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TW202535885A - 配體-藥物偶聯物、偶聯連接子及其用途 - Google Patents

配體-藥物偶聯物、偶聯連接子及其用途

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Publication number
TW202535885A
TW202535885A TW113143623A TW113143623A TW202535885A TW 202535885 A TW202535885 A TW 202535885A TW 113143623 A TW113143623 A TW 113143623A TW 113143623 A TW113143623 A TW 113143623A TW 202535885 A TW202535885 A TW 202535885A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
alkyl
ligand
pharmaceutically acceptable
cycloalkyl
independently selected
Prior art date
Application number
TW113143623A
Other languages
English (en)
Inventor
李楨
王雪楓
陳常豔
付雅媛
魏夢浩
李正濤
岑超超
Original Assignee
大陸商海南先聲再明醫藥股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商海南先聲再明醫藥股份有限公司 filed Critical 大陸商海南先聲再明醫藥股份有限公司
Publication of TW202535885A publication Critical patent/TW202535885A/zh

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
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    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
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Abstract

本發明係提供由通式Pc-(L-D)n表示的一類配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，進一步提供如式(L)所示的偶聯連接子，該類連接子可以高效且高選擇性地與半胱胺酸上的巰基進行化學偶聯，形成的抗體偶聯藥物具有良好的穩定性。

Description

配體-藥物偶聯物、偶聯連接子及其用途
本發明屬於生物醫藥領域，關於一類結構新穎的配體-藥物偶聯物及其偶聯連接子、含有該偶聯物的藥物組成物以及該偶聯物作為抗腫瘤藥物等方面的用途。
抗體偶聯藥物(antibody drug conjugate，ADC)係近年來新型的一種藥物治療形式。從結構上看，ADC的組成包含具有標靶作用的抗體、發揮藥理活性作用的荷載(payload)以及一條連接鏈(linker)將抗體及荷載藉由化學方式連接起來。從機制上講，ADC係藉由抗體對抗原的特異性識別作用，增強ADC在抗原高表現的病灶組織部位富集，並經過內吞、溶酶體降解等方式，實現活性payload在病灶組織的標靶釋放，進而產生藥理作用。與此同時，ADC在體循環內能夠保持相對穩定的狀態，相比於病灶組織，僅有少量的payload能夠釋放到體循環中，進而降低高活性payload的全身性毒性。ADC藉由如此選擇性釋放的機制，進一步提高對疾病的治療效果並降低毒性風險。而linker作為連接抗體與payload之間的橋樑，在如何控制payload的靶組織釋放以及體循環中的穩定中，發揮著重要作用。
在ADC的linker中，將小分子與抗體藉由化學鍵相連的部分稱為 偶聯連接子。對於與抗體的偶聯方式大致可分為，藉由與抗體上天然胺基酸殘基進行偶聯(如離胺酸、半胱胺酸等)，以及藉由工程化抗體改造所進行的定點偶聯(如N297醣基偶聯、非天然胺基酸偶聯等)。針對不同的抗體偶聯方式，對應的偶聯連接子亦有所不同。目前在已經上市的ADC中，藉由半胱胺酸上的巰基進行偶聯係最常用的偶聯方式之一。通常情況下，抗體中含有4對鏈間二硫鍵，藉由還原的方式可以得到8個含巰基的半胱胺酸。借助於巰基的親核活性，可以與偶聯連接子進行化學反應，將抗體與linker-payload連接在一起。其中最常用的偶聯連接子為馬來醯亞胺，其可藉由邁克爾加成反應與半胱胺酸上的巰基高效地形成碳-硫鍵，進而將payload與抗體相連。例如，Adcetris，Enhertu等均係藉由馬來醯亞胺進行半胱胺酸偶聯得到的ADC產物。
第一態樣，本發明提供一種配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其結構通式為Pc-(L-D)n，
其中，
Pc為配體單元；
D為藥物單元；
L為以下結構的連接子單元，a端與配體單元連接，
其中，
X1、X2、X3各自獨立地選自N或CRa1，且X1、X2、X3中的至少一個選自N，前述Ra1選自H、鹵素、CN、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基、C3-C6環烷基或4-7元雜環基；
n1、n2各自獨立地選自0、1、2；
X4、X5各自獨立地選自C(=O)、C(Rb1)(Rb2)、O、S、S(=O)、S(=O)2、NRb3或其等的任意組合，前述Rb1、Rb2、Rb3各自獨立地選自H或Rc1，或者Rb1、Rb2與其等連接的碳原子共同形成C3-C6環烷基或4-7元雜環基，前述C3-C6環烷基或4-7元雜環基任意地被一個或複數個Rc1取代；
每一個Rc1獨立地選自鹵素、CN、C1-C6烷基、C3-C6環烷基或者親水性基團；
La選自或，Rb4、Rb5各自獨立地選自H、鹵素、CN、C1-C3烷基、OH、O(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C3烷基)或N(C1-C3烷基)2，或者Rb4、Rb5與其等連接的碳原子共同形成C3-C6環烷基或4-7元雜環基，m4選自1~10的整數，La的c端與Lb連接；
Lb選自化學鍵或，m5選自0~24的整數，m6選自1~10的整數，每一個Rb6、Rb7、Rb8各自獨立地選自H或Rc6，前述Rc6選自鹵素、CN、C1-C6烷基、C3-C6環烷基或者親水性基團，Lb的d端與Lc連接；
Lc選自Y1-Y2-Y3，Y1選自化學鍵或，m7選自1~6的整數，Y2選自由2-10個胺基酸構成的肽殘基，Y3選自或，Lc的b端與藥物單元D連接；
n為1~16的實數。
在部分實施態樣中，X1、X2均選自N，X3選自CH。
在部分實施態樣中，n1、n2各自獨立地選自0或1。
在部分實施態樣中，n1選自1，n2選自0。
在部分實施態樣中，X4、X5各自獨立地選自C(=O)或C(Rb1)(Rb2)，前述Rb1、Rb2各自獨立地選自H或Rc1，或者Rb1、Rb2與其等連接的碳原子共同形成C3-C6環烷基或4-7元雜環基，前述C3-C6環烷基或4-7元雜環基任意地被一個或複數個Rc1取代。
在部分實施態樣中，X4選自C(=O)，X5選自C(Rb1)(Rb2)，前述Rb1、Rb2各自獨立地選自H或Rc1，或者Rb1、Rb2與其等連接的碳原子共同形成C3-C6環烷基或4-7元雜環基，前述C3-C6環烷基或4-7元雜環基任意地被一個或複數個Rc1取代。
在部分實施態樣中，X4選自C(=O)，X5選自C(Rb1)(Rb2)，前述Rb1、Rb2各自獨立地選自H或Rc1，或者Rb1、Rb2與其等連接的碳原子共同形成C4-C6環烷基或4-6元含有1個O原子或1個N原子的雜環基，前述4-6元含有1個O原子或1個N原子的雜環基任意地被一個Rc1取代；其中每一個Rc1獨立地選自
在部分實施態樣中，Lb選自化學鍵、或，其中m5選自1~16的整數，例如m5選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16，m6選自1~6的整數，例如m6選自1、2、3、4、5或6，Rb7、Rb8各自獨立地選自H或Rc6，Lb的d端與Lc連接。
在部分實施態樣中，Lb選自化學鍵或，其中Rb7為H，且Rb8為H或Rc6，Lb的d端與Lc連接。
在部分實施態樣中，每一個Rc1及Rc6各自獨立地選自鹵素、CN、C1-C6烷基、C3-C6環烷基或者親水性基團，前述親水性基團包含一個或複數個以下原子團或結構片段：C(=O)、OH、O(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C3烷基)、N(C1-C3烷基)2、C1-C4烷基-O、NHC(=O)、N(CH3)C(=O)、C(=O)NH2、S(=O)2NH2、C(=O)NH(C1-C3烷基)、S(=O)2NH(C1-C3烷基)、C(=O)N(C1-C3烷基)2、S(=O)2N(C1-C3烷基)2、、、。
在部分實施態樣中，每一個Rc1及Rc6獨立地選自鹵素、CN、C1-C6烷基、C3-C6環烷基或者W1-W2-W3-W4-W5，每一個W1、W2、W3、W4各自獨立地選自化學鍵、A-(C1-C4烷基-O)m1或[A-(CRd1Rd2)m2-NRd3]m3-B，每一個A及B 獨立地選自化學鍵、C1-C10亞烷基、C3-C6亞環烷基、4-7元亞雜環基、O、S、NRd4、C=O、C(=O)NRd5、S(=O)2、S(=O)2NRd6、S(=O)(=NRd7)、或其等的任意組合，前述Rd1、Rd2、Rd3、Rd4、Rd5、Rd6、Rd7、Rd8各自獨立地選自H、C1-C6烷基、C3-C6環烷基、4-7元雜環基或(C1-C4烷基-O)k1-C1-C6烷基，前述C1-C6烷基、C3-C6環烷基或4-7元雜環基任意被鹵素、CN、OH、O(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C3烷基)、N(C1-C3烷基)2、C(=O)NH2、NHC(=O)NH2或COOH取代，m1選自0~30的整數，m2選自1~5的整數，m3、k1各自獨立地選自1~30的整數，W5選自H、C1-C6烷基、C3-C6環烷基、4-7元雜環基、OH、O(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C3烷基)、N(C1-C3烷基)2、C(=O)NH2、S(=O)2NH2、C(=O)NH(C1-C3烷基)、S(=O)2NH(C1-C3烷基)、C(=O)N(C1-C3烷基)2、S(=O)2N(C1-C3烷基)2、、或。
在部分實施態樣中，每一個Rc1及Rc6獨立地選自W1-W2-W3-W4-W5，W1、W2均選自化學鍵，W3選自化學鍵或A-(C1-C4烷基-O)m1，W4選自A-(C1-C4烷基-O)m1或[A-(CRd1Rd2)m2-NRd3]m3-B，每一個A及B獨立地選自化學鍵、C1-C10亞烷基、C3-C6亞環烷基、4-7元亞雜環基、O、S、NRd4、C=O、C(=O)NRd5、S(=O)2、S(=O)2NRd6、S(=O)(=NRd7)、或其等的任意組合，前述Rd1、Rd2、Rd3、Rd4、Rd5、Rd6、Rd7、Rd8各自獨立地選自H、C1-C6烷基、C3-C6環烷基、4-7元雜環基或(C1-C4烷基-O)k1-C1-C6烷基，前述C1-C6烷基、C3-C6環烷基或4-7元雜環基任意被鹵素、CN、OH、O(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C3烷基)、N(C1-C3烷基)2、C(=O)NH2、NHC(=O)NH2或COOH取代，m1選自 0~30的整數，m2選自1~5的整數，m3、k1各自獨立地選自1~30的整數，W5選自H、C1-C6烷基、C3-C6環烷基、4-7元雜環基、OH、O(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C3烷基)、N(C1-C3烷基)2、C(=O)NH2、S(=O)2NH2、C(=O)NH(C1-C3烷基)、S(=O)2NH(C1-C3烷基)、C(=O)N(C1-C3烷基)2、S(=O)2N(C1-C3烷基)2、
在部分實施態樣中，每一個Rc1獨立地選自A-(C1-C4烷基-O)m1-W5或[C(=O)-CH2-NRd3]m3-B-W5，A選自化學鍵或C=O，Rd3選自C1-C6烷基，B選自C1-C10亞烷基、C=O或其等的組合C(=O)-C1-C10亞烷基，W5選自C1-C6烷基、C(=O)NH2或S(=O)2NH2，m1及m3獨立地選自1~24的整數。
在部分實施態樣中，每一個Rc1獨立地選自
在部分實施態樣中，每一個Rc1獨立地選自
在部分實施態樣中，每一個Rc6獨立地選自W1-W2-W3-W4-W5，W1、W2均選自化學鍵，W3選自化學鍵或A-(C1-C4烷基-O)m1，W4選自A-(C1-C4烷基-O)m1或[C(=O)-CH2-NRd3]m3-B，每一個A及B獨立地選自化學鍵、C1-C6亞烷基、NRd4、C(=O)、C(=O)NH、S(=O)2、S(=O)2NRd6、S(=O)(=NRd7)、或其等的任意組合，前述Rd1、Rd2、Rd3、Rd4、Rd6、Rd7、Rd8各自獨立地選自H、C1-C6烷基或(C1-C4烷基-O)k1-C1-C6烷基，m1選自0~24的整數，m2選自1~5的整數，m3、k1各自獨立地選自1~24的整數，W5選自C1-C6烷基、NH2、
在部分實施態樣中，Rc6選自、
在部分實施態樣中，Rc6選自、
在部分實施態樣中，La選自或，Rb4、Rb5各自獨立地選自H，m4選自1~6的整數，例如m4選自1、2、3、4、5或6，La的c端與Lb連接。
在部分實施態樣中，La選自，Rb4、Rb5各自獨立地選自H，m4選自1~6的整數，例如m4選自1、2、3、4、5或6，La的c端與Lb連接。
在部分實施態樣中，Lc選自Y1-Y2-Y3，Y1選自化學鍵或，Y2選自Val-Cit、Val-Ala、Gly-Gly-Phe-Gly、Ala-Ala-Ala的二肽、三肽或四肽殘基，Y3選自或，Lc的b端與藥物單元D連接。
在部分實施態樣中，Lc選自Y1-Y2-Y3，Y1選自化學鍵或，Y2選自Val-Cit、Val-Ala、Gly-Gly-Phe-Gly的二肽或四肽殘基，Y3選自或，Lc的b端與藥物單元D連接。
在部分實施態樣中，Lc選自、
在部分實施態樣中，Lc選自、
在部分實施態樣中，連接子單元L選自以下結構：
或
在部分實施態樣中，前述藥物單元D選自細胞毒性藥物及蛋白降解劑。
在部分實施態樣中，前述細胞毒性藥物選自微管蛋白抑制劑、DNA損傷劑或拓撲異構酶抑制劑，前述微管蛋白抑制劑包含但不限於海兔毒素(dolastatin)類、澳瑞他汀(auristatin)類、美登素(maytansine)類、微管溶素(Tubulysins)類及隱黏菌素(cryptomycins)類藥物，前述DNA損傷劑包含但不限於PBD類、杜卡黴素(duocarmycin)類及卡齊黴素(calicheamicin)類藥物，前述拓撲異構酶抑制劑包含但不限於喜樹鹼類藥物。
在部分實施態樣中，前述細胞毒性藥物包含但不限於喜樹鹼、羥基喜樹鹼、9-胺基喜樹鹼、SN-38、伊立替康、拓撲替康、貝洛替康、盧比替康、放線菌素D、多柔比星、多卡米星，柔紅黴素、米托蒽醌、鬼臼毒素、依託泊苷、長春新鹼、長春鹼、紫杉醇、多西他賽、卡巴他賽、美登素、類美登素、DM1、DM3、DM4、卡齊黴素、MMAE、MMAF及Tubulysin D。
在部分實施態樣中，前述藥物單元D選自拓撲異構酶I抑制劑或澳瑞他汀類藥物。
在部分實施態樣中，前述蛋白降解劑選自GSPT1蛋白降解劑。
在部分實施態樣中，前述D選自、
在部分實施態樣中，本發明通式為Pc-(L-D)n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽選自以下化合物或其藥學上可接受的鹽：
在部分實施態樣中，前述配體單元Pc可選自多肽、抗體或其抗原結合片段。
在部分實施態樣中，配體單元Pc可特異性結合選自以下群組的一種或多種抗原：HER2(ErbB2)、p95HER2、HER3(ErbB3)、CD3、CD16、ROR1、DLL3、CDH6、CD70、CD5、CD20、BCMA、EGFR、VEGF、Trop-2、Claudin6、Claudin18.2、c-MET、CD30、MUC1、Nectin-4、CD22、CD74、CD19、CD79b、MSLN、TOPO2、EpCAM、CEACAM-5、Mesothelin、PD-L1、PSMA、ROR1、ROR2、CD25、CD33、CD123、FLT3、CD174、CD166、CD326、CD71、LIV-1、MUC16、ENPP3、TDGF1、ETBR、TIM1、TIM3、LRRC15、CanAg/AFP、FAP、SLITRK6、KIT/CD117、STEAP1、SLAMF7/CS1、NaPi2B/SLC34A2、GPNMB、AXL、B7-H3(CD276)、PTK7/CCK4、PRLR、EFNA4、5T4、NOTCH3、CD142、CA6、GPR20、EphA2、LYPD3、FGFR2、FGFR3、FRα、CEACAMs、GCC、IntegrinAv、CAIX、P-cadherin、GD3、cadherin6、LAMP1、CD56、CD37、CD47、CD138 或CD352。
在部分實施態樣中，前述配體單元Pc可特異性結合HER2。
在部分實施態樣中，前述Pc包含特異性結合HER2的抗體或其抗原結合片段；前述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中：
(1)重鏈可變區包含如SEQ ID NO.5所示序列的HCDR1、如SEQ ID NO.6所示序列的HCDR2及如SEQ ID NO.7所示序列的HCDR3，及/或前述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.8所示序列的LCDR1、如SEQ ID NO.9所示序列的LCDR2及如SEQ ID NO.10所示序列的LCDR3；或，
(2)前述重鏈可變區包含與(1)相比每個CDR至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性，或至多發生3個、2個、1個插入、缺失或替換突變的胺基酸序列，及/或前述輕鏈可變區包含與(1)相比每個CDR至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性或至多發生3個、2個、1個插入、缺失或替換突變的胺基酸序列。
在部分實施態樣中，前述抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中：
(1)前述重鏈可變區包含SEQ ID NO.1所示序列，及/或前述輕鏈可變區包含SEQ ID NO.2所示序列；或，
(2)前述重鏈可變區及/或前述輕鏈可變區與上述第(1)組中任一組前述重鏈可變區及/或輕鏈可變區相比，具有至少80%、85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%同一性的序列，或至 多發生3個、2個、1個插入、缺失或替換突變的序列。
在部分實施態樣中，前述配體單元Pc可特異性結合CDH6。
在部分實施態樣中，前述Pc包含特異性結合CDH6的抗體或其抗原結合片段；前述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中：
(1)重鏈可變區包含如SEQ ID NO.17所示序列的HCDR1、如SEQ ID NO.18所示序列的HCDR2及如SEQ ID NO.19所示序列的HCDR3，及/或前述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.20所示序列的LCDR1、如SEQ ID NO.21所示序列的LCDR2及如SEQ ID NO.22所示序列的LCDR3；或，
(2)前述重鏈可變區包含與(1)相比每個CDR至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性，或至多發生3個、2個、1個插入、缺失或替換突變的胺基酸序列，及/或前述輕鏈可變區包含與(1)相比每個CDR至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性或至多發生3個、2個、1個插入、缺失或替換突變的胺基酸序列。
在部分實施態樣中，前述抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)及/或輕鏈可變區(VL)，其中：
(1)前述重鏈可變區包含SEQ ID NO.15所示序列，及/或前述輕鏈可變區包含SEQ ID NO.16所示序列；或，
(2)前述重鏈可變區及/或前述輕鏈可變區與上述第(1)組中任一組前述重鏈可變區及/或輕鏈可變區相比，具有至少80%、85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%同一性的序列，或至 多發生3個、2個、1個插入、缺失或替換突變的序列。
在部分實施態樣中，前述抗體或抗原結合片段包含重鏈恆定區序列及/或輕鏈恆定區序列；選擇性地，前述重鏈恆定區及/或輕鏈恆定區包含完整的恆定區序列或其片段，前述恆定區片段包含CH1，鉸鏈區，CH2，CH3或Fc；選擇性地，前述重鏈恆定區選自人或鼠IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區，及/或，前述輕鏈恆定區選自人或鼠kappa恆定區或lamda恆定區；選擇性地，前述抗體或抗原結合片段包含完整的重鏈及輕鏈，前述重鏈由前述VH及重鏈恆定區組成，前述重鏈恆定區包含如SEQ ID NO.3所示序列，前述輕鏈由前述VL及輕鏈恆定區組成，前述輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO.4所示序列。
在部分實施態樣中，前述的抗體或抗原結合片段為：
(1)嵌合抗體或其片段；
(2)人源化抗體或其片段；及/或，
(3)全人源抗體或其片段；
理想的，前述抗體或抗原結合片段選自單株抗體、多株抗體、天然抗體、工程化抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、單價抗體、多價抗體、全長抗體、抗體片段、裸抗體、綴合抗體、人源化抗體、全人抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、雙抗體(diabody)或單域抗體(sdAb)。
在部分實施態樣中，前述抗原結合片段選自F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、雙特異抗體、奈米抗體及抗體最小識別單位中的一種或多種。
在部分實施態樣中，前述配體單元Pc特異性結合EGFR及c- Met。
在部分實施態樣中，前述特異性結合EGFR及c-Met的配體單元Pc包含至少雙特異性抗體；理想地，前述雙特異性抗體至少為二價；理想地，前述雙特異性抗體包含兩條相異的Fc區，前述Fc包含促異二聚化的突變，例如Knob-into-Hole突變。
在部分實施態樣中，前述配體單元Pc包含第一、第二、第三及第四多肽鏈：
(1)第一多肽鏈包含標靶EGFR的抗體重鏈可變區結構域，前述第一多肽鏈包含如SEQ ID NO.11所示胺基酸序列；
(2)第二多肽鏈包含標靶c-Met的抗體重鏈可變區結構域，前述第一多肽鏈包含如SEQ ID NO.12所示胺基酸序列；
(3)第三多肽鏈包含標靶EGFR的抗體輕鏈可變區結構域，前述第一多肽鏈包含如SEQ ID NO.13所示胺基酸序列；及
(4)第四多肽鏈包含標靶c-Met的抗體輕鏈可變區結構域，前述第一多肽鏈包含如SEQ ID NO.14所示胺基酸序列。
在部分實施態樣中，n選自1-8的實數，例如n為1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0；理想地，n選自2-8的實數，更理想地，n選自6-8的實數。
第二態樣，本發明提供式(L)所示的連接子單元，用於連接配體單元及藥物單元得到配體-藥物偶聯物，
其中，X1、X2、X3、X4、X5、La、Lb、Lc、n1及n2如前文第一態樣任一實施態樣中所定義，L的a端與配體單元連接，b端與藥物單元連接。
第三態樣，本發明提供一種式(II)所示的藥物-連接子化合物或其藥學上可接受的鹽，
其中，X1、X2、X3、X4、X5、La、Lb、Lc、n1、n2及藥物單元D如前文第一態樣任一項中所定義；
X選自不存在、O或NRe1；
R1選自N(Re2)(Re3)、C1-C10烷基、C3-C10環烷基、4-14元雜環基、C6-C10芳基或5-10元雜芳基；前述C1-C10烷基、C3-C10環烷基、4-14元雜環基、C6-C10芳基或5-10元雜芳基任意被一個或複數個Rf取代，每一個Rf獨立地選自鹵素、CN、=O、C1-C3烷基、OH、O(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C3烷基)或N(C1-C3烷基)2；
Re1、Re2、Re3各自獨立地選自H、C1-C6烷基、C3-C6環烷基或4-7元雜環基。
在部分實施態樣中，X選自O。
在部分實施態樣中，R1選自C1-C6烷基或C3-C6環烷基，前述C1-C6烷基或C3-C6環烷基任意被一個或複數個Rf取代。
