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TWI895608B - 抗c-Met抗體藥物結合物 - Google Patents

抗c-Met抗體藥物結合物

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TWI895608B
TWI895608B TW111116135A TW111116135A TWI895608B TW I895608 B TWI895608 B TW I895608B TW 111116135 A TW111116135 A TW 111116135A TW 111116135 A TW111116135 A TW 111116135A TW I895608 B TWI895608 B TW I895608B
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安德魯 C 菲力浦斯
蕾琴娜 Ｍ 萊麗
喬治 Ａ 朵合蒂
承 季
米蘭 布朗克
爾溫 R 柏哈爾特
馬克 安德森
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愛爾蘭商艾伯維製造管理無限公司
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Abstract

本揭示案提供了c-Met抗體藥物結合物（ADC），包括使用此類ADC之組合物及方法。

Description

抗c-Met抗體藥物結合物
序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。該ASCII複本創建於2021年4月29日，命名為603USP1_SL_ST25.txt且大小為22,928個位元組。
本申請案尤其涉及新型拓樸異構酶抑制劑藥物、藥物連接子、抗c-Met抗體藥物結合物(ADC)及其製備方法。
c-Met是一種在上皮細胞及內皮細胞表面表現的信號傳導酪胺酸激酶受體。c-Met經肝細胞生長因子(HGF)(其唯一已知的配位體)之激活，已顯示可控制細胞增殖、血管生成、存活及細胞運動。
非小細胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌之85%，且為全世界癌症相關死亡的主要原因。異常的c-Met信號傳導在NSCLC中常見，且咸信為經多種機制發生。失調的c-Met信號傳導與預後不良、腫瘤發生、對化學療法/放射療法的耐藥性以及對表皮生長因子受體(EGFR)酪胺酸激酶抑制劑(TKI)的獲得性耐藥有關。
抗體藥物結合物(ADC)代表一類相對新療法，包括經由化學連 接子與細胞毒性藥物結合之抗體。ADC的治療概念為將抗體與藥物之結合能力組合，其中抗體用於藉助於與靶表面抗原結合的方式將藥物遞送至腫瘤細胞，包括在腫瘤細胞中過表現或擴增的靶表面抗原。
然而，沒有抗體藥物結合物被批准用於治療非小細胞肺癌。本領域仍然需要可用於治療目的的抗體藥物結合物，例如用於治療非小細胞肺癌。
本揭示案提供特異性結合人c-Met之抗體藥物結合物。例示性CDR之胺基酸序列，以及例示性抗c-Met ADC之抗體的重鏈及輕鏈之VH及VL區之胺基酸序列提供於以下具體實施方式中。
在另一態樣中，本揭示案提供包括本文所述之抗c-Met ADC的組合物。組合物通常包含一或多種如本文所述的抗c-Met ADC，以及一或多種賦形劑、載體或稀釋劑。
本揭示案提供治療患有NSCLC的個體(諸如人類個體)的方法，包含施用有效量的本文揭示之抗c-Met ADC。抗c-Met ADC通常作為靜脈內輸注及/或注射施用。
圖1顯示式I之拓樸異構酶I(TOP1)抑制劑的合成途徑。
圖2A-2B顯示在施用TOP1抑制劑化合物後對Calu-6(肺腺癌；圖2A)及A375(惡性黑素瘤；圖2B)的細胞增殖。
圖3A-3J顯示本揭示案之ADC(ADC-1)對細胞系的活體外活性，包括(A)SNU-5(人胃癌)、(B)Hs 746T(胃癌)、(C)EBC1(人肺鱗 狀細胞癌)、(D)NCI-H441(人肺腺癌)、(E)NCI-H1573(肺腺癌)、(F)HCC827(肺腺癌)、(G)NCI-H820(肺乳頭狀腺癌)、(H)Calu-3(肺腺癌)、(I)MIA PaCa-2(胰腺導管腺癌)及(J)HEK-293。
圖4A-4B顯示ADC-1在NCI-H441(人腺癌，圖4A)及Hs 746T(胃腺癌，圖4B)異種移植腫瘤模型中的活體內活性。
本發明的各個方面係關於拓樸異構酶I(TOP1)抑制劑及包含此類TOP1抑制劑之抗c-Met抗體藥物結合物。在某些實施例中，本發明提供抗c-Met ADC，包括包含TOP1抑制劑之抗c-Met ADC、可用於合成ADC之合成子、製備ADC之方法及使用ADC之各種方法。
6.1. 拓樸異構酶1抑制劑(TOP1i)
拓樸異構酶1(TOP1)移除DNA複製期間形成之超螺旋。TOP1抑制劑(TOP1i)可以結合且穩定TOP1-DNA複合物，誘導DNA鏈斷裂及細胞凋亡。本文呈現根據結構式(I)之拓樸異構酶I抑制劑藥物(「TOP1i藥物」)，其可用於藉由結合至抗體靶向遞送至細胞。
在實施例中，TOP1i藥物為根據式(I)之化合物。在實施例中，TOP1i藥物為(7S)-14-(3-胺基雙環[1.1.1]戊-1-基)-7-乙基-7-羥基-2H,10H-[1,3]二 氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-8,11(7H,13H)-二酮或其結構等效形式。
如結構式(II)所示，本文所考慮之TOP1i藥物可與ADC中的抗體結合：
其中表示連接子與TOP1i藥物之連接點。
6.2. 抗c-Met ADC
如本文所述之拓樸異構酶抑制劑可與抗c-Met抗體結合以形成抗c-Met TOP1i抗體藥物結合物(ADC)。由於ADC能夠將一或多種藥物部分選擇性遞送至靶組織，諸如腫瘤相關抗原，例如表現c-Met之腫瘤，抗體-藥物結合物可提高抗體治療疾病的治療功效。因此，在實施例中，本揭示案提供用於治療用途，例如用於治療非小細胞肺癌的抗c-Met TOP1i ADC。
在某些實施例中，TOP1i藥物藉由根據結構式(III)的連接子與抗體結合：
其中X表示溴或N-連接之順丁烯二醯亞胺。
在本文所述之抗c-Met ADC中，TOP1i藥物藉由連接子部分與抗c-Met抗體結合。如熟練技術人員應瞭解，連接子藉由在一個位置與TOP1i藥物形成共價鍵且在另一位置與抗體形成共價鍵，將TOP1i藥物與抗c-Met抗體連接。共價鍵係藉由連接子上的官能基與TOP1i藥物及抗c-Met抗體上的官能基之間的反應形成的。
可用於形成ADC的合成中間體化合物可包括：
6.2.1. 連接子藥物LD1(結構式(V))
(2S)-2-(2-溴乙醯胺基)-N-[(2S)-1-({3-[(7S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-7,8,11,13-四氫-2H,10H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]雙環[1.1.1]戊-1-基}胺基)-1-側氧基丙-2-基]-3-甲基丁醯胺
6.2.2. 連接子藥物LD2(結構式(VI))
(2S)-2-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-N-[(2S)-1-({3-[(7S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-7,8,11,13-四氫-2H,10H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]雙環[1.1.1]戊-1-基}胺基)-1-側氧基丙-2-基]-3-甲基丁醯胺
6.2.3. 連接子藥物LD3(結構式(VII))
(2S,3S,4R,5R,6S)-6-[2-(5-{[(2S)-2-({(2S)-2-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}-2-{[({3-[(7S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-7,8,11,13-四氫-2H,10H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并 [3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]雙環[1.1.1]戊-1-基}胺甲醯基)氧基]甲基}苯基)乙基]-3,4,5-三羥基氧雜環己烷-2-甲酸
6.2.4. 連接之藥物的數目
本文揭示之ADC包含以各種化學計量莫耳比與抗體部分連接的藥物分子，此取決於抗體之構型以及至少部分地取決於用於實現結合之方法。
術語「載藥量(drug load)」或「載藥量(drug loading)」係指個別ADC分子中每個抗體的藥物分子數目。與抗c-Met ADC連接之TOP1i藥物之數目可能會有所不同，且將會受到抗c-Met抗體上可用連接位點之數目的限制。如本發明之抗c-Met ADC所考慮的，連接子將單個TOP1i藥物與抗c-Met ADC抗體連接。只要抗c-Met ADC在使用及/或儲存條件下不展現不可接受之聚集水準，則n高達10之抗c-Met ADC(即結構式(III))涵蓋在內。在一些實施例中，抗c-Met ADC具有1-10範圍內之n。在一些實施例中，抗c-Met ADC具有選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的n。在實施例中，n為2、4、6、8或10。在實施例中，n為6。在實施例中，載藥量可包含1個藥物分子、2個藥物分子、3個藥物分子、4個藥物分子、5個藥物分子、6個藥物分子、7個藥物分子、8個藥物分子、9個藥物分子或10個藥物分子。
6.2.5. 抗體AbA
AbA為小鼠單株抗體224G11之人源化型式，其首次揭示且體現在美國專利第8,329,173號中。鼠抗體m224G11具有如SEQ ID NO：13所示的可變重域及如SEQ ID NO：14所示的可變輕域：m224G11重鏈可變域(CDR加下劃線，且如SEQ ID NO：15、16及17所示) (SEQ ID NO：13)
m224G11輕鏈可變域(CDR加下劃線，且如SEQ ID NO：18、19及20所示)： (SEQ ID NO：14)
AbA為一種人源化重組IgG1κ(在美國專利第8,741,290號中揭示為224G11[TH7 Hz3])，其靶向位於免疫球蛋白-叢蛋白-轉錄因子同源(IPT)域1內的c-Met獨特表位，導致阻斷HGF依賴性及HGF非依賴性c-Met信號傳導。
根據IMGT命名法定義，AbA之CDR序列包含以下序列：CDR-H1：GYIFTAYT(SEQ ID NO：1)
CDR-H2：IKPNNGLA(SEQ ID NO：2)
CDR-H3：ARSEITTEFDY(SEQ ID NO：3)
CDR-L1：ESVDSYANSF(SEQ ID NO：4)
CDR-L2：RAS(SEQ ID NO：5)
CDR-L3：QQSKEDPLT(SEQ ID NO：6)
在一些實施例中，構成本揭示案之ADC的抗c-Met抗體包含具有如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列的CDR-H1、具有如SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列的CDR-H2；具有如SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列的CDR-H3，具有如SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列的CDR-L1，具有如SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列的CDR-L2；以及具有如SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列的CDR-L3。
