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WO2002034924A2 - Expressionskassetten zur transgenen expression von nukleinsäuren in der pflanzlichen embryonalen epidermis und der blüte - Google Patents

Expressionskassetten zur transgenen expression von nukleinsäuren in der pflanzlichen embryonalen epidermis und der blüte Download PDF

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Publication number
WO2002034924A2
WO2002034924A2 PCT/EP2001/012444 EP0112444W WO0234924A2 WO 2002034924 A2 WO2002034924 A2 WO 2002034924A2 EP 0112444 W EP0112444 W EP 0112444W WO 0234924 A2 WO0234924 A2 WO 0234924A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
expression
promoter
plant
transgenic
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2001/012444
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English (en)
French (fr)
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WO2002034924A3 (de
Inventor
Andreas Reindl
Friedrich Bischoff
Chiara Tonelli
Katia Petroni
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Plant Science GmbH
Original Assignee
BASF Plant Science GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF Plant Science GmbH filed Critical BASF Plant Science GmbH
Priority to AU2002224803A priority Critical patent/AU2002224803A1/en
Publication of WO2002034924A2 publication Critical patent/WO2002034924A2/de
Publication of WO2002034924A3 publication Critical patent/WO2002034924A3/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
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    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
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    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
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    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm

Definitions

  • Promoters with specificities for the anthers, ovaries, flowers, leaves, stems, roots and seeds are described. The stringency of the specificity as well as the expression activity of these promoters is very different. Promoters that ensure leaf-specific expression are to be mentioned, such as the promoter of the cytosolic FBPase from potato (WO 97/05900), the SSU promoter (small subunit) of the Rubisco (ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase) or the ST- Potato LSI promoter (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245).
  • promoters are, for example, promoters with specificity for tubers, storage roots or roots, such as, for example, the patatin promoter class I (B33), the promoter of the cathepsin D inhibitor from potato, the promoter of the starch synthase (GBSS1) or the sporamine promoter, fruit-specific promoters, such as the fruit-specific promoter made of tomato (EP-A 409625), fruit-ripening-specific promoters such as the fruit-specific promoter made of tomato
  • flower-specific promoters such as the phytoene synthase promoter (WO 92/16635) or the promoter of the P-rr gene (WO 98/22593).
  • Promoters are also known which control expression in seeds and plant embryos.
  • the promoters of genes that are used for storage proteins have been identified. encode different dicotyledons.
  • Seed-specific promoters are, for example, the promoter of phaseoline (US 5,504,200, Bustos MM et al., Plant Cell. 1989; 1 (9): 839-53), of the 2S albuming gene (Joseffson LG et al., J Biol Chem 1987, 262 : 12196-12201), leguminum (Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989;
  • Expression is rarely cell type specific. Differences in the expression pattern and the expression strength of a particular promoter can be caused by different host plants or by different insertion sites in the genome of the host plant (Goossens A et al., Plant Phys 1999, 120: 1095-1104).
  • a promoter activity with a specificity for certain cells within the seed has only been described for the seed coat:
  • a cryptic promoter with specificity for the seed coat was identified by "T-DNA tagging" in tobacco (Fobert PR et al., Plant Journal 19946 (4): 567-77; US 5,824,863; WO 99/53067).
  • Cryptic promoters or pseudopromotors are inherently inactive sequences within the genome, which, however, acquire expression-regulating functionality when positioned near genes.
  • a lectin-like protein that accumulates in the shoot tip epider is the garden pea (Pisum safcivum) has been described (Maiti et al., Planta 1993, 190, 241-246). Sterk et al. describe a lipid transfer protein that is strongly expressed in the epidermal cells of carrot shoot tips (Sterk et al., Plant Cell 1991, 3, 907-921). Clark et al. (Clark et al., Plant Cell 1992, 4, 1189-1198) describe a lipid transfer protein that is expressed in the epidermis of Pachyphy turn.
  • epidermis-specifically expressed genes such as the Chalcon synthase and phenylalanine ammonia gene families have been reported (Schmelzer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 2989-2993; Schmelzer et al., Plant Cell 1989, 1, 993-1001).
  • Goodrich et al. describes enzymes of anthocyanin biosynthesis in the snapdragon flower, which are expressed in specialized, epidermal cells for a limited period during the development of the flower bud (Goodrich et al., Cell 1992, 68, 955-964). Wyatt et al.
  • Promoters are described with tissue specificity for the mesophyll and the pallisade cells in leaves (Broglie et al., Science 1984, 234, 838-845), the dividing shoot and the root meristem (Atanassova et al., Plant J. 1992 , 2, 291-300), pollen (Guerrero et al., Mol. Gen. Genet. 1990, 224, 161-168), seed endosperm (Stalberg et al., Plant Mol. Biol. 1993, 23, 20 671-683 ), Root epidermis (Suzuki et al., Plant Mol. Biol 1993, 21, 109-119), as well as for the root meristem, root vascular tissue and root nodules (Bogusz et al., Plant Cell 1990, 2, 633-641).
  • Epidermis-specific promoters are also known with activity in flowers (Koes et al., Plant Cell 1990, 2, 379-392) or after wound injuries (Liang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1989, 86 , 9284-9288).
  • No. 5,744,334 describes a plant promoter (Blec promoter) with specificity for the epidermis of the shoot tip.
  • no promoter has been described that specifically ensures expression in the plant embryonic epidermis.
  • genes are regulated in all organisms via transcription factors. These also show development and
  • the task was therefore to identify corresponding promoters.
  • This task was solved by providing the promoter for the Arabidopsis thaliana mybll gene.
  • the promoter of the Arabidopsis thaliana mybll gene has an expression-regulating specificity which shows expression in the flower bud, the flower, the withering flower, the green pods and in the embryonic epidermis on day 4 of germination (compare FIGS. 1 to 6).
  • the mybll gene belongs to the R2R3-MYB family of transcription factors.
  • the MYB11 gene is known (Genbank Acc.-No: AL162651). However, neither its function nor its expression pattern are described. To date, no MYB transcription factor has been described or identified that is expressed both in flowers and in the embryonic epidermis or in the embryonic epidermis alone.
  • the flower bud and the flower of the plant is a sensitive organ, especially against stress factors such as cold, and
  • the plant embryo is particularly sensitive and susceptible to biotic and abiotic stress factors, especially in the first days of embryogenesis.
  • the epidermis of the plant embryo has a special function because it is the immediate barrier and contact point with the environment.
  • a first subject of the invention therefore relates to an expression cassette for the transgenic expression of nucleic acids in the embryonic epidermis and / or containing the flower
  • b) a functional equivalent or equivalent fragment of a) which have essentially the same promoter activities as a), where a) or b) are functionally linked to a nucleic acid sequence to be expressed transgenically.
  • Expression cassette for the transgenic expression of nucleic acids means all such constructions which have been obtained by genetic engineering methods and in which either
  • nucleotide residues are not in their natural, genetic environment (i.e. at their natural chromosomal locus) or have been modified by genetic engineering methods, the modification being, for example, a substitution, addition, deletion, inversion or insertion of one or more nucleotide residues.
  • the expression of a specific nucleic acid by a promoter with specificity for the embryonic epidermis and / or the flower can lead to the formation of sense RNA or anti-sense RNA.
  • the sense RNA can be translated into certain polypeptides.
  • the expression of certain genes can be downregulated with the anti-sense RNA.
  • a functional link is understood to mean, for example, the sequential arrangement of the promoter with specificity for the embryonic epidermis and / or the flower, the nucleic acid sequence to be expressed transgenically and if necessary.
  • further regulatory elements such as a terminator such that each of the regulatory elements can fulfill its function in the transgenic expression of the nucleic acid sequence, depending on the arrangement of the nucleic acid sequences to sense or anti-sense RNA. This does not necessarily require a direct link in the chemical sense.
  • Genetic control sequences such as, for example, enhancer sequences, can also perform their function on the target sequence from more distant positions or even from other DNA molecules.
  • nucleic acid sequence to be expressed transgenically is positioned behind the sequence functioning as a promoter, so that both sequences are covalently linked to one another.
  • the distance between the promoter sequence and the transgene is preferably to be expressed.
  • Nucleic acid sequence less than 200 base pairs, particularly preferably less than 100 base pairs, very particularly preferably less than 50 base pairs.
  • An expression cassette according to the invention is preferably produced, for example, by direct fusion of a nucleic acid sequence acting as a promoter with specificity for the embryonic epidermis and / or the flower with a nucleotide sequence to be expressed.
  • Common recombination and cloning techniques such as those described in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W.
  • the expression cassette consisting of a linkage of promoter and nucleic acid sequence to be expressed, can preferably be integrated in a vector according to the invention and inserted into a plant genome by, for example, transformation.
  • An expression cassette is also to be understood as such constructions in which the promoter, without having been functionally linked to a nucleic acid sequence to be expressed, is introduced, for example via targeted homologous recombination or a random insertion into a host genome, there regulatory control over then takes over functionally linked nucleic acid sequences and controls their transgenic expression.
  • Vectors according to the invention also contain the expression cassettes described above.
  • nucleic acid sequences contained in the expression cassettes or vectors according to the invention can be functionally linked to further genetic control sequences in addition to the promoter with specificity for the embryonic epidermis and / or the flower.
  • genetic control sequences is to be understood broadly and means all those sequences which have an influence on the formation or the function of the expression cassette according to the invention. Genetic control sequences modify, for example, transcription and translation in prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • the expression cassettes according to the invention preferably comprise 5 'upstream of the respective nucleic acid sequence to be expressed transgenically, the promoter with specificity for the embryonic epidermis and / or the flower and 3' downstream a terminator sequence as an additional genetic control sequence, and, if appropriate, further customary regulatory elements, in each case functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed transgenically.
  • Genetic control sequences also include further promoters, promoter elements or minimal promoters that can modify the expression-controlling properties.
  • tissue-specific expression can also depend on certain stress factors.
  • Corresponding elements are, for example, for water stress, abscisic acid (Lam E and Chua NH, J Biol Chem 1991; 266 (26): 17131 -17135) and heat stress (Schöffl F et al., Molecular & General Genetics 217 (2-3 ): 246-53, 1989).
  • promoters can be functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed, which enable expression in other plant tissues or in other organisms, such as E. coli bacteria.
  • all promoters described above can be used as plant promoters.
  • a promoter for example the promoter with specificity for the embryonic epidermis and / or the flower
  • a promoter for example the promoter with specificity for the embryonic epidermis and / or the flower
  • a promoter for example the promoter with specificity for the embryonic epidermis and / or the flower
  • a promoter for example the promoter with specificity for the embryonic epidermis and / or the flower
  • the same nucleic acid sequence is translated by another promoter with another Specificity in another tissue is transcribed to anti-sense RNA and the corresponding protein is downregulated.
  • This can be achieved by means of an expression cassette according to the invention, in that one promoter is positioned in front of the nucleic acid sequence to be expressed transgenically and the other
  • Genetic control sequences also include the 5'-untranslated region, introns or the non-coding 3 'region of genes, preferably the mybll gene from Arabidopsis thaliana. It has been shown that these can play a significant role in regulating gene expression. It has been shown that 5 'untranslated sequences can increase the transient expression of heterologous genes. They can also promote tissue specificity (Rouster J et al., Plant J. 1998, 15: 435-440.). Conversely, the 5 'untranslated region of the opaque-2 gene suppresses expression. Deletion of the corresponding region leads to an increase in gene activity (Lohmer S et al., Plant Cell 1993, 5: 65-73). The nucleic acid sequence given under SEQ ID N0: 1 contains the section of the mybll gene which represents the promoter and the 5 'untranslated region up to the ATG start codon of the MYBll transcription factor.
  • the expression cassette can advantageously one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the
  • preferred but not restricted sequences are further targeting sequences different from the transit peptide, to ensure subcellular localization in the apoplast, in the vacuole, in plastids, in the mitochondrium, in the endoplasmic reticulum (ER), in the cell nucleus, in oil corpuscles or other compartments; and translation enhancers such as the 5 'leader sequence cn ö tQ ⁇ J 0 tr CD H ö ⁇ J z WJ t ⁇ TJ rn 3 tr «tQ N ö ⁇ ⁇ td ⁇ rt I ⁇ rt H s: ⁇ > _ ⁇ .
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  • Selection markers which are resistant to a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456), antibiotics or biocides, preferably herbicides, such as, for example, kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin, or phosphinotricin etc. to lend.
  • a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456)
  • antibiotics or biocides preferably herbicides, such as, for example, kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin, or phosphinotricin etc. to lend.
  • reporter genes which code for easily quantifiable proteins and which, by means of their own color or enzyme activity, ensure an assessment of the transformation efficiency or of the expression site or time.
  • Reporter proteins Schoenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (l): 29-44) such as "green fluorescence protein” (GFP) (Chui WL et al ., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques.
  • Replication origins which are an increase in the expression cassettes or vectors according to the invention in, for example
  • E.coli examples include ORI (origin of DNA replication), pBR322 ori or P15A ori (Sa-brook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) ,
  • a selectable marker which gives the successfully recombined cells resistance to a biocide (for example a herbicide), a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglu cose-6-phosphate (WO 98/45456) or an antibiotic.
  • a biocide for example a herbicide
  • a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglu cose-6-phosphate (WO 98/45456) or an antibiotic.
  • the selection marker permits the selection of the transformed cells from untransformed ones (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).
  • Functional equivalents initially mean DNA sequences which hybridize under standard conditions with the nucleic acid sequence described by SEQ ID NO: 1 or the nucleic acid sequence complementary to it and which have essentially the same promoter activities as the nucleic acid sequence described by SEQ ID N0: 1.
  • Standard hybridization conditions are to be understood broadly and mean stringent as well as less stringent hybridization conditions. Such hybridization conditions are described, inter alia, by Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al. , in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57) or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. described.
  • the conditions during the washing step can be selected from the range of conditions limited by those with low stringency (with approximately 2X SSC at 50 ° C.) and those with high stringency (with approximately 0.2X SSC at 50 ° C., preferably at 65 ° C) (20X SSC: 0.3M sodium citrate, 3MNaCl, pH 7.0).
  • the temperature during the washing step can be raised from low stringent conditions at room temperature, about 22 ° C, to more stringent conditions at about 65 ° C. Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied simultaneously, one of the two parameters can also be kept constant and only the other can be varied. Denaturing agents such as for example amide or SDS can also be used during the hybridization. In the presence of 50% formamide, the hybridization is preferably carried out at 42 ° C.
  • 6X SSC at 68 ° C, 100 ⁇ g / ml denatured fish sperm DNA, or (iv) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 ⁇ g / ml denatured, fragmented salmon sperm DNA at 68 ° C, or
  • nucleic acids in the expression cassettes or from vectors derived therefrom which have the double-stranded DNA sequence described by SEQ ID NO: 1 or fragments thereof, such as, for example, the double-stranded DNA sequences described by SEQ ID NO: 2 and 15 to 19 DNA sequences hybridize under the conditions defined above and have essentially the same promoter activity as.
  • Sequence fragments derived from SEQ ID NO: 1 are particularly preferred, which comprise base pairs 1700 to 2700 of the sequence with SEQ ID NO: 1.
  • a functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural or artificial mutations of the mybll promoter described under SEQ ID NO: 1 and its homologs from other plant genera and plant species, which continue to initiate expression in the plant embryonic epidermis and / or flowers can. Mutations include substitutions, additions, deletions, inversions or insertions of one or more nucleotide residues.
  • the present invention also encompasses those nucleotide sequences which are obtained by modification of the mybll promoter nucleotide sequence in accordance with SEQ ID NO: 1.
  • the aim of such a modification can be, for example, the further limitation of the sequence contained therein to certain regulatory elements or, for example, the insertion of further restriction enzyme interfaces, the removal of superfluous DNA or the addition of further sequences, for example further regulatory sequences.
  • the sequence can also be limited to specific, essential regulatory regions with the aid of a search routine for searching promoter elements. Certain promoter elements are often present in abundance in the regions relevant to promoter activity. This analysis can be carried out, for example, using computer programs such as the PLACE program ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements") (K.Higo et al., (1999) Nuclear Acids Research 27: 1, 297-300).
  • insertions, deletions or substitutions e.g. Transitions and transversions
  • techniques known per se such as in vitro mutagenesis, primer repair, restriction or ligation, can be used.
