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WO2000017653A2 - Salmonellenantigenformulierung und kit zur bestimmung von antikörpern gegen salmonellen - Google Patents

Salmonellenantigenformulierung und kit zur bestimmung von antikörpern gegen salmonellen Download PDF

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WO2000017653A2
WO2000017653A2 PCT/DE1999/003017 DE9903017W WO0017653A2 WO 2000017653 A2 WO2000017653 A2 WO 2000017653A2 DE 9903017 W DE9903017 W DE 9903017W WO 0017653 A2 WO0017653 A2 WO 0017653A2
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WO
WIPO (PCT)
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salmonella
lps
antigen
conjugate
serum albumin
Prior art date
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PCT/DE1999/003017
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English (en)
French (fr)
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WO2000017653A3 (de
Inventor
Anton Gabert
Jörg GABERT
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Indical Bioscience GmbH
Original Assignee
Labor Diagnostik GmbH
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Publication date
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Priority to EP99955751A priority patent/EP1114321A2/de
Priority to JP2000571263A priority patent/JP2002525605A/ja
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Publication of WO2000017653A3 publication Critical patent/WO2000017653A3/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to a salmonella antigen formulation and a kit for the determination of antibodies against salmonella in meat juice, serum or egg yolk samples or other liquids. Connection with an immunological determination method, in particular a heterogeneous ELISA test.
  • Salmonella Human diseases caused by Salmonella are caused in particular by contaminated food. In addition to the pathogens which are adapted to certain animal species or to humans, a large number of serovars can trigger salmonellosis or infections in humans and animals. In the field of veterinary and human medicine, food control and animal production, there is also an increasing need for fast and safe methods for the detection of Salmonella due to the large number of illnesses and for consumer protection reasons. Different methods are known for the detection and determination of Salmonella. In this way, bacteria can be cultivated on various nutrient media. Serological typing is possible via selective enrichment on solid selective nutrient media. This procedure takes a total of 4-5 days.
  • LPS Lipopolysaccharides
  • STM Salmonella Typhimurium
  • SCS Salmonella Cholereasuis
  • ELISA solid phase carriers bind lipopolysaccharides (LPS) far less, inhomogeneously or unstably than proteins. If different LPS preparations are used to bind to a carrier, displacement, anticompetition, cross-reactivities or antigen unmasking can strengthen the already unfavorable binding properties of the LPS and make it difficult to use in diagnostic test systems or make them almost impossible for certain tasks.
  • LPS lipopolysaccharides
  • the invention has for its object to provide improved means and methods for the serological or immunological detection of various Salmonella serovars, in particular for the determination of anti-Salmonella antibodies.
  • an antigen formulation according to claim 1 and a test kit for the detection of antibodies against Salmonella in meat juice, egg yolk or serum samples in connection with an immunological determination method, in particular a heterogeneous ELISA test according to claim 9, in which the carrier with the Salmonella antigen formulation according to the invention is loaded with antibodies to be detected for an immunological reaction.
  • Claims 2 to 8 and claims 10 to 19 contain further advantageous embodiments of the invention.
  • the salmonella antigen formulation according to the invention very good binding properties to diagnostic solid phase carriers can be achieved.
  • the advantageous binding properties of the proteins are transferred to the Salmonella LPS which is of only limited suitability as a result of their disadvantageous binding properties for the coating of diagnostic solid phase carriers.
  • stable, homogeneous and sensitive LPS antigen coatings on microtitration plates can be produced and diagnostic systems can be developed that meet the requirements of classic Salmonella serology, detection of antibodies against certain Salmonella serovars depending on the task.
  • the carrier is provided with a conjugate of STM-LPS with bovine serum albumin (BSA) and a Salmonella antigen of the Salmonella cholera suis (SCS) type, the best binding properties in a range of 1: 0 according to the invention , 5 to 1: 3 of a conjugation of STM-LPS with BSA and a ratio of SCS to STM-LPS-BSA conjugate of 1:10 to 1: 200 were detected.
  • BSA bovine serum albumin
  • SCS Salmonella antigen of the Salmonella cholera suis
  • the salmonella antigen formulation according to the invention not only has good binding properties but also high stability.
  • the Salmonella antigen formulation according to the invention is not cross-reactive and, for example, in the formulation antigen mixture of a Salmonella-LPS-serum albumin conjugate based on a Salmonella antigen of the Salmonella Typhimurium (STM) type and a Salmonella antigen of the Salmonella Choleraesuis (SCS) type, allows the detection of at least 90 % of the most frequently detected serotypes.
  • STM Salmonella antigen of the Salmonella Typhimurium
  • SCS Salmonella Choleraesuis
  • the salmonella antigen formulation according to the invention binds very well to carriers, e.g. For example, microtiter plates as used for ELISA tests. The carriers can thus be prefabricated and made available for analysis. This eliminates the need for coating by the user.
  • the carrier is provided with a conjugate of STM-LPS with bovine casein and an STM-Salmonella LPS, with very good binding properties according to the invention in a range from 1: 0.5 to 1: 3 of a conjugation of STM-LPS with casein and an STM-LPS conjugate to STM-LPS ratio of 1: 1 were detected.
  • This antigen formulation enables the simultaneous detection of antibodies against the serovars S. Enteritidis, S. Thvphimurium and S. Gallinarum-pullorum, which are relevant for poultry farming, with again very good binding to microtiter plates and good storage stability of the prefabricated microtiter plates.
  • the prefabricated test systems according to the invention can be provided in stock and used as required and enable broad-based investigations (screening) with large numbers of samples, as are required in the fields of medicine and agriculture.
  • kits according to the invention consist of various control sera, wash buffer concentrate, dilution buffer and anti-antibody enzyme conjugate, as well as a corresponding substrate and stop solution.
  • An anti-porcine immunogluboline peroxidase conjugate is advantageously used as an anti-antibody enzyme conjugate for the detection of antibodies against salmonella in pig sera
  • an anti-chicken-immunogluboline peroxidase conjugate and tetramethylbenzidine (TMB) as substrate solution are advantageously used for the detection of antibodies against salmonella in chicken sera and diluted HC1 used as a stop solution.
  • the STM / SCS salmonella antigens are obtained from a salmonella culture according to the method of Appelmelk, BJ et al, J. of Immunolog. Methods, 82 (1985): 199-207 "An Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for the measurement of Antibodies to different Parts of the gram-negative Lipopolysaccharide Core Region".
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • the Salmonella LPS-type are then combined with a serum albumin to form the Salmonella-LPS-serum albumin conjugate. This is done according to the method described by Galanos, C, ETRietschel, O.Lüderitz, O.Westphal, 1972, Eur.J.Biochem. 31, 230.
  • the coating of the support e.g. in the form of a microtiter plate is carried out by incubation with the antigen formulation according to the invention, blocking the free binding sites with a protein solution in the presence of a buffer solution.
  • the carriers thus produced are washed and then dried.