在部分實施態樣中，R1選自甲基、三級丁基或環戊基。
在部分實施態樣中，式(II)所示的藥物-連接子化合物或其藥學上可接受的鹽選自以下化合物或其藥學上可接受的鹽：
另一態樣，本發明提供一種藥物組成物，其包含本發明前述通式為Pc-(L-D)n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽及藥學上可接受的輔料。
另一態樣，本發明提供治療哺乳動物腫瘤的方法，包含對需要 該治療的哺乳動物，理想人類，給予治療有效量的前述通式為Pc-(L-D)n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或其藥物組成物。
另一態樣，本發明提供前述通式為Pc-(L-D)n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或其藥物組成物在製備治療腫瘤的藥物中的用途。
另一態樣，本發明提供前述通式為Pc-(L-D)n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或其藥物組成物在治療腫瘤中的用途。
另一態樣，本發明提供用於治療腫瘤的前述通式為Pc-(L-D)n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或其藥物組成物。
另一態樣，本發明提供通式為Pc-(L-D)n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽的製備方法，包含將本發明前述通式為(II)的藥物-連接子化合物與前述配體偶聯的步驟，選擇性地，前述配體為抗體或其抗原結合片段。
另一態樣，本發明提供通式為Pc-(L-D)n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽的製備方法，包含將本發明前述藥物單元D與前述配體單元Pc連接的步驟；選擇性地，前述藥物單元D藉由前述連接子單元L與前述配體單元Pc連接；選擇性地，配體單元Pc為抗體或其抗原結合片段。
本發明提供的配體-藥物偶聯物具有顯著的抗腫瘤活性及/或降低的毒副作用及/或提高的產物均一性及/或更高的穩定性。
〔圖1〕顯示本發明的示例性的EGFR-cMet ADC及對照ADC在HCC827皮 下瘤模型中對腫瘤生長的抑制。
〔圖2〕顯示本發明的示例性的EGFR-cMet ADC及對照ADC在HCC827皮下瘤模型中對小鼠體重的影響。
〔圖3〕顯示本發明的示例性的EGFR-cMet ADC及對照ADC在HCT116皮下瘤模型中對腫瘤生長的抑制。
〔圖4〕顯示本發明的示例性的EGFR-cMet ADC及對照ADC在HCT116皮下瘤模型中對小鼠體重的影響。
〔圖5〕顯示本發明的示例性的EGFR-cMet ADC及對照ADC在PC9-6皮下瘤模型中對腫瘤生長的抑制。
〔圖6〕顯示本發明的示例性的EGFR-cMet ADC及對照ADC在PC9-6皮下瘤模型中對小鼠體重的影響。
〔圖7〕顯示本發明的示例性的CDH-6 ADC及對照ADC在PA-1皮下瘤模型中對腫瘤生長的抑制。
〔術語定義及說明〕
除非另有說明，本發明中所用的術語具有下列含義，本發明中記載的基團及術語定義，包含其作為實例的定義、示例性的定義、理想的定義、表格中記載的定義、實施例中具體化合物的定義等，可以彼此之間任意組合及結合。一個特定的術語在沒有特別定義的情況下不應該被認為係不確定的或不清楚的，而應該按照所屬技術領域中通常的含義去理解。當本說明書中出現商品名時，意在指代其對應的商品或其活性成分。
術語「配體」係指能識別及結合目標細胞相關的抗原或受體的大分子化合物。配體的作用係將藥物呈遞給與配體結合的目標細胞群，此等配體包含但不限於蛋白類激素、凝集素、生長因子、抗體或其他能與細胞結合的分子。在本發明的實施態樣中，配體或配體單元表示為Pc，配體可藉由配體上的雜原子與連接子單元形成連接鍵。在本發明的部分實施態樣中，配體單元Pc可包含配體上用於與連接子單元連接的雜原子基團(例如S原子或N原子)，亦可不包含上述用於與連接子單元連接的雜原子基團。在本發明的部分實施態樣中，配體選自抗體或抗原結合片段，前述抗體選自嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或鼠源抗體；在本發明的部分實施態樣中，抗體為單株抗體。
術語「連接子」或「連接子單元」係指一端與配體連接而另一端與藥物相連的化學結構片段或化學鍵。
術語「藥物」指在生物體內具有生物活性的小分子化合物。在本發明的部分實施態樣中，藥物包含具有抗炎功能的糖皮質激素受體激動劑、具有殺死或抑制細胞生長的細胞毒性藥物及促進目標蛋白質在細胞內降解的蛋白降解劑。在本發明的部分實施態樣中，蛋白降解劑為小分子類蛋白降解劑。
術語「配體-藥物偶聯物」，指配體藉由穩定的連接子單元與具有生物活性的藥物相連。在本發明的部分實施態樣中，「配體-藥物偶聯物」為抗體-藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)，ADC指將單株抗體或者抗體片段藉由穩定的連接子單元與具有生物活性的藥物相連。
術語「DAR」或「藥物抗體比率」係指每個抗體分子連接的小分子糖皮質激素受體激動劑藥物的平均數目。在本發明的抗體-藥物偶聯物中，DAR由變量「n」定義，n既可以係整數，亦可以係小數。
術語「抗體」按最廣義使用，係指包含來自免疫球蛋白重鏈可變區的足夠序列及/或來自免疫球蛋白輕鏈可變區的足夠序列，從而能夠特異性結合至抗原的多肽或多肽組合。本說明書「抗體」涵蓋各種形式及各種結構，只要其等展現出期望的抗原結合活性。本說明書的「抗體」包含具有移植的互補決定區(CDR)或CDR衍生物的替代蛋白質支架或人工支架。此類支架包含抗體衍生的支架(其包含引入以例如穩定化抗體三維結構的突變)以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。參見，例如Korndorfer等人，2003,Proteins：Structure,Function,and Bioinformatics,53(1)：121-129(2003)；Roque等人，Biotechnol.Prog.20：639-654(2004)。此類支架進一步可以包含非抗體衍生的支架，例如所屬技術領域中已知可用於移植CDR的支架蛋白，包含但不限於肌腱蛋白、纖連蛋白、肽適體等。
本說明書的「抗體」包含典型的「四鏈抗體」，其屬於由兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)組成的免疫球蛋白；重鏈係指如此的多肽鏈，其在N端到C端的方向上由重鏈可變區(VH)、重鏈恆定區CH1結構域、鉸鏈區(HR)、重鏈恆定區CH2結構域、重鏈恆定區CH3結構域組成；此外，當前述全長抗體為IgE同種型時，任意地進一步包含重鏈恆定區CH4結構域；輕鏈係在N端到C端方向上由輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)組成的多肽鏈；重鏈與重鏈之間、重鏈與輕鏈之間藉由二硫鍵連接，形成「Y」字型結構。因免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成及排列順序不同，故其抗原性亦不同。據此，可將本說明書的「免疫球蛋白」分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA及IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈及ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成及重鏈二硫鍵的數目及位置的差別，又 可分為相異的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分為IgA1及IgA2。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
本說明書的「抗體」進一步包含不包含輕鏈的抗體，例如，由單峰駝(Camelus dromedarius)、雙峰駝(Camelus bactrianus)、大羊駝(Lama glama)、原駝(Lama guanicoe)及羊駝(Vicugna pacos)等產生的重鏈抗體(heavy-chain antibodies，HCAbs)以及在鯊等軟骨魚綱中發現的免疫球蛋白新抗原受體(Ig new antigen receptor，IgNAR)。
本說明書的「抗體」可以來源於任何動物，包含但不限於人及非人動物，前述非人動物可選自靈長類動物、哺乳動物、齧齒動物及脊椎動物，例如駱駝科動物、大羊駝、原駝、羊駝、羊、兔、小鼠、大鼠或軟骨魚綱(例如鯊)。
本說明書的「抗體」包含但不限於單株抗體、多株抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、單價抗體、多價抗體、完整抗體、完整抗體的片段、裸抗體、綴合抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。
術語「單株抗體」係指從基本上同質的抗體群體獲得的抗體，即，除了可能的變異體(例如含有天然存在的突變或在製劑的生產過程中產生，此類變體通常以少量存在)之外，包含前述群體的各個抗體係相同的及/或結合相同的表位。與通常包含針對相異決定簇(表位)的相異抗體的多株抗體製劑相反，單株抗體製劑中的每種單株抗體針對抗原上的單一決定簇。本說明書修飾語「單株」不應解釋為必須藉由任何特定方法產生前述抗體或抗原結 合分子。舉例來說，單株抗體可藉由多種技術製得，包含(但不限於)融合瘤技術、重組DNA方法、噬菌體庫展示技術及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法及其它所屬技術領域中已知的方法。
術語「天然抗體」係指藉由多細胞生物體的免疫系統產生及配對的抗體。本說明書的術語「工程化抗體」係指藉由基因工程、抗體工程等技術獲得的非天然抗體，示例性地，「工程化抗體」包含人源化抗體、抗體片段(例如scFv、sdAb等)、雙特異性抗體等。
本說明書術語「HER2」又稱「人表皮生長因子受體2」或ErbB2，係一種細胞來源癌基因，係具有酪胺酸蛋白激酶活性的跨膜醣蛋白，能活化胞內酪胺酸激酶調控的訊號轉導系統。HER2基因拷貝數擴增及蛋白過表現將導致訊號過度活化，該訊號的生物學功能與多種癌症的形成、惡性增殖、侵襲轉移及放化療耐藥性關係密切，在多種腫瘤中其癌基因及其蛋白產物(P185)均有過度表現及擴增。其陽性表現可見於各種癌症，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、涎腺腫瘤、肺癌、膽管癌、膀胱癌、前列腺癌、結直腸癌等。
本說明書術語「CDH6」又稱「鈣黏蛋白6」，係指細胞黏附分子，其係細胞-細胞黏附分子的鈣黏蛋白家族的成員。CDH6係由790個胺基酸構成的單次跨膜蛋白，其被分類為II型鈣黏著蛋白家族，並且該蛋白具有N-末端細胞外及C-末端細胞內結構域。用於本發明的CDH6蛋白可以直接從人或非人哺乳動物(例如大鼠、小鼠或猴)的表現CDH6的細胞中純化，並且隨後可以使用，或者可以製備上述細胞的細胞膜級分並且可以作為CDH6蛋白使用。或者，CDH6亦可藉由在體外合成或藉由遺傳操作而允許宿主細胞產生CDH6而 獲得。根據此遺傳操作，可以獲得CDH6蛋白，具體而言，將CDH6 cDNA併入到能夠表現CDH6 cDNA的載體中，並且隨後在含有酶、受質及轉錄及翻譯所需的能量材料的溶液中合成CDH6，或者藉由轉化其他原核生物或真核生物的宿主細胞，從而允許其表現CDH6。基於上述遺傳操作的表現CDH6的細胞或表現CDH6的細胞株亦可用於呈遞CDH6蛋白。或者，可以直接向待免疫的動物施用已併入CDH6 cDNA的表現載體，並且CDH6可以在如此免疫的動物體內表現。
本說明書術語「表皮生長因子受體」或「EGFR」係指具有以GenBank登錄號NP_005219示出的胺基酸序列的人類EGFR(亦稱為HER1或ErbB1，以及其天然存在的變體。
本說明書術語「肝細胞生長因子受體」或「c-Met」係指具有以GenBank登錄號NP_001120972示出的胺基酸序列的人類c-Met及其天然變體。
術語「單特異性」係指表示具有一個或複數個結合位點，其中每個結合位點結合相同抗原的相同表位。
術語「多特異性抗體」係指具有至少兩個抗原結合位點，前述至少兩個抗原結合位點中的每一個抗原結合位點與相同抗原的相異表位或與相異抗原的相異表位結合。因此，諸如「雙特異性」、「三特異性」、「四特異性」等術語係指抗體/抗原結合分子可以結合的相異表位的數目。
術語「價」表示抗體/抗原結合分子中規定數目的結合位點的存在。因此，術語「單價」、「二價」、「四價」及「六價」分別表示抗體/抗原結合分子中一個結合位點、兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點的存在。
本說明書的「全長抗體」、「完好抗體」及「完整抗體」在本說 明書中可互換使用，係指具有基本上與天然抗體結構相似的結構。
本說明書的「抗原結合片段」及「抗體片段」在本說明書中可互換使用，其不具備完整抗體的全部結構，僅包含完整抗體的局部或局部的變體，前述局部或局部的變體具備結合抗原的能力。本說明書「抗原結合片段」或「抗體片段」包含但不限於Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、VHH及scFv。
完整抗體的木瓜蛋白酶消化生成兩個同一的抗原結合片段，稱作「Fab」片段，每個含有重及輕鏈可變域，還有輕鏈的恆定域及重鏈的第一恆定域(CH1)。如此，本說明書的術語「Fab片段」指包含輕鏈的VL域及恆定域(CL)的輕鏈片段以及重鏈的VH域及第一恆定域(CH1)的抗體片段。Fab’片段因在重鏈CH1域的羧基末端增加少數殘基而與Fab片段不同，包含來自抗體鉸鏈區的一個或複數個半胱胺酸。Fab’-SH係其中恆定域的半胱胺酸殘基攜帶游離硫醇基團的Fab’片段。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點(兩個Fab片段)及Fc區的一部分的F(ab’)2片段。
「Fv片段」係由IgG及IgM產生的最小片段，包含完整的抗原結合位點，Fv片段具有與Fab相同的結合特性及相似的三維結合特性，Fv片段的VH及VL鏈藉由非共價相互作用結合在一起。
術語「scFv」(single-chain variable fragment)係指包含VL及VH結構域的單個多肽鏈，其中前述VL及VH藉由連接子(linker)相連(參見，例如，Bird等人，Science 242：423-426(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；及Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg及Moore編，Springer-Verlag，紐約，第269-315 頁(1994))。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH。合適的先前技術連接子由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有胺基酸序列(GGGGS)4的連接子，但亦可使用其變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448)。可用於本發明的其他連接子由Alfthan等人(1995),Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001),Eur.J.Immunol.31：94-106，Hu等人(1996),Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999),J.Mol.Biol.293：41-56及Roovers等人(2001),Cancer Immunol.描述。在部分情況下，scFv的VH與VL之間進一步可以存在二硫鍵，形成二硫鍵連接的Fv(dsFv)。
術語「雙抗體(diabody)」，其VH及VL結構域在單個多肽鏈上表現，但使用太短的連接體以致不允許在相同鏈的兩個結構域之間配對，從而迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對並且產生兩個抗原結合部位(參見，例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)，及Poljak R.J.等人，Structure 2：1121-1123(1994))。
術語「嵌合抗體(Chimeric antibody)」係指如此的抗體，其輕鏈及/或重鏈的一部分源自一個抗體(其可以源自某一特定物種或屬於某一特定抗體類或亞類)，且輕鏈及/或重鏈的另一部分源自另一個抗體(其可以源自相同或相異的物種或屬於相同或相異的抗體類或亞類)，但無論如何，其仍保留對目標抗原的結合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly等人；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851 6855(1984))。例如，術語「嵌合抗體」可包含如此的抗體(例如人鼠嵌合抗體)，其中抗體的重鏈及輕鏈可變區來自第一抗體(例如鼠源抗體)，而抗體的重鏈及輕鏈恆定區來自第二抗體(例如人抗 體)。
術語「人源化抗體」係指經基因工程改造的非人源抗體，其胺基酸序列經修飾以提高與人源抗體的序列的同源性。通常而言，人源化抗體的全部或部分CDR區來自於非人源抗體(供體抗體)，全部或部分的非CDR區(例如，可變區中的FR及/或恆定區)來自於人源免疫球蛋白(受體抗體)。人源化抗體通常保留或部分保留供體抗體的預期性質，包含但不限於，抗原特異性、親和性、反應性、提高免疫細胞活性的能力、增強免疫應答的能力等。
術語「全人抗體」係指具有其中FR及CDR二者都源自人種系免疫球蛋白序列的可變區的抗體。此外，如果抗體包含恆定區，則恆定區亦源自人種系免疫球蛋白序列。本說明書的「全人抗體」可以包含不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變引入的突變)。然而，本說明書的「全人抗體」不包含其中來源於另一個哺乳動物物種(例如小鼠)的種系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗體。
術語「可變區」係指抗體重鏈或輕鏈中所包含的使抗體結合抗原的區域，「重鏈可變區」與「VH」、「HCVR」可互換使用，「輕鏈可變區」與「VL」、「LCVR」可互換使用。天然抗體的重鏈及輕鏈的可變域(分別係VH及VL)一般具有相似的結構，每個域包含四個保守的框架區(FR)及三個高變區(HVR)。參見例如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。單個VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。本說明書的術語「互補決定區」與「CDR」可互換使用，通常指重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)的高變區(HVR)，該部位因在空間結構上可與抗原表位形成精密 的互補，故又稱為互補決定區，其中，重鏈可變區CDR可縮寫為HCDR，輕鏈可變區CDR可縮寫為LCDR。本說明書的術語「框架區」或「FR區」可互換，係指抗體重鏈可變區或輕鏈可變區中除CDR以外的其等胺基酸殘基。通常典型的抗體可變區由4個FR區及3個CDR區按以下順序組成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
本說明書的「CDR」可由所屬技術領域中習知的方式加以標注及定義，包含但不限於Kabat編號系統、Chothia編號系統或IMGT編號系統，使用的工具網站包含但不限於AbRSA網站(http：//cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php)、abYsis網站(www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)及IMGT網站(http：//www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results)。本說明書的CDR包含不同定義方式的胺基酸殘基的重疊(overlap)及子集。
本說明書的術語「重鏈恆定區」係指抗體重鏈的羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原的結合，但是表現出效應子功能，諸如與Fc受體的相互作用，其相對於抗體的可變結構域具有更保守的胺基酸序列。「重鏈恆定區」至少包含：CH1結構域，鉸鏈區，CH2結構域，CH3結構域，或其變體或片段。「重鏈恆定區」包含「全長重鏈恆定區」及「重鏈恆定區片段」，前者具有基本上與天然抗體恆定區基本相似的結構，而後者僅包含「全長重鏈恆定區的一部分」。示例性地，典型的「全長抗體重鏈恆定區」由CH1結構域-鉸鏈區-CH2結構域-CH3結構域組成；當抗體為IgE時，其進一步包含CH4結構域；當抗體為重鏈抗體時，則其不包含CH1結構域。示例性地，典型的「重鏈恆定區 片段」可選自CH1、Fc或CH3結構域。
本說明書的術語「輕鏈恆定區」係指抗體輕鏈的羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原的結合，前述輕鏈恆定區可選自恆定κ結構域或恆定λ結構域。
本說明書的術語「Fc」係指完整抗體經木瓜蛋白酶水解而成的抗體羧基端部分，典型地，其包含抗體的CH3及CH2結構域。Fc區包含例如天然序列Fc區、重組Fc區及變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈的Fc區的邊界可以略微變化，但是人IgG重鏈的Fc區通常被定義為從Cys226位置的胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端。Fc區的C末端離胺酸(根據Kabat編號系統的殘基447)可以例如在抗體的產生或純化過程中，或藉由對編碼抗體重鏈的核酸重組工程化而除去，因此，Fc區可包含或不包含Lys447。
本說明書的術語「同一性」可藉由下述方式計算獲得：為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的「同一性」百分數，將前述序列出於最佳比較目的比對(例如，可以為最佳比對而在第一及第二胺基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以為比較目的而拋棄非同源序列)。隨後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置由第二序列中對應位置處的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則前述分子在這個位置處係相同的。
考慮到為最佳比對這兩個序列而需要引入的空位的數目及每個空位的長度，兩個序列之間的同一性百分數隨前述序列共有的相同位置變化而變化。
可以利用數學算法實現兩個序列間的序列比較及同一性百分數 的計算。例如，使用已經整合至GCG軟體包的GAP程序中的Needlema及Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法(在www.gcg.com可獲得)，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣及空位權重16、14、12、10、8、6或4及長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分數。又例如，使用GCG軟體包中的GAP程序(在www.gcg.com可獲得)，使用NWSgapdna.CMP矩陣及空位權重40、50、60、70或80及長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分數。特別理想的參數集合(及除非另外說明否則應當使用的一個參數集合)係採用空位罰分12、空位延伸罰分4及移碼空位罰分5的Blossum62評分矩陣。
本說明書中「n為1-8的實數」指n為大於或等於1且小於或等於8的任意實數。
本說明書中「x~y的整數」指既包含該區間中的每一個整數(含x及y)的情況，亦包含以上述整數中的任意2個為端點的範圍值。例如，「m4選自1~10的整數」指m4既包含選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的情況，亦包含m4選自以上述10個整數中的任意2個為端點的範圍值的情況，例如m4選自2~9、3~9、3~8、4~6等。
本說明書中「」表示連接位點。
本說明書中消旋體或者對映體純的化合物的圖示法來自Maehr,J.Chem.Ed.1985,62：114-120。除非另有說明，用楔形鍵及虛楔鍵(及)表示一個立體中心的絕對構型，用黑實鍵及虛鍵(及)表示一個立體中心的相對構型(如脂環化合物的順反構型)。
術語「互變異構體」係指因分子中某一原子在兩個位置迅速移 動而產生的官能團異構體。本發明化合物可表現出互變異構現象。互變異構的化合物可以存在兩種或多種可相互轉化的種類。互變異構體一般以平衡形式存在，嘗試分離單一互變異構體時通常產生一種混合物，其理化性質與化合物的混合物係一致的。平衡的位置取決於分子內的化學特性。例如，在很多脂族醛及酮如乙醛中，酮型佔優勢；而在酚中，烯醇型佔優勢。本發明包含化合物的任一互變異構形式。