  • PCR polymerase chain reaction
  • GAP World Health Organization
  • Gap Weight 12 Length Weight: 4
  • Average Match 2,912 Average Mismatch: -2, 003
  • Functional equivalents derived from one of the promoter sequences used in the expression cassettes or vectors according to the invention, for example by substitution, insertion or deletion of nucleotides, have a homology of at least 20%, preferably 40%, preferably at least 60%, particularly preferably at least 80%, very particularly preferably at least 90%, and are distinguished by essentially the same transcription activity compared to the mybll promoter sequence according to SEQ-ID NO: 1.
  • promoter sequences used in the expression cassettes or expression vectors according to the invention can be found, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, for example from Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthinum, by comparing homology easy to find from databases.
  • Functional equivalents also include those promoter variants whose function is weakened or enhanced compared to the starting promoter.
  • Suitable functionally equivalent expression cassettes are sequences which express a fusion protein under the control of the promoter sequence, one component of the fusion protein the nucleic acid sequence to be expressed, the other a regulatory protein sequence, e.g. is a signal or transit peptide that directs the gene product to the desired site of action.
  • the specificity of the expression constructs and vectors according to the invention for the plant, embryonic epidermis and the flower is particularly advantageous.
  • the plant epidermis represents both the primary barrier and the essential contact surface of the plant organism with its environment. It has an important function in protecting the plant against biotic and abiotic stress factors. Biotic stress factors can be pathogens, bite from animals etc., abiotic stress can be pathogens, bite from animals etc., abiotic stress can be pathogens, bite from animals etc.
  • the epidermis also has a function in attracting beneficial insects through pigment storage or the synthesis of volatile chemicals, it provides mechanical stability and prevents water loss.
  • the epidermis also has an essential role in the absorption of water, gases and nutrients in the semen embryo.
  • the plant's natural defense mechanisms for example against pathogens, are often inadequate.
  • the introduction of foreign genes from plants, animals or microbial sources can strengthen the immune system. Examples are protection against insect damage in tobacco by expression of the Bacillus thuringiensis endotoxin under the control of the 35 S CaMV promoter (Vaeck et al., Nature 1987, 328, 33-37) or protection of the tobacco against fungal attack by expression of a chitinase the bean under the control of the CaMV promoter (Broglie et al., Science 1991, 254, 1194-1197).
  • concentrated expression of the corresponding nucleic acid sequence to be expressed transgenically is particularly advantageous in the outermost envelope of the plant, the epidermis, or the flower.
  • Constituent expression in the entire plant can question the effect, for example by diluting it, or impair the growth of the plant or the quality of the plant product.
  • constitutive expression can lead to an increased shutdown of the transgene ("gene silencing").
  • promoters with specificity for the embryonic epidermis and / or the blossom are advantageous.
  • Nucleic acids which are particularly preferred are those for the chalcone synthase from Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No .: M20308), the 6-4 photolyase from Arabidopsis
  • Nucleic acids which code for the cationic amino acid transporter from Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No .: X92657) or for the monosaccharide transporter from Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No .: AJ002399) or functional equivalents of the same.
  • neutraceuticals such as polyunsaturated fatty acids such as arachidonic acid or EP (eicosapentaenoic acid) or DHA (docosahexaenoic acid) by expression of fatty acid elongases and / or desaturases or production of proteins with improved nutritional value such as a high proportion of essential amino acids (eg the methionine-rich 2S albumingens of the Brazil nut).
  • Preferred nucleic acids are those for the methionine-rich 2S albumin from Bertholletia excelsa (GenBank Acc.
  • Modification of the fiber content in seed-based foods by, for example, expression of antisense transcripts of the caffeine acid-O-methyltransferase or the cinnamoyl alcohol-containing hydrogenase gene.
  • Functional equivalents here - analogous to the definition of the functional equivalents of the promoter with specificity for the embryonic epidermis and / or the flower - mean all the sequences which have essentially the same function, i.e. are capable of the function (for example a substrate conversion or a signal transduction) as well as the protein mentioned by way of example.
  • the functional equivalent may well differ in other features. For example, it may have a higher or lower activity, or it may have other functionalities.
  • Functional equivalents also means sequences which code for fusion proteins consisting of one of the preferred proteins and other proteins, for example another preferred protein or else a signal peptide sequence.
  • the person skilled in the art is also aware that he does not have to express the genes described above directly using the nucleic acid sequences coding for these genes or to repress them, for example, by antisense.
  • he can also use artificial transcription factors of the zinc finger protein type (Beerli RR et al., Proc Natl Acad Sei USA 2000; 97 (4): 1495-500). These factors are reflected in the regulatory areas of endogenous genes to be expressed or repressed and, depending on the design of the factor, cause expression or repression of the endogenous gene.
  • Another object of the invention relates to transgenic organisms, transformed with at least one expression cassette according to the invention or a vector according to the invention, as well as cells, cell cultures, tissues, parts - such as leaves, roots etc. in plant organisms - or well reproduced from such organisms.
  • Organism starting or host organisms are understood to mean prokaryotic or eukaryotic organisms, such as, for example, microorganisms or plant organisms.
  • Preferred microorganisms are bacteria, yeast, algae or fungi.
  • Preferred bacteria are bacteria of the genus Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes or cyanobacteria, for example of the genus Synechocystis.
  • microorganisms which are capable of infecting plants and thus of transmitting the constructs according to the invention.
  • Preferred microorganisms are those from the genus Agrobacterium and in particular from the species Agrobacterium tumefaciens.
  • Preferred yeasts are Candida, Saccharomyces, Hansenula or Pichia.
  • Preferred mushrooms are Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria or others in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) on page 15, Table 6 described mushrooms.
  • Plants are primarily host or parent organisms preferred as transgenic organisms. Included in the scope of the invention are all genera and species of higher and lower plants in the plant kingdom. Also included are the mature plants, seeds, sprouts and seedlings, as well as parts, propagation material and cultures derived therefrom, for example cell cultures. Mature plants mean plants at any stage of development beyond the seedling. Seedling means a young, immature plant at an early stage of development.
  • Liverwort Liverwort and musci (mosses); Pteridophytes such as ferns, horsetail and lycopods; Gymnosperms such as conifers, cycads, ginkgo and gnetals, - algae such as Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae
  • Plants within the scope of the invention include, by way of example and not limitation, the families of the Rosaceae such as rose, Ericaceae such as rhododendrons and azaleas, Euphorbiaceae such as poinsettias and croton, Caryophyllaceae such as carnations, Solanaceae such as petunias, Gesneriaceae such as the African violet and Balsamineaaceae such as Balsamineaaceae and Balsamineaaceae , Iridaceae like gladiolus, iris, freesia and crocus, Compositae like marigold, Geraniaceae like geraniums, Liliaceae like the dragon tree, Moraceae like Ficus, Araceae like Philodendron and others.
  • Rosaceae such as rose, Ericaceae such as rhododendrons and azaleas
  • Euphorbiaceae such as poinsettias
  • leguminosae such as pea, alfalfa and soy are to be mentioned as examples but not restrictive for flowering plants; Gramineae such as rice, corn, wheat; Solanaceae such as tobacco and others; the Umbelliferae family, especially the genus Daucus (especially the species carota (carrot)) and Apium (especially the species graveolens dulce (selaria)) and others; the family of Solanacea, especially the genus Lycopersicon, especially the species esculentum (tomato) and the genus Solanum, especially the species tuberosum (potato) and melongena (eggplant) and others; and the genus Capsicum, especially the species annum (pepper) and others, - the family of the Leguminosae, especially the genus Glycine, especially the species max (soybean) and others; and the Cruciferae family, especially the Brassica genus, especially the campestris
  • the transgenic plants according to the invention are selected in particular from monocotyledonous crop plants, such as, for example, cereals such as wheat, barley, millet, rye, triticale, maize, rice or oats, and sugar cane.
  • the transgenic plants according to the invention are selected in particular from dicotyledonous crop plants, such as, for example Brassicacae such as rapeseed, cress, arabidopsis, cabbage or canola, leguminosae such as soy, alfalfa, pea, alfalfa, bean family or peanut
  • Solanaceae such as potato, tobacco, tomato, eggplant or paprika
  • Asteraceae such as sunflower, tagetes, lettuce or calendula
  • Cucurbitaceae such as melon, pumpkin or zucchini, as well as linen, cotton, hemp, flax, red pepper, carrot, carrot, sugar beet and the various Tree, nut and wine species.
  • oilseed rape for example rape
  • Types of nuts soy, sunflower, pumpkin and peanut.
  • Plant organisms in the sense of the invention are further photosynthetically active capable organisms, such as algae or cyanobacteria, and mosses.
  • Preferred algae are green algae, such as algae of the genus Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox or Dunaliella.
  • the production of a transformed organism or cell requires that the corresponding DNA be introduced into the corresponding host cell.
  • a large number of methods are available for this process, which is referred to as transformation (see also Keown et al. 1990 Methods in Enzymology 185: 527-537).
  • the DNA can be introduced directly by microinjection or by bombardment with DNA-coated microparticles.
  • the cell can also be chemically permeabilized, for example with polyethylene glycol, so that the DNA can get into the cell by diffusion.
  • the DNA can also be obtained by protoplast fusion with other DNA-containing units such as minicells, cells, lysosomes or liposomes.
  • Electroporation is another suitable method for introducing DNA, in which the cells are reversibly permeabilized by an electrical impulse.
  • Suitable methods are, above all, the protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene gun, the so-called particle bombardment method, electroporation, incubation of dry embryos in DNA-containing solution and microinjection.
  • a transformation can also be carried out by bacterial infection using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes. These strains contain a plasmid (Ti or Ri plasmid) which is transferred to the plant after agrobaterium infection. Part of this plasmid, called T-DNA (transferred DNA), is integrated into the genome of the plant cell.
  • Ti or Ri plasmid plasmid
  • T-DNA transferred DNA
  • the Agrobacterium -mediated transformation is best suited for dicotyledonous, diploid plant cells, whereas the direct transformation techniques are suitable for every cell type.
  • Vectors can be, for example, plasmids, cosmids, phages, viruses or even agrobacteria.
  • the expression cassette is introduced by means of plasmid vectors.
  • Preferred vectors are those which enable stable integration of the expression cassette into the host genome.
  • Transformation techniques are described for various monocot and dicotyledonous plant organisms.
  • Various possible plasmid vectors are also available for the introduction of foreign genes into plants, which generally contain an origin of replication for reproduction in E. coli and a marker gene for selection of transformed bacteria. Examples are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184 etc.
  • Those expressing such a marker gene are able to survive in the presence of concentrations of an appropriate antibiotic or herbicide that kill an untransformed wild type.
  • Examples are the bar gene that confers resistance to the herbicide phosphinotricin (Rathore KS et al., Plant Mol Biol.
  • nptll gene which confers resistance to kanamycin
  • hpt gene which confers resistance to hygro ycin
  • EPSP gene which confers resistance to the herbicide glyphosate.
  • a Ti or Ri plasmid is to be used for transformation, at least the right boundary, but mostly the right and left boundary of the Ti or Ri plasmid T-DNA as the flanking region, is connected to the expression cassette to be inserted.
  • Binary vectors are preferably used.
  • ren can replicate in both E.coli and Agrobacterium. They usually contain a selection marker gene and a linker or polylinker flanked by the right and left T-DNA restriction sequences. They can be transformed directly into Agrobacterium (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163 (1978),
  • the selection marker gene allows selection of transformed agrobacteria and is, for example, the nptll gene which confers resistance to kanamycin.
  • the Agrobacterium which acts as the host organism in this case, should already contain a plasmid with the vir region. This is for the transfer
  • T-DNA 40 g of T-DNA required on the plant cell.
  • An Agrobacterium transformed in this way can be used to transform plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells 45 has been intensively investigated and described (EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Be., 4: 1-46 and An et al. , EMBO J. 4 (1985) 277-287).
  • Various binary vectors are known and some are commercially available, for example pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
  • plant explants are co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes Starting from infected plant material (e.g. leaf, root or stem parts, but also protoplasts or suspensions of plant cells), whole plants can be regenerated using a suitable medium, which can contain, for example, antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the plants obtained can then be screened for the presence of the introduced DNA, here the expression cassette according to the invention.
  • the corresponding genotype is generally stable and the corresponding insertion is also found in the subsequent generations.
  • the integrated expression cassette contains a selection marker which gives the transformed plant resistance to a biocide (for example a herbicide) or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinotricin etc.
  • the selection marker allows the selection of transformed cells from untransformed (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). The plants obtained can be grown and crossed in a conventional manner. Two or more generations should be cultivated to ensure that genomic integration is stable and inheritable.
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).
  • a whole plant can be obtained using methods known to those skilled in the art. This is based on the example of callus cultures. The formation of shoots and roots can be induced in a known manner from these still undifferentiated cell masses. The sprouts obtained can be planted out and grown. The effectiveness of the expression of the transgenically expressed nucleic acids can be determined, for example, in vitro by sprout meristem propagation using one of the selection methods described above.
  • transgenic organisms described above cell cultures, parts - such as roots, leaves, etc. in transgenic plant organisms - and transgenic propagation material such as seeds or fruits.
  • Genetically modified plants according to the invention which can be consumed by humans and animals can also be used as food or feed, for example directly or after preparation known per se.
  • Another object of the invention relates to the use of the transgenic organisms according to the invention described above and the cells, cell cultures, parts derived therefrom - such as roots, leaves etc. in transgenic plant organisms - and transgenic propagation material such as seeds or fruits for the production of food or feed, pharmaceuticals or fine chemicals.
  • This process is widely applicable to fine chemicals such as enzymes, vitamins, amino acids, sugars, fatty acids, natural and synthetic flavors, aromas and colors.
  • the production of tocopherols and tocotrienols and carotenoids is particularly preferred.
  • the transformed host organisms and the isolation from the host organisms or from the growth medium are cultivated using methods known to those skilled in the art.
  • SEQ ID NO: 1 promoter and 5 'untranslated region of the Arabidopsis thaliana mybll gene.
  • SEQ ID NO: 2 2035bp fragment of promoter and 5 'untranslated region of the Arabidopsis thaliana mybll gene.
  • SEQ ID NO: 3 oligonucleotide primers, oligo (dT) primers
  • SEQ ID NO: 7 oligonucleotide primers
  • SEQ ID NO: 11 oligonucleotide primer, myBLI forward primer
  • SEQ ID NO: 12 oligonucleotide primers, myBLI reverse primer
  • SEQ ID NO: 14 oligonucleotide primers
  • SEQ ID NO: 15 888bp fragment of promoter and 5 'untranslated region of the Arabidopsis thaliana mybll gene.
  • Fig. 1 (I and II) show a section through a seed and thus through the plant embryo (Arabidopsis thaliana). "in” denotes the integument, "h” the hypocotyl, “c” the cotyledon and “r” the root.
  • Fig.l (I) shows the section without clarifying the expression region.
  • Fig.l (II) illustrates the expression region of the mybll promoter, which runs along the white, dashed line (marked by the white arrow). This region corresponds to the embryonic epidermis.
  • Fig. 3 (I and II) show a section through the ovary systems of Arabidopsis thaliana. "al” denotes the pollen sac
  • Fig. 3 (I) shows the section without clarifying the expression region.
  • Fig. 3 (II) illustrates the expression region of the mybll promoter, which can be found in the white hatched regions (marked by white arrows). These regions correspond to the egg facilities.
  • Fig. 4 (I and II) show a section through the plant flowers (Arabidopsis thaliana). "im” denotes the flower meristem (tunica). The numbers 2 and 6 describe flowers in the flower development stage 2 or 6 (Arabidopsis Atlas of Morphology, Bowman J ed ' ., Springer Verlag, New York, USA, 1995).
  • Fig. 4 (II) shows the section without clarifying the expression region.
  • Fig. 4 (I) illustrates the express sion region of the mybll promoter, which can be found in the white hatched regions. These regions correspond to the flower meristem and the flower tip (development stage 2) or the stamen plant and the petal primordia (development stage 6).
  • FIG. 6 The result of an RT-PCR is shown using different tissues to determine the expression pattern of the mybll promoter. Expression can be demonstrated in the seedling (day 4), the flower bud, flowering and withering flower, and the green pods.
  • Fig. 7 Schematic representation of the vectors pCR-TOPO-mybll (I), pGPTV-ybll:: GUS (II), pGPTVl-mybll :: GUS (III) and pGPTV2-mybll:: GUS (IV).