  • Salmonella-positive and salmonella-negative non-cross-reactive sera are used as control sera. It has been shown to be particularly advantageous for the determination of Salmonella antibodies in control sera of Salmonella positive animals which have been immunized by field infections or vaccinations.
  • the sample to be examined is brought into contact with the carrier coated with the salmonella antigen formulation according to the invention.
  • Specific antibodies to Salmonella form a complex with the antigen during the incubation of the sample in the coated well. Unbound material is removed by suction or knocking out and washing with the wash buffer solution.
  • the anti-antibody enzyme conjugate is then added. Unbound antibody conjugate is removed by suction or knocking out and washing with the washing buffer solution.
  • TMB as a substrate leads to color development (substrate conversion) by means of an antibody bound to an antibody.
  • the color reaction can then be used for the spectrophotometric determination of the amount of Salmonella antibodies in the sample and is proportional to this.
  • test sera are carried out with control sera and the measured extinctions of the control sera are related to their specified concentrations. From this, either a regression line is calculated, with the help of which the concentration of Salmonella antibodies can be calculated on the basis of the measured absorbance of the samples. Or positive, negative or questionable sample antibody contents are calculated from the control sera carried with the aid of a predetermined cut-off formula.
  • a culture in the 50th of the required Salmonella serotypes S.thyphimurium and S.choleraee suis available from the Robert Koch Institute, Federal Institute for Infectious Diseases and Non-Communicable Diseases, National Reference Center for Salmonella and other Enteritis Agents, PO Box, 38843 Wernigerode) 1 fermenter set up and incubated at 37 ° C for 8 hours. 505 ml of a 36% formaldehyde solution are then added to the culture in order to obtain a final concentration of 1% formalin in the culture for killing the germs. Incubate at room temperature for at least 4 hours.
  • the culture is now concentrated by means of tangential filtration.
  • the cell suspension is centrifuged at 8,000 rpm for 30 minutes.
  • the cell sediment is washed 3 times with phosphate buffer (PBS), 30 minutes at 8,000 rpm.
  • PBS phosphate buffer
  • the cell suspension is placed in 3 x 2,000 ml screw-top bottles (approx. 300 ml per bottle) and placed in the refrigerator overnight.
  • the bottles are closed, shaken well and placed in the freezer at -22 ° C for 2-3 hours.
  • step 12. After repeating step 11. two more times, the bottles are placed in the freezer overnight.
  • the sediments are then divided into several petri dishes, which are then left under a hood overnight so that the remaining acetone can evaporate.
  • the dried cell sediment is ground into powder in a mortar and left overnight in an open, weighed Erlenmeyer flask in the fume cupboard.
  • the pulverized cells are 1: 1 with sterile distilled water. solved.
  • the cell suspension is incubated in a 65 ° C water bath for 5 minutes.
  • the phenol solution and the cell suspension are now mixed 1: 1 in a 2,000 ml round bottom flask, shaken vigorously and incubated for a further 20 min at 65 ° C in a shaking water bath.
  • the flasks are cooled to 4 ° C in an ice water bath.
  • the content of the dialysis tubing is collected again, checked for clarity and, if particles are still visible, for 20 min. Centrifuged at 5,000 g.
  • the Salmonella LPS antigens obtained are distilled in aqua dest. dissolved, which contains 0.5% o TEA (triethanolamine).
  • the En ⁇ concentration Salmonella - LPS antigen is adjusted to 1 mg / ml.
  • BSA suspension Bovine Serum Albumin (10 mg / ml) in 0.5% TEA is mixed in equal parts with the Salmonella LPS antigen suspension prepared from 3.
  • the mixture obtained is filled into 1.0 ml aliquots and lyophilized.
  • the lyophilized Salmonella-LPS-BSA mixture is resuspended in 1 ml of 0.5% TEA.
  • Step 5 is repeated 3 times and step 6 is repeated 2 times.
  • the salmonella-LPS-BSA conjugate obtained in this way is stored at 2-8 ° C.
  • a salmonella antigen mixture is prepared from an aqueous solution of 0.04 mg / 1 SCS-LPS and 4.0 mg / 1 STM-LPS-BSA conjugate.
  • a microtitre plate from Nunc / Nunc Polysorb is coated by incubating 100 ⁇ l / well with the salmonella antigen mixture at 12 ° C. for 12 hours. After the incubation, unbound salmonella antigen mixture is suctioned off and the plate 3x with 250 ⁇ l / well with Aqua purif. washed. The free binding sites are then blocked with 200 ⁇ l of a 1% serum albumin solution in carbonate buffer (0.1M, pH 9.6) for 15 minutes at room temperature. This is followed by a washing step of 2 x 250 ⁇ l washing buffer (PBS-Tween) / well before the coated and blocked microtiter plates are dried in an air stream for 12-14 hours.
  • PBS-Tween 2 x 250 ⁇ l washing buffer
  • the kit consists of the following reagents: Reagents: Quantity:
  • Anti-antibody conjugate (rabbit-anti-pig-horseradish-peroxidase conjugate) in buffer with protein stabilizers, concentrate, preserved with thimerosal 50 ⁇ l
  • Control serum No. 1 salmonella positive, serum obtained from hyperimmunized pigs, lyophilized 300 ⁇ l
  • Control serum No. 2 salmonella positive, serum obtained from hyperimmunized pigs, lyophilized 300 ⁇ l
  • Control serum No. 3 salmonella-positive, serum obtained from hyperimmunized pigs, lyophilized 300 ⁇ l
  • Control serum No. 4 salmonella-positive, serum obtained from hyperimmunized pigs, lyophilized 300 ⁇ l
  • Meat juice - usually obtained by freezing and thawing the muscles of the diaphragm pillar - is diluted 1:30 with sample dilution buffer.
  • the measured extinctions of the control sera are related to their given concentrations and then a regression line is calculated, with the help of which the concentration of Salmonella antibodies is calculated on the basis of the measured extinctions of the samples.
  • Comparative tests were carried out over a period of 6 months with coated and blocked microtiter plates. Variations coefficients CV of 2.29 - 8.7% were determined with a measured sample volume of 94 / plate / month. These results demonstrate a high long-term stability of the plates coated according to the invention. Control tests prove a high accuracy of the determinations carried out. The controls used were examined for their cross-reactivity and proven to be non-cross-reactive.
  • An LPS antigen is produced from the required Salmonella serotype S.Typhimurium analogously to embodiment 1.
  • the Salmonella LPS antigen obtained is distilled in aqua dest. dissolved, which contains 0.5% TEA (triethanolamine)
  • the final concentration of Salmonella LPS antigen is adjusted to 1 mg / ml.
  • the mixture obtained is filled into 1.0 ml aliquots and lyophilized.
  • the lyophilized Salmonella-LPS-casein mixture is resuspended in 1 ml of 0.5% TEA.
  • Step 5 is repeated 3 times and step 6 is repeated 2 times.
  • Polysorb is carried out by incubating 100 ⁇ l / well with the Salmonella - LPS - casein /
  • Salmonella - LPS - mixed antigen over 12 hours at 7 ° C.
