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CN116165380A - 一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条 - Google Patents

一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条 Download PDF

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CN116165380A
CN116165380A CN202211581961.7A CN202211581961A CN116165380A CN 116165380 A CN116165380 A CN 116165380A CN 202211581961 A CN202211581961 A CN 202211581961A CN 116165380 A CN116165380 A CN 116165380A
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杨娜
桑晓宇
海智慧
张小涵
冯颖
陈冉
李响
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Shenyang Agricultural University
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Abstract

本发明公开了一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条，包括样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水纸和PVC底板。所述标记物垫中有荧光微球标记的小鼠IgG和GRA1抗原；所述NC膜的测试线(T线)包被的是GRA1抗原，控制线(C线)包被的是山羊抗小鼠IgG。将样品垫、标记物垫、NC膜和吸水纸从左到右顺次安装在PVC底板上组装成试纸条。本发明提出的试纸条可用于多种动物(猪、猫等)弓形虫病血清抗体的快速检测，具有检测快速、灵敏度高、特异性好的优点，可应用于基层畜牧业。

Description

一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条
技术领域
本发明涉及弓形虫检测技术领域，具体涉及一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条。
背景技术
刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫，能够感染包括人类在内的所有温血动物。弓形虫在全世界分布广泛，据估计全世界大约有超过1/3的人口感染。家畜猪、牛、羊及宠物猫是弓形虫的重要宿主，目前感染率最高的动物是猪和猫。人们因食用未煮熟或生的含有弓形虫的肉或肉制品获得感染，也可通过接触猫粪便中弓形虫卵囊获得感染，对免疫力低下的人群和孕妇危害最为严重，另外弓形虫病也给畜牧业带来严重经济损失。
目前，还没有针对弓形虫病的特效治疗药物，仅磺胺嘧啶和乙胺嘧啶联合应用治疗弓形虫急性感染，但仅是抑制其生长而无法杀灭虫体。寻找一种可靠的抗原，建立一种简便、快速、准确度高、特异性好的诊断方法，可以帮助基层养殖业快速准确诊断动物的弓形虫病，减少畜牧业损失和对人们的危害。
发明内容
为此，本发明提供一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条，以实现一种可以用于现场检测的、准确性高的且简便的快速检测动物弓形虫病的试纸条。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，提出一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条，所述试纸条包括依次设置在PVC底板上的样品垫、标记物垫、NC膜和吸水滤纸，所述样品垫设置有加样孔用于滴加待检测动物血清样本，所述标记物垫中有荧光微球标记的小鼠IgG和GRA1重组抗原，所述NC膜上包被有T线和C线，所述T线包被的是GRA1重组抗原，所述C线包被的是山羊抗小鼠IgG。
根据本发明实施例的第二方面，提出一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的制备方法，所述制备方法包括：
步骤一，GRA1重组抗原的制备：由上海生工生物工程有限公司合成了含有相对目的基因的表达载体p ET-28a，构建好的重组表达质粒。命名为pET-28a-GRA1。通过小量诱导表达确定大量表达及纯化条件：在32℃，0.1mM IPTG浓度下诱导表达。在32℃，0.1mM IPTG诱导条件下培养菌液6h～8h后，收集菌体，使用高压破碎后，离心弃上清，沉淀用100μLddH2O重悬，加入15mL His Binding Buffer室温感作12h，离心收集上清后与Ni-Agrose在4℃感作2h，用5mM咪唑洗脱杂蛋白，再用500mM含有脲素的咪唑洗脱目的蛋白，测蛋白浓度；