  • the direction of the arrow indicates the orientation of the promoter, with the arrow pointing in the direction of the start codon.
  • the abbreviations have the following meaning: mybll: promoter or promoter fragment of the mybll promoter NOS-T: terminator sequence of nopaline synthase (NOS)
  • NOS-T terminator sequence of nopaline synthase (NOS)
  • GUS reporter gene (bacterial ⁇ -glucuronidase)
  • Fig. 8 Schematic representation of the vectors pGPTV3-mybll :: GUS (V), pGPTV4-mybll:: GUS (VI), pGPTV5-mybll :: GUS
  • Fig. 9 Schematic representation of the vectors pBSK-mybll (IX) and pBM-ybll (X).
  • the direction of the arrow indicates the orientation of the promoter, with the arrow pointing in the direction of the start codon.
  • the abbreviations have the following meaning: mybll: promoter or promoter fragment of the mybll promoter Examples
  • oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the cloning steps carried out in the context of the present invention such as e.g. Restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria, multiplication of phages and sequence analysis of recombinant DNA are carried out as in Sambrook et al , (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6.
  • the sequencing of recombinant DNA molecules takes place with a laser fluorescence DNA sequencer from ABI according to the method of Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).
  • Example 1 Plant growth conditions for tissue-specific RT-PCR analysis
  • the seedlings are grown in a 16-hour light / 8-hour dark cycle (Philips 58W / 33 white light lamps) at 22 ° C and harvested 4 or 7 days after the start of the germination phase.
  • Roots 100 seeds for the extraction of Roots sterilized as described above, incubated for 4 days at 4 ° C and then see in 250ml bottles with MS medium (Sigma M5519) with the addition of a further 3% sucrose and 0.5 g / 1 MES (Sigma M8652), pH 5.7.
  • the seedlings are grown in a 16-hour light / 8-hour dark cycle (Philips 58W / 33 white light lamps) at 22 ° C, 120 rpm and harvested after 3 weeks.
  • the seeds are sown on uniform soil (type VM, Manna-Italia, Via S.
  • RNA is isolated from the organs of the plant described in Example 1 at various times of development as described (Prescott A, Martin C Plant Mol Biol Rep 1987, - 4: 219-224).
  • the reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) is used to detect the Atmybll gene transcript. All RNA samples are treated with DNasel (15 units, Boehringer, Mannheim) before the cDNA synthesis.
  • the first strand cDNA synthesis is carried out starting from 6 ⁇ g total RNA with an oligo (dT) primer and RT Superscript TM II enzyme (300 U ⁇ its) according to the manufacturer in a total volume of 20 ⁇ l (Life Technologies, Gaithersburg, MD).
  • 150 ng oligo- (dT.) are added to the RNA in a final volume of 12 ⁇ l.
  • the mixture is heated at 70 ° C. for 10 minutes and then immediately cooled on ice.
  • 4 ⁇ l of the 5X first strand buffer, 2 ⁇ l of 0. IM DTT, 1 ⁇ l of 10 mM dNTP mix (in each case 10 mM dATP, dCTP, dGTP and dTTP) and RNase inhibitor (5 units, Bschreibinger Mannheim) are added.
  • the mixture is heated to 42 ° C. for 2 minutes, RT 'Superscript TM II enzyme (300 units, Life Technologies) is added and incubated at 42 ° C. for 50 minutes.
  • the first strand cDNA is used as a template for the PCR.
  • the following primers are used for the PCR:
  • Forward primer Z17F2 5 '-GCCAATACCGTCGAGAATGCGCC-3' (SEQ ID NO: 8)
  • Reverse primer Z17R3 5 '-TCGTCAATATCCAACGGTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 9)
  • the PCR reaction approach is composed as follows:
  • each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP 0.5 ⁇ M of each of the oligonucleotide primers Z127F2 and Z17F3 (SEQ ID No.: 8 and 9) 2.5 units AmpliTaq (Perkin Elmer) dest. Water up to a final volume of 50 ⁇ l.
  • PCR products are separated using 2% w / v agarose gel electrophoresis, blotted onto a Hybond N + nylon membrane (Amersham, England) and hybridized with fluorescein-labeled probes.
  • the production of the probes and the detection reaction is carried out as specified in the manufacturer's protocol of the Amersham company.
  • the standardization of the method is verified using primers specifically for the Arabidopsis ACT1 gene which codes for actin (An YQ et al. Plant Cell 1996, 8: 15-30). The following primers are used for the mRNA detection of At-MYBll:
  • Forward primer Z17F2 5 '-GCCAATACCGTCGAGAATGCGCC-3' (SEQ ID NO: 8)
  • Reverse primer Z17R3 5 '-TCGTCAATATCCAACGGTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 9)
  • the template for the in-si tu hybridization sample is prepared as described in the instructions for the Lig'nScribe TM PCR Promoter Addition Kit (Ambion, USA). For this purpose, 20 ng of the PCR fragment, which is obtained with the primers Z17F2 and Z17R3, starting from a partial cDNA clone of the AtMYBll gene (EMBL AF062863; Kranz et al., 1998 (see above), against a reading direction behind a T7 promoter adapter cloned (Ambion, USA)
  • Ligation reaction contains 1 ⁇ l of the 10X ligation buffer, 1 ⁇ l of the promoter adapter, 1 ⁇ l of T4 DNA ligase and distilled water in a total volume of 10 ⁇ l.
  • the ligation reaction is incubated for 15 min at room temperature.
  • the template for the antisense strand of the AtMYBll probe is carried out by means of PCR using part of the ligation reaction and the primers Z17F2 (SEQ ID NO: 8) and Ambion PCR Primer 1. For this, 2 ⁇ l of the ligation reaction and the primers Z17F2 and the PCR adapter primer 1
  • PCR adapter primer 1 5 '-GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGG-3' (SEQ ID NO: 10)
  • the primers Z17R3 and PCR adapter primer 1 are used to produce the template for the sense strand of the AtMYBll probe.
  • the PCR conditions for producing the templates for the antisense and sense strands of the AtMYBll probes are identical and are carried out under the conditions described in Example 2. In deviation from this, 35 cycles are carried out and only a concentration of 0.25 mM of the primers used is used.
  • Sense and antisense DIG-11-UTP labeled RNA probes are synthesized using T7 RNA polymerase with reagents from Röche Diagnostics: The following components are combined in one RNase-free Eppendorf tube, which is kept on ice, mixed in the order shown. The final concentration in a reaction volume of 20 ⁇ l is given.
  • lx labeling mixture (as lOx Mix with 10MM ATP, 10MM CTP, 10MM GTP; 6.5mM UTP, 3.5mM DIG-UTP in Tris-HCl, pH 7.5), lx transcription buffer (as lOx buffer with 400mM Tris-HCl, pH 8.0, 60mM MgCl 2 / lOOmM dithioerythritol, 20mM spermidine, lOOmM NaCl, 1 unit / ml RNase inhibitor) and 40 5 units T7 RNA polymerase.
  • the mixture is shaken briefly and centrifuged for a few seconds.
  • the mixture is then incubated at 37 2 C for at least 2 hours.
  • 20 units of DNase are added and incubated at 37 S C for 15 min. 10 2 ⁇ l of the supplied EDTA solution are added to terminate the reaction.
  • the supports are then washed for 5 min in 100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2 and for 48 hours in a solution of 0.34 mg / ml nitro blue tetrazolium salt and 0.175 mg / ml 5-bromo Incubate -4-chloro-3-indolylphosphate toluidinium salt in 100mM Tris-HCl (pH 9.5), 100mM NaCl and 50mM MgCl 2 .
  • the color reaction is stopped with 10 mM Tris-HCl (pH 8), ImM EDTA and the sections are washed with gentle shaking in 95% ethanol, then with an ethanol dilution series and finally with sterile water before they are fixed with Euparal (BDH).
  • BDH Euparal
  • genomic 'DNA from Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia) is extracted as described (Galbiati M et al Funct Integr Genomics 2000, 1:.. 25-34).
  • the isolated DNA is used as template DNA in a PCR using the following primers:
  • the PCR product is cloned into the vector pCR4-T0P0 (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions, ie the PCR product obtained is inserted into a vector with T overhangs using its A overhangs and a topoisomerase.
  • the construct obtained is 5 pCR4-T0P0-mybll (Fig. 7, I).
  • a fine mapping of the mybll promoter i.e. The 15 nucleic acid sections relevant to its specificity are narrowed by producing different reporter gene expression vectors which contain the entire promoter region on the one hand and various fragments thereof on the other hand.
  • the entire promoter region or fragments thereof are cloned into the pGPTV-GUS-Kan 0 vector (Becker D et al., 1992 Plant Mol Biol 20: 1195-1197).
  • fragments are used for this, which are obtained by using restriction enzymes for the internal restriction sites in the full-length promoter sequence.
  • PCR fragments are used which are provided with interfaces introduced by primers.
  • pCR4-T0P0-mybll is digested with EcoRI and the 5 ca.2050 base pairs fragment isolated from a 1% agarose gel is subcloned into pBluescript SK (Stratagene).
  • the insert is obtained from the resulting vector pBSK-ybll (FIG. 9, construct IX) by digestion with HindII and Smal, isolated over a 1% agarose gel and cloned into pGPTV-GUS-Kan.
  • the construct obtained bears the designation 0 pGPTVl-mybll :: GUS (FIG. 7, construct III).
  • pBSK-mybll is digested with EcoRV and Ncol. Overhanging ends are digested with T4 DNA polymerase and the plasmid is religated with blunt ends (as described in Sambrook et al., 5, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) to pBM-ybll ( Fig. 9, construct X).
  • the Ver- The shortened insert is obtained from the vector pBM-mybll by digestion with Hinllll and Smal, isolated using a 1% agarose gel and cloned into pGPTV-GUS-Kan. The construct obtained is called pGPTV2-mybll :: GUS (Fig. 7, construct IV).
  • pCR4-T0P0-mybll is used as a template for a PCR.
  • the Hindlll and Smal interfaces are introduced using the following primers
  • Reverse primer 5 '-CCCGGGAAAATCACTCACTTCACT-3' (SEQ ID NO: 12).
  • the fragment is isolated from a 1.5% agarose gel and again cloned in pGPTV-GUS-Kan.
  • the construct obtained is called pGPTV3-mybll :: GUS (Fig. 8, construct V).
  • pCR4-T0P0-mybll is used as a template for a PCR.
  • the Hindlll and Sall interfaces are introduced using the following primers
  • pCR4-T0P0-mybll is used as a template for a PCR.
  • the Hindlll and Xbal interfaces are introduced using the following primers
  • the fragment is isolated from a 1.5% agarose gel and again cloned in pGPTV-GUS-Kan.
  • the construct obtained is called pGPTV5-mybll:: GUS-Kan (Fig. 8, construct VII).
  • the fragment is isolated from a 1.5% agarose gel and again cloned in pGPTV-GUS-Kan.
  • the construct obtained is called pGPTV6-mybll:: GUS-Kan (Fig. 8, construct VIII).
  • i-grrojbacterium tumefaciens (strain C58C1 pGV2260) is transformed with various mybll promoter-GUS vector constructs.
  • the agrobacterial strains are then used to produce transgenic plants.
  • a single transformed agrobacterium colony in a 4 ml culture (medium: YEB medium with 50 ⁇ g / ml
  • Kanamycin and 25 ⁇ g / ml rifampicin incubated overnight at 28 ° C.
  • a 400 ml culture is then inoculated with this culture in the same medium, incubated overnight (28 ° C., 220 rpm) and centrifuged off (GSA rotor, 8,000 rpm, 20 min).
  • the pellet is resuspended in infiltration medium (.1 / 2 MS medium; 0.5 g / l MES, pH 5.8; 50 g / 1 sucrose).
  • the suspension is placed in a plant box (Duchefa) and 100 ml of SILVET L-77 (heptamethyltrisiloxane modified with polyalkylene oxide; Osi Specialties Inc., Cat.
  • transgenic Arabidopsis plants can be obtained by root transformation.
  • White root sprouts from plants up to 8 weeks old are used.
  • plants are placed under sterile conditions in 1 MS medium (1% sucrose; 100mg / l inositol; l, 0mg / l thiamine; 0.5 mg / 1 pyridoxine; 0.5 mg / 1 - nicotinic acid; 0.5 g MES, pH 5, 7; 0.8% agar) are used.
  • Roots are grown on kailus-inducing medium for 3 days (Ix Gambourg's B5 medium; 2% glucose; 0.5 g / 1
  • the small, green sprouts are placed on germination medium (1 MS medium; 1% sucrose; 100 mg / 1 inositol; 1.0 mg / l thiamine; 0.5 mg / 1 pyridoxine; 0.5 mg / 1 nicotinic acid; 0.5 g MES, pH 5, 7; 0.8% agar) and regenerated into plants.
  • MS medium 1% sucrose; 100 mg / 1 inositol; 1.0 mg / l thiamine; 0.5 mg / 1 pyridoxine; 0.5 mg / 1 nicotinic acid; 0.5 g MES, pH 5, 7; 0.8% agar
  • the bacterial ⁇ -glucuronidase may be mentioned as an example (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907).
  • the ß-glucuroni-. this activity can be determined in-planta using a chromogenic substrate such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid as part of an activity staining (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 387-405).
  • a chromogenic substrate such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid as part of an activity staining (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 387-405).
  • the plant tissue is cut, embedded, stained and analyzed as described (e.g. Bäumlein H et al., 1991 Mol Gen Genet 225: 121-128).
  • MUG methylumbelliferyl glucuronide
  • MU methylumbelliferone
  • glucuronic acid glucuronic acid

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Abstract

Expressionskassette zur transgenen Expression von Nukleinsäuren in der embryonalen Epidermis und/oder der Blüte enthaltend den Promotor des My11 Gens aus Arabidopsis thaliane oder funktionelle Äquivalente oder äquivalente Fragmente desselben, die im wesentlichen die gleichen Promotoraktivität besitzen, wobei der Promotor funktionell mit einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft ist. Die Erfindung betrifft ferner von diesen Expressionskassette abgeleitete Vektoren. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassette oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

Description

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die Expression eines bestimmten Gens in einer transgenen Pflanze zu steuern und so bestimmte Wesensmerkmals der Pflanze zu erzielen. Verschiedene pflanzliche Promotoren sind bekannt.
Bekannt sind zum Beispiel konstitutive Promotoren wie der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor oder der Promotor des 35S-Transkriptes des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) (Odell et al . , Nature 313 (1985 ), 810-812) , der OCS (Octo- pin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al . , Plant Mol Biol 1995, 29:637-646), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991) . Nachteilig bei diesen Promotoren ist, dass sie in fast allen Geweben der Pflanze konstitutiv aktiv sind. Eine gezielte Expression von Genen in be- stimmten Pflanzenteilen oder zu bestimmten Entwicklungszeitpunkten ist mit diesen Promotoren nicht möglich.
Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen sind beschrieben. Die Strin- genz der Spezifität, als auch die Expressionsaktivität dieser Promotoren ist sehr unterschiedlich. Zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten, wie der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900) , der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1, 5-bisphosp- hatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445 - 245).
Weitere Promotoren sind beispielsweise Promotoren mit Spezifität für Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel, der Promotor der Stärke Synthase (GBSS1) oder der Sporamin Promotor, fruchtspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtspezifische Promotor aus Tomate (EP-A 409625), fruchtreifungspezifische Promotoren, wie bei- spielsweise der fruchtreifungspezifische Promotor aus Tomate
(WO 94/21794) , blütenspezifische Promotoren, wie beispielsweise der Phytoen-Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).
Eine Variation der Aktivität eines Promotors abhängig vom Entwicklungsstadium der Pflanze ist unter anderem bei Baerson et al . beschrieben (Baerson SR, Lamppa GK. Plant Mol Biol. 1993; 22(2) :255-67) .
Bekannt sind ferner Promotoren, die eine Expression in Samen und pflanzlichen Embryonen steuern. So wurden beispielsweise die Promotoren von Genen identifiziert, die für Speicherproteine ver- schiedener Dicotyledonen kodieren. Samenspezifische Promotoren sind zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200, Bustos MM et al . , Plant Cell. 1989 ; 1 (9 ): 839-53 ) , des 2S Albumingens (Joseffson LG et al . , J Biol Chem 1987, 262:12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al . , Mol Gen Genet . 1989;
215 (2) : 326-331) , des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al., Molecular & General Genetics 1991, 225 (3) : 459-67) des Napin Gens (Stalberg K, et al . , L. Planta 1996, 199:515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der LeB4-Promotor (Bäumlein H et al . , Mol Gen Genet 1991, 225: 121-128). Diese steuern eine samenspezifische Expression von Speicherproteinen.