  • Carbonate buffer (0.1M, pH 9.6) 15 min at room temperature.
  • washing step 2x 250 ⁇ l washing buffer (PBS-Tween) / well before the microtitre plates coated and blocked with the antigen mixture are dried in an air stream for 12-14 hours.
  • PBS-Tween 2x 250 ⁇ l washing buffer
  • the kit consists of the following reagents:
  • Negative control 10-fold antibody concentration, chicken serum not reacting to STM and SE in buffer with protein stabilizers, use 100 ⁇ l after dilution with dilution buffer
  • Antibody conjugate concentrate in buffer with protein stabilizers, use 100 ⁇ l after dilution with dilution buffer
  • the evaluation is carried out by calculating cut-off values from the measured values of the positive and negative controls contained in the test kit.
  • the negative control (NK) must give an average (MW) ⁇ 0.3 OD and the positive control (PK) an average> 0.6 OD.
  • the blank value of position AI should be less than 0.1 OD and must not be greater than 0.2 OD.
  • Samples with OD values> the positive cut-off are considered positive if the test is valid. 1. Samples with OD values between the negative and the positive cut-off must be tested repeatedly, possibly at a later point in time after taking the sample again.
  • the salmonella antigen formulation By using the salmonella antigen formulation, a homogeneous, stable and highly sensitive antigen coating is achieved.
  • the shelf life and homogeneity of the microtitre plates coated with the salmonella antigen formulation are improved and enable the production of standardized ELISA test systems.
  • a test system produced on the basis of the antigen formulation according to the invention, STM-LPS-casein conjugate STM-LPS mixed antigen enables the simultaneous detection of antibodies against Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium and Salmonella gallinarum-pullorum.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Salmonellenantigenformulierung aus mindestens einem LPS-Protein-Konjugat von Salmonella enterica und einen Kit zur Bestimmung von Antikörpern gegen Salmonellen in Fleischsaft-, Serum- oder Eigelbproben oder anderen Flüssigkeiten in Verbindung mit einer immunologischen Bestimmungsmethode, insbesondere einem heterogenen ELISA-Test. Dabei ist der Festphasenträger mit der erfindungsgemässen Salmonellenantigenformulierung für eine immunologische Reaktion mit Antikörpern beladen.

Description

Salmonellenantigenformulierung und Kit zur Bestimmung von Antikörpern gegen Salmonellen
Die Erfindung betrifft eine Salmonellenantigenformulierung und einen Kit zur Bestimmung von Antikörpern gegen Salmonellen in Fleischsaft-, Serum- oder Eigelbproben oder anderen Flüssigkeiten 4» Verbindung mit einer immunologischen Bestimmungsmethode, insbesondere einem heterogenen ELISA-Test.
Durch Salmonellen verursachte Krankheiten beim Menschen werden insbesondere über kontaminierte Lebensmittel hervorgerufen. Neben den an bestimmte Tierarten oder an den Menschen angepaßten Erregern können eine Vielzahl von Serovaren bei Mensch und Tier Salmonellosen oder Infektionen auslösen. Für den Bereich der Veterinär- und Humanmedizin, der Lebensmittelkontrolle und der Tierproduktion besteht auch aufgrund der Vielzahl von Krankheitsfällen und aus Verbraucherschutzgründen ein steigender Bedarf an schnellen und sicheren Verfahren zum Nachweis von Salmonellen. Zum Nachweis und zur Bestimmung von Salmonellen sind unterschiedliche Methoden bekannt. So können Bakterien auf verschiedenen Nährböden kultiviert werden. Über eine Selektivanreicherung auf festen Selektivnährböden ist eine serologische Typisierung möglich. Insgesamt dauert dieses Verfahren 4-5 Tage.
Unter Verwendung immunologischer Bestimmungsmethoden, insbesondere eines heterogenen ELISA-Tests ist auch der Nachweis von Salmonellenantikörpern bekannt (Enzyme-linked immunosorbent assay for Salmonella serology using lipopolysaccharide antigen, JNet.Diagn.Invest. 7: 481 - 487 ( 1995 )Bradford P.Smith, George W.Dilling, John K.House, Hans Konrad, Nadia Moore). Dabei ist eine Mikrotiterplatte mit einem Salmonellenantigen beschichtet. Spezifische Antikörper gegen Salmonellen bilden während der Inkubation der Probe in der beschichteten Vertiefung einen Komplex mit dem Antigen. Nicht gebundenes Material wird durch Waschen entfernt. Ein zweiter, enzymmarkierter Antikörper, der gegen den antigengebundenen Antikörper gerichtet ist, bindet sich an die antigengebundenen Antikörper. Ungebundenes Konjugat wird herausgewaschen. Die Hinzugabe einer Farbreagenz (Substrat) fuhrt dann zu einer Farbentwicklung (Substratumsetzung) durch antikörpergebundenes Enzym. Die Farbreaktion kann dann zur spektrophotometrischen Bestimmung der Menge von Salmonella-Antikörpern in der Probe genutzt werden und ist dieser proportional. Als Salmonellenantigene werden dabei Lipopolysaccharide (LPS), in speziellen Fällen LPS von Salmonellen vom Typ Salmonella Typhimurium (STM) und Salmonella Cholereasuis (SCS), verwandt. Die Bindung dieser Salmonellenantigene an die Mikrotiterplatte ist schwierig und insbesondere für die Automatisierung der Nachweisverfahren unzureichend. Die schlechte Bindung dieser Salmonellenantigene insbesondere in deren Kombination und deren Reaktivitätsverlust erfordert häufig eine frische Testplattenbeladung vor Testdurchführung. Damit wird aber auch für diese Bestimmungsmethode ein Zeitraum von mindestens 2 Tagen benötigt. Als nachteilig hat sich auch herausgestellt, daß die STM-bzw. SCS-Antikörper positiven Kontrollen zu mehr als 30% mit SCS- bzw. STM-LPS-Antigen kreuzreaktiv reagieren.