步骤二，标记物垫的制备：用标记缓冲液将荧光微球按1:20比例稀释后，得到荧光标记溶液，用此荧光标记溶液分别标记小鼠IgG和GRA1重组抗原；用荧光工作液将荧光微球标记的小鼠IgG和荧光微球标记的GRA1重组抗原分别进行稀释，并混合制备成荧光溶液；将此荧光溶液喷涂在玻璃纤维上制备成为标记物垫，放入温度45±1℃湿度≤35％烘箱中，烘干8小时以上，铝箔袋密封保存；
步骤三，T线和C线的制备：GRA1重组抗原用于包被T线，山羊抗小鼠IgG用于包被C线，用喷金划膜仪将T线和C线包被于NC膜上，放入温度45±1℃湿度≤35％烘箱中，烘干8h以上，铝箔袋密封保存；
步骤四，试纸条的组装：将样品垫、标记物垫、NC膜和吸水纸从左到右顺次安装在PVC底板上组装成试纸条。
进一步地，所述步骤二中，荧光微球标记的小鼠IgG的制备方法为：
取50μL荧光微球加入950μL的标记缓冲液(0.01M磷酸盐缓冲液)中，加入终浓度为10mg/mL的EDC，振荡混匀后，室温孵育30min，然后加入标记量为20μg/mL的小鼠IgG，即1mL的荧光微球溶液加入小鼠IgG的量为20μg，振荡混均，室温避光孵育1h。加入终浓度为2％BSA，振荡混匀后，室温避光孵育1h。12000rpm离心20min，去除上清，得到浓缩的荧光微球标记的鼠IgG，加入荧光微球工作液，放入4℃避光保存。
进一步地，所述步骤二中，荧光微球标记的GRA1重组抗原的制备方法为：
取50μL荧光微球加入950μL的标记缓冲液(0.01M磷酸盐缓冲液)中，加入终浓度为10mg/mL的EDC，振荡混匀后，室温孵育30min，然后加入标记量为25μg/mL的GRA1重组抗原，即1mL的荧光微球溶液加入GRA1重组抗原的量为25μg，振荡混均，室温避光孵育1h。加入终浓度为2％BSA，振荡混匀后，室温避光孵育1h。12000rpm离心20min，去除上清，得到浓缩的荧光微球标记的GRA1重组抗原，加入荧光微球工作液，放入2℃～8℃避光保存。
进一步地，所述步骤二中，用荧光工作液将荧光微球标记的小鼠IgG进行稀释的最佳稀释比例为20倍稀释，用荧光工作液将荧光微球标记的GRA1重组抗原进行稀释的最佳稀释比例为3倍稀释。
进一步地，所述步骤二中，用荧光标记溶液分别标记小鼠IgG和GRA1重组抗原，小鼠IgG的标记量为20μg/mL，即1mL的荧光微球溶液加入小鼠IgG的量为20μg；GRA1重组抗原的标记量为25μg/mL，即1mL的荧光微球溶液加入GRA1重组抗原的量为25μg。
进一步地，所述步骤三中，GRA1重组抗原用于包被T线，最佳GRA1重组抗原包被浓度为1mg/mL，山羊抗小鼠IgG用于包被C线，山羊抗小鼠IgG包被浓度为2mg/mL。
根据本发明实施例的第三方面，提出荧光免疫层析法试纸条用于在临床中对包括猪、猫等多种动物弓形虫血清抗体的检测。
根据本发明实施例的第四方面，提出一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的应用，具体应用方法包括：
取75μL待检血清样本加入到样品缓冲液中，充分混匀30s～1min，用移液器吸取75μL混合后的样本，滴加到检测卡的加样孔内，待15min后，在荧光免疫分析仪读取结果。
本发明具有如下优点：
本发明提出的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条，包括样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水纸和PVC底板。所述标记物垫中有荧光微球标记的小鼠IgG和GRA1抗原；所述NC膜的测试线(T线)包被的是GRA1抗原，控制线(C线)包被的是山羊抗小鼠IgG。将样品垫、标记物垫、NC膜和吸水纸从左到右顺次安装在PVC底板上组装成试纸条。具有检测快速、灵敏度高、特异性好的优点，可以替代ELISA、胶体金等诊断方法，更好的用于基层单位，为流行病学调查提供一种快速的解决方案。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例提供的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的结构示意图；
图2为本发明实施例提供的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条特异性评定结果；
图3为本发明实施例提供的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条对猪弓形虫阳性血清的灵敏度评定结果；
图4为本发明实施例提供的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条对猫弓形虫阳性血清的灵敏度评定结果。