Die Höhe einer transgenen Expression von heterologen Genen unter Kontrolle dieser Promotoren ist jedoch oft stark von der Art der Wirtspflanze abhängig. Ferner wurde festgestellt, dass die
Expression selten zelltypspezifisch ist. Unterschiede im Expressionsmuster und der Expressionsstärke eines bestimmten Promotors können durch unterschiedliche Wirtspflanzen oder durch unterschiedliche Insertionsorte in das Genom der Wirtspflanze bedingt sein (Goossens A et al . , Plant Phys 1999, 120:1095-1104).
Eine Promotoraktivität mit einer Spezifität für bestimmte Zellen innerhalb des Samens ist lediglich für die Samenhülle beschrieben worden: Ein kryptischer Promotor mit Spezifität für die Samen- hülle wurde durch "T-DNA tagging" in Tabak identifiziert (Fobert PR et al., Plant Journal 19946 (4) : 567-77; US 5,824,863; WO 99/53067) . Kryptische Promotoren oder Pseudopromotoren sind an sich inaktive Sequenzen innerhalb des Genoms, die jedoch eine expressionregulierende Funktionalität bekommen, wenn sie in der Nähe von Genen positioniert werden.
Die pflanzliche Epidermis stellt sowohl die primäre Barriere als auch die wesentliche Kontaktfläche des pflanzlichen Organismus zu seiner Umwelt dar. Sie hat eine bedeutende Funktion beim Schutz der Pflanze gegen biotische und abiotische Stressf ktoren, aber auch bei der Aufnahme von Nährstoffen.
Die epidermisspezifische Expression bestimmter Gene ist bekannt. So ist ein Lektin-ähnliches Protein, das sich in der Sprossspit- zenepider is der Gartenerbse ( Pisum safcivum) anreichert, beschrieben (Maiti et al . , Planta 1993, 190, 241-246). Sterk et al . beschreiben ein Lipidtransferprotein, dass stark in den epidermalen Zellen von Sprossspitzen der Karotte exprimiert wird (Sterk et al., Plant Cell 1991, 3, 907-921). Clark et al . (Clark et al . , Plant Cell 1992, 4, 1189-1198) beschreiben ein Lipidtransferpro- tein, dass in der Epidermis von Pachyphy turn exprimiert wird. Weitere Beispiele für epidermisspezifisch exprimierte Gene, wie die Chalconsynthase- und Phenylalaninammonialyase-Genfamilien, sind berichtet (Schmelzer et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1988, 85, 2989-2993; Schmelzer et al . , Plant Cell 1989, 1, 993-1001). Goodrich et al . beschreibt Enzyme der Anthocyaninbiosynthese in der 5 Löwenmaul-Blume, die in spezialisierten, epidermalen Zellen für einen begrenzten Zeitraum während der Entwicklung der Blütenknospe exprimiert werden (Goodrich et al., Cell 1992, 68, 955-964). Wyatt et al . beschreibt die prolinreichen Zellwandproteine SbPRPl, SbPRP2, und SbPRP2 aus Soja, die zu bestimmten Ent- 10 wicklungstadien in der Epidermis, zu anderen Zeiten aber auch im Gefässgewebe exprimiert werden (Wyatt et al . , Plant Cell 1992, 4, 99-110) .
Es sind Promotoren beschrieben mit Gewebespezifität für das Meso- 15 phyll und die Pallisadenzellen in Blättern (Broglie et al . , Science 1984, 234, 838-845) , den sich teilenden Spross und das Wurzelmeristem (Atanassova et al . , Plant J. 1992, 2, 291-300), Pollen (Guerrero et al . , Mol. Gen. Genet. 1990, 224,161-168), Sa- menendosperm (Stalberg et al . , Plant Mol. Biol. 1993, 23, 20 671-683), Wurzelepidermis (Suzuki et al . , Plant Mol. Biol 1993, 21, 109-119), sowie für das Wurzelmeristem, Wurzelgefässgewebe und Wurzelknötchen (Bogusz et al . , Plant Cell 1990, 2, 633-641).
Es sind ferner epidermisspezifische Promotoren bekannt mit Akti- 25 vität in Blüten (Koes et al . , Plant Cell 1990, 2, 379-392) oder nach Wundverletzungen (Liang et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1989, 86, 9284-9288). US 5,744,334 beschreibt einen pflanzlichen Promotor (Blec-Promotor) mit Spezifität für die Epidermis der Sprossspitze. Hingegen wurde noch kein Promoter beschrieben, der 30 spezifisch die Expression in der pflanzlichen, embryonalen Epidermis gewährleistet .
Die Expression von Genen wird in allen Organismen über Transkriptionsfaktoren reguliert. Auch diese zeigen entwicklungs- und
35 ortsabhängige Expressionsmuster. Von besonderem Interesse ist die Familie der R2R3-MYB Transkriptionsfaktoren, die konservierte DNA-Bindungsdomänen vergleichbar der des Transkriptionsfaktors c-myb aufweisen und in nahezu allen Eukaryoten identifiziert wurden. Es wird gemutmasst, dass Arabidopsis thaliana mehr als 90
40 R2R3-MYB Gene hat (Meissner RC et al ., Plant Cell 1999; 11(10) :1827-1840) .
Trotz der Vielzahl bekannter pflanzlicher Promotoren, wurde bislang kein Promotor mit einer Spezifität für die Epidermis des 45 pflanzlichen Embryos identifiziert. Auch sind keine Promotoren bekannt, die eine Expression in der Blüte und in der Epidermis des pflanzlichen Embryos bedingen.
Es bestand daher die Aufgabe, entsprechende Promotoren zu identi- fizieren. Diese Aufgabe wurde durch Bereitstellung des Promotors für das mybll Gen aus Arabidopsis thaliana gelöst. Der Promotor des mybll-Gens aus Arabidopsis thaliana hat eine expressionsregu- lierende Spezifität, die eine Expression in der Blütenknospe, der Blüte, der welkenden Blüte, den grünen Samenschoten und in der embryonalen Epidermis am Tag 4 der Keimung zeigt (vergleiche Fig. 1 bis 6) .
Das mybll Gen zählt zu der R2R3-MYB Familie von Transkriptionfaktoren. Das Gen von MYB11 ist bekannt (Genbank Acc.-No: AL162651) . Weder seine Funktion noch sein Expressionsmuster sind jedoch beschrieben. Bislang ist kein MYB-Transkriptionsfaktor beschrieben oder identifiziert worden, der sowohl in Blüten als auch in der embryonalen Epidermis oder allein in der embryonalen Epidermis exprimiert wird.
Die Expressionsspezifität von Expressionskassetten, die von diesem Promotor abgeleitet sind, in der Blüte und der embryonalen Epidermis ist besonders vorteilhaft, weil
a) die Blütenknospe und die Blüte der Pflanze ein empfindliches Organ, besonders gegen Stressfaktoren wie Kälte, ist und
b) der pflanzliche Embryo vor allem in den ersten Tagen der Embryogenese besonders empfindlich und anfällig gegen biotische und abiotische Stressfaktoren ist.
Der Epidermis des pflanzlichen Embryos kommt eine besonders Funktion zu, da sie die unmittelbare Barriere und Kontaktstelle zur Umwelt darstellt .
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft daher Expressions- kassette zur transgenen Expression von Nukleinsäuren in der embryonalen Epidermis und/oder der Blüte enthaltend
a) den Promotor des mybll Gens aus Arabidopsis thaliana gemäss SEQ ID NO: 1, oder
b) ein funktionelle Äquivalent oder äquivalentes Fragment von a) , die im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie a) besitzten, wobei a) oder b) funktioneil mit einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.
Expressionskassette zur transgenen Expression von Nukleinsäuren meint alle solche durch gentechnische Methoden zustandengekommene Konstruktionen, in denen sich entweder
a) der Promotor mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/ oder die Blüte oder ein von ihm abgeleitetes funktionelles Äquivalent oder äquivalente Fragment derselben, oder
b) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz, oder
c) (a) und (b)
sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung (d.h. an ihrem natürlichen chromosomalen Locus) befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inver- sion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann.
Im Rahmen der erfindungsgemässen Expressionskassette kann die Expression einer bestimmten Nukleinsäure durch einen Promotor mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte zu Bildung von sense-RNA oder anti-sense RNA führen. Die sense-RNA kann infolge in bestimmte Polypeptide translatiert werden. Mit der anti-sense-RNA kann die Expression bestimmter Gene herrunter- reguliert werden.
Unter einer funktioneilen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung von dem Promotor mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte, der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz und ggf . weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäurese- quenzen zu sense oder anti-sense RNA, erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüfung im chemischen Sinne er- forderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhan- cer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promotor fun- gierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimie- rende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Die Herstellung einer funktioneilen Verknüpfung kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sam- brook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Se- quenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen.
Dem Fachmann sind verschiedene Wege bekannt, um zu einer erfin- dungsgemässen Expressionskassette zu gelangen. Die Herstellung einer erfindungsgemässen Expressionskassettete erfolgt beispielsweise bevorzugt durch direkte Fusion einer als Promotor mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte fungie- renden Nukleinsäuresequenz mit einer zu exprimierenden Nukleotid- sequenz . Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) so- wie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind. Bevorzugt kann die Expressions- kassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promotor und zu exprimierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem erfindungsgemässen Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden.
Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen der Promotor, ohne dass er zuvor mit einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktioneil verknüpft wurde, zum Beispiel über eine gezielte homologe Rekombination oder eine zufällige Insertion in ein Wirtsgenom eingeführt wird, dort regulatorische Kontrolle über mit ihm dann funktionell verknüpfte Nukleinsäuresequenzen übernimmt und die transgene Expression derselben steuert . Durch Insertion des Promotors - zum
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Ansonsten unveränderte Bedingungen bedeutet, dass die Expression, die durch eine der zu vergleichenden Expressionskassetten initiiert wird, nicht durch Kombination mit zusätzlichen genetischen Kontrollsequenzen, zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, modifiziert wird.
Erfindungsgemäss sind ferner Vektoren, die die oben beschriebenen Expressionskassetten enthalten.
Die in den erfindungsgemässen Expressionskassetten oder Vektoren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben dem Promotor mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte funktionell verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemässen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemässen Expressionskassetten 5 ' -stromaufwärts von der je- weiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäureseuenz den Promotor mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte und 3 ' -stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.
Gentische KontrollSequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionsteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch geneti- sehe Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Absci- sinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26) : 17131 -17135) und Hitzestress (Schöffl F et al . , Molecular & General Genetics 217 (2-3 ): 246-53 , 1989) beschrieben.
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen. Als Pflanzenpromotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage. Vorstellbar ist zum Beispiel, dass eine bestimmte Nukleinsäurese- quenz durch einen Promotor (zum Beispiel den Promotor mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte) in einem Pflanzengewebe als sense-RNA transkribiert und in das entsprechende Protein translatiert wird, während die gleiche Nukleinsäu- resequenz durch einen anderen Promotor mit einen anderen Spezifität in einem anderen Gewebe zu anti-sense-RNA transkibiert und das entsprechende Protein herrunterreguliert wird. Dieses kann durch eine erfindungsgemässe Expressionskassette realisiert werden, indem der eine Promotor vor die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz positioniert wird und der andere Promotor dahinter.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untrans- latierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3 ' -Region von Genen, bevorzugt des mybll-Gens aus Arabidopsis thaliana. Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5 ' -untranslatierte Sequenzen die transiente Expression hete- rologer Gene verstärken können. Sie können ferner die Gewebsspe- zifität fördern (Rouster J et al . , Plant J. 1998, 15: 435-440.). Umgekehrt unterdrückt die 5 ' -untranslatierte Region des opaque-2 Gens die Expression. Eine Deletion der entsprechenden Region führt zu einer Erhöhung der Genaktivität (Lohmer S et al . , Plant Cell 1993, 5:65-73). Die unter SEQ ID N0:1 angegebene Nukleinsäu- resequenz enthält den Abschnitt des mybll-Gens, der den Promotor und die 5 ' -untranslatierte Region bis vor das ATG-Startcodon des MYBll-Transkriptionsfaktors repräsentiert .
Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem
Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 ' -Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Ele- mente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkon- strukt enthalten sein.
Zusätzliche zur funktionellen Verknüpfung bevorzugte aber nicht darauf beschränkte Sequenzen sind weitere, von den Transitpeptid kodierenden Sequenzen verschiedene, Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Piastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Re- tikulum (ER) , im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Komparti- menten; sowie Translationsverstärker wie die 5 ' -Leadersequenz aus
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oder Funktion der erfindungsgemässen Expressionskassetten, Vektoren oder transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:
a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) , Antibiotika oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphi- notricin etc. verleihen.
b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -Zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind da- bei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Bio- technol. 1999; 13(l):29-44) wie das "green fluorescence pro- tein" (GFP) (Chui WL et al . , Curr Biol 1996, 6:325-330; Lef- fel SM et al . , Biotechniques . 23(5):912-8, 1997), die Chlo- ramphenicoltransferase, eine Luziferase (Millar et al . , Plant Mol Biol Rep 1992 10:324-414), die ß-Galactosidase, ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glucuronidase (Jefferson et al . , EMBO J. 1987, 6, 3901-3907).
c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsge- mässen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel
E.coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication) , der pBR322 ori oder der P15A ori (Sa - brook et al . : Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.
Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selek- tionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Bei- spiel ein Herbizid) , einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglu- cose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al . , Plant Cell Reports 5 (1986) , 81-84) .
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kriptionsfaktors aus Arabidopsis thaliana enthalten. Funktionell äquivalente Sequenzen umfassen auch all die Sequenzen, die von dem komplementären Gegenstrang der durch SEQ ID NO:l definierten Sequenz abgeleitet sind und im wesentlichen die gleiche Promoto- raktivität aufweisen.
Funktionelle Äquivalente meint zunächst DNA Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit der durch SEQ ID NO : 1 beschriebenen Nukleinsäuresequenz oder der zu ihr komplementären Nukleinsäure- sequenz hybridisieren und die im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie durch SEQ ID N0:1 beschriebene Nukleinsäuresequenz haben. Standardhybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybri- disierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al . , in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0.2X SSC bei 50°C bevor- zugt bei 65°C) (20X SSC: 0, 3M Natriumeitrat , 3MNaCl, pH 7.0). Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel For amid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausge- führt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:
(1) Hybridisierungbedingungen mit zum Beispiel
(i) 4X SSC bei 65°C, oder
(ii) 6X SSC bei 45°C, oder
(iii) 6X SSC bei 68°C, lOOμg/ml denaturierter Fischsperma- DNA, oder (iv) 6X SSC, 0.5% SDS, lOOμg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 68°C, oder
(v) 6X SSC, 0.5% SDS, lOOμg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50% Formamid bei 42°C.
(vi) 50% Formamid, 4XSSC bei 42°C, oder
(vii) 50% (vol/vol) Formamid, 0.1% Rinderserumalbumin, 0.1% Ficoll, 0.1% Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6.5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumeitrate bei 42° C, oder
(viii) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung) , oder
(ix) 30 bis 40% Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (schwach stringente Bedingung) .
(2) Waschschritte mit zum Beispiel
(i) 0.015 MNaCl/0.0015 M Natriumeitrat/0.1% SDS bei 50°C; oder
(ii) 0.1XSSC bei 65°C, oder
(iii) 0,1X SSC, 0,5% SDS bei 68°C, oder
(iv) 0,1X SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C, oder
(v) 0.2X SSC, 0.1% SDS bei 42°C, oder
(vi) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung) .
Erfindungsgemäss bevorzugt ist der Einsatz solcher Nukleinsäuren in den Expressionskassetten oder von ihnen abgeleiteten Vektoren, die mit der durch SEQ ID NO:l beschriebenen doppelsträngigen DNA- Sequenz oder Fragmenten derselben, wie zum Beispiel den mit SEQ ID NO: 2 und 15 bis 19 beschriebenen doppelsträngigen DNA-Sequenzen, unter den oben definierten Bedingungen hybridisieren und im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie aufweisen.