Die bisherige Diagnostik wird dadurch erschwert, daß von den über 2000 bekannten und im Kauffmann-White-Schema gruppierten Serovaren je nach diagnostischem Zweck einerseits ein möglichst breites Spektrum erfaßt werden soll, wie für die serologische Kontrolle von Schweinebeständen, oder aber nur Wert auf den Nachweis bestimmter Serovare gelegt wird, z. Bsp. in Geflügelbeständen, hier wird der Nachweis bzw. Ausschluß von S. Typhimurium und S. Enteritidis sowie S. Gallinarum-pullorum gefordert. Die mit den O-Antigenen korrespondierenden LPS-Antigene der Salmonellen müssen für den Einsatz in ELISA-Tests an Festphasenträger, im allgemeinen Mikrotitrationsplatten, gebunden werden. ELISA- Festphasenträger binden Lipopolysaccharide (LPS) jedoch im Vergleich zu Proteinen weitaus geringer, inhomogener oder instabiler. Bei Einsatz verschiedener LPS-Präparationen zur Bindung an einen Träger können Verdrängung, Konkurrenzhemmung, Kreuzreaktivitäten oder Antigendemaskierung die schon ohnehin ungünstigen Bindungseigenschaften der LPS verstärken und den Einsatz in diagnostischen Testsystemen erschweren oder für bestimmte Aufgabenstellungen nahezu unmöglich werden lassen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, verbesserte Mittel und Methoden für den serologischen bzw. immunologischen Nachweis von verschiedenen Salmonellen-Serovaren, insbesondere zur Bestimmung von Anti-Salmonella- Antikörpern bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch eine Antigenformulierung nach Anspruch 1 und einen Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen Salmonellen in Fleischsaft-, Eigelb- oder Serumproben in Verbindung mit einer immunologischen Bestimmungsmethode, insbesondere einem heterogenen ELISA-Test nach Anspruch 9 gelöst, bei dem der Träger mit der erfindungsgemäßen Salmonellenantigenformulierung für eine immunologische Reaktion mit nachzuweisenden Antikörpern beladen ist. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung enthalten die Ansprüche 2 bis 8 sowie die Ansprüche 10 bis 19.
Mit der erfindungsgemäßen Salmonellenantigenformulierung lassen sich sehr gute Bindungseigenschaften an diagnostische Festphasenträger erreichen. Durch die Kopplung an Proteine werden die vorteilhaften Bindungseigenschaften der Proteine auf die infolge ihrer nachteiligen Bindungseigenschaften für die Beschichtung von diagnostischen Festphasenträgern nur beschränkt geeigneten Salmonellen-LPS übertragen. Dadurch lassen sich stabile, homogene und sensitive LPS-Antigenbeschichtungen von Mikrotitrationsplatten herstellen und diagnostische Systeme entwickeln, die den Anforderungen der klassischen Salmonellenserologie, Nachweis von Antikörpern gegen bestimmte, je nach Aufgabenstellung verschiedene Salmonellenserovare, gerecht werden. Neben dem Einsatz nur eines modifizierten, an Proteine gekoppelten Salmonellen-LPS sind Kombinationen mit weiteren Salmonellen-LPS-Protein-Konjugaten und/oder Antigenpräparationen von Salmonellen und gleichzeitig auch mit Präparationen von anderen Bakterien, z. Bsp. LPS-Proteinkonjugaten andererer gramnegativer Bakterien möglich. Wegen der Vielzahl der im Kauffmann-White- Schema erfaßten Salmonellen O-Antigene und der daraus resultierenden diagnostischen Zielstellung kann für jeden Anwendungszweck eine geeignete Antigenzusammenstellung ausgewählt werden, deren Einzelkomponente oder Komponenten nach erfindungsgemäßer Kopplung an Proteine und Bindung an Festphasenträger in diagnostischen Systemen eingesetzt werden können. Die an Proteine gekoppelten LPS-Konjugate ermöglichen wegen ihrer vorteilhaften Eigenschaften kombinierbare, homogene, sensitive und lagerungsstabile Festphasenträgerbeschichtungen für Immunoassaytestsysteme.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist der Träger mit einem Konjugat aus STM-LPS mit Rinder-Serumalbumin (BSA) und einem Salmonellenantigen vom Typ Salmonella cholera suis (SCS) versehen, wobei erfindungsgemäß die bei weitem besten Bindungseigenschaften in einem Bereich von 1 : 0,5 bis 1 : 3 einer Konjugation von STM- LPS mit BSA und einem Verhältnis SCS zu STM-LPS-BSA-Konjugat von 1 : 10 bis 1 : 200 nachgewiesen wurden.
Überraschend wurde festgestellt, daß die erfmdungsgemäße Salmonellenantigenformulierung neben guten Bindungseigenschaften auch eine hohe Stabilität aufweist. Die erfindungsgemäße Salmonellenantigenformulierung ist nicht kreuzreaktiv und erlaubt zuni Beispiel in der Formulierung Antigengemisch aus einem Salmonellen-LPS-Serumalbumin- Konjugat auf Basis eines Salmonellen-antigens vom Typ Salmonella Typhimurium (STM) und einem Salmonellenantigen vom Typ Salmonella Choleraesuis (SCS) den Nachweis von mindestens 90 % der am häufigsten nachgewiesenen Serotypen. Die erfindungsgemäße Salmonellenantigenformulierung bindet sehr gut an Träger, z. Bsp. Mikrotiterplatten, wie sie für ELISA-Tests verwendet werden. Die Träger können damit vorgefertigt und für die Analyse bereitgestellt werden. Damit entfällt die Beschichtung durch den Anwender.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist der Träger mit einem Konjugat aus STM-LPS mit Rinder-Casein und einem STM-Salmonellen-LPS versehen, wobei erfindungsgemäß sehr gute Bindungseigenschaften in einem Bereich von 1 : 0,5 bis 1 : 3 einer Konjugation von STM-LPS mit Casein und einem Verhältnis STM-LPS-Konjugat zu STM- LPS von 1:1 nachgewiesen wurden. Die spezielle Beschaffenheit dieser Antigenformulierung ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von Antikörpern gegen die für die Geflügelwirtschaft relevanten Serovare S. Enteritidis, S. Thvphimurium und S. Gallinarum-pullorum bei wiederum sehr guter Bindung an Mikrotiterplatten und guter Lagerungsstabilität der vorgefertigten Mikrotiterplatten.
Die vorfabrizierten erfindungsgemäßen Testsysteme können lagermäßig bereitgestellt und nach Bedarf benutzt werden und ermöglichen breit angelegte Untersuchungen (Screening) mit hohen Probenzahlen, wie sie in den Bereichen Medizin und Landwirtschaft gefordert werden.
Die erfindungsgemäßen Kits bestehen neben dem mit der erfindungsgemäßen Salmonellenantigenformulierung beschichteten Träger aus verschiedenen Kontrollseren, Waschpufferkonzentrat, Verdünnungspuffer und Anti-Antikörperenzymkonjugat sowie entsprechender Substrat- und Stoplösung. Als Anti-Antikö erenzymkonjugat wird für den Nachweis von Antikörpern gegen Salmonellen in Schweineseren vorteilhaft ein Anti- Schwein-Immunoglubolin-Peroxidasekonjugat sowie für den Nachweis von Antikörpern gegen Salmonellen in Hühnerseren vorteilhaft ein Anti-Huhn-Immunoglubolin- Peroxidasekonjugat und Tetramethylbenzidin (TMB) als Substratlösung sowie verdünnte HC1 als Stoplösung verwandt. Die STM/SCS-Salmonellenantigene werden aus einer Salmonellenkultur nach der Methode von Appelmelk, B. J. et al, J. of Immunolog. Methods, 82 (1985): 199 - 207 "An Enzyme- Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for the measurement of Antibodies to different Parts of the gram-negative Lipopolysaccharide Core Region" gewonnen. Anschließend werden die Salmonellen-LPS vom Typ mit einem Serumalbumin zum Salmonellen-LPS-Serumalbumin- Konjugat verbunden. Dies erfolgt nach der von Galanos, C, E.T.Rietschel, O.Lüderitz, O.Westphal, 1972, Eur.J.Biochem.31, 230, beschriebenen Methode.