在一些實施例中，構成本揭示案之ADC的抗c-Met抗體包含重 鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列： (SEQ ID NO：7)；以及輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列： (SEQ ID NO：8)。
在一些實施例中，構成本揭示案之ADC的抗c-Met抗體包含重鏈，該重鏈包含如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列(恆定區為粗體；CDR帶下劃線(揭示為SEQ ID NO：1-3，分別按出現順序)： (全長序列揭示為SEQ ID NO：9)
以及包含如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列的輕鏈(CDR序列分別揭示為SEQ ID NO：4-6，按出現順序)： (全長序列揭示為SEQ ID NO：10)。
在實施例中，本揭示案之抗體為特立妥珠單抗(telisotuzumab)，其包含SEQ ID NO：9之重鏈及SEQ ID NO：10之輕鏈。
在一個實施例中，構成本揭示案之ADC的抗c-Met抗體的重鏈由以下核苷酸序列編碼(全長序列揭示為SEQ ID NO：21)： (SEQ ID NO：21)
粗體大寫字母的分泌信號肽；包括最終終止密碼子(TGA)；恆定區為粗 體；CDR有下劃線(CDR序列分別揭示為SEQ ID NO：22-24，按出現順序)
在一個實施例中，構成本揭示案之ADC的抗c-Met抗體的輕鏈由以下核苷酸序列編碼(全長序列揭示為SEQ ID NO：25)： (SEQ ID NO：25)
粗體大寫字母的分泌信號肽；包括最終終止密碼子(TGA)；恆定區為粗體；CDR有下劃線(CDR序列分別揭示為SEQ ID NO：26-28，按出現順序)。
6.2.6. 例示性抗c-Met ADC
在特定實施例中，本發明之抗c-Met ADC包含包括六個互補決定區(CDR)的抗c-Met抗體，對應於抗體AbA之CDR，其藉由可裂解之纈胺酸丙胺酸(va)連接子結合至TOP1i藥物。在某些實施例中，連接子包含溴乙醯胺官能基，用於與來自ADC之抗c-Met抗體的還原半胱胺酸的巰基結合。在其他實施例中，連接子包含用於與來自ADC的抗c-Met抗體的還原半胱胺酸的巰基結合的順丁烯二醯亞胺官能基。在一些實施例中，連接子進一步包含自犧牲間隔子，較佳對胺基苯甲基羰基(PABC)或其類似物。
在實施例中，抗c-Met ADC包含抗c-Met抗體，其包含對應於抗體AbA之CDR的六個互補決定區(CDR)，其經由與抗c-Met抗體之半胱胺酸殘基的巰基形成連接結合至連接子藥物LD1(結構式(V))。在一些實施例中，抗c-Met抗體包含抗體AbA之可變重(VH)鏈及可變輕(VL)鏈區序列。在一些實施例中，抗c-Met抗體包含抗體AbA之重鏈(HC)及輕鏈(LC)序列。
在實施例中，抗c-Met ADC具有以下結構式(VIII)：
其中n為1-10的整數，且其中Ab為IgG1抗c-Met抗體，其包含如SEQ ID NO：1所示之重鏈CDR1、如SEQ ID NO：2所示之重鏈CDR2、如SEQ ID NO：3所示之重鏈CDR3，如SEQ ID NO：4所示之輕鏈CDR1，如SEQ ID NO：5所示之輕鏈CDR2，及如SEQ ID NO：6所示之輕鏈CDR3。在實施例中，抗體Ab為IgG1抗c-Met抗體，其包含包括如SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列的重鏈可變區及包括如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列的輕鏈可變區。在實施例中，抗體Ab為抗c-Met抗體，其包含包括如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列的重鏈及包括如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列的輕鏈。在實施例中，抗體Ab是特立妥珠單抗。在實施例中，連接子-藥物與抗體之結合係經由與抗體之半胱胺酸殘基的巰基形成的連接。在實施例中，n具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的值。在實施例中，n具有2、4、6、8或10的值。在實施例中，n為6。
在某些實施例中，抗c-Met ADC包含包括六個互補決定區(CDR)之抗c-Met抗體，此等互補決定區(CDR)對應於抗體AbA之CDR，其經由與抗c-Met抗體之半胱胺酸殘基的巰基形成連接結合至連接子藥物LD2(結構式(VI))。在一些實施例中，抗c-Met抗體包含抗體AbA之可變重(VH)鏈及可變輕(VL)鏈區序列。在一些實施例中，抗c-Met抗體包含抗體AbA之重鏈(HC)及輕鏈(LC)序列。
在一些實施例中，抗c-Met ADC具有以下結構式(IX)：
其中n為1-10的整數，且其中Ab為IgG1抗c-Met抗體，其包含如SEQ ID NO：1所示之重鏈CDR1、如SEQ ID NO：2所示之重鏈CDR2、如SEQ ID NO：3所示之重鏈CDR3，如SEQ ID NO：4所示之輕鏈CDR1，如SEQ ID NO：5所示之輕鏈CDR2，及如SEQ ID NO：6所示之輕鏈CDR3。在實施例中，抗體Ab為IgG1抗c-Met抗體，其包含包括如SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列的重鏈可變區及包括如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列的輕鏈可變區。在實施例中，抗體Ab為抗c-Met抗體，其包含包括如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列的重鏈及包括如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列的輕鏈。在實施例中，抗體Ab是特立妥珠單抗。在實施例中，連接子-藥物與抗體之結合係經由與抗體之半胱胺酸殘基的巰基形成的連接。在實施例中，n具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的值。在實施例中，n具有2、4、6、8或10的值。在實施例中，n為6。
在某些實施例中，抗c-Met ADC包含包括六個互補決定區(CDR)的抗c-Met抗體，此等互補決定區(CDR)對應於經由與抗c-Met抗體之半胱胺酸殘基的巰基形成連接結合至連接子藥物LD3(結構式(VII))。在一些實施例中，抗c-Met抗體包含抗體AbA之可變重(VH)鏈及可變輕(VL)鏈區序列。在一些實施例中，抗c-Met抗體包含抗體AbA之重鏈(HC)及輕鏈(LC)序列。
在一些實施例中，抗c-Met ADC具有以下結構式(X)：
其中n為1-10的整數，且其中Ab為IgG1抗c-Met抗體，其包含如SEQ ID NO：1所示之重鏈CDR1、如SEQ ID NO：2所示之重鏈CDR2、如SEQ ID NO：3所示之重鏈CDR3，如SEQ ID NO：4所示之輕鏈CDR1，如SEQ ID NO：5所示之輕鏈CDR2，如SEQ ID NO：6所示之輕鏈CDR3。在實施例中，抗體Ab為IgG1抗c-Met抗體，其包含包括如SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列的重鏈可變區及包括如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列的輕鏈可變區。在實施例中，抗體Ab為抗c-Met抗體，其包含包括如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列的重鏈及包括如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列的輕鏈。在實施例中，抗體Ab是特立妥珠單抗。在實施例中，連接子-藥物與抗體的結合係藉由與抗體之胱胺酸殘基的巰基形成的連接。在實施例中，n具有1、2、3、4、5、6、7、8、9 或10的值。在實施例中，n具有2、4、6、8或10的值。在實施例中，n為6。
本揭示之ADC可以作為適合施用於個體的組合物提供。在一些實施例中，ADC組合物為醫藥組合物，其包含本揭示案之ADC及醫藥學上可接受之載劑。
6.3. 使用方法
在實施例中，本文所述之方法係關於用本發明之抗c-Met ADC治療患有非鱗狀NSCLC之患者。
7. 實例
以下實例係出於說明之目的提供，該等實例強調本文所描述之抗體及結合片段之例示性實施例的某些特徵及特性。
實例1
(2S)-2-(2-溴乙醯胺基)-N-[(2S)-1-({3-[(7S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-7,8,11,13-四氫-2H,10H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪基[1,2-b]喹啉基-14-基]雙環[1.1.1]戊-1-基}胺基)-1-側氧基丙-2-基]-3-甲基丁醯胺
實例1A
(3-(甲氧基(甲基)胺甲醯基)雙環[1.1.1]戊-1-基)胺基甲酸第三丁酯
在10℃下，向3-((第三丁氧基羰基)胺基)雙環[1.1.1]戊-1-甲酸(4.9g)、N,O-二甲基羥胺鹽酸鹽(2.2g)及N,N-二異丙基乙胺(11.30mL)於二氯甲烷(10mL)中之溶液分部分添加1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡錠3-氧化物六氟磷酸(8.61g)。將反應混合物在20℃下攪拌12小時。建立兩個額外反應，且如所述在20℃下攪拌12小時。組合所有三個反應。將反應物用二氯甲烷(200mL)稀釋且添加1NHCl水溶液(50mL)。過濾所形成的沈澱物且使濾液分離。有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液(50mL)及鹽水(50mL)洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾且減壓濃縮。殘餘物藉由矽膠層析純化，用含1-50%乙酸乙酯之石油醚溶離，獲得標題化合物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ ppm 4.97(br s,1H),3.66(s,3H),3.18(s,3H),2.34(s,6H),1.45(s,9H)。MS(ESI+)m/z 271.2(M+H)+。
實例1B
(3-(苯并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-羰基)雙環[1.1.1]戊-1-基)胺基甲酸第三丁酯
在-65℃下在氮氣下向5-溴苯并[d][1,3]二氧雜環戊烯(8.83g)於四氫呋喃(100mL)中的溶液中緩慢添加正丁基鋰(17.57mL，己烷中2.5M)。將混合物在-65℃下攪拌30分鐘。緩慢添加實例1A(4.75g)於四氫呋喃(40mL)中之溶液。將混合物在-65℃下攪拌3小時。設置三個額外反應且允許在-65℃下攪拌3小時。合併所有四個反應物。混合物用飽和氯化銨水溶液(500mL)淬滅且用乙酸乙酯(3×500mL)萃取。組合之有機層用鹽水(500mL)洗滌，經無 水硫酸鈉乾燥，過濾且減壓濃縮。殘餘物藉由矽膠層析純化，用含1-50%乙酸乙酯之石油醚溶離，獲得標題化合物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ ppm 7.63(dd,1H),7.45(d,1H),6.82(d,1H),6.03(s,2H),5.04(br s,1H),2.50(s,6H),1.46(s,9H)。MS(ESI+)m/z 354.2(M+Na)+。