Besonders bevorzugt sind von SEQ ID NO: 1 abgeleitete Sequenzfragmente, die die Basenpaare 1700 bis 2700 der Sequenz mit der SEQ ID NO: 1 umfassen. Unter einem funktionalen Äquivalent versteht man ferner insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen des unter SEQ ID NO:l beschriebenen mybll-Promotors sowie seine Homologen aus anderen Pflanzengattungen und -arten, welche weiterhin eine Expres- sion in der pflanzlichen embryonalen Epidermis und/oder Blüten initiieren können. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste . Somit werden beispielsweise auch solche Nukleo- tidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der mybll-Promotor-Nukleotidsequenz erhält gemäss SEQ ID NO: 1. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen Sequenz auf bestimmte regulatorische Elemente oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung überflüssi- ger DNA oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen, zum Beispiel weiterer regulatorischer Sequenzen, sein.
Die Eingrenzung der Sequenz auf bestimmte, essentielle regulatorische Regionen kann auch mit Hilfe von Suchroutine zur Suche von Promoterelementen vorgenommen werden. Oft sind in den für die Promotoraktivität relevanten Regionen bestimmte Promotorelemente gehäuft vorhanden. Diese Analyse kann beispielsweise mit Computerprogrammen wie dem Programm PLACE ("Plant Cis-acting Regula- tory DNA Elements") vorgenommen werden (K.Higo et al . , (1999) Nu- cleic Acids Research 27:1, 297-300).
Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z.B. Transitionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair" , Re- striktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid-Primer kommen.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Ge- netics Computer Group (GCG) , Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 12 Length Weight: 4
Average Match: 2,912 Average Mismatch:-2 , 003 Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 20 % auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO. 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO. 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obi- gern Parametersatz eine Homologie von mindestens 20 % aufweist.
Funktionelle Äquivalente, abgeleitet von einer der in den erfin- dungsgemässen Expressionskassetten oder Vektoren zum Einsatz kommenden Promotorsequenzen zum Beispiel durch Substitution, Inser- tion oder Deletion von Nukleotiden, haben eine Homologie von mindestens 20 %, bevorzugt 40 %, vorzugsweise mindestens 60 %, besonders bevorzugt mindestens 80 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 %, und zeichnen sich durch eine im wesentlichen gleiche Transkriptionsaktivität im Vergleich zu der mybll-Promotorse- quenz ge äss SEQ-ID NO : 1 aus .
Weitere Beispiele für die in den erfindungsgemässen Expressionskassetten oder Expressionsvektoren zum Einsatz kommenden Promotorsequenzen lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Orga- nismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie beispielsweise aus Arabidopsis thaliana, Brassica napus , Nicotiana tabacum, So- lanum tuberosum, Helianthinum, durch Homologievergleiche aus Datenbanken leicht auffinden.
Funktionelle Äquivalente umfassen auch solche Promotorvarianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangspromotor, abgeschwächt oder verstärkt ist .
Als weitere geeignete funktionell äquivalente Expressionskasset- ten sind Sequenzen zu nennen, die unter Kontrolle der Promotorsequenz ein Fusionsprotein exprimieren, wobei ein Bestandteil des Fusionsproteins die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz, der andere eine regulative Proteinsequenz, wie z.B. ein Signal- oder Transitpeptid, das das Genprodukt an den gewünschten Wirkort lei- tet, ist.
Die Herstellung einer erfindungsgemässen Expressionskassette erfolgt beispielsweise durch Fusion des mybll-Promotors gemäss SEQ-ID NO: 1 oder eines funktioneilen Äquivalentes mit einer zu exprimierenden Nukleotidsequenz , gegebenenfalls einer für eine Transitpeptid kodierenden Sequenz, vorzugsweise ein chloropla- stenspezifisches Transitpeptid, welches vorzugsweise zwischen dem Promotor und der jeweiligen Nukleotidsequenz angeordnet ist, sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal . Dazu verwen- det man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo- ratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Die Spezifität der erfindungsgemässen Expressionskonstrukte und Vektoren für die pflanzliche, embryonale Epidermis und die Blüte ist besonders vorteilhaft. Die pflanzliche Epidermis stellt sowohl die primäre Barriere als auch die wesentliche Kontaktfläche des pflanzlichen Organismus zu seiner Umwelt dar. Sie hat eine bedeutende Funktion beim Schutz der Pflanze gegen biotische und abiotische Stressfaktoren. Biotische Stressfaktoren können Patho- gene, Verbiss durch Tiere etc. sein, abiotischer Stress kann
Hitze, Kälte, Trockenheit, UV-Licht etc. sein. Die Epidermis hat ferner eine Funktion im Anlocken von Nutzinsekten durch Pigmenteinlagerung oder Synthese flüchtiger Chemikalien, sie gewährt mechanische Stabilität und verhindert den Wasserverlust. Die Epi- dermis hat im Samenembryo darüber hinaus eine essentielle Rolle bei der Aufnahme von Wasser, Gasen und Nährstoffen.
Oft sind die natürlichen Abwehrmechanismen der Pflanze zum Beispiel gegen Pathogene unzureichend. Die Einführung fremder Gene aus Pflanzen, Tieren, oder mikrobiellen Quellen kann die Abwehr verstärken. Beispiel sind der Schutz gegen Insektenfrass in Tabak durch Expression des Bacillus thuringiensis Endotoxin unter Kontrolle des 35 S CaMV Promotors (Vaeck et al . , Nature 1987, 328, 33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expres- sion einer Chitinase aus der Bohne unter Kontrolle des CaMV Promotors (Broglie et al . , Science 1991, 254, 1194-1197).
Kälteeinbrüche in der Blütezeit führen jedes Jahr zu erheblichen Ernteverlusten. Eine gezielte Expression schützender Proteine ge- zielt in der Blüteperiode kann einen Schutz gewähren.
Für eine hohe Effizienz solcher gentechnischer Ansätze ist eine konzentrierte Expression der entsprechenden transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz vor allem in der äussersten Hülle der Pflanze, der Epidermis, oder der Blüte vorteilhaft. Eine konsti- tutive Expression in der gesamten Pflanze kann den Effekt zum Beispiel durch eine Verdünnung in Frage stellen oder das Wachstum der Pflanze bzw. die Qualität des Pflanzenproduktes beeinträchtigen. Außerdem kann es durch eine konstitutive Expression ver- stärkt zum Abschalten des Transgens kommen ("gene silencing") . Hierzu sind Promotoren mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte vorteilhaft.
Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Proteinen bekannt, deren re- 5 kombinante Expression in der embryonalen Epidermis oder der Blüte vorteilhaft sind. Ferner sind dem Fachmann eine Vielzahl von Genen bekannt, durch deren Reprimierung oder Ausschaltung mittels Expression einer entsprechenden antisense-RNA ebenfalls vorteilhafte Effekte erreicht werden können. Beispielhaft jedoch nicht
10 einschränkend für vorteilhafte Effekte seien zu nennen: Das Erzielen einer Resistenz gegen abiotische Stressfaktoren (Hitze, Kälte, Trockenheit, erhöhte Feuchtigkeit, Umweltgifte, UV-Strahlung) und biotische Stressfaktoren (Pathogene, Viren, Insekten und Krankheiten) , die Verbesserung von Nahrungs- oder Futterei-
I5 genschaften, die Verbesserung der Wachstumsrate oder des Ertrages, das Erzielen einer längeren oder früheren Blütezeit, die Veränderung oder Verstärkung des Duftes oder des Farbgebung der Blüten. Für die in diesen Anwendungen einsetzbaren Nukleinsäure- sequenzen oder Polypeptide seien beispielhaft aber nicht ein-
20 schränkend zu nennen:
1. Verbesserter UV-Schutz des pflanzlichen Embryos durch Veränderung der Pigmentierung durch Expression bestimmer Polypeptide wie Enyzme der Flavonoidbiosynthese wie die Chalconsynt-
25 hase oder die Phenylalaninammonialyase oder bestimmter Enyzme der DNA-Reparatur wie der Photolyase (Sakamoto A et al . , DNA Seq. 1998; 9 (5-6) :335-40) . Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Chalconsynthase aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: M20308), die 6-4 Photolyase aus Arabidop-
30 sis thaliana (GenBank Acc . -No. :BAB00748 ) oder den Blaulicht- Photorezeptor / Photolyase Homolog (PHHl) aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U62549) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
35 2. Verbesserter Schutz des pflanzlichen Embryos oder der Blüte gegen abiotische Stressfaktoren wie Trockenheit, Hitze, oder Kälte zum Beispiel durch Überexpression von dem "antifreeze polypeptides aus Myoxocephalus Scorpius (WO 00/00512) , Myoxo- cephalus octodecemspinosus , dem Arabidopsis thaliana Trans- 0 kriptionsaktivator CBF1, Glutamatdehydrogenasen (WO 97/12983, WO 98/11240) , einem späten Embryogenesegen (LEA) zum Beispiel aus Gerste (WO 97/13843) , Calcium-abhängigen Proteinkinasege- nen (WO 98/26045), Calcineurinen (WO 99/05902), Farnesyl- transferasen (WO 99/06580), Pei ZM et al . , Science 1998, 282:
45 287-290), Ferritin (Deak M et al . , Nature Biotechnology 1999, 17:192-196), Oxalatoxidase (WO 99/04013; Dunwell JM Biotechnology and Genetic Engeneering Reviews 1998, 15:1-32),
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sektizide Proteine wie Bacillus thuringiensis Endotoxin, -Amylaseinhibitor oder Proteaseinhibitoren (cowpea Trypsi- ninhibitor) , Glucanasen, Lectine wie Phytohemagglutinin, Schneeglöckchenlectin, Weizenkeimagglutinin, RNAsen oder Ribozyme. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die chit42 Endochitinase aus Trichoderma harzianum (GenBank Acc.- No. : S78423) oder für das N-hydroxylierende, multifunktio- nelle Cytochrom P-450 (CYP79) aus Sorghum bicolor (GenBank Acc.-No.: U32624) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
6. Erreichen einer Insektenabwehr oder -anlockung zum Beispiel durch erhöhte Freisetzung flüchtiger Duft- oder Botenstoffe durch zum Beispiel Enzyme der Terpenbiosynthese .
7. Erreichen einer Speicherfähigkeit in den Epidermiszellen, die normalerweise keine Speicherproteine oder -lipide enthalten mit dem Ziel, den Ertrag an diesen Substanzen zu erhöhen, zum Beispiel durch Expression eine Acetyl-CoA Carboxylase. Bevor- zugt sind Nukleinsäuren, die für die Acetyl-CoA Carboxylase (Accase) aus Medicago sativa (GenBank Acc.-No.: L25042) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
8. Expression von Transportproteinen, die die Aufnahme von Meta- boliten, Nährstoffen oder Wasser in den Embryo verbessern und so das Embryonenwachstum, die Metabolitenzusammensetzung oder den Ertrag optimieren, zum Beispiel durch Expression eines Aminosäuretransporters, der die Aufnahme von Aminosäuren beschleunigt, oder eines Monosaccharid-Transporters , der die Aufnahme von Zuckern fördert. Bevorzugt bevorzugt sind
Nukleinsäuren, die für den kationische Aminosäure-Transporter aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: X92657) oder für den Monosaccharid-Transporter aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: AJ002399) oder funktionelle Äquivalente der- selben kodieren.
9. Expression von Genen, die eine Akkumulation von Feinchemikalien, wie von Tocopherolen, Tocotrienolen oder Carotiniden in der Epidermis des Samens bewirken. Beispielhaft sei die Phy- toendesaturase genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Phytoendesaturase aus Narcissus pseudonarcissus (GenBank Acc.-No.: X78815) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
10. Modifikation der Wachsesterbildung oder der Zusammensetzung der eingelagerten Oligosaccharide zur Verbesserung des Schutzes -gegen Umwelteinflüsse oder zur Verbesserung der Verdau- barkeit beim Einsätz in Futter- oder Nahrungsmitteln. Beispielhaft sein die Überexpression der Endoxyloglucantransfe- rase genannt. Bevorzug sind Nukleinsäuren, die für die Endo- xyloglucantransferase (EXGT-Al)aus Arabidopsis thaliana (Gen- Bank Acc . -No. :AF163819 ) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
11. Verlängern oder Aufheben der Ruhephase durch Expression von Transkriptionsfaktoren, die in die Regulation von Dormanz-re- levanten Genen eingreifen. Beispielhaft sei die Überexpression des ABI3 Proteins (abscisic acid insensitive gene) oder des Viviparous-1 Protein (VP-1) zu nennen. Die Keimzeitveränderung kann eine Ertragserhöhung und eine verkürzte Embryonalentwicklung bedingen. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für das Viviparous-1 Protein aus Zea mays (GenBank Acc.-No.: M60214) oder das ABI3 Protein (abscisic acid insensitive gene) aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: X68141) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
12. Erzeugung von sterilen Pflanzen durch Verhinderung der Befruchtung und/oder der Keimung mit Hilfe der Expression eines geeigneten Inhibitors zum Beispiel eines Toxins in Blüten und im Samen.
13. Produktion von Neutraceuticals wie zum Beispiel polyungesättigten Fettsäuren wie beispielsweise Arachidonsäure oder EP (Eicosapentaensäure) oder DHA (Docosahexaensäure) durch Expression von Fettsäureelongasen und/oder -desaturasen oder Produktion von Proteinen mit verbessertem Nahrungswert wie zum Beispiel mit einem hohen Anteil an essentiellen Aminosäuren (z.B. das methioninreiche 2S Albumingens der Brasilnuss). Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für das methioninreiche 2S Albumin aus Bertholletia excelsa (GenBank Acc . -No. :AB044391) , die Δ6-Acyllipiddesaturase aus Physcomitrella patens (GenBank Acc.-No.: AJ222980; Girke et al 1998, The Plant Journal
15:39-48), die Δ6-Desaturase aus Mortierella alpina (Sakura- dani et al 1999 Gene 238:445-453), die Δ5-Desaturase aus Cae- norhabditis elegans (Michaelson et al . 1998, FEBS Letters 439:215-218), die Δ5-Fettsäuredesaturase (des-5) aus Caenor- habditis elegans (GenBank Acc.-No.: AF078796), die Δ5-Desatu- rase aus Mortierella alpina (Michaelson et al . JBC 273:19055 - 19059), die Δ6-Elongase aus Caenorhabditis elegans (Beau- doin et al . 2000, PNAS 97:6421-6426), die Δ6-Elongase aus Physcomitrella patens (Zank et al . 2000, Biochemical Society Transactions 28:654-657) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren. 14. Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakzinen wie beschrieben bei Hood EE, Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999 Aug; 10 (4) : 382-6 ; Ma JK, Vine ND.Curr Top Microbiol Immuno1. 1999;236:275-92.
15. Modifikation des Faseranteils in Nahrungsmitteln auf Samenbasis durch zum Beispiel Expression von antisense-Transkripten der Coffeinsäure-O-methyltransferase oder des Cinnamoylalko- holdehydrogenase Gens .
16. Inhibition der Reifung der Samenhülle durch Expression von zum Beispiel Ribonukleasegenen oder Transkriptionsfaktoren zum Erzielen einer erhöhten Samengrösse, zur Reduktion der relativen Biomasse der Samenhülle und zur Erleichterung der Enthüllung des Samens. Beispielhaft sei hier eine Überexpression des ANT (AINTEGUMENTA) Gens genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für das AINTEGUMENTA Gen aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U40256) oder funktionelle Äquivalente desselben kodieren.
Weitere Beispiele für vorteilhafte Gene sind zum Beispiel genannt bei Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No; Seite 487-96.
Funktionelle Äquivalente meint hier - analog zu der Definition der funktionellen Äquivalente des Promotors mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte - all die Sequenzen, die die im wesentlichen die gleiche Funktion haben d.h. zu der Funktion (zum Beispiel einer Substratumsetzung oder einer Signal- transduktion) befähigt sind wie auch das beispielhaft genannte Protein. Dabei kann das funktionelle Äquivalent sich in anderen Merkmalen durchaus unterscheiden. Es kann zum Beispiel eine höhere oder niedrigere Aktivität haben oder auch über weitere Funktionalitäten verfügen.
