[go: up one dir, main page]

DE10127882A1 - Expressionskonstrukte zur transgenen Expression von Nukleinsäuren - Google Patents

Expressionskonstrukte zur transgenen Expression von Nukleinsäuren

Info

Publication number
DE10127882A1
DE10127882A1 DE2001127882 DE10127882A DE10127882A1 DE 10127882 A1 DE10127882 A1 DE 10127882A1 DE 2001127882 DE2001127882 DE 2001127882 DE 10127882 A DE10127882 A DE 10127882A DE 10127882 A1 DE10127882 A1 DE 10127882A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
gene
expression
nucleic acid
promoter
transgenic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE2001127882
Other languages
English (en)
Inventor
Friedrich Bischoff
Ivo Feusner
Linda Patricia Loyall
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Plant Science GmbH
Original Assignee
BASF Plant Science GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF Plant Science GmbH filed Critical BASF Plant Science GmbH
Priority to DE2001127882 priority Critical patent/DE10127882A1/de
Publication of DE10127882A1 publication Critical patent/DE10127882A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft Expressionskonstrukte und Vektoren, die pflanzliche Promotoren mit einer Expressionsspezifität für Keimblätter und/oder weitere pflanzliche embryonale Gewebe enthalten, sowie deren Verwendung zur transgenen Expression von Nukleinsäuresequenzen in Organismen, bevorzugt in Pflanzen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskonstrukte oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