图中：PVC底板100、样品垫200、标记物垫300、T线400、C线500、NC膜600、吸水滤纸700。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了能够在在临床现场中快速、准确诊断弓形虫病，本发明提供了一种弓形虫病荧光免疫层析试纸条来检测弓形虫病的血清抗体。如图1所示，该试纸条包括依次设置在PVC底板100上的样品垫200、标记物垫300、NC膜600和吸水滤纸700，样品垫200设置有加样孔用于滴加待检测动物血清样本，标记物垫300中有荧光微球标记的小鼠IgG和GRA1重组抗原，NC膜600上包被有T线400和C线500，T线400包被的是GRA1重组抗原，C线500包被的是山羊抗小鼠IgG。
GRA1重组抗原的制备：构建原核表达载体。将构建好的GRA1经双酶切和测序正确后，转入BL21(DE3)表达感受态中。经诱导、表达获得GRA1重组蛋白。
本发明为了提高弓形虫病荧光免疫层析试纸条检测时的准确性，摸索了以下条件：
荧光免疫层析试纸条的最优条件的确定方法为：其他条件不变，每次只改变其中一个变量。加样方式为：取75μL待检血清样本加入到样品缓冲液中，充分混匀30s～1min，用移液器吸取75μL混合后的样本，滴加到检测卡的加样孔内，待15min后，用荧光免疫分析仪读取测试线和控制线的反应信号值。GRA1重组抗原和山羊抗小鼠IgG的包被参数为0.75μL/mL。
抗原包被浓度的确定：将GRA1重组抗原1.0mg/mL，2.0mg/mL，3.0mg/mL制备成三种工作浓度进行包被，C线山羊抗小鼠IgG以2.0mg/mL浓度包被。放入温度45±1℃湿度≤35％烘箱烘干8h。搭配荧光垫和样品垫，制备小样。在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，已确定最佳的包被抗原浓度。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表1，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现当GRA1重组抗原浓度为2.0mg/mL时，是最适包被量。
表1包被抗原浓度的检测结果
Figure BDA0003991488880000061
标记抗原浓度的确定：以相同标记方法，GRA1抗原的标记量分别为：12.5μg/mL，25μg/mL，50μg/mL。以相同的稀释浓度制备小样，搭配包被片材和样品垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最佳的标记抗原浓度。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表2，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现当标记抗原GRA1浓度为25μg/mL时，是最适的结合垫标记浓度。
表2标记抗原浓度的检测结果
Figure BDA0003991488880000062
Figure BDA0003991488880000071
荧光标记溶液稀释比例的确定：荧光微球标记的小鼠IgG进行20倍稀释，荧光微球标记的GRA1重组抗原分别作3倍、6倍、9倍稀释。制备小样，搭配包被片材和样品垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最佳的荧光标记溶液稀释比例。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表3，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现当荧光标记溶液稀释比例为3倍时，为最佳的荧光标记溶液最适稀释比例。
表3荧光标记溶液稀释比例的检测结果
Figure BDA0003991488880000072
荧光工作液的确定：按确定的荧光标记溶液稀释比例，选取三组荧光工作液：第一组为：0.05M Tris-HCl、0.9％NaCl、0.05％BSA、0.05％Tween20，调至pH＝7.9；第二组为：0.02M Tris-HCl、0.4％BSA，调至pH＝7.5；第三组为：0.1M Tris-HCl、0.1％BSA(5mL)、10％S9、10％Tween20、10％PEG12000、3g海藻糖。制备小样，搭配包被片材和样品垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的荧光工作液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表4，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现使用第二组荧光工作液时，为最佳的荧光工作液。
表4荧光工作液检测结果
工作液 T(N) C(N) T/C(N) T(P) C(P) T/C(P) 结果
1 1254 13011 0.0964 13711 14099 0.9725 不合格
2 563 11996 0.0469 4213 14921 0.2824 合格
3 123 13099 0.0094 939 15669 0.0599 不合格