Funktionelle Äquivalente meint ferner Sequenzen, die für Fusionsproteine bestehend aus einem der bevorzugten Proteine und anderen Proteinen zum Beispiel einem weiteren bevorzugten Protein oder aber auch einer Signalpeptidsequenz kodieren.
Dem Fachmann ist ferner bekannt, dass er die oben beschriebenen Gene, nicht direkt unter Verwendung der für diese Gene kodierenden Nukleinsäuresequenzen exprimieren oder zum Beispiel durch anti- sense reprimieren muss . Er kann auch zum Beispiel künstliche Transkriptionsfaktoren vom Typ der Zinkfingerproteine verwenden (Beerli RR et al . , Proc Natl Acad Sei USA 2000; 97 (4) : 1495-500) . Diese Faktoren lagern sich in den regulatorischen Bereichen der zu exprimierenden oder zu reprimierenden endogenen Gene an und bewirken, je nach Gestaltung des Faktors, eine Expression oder Repression des endogenen Gens .
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organismen, transformiert mit wenigstens einer erfindungsgemässen Expressionskassette oder einem erfindungsgemässen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw.- oder Vermehrungs- gut abgeleitet von solchen Organismen.
Unter Organismus, Ausgangs- oder Wirtsorganismen werden prokaryo- tische oder eukaryotische Organismen, wie beispielsweise Mikroorganismen oder pflanzliche Organismen verstanden. Bevorzugte Mi- kroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algen oder Pilze.
Bevorzugte Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Er- winia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyanobak- terien zum Beispiel der Gattung Synechocystis . Bevorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemässen Konstrukte befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismus sind solche aus der Gattung Agrobacterium und insbesondere der Art Agrobacterium tumefaciens .
Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces , Hansenula oder Pichia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neu- rospora, Fusarium, Beauveria oder weitere in Indian Chem Engr . Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschriebene Pilze.
Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangsorganis- men sind vor allem Pflanzen. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkultu- ren. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
Einjährige, mehrjährige, monoeotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzuge Wirtsorganismen für die Herstellung transgener Pflanzen. Die Expression von Genen in der embryonalen Epidermis und vor allem der Blüte ist ferner vorteilhaft bei allen Schmuck- pflanzen, Nutz- oder Zierbäumen, Blumen, Schnittblumen, Sträuchern oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae
(Leberblümchen) und Musci (Moose) ; Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen,- Algen wie Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae , Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae
(Diätomeen) und Euglenophyceae .
Pflanzen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielhaft und nicht einschränkend die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr.
Beispielhaft aber nicht einschränkend für Blütenpflanzen seien zu nennen die Familien der Leguminosae wie Erbse, Alfalfa und Soja; Gramineae wie Reis, Mais, Weizen; Solanaceae wie Tabak und andere mehr; die Familie der Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karrotte) ) und Apium (ganz beson- ders die Art graveolens dulce (Selarie) ) und andere mehr; die Familie der Solanacea, besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) und andere mehr; und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer) und andere mehr,- die Familie der Leguminosae, besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) und andere mehr; und die Familie der Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten campestris (Rübe) , oleracea cv Tastie (Kohl) , oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli) ; und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana und andere mehr; die Familie der Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art Sativa (Salat) und andere mehr.
Die erfindungsgemässen transgenen Pflanzen sind insbesondere ausgewählt unter monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Getreidearten wie Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis oder Hafer sowie dem Zuckerrohr. Ferner sind die erfindungsgemässen transgenen Pflanzen insbesondere ausgewählt unter diko- tylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Brassicacae wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten oder Canola, Leguminosae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Luzerne, Bohnengewächsen oder Erdnuss
Solanaceae wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Paprika, Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula, Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini, sowie Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Roter Pfeffer, Möhre, Karotte, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Wein- species .
Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Tagetes erecta, Calendula officinalis sowie alle Gattungen und Arten, die als Nahrungs- oder Futtermittel zum Einsatz kommen, wie die beschriebenen Getreidearten, oder sich zur Herstellung von Ölen eignen, wie Olsaaten (wie zum Beispiel Raps) , Nussarten, Soja, Sonnenblume, Kürbis und Erdnuss.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Bei- spiel Algen oder Cyanobakterien, sowie Moose.
Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella.
Die Herstellung eines transformierten Organismus oder einer transformierten Zelle erfordert, dass die entsprechende DNA in die entsprechende Wirtzelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (siehe auch Keown et al . 1990 Methods in Enzymology 185:527-537). So kann die DNA bespielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elek- trischen Impuls permeabilisert werden.
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation ge- nutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentrans- formation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnähme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Trans- formation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Diese Stämme enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid) , das auf die Pflanze nach Agrobaterium-Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA), wird in das Ge- nom der Pflanzenzelle integriert.
Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone, diploide Pflanzenzellen geeignet, wohingegen die direkten Transformationstechniken sich für jeden Zelltyp eignen.
Die Einführung einer erfindungsgemässen Expressionskassette in Zellen, bevorzugt in pflanzliche Zellen, kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacte- rien sein.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der Expressionskassette mittels Plasmidvektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expres- sionskassette in -das Wirtsgenom ermöglichen.
Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.
Transformationstechniken sind für verschiedene monokotyle und dikotyle pflanzliche Organismen beschrieben. Ferner stehen verschiedene mögliche Plasmidvektoren für die Einführung fremder Gene in Pflanzen zur Verfügung, die in der Regel einen Replikati- onsursprung für eine Vermehrung in E.coli und ein Markergen für eine Selektion transformierter Bakterien enthalten. Beispiele sind pBR322, pUC Reihe, M13mp Reihe, pACYC184 etc.
Die Expressionskassete kann in den Vektor über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Das entstandene Plasmid wird zunächst in E.coli eingeführt. Korrekt transformierte E.coli werden selektioniert , gezüchtet und das rekombi- nante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen.
Transformierte Zellen d.h. solche, die die eingeführte DNA inte- 5 griert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untrans- formierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist . Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide zu verleihen vermag. Transformierte Zellen,
10 die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al ., Plant Mol Biol.
15 1993 Mar;21(5) :871-884) , das nptll Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygro ycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht.
20 Je nach Methode der DNA-Einführung können weitere Gene auf dem Vektorplasmid erforderlich sein. Werden Agrobacteria verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: Shuttle or in- termediate vector) oder einen binären Vektor. Wenn zum Beispiel
25 ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vekto-
30 ren können sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz . Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al.,Mol. Gen. Genet. 163 (1978),
35 181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das nptll Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertra-
40 gung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden.
Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen 45 ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V. , Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al . , Crit. Rev. Plant. Sei., 4:1-46 and An et al . , EMBO J. 4 (1985), 277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. U.S.A.).
Für den Transfer der DNA auf die pflanzliche Zelle werden pflanzliche Explantate mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert . Ausgehend von infiziertem Pflanzenmaterial (z.B. Blatt-, Wurzel- oder Stengelteile, aber auch Protoplasten oder Suspensionen von Pflanzenzellen) können ganze Pflanzen unter Verwendung eines geeigneten Mediums, dass zum Beispiel Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierten Zellen enthalten kann, regeneriert werden. Die erhaltenen Pflanzen können dann auf die Präsenz der eingeführten DNA, hier der erfindungsgemässen Expressionskassette, durchmustert werden. Sobald die DNA in das Wirtsgenom integriert ist, ist der entsprechende Genotyp in der Regel stabil und die entsprechende Insertion wird auch in den Nachfolgegenerationen wiedergefunden. In der Regel enthält die integrierte Expressionskassette einen Selektionsmarker, der der transformierten Pflanze eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herizid) oder ein Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc. verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al . , Plant Cell Reports 5 (1986) , 81-84) . Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al . , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128 - 143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205 - 225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al . , Nucl. Acids Res . 12 (1984), 8711).
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden. Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nukleinsäuren kann beispielsweise in vi tro durch Sprossmeristemvermehrung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektionsmethoden ermittelt werden.
Erfindungsgemäss sind ferner von den oben beschriebenen transgenen Organismen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.- , und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte.
Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemässe, genetisch veränderte Pflanzen können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futtermittel verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der oben beschriebenen erfindungsgemässen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.- , und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
Bevorzugt ist ferner ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen wobei ein Wirtsorganismus mit einer der oben beschriebenen Expressionskassetten transformiert wird und diese Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene enthält, die für die gewünschte Fein- chemikalie kodieren oder die Biosynthese der gewünschten Feinche- mikalie katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus gezüchtet wird und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Züchtungsmedium isoliert wird. Dieses Verfahren ist für Feinchemikalien wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe breit anwendbar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Tocopherolen und Toco- trienolen sowie Carotinoiden. Die Züchtung der transformierten Wirtsorganismen sowie die Isolierung aus den Wirtsorganismen bzw. aus dem Züchtungsmedium erfolgt mit dem Fachmann bekannten Verfahren. Die Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Anti- körpern oder Vakkzinen ist beschrieben bei Hood EE, Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999 Aug;10 (4) :382-6; Ma JK, Vine ND.Curr Top Microbiol Immuno1. 1999;236:275-92. Sequenzen
1. SEQ ID NO: 1 Promotor and 5 ' -untranslatierte Region des Arabidopsis thaliana mybll Gens .
2. SEQ ID NO: 2 2035bp-Fragment von Promotor and 5 ' -untransla- tierter Region des Arabidopsis thaliana mybll Gens .
3. SEQ ID NO: 3 Oligonukleotid-Primer, oligo-(dT) Primer
4. SEQ ID NO: 4 Oligonukleotid-Primer
5. SEQ ID NO: 5 Oligonukleotid-Primer
6. SEQ ID NO: 6 Oligonukleotid-Primer
7. SEQ ID NO: 7 Oligonukleotid-Primer
8. SEQ ID NO: 8 Oligonukleotid-Primer, Vorwärts-Primer Z17F2
9. SEQ ID NO: 9 Oligonukleotid-Primer, Rückwärts-Primer Z17R3
10. SEQ ID NO: 10 Oligonukleotid-Primer, PCR-Adaptorprimer 1
11. SEQ ID NO: 11 Oligonukleotid-Primer, mybll-Vorwärts-Primer
12. SEQ ID NO: 12 Oligonukleotid-Primer, mybll-Rückwärts-Primer
13. SEQ ID NO: 13 Oligonukleotid-Primer
14. SEQ ID NO: 14 Oligonukleotid-Primer
15. SEQ ID NO: 15 888bp-Fragment von Promotor and 5 ' -untransla- tierter Region des Arabidopsis thaliana mybll Gens.
16. SEQ ID NO: 16 282bp-Fragment von Promotor and 5 ' -untransla- tierter Region des Arabidopsis thaliana mybll Gens
17. SEQ ID NO: 17 1394bp-Fragment von Promotor and 5 ' -untransla- tierter Region des Arabidopsis thaliana mybll Gens
18. SEQ ID NO: 18 1191bp-Fragment von Promotor and 5 ' -untransla- tierter Region des Arabidopsis thaliana mybll Gens 19. SEQ ID NO: 19 665bp-Fragment von Promotor and 5 ' -untransla- tierter Region des Arabidopsis thaliana mybll Gens
Abbildungen
Die folgenden Abbildungen zeigen in-si tu Hybridisierungen von unterschiedlichen pflanzlichen Organen zu unterschiedlichen Entwicklungszeitpunkten:
1. Fig. 1 (I und II) zeigen einen Schnitt durch ein Samenkorn und damit durch den pflanzlichen Embryo (Arabidopsis thaliana) . "in" bezeichnet das Integument, "h" das Hypokotyl, "c" das Keimblatt und "r" die Wurzel. Fig.l (I) zeigt den Schnitt ohne Verdeutlichung der Expressionsregion. Fig.l (II) verdeutlicht die Expressionsregion des mybll-Promotors, die entlang der weissen, gestrichelten Linie (markiert durch den weissen Pfeil) verläuft. Diese Region entspricht der embryonalen Epidermis .
2. Fig. 2 (I und II) zeigen einen Schnitt durch die pflanzliche Blütenknospe (Arabidopsis thaliana) . "sp" bezeichnet die Nar- benpapillen (englisch: stigmatic papilla) , "w" die Ovarien- wand, "st" das Stigma, "pl" die Placentae (Nährgewebe) und "ov" das Ei. Fig.2 (I) zeigt den Schnitt ohne Verdeutlichung der Expressionsregion. Fig.2 (II) verdeutlicht die Expressionsregion des mybll-Promotors, die stark in den schraffierten Regionen, weniger stark in den punktierten Regionen zu finden ist . Diese Regionen entsprechen zum einen der Ovarien- wand, zum anderen den Ovarien selber.
3. Fig. 3 (I und II) zeigen einen Schnitt durch die Ovarienanla- gen von Arabidopsis thaliana. "al" bezeichnet den Pollensack
(englisch: anther locules) , "g" das Gynoecium, "op" die Eian- lagen (englisch: ovule primordia) und "sp" ein Blütenblatt (Sepale) . Fig.3 (I) zeigt den Schnitt ohne Verdeutlichung der Expressionsregion. Fig.3 (II) verdeutlicht die Expressionsregion des mybll-Promotors, die in den weiss-schraffierten Regionen (markiert durch weisse Pfeile) zu finden ist. Diese Regionen entsprechen den Eianlagen.
4. Fig, 4 (I und II) zeigen einen Schnitt durch die pflanzlichen Blütenanlagen (Arabidopsis thaliana) . "im" bezeichnet das Blütenmeristem (tunica) . Die Zahlen 2 und 6 beschreiben Blüten im Blütenentwicklungsstadium 2 bzw. 6 (Arabidopsis At- las of Morphology, Bowman J ed'. , Springer Verlag, New York, USA, 1995). Fig.4 (II) zeigt den Schnitt ohne Verdeutlichung der Expressionsregion. Fig.4 (I) verdeutlicht die Expres- sionsregion des mybll-Promotors, die in den weiss-schraffier- ten Regionen zu finden ist. Diese Regionen entsprechen dem Blütenmeristem und der Blütenspitze (EntwicklungsStadium 2) bzw. der Staubblattanlage und den Blütenblattprimordien (Ent- wicklungsStadium 6) .
5. Fig. 5 (I) zeigt eine schematische Darstellung der Expression im Blütenstadium 2. "fa" bezeichnet die Blütenspitze (floral apex) . Die Expressionsregion, des mybll-Promotor ist in der schra fierten Region zu finden. Fig. 5 (II) zeigt eine schematische Darstellung der Expression im Blütenstadium 6. "p" bezeichnet das Blütenblattprimordium, "ms" bezeichnet die Staubblattanalge) , "g" das Gynoecium. Die Expressionsregion des mybll-Promotor ist in der schraffierten Region zu finden
6. Fig. 6: Gezeigt ist das Ergebnis einer RT-PCR unter Verwendung verschiedener Gewebe zur Bestimmung des Expressionsmu- sters des mybll Promotors. Die Expression ist im Sämling (Tag 4), der Blütenknospe, Blüte und welkenden Blüte, sowie den grünen Schoten nachzuweisen.
7. Fig. 7: Schematische Darstellung der Vektoren pCR-TOPO-mybll (I), pGPTV- ybll: :GUS (II), pGPTVl-mybll :: GUS (III) und pGPTV2-mybll: :GUS (IV). Die Pfeilrichtung gibt die Orientie- rung des Promoters an, wobei die Pfeilspitze in Richtung des Startkodons weist. Die Abkürzungen haben folgende Bedeutung: mybll : Promotor oder Promotorfragment des mybll Promotors NOS-T: Terminatorsequenz der Nopalin-Synthase (NOS) GUS: Reportergen (bakterielle ß-Glucuronidase)
8. Fig. 8: Schematische Darstellung der Vektoren pGPTV3- mybll::GUS (V), pGPTV4-mybll : :GUS (VI), pGPTV5-mybll :: GUS
(VII) und pGPTV6-mybll: :GUS (VIII). Die Pfeilrichtung gibt die Orientierung des Promotors an, wobei die Pfeilspitze in Richtung des Startkodons weist. Die Abkürzungen haben folgende Bedeutung : mybll : Promotor oder Promotorfragment des mybll Promotors NOS-T: Terminatorsequenz der Nopalin-Synthase (NOS) GUS: Reportergen (bakterielle ß-Glucuronidase)
9. Fig. 9: Schematische Darstellung der Vektoren pBSK-mybll (IX) und pBM- ybll (X) . Die Pfeilrichtung gibt die Orientierung des Promotors an, wobei die Pfeilspitze in Richtung des Startkodons weist. Die Abkürzungen haben folgende Bedeutung: mybll : Promotor oder Promotorfragment des mybll Promotors Beispiele
Allgemeine Methoden:
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungs- schritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektropho- rese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al . (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 5463-5467) .