術語「立體異構體」係指由分子中原子在空間上排列方式不同所產生的異構體，包含順反異構體、對映異構體及非對映異構體。
本發明的化合物可以具有不對稱原子如碳原子、硫原子、氮原子、磷原子或不對稱雙鍵，因此本發明的化合物可以存在特定的幾何或立體異構體形式。特定的幾何或立體異構體形式可以係順式及反式異構體、E型及Z型幾何異構體、(-)-及(+)-對映體、(R)-及(S)-對映體、非對映異構體、(D)-異構體、(L)-異構體，以及其外消旋混合物或其它混合物，例如對映異構體或非對映體富集的混合物，以上所有此等異構體以及其等的混合物都屬於本發明化合物的定義範圍之內。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子、不對稱硫原子、不對稱氮原子或不對稱磷原子，任一取代基中之此等異構體以及其等的混合物，亦均包含在本發明化合物的定義範圍之內。本發明的含有不對稱原子的化合物可以以光學活性純的形式或外消旋形式被分離出來，光學活性純的形式可以從外消旋混合物拆分，或藉由使用手性原料或手性試劑合成。
術語「被取代」係指特定原子上的任意一個或複數個氫原子被取代基取代，只要特定原子的價態係正常的並且取代後的化合物係穩定的。當取代基為氧代(即=O)時，意味著兩個氫原子被取代，氧代不會發生在芳香基 上。
術語「任意」或「任意地」係指隨後描述的事件或情況可以發生或不發生，該描述包含發生前述事件或情況及不發生前述事件或情況。例如，乙基「任意」被鹵素取代，係指乙基可以係未被取代的(CH2CH3)、單取代的(CH2CH2F、CH2CH2Cl等)、多取代的(CHFCH2F、CH2CHF2、CHFCH2Cl、CH2CHCl2等)或完全被取代的(CF2CF3、CF2CCl3、CCl2CCl3等)。所屬技術領域中具有通常知識者可理解，對於包含一個或複數個取代基的任何基團，不會引入任何在空間上不可能存在及/或不能合成的取代或取代模式。
當任何變量(例如Ra、Rb)在化合物的組成或結構中出現一次以上時，其在每一種情況下的定義皆係獨立的。例如，如果一個基團被2個Rb所取代，則每個Rb都有獨立的選項。
當一個連接基團的數量為0時，例如-(CH2)0-，表示該連接基團為鍵。
當其中一個變量選自化學鍵或不存在時，表示其連接的兩個基團直接相連，例如A-L-Z中L代表鍵時表示該結構實際上係A-Z。
當本說明書中之連接基團若沒有指明其連接方向，則其連接方向係任意的。例如當結構單元W3-W4-W5中的W4選自「[A-(CRd1Rd2)m2-NRd3]m3-B」時，此時W4既可以按照與從左到右的方向連接W3及W5構成「W3-[A-(CRd1Rd2)m2-NRd3]m3-B-W5」，亦可按照從右到左的方向連接W3及W5構成「W3-B-[NRd3-(CRd1Rd2)m2-A]m3-W5」。
本說明書中的Cm-Cn，係指具有m-n範圍中的整數個碳原子。
術語「烷基」係指通式為CnH2n+1的一價烴基，該烷基可以係直鏈或支鏈的。術語「C1-C10烷基」指具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴基。前述烷基的具體實例包含但不限於甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、異丁基、二級丁基、三級丁基、異戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基-、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等；術語「C1-C6烷基」指具有1、2、3、4、5或6個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴基。本說明書所記載之「C1-C10烷基」可以包含「C1-C6烷基」、「C1-C4烷基」或「C1-C3烷基」等範圍，前述「C1-C6烷基」可以進一步包含「C1-C4烷基」或「C1-C3烷基」。
術語「亞烷基」係指具有直鏈或支鏈的飽和二價烴基。「C1-C10亞烷基」係指具有直鏈或支鏈飽和二價烴基，其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子，包含但不限於亞甲基、CH2CH2或CH2CH2CH2等。
術語「環烷基」指完全飽和的且以單環、並環、橋環或螺環等形式存在的一價碳環。術語「C3-C6環烷基」應理解為表示飽和的單環、並環、螺環或橋環，其具有3、4、5、6個碳原子，具體實例包含但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基等。
術語「C3-C6亞環烷基」指完全飽和的且以單環、並環、橋環或螺環等形式存在的二價碳環，其具有3、4、5、6個環碳原子。
術語「雜環基」係指完全飽和的或部分飽和的以單環、並環、螺環或橋環等形式存在的一價基團，其環原子中含有1-5個雜原子或雜原子團 (即含有雜原子的原子團)，前述「雜原子或雜原子團」包含但不限於氮原子(N)、氧原子(O)、硫原子(S)、磷原子(P)、硼原子(B)、-S(=O)2-、-S(=O)-、-P(=O)2-、-P(=O)-、-NH-、-S(=O)(=NH)-、-C(=O)NH-或-NHC(=O)NH-等。術語「4-7元雜環基」指環原子數目為4、5、6或7的雜環基，且其環原子中含有1-3個獨立選自上文前述的雜原子或雜原子團。其中，4元雜環基的實例包含但不限於氮雜環丁烷基、氧雜環丁烷基；5元雜環基的實例包含但不限於四氫呋喃基、二氧雜環戊烯基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基、4,5-二氫噁唑或2,5-二氫-1H-吡咯基；6元雜環基的實例包含但不限於四氫吡喃基、哌啶基、嗎啉基、二噻烷基、硫代嗎啉基、哌嗪基、三噻烷基、四氫吡啶基或4H-[1,3,4]噻二嗪基；7元雜環基的實例包含但不限於二氮雜環庚烷基。理想地，「4-7元雜環基」可以包含「4-7元雜環烷基」、「5-6元雜環基」、「5-6元雜環烷基」等範圍。
術語「亞雜環基」係指完全飽和的或部分飽和的以單環、並環、螺環或橋環等形式存在的二價基團，其環原子中含有1-5個雜原子或雜原子團，前述「雜原子或雜原子團」包含但不限於氮原子(N)、氧原子(O)、硫原子(S)、磷原子(P)、硼原子(B)、-S(=O)2-、-S(=O)-、-P(=O)2-、-P(=O)-、-NH-、-S(=O)(=NH)-、-C(=O)NH-或-NHC(=O)NH-等。
術語「C2-C3烯基」係指直鏈或支鏈的不飽和烴基，其包含一個雙鍵並且具有2或3個碳原子，具體實例包含但不限於乙烯基、烯丙基、(E)-2-甲基乙烯基、(Z)-2-甲基乙烯基。
術語「C2-C3炔基」係指直鏈或支鏈的不飽和烴基，其包含一個三鍵並且具有2或3個碳原子，具體實例包含但不限於乙炔基(-C≡CH)、丙-1- 炔基(-C≡CCH3)、丙-2-炔基(-CH2C≡CH)。
術語「鹵」或「鹵素」係指氟、氯、溴及碘。
術語「親水性基團」係指能夠溶解或電離到水中、容易與水親和的基團。親水性基團通常含有一個或複數個O、N、P、S、OH、NH、NH2、C=O、S(=O)2、P(=O)2以及其等的任意組合，例如含有聚醚、多羥基、多胺、多醣、肽、羧酸、磺酸、磷酸等結構單元。
術語「治療」係指外科手術或藥物處理(surgical or therapeutic treatment)，其目的係預防、減緩(減少)治療對象中不希望的生理變化或病變，如癌症、自身免疫性疾病及病毒感染的進展。有益的或所希望的臨床結果包含但不限於症狀的減輕、疾病程度減弱、疾病狀態穩定(即，未惡化)、疾病進展的延遲或減慢、疾病狀態的改善或緩和、以及緩解(無論係部分緩解或完全緩解)，無論係可檢測的或不可檢測的。需要治療的對象包含已患有病症或疾病的對象以及易於患上病症或疾病的對象或打算預防病症或疾病的對象。當提到減緩、減輕、減弱、緩和、緩解等術語時，其含義亦包含消除、消失、不發生等情況。
術語「有效量」指單獨給予或與另一治療劑組合給予細胞、組織或對象時能有效防止或緩解疾病病症或該疾病進展的治療劑用量。「有效量」進一步指足以緩解症狀，例如治療、治癒、防止或緩解相關醫學病症，或治療、治癒、防止或緩解此等病症的速度增加的化合物用量。當將活性成分單獨給予個體時，治療有效劑量單指該成分。當應用某一組合時，治療有效劑量指產生治療作用的活性成分的組合用量，而無論係組合、連續或同時給予。
術語「受試者」係指接受對如本發明所記載之特定疾病或病症 的治療的生物體。對象及患者的實例包含接受疾病或病症治療的哺乳動物，如人、靈長類動物(例如，猴)或非靈長類哺乳動物。
構成「治療有效量」的本發明化合物的量取決於該化合物、疾病狀態及其嚴重性、給藥方式以及待被治療的哺乳動物的年齡而改變，但可例行性地由所屬技術領域中具有通常知識者根據其自身的知識及本發明內容而確定。
術語「藥學上可接受的」，係針對其等化合物、材料、組成物及/或劑型而言，其等在可靠的醫學判斷的範圍之內，適用於與人類及動物的組織接觸使用，而沒有過多的毒性、刺激性、過敏性反應或其它問題或併發症，與合理的利益/風險比相稱。
術語「藥學上可接受的鹽」係指藥學上可接受的酸或鹼的鹽，包含化合物與無機酸或有機酸形成的鹽，以及化合物與無機鹼或有機鹼形成的鹽。
術語「藥物組成物」係指一種或多種本發明的化合物或其鹽與藥學上可接受的輔料組成的混合物。藥物組成物的目的係有利於對有機體給予本發明的化合物。
術語「藥學上可接受的輔料」係指對有機體無明顯刺激作用，而且不會損害該活性化合物的生物活性及性能的其等輔料。合適的輔料係所屬技術領域中具有通常知識者熟知的，例如碳水化合物、蠟、水溶性及/或水可膨脹的聚合物、親水性或疏水性材料、明膠、油、溶劑、水等。
詞語「包含(comprise)」及其英文變體例如comprises或comprising可理解為開放的、非排他性的意義，即「包含但不限於」。
本發明進一步包含與本說明書中記載的其等相同的，但一個或複數個原子被原子量或質量數不同於自然中通常發現的原子量或質量數的原子置換的同位素標記的本發明化合物。可結合到本發明化合物的同位素的實例包含氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘及氯的同位素，諸如分別為2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、31P、32P、35S、18F、123I、125I及36Cl等。
某些同位素標記的本發明化合物(例如用3H及14C標記)可用於化合物及/或受質組織分佈分析中。氚化(即3H)及碳-14(即14C)同位素對於因其等易於製備及可檢測性係尤其理想的。正電子發射同位素，諸如15O、13N、11C及18F可用於正電子發射斷層掃描(PET)研究以測定受質佔有率。通常可以藉由與揭示於下文的方案及/或實施例中的其等類似的下列程序，藉由同位素標記試劑取代未經同位素標記的試劑來製備同位素標記的本發明化合物。
本發明的藥物組成物可適用於腸胃外給藥，如合適的單位劑型的無菌溶液劑、懸浮劑或乾燥產物。例如，本發明的藥物組成物可以係用於肌內或皮下給藥的無菌注射水溶液形式。本發明的藥物組成物在使用時可接受其它溶媒或溶劑，如水、林格氏液或等滲氯化鈉溶液。
本說明書所記載之化合物的所有施用方法中，每天給藥的劑量為0.001mg/kg到600mg/kg體重，理想為0.05mg/kg到200mg/kg體重，更理想0.1mg/kg到100mg/kg體重，以單獨或分開劑量的形式。
本發明的化合物可以藉由所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的多種合成方法來製備，包含下述列舉的具體實施態樣、其與其它化學合成方法的結合所形成的實施態樣以及所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的均 等替換方式，理想的實施態樣包含但不限於本發明的實施例。
本發明具體實施態樣的化學反應係在合適的溶劑中完成的，前述的溶劑須適合於本發明的化學變化及其所需的試劑及物料。為了獲得本發明的化合物，有時需要所屬技術領域中具有通常知識者在已有實施態樣的基礎上對合成步驟或者反應流程進行修改或選擇。
所屬技術領域中合成路徑規劃中的一個重要考量因素係為反應性官能團(如本發明中的胺基、羧基)選擇合適的保護基，例如，可參考Greene's Protective Groups in Organic Synthesis(4th Ed).Hoboken,New Jersey：John Wiley & Sons,Inc.本發明引用的所有參考文獻整體上併入本發明。
本發明採用以下縮寫：
〔實施例〕
以下藉由實施例對本發明進行詳細描述，但並不意味著對本發 明任何不利限制。本說明書已經詳細地描述本發明，其中亦揭示其具體實施例方式，對所屬技術領域中具有通常知識者而言，在不脫離本發明精神及範圍的情況下針對本發明具體實施態樣進行各種改變將係顯而易見的。本發明所使用的任一試劑係市售的，無需進一步純化即可使用。
除非另作說明，混合溶劑表示的比例係體積混合比例。
除非另作說明，否則，%係指wt%。
化合物經手工或ChemDraw®軟體命名，市售化合物採用供應商目錄名稱。
化合物的結構係藉由核磁共振(NMR)及/或質譜(MS)來確定的。NMR位移的單位為10-6(ppm)。NMR測定的溶劑為氘代二甲基亞碸、氘代氯仿、氘代甲醇等，內標為四甲基矽烷(TMS)；「IC50」指半數抑制濃度，指達到最大抑制效果一半時的濃度，「EC50」指能半數最大效應濃度，引起50%最大效應的濃度。
實施例1、3-(2-甲磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物1)
步驟1：2-甲硫基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-甲酸 三級丁酯(中間體1-1)的合成
在室溫及氮氣氣氛下，向2,4-二氧代哌啶-1-甲酸三級丁酯(15g)與150mL甲苯的混合物中加入N,N-二甲基甲醯胺二甲縮醛(DMF-DMA)(9.2g)。將所得混合物在25℃下攪拌反應1小時。混合物經減壓除去溶劑後，加入甲基異硫脲半硫酸鹽(10.8g)。碳酸鉀(14.7g)與無水乙醇(200mL)，所得混合物在25℃下攪拌反應4小時。之後混合物經減壓除去溶劑，柱層析分離(EA/PE，0-30%)得標題化合物粗品，直接用於下一步反應。
LC-MS：m/z(ESI)：296.1[M+H]+.
步驟2：2-甲硫基-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮(中間體1-2)的合成
將上步所得中間體1-1溶於100mL二氯甲烷中，加入25mL三氟乙酸，在25℃下攪拌反應2小時。之後減壓除去溶劑，加入100mL乙酸乙酯打漿，經過濾，乾燥得標題化合物(10.0g)。
LC-MS：m/z(ESI)：196.1[M+H]+.
步驟3：3-(2-甲硫基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體1-3)的合成
在0℃下，向中間體1-2(9.75g)與THF(240mL)的混合物中加入NaH(5g，60%質量分數於礦物油中)，所得混合物在0℃下反應30分鐘。接著向反應混合物中加入3-溴丙酸三級丁酯(15.68g)並將所得混合物升溫至70℃反應2小時。之後向混合物中加入2mL水，減壓除去溶劑，經柱層析分離(EA/PE，0-50%)得標題化合物(9.75g)。
LC-MS：m/z(ESI)：324.4[M+H]+.
步驟4：3-(2-甲磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物1)的合成
在0℃下，向中間體1-3(5g)與DCM(150mL)的混合物中加入mCPBA(12.6g，85%純度)，所得混合物在室溫下反應30分鐘。之後混合物經減壓，殘餘物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物(5.2g)。
LC-MS：m/z(ESI)：356.4[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 9.24(s,1H),3.76(t,J=6.7Hz,2H),3.70(t,J=7.0Hz,2H),3.43(s,3H),3.24(t,J=6.7Hz,2H),2.57(t,J=7.0Hz,2H),1.39(s,9H)。
實施例2、3-(2-甲磺醯基-5-氧代-5,7-二氫-6H-吡咯並[3,4-d]嘧啶-6-基)丙酸三級丁酯(化合物2)
步驟1：4-(((三級丁氧羰基)胺基)甲基)-2-甲硫基嘧啶-5-甲酸乙酯(中間體2-1)的合成
在室溫及氮氣氣氛下，向4-氯-2-甲硫基嘧啶-5-甲酸乙酯(5.82g)，[(三級丁氧羰基胺基)甲基]三氟硼酸鉀(4.74g)，碳酸銫(13.0g)，醋酸鈀(448mg)及正丁基二(1-金剛烷基)膦(1.43g)的混合物中加入1,4-二氧六環 (100mL)及水(10mL)。將所得混合物在90℃下攪拌反應6小時。之後減壓除去溶劑，經柱層析分離(EA/PE，0-50%)得標題化合物(4147mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：328.1[M+H]+.
步驟2：(5-乙氧羰基-2-甲硫基嘧啶-4-基)甲胺鹽酸鹽(中間體2-2)的合成
在室溫及氮氣氣氛下，向中間體2-1(1637mg)於10mL乙酸乙酯的溶液中加入4M氯化氫乙酸乙酯溶液(10mL)，將所得混合物在室溫下攪拌反應4小時。之後過濾混合物，濾餅用乙酸乙酯洗滌，得標題化合物(1231mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：228.3[M+H]+.
步驟3：3-(2-甲硫基-5-氧代-5,7-二氫-6H-吡咯並[3,4-d]嘧啶-6-基)丙酸三級丁酯(中間體2-3)的合成
在氮氣氣氛下，將中間體2-2(500mg)，碳酸銫(2.14g)，3-溴丙酸三級丁酯(916mg)及二甲苯(10mL)的混合物加熱至80℃反應16小時。之後減壓除去溶劑，經柱層析分離(EA/PE，0-30%)及薄層色譜分離(EA/PE=1/1)得標題化合物(28mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：310.0[M+H]+.
步驟4：3-(2-甲磺醯基-5-氧代-5,7-二氫-6H-吡咯並[3,4-d]嘧啶-6-基)丙酸三級丁酯(化合物2)的合成
在0℃下，將間氯過氧苯甲酸(mCPBA)(78.74mg，85%純度)加入中間體2-3(30mg)溶於1mL二氯甲烷的溶液中，所得混合物在室溫下攪拌1小時。之後混合物經柱層析分離(EA/PE，0-66%)得標題化合物 (14.0mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：342.2[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ=9.37(s,1H),4.76(s,2H),3.78(t,J=7.1Hz,2H),3.48(s,3H),2.64(t,J=7.1Hz,2H),1.39(s,9H)
實施例3、3-(2-乙磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物3)
步驟1：3-(2-乙硫基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體3-1)的合成
在室溫下，向化合物1(50mg)與乙硫醇(180mg)的混合物中加入二氯甲烷(1mL)及2M氫氧化鈉溶液(0.5mL)。將所得混合物在25℃下攪拌反應3小時。之後減壓除去溶劑，經柱層析分離(THF/PE，0~30%)得標題化合物(45mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：338.1[M+H]+.
步驟2：3-(2-乙磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物3)的合成
在0℃下，將間氯過氧苯甲酸(92.05mg)加入中間體3-1(45mg)溶於二氯甲烷(2mL)的溶液中，所得混合物在室溫下攪拌1小時。之後混合物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物(15.6mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：370.1[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.25(s,1H),3.77(t,J=6.7Hz,2H),3.71(t,J=7.0Hz,2H),3.62(q,J=7.4Hz,2H),3.25(t,J=6.7Hz,2H),2.57(t,J=7.0Hz,2H),1.40(s,9H),1.26(t,J=7.3Hz,3H)
實施例4、3-(2-丁磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物4)
步驟1：3-(2-丁硫基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體4-1)的合成
在室溫下，向化合物1(50mg)與1-丁硫醇(19mg)的混合物中加入二氯甲烷(1mL)及2M氫氧化鈉溶液(0.5mL)。將所得混合物在25℃下攪拌反應3小時。之後減壓除去溶劑，經柱層析分離(THF/PE，0~18%)得標題化合物(47mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：366.4[M+H]+.
步驟2：3-(2-丁磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物4)的合成
在0℃下，將間氯過氧苯甲酸(88.76mg)加入中間體4-1(47mg)溶於二氯甲烷(2mL)的溶液中，所得混合物在室溫下攪拌1小時。之後混合物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物(10.7mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：398.1[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.25(s,1H),3.77(t,J=6.7Hz,2H), 3.71(t,J=7.0Hz,2H),3.63-3.58(m,2H),3.25(t,J=6.7Hz,2H),2.57(t,J=7.0Hz,2H),1.72-1.63(m,2H),1.45-1.41(m,2H),1.40(s,9H),0.89(t,J=7.3Hz,3H)
實施例5、3-(2-異丁磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物5)
步驟1：3-(2-異丁硫基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體5-1)的合成
在室溫下，向化合物1(50mg)與1-丁硫醇(250mg)的混合物中加入二氯甲烷(1mL)及2M氫氧化鈉溶液(0.5mL)。將所得混合物在25℃下攪拌反應3小時。之後減壓除去溶劑，經柱層析分離(THF/PE，0~18%)得標題化合物(47mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：366.4[M+H]+.
步驟2：3-(2-異丁磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物5)的合成
在0℃下，將間氯過氧苯甲酸(88.76mg)加入中間體5-2(47mg)溶於二氯甲烷(2mL)的溶液中，所得混合物在室溫下攪拌1小時。之後混合物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物(7.6mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：398.1[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.25(s,1H),3.77(t,J=6.7Hz,2H),3.71(t,J=7.0Hz,2H),3.54(d,J=6.6Hz,2H),3.25(t,J=6.7Hz,2H),2.57(t,J=7.0 Hz,2H),2.21(t,J=6.7,13.4Hz,1H),1.40(s,9H),1.04(d,J=6.7Hz,6H)
實施例6、3-(2-異丙磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物6)
步驟1：3-(2-異丙硫基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體6-1)的合成
在室溫下，向化合物1(50mg)與異丙硫醇(500mg)的混合物中加入二氯甲烷(1mL)及2M氫氧化鈉溶液(0.5mL)。將所得混合物在25℃下攪拌反應3小時。之後減壓除去溶劑，經柱層析分離(THF/PE，0~30%)得標題化合物(45mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：352.2[M+H]+.
