DE19842609C2 - Salmonellenantigengemisch und Kit zur Bestimmung von Antikörpern gegen Salmonellen - Google Patents
Salmonellenantigengemisch und Kit zur Bestimmung von Antikörpern gegen SalmonellenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Salmonellenantigengemisch aus einem Salmonellen-LPS-Serumalbumin-Konjugat auf Basis eines Salmonellenantigens vom Typ Salmonella typhimurium (STM) und einem Salmonellenantigen vom Typ Salmonella cholerae sius (SCS) und einen Kit zur Bestimmung von Antikörpern gegen Salmonellen in Fleischsaft- oder Serumproben oder in Verbindung mit einer immunologischen Bestimmungsmethode, insbesondere einem heterogenen ELISA-Test. Dabei ist der Festphasenträger mit dem erfindungsgemäßen Salmonellenantigengemisch für eine immunologische Reaktion mit Antikörpern beladen.
Description
Die Erfindung betrifft ein Salmonellenantigengemisch und einen Kit zur Bestimmung von
Antikörpern gegen Salmonellen in Fleischsaft- oder Serumproben oder anderen Flüssigkeiten
in Verbindung mit einer immunologischen Bestimmungsmethode, insbesondere einem
heterogenen ELISA-Test.
Durch Salmonellen verursachte Krankheiten werden insbesondere über kontaminierte
Lebensmittel hervorgerufen. Für den Bereich der Lebensmittelkontrolle und der
Tierproduktion besteht auch aufgrund gestiegener Krankheitsfälle ein steigender Bedarf an
schnellen und sicheren Verfahren zum Nachweis von Salmonellen. Zum Nachweis und zur
Bestimmung von Salmonellen sind unterschiedliche Methoden bekannt. So können Bakterien
auf verschiedenen Nährböden kultiviert werden. Über eine Selektivanreicherung auf festen
Selektivnährböden ist eine serologische Typisierung möglich. Insgesamt dauert dieses
Verfahren 4-5 Tage.
Unter Verwendung immunologischer Bestimmungsmethoden, insbesondere eines heterogenen
ELISA-Tests ist auch der Nachweis von Salmonellenantikörpern bekannt (Enzyme-linked
immunosorbent assay for Salmonella serology using lipopolysaccharide antigen,
J. Vet. Diagn. Invest. 7: 481-487 (1995) Bradford P. Smith, George W. Dilling, John K. House,
Hans Konrad, Nadia Moore). Dabei ist eine Mikrotiterplatte mit einem Salmonellenantigen
beschichtet. Spezifische Antikörper gegen Salmonellen bilden während der Inkubation der
Probe in der beschichteten Vertiefung einen Komplex mit dem Antigen. Nicht gebundenes
Material wird durch Waschen entfernt. Ein zweiter, enzymmarkierter Antikörper, der gegen
den antigengebundenen Antikörper gerichtet ist, bindet sich an die antigengebundenen
Antikörper. Ungebundenes Konjugat wird herausgewaschen. Die Hinzugabe einer Farb
reagenz (Substrat) führt dann zu einer Farbentwicklung (Substratumsetzung) durch
antikörpergebundenes Enzym. Die Farbreaktion kann dann zur spektrophotometrischen
Bestimmung der Menge von Salmonella-Antikörpern in der Probe genutzt werden und ist
dieser proportional.
Als Salmonellenantigene werden dabei Lipopolysaccharide (LPS) von Salmonellen vom Typ
Salmonella typhimurium (STM) und Salmonella cholerae suis (SCS) verwandt. Die Bindung
dieser Salmonellenantigene an die Mikrotiterplatte ist schwierig und insbesondere für die
Automatisierung der Nachweisverfahren unzureichend. Die schlechte Bindung dieser
Salmonellenantigene und deren Reaktivitätsverlust erfordert bislang eine frische Zubereitung
vor Testdurchführung. Damit wird aber auch für diese Bestimmungsmethode ein Zeitraum
von mindestens 2 Tagen benötigt. Als nachteilig hat sich auch herausgestellt, daß die STM-
bzw. SCS-Antikörper positiven Kontrollen zu mehr als 30% mit SCS- bzw. STM-LPS-
Antigen kreuzreaktiv reagieren.