實例1C
N-(3-(苯并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-羰基)雙環[1.1.1]戊-1-基)-2,2,2-三氟乙醯胺
步驟1：在0℃下向實例1B(6.2g)於二氯甲烷(62mL)中之溶液中緩慢添加三氟乙酸(62mL)。將反應物在25℃下攪拌4小時。建立兩個額外反應且在25℃下攪拌4小時。減壓濃縮每種混合物。每個殘餘物無需進一步純化即可用於下一步。
步驟2：在0℃下向上述粗產物於二氯甲烷(62mL)中的溶液中逐滴添加N,N-二異丙基乙胺(16.34mL)及三氟乙酸酐(3.96mL)。將混合物在25℃下攪拌2小時。如所述建立兩個額外反應且在25℃下攪拌2小時。將所有三個反應物合併且倒入水(200mL)中，用二氯甲烷(2×200mL)萃取。有機層用鹽水(200mL)洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾且減壓濃縮。殘餘物藉由矽膠管柱層析純化，用含25%乙酸乙酯之石油醚溶離，獲得標題化合物。1H NMR(501MHz,CDCl3)δ ppm 7.61(dd,1H),7.43(d,1H),7.00(s,1H),6.85(d,1H),6.05(s,2H),2.62(s,6H)。MS(ESI+)m/z 328.2(M+H)+。
實例1D
2,2,2-三氟-N-(3-(6-硝基苯并[d][1,3]d二氧雜環戊烯-5-羰基)雙環[1.1.1]戊-1-基)乙醯胺
在0℃下向實例1C(4.3g)於乙酸酐(25mL)之溶液中分部分添加硝酸銅(II)三水合物(4.76g)。將混合物在0℃下攪拌3小時。如所述，設置三個額外反應且在0℃下攪拌3小時。合併所有四個反應物。將混合物倒入水(50mL)中且用乙酸乙酯(5×100mL)萃取。有機層經無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮。殘餘物藉由矽膠管柱層析純化，用含75%乙酸乙酯之石油醚溶離，獲得標題化合物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ ppm 7.61(s,1H),6.77(br s,1H),6.64(s,1H),6.21(s,2 H),2.43(s,6 H)。MS(APCI+)m/z 373.1(M+H)+。
實例1E
N-(3-(6-胺基苯并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-羰基)雙環[1.1.1]戊-1-基)-2,2,2-三氟乙醯胺
在氮氣下向實例1D(4g)於乙醇(40mL)及水(8mL)中之溶液中添加鐵(5.4g)及氯化銨(5.17g)。將混合物在100℃下攪拌3小時。如所述，設置三個額外反應且在100℃下攪拌3小時。冷卻至環境溫度之後，合併 所有四個反應物。將混合物倒入水(1L)中且用乙酸乙酯(5×500mL)萃取。組合之有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾且減壓濃縮。殘餘物藉由矽膠管柱層析純化，用石油醚中的10-75%乙酸乙酯溶離，獲得標題化合物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ ppm 7.22(s,1H),6.70(s,1H),6.50(s,2H),6.14(s,1H),5.92(s,2H),2.63(s,6H)。MS(ESI+)m/z 343.2(M+H)+。
實例1F
(S)-N-(3-(7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-8,10,11,13-四氫-7H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3',4'：6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-14-基)雙環[1.1.1]戊-1-基)-2,2,2-三氟乙醯胺
實例1E(3.5g)及(S)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1H-哌喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4H)-三酮(2.69g)於甲苯(140mL)中之懸浮液添加對甲苯磺酸單水合物(1.945g)。將混合物在115℃下攪拌12小時。如所述，設置三個額外反應且在115℃下攪拌12小時。冷卻至環境溫度之後，合併所有四個反應物。過濾混合物，且收集之固體用乙腈(200mL)濕磨，獲得標題化合物。1H NMR(400MHz，二甲亞碸-d 6 )δ ppm 10.28(s,1H),7.64(s,1H),7.52(s,1H),7.24(s,1H),6.47(s,1H),6.30(dd,2H),5.42(s,2H),5.36(s,2H),2.87(s,6H),1.94-1.77(m,2H),0.88(t,3H)。MS(ESI+)m/z 570.3(M+H)+。
實例1G：(7S)-14-(3-胺基雙環[1.1.1]戊-1-基)-7-乙基-7-羥基-2H,10H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-8,11(7H,13H)-二酮
向實例1F(3g)於甲醇(30mL)中之溶液中添加HCl(60mL，甲醇中4M)。將混合物在65℃下攪拌4小時。如上所述，設置四個額外反應且在65℃下攪拌4小時。冷卻至環境溫度之後，合併所有五個反應物。將混合物減壓濃縮且將殘餘物與甲醇(200mL)一起濕磨，獲得標題化合物。1H NMR(400MHz，二甲亞碸-d 6 )δ ppm 9.23(s,3H),7.54(s,1H),7.51(s,1H),7.24(s,1H),6.30(d,2H),5.41(s,2H),5.39-5.26(m,2H),2.79(s,6H),1.87(七重峰，2H),0.88(t,3H)。MS(ESI+)m/z 474.3(M+H)+。
實例1H
((S)-1-(((S)-1-((3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-8,10,11,13-四氫-7H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)雙環[1.1.1]戊-1-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸第三丁酯
向(S)-2-((S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙酸(2.49g)、2-羥基吡啶1-氧化物(1.31g)及N 1-((乙基亞胺基)亞甲基)-N 3,N 3-二甲基丙烷-1,3-二胺鹽酸鹽(2.26g)於乙腈(40mL)中之懸浮液添加2,6-二甲基吡啶(2.74mL)。在環境溫度下攪拌混合物30分鐘。在一個單獨的燒瓶中，將實例1G(4g)及2,6-二甲基吡啶(2.74mL)在N,N-二甲基甲醯胺(40mL)中合併且添加上述溶液。在環境溫度下攪拌混合物隔夜。減壓濃縮混合物，且將殘餘物溶解於二氯甲烷(300mL)中，用飽和氯化銨水溶液(100mL)、鹽水(100mL)洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾且減壓濃縮。殘餘物藉由矽膠管柱層析純化，用含0-10%甲醇之二氯甲烷溶離，獲得標題化合物。1H NMR(400MHz，二甲亞碸-d 6 )δ ppm 8.65(s,1H),7.89(d,1H),7.61(s,1H),7.49(s,1H),7.22(s,1H),6.77(d,1H),6.46(s,1H),6.29(d,2H),5.41(s,2H),5.32(s,2H),4.29(q,1H),3.87-3.77(m,1H),2.76(s,6H),1.99(q,1H),1.92-1.81(m,2H),1.41(s,9H),1.25(d,3H),0.92-0.80(m,9H)。MS(ESI+)m/z 744.4(M+H)+。
實例1I
(S)-2-胺基-N-((S)-1-((3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-8,10,11,13-四氫-7H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)雙環[1.1.1]戊-1-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-3-甲基丁醯胺
在環境溫度下用三氟乙酸(30mL)處理實例1H(5.5g)持續30 分鐘。將混合物減壓濃縮且將殘餘物溶解在50%乙腈於水中之溶液(200mL)中。將該溶液凍乾，獲得標題化合物。1H NMR(600MHz，二甲亞碸-d 6 )δ ppm 8.80(s,1H),8.59(d,1H),8.10(d,3H),7.60(s,1H),7.48(s,1H),7.23(s,1H),6.33-6.26(m,2H),5.41(d,2H),5.35-5.23(m,2H),4.35(p,1H),3.66-3.63(m,1H),2.77(s,6H),2.17-2.06(m,1H),1.91-1.83(m,2H),1.31(d,3H),1.01-0.96(dd,6H),0.89(t,3H)。MS(ESI+)m/z 644.4(M+H)+。
實例1J
(2S)-2-(2-溴乙醯胺基)-N-[(2S)-1-({3-[(7S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-7,8,11,13-四氫-2H,10H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]雙環[1.1.1]戊-1-基}胺基)-1-側氧基丙-2-基]-3-甲基丁醯胺
向2-溴乙酸(1.435g)於N,N-二甲基甲醯胺(26mL)中之溶液添加2-乙氧基喹啉-1(2H)-甲酸乙酯(2.55g)。在環境溫度下攪拌混合物10分鐘。在一個單獨的燒瓶中，將實例1I(4.5g)及2,6-二甲基吡啶(3.61mL)在N,N-二甲基甲醯胺(26mL)中合併且添加上述溶液。在環境溫度下攪拌混合物30分鐘。混合物用三氟乙酸(4mL)酸化且藉由在CombiFlash® Teledyne Isco系統上使用Luna管柱(250×50mm，10mm)的逆相HPLC，用含有0.1%三氟乙酸的5-75%乙腈水溶液經30分鐘溶離來純化，凍乾後獲得標題化合物。1H NMR (600MHz，二甲亞碸-d 6 )δ ppm 8.57(s,1H),8.32(d,1H),8.16(d,1H),7.67(s,1H),7.52(s,1H),7.24(s,1H),6.30(dd,2H),5.42(s,2H),5.38(d,2H),4.28-4.19(m,2H),4.03-3.91(m,2H),2.76(s,6H),2.02(h,1H),1.86(ddp,2H),1.25(d,3H),0.93-0.84(m,9H)。MS(ESI+)m/z 764.46(M+H)+。
實例2
(2S)-2-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-N-[(2S)-1-({3-[(7S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-7,8,11,13-四氫-2H,10H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]雙環[1.1.1]戊-1-基}胺基)-1-側氧基丙-2-基]-3-甲基丁醯胺