步驟2：3-(2-異丙磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物6)的合成
在0℃下，將間氯過氧苯甲酸(88mg)加入中間體6-1(45mg)溶於二氯甲烷(2mL)的溶液中，所得混合物在室溫下攪拌1小時。之後混合物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物(18.5mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：384.1[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.25(s,1H),3.99-3.94(m,1H),3.77(t,J=6.7Hz,2H),3.71(t,J=7.0Hz,2H),3.25(t,J=6.7Hz,2H),2.57(t,J=7.0Hz,2H),1.40(s,9H),1.28(s,3H),1.27(s,3H)
實施例7、3-(2-環戊磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物7)
步驟1：3-(2-環戊硫基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體7-1)的合成
在室溫下，向化合物1(1.066g)溶於DCM(10mL)的溶液中依次加入環戊基硫醇(367mg)與2M氫氧化鈉溶液(1.65mL)，所得混合物在室溫下攪拌反應30分鐘。之後混合物經柱層析分離(EA/PE，0-50%)得標題化合物粗品，直接用於下一步反應。
LC-MS：m/z(ESI)：378.4[M+H]+.
步驟2：3-(2-環戊磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物7)的合成
在0℃下，向上步所得化合物粗品與DCM(50mL)的混合物中加入mCPBA(2.43g，85%純度)，所得混合物在室溫下反應30分鐘。之後混合物減壓濃縮，殘餘物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物(890mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：410.5[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 9.23(s,1H),4.30-4.17(m,1H),3.76(t,J=6.7Hz,2H),3.70(t,J=7.0Hz,2H),3.24(t,J=6.7Hz,2H),2.56(t,J=7.0Hz,2H),2.04-1.85(m,4H),1.74-1.57(m,4H),1.39(s,9H).
實施例8、3-(2-三級丁磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物8)
步驟1：3-(2-三級丁硫基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體8-1)的合成
在室溫下，向化合物1(1.066g)溶於DCM(10mL)的溶液中依次加入三級丁基硫醇(324mg)與2M氫氧化鈉溶液(1.65mL)，所得混合物在室溫下強烈攪拌反應30分鐘。之後混合物經柱層析分離(EA/PE，0-50%)得標題化合物粗品，直接用於下一步反應。
LC-MS：m/z(ESI)：366.4[M+H]+.
步驟2：3-(2-三級丁磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物8)的合成
在0℃下，向上步所得化合物粗品與DCM(50mL)的混合物中加入mCPBA(2.43g，85%純度)，所得混合物在室溫下反應30分鐘。之後混合物減壓濃縮，殘餘物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物(831mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：398.4[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 9.25(s,1H),3.76(t,J=6.7Hz,2H),3.70(t,J=7.0Hz,2H),3.23(t,J=6.7Hz,2H),2.57(t,J=7.0Hz,2H),1.40(s,9H),1.37(s,9H).
實施例9、3-(2-(1-金剛烷基磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物9)的合成
步驟1：3-(2-(1-金剛烷基硫基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體9-1)的合成
在室溫下，向化合物1(410mg)的DCM(10mL)溶液中加入2M NaOH水溶液(0.692mL)及1-金剛烷硫醇(291mg)，所得混合物在25℃下攪拌2小時。之後用水(5mL)稀釋反應液，DCM(3mL×3)萃取，合併有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮後經柱層析分離(THF/PE，0-60%)得標題化合物(351mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：444.0[M+H]+
步驟2：3-(2-(1-金剛烷基磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物9)的合成
在室溫下，將mCPBA(546mg，85%純度純度)加入到中間體9-1(351mg)的DCM(5mL)溶液中，在25℃下攪拌2小時。之後減壓濃縮除去溶劑，混合物經柱層析分離(THF/PE，0-50%)得標題化合物(300mg)，再用高效液相色譜法純化(柱子：C18 150×30mm×5um；流動相：〔A相：水(0.225%甲酸)，B相：乙腈〕；B%：43%-63%，11分鐘)得標題化合物(24.7mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：476.1[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.26(s,1H),3.77-3.75(m,2H),3.71-3.69(m,2H),3.24(t,J=6.7Hz,2H),2.60-2.55(m,2H),2.08(s,3H),2.00-1.92(m,6H),1.68-1.58(m,6H),1.41(s,9H).
實施例10、3-(2-(4-甲氧基苯磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物10)
步驟1：3-(2-(4-甲氧基苯硫基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體10-1)的合成
在室溫及氮氣氣氛下，向化合物1(40.0mg)，4-甲氧基苯硫酚(23.7mg)，氫氧化鈉(4.50mg)的混合物中加入二氯甲烷(2mL)及水(56μL)。將所得混合物在室溫下攪拌反應1小時。之後減壓除去溶劑，經柱層析分離(EA/PE，0-80%)得標題化合物(40.0mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：416.3[M+H]+.
步驟2：3-(2-(4-甲氧基苯磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物10)的合成
在0℃下，將mCPBA(117mg，85%純度)加入中間體10-1(40mg)溶於1mL二氯甲烷的溶液中，所得混合物在室溫下攪拌1小時。之後混合物經柱層析分離(THF/PE，0-80%)及高效液相色譜法純化(柱子：C18 150×30mm×5um；流動相：〔A相：水(0.225%甲酸)，B相：乙腈〕；B%： 45%-75%，9分鐘)得標題化合物(5.0mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：448.2[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 9.14(s,1H),7.93(d,J=8.8Hz,2H),7.20(d,J=8.8Hz,2H),3.87(s,3H),3.73-3.64(m,4H),3.18(t,J=6.7Hz,2H),2.55-2.51(m,2H),1.38(s,9H).
實施例11、4-((6-(3-三級丁氧基-3-氧代丙基)-5-氧代-5,6,7,8-四氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-2-基)磺醯基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(化合物11)
步驟1：4-((6-(3-三級丁氧基-3-氧代丙基)-5-氧代-5,6,7,8-四氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-2-基)硫基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(中間體11-1)的合成
在室溫下，向化合物1(50mg)與4-巰基哌啶-1-甲酸三級丁酯(30.57mg)的混合物中加入二氯甲烷(1mL)及2M氫氧化鈉溶液(0.5mL)，將所得混合物在25℃下攪拌反應3小時。之後減壓除去溶劑，混合物經柱層析分離(THF/PE，0~30%)得標題化合物(50mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：515.1[M+Na]+.
步驟2：4-((6-(3-三級丁氧基-3-氧代丙基)-5-氧代-5,6,7,8-四氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-2-基)磺醯基)哌啶-1-甲酸三級丁酯(化合物11)的合成
在0℃下，將mCPBA(87.57mg)加入中間體11-1(50mg)的二氯甲烷(1mL)溶液中，所得混合物在室溫下攪拌反應1小時。之後混合物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物(20.7mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：547.2[M+Na]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.25(s,1H),4.08-3.96(m,3H),3.77(t,J=6.7Hz,2H),3.73-3.66(m,2H),3.25(t,J=6.8Hz,2H),2.92-2.75(m,2H),2.61-2.55(m,2H),1.95(d,J=12.1Hz,2H),1.58-1.46(m,2H),1.41(s,9H),1.40(s,9H).
實施例12、3-(2-(4,4-二氟環己基磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物12)
步驟1：4,4-二氟環己醇甲磺酸酯(中間體12-1)的合成
在0℃下，向4,4-二氟環己醇(1g)與三乙胺(1.23mL)的DCM(36mL)溶液中滴加甲磺醯氯(1.01g)，所得混合物在25℃下攪拌16小時。反應結束後，將混合物倒入水中(50mL)，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合併有機相用無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮得標題化合物粗品(1.57g)，無需進一步提純，直接用於下一步反應。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=4.93-4.77(m,1H),3.22(s,3H),2.11-1.80(m,8H)
步驟2：S-(4,4-二氟環己基硫醇乙酸酯(中間體12-2)的合成
向中間體12-1(785mg)的DMA(18mL)溶液中加入硫代乙酸鉀(1.26g)，所得混合物在80℃下加熱反應18小時。之後將混合物冷卻至室溫，加入乙酸乙酯(50mL)及水(50mL)，用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，合併有機相用無水硫酸鈉乾燥，經減壓濃縮後柱層析(THF/PE，0-6%)純化得標題化合物(368mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=3.58-3.46(m,1H),2.32(s,3H),2.08-1.85(m,8H).
步驟3：3-(2-(4,4-二氟環己基硫基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體12-3)的合成
向中間體12-2(100mg)的THF(1mL)溶液中加入NaOH(2M,1.54mL)，反應液在25℃下攪拌2小時。之後加入化合物1(90mg)，在25℃下攪拌1小時，之後將混合物倒入5mL水中，用乙酸乙酯(2mL*3)萃取，合併有機相用無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，經柱層析分離(EA/PE，0-31%)得標題化合物(80mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：428.1[M+H]+
步驟4：3-(2-(4,4-二氟環己基磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物12)的合成
將mCPBA(151.96mg，85%純度)加入到中間體12-3(80mg)的DCM(1mL)溶液中，在25℃下攪拌2小時。之後將混合物倒入5mL水中，用乙酸乙酯(2mL*3)萃取，合併有機相用無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，經柱層析分離(EA/PE，0-40%)，再以薄層製備色譜純化(PE/EA=1/2)得標 題化合物(9.3mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：460.2[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.25(s,1H),4.05-3.95(m,1H),3.82-3.73(m,2H),3.70(t,J=6.8Hz,2H),3.24(t,J=6.5Hz,2H),2.64-2.54(m,2H),2.19-1.93(m,6H),1.71(d,J=12.4Hz,2H),1.39(s,9H).
19F NMR(376MHz,DMSO-d 6 )δ=-91.16(d,J=235.6Hz),-100.27(d,J=235.6Hz).
實施例13、3-(2-甲磺醯基-5-氧代-8,8-二甲基-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物13)
步驟1：3-(2-甲硫基-5-氧代-8,8-二甲基-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體13-1)的合成
在0℃下，向中間體1-3(4.75g)與THF(100mL)的混合物中加入NaH(1.76g，60%質量分數於礦物油中)，所得混合物在0℃下反應30分鐘。接著向反應所得混合物中加入碘甲烷(6.24g)與DMF(20mL)，將所得混合物在室溫下繼續反應4小時。之後向混合物中加入2mL水，減壓除去溶劑，經柱層析分離(EA/PE，0-50%)得標題化合物(2.77g)。
LC-MS：m/z(ESI)：352.4[M+H]+.
步驟2：3-(2-甲硫基-5-氧代-8,8-二甲基-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物13)的合成
在0℃下，向上步所得化合物粗品與DCM(100mL)的混合物中加入mCPBA(6.38g，85%純度)，所得混合物在室溫下反應30分鐘。之後減壓濃縮，殘餘物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物(2.87g)。
LC-MS：m/z(ESI)：384.4[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 9.27(s,1H),3.70(t,J=7.0Hz,2H),3.60(s,2H),3.45(s,3H),2.58(t,J=7.0Hz,2H),1.39(s,9H),1.33(s,6H).
實施例14、3-(2-三級丁磺醯基-5-氧代-8,8-二甲基-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物14)
步驟1：3-(2-三級丁硫基-5-氧代-8,8-二甲基-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體14-1)的合成
在室溫下，向化合物13(600mg)溶於DCM(10mL)的溶液中依次加入三級丁基硫醇(212mg)與2M氫氧化鈉溶液(0.94mL)，所得混合物在室溫下攪拌反應30分鐘。之後混合物經柱層析分離(EA/PE，0-50%)得標題化合物粗品，直接用於下一步反應。
LC-MS：m/z(ESI)：394.4[M+H]+.
步驟2：3-(2-三級丁磺醯基-5-氧代-8,8-二甲基-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物14)的合成
在0℃下，向上步所得化合物粗品與DCM(30mL)的混合物中加入mCPBA(1.27g，85%純度)，所得混合物在室溫下反應30分鐘。之後混 合物減壓濃縮，殘餘物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物。
LC-MS：m/z(ESI)：426.5[M+H]+.
實施例15、3-(2-三級丁磺醯基-5-氧代嘧啶並[5,4-c]喹啉-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物15)
步驟1：2-甲硫基嘧啶並[5,4-c]喹啉-5(6H)-酮(中間體15-1)的合成
在氮氣氣氛下，向2-甲硫基-4-氯嘧啶-5-羧酸乙酯(1.86g)，2-胺基苯硼酸(1.096g)，Pd(dppf)Cl2(585mg)，Cs2CO3(5.2g)的混合物中加入THF(40mL)與水(6mL)，將所得混合物在70℃下攪拌反應4小時。之後將混合物冷卻至室溫過夜，過濾，濾餅用水與石油醚洗滌，得標題化合物(400mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：244.3[M+H]+.
步驟2：3-(2-甲硫基-5-氧代嘧啶並[5,4-c]喹啉-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體15-2)的合成
在氮氣氣氛下，向中間體15-1(90mg)溶於DMF(3mL)與 THF(3mL)的混合物中加入NaH(59mg，60%質量分數於礦物油中)，所得混合物在室溫下攪拌反應30分鐘。之後加入3-溴丙酸三級丁酯(309mg)，所得混合物在70℃下反應16小時。之後向混合物中加入0.5mL水，減壓除去溶劑後柱層析分離，得標題化合物粗品，直接用於下一步反應。
LC-MS：m/z(ESI)：372.4[M+H]+.
步驟3：3-(2-甲磺醯基-5-氧代嘧啶並[5,4-c]喹啉-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體15-3)的合成
在0℃下，向上步所得化合物粗品與DCM(10mL)的混合物中加入mCPBA(200mg，85%純度)，所得混合物在室溫下反應30分鐘。之後混合物減壓濃縮，殘餘物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物粗品，直接用於下一步反應。
LC-MS：m/z(ESI)：404.4[M+H]+.
步驟4：3-(2-三級丁硫基-5-氧代嘧啶並[5,4-c]喹啉-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體15-4)的合成
在室溫下，向上步所得化合物粗品溶於DCM(10mL)的溶液中依次加入三級丁基硫醇(200mg)與2M氫氧化鈉溶液(0.5mL)，所得混合物在室溫下強烈攪拌反應30分鐘。之後混合物經柱層析分離(EA/PE，0-50%)得標題化合物粗品。
LC-MS：m/z(ESI)：414.4[M+H]+.
步驟5：3-(2-三級丁磺醯基-5-氧代嘧啶並[5,4-c]喹啉-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物15)的合成
在0℃下，向上步所得化合物粗品與DCM(10mL)的混合物 中加入mCPBA(200mg，85%純度)，所得混合物在室溫下反應30分鐘。之後混合物減壓濃縮，殘餘物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物(28.9mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：446.5[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 9.78(s,1H),8.73-8.67(m,1H),7.96-7.89(m,1H),7.81(d,J=8.6Hz,1H),7.55(t,J=7.5Hz,1H),4.62-4.55(m,2H),2.70-2.62(m,2H),1.45(s,9H),1.38(s,9H).
實施例16、3-(2-三級丁磺醯基-5-氧代-5,7,8,9-四氫-6H-嘧啶並[5,4-c]氮雜-6-基)丙酸三級丁酯(化合物16)
步驟1：2-甲硫基7,8-二氫喹啉-5(6H)-酮(中間體16-1)的合成
在室溫及氮氣氣氛下，將1,3-環己二酮(11.2g)與DMF-DMA(35.7g)的混合物攪拌反應1小時，再升至50℃反應1小時。混合物經減壓除去溶劑後，加入甲基異硫脲半硫酸鹽(13.9g)，碳酸鈉(12.7g)與1,4-二氧六環(200mL)，所得混合物在100℃下攪拌反應16小時。之後混合物經減壓除去溶劑，柱層析分離(EA/PE，0-30%)得標題化合物(5g)。
LC-MS：m/z(ESI)：195.4[M+H]+.
步驟2：2-甲硫基-6,7,8,9-四氫-5H-嘧啶並[5,4-c]氮雜-5-酮(中 間體16-2)的合成
在0℃及氮氣氣氛下，向中間體16-1(1.94g)溶於20mL三氟乙酸的溶液中加入三甲基疊氮基矽烷(2.3g)，將所得混合物在25℃下攪拌反應10天。之後將混合物倒入200mL水中並用二氯甲烷萃取(50mL×3)，合併有機相以無水硫酸鈉乾燥後柱層析分離(EA/PE，0-100%)，得標題化合物(210mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：210.5[M+H]+.
步驟3：3-(2-甲硫基-5-氧代-5,7,8,9-四氫-6H-嘧啶並[5,4-c]氮雜-6-基)丙酸三級丁酯(中間體16-3)的合成
在0℃下，向中間體16-2(210mg)與THF(5mL)的混合物中加入NaH(80mg，60%質量分數於礦物油中)，所得混合物在0℃下反應30分鐘。接著向反應所得混合物中加入3-溴丙酸三級丁酯(418mg)並將所得混合物升溫至70℃反應16小時。之後減壓除去溶劑，經柱層析分離(EA/PE，0-70%)得標題化合物粗品，直接用於下一步反應。
LC-MS：m/z(ESI)：338.4[M+H]+.
步驟4：3-(2-甲磺醯基-5-氧代-5,7,8,9-四氫-6H-嘧啶並[5,4-c]氮雜-6-基)丙酸三級丁酯(中間體16-4)的合成
在0℃下，向上步所得化合物粗品與DCM(5mL)的混合物中加入mCPBA(200mg)，所得混合物在室溫下反應30分鐘。之後混合物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物粗品，直接用於下一步反應。
LC-MS：m/z(ESI)：370.4[M+H]+.
步驟5：3-(2-三級丁硫基-5-氧代-5,7,8,9-四氫-6H-嘧啶並[5,4-c] 氮雜-6-基)丙酸三級丁酯(中間體16-5)的合成
在強烈攪拌下，向上步所得化合物粗品與DCM(5mL)的混合物中加入三級丁基硫醇(0.5mL)及2M氫氧化鈉溶液(1mL)，所得混合物在室溫下反應1小時。之後混合物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物粗品，直接用於下一步反應。
LC-MS：m/z(ESI)：380.4[M+H]+.
步驟6：3-(2-三級丁磺醯基-5-氧代-5,7,8,9-四氫-6H-嘧啶並[5,4-c]氮雜-6-基)丙酸三級丁酯(化合物16)的合成
在0℃下，向上步所得化合物粗品與DCM(5mL)的混合物中加入mCPBA(200mg)，所得混合物在室溫下反應30分鐘。之後混合物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物(14.2mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：412.5[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 9.04(s,1H),3.75(t,J=7.0Hz,2H),3.37-3.34(m,2H),2.99(t,J=7.3Hz,2H),2.61(t,J=7.0Hz,2H),2.21-2.11(m,2H),1.42(s,9H),1.38(s,9H).
實施例17、3-(2-(環戊磺醯基)-5-氧代-8,8-二(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物17)
步驟1：3-(2-環戊硫基-5-氧代-8,8-二(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13- 基)-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(中間體17-1)的合成
在0℃及氮氣氣氛下，將中間體7-1(50mg)溶於DMF(1mL)中，向其中加入NaH(26.5mg，60%有效含量)，反應在25℃下攪拌30分鐘，向其中加入13-溴-2,5,8,11-四氧雜十三烷(179.57mg)。反應液在氮氣保護下於25℃攪拌3小時。之後混合物倒入30mL水中，經乙酸乙酯萃取(20mL×3)，合併有機相以無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮後經柱層析分離(THF/PE，0-100%)得標題化合物(25mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：758.5[M+H]+
步驟2：3-(2-環戊磺醯基-5-氧代-8,8-二(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸三級丁酯(化合物17)的合成
在0℃下將中間體17-1(25mg)溶於無水二氯甲烷(1mL)中，向其中加入間氯過氧苯甲酸(22.77mg，85%純度)。反應液於25℃攪拌1小時。之後混合物經反相高效液相色譜法純化(柱子：Boston Green ODS 150*30mm*5um；流動相：〔A相：水(0.225%甲酸)，B相：乙腈〕；B%：50%-80%，10分鐘)得標題化合物(2.2mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：790.4[M+H]+.
1H NMR(400MHz,D2O)δ=9.28(s,1H),4.36-4.24(m,1H),3.84(t,J=6.3Hz,2H),3.80(s,2H),3.63-3.49(m,20H),3.47-3.36(m,8H),3.32(s,6H),2.67(t,J=6.3Hz,2H),2.33-2.22(m,2H),2.20-2.10(m,2H),2.09-1.97(m,4H),1.70-1.62(m,4H),1.39(s,9H)
實施例18、6-(2-(環戊磺醯基)-5-氧代-8,8-二(2,5,8,11-四氧雜十 三烷-13-基)-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)己酸三級丁酯(化合物18)
步驟1：6-(2-甲硫基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)己酸三級丁酯(中間體18-1)的合成
在0℃及氮氣氣氛下，將中間體1-2(1.0g)與DMF(20mL)的混合物中加入NaH(307.28mg，60%質量分數於礦物油中)，反應在25℃下攪拌30分鐘後向其中加入6-溴己酸三級丁酯(1.93g)。反應液在氮氣保護下於25℃攪拌1小時。之後混合物倒入50mL水中，經乙酸乙酯萃取(30mL×3)，合併有機相以無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮後經柱層析分離(THF/PE，0-50%)得標題化合物(500mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：366.2[M+H]+.
步驟2：6-(2-甲磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)己酸三級丁酯(中間體18-2)的合成
在0℃下將中間體18-1(500mg)溶於無水二氯甲烷(10mL)中，向其中加入間氯過氧苯甲酸(944.30mg，85%純度)。反應液於25℃攪拌1小時。之後混合物經柱層析分離(THF/PE，0-50%)得標題化合物(500mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：342.0[M-56]+.