Die Beschichtung des Trägers, z.B. in Form einer Mikrotiteφlatte erfolgt durch Inkubation mit der erfindungsgemäßen Antigenformulierung, Blockung der freien Bindungsstellen mit einer Proteinlösung in Gegenwart einer Pufferlösung. Die so gefertigten Träger werden gewaschen und anschließend getrocknet.
Als Kontrollseren werden salmonellapositive und salmonellanegative nichtkreuzreaktive Seren verwendet. Als besonders vorteilhaft haben sich für die Bestimmung von Salmonellen- Antiköφern in Kontrollseren von Salmonellen positiven Tieren gezeigt, die durch Feldinfektionen oder Impfungen immunisiert wurden.
Die zu untersuchende Probe wird mit dem mit der erfindungsgemäßen Salmonellenantigenformulierung beschichteten Träger in Verbindung gebracht. Spezifische Antiköφer gegen Salmonellen bilden während der Inkubation der Probe in der beschichteten Vertiefung einen Komplex mit dem Antigen. Nicht gebundenes Material wird durch Absaugen oder Ausschlagen und Waschen mit der Waschpufferlösung entfernt. Danach wird das Anti-Antiköφerenzymkonjugat zugegeben. Nicht gebundenes Antiköφerenzymkonjugat wird durch Absaugen oder Ausschlagen und Waschen mit der Waschpufferlösung entfernt. Die Hinzugabe von TMB als Substrat führt zu einer Farbentwicklung (Substratumsetzung) durch antiköφergebundenes Enzym. Die Farbreaktion kann dann zur spektrophotometrischen Bestimmung der Menge von Salmonella-Antiköφern in der Probe genutzt werden und ist dieser proportional.
Zum Vergleich werden Versuche mit Kontrollseren durchgeführt und die gemessenen Extinktionen der Kontrollseren zu ihren angegebenen Konzentrationen ins Verhältnis gesetzt. Daraus wird entweder eine Regressionsgerade berechnet, mit deren Hilfe anhand der gemessenen Extinktion der Proben deren Konzentration an Salmonellenantiköφern berechnet werden kann. Oder es werden aus den mitgeführten Kontrollseren unter Zuhilfenahme einer vorgegebenen Cut-Off-Formel positiv, negativ oder fraglich einzustufende Proben- Antiköφergehalte errechnet.
Anhand nachfolgender Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert:
Ausführungsbeispiel 1
Herstellung einer Antigenformulierung und eines Festphasenträgers und Einsatz in einem Testkit zum Nachweis von Schweine-Antikörpern gegen Salmonellen
Herstellung des Salmonella - LPS - Antigens
1. Von den benötigten Salmonella Serotypen S.thyphimurium und S.choleraee suis (erhältlich bei Robert Koch - Institut, Bundesinstitut für Infektionskrankheiten und nicht übertragbare Krankheiten, Nationales Referenzzentrum für Salmonellen und andere Enteritiserreger, Postfach, 38843 Wernigerode) wird jeweils eine Kultur im 50 1 Fermenter angelegt und 8 Stunden bei 37 °C inkubiert. In die Kultur gibt man anschließend 505 ml einer 36%igen Formaldehydlösung, um in der Kultur eine Endkonzentration von 1% Formalin zur Abtötung der Keime zu erhalten. Inkubation bei Raumtemperatur für mindestens 4 Stunden.
2. Anlegen einer Sterilkontrolle für jede Kultur und 24 bis 48 Stunden Inkubation.
3. Die Kultur wird nun mittels Tangentialfiltration eingeengt.
4. Die Zellsuspension wird 30 Minuten bei 8.000 U/min zentrifügiert.
5. Das Zellsediment wird 3 mal mit Phosphatpuffer (PBS) gewaschen, 30 Minuten bei 8.000 U/min.
6. Anschließend wird das Zellsediment 1 :1 in sterilem Aqua dest. resuspendiert.
7. Die Zellsuspension wird in 3 mal 2.000 ml Schraubflaschen gegeben (ca. 300 ml pro Flasche) und kommt über Nacht in den Kühlschrank.
8. Aceton für den nächsten Arbeitsschritt am darauffolgenden Tag vorbereiten: 22 mal 500 ml Aceton kommt über Nacht in den Gefrierschrank bei - 22 °C.
9. In die Flaschen mit der Zellsuspension wird nun jeweils 1.500 ml kaltes Aceton gegeben.
10. Die Flaschen werden verschlossen, gut geschüttelt und kommen für 2 - 3 Stunden bei -22°C in den Gefrierschrank.
11. Der klare Überstand wird vorsichtig abgesaugt und verworfen. Dann werden pro Flasche 500 ml kaltes Aceton aufgefüllt. Die Flaschen kommen erneut für 2 - 3 Stunden in den Gefrierschrank.
12. Nachdem der Schritt 11. noch zweimal wiederholt wurde, kommen die Flaschen diesmal über Nacht in den Gefrierschrank.
13. Vorsichtig wird erneut der Überstand abgesaugt und verworfen.
14. Die Bodensätze werden abschließend in mehrere Petrischalen verteilt, die man nun über Nacht unter einem Abzug stehen läßt, damit das restliche Aceton verdunsten kann.
15. Das getrocknete Zellsediment wird im Mörser zu Pulver zerrieben und in einem offenen abgewogenen Erlenmeyerkolben im Abzug über Nacht stehen gelassen.
16. Die pulverisierten Zellen werden 1 : 1 mit sterilem Aqua dest. gelöst.
17. Die Zellsuspension wird in einem 65 °C warmen Wasserbad 5 min inkubiert.
18. Entsprechend der Gesamtmenge Zellsuspension benötigt man nun ebensoviel 90%iges Phenol. Dazu löst man das Phenol direkt in den Flaschen durch Zugabe von Aqua dest. Die 90%ige Phenollösung wird ebenfalls auf 65 °C erwärmt und 5 min inkubiert.
19. Die Phenollösung und die Zellsuspension werden nun 1:1 in einem 2.000 ml Rundkolben gemischt, kräftig geschüttelt und für weitere 20 min bei 65 °C im Schüttelwasserbad inkubiert.
20. Die Kolben werden in einem Eiswasserbad auf 4 °C abgekühlt.
21. Zentrifugation des Zelle-/Phenolgemisches in 250 ml Bechern gefüllt mit 150 ml bei 13.000 U / min für 40 min.
22. Die klaren Überstände werden gesammelt und dann in 3 bis 4 Dialyseschläuche ( 15 KD ) gegeben und über Nacht gegen VE - Wasser dialysiert.
23. Der Inhalt der Dialyseschläuche wird wieder gesammelt, auf Klarheit geprüft und falls noch Partikel zu erkennen sind, für 20 min. bei 5.000 g zentrifugiert.