向實例1I(2g)於N,N-二甲基甲醯胺(54mL)中之溶液添加2,5-二側氧基吡咯啶-1-基2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸酯(0.7g)，隨後添加N,N-二異丙基乙胺(2.3mL)。在環境溫度下攪拌混合物30分鐘。用三氟乙酸(2mL)淬滅反應，且在Gilson PLC 2020系統上使用Luna管柱(250×50mm，10mm)的逆向HPLC，用含0.1%三氟乙酸的5-75%乙腈水溶液經30分鐘溶離來純化，凍乾後獲得標題化合物。1H NMR(500MHz，二甲亞碸-d 6 )δ ppm 8.50(s,1H),8.29(d,1H),8.13(d,1H),7.64(s,1H),7.51(s,1H),7.23(s,1H),7.12(s,2H),6.30(d,2H),5.42(s,2H),5.36(d,2H),4.24(p,1H),4.20-4.14(m,3H), 2.75(s,6H),2.01(h,1H),1.86(dp,2H),1.26(d,3H),0.93-0.83(m,9H)。MS(ESI+)m/z 781.14(M+H)+。
實例3
(2S,3S,4R,5R,6S)-6-[2-(5-{[(2S)-2-({(2S)-2-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}-2-{[({3-[(7S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-7,8,11,13-四氫-2H,10H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]雙環[1.1.1]戊-1-基}胺甲醯基)氧基]甲基}苯基)乙基]-3,4,5-三羥基氧雜環己烷-2-甲酸
實例3A
(2S,3S,4R,5S,6S)-2-(5-((S)-2-((S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)-2-((((3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-8,10,11,13-四氫-7H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)雙環[1.1.1]戊-1-基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯乙基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-哌喃-3,4,5-三基三乙酸酯
向(2S,3S,4R,5S,6S)-2-(5-((S)-2-((S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯乙基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-哌喃-3,4,5-三基三乙酸酯(如WO2016094509中所述製備，2.99g]、實例1G(1.35g)及1-羥基-7-氮雜苯并三唑(0.361g)於N,N-二甲基甲醯胺(26.5mL)中之混合物添加N,N-二異丙基乙基胺(1.39mL)。在環境溫度下攪拌混合物4小時。減壓濃縮混合物，且殘餘物藉由矽膠管柱層析純化，用含0-8%甲醇之二氯甲烷溶離，獲得標題化合物。1H NMR(501MHz,CDCl3)δ ppm 8.43(br s,1H),7.74(d,2H),7.61(br s,1H),7.57-7.46(d,4H),7.43(s,1H),7.38(t,3H),7.33-7.27(m,3H),6.43(br s,1H),6.17(s,2H),5.89(br s,1H),5.72(d,1H),5.37-5.02(m,8H),4.94(t,1H),4.67-4.56(m,1H),4.53-4.44(t,2H),4.19(br s,1H),4.00(d,2H),3.77(s,3H),3.48(dt,1H),2.94(d,1H),2.88-2.66(m,6H),2.16(br s,1H),2.08-1.97(m,9H),1.94-1.80(ddt,4H),1.45(d,3H),1.02(t,3H),0.98-0.90(m,6H)。MS(ESI+)m/z 1359.5(M+H)+。
實例3B
(2S,3S,4R,5R,6S)-6-(5-((S)-2-((S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)-2-((((3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-8,10,11,13-四氫-7H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)雙環[1.1.1]戊-1-基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯乙基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-哌喃-2-甲酸
向實例3A(3.2g)於甲醇(24mL)及四氫呋喃(24mL)中的溶液中添加氫氧化鋰單水合物(846mg)於水(24mL)中的溶液。在環境溫度下攪拌混合物30分鐘。用三氟乙酸(3mL)淬滅反應且用庚烷(5×30mL)萃取。藉由在CombiFlash®Teledyne Isco系統上使用Luna管柱(250×50mm，10mm)的逆向HPLC，用含0.1%三氟乙酸的5-75%乙腈水溶液經30分鐘溶離來純化含水層，凍乾後獲得標題化合物。1H NMR(400MHz，二甲亞碸-d 6 )δ ppm 10.03(s,1H),8.62(d,1H),8.02(br s,4H),7.55(s,1H),7.43(s,1H),7.41(d,2H),7.35(s,1H),7.22(d,1H),7.16(s,1H),6.40(br s,1H),6.23(s,2H),5.35(s,2H),5.27(s,2H),4.97(s,2H),4.43(p,1H),3.60-3.47(m,3H),3.15-3.01(m,3H),2.90(t,1H),2.64(s,6H),2.00(tq,2H),1.79(hept,2H),1.60-1.46(m,1H),1.29(d,3H),0.89(dd,6H),0.80(t,3H)。MS(ESI+)m/z 997.3(M+H)+。
實例3C
(2S,3S,4R,5R,6S)-6-[2-(5-{[(2S)-2-({(2S)-2-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}-2-{[({3-[(7S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-7,8,11,13-四氫-2H,10H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]雙環[1.1.1]戊-1-基}胺甲醯基)氧基]甲基}苯基)乙基]-3,4,5-三羥基氧雜環己烷-2-甲酸
向實例3B(1.02g)於N,N-二甲基甲醯胺(16mL)中之溶液添加2,5-二側氧基吡咯啶-1-基2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸酯(0.28g)，隨後添加N,N-二異丙基乙胺(0.8mL)。在環境溫度下攪拌混合物30分鐘。反應用乙酸(0.8mL)淬滅，且藉由Gilson PLC 2020系統上使用Luna管柱(250×50mm，10mm]的逆向HPLC，用含0.1%三氟乙酸之5-75%乙腈水溶液經30分鐘溶離來純化，凍乾後獲得標題化合物。1H NMR(501MHz，二甲亞碸-d 6 )δ ppm 9.90(s,1H),8.29-8.25(m,2H),8.11(s,1H),7.64(s,1H),7.51(s,1H),7.47(d,1H),7.42(s,1H),7.27(d,1H),7.23(s,1H),7.08(s,2H),6.30(s,2H),5.42(s,2H),5.36(s,2H),5.03(s,2H),4.38(p,1H),4.22(dd,1H),4.13(s,2H),3.58(d, 2H),3.15(d,4H),2.97(t,1H),2.71(s,6H),2.10-1.93(m,2H),1.86(dp,2H),1.64-1.52(m,1H),1.31(d,3H),0.91-0.79(m,9H)。MS(ESI+)m/z 1134.3(M+H)+。
實例4：細胞增殖
藉由評估TOP1i藥物對細胞活力的影響監測代謝活躍細胞的ATP存在。使用CellTiter-Glo®發光量化Calu-6細胞(肺腺癌)及A375細胞(惡性黑色素瘤)的增殖。如圖2A及表1中所示，式I的化合物(實施例1G)表現出亞奈莫耳功效以降低增殖的Calu-6細胞(0.57nM，圖2A)及A375(0.50nM，圖2B)的活力。此亞奈莫耳功效比TOP1i藥物SN-38在同一分析中的性能有所提高，其EC50為6.58nM(Calu-6)及2.30nM(A375)。
實例5：AbA的製備及純化
AbA在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表現，其重鏈及輕鏈序列分別為SEQ ID NO：9及10。在結合之前分離及純化AbA。
實例6：結合程序(ADC-1)
結合步驟1
在還原之前，將抗c-Met抗體AbA溶液在4℃下培育至少12小 時。隨後添加0.5M乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液(EDTA，Sigma Aldrich)，最終濃度為5mM。將參(2-羧乙基)膦(TCEP，100mM，2.67莫耳當量，Bond BreakerTM，Thermo ScientificTM)添加至溶液(在1X DPBS中約10mg/mL(杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水)中，攪拌板輕輕混合(225rpm)5分鐘。在4℃冰箱培育17小時後，使溶液在225rpm攪拌板混合下達到22℃。隨後添加10% v/v N,N-二甲基乙醯胺(MA，Sigma Aldrich)共溶劑，隨後20% v/v製備之1M硼酸，pH 8.0(Sigma Aldrich)且隨後駐地添加6莫耳{4當量含50mM連接子藥物LD1(結構式V，實例1J)之N,N-二甲基乙醯胺。20分鐘後中斷混合且將溶液在22℃下培育3.3小時。培育後，將在1X DPBS中製備的2莫耳當量50mM N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC，Sigma Aldrich)添加至溶液中，且藉由手動攪拌容器輕輕混合。在22℃下培育1小時後，使用691mL G25精細脫鹽(CytivaTM)管柱將溶液脫鹽至1X DPBS中。
結合步驟2
在還原之前，將抗c-Met抗體AbA溶液在4℃下培育至少12小時。隨後添加0.5M乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液(EDTA，Sigma Aldrich)，最終濃度為5mM。將參(2-羧乙基)膦(TCEP，100mM，1.00莫耳當量，Bond BreakerTM，Thermo ScientificTM)添加至抗體溶液中(在1X DPBS中約4mg/mL)，攪拌板輕輕混合(225rpm)5分鐘。在4℃下冰箱培育17小時後，在225rpm下攪拌板混合下使溶液升溫至22℃。隨後添加10% v/v N,N-二甲基乙醯胺(DMA，Sigma Aldrich)共溶劑，隨後添加20% v/v 1M硼酸，pH 8.0(Sigma Aldrich)，且隨後逐滴添加4莫耳當量含50mM連接子藥物LD1(結構式V，實例1J)之N,N-二甲基乙醯胺。20分鐘後中斷混合且將溶液在22℃下培育2.1小時。培育後，將在1X DPBS中製備的2莫耳當量的10mM N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC，Sigma Aldrich)添加至溶液中，且藉由手動攪拌容器輕輕混合。在22℃下培育5 小時後，濃縮溶液，且藉由超濾透濾(UF/DF)更換緩衝液。