步驟3：6-(2-環戊硫基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)己酸三級丁酯(中間體18-3)的合成
在室溫下，將中間體18-2(500mg)及環戊硫醇(193mg)溶於二氯甲烷(10mL)及2M氫氧化鈉溶液(5mL)。將所得混合物在25℃下攪拌反應3小時。之後減壓除去溶劑，經柱層析分離(THF/PE，0-30%)得標題化合物(460mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：442.1[M+Na]+.
步驟4：6-(2-(環戊硫基)-5-氧代-8,8-二(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)己酸三級丁酯(中間體18-4)的合成
在0℃及氮氣氣氛下，將中間體18-3(350mg)溶於DMF(5mL)中，向其中加入NaH(167mg，60%有效含量)，反應在25℃下攪拌30分鐘，向其中加入13-溴-2,5,8,11-四氧雜十三烷(1.13g)。反應液在氮氣保護下於25℃攪拌3小時。之後混合物倒入30mL水中，經乙酸乙酯萃取(20mL×3)，合併有機相以無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮後經柱層析分離(THF/PE，0-100%)得標題化合物(300mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：800.6[M+H]+.
步驟5：6-(2-(環戊磺醯基)-5-氧代-8,8-二(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)己酸三級丁酯(化合物18)的合成
在0℃下將中間體18-4(450mg)溶於無水二氯甲烷(5mL)中，向其中加入間氯過氧苯甲酸(388.25mg，85%純度)。反應液於25℃攪拌 1小時。之後混合物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物(300mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：832.3[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.26(s,1H),4.31-4.28(m,1H),3.70(s,2H),3.53-3.39(m,24H),3.38-3.34(m,4H),3.32-3.30(m,1H),3.23(s,6H),2.20(t,J=7.3Hz,2H),2.13-1.93(m,8H),1.73-1.63(m,4H),1.59-1.55(m,4H),1.39(s,9H),1.33-1.29(m,2H)
實施例19、3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-5'H-螺[環戊並-1,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙酸三級丁酯(化合物19)
步驟1：3-(2'-(環戊硫基)-5'-氧代-5'H-螺[環戊烷-1,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙酸三級丁酯(中間體19-1)的合成
在0℃及氮氣氣氛下，將中間體7-1(1g)溶於N,N-二甲基甲醯胺(10mL)中，向其中加入NaH(635.7mg，60%純度)，反應在0℃下攪拌15分鐘，向其中加入1,4-二碘丁烷(2.46g)。反應液在氮氣保護0℃攪拌1小時。之後混合物倒入20mL冰水中，經乙酸乙酯萃取(10mL×3)，合併有機相以無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮後經柱層析分離(乙酸乙酯/石油醚，0-25%)得標題化合物(620mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：432.1[M+H]+
步驟2：3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-5'H-螺[環戊烷-1,8'-吡啶並 [4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙酸三級丁酯(化合物19)的合成
在0℃下將中間體19-1(100mg)溶於無水二氯甲烷(2mL)中，向其中加入間氯過氧苯甲酸(188.16mg，85%純度)。反應液於0℃攪拌1小時。混合物經減壓濃縮後經柱層析分離(乙酸乙酯/石油醚，0-50%)得標題化合物(49.2mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：464.3[M+H]+.
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ=9.35(s,1H),4.34-4.13(m,1H),3.80(t,J=6.4Hz,2H),3.61(s,2H),2.66(t,J=6.3Hz,2H),2.24-2.11(m,4H),2.05(m,2H),1.99-1.90(m,2H),1.89-1.75(m,6H),1.73-1.65(m,2H),1.45(s,9H)
實施例20、3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃並-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙酸三級丁酯(化合物20)
步驟1：3-(2'-(環戊硫基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃並-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙酸三級丁酯(中間體20-1)的合成
在0℃及氮氣氣氛下，將中間體7-1(200mg)溶於N,N-二甲基甲醯胺(2mL)中，向其中加入NaH(127.15mg，60%有效含量)，向其中加入1-碘-2-(2-碘乙氧基)乙烷(518.01mg)。反應液於氮氣保護下0℃攪拌1小時。之後向反應液中加入冰水(2mL)，經乙酸乙酯萃取(1mL×3)，合併有機相以無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮後經柱層析分離(乙酸乙酯/石油醚，0-60%)得標題化合物(110mg)。
MS m/z(ESI)：448.2[M+H]+。
步驟2：3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃並-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙酸三級丁酯(化合物20)的合成
在0℃下將中間體20-1(60mg)溶於無水二氯甲烷(1mL)中，向其中加入間氯過氧苯甲酸(108.86mg，85%純度)。反應液於25℃攪拌1小時。反應結束經減壓濃縮後經柱層析分離(乙酸乙酯/石油醚，0-55%)得標題化合物(9.8mg)。
MS m/z(ESI)：480.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ=9.40(s,1H),4.35-4.18(m,1H),4.00(m,2H),3.86-3.72(m,6H),2.68(t,J=6.3Hz,2H),2.31-2.23(m,2H),2.18(m,2H),2.06(m,2H),1.93-1.81(m,2H),1.77-1.65(m,4H),1.45(s,9H)
實施例21、3-(2-甲磺醯基-7-氧代-5,7-二氫-6H-吡咯並[3,4-d]嘧啶-6-基)丙酸三級丁酯(化合物21)
步驟1：5-(((三級丁氧羰基)胺基)甲基)-2-甲硫基嘧啶-4-甲酸甲酯(中間體21-1)的合成
在室溫及氮氣氣氛下，向5-溴-2-甲硫基嘧啶-4-甲酸甲酯(4 g)，[(三級丁氧羰基胺基)甲基]三氟硼酸鉀(5.41g)，碳酸銫(9.91g)，醋酸鈀(341.34mg)及正丁基二(1-金剛烷基)膦(817.62mg)的混合物中加入1,4-二氧六環(50mL)及水(5mL)。將所得混合物在80℃下攪拌反應5小時。之後減壓除去溶劑，經柱層析分離(四氫呋喃/石油醚，0-30%)得標題化合物(1300mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：314.0[M+H]+.
步驟2：(4-甲氧羰基-2-甲硫基嘧啶-4-基)甲胺鹽酸鹽(中間體21-2)的合成
在室溫及氮氣氣氛下，向中間體21-1(1300mg)於20mL乙酸乙酯的溶液中加入4M氯化氫乙酸乙酯溶液(20mL)，將所得混合物在室溫下攪拌反應4小時。LCMS檢測反應完畢後，過濾混合物，濾餅用乙酸乙酯洗滌，得標題化合物(750mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：214.0[M+H]+.
步驟3：3-(2-甲硫基-7-氧代-5,7-二氫-6H-吡咯並[3,4-d]嘧啶-6-基)丙酸三級丁酯(中間體21-3)的合成
在氮氣氣氛下，中間體21-2(100mg)，碳酸銫(195.71mg)，3-溴丙酸三級丁酯(83.73mg)及N,N-二甲基甲醯胺(4mL)的混合物加熱至80℃反應16小時。之後減壓除去溶劑，經柱層析分離(四氫呋喃/石油醚，0-50%)得標題化合物(20mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：310.0[M+H]+
步驟4：3-(2-甲磺醯基-7-氧代-5,7-二氫-6H-吡咯並[3,4-d]嘧啶-6-基)丙酸三級丁酯(化合物21)的合成
在0℃下，將間氯過氧苯甲酸(33.47mg)加入中間體21-3(20mg)溶於二氯甲烷(4mL)的溶液中，所得混合物在室溫下攪拌2小時。反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：Phenomenex Gemini NX 150×30mm,5μm；流動相：〔A：水(碳酸氫銨)，B：乙腈〕；B%：13%-43%，11分鐘)得標題化合物(2.9mg)。
(流動相A配製：30L純水+24g碳酸氫銨)
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ=9.44(s,1H),4.77-4.66(m,2H),3.90-3.78(m,2H),3.50-3.45(m,3H),2.69-2.63(m,2H),1.41-1.38(m,9H)。
藥物-連接子的製備實施例(實施例22-40)
實施例22、N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-6-(2-甲磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)己醯胺(a-L1-1)
步驟1：1-(苯並[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基-2,2-d 2)乙烷-1-酮(中間體L1-1)的合成
將3’,4’-二羥基苯乙酮(3g)溶於無水DMF(25mL)中，加入氘代二氯甲烷(8.57g)及碳酸鉀(8.18g)，加畢，升溫至90℃攪拌16小時。隨後將反應液加入到水(100mL)中，並用乙酸乙酯(200mL*2)萃取，合併有機相用飽和食鹽水(100mL)洗滌，並用無水硫酸鈉乾燥。過濾後，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物藉由柱層析色譜法純化(乙酸乙酯/石油醚=5：1)，得到標題化合物(2.4g)。
MS m/z(ESI)：167.1[M+H]+。
步驟2：1-(6-硝基苯並[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基-2,2-d 2)乙烷-1-酮(中間體L1-2)的合成
將中間體L1-1(2.4g)溶於無水醋酸(10mL)中，在0℃滴加濃硝酸(32.50g，70%含量)，之後0℃攪拌10分鐘。隨後升溫至室溫，攪拌1小時。反應完畢後，將反應液滴加入到冰水(200mL)中，過濾後，濾餅乾燥得到標題化合物(1.9g)。
MS m/z(ESI)：212.0[M+H]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 7.69(s,1H),7.30(s,1H),2.49(s,3H).
步驟3：N-(6-乙醯苯並[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基-2,2-d 2)乙醯胺(中間體L1-3)的合成
將中間體L1-2(1.8g)溶於醋酸(25mL)中，加入醋酸酐(1.84g)及還原鐵粉(4.76g)，室溫攪拌1小時。反應完畢後，過濾，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物藉由柱層析色譜法純化(乙酸乙酯/石油醚=5：1)，得到標題化合物(1.5g)。
MS m/z(ESI)：224.1[M+H]+。
步驟4：N-(6-(2-溴乙醯基)苯並[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基-2,2-d 2)乙醯胺(中間體L1-4)的合成
將HBr的乙酸溶液(2.39g，33%含量)滴加到中間體L1-3(1.45g)的無水醋酸(25mL)溶液中，接著再滴加Br2(1.07g)，滴加完，室溫攪拌1小時。反應完畢後，反應液減壓濃縮至乾，殘餘物加入到水(50 mL)中，用乙酸乙酯(50mL*2)萃取，有機相用飽和食鹽水(50mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾後，殘餘物藉由柱層析色譜法純化(乙酸乙酯/石油醚=5：1)，得到標題化合物(1.3g)。
MS m/z(ESI)：302.1[M+H]+。
步驟5：1-(6-胺基苯並[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基-2,2-d 2)-2-氯乙烷-1-酮(中間體L1-5)的合成
將中間體L1-4(1.2g)及濃鹽酸(144.82mg)溶於乙醇(15mL)中，反應液在60℃下攪拌16小時。反應完畢後，反應液減壓濃縮至乾，殘餘物藉由高效液相色譜法純化(YMC-Actus Triart C18柱5μm二氧化矽，30mm直徑，150mm長度；用水(含有0.05%NH4HCO3)及乙腈的極性遞減的混合物作為洗脫液(乙腈梯度比例40%-50%)，得到標題化合物(577mg)。
MS m/z(ESI)：216.0[M+H]+。
步驟6：(S)-14-(氯甲基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烯並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮-2,2-d 2(中間體L1-6)的合成
將中間體L1-5(100.0mg)及(S)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1H-吡喃並[3,4-f]吲嗪-3,6,10(4H)-三酮(109.87mg)溶於甲苯(1mL)及乙酸(1mL)中，向其中加入對甲基苯磺酸吡啶鹽(5.24mg)。反應液在100℃攪拌16小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，直接將反應液經減壓濃縮至乾。加入乙醇(5mL)，反應液於25℃攪拌0.5小時。反應液過濾，濾餅用乙醇(5mL*2)洗滌得到標題化合物(100.0mg)。
MS m/z(ESI)：443.0[M+H]+。
步驟7：(S)-14-(胺基甲基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烯並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮-2,2-d 2(中間體L1-7)的合成
將中間體L1-6(100.00mg)溶於無水乙醇(1.5mL)及無水DMF(1.5mL)中，向其中加入六次甲基四胺(94.97mg)。反應液在50℃攪拌6小時。反應結束後，反應液經減壓濃縮至乾，殘餘物經高效液相色譜法純化(柱子：Boston Green ODS 150*30mm*5μm；流動相：〔A：水(甲酸)，B：乙腈〕；B%：0%-30%，12分鐘)得標題化合物(25.0mg)。
MS m/z(ESI)：424.0[M+H]+。
步驟8：(S)-4-苄基-3-(2-環丙基乙醯基)噁唑烷-2-酮(中間體L1-10)的合成
稱取化合物L1-8(150.0g)，DMAP(160.15g)，及化合物L1-9(221.2g)，溶解於1500mL二氯甲烷中，並在室溫下攪拌15分鐘。稱取EDCI(359.0g)，分批加入反應液，加畢，在室溫下攪拌約5小時。反應結束後，向反應液中加入二氯甲烷(1500mL)稀釋，接著依次用水(500mL)洗滌2次，2N HCl(500mL)洗滌一次，飽和碳酸氫鈉溶液(500mL)洗滌一次，飽和食鹽水溶液(500mL)洗滌一次，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後濾液減壓濃縮至乾，得標題化合物(302g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.32-7.35(m,2H),7.26-7.29(m,1H),7.21-7.23(m,2H),4.68-4.71(m,1H),4.17-4.23(m,2H),3.30-3.33(dd,1H),2.91-2.95(dd,1H),2.78-2.82(m,2H),1.14-1.18(m,1H),0.59-0.63(m,2H),0.21-0.26(m,2H).
步驟9：(S)-4-苄基-3-((S)-2-環丙基-2-羥基乙醯基)噁唑烷-2-酮(中間體L1-12)的合成
稱取中間體L1-10(200g)，溶解於2000mL無水THF中，在氮氣保護下，-78℃下攪拌15分鐘。隨後，向反應液中滴加二(三甲基矽基)胺基鈉(443.5mL，2M in THF)。滴加結束，反應反應液在-78℃下攪拌30分鐘。將中間體L1-11(201.5g)溶解於700mL THF中溶清，並緩慢滴加入反應液。滴加結束，-78℃下攪拌2小時。隨後，向反應液中加入冰醋酸220mL，淬滅反應。滴畢後逐漸升溫至室溫，並向反應液中加入2N HCl 600mL，室溫(20-25℃)攪拌10小時。隨後，反應液減壓濃縮，並向殘留物中加入乙酸乙酯(1000mL)及水(200mL)，攪拌20分鐘。分離水相用乙酸乙酯(500mL x2)萃取兩次，合併有機相，依次用飽和NaHCO3溶液400mL，飽和Na2S2O3溶液400mL及飽和食鹽水各洗滌兩次，所得有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後，濾液減壓濃縮至乾，殘留物用矽膠柱色譜純化(石油醚：乙酸乙酯=1/30)得標題化合物(128.7g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.37(dd,J=8.1,6.8Hz,2H),7.33-7.29(m,1H),7.27-7.23(m,2H),4.81(dd,J=7.9,5.9Hz,1H),4.72(ddt,J=10.0,7.5,2.9Hz,1H),4.33(t,J=8.3Hz,1H),4.28(dd,J=9.1,2.5Hz,1H),3.48(dd,J=8.2,3.9Hz,1H),3.35(dd,J=13.5,3.4Hz,1H),2.88(dd,J=13.5,9.4Hz,1H),1.36-1.29(m,1H),0.62-0.44(m,4H).
步驟10：(S)-4-苄基-3-((S)-2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)-2-環丙基乙醯基)噁唑烷-2-酮(中間體L1-13)的合成
稱取中間體L1-12(128.7g)，溶解於1300mL DCM中，並加入 咪唑(56.17g)，在冰浴下攪拌15分鐘。隨後分批向反應液中加入TBSCl(107.3g)，並在室溫下攪拌3小時。向反應液中加入200mL 2N HCl攪拌20分鐘，分液。有機相依次用飽和NaHCO3溶液200mL及飽和食鹽水各洗滌兩次。有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後，濾液減壓濃縮至乾，殘留物用矽膠柱色譜純化(石油醚：乙酸乙酯=80：1)得標題化合物(160g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.35-7.37(m,2H),7.30-7.32(m,1H),7.26-7.29(m,2H),5.26-5.31(m,1H),4.67-4.71(m,1H),4.20-4.26(m,2H),3.41-3.44(dd,1H),2.72-2.76(dd,1H),1.25-1.31(m,1H),0.94(s,9H),0.54-0.56(m,2H),0.46-0.48(m,2H),0.12(s,6H).
步驟11：(S)-2-((三級丁基二甲基矽基)氧基)-2-環丙基乙酸苄酯(中間體L1-14)的合成
稱取苄醇(62.18g)，溶解於500mL THF中，並在-25℃下攪拌。量取正丁基鋰(213.6mL，2.5M in THF)，緩慢滴加入反應液。滴畢，在-25℃下攪拌1小時。稱取中間體L1-13(160g)，溶於320mL THF中，並在-25℃下緩慢滴加入反應液中。滴畢，在-15℃下攪拌3小時。向反應液中加入飽和NH4Cl(200mL)溶液淬滅反應。隨後減壓濃縮，並向反應液中加入甲基三級丁基醚400mL及水(150mL)，攪拌30分鐘，分液，水相用甲基三級丁基醚(200mL x2)萃取兩次，合併有機相，飽和食鹽水(250mL)洗滌一次，無水硫酸鈉乾燥，過濾後，濾液經減壓濃縮，殘留物經矽膠柱色譜純化(石油醚：乙酸乙酯=100：1)，得標題化合物(125g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.28-7.40(m,5H),5.17-5.26(m,2H),3.86-3.89(m,1H),1.21-1.46(m,1H),0.90(s,9H),0.45-0.51(m,4H),0.05(s,6H).
步驟12：(S)-2-環丙基-2-羥基乙酸苄酯(中間體L1-15)的合成
稱取中間體L1-14(125g)，溶於1200mL THF中，並加入冰醋酸(35.1g)，在室溫下攪拌5分鐘。隨後向反應液中加入TBAF(585mL，1M in THF)，並將反應液置於45℃下反應4小時。反應液減壓濃縮除去溶劑，並向殘餘物中加入300mL水及400mL甲基三級丁基醚，攪拌20分鐘，分液，水相用甲基三級丁基醚(200mL)萃取兩次，合併有機相，依次用飽和NaHCO3溶液200mL及飽和食鹽水各洗滌兩次，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後，濾液減壓濃縮至乾，殘留物矽膠柱色譜純化(石油醚：乙酸乙酯=60：1)，得標題化合物(68.9g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.27-7.39(m,5H),5.22-5.28(m,2H),3.82(d,1H),2.7(brs,1H),1.11-1.15(m,1H),0.41-0.56(m,4H).