Beispiel 1: Wachstumsbedingungen der Pflanzen für gewebsspezifische RT-PCR Analyse
Um 4 bzw. 7 Tage alte Keimlinge zu erhalten, werden jeweils unge- fähr 400 Samen (Arabidopsis thaliana Ökotyp Columbia) oberflächig mit einer 80%igen Ethanollösung für 2 Minuten sterilisiert, mit einer Natriumhypochloritlösung (0.5% v/v) 5 Minuten behandelt, dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und bei 4°C für 4 Tage inkubiert, um eine gleichmässige Keimung sicherzustellen. Anschliessend werden die Samen auf Petrischalen mit MS' Medium
(Sigma M5519) unter Zusatz von 1% Saccharose, 0.5 g/1 MES (Sigma M8652), 0.8% Difco-BactoAgar (Difco 0140-01), pH 5.7 inkubiert. Die Sämlinge werden in einem 16-stündigen Licht / 8-stündigen Dunkelheitszyklus (Philips 58W/33 Weisslichtlampen) bei 22°C gezüchtet und nach 4 bzw. 7 Tagen nach Beginn der Keimphase geerntet .
Für die Gewinnung von Wurzeln werden' 100 Samen wie oben beschrieben sterilisiert, bei 4°C 4 Tage inkubiert und dann in 250ml Fla- sehen mit MS Medium (Sigma M5519) unter Zusatz von weiteren 3% Saccharose und 0.5 g/1 MES (Sigma M8652), pH 5.7 gezüchtet. Die Sämlinge werden in einem 16-stündigen Licht- / 8-stündigen Dunkelheitszyklus (Philips 58W/33 Weisslichtlampen) bei 22°C, 120 U/min gezüchtet und nach 3 Wochen geerntet. Für alle anderen verwendeten pflanzlichen Organe werden die Samen auf Einheitserde (Typ VM, Manna-Italia, Via S. Giaco o 42, 39050 San Giacomo/ Laives, Bolzano, Italien) ausgesäht, 4 Tage bei 4°C inkubiert um eine gleichmässige Keimung zu gewährleisten und dann in einem 16-stündigen Licht- / 8-stündigen Dunkelheitszyklus (OSRAM Lumi- lux Daylight 36W/12 Leuchtstoffröhren) bei 22°C gezüchtet. Junge Rosettenblätter werden im 8-Blattstadium (nach 3 Wochen) geern- tet, reife Rosettenblätter werden nach 8-Wochen kurz vor der
Stengelbildung geerntet. Blütenstände (Apices) der ausschießenden Stengel werden kurz nach dem Ausschießen geerntet. Stengel, Stengelblätter und Blütenknospen werden in der Entwicklungsstufe 12 J Bowmann J (ed.), Arabidopsis, Atlas of Morphology, Springer New York, 1995) vor der Staubblattentwicklung geerntet. Geöffnete
Blüten werden in Stadium 14 sofort nach der Staubblattentwicklung geerntet. Welkende Blüten werden in Stadium 15 bis 16 geerntet. Die verwendeten grünen und gelben Schoten hatten eine Länge von 10 bis 13 mm.
Beispiel 2 : RJMA Extraktion und RT-PCR Analyse
Gesa t-RNA wird aus den in Beispiel 1 beschriebenen Organen der Pflanze zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung wie be- schrieben isoliert (Prescott A, Martin C Plant Mol Biol Rep 1987,- 4: 219-224). Die Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) wird verwendet, um das Atmybll Gentranskript nachzuweisen. Alle RNA Proben werden mit DNasel (15 Units, Boehringer, Mannheim) vor der cDNA Synthese behandelt. Die Erststrang cDNA Synthese wird ausgehend von 6μg Gesamt-RNA mit einem oligo-(dT) Primer und RT Superscript™II Enzym (300 Uήits) nach Angaben des Herstellers in einem Gesamtvolumen von 20 μl (Life Technologies, Gaithersburg, MD) durchgeführt. Zur RNA werden dazu 150 ng oligo-(dT.) in einem Endvolumen von 12 μl gegeben. Der Ansatz wird für 10 min bei 70 aC erhitzt und anschließend sofort auf Eis gekühlt. Dann werden 4 μl des 5X Erststrangpuffers, 2 μl 0. IM DTT, 1 μl 10 mM dNTP-Mix (jeweils 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und RNase Inhibitor (5 Units, Böhringer Mannheim) zugegeben. Der Ansatz wird für 2 min auf 42 aC erhitzt, RT' Superscript™ II Enzym (300 Units, Life Technologies) zugegeben und für 50 min bei 422C inkubiert. Als oligo-(dT) Primer wird ein 35-Basen langes Oligo- nukleotid mit 17 dT Resten und einer Adaptorsequenz verwendet (Frohman MA (1990) Acade ic Press, San Diego, CA. pp. 28-38) :
5'-GGGAATTCGTCGACAAGC(T)ι7-3') (SEQ ID NO: 3)
Die Erststrang-cDNA wird als Matrize für die PCR verwendet. Für die PCR werden die folgenden Primer verwendet:
Vorwärts-Primer Z17F2 : 5 ' -GCCAATACCGTCGAGAATGCGCC-3 ' (SEQ ID NO: 8) Rückwärts-Primer Z17R3 : 5 ' -TCGTCAATATCCAACGGTTCTCC-3 ' (SEQ ID NO: 9)
Der PCR-Reaktionsansatz setzt sich zusammen wie folgt:
2.5 μg Erststrang-cDNA
IX PCR Buffer II Perkin Eimer (Warrington, UK) 2.5 mM mM MgCl2
200 μM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP 0.5 μM von jedem der Oligonukleotid-Primer Z127F2 und Z17F3 (SEQ-ID No. : 8 und 9) 2.5 Units AmpliTaq (Perkin Eimer) dest. Wasser bis zu einem Endvolumen von 50 μl .
Folgendes Temperaturprogramm wird verwendet (PTC-100TM Modell 96V; MJ Research, Inc., Watertown, Massachussetts) :
1 Zyklus mit 150 sec bei 94°C
20 Zyklen mit 94°C für 45 sec, 55°C für 1 min und 72°C für 2 min .
1 Zyklus mit 72°C für 7 min
Um eine Linearität des Amplifikationsprozesses zu gewährleisten, werden lediglich 20 PCR-Zyklen durchgeführt. Die PCR Produkte werden mittels 2% w/v Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, auf eine Hybond N+ Nylonmembran (Amersham, England) geblottet und mit Fluorescein-markierten Sonden hybridisiert. Die Herstellung der Sonden sowie die Detektionsreaktion erfolgt wie im Herstellerprotokoll der Firma Amersham angegeben. Die Standardisierung der Methode wird mittels Verwendung von Primern spezifisch für das Arabidopsis ACT1 Gen, das für Actin kodiert (An YQ et al . Plant Cell 1996, 8:15-30), verifiziert. Für die mRNA Detektion von At- MYBll werden die folgenden Primer verwendet:
Vorwärts-Primer Z17F2 : 5 ' -GCCAATACCGTCGAGAATGCGCC-3 ' (SEQ ID NO: 8)
Rückwärts-Primer Z17R3 : 5 ' -TCGTCAATATCCAACGGTTCTCC-3 ' (SEQ ID NO: 9)
Die Grosse des amplifizierten PCR-Produktes beträgt 562 bp. Die PCR-Reaktion wird nur über 25 Zyklen bei den oben genannten Bedingungen durchgeführt. (EMBL AF062863; Kranz et al . , 1998). Das Ergebnis der RT-PCR Analyse ist in Fig. 6 dargestellt. Beispiel 3: Analyse der Atmybll Expression durch in si tu Hybridisierung
Blüten und Schoten werden zu unterschiedlichen Entwicklungstadien von 7-Wochen alten Pflanzen, die auf Erde wie oben beschrieben gehalten werden, gesammelt. Die Proben werden sofort in frisch bereiteter 4% p-Formaldehydlösung in PBS Puffer (130 mM NaCl, 7 mM NaHP04, 3 mM NaH2P04) unter Vakuum für 3 Stunden fixiert. Das fixierte Material wird in 70% Ethanol bei 4°C bis zur weiteren Verwendung gelagert . Fixierungs- und Einbettungsarbeiten werden nach der Vorschrift von Dolfini et al durchgeführt (Dolfini S et al . , Dev. Genet. 1992, 13, 264-276) mit der Abwandlung, dass jeder beschriebene Schritt auf eine Dauer von 1 Stunde verkürzt wurde. Die Matrize für die Probe zur in-si tu Hybridisierung wird hergestellt wie in der Anleitung des Lig'nScribe™ PCR Promoter Addition Kit (Ambion, USA) beschrieben. Dazu werden 20 ng des PCR-Fragments , das mit den Primern Z17F2 und Z17R3 ausgehend von einem partiellen cDNA Klon des AtMYBll Gens (EMBL AF062863; Kranz et al . , 1998 erhalten wird (s.oben), entgegen seiner Leserichtung hinter einen T7 Promotoradapter kloniert (Ambion, USA) . Diese
Ligationsreaktion enthält 1 μl des 10X Ligationspuffers , 1 μl des Promotoradapters, 1 μl T4 DNA Ligase und destilliertes Wasser in einem Gesamtvolumen von 10 μl . Die Ligationsreaktion wird für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Matrize für den Antisense- Strang der AtMYBll Sonde wird mittels PCR unter Verwendung eines Teils der Ligationsreaktion und der Primer Z17F2 (SEQ ID NO : 8) sowie Ambion PCR Primer 1 durchgeführt. Dazu werden 2 μl der Ligationsreaktion und die Primer Z17F2 und der PCR-Adaptorprimer 1
PCR-Adaptorprimer 1: 5 ' -GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGG-3 ' (SEQ ID NO: 10)
gemischt. Die Primer Z17R3 und PCR-Adaptorprimer 1 werden zur Herstellung der Matrize für den Sense-Strang der AtMYBll Sonde verwendet. Die PCR Bedingungen zur Herstellung der Matrizen für die Antisense und Sense-Stränge der AtMYBll Sonden sind identisch und werden unter den in Beispiel 2 beschrieben Bedingungen durchgeführt. Abweichend davon werden 35 Zyklen durchgeführt und le- diglich eine Konzentration von 0.25 mM der eingesetzten Primer verwendet .Sense und Antisense DIG-11-UTP markierte RNA Sonden werden unter Verwendung der T7 RNA Polymerase mit Reagenzien von Röche Diagnostics synthetisiert: Folgende Komponenten werden in einem RNase-freien Eppendorfgefäß, welches auf Eis gehalten wird, in der angegebenen Reihenfolge gemischt. Angegeben ist jeweils die Endkonzentration in einem Reaktionsvolumen von 20μl. 0,1 μg Ethanol-gefälltes PCR-Produkt, lx Markierungsmischung (als lOx Mischung mit lOmM ATP, lOmM CTP, lOmM GTP; 6.5mM UTP, 3.5mM DIG- UTP in Tris-HCl, pH 7,5), lx Transkriptionspuffer (als lOx Puffer mit 400mM Tris-HCl, pH 8,0, 60mM MgCl2/ lOOmM Dithioerythritol, 20mM Spermidin, lOOmM NaCl, 1 unit/ml RNase Inhibitor) und 40 5 Einheiten T7 RNA Polymerase. Der Ansatz wird kurz schüttelnd gemischt und wenige Sekunden zentrifugiert . Anschließend wird der Ansatz für mindestens 2 Stunden bei 372C inkubiert. Zum Verdau des DNA-PCR-Produktes werden 20 Einheiten DNase zugegeben und für 15 min bei 37 SC inkubiert. Zur Beendigung der Reaktion werden 10 2 μl der mitgelieferten EDTA-Lösung hinzu gegeben.
8μm dicke Schnitte des fixierten Pflanzenmaterials werden durch ein Mikrotom unter Verwendung von Miktotomklingen Typ S35 (Fea- ther, Japan) geschnitten (Minot-Mikrotom Typ 1212; Leitz Wetzlar,
15 Germany) , auf poly-L-Lysin-beschicktete Objektträger aufgebracht und behandelt wie bei Coen et al . beschrieben (Coen ES et al . , , Cell 1990, 63:1311-1322). Vor der Hybridisierung werden die Schnitte in Xylen eingelegt um das Paraffin zu entfernen und an- schliessend mit einer Serie an Ethanolverdünnungen rehydrati-
20 siert. Es folgt eine Inkubation mit 1 μg/ml Proteinase K für 30 min bei 37°C in 100 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM EDTA. Anschliessend wird mit Acetanhydrid acetyliert, mit einer Verdünnunsgreihe von Ethanol dehydriert und an der Luft getrocknet. Die DIG-11-UTP markierten RNA-Sonden werden einer milden alkalischen Hydrolyse
25 unter Erwärmen auf 60°C für eine Stunde in lOOmM Carbonatpuffer (pH 10.2) ausgesetzt, um eine durchschnittliche Fragmentlänge von ungefähr 150 Basen zu erreichen.
Ungefähr jeweils 20 ng der DIG-11-UTP markierten RNA-Sonde in
30 50 μl auf 70°C vorgewärmtem Hybrisierungspuffer (50% Formamid, 300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, IX Denhardts, 10% Dextransulfat, 10 mM DTT, 250 ng/ l tRNA, 100 μg/ml polyA) werden für jeden Objektträger verwendet und mit der Gewebeprobe bei 45°C über Nacht inkubiert. Die Träger werden 45 min in 2X SSC
35 (20X SSC: 0 , 3M Natriumeitrat , 3M NaCl, pH 7.0) bei Raumtemperatur, 45 min in 2X SSC bei 55°C, 45 min in 0.5X SSC bei 55°C gewaschen und dann mit 20 μg/ml RNase A in NTE (0.5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA) bei 37°C für 30 min behandelt. Anschliessend werden die Träger erneut 15 min in 2X SSC bei Raum-
40 temperatur und 15 min in 2X SSC bei 50°C gewaschen. Die immunologische Detektion der Sonde wird gemäss Anleitung des "digoxige- nin-nucleic acid detection kit" (Röche Diagnostics) realisiert: Dazu werden die Träger unter sanfter Bewegung für 1 Stunde in l%iger Blockierungslösung (Röche Diagnostics) in 100 M Tris-HCl
45 (pH 7.5), 150 mM NaCl und anschliessend 30 min in Puffer A (0.5% Rinderserumalbumin, 0.3% Triton-XIOO, 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl) inkubiert. Anschliessend werden die Träger mit dem Antikörperkonjugat in einer 1:1500 Verdünnung in Puffer A inkubiert und dreimal für 20 min in 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl gewaschen. Die Träger werden dann für 5 min in 100 mM Tris- HCl (pH 9.5), 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2 gewaschen und für 48 Stun- den in einer Lösung aus 0.34 mg/ml Nitroblautetrazoliumsalz und 0.175 mg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphattoluidiniumsalz in 100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 100 mM NaCl und 50 mM MgCl2 inkubiert. Die Farbreaktion wird mit 10 mM Tris-HCl (pH 8) , ImM EDTA gestoppt und die Schnitte unter leichten Schütteln in 95% Ethanol, dann mit einer Ethanol-Verdünnungsreihe und abschliessend mit sterilem Wasser gewaschen bevor sie mit Euparal (BDH) gefestigt werden. Anschliessend wird das Gewebe unter einem geeigneten Mikroskop (z.B. Leica DMRB) mit Kamera dokumentiert.
