチド、マル
チクローニングサイトおよびターミネーターとしてＨＳ
遺伝子（特開平９−２２４６７７号公報）を含む。該マ
ルチクローニングサイトは、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓ
ａｌＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、
ＳｍａＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトをクローニ
ングサイトとして使用することができる。
規であり、例えばｐＮＣＭＯ２は、大きさが５，２２４
ｂｐのプラスミドベクターである。ｐＮＣＭＯ２の制限
酵素地図およびプロモーターを含む一部の塩基配列を図
２１に示した。ｐＮＣＭＯ２のプロモーター領域は、ブ
レビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のＨＷＰプ
ロモーター領域に由来するＰ２プロモーター、大腸菌に
由来するｌａｃオペレーター、ＳＤ配列、分泌シグナル
ペプチドとしてＲ２Ｌ６型改変シグナルペプチド、マル
チクローニングサイトおよびターミネーターとしてＨＳ
遺伝子（特開平９−２２４６７７号公報）を含む。該マ
ルチクローニングサイトは、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓ
ａｌＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、
ＳｍａＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトをクローニ
ングサイトとして使用することができる。
【００２３】また、プラスミドシャトルベクターｐＮＣ
ＭＯ２は、ブレビバチルス属細菌に対する選択マーカー
遺伝子としてネオマイシン耐性遺伝子、ブレビバチルス
属細菌中での複製に必要なｐＵＢ１１０由来のＲｅｐタ
ンパク質遺伝子、大腸菌の複製開始点としてＣｏｌＥ１
ｏｒｉ領域、大腸菌に対する選択マーカー遺伝子とし
てアンピシリン耐性遺伝子をコードするＤＮＡ配列を持
つ。
ＭＯ２は、ブレビバチルス属細菌に対する選択マーカー
遺伝子としてネオマイシン耐性遺伝子、ブレビバチルス
属細菌中での複製に必要なｐＵＢ１１０由来のＲｅｐタ
ンパク質遺伝子、大腸菌の複製開始点としてＣｏｌＥ１
ｏｒｉ領域、大腸菌に対する選択マーカー遺伝子とし
てアンピシリン耐性遺伝子をコードするＤＮＡ配列を持
つ。
【００２４】本発明のプラスミドシャトルベクターｐＮ
ＣＭＯ２の構築には、ｐＮＹ３０１、ｐＮＨ３２６およ
びｐＮＵ２０１などを用いる。プラスミドｐＮＹ３０１
は、特開平１０−２９５３７８号において、プラスミド
ｐＮＨ３２６は、Ｋａｊｉｎｏ，Ｔ．，ら．Ａｐｐｌ．
Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６，６３８
−６４２（２０００）において、またｐＮＵ２０１は、
Ｕｄａｋａ，Ｓ．，ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ，２１７，２３−３３（１９９３）にお
いて、それぞれ公開されており公知のプラスミドであ
る。また、その他の本発明のプラスミドシャトルベクタ
ーの構築に使用されるプラスミドは、市場で購入するこ
とが可能である。
ＣＭＯ２の構築には、ｐＮＹ３０１、ｐＮＨ３２６およ
びｐＮＵ２０１などを用いる。プラスミドｐＮＹ３０１
は、特開平１０−２９５３７８号において、プラスミド
ｐＮＨ３２６は、Ｋａｊｉｎｏ，Ｔ．，ら．Ａｐｐｌ．
Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６，６３８
−６４２（２０００）において、またｐＮＵ２０１は、
Ｕｄａｋａ，Ｓ．，ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ，２１７，２３−３３（１９９３）にお
いて、それぞれ公開されており公知のプラスミドであ
る。また、その他の本発明のプラスミドシャトルベクタ
ーの構築に使用されるプラスミドは、市場で購入するこ
とが可能である。
【００２５】プラスミドベクターｐＮＣＭＯ２を保持す
るブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５
／ｐＮＣＭＯ２は、平成１２年１２月１２日通商産業省
工業技術院（現、経済産業省産業技術総合研究所）生命
工学工業技術研究所の特許微生物寄託センターに国際寄
託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３９４が付されて
いる。
るブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５
／ｐＮＣＭＯ２は、平成１２年１２月１２日通商産業省
工業技術院（現、経済産業省産業技術総合研究所）生命
工学工業技術研究所の特許微生物寄託センターに国際寄
託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３９４が付されて
いる。
【００２６】本発明の発現プラスミドの構築に用いる宿
主は、大腸菌に属する菌株ならば特に限定されないが、
特に好ましい例として大腸菌ＪＭ１０９を挙げることが
できる。大腸菌ＪＭ１０９は、公知の菌株であり市場で
購入することが可能である。
主は、大腸菌に属する菌株ならば特に限定されないが、
特に好ましい例として大腸菌ＪＭ１０９を挙げることが
できる。大腸菌ＪＭ１０９は、公知の菌株であり市場で
購入することが可能である。
【００２７】大腸菌を用いて本発明のプラスミドシャト
ルベクターから組換え遺伝子発現プラスミドを構築する
方法は、当業者に公知の標準的な分子生物学的技術に基
づいた方法を適宜使用することができる。例えば、モレ
キュラー・クローニング・ア・ラボラトリーマニュアル
第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラポラトリ
ー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅ
ｄ．，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ（１９８９））に記載の方法などが挙げられるが、
具体的な詳細は、実施例に示した。
ルベクターから組換え遺伝子発現プラスミドを構築する
方法は、当業者に公知の標準的な分子生物学的技術に基
づいた方法を適宜使用することができる。例えば、モレ
キュラー・クローニング・ア・ラボラトリーマニュアル
第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラポラトリ
ー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅ
ｄ．，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ（１９８９））に記載の方法などが挙げられるが、
具体的な詳細は、実施例に示した。
【００２８】本発明の組換え遺伝子の発現に用いる宿主
には、ブレビバチルス属細菌のいずれの株に属するもの
でも使用できるが、好ましくはブレビバチルス・チョウ
シネンシスである。特に好ましい例として、ブレビバチ
ルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１０８７、ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６３）やその変異株で
あるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ
５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）などを挙げることがで
きる。
には、ブレビバチルス属細菌のいずれの株に属するもの
でも使用できるが、好ましくはブレビバチルス・チョウ
シネンシスである。特に好ましい例として、ブレビバチ
ルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１０８７、ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６３）やその変異株で
あるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ
５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）などを挙げることがで
きる。
【００２９】本発明のシャトルベクターと大腸菌により
構築された組換え遺伝子発現プラスミドを用いたブレビ
バチルス属細菌を形質転換する方法には、エレクトロポ
レーション法などの当業者に公知の形質転換方法を使用
することができる。
構築された組換え遺伝子発現プラスミドを用いたブレビ
バチルス属細菌を形質転換する方法には、エレクトロポ
レーション法などの当業者に公知の形質転換方法を使用
することができる。
【００３０】本発明の形質転換体の培養に用いる培地に
は炭素源、窒素源の他、無機塩類が必要に応じて含めら
れる。また、糖と無機塩類を主とする合成培地を用いて
培養してもよい。栄養要求性を示す菌株を用いる場合に
は、その生育に必要な栄養物質を培地に添加することが
望ましい。さらに、必要であれば、培地に抗生物質や消
泡剤などを加えてもよい。
は炭素源、窒素源の他、無機塩類が必要に応じて含めら
れる。また、糖と無機塩類を主とする合成培地を用いて
培養してもよい。栄養要求性を示す菌株を用いる場合に
は、その生育に必要な栄養物質を培地に添加することが
望ましい。さらに、必要であれば、培地に抗生物質や消
泡剤などを加えてもよい。
【００３１】また培養条件は、培地の初発ｐＨを５．０
〜９．０、好ましくは６．５〜７．５に調節する。培養
温度は、通常１５℃〜４２℃、好ましくは２４〜３７℃
であり、培養時間は通常１６〜３６０時間、好ましくは
２４〜１４４時間である。これにより本発明の方法によ
り形質転換されたブレビバチルス属細菌は、培養液中に
タンパク質を生成、蓄積する。
〜９．０、好ましくは６．５〜７．５に調節する。培養
温度は、通常１５℃〜４２℃、好ましくは２４〜３７℃
であり、培養時間は通常１６〜３６０時間、好ましくは
２４〜１４４時間である。これにより本発明の方法によ