Aus WO 97/08559 ist ein Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern mittels
Fluoreszenzpolarisation bekannt. Dieses Verfahren ist zur Durchführung von
Immunoassays in Flüssigphasen und Messung in einem speziellen Fluoreszenz-
Polarisationsgerät bestimmt. Aufgrund der Verfahrensspezifik und des gesonderten
apparativen Aufwandes ist dieses Bestimmungsverfahren auf in der Praxis übliche
ELISA-Techniken mittels Festphasenassays nicht anwendbar.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, verbesserte Mittel und Methoden für den
immunologischen Nachweis von verschiedenen Salmonellen-Serovaren, insbesondere zur
Bestimmung von Salmonella-Antikörpern bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein lyophilisiertes Salmonellenantigengemisch,
bestehend aus einem Salmonellen-LPS-Serumalbumin-Konjugat auf Basis eines Salmonellen
antigens vom Typ Salmonella typhimurium (STM) und einem Salmonellenantigen vom Typ
Salmonella cholerae suis (SCS) und einen Kit zum Nachweis von Antikörpern gegen
Salmonellen in Fleischsaft- oder Serumproben in Verbindung mit einer immunologischen
Bestimmungsmethode, insbesondere einem heterogenen ELISA-Test gelöst, bei dem der
Träger mit dem erfindungsgemäßen Salmonellenantigengemisch für eine immunologische
Reaktion mit Antikörpern beladen ist.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist das Salmonellen-LPS-Serumalbumin-
Konjugat ein Salmonellen-LPS-Rinder-Serumalbumin-Konjugat auf Basis eines Salmonellen
antigens vom Typ Salmonella typhimurium (STM).
Überraschend wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße Salmonellenantigengemisch sehr
gute Bindungseigenschaften und eine hohe Langzeitstabilität aufweist. Das erfindungsgemäße
Salmonellenantigengemisch ist nicht kreuzreaktiv und erlaubt den Nachweis von mindestens
95% der vorhandenen Serotypen. Das erfindungsgemäße Salmonellenantigengemisch bindet
sehr gut an Träger, z. B. Mikrotiterplatten, wie sie für ELISA-Tests verwendet werden. Die
Träger können damit vorgefertigt und für die Analyse bereitgestellt werden. Damit entfällt die
bislang aufwendige Beschichtung und Probenvorbereitung durch den Anwender.
Die STM/SCS-Salmonellenantigene werden aus einer Salmonellenkultur nach der Methode
von Appelmelk, B. J. et al., J. of Immunolog. Methods, 82 (1985): 199-207 "An Enzyme-
Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for the measurement of Antibodies to different Parts
of the gram-negative Lipopolysaccharide Core Region" gewonnen. Anschließend werden die
Salmonellen-LPS vom Typ STM mit einem Serumalbumin zum Salmonellen-LPS-
Serumalbumin-Konjugat verbunden. Dies erfolgt nach der von Galanos, C., E. T. Rietschel,
O. Lüderitz, O. Westphal, 1972, Eur. J. Biochem. 31, 230, beschriebenen Methode.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist der Träger mit einem Konjugat aus
STM-LPS und Rinder-Serumalbumin (BSA) und einem Salmonellenantigen vom Typ
Salmonella cholerae suis (SCS) versehen, wobei die besten Bindungseigenschaften in einem
Bereich von 1 : 0,5 bis 1 : 3 einer Konjugation von STM-LPS mit BSA und einem Verhältnis
SCS zu STM-LPS-BSA-Konjugat von 1 : 10 bis 1 : 200 nachgewiesen wurden.
Die Beschichtung des Trägers, z. B. in Form einer Mikrotiterplatte erfolgt durch Inkubation
mit dem erfindungsgemäßen Antigengemisch, Blockung der freien Bindungsstellen mit einer
Serumalbuminlösung in Gegenwart einer Pufferlösung. Die so gefertigten Träger werden
gewaschen und anschließend getrocknet.