24. Der Überstand bzw. das Dialysat wird gewonnen und mit 0,1% Natriumazid konserviert.
25. Ermittlung der Antigen - Gebrauchsverdünnung. Herstellung des Salmonella - LPS - BSA - Konjugates
1. Die gewonnenen Salmonella - LPS - Antigene werden in Aqua dest. gelöst, welches 0,5%o TEA (Triethanolamin) enthält.
2. Nach erfolgter Resuspendierung erfolgt eine Inkubation im Ultraschallbad für 30 sec.
3. Die EnÖkonzentration Salmonella - LPS - Antigen wird auf 1 mg/ml eingestellt.
4. Die zuvor hergestellte BSA - Suspension (Bovine Serum Albumin) (10 mg/ml) in 0,5% TEA wird zu gleichen Teilen mit der aus 3. hergestellten Salmonella- LPS - Antigen - Suspension gemischt.
5. Das erhaltene Gemisch wird zu Aliquoten von 1 ,0 ml abgefüllt und lyophilisiert.
6. Das lyophilisierte Salmonellen - LPS - BSA - Gemisch wird erneut resuspendiert in 1 ml 0,5%igem TEA.
7. Der Schritt 5. wird 3 mal, der Schritt 6. 2 mal wiederholt.
8. Das so erhaltene Salmonellen - LPS - BSA - Konjugat wird bei 2 - 8 °C gelagert.
Beschichtung der Mikrotiterplatte
Es wird ein Salmonellenantigengemisch aus einer wässrigen Lösung von 0,04 mg/1 SCS-LPS und 4,0 mg/1 STM-LPS-BSA-Konjugat hergestellt. Die Beschichtung einer Mikrotiteφlatte der Fa.Nunc / Nunc Polysorb erfolgt durch Inkubation von 100 μl/Well mit dem Salmonellenantigengemisch über 12 Stunden bei 7 °C. Nach erfolgter Inkubation wird nicht gebundenes Salmonellenantigengemisch abgesaugt und die Platte 3x mit 250μl / Well mit Aqua purif. gewaschen. Es folgt die Blockung der freien Bindungsstellen mit 200μl einer 1%- igen Serumalbuminlösung in Karbonatpuffer (0,1M, pH 9,6) 15 min bei Raumtemperatur. Daran schließt sich ein Waschschritt von 2 x 250μl Waschpuffer (PBS-Tween)/Well an, bevor die beschichteten und geblockten Mikrotiteφlatten 12 - 14 Stunden im Luftstrom getrocknet werden.
Einsatz in einem Testkit Kit und Bestimmungsmethode zum Nachweis von Schweineantikörpern gegen
Salmonellen,
Der Kit besteht aus folgenden Reagenzien: Reagenzien: Menge:
1. Waschpufferkonzentrat - Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20, lOfach konzentriert, konserviert mit
Thimerosal 30 ml
2. Probenvefφ&nnungspuffer, Puffer mit Protein, konserviert mit Natriumazid 2 x 30 ml
3. TMB Substratlösung, gebrauchsfertig 12 ml
4. Stoplösung - 1 M Salzsäure 12 ml
5. Anti-Antiköφer-Konjugat (Kaninchen- Anti-Schwein-Meerrettich- peroxidasekonjugat) in Puffer mit Proteinstabilisatoren, Konzentrat, konserviert mit Thimerosal 50 μl
6. Kontrollserum Nr. 1, salmonellapositiv, von hyperimmunisierten Schweinen gewonnenes Serum, lyophilisiert 300 μl
7. Kontrollserum Nr. 2, salmonellapositiv, von hyperimmunisierten Schweinen gewonnenes Serum, lyophilisiert 300 μl
8. Kontrollserum Nr. 3, salmonellapositiv, von hyperimmunisierten Schweinen gewonnenes Serum, lyophilisiert 300 μl
9. Kontrollserum Nr. 4, salmonellapositiv, von hyperimmunisierten Schweinen gewonnenes Serum, lyophilisiert 300 μl
10. Kontrollserum Nr. 5, salmonellanegativ, von Schweinen gewonnenes Serum mit niedrigem Antiköφertiter, lyophilisiert 300 μl
11. Mit Salmonella- Antigen beschichtete Testplatte (inaktiviert),
96 Vertiefungen pro Platte 1
Probenvorbereitung:
• Fleischsaft - üblicherweise durch Einfrieren und Auftauen von Muskulatur des Zwerchfellpfeilers gewonnen - wird 1 : 30 mit Probenverdünnungspuffer verdünnt.
• Serumproben werden 1 : 400 mit Probenverdünnungspuffer verdünnt. Test-Durchführung:
Alle Reagenzien werden vor der Benutzung auf Raumtemperatur (18 - 23 °C) gebracht und durch leichtes Schütteln gemischt.
1. Registrieren der Kontrollen- und Probenlokalisationen in Doppelbestimmung entsprBqhend der Aufteilung der Testplatte auf einem Arbeitsblatt, z. B. Kl = A1/A2; K2 = B1/B2; K3 = C1/C2; K4 = D1/D2; K5 = E1/E2; übrige Positionen für Proben in Doppelbestimmung
2. Jeweils 100 μl der gelösten Kontrollen sowie der vorverdünnten Proben in die Vertriefungen der Testplatte pipettieren und die Testplatte abdecken
3. 60 min bei Raumtemperatur inkubieren und danach die Vertiefungen entleeren durch Absaugen oder Ausschlagen
4. 3 x Waschen mit je 200 μl vorbereitetem Waschpuffer, nach jedem Waschen den Puffer entleeren
5. In jede Vertiefung 100 μl vorbereitetes Kaninchen- Anti-Schwein-Meerettich- peroxidase-Konjugat geben
6. 60 min bei Raumtemperatur inkubieren und danach die Vertiefungen entleeren durch Absaugen oder Ausschlagen
7. 3 x Waschen mit je 200 μl vorbereitetem Waschpuffer, nach jedem Waschen den Puffer entleeren
8. In jede Vertiefung 100 μl TMB-Substratlösung geben
9. Inkubation bei Raumtemperatur 7 min
10. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 100 μl Stoplösung pro Vertiefung
11. Kalibrierung des Photometers gegen Luft als Leerwert, Messung im Photometer bei 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm.
Auswertung
Die gemessenen Extinktionen der Kontrollseren werden zu ihren angegebenen Konzentrationen ins Verhältnis gesetzt und darauf eine Regressionsgerade berechnet, mit deren Hilfe anhand der gemessenen Extinktionen der Proben deren Konzentration an Salmonellen-Antiköφer berechnet wird. Mit beschichteten und geblockten Mikrotiteφlatten wurden über einen Zeitraum von 6 Monaten Vergleichsversuche durchgeführt. Dabei wurden Variationskoeffizienten CV von 2,29 - 8,7 % bei einem gemessenen Probenvolumen von 94 / Platte / Monat ermittelt. Diese Ergebnisse belegen eine hohe Langzeitstabiltät der erfindungsgemäß beschichteten Platten. Kontrollversuche belegen eine hohe Genauigkeit der durchgeführten Bestimmungen. Untersucht wurden die verwendeten Kontrollen auf ihre Kreuzreaktivität und als nicht kreuzreagierend nachgewiesen.