UF/DF步驟
Pellicon® 3 0.22m2 Cassette(Millipore)用2L無菌水，隨後用0.5L調配物緩衝液沖洗。超濾(UF)以250mL/min的進料流動速率及12-13psi的跨膜壓力(TMP)進行，起始體積為1.3L。最終滲透體積為1.1L。使用25透析體積(DV)的最終調配物緩衝液，與UF步驟相同的進料流動速率及TMP進行透濾(DF)。在DF之後，執行第二UF步驟以進一步將ADC溶液體積減少至100mL。移除ADC溶液，且用125mL調配物緩衝液沖洗盒兩次，隨後將其超濾至每次20mL。隨後將此等沖洗液添加至大量ADC溶液中。在表徵之前，用0.22μm過濾器對最終溶液進行無菌過濾。
實例7：結合程序(ADC-2)
還原之前，抗c-Met抗體AbA溶液在濕冰上培育35分鐘。隨後添加0.5M乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液(EDTA，Sigma Aldrich)，最終濃度為5mM。將參(2-羧乙基)膦(TCEP，25mM，3.50莫耳當量，Bond BreakerTM，Thermo ScientificTM)添加至溶液中(在1X DPBS中約10mg/mL)，且藉由緩慢倒置試管若干次輕輕混合。隨後將溶液置於濕冰上且置於4℃冰箱中24小時。培育後，添加10% v/v N,N-二甲基乙醯胺共溶劑，隨後添加10莫耳當量的10mM連接子藥物LD2(結構式VI，實例2)於N,N-二甲基乙醯胺(DMA，Sigma Aldrich)中之溶液，且藉由緩慢倒置試管若干次輕輕混合。隨後將溶液置於濕冰上30分鐘且在22℃下培育90分鐘。培育後，將在PBS中製備的8莫耳當量之10mM N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC，Sigma Aldrich)添加至溶液中，且藉由緩慢倒置試管若干次輕輕混合。在22℃下培育60分鐘後，將溶液經HiPrepTM 26/10脫鹽管柱脫鹽至1X DPBS(CytivaTM)中。隨後藉由添加製備的10% v/v 1M硼酸溶液，pH 8.0(Sigma Aldrich)水解脫鹽之ADC，且在22℃下培育96小時。水解之ADC 藉由偶合親和脫鹽層析(2×1mL HiTrap MabSelect SuRe、HiPrepTM26/10脫鹽，CytivaTM)純化成1X DPBS的最終調配物。將收集的級分彙聚且在表徵之前經0.22μm過濾器無菌過濾。
實例8：結合程序(ADC-3)
乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA，0.5M，21.3μL，Sigma Aldrich)水溶液添加至5.337mL抗c-Met抗體(AbA，1X DPBS中13.34mg/mL，pH 7.4)溶液中。將參(2-羧乙基)膦(TCEP，10mM，3.0莫耳當量，142.4μL，Bond BreakerTM，Thermo ScientificTM)添加至溶液中，輕輕攪拌，且在37℃下保持75分鐘。將溶液冷卻至環境溫度且添加連接子-藥物LD3(結構式VII，實例3C)(10當量，527μL 10mM LD3溶液(結構式VII，實例3C，在N,N-二甲基乙醯胺中，純度90%)。輕輕攪拌結合物且在環境溫度下靜置1.2小時。ADC溶液藉由脫鹽純化。脫鹽後，ADC溶液經0.22μm過濾器過濾且所得樣品在4℃下儲存。藉由添加10% v/v 1.0M硼酸鹽緩衝液，pH 8.0水解所得ADC，且在黑暗環境中在環境溫度下培育72小時。水解後，所得ADC溶液藉由吸附至蛋白A樹脂管柱(MabSelectTM SuReTM LX，GE Healthcare)進行純化；用4管柱體積之1X DPBS，pH 7.4洗滌；用5管柱體積之IgG溶離緩衝液(Thermo ScientificTM)溶離樹脂；且脫鹽至1X DPBS，pH 7.4。脫鹽後，ADC溶液經0.22μm過濾器過濾，且所得樣品在4℃下儲存。
實例9：結合程序(ADC-4)
乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA，0.5M，974μL，Sigma Aldrich)水溶液添加至243.3mL純化的MSL109-C6v1抗體溶液(12.3mg/mL在20mM Tris緩衝液中，pH 7.4)。MSL109-C6v1為與CMV醣蛋白H結合之單株抗體。MSL109-C6v1包含如SEQ ID NO：11所示之重鏈及如SEQ ID NO：12所示之輕鏈，且用作非靶向對照抗體。參(2-羧乙基)膦(TCEP，500mM，6.0莫耳當量，242.4μL， Bond BreakerTM，Thermo ScientificTM)添加至MSL109-C6v1與2mM EDTA的溶液中，輕輕攪拌且在4℃下保持20小時。將4℃的Tris緩衝液(1.0M，pH 8.0)添加至溶液中(24.5mL，10% v/v)。將連接子-藥物LD1(實例1J，(2S)-2-(2-溴乙醯胺基)-N-[(2S)-1-({3-[(7S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二側氧基-7,8,11,13-四氫-2H,10H-[1,3]二氧雜環戊烯并[4,5-g]哌喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]雙環[1.1.1]戊-1-基}胺基)-1-側氧基丙-2-基]-3-甲基丁醯胺)添加至pH 8.0之還原抗體(10當量，22.5Ml 10mM LD1溶液，結構式V，實例1J，在N,N-二甲基乙醯胺中，90%純度)。輕輕攪拌結合物且在環境溫度水浴下靜置1.5小時。藉由添加4當量的N-乙醯基-L-半胱胺酸水溶液(NAC，Sigma Aldrich，1X DPBS中的100mM溶液，0.8mL)淬滅結合。將混合物輕輕攪拌且在環境溫度下靜置1小時。添加Tris緩衝液(15%，Sigma，1.0M，pH 7.4，44mL)以將ADC溶液調節至pH 7.5。ADC溶液在4℃下儲存隔夜。濃縮ADC溶液，且經超濾透濾(Pellicon® 3 0.22m2 Cassette(Millipore))更換緩衝液。最終的ADC溶液經0.22μm過濾器過濾且所得ADC樣品在4℃下儲存。ADC的最終體積為138mL。
實例10：DAR(藥物抗體比)測定
DAR藉由LC-MS測定。使用與Agilent LC/MSD TOF 6220 ESI質譜儀連接之Agilent 1100 HPLC系統進行LC-MS分析。ADC用5mM(最終濃度)Bond-BreakerTM TCEP溶液(Thermo ScientificTM，Rockford，IL)還原，裝載至蛋白質微量捕集器(Michrom Bioresources，Auburn，CA)脫鹽濾筒上，且在環境溫度下以0.2分鐘內10% B至75% B的梯度溶離。移動相A為含0.1%甲酸(FA)之H2O，移動相B為含0.1% FA之乙腈，且流動速率為0.2mL/min。使用Agilent MassHunterTM採集軟體採集共溶離之輕鏈及重鏈的電噴霧電離飛行時間質譜。使用MassHunterTM軟體的最大熵特徵對提取的強度與m/z光譜進行解卷積，以測定每個還原抗體片段之質量。藉由將輕鏈及重鏈的裸峰及修飾峰的強度 相加，藉由將強度乘以附著之藥物數目進行歸一化，自解卷積光譜中計算出DAR。歸一化之強度總和除以強度總和，且兩條輕鏈及兩條重鏈之總和結果產生完整ADC的最終平均DAR值。生物結合物的硫代丁二醯亞胺水解可藉由電噴霧質譜法監測，因為向結合物中添加水導致結合物的可觀測分子量增加18道爾頓。
實例11：活體外細胞毒性分析
將腫瘤細胞以2000-5000個細胞/孔接種至96孔板中的180μL含有10% FBS(胎牛血清)的生長培養基中，且在37℃下在5% CO2的加濕培育箱中培養。18至24小時後，添加20μL中的抗體或ADC滴定液，且將細胞培育6天，但HCC827、NCI-H820及HEK-293(5天)及MIA PaCa2(4天)除外。根據製造商說明，使用CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay(Promega)測定細胞活力。所有分析中亦包括非結合不相關的陰性對照ADC(ADC-4，結構式VIII，其中Ab為MSL109-C6v1)，以確認細胞殺傷係抗原依賴性的。所有ADC的平均DAR大致相當。
實例12：受體密度的測定
c-Met細胞表面密度(每個細胞的抗原結合能力)藉由使用QIFIKIT®(Dako/Agilent)對培養細胞上的細胞表面抗原進行間接免疫螢光染色來測定。簡言之，如上文針對FACS(螢光激活細胞分選)分析所述自培養燒瓶 採集細胞，以100μL/孔添加至圓底96孔板中，且在4℃下與3μg/mL c-Met抗體m224G11一起培育。用3μg/mL相同同種型的無關小鼠單株抗體(mIgG1)處理的孔作為對照。與初級抗體培育1小時後，將細胞在300 xg下離心3分鐘，且用FACS緩衝液洗滌兩次。對於QIFIKIT®珠粒的間接免疫螢光染色，將100μL來自小瓶1(設置珠粒)及小瓶2(校準珠粒)的重懸浮珠粒添加至單獨的孔中，以300 x g離心3分鐘，且用FACS緩衝液洗滌一次。所有孔均在4℃下與在FACS緩衝液中以1：250倍稀釋的100μL抗小鼠Alexa Fluor® 488結合抗體(Invitrogen，目錄號A-11029)一起培育。將細胞以300 x g離心3分鐘，用FACS緩衝液洗滌兩次，且用100μL/孔含1%甲醛之PBS溶液(磷酸鹽緩衝鹽水)固定。在BDTM LSRII流式細胞儀上採集資料，記錄5個珠群群體之幾何平均值，且基於每個珠粒之批次特異性抗體分子產生標準曲線。標準曲線用於將ABC(抗體結合能力或受體數目)分配給染色的細胞樣品。
結果
為了測定c-Met表現水準及對ADC-1敏感性的潛在相關性，在活體外增殖分析中測試一組9個細胞系。FACS分析證明此等細胞系具有一定範圍之c-Met表現量，如經由代表細胞表面c-Met分子數目之c-Met抗體結合能力量化(表3)。在細胞增殖分析中對ADC-1之敏感性根據最大殺傷及IC50量化(表3)。ADC-1抑制過度表現c-Met的癌細胞的增殖，包括MET擴增的細胞系(表3)。作為比較，未結合之AbA抑制具有MET擴增的細胞增殖，即Hs 746T、SNU-5及EBC-1(圖3A-C)，但不抑制不具有MET擴增的細胞系，即NCI-H441、NCI-H1573、HCC827、NCI-H820及Calu-3，且其中ADC-1亦具有活性(圖3D-H)。未結合之AbA及ADC-1對低c-Met表現細胞HEK-293及MIA PaCa2均無活性(表3，圖3I及圖3J)，表明ADC-1的顯著殺傷需要閾值c-Met表現量。
a藉由FACS分析測定之細胞表面上大致c-Met分子數目，作為在0.01mg/mL下結合之m224GI I(AbA的鼠親本)的抗體結合能力
bMax係增殖分析中相對於未處理對照組的最大百分比降低。
c由於曲線擬合問題而估算
d與對照組沒有不同
end意謂未測得
實例13：c-Met靶向TOP1i ADC活體內抑制癌症異種移植物的生長