り形質転換されたブレビバチルス属細菌は、培養液中に
タンパク質を生成、蓄積する。
【００３２】培養終了後、培養物からの目的タンパク質
の採取は、溶媒抽出、限外濾過、硫安分画、ＨＰＬＣ、
ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動な
どの当業者に公知のタンパク質精製方法を適宜組合わせ
ることにより可能である。
の採取は、溶媒抽出、限外濾過、硫安分画、ＨＰＬＣ、
ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動な
どの当業者に公知のタンパク質精製方法を適宜組合わせ
ることにより可能である。
【００３３】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、これは例示的なものであり、本発明はこれ
に限定されるものではない。
説明するが、これは例示的なものであり、本発明はこれ
に限定されるものではない。
【００３４】
【実施例１】プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２
の構築 （１）プラスミドシャトルベクターｐＮＣ３０１の構築 プラスミドベクターｐＵＣ１１９をテンプレートとして
プライマー１（配列番号６：図６）およびプライマー２
（配列番号７：図７）を用いてＰＣＲ法により増幅し、
得られたＰＣＲ産物をＮｓｉＩで切断し、大腸菌の複製
開始点であるＣｏｌＥ１ ｏｒｉ領域とアンピシリン耐
性遺伝子を含む約２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
の構築 （１）プラスミドシャトルベクターｐＮＣ３０１の構築 プラスミドベクターｐＵＣ１１９をテンプレートとして
プライマー１（配列番号６：図６）およびプライマー２
（配列番号７：図７）を用いてＰＣＲ法により増幅し、
得られたＰＣＲ産物をＮｓｉＩで切断し、大腸菌の複製
開始点であるＣｏｌＥ１ ｏｒｉ領域とアンピシリン耐
性遺伝子を含む約２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００３５】ＰＣＲは、ＰＣＲキット（宝酒造社製）を
使用し、プライマーを各々１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリ
メラーゼ２．５単位、ｄＮＴＰ２００μＭ、ｐＵＣ１１
９テンプレートＤＮＡ １ｎｇ、１００μｌ Ｔａｑ緩
衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、２．５ｍ
Ｍ Ｍｇ++、５０ｍＭ塩化カリウム、１００μｇ／ｍｌ
ウシ血清アルブミン）を混合し、９６℃で３０秒保持し
た後、ＤＮＡの熱変性（９４℃、６０秒）、プライマー
のアニーリング（５４℃、６０秒）、プライマーの伸長
（７０℃、６０秒）を２５サイクルさせることによって
行った。以下、この条件を条件１とする。
使用し、プライマーを各々１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリ
メラーゼ２．５単位、ｄＮＴＰ２００μＭ、ｐＵＣ１１
９テンプレートＤＮＡ １ｎｇ、１００μｌ Ｔａｑ緩
衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、２．５ｍ
Ｍ Ｍｇ++、５０ｍＭ塩化カリウム、１００μｇ／ｍｌ
ウシ血清アルブミン）を混合し、９６℃で３０秒保持し
た後、ＤＮＡの熱変性（９４℃、６０秒）、プライマー
のアニーリング（５４℃、６０秒）、プライマーの伸長
（７０℃、６０秒）を２５サイクルさせることによって
行った。以下、この条件を条件１とする。
【００３６】ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ
３１のＨＷＰプロモーター領域由来のＰ５プロモーター
および分泌シグナルペプチドとして天然型ＨＷＰシグナ
ルペプチド配列を含むプラスミドベクターｐＮＹ３０１
（特開平１０−２９５３７６号）のＳｓｅ８３８７Ｉサ
イトに先に得た約２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲ
ーションキット（宝酒造社製）を用いてＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより連結した。このＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１
０９（宝酒造社製）をＣａＣｌ2法（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１，８２，（１
９８９））により形質転換し、得られたアンピシリン耐
性の形質転換体よりプラスミドを抽出した。得られたプ
ラスミドは、大腸菌とブレビバチルス属細菌において複
製可能な新規なプラスミドシャトルベクターであり、ｐ
ＮＣ３０１と命名した。
３１のＨＷＰプロモーター領域由来のＰ５プロモーター
および分泌シグナルペプチドとして天然型ＨＷＰシグナ
ルペプチド配列を含むプラスミドベクターｐＮＹ３０１
（特開平１０−２９５３７６号）のＳｓｅ８３８７Ｉサ
イトに先に得た約２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲ
ーションキット（宝酒造社製）を用いてＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより連結した。このＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１
０９（宝酒造社製）をＣａＣｌ2法（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１，８２，（１
９８９））により形質転換し、得られたアンピシリン耐
性の形質転換体よりプラスミドを抽出した。得られたプ
ラスミドは、大腸菌とブレビバチルス属細菌において複
製可能な新規なプラスミドシャトルベクターであり、ｐ
ＮＣ３０１と命名した。
【００３７】プラスミドシャトルベクターｐＮＣ３０１
は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のＨ
ＷＰプロモーター領域由来のＰ５プロモーター、ブレビ
バチルス属に対する選択マーカー遺伝子としてネオマイ
シン耐性遺伝子、大腸菌の複製開始点としてＣｏｌＥ１
ｏｒｉ領域、大腸菌に対する選択マーカー遺伝子とし
てアンピシリン耐性遺伝子を含む。また更に分泌シグナ
ルペプチドとして天然型ＨＷＰシグナルペプチドを含
む。（図２２） 以下、図２３を参照しながら、プラスミドシャトルベク
ターｐＮＣＭＯ２の構築について説明する。
は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のＨ
ＷＰプロモーター領域由来のＰ５プロモーター、ブレビ
バチルス属に対する選択マーカー遺伝子としてネオマイ
シン耐性遺伝子、大腸菌の複製開始点としてＣｏｌＥ１
ｏｒｉ領域、大腸菌に対する選択マーカー遺伝子とし
てアンピシリン耐性遺伝子を含む。また更に分泌シグナ
ルペプチドとして天然型ＨＷＰシグナルペプチドを含
む。（図２２） 以下、図２３を参照しながら、プラスミドシャトルベク
ターｐＮＣＭＯ２の構築について説明する。
【００３８】（２）プラスミドｐＮＣの構築 プラスミドシャトルベクターｐＮＣ３０１よりブレビバ
チルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１由来のＨＷＰプロ
モーター領域を除いたｐＮＣ３０１全長をプライマー３
（配列番号８：図８）とプライマー４（配列番号９：図
９）を用いた条件１のＰＣＲ法により増幅し、増幅され
た約５ｋｂｐの断片をＢｃｌＩで処理し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼによりセルフライゲーションを行った。このＤＮ
Ａを用いて大腸菌ＪＭ１０９にＣａＣｌ2法で形質転換
し、プラスミドｐＮＣを得た。ＰＣＲの反応条件は、
（変性温度：９４℃〜６０ｓｅｃ、アニール温度：５４
℃−１２０ｓｅｃ、ＤＮＡ鎖伸長温度：７０℃〜１８０
ｓｅｃを１サイクルとして２５回繰り返す）とした。
チルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１由来のＨＷＰプロ
モーター領域を除いたｐＮＣ３０１全長をプライマー３
（配列番号８：図８）とプライマー４（配列番号９：図
９）を用いた条件１のＰＣＲ法により増幅し、増幅され
た約５ｋｂｐの断片をＢｃｌＩで処理し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼによりセルフライゲーションを行った。このＤＮ
Ａを用いて大腸菌ＪＭ１０９にＣａＣｌ2法で形質転換
し、プラスミドｐＮＣを得た。ＰＣＲの反応条件は、
（変性温度：９４℃〜６０ｓｅｃ、アニール温度：５４
℃−１２０ｓｅｃ、ＤＮＡ鎖伸長温度：７０℃〜１８０
ｓｅｃを１サイクルとして２５回繰り返す）とした。
【００３９】（３）プラスミドｐＧＥＭ−ＴＰ２の構築 プラスミドｐＮＵ２１０（Ｕｄａｋａ，Ｓ．ら，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７，２３
−３３（１９９３））に含まれるＨＷＰプロモーター領
域由来のＰ２プロモーターをコードするＤＮＡ配列をプ
ライマー５（配列番号１０：図１０）とプライマー６
（配列番号１１：図１１）を用いて条件１のＰＣＲ法に
より増幅し、約１４０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。プライ
マー６にはｌａｃオペレーター配列が含まれるため、こ
のＤＮＡ断片はＰ２プロモーターの３′末端側にｌａｃ
オペレーター配列を含む。このＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−
Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にＴ４ＤＮＡリガーゼにより
連結した。このＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９をＣａ
Ｃｌ2法により形質転換し、得られたアンピシリン耐性
の形質転換体よりプラスミドを抽出し、ｐＧＥＭ−ＴＰ