Description

Die Erfindung betrifft Expressionskonstrukte und Vektoren, die pflanzliche Promotoren mit einer Expressionsspezifität für Keimblätter und/oder weitere pflanzliche embryonale Gewebe enthalten, sowie die Verwendung dieser Expressionskonstrukte oder Vektoren zur transgenen Expression von Nukleinsäuresequenzen in Organismen, bevorzugt in Pflanzen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskonstrukten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder Ver­ mehrungsgut, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Fein­ chemikalien.
Verschiedene Methoden zum Einschleusen von Genen in das Genom von Pflanzen sind bekannt (Halford NG, Shewry PR, Br Med Bull 2000; 56 (1): 62-73). Ziel ist die Herstellung von Pflanzen mit vorteil­ haften, neuen Eigenschaften zum Beispiel zur Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität, zur Qualitätssteigerung bei Nahrungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika (Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec No: 487-96). Oft sind die natürlichen Abwehrmechanismen der Pflanze zum Bei­ spiel gegen Pathogene unzureichend. Die Einführung fremder Gene aus Pflanzen, Tieren oder mikrobiellen Quellen kann die Abwehr verstärken. Beispiele sind der Schutz gegen Insektenfrass in Tabak durch Expression des Bacillus thuringiensis Endotoxin unter Kontrolle des 35 S CaMV Promotors (Vaeck et al. (1987) Nature 328: 33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expression einer Chitinase aus der Bohne unter Kontrolle des CaMV Promotors (Broglie et al. (1991) Science 254; 1194-1197). Ferner kann durch die Einführung fremder Gene eine Herbizid­ resistenz erzielt werden, was die Anbaubedingungen optimiert und Ernteverluste verringert (Ott KH et al. (1996) J Mol Biol 263 (2): 359-368). Auch kann die Qualität der Erzeugnisse ver­ bessert werden. So kann die Haltbarkeit und Lagerfähigkeit von Ernteerzeugnissen zum Beispiel durch Inaktivierung bestimmter Reifungsgene erhöht werden. Gezeigt wurde dies zum Beispiel an der Tomate durch Inaktivierung der Polygalacturonase (Hamilton AJ et al. (1995) Curr Top Microbiol Immunol 197: 77-89).
Eine Grundvoraussetzung für die transgene Expression bestimmter Gene in Pflanzen ist die Bereitstellung pflanzenspezifischer Promotoren. Verschiedene pflanzliche Promotoren sind bekannt.
Bekannt sind zum Beispiel konstitutive Promotoren wie der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppel­ promotor oder der Promotor des 35S-Transkriptes des Blumenkohl­ mosaikvirüs (CaMV) (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812), der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Callis et al. (1990) J Biol Chem 265: 12486-12493), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991). Nachteilig bei diesen Promotoren ist, dass sie in fast allen Geweben der Pflanze konstitutiv aktiv sind. Eine gezielte Expression von Genen in bestimmten Pflanzenteilen oder zu bestimmten Ent­ wicklungszeitpunkten ist mit diesen Promotoren nicht möglich.
Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen sind beschrieben. Die Stringenz der Spezifität, als auch die Expressionsaktivität dieser Promotoren ist sehr unterschiedlich. Zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten, wie der Promotor der zytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8: 2445-2245).
Weitere Promotoren sind beispielsweise Promotoren mit Spezifität für Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel, der Promotor der Stärke Synthase (GBSS1) oder der Sporamin Promotor, fruchtspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtspezifische Promotor aus Tomate (EP-A 409625), fruchtreifungspezifische Promotoren, wie bei­ spielsweise der fruchtreifungspezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794), blütenspezifische Promotoren, wie beispielsweise der Phytoen-Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).
Ein entwicklungsabhängig regulierter Promotors ist unter anderem bei Baerson et al. beschrieben (Baerson SR, Lamppa GK (1993) Plant Mol Biol 22(2): 255-67).
Es sind Promotoren beschrieben mit Gewebespezifität für das Mesophyll und die Pallisadenzellen in Blättern (Broglie et al. (1984) Science 234: 838-845), den sich teilenden Spross und das Wurzelmeristem (Atanassova et al. (1992) Plant J 2: 291-300), Pollen (Guerrero et al. (1990) Mol Gen Genet 224: 161-168), Samen­ endosperm (Stalberg et al. (1993) Plant Mol Biol 23: 671-683), Wurzelepidermis (Suzuki et al. (1993) Plant Mol Biol 21: 109-119), sowie für das Wurzelmeristem, Wurzelgefäßgewebe und Wurzel­ knötchen (Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2: 633-641).
Bekannt sind ferner Promotoren, die eine Expression in Samen und pflanzlichen Embryonen steuern. Samenspezifische Promotoren sind zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200, Bustos mm et al. (1989) Plant Cell 1 (9): 839-53), des 25 Albumingens (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215 (2): 326-331), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al. (1991) Molecular & General Genetics 225 (3): 459-67) des Napin Gens (Stalberg K, et al. (1996) Planta 199: 515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der LeB4-Promotor (Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128). Diese steuern eine samenspezifische Expression von Speicherproteinen.
Die eingeschränkte Zelltypspezifität der sogenannten "samen­ spezifischen Promotoren" ist aus der Literatur für die oben genannten Promotoren bekannt: Unter Verwendung eines USP Promotor-GUS Fusionskonstruktes wurde eine Nebenaktivität des USP Promotors in keimenden Sämlingen von Arabidopsis gefunden, insbesondere in den Kotyledonen und in der Wurzel mit abnehmender Intensität in Richtung der Wurzelspitze. Weitere Nebenaktivitäten wurden in den Wurzelhaaren, den Gefäßbündeln, den Mesophyllzellen und den epidermalen Zellen des Cotyledons und des Hypocotyl gefunden (Bäumlein et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 459-467). In späteren Stadien der Entwicklung (2 Wochen) wurden Neben­ aktivitäten in den Gefäßbündeln der Wurzeln mit der höchsten Aktivität in den Wurzelhaubenzellen und dem Wurzelmeristem. Dies bedeutet, dass diese Aktivität Konsequenz einer de novo Synthese und nicht Folge einer Restaktivität von während der Embryogenese exprimierter β-Glucoronidase Aktivität ist (Bäumlein et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 459-4671). Ähnliche Nebenaktivitäten wurden bei Studien mit dem USP-Promotor in Tabak gefunden. Weitere, detaillierte Untersuchungen der USP-Promotoraktivität in Arabi­ dopsis zeigten darüberhinaus Nebenaktivitäten im Pollen und den Blütenorganen. In transgenen Tabak und Arabidopsis Pflanzen, die ein Legumin B4 Promotor-GUS Fusionskonstrukt enthielten, wurde eine Anfärbung der Endospermzellen in Nachbarschaft zum Embryo gefunden (Bäumlein et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128).
Für den USP und Legumin B4 Promotor wurde eine Nebenaktivität im Pollen beobachtet. Bezüglich ein weiterer, samenspezifischer Promotor namens DC3 wurde eine Induzierbarkeit durch exogene Abscisinsäure (ABA) und Wassermangel in allen Organen eines entsprechenden transgenen Tabakpflanze berichtet (Vivekananda et al. (1992) Plant Physiol 100: 576-581).
Eine Promotoraktivität mit einer Spezifität für bestimmte Zellen innerhalb des Samens ist lediglich für die Samenhülle beschrieben worden: Ein kryptischer Promotor mit Spezifität für die Samen­ hülle wurde durch "T-DNA tagging" in Tabak identifiziert (Fobert PR et al. (1994) Plant Journal 6 (4): 567-77; US 5,824,863; WO 99/53067). Kryptische Promotoren oder Pseudopromotoren sind an sich inaktive Sequenzen innerhalb des Genoms, die jedoch eine expressionregulierende Funktionalität bekommen, wenn sie in der Nähe von Genen positioniert werden.
Die im Stand der Technik beschriebenen, sogenannten "samen­ spezifischen" Promotoren weisen einen oder mehr der nachfolgenden Nachteile auf:
  • 1. Mangelhafte Samenspezifität:
    Die oben erwähnte Nebenaktivität der bekannten, sogenannten "samenspezifischen" Promotoren in anderen Pflanzenorganen ist unvorteilhaft, da auch dort die Expression heterogener Nukleinsäuren bzw. Proteine erfolgen kann. Dies kann sich nachteilig auf das Pflanzenwachstum oder den Pflanzenwert auswirken, kann aber auch unvorteilhafte Auswirkungen auf die Umwelt haben. So hatte eine unspezifische Expression von Bacillus thuringiensis Endotoxinen nicht nur den gewünschten Effekt auf Fraßinsekten durch Expression in der Wurzel, sondern auch infolge einer Expression im Pollen bedeutende Schäden im Bestand des Monarchfalters zur Folge, der den Pollen als Hauptnahrungsquelle nutzt (Losey JE et al. (1999) Nature 399, 214).
  • 2. Mangelhaftes Zeitprofil:
    Die im Stand der Technik bekannten sogenannten "samen­ spezifischen" Promotoren zeigen oft einen zu späten Beginn ihrer Aktivität und/oder eine anhaltende Aktivität in die Keimungsphase hinein. Damit können in der frühen Phase der Embryogenese keine wünschenswerten Effekte erzielt werden, was gerade hier - aufgrund der Empfindlichkeit des Embryos gegen biotische und ablotische Stressfaktoren - vorteilhaft wäre. Eine frühzeitig während der Samenentwicklung einset­ zende Promotoraktivität kann vorteilhaft sein, nicht hingegen eine Nebenaktivität in bereits keimenden Sämlingen, was zu einer Störung der Keimung führen könnte.
  • 3. Mangelnde Homogenität der Expression im Samen:
    Wie oben erwähnt ist die Expressionsaktivität vieler im Stand der Technik bekannter, sogenannter "samenspezifischer" Promotoren nicht homogen über den Keimling verteilt, sondern weist Gradienten innerhalb desselben oder Präferenzen für einzelne Zelltypen auf. Damit kann eine unter dem Promotor exprimierte Nukleinsäure oder Protein seinen potentiellen, vorteilhaften Effekt nicht auf den gesamten Samen gleichmäßig ausüben, was ggf. zu Effizienzverlusten führen kann.
  • 4. Mangelnde Anwendbarkeit auf viele Pflanzenarten:
    Die im Stand der Technik beschriebenen sogenannten "samen­ spezifischen" Promotoren sind oft nicht in allen Arten aktiv. So weist der Napin-Promotor beispielsweise keine Aktivität in Lein auf (Hjördis Voss (2000) Versuche zur gentechnologischen Modifizierung von Triacylglycerolen durch Expression hetero­ loger Lipoxygenasen in transgenem Lein. Dissertation, Fach­ bereich Biologie der Universität Hamburg).
Für die Anwendung eines samenspezifischen Promotors in der Land­ wirtschaft und Pflanzenforschung sind nachfolgende Eigenschaften wünschenswert:
  • 1. Das Expressionsprofil des Promotors sollte zu einem definierten Zeitpunkt beginnen und vor der Keimung enden. Dies ist insbesondere für Genaktivitäten relevant, die eine Anreicherung von Speicherproteinen oder -verbindungen bewirken sollen.
  • 2. Eine uniforme Expression innerhalb des Embryos ist wünschens­ wert, um eine optimale Nutzung des exprimierten Merkmals ("Trait") zu gewährleisten, wohingegen eine Nebenaktivität im Endosperm nicht erwünscht ist.
  • 3. Alternativ kann eine auf ein embryonales Organ (wie z. B. die Kotyledonen) beschränkte Promotoraktivität für Anwendungen vorteilhaft sein, bei denen eine Kompartimentierung erstrebenswert ist.
  • 4. Nebenaktivitäten eines Promotors im Pollen sind nicht wünschenswert, zum Beispiel um Umweltschäden zu vermeiden (wie bei der Schädigung des Monarchfalterbestandes durch Bt-Toxin exprimierende Pflanzen geschehen; s. o.).
Trotz der Vielzahl bekannter pflanzlicher Promotoren, wurde bislang kein Promotor mit den oben aufgezählten gewünschten Eigenschaften beschrieben. Insbesondere ist kein Promotor mit Spezifität für die Keimblätter (Kotyledonen) des pflanzlichen Embryos bekannt. Auch sind keine samenspezifischen Promotoren bekannt, die eine sehr frühe Expression im Samenembryo verleihen und gleichzeitig keine unerwünschten Nebenaktivitäten wie im Pollen aufweisen.
Es bestand daher die Aufgabe, entsprechende Promotoren zu identifizieren.
Diese Aufgabe wurde durch Bereitstellung von Expressions­ konstrukten basierend auf dem Promotor des LOX5 Gens aus Arabidopsis thaliana (infolge AtLOX5) gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 gelöst. Der Promotor des AtLOX5-Gens hat eine expressions­ regulierende Spezifität mit nachfolgenden bislang in dieser Kombination nicht beschriebenen vorteilhaften Eigenschaften:
  • 1. Eine früh einsetzende, sehr starke Expressionsaktivität im Embryo, vor allem in den Keimblättern.
    Vorteile:
    • - Der pflanzliche Embryo ist vor allem in den ersten Tagen der Embryogenese besonders anfällig gegen biotische und ablotische Stressfaktoren. Durch seine früh ein­ setzende Promotoraktivität bieten die erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte die Möglichkeit, durch eine gezielte Expression nachfolgend beschriebener Nuklein­ säuren bzw. Proteine einen Schutz gegen diese Stress­ faktoren aufzubauen bzw. Schäden zu kompensieren.
    • - Die Keimblätter des Samenembryos sind das Hauptspeicher­ organ und eine starke Expression dort ist besonders wünschenswert und vorteilhaft, da so beispielsweise der Nährwert eines als Nahrungs- bzw. Futtermittel ver­ wendeten Samens (z. B. eines Getreides) gezielt gesteigert oder modifiziert werden kann.
  • 2. Homogene Expressionsaktivität innerhalb des Keimblattes.
    Vorteil: Gleichmäßiger Effekt des zu exprimierenden Merkmals ("Trait"), dadurch erhöhte Effizienz und Vermeidung von nach­ teiligen Effekten durch lokale über- bzw. Unterexpression.
  • 3. Eine nicht-detektierbare Nebenaktivität in anderen Pflanzen­ organen insbesondere im Pollen.
    Vorteile: Vermeidung von potentiellen, unvorteilhaften Effekten auf Pflanzenwachstum, -eigenschaften oder -wert bzw. auf die Umwelt.
  • 4. Eine spezifische Wirksamkeit in einer breiten Anzahl von Pflanzenarten.
    Vorteile: Steigerung der Effizienz in der Pflanzen­ biotechnologie durch breite Anwendbarkeit von Expressions­ konstrukten.
Das Genprodukt des AtLOX5 Gens zählt zu der Familie der 9-Lipoxy­ genasen. Eine partielle mRNA ist unter der Accession-No AJ302043 in der GenBAnk hinterlegt (AJ302043: Arabidopsis thaliana partial mRNA for lipoxygenase (LOX5 gene)). Das Gen von AtLOX5 ist bekannt. Seine Sequenz wurde im Rahmen des Arabidopsis thaliana Genomprojektes ermittelt und liegt - eingebettet in einen größeren genomischen Klon (Arabidopsis thaliana genomic DNA, chromosome 3, P1 clone: MCB17, Genbank Acc.-No: AB022215.1), der 83205 Nukleotide umfasst - vor. Die Promotor-Sequenz ein­ schließlich der 5'-untranslatierten Region des AtLOX5-Gen hat eine Länge von 1368 Nukleotiden und umfasst die Basen No. 45985 bis 47352 des obigen genomischen Klons.
Weder die pflanzenphysiologische Bedeutung noch das Expressions­ muster des AtLOX5 Gens oder Proteins sind beschrieben. Bislang ist kein Lipoxygenasepromotor beschrieben oder identifiziert worden, der eine samenspezifische Expression aufweist.
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft daher Expressions­ konstrukte zur transgenen Expression von Nukleinsäuren umfassend
  • a) den Promotor des AtLOX5 Gens gemäß SEQ ID NO: 1, oder
  • b) eine Deletionsvariante des LOX5 Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 2 oder 3, oder
  • c) ein funktionelles Äquivalent oder äquivalentes Fragment von a), das im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie a) besitzt,
wobei a) oder b) funktionell mit einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.
Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur transgenen Expression von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nuklein­ säuresequenz in funktioneller Verknüpfung mit
  • a) dem Promotor des LOXS Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 1, oder
  • b) einer Deletionsvariante des LOX5 Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 2 oder 3, oder
  • c) einem funktionelle Äquivalent oder äquivalente Fragment von a) oder b), das im wesentlichen die gleichen Promotor­ aktivitäten wie a) oder b) besitzt,
transgen exprimiert wird.
Expression umfasst die Transkription der transgen zu exprimieren­ den Nukleinsäuresequenz, kann aber - im Falle eines offenen Lese­ rasters in "sense"-Orientierung - auch die Translation der trans­ kribierten RNA der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in ein korrespondierendes Polypeptid umfassen.
Expressionskassette zur transgenen Expression von Nukleinsäuren oder Verfahren zur transgenen Expression von Nukleinsäuren um­ fasst alle solche durch gentechnische Methoden zustande gekommene Konstruktionen oder Verfahren, in denen sich entweder
  • a) der Promotor des AtLOX5 Gens gemäß SEQ ID NO: 1, eine Deletionsvariante des LOXS Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 2 oder 3, oder ein von ihm abgeleitetes funktionelles Äquivalent oder äquivalente Fragment derselben, oder
  • b) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz, oder
  • c) (a) und (b)
sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung (d. h. an ihrem natürlichen chromosomalen Locus) befinden oder durch gen­ technische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann.
Die erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte, von ihnen abge­ leitete Vektoren oder die erfindungsgemäßen Verfahren können funktionelle Äquivalente zu der unter SEQ ID NO: 1 beschriebenen Sequenz des AtLOX5 Promotors umfassen. Funktionell äquivalente Sequenzen umfassen auch all die Sequenzen, die von dem komple­ mentären Gegenstrang der durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 definierten Sequenz abgeleitet sind und im wesentlichen die gleiche Promotor­ aktivität aufweisen.
Funktionelle Äquivalente in bezug auf den AtLOX5 Promotor meint insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen der unter SEQ ID NO: 1 beschriebenen AtLOX5 Promotorsequenz oder der davon abgeleiteten Deletionsvarianten gemäß SEQ ID NO: 2 und 3 sowie seine Homologen aus anderen Pflanzengattungen und -arten, welche weiterhin im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität auf­ weisen.
Eine Promotoraktivität wird im wesentlichen als gleich bezeich­ net, wenn die Transkription eines beliebigen zu exprimierenden Gens unter Kontrolle eines bestimmten von SEQ ID NO: 1 oder der von den Deletionsvarianten gemäß SEQ ID NO: 2 und 3 abgeleiteten Promotors im Zielkompartiment der Expression (also vor allem in den Keimblättern) stattfindet. Dabei kann die Expressionshöhe sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich zu einem Ver­ gleichswert abweichen. Bevorzugt sind dabei solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unver­ änderten Bedingungen quantitativ um nicht mehr als 50, bevorzugt 25%, besonders bevorzugt 10% von einem Vergleichswert erhalten mit dem durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 beschriebenen Promotor un­ terscheidet. Besonders bevorzugt sind solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um mehr als 50%, bevorzugt 100%, besonders bevorzugt 500%, ganz besonders bevorzugt 1000% einen Vergleichswert erhalten mit dem durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 beschriebenen Promotor übersteigt. Bevorzugt ist als Vergleichs­ wert die Expressionshöhe der natürlichen AtLOX5 mRNA oder des natürlichen AtLOX5 Proteins aus Arabidopsis thaliana. Bevorzugt ist ferner als Vergleichswert die Expressionshöhe erhalten mit einer beliebigen, aber bestimmten Nukleinsäuresequenz, bevorzugt solchen Nukleinsäuresequenzen, die für leicht guantifizierbare Proteine kodieren. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter- Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1): 29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Bio­ techniques. 23 (5): 912-8, 1997), die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 1O: 324-414) oder die β-Galactosidase, ganz besonders bevorzugt ist die β-Glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907).
Ansonsten unveränderte Bedingungen bedeutet, dass die Expression, die durch eine der zu vergleichenden Expressionskonstrukte initiiert wird, nicht durch Kombination mit zusätzlichen genetischen Kontrollsequenzen, zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, modifiziert wird.
Funktionelle Äquivalente umfassen auch solche Promotorvarianten, deren Funktion, verglichen mit dem AtLOX5 Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3, abgeschwächt oder verstärkt ist. Dabei ist die Promotoraktivität mindestens 50% höher, bevorzugt min­ destens 100% höher, besonders bevorzugt mindestens 300% höher, ganz besonders bevorzugt mindestens 500% höher als ein unter ansonsten unveränderten Bedingungen erhaltener Vergleichswert mit dem AtLOX5 Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3. Bevorzugt unterschreitet die Aktivität die des AtLOX5 Promotors gemäß SEQ ID NO: 1 um nicht mehr als 80%, bevorzugt nicht mehr als 50%, besonders bevorzugt nicht mehr als 20%, ganz besonders bevorzugt nicht mehr als 10%.
Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation des AtLOX5 Promotors gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3, erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann die weitere Ein­ grenzung der darin enthaltenen Sequenz oder z. B. auch die Ein­ fügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung überflüssiger DNA oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen, zum Beispiel weiterer regulatorischer Sequenzen, sein.
Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z. B. Transitionen und Transversioneri, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair" Restriktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Über­ hängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymeraseketten­ reaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid- Primer kommen.
Funktionelle Äquivalente, abgeleitet von einer RI-DNA zum Beispiel durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden, haben eine Homologie von mindestens 20%, bevor­ zugt 50%, vorzugsweise mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%, und zeichnen sich durch im wesentlichen gleiche Eigenschaften wie des AtLOX5 Promotor gemäß SEG ID NO: 1, 2 oder 3 aus.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 12
Length Weight: 4
Average Match: 2,912
Average Mismatch: -2,003
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 50% auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO. 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO. 1, 2 oder 3 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 50% aufweist.
Weitere Beispiele für die in den erfindungsgemäßen Expressions­ konstrukte oder Expressionsvektoren zum Einsatz kommenden Promotorsequenzen lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie beispiels­ weise aus Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthium anuus, Linum sativum durch Homologievergleiche aus Datenbanken leicht auffinden.
Funktionelle Äquivalente meint ferner DNA Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit der Nukleinsäuresequenz kodierend für den AtLOX5 Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 oder der zu ihr komplementären Nukleinsäuresequenzen hybridisieren und die im wesentlichen gleichen Eigenschaften haben. Standard­ hybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybridisierungs­ bedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley , N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0.2X SSC bei 50°C bevor­ zugt bei 65°C) (20X SSC: 0,3M Natriumcitrat, 3M NaCl, pH 7,0). Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Para­ meter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegen­ wart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:
  • 1. Hybridisierungbedingungen mit zum Beispiel
    • a) 4X SSC bei 65°C, oder
    • b) 6X SSC, 0,5% SDS, 100 µg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 65°C, oder
    • c) 4X SSC, 50% Formamid, bei 42°C, oder
    • d) 6X SSC, 0,5% SDS, 100 µg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50% Formamid bei 42°C, oder
    • e) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung), oder
    • f) 2X oder 4X SSC, 30 bis 40% Formamid bei 42°C (schwach stringente Bedingung).
  • 2. Waschschritte mit zum Beispiel
    • a) 0,1X SSC bei 65°C, oder
    • b) 0,1X SSC, 0,5% SDS bei 68°C, oder
    • c) 0,1X SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C, oder
    • d) 0,2X SSC, 0,1% SDS bei 42°C, oder
    • e) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung).
Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer funktioneller Äquivalente umfasst bevorzugt die Einführung von Mutationen in den AtLOX5 Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3. Eine Mutagenese kann ungerichtet ("random") erfolgen, wobei die mutagenisierten Sequenzen anschließend bezüglich ihrer Eigenschaften nach einer "trial-by-error" Prozedur durchmustert werden. Besonders vorteil­ hafte Selektionskriterien umfassen beispielsweise die Stabilität der DI-RNA, die Höhe der resultierenden Expression der ein­ geführten Nukleinsäuresequenz oder die Fähigkeit zu Replizieren.
Alternativ können nicht-essentielle Sequenzen des AtLOX5 Promotors deletiert werden ohne die genannten Eigenschaften signifikant zu beeinträchtigen. Derartige Deletionsvarianten stellen funktionell äquivalente Teile des Promoters beschrieben durch SEQ ID NO: 1 dar.
Die Eingrenzung der AtLOX5 Promotorsequenz auf bestimmte, essentielle regulatorische Regionen kann auch mit Hilfe von Suchroutine zur Suche von Promotorelementen vorgenommen werden. Oft sind in den für die Promotoraktivität relevanten Regionen bestimmte Promotorelemente gehäuft vorhanden. Diese Analyse kann beispielsweise mit Computerprogrammen wie dem Programm PLACE ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements") vorgenommen werden (K. Higo et al., (1999) Nucleic Acids Research 27: 1, 297-300).
Beispielsweise umfassen funktionell äquivalente Teile in bezug auf den AtLOX5 Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 die Deletionsvarianten gemäß SEQ ID NO: 2 und 3.
Verfahren zur Mutagenisierung von Nukleinsäuresequenzen sind dem Fachmann bekannt und schließen beispielhaft die Verwendung von Oligonukleotiden mit einer oder mehr Mutationen im Vergleich zu der zu mutierenden Region ein (z. B. im Rahmen einer "Site­ specific mutagenesis"). Typischerweise kommen Primer mit ungefähr 15 bis ungefähr 75 Nukleotiden oder mehr zum Einsatz, wobei bevorzugt ca. 10 bis ca. 25 oder mehr Nukleotidreste an beiden Seiten der zu verändernden Sequenz lokalisiert sind. Details und Durchführung besagter Mutageneseverfahren sind dem Fachmann ge­ läufig (Kunkel et al., Methods Enzymol, 154: 367-382, 1987; Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res 12: 1656; Upender, Raj, Weir (1995) Biotechniques 18 (I): 29-30; US 4,237,224). Eine Mutagenese kann auch durch Behandlung von beispielsweise Vektoren, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten, mit mutagenisierenden Agentien wie Hydroxylamin realisiert werden.
Die in den erfindungsgemäßen Expressionskonstrukten enthaltenen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben dem AtLOX5 Promotor funktionell verknüpft sein.
Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die seguentielle Anordnung des AtLOX5 Promotors, der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäure­ sequenzen zu sense oder anti-sense RNA, erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter ent­ fernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promotor fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Mole­ cular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnitt­ stellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen.
Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu ver­ stehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modi­ fizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte 5'-strom­ aufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nuklein­ säuresequenz den AtLOX5 Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressions­ teuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasser­ stress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266 (26); 17131-17135) und Hitzestress (Schöffl F et al., Mole­ cular & General Genetics 217 (2-3): 246-53, 1989) beschrieben.
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen. Als Pflanzenpromotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage. Vorstellbar ist zum Beispiel, dass eine bestimmte Nukleinsäuresequenz durch einen Promotor (zum Beispiel den AtLOX5 Promotor) in einem Pflanzengewebe als sense-RNA trans­ kribiert und in das entsprechende Protein translatiert wird, während die gleiche Nukleinsäuresequenz durch einen anderen Promotor mit einen anderen Spezifität in einem anderen Gewebe zu anti-sense-RNA transkibiert und das entsprechende Protein herunterreguliert wird. Dieses kann durch eine erfindungs­ gemäße Expressionskassette realisiert werden, indem der eine Promotor vor die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz positioniert wird und der andere Promotor dahinter.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untrans­ latierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3'-Region von Genen, bevorzugt des AtLOX5-Gens. Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Ge­ nexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untrans­ latierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al., Plant J. 1998, 15: 435-440). Umgekehrt unter­ drückt die 5'-untranslatierte Region des opaque-2 Gens die Expression. Eine Deletion der entsprechenden Region führt zu einer Erhöhung der Genaktivität (Lohmer S et al., Plant Cell 1993, 5: 65-73). Die unter SEQ ID NO: 1 angegebene Nukleinsäure­ sequenz enthält den Abschnitt des AtLOX5-Gens, der den Promotor und die 5'-untranslatierte Region bis vor das ATG-Startcodon des AtLOX5 Proteins repräsentiert. Die unter SEQ ID NO: 2 und 3 angegebenen Sequenzen umfassen ebenfalls die 5'-untranslatierte Region bis vor das ATG-Startcodon.
Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteil­ hafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promotor eines bestimmten Gens gegen den AtLOX5 Promotor ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox-Techno­ logie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzier­ bare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirts­ organismus (Sauer B. Methods. 1998; 14 (4): 381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox- Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre- Rekombinase ermöglichen.
Der einzuführende Promotor kann mittels homologer Rekombination vor das transgen zu exprimierende Zielgen plaziert werden, indem der Promotor mit DNA-Sequenzen verknüpft wird, die zum Beispiel zu endogenen Sequenzen homolog sind, die dem Leseraster des Ziel­ gens vorgelagert sind. Derartige Sequenzen sind als genetische Kontrollsequenzen zu verstehen. Nachdem eine Zelle mit dem ent­ sprechenden DNA-Konstrukt transformiert wurde, können die beiden homologen Sequenzen interagieren und so die Promotorsequenz an dem gewünschten Ort vor dem Zielgen platzieren, so dass die Promotorsequenz nun in funktioneller Verknüpfung mit dem Zielgen steht und eine erfindungsgemäße Expressionskassette bildet. Die Auswahl der homologen Sequenzen bestimmt den Insertionsort des Promotors. Hierbei kann die Expressionskassette durch homologe Rekombination mittels einer einfachen oder einer doppelten-rezi­ proken Rekombination generiert werden. Bei der einfach reziproken Rekombination wird nur eine einzelne Rekombinationssequenz ver­ wendet und es erfolgt Insertion der gesamten eingeführten DNA. Bei der doppelt-reziproken Rekombination ist die einzuführende DNA durch zwei homologe Sequenzen flankiert und es erfolgt die Insertion des flankierten Bereiches. Letzteres Verfahren ist geeignet, um wie oben beschrieben den natürlichen Promotor eines bestimmten Gens gegen den AtLOX5 Promotor auszutauschen und so den Expressionsort und -zeitpunkt dieses Gens zu modifizieren.
Die funktionelle Verknüpfung stellt eine erfindungsgemäße Expressionskassette dar.
Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selektionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolg­ reich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).
Homologe Rekombination ist ein relativ seltenes Ereignis in höheren Eukaryoten, vor allem in Pflanzen. Zufällige Integrationen in das Wirtsgenom überwiegen. Eine Möglichkeit die zufällig integrierten Sequenzen zu entfernen und so Zellklone mit einer korrekten homologen Rekombination anzureichern, besteht in der Verwendung eines sequenzspezifischen Rekombinations­ systems wie in US 6,110,736 beschrieben. Dieses besteht aus drei Elementen: zwei Paaren von spezifischen Rekombinationssequenzen und einer sequenzspezifischen Rekombinase. Diese Rekombinase katalysiert eine Rekombination lediglich zwischen den beiden Paaren von spezifischen Rekombinationsequenzen. Das eine Paar dieser spezifischen DNA-Sequenzen wird außerhalb der zu inte­ grierenden DNA-Sequenz, d. h. außerhalb der beiden homologen DNA-Sequenzen lokalisiert. Im Falle einer korrekten homologen Rekombination werden diese Sequenzen nicht mit in das Genom über­ tragen. Im Falle einer zufälligen Integration insertieren sie in der Regel zusammen mit dem Rest des Konstruktes. Unter Einsatz einer speziellen Rekombinase und eines Konstruktes enthaltend ein zweites Paar der spezifischen Sequenzen können die zufällig insertierten Sequenzen herausgeschnitten oder durch Inversion in­ aktiviert werden, während die korrekt über homologe Rekombination insertierten Sequenzen im Genom verbleiben. Eine Vielzahl von sequenzspezifischen Rekombinationssystemen kann verwendet werden, beispielhaft sind das Cre/lox-System des Bacteriophagen P1, das FLP/FRT System der Hefe, die Gin Recombinase des Mu Phagen, die Pin Rekombinase aus E. coli und das R/RS System des pSR1 Plasmids genannt. Bevorzugt sind das Bacteriophagen P1 Cre/lox und das Hefe FLP/FRT System. Hier interagiert die Rekombinase (Cre oder FLP) spezifisch mit ihren jeweiligen Rekombinationssequenzen (34bp lox-Sequenz bzw. 47bp FRT-Sequenz) um die zwischengelager­ ten Sequenzen zu deletieren oder zu invertieren. Das FLP/FRT und cre/lox Rekombinasesystem wurde bereits in pflanzlichen Systemen angewendet (Odell et al., Mol. Gen. Genet., 223: 369-378, 1990).
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octo­ pin-Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)-Termina­ tor.
Die erfindungsgemäßen Expressionskönstrukte und die von ihnen abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten.
Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte oder von diesen abgeleitete Vektoren oder Organismen haben. Beispiel­ haft aber nicht einschränkend seien zu nennen:
  • a) Selektionsmarker sind in der Regel erforderlich, um erfolg­ reich homolog rekombinierte oder transformierte Zellen zu selektionieren. Der mit dem Expressionskonstrukt eingebrachte selektionierbaren Marker verleiht den erfolgreich rekombi­ nierten oder transformierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid wie Phosphinotricin, Glyphosat oder Bromoxynil), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft als Selektionsmarker seien genannt:
    • - DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren, welche die freie Aminogruppe des Glutaminsynthaseinhibitors Phosphinothricin (PPT) acetylierten und damit eine Detoxifizierung des PPT erreicht (de Block et al. 1987, EMBO J. 6, 2513-2518) (auch Bialophos®resistenzgen (bar) genannt)
    • - 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N-(phosphonomethyl)glycin) verleihen,
    • - das für das Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase),
    • - das deh Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon® inaktiviert),
    • - Sulfonylurea- und Imidazolinon inaktivierende Aceto­ lactatsynthasen
    • - bxn Gene, die für Bromoxynil® degardierende Nitrilase­ enzyme kodieren
    • - das Kanamycin- bzw. G418-Resistenzgen (NPTII). Das NPTII Gen codiert für eine Neomycinphosphotransferase, die durch eine Phosphorylierungsreaktion die inhibierende Wirkung von Kanamycin, Neomycin, G418 und Paromomycin reduziert.
    • - das DOGR1-Gen. Das Gen DOGR1 wurde aus der Hefe Saccharo­ myces cerevisiae isoliert (EP 0 807 836). Es codiert für eine 2-Desoxyglukose-6-phosphat Phosphatase, die Resistenz gegenüber 2-DOG verleiht (Randez-Gil et al. 1995, Yeast 11, 1233-1240).
  • b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz, des Expressionsortes oder -zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Gene kodierend für Reporter-Proteine (siehe auch Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1): 29-44) wie
    • - "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23 (5): 912-8, 1997; Sheen et al. (1995) Plant Journal 8 (5): 777-784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94 (6): 2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93 (12): 5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267-271; WO 97/41228).
    • - Chloramphenicoltransferase,
    • - Luziferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414; Ow et al. (1986) Science, 234: 856-859); erlaubt Bioluminescenzdetektion.
    • - β-Galactosidase, kodiert für ein Enzym für das ver­ schiedenen chromogene Substrate zur Verfügung stehen.
    • - β-Glucuronidase (GUS) (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) oder das uidA Gen, das ein Enzym für ver­ schiedene chromogene Substrate kodiert.
    • - R-Locus Genprodukt : Protein, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfsstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht (Dellaporta et al., In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, lBth Stadler Genetics Symposium, 11: 263-282, 1988).
    • - β-Lactamase (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 3737-3741), Enzym für verschiedene chromogene Substrate (z. B. PADAC, eine chromogenes Cephalosporin).
    • - xylE Genprodukt (Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 1101-1105), Catecholdioxygenase, die chromo­ gene Catechole umsetzen kann.
    • - Alpha-Amylase (Ikuta et al. (1990) Bio/technol. 8: 241-242).
    • - Tyrosinase (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129: 2703-2714), Enzym, das Tyrosin zu DOPA und Dopaquinon oxidiert, die infolge das leicht nachweisbare Melanin bilden.
    • - Aequorin (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3): 1259-1268), kann in der Calcium-sensitiven Bioluminescenzdetektion verwendet werden.
  • c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungs­ gemäßen Expressionskonstrukte oder Vektoren in zum Beispiel E. coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • d) Elemente zum Beispiel "Bordersequenzen", die einen Agro­ bakterien-vermittelte Transfer in Pflanzenzellen für die Übertragung und Integration ins Pflanzengenom ermöglichen, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.
  • e) Multiple Klonierungsregionen (MCS) erlauben und erleichtern die Insertion eines oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen. Bezüglich der Nukleinsäurekodierend für die DI-RNA kann die MCS kann theoretisch innerhalb unterschiedlicher Regionen der cDNA liegen. Bevorzugt wird jedoch die Region zwischen dem 1. und 2. Segment der DI-RNA. Dies ist günstig für die Stabilität des Konstruktes.
Die Spezifität der erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte und Vektoren für die Keimblätter bzw. des Embryos als solchen ist besonders vorteilhaft. Die pflanzlichen Keimblätter sind das Hauptspeicherorgan bei z. B. Ölsaatpflanzen und somit bevorzugter Angriffspunkt von Schädlingen aber auch besonders empfindlich gegen Umweltschäden. Bekannt ist die Akkumulation von Glucosino­ laten in Pflanzen der Gattung der Cardales insbesondere der Ölsaaten zum Schutz vor Schädlingen (L. Rask et al.; Plant Molecular biology (2000) 42, 93-113 and R. Menard et al.; Phyto­ chemistry (1999) 52, 29-35). Oft sind die natürlichen Abwehr­ mechanismen der Pflanze zum Beispiel gegen Pathogene unzu­ reichend. Die Einführung fremder Gene aus Pflanzen, Tieren, oder mikrobiellen Quellen kann die Abwehr verstärken. Beispiel sind der Schutz gegen Insektenfrass in Tabak durch Expression des Bacillus thuringiensis Endotoxin unter Kontrolle des 35 S CaMV Promotors (Vaeck et al., Nature 1987, 328, 33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expression einer Chitinase aus der Bohne unter Kontrolle des CaMV Promotors (Broglie et al., Science 1991, 254, 1194-1197).
Für eine hohe Effizienz solcher gentechnischer Ansätze ist eine konzentrierte Expression der entsprechenden transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz vor allem in den Keimblättern bzw. dem gesamten Keimling. Eine konstitutive Expression in der gesamten Pflanze kann den Effekt zum Beispiel durch eine Ver­ dünnung in Frage stellen oder das Wachstum der Pflanze bzw. die Qualität des Pflanzenproduktes beeinträchtigen. Im Falle der Akkumulation von Glucosinolaten zum Schutz vor Freßfeinden kann ein gesteigerter bzw. veränderter Metabolismus in der gesamten Pflanze gravierende Auswirkungen auf die Wüchsigkeit haben (Reintanz B et al. (2001) Plant Cell 13: 351-367). Eine auf die Keimblätter oder den Embryo beschränkte Expression ist hier besonders vorteilhaft, um diese Nebeneffekte gering zu halten.