細胞系Hs 746T及NCI-H441獲自ATCC(美國典型培養物保藏中心]。根據供應商的建議，細胞在單層培養中最多維持3代。在雌性C.B-17 SCID小鼠的右腹側皮下注射與Matrigel®(1：1，體積：體積)混合的培養基中的2×106個細胞的懸浮液，以自胃癌細胞系Hs 746T產生異種移植物。為了自NSCLC細 胞系產生異種移植物，將培養基中5×106個細胞與Matrigel混合(1：1，體積：體積)的NCI-H441 a懸浮液皮下注射至雌性SCID/bg小鼠中。當側腹腫瘤的大小為約200mm3時開始治療。
投與媒劑(0mg/kg)及四種劑量水準(劑量A-D，自最低至最高)。每隻動物接收單次劑量。
圖4A及4B顯示ADC-1抑制在免疫受損小鼠中作為異種移植物生長的人類NSCLC的生長。在投與一次劑量之劑量C及劑量D的ADC-1之後顯示出強烈的生長抑制，在Hs 746T及NCI-H441異種移植物中給予劑量B後的中等腫瘤生長延遲。
實例14：靶向c-MET之TOP1i ADC活體內抑制患者源性癌細胞的生長
NSCLC患者源性異種移植(PDX)模型LU450、LU120、LU572、LU123及LU413係藉由在雌性免疫缺陷NOD/SCID小鼠(Charles River Laboratories)中皮下植入患者活檢組織碎片而內部形成的。一旦形成腫瘤，藉由將腫瘤解離成細胞懸浮液來擴增PDX腫瘤細胞，且將培養基中的5×104個細胞與Matrigel®(1：1，體積：體積)混合，皮下注射至雌性NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪墊區。對於功效研究，將荷瘤小鼠隨機分為治療組，每組具有相等的平均腫瘤體積(130-200mm3)。c-Met-ADC經腹膜內注射以六個劑量水準(劑量A-F，自最低至最高)作為單次劑量投與。將c-Met靶向之功效與類似的賦形劑投與進行比較。每週量測腫瘤體積一到兩次，且藉由相對於時間繪製腫瘤體積(mm3)來評估功效，以計算腫瘤進展時間(TTP)。TTP，以天數為單位表示，係單次劑量治療後腫瘤再生至治療前兩倍大小的時間(隨機化)。持續反應(治癒)的TTP表示為研究長度，數字前帶有「>」符號。
10=媒劑對照組
具有根據結構式(VIII)之結構的ADC表現出改良之活體內毒性。 

          <![CDATA[<110>  艾伯維公司（AbbVie Inc.）]]>
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          Gln Gln Ser Lys Glu Asp Pro Leu Thr 
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          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
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          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Ser Glu Ile Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Val Thr Val Ser Ser 
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          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Asn Ser Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
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          Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
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          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 
                  115                 120                 125             
          Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 
              130                 135                 140                 
          Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 
                  195                 200                 205             
          Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His 
              210                 215                 220                 
          Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 
                          245                 250                 255     
          Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 
                      260                 265                 270         
          Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 
                  275                 280                 285             
          Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 
              290                 295                 300                 
          Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 
                          325                 330                 335     
          Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 
                      340                 345                 350         
          Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 
                  355                 360                 365             
          Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 
              370                 375                 380                 
          Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 
                          405                 410                 415     
          Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 
                      420                 425                 430         
          Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
                  435                 440                 445 
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  218]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Asn Ser Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105                 110         
          Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 
                  115                 120                 125             
          Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 
              130                 135                 140                 
          Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 
                          165                 170                 175     
          Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 
                      180                 185                 190         
          His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 
                  195                 200                 205             
          Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215             
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  460]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Glu Glu Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Val Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ser Ile Asn Ser Asp Ser Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Ile Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Tyr Ala Phe Ser Ser Gly Ser Leu Ser Asp 