２を得た。
ｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７，２３
−３３（１９９３））に含まれるＨＷＰプロモーター領
域由来のＰ２プロモーターをコードするＤＮＡ配列をプ
ライマー５（配列番号１０：図１０）とプライマー６
（配列番号１１：図１１）を用いて条件１のＰＣＲ法に
より増幅し、約１４０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。プライ
マー６にはｌａｃオペレーター配列が含まれるため、こ
のＤＮＡ断片はＰ２プロモーターの３′末端側にｌａｃ
オペレーター配列を含む。このＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−
Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にＴ４ＤＮＡリガーゼにより
連結した。このＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９をＣａ
Ｃｌ2法により形質転換し、得られたアンピシリン耐性
の形質転換体よりプラスミドを抽出し、ｐＧＥＭ−ＴＰ
２を得た。
【００４０】（４）プラスミドｐＧＥＭ−ＴＰ２+の構
築 プラスミドｐＮＨ３２６（Ｋａｊｉｎｏ，Ｔ．，ら．Ａ
ｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６
６，６３８−６４２（２０００）に含まれるブレビバチ
ルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のＨＷＰプロモータ
ー領域のＳＤ１とＳＤ２配列と分泌シグナルペプチド配
列であるＲ２Ｌ６型の改変ＨＷＰシグナル配列（特開平
７−１７０９８４号）（配列番号５、配列番号２１：図
５）およびマルチクローニングサイトを含むＤＮＡ配列
を、プライマー７（配列番号１２：図１２）とプライマ
ー８（配列番号１３：図１３）を用いて、条件１の条件
でＰＣＲ法により増幅し、約２７０ｂｐのＤＮＡ断片を
得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｓｉＩとＨｉｎ
ｄIIIで処理し、ｐＧＥＭ−ＴＰ２のＰｓｔＩ／Ｈｉｎ
ｄIIIサイトにＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。このＤ
ＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９をコンピテントセル法に
より形質転換し、ｐＧＥＭ−ＴＰ２+を得た。
築 プラスミドｐＮＨ３２６（Ｋａｊｉｎｏ，Ｔ．，ら．Ａ
ｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６
６，６３８−６４２（２０００）に含まれるブレビバチ
ルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のＨＷＰプロモータ
ー領域のＳＤ１とＳＤ２配列と分泌シグナルペプチド配
列であるＲ２Ｌ６型の改変ＨＷＰシグナル配列（特開平
７−１７０９８４号）（配列番号５、配列番号２１：図
５）およびマルチクローニングサイトを含むＤＮＡ配列
を、プライマー７（配列番号１２：図１２）とプライマ
ー８（配列番号１３：図１３）を用いて、条件１の条件
でＰＣＲ法により増幅し、約２７０ｂｐのＤＮＡ断片を
得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｓｉＩとＨｉｎ
ｄIIIで処理し、ｐＧＥＭ−ＴＰ２のＰｓｔＩ／Ｈｉｎ
ｄIIIサイトにＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。このＤ
ＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９をコンピテントセル法に
より形質転換し、ｐＧＥＭ−ＴＰ２+を得た。
【００４１】（５）プラスミドシャトルベクターｐＮＣ
ＭＯ２の構築 更にｐＧＥＭ−ＴＰ２+をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで
処理し、得られた約４００ｂｐの断片をｐＮＣのＢｃｌ
Ｉ／ＰｓｔＩサイトに挿入し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９にＣａＣｌ2法で形質転
換した。得られたアンピシリン耐性株からプラスミドを
抽出し、新規なプラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ
２を得た（図２３）。プラスミドシャトルベクターｐＮ
ＣＭＯ２の構築の概要を図２２、図２３に示す。このよ
うにして得た新規プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭ
Ｏ２の制限酵素地図及びプロモーター等を含む一部の塩
基配列を図２１に示した。上記と同様にして本プラスミ
ドシャトルベクターを用いてブレビバチルス・チョウシ
ネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２
３）を形質転換し、得られた形質転換体（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３
１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２）をＦＥＲＭ ＢＰ−７３９４
として生命研に国際寄託した。
ＭＯ２の構築 更にｐＧＥＭ−ＴＰ２+をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで
処理し、得られた約４００ｂｐの断片をｐＮＣのＢｃｌ
Ｉ／ＰｓｔＩサイトに挿入し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９にＣａＣｌ2法で形質転
換した。得られたアンピシリン耐性株からプラスミドを
抽出し、新規なプラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ
２を得た（図２３）。プラスミドシャトルベクターｐＮ
ＣＭＯ２の構築の概要を図２２、図２３に示す。このよ
うにして得た新規プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭ
Ｏ２の制限酵素地図及びプロモーター等を含む一部の塩
基配列を図２１に示した。上記と同様にして本プラスミ
ドシャトルベクターを用いてブレビバチルス・チョウシ
ネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２
３）を形質転換し、得られた形質転換体（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３
１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２）をＦＥＲＭ ＢＰ−７３９４
として生命研に国際寄託した。
【００４２】
【実施例２】ｐＮＣＭＯ２、ｐＮＣ３０１の形質転換効
率 ｐＮＣＭＯ２、ｐＮＣ３０１の形質転換効率を表１に示
す。両ベクターの大腸菌ＪＭ１０９に対する形質転換効
率は十分に高いものであった。ｐＮＣＭＯ２のブレビバ
チルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５に対する形
質転換効率はｐＮＣ３０１に比べて低いが、構築済みの
プラスミドを挿入する目的には十分高いものであった。
なお、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換はＣａＣｌ2法（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｒｅ
ｓｅ，１，８２，（１９８９））を用いて行い、ブレビ
バチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転
換はエレクトロポレーション法（Ｔａｋａｇｉ，Ｈ．
ら，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９
９−３１００（１９８９））を用いて行った。エレクト
ロポレーションはジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ社製）
を用いて、１．５ｋＶ、１０００オーム、２５μＦ、
１．８ｍｓｅｃの条件で行った。
率 ｐＮＣＭＯ２、ｐＮＣ３０１の形質転換効率を表１に示
す。両ベクターの大腸菌ＪＭ１０９に対する形質転換効
率は十分に高いものであった。ｐＮＣＭＯ２のブレビバ
チルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５に対する形
質転換効率はｐＮＣ３０１に比べて低いが、構築済みの
プラスミドを挿入する目的には十分高いものであった。
なお、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換はＣａＣｌ2法（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｒｅ
ｓｅ，１，８２，（１９８９））を用いて行い、ブレビ
バチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転
換はエレクトロポレーション法（Ｔａｋａｇｉ，Ｈ．
ら，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９
９−３１００（１９８９））を用いて行った。エレクト
ロポレーションはジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ社製）
を用いて、１．５ｋＶ、１０００オーム、２５μＦ、
１．８ｍｓｅｃの条件で行った。
【００４３】
【００４４】
【実施例３】プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２
とプラスミドシャトルベクターｐＮＣ３０１のＢＬＡの
生産での比較
とプラスミドシャトルベクターｐＮＣ３０１のＢＬＡの
生産での比較
【００４５】（１）組換え遺伝子発現プラスミドｐＮＣ
ＭＯ２ＢＬＡおよびＰＮＣ３０１ＢＬＡの構築 バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformi
s）由来α−アミラーゼ（ＢＬＡ）遺伝子をｐＨＹ４６
３１（Ｙａｍａｇａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．ｏｆＢｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ，１６９，１２３９−１２４５（１９８
７））をテンプレートとしてプライマー９（配列番号１
４：図１４）およびプライマー１０（配列番号１５：図
１５）を用いてＰＣＲ法で増幅した。得られたＰＣＲ産
物を制限酵素ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIIIで消化し、ＢＬＡ
遺伝子を含んだ約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。実施
例１で構築したプラスミドベクターｐＮＣＭＯ２および
ｐＮＣ３０１を制限酵素ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIIIで消化
し、先に得たＢＬＡ遺伝子を含んだ断片をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで連結し、プラスミドベクターｐＮＣＭＯ２ＢＬ
Ａ、およびｐＮＣ３０１ＢＬＡを得た（図２４）。更に
プラスミドベクターｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよびｐＮＣ３
０１ＢＬＡ、各々を用いてＣａＣｌ2法により大腸菌Ｊ
Ｍ１０９を形質転換し、プラスミドベクターｐＮＣＭＯ
２ＢＬＡ、ｐＮＣ３０１ＢＬＡ各々を保持する形質転換
体、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡ、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡを得た。また、ＢＬＡ遺
伝子としては、ＢＬＡ遺伝子を含有するプラスミド、例
えばｐＨＴ１１０ＢＬＡ（特許第２７２７３９１号）か
ら切り出したＤＮＡ断片を使用することも可能であっ
た。
ＭＯ２ＢＬＡおよびＰＮＣ３０１ＢＬＡの構築 バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformi
s）由来α−アミラーゼ（ＢＬＡ）遺伝子をｐＨＹ４６
３１（Ｙａｍａｇａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．ｏｆＢｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ，１６９，１２３９−１２４５（１９８
７））をテンプレートとしてプライマー９（配列番号１
４：図１４）およびプライマー１０（配列番号１５：図
１５）を用いてＰＣＲ法で増幅した。得られたＰＣＲ産
物を制限酵素ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIIIで消化し、ＢＬＡ
遺伝子を含んだ約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。実施
例１で構築したプラスミドベクターｐＮＣＭＯ２および
ｐＮＣ３０１を制限酵素ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIIIで消化
し、先に得たＢＬＡ遺伝子を含んだ断片をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで連結し、プラスミドベクターｐＮＣＭＯ２ＢＬ
Ａ、およびｐＮＣ３０１ＢＬＡを得た（図２４）。更に
プラスミドベクターｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよびｐＮＣ３
０１ＢＬＡ、各々を用いてＣａＣｌ2法により大腸菌Ｊ
Ｍ１０９を形質転換し、プラスミドベクターｐＮＣＭＯ
２ＢＬＡ、ｐＮＣ３０１ＢＬＡ各々を保持する形質転換
体、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡ、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡを得た。また、ＢＬＡ遺
伝子としては、ＢＬＡ遺伝子を含有するプラスミド、例
えばｐＨＴ１１０ＢＬＡ（特許第２７２７３９１号）か
ら切り出したＤＮＡ断片を使用することも可能であっ
た。
【００４６】（２）大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２Ｂ
ＬＡおよび大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡによ
るＢＬＡの生産 それぞれの形質転換体を、２ｘＹＴ培地を１．５ｍｌ分
注した培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養した。こ
の培養液を、菌体を破砕する為に、ソニケーターで３０
秒間処理し、その処理液中のアミラーゼ活性を可溶性澱
粉を基質として斎藤の方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１５５，２９０（１９７３））
を用いて測定した（図２５）。大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮ
ＣＭＯ２ＢＬＡは、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣ３０１Ｂ
ＬＡと比較すると約７０分の１のアミラーゼしか生産せ
ず、大腸菌における遺伝子発現が効率的に抑制されてい
た。
ＬＡおよび大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡによ
るＢＬＡの生産 それぞれの形質転換体を、２ｘＹＴ培地を１．５ｍｌ分
注した培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養した。こ
の培養液を、菌体を破砕する為に、ソニケーターで３０
秒間処理し、その処理液中のアミラーゼ活性を可溶性澱
粉を基質として斎藤の方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１５５，２９０（１９７３））
を用いて測定した（図２５）。大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮ
ＣＭＯ２ＢＬＡは、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣ３０１Ｂ
ＬＡと比較すると約７０分の１のアミラーゼしか生産せ
ず、大腸菌における遺伝子発現が効率的に抑制されてい
た。
【００４７】また、３％澱粉を含むＬＡ寒天培地上に大
腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡ、大腸菌ＪＭ１０
９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡを植菌し３７℃で一晩培養し、
コロニーを形成させ、それぞれのハロー形成能および生
育を比較した（図２６：図面代用写真）。その結果、大
腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡは、大腸菌ＪＭ１
０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡと比較すると、コロニー周囲
のハローのサイズが小さいことから、ＢＬＡの発現が抑
えられていた。また、生育したコロニーの大きさから大
腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡのほうが増殖が早
いことが判明した。これは大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭ
Ｏ２ＢＬＡではＢＬＡの発現が効率よく抑えられてお
り、その結果菌株にかかるストレスが低減され増殖がよ
くなったためと考えられる。
腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡ、大腸菌ＪＭ１０
９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡを植菌し３７℃で一晩培養し、
コロニーを形成させ、それぞれのハロー形成能および生
育を比較した（図２６：図面代用写真）。その結果、大
腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡは、大腸菌ＪＭ１
０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡと比較すると、コロニー周囲
のハローのサイズが小さいことから、ＢＬＡの発現が抑
えられていた。また、生育したコロニーの大きさから大
腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡのほうが増殖が早
いことが判明した。これは大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭ
Ｏ２ＢＬＡではＢＬＡの発現が効率よく抑えられてお
り、その結果菌株にかかるストレスが低減され増殖がよ
くなったためと考えられる。
【００４８】更に大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬ
Ａを１ｍＭ ＩＰＴＧを含んだ寒天培地で培養したとこ
ろ形成されたハローの大きさが、ＩＰＴＧを含まない寒
天培地上で培養した同菌株と比較してほとんど変わらな
かった（図２７：図面代用写真）。ｐＮＣＭＯ２が持つ
大腸菌での発現抑制効果は、ｌａｃオペレーターの挿入
する抑制効果に加えて、Ｐ２プロモーター活性がＰ５プ
ロモーター活性と比較すると大腸菌中で非常に低いこと
によると考えられた。
Ａを１ｍＭ ＩＰＴＧを含んだ寒天培地で培養したとこ
ろ形成されたハローの大きさが、ＩＰＴＧを含まない寒
天培地上で培養した同菌株と比較してほとんど変わらな
かった（図２７：図面代用写真）。ｐＮＣＭＯ２が持つ
大腸菌での発現抑制効果は、ｌａｃオペレーターの挿入
する抑制効果に加えて、Ｐ２プロモーター活性がＰ５プ