Der erfindungsgemäße Kit besteht neben dem mit dem erfindungsgemäßen Salmonellen
antigengemisch beschichteten Träger aus verschiedenen Kontrollseren, Waschpuffer
konzentrat, Verdünnungspuffer und Anti-Antikörperenzymkonjugat sowie entsprechender
Substrat- und Stoplösung. Als Anti-Antikörperenzymkonjugat wird für den Nachweis von
Antikörpern gegen Salmonellen in Schweineseren vorteilhaft ein Anti-Schwein-
Immunoglubolin-G-Peroxidasekonjugat und Tetramethylbenzidin (TMB) als Substratlösung
sowie verdünnte HCl als Stoplösung verwandt.
Als Kontrollseren werden salmonellapositive und salmonellanegative nichtkreuzreaktive
Seren verwendet. Als besonders vorteilhaft haben sich für die Bestimmung von Salmonellen-
Antikörpern in Schweineseren Kontrollseren von Salmonellen positiven Schweinen gezeigt,
die durch Feldinfektionen infiziert wurden.
Die zu untersuchende Probe wird mit dem mit dem erfindungsgemäßen Salmonellen
antigengemisch beschichteten Träger in Verbindung gebracht. Spezifische Antikörper gegen
Salmonellen bilden während der Inkubation der Probe in der beschichteten Vertiefung einen
Komplex mit dem Antigen. Nicht gebundenes Material wird durch Absaugen oder
Ausschlagen und Waschen mit der Waschpufferlösung entfernt. Danach wird das Anti-
Antikörperenzymkonjugat zugegeben. Nicht gebundenes Antikörperenzymkonjugat wird
durch Absaugen oder Ausschlagen und Waschen mit der Waschpufferlösung entfernt. Die
Hinzugabe von TMB als Substrat führt zu einer Farbentwicklung (Substratumsetzung) durch
antikörpergebundenes Enzym. Die Farbreaktion kann dann zur spektrophotometrischen
Bestimmung der Menge von Salmonella-Antikörpern in der Probe genutzt werden und ist
dieser proportional.
Zum Vergleich werden Versuche mit Kontrollseren durchgeführt und die gemessenen
Extinktionen der Kontrollseren zu ihren angegebenen Konzentrationen ins Verhältnis gesetzt.
Daraus wird eine Regressionsgerade berechnet, mit deren Hilfe anhand der gemessenen
Extinktion der Proben deren Konzentration an Salmonellenantikörpern berechnet werden
kann.
Anhand nachfolgender Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert:
- 1. Von den benötigten Salmonella Serotypen S. thyphimurium und S. choleraee suis (erhältlich bei Robert Koch - Institut, Bundesinstitut für Infektionskrankheiten und nicht übertragbare Krankheiten, Nationales Referenzzentrum für Salmonellen und andere Enteritiserreger, Postfach, 38843 Wernigerode) wird jeweils eine Kultur im 50 l Fermenter angelegt und 8 Stunden bei 37°C inkubiert. In die Kultur gibt man anschließend 505 ml einer 36%igen Formaldehydlösung, um in der Kultur eine Endkonzentration von 1% Formalin zur Abtötung der Keime zu erhalten. Inkubation bei Raumtemperatur für mindestens 4 Stunden.
- 2. Anlegen einer Sterilkontrolle für jede Kultur und 24 bis 48 Stunden Inkubation.
- 3. Die Kultur wird nun mittels Tangentialfiltration eingeengt.
- 4. Die Zellsuspension wird 30 Minuten bei 8.000 U/min zentrifugiert.
- 5. Das Zellsediment wird 3 mal mit Phosphatpuffer (PBS) gewaschen, 30 Minuten bei 8.000 U/min.
- 6. Anschließend wird das Zellsediment 1 : 1 in sterilem Aqua dest. resuspendiert.
- 7. Die Zellsuspension wird in 3 mal 2.000 ml Schraubflaschen gegeben (ca. 300 ml pro Flasche) und kommt über Nacht in den Kühlschrank.
- 8. Aceton für den nächsten Arbeitsschritt am darauffolgenden Tag vorbereiten: 22 mal 500 ml Aceton kommt über Nacht in den Gefrierschrank bei -22°C.