Außerdem kann es durch eine konstitutive Expression verstärkt zum Abschalten des Transgens kommen ("gene silencing"). Hierzu sind Promotoren mit Spezifität für den Keimling besonders vorteilhaft, Promotoren mit Spezifität für die Keimblätter sind ganz besonders vorteilhaft.
Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Nukleinsäuren bzw. Proteinen bekannt, deren rekombinante Expression in den embryonalen Keim­ blättern vorteilhaft sind. Ferner sind dem Fachmann eine Vielzahl von Genen bekannt, durch deren Reprimierung oder Ausschaltung mittels Expression einer entsprechenden antisense-RNA ebenfalls vorteilhafte Effekte erreicht werden können. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend für vorteilhafte Effekte seien zu nennen:
  • - Erzielen einer Resistenz gegen ablotische Stressfaktoren (Hitze, Kälte, Trockenheit, erhöhte Feuchtigkeit, Umwelt­ gifte, UV-Strahlung)
  • - Erzielen einer Resistenz gegen biotische Stressfaktoren (Pathogene, Viren, Insekten und Krankheiten)
  • - Verbesserung von Nahrungs- oder Futtereigenschaften
  • - Verbesserung der Wachstumsrate oder des Ertrages.
Für die in diesen Anwendungen einsetzbarer Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptide seien beispielhaft aber nicht einschränkend zu nennen:
  • 1. Verbesserter Schutz des pflanzlichen Embryos gegen ablotische Stressfaktoren wie Trockenheit, Hitze, oder Kälte zum Bei­ spiel durch Überexpression von dem "antifreeze polypeptides aus Myoxocephalus Scorpius (WO 00/00512); Myoxocephalus octodecemspinosus, dem Arabidopsis thaliana Transkriptions­ aktivator CBF1, Glutamatdehydrogenasen (WO 97/12983, WO 98/11240), einem späten Embryogenesegen (LEA) zum Beispiel aus Gerste (WO 97/13843), Calcium-abhängigen Proteinkinase­ genen (WO 98/26045), Calcineurinen (WO 99/05902), Farnesyl­ transferasen (WO 99/06580), Pei ZM et al., Science 1998, 282: 287-290), Ferritin (Deak M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 192-196), Oxalatoxidase (WO 99/04013; Dunwell JM Bio­ technology and Genetic Engeneering Reviews 1998, 15: 1-32), DREBIA-Faktor (dehydration response element B 1A; Kasuga M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 276-286), Genen der Mannitol- oder Trehalosesynthese wie der Trehalosephosphat­ synthase oder der Trehalosephosphatphosphatase (WO 97/42326), oder durch Inhibition von Genen wie der Trehalase (WO 97/50561). Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für den transkriptionellen Aktivator CBF1 aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U77378) oder das "antifreeze protein" aus Myoxocephalus octodecemspinosus (GenBank Acc.-No.: AF306348) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
  • 2. Modifikation der Speicherreserven, zum Beispiel Stärke- oder Lipidmodifikation, durch Expression von bestimmten Enzymen zur Initiierung von Fermentationsprozessen nach dem Maischen des Saatgutes. Vorteilhaft ist hier besonders die in dem intakten Saatkorn unterschiedliche Kompartimentierung der Speicherreserven in den Keimblätternund der zu exprimierenden Enzyme im Endosperm, die erst durch einen Prozess wie das Maischen miteinander in Kontakt gebracht werden. Beispiele sind eine verbesserte Mobilisierung der Stärke durch Expression einer Stärkeinvertase aus Hefe oder die Modi­ fikation des Lipidgehaltes durch Expression von Lipasen, bevorzugt von Triacylglycerol-Lipasen. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren die für das tglA Gen der Triacylglycerol- Lipase aus Aspergillus oryzae (GenBank Acc.-No.: AB039325) oder die SUC2 Invertase aus Saccharomyces cerevisiae (GenBank Acc.-No.: V01311) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
  • 3. Expression von Stoffwechselenzymen zur Verwendung im Futter- und Nahrungsmittelbereich, zum Beispiel die Expression von Phytase und Cellulasen. Besonders bevorzugt sind Nuklein­ säuren wie die künstliche für eine mikrobielle Phytase kodierende cDNA (GenBank Acc.-No.: A19451) oder funktionelle Äquivalente derselben.
  • 4. Erreichen einer Resistenz zum Beispiel gegen Pilze, Insekten, Nematoden und Krankheiten durch gezielte Absonderung oder Anreicherung bestimmter Metaboliten oder Proteine in der Epidermis des Embryos. Beispielhaft seien genannt Glucosinolate (Abwehr von Herbivoren), Chitinasen oder Glucanasen und andere Enzyme die die Zellwand von Parasiten zerstören, Ribosom-inaktivierende Proteine (RIPs) und andere Proteine der pflanzlichen Resistenz- und Stressreaktion, wie sie bei Verletzung oder mikrobiellen Befall von Pflanzen oder chemisch durch zum Beispiel Salicylsäure, Jasmonsäure oder Ethylen induziert werden, Lysozyme aus nicht-pflanzlichen Quellen wie zum Beispiel T4 Lysozym oder Lysozm aus ver­ schiedenenen Säugern, insektizide Proteine wie Bacillus thuringiensis Endotoxin, α-Amylaseinhibitor oder Protease­ inhibitoren (cowpea Trypsininhibitor), Glucanasen, Lectine wie Phytohemagglutinin, Schneeglöckchenlectin, Weizenkeim­ agglutinin, RNAsen oder Ribozyme. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die chit42 Endochitinase aus Trichoderma harzianum (GenBank Acc.-No.: 578423) oder für das N-hydroxylierende, multifunktionelle Cytochrom P-450 (CYP79) Proteine aus Sorghum bicolor (GenBank Acc.-No.: U32624) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
  • 5. Erzeugen von konjugierten Fettsäuren, Hydroxyfettsäuren bzw. Peroxiden im Samenöl mit dem Ziel das Öl als Industrie­ rohstoff zum Erhalt dieser Substanzen bzw. zur Weiter­ verarbeitung zu Lacken und Linoleum zum Beispiel durch Expression einer Lipoxygenase. Bevorzugt sind Nukleinsäuren wie die AtLOX5 (Genbank Acc.No. AJ302043) oder eine Lipoxy­ genase aus Gurke (Patent Nr. WO0060093, Genbank Acc.No. X92890).
  • 6. Erreichen von höheren Lipidgehalten durch
    • a) niedrigere Stärkegehalte in Zellen des Keimlings durch Inhibierung von Enzymen des Kohlenhydratstoffwechsels, zum Beispiel durch anti-sense expression der cDNA von ADP-glucose-pyrophosphorylasen oder durch
    • b) veränderte z. B. niedrigere Proteingehalte in Zellen des Keimlings durch Inhibierung von Speicherproteingenen wie cruciferin. Bevorzugt sind Nukleinsäuren wie die ADP­ glucose-phosphorylase aus Brassica napus (WO 9911805, Genbank Acc.No. AJ271162) oder Cruciferin A aus Brassica napus (Genbank Acc.No. X14555)
  • 7. Erreichen einer erhöhten Speicherfähigkeit in Zellen des Keimlings, die normalerweise weniger Speicherproteine oder -lipide enthalten mit dem Ziel, den Ertrag an diesen Substan­ zen zu erhöhen, zum Beispiel durch Expression eine Acetyl-CoA Carboxylase. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Acetyl-CoA Carboxylase (Accase) aus Medicago sativa (GenBank Acc.-No.: L25042) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
  • 8. Expression von Genen, die eine Akkumulation von Fein­ chemikalien, wie von Tocopherolen, Tocotrienolen oder Carotinoiden im Samen bzw. in den Keimblättern bewirken. Beispielhaft sei die Phytoendesaturase genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Phytoendesaturase aus Narcissus pseudonarcissus (GenBank Acc.-No.: X78815) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
  • 9. Verlängern oder Aufheben der Ruhephase durch Expression von Transkriptionsfaktoren, die in die Regulation von Dormanz­ relevanten Genen eingreifen. Beispielhaft sei die Über­ expression des ABI3 Proteins (abscisic acid insensitive gene) oder des Viviparous-1 Protein (VP-1) zu nennen. Die Keimzeit­ veränderung kann eine Ertragserhöhung und eine verkürzte Embryonalentwicklung bedingen. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für das Viviparous-1 Protein aus Zea mays (GenBank Acc.- No.: M60214) oder das ABI3 Protein (abscisic acid insensitive gene) aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: X68141) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
  • 10. Erzeugung von sterilen Pflanzen durch Verhinderung der Befruchtung und/oder der Keimung mit Hilfe cler Expression eines geeigneten Inhibitors zum Beispiel eines Toxins im Samen.
  • 11. Produktion von Neutraceuticals wie zum Beispiel poly­ ungesättigten Fettsäuren wie beispielsweise Arachidonsäure oder EP (Eicosapentaensäure) oder DHA (Docosahexaensäure) durch Expression von Fettsäureelongasen und/oder -desaturasen oder Produktion von Proteinen mit verbessertem Nahrungswert wie zum Beispiel mit einem hohen Anteil an essentiellen Aminosäuren (z. B. das methioninreiche 2S Albumingens der Brasilnuss). Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für das methioninreiche 2S Albumin aus Bertholletia excelsa (GenBank Acc.-No.: AB044391), die Δ6-Acyllipiddesaturase aus Physco­ mitrella patens (GenBank Acc.-No.: AJ222980; Girke et al 1998, The Plant Journal 15: 39-48), die Δ6-Desaturase aus Mortierella alpina (Sakuradani et al 1999 Gene 238: 445-453), die Δ5-Desaturase aus Caenorhabditis elegans (Michaelson et al. 1998, FEBS Letters 439: 215-218), die Δ5-Fettsäure­ desaturase (des-5) aus Caenorhabditis elegans (GenBank Acc.- No.: AF078796), die Δ5-Desaturase aus Mortierella alpina (Michaelson et al. JBC 273: 19055-19059), die Δ6-Elongase aus Caenorhabditis elegans (Beaudoin et al. 2000, PNAS 97: 6421-6426), die Δ6-Elongase aus Physcomitrella patens (Zank et al. 2000, Biochemical Society Transactions 28: 654-657) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
  • 12. Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakzinen wie beschrieben bei Hood EE, Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999 Aug; 10 (4): 382-6; Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol Immunol. 1999; 236: 275-92.
  • 13. Modifikation des Faseranteils in Nahrungsmitteln auf Samenbasis durch zum Beispiel Expression von antisense- Transkripten der Coffeinsäure-O-methyltransferase oder des Cinnamoylalkoholdehydrogenase Gens.
  • 14. Inhibition der Reifung des Keimlings durch Expression von zum Beispiel Ribonukleasegenen oder Transkriptionsfaktoren zum Erzielen einer erhöhten Samengrösse, zur Reduktion der relativen Biomasse der Samenhülle und zur Erleichterung der Enthüllung des Samens. Beispielhaft sei hier eine Über­ expression des ANT (AINTEGUMENTA) Gens genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für das AINTEGUMENTA Gen aus Arabi­ dopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U40256) oder funktionelle Äquivalente desselben kodieren.
Weitere Beispiele für vorteilhafte Gene sind zum Beispiel genannt bei Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No; Seite 487-96.
Ferner können funktionelle Analoga der genannten Nukleinsäuren bzw. Proteine exprimiert werden. Funktionelle Analoga meint hier all die Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche Funktion haben d. h. zu der Funktion (zum Beispiel einer Substratumsetzung oder einer Signaltransduktion) befähigt sind wie auch das beispielhaft genannte Protein. Dabei kann das funktionelle Analogon sich in anderen Merkmalen durchaus unterscheiden. Es kann zum Beispiel eine höhere oder niedrigere Aktivität haben oder auch über weitere Funktionalitäten verfügen.
Funktionelle Analoga meint ferner Sequenzen, dis für Fusions­ proteine bestehend aus einem der bevorzugten Proteine und anderen Proteinen zum Beispiel einem weiteren bevorzugten Protein oder aber auch einer Signalpeptidsequenz kodieren.
Die Expression des Zielgenes ist in jedem gewünschten Zell­ kompartiment, wie z. B. dem Endomembransystem, der Vakuole und den Chloroplasten möglich. Durch Nutzung des sekretorischen Weges sind gewünschte Glykosylierungsreaktionen, besondere Faltungen u. ä. möglich. Auch die Sekretion des Zielproteins zur Zell­ oberfläche bzw. die Sezernierung ins Kulturmedium, beispielsweise bei Nutzung suspensionskultivierter Zellen oder Protoplasten ist möglich. Die dafür notwendigen Targetsequenzen können sowohl in einzelnen Vektorvariationen berücksichtigt werden als auch durch Verwendung einer geeigneten Klonierungsstrategie gemeinsam mit dem zu klonierenden Zielgen in den Vektor mit eingebracht werden. Als Targetsequenzen können sowohl Gen eigene, sofern vorhanden, oder heterologe Sequenzen genutzt werden. Zusätzliche, heterologe zur funktionellen Verknüpfung bevorzugte aber nicht darauf be­ schränkte Sequenzen sind weitere Targeting-Sequenzen zur Gewähr­ leistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten; sowie Translationsverstärker wie die 5'-Leader­ sequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711) und dergleichen. Das Verfahren, an sich nicht in den Plastiden lokalisierte Proteine, gezielt in die Plastiden zu transportieren ist beschrieben (Klosgen RB und Weil JH (1991) Mol Gen Genet 225 (2): 297-304; Van Breusegem F et al. (1998) Plant Mol Biol. 38 (3): 491-496). Bevorzugte Sequenzen sind:
  • a) kleine Untereinheit (SSU) der Ribulosebisphosphatcarboxylase (Rubisco ssu) aus Erbse, Mais, Sonnenblume,
  • b) Transitpeptide abgeleitet von Genen der pflanzlichen Fett­ säurebiosynthese wie das Transitpeptid des plastidären "Acyl Carrier Protein" (ACP), die Stearyl-ACP-Desaturase, β-Keto­ acyl-ACP Synthase oder die Acyl-ACP-Thioesterase,
  • c) das Transitpeptid für GBSSI ("Starch Granule Bound Synthase L"),
  • d) LHCP II Gene.
Die Zielsequenzen können mit anderen, von dem Transitpeptid kodierenden Sequenzen verschiedenen, Targeting-Sequenzen verknüpft sein, um eine subzellulären Lokalisation im Apo­ plasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten zu gewährleisten. Ferner können sowie Translationsverstärker wie die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711) und dergleichen zum Einsatz kommen.
Dem Fachmann ist ferner bekannt, dass er die oben beschriebenen Gene nicht direkt unter Verwendung der für diese Gene kodierenden Nukleinsäuresequenzen exprimieren oder zum Beispiel durch anti­ sense reprimieren muss. Er kann auch zum Beispiel künstliche Transkriptionsfaktoren vom Typ der Zinkfingerproteine verwenden (Beerli RR et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97 (4): 1495-500).
Diese Faktoren lagern sich in den regulatorischen Bereichen der zu exprimierenden oder zu reprimierenden endogenen Gene an und bewirken, je nach Gestaltung des Faktors, eine Expression oder Repression des endogenen Gens.
Die erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte können ebenso zur Unterdrückung bzw. Reduktion von Replikation oder/und Translation von Targetgenen durch "gene silencing" eingesetzt werden. Die erfindungsgemäß bevorzugte Strategie umfasst die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen eingefügt in eine transgene DI-RNA, welche zu einer antisense-Nukleinsäuresequenz transkribierbar sind, die beispielsweise zur Verminderung der Expression eines Zielprotein befähigt sind.
Bevorzugte Gene bzw. Proteine, deren Suppression einen vorteil­ haften Phänotyp bedingt, sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielhaft, aber nicht einschränkend:
  • 1. Zum Erreichen von höheren Lipidgehalten durch
    • a) niedrigere Stärkegehalte in Zellen des Keimlings durch Inhibierung von Enzymen des Kohlenhydratstoffwechsels, zum Beispiel durch anti-sense Expression der cDNA von ADP-glucose-pyrophosphorylasen oder durch
    • b) veränderte z. B. niedrigere Proteingehalte in Zellen des Keimlings durch Inhibierung von Speicherproteingenen wie cruciferin. Bevorzugt sind Nukleinsäuren wie die ADP- Glucose-phosphorylase aus Brassica napus (WO9911805, Genbank Acc.-No. AJ271162)oder Cruciferin A aus Brassica napus (Genbank Acc.-No. X14555). Suppression der Δ-12-Desaturasen in Brassica napus bzw. B. juncea (Genbank Acc-No. X91139) zur Erzeugung von Hoch-Öl­ säurevarietäten (P. A. Stoutjesdijk et al. (2000) Biochem Soc Transactions 28: 938-940).
Eine "antisense" Nukleinsäure meint zunächst eine Nuklein­ säuresequenz die ganz oder teilweise zu zumindest einem Teil des "sense"-Stranges besagten Zielproteins komplementär ist. Dem Fachmann ist bekannt, dass er alternative cDNA oder das korrespondierendes Gen als Ausgangsmatrize für entsprechende antisense-Konstrukte verwenden kann. Bevorzugt ist die "anti­ sense" Nukleinsäure komplementär zu dem kodierenden Bereich des Zielproteins oder einem Teil desselben. Die "antisense" Nuklein­ säure kann aber auch zu der nicht-kodierenden Region oder einem Teil derselben komplementär sein. Ausgehend von der Sequenz­ information zu einem Zielprotein, kann eine antisense Nuklein­ säure unter Berücksichtigung der Basenpaarregeln von Watson und Crick in der dem Fachmann geläufigen Weise entworfen werden. Eine antisense Nukleinsäure kann komplementär zu der gesamten oder einem Teil der Nukleinsäuresequenz eines Zielproteins sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die antisense Nukleinsäure ein Oliginukleotid mit einer Länge von zum Beispiel 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden.
Die antisense Nukleinsäure umfasst in einer bevorzugten Aus­ führungsform α-anomere Nukleinsäuremoleküle. α-Anomere Nuklein­ säuremoleküle bilden besondere doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA in denen im Unterschied zu den normalen β-Einheiten die Stränge parallel zu einander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641).
Ebenso umfasst ist die Verwendung der oben beschriebenen Sequenzen in sense-Orientierung, was wie dem Fachmann geläufig ist, zu einer Kosuppression führen kann. In Tabak, Tomate und Petunie ist demonstriert worden, dass die Expression von sense- RNA zu einem endogenen Gen, die Expression desselben vermindern oder ausschalten kann, ähnlich wie es für antisense Ansätze beschrieben wurde (Goring et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 88: 1770-1774, 1991; Smith, Watson, Bird. Ray. Schuch, Grierson, Mol. Gen. Genet., 224: 447-481, 1990.; Napoli, Lemieux, Jorgensen, Plant Cell, 2: 279-289, 1990; Van der Krol, Mur, Beld, Mol, Stuitje, Plant Cell, 2: 291-99, 1990). Dabei kann das ein­ geführte Konstrukt das zu vermindernde Gen ganz oder nur teil­ weise representieren. Die Möglichkeit zur Translation ist nicht erforderlich.
Ganz besonders bevorzugt ist auch die Verwendung von Verfahren wie der Genregulation mittels doppelsträngiger BNA ("double­ stranded RNA interference"). Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bekannt und im Detail beschrieben (z. B. Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43: 401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391: 806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Auf die in den ange­ gebenen Zitaten beschriebenen Verfahren und Methoden wird aus­ drücklich Bezug genommen. Hier wird durch gleichzeitige Ein­ bringung von Strang- und Gegenstrang eine hocheffiziente Unter­ drückung nativer Gene bewirkt.
Vorteilhaft kann die antisense-Strategie mit einem Ribozym-Ver­ fahren gekoppelt werden. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA Sequenzen, die gekoppelt an die antisense Sequenzen, die Ziel­ sequenzen katalytisch spalten (Tanner NK. FEMS Microbiol Rev. 1999; 23 (3): 257-75). Dies kann die Effizienz einer anti-sense Strategie erhöhen. Die Expression von Ribozymen zur Verminderung bestimmter Proteine ist dem Fachmann bekannt und beispiels­ weise beschrieben in EP-A1 0 291 533, EP-A1 0 321 201 und EP-A1 0 360 257. Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum Beispiel wie bei Steinecke (Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al eds Academic Press, Inc. (1995), 449-460) beschrieben, durch Sekundärstrukturberechnungen von Ribozym- und Ziel-RNA sowie durch deren Interaktion bestimmt werden (Bayley CC et al., Plant Mol Biol. 1992; 18 (2): 353-361; Lloyd AM and Davis RW et al., Mol Gen Genet. 1994 Mar; 242 (6): 653-657). Beispielhaft sind "hammerhead"-Ribozyme zu nennen (Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591). Bevorzugte Ribozyme basieren auf Derivaten der Tetrahymena L-19 IVS RNA (US 4,987,071; US 5,116,742). Weitere Ribozyme mit Selektivität für eine L119 mRNA können selektioniert werden (Bartel D und Szostak JW (1993) Science 261: 1411-1418).
In einer weiteren Ausführungsform kann Verminderung der Ziel­ protein-Expression unter Verwendung von Nukleinsäuresequenzen bewirkt werden, die komplementär zu regulativen Elementen der Zielprotein-Gene sind, mit diesen eine triple-helikale Struktur ausbilden und so die Gen-Transkription verhindern (Helene C (1991) Anticancer Drug Des. 6 (6): 569-84; Helene C et al. (1992) Ann NY Acad Sci 660: 27-36; Maher LJ (1992) Bioassays 14 (12): 807-815).