藉由以下手性超臨界流體色譜條件對中間體L1-15進一步分析。
中間體L1-15在上述手性超臨界流體色譜條件下，其保留時間為3.013分鐘。
步驟13：乙酸(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲酯(中間體L1-17)的合成
將化合物L1-16(25g)，醋酸鉛(43.79g)及吡啶(6.98g)溶於四氫呋喃(600mL)及甲苯(200mL)的混合溶劑，氮氣置換3次，反應在氮氣保護下加熱到85℃，攪拌反應18小時。之後冷卻至室溫，過濾反應液，濾液減壓濃縮至乾，粗品經快速矽膠柱純化(ISCO®；330g SepaFlash® Silica Flash Column，流動相梯度0~75%乙酸乙酯/石油醚，流速100mL/min)得標題化合物(18g)。
((MS m/z(ESI)：391.1[M+Na]+。
步驟14：(S)-10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一烷-11-羧酸苄酯(中間體L1-18)的合成
將中間體L1-17(5g)，中間體L1-15(8.40g)，對甲基苯磺酸吡啶鹽(341.09mg)溶於二氯甲烷(150mL)，氮氣置換3次，反應液在氮氣保護下加熱到65℃，攪拌反應48小時。之後冷卻至室溫，過濾反應液，濾液減壓濃縮至乾，粗品經快速矽膠柱純化(ISCO®；120g SepaFlash® Silica Flash Column，流動相梯度0~45%乙酸乙酯/石油醚，流速80mL/min)，再進一步由高效液相色譜純化(柱子：Boston Prime C18 150*30mm*5um；流動相：〔A：水(甲酸)，B：乙腈〕；B%：42%-82%，13分鐘)得標題化合物(1.4g)。
MS m/z(ESI)：537.2[M+Na]+。
步驟15：(S)-10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一烷-11-羧酸(中間體L1-19)的合成
將中間體L1-18(1.4g)溶於混合溶劑甲醇(15mL)及水(15mL)，氮氣氛圍下加入濕鈀碳(10%質量含量，0.15g)，氫氣置換3次後，反應液在25℃氫氣氛圍中(15Psi)攪拌反應16小時。反應結束後，過濾反應液， 濾液減壓濃縮至乾，粗品經高效液相色譜法純化(柱子：Boston Prime C18 150*30mm*5um；流動相：〔A：水(甲酸)，B：乙腈〕；B%：24%-64%，13分鐘)得標題化合物。
LCMS m/z(ESI)：447.5[M+Na]+。
步驟16：樹脂負載的(S)-10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一烷-11-羧酸(中間體L1-20)的合成
將CTC樹脂(規格：約1.19mmol/g)(257mg)加入二氯甲烷(3mL)中，再加入中間體L1-19(130mg)及二異丙基乙基胺(59.37mg)。反應液氮氣置換3次後，在25℃搖床搖晃反應16小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(330mg)。
步驟17：樹脂負載的(S)-2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-2-環丙基乙酸(中間體L1-21)的合成
將中間體L1-20(330mg)溶於N,N-二甲基甲醯胺(5mL)中，加入哌啶(1.08g)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(220mg)。
步驟18：樹脂負載的(5S)-5-苄基-13-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9-三氧基-2,12-二氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-酸(中間體L1-22)的合成
將中間體L1-21(220mg)及(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-苯丙胺酸(230.17mg)溶於N,N-二甲基甲醯胺(5mL)中，加入O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(225.31mg)及二異丙基乙基胺(99.96mg)。反應液在25 ℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(377mg)。
步驟19：樹脂負載的(S)-2-((2-((S)-2-胺基-3-苯基丙醯胺基))乙醯胺基)甲氧基)-2-環丙基乙酸(中間體L1-23)的合成
將中間體L1-22(377mg)溶於N,N-二甲基甲醯胺(5mL)中，加入哌啶(37.22mg，437.15umol，43.17uL)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(270mg)。
步驟20：樹脂負載的(11S,19S)-11-苄基-19-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五氧代-2,18-二氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十烷-20-羧酸(中間體L1-24)的合成
將中間體L1-23(270mg)溶於N,N-二甲基甲醯胺(5mL)中，依次加入中間體L1-16(209.58mg)及O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(224.29mg)，二異丙基乙基胺(99.51mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(403mg)。
步驟21：樹脂負載的(10S)-16-胺基-10-苄基-2-環丙基-6,9,12,15-四氧基-3-氧基-5,8,11,14-四氮雜十六烷-1-甲酸(中間體L1-25)的合成
將中間體L1-24(403mg)溶於N,N-二甲基甲醯胺(5mL)中，加入哌啶(1.08g)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂 用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(300mg)。
步驟22：6-(2-甲磺醯基-5-氧代-5H,6H,7H,8H-吡啶並[4,3-d]嘧啶-6-基)己酸(中間體L1-26)的合成
將中間體18-2(2.4g)溶於二氯甲烷(50mL)中後加入三氟乙酸(10mL)。反應液在25℃下攪拌反應1小時。之後反應液經減壓濃縮除去溶劑後，加入水(20mL)室溫攪拌5分鐘後過濾得標題化合物(1.5g)。
(MS m/z(ESI)：342.1[M+H]+。
步驟23：樹脂負載的(2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-23-(2-甲磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)-6,9,12,15,18-五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十三烷酸(中間體L1-27)的合成
將中間體L1-25(200mg)加入DMF(3mL)中，依次加入中間體L1-26(127mg)及O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(141mg)，二異丙基乙基胺(69mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(220mg)。
步驟24：(2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-23-(2-甲磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)-6,9,12,15,18-五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十三烷酸(中間體L1-28)的合成
將中間體L1-27(220mg)加入二氯甲烷(4mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(1mL)的混合物中，在25℃搖晃1小時。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮至乾，得標題化合物(17mg)。
步驟25：N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-6-(2-甲磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)己醯胺(a-L1-1)的合成
將中間體L1-28(17mg)，中間體L1-7(10.06mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(8.28mg)，吡啶(5.13mg)及1-羥基苯並三唑(5.84mg)溶解於DMF(0.7mL)，氮氣置換3次，反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應1小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：Welch Xtimate C18 150*25mm*5um；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：25%-55%，11分鐘)得標題化合物(2.1mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.22(s,1H),8.67(t,J=6.0Hz,1H),8.60(t,J=6.5Hz,1H),8.30(t,J=5.7Hz,1H),8.17-8.05(m,2H),8.05-7.97(m,1H),7.80(s,1H),7.52(s,1H),7.29-7.20(m,5H),7.18-7.16(m,1H),6.54-6.46(m,1H),5.44(d,J=8.7Hz,4H),4.85-4.71(m,2H),4.68-4.66(m,1H),4.55-4.45(m,1H),4.42-4.39(m,1H),3.77-3.63(m,7H),3.62-3.53(m,1H),3.51-3.45(m,3H),3.43(s,3H),3.25(t,J=6.7Hz,2H),3.05-3.03(m,1H),2.80-2.78(m,1H),2.13(t,J=7.5Hz,2H),1.94-1.79(m,2H),1.61-1.46(m,4H),1.33-1.21(m,2H),1.01-0.92(m,1H),0.87(t,J=7.3Hz,3H),0.43-0.26(m,4H)
MS m/z(ESI)：1192.6[M+H]+。
實施例23、N-((4S,12S,21S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並 [3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-21-(3-(2-(甲磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-3,8,11,14,17,20-六氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19-六氮雜二十五烷-25-基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(a-L2-1)
步驟1：(S)-32-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-26-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜三十三烷-33-酸(中間體L2-1)的合成
將2,5-二氧代吡咯烷-1-基2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26酸酯(4.5g)溶於DMF(70mL)中，加入(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-離胺酸(3.25g)。反應液在25℃攪拌16小時。反應結束後，向反應液加入水(300mL)，使用乙酸乙酯萃取(50mL*3次)，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥。過濾後，有機相經減壓濃縮除去溶劑，殘留物經快速矽膠柱純化 (ISCO®；40g SepaFlash® Silica Flash色譜柱，梯度0-4%甲醇/二氯甲烷@60mL/min)得標題化合物(4.1g)。
MS m/z(ESI)：763.3[M+H]+。
步驟2：樹脂負載的(32S,41S,49S)-32-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-41-苄基-49-環丙基-26,33,36,39,42,45-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,48-九氧雜-27,34,37,40,43,46-六氮雜五十烷-50-酸(中間體L2-2)的合成
將中間體L1-25(1.5g)溶於DMF(15mL)中，依次加入中間體L2-1(2.02g)及O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(1.01g)，二異丙基乙基胺(771.05mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(20mL)及二氯甲烷(20mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(1.67g)。
MS m/z(ESI)：1230.5[M+Na]+
步驟3：樹脂負載的(32S,41S,49S)-32-胺基-41-苄基-49-環丙基-26,33,36,39,42,45-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,48-九氧雜-27,34,37,40,43,46-六氮雜五十烷-50-酸(中間體L2-3)的合成
將中間體L2-2(1.67g)溶於DMF(10mL)中，加入哌啶(2.5mL)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(20mL)及二氯甲烷(20mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(1.5g)。
MS m/z(ESI)：986.5[M+H]+。
步驟4：3-(2-(甲磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶- 6(5H)-基)-丙酸(中間體L2-4)的合成
在氮氣氣氛下，將化合物1(400mg)溶於20mL無水二氯甲烷中並冷卻至-78℃。在該溫度下加入5mL三氟乙酸，將混合物緩慢自然升溫至室溫。之後以氮氣氣流除去溶劑，殘留物中加入5mL無水乙腈，過濾，濾餅以1：1石油醚與乙酸乙酯的混合物洗滌，得標題化合物(220mg)。
步驟5：樹脂負載的(32S,41S,49S)-41-苄基-49-環丙基-32-(3-(2-(甲磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-26,33,36,39,42,45-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,48-九氧雜-27,34,37,40,43,46-六氮雜五十烷-50-酸(中間體L2-5)的合成
將中間體L2-3(300mg)溶於DMF(5mL)中，依次加入中間體L2-4(93.52mg)及O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(119.29mg)，二異丙基乙基胺(91.09mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(325mg)。
步驟6：(32S,41S,49S)-41-苄基-49-環丙基-32-(3-(2-(甲磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-26,33,36,39,42,45-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,48-九氧雜-27,34,37,40,43,46-六氮雜五十烷-50-酸(中間體L2-6)的合成
將中間體L2-5(325mg)加入混合溶劑二氯甲烷(10mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(2.5mL)中，在25℃搖晃0.5小時。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮至乾，得標題化合物(75mg)。
MS m/z(ESI)：562.0[(M+H+)/2]+。
步驟7：N-((4S,12S,21S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-21-(3-(2-(甲磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-3,8,11,14,17,20-六氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19-六氮雜二十五烷-25-基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(a-L2-1)的合成
將中間體L2-6(70mg)，中間體L1-7(28.06mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(21.18mg)，1-羥基苯並三唑(14.93mg)及吡啶(13.11mg)溶解於DMF(0.5mL)，氮氣置換3次，反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應1小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：C18 100×10mm；流動相：〔A：水(三氟乙酸)，B：乙腈〕；B%：16%-46%，8分鐘)得標題化合物(4.4mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.22(s,1H),8.67(t,J=5.9Hz,1H),8.60(t,J=6.3Hz,1H),8.32(s,1H),8.26-8.16(m,2H),8.11(d,J=7.9Hz,1H),7.97(t,J=5.4Hz,1H),7.83-7.74(m,2H),7.54-7.49(m,1H),7.28-7.20(m,5H),7.19-7.14(m,1H),7.12(s,1H),6.50(s,1H),5.43(d,J=5.3Hz,4H),4.84-4.62(m,3H),4.55-4.47(m,1H),4.42-4.39(m,1H),4.26-4.13(m,1H),3.78-3.61(m,10H),3.57(t,J=6.6Hz,3H),3.53-3.45(m,23H),3.45-3.40(m,6H),3.24(s,4H),3.14-3.01(m,3H),2.96(d,J=5.8Hz,2H),2.84-2.74(m,1H),2.28(t,J=6.4Hz,2H),1.95-1.80(m,2H),1.62(s,1H),1.48(d,J=9.4Hz,1H),1.33(s,2H),1.24(s,1H),1.18(t,J=7.3Hz,3H),1.02-0.93(m,1H),0.88(t,J=7.3Hz,3H),0.41-0.29(m,4H)
MS m/z(ESI)：837.4[(M+2H)/2]+。
實施例24、N-((4S,12S,21S)-12-苄基-21-(3-(2-(環戊磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17,20-六氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19-六氮雜二十五烷-25-基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(b-L2-1)
步驟1：3-(2-環戊磺醯基基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸(中間體L3-1)的合成
在0℃下，向化合物7(135mg)與DCM(10mL)的混合物中加入三氟乙酸(2mL)，所得混合物升至室溫反應2小時。之後減壓除去溶劑，混合物經柱層析分離(EA/PE，0-100%)得標題化合物(80mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：354.4[M+H]+.
步驟2：樹脂負載的(32S,41S,49S)-41-苄基-32-(3-(2-(環戊磺醯 基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-49-環丙基-26,33,36,39,42,45-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,48-九氧雜-27,34,37,40,43,46-六氮雜五十烷-50-酸(中間體L3-2)的合成
將中間體L2-3(200mg)溶於DMF(5mL)中，依次加入中間體L3-1(73.62mg)及O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(79.53mg)，二異丙基乙基胺(60.73mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(285mg)。
MS m/z(ESI)：1344.7[M+Na]+。
步驟3：(32S,41S,49S)-41-苄基-32-(3-(2-(環戊磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-49-環丙基-26,33,36,39,42,45-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,48-九氧雜-27,34,37,40,43,46-六氮雜五十烷-50-酸(中間體L3-3)的合成
將中間體L3-2(200mg)加入混合溶劑二氯甲烷(10mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(2.5mL)中，在25℃搖晃0.5小時。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮至乾，得標題化合物(55mg)。
MS m/z(ESI)：1344.7[M+Na]+。
步驟4：N-((4S,12S,21S)-12-苄基-21-(3-(2-(環戊磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17,20-六氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19-六氮雜二十五烷-25-基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六 烷-26-醯胺(b-L2-1)的合成
將中間體L3-3(55mg)，中間體L1-7(21.15mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(15.96mg)，1-羥基苯並三唑(11.25mg)及吡啶(9.88mg)溶解於DMF(0.5mL)，氮氣置換3次，反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應1小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：C18 150×30mm×5um；流動相：〔A：水(三氟乙酸)，B：乙腈〕；B%：27%-67%，11分鐘)得標題化合物(6.45mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.23(s,1H),8.70-8.64(m,1H),8.63-8.55(m,1H),8.36-8.28(m,1H),8.26-8.15(m,2H),8.14-8.08(m,1H),8.00-7.94(m,1H),7.82-7.74(m,2H),7.54-7.48(m,1H),7.27-7.21(m,6H),7.19-7.13(m,1H),6.51-6.47(m,1H),5.48-5.39(m,4H),4.84-4.72(m,2H),4.71-4.64(m,1H),4.55-4.49(m,1H),4.41-4.39(m,1H),4.27-4.16(m,2H),3.76-3.63(m,11H),3.57(t,J=6.5Hz,2H),3.51-3.47(m,26H),3.43(d,J=5.3Hz,3H),3.24(s,3H),3.22-3.17(m,1H),3.07-2.96(m,3H),2.84-2.76(m,1H),2.31-2.26(m,2H),2.01-1.84(m,6H),1.71-1.59(m,5H),1.53-1.44(m,1H),1.38-1.21(m,4H),1.01-0.94(m,1H),0.88(t,J=7.3Hz,3H),0.39-0.32(m,4H)
MS m/z(ESI)：864.0[(M+2H)/2]+。
實施例25、N-((4S,12S,21S)-12-苄基-21-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17,20-六氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19-六氮雜二十五烷-25-基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六 烷-26-醯胺(c-L2-1)
步驟1：3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙酸(中間體L4-1)的合成
在氮氣氣氛下，將化合物8(200mg)溶於無水二氯甲烷(10mL)中並冷卻至-78℃，在該溫度下加入三氟乙酸(2.5mL)，將混合物緩慢升溫至室溫攪拌2小時。反應結束後，以氮氣氣流除去溶劑，殘留物以5：1石油醚與乙酸乙酯的混合物洗滌，過濾得標題化合物(150mg)。
MS m/z(ESI)：342.1[M+H]+。
步驟2：樹脂負載的(32S,41S,49S)-41-苄基-32-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-49-環丙基-26,33,36,39,42,45-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,48-九氧雜-27,34,37,40,43,46-六氮雜五十烷-50-酸(中間體L4-2)的合成
將中間體L2-3(300mg)溶於DMF(5mL)中，依次加入中間體L4-1(106.67mg)及O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(178.20mg)，二異 丙基乙基胺(91.09mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(300mg)。
MS m/z(ESI)：583.0[(M+H)/2]+。
步驟3：(32S,41S,49S)-41-苄基-32-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-49-環丙基-26,33,36,39,42,45-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,48-九氧雜-27,34,37,40,43,46-六氮雜五十烷-50-酸(中間體L4-3)的合成
將中間體L4-2(300mg)加入混合溶劑二氯甲烷(10mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(2.5mL)中，在25℃搖晃0.5小時。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮至乾，粗品用乾燥機乾燥得標題化合物(80mg)。
MS m/z(ESI)：583.0[(M+H)/2]+。
步驟4：N-((4S,12S,21S)-12-苄基-21-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17,20-六氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19-六氮雜二十五烷-25-基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(c-L2-1)的合成
將中間體L4-3(70mg)，中間體L1-7(24.57mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(20.5mg)，1-羥基苯並三唑(14.44mg)及吡啶(12.68mg)溶解於DMF(0.5mL)，氮氣置換3次，反應液在25℃氮氣保護 下，攪拌反應1小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：C18 100×10mm；流動相：〔A：水(三氟乙酸)，B：乙腈〕；B%：18%-48%，8分鐘)得標題化合物(6.3mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ=9.25(s,1H),8.69-8.64(m,1H),8.60(t,J=6.4Hz,1H),8.32(t,J=5.6Hz,1H),8.25-8.16(m,1H),8.11(d,J=7.8Hz,1H),7.96(t,J=5.3Hz,1H),7.82-7.75(m,1H),7.52(s,1H),7.29-7.19(m,5H),7.19-7.12(m,1H),6.50(s,1H),5.44(d,J=8.8Hz,4H),4.86-4.71(m,2H),4.71-4.63(m,1H),4.55-4.47(m,1H),4.41-4.39(m,1H),4.22-4.15(m,1H),3.81-3.60(m,9H),3.57(t,J=6.6Hz,3H),3.53-3.44(m,24H),3.43-3.40(m,12H),3.24-3.20(m,4H),3.08-3.08(m,1H),3.08-2.94(m,2H),2.79-2.77(m,1H),2.28(t,J=6.5Hz,2H),1.93-1.79(m,2H),1.62(s,1H),1.48(d,J=9.3Hz,1H),1.37(s,9H),1.24(s,2H),1.02-0.93(m,1H),0.88(t,J=7.1Hz,3H),0.40-0.28(m,4H)
MS m/z(ESI)：858.4[(M+2H)/2]+。
實施例26、N-((4S,12S,25S)-12-苄基-25-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17,20,24-七氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19,23-七氮雜二十九烷-29-基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(c-L5-1)
步驟1：樹脂負載的(15S,23S)-15-苄基-23-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,7,10,13,16,19-六氧代-2,22-二氧雜-4,8,11,14,17,20-六氮雜二十四烷-24-酸(中間體L5-1)的合成
將3-(9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丙酸(274.48mg)溶於DMF(5mL)中，依次加入L1-25(受質加樹脂總重500mg，含量約0.22mmol)及O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(336.58mg)，二異丙基乙基胺(257.02mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(15mL)及二氯甲烷(15mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(528.4mg)。
MS m/z(ESI)：779.5([M+Na)]+。
步驟2：樹脂負載的(2S,10S)-20-胺基-10-苄基-2-環丙基-6,9,12,15,18-五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十烷-1-羧酸(中間體L5-2)的合成
將中間體L5-1(528.4mg)溶於DMF(5mL)及哌啶(42.97mg)中。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(15mL)及二氯甲烷(15mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(480.6mg)。
MS m/z(ESI)：535.1([M+H)]+。
步驟3：樹脂負載的(32S,45S,53S)-32-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-45-苄基-53-環丙基-26,33,37,40,43,46,49-七氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,52-九氧雜-27,34,38,41,44,47,50-七氮雜五十四烷-54-羧酸(中間體L5-3)的合成
將中間體L2-3(590.82mg)溶於DMF(5mL)中，依次加入化合物L5-2(480.6mg)及O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(295.66mg)，二異丙基乙基胺(225.77mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(15mL)及二氯甲烷(15mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(502mg)。
步驟4：樹脂負載的(32S,45S,53S)-32-胺基-45-苄基-53-環丙基-26,33,37,40,43,46,49-七氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,52-九氧雜-27,34,38,41,44,47,50-七氮雜五十四烷-54-羧酸(中間體L5-4)的合成
將中間體L5-3(502mg)溶於DMF(5mL)及哌啶(26.98mg)中。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(15mL)及二氯甲烷(15mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾 燥後得標題化合物(468.5mg)。
步驟5：樹脂負載的甲基(32S,45S,53S)-45-苄基-32-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-53-環丙基-26,33,37,40,43,46,49-七氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,52-九氧雜-27,34,38,41,44,47,50-七氮雜五十四烷-54-羧酸(中間體L5-5)的合成
將中間體L5-4(220.0mg)溶於DMF(5mL)中，依次加入中間體L4-1(74.10mg)及O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(82.87mg)，二異丙基乙基胺(63.28mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(220mg)。
MS m/z(ESI)：713.0([M+Na)]+。
步驟6：(32S,45S,53S)-45-苄基-32-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-53-環丙基-26,33,37,40,43,46,49-七氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,52-九氧雜-27,34,38,41,44,47,50-七氮雜五十四烷-54-羧酸(中間體L5-6)的合成
將中間體L5-5(220.00mg)加入混合溶劑二氯甲烷(16mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(4mL)中，在25℃搖晃15分鐘。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮至乾，得標題化合物(30mg)。
MS m/z(ESI)：691.0[(M+2H)/2]+。
步驟7：N-((4S,12S,25S)-12-苄基-25-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並 [3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17,20,24-七氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19,23-七氮雜二十九烷-29-基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(c-L5-1)的合成
將中間體L5-5(30mg)，中間體L1-7(17.49mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(8.33mg)，1-羥基苯並三唑(5.87mg)及吡啶(5.16mg)溶解於DMF(0.5mL)，氮氣置換3次，反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應1小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：C18 150×30mm×5um；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：25%-55%，11分鐘)得標題化合物(7.1mg)。
MS m/z(ESI)：893.7[(M+2H)/2]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.25(s,1H),8.67(s,1H),8.63-8.57(m,1H),8.30(s,1H),8.22-8.09(m,2H),8.03(s,1H),7.96(s,1H),7.83-7.75(m,2H),7.52(s,1H),7.28-7.19(m,5H),7.17(d,J=6.6Hz,1H),6.50(s,1H),5.44(d,J=9.0Hz,4H),4.85-4.71(m,2H),4.68-4.66(m,1H),4.51(s,1H),4.41-4.39(m,1H),4.18-4.09(m,1H),4.06(s,1H),3.77-3.65(m,12H),3.61-3.55(m,9H),3.51-3.49(m,22H),3.24(s,5H),3.04(d,J=9.8Hz,1H),2.97(d,J=6.1Hz,2H),2.79-2.77(m,1H),2.32-2.24(m,3H),1.93-1.80(m,2H),1.56(s,2H),1.45(d,J=8.5Hz,2H),1.37(s,9H),1.34-1.28(m,2H),1.22(d,J=15.6Hz,3H),0.96(d,J=6.8Hz,1H),0.87(t,J=7.3Hz,3H),0.40-0.30(m,4H)