- 9. In die Flaschen mit der Zellsuspension wird nun jeweils 1.500 ml kaltes Aceton gegeben.
- 10. Die Flaschen werden verschlossen, gut geschüttelt und kommen für 2-3 Stunden bei -22°C in den Gefrierschrank.
- 11. Der klare Überstand wird vorsichtig abgesaugt und verworfen. Dann werden pro Flasche 500 ml kaltes Aceton aufgefüllt. Die Flaschen kommen erneut für 2-3 Stunden in den Gefrierschrank.
- 12. Nachdem der Schritt 11. noch zweimal wiederholt wurde, kommen die Flaschen diesmal über Nacht in den Gefrierschrank.
- 13. Vorsichtig wird erneut der Überstand abgesaugt und verworfen.
- 14. Die Bodensätze werden abschließend in mehrere Petrischalen verteilt, die man nun über Nacht unter einem Abzug stehen läßt, damit das restliche Aceton verdunsten kann.
- 15. Das getrocknete Zellsediment wird im Mörser zu Pulver zerrieben und in einem offenen abgewogenen Erlenmeyerkolben im Abzug über Nacht stehen gelassen.
- 16. Die pulverisierten Zellen werden 1 : 1 mit sterilem Aqua dest. gelöst.
- 17. Die Zellsuspension wird in einem 65°C warmen Wasserbad 5 min inkubiert.
- 18. Entsprechend der Gesamtmenge Zellsuspension benötigt man nun ebensoviel 90%iges Phenol. Dazu löst man das Phenol direkt in den Flaschen durch Zugabe von Aqua dest. Die 90%ige Phenollösung wird ebenfalls auf 65°C erwärmt und 5 min inkubiert.
- 19. Die Phenollösung und die Zellsuspension werden nun 1 : 1 in einem 2.000 ml Rundkolben gemischt, kräftig geschüttelt und für weitere 20 min bei 65°C im Schüttelwasserbad inkubiert.
- 20. Die Kolben werden in einem Eiswasserbad auf 4°C abgekühlt.
- 21. Zentrifugation des Zelle-/Phenolgemisches in 250 ml Bechern gefüllt mit 150 ml bei 13.000 U/min für 40 min.
- 22. Die klaren Überstände werden gesammelt und dann in 3 bis 4 Dialyseschläuche (15 KD) gegeben und über Nacht gegen VE-Wasser dialysiert.
- 23. Der Inhalt der Dialyseschläuche wird wieder gesammelt, auf Klarheit geprüft und falls noch Partikel zu erkennen sind, für 20 min. bei 5.000 g zentrifugiert.
- 24. Der Überstand bzw. das Dialysat wird gewonnen und mit 0,1% Natriumazid konserviert.
- 25. Ermittlung der Antigen-Gebrauchsverdünnung.
- 1. Die gewonnenen Salmonella-LPS-Antigene werden in Aqua dest. gelöst, welches 0,5% TEA (Triethanolamin) enthält.
- 2. Nach erfolgter Resuspendierung erfolgt eine Inkubation im Ultraschallbad für 30 sec.
- 3. Die Endkonzentration Salmonella-LPS-Antigen wird auf 1 mg/ml eingestellt.
- 4. Die zuvor hergestellte BSA-Suspension (Bovine Serum Albumin) (10 mg/ml) in 0,5% TEA wird zu gleichen Teilen mit der aus 3. hergestellten Salmonella- LPS- Antigen-Suspension gemischt.
- 5. Das erhaltene Gemisch wird zu Aliquoten von 1,0 ml abgefüllt und lyophilisiert.
- 6. Das lyophilisierte Salmonellen-LPS-BSA-Gemisch wird erneut resuspendiert in 1 ml 0,5%igem TEA.
- 7. Der Schritt 5. wird 3 mal, der Schritt 6. 2 mal wiederholt.
- 8. Das so erhaltene Salmonellen-LPS-BSA-Konjugat wird bei 2-8°C gelagert.