                      100                 105                 110         
          Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ile Val 
                  115                 120                 125             
          Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 
              130                 135                 140                 
          Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 
                          165                 170                 175     
          Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 
                      180                 185                 190         
          Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 
                  195                 200                 205             
          Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 
              210                 215                 220                 
          Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 
                          245                 250                 255     
          Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 
                      260                 265                 270         
          Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 
                  275                 280                 285             
          Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 
              290                 295                 300                 
          Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 
                          325                 330                 335     
          Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 
                      340                 345                 350         
          Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 
                  355                 360                 365             
          Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 
              370                 375                 380                 
          Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 
                          405                 410                 415     
          Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 
                      420                 425                 430         
          Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 
                  435                 440                 445             
          Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
              450                 455                 460 
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  219]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr 
                      20                  25                  30          
          Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Val Glu Thr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 
                          85                  90                  95      
          Leu Gln Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
              130                 135                 140                 
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
                      180                 185                 190         
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
                  195                 200                 205             
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ala 
              210                 215                 
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          <![CDATA[<400>  13]]>
          Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met His Trp Val Arg Gln Ser Leu Gly Glu Ser Leu Asp Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Ser Glu Ile Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Ala Leu Thr Val Ser Ser 
                  115             
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys 
                      100                 105                 110     
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr Thr 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  17]]>
          Ala Arg Ser Glu Ile Thr Thr Glu Phe Asp Tyr 
          1               5                   10      
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          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Glu Ser Val Asp Ser Tyr Ala Asn Ser Phe 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  3]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Arg Ala Ser 
          1           
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成多肽]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Gln Gln Ser Lys Glu Asp Pro Leu Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  1395]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成聚核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          atgggatggt cttggatctt tctgctgttt ctgtctggta ctgctggtgt gctgagccag       60
          gtccagctgg tgcaatccgg cgcagaggtg aagaagccag gcgcttccgt gaaggtgagc      120
          tgtaaggcct ctggctacat cttcacagca tacaccatgc actgggtgag gcaagctcct      180