Dem Fachmann sind verschiedene Wege bekannt, um zu einer erfindungsgemäßen Expressionskassette zu gelangen.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt beispielsweise durch Fusion des AtLOX5-Promotors oder eines funktionellen Äquivalentes oder funktionell äquivalenten Teils gemäß SEQ-ID NO: 1 oder eines funktionellen Äquivalentes mit einer zu exprimierenden Nukleotidsequenz, gegebenenfalls einer für eine Transitpeptid kodierenden Sequenz, vorzugsweise ein chloroplastenspezifisches Transitpeptid, welches vorzugs­ weise zwischen dem Promotor und der jeweiligen Nukleotid­ sequenz angeordnet ist, sowie einem Terminator- oder Poly­ adenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Fublishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen der Promotor, ohne dass er zuvor mit einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpft wurde, zum Beispiel über eine gezielte homologe Rekombination oder eine zufällige Insertion in ein. Wirtsgenom eingeführt wird, dort regulatorische Kontrolle über mit ihm dann funktionell verknüpfte Nukleinsäureaequenzen über­ nimmt und die transgene Expression derselben steuert. Durch Insertion des Promotors - zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - vor eine für ein bestimmtes Polypeptid kodierende Nukleinsäure erhält man eine erfindungsgemäße Expressions­ kassette, die die Expression des bestimmten Polypeptides selektiv in den Keimblättern des pflanzlichen Embryos steuert. Ferner kann die Insertion des Promotors auch derart erfolgen, dass antisense- RNA zu der für ein bestimmtes Polypeptid kodierenden Nuklein­ säure exprimiert wird. Damit wird selektiv die Expression des bestimmten Polypeptides in den Keimblättern des pflanzlichen Embryos herunterreguliert oder ausgeschaltet.
Analog kann auch eine transgen zu exprimierende Nukleinsäure­ sequenz zum Beispiel durch eine homologe Rekombination hinter den endogenen, natürlichen AtLOX5-Promotor plaziert werden, wodurch man eine erfindungsgemäße Expressionskassette erhält, die die Expression der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in den Keimblättern des pflanzlichen Embryos steuert.
Erfindungsgemäß sind ferner Vektoren, die die oben beschriebenen Expressionskonstrukte enthalten. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacterien sein.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organismen, transformiert mit wenigstens einer erfindungs­ gemäßen Expressionskassette oder einem erfindungsgemäßen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw. - oder Vermehrungs­ gut abgeleitet von solchen Organismen.
Unter Organismus, Ausgangs- oder Wirtsorganismen werden pro­ karyotische oder eukaryotische Organismen, wie beispielsweise Mikroorganismen oder pflanzliche Organismen verstanden. Bevor­ zugte Mikroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algren oder Pilze.
Bevorzugte Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyano­ bakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis.
Bevorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemäßen Konstrukte befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismen sind solche aus der Gattung Agrobacterium und insbesondere der Art Agro­ bacterium tumefaciens.
Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula oder Pichia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1, 2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschriebene Pilze.
Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangs­ organismen sind vor allem Pflanzen. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzuge Wirtsorganismen für die Herstellung transgener Pflanzen. Die Expression von Genen ist ferner vorteilhaft bei allen Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäumen, Blumen, Schnitt­ blumen, Sträuchern oder Rasen. Beispielhaft aber nicht ein­ schränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Bei­ spiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose); Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koni­ feren, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen; Algen wie Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacilla­ riophyceae (Diatomeen) und Euglenophyceae.
Pflanzen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielhaft und nicht einschränkend die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr.
Beispielhaft aber nicht einschränkend für Blütenpflanzen seien zu nennen die Familien der Leguminosae wie Erbse, Alfalfa und Soja; Gramineae wie Reis, Mais, Weizen; Solanaceae wie Tabak und andere mehr; die Familie der Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus, ganz besonders die Art carota (Karrotte) und Apium, ganz be­ sonders die Art graveolens dulce (Selarie) und andere mehr; die Familie der Solanacea, besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) und andere mehr; und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer) und andere mehr; die Familie der Leguminosae, besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) und andere mehr; und die Familie der Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl), oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli); und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana und andere mehr; die Familie der Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art Sativa (Salat) und andere mehr.
Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen sind insbesondere ausgewählt unter monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Getreidearten wie Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis oder Hafer sowie dem Zuckerrohr. Ferner sind die erfindungs­ gemäßen transgenen Pflanzen insbesondere ausgewählt unter dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel
Brassicacae wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten oder Canola, Leguminosae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Luzerne, Bohnengewächsen oder Erdnuss
Solanaceae wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Paprika, Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula, Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini,
sowie Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Roter Pfeffer, Möhre, Karotte, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinspecies.
Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Tagetes erecta, Calendula officinalis sowie alle Gattungen und Arten, die als Nahrungs- oder Futtermittel zum Einsatz kommen, wie die beschriebenen Getreidearten, oder sich zur Herstellung von Ölen eignen, wie Ölsaaten (wie zum Beispiel Raps), Nussarten, Soja, Sonnenblume, Kürbis und Erdnuss.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen oder Cyanobakterien, sowie Moose.
Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella.
Die Herstellung eines transformierten Organismus oder einer transformierten Zelle erfordert, dass die entsprechende DNA in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation bezeichnet wird, steht eine Viel­ zahl von Methoden zur Verfügung (siehe auch Keown et al. 1990 Methods in Enzymology 185: 527-537). So kann die DNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA­ beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permea­ bilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lyso­ somen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden.
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Trans­ formation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplasten­ transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikro­ injektion.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agro­ bacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Diese Stämme enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid)., das auf die Pflanze nach Agrobaterium-Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA), wird in das Genom der Pflanzenzelle integriert.
Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone, diploide Pflanzenzellen geeignet, wohingegen die direkten Transformationstechniken sich für jeden Zelltyp eignen.
Die Einführung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in Zellen, bevorzugt in pflanzliche Zellen, kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der Expressionskassette mittels Plasmidvektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.
Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA in pflanz­ liche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das ver­ wendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforder­ lich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.
Transformationstechniken sind für verschiedene monokotyle und dikotyle pflanzliche Organismen beschrieben. Ferner stehen verschiedene mögliche Plasmidvektoren für die Einführung fremder Gene in Pflanzen zur Verfügung, die in dier Regel einen Replikationsursprung für eine Vermehrung in E.coli und ein Markergen für eine Selektion transformierter Bakterien enthalten. Beispiele sind pBR322, pUC Reihe, M13mp Reihe, pACYC184 etc.
Die Expressionskassette kann in den Vektor über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Das entstandene Plasmid wird zunächst in E.coli eingeführt. Korrekt trans­ formierte E.coli werden selektioniert, gezüchtet und das rekombinante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen.
Transformierte Zellen d. h. solche, die die einge führte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionier­ barer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide zu verleihen vermag. Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untrans­ formierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al.,Plant Mol Biol. 1993 Mar; 21 (5): 871-884), das nptII Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht.
Je nach Methode der DNA-Einführung können weitere Gene auf dem Vektorplasmid erforderlich sein. Werden Agrobacteria verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu inte­ grieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wenn zum Beispiel ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agro­ bacterium transformiert werden (Holsters et al.,Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das nptII Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden.
Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 and An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. U.S.A.).
Für den Transfer der DNA auf die pflanzliche Zelle werden pflanz­ liche Explantate mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert. Ausgehend von infiziertem Pflanzen­ material (z. B. Blatt-, Wurzel- oder Stengelteile, aber auch Protoplasten oder Suspensionen von Pflanzenzellen) können ganze Pflanzen unter Verwendung eines geeigneten Mediums, dass zum Beispiel Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierten Zellen enthalten kann, regeneriert werden. Die erhaltenen Pflanzen können dann auf die Präsenz der eingeführten DNA, hier der erfindungsgemäßen Expressionskassette, durchmustert werden. Sobald die DNA in das Wirtsgenom integriert ist, ist der ent­ sprechende Genotyp in der Regel stabil und die entsprechende Insertion wird auch in den Nachfolgegenerationen wiedergefunden. In der Regel enthält die integrierte Expressionskassette einen Selektionsmarker, der der transformierten Pflanze eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid) oder ein Anti­ biotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc. verleiht. Der Selektionsmarlcer erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tume­ faciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann be­ kannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zell­ massen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden.
Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nuklein­ säuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristem­ vermehrung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektionsmethoden ermittelt werden.
Erfindungsgemäß sind ferner von den oben beschriebenen transgenen Organismen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte.
Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futter­ mittel verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der oben beschriebenen erfindungsgemäßen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
Bevorzugt ist ferner ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen, wobei ein Wirtsorganismus mit einer der oben beschriebenen Expressions­ konstrukte transformiert wird und diese Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene enthält, die für die gewünschte Fein­ chemikalie kodieren oder die Biosynthese der gewünschten Fein­ chemikalie katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus ge­ züchtet wird und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Züchtungs­ medium isoliert wird. Dieses Verfahren ist für Feinchemikalien wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe breit anwend­ bar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Carotinoiden. Die Züchtung der trans­ formierten Wirtsorganismen sowie die Isolierung aus den Wirts­ organismen bzw. aus dem Züchtungsmedium erfolgt mit dem Fachmann bekannten Verfahren. Die Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern, Vakzinen, Enzymen oder pharmazeutisch ativen Proteinen ist beschrieben (Hood EE, Jilka JM. (1999) Curr Opin Biotechnol. 10 (4): 382-6; Ma JK, Vine ND. (1999) Curr Top Microbiol. Immunol. 236: 275-92; Russel DA (1999), Current Topics in Microbiology and Immunology 240: 119-138; Cramer CL et al. (1999), Current Topics in Microbiology and Immunology 240: 95-118; Gavilondo JV. und Larrick J 30766 00070 552 001000280000000200012000285913065500040 0002010127882 00004 30647W. (2000) Biotechnigues 29 (1): 128-138; Holliger P. und Bohlen H. (1999) Cancer & Metastasis Reviews 18 (4): 411-419).
Sequenzen
1. SEQ ID NO: 1
Promotor and 5'-untranslatierte Region des Arabidopsis thaliana LOX5 Gens.
2. SEQ ID NO: 2
861 bp Fragment von Promotor and 5'-untranslatierte Region des Arabidopsis thaliana LOXS Gens.
3. SEQ ID NO: 3
521 bp Fragment von Promotor and 5'-untranslatierte Region des Arabidopsis thaliana LOXS Gens.
4. SEQ ID NO: 4
Vorwärts-Primer (BIS22): 5'-AATAAGCTTAACAATAAAAGTCCATTTC-3'
5. SEQ ID NO: 5
Rückwärts-Primer (BIS23): 5'-CTATCTAGATCGTCGTCGTCTTCTT-3'
6. SEQ ID NO: 6
APF-1 Primer: 5'-ATG AAG ATA GAA GGA GAA G-3'
7. SEQ ID NO: 7
APF-2 Primer: 5'-CAT CTG GAA AAA TGG GTA AC-3'
8. SEQ ID NO: 8
APF-3 Primer: 5'-GAT TGG GAC GAG TCA ATG-3'
9. SEQ ID NO: 9
APR-1 Primer: 5'-GGT GGA AAT TCC TGA AGA ACG-3'
10. SEQ ID NO: 10
APR-2 Primer: 5'-GCT TCT TGG ACA TTG AGG CCG-3'
11. SEQ ID NO: 11
APR-3 Primer: 5'-CTT TGC TGA CCG ATC CAT ATG-3'
12. SEQ ID NO: 12
APR-4 Primer: 5'-CAA CAA TGT GTA CGG TAT G-3'
Abbildungen
Fig. 1: Reportergenaktivität in Keimblättern nach GUS-Färbung von transgenen Arabidopsissamen (pGPTV-ALLOX5::GUS). Abbildungsteil A stellt die Samen ohne Verdeutlichung der GUS-Färbung dar. In Abbildungsteil B ist die GUS-Färbung durch Schraffur hervorgehoben. Der Pfeil weißt auf die Region der Keimblätter hin.
Fig. 2: Schematische Darstellung der Vektoren pBSK-LOX5 (I), pBSK-LOX5 (861) (II), pBSK-LOX5 (521) (IIa), pGPTV- LOX5::GUS (VI), pGPTVl-LOX5::GUS (V) und pGPTV2-LOXS:GUS (VI). Die Pfeilrichtung gibt die Orientierung des Promotors an, wobei die Pfeilspitze in Richtung des Startkodons weist. Die Abkürzungen haben folgende Bedeutung:
LOX5: Promotor oder Promotorfragment des AtLOX5 Promotors
NOST: Terminatorsequenz der Nopalin-Synthase (NOS)
GUS: Reportergen (bakterielle β-Glucuronidase)
Beispiele Allgemeine Methoden
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungs­ schritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektro­ phorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nuklein­ säuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).
Beispiel 1 Wachstumsbedingungen der Pflanzen für gewebs­ spezifische RT-PCR Analyse bzw. Northern-Analyse
Um 6 Tage alte Keimlinge zu erhalten, werden jeweils unge­ fähr 500 Samen (Arabidopsis thaliana Ökotyp Columbia) an der Oberfläche mit einer 70%igen Ethanollösung für 2 Minuten sterilisiert, mit einer Natriumhypochloritlösung (5% v/v) 2 Minuten behandelt, fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen und bei 4°C für 1 Tag inkubiert, um eine gleichmäßige Keimung sicherzustellen. Anschliessend werden die Samen in sterilisierten Behältern (9,7 cm × 9,6 cm × 9 cm) auf mit Hoagland-Nährlösung (modifiziert für Arabidopsis thaliana) getränktem Filterpapier ausgesäht. Die Hoagland-Lösung ist aus drei verschiedenen 200x Stammlösungen hergestellt. Die Stammlösung I enthält 0,5 M Ca(NO3)2, die Stammlösung II enthält 0,1 M MgSO4, und die Stamm­ lösung III enthält 0.5 M KNO3 und 0,1 M KH2PO4. Alle Stammlösungen wurden vor Gebrauch 1 : 200 verdünnt und 1 : 1 : 1 gemischt. Spuren­ elemente wurden mittels einer 2000x Spurenelement-Stammlösung (5 × 10-2 M H3BO3, 4,5 × 10-3 M MNCl2, 3,8 × 10-3 M ZnSO4, 3 × 10-4 M CuSO4, 1 × 10-4 M (NH4)6MO7O24)und 250x Fe-EDTA-Stammlösung (10 mM FeCl3, 10 mM Na-EDTA) zugesetzt. Der pH-Wert der Nährlösung wurde mit 5 N KOH auf pH 6,0 eingestellt und die Hoaglandlösung dann autoklaviert. Die Sämlinge werden im Dunkeln bei 22°C gezüchtet und nach 6 Tagen nach Beginn der Keimphase geerntet.
Für die Gewinnung von Wurzeln werden 100 Samen wie oben beschrieben sterilisiert, bei 4°C 4 Tage inkubiert und dann in 250 ml Flaschen mit MS Medium (Sigma M5519) unter Zusatz von weiteren 3% Saccharose und 0,5 g/l MES (Sigma M8652), pH 5,7 gezüchtet. Die Sämlinge werden in einem 16-stündigen Licht-/­ 8-stündigen Dunkelheitszyklus (Philips 58W/33 Weißlichtlampen) bei 22°C, 120 U/min gezüchtet und nach 3 Wochen geerntet. Für alle anderen verwendeten pflanzlichen Organe werden die Samen auf Ein­ heitserde (Typ VM, Manna-Italia, Via S. Giacomo 42, 39050 San Giacomo/Laives, Bolzano, Italien) ausgesäht, 4 Tage bei 4°C inkubiert um eine gleichmäßige Keimung zu gewährleisten und zunächst unter Kurztagsbedingungen bei 2200, 9 h Licht (150 mE) und 60 bis 65% rel. Luftfeuchte mit einer Nachtabsenkung auf 18°C gezüchtet. Um die Spross- und Blütenentwicklung zu fördern, wurden die Pflanzen zu Langtagsbedingungen mit einem 16-stündigen Licht-/8-stündigen Dunkelheitszyklus (OSRAM Lumilux Daylight 36W/12 Leuchtstoffröhren) bei 22°C, umgesetzt. Junge Rosetten­ blätter werden im 8-Blattstadium (nach 3 Wochen) geerntet, Stengel, geöffnete Blüten werden in Stadium 14 sofort nach der Staubblattentwicklung geerntet. Die verwendeten grünen Schoten hatten eine Länge von 10 bis 13 mm.
Beispiel 2 RNA Extraktion und RT-PCR Analyse
Gesamt-RNA wird aus den in Beispiel 1 beschriebenen Organen der Pflanze zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung nach dem RNA-Isolierungspotokoll(Sambrook et al., 1989), modi­ fiziert für Arabidopsis thaliana isoliert. Die Proben wurden mit flüssigem N2 fein zermörsert, mit 1 ml Homogenisierungspuffer (4 M Guanidiniumthiocyanat, 0,1 M Tris HCl pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,5% Na-Laurylsarcosin, 1% (v/v) β-Mercaptoethanol) versetzt und während des Auftauens weiter sorgfältig aufgeschlossen und in ein mit 800 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (P/C/I/) (25 : 24 : 1 v/v, mit DEPC (Diethylpyrocarbonat)-Wasser über­ schichtet) gefülltes 2-ml-Reaktionsgefäß überführt. Es wurde 1 min gevortext, bei 4°C für 15 min bei 17500 × g zentrifugiert, die wässrige Phase abgenommen und erneut mit 800 µl P/C/I aus­ geschüttelt und zentrifugiert (17500 × g, für 15 min, bei 4°C). Um das Phenol zu entfernen, erfolgte eine Extraktion mit 800 µl Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1 v/v). Eine bessere Phasen­ trennung wurde durch erneute Zentrifugation (s. o.) erreicht. Der Überstand wurde abgenommen, die Nukleinsäuren mit dem 1-fachen Volumen Isopropanol bei -20°C für 1 h gefällt. Das Präzipitat wurde bei 4°C für 15 min bei 17500 × g sedimentiert, mit 3 M Na-Acetat (pH 5,4) gewaschen, wieder zentrifugiert (10 min, bei 17500 × g und 4°C), danach nochmals 2 × mit eiskaltem 70% Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde in 750 µl TENS Puffer (50 mM Tris HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 2% SDS (w/v), 3 mg/ml Diethyl­ thiocyanat) resuspendiert, mit 800 µl P/C/I extrahiert und mit 800 µl Chloroform/ Isoamylalkohol ausgescrüttelt (s. o.). Die wässrige Phase wurde im Verhältnis 1 : 1 mit 5 M LiCl versetzt, die RNA bei 4°C über Nacht gefällt und dann für 30 min bei 4°C und 17500 × g abzentrifugiert. Danach wurde das Pellet zweimal mit 70% Ethanol gewaschen, bei 50°C im Heizblock getrocknet und in 40 µl H2O resuspendiert. Alle Lösungen wurden mit tridest. H2O, das vorher mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt und anschließend autoklaviert worden ist, angesetzt.