Ausführungsbeispiel 2
Herstellung einer Antigenformulierung und eines Festphasenträgers und Einsatz in einem Testkit zum Nachweis von Geflügelantikörpern gegen Salmonellen
Herstellung eines Salmonella - LPS - Antigens
1. Von dem benötigten Salmonella-Serotyp S.Typhimurium wird analog Ausführungsbeispiel 1 ein LPS-Antigen hergestellt.
Herstellung eines Salmonella - LPS - Casein - Konjugates
1. Das gewonnene Salmonella - LPS - Antigen wird in Aqua dest. gelöst, welches 0,5% TEA ( Triethanolamin ) enthält
2. Nach erfolgter Resuspendierung erfolgt eine Inkubation im Ultraschallbad für 30 sec.
3. Die Endkonzentration Salmonella - LPS - Antigen wird auf 1 mg/ml eingestellt.
4. Die zuvor hergestellte Casein - Suspension ( from bovine milk ) ( 10 mg/ml ) in 0,5% TEA wird zu gleichen Teilen mit der aus 3. hergestellten Salmonella- LPS - Antigen - Suspension gemischt.
5. Das erhaltene Gemisch wird zu Aliquoten von 1,0 ml abgefüllt und lyophilisiert.
6. Das lyophilisierte Salmonellen - LPS - Casein - Gemisch wird erneut resuspendiert in 1 ml 0,5%igem TEA.
7. Der Schritt 5. wird 3 mal, der Schritt 6. 2 mal wiederholt.
8. Das so erhaltene Salmonellen - LPS - Casein - Konjugat wird bei 2 - 8 °C gelagert. Herstellung des Festphasenträgers
Zunächst wird ein Salmonella - LPS - Casein / Salmonella - LPS - Gemisch im Verhältnis
1 :1 aus einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 1,0 mg 1 STM-LPS-Casein und 1,0 mg/1 STM-Li§ hergestellt. Die Beschichtung einer Mikrotiteφlatte der Fa.Nunc / Nunc
Polysorb erfolgt durch Inkubation von 100 μl/Well mit dem Salmonella - LPS - Casein /
Salmonella - LPS - Mischantigen, über 12 Stunden bei 7 °C.
Nach erfolgter Inkubation wird das Salmonellenantigengemisch abgesaugt und die Platte 3x mit 250μl / Well mit Aqua purif gewaschen.
Es folgt die Blockung der freien Bindungsstellen mit 200μl einer 1%- igen Caseinlösung in
Karbonatpuffer ( 0,1M, pH 9,6 ) 15 min bei Raumtemperatur .
Daran schließt sich ein Waschschritt von 2x 250μl Waschpuffer (PBS-Tween)/Well an bevor die mit dem Antigengemisch beschichteten und geblockten Mikrotiteφlatten 12-14 Stunden im Luftstrom getrocknet werden.
Kit und Bestimmungsmethode zum Nachweis von Geflügelantikörpern gegen
Salmonellen
Der Kit besteht aus folgenden Reagenzien:
1. Mit Salmonella- Antigen beschichtete Testplatte (inaktiviert), 96 Vertiefungen pro Platte 2
2. Positivkontrolle, lOfache Antiköperkonzentration, Huhn-anti-Salmonella-Serum in Puffer mit Proteinstabilisatoren, nach Verdünnung mit Verdünnungspuffer verwenden 100 μl
3. Negativkontrolle, lOfache Antiköperkonzentration, nicht auf STM und SE reagierendes Hühnerserum in Puffer mit Proteinstabilisatoren, nach Verdünnung mit Verdünnungspuffer verwenden 100 μl
4. Probenverdünnungspuffer, Puffer mit Protein, konserviert mit Natriumazid 2 x 60 ml 5. Waschpufferkonzentrat, phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit
Tween 20, lOfach konzentriert, konserviert mit Thiomersal 60 ml
6. Antiköφer-Konjugat (Anti-Huhn-Meerettichperoxidasekonjugat), Konzentrat in Puffer mit Proteinstabilisatoren, nach Verdünnung mit Verdünnungspuffer verwenden 100 μl
7. TMB (TetEarnethylbenzidin) Substratlösung, gebrauchsfertig 24 ml
8. Stoplösung - 1 M Salzsäure, 24 ml
Probenvorbereitung:
• Serumproben 1 :400 mit Verdünnungspuffer verdünnen und mischen
• Eidotter 1 :400 mit Verdünnungspuffer verdünnen und mischen
Test-Durchführung:
Alle Reagenzien werden vor der Benutzung auf Raumtemperatur (18 - 23 °C) gebracht und durch leichtes Schütteln gemischt.
1. 100 μl Verdünnungspuffer in Vertiefung AI als Blankwert pipettieren
2. jeweils 100 μl vorbereitete Positivkontrolle in die Vertiefungen Bl und Cl pipettieren
3. jeweils 100 μl vorbereitete Negativkontrolle in die Vertiefungen Dl und El pipettieren
4. 100 μl der 1:400 verdünnten Proben oder 90 μl Verdünnungspuffer und 10 μl der 1:40 verdünnten Proben in die übrigen Vertiefungen pipettieren und die Testplatte abdecken
5. 60 min bei Raumtemperatur inkubieren und danach die Vertiefungen entleeren durch Absaugen oder Ausklopfen
6. 3x Waschen mit je 200 μl vorbereitetem Waschpuffer, nach jedem Waschen den Puffer entleeren
7. In jede Vertiefung 100 μl vorbereitetes Konjugat geben
8. 60 min bei Raumtemperatur inkubieren und danach die Vertiefungen entleeren durch Absaugen oder Ausklopfen
9. 3x Waschen mit je 200 μl vorbereitetem Waschpuffer, nach jedem Waschen den Puffer entleeren
10. in jede Vertiefung 100 μl TMB-Substratlösung geben
11. Inkubation bei Raumtemperatur 7 min. Für eine exakte Testdurchführung muß jede Vertiefung!, der Testplatte genau 7 min reagieren, d. h. Substrat- und Stoplösung müssen in der gleichen Reihenfolge einpipettiert werden
12. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 100 μl Stoplösung pro Vertiefung
13. Kalibrierung des Photometers gegen den Blankwert der Position AI, Messung im Photometer bei 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm
Auswertung
Die Auswertung erfolgt durch Berechnung von Cut-Off- Werten aus den Meßwerten der der im Testkit enthaltenen Positiv- und Negativkontrolle. Für einen gültigen Test muß die Negativkontrolle (NK) einen Mittelwert (MW) < 0,3 OD und die Positivkontrolle (PK) einen Mittelwert > 0,6 OD ergeben. Der Blankwert der Position AI sollte kleiner als 0,1 OD und darf nicht größer als 0,2 OD sein.