ロモーター活性と比較すると大腸菌中で非常に低いこと
によると考えられた。
【００４９】（３）ブレビバチルス・チョウシネンシス
ＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよびブレビバ
チルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣ３
０１ＢＬＡによるＢＬＡの生産 （１）で得たプラスミドベクターｐＮＣＭＯ２ＢＬＡお
よびｐＮＣ３０１ＢＬＡ各々でブレビバチルス・チョウ
シネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５をエレクトロポレーション
法で形質転換し、プラスミドベクターｐＮＣＭＯ２ＢＬ
Ａ、ｐＮＣ３０１ＢＬＡ各々を保持する形質転換体、ブ
レビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐ
ＮＣＭＯ２ＢＬＡ、ブレビバチルス・チョウシネンシス
ＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣ３０１ＢＬＡを得た（図２
４）。エレクトロポレーションは、ジーンパルサー（Ｂ
ｉｏＲａｄ社製）を用いて、１．５ｋＶ、１０００オー
ム、２５μＦ、１．８ｍｓｅｃの条件で行った。各々の
形質転換体を、１．５ｍｌのＴＭＮ培地を含んだ試験管
に接種し、３０℃で２日間振とう培養した。この培養液
を遠心分離し、その培養上清のアミラーゼ活性を可溶性
澱粉を基質として斎藤の方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１５５，２９０（１９７３）を
用いて測定した（図２８）。ブレビバチルス・チョウシ
ネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡはブレ
ビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮ
Ｃ３０１ＢＬＡの約２２倍のアミラーゼを生産したこと
から、ｐＮＣＭＯ２はブレビバチルス属細菌中において
ｐＮＣ３０１よりも遥かに効率的に遺伝子を発現できる
ことが示された。
ＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよびブレビバ
チルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣ３
０１ＢＬＡによるＢＬＡの生産 （１）で得たプラスミドベクターｐＮＣＭＯ２ＢＬＡお
よびｐＮＣ３０１ＢＬＡ各々でブレビバチルス・チョウ
シネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５をエレクトロポレーション
法で形質転換し、プラスミドベクターｐＮＣＭＯ２ＢＬ
Ａ、ｐＮＣ３０１ＢＬＡ各々を保持する形質転換体、ブ
レビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐ
ＮＣＭＯ２ＢＬＡ、ブレビバチルス・チョウシネンシス
ＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣ３０１ＢＬＡを得た（図２
４）。エレクトロポレーションは、ジーンパルサー（Ｂ
ｉｏＲａｄ社製）を用いて、１．５ｋＶ、１０００オー
ム、２５μＦ、１．８ｍｓｅｃの条件で行った。各々の
形質転換体を、１．５ｍｌのＴＭＮ培地を含んだ試験管
に接種し、３０℃で２日間振とう培養した。この培養液
を遠心分離し、その培養上清のアミラーゼ活性を可溶性
澱粉を基質として斎藤の方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１５５，２９０（１９７３）を
用いて測定した（図２８）。ブレビバチルス・チョウシ
ネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡはブレ
ビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮ
Ｃ３０１ＢＬＡの約２２倍のアミラーゼを生産したこと
から、ｐＮＣＭＯ２はブレビバチルス属細菌中において
ｐＮＣ３０１よりも遥かに効率的に遺伝子を発現できる
ことが示された。
【００５０】
【実施例４】組換え遺伝子発現プラスミドｐＮＹ３２６
ＣＴの構築 （１）ＣＴＡ遺伝子およびＣＴＢ遺伝子の取得 コレラ菌染色体ＤＮＡ（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．ら，
Ｎａｔｕｒｅ，３０６，５５１−５５７（１９８３））
をテンプレートとして、合成した２種類のプライマー１
１（配列番号１６：図１６）、プライマー１２（配列番
号１７：図１７）を用いてコレラトキシン（ＣＴ）のＡ
サブユニット遺伝子（ＣＴＡ）（０．７ｂｐ）をＰＣＲ
法で増幅した。同様に２種類のプライマー１３（配列番
号１８：図１８）、プライマー１４（配列番号１９：図
１９）を用いてＣＴのＢサブユニット遺伝子（ＣＴＢ）
（０．３ｂｐ）を増幅した。
ＣＴの構築 （１）ＣＴＡ遺伝子およびＣＴＢ遺伝子の取得 コレラ菌染色体ＤＮＡ（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．ら，
Ｎａｔｕｒｅ，３０６，５５１−５５７（１９８３））
をテンプレートとして、合成した２種類のプライマー１
１（配列番号１６：図１６）、プライマー１２（配列番
号１７：図１７）を用いてコレラトキシン（ＣＴ）のＡ
サブユニット遺伝子（ＣＴＡ）（０．７ｂｐ）をＰＣＲ
法で増幅した。同様に２種類のプライマー１３（配列番
号１８：図１８）、プライマー１４（配列番号１９：図
１９）を用いてＣＴのＢサブユニット遺伝子（ＣＴＢ）
（０．３ｂｐ）を増幅した。
【００５１】（２）プラスミドｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＡお
よびプラスミドｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＢプラスミドｐＴ７
Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）と先に得たＣＴＡ遺伝
子あるいはＣＴＢ遺伝子をＴ４リガーゼを用いて連結
し、ＣＴＡ遺伝子、ＣＴＢ遺伝子を保持するプラスミド
ｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＡ、ｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＢを得た。
よびプラスミドｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＢプラスミドｐＴ７
Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）と先に得たＣＴＡ遺伝
子あるいはＣＴＢ遺伝子をＴ４リガーゼを用いて連結
し、ＣＴＡ遺伝子、ＣＴＢ遺伝子を保持するプラスミド
ｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＡ、ｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＢを得た。
【００５２】（３）プラスミドｐＮＹ３２６ＣＴＡの構
築 プラスミドｐＮＹ３２６（ｐＮＹ３０１（特開平１０−
２９５３７８号）のシグナルペプチドをＲ２Ｌ６型（配
列番号５、２１：図５）に変換したもの）をＮｃｏＩと
ＨｉｎｄIIIで処理し３．６ｋｂｐの断片を得た。さら
に、ｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＡをＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで
処理し、ＣＴＡ遺伝子を含有する０．７ｋｂｐのＤＮＡ
断片を得、先に得た３．６ｋｂｐの遺伝子断片とＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブ
レビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５をエ
レクトロポレーション法で形質転換し、得られたネオマ
イシン耐性株よりプラスミドを抽出し、ＣＴＡ遺伝子を
保持するｐＮＹ３２６ＣＴＡを得た。
築 プラスミドｐＮＹ３２６（ｐＮＹ３０１（特開平１０−
２９５３７８号）のシグナルペプチドをＲ２Ｌ６型（配
列番号５、２１：図５）に変換したもの）をＮｃｏＩと
ＨｉｎｄIIIで処理し３．６ｋｂｐの断片を得た。さら
に、ｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＡをＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで
処理し、ＣＴＡ遺伝子を含有する０．７ｋｂｐのＤＮＡ
断片を得、先に得た３．６ｋｂｐの遺伝子断片とＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブ
レビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５をエ
レクトロポレーション法で形質転換し、得られたネオマ
イシン耐性株よりプラスミドを抽出し、ＣＴＡ遺伝子を
保持するｐＮＹ３２６ＣＴＡを得た。
【００５３】（４）プラスミドｐＮＹ３２６ＣＴＢの構
築 同様の方法でｐＮＹ３２６をＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処
理して３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。さらにｐＴ７
ＢｌｕｅＣＴＢをＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理してＣＴ
Ｂ遺伝子を含有する０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を得、先
に得た３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブレビバチルス
・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５を形質転換し、ネ