Die Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) wird verwendet, um das AtLOX5 Gentranskript nachzuweisen. Die Erst­ strang cDNA Synthese wird ausgehend von 6 µg Gesamt-RNA mit einem oligo-(dT) Primer und RT Superscript™II Enzym (200 Units) nach Angaben des Herstellers in einem Gesamtvolumen von 20 µl (Life Technologies, Gaithersburg, MD; Cat. No. 18064-022) durchgeführt. Zur RNA werden dazu 500 ng oligo-(dT) Primer in einem Endvolumen von 12 µl gegeben. Der Ansatz wird für 10 min bei 70°C erhitzt und anschließend sofort auf Eis gekühlt. Dann werden 4 µl des 5X Erststrangpuffers [250 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei Raumtemperatur), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2], 2 µl 0,1 M DTT und 1 µl 10 mM dNTP-Mix (jeweils 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP bei neutralem pH) zuge­ geben. Der Ansatz wird für 2 min auf 42°C erhitzt, RT Superscript­ ™II Enzym (1 µl (200 Units), Life Technologies) zugegeben und für 50 min bei 42°C inkubiert. Als oligo-(dT) Primer wird ein Oligo­ nukleotid mit 17 dT Resten verwendet.
Für die PCR-Reaktion werden ungefähr 2 µl der Erststrang cDNA Synthese eingesetzt. In einem Gesamtvolumen von 50 µl werden gemäß den Angaben des Herstellers (Life Technologies) zusammen­ gegeben:
5 µl 10X PCR Buffer [200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl],
1,5 µl 50 mM MgCl2,
1 µl 10 mM dNTP Mix (jeweils 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP),
1 µl Amplifikations-Primer 1 (10 µM),
1 µl Amplifikations-Primer 2 (10 µM),
0,4 µl Taq DNA polymerase (5 U/µl),
2 µl cDNA (aus der Erststrang cDNA Synthese),
38,1 µl autoklaviertes, destilliertes Wasser.
Das Reaktionsgemisch wird mit ca. 50 µl Silikonöl überschichtet und nachfolgendem Temperaturprogramm ausgesetzt (Thermocycler: MWG Biotech Primus HT; MWG Biotech, Deutschland):
1 Zyklus mit 180 sec bei 95°C,
30 Zyklen mit 95°C für 40 sec, 53°C für 60 sec und 72°C für 2 min,
1 Zyklus mit 72°C für 5 min.
Die Präsenz der AtLOX5 mRNA in einer Probe wird dann durch Auf­ trennung des Reaktionsgemisches auf einem 1% Agarosegel elektro­ phoretisch nach Färbung beispielsweise mit Ethidiumbromid nach­ gewiesen.
Als Amplifikations-Primer 1 ("forward"-Primer) wird eines der nachfolgender Oligonukleotide eingesetzt:
APF-1 (SEQ ID NO: 6): 5'-ATG AAG ATA GAA GGA GAA G-3',
APF-2 (SEQ ID NO: 7): 5'-CAT CTG GAA AAA TGG GT. A AC-3',
APF-3 (SEQ ID NO: 8): 5'-GAT TGG GAC GAG TCA ATG-3'.
Als Amplifikations-Primer 2 ("reverse"-Primer) wird eines der nachfolgender Oligonukleotide eingesetzt:
APR-1 (SEQ ID NO: 9): 5'-GGT GGA AAT TCC TGA. AGA ACG-3',
APR-2 (SEQ ID NO: 10): 5'-GCT TCT TGG ACA TTG. AGG CCG-3',
APR-3 (SEQ ID NO: 11): 5'-CTT TGC TGA CCG ATC CAT ATG-3',
APR-4 (SEQ ID NO: 12): 5'-CAA CAA TGT GTA CGG TAT G-3'.
Weitere Primer sind aus der bekannten cDNA Sequenz des AtLOX5 (AJ302043 Arabidopsis thaliana partial mRNA for lipoxygenase (LOX5 gene) gi|11967676|emb|AJ302043.1|ATH302043[11967676]) ableitbar.
Beispiel 3 Lokalisierung der Expression von LOX Proteinen aus Arabidopsis mittels Immunolokolisierung
Kleine Stückchen von grünen Schoten wurden von ausgewachsenen Pflanzen entnommen und in 4% para-Formaldehyd und 0,1% Triton X-100 in PBS für 2 h bei RT fixiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Proben über eine aufsteigende Ethanolreihe ent­ wässert, über Xylol mit Paraplast (SIGMA) infiltriert und ein­ gebettet. Längsschnitte durch den medianen Bereich der Schoten (5 µm dick) wurden auf poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger aufgebracht, das Paraplast mittels Xylol wieder entfernt und die Schnitte über eine absteigende Ethanolreihe bewässert. Nach 30 min Blockierung der Schnitte mit 1% BSA in PBS erfolgte die Inkubation mit dem primären Antikörper (anti-LB-LOX, 1 : 500 in 1% BSA/PBS; Feussner I und Kindl H (1994) Planta 194: 22-28) ON bei 4°C. Als sekundärer AK wurde ein anti-Kaninchen IgG, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics) wie dort be­ schrieben nach den Angaben des Herstellers eingesetzt. Der Nach­ weis der immunmarkierten LOX erfolgte über die Farbreaktion der alkalischen Phosphatase mittels NBT und BCIP. Abschließend wurden die Schnitte mit Glycerin eingeschlossen und mit Hilfe eines Zeiss "Axioskop" analysiert.
Beispiel 4 Klonierung des AtLOX5 Promotors
Um den vollständigen AtLOX5 Promotor zu isolieren, wird genomische DNA aus Arabidopsis thaliana (Ökotyp Columbia) extrahiert. Dies geschieht mit Hilfe des Qiagen DNAeäsy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland). Die isolierte DNA wird als Matrizen-DNA in einer PCR-Vervielfältigungsreaktion unter Verwendung folgender Primer eingesetzt:
Vorwärts-Primer (BIS22): 5'-AATAAGCTTAACAATAAAAGTCCATTTC-3' (SEQ ID NO: 4),
Rückwärts-Primer (BIS23): 5'-CTATCTAGATCGTCGTCGTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 5).
Die Amplifikation wird wie folgt durchgeführt:
1 × PCR reaction buffer (Roche Diagnostics),
5 µl genomische DNA (entspricht etwa 80 ng),
je 2,5 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP (Invitrogen: dNTP Mix),
1 µl Primer BIS22 (SEQ ID NO: 11) 330 µg/ml,
1 µl Primer BIS23 (SEQ ID NO: 12) 230 µg/ml,
1 µl Taq DNA Polymerase 5 U/µl (Roche Diagnostics),
in einem Endvolumen von 100 µl.
Folgendes Temperaturprogramm wird verwendet (Thermocycler: MWG Biotech Primus HT; MWG Biotech, Deutschland):
1 Zyklus mit 180 sec bei 95°C,
30 Zyklen mit 95°C für 40 sec, 53°C für 60 sec und 72°C für 2 min,
1 Zyklus mit 72°C für 5 min.
Das PCR-Produkt wird auf ein 1% (w/v) Agarosegel aufgetragen und bei 80 V aufgetrennt. Fragmente von etwa 1400 Basenpaaren Länge werden aus dem Gel ausgeschnitten und mit Hilfe des Qiagen Gel Extraction Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) aufgereinigt. Das Eluat von 50 Microlitern kann ggf. eingedampft werden. Die auf­ gereinigte DNA wird wie folgt 2 Stunden bei 37°C verdaut:
19 µl aufgereinigte PCR-DNA,
1 µl HindIII Restriktionsenzym (10 U, Roche Diagnostics),
1 µl XbaI Restriktionsenzym (10 U, Roche Diagnostics),
10 µl Puffer B (Roche Diagnostics),
69 µl dest. Wasser.
Anschließend folgt eine Aufreinigung entweder über eine phenolische Extraktion und eine ethanolische Fällung (Sambrook et al., 1989) oder alternativ über den PCR Purification Kit (Roche Diagnostics). Das geschnittene und aufgereinigte DNA- Fragment wird in das Bluescript-Plasmid (Stratagene) in die HindIII- und XbaI-Schnittstellen eingefügt. Ligation des Vektors, Transformation in E.coli Zellen und Analyse der Plasmide erfolgt nach Standardmethoden (Sambrook et al., 1989). Die Identität kann durch Sequenzierung des Plasmides und Vergleich mit der genomischen DNA-Sequenz (Genbank Nummer AB022215) überprüft werden. Das erhaltene Konstrukt ist pBSK-AtLOX5 (Fig. 2, Konstrukt I).
Alternativ kann das PCR Produkt direkt in den Velctor pCR4-TOPO (Invitrogen) nach Herstellerangaben kloniert werden d. h. das erhaltene PCR-Produkt wird mittels seiner A-Überhänge und einer Topoisomerase in einen Vektor mit T-Überhängen eingefügt.
Beispiel 5 Deletionsanalyse
Die Klonierungsverfahren ist von Rouster (Rouster J et al. (1997) Plant Journal 11 (3): 513-523) und Sambrook (Sambrook et al., Mole­ cular Cloning. A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) beschrieben.
Eine Feinkartierung des AtLOX5 Promotors, d. h. eine Einengung der für seine Spezifität relevanten Nukleinsäureabschnitte, erfolgt durch Herstellung verschiedener Reportergen-Expressionsvektoren, die zum einen den gesamten Promotorbereich, zum anderen ver­ schiedene Fragmente desselben enthalten. Kloniert wird einerseits die gesamte Promotorregion bzw. Fragmente davon in den pGPTV-GUS- Kan Vektor (Becker D et al., 1992 Plant Mol Biol 20: 1195-1197). Dafür werden einerseits Fragmente eingesetzt, die durch die Ver­ wendung von Restriktionsenzymen für die internen Restriktions­ schnittstellen in der Volllängen-Promotorsequenz erhalten werden. Andererseits werden PCR-Fragmente eingesetzt, die mit durch Primer eingeführte Schnittstellen versehen sind.
Für die Klonierung des Volllängen-Promotors wird der Vektor pBSK- AtLOX5 (Fig. 2, Konstrukt I) mit Hindlil und Xbal: verdaut und das aus einem 1%igen Agarose-Gel isolierte DNA-Fragment in die Hin­ dlii und XbaI-Schnittstellen des pGPTV-GUS-Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt wird mit pGPTV-LOX5::GUS bezeichnet (Fig. 2, Konstrukt IV).
Für einen ersten verkürzten Promotor wird pBSK-AtLOX5 mit EcoRI und XbaI verdaut und das aus einem 1%igen Agarosegel isolierte, 851 Basenpaare große Fragment in pBluescript SK (Stratagene) subkloniert. Das Insert wird aus dem entstandenen Vektor pBSK- LOX5(861) (Fig. 2, Konstrukt II) durch Verdau mit HindIII und XbaI gewonnen, über ein 1%iges Agarosegel isoliert und in pGPTV-GUS- Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung pGPTVl-LOX5::GUS (Fig. 2, Konstrukt V).
Für einen zweiten verkürzten Promotor wird pBSK-AtLOX5 mit SpeI und XbaI verdaut und das aus einem 1%igen Agarosegel isolierte, ca. 521 Basenpaare große Fragment in pBluescript SK (Stratagene) subkloniert. Das Insert wird aus dem entstandenen Vektor pBSK- LOX5 (521) (Fig. 2, Konstrukt III) durch Verdau mit HindIII und XbaI gewonnen, über ein 1%iges Agarosegel isoliert und in pGPTV- GUS-Kan kloniert. Das erhaltene Konstrukt trägt die Bezeichnung pGPTV2-LOX5::GUS (Fig. 2, Konstrukt VI).
Beispiel 6 Transformation und Regeneration transgener Arabidopsis thaliana (Columbia) Pflanzen
Zur Herstellung transgener Arabidopsis Pflanzen wird Agro­ bacterium turnefaciens (Stamm C58C1 pGV2260) mit verschiedenen AtLOX5 Promotor-GUS Vektorkonstrukten transformiert. Die Agro­ bakterienstämme werden anschließend zur Herstellung transgener Pflanzen verwendet. Dazu wird eine einzelne transformierte Agrobakterium-Kolonie in einer 4 ml Kultur (Medium: YEB-Medium mit 50 µg/ml Kanamycin und 25 µg/ml Rifampicin) über Nacht bei 28°C inkubiert. Mit dieser Kultur wird anschließend eine 400 ml Kultur in demselben Medium angeimpft, über Nacht inkubiert (28°C, 220 U/min) und abzentrifugiert (GSA-Rotor, 8.000 U/min, 20 min). Das Pellet wird in Infiltrationsmedium (1/2 MS-Medium; 0,5 g/l MES, pH 5,8; 50 g/l Saccharose) resuspendiert. Die Suspension wird in eine Pflanzenbox (Duchefa) eingebracht und 100 ml SIL­ WET L-77 (mit Polyalkylenoxid modifiziertes Heptamethyltri­ siloxan; Osi Specialties Inc., Cat. P030196) wurde zu einer End­ konzentration von 0,02% hinzugegeben. Die Pflanzenbox mit 8 bis 12 Pflanzen wird in einem Exikator für 10 bis 15 Minuten einem Vakuum mit anschließender spontaner Belüftung ausgesetzt. Dies wird 2 bis 3 Mal wiederholt. Hernach werden alle Pflanzen in Pflanztöpfe mit Feuchterde gepflanzt und unter Langtagbedingungen gezüchtet (Tagestemperatur 22 bis 24°C, Nachttemperatur 19°C; 65% relative Luftfeuchte). Nach 6 Wochen werden die Samen geerntet.
Alternativ können transgene Arabidopsis Pflanzen durch Wurzel­ transformation erhalten werden. Weiße Wurzelsprossen von maximal 8 Wochen alten Pflanzen werden verwendet. Dazu werden Pflanzen, die unter sterilen Bedingungen in 1 MS-Medium (1% Saccharose; 100 mg/l Inositol; 1,0 mg/l Thiamin; 0,5 mg/l Pyridoxin; 0,5 mg/l Nicotinsäure; 0,5 g MES, pH 5,7; 0,8% Agar) gehalten werden, verwendet. Wurzeln werden auf Kallus-induzierendem Medium für 3 Tage kultiviert (1x Gambourg's B5 Medium; 2% Glukosev 0,5 g/l Mercaptoethanol; 0,8% Agar; 0,5 mg/l 2,4-D (2,4-Dichlorphenoxy­ essigsäure); 0,05 mg/l Kinetin). 0,5 cm lange Wurzelabschnitte werden in 10 bis 20 ml Kallusinduzierendes Flüssigmedium über­ führt (Zusammensetzung wie oben beschrieben, jedoch ohne Agar­ zusatz) und mit 1 ml der oben beschriebenen Übernacht-Agro­ bakterienkultur (gewachsen bei 28°C, 200 U/min in LB) angeimpft und für 2 min geschüttelt. Die Wurzelexplantate werden nach Entfernen von überschüssigem Medium durch Abtropfen in Kallus­ induzierendes Medium mit Agar überführt, anschließend in Kallus­ induzierendes Flüssigmediun ohne Agar (mit 500 mg/l Betabactyl, SmithKline Beecham Pharma GmbH, München) unter Schütteln inkubiert und abschließend in Spross-induzierendtes Medium (5 mg/l 2-Isopentenyl-Adenin-Phosphat; 0,15 mg/l Indol-3-Essigsäure; 50 mg/l Kanamycin; 500 mg/l Betabactyl) überführt. Nach 5 Wochen und 1 bis 2maligem Mediumwechsel werden die kleinen, grünen Sprösslinge auf Keimungsmedium (1 MS-medium; 1% Saccharose; 100 mg/l Inositol; 1,0 mg/l Thiamin; 0,5 mg/l Pyridoxin; 0,5 mg/l Nicotinsäure; 0,5 g MES, pH 5,7; 0,8% Agar) gesetzt und zu Pflanzen regeneriert.
Beispiel 7 Transformation und Regeneration von Kulturpflanzen
Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann unter Verwendung von Standard-Transformations- und Regenerations­ techniken auch zum Zwecke der Transformation von Kulturpflanzen durchgeführt werden (Gelvin SB, Schilperoort RA (1995) Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl., Dordrecht: Kluwer Academic Publ., ISBN 0-7923-2731-4; Glick BR, Thompson, JE (1993) Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, ISBN 0-8493-5164-2).
Beispielsweise kann Raps mittels Kotyledonen- oder Hypokotyl­ transformation transformiert werden (Moloney et al., Plant Cell 8 (1989) 238-242; De Block et al., Plant Physiol. 91 (1989) 694-701). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation ver­ wendeten binären Vektor und Agrobacterium-Stamm ab. Die Raps­ selektion wird gewöhnlich unter Verwendung von Kanamycin als selektierbarem Pflanzenmarker durchgeführt.
Der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer in Lein (Linum usitatissimum) lässt sich unter Verwendung von beispielsweise einer von Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13: 282-285 beschriebenen Technik durchführen.
Die Transformation von Soja kann unter Verwendung von beispiels­ weise einer in EP-A-0 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) oder in EP-A-0 0397 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University Toledo) beschriebenen Technik durchgeführt werden.
Die Pflanzentransformation unter Verwendung von Teilchen­ beschuss, Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme oder über die Siliziumcarbonatfaser-Technik ist beispielsweise beschrieben von Freeling und Walbot "The maize handbook" (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag (New York).
Beispiel 8 Plasmide für die Pflanzentransformation Geeignete binäre Vektoren und Transformationsmarker
Zur Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230) oder pGPTV (Becker et al. 1992, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197) ver­ wendet werden. Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch Ligation der cDNA in Sense- oder Antisense-Orientierung in T-DNA erfolgen. 5' der cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor die Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz befindet sich 3' von der cDNA. Die binären Vektoren können unterschied­ liche Markergene tragen. So kann etwa die Resistenz durch die Expression des nptII Markergens unter Kontrolle des 35S oder des nos Promoters erfolgen. Insbesondere kann das nptII-Markergen codierend für Kanamycin-Resistenz vermittelt durch Neomycin­ phosphötransferase gegen die herbizidresistente Form eines Acetolactat Synthasegens (AHAS oder ALS) ausgetauscht werden. Das ALS-Gen ist beschrieben in Ott et al., J. Mol. Biol. 1996, 263: 359-360. Geeignet für manche Pflanzen ist auch die Verwendung des Hygromycin-Resistenz-Gens. Der v-ATPase-c1-Promotor kann in das Plasmid pBinl9 oder pGPTV kloniert werden und durch Klonierung vor die kodierende Region des ALS Gens für die Marker­ genexpression genutzt werden. Der genannte v-ATPase-c1-Promotor entspricht einem 1153 Basenpaarfragment aus Beta vulgaris (Plant Mol Biol, 1999, 39: 463-475). Der genannte nos Promoter. Dabei können sowohl Sulphonylharnstoffe als auch Imidazolinone wie Imazethapyr oder Sulphonylharnstoffe als Antimetaboliten zur Selektion verwendet werden. Alternativ kann auch der nos-Promoter für die Markergenexpression verwendet werden.
Beispiel 9 Nachweis der gewebespezifischen Expression
Um die Eigenschaften des Promotors zu bestimmen und die essentiellen Elemente desselben, die seine Gewebespezifität ausmachen, zu identifizieren, ist es erforderlich, den Promotor selbst und verschiedene Fragmente desselben vor ein sogenanntes Reportergen zu setzen, das eine Bestimmung der Expressions­ aktivität ermöglicht. Beispielhaft sei die bakterielle β-Glucuronidase genannt (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907). Die β-Glucuronidase Aktivität kann in-planta mittels eines chromogenen Substrates wie 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl- β-D-Glucuronsäure im Rahmen einer Aktivitätsfärbung bestimmt werden (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 387-405). Für die Untersuchungen der Gewebespezifität wird das pflanzliche Gewebe geschnitten, eingebettet, gefärbt und analysiert wie beschrieben (z. B. Bäumlein H et al., 1991 Mol Gen Genet 225: 121-128). Besonders vorteilhaft ist es Embryonen aus unreifen oder reifen Samen herauszupräparieren und erst dann zu färben (siehe Fig. 1). Ebenso können ungeöffnete Blüten gefärbt werden, um eine Promoteraktivität durch GUS-Färbung im Pollen nachzuweisen.
Ein zweiter Assay erlaubt eine quantitative Bestimmung der GUS-Aktivität in dem untersuchten Gewebe. Für die quantitative Aktivitätsbestimmung wird als Substrat für die β-Glucuronidase MUG (4-Methyl-umbelliferyl-beta-D-glucuronid) verwendet, das in MU (Methyl-umbelliferon) und Glucuronsäure gespalten wird.
Dabei wird zunächst ein Proteinextrakt des gewünschten Gewebe hergestellt, dem dann das Substrat der GUS zugesetzt wird. Das Substrat ist erst nach der Umsetzung durch GUS fluorimetrisch messbar. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden Proben entnommen, die anschließend im Fluorimeter gemessen werden. Dieser Test kann z. B. mit Leinembryonen verschiedener Altersstadien durchgeführt (21, 24 oder 30 Tage nach Beginn der Blüte, daf = days after flowering). Dazu wird je ein Embryo in einem 2 ml-Reaktionsgefäß mit Hilfe einer Schwingmühle (Retsch MM 2000) in flüssigem Stick­ stoff zu Pulver zerrieben. Nach Zugabe von 100 ml EGL-Puffer wird für 10 min bei 25°C und 14000 × g zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und ein zweites Mal zentrifugiert. Wieder wird der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bis zur weiteren Verwendung auf Eis gehalten. Von diesem Proteinextrakt werden 25 ml mit 65 ml EGL-Puffer (ohne DTT) versetzt und für den GUS-Assay eingesetzt. Nun werden 10 ml des Substrates MUG (10 mM 4-Methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronid) dazugegeben, gevortext und sofort 30 ml als Nullwert entnommen und mit 470 ml Stopp-Puffer (0,2 M Na2CO3) versetzt. Dieser Vorgang wurde für alle Proben in einem Abstand von 30 s wiederholt. Die entnommenen Proben wurden bis zur Messung im Kühlschrank gelagert. Weitere Messwerte wurden nach 1 h und nach 2 h entnommen. Für die Messung im Fluorimeter wurde eine Eichreihe erstellt, die Konzentrationen von 0,1 mM bis 10 mM MU (4-Methyl-umbelliferon) enthielt. Waren die Probenwerte außerhalb dieser Konzentrationen, wurde weniger Proteinextrakt eingesetzt (10 ml, 1 ml, 1 ml aus 1 : 10 Verdünnung), und es wurden kürzere Zeitabstände gemessen (0 h, 30 min, 1 h). Die Messung erfolgte bei einer Exitation von 365 nm und einer Emission von 445 nm in einem Fluoroscan II-Gerät (Labsystem). Alternativ kann die Substratspaltung unter alkalischen Bedingungen fluorometrisch verfolgt werden (Anregung bei 365 nm, Messung der Emission bei 455 nm; Spectro Fluorimeter BMG Polarstar+) wie beschrieben in Bustos M. M. et al., 1989 Plant Cell 1: 839-853. Alle Proben wurden einer Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford (1976) unter­ zogen, um so eine Aussage über die Promoteraktivität und -stärke in verschiedenen Geweben und Pflanzen erlauben.
EGL-Puffer,
0,1 M KPO4, pH 7,8,
1 m MEDTA,
5% Glycerin,
1M DTT
Beispiel 10 In vivo-Mutagenese
Um die Promoteraktivität zu modifizieren oder wichtige Promotor­ elemente zu identifizieren, sind dem Fachmann verschiedene Ver­ fahren bekannt. Eines basiert auf der zufälligen Mutation und nachfolgenden Testung mit Reportergenen wie zuvor beschrieben. Die in vivo-Mutagenese von Mikroorganismen kann mittels Passage der Plasmid-(oder einer anderen Vektor-)DNA durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z. B. Bacillus spp. oder Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae), bei denen die Fähigkeiten, die Unversehrtheit ihrer genetischen Information aufrechtzuerhalten, gestört ist, erfolgen. Übliche Mutator-Stämme haben Mutationen in den Genen für das DNA-Reparatursystem (z. B. mutHLS, mutD, mutT usw.; als Literaturstelle siehe Rupp WD (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, S. 2277-2294, ASM: Washington). Diese Stämme sind dem Fachmann. bekannt. Die Verwendung dieser Stämme ist beispielsweise erläutert bei Greener A und Callahan M (1994) Strategies 7: 32-34. Der Transfer mutier­ ter DNA-Moleküle in Pflanzen erfolgt vorzugsweise nach Selektion und Test der Mikrooganismen. Transgene Pflanzen werden analog den unter Beispiel 6 bis 9 hergestellt und analysiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (21)