Beispiel 4 : Klonierung des AtMYBll Promotors
Um den vollständigen AtMYBll Promoter zu isolieren, wird genomische 'DNA aus Arabidopsis thaliana (Ökotyp Columbia) extrahiert wie beschrieben (Galbiati M et al . Funct. Integr Genomics 2000, 1:25-34). Die isolierte DNA wird als Matrizen-DNA in einer PCR unter Verwendung folgender Primer eingesetzt:
Vorwärts-Primer: 5 ' -AAGCTTTTGATTTTACAATGAGG-3 ' (SEQ ID NO: 11)
Rückwärts-Primer: 5 ' -CCCGGGAAAATCACTCACTTCACT-3 ' (SEQ ID NO: 12)
Die Amplifikation wird wie folgt durchgeführt:
80 ng genomische DNA I X Expand™ Long Template PCR Puffer 1
2.5 mM MgCl2, je 350 μM von dATP, dCTP, dGTP und dTTP je 300 nM eines jeden Primers -(SEQ ID NO: 11 und 12)
2.5 Units Expand™ Long Template Poly erase (Röche Diagno- stics) . in einem Endvolumen von 25 μl .
Folgendes Temperaturprogramm wird verwendet (PTC-100TM Modell 96V; MJ Research, Inc., Watertown, Massachussetts) :
1 Zyklus mit 120 sec bei 94°C
35 Zyklen mit 94°C für 10 sec, 55°C für 30 sec und 68°C für 3 min. 1 Zyklus mit 68°C für 30 min Das PCR-Produkt wird in den Vektor pCR4-T0P0 (Invitrogen) nach Herstellerangaben kloniert d.h. das erhaltene PCR-Produkt wird mittels seiner A-Überhänge und einer Topoisomerase in einen Vektor mit T-Überhängen eingefügt. Das erhaltene Konstrukt ist 5 pCR4-T0P0-mybll (Fig.7, I) .
Beispiel 5 : Deletionsanalyse
Das Verfahren ist von Rouster (Rouster J et al . , Plant Journal 10 11(3): 513-23, 1997) und Sambrook (Sambrook et al . , Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) beschrieben.
Eine Feinkartierung des mybll Promotors, d.h. eine Einengung der 15 für seine Spezität relevanten Nukleinsäureabschnitte, erfolgt durch Herstellung verschiedenen Reportergen-Expressionsvektoren, die zum einen den gesamten Promotorbereich, zum anderen verschiedene Fragmente desselben enthalten. Kloniert wird einerseits die gesamte Promotorregion bzw. Fragmente davon in den pGPTV-GUS-Kan 0 Vektor (Becker D et al . , 1992 Plant Mol Biol 20: 1195-1197). Dafür werden einerseits Fragmente eingesetzt, die durch die Verwendung von Restriktionsenzymen für die internen Restriktionsschnittstellen in der Volllängen-Promotorsequenz erhalten werden. Andererseits werden PCR-Fragmente eingesetzt, die mit durch Pri- 5 mer eingeführte Schnittstellen versehen sind.
Für die Klonierung des Volllängen-Promotors wird der Vektor pCR4-T0P0-mybll mit Hindlll und Smal verdaut und das aus einem l%igen Agarose-Gel isolierte Fragment in den pGPTV-GUS-Kan klo- 0 niert. Das erhaltene Konstrukt wird mit pGPTV-mybll : : GUS bezeichnet (Fig.7, Konstrukt II).
Für einen ersten verkürzten Promotor wird pCR4-T0P0-mybll mit EcoRI verdaut und das aus einem l%igen Agarosegel isolierte, 5 ca.2050 Basenpaare große Fragment in pBluescript SK (Stratagene) subkloniert . Das Insert wird aus dem entstandenen Vektor pBSK- ybll (Fig.9, Konstrukt IX) durch Verdau mit HindiII und Smal gewonnen, über ein l%iges Agarosegel isoliert und in pGPTV-GUS-Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung 0 pGPTVl-mybll :: GUS (Fig. 7, Konstrukt III).
Für einen zweiten verkürzten Promotor wird pBSK-mybll mit EcoRV und Ncol verdaut. Überhängende Enden werden mit T4 DNA Polymerase abgedaut und das Plasmid wird mit glatten Enden religiert (wie 5 beschrieben in Sambrook et al . , Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), um pBM- ybll (Fig.9, Konstrukt X) zu erhalten. Das ver- kürzte Insert wird aus dem Vektor pBM-mybll durch Verdau mit Hin- dlll und Smal gewonnen, über ein l%iges Agarose-Gel isoliert und in pGPTV-GUS-Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung pGPTV2-mybll :: GUS (Fig. 7, Konstrukt IV).
Für einen dritten verkürzten Promotor wird pCR4-T0P0-mybll als Matrize für eine PCR eingesetzt. Die Schnittstellen Hindlll und Smal werden über die folgenden Primer eingeführt
Vorwärtsprimer 5 ' -AAGCTTAACCAATCAGGATTAAG-3 ' ( SEQ JD O : 13) und
Rückwärtsprimer 5 ' -CCCGGGAAAATCACTCACTTCACT-3 ' (SEQ ID NO: 12).
Das Fragment wird aus einem 1.5%igen Agarosegel isoliert und wiederum in pGPTV-GUS-Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung pGPTV3-mybll :: GUS (Fig. 8, Konstrukt V).
Für einen vierten verkürzten Promotor wird pCR4-T0P0-mybll als Matrize für eine PCR eingesetzt. Die Schnittstellen Hindlll und Sall werden über die folgenden Primer eingeführt
Vorwärtsprimer 5'- AAGCTTGCATTATGGATTTTGTA-3 ' (SEQ ID NO: 14) und
Rückwärtsprimer 5 ' -GTCGACAAAATCACTCACTTCACT-3 ' (SEQ ID O: 4).
Das Fragment wird aus einem 1.5%igen Agarosegel isoliert und wiederum in pGPTV-GUS-Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung • GPTV4-mybll : :GUS-Kan (Fig. 8, Konstrukt VI).
Für einen fünften verkürzten Promotor wird pCR4-T0P0-mybll als Matrize für eine PCR eingesetzt. Die Schnittstellen Hindlll und Xbal werden über die folgenden Primer eingeführt
Vorwärtsprimer 5 ' -AAGCTTTGGACAATCATGTCATA-3 ' . ( SEQ ID O: 5) und
Rückwärtsprimer 5 ' -TCTAGAAAAATCACTCACTTCACT-3 ' (SEQ ID NO: 6).
Das Fragment wird aus einem 1.5%igen Agarosegel isoliert und wiederum in pGPTV-GUS-Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung pGPTV5-mybll : :GUS-Kan (Fig. 8, Konstrukt VII).
Für einen sechsten verkürzten Promotor wird pCR4-T0P0-mybll als Matrize für eine PCR eingesetzt. Die Schnittstellen Hindlll und Xbal werden über die folgenden Primer eingeführt.
Vorwärtsprimer 5 ' -AAGCTTCTAATTAGAGACACTAGG-3 ' (SEQ ID NO : 7) und Rückwärtsprimer 5'- TCTAGAAAAATCACTCACTTCACT-3 ' (SEQ ID NO: 6).
Das Fragment wird aus einem 1.5%igen Agarosegel isoliert und wiederum in pGPTV-GUS-Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung pGPTV6-mybll : :GUS-Kan (Fig. 8, Konstrukt VIII).
Beispiel 6 : Transformation und Regeneration transgener Arabidopsis thaliana (Columbia) Pflanzen
Zur Herstellung transgener Arabidopsis Pflanzen wird i-grrojbacte- rium tumefaciens (Stamm C58C1 pGV2260) mit verschiedenen mybll Promoter-GUS Vektorkonstrukten transformiert. Die Agrobakterien- stämme werden anschliessend zur Herstellung transgener Pflanzen verwendet. Dazu wird eine einzelne transformierte Agrobakterium- Kolonie in einer 4 ml Kultur (Medium: YEB-Medium mit 50 μg/ml
Kanamycin und 25 μg/ml Rifampicin) über Nacht bei 28°C inkubiert. Mit dieser Kultur wird anschliessend eine 400 ml Kultur in dem- selben Medium angeimpft, über Nacht inkubiert (28 °C, 220 U/min) und abzentrifugiert (GSA-Rotor, 8.000 U/min, 20 min). Das Pellet wird in Infiltrationsmedium (.1/2 MS-Medium; 0,5g/l MES, pH 5,8; 50 g/1 Saccharose) resuspendiert. Die Suspension wird in eine Pflanzenbox (Duchefa) eingebracht und 100 ml SILVET L-77 (mit Polyalkylenoxid modifiziertes Heptamethyltrisiloxan; Osi Special- ties Inc., Cat . P030196) wurde zu einer Endkonzentration von 0.02% hinzugegeben. Die Pflanzenbox mit 8 bis 12 Pflanzen wird in einem Exikator für 10 bis 15 Minuten einem Vakuum mit anschlies- sender spontaner Belüftung ausgesetzt. Dies wird 2 bis 3 Mal wiederholt. Hernach werden alle Pflanzen in Pflanztöpfe mit Feuchterde gepflanzt und unter Langtagbedingungen gezüchtet ( agestem- peratur 22 bis 24°C, Nachtemperatur 19°C; 65% relative Luftfeuchte) . Nach 6 Wochen werden die Samen geerntet.
Alternativ können transgene Arabidopsis Pflanzen durch Wurzeltransformation erhalten werden. Weisse Wurzelsprossen von maximal 8 Wochen alten Pflanzen werden verwendet. Dazu werden Pflanzen, die unter sterilen Bedingungen in 1 MS-Medium (1 % Saccharose; 100mg/l Inositol; l,0mg/l Thiamin; 0,5 mg/1 Pyridoxin; 0,5 mg/1 - Nicotinsäure; 0,5 g MES, pH 5 , 7 ; 0,8 % Agar) gehalten werden, verwendet. Wurzeln werden auf Kailus-induzierendem Medium für 3 Tage kultiviert (Ix Gambourg's B5 Medium; 2% Glukose; 0,5 g/1
Mercaptoethanol ; 0,8% Agar; 0,5 -mg/1 2 , 4-D (2 , 4-Dichlorphenoxyes- sigsäure) ; 0,05 mg/1 Kinetin) . 0,5 cm lange Wurzelabschnitte werden in 10 bis 20 ml Kallus-induzierendes Flüssigmedium überführt (Zusammensetzung wie oben beschrieben, jedoch ohne Agarzusatz) und mit 1 ml der oben beschriebenen Ubernacht-Agrobakterienkultur (gewachsen bei 28°C, 200 U/min in LB) angeimpft und für 2 min geschüttelt . Die Wurzelexplantate werden nach Entfernen von über- schüssigem Medium durch Abtropfen in Kallus-induzierendes Medium mit Agar überführt, anschliessend in Kallus-induzierendes Flüssigmedium ohne Agar (mit 500mg/l Betabactyl, SmithKline Beecham Pharma GmbH, München) unter Schütteln inkubiert und abschliessend in Spross-induzierendes Medium (5 mg/1 2-Isopentenyl-Adenin-Phosphat; 0,15 mg/1 Indol-3-Essigsäure; 50 mg/1 Kanamycin; 500mg/l Betabactyl) überführt. Nach 5 Wochen und 1 bis 2 maligem Mediumswechsel werden die kleinen, grünen Sprösslinge auf Keimungsmedium (1 MS-medium; 1 % Saccharose; 100mg/1 Inositol; l,0mg/l Thiamin; 0,5 mg/1 Pyridoxin; 0,5 mg/1 Nicotinsäure; 0,5 g MES, pH 5 , 7 ; 0,8 % Agar) gesetzt und zu Pflanzen regeneriert.
Beispiel 7: Nachweis der gewebespezifischen Expression
Um die Eigenschaften des Promotors zu bestimmen und die essentiellen Elemente desselben, die seine Gewebespezifität ausmachen, zu identifizieren, ist es erforderlich, den Promotor selbst und verschiedene Fragmente desselben vor ein sogenanntes Reportergen zu setzen, das eine Bestimmung der Expressionsaktivität ermög- licht. Beispielhaft sei die bakterielle ß-Glucuronidase genannt (Jefferson et al . , EMBO J. 1987, 6, 3901-3907). Die ß-Glucuroni-. dase Aktivität kann in-planta mittels eines chromogenen Substrates wie 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-ß-D-Glucuronsäure im Rahmen einer Aktivitätsfärbung bestimmt werden (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 387-405). Für die Untersuchungen der Gewebespezifität wird das pflanzliche Gewebe geschnitten, eingebettet, gefärbt und analysiert wie beschrieben (z.B. Bäumlein H et al., 1991 Mol Gen Genet 225: 121-128).
Für die quantitative Aktivitätsbestimmung wird als Substrat für die ß-Glucuronidase MUG (Methylumbelliferylglucuronid) verwendet, das in MU (Methylumbelliferon) und Glucuronsäure gespalten wird. Unter alkalischen Bedingungen kann diese Spaltung quantitativ fluorometrisch verfolgt werden (Anregung bei 365 nm, Messung der Emission bei 455 nm;SpectroFluorimeter BMG Polarstar+) wie beschrieben in Bustos M.M. et al . , 1989 Plant Cell 1:839-853.

Claims

Patentansprüche
1. Expressionskassette zur transgenen Expression von Nukleinsäu- ren enthaltend
a) den Promotor des mybll Gens aus Arabidopsis thaliana gemäss SEQ ID NO: 1, oder
b) funktionelle Äquivalente oder äquivalente Fragmente von a) , die im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie a) besitzen,
wobei a) oder b) funktionell mit einer transgen zu exprimie- renden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.
2. Expressionskassette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
a) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen funktionell verknüpft ist, oder
b) die Expressionskassette zusätzliche Funktionselemente enthält, oder
c) a) und b) gegeben sind.
3. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 oder 2, da- durch gekennzeichnet, dass die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz
a) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierten Proteins , oder
b) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierter sense oder anti-sense-RNA ermöglicht.
Zeichn.-
4. Expressionskassette nach den Ansprüchen 1 bis 3 , wobei die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus Nukleinsäuren kodierend für Aminosäuretransporter, Sac- charidtransporter, Chalconsynthasen, Photolyasen, Photorezep- toren, Phytasen, Lipasen, Triacylglycerol-Lipasen, Acetyl-CoA Carboxylasen, Endochitinasen, das N-hydroxylierende, multi— funktionelle Cytochrom P-450, den transkriptioneilen Aktivator CBFl, Invertasen, das 2S Albumin aus Bertholletia ex- celsa, Endoxyl.glucantransferasen,' Phytoendesaturasen, das ABI3-Protein, das VP-1 Protein, "antifreeze"-Proteinen, Glu- tamatdehydrogenasen, einem späten Embryogenesegen (LEA) , Cal- . cium-abhängigen Proteinkinasen, Calcineurinen, Farnesyltrans- ferasen, Ferritin, Oxalatoxidase, DREBlA-Faktor, Trehalose- phosphatsynthase , Trehal sephosphatphosphatase, Trehalase, Cellulasen, Chitinasen, Glucanasen, Ribosom-inaktivierende
Proteine, Lysozyme, Bacillus thuringiensis Endotoxin, a-Amy- laseinhibitor, Proteaseinhibitoren, Lektine, RMAasen, Ribo- zyme, Fettsäuredesaturasen, Fettsäureelongasen, Coffeinsäure- O-methyltransferase, Cinnamoylalkoholdehydrogenase, ANT-Gen.
5. Expressionskassette nach den Ansprüchen 1 bis '4, wobei die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukleinsäurensequenzen mit den Genbank Accession-Nummern X92657, M20308, .AJ002399, BAB00748, A19451, U62549, U4Ö256, AB039325, L25042, S78423, U32624, U77378, V01311, AB044391, AF163819, X78815, AF306348, M60214, X68141, AJ222980, AF078796.-
6. Vektoren enthaltend eine Expressionskassette gemäss den An- Sprüchen 1 bis 5.
7. Transgener Organismus transformiert mit einer Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 oder einem Vekor gemäß Anspruch 6.
8. Transgener Organismus nach Anspruch 7 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien,- Hefen, Pilzen, tierischen und pflanzlichen Organismen
9. Zellkulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut abgeleitet von einem transgenen Organismus nach den Ansprüchen 7 oder 8.
10. Verwendung eines transgenen Organismus nach einem der Ansprüche 7 bis 8 oder von diesem abgeleitete Zellkulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut nach Anspruch 9 zur Herstel- lung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
11. Verfahren zur Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemika- lien in transgenen Organismen nach einem der Ansprüche 7 oder
8 oder von diesen abgeleiteten Zellkulturen, Teilen oder transgenen Vermehrungsgut nach Anspruch 9 , dadurch gekennzeichnet, dass der transgene Organismus gezüchtet und das gewünschte Pharmakon oder die gewünschte Feinchemikalie iso- liert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Feinchemikalien Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, natürlicher oder synthetische Geschmacks-, Aroma- oder Farbstoffe sind.
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