A. Feldinfektion
1. Für die Ermittlung der negativen Proben ist ein Cut-Off- Wert aus den OD-Werten nach folgender Formel zu berechnen:
• Negativ-Cut-Off: (MW PK - MW NK) / 5 + MW NK
Proben mit OD-Werten < dem Negativ-Cut-Off gelten bei einem gültigen Test als negativ.
1. Für die Ermittlung der positiven Proben ist ein Cut-Off-Wert aus den OD-Werten nach folgender Formel zu berechnen:
• Positiv-Cut-Off: (MW PK - MW NK) / 3 + MW NK
Proben mit OD-Werten > dem Positiv-Cut-Off gelten bei einem gültigen Test als positiv. 1. Proben mit OD-Werten zwischen dem Negativ- und dem Positiv-Cut-Off sind, eventuell zu einem späteren Zeitpunkt nach erneuter Probenahme, wiederholt zu testen.
B. Impfung
Wegen der unterschiedlichen Impfverfahren (Adsorbatvakzinen, Lebendimpfstoffe) und bestandsspezifischen Faktoren lassen sich keine Grenzwerte angeben. Die Cut-Off- Werte für die Feldinfektionen können lediglich als Orientierungshilfen dienen. Jedes Labor sollte zur Überwachung von Impfbeständen eigene Parameter festlegen.
Durch Verwendung der Salmonellenantigenformulierung wird eine homogene, stabile und im Testergebnis hochsensitive Antigenbeschichtung erreicht. Haltbarkeit und Homogentät der mit der Salmonellenantigenformulierung beschichteten Mikrotiteφlatten werden verbessert und ermöglichen die Herstellung standardisierter ELISA-Testsysteme Die Lagerfähigkeit der der Salmonellenantigenformulierung beschichteten und geblockten Mikrotiteφlatten beträgt mindestens 7 Monate bei einem Variationskoeffizienten CV<= 10 %. Ein auf Basis erfindungsgemäßer Antigenformulierung, STM-LPS-Casein-Konjugat STM-LPS Mischantigen, hergestelltes Testsystem ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von Antiköφern gegen Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium und Salmonella gallinarum-pullorum.

Claims

Patentansprüche
1. Salmonellenantigenformulierung, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens aus einem LPS-Protein-Konjugat von Salmonella enterica besteht.
2. Salmoa^lenantigenformulierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens aus einem LPS-Serumalbuminkonjugat von Salmonella enterica besteht.
3. Salmonellenantigenformulierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens aus einem LPS-Caseinkonjugat von Salmonella enterica besteht.
4. Salmonellenantigenformulierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens aus einem LPS-Proteinkonjugat von Salmonella enterica und mindestens einer weiteren Antigenpräparation oder LPS-Präparation von Salmonella enterica oder anderen Bakterien besteht.
5. Salmonellenantigenformulierung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Salmonellenantigengemisch von Salmonellen-LPS-Serumalbumin- Konjugat auf Basis eines Salmonellenantigens vom Typ Salmonella Typhimurium (STM) und einem Salmonellenantigen vom Typ Salmonella cholerae suis (SCS) besteht.
6. Salmonellenantigenformulierung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Salmonellenantigengemisch aus LPS-Caseinkonjugat von Salmonella Thyphimurium und einer LPS-Präparation von Salmonella Thyphimurium oder aus einer LPS-Caseinkonjugat von Salmonella Thyphimurium besteht.
7. Salmonellenantigengemisch nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es Salmonellenantigen vom Typ Salmonella cholerae suis (SCS) und Salmonellen-LPS- Serumalbumin-Konjugat auf Basis eines Salmonellenantigens vom Typ Salmonella Typhimurium (STM) im Verhältnis von 1 : 10 bis 1 : 200 enthält.
8. Salmonellen-LPS-Serumalbumin-Konjugat nach Anspruch 5 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Salmonellen-LPS-Serumalbumin-Konjugat ein Salmonellen- LPS-Rinderserum-albumin-Konjugat ist.
9. Kit zum Nachweis von Antiköφern gegen Salmonellen in Fleischsaft-, Serum-, Eigelbproben oder anderen Flüssigkeiten in Verbindung mit einer immunologischen Bestimmungsmethode, insbesondere einem heterogenen ELISA-Test, bei der ein Trägen Hiit Antigenen für eine immunologische Reaktion mit Antiköφern beladen ist und der weiterhin aus verschiedenen Kontrollseren, Waschpufferkonzentrat, Verdünnungspuffer und Anti-Antiköφerenzymkonjugat sowie entsprechender Substrat- und Stoplösung besteht, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit einer Salmonellenantigenformulierung aus mindestens einem LPS-Protein-Konjugat von Salmonella enterica versehen ist.
10. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit einer Salmonellenantigenformulierung aus mindestens einem LPS-Serumalbuminkonjugat von Salmonella enterica versehen ist.
11. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit einer Salmonellenantigenformulierung aus mindestens einem LPS-Caseinkonjugat von Salmonella enterica versehen ist.
12. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit einer Salmonellenantigenformulierung aus mindestens einem LPS-Proteinkonjugat von Salmonella enterica und mindestens einer weiteren Antigenpräparation oder LPS- Präparation von Salmonella enterica oder anderen Bakterien versehen ist.
13. Kit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit einem Salmonellenantigengemisch von Salmonellen-LPS-Serumalbumin-Konjugat auf Basis eines Salmonellenantigens vom Typ Salmonella Typhimurium (STM) und einem Salmonellenantigen vom Typ Salmonella cholerae suis (SCS) versehen ist.
14. Kit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit einem Salmonellenantigengemisch aus LPS-Caseinkonjugat von Salmonella Thyphimurium und LPS-Präparation von Salmonella Thyphimurium oder aus LPS-Caseinkonjugat von Salmonella Thyphimurium versehen ist.
15. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit einem Salmonellenantigengemisch aus Salmonellenantigen vom Typ Salmonella cholerae suis (SCS) und Salmonellen-LPS-Serumalbumin-Konjugat auf Basis eines Salmonellenantigens vom Typ Salmonella Typhimurium (STM) im Verhältnis von 1 : 10 bi-f : 200 versehen ist.
16. Kit nach Anspruch 13 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Salmonellen-LPS- Serumalbumin-Konjugat ein Salmonellen-LPS-Rinderserum-albumin-Konjugat ist.
17. Kit nach jeweils einem der Ansprüche 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß für den Nachweis von Antiköφern gegen Salmonellen in Proben von Schweinen das Anti- Antiköφer-enzymkonjugat ein Anti-Schwein-Immunoglobulin-Enzymkonjugat ist.
18. Kit nach jeweils einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß für den Nachweis von Antiköφern gegen Salmonellen in Proben von Hühnern das Anti- Antiköφer-enzymkonjugat ein Anti-Huhn-Immunglobulinperoxidasekonjugat ist.
19. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Kontrollseren Kontrollseren von Salmonellen positiven und negativen Tieren, aus veterinärmedizinisch überwachten Beständen, verwendet werden.
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