1. Expressionskassette zur transgenen Expression von Nuklein­ säuren enthaltend
  • a) den Promotor des LOX5 Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 1, oder
  • b) eine Deletionsvariante des LOX5 Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 2 oder 3, oder
  • c) funktionelle Äquivalente oder äquivalente Fragmente von a) oder b), die im wesentlichen die gleichen Promotor­ aktivitäten wie a) oder b) besitzen,
wobei a) oder b) funktionell mit einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.
2. Expressionskassette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
  • a) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen funktionell verknüpft ist, oder
  • b) die Expressionskassette zusätzliche Funktionselemente enthält, oder
  • c) a) und b) gegeben sind.
3. Expressionskassette nach einem der Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz
  • a) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierten Proteins, oder
  • b) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierter sense oder anti-sense-RNA
ermöglicht.
4. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus Nukleinsäuren kodierend für Aminosäuretransporter, Saccharidtransporter, Phytasen, Lipasen, Triacylglycerol- Lipasen, Acetyl-CoA Carboxylasen, Endochitinasen, das N-hydroxylierende, multifunktionelle Cytochrom P-450, den transkriptionellen Aktivator CBF1, Invertasen, das 2S Albumin aus Bertholletia excelsa, Endoxylglucantransferasen, Phytoen­ desaturasen, das ABI3-Protein, das VP-1 Protein, "anti­ freeze"-Proteinen, Glutamatdehydrogenasen, einem späten Embryogenesegen (LEA), Calcium-abhängigen Proteinkinasen, Calcineurinen, Farnesyltransferasen, Ferritin, Oxalatoxidase, DREBIA-Faktor, Trehalosephosphatsynthase, Trehalosephosphat­ phosphatase, Trehalase, Cellulasen, Chitinasen, Glucanasen, Ribosom-inaktivierende Proteine, Lysozyme, Bacillus thurin­ giensis Endotoxin, a-Amylaseinhibitor, Proteaseinhibitoren, Lektine, RMAasen, Ribozyme, Fettsäuredesaturasen, Fettsäure­ elongasen, Coffeinsäure-O-methyltransferase, Cinnamoyl­ alkoholdehydrogenase, AINTEGUMENT-Gen, Lipoxygenasen, ADP­ glucose phosphorylasen, Cruciferin Speicherproteine.
5. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukleinsäurensequenzen mit den Genbank Accession-Nummern X92657, M20308, AJ002399, A19451, U40256, AB039325, L25042, S78423, U32624, U77378, V01311, AB044391, AF163819, X78815, AF306348, M60214, X6ß141, AJ222980, AF078796, AJ302043, X92890, AJ271162, X14555.
6. Vektor enthaltend eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.
7. Verfahren zur transgenen Expression von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäuresequenz in funktioneller Verknüpfung mit
  • a) dem Promotor des LOXS Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 1, oder
  • b) einer Deletionsvariante des LOX5 Gens aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO: 2 oder 3, oder
  • c) einem funktionelle Äquivalent oder äquivalente Fragment von a) oder b), das im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie a) oder b) besitzt,
transgen exprimiert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass
  • a) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen funktionell verknüpft ist, oder
  • b) eine verwendete Expressionskassette zusätzliche Funktionselemente enthält, oder
  • c) a) und b) gegeben sind.
9. Verfahren nach einem der Ansprüchen 7 oder 8, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die transgen zu exprimierende Nukleinsäure­ sequenz
  • a) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierten Proteins, oder
  • b) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierter sense oder anti-sense-RNA
ermöglicht.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus Nukleinsäuren kodierend für Aminosäuretransporter, Saccharidtransporter, Phytasen, Lipasen, Triacylglycerol- Lipasen, Acetyl-CoA Carboxylasen, Endochitinasen, das N-hydroxylierende, multifunktionelle Cytochrom P-450, den transkriptionellen Aktivator CBF1, Invertasen, das 2S Albumin aus Bertholletia excelsa, Endoxylglucantransferasen, Phytoen­ desaturasen, das ABI3-Protein, das VP-1 Protein, "anti­ freeze"-Proteinen, Glutamatdehydrogenasen, einem späten Embryogenesegen (LEA), Calcium-abhängigen Proteinkinasen, Calcineurinen, Farnesyltransferasen, Ferritin, Oxalatoxidase, DREBIA-Faktor, Trehalosephosphatsynthase, Trehalosephosphat­ phosphatase, Trehalase, Cellulasen, Chitinasen, Glucanasen, Ribosom-inaktivierende Proteine, Lysozyme, Bacillus thurin­ giensis Endotoxin, a-Amylaseinhibitor, Proteaseinhibitoren, Lektine, RMAasen, Ribozyme, Fettsäuredesaturasen, Fettsäure­ elongasen, Coffeinsäure-O-methyltransferase, Cinnamoyl­ alkoholdehydrogenase, AINTEGUMENT-Gen, Lipoxygenasen, ADP­ glucose phosphorylasen, Cruciferin Speicherproteine.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukleinsäurensequenzen mit den Genbank Accession-Nummern X92657, M20308, AJ002399, A19451, U40256, AB039325, L25042, S78423, U32624, U77378, V01311, AB044391, AF163819, X78815, AF306348, M60214, X68141, AJ222980, AF078796, AJ302043, X92890, AJ271162, X14555.
12. Transgener Organismus transformiert mit einer Expressions­ kassette gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 oder einem Vektor gemäß Anspruch 6.
13. Transgener Organismus nach Anspruch 12 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen und pflanzlichen Organismen
14. Zellkulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut abgeleitet von einem transgenen Organismus nach einem cler Ansprüche 12 oder 13.
15. Verwendung eines transgenen Organismus nach einem der Ansprüche 12 oder 13 oder von diesem abgeleitete Zell­ kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut nach Anspruch 14 zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Feinchemikalien Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, natürliche oder synthetische Geschmacks-, Aroma- oder Farbstoffe sind.
17. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Pharmazeutikum ein Antikörper, Enzym oder pharmazeutisch aktives Protein ist.
18. Verfahren zur Herstellung von Pharmazeutika oder Fein­ chemikalien in transgenen Organismen nach einem der Ansprüche 12 oder 13 oder von diesen abgeleiteten Zell­ kulturen, Teilen oder transgenes Vermehrungsgut, dadurch gekennzeichnet, dass der transgene Organismus gezüchtet und das gewünschte Pharmazeutikon oder die gewünschte Feinchemikalie isoliert wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Feinchemikalien Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, natürliche oder synthetische Geschmacks-, Aroma- oder Farbstoffe sind.
20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Pharmazeutikum ein Antikörper, Vakzine, Enzym oder pharmazeutisch aktives Protein ist.
DE2001127882 2001-06-11 2001-06-11 Expressionskonstrukte zur transgenen Expression von Nukleinsäuren Withdrawn DE10127882A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2001127882 DE10127882A1 (de) 2001-06-11 2001-06-11 Expressionskonstrukte zur transgenen Expression von Nukleinsäuren