實施例27、N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五 氮雜十八烷-18-基)-1-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-醯胺(c-L6-1)
步驟1：樹脂負載的(39S,47S)-39-苄基-47-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,31,34,37,40,43-六氧代-2,7,10,13,16,19,22,25,28,46-十氧雜-4,32,35,38,41,44-六氮雜四十八烷-48-酸(中間體L6-1)的合成
將1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16,19,22,25,28-九氧雜-4-氮雜三十一烷-31-羧酸(468.16mg)溶於DMF(5mL)中，依次加入中間體L1-25(400.0mg)及O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(269.26mg)，二異丙基乙基胺(205.61mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(15mL)及二氯甲烷(15mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(450mg)。
MS m/z(ESI)：1109.4([M+H)]+。
步驟2：樹脂負載的(2S,10S)-44-胺基-10-苄基-2-環丙基-6,9,12,15,18-五氧代-3,21,24,27,30,33,36,39,42-九氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜四十四烷酸(化合物L6-2)的合成
將中間體L6-1(440mg)溶於DMF(10mL)及哌啶(2mL)中。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(15mL)及二氯甲烷(15mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(365mg)。
MS m/z(ESI)：887.5([M+H)]+。
步驟3：樹脂負載的(2S,10S)-10-苄基-48-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)-2-環丙基-6,9,12,15,18,46-六氧代-3,21,24,27,30,33,36,39,42-九氧雜-5,8,11,14,17,45-六氮雜四十八烷酸(中間體L6-3)的合成
將中間體L6-2(365.0mg)溶於DMF(5mL)中，依次加入中間體L4-1(140.71mg)及O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(157.35mg)，二異丙基乙基胺(120.16mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(285mg)。
MS m/z(ESI)：1210.4([M+H)]+。
步驟4：(2S,10S)-10-苄基-48-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)-2-環丙基-6,9,12,15,18,46-六氧代-3,21,24,27,30,33,36,39,42-九氧雜-5,8,11,14,17,45-六氮雜四十八烷酸(中間體L6- 4)的合成
將中間體L6-3(380.00mg)加入混合溶劑二氯甲烷(8mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(2mL)中，在25℃搖晃15分鐘。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮至乾，得標題化合物(110mg)。
MS m/z(ESI)：606.0[(M+2H)/2]+。
步驟5：N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-1-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-醯胺(c-L6-1)的合成
將中間體L6-4(50mg)，中間體L1-7(17.49mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(15.84mg)，1-羥基苯並三唑(11.16mg)及吡啶(9.80mg)溶解於DMF(0.5mL)，氮氣置換3次，反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應1小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：C18 150×30mm×5um；流動相：〔A相：水(0.225%甲酸)，B相：乙腈〕；B%：25%-55%，9分鐘)得標題化合物(14.1mg)。
MS m/z(ESI)：808.6[(M+2H)/2]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.26(s,1H),8.69-8.56(m,2H),8.32-8.25(m,1H),8.19-8.14(m,1H),8.13-8.04(m,2H),8.02-7.97(m,1H),7.80(s,1H),7.52(s,1H),7.28-7.21(m,5H),7.19-7.17(m,1H),6.50(s,1H),5.44(d,J=8.3Hz,4H),4.79(d,J=7.8Hz,2H),4.68-4.66(m,1H),4.54-4.46(m,1H),4.41-4.39(m,1H),3.77- 3.66(m,10H),3.62-3.57(m,3H),3.51-3.46(m,30H),3.22(d,J=6.8Hz,4H),3.09-3.01(m,1H),2.80-2.78(m,1H),2.46-2.37(m,4H),1.93-1.80(m,2H),1.37(s,9H),1.01-0.94(m,1H),0.88(t,J=7.3Hz,3H),0.39-0.31(m,4H)。
實施例28、N-((4S,12S,21S)-12-苄基-21-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-8,10,11,13-四氫-7H-代[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17,20-六氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19-六氮雜二十五烷-25-基)-2,5,8,11-四氧雜十四烷-14-醯胺(c-L7-1)
步驟1：(S)-20-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-14-氧代-2,5,8,11-四氧雜-15-氮雜二十一烷-21-酸(中間體L7-1)的合成
將(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-離胺酸(2.1g)及O-(2,5-二氧 代吡咯烷-1-基)-2,5,8,11-四氧雜十四烷-14-酸酯(1.9g)溶於DMF(40mL)，氮氣置換3次，反應在25℃下攪拌16小時。反應結束後，粗品經混合物經柱層析分離(乙酸乙酯/石油醚，0-80%)得標題化合物(2.3g)。
MS m/z(ESI)：587.1[M+H]+。
步驟2：樹脂負載的(20S,29S,37S)-20-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-29-苄基-37-環丙基-14,21,24,27,30,33-六氧代-2,5,8,11,36-五氧雜-15,22,25,28,31,34-六氮雜三十八烷-38-酸(中間體L7-2)的合成
將中間體L7-1(517.24mg)溶於DMF(5mL)中，依次加入中間體L1-25(負載受質加樹脂總重500mg，含量約0.22mmol)及O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(336.58mg)，二異丙基乙基胺(257.02mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(15mL)及二氯甲烷(15mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(555mg)。
MS m/z(ESI)：1032.3([M+H)]+。
步驟3：樹脂負載的(20S,29S,37S)-20-胺基-29-苄基-37-環丙基-14,21,24,27,30,33-六氧代-2,5,8,11,36-五氧雜-15,22,25,28,31,34-六氮雜三十八烷-38-酸(中間體L7-3)的合成
將中間體L7-2(555mg)溶於DMF(5mL)及哌啶(35.72mg)中。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(15mL)及二氯甲烷(15mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(428mg)。
MS m/z(ESI)：810.2([M+H)]+。
步驟4：樹脂負載的(20S,29S,37S)-29-苄基-20-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-37-環丙基-14,21,24,27,30,33-六氧代-2,5,8,11,36-五氧雜-15,22,25,28,31,34-六氮雜三十八烷-38-酸(中間體L7-4)的合成
將中間體L7-3(428mg)溶於DMF(5mL)中，依次加入中間體L4-1(176.55mg)及O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(197.43mg)，二異丙基乙基胺(150.76mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(438mg)。
MS m/z(ESI)：1155.3([M+Na)]+。
步驟5：(20S,29S,37S)-29-苄基-20-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-37-環丙基-14,21,24,27,30,33-六氧代-2,5,8,11,36-五氧雜-15,22,25,28,31,34-六氮雜三十八烷-38-酸(中間體L7-5)的合成
將中間體L7-4(438mg)加入混合溶劑二氯甲烷(8mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(2mL)中，在25℃搖晃15分鐘。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮至乾，得標題化合物(50mg)。
MS m/z(ESI)：1155.3([M+Na)]+。
步驟6：N-((4S,12S,21S)-12-苄基-21-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-8,10,11,13-四氫-7H-代[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17,20-六氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19-六氮雜 二十五烷-25-基)-2,5,8,11-四氧雜十四烷-14-醯胺(c-L7-1)的合成
將中間體L7-5(50mg)，中間體L1-7(18.68mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(16.92mg)，1-羥基苯並三唑(11.92mg)及吡啶(10.47mg)溶解於DMF(1mL)，氮氣置換3次，反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應1小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：Boston Prime C18 100*10mm；流動相：〔A相：水(0.225%甲酸)，B相：乙腈〕；B%：20%-42%，15分鐘)得標題化合物(5.7mg)。
MS m/z(ESI)：770.0[(M+2H)/2]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.23(s,1H),8.76-8.64(m,1H),8.59(t,J=6.4Hz,1H),8.31(t,J=5.6Hz,1H),8.28-8.14(m,2H),8.14-8.04(m,1H),7.96(t,J=5.2Hz,1H),7.86-7.69(m,2H),7.51(s,1H),7.28-7.19(m,4H),7.16(J=2.6,5.7Hz,1H),6.63-6.51(m,1H),6.50(s,1H),5.43(d,J=7.5Hz,3H),4.90-4.57(m,3H),4.50(J=5.1,8.5Hz,1H),4.39(J=6.5,9.9Hz,1H),4.23-4.12(m,1H),3.81-3.44(m,27H),3.22(s,3H),3.08-2.91(m,4H),2.86-2.72(m,2H),2.27(t,J=6.4Hz,2H),1.96-1.78(m,2H),1.67-1.56(m,1H),1.53-1.44(m,1H),1.43-1.27(m,9H),1.23(s,3H),0.99-0.91(m,1H),0.91-0.81(m,3H),0.43-0.26(m,4H)
實施例29、N-((4S,12S,21S)-12-苄基-21-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17,20-六氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19-六氮雜二十五烷-25-基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八烷-38-醯胺(c-L8-1)
步驟1：(S)-44-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜-39-氮雜四十五烷-45-酸(中間體L8-1)的合成
將(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-離胺酸(800mg)及O-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八烷酸酯(429mg)溶於DMF(4mL)，氮氣置換3次，反應在25℃下攪拌16小時。反應結束後，粗品經反相高效液相製備色譜純化(ISCO®；80g C18柱，流動相梯度0~50%乙腈/水，流速40mL/min)得標題化合物(650mg)。
MS m/z(ESI)：940.0[M+H]+。
步驟2：樹脂負載的(44S,53S,61S)-44-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-53-苄基-61-環丙基-38,45,48,51,54,57-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,60-十三氧雜-39,46,49,52,55,58-六氮雜六十二烷-62-酸(中間體L8-2)的合成
將中間體L8-1(650mg)加入DMF(10mL)中，再加入中間體L1-25(400mg)，O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(336.58mg)及二異丙基乙基胺(205.62mg)。反應液氮氣置換3次後，在25℃搖床搖晃反應1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(430mg)。
步驟3：樹脂負載的(44S,53S,61S)-44-胺基-53-苄基-61-環丙基-38,45,48,51,54,57-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,60-十三氧雜-39,46,49,52,55,58-六氮雜六十二烷-62-酸(中間體L8-3)的合成
將中間體L8-2(430mg)溶於DMF(5mL)中，加入哌啶(1.08g，1.25mL)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(410mg)。
步驟4：樹脂負載的(44S,53S,61S)-53-苄基-44-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-61-環丙基-38,45,48,51,54,57-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,60-十三氧雜-39,46,49,52,55,58-六氮雜六十二烷-62-酸(中間體L8-4)的合成
將中間體L8-3(410mg)及中間體L4-1(144.48mg)溶於DMF(10mL)中，加入O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(214.89mg)及二異丙基乙基胺(182.33mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(420mg)。
步驟5：(44S,53S,61S)-53-苄基-44-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代- 7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-61-環丙基-38,45,48,51,54,57-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,60-十三氧雜-39,46,49,52,55,58-六氮雜六十二烷-62-酸(中間體L8-5)的合成
將中間體L8-4(420mg)加入混合溶劑二氯甲烷(8mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(2mL)中，在25℃搖晃0.5小時。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮至乾，得標題化合物(130mg)。
步驟6：N-((4S,12S,21S)-12-苄基-21-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17,20-六氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19-六氮雜二十五烷-25-基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十八烷-38-醯胺(c-L8-1)的合成
將中間體L8-5(70mg)，中間體L1-7(21.94mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(18.20mg)，吡啶(11.26mg)及1-羥基苯並三唑(12.83mg)溶解於DMF(2mL)，氮氣置換3次，反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應2小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：C 18 100*10mm；流動相：〔A相：水(0.225%甲酸)，B相：乙腈〕；B%：28%-35%，20分鐘)得標題化合物(5.1mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.27-9.23(m,1H),8.70(d,J=5.3Hz,1H),8.68-8.61(m,1H),8.40(s,2H),8.28-8.23(m,1H),8.22-8.13(m,1H),8.04-7.97(m,1H),7.84-7.76(m,2H),7.54-7.50(m,1H),7.26(s,1H),7.23-7.21(m,4H),7.19-7.12(m,1H),6.61-6.44(m,1H),5.46-5.40(m,4H),4.86-4.72(m,2H),4.71-4.63(m, 2H),4.57-4.46(m,2H),4.46-4.35(m,2H),4.25-4.14(m,2H),3.82-3.55(m,28H),3.49-3.37(m,22H),3.28-3.18(m,9H),3.10-2.95(m,5H),2.85-2.74(m,2H),2.28(t,J=6.5Hz,2H),1.92-1.80(m,2H),1.66-1.59(m,1H),1.51-1.42(m,1H),1.42-1.30(m,9H),1.28-1.16(m,2H),1.00-0.95(m,1H),0.89-0.85(m,3H),0.38-0.32(m,4H)
MS m/z(ESI)：946.5[M/2+H]+。
實施例30、N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-1-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺(c-L9-1)
步驟1：樹脂負載的(27S,35S)-27-苄基-35-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,19,22,25,28,31-六氧代-2,7,10,13,16,34-六氧雜-4,20,23,26,29,32-六氮雜三十六烷-36-酸(中間體L9-1)的合成
在室溫及氮氣氣氛下，向1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16-五氧雜-4-氮雜十九烷-19-羧酸(420mg)，中間體L1-25(負載的受質與樹脂的總 重500mg，含量約0.22mmol)，N,N-二異丙基乙胺(257mg)，苯並三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸鹽(497mg)的混合物中加入DMF(5mL)。將所得混合物在20℃下搖床搖晃1小時。之後樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(550mg)。
步驟2：樹脂負載的(2S,10S)-32-胺基-10-苄基-2-環丙基-6,9,12,15,18-五氧代-3,21,24,27,30-五氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜三十二烷酸(中間體L9-2)的合成
在室溫及氮氣氣氛下，向中間體L9-1(550mg)於DMF(5mL)的溶液中加入哌啶(500μL)，將所得混合物在20℃下搖床搖晃1小時。之後樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(500mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：733.2[M+Na]+。
步驟3：樹脂負載的(2S,10S)-10-苄基-36-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)-2-環丙基-6,9,12,15,18,34-六氧代-3,21,24,27,30-五氧雜-5,8,11,14,17,33-六氮雜三十六烷酸(中間體L9-3)的合成
在氮氣氣氛下，中間體L9-2(500mg)，中間體L4-1(187mg)，N,N-二異丙基乙胺(193mg)，苯並三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸鹽(253mg)的混合物中加入DMF(5mL)。將所得混合物在20℃下搖床搖晃1小時。之後樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(500mg)。
步驟4：(2S,10S)-10-苄基-36-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫 吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)-2-環丙基-6,9,12,15,18,34-六氧代-3,21,24,27,30-五氧雜-5,8,11,14,17,33-六氮雜三十六烷酸(中間體L9-4)的合成
在氮氣氣氛下，中間體L9-3(500mg)溶於二氯甲烷(16mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(4mL)。將所得混合物在20℃下搖床搖晃1小時。之後過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮至乾，加入乙腈(4mL)及純水(8mL)乾燥機乾燥得標題化合物(150mg)。
步驟5：N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-1-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺(c-L9-1)的合成
在氮氣氣氛下，中間體L9-4(100mg)中間體L1-7(45.0mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(37.1mg)，1-羥基苯並三唑(26.1mg)及吡啶(23.0mg)的混合物中加入DMF(2mL)。將所得混合物在室溫下攪拌1小時。之後混合物反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：C18 100×10mm；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：15%-40%，18分鐘)得標題化合物(10.6mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：1439.4[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ 9.29-9.24(m,1H),8.60(t,J=6.4Hz,2H),8.33-8.26(m,1H),8.21-8.13(m,1H),8.13-8.04(m,2H),8.00(t,J=5.5Hz,1H),7.80(s,1H),7.52(s,1H),7.26-7.22(m,5H),7.19-7.14(m,1H),6.50(s,1H),5.44(d,J=8.4Hz,4H),4.83-4.72(m,2H),4.70-4.63(m,1H),4.55-4.47(m,1H),4.45-4.37(m,1H), 3.77-3.67(m,10H),3.61-3.55(m,3H),3.50-3.45(m,14H),3.26-3.18(m,4H),3.05-3.03(m,1H),2.84-2.74(m,1H),2.46-2.35(m,4H),1.92-1.81(m,2H),1.41-1.33(m,9H),1.00-0.94(m,1H),0.90-0.86(m,3H),0.39-0.36(m,2H),0.34-0.30(m,2H)。
實施例31、N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-1-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺(c-L10-1)
步驟1：(51S,59S)-51-苄基-59-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,43,46,49,52,55-六氧代-2,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,58-十四氧雜-4,44,47,50,53,56-六氮雜六十烷酸(中間體L10-1)的合成
將中間體L1-25(負載受質加樹脂總重500mg，含量約0.22mmol)溶於DMF(5mL)中，依次加入1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十三氧雜-4-氮雜四十三烷酸(723.85mg)及O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(336.58mg)，二異丙基乙基胺(257.02mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(500mg)。
MS m/z(ESI)：1307.4[M+Na]+。
步驟2：樹脂負載的(2S,10S)-56-胺基-10-苄基-2-環丙基-6,9,12,15,18-五氧代-3,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54-十三氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜五十六烷酸(中間體L10-2)的合成
將中間體L10-1(500mg)溶於DMF(2mL)中，加入哌啶(0.5mL)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(470mg)。
步驟3：樹脂負載的(2S,10S)-10-苄基-60-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)-2-環丙基-6,9,12,15,18,58-六氧代-3,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54-十三氧雜-5,8,11,14,17,57-六氮雜六十烷酸(中間體L10-3)的合成
將中間體L10-2(470mg)溶於DMF(5mL)中，依次加入中間體L4-1(192.54mg)，O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(176.25mg)及二異丙基乙基胺(134.59mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束 後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(460mg)。
步驟4：(2S,10S)-10-苄基-60-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)-2-環丙基-6,9,12,15,18,58-六氧代-3,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54-十三氧雜-5,8,11,14,17,57-六氮雜六十烷酸(中間體L10-4)的合成
將中間體L10-3(460mg)加入混合溶劑二氯甲烷(4mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(1mL)中，在25℃搖晃0.5小時。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮，乾燥後得標題化合物(130mg)。
步驟5：N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-1-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧雜三十九烷-39-醯胺(c-L10-1)的合成
將中間體L10-4(50mg)，中間體L1-7(16.80mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(13.83mg)，吡啶(8.56mg)及1-羥基苯並三唑(9.75mg)溶解於DMF(1mL)，氮氣置換3次，反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應2小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：Boston Prime100*10mm；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：20%-42%，15分鐘)得標題化合物(3.3mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ 9.25(s,1H),8.70-8.58(m,2H),8.34- 8.26(m,1H),8.19-8.15(m,1H),8.15-8.04(m,2H),8.03-7.97(m,1H),7.79(s,1H),7.51(s,1H),7.27-7.21(m,5H),7.19-7.15(m,1H),6.82-6.73(m,1H),6.50(s,1H),5.50-5.37(m,4H),4.84-4.70(m,2H),4.67-4.65(m,1H),4.51-4.45(m,1H),4.42-4.36(m,1H),3.76-3.66(m,10H),3.59(s,3H),3.50-3.46(m,45H),3.24-3.17(m,4H),3.06-3.01(m,1H),2.82-2.75(m,1H),2.45-2.35(m,4H),1.92-1.80(m,2H),1.36(s,9H),0.93(s,1H),0.87(t,J=7.3Hz,3H),0.38-0.30(m,4H)。
MS m/z(ESI)：896.6[M/2+H]+。
實施例32、N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-1-(3-(2-(環戊磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-醯胺(b-L6-1)
步驟1：樹脂負載的(39S,47S)-39-苄基-47-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,31,34,37,40,43-六氧代-2,7,10,13,16,19,22,25,28,46-十氧雜-4,32,35,38,41,44-六氮雜四十八烷-48-羧酸(中間體2)的合成
在室溫及氮氣氣氛下，向中間體1A(1.17g)，中間體L1-25(負載的受質與樹脂的總重1g，含量約0.43mmol),N,N-二異丙基乙胺(514.05mg)，苯並三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸鹽(1.01g)的混合物中加入N,N-二甲基甲醯胺(10mL)。將所得混合物在20℃下搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(20mL)及二氯甲烷(20mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(1.03g)。
步驟2：樹脂負載的(2S,10S)-44-胺基-10-苄基-2-環丙基-6,9,12,15,18-五氧代-3,21,24,27,30,33,36,39,42-九氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜四十四 烷酸(L11-2)的合成
在室溫及氮氣氣氛下，向中間體L11-1(1.03g)於N,N-二甲基甲醯胺(10mL)的溶液中加入哌啶(2.5mL)，將所得混合物在20℃下搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(20mL)及二氯甲烷(20mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(993mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：887.6[M+H]+。
步驟3：樹脂負載的(2S,10S)-10-苄基-48-(2-(環戊磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)-2-環丙基-6,9,12,15,18,46-六氧代-3,21,24,27,30,33,36,39,42-九氧雜-5,8,11,14,17,45-六氮雜四十八烷酸(中間體L11-3)的合成
在氮氣氣氛下，中間體L11-2(993mg)，中間體L3-1(396.28mg)，N,N-二異丙基乙胺(326.90mg)，苯並三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸鹽(639.49mg)的混合物中加入N,N-二甲基甲醯胺(15mL)。將所得混合物在20℃下搖床搖晃1小時。LCMS檢測原料反應完畢後，反應結束後，樹脂用甲醇(20mL)及二氯甲烷(20mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(1.02g)。
LC-MS：m/z(ESI)：1245.2[M+Na]+
步驟4：(2S,10S)-10-苄基-48-(2-(環戊磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)-2-環丙基-6,9,12,15,18,46-六氧代-3,21,24,27,30,33,36,39,42-九氧雜-5,8,11,14,17,45-六氮雜四十八烷酸(中間體L11-4)的合成
在氮氣氣氛下，中間體L11-3(1.02g)溶於二氯甲烷(16mL) 及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(4mL)。將所得混合物在20℃下搖床搖晃1小時。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮至乾，加入乙腈(4mL)及純水(8mL)乾燥機乾燥得標題化合物(230mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：1244.7[M+Na]+
步驟5：N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-1-(3-(2-(環戊磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-醯胺(b-L6-1)的合成