Es wird ein Salmonellenantigengemisch aus einer wässrigen Lösung von 0,04 mg/l SCS-LPS
und 4,0 mg/l STM-LPS-BSA-Konjugat hergestellt. Die Beschichtung einer Mikrotiterplatte
der Fa.Nunc/Nunc Polysorb erfolgt durch Inkubation von 100 µl/Well mit dem
Salmonellenantigengemisch über 12 Stunden bei 7°C. Nach erfolgter Inkubation wird nicht
gebundenes Salmonellenantigengemisch abgesaugt und die Platte 3 × mit 250 µl/Well mit
Aqua purif. gewaschen. Es folgt die Blockung der freien Bindungsstellen mit 200 µl einer 1%-
igen Serumalbuminlösung in Karbonatpuffer (0,1 M, pH 9,6) 15 min bei Raumtemperatur.
Daran schließt sich ein Waschschritt von 2 × 250 µl Waschpuffer (PBS-Tween)/Well an, bevor
die beschichteten und geblockten Mikrotiterplatten 12-14 Stunden im Luftstrom getrocknet
werden.
Der Kit besteht aus folgenden Reagenzien:
| Reagenzien: | |
| Menge: | |
| 1. Waschpufferkonzentrat-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20, 10fach konzentriert, konserviert mit Thimerosal | 30 ml |
| 2. Probenverdünnungspuffer, Puffer mit Protein, konserviert mit Natriumazid | 2 × 30 ml |
| 3. TMB Substratlösung, gebrauchsfertig | 12 ml |
| 4. Stoplösung - 1 M Salzsäure | 12 ml |
| 5. Anti-Antikörper-Konjugat (Kaninchen-Anti-Schwein-Meerrettichperoxidasekonjugat) in Puffer mit Proteinstabilisatoren, Konzentrat, konserviert mit Thimerosal | 50 µl |
| 6. Kontrollserum Nr. 1, salmonellapositiv, von hyperimmunisierten Schweinen gewonnenes Serum, lyophilisiert | 300 µl |
| 7. Kontrollserum Nr. 2, salmonellapositiv, von hyperimmunisierten Schweinen gewonnenes Serum, lyophilisiert | 300 µl |
| 8. Kontrollserum Nr. 3, salmonellapositiv, von hyperimmunisierten Schweinen gewonnenes Serum, lyophilisiert | 300 µl |
| 9. Kontrollserum Nr. 4, salmonellapositiv, von hyperimmunisierten Schweinen gewonnenes Serum, lyophilisiert | 300 µl |
| 10. Kontrollserum Nr. 5. salmonellanegativ, von Schweinen gewonnenes Serum mit niedrigem Antikörpertiter, lyophilisiert | 300 µl |
| 11. Mit Salmonella-Antigen beschichtete Testplatte (inaktiviert), 96 Vertiefungen pro Platte | 1 |
- - Fleischsaft - üblicherweise durch Einfrieren und Auftauen von Muskulatur des Zwerchfellpfeilers gewonnen - wird 1 : 30 mit Probenverdünnungspuffer verdünnt.
- - Serumproben werden 1 : 400 mit Probenverdünnungspuffer verdünnt.
Alle Reagenzien werden vor der Benutzung auf Raumtemperatur (18-23°C) gebracht und
durch leichtes Schütteln gemischt.
- 1. Registrieren der Kontrollen- und Probenlokalisationen in Doppelbestimmung entsprechend der Aufteilung der Testplatte auf einem Arbeitsblatt, z. B. K1 = A1/A2; K2 = B1/B2; K3 = C1/C2; K4 = D1/D2; K5 = E1/E2; übrige Positionen für Proben in Doppelbestimmung
- 2. Jeweils 100 µl der gelösten Kontrollen sowie der vorverdünnten Proben in die Vertiefungen der Testplatte pipettieren und die Testplatte abdecken
- 3. 60 min bei Raumtemperatur inkubieren und danach die Vertiefungen entleeren durch Absaugen oder Ausschlagen
- 4. 3 × Waschen mit je 200 µl vorbereitetem Waschpuffer, nach jedem Waschen den Puffer entleeren
- 5. In jede Vertiefung 100 µl vorbereitetes Kaninchen-Anti-Schwein-Meerettich peroxidase-Konjugat geben
- 6. 60 min bei Raumtemperatur inkubieren und danach die Vertiefungen entleeren durch Absaugen oder Ausschlagen
- 7. 3 × Waschen mit je 200 µl vorbereitetem Waschpuffer, nach jedem Waschen den Puffer entleeren
- 8. In jede Vertiefung 100 µl TMB-Substratlösung geben
- 9. Inkubation bei Raumtemperatur 7 min
- 10. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 100 µl Stoplösung pro Vertiefung
- 11. Kalibrierung des Photometers gegen Luft als Leerwert, Messung im Photometer bei 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm.