样品垫处理液的确定：为了是使样品中的抗体能更好的与标记物垫中荧光微球标记的抗原结合，配制了三种样品垫处理液，分为三组。第一组为：1％BSA、0.1％Triton-100的、0.02mol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲液；第二组为：0.1MNa2B4O7·10H2O、1％PVP、0.2％Casein-Na、1％Triton-X100、1％Tetronic 1307、0.2％NaN3，调至pH＝9.3；第三组为：0.5M硼酸缓冲液、1％TritonX-100、1％PVP、2％NaCl，调至pH＝9.0。制备小样，搭配包被片材和荧光垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的样品垫处理液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表5，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现使用第二组样品垫处理液时，为最佳的样品垫处理液。
表5样品垫处理液检测结果
Figure BDA0003991488880000081
反应时间的确定：用移液器吸取75μL样本加入到150μL样本缓冲液内，充分混匀30s～1min，用移液器吸取75μL混合后的样本，滴加到检测卡的加样孔内，待反应10min，15min，20min后分别进行读数。在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，已确定最佳反应时间。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表6，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现层析试纸条最佳反应时间为15min。
表6反应时间的检测结果
Figure BDA0003991488880000091
样品缓冲液的确定：为了确保抗原抗体充分反应，摸索了三种样品稀释液，分成三组，分别为：第一组：pH＝7.8的0.02M Tris-HCl、0.9％NaCl、0.1％BSA、0.5％Tween-20、0.1％NaN3；第二组：pH＝7.8的0.05M Tris-HCl、0.9％NaCl、1.5％BSA、0.01％Tween-20、0.1％NaN3；第三组：pH＝7.8的PBS缓冲液。在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的样品稀释液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表7，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现第二组样品缓冲液为最佳的样品稀释液。
表7样品缓冲液的检测结果
Figure BDA0003991488880000092
Figure BDA0003991488880000101
样品稀释比例的确定：样本与样品缓冲液，分别按照下表8的比例，进行混合，混合后的样本，滴加至检测卡加样孔中，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的样本稀释比例。
表8样本与样品缓冲液稀释比例
Figure BDA0003991488880000102
结果见表9，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现最适的稀释比例为1:2(样品体积:样品缓冲液)
表9样品稀释液的检测结果
Figure BDA0003991488880000103
荧光免疫层析试纸条特异性的评定：对猪弓形虫阴性血清、猫弓形虫阴性血清、猪弓形虫阳性血清和猫弓形虫阳性血清样本进行检测，除弓形虫病的阳性血清外，荧光免疫分析仪的结果判定为阴性。结果如图2(1.猪弓形虫阴性血清2.猫弓形虫阴性血清3.猪弓形虫阳性血清4.猫弓形虫阳性血清)。
荧光免疫层析试纸条分析灵敏度的评定：对猪和猫弓形虫阳性血清分别进行1:50(1#)，1:100(2#)，1:200(3#)，1:400(4#)，1:800(5#)，1:1600(6#)稀释后，分别测试。结果显示：当阳性血清稀释比例为1:1600时，仍旧可以观察到T线的条带，说明分析灵敏度可以达到1:1600。结果如图3(猪血清依次按1:50(1#)，1:100(2#)，1:200(3#)，1:400(4#)，1:800(5#)，1:1600(6#)稀释；7#为样品稀释液)和图4(猫血清依次按1:50(1#)，1:100(2#)，1:200(3#)，1:400(4#)，1:800(5#)，1:1600(6#)稀释；7#为样品稀释液)。
荧光免疫层析试纸条诊断灵敏度的评定：为了验证荧光免疫层析试纸条在感染率最高的动物(猪、猫等)弓形虫病的诊断灵敏度，用商品化ELISA试剂盒作为对照，分别检测了猪、猫弓形虫病的阳性血清样本和阴性血清样本，结果如表10，说明本发明中的荧光免疫层析试纸条与商品化试剂盒具有很好的一致性。