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2001127882 DE10127882A1 (de) 2001-06-11 2001-06-11 Expressionskonstrukte zur transgenen Expression von Nukleinsäuren

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE10127882A1 true DE10127882A1 (de) 2002-12-12

Family

ID=7687654

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2001127882 Withdrawn DE10127882A1 (de) 2001-06-11 2001-06-11 Expressionskonstrukte zur transgenen Expression von Nukleinsäuren

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE10127882A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112326966A (zh) * 2020-11-02 2021-02-05 杭州昱鼎生物科技有限公司 一种新型冠状病毒抗原的快速检测试剂盒及其制备方法和应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112326966A (zh) * 2020-11-02 2021-02-05 杭州昱鼎生物科技有限公司 一种新型冠状病毒抗原的快速检测试剂盒及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1487979B1 (de) Konstrukte und verfahren zur regulation der genexpression
DE10224889A1 (de) Verfahren zur stabilen Expression von Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen
DE112010003162T5 (de) Gesamtsamen-spezifischer Promotor
EP1409697B1 (de) Expressionskassetten zur transgenen expression von nukleinsäuren
DE10225066A1 (de) Neue Expressionssysteme für Pflanzen
EP1604027A2 (de) Expressionskassette mit promotoren der stärkesynthase 3 zur expression von nukleinsäuren in stärkehaltigen geweben von pflanzen
EP1711612B1 (de) Expressionskassetten zur bidirektionalen transgenen expression von nukleinsäuren in pflanzen
EP1537218B1 (de) Transgene expressionskassetten zur expression von nukleinsäuren in nicht-reproduktiven blütengeweben von pflanzen
DE10133407A1 (de) Expressionskassetten zur transgenen Expression von Nukleinsäuren
DE10127882A1 (de) Expressionskonstrukte zur transgenen Expression von Nukleinsäuren
WO2003008596A2 (de) Expressionskassetten zur transgenen expression von selektionsmarkern
EP1539967B1 (de) Expressionskassetten zur expression von nukleinsäuren in kohlenhydrat-speichernden sink-geweben von pflanzen
DE10212893A9 (de) Verfahren zum Erhöhen des Ölgehaltes in Pflanzen
WO2002034924A2 (de) Expressionskassetten zur transgenen expression von nukleinsäuren in der pflanzlichen embryonalen epidermis und der blüte
WO2004027069A1 (de) Transgene expressionskassetten zur expression von nukleinsäuren in der pflanzlichen blüte
EP1880011A2 (de) Transgene expressionskassetten zur expression von nukleinsäuren in blütengeweben von pflanzen
DE10207582A1 (de) Expressionskassetten zur transgenen Expression von Nukleinsäuren
Pouramini Biotechnological modulation of hordein accumulation in barley grains for molecular farming
WO2002002786A1 (de) Promotoren zur genexpression in karyopsen von pflanzen
DE10131789A1 (de) Promotor für die spezifische Expression in Transferzellen pflanzlicher Embryonen
DE10159455A1 (de) Expressionskassetten zur transgenen Expression von Nukleinsäuren
EP1190081A2 (de) Pflanzen mit veränderter genexpression
EP1554388A1 (de) Transgene expressionskassetten zur expression von nukleinsäuren in der pflanzlichen blüte
DE10231587A1 (de) Transgene Expressionskonstrukte und Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen

Legal Events

Date Code Title Description
8139 Disposal/non-payment of the annual fee