オマイシン耐性株を持つ株を選択した。選択株よりプラ
スミドを抽出してＣＴＢ遺伝子を保持するプラスミドｐ
ＮＹ３２６ＣＴＢを得た。
築 同様の方法でｐＮＹ３２６をＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処
理して３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。さらにｐＴ７
ＢｌｕｅＣＴＢをＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理してＣＴ
Ｂ遺伝子を含有する０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を得、先
に得た３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結した。連結ＤＮＡを用いてブレビバチルス
・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５を形質転換し、ネ
オマイシン耐性株を持つ株を選択した。選択株よりプラ
スミドを抽出してＣＴＢ遺伝子を保持するプラスミドｐ
ＮＹ３２６ＣＴＢを得た。
【００５４】（５）ｐＮＹ３２６ＣＴによるブレビバチ
ルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換の
試行 ｐＮＹ３２６ＣＴＢをＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで処理
し、４．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。さらに、ｐＮＹ
３２６ＣＴＡをテンプレートとして２種類のプライマー
１５（配列番号２０：図２０）、プライマー１１（配列
番号１６：図１６）を用いて、ＣＴＡ遺伝子をＳＤ２配
列を含めた形（ＳＤ−ＣＴＡ遺伝子（０．８ｋｂｐ））
でＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＨｉ
ｎｄIIIで処理して０．４ｋｂｐの断片を得、先に得た
ｐＮＹ３２６ＣＴＢ由来の４．７ｋｂｐのＤＮＡ断片と
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用
いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ
５をエレクトロポレーション法で形質転換し、ネオマイ
シン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ寒天培地（１％ペプトン、
０．２％酵母エキス、０．５％肉エキス、１％グルコー
ス、０．００１％ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１％
ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ、０．０００１％ ＺｎＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ、１．５％寒天、ｐＨ７．０）に塗布をして、ネ
オマイシン耐性を持つ株を選択しようとしたが、耐性株
が得られなかった。エレクトロポレーションはジーンパ
ルサー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、１．５ｋＶ、１
０００オーム、２５μＦ、１．８ｍｓｅｃの条件で行っ
た。
ルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換の
試行 ｐＮＹ３２６ＣＴＢをＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで処理
し、４．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。さらに、ｐＮＹ
３２６ＣＴＡをテンプレートとして２種類のプライマー
１５（配列番号２０：図２０）、プライマー１１（配列
番号１６：図１６）を用いて、ＣＴＡ遺伝子をＳＤ２配
列を含めた形（ＳＤ−ＣＴＡ遺伝子（０．８ｋｂｐ））
でＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＨｉ
ｎｄIIIで処理して０．４ｋｂｐの断片を得、先に得た
ｐＮＹ３２６ＣＴＢ由来の４．７ｋｂｐのＤＮＡ断片と
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結ＤＮＡを用
いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ
５をエレクトロポレーション法で形質転換し、ネオマイ
シン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ寒天培地（１％ペプトン、
０．２％酵母エキス、０．５％肉エキス、１％グルコー
ス、０．００１％ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１％
ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ、０．０００１％ ＺｎＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ、１．５％寒天、ｐＨ７．０）に塗布をして、ネ
オマイシン耐性を持つ株を選択しようとしたが、耐性株
が得られなかった。エレクトロポレーションはジーンパ
ルサー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、１．５ｋＶ、１
０００オーム、２５μＦ、１．８ｍｓｅｃの条件で行っ
た。
【００５５】
【実施例５】組換え遺伝子発現プラスミドｐＮＣＭＯ２
ＣＴの構築 （１）プラスミドｐＮＣＭＯ２ＣＴＢの構築 ｐＮＣＭＯ２をＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理して５．２
ｋｂｐの断片を得た。さらに、ｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＢを
ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理してＣＴＢ遺伝子を含有す
る０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を得、先に得た５．２ｋｂ
ｐの遺伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した
（図２９）。連結ＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形
質転換し、プラスミドを抽出してＣＴＢ遺伝子を保持す
るｐＮＣＭＯ２ＣＴＢを得た。
ＣＴの構築 （１）プラスミドｐＮＣＭＯ２ＣＴＢの構築 ｐＮＣＭＯ２をＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理して５．２
ｋｂｐの断片を得た。さらに、ｐＴ７ＢｌｕｅＣＴＢを
ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理してＣＴＢ遺伝子を含有す
る０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を得、先に得た５．２ｋｂ
ｐの遺伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した
（図２９）。連結ＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形
質転換し、プラスミドを抽出してＣＴＢ遺伝子を保持す
るｐＮＣＭＯ２ＣＴＢを得た。
【００５６】（２）プラスミドｐＮＣＭＯ２ＣＴの構築 ｐＮＣＭＯ２ＣＴＢをＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで処理
し５．５ｋｂｐの断片を得た。実施例４（５）で得たＳ
Ｄ−ＣＴＡ遺伝子（０．８ｋｂｐ）をＢａｍＨＩとＨｉ
ｎｄIIIで処理して０．８ｋｂｐの断片を回収し、先に
得た５．５ｋｂｐの遺伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結した（図２９）。連結ＤＮＡを用いて大腸菌
ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性を持つ株を
選択した。選択株よりプラスミドを抽出してＣＴＢ遺伝
子を保持するプラスミドｐＮＣＭＯ２ＣＴを３株得た。
何れの株もシーケンスの結果ＣＴＢ遺伝子が正しくプラ
スミドに連結されていることが解った。ここで得た株を
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＣＴとした。大腸菌Ｊ
Ｍ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＣＴより抽出したｐＮＣＭＯ２
ＣＴで、エレクトロポレーション法によりブレビバチル
ス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５を形質転換した
ところ、同プラスミドを保持する形質転換体が多数個得
られた。得られた株をブレビバチルス・チョウシネンシ
スＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＣＴとした。エレク
トロポレーションは、ジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ社
製）を用いて、１．５ｋＶ、１０００オーム、２５μ
Ｆ、１．８ｍｓｅｃの条件で行った。
し５．５ｋｂｐの断片を得た。実施例４（５）で得たＳ
Ｄ−ＣＴＡ遺伝子（０．８ｋｂｐ）をＢａｍＨＩとＨｉ
ｎｄIIIで処理して０．８ｋｂｐの断片を回収し、先に
得た５．５ｋｂｐの遺伝子断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結した（図２９）。連結ＤＮＡを用いて大腸菌
ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性を持つ株を
選択した。選択株よりプラスミドを抽出してＣＴＢ遺伝
子を保持するプラスミドｐＮＣＭＯ２ＣＴを３株得た。