Die gemessenen Extinktionen der Kontrollseren werden zu ihren angegebenen
Konzentrationen ins Verhältnis gesetzt und darauf eine Regressionsgerade berechnet, mit
deren Hilfe anhand der gemessenen Extinktionen der Proben deren Konzentration an
Salmonellen-Antikörper berechnet wird.
Mit beschichteten und geblockten Mikrotiterplatten wurden über einen Zeitraum von 6
Monaten Vergleichsversuche durchgeführt. Dabei wurden Variationskoeffizienten CV von
2,29-8,7% bei einem gemessenen Probenvolumen von 94/Platte/Monat ermittelt. Diese
Ergebnisse belegen eine hohe Langzeitstabiltät der erfindungsgemäß beschichteten Platten.
Kontrollversuche belegen eine hohe Genauigkeit der durchgeführten Bestimmungen.
Untersucht wurden die verwendeten Kontrollen auf ihre Kreuzreaktivität und als nicht
kreuzreagierend nachgewiesen.
Claims (8)
1. Salmonellenantigengemisch, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Salmonellen-
LPS-Serumalbumin-Konjugat auf Basis eines Salmonellenantigens vom Typ
Salmonella typhimurium (STM) und einem Salmonellenantigen vom Typ Salmonella
cholerae suis (SCS) besteht.
2. Salmonellenantigengemisch nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es
Salmonellenantigen vom Typ Salmonella cholerae suis (SCS) und Salmonellen-LPS-
Serumalbumin-Konjugat auf Basis eines Salmonellenantigens vom Typ Salmonella
typhimurium (STM) im Verhältnis von 1 : 10 bis 1 : 200 enthält.
3. Salmonellenantigengemisch nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das
Salmonellen-LPS-Serumalbumin-Konjugat ein Salmonellen-LPS-Rinderserum
albumin-Konjugat ist.
4. Kit zum Nachweis von Antikörpern gegen Salmonellen in Fleischsaft- oder
Serumproben in Verbindung mit einer immunologischen Bestimmungsmethode,
insbesondere einem heterogenen ELISA-Test, bei der ein Träger mit Antigenen für
eine immunologische Reaktion mit Antikörpern beladen ist und der weiterhin aus
verschiedenen Kontrollseren, Waschpufferkonzentrat, Verdünnungspuffer und Anti-
Antikörperenzymkonjugat sowie entsprechender Substrat- und Stoplösung besteht,
dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit einem Salmonellen-LPS-Serumalbumin-
Konjugat auf Basis eines Salmonellenantigens vom Typ Salmonella typhimurium
(STM) und einem Salmonellenantigen vom Typ Salmonella cholerae suis (SCS)
versehen ist.
5. Kit nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit Salmonellenantigen
vom Typ Salmonella cholerae suis (SCS) und mit Salmonellen-LPS-Rinder-
Serumalbumin-Konjugat auf Basis eines Salmonellenantigens vom Typ Salmonella
typhimurium (STM) versehen ist.
6. Kit nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit Salmonellenantigen
vom Typ Salmonella cholerae suis (SCS) und Salmonellen-LPS-Serumalbumin-
Konjugat auf Basis eines Salmonellenantigens vom Typ Salmonella typhimurium
(STM) im Verhältnis von 1 : 10 bis 1 : 200 versehen ist.
7. Kit nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Anti-Antikörper
enzymkonjugat ein Anti-Schwein-Immunoglobulin-G-peroxidasekonjugat ist.
8. Kit nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Kontrollseren Kontrollseren
von Salmonellen positiven Schweinen, die durch Feldinfektionen infiziert sind,
verwendet werden.
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