          gggcagggac tggagtggat gggatggatt aaacccaaca atgggctggc caactacgcc      240
          cagaaattcc agggtagggt cactatgaca agggatacca gcatcagcac cgcatatatg      300
          gagctgagca ggctgaggtc tgacgacact gctgtctatt attgcgccag gagcgaaatt      360
          acaacagaat tcgattactg ggggcagggc accctggtga ccgtgtcctc tgccagcacc      420
          aagggcccaa gcgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc      480
          gccctgggct gcctggtgaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc      540
          ggagccctca cttctggagt tcataccttc ccagcagtat tgcagagcag tggcctgtat      600
          tcactgtctt ccgtcgtaac agttccatcc tccagcctcg ggacacagac ttacatttgt      660
          aacgtgaatc acaagcctag caacaccaag gtcgacaaga gagttgaacc aaagagttgt      720
          gattgccact gtcctccctg cccagctcct gagctgcttg gcggtcccag tgtcttcttg      780
          tttcccccta aacccaaaga caccctgatg atctcaagga ctcccgaggt gacatgcgtg      840
          gtggtggatg tgtctcatga ggacccagag gtgaagttca actggtacgt ggacggcgtg      900
          gaggtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggagcagt acaacagcac ctacagggtg      960
          gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgtaag     1020
          gtgtccaaca aggccctgcc agccccaatc gaaaagacca tcagcaaggc caagggccag     1080
          ccaagagagc cccaggtgta caccctgcca cccagcaggg aggagatgac caagaaccag     1140
          gtgtccctga cctgtctggt gaagggcttc tacccaagcg acatcgccgt ggagtgggag     1200
          agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc cagtgctgga cagcgacggc     1260
          agcttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaagagca gatggcagca gggcaacgtg     1320
          ttcagctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgagc     1380
          ctgtccccag gctga                                                      1395
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成聚核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          ggctacatct tcacagcata cacc                                              24
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成聚核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          attaaaccca acaatgggct ggcc                                              24
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成聚核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          gccaggagcg aaattacaac agaattcgat tac                                    33
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  717]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成聚核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          atggaaactg atacactgct gctgtgggtc ctgctgctgt gggtccctgg aagcacaggg       60
          gacattgtga tgacccagtc tcccgatagc ctggccgtgt ccctgggcga gagggctacc      120
          atcaactgta aaagctccga atctgtggac tcttacgcaa acagctttct gcactggtat      180
          cagcaaaagc caggccaacc tccaaagctg ctgatttaca gggcttctac cagggagagc      240
          ggcgtgcccg ataggttcag cggatctggc agcggcaccg actttacact gaccatctcc      300
          agcctgcagg ccgaagatgt ggcagtctat tactgccagc agtccaagga ggaccccctg      360
          actttcgggg gtggtactaa agtggagatc aagcgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc      420
          atcttccccc caagcgacga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgtctgctg      480
          aacaacttct accccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc      540
          ggcaacagcc aggagagcgt caccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc      600
          agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg      660
          acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca acaggggcga gtgctga         717
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成聚核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          gaatctgtgg actcttacgc aaacagcttt                                        30
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成聚核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          agggcttct                                                                9
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成聚核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          cagcagtcca aggaggaccc cctgact                                           27

Claims (8)

  1. 一種抗c-Met抗體藥物結合物，其包含以下結構：其中n是1至10的整數，並且其中Ab是IgG1抗c-Met抗體，其包含重鏈可變區，其包含重鏈互補決定區（CDR）3域、重鏈CDR2域及重鏈CDR1域，該重鏈CDR3域包含SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列，該重鏈CDR2域包含SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列，且該重鏈CDR1域包含SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含輕鏈CDR3域、輕鏈CDR2域及輕鏈CDR1域，該輕鏈CDR3域包含SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列，該輕鏈CDR2域包含SEQ ID NO: 5所示之胺基酸序列，且該輕鏈CDR1域包含SEQ ID NO: 4所示之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之抗c-Met抗體藥物結合物，其中該抗體Ab包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 7所示之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列。
  3. 如請求項1之抗c-Met抗體藥物結合物，其中該抗體Ab包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列。
  4. 如請求項3之抗c-Met抗體藥物結合物，其中n為6。
  5. 如請求項3之抗c-Met抗體藥物結合物，其中n為2。
  6. 如請求項3之抗c-Met抗體藥物結合物，其中n為4。
  7. 如請求項3之抗c-Met抗體藥物結合物，其中n為8。
  8. 如請求項3之抗c-Met抗體藥物結合物，其中n為10。
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