何れの株もシーケンスの結果ＣＴＢ遺伝子が正しくプラ
スミドに連結されていることが解った。ここで得た株を
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＣＴとした。大腸菌Ｊ
Ｍ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＣＴより抽出したｐＮＣＭＯ２
ＣＴで、エレクトロポレーション法によりブレビバチル
ス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５を形質転換した
ところ、同プラスミドを保持する形質転換体が多数個得
られた。得られた株をブレビバチルス・チョウシネンシ
スＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＣＴとした。エレク
トロポレーションは、ジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ社
製）を用いて、１．５ｋＶ、１０００オーム、２５μ
Ｆ、１．８ｍｓｅｃの条件で行った。
【００５７】（３）ブレビバチルス・チョウシネンシス
ＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＣＴによるＣＴの発現 ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／
ｐＮＣＭＯ２ＣＴを中試験管を用いてネオマイシン５０
μｇ／ｍｌ含有ＴＭ液体培地３ｍｌで３０℃で２日間振
とう培養を行い、その培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供
し、クマシーブリリアントブルー染色、およびウサギＣ
Ｔポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法に
より解析を行った。ＣＴＡおよびＣＴＢの推定分子量
は、それぞれ２８ｋＤａ、１２ｋＤａであり、それぞれ
が相当の分子量の位置に染色バンドを示した。バンドの
濃さよりＣＴＡの分泌生産量は７０ｍｇ／ｌ、ＣＴＢの
分泌生産量は３０ｍｇ／ｌと推定した。そのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ電気泳動パターンを図面代用写真に示す（図３
０）。また、培養上清をＣＴを特異的に結合するガラク
トース樹脂を用いて精製したあと（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，１６，７１−７９（１９
９４））。精製分画を加熱処理せずに泳動した場合、バ
ンドが約９０ｋＤａの位置にシフトしたことから、発現
されたサブユニットは１Ａ５Ｂ構造を取っている事が推
測された。
ＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＣＴによるＣＴの発現 ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／
ｐＮＣＭＯ２ＣＴを中試験管を用いてネオマイシン５０
μｇ／ｍｌ含有ＴＭ液体培地３ｍｌで３０℃で２日間振
とう培養を行い、その培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供
し、クマシーブリリアントブルー染色、およびウサギＣ
Ｔポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法に
より解析を行った。ＣＴＡおよびＣＴＢの推定分子量
は、それぞれ２８ｋＤａ、１２ｋＤａであり、それぞれ
が相当の分子量の位置に染色バンドを示した。バンドの
濃さよりＣＴＡの分泌生産量は７０ｍｇ／ｌ、ＣＴＢの
分泌生産量は３０ｍｇ／ｌと推定した。そのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ電気泳動パターンを図面代用写真に示す（図３
０）。また、培養上清をＣＴを特異的に結合するガラク
トース樹脂を用いて精製したあと（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，１６，７１−７９（１９
９４））。精製分画を加熱処理せずに泳動した場合、バ
ンドが約９０ｋＤａの位置にシフトしたことから、発現
されたサブユニットは１Ａ５Ｂ構造を取っている事が推
測された。
【００５８】
【発明の効果】本発明により、大腸菌とブレビバチルス
属細菌間のプラスミドシャトルベクターが提供される。
また本発明のプラスミドシャトルベクターは、実施例３
におけるＢＬＡ遺伝子の発現の結果が示すように大腸菌
において遺伝子の発現が抑制され、ブレビバチルス・チ
ョウシネンシス中において効率的な遺伝子の発現を行う
ことができる。更に実施例４および実施例５におけるＣ
Ｔの発現により示されたように、本発明におけるプラス
ミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２は、特に複雑な遺伝
子構築を必要とする組換え遺伝子発現プラスミドの構築
および該組換え遺伝子発現プラスミドにより形質転換さ
れた形質転換体によるタンパク質の生産に有用である。
属細菌間のプラスミドシャトルベクターが提供される。
また本発明のプラスミドシャトルベクターは、実施例３
におけるＢＬＡ遺伝子の発現の結果が示すように大腸菌
において遺伝子の発現が抑制され、ブレビバチルス・チ
ョウシネンシス中において効率的な遺伝子の発現を行う
ことができる。更に実施例４および実施例５におけるＣ
Ｔの発現により示されたように、本発明におけるプラス
ミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２は、特に複雑な遺伝
子構築を必要とする組換え遺伝子発現プラスミドの構築
および該組換え遺伝子発現プラスミドにより形質転換さ
れた形質転換体によるタンパク質の生産に有用である。
【００５９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Higeta Shoyu Co., Ltd <120> Plasmid Shuttle Vector between E．coli and Brevibacillus <130> 6414 <140> 2001-2-14 <160> 21 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Brevibacillus choshinensis <400> 1 aaggcgccgc aacttttgat tcgctcaggc gtttaatagg atgt 44 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 aattgtgagc ggataacaat t 21 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Brevibacillus choshinensis <400> 3 gaaaggaggt 10 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Brevibacillus choshmensis <400> 4 agaggaggag aa 12 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 5 Met Lys Lys Arg Arg Val Val Asn Ser Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 5 10 15 Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro Met Ala Phe Ala 20 25 30 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 aaaatgcatg gccagcaaaa gg 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 aaaatgcatg acgaaagggc 20 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 aaatgatcaa agcttcggca ttatagtgcg gg 32 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 aaatgatcct gcaggatccg tcgactctag 30 <210> 10 <211> 24 <2i2> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 aaaggatccg acataatgga cagg 24 <210> 11 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 aaactgcaga ataattgtta tccgctcaca attacatcct attaaacgcc tg 52 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 aaactgcatg gctttcctgc gaaagg 26 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 aaaagcttat cgatttcgaa ggg 23 <210> 14 <211> 23 <2i2> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 cgctgcagca gcggcggcaa atc 23 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 aaaagcttat ctttgaacat aaattg 26 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 aaccatggct ttcgctaatg atgataagtt atat 34 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 ttaagcttca taattcatcc ttaattct 28 <210> 18 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 aaccatggct ttcgctacac ctcaaaatat tactgatttg tgtgcagaat accacaac 58 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 aaggatcctt aatttgccat actaattgcg gc 32 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 gcggatccag aggaggagaa cacaaggtc 29 <210> 21 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 atgaaaaaaa gaagggtcgt taacagtgta ttgcttctgc tactgctagc tagtgcactc 60 gcacttactg ttgctcccat ggctttcgct 90