表10荧光免疫层析试纸条与商业化ELISA试剂盒的比较结果(猪、猫)。
Figure BDA0003991488880000111
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
本发明中的荧光免疫层析法试纸条，使用了GRA1重组蛋白抗原替代了天然抗原作为包被抗原，该试纸条可以检测多种动物的弓形虫血清抗体。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条，其特征在于，所述试纸条包括依次设置在PVC底板上的样品垫、标记物垫、NC膜和吸水滤纸，所述样品垫设置有加样孔用于滴加待检测动物血清样本，所述标记物垫中有荧光微球标记的小鼠IgG和GRA1重组抗原，所述NC膜上包被有T线和C线，所述T线包被的是GRA1重组抗原，所述C线包被的是山羊抗小鼠IgG。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
步骤一，GRA1重组抗原的制备：合成含有相对目的基因的表达载体pET-28a，构建好的重组表达质粒命名为pET-28a-GRA1，将构建的原核表达载体pET-28a-GRA1转入BL21(DE3)表达感受态中进行蛋白小量诱导表达确定培养条件后，收集菌体，使用高压破碎后离心弃上清，沉淀用ddH2O重悬，加入一定量HisBindingBuffer室温感作一定时间，离心收集上清后与Ni-Agrose在一定温度下感作一定时间，用咪唑洗脱杂蛋白，再用含有脲素的咪唑洗脱目的蛋白，测蛋白浓度；
步骤二，标记物垫的制备：用标记缓冲液将荧光微球按一定比例稀释后，得到荧光标记溶液，用此荧光标记溶液分别标记小鼠IgG和GRA1重组抗原；用荧光工作液将荧光微球标记的小鼠IgG和荧光微球标记的GRA1重组抗原分别进行稀释，并混合制备成荧光溶液；将制得的荧光溶液喷涂在玻璃纤维上制备成为标记物垫，放入烘箱中烘干后密封保存；
步骤三，T线和C线的制备：GRA1重组抗原用于包被T线，山羊抗小鼠IgG用于包被C线，用喷金划膜仪将T线和C线包被于NC膜上，放入烘箱中烘干后密封保存；
步骤四，试纸条的组装：将样品垫、标记物垫、NC膜和吸水纸从左到右顺次安装在PVC底板上组装成试纸条。
3.根据权利要求2所述的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，荧光微球标记的小鼠IgG的制备方法为：
取一定量荧光微球加入一定量标记缓冲液中，加入一定终浓度的EDC，振荡混匀后，室温孵育一定时间，然后加入一定标记量的小鼠IgG，振荡混均，室温避光孵育一定时间；加入一定终浓度的BSA，振荡混匀后，室温避光孵育一定时间；离心去除上清，得到浓缩的荧光微球标记的鼠IgG，加入荧光微球工作液，避光保存。
4.根据权利要求2所述的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，荧光微球标记的GRA1重组抗原的制备方法为：
取一定量荧光微球加入一定量的标记缓冲液中，加入一定终浓度的EDC振荡混匀后，室温孵育一定时间，然后加入一定标记量的GRA1重组抗原，振荡混均，室温避光孵育一定时间；加入一定终浓度的BSA，振荡混匀后，室温避光孵育一定时间；离心去除上清，得到浓缩的荧光微球标记的GRA1重组抗原，加入荧光微球工作液，避光保存。
5.根据权利要求2所述的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，用荧光工作液将荧光微球标记的小鼠IgG进行稀释的最佳稀释比例为20倍稀释，用荧光工作液将荧光微球标记的GRA1重组抗原进行稀释的最佳稀释比例为3倍稀释。
6.根据权利要求2所述的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，用荧光标记溶液分别标记小鼠IgG和GRA1重组抗原，小鼠IgG的标记量为20μg/mL，即1mL的荧光微球溶液加入小鼠IgG的量为20μg；GRA1重组抗原的标记量为25μg/mL，即1mL的荧光微球溶液加入GRA1重组抗原的量为25μg。
7.根据权利要求2所述的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，GRA1重组抗原用于包被T线，最佳GRA1重组抗原包被浓度为1mg/mL，山羊抗小鼠IgG用于包被C线，山羊抗小鼠IgG包被浓度为2mg/mL。
8.根据权利要求1所述的荧光免疫层析法试纸条用于在临床中对包括猪、猫的多种动物弓形虫血清抗体的检测。
9.根据权利要求1所述的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的应用，其特征在于，具体应用方法包括：
取一定量待检动物血清样本加入到样品缓冲液中，充分混匀，用移液器吸取一定量混合后的样本，滴加到加样孔内，待一定时间后，使用荧光免疫分析仪读取T线和C线的反应信号值。
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