【図１】Ｐ２プロモーターを示す。
【図２】Ｌａｃオペレータ配列を示す。
【図３】ＳＤ配列（ＳＤ１）を示す。
【図４】ＳＤ配列（ＳＤ２）を示す。
【図５】Ｒ２Ｌ６型の改変シグナルペプチド（上段に塩
基配列、下段にアミノ酸配列）を示す。
基配列、下段にアミノ酸配列）を示す。
【図６】ＰＣＲクローニングプライマー１を示す。
【図７】ＰＣＲクローニングプライマー２を示す。
【図８】ＰＣＲクローニングプライマー３を示す。
【図９】ＰＣＲクローニングプライマー４を示す。
【図１０】ＰＣＲクローニングプライマー５を示す。
【図１１】ＰＣＲクローニングプライマー６を示す。
【図１２】ＰＣＲクローニングプライマー７を示す。
【図１３】ＰＣＲクローニングプライマー８を示す。
【図１４】ＰＣＲクローニングプライマー９を示す。
【図１５】ＰＣＲクローニングプライマー１０を示す。
【図１６】ＰＣＲクローニングプライマー１１を示す。
【図１７】ＰＣＲクローニングプライマー１２を示す。
【図１８】ＰＣＲクローニングプライマー１３を示す。
【図１９】ＰＣＲクローニングプライマー１４を示す。
【図２０】ＰＣＲクローニングプライマー１５を示す。
【図２１】プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２の
制限酵素地図を示す。
制限酵素地図を示す。
【図２２】プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２の
構築の過程を示す。
構築の過程を示す。
【図２３】同上続きを示す。
【図２４】組換え遺伝子発現プラスミドｐＮＣＭＯ２Ｂ
ＬＡおよびｐＮＣ３０１ＢＬＡの構築の過程を示す。
ＬＡおよびｐＮＣ３０１ＢＬＡの構築の過程を示す。
【図２５】大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよ
び大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡの生産性を示
す。
び大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡの生産性を示
す。
【図２６】大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよ
び大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡによるハロー
形成能および生育を示す図面代用写真である。
び大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣ３０１ＢＬＡによるハロー
形成能および生育を示す図面代用写真である。
【図２７】大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡによ
るＢＬＡ発現に対するＩＰＴＧの効果を示す図面代用写
真である。
るＢＬＡ発現に対するＩＰＴＧの効果を示す図面代用写
真である。
【図２８】ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３
１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよびブレビバチルス・
チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣ３０１ＢＬ
ＡによるＢＬＡの生産性を示す。
１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＢＬＡおよびブレビバチルス・
チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣ３０１ＢＬ
ＡによるＢＬＡの生産性を示す。
【図２９】組換え遺伝子発現プラスミドｐＮＣＭＯ２Ｃ
Ｔの構築の過程を示すものである。
Ｔの構築の過程を示すものである。
【図３０】形質転換体ブレビバチルス・チョウシネンシ
スＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＣＴの培養物のクマ
シーブリリアントブルー染色像およびウェスタンブロッ
ティング像を示す図面代用写真である。
スＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２ＣＴの培養物のクマ
シーブリリアントブルー染色像およびウェスタンブロッ
ティング像を示す図面代用写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:08） Ｃ１２Ｒ 1:08） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Claims (11)
- 【請求項１】 ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）属細菌および大腸菌（エシェリヒア・コリ（Es
cherichia coli））のいずれにおいても複製可能で、ブ
レビバチルス属細菌において機能し得るプロモーターと
大腸菌およびブレビバチルス属細菌の選択マーカーとし
て機能し得る配列をコードするＤＮＡ配列を有すること
を特徴とするプラスミドシャトルベクター。 - 【請求項２】 （イ）ブレビバチルス属細菌において機
能し得るプロモーター、ＳＤ配列およびシグナル配列、
（ロ）ブレビバチルス属細菌において機能し得るＲｅｐ
タンパク質遺伝子および複製開始点をコードするＤＮＡ
配列、（ハ）ブレビバチルス属細菌に対する選択マーカ
ーとして機能し得る配列をコードするＤＮＡ配列、
（ニ）大腸菌において機能し得る複製開始点をコードす
るＤＮＡ配列、（ホ）大腸菌に対する選択マーカーとし
て機能し得る配列をコードするＤＮＡ配列を有すること
を特徴とする大腸菌およびブレビバチルス属細菌のいず
れの細菌でも複製可能なプラスミドシャトルベクター。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載のブレビバチルス
属細菌中で機能し得るプロモーターが、ブレビバチルス
・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃ
ｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）由来のＨＷＰプロモーターが
包含するＰ２プロモーターであって、その塩基配列は配
列番号１で表わされるものであること、を特徴とする請
求項１又は２に記載のプラスミドシャトルベクター。 - 【請求項４】 更に、大腸菌での組換えタンパク質の発
現を抑制する機能を持つＤＮＡ配列を有すること、を特
徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のプラスミ
ドシャトルベクター。 - 【請求項５】 請求項４に記載の大腸菌での組換えタン
パク質の発現を抑制する機能を持つＤＮＡ配列が大腸菌
由来のｌａｃオペレーター配列であって、その塩基配列
は配列番号２で表されるものであること、を特徴とする
請求項４に記載のプラスミドシャトルベクター。 - 【請求項６】 下図に記載の制限酵素認識部位を有する
プラスミドシャトルベクターｐＮＣＭＯ２。 【図２１】 - 【請求項７】 請求項６のプラスミドシャトルベクター
ｐＮＣＭＯ２を含有し、国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−
７３９４として生命工学工業技術研究所に寄託されてい
るブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｉｌｌｕｓｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＨＰＤ３１−
Ｓ５／ｐＮＣＭＯ２株。 - 【請求項８】 請求項１〜６のいずれか１項に記載のプ
ラスミドシャトルベクターにタンパク質をコードする遺
伝子のＤＮＡ配列を組み込んでなる組換えプラスミドに
よって形質転換されたブレビバチルス・チョウシネンシ
ス。 - 【請求項９】 ブレビバチルス・チョウシネンシスが、
国際寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３として生命工
学工業技術研究所に寄託されているブレビバチルス・チ
ョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５であること、を特徴と
する請求項８に記載のブレビバチルス・チョウシネンシ
ス。 - 【請求項１０】 請求項１〜６のいずれか１項に記載の
プラスミドシャトルベクターにタンパク質をコードする
遺伝子のＤＮＡ配列を組み込んでなる組換えプラスミド
で大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体から抽出し
たプラスミドを用いてブレビバチルス属細菌を形質転換
すること、を特徴とする形質転換方法。 - 【請求項１１】 請求項１〜６のいずれか１項に記載の
プラスミドシャトルベクターにタンパク質をコードする
遺伝子のＤＮＡ配列を組み込んでなる組換えプラスミド
によって形質転換されたブレビバチルス属細菌を培養
し、その培養液に分泌、蓄積された目的タンパク質を採
取すること、を特徴とするタンパク質の製造方法。
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