在氮氣氣氛下，中間體L11-4(230mg)中間體L1-7(87.64mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(72.14mg)，1-羥基苯並三唑(50.85mg)及吡啶(44.65mg)的混合物中加入N,N-二甲基甲醯胺(2mL)。將所得混合物在室溫下攪拌1小時。LCMS檢測原料反應完畢後，混合物反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：C18 Welch Xtimate C18 150*30mm*5um；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：27%-47%，22分鐘)得標題化合物(41.4mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：814.8[(M+2H)/2]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ=9.24(s,1H),8.70-8.64(m,1H),8.60(t,J=6.6Hz,1H),8.29(t,J=5.9Hz,1H),8.17(t,J=5.6Hz,1H),8.11(d,J=8.0Hz,1H),8.07(t,J=5.5Hz,1H),8.00(t,J=5.6Hz,1H),7.79(s,1H),7.52(s,1H),7.27-7.21(m,6H),7.16(s,1H),6.51(s,1H),5.43(s,4H),4.84-4.71(m,2H),4.68-4.66(m,1H),4.54-4.46(m,1H),4.43-4.37(m,1H),4.28-4.19(m,1H),3.76-3.66(m,11H), 3.59(t,J=6.4Hz,3H),3.50-3.46(m,25H),3.26-3.18(m,5H),3.05-3.03(m,1H),2.80-2.78(m,1H),2.42-2.40(m,5H),2.00-1.85(m,6H),1.74-1.58(m,5H),0.99-0.96(m,1H),0.88(t,J=7.3Hz,3H),0.38-0.31(m,4H)
實施例33、(S)-N 4-(26-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24-八甲基-2,5,8,11,14,17,20,23,26-九氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氮雜二十六烷基)-N 1-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-8,10,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-2-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-N 4-甲基丁二醯胺(c-L12-1)
步驟1：(S)-5-烯丙氧羰基-1-(9H-芴-9-基)-8,11,14,17,20,23,26,29,32-九甲基-3,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧代-2-氧雜-4,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氮雜三十四烷-34-羧酸(中間體L12-1)的合成
該化合物由多肽固相合成法合成，步驟如下：
1)在氮氣保護下向CTC樹脂(0.64mmol/g，12.5g)與N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基甘胺酸(2.50g)的混合物中加入二氯甲烷；
2)滴加二異丙基乙胺DIEA(6.2g)並混合攪拌2小時；
3)加入甲醇(13mL)並混合攪拌0.5小時；
4)過濾並用DMF洗滌三次；
5)加入20%哌啶/DMF溶液並反應30分鐘；
6)過濾並用DMF洗滌五次；
7)加入下表中「原料」列的物質並混合30秒，之後加入下表中「試劑」列的物質。反應在氮氣鼓泡條件下進行1小時；
8)重複步驟4-7以完成所需多肽合成。
Note：
固相製備完畢後，向所得混合物中加入20% HFIP/DCM溶液並攪拌反應1.5小時。之後過濾，收集濾液後濃縮，所得混合物以製備液相色譜純化(A：0.075% TFA in H2O，B：乙腈)得標題化合物(2.15g)。
MS m/z(ESI)：1035.6[M+H]+。
步驟2：(S)-30-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28-十氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氮雜三十一烷-31-羧酸烯丙酯(中間體L12-2)的合成
將中間體L12-1(1g)，氯化銨(155.09mg)，二異丙基乙基胺(499.44mg)，HATU(728.95mg)於DMF(5mL)，氮氣置換3次，反應在25 ℃下攪拌3小時。反應結束後，粗品經反相高效液相製備色譜純化(ISCO®；80g C 18 Column，流動相梯度0~40%乙腈/水，流速40mL/min)得標題化合物(800mg)。
MS m/z(ESI)：1034.6[M+H]+。
步驟3：(S)-30-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28-十氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氮雜三十一烷-31-羧酸(中間體L12-3)的合成
將中間體L12-2(800mg)及四三苯基膦鈀(201.84mg)，1.3-二甲基巴比妥酸(108.71mg)於DMF(5mL)，氮氣置換3次，反應在25℃下攪拌4小時。反應結束後，粗品經反相高效液相製備色譜純化(ISCO®；80g C 18 Column，流動相梯度0~40%乙腈/水，流速40mL/min)得標題化合物(700mg)。
MS m/z(ESI)：994.9[M+H]+。
步驟4：樹脂負載的(2S,10S,19S)-19-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-48-胺基-10-苄基-2-環丙基-22,25,28,31,34,37,40,43,46-九甲基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48-十五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17,22,25,28,31,34,37,40,43,46-十四氮雜四十八烷酸(中間體L12-4)的合成
將中間體L12-3(700mg)加入DMF(10mL)中，再加入中間體L1-25(樹脂加受質總重400mg，含量約0.18mmol)，O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(336.58mg)及二異丙基乙基胺(205.62mg)。反應液氮氣置換3次後，在25℃搖床搖晃反應1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二 氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(420mg)。
MS m/z(ESI)：1461.4[M+Na]+。
步驟5：樹脂負載的(2S,10S,19S)-19,48-二胺基-10-苄基-2-環丙基-22,25,28,31,34,37,40,43,46-九甲基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48-十五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17,22,25,28,31,34,37,40,43,46-十四氮雜四十八烷酸(中間體L12-5)的合成
將中間體L12-4(420mg)溶於DMF(5mL)中，加入哌啶(1.25mL)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(400mg)。
MS m/z(ESI)：1217.4[M+H]+。
步驟6：樹脂負載的(2S,10S,19S)-48-胺基-10-苄基-19-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-2-環丙基-22,25,28,31,34,37,40,43,46-九甲基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48-十五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17,22,25,28,31,34,37,40,43,46-十四氮雜四十八烷-1-羧酸(中間體L12-6)的合成
將中間體L12-5(360mg)及中間體L4-1(108.39mg)溶於DMF(10mL)中，加入1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(114mg)，吡啶(108mg)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(390mg)。
步驟7：(2S,10S,19S)-48-胺基-10-苄基-19-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-2-環丙基-22,25,28,31,34,37,40,43,46-九甲基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48-十五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17,22,25,28,31,34,37,40,43,46-十四氮雜四十八烷-1-羧酸(中間體L12-7)的合成
將中間體L12-6(390mg)加入混合溶劑二氯甲烷(8mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(2mL)中，在25℃搖晃0.5小時。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮至乾，粗品直接經高效液相色譜法純化(柱子：Boston Green ODS 150*30mm*5um；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：10%-50%，10分鐘)得標題化合物(25mg)。
步驟8：(S)-N 4-(26-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24-八甲基-2,5,8,11,14,17,20,23,26-九氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氮雜二十六烷基)-N 1-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-8,10,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d 2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-2-(3-(2-(三級丁磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-N 4-甲基丁二醯胺(c-L12-1)的合成
將中間體L7-7(16mg)，中間體L1-7(4.4mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(3.98mg)，吡啶(2.46mg)及1-羥基苯並三唑(2.81mg)溶解於DMF(2mL)，氮氣置換3次，反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應2小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：C18 100*10mm；流動相：〔A：水(碳酸氫銨)，B：乙腈〕；B%：10%-38%，16分 鐘)得標題化合物(4.5mg)。
(流動相A配製：30L純水+24g碳酸氫銨)
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ=9.24(s,1H),8.66(d,J=6.4Hz,1H),8.59(s,1H),8.27(s,2H),8.01(d,J=16.5Hz,2H),7.81(s,1H),7.52(s,1H),7.26(s,1H),7.22(s,5H),7.16(s,1H),6.50(s,1H),5.44(d,J=9.9Hz,4H),4.85-4.71(m,3H),4.70-4.63(m,1H),4.57(s,1H),4.49(s,1H),4.43-4.27(m,6H),4.23(d,J=16.1Hz,3H),4.16(s,1H),4.13-3.99(m,5H),3.92(s,4H),3.86(d,J=13.0Hz,2H),3.75-3.64(m,10H),3.59(s,2H),3.49(d,J=7.0Hz,1H),3.22(t,J=6.4Hz,2H),2.99-2.84(m,14H),2.84-2.71(m,14H),1.92-1.79(m,2H),1.37(s,9H),1.24(s,2H),0.96(d,J=7.7Hz,1H),0.91-0.84(m,3H),0.39-0.30(m,4H)
MS m/z(ESI)：973.9[M/2+H]+。
實施例34、N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-6-(2-(環戊基磺醯)-5-氧代-8,8-二(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)己醯胺(b-L13-1)
步驟1：6-(2-環戊磺醯基-5-氧代-8,8-二(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)己酸(中間體L13-1)的合成
將化合物18(800mg)溶於二氯甲烷(8mL)中，加入三氟乙酸(1.5mL)。反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應2小時。反應結束後，經減壓濃縮除去溶劑。殘留物以快速矽膠柱層析法純化(ISCO®；12g SepaFlash®快速矽膠柱，梯度0~30%四氫呋喃/石油醚，流速50mL/min)得標題化合物(280mg)。
MS m/z(ESI)：776.6(M+H)+。
步驟2：樹脂負載的(2S,10S)-10-苄基-23-(2-環戊磺醯基-5-氧代- 8,8-二(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)-2-環丙基-6,9,12,15,18-五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十三烷酸(中間體L13-2)的合成
將中間體L13-1(280mg)及中間體L1-25(440mg)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(5mL)中，依次加入O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(183.22mg)及N,N-二異丙基乙胺(139.91mg)，反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(470mg)。
MS m/z(ESI)：1221.1(M+H)+。
步驟3：(2S,10S)-10苄基-23-(2-環戊磺醯基-5-氧代-8,8-二(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)-2-環丙基-6,9,12,15,18-五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十三烷酸(中間體L13-3)的合成
將中間體L13-2(450mg)溶解於二氯甲烷(8mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(2mL)，反應液在25℃搖床中反應0.5小時。反應結束後，過濾，濾液經減壓濃縮除去溶劑。殘餘物經製備高效液相色譜純化(C18柱5um粒徑，30mm直徑，150mm長度；用水(含有0.225%甲酸)及乙腈的極性遞減的混合物作為洗脫液；乙腈梯度比例25%-45%，洗脫時間22分鐘)得標題化合物(34mg)。
MS m/z(ESI)：1221.4(M+H)+。
步驟4：N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪 並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-6-(2-(環戊基磺醯)-5-氧代-8,8-二(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)己醯胺(b-L13-1)的合成
將中間體L13-3(34mg)及中間體L1-7(12.38mg)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(0.5mL)中，依次加入1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(10.67mg)，1-羥基苯並三唑(7.52mg)及吡啶(6.61mg)，氮氣置換3次。反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應1小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(C18柱5um粒徑，30mm直徑，150mm長度；用水(含有0.225%甲酸)及乙腈的極性遞減的混合物作為洗脫液；乙腈梯度比例32%-52%，洗脫時間22分鐘)得標題化合物(26.8mg)。
MS m/z(ESI)：814.1[(M+2H)/2]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=9.24(s,1H),8.71-8.64(m,1H),8.62-8.57(m,1H),8.33-8.25(m,1H),8.12(d,J=7.9Hz,1H),8.09-8.04(m,1H),8.04-7.98(m,1H),7.80(s,1H),7.52(s,1H),7.26-7.23(m,5H),7.19-7.12(m,1H),6.49(s,1H),5.44(d,J=8.3Hz,4H),4.84-4.71(m,2H),4.70-4.63(m,1H),4.54-4.45(m,1H),4.44-4.37(m,1H),4.31-4.21(m,1H),3.80-3.63(m,8H),3.63-3.57(m,1H),3.53-3.36(m,30H),3.22(s,6H),3.09-3.00(m,1H),2.84-2.75(m,1H),2.13(d,J=7.5Hz,2H),2.11-1.93(m,8H),1.90(s,2H),1.68(m,4H),1.55(d,J=7.7Hz,4H),1.33-1.25(m,2H),1.01-0.93(m,1H),0.90-0.85(m,3H),0.39-0.28(m,4H)
實施例35、N-((4S,12S,21S)-12-苄基-21-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-5'H-螺[環戊並-1,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並 [4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d2)-3,8,11,14,17,20-六氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19-六氮雜二十五烷-25-基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(b-L14-1)
步驟1：3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-5'H-螺[環戊烷-1,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙酸(中間體L14-1)的合成
將化合物19(630mg)溶於二氯甲烷(3mL)中，加入三氟乙酸(0.6mL)，反應液在25℃攪拌1小時。反應結束後，減壓濃縮，殘餘物經石油醚(1mL)及乙酸乙酯(1mL)打漿，並在真空下乾燥後得標題化合物 (380mg)。
MS m/z(ESI)：408.2[M+H]+。
步驟2：樹脂負載的(32S,41S,49S)-41-苄基-32-(3-(2'-環戊磺醯基-5'-氧代-5'H-螺[環戊烷-1,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-49-環丙基-26,33,36,39,42,45-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,48-九氧雜-27,34,37,40,43,46-六氮雜五十烷-50-羧酸(中間體L14-2)的合成
將中間體L14-1溶於N,N-二甲基甲醯胺(3mL)中，依次加入中間體L2-3(195.59mg)，O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(243.72mg)及N,N-二異丙基乙胺(250.82μL)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(5mL)及二氯甲烷(5mL)依次洗滌，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(430mg)。
步驟3：(32S,41S,49S)-41-苄基-32-(3-(2'-環戊磺醯基-5'-氧代-5'H-螺[環戊烷-1,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-49-環丙基-26,33,36,39,42,45-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,48-九氧雜-27,34,37,40,43,46-六氮雜五十烷-50-羧酸(中間體L14-3)的合成
將中間體L14-2(430mg)加入混合溶劑二氯甲烷(4mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(1mL)中，反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮，經高效液相色譜法純化(柱子：Welch Xtimate C18 150*30mm*5um；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：25%-45%，15分鐘)得標題化合物(17mg)。
步驟4：N-((4S,12S,21S)-12-苄基-21-(3-(2'-環戊磺醯基-5'-氧代-5'H-螺[環戊烷-1,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-4-環丙基-1-((S)-7-乙 基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁二氘代戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d2)-3,8,11,14,17,20-六氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19-六氮雜二十五烷-25-基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(b-L14-1)的合成
將中間體L14-3(17mg)，中間體L1-7(5.76mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(4.74mg)，吡啶(8.56mg)及1-羥基苯並三唑(3.34mg)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(0.5mL)，氮氣置換3次，反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應2小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：Welch Xtimate C18 150*30mm*5um；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：32%-52%，22分鐘)得標題化合物(9.8mg)。
MS m/z(ESI)：891.2[M/2+H]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=9.23(s,1H),8.73-8.55(m,2H),8.36-8.29(m,1H),8.25-8.16(m,2H),8.13(d,J=7.9Hz,1H),7.99(t,J=5.1Hz,1H),7.81-7.74(m,2H),7.50(s,1H),7.25(s,1H),7.23-7.19(m,4H),7.18-7.12(m,1H),6.49(s,1H),5.42(s,4H),4.84-4.71(m,2H),4.66(m,J=6.7,9.8Hz,1H),4.55-4.45(m,1H),4.39(m,J=6.5,10.1Hz,1H),4.31-4.16(m,2H),3.70-3.66(m,7H),3.60-3.53(m,5H),3.51-3.47(m,25H),3.40(s,3H),3.23(s,3H),3.08-2.90(m,4H),2.78(m,1H),2.27(t,J=6.5Hz,2H),2.07-1.91(m,7H),1.90-1.82(m,2H),1.76(s,6H),1.71-1.57(m,6H),1.54-1.43(m,1H),1.36-1.30(m,2H),1.28-1.23(m,2H),1.00-0.92(m,1H),0.87(t,J=7.3Hz,3H),0.38-0.34(m,2H),0.31(d,J=4.5Hz,2H)。
實施例36、(S)-N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪 並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-19-(3-(2-環戊磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6(5H)-基)丙醯胺基)-14-(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-2,5,8,11-四氧雜-14-氮雜二十烷-20-醯胺(b-L15-1)
步驟1：2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-醛(中間體L15-1)的合成
在-70℃及氮氣氣氛下，向草醯氯(914mg)的二氯甲烷(25mL)溶液中緩慢滴加二甲基亞碸(1.02mL)，反應液在-70℃下攪拌10分鐘，在-70℃下滴加2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-醇(1.00g)的二氯甲烷(5mL)溶液，反應液在-70℃下攪拌10分鐘，在-70℃下滴加三乙胺(4.02mL)，反應升 溫至室溫，將反應液在20℃下攪拌反應0.5小時。反應完畢後，得到標題化合物的二氯甲烷(30mL)溶液，過濾後直接用於下一步反應。
步驟2：(S)-19-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-14-(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-2,5,8,11-四氧雜-14-氮雜二十烷-20-羧酸三級丁酯(中間體L15-2)的合成
在室溫及氮氣氣氛下，向Fmoc-離胺酸三級丁酯鹽酸鹽(407.58mg)的乙醇(20mL)溶液中加入三乙醯氧基硼氫化鈉(4.07g)，滴加上步所得中間體L15-1的二氯甲烷(30mL)溶液，將所得混合物在20℃下攪拌反應3小時。反應完畢後，減壓除去溶劑，殘留物以快速矽膠柱層析法純化(ISCO®；20g SepaFlash®快速矽膠柱，梯度0~15%甲醇/二氯甲烷，流速60mL/min)得標題化合物(1.00g)。
LC-MS：m/z(ESI)：805.6[M+H]+.
步驟3：(S)-19-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-14-(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-2,5,8,11-四氧雜-14-氮雜二十烷-20-羧酸(中間體L15-3)的合成
在氮氣氣氛下，中間體L15-2(1.00g)溶於二氯甲烷(5mL)中，室溫下加入三氟乙酸(5mL)，反應液在20℃反應2小時。反應完畢後，減壓除去溶劑，殘留物以快速矽膠柱層析法純化(ISCO®；12g SepaFlash®快速矽膠柱，梯度0~15%甲醇/二氯甲烷，流速60mL/min)得標題化合物(330mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：749.4[M+H]+.
步驟4：樹脂負載的(19S,28S,36S)-19-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰 基)胺基)-28-苄基-36-環丙基-20,23,26,29,32-五氧代-14-(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-2,5,8,11,35-五氧雜-14,21,24,27,30,33-六氮雜三十七烷-37-羧酸(中間體L15-4)的合成
將中間體L15-3(301.44mg)及中間體L1-25(400mg)溶解於無水N,N-二甲基甲醯胺(8mL)，依次加入O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(88.86mg)及N,N-二異丙基乙胺(113.09mg)，反應液在25℃搖床中反應1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(20mL)及二氯甲烷(20mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(500mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：1194.6[M+H]+.
步驟5：樹脂負載的(19S,28S,36S)-19-胺基-28-苄基-36-環丙基-20,23,26,29,32-五氧代-14-(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-2,5,8,11,35-五氧雜-14,21,24,27,30,33-六氮雜三十七烷-37-羧酸(中間體L15-5)的合成
將中間體L15-4(0.55g)溶解於無水N,N-二甲基甲醯胺(2.5mL)，加入哌啶(0.5mL)，反應液在25℃搖床中反應1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(20mL)及二氯甲烷(20mL)依次洗滌，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(440mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：972.6[M+H]+.
步驟6：樹脂負載的(19S,28S,36S)-28-苄基-19-(3-(2-環戊磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6(5H)-基)丙醯胺基)-36-環丙基-20,23,26,29,32-五氧代-14-(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-2,5,8,11,35-五氧雜-14,21,24,27,30,33-六氮雜三十七烷-37-羧酸(中間體L15-6)的合成
將中間體L15-5(400mg)及中間體L3-1(100.74mg)溶解於 無水N,N-二甲基甲醯胺(8mL)，依次加入O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(48.25mg)及N,N-二異丙基乙胺(122.80mg)，反應液在25℃搖床中反應1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(20mL)及二氯甲烷(20mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(458mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：1307.5[M+H]+.
步驟7：(19S,28S,36S)-28-苄基-19-(3-(2-環戊磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6(5H)-基)丙醯胺基)-36-環丙基-20,23,26,29,32-五氧代-14-(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-2,5,8,11,35-五氧雜-14,21,24,27,30,33-六氮雜三十七烷-37-羧酸(中間體L15-7)的合成
將中間體L15-6(458.00mg)溶解於無水二氯甲烷(4mL)，加入1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(1mL)，反應液在25℃攪拌下反應1小時。反應結束後，過濾並用二氯甲烷(10mL)洗滌三次，濾液減壓濃縮，經製備高效液相色譜純化(C18柱5um粒徑，30mm直徑，150mm長度；用水(含有0.225%甲酸)及乙腈的極性遞減的混合物作為洗脫液；乙腈梯度比例20%-37%，洗脫時間19分鐘)，得標題化合物(25mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：1307.5[M+H]+.
步驟8：(S)-N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-19-(3-(2-環戊磺醯基-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6(5H)-基)丙醯胺基)-14-(2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-2,5,8,11-四氧雜-14-氮雜二十烷-20-醯胺(b-L15-1)的合成
將中間體L15-7(20.00mg)及中間體L1-7(14.25mg)溶解於無水N,N-二甲基甲醯胺(0.8mL)，依次加入1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(11.73mg)，1-羥基苯並三唑(8.27mg)及吡啶(7.26mg)，氮氣置換3次。反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應1小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(C18柱5um粒徑，30mm直徑，150mm長度；用水(含有0.225%甲酸)及乙腈的極性遞減的混合物作為洗脫液；乙腈梯度比例28%-38.5%，洗脫時間15分鐘)得標題化合物(7.8mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：857.4[(M+2H)/2]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=9.29-9.17(m,1H),8.73-8.59(m,2H),8.34(s,2H),8.30-8.18(m,2H),8.17-8.10(m,1H),8.04-7.96(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.54-7.46(m,1H),7.29-7.18(m,5H),7.18-7.12(m,1H),6.68-6.41(m,1H),5.46-5.40(m,3H),4.87-4.71(m,2H),4.70-4.62(m,1H),4.56-4.34(m,2H),4.29-4.14(m,2H),3.78-3.60(m,11H),3.53-3.44(m,32H),3.23-3.21(m,6H),3.07-3.00(m,1H),2.84-2.74(m,1H),2.58-2.53(m,4H),2.40-2.32(m,2H),1.80(m,6H),1.75-1.56(m,5H),1.53-1.39(m,1H),1.37-1.13(m,4H),1.00-0.93(m,1H),0.91-0.83(m,3H),0.41-0.26(m,4H)
實施例37、(S)-N4-(26-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24-八甲基-2,5,8,11,14,17,20,23,26-九氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氮雜二十六烷-1-基)-N1-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁二氘代戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-2-(3-(2-(環戊磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-N4-甲基丁二醯 胺(b-L12-1)
步驟1：樹脂負載的(2S,10S,19S)-48-胺基-10-苄基-19-(3-(2-(環戊磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-2-環丙基-22,25,28,31,34,37,40,43,46-九甲基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48-十五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17,22,25,28,31,34,37,40,43,46-十四氮雜四十八烷-1-羧酸(中間體L16-1)的合成
將中間體L12-5(535mg)及中間體L3-1(187.41mg)溶於N,N-二甲基甲醯胺(10mL)中，加入O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(270mg)及二異丙基乙基胺(309uL)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(550mg)。
步驟2：(2S,10S,19S)-48-胺基-10-苄基-19-(3-(2-(環戊磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-2-環丙基-22,25,28,31,34,37,40,43,46-九甲基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48-十五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17,22,25,28,31,34,37,40,43,46-十四氮雜四十八烷-1-羧酸 (中間體L16-2)的合成
將中間體L16-1(550mg)加入混合溶劑二氯甲烷(8mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(2mL)中，在25℃搖晃0.5小時。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物直接經高效液相色譜法純化(柱子：Welch Xtimate C18 150*30mm*5um；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：18%-38%，20分鐘)得標題化合物(35mg)。
步驟3：(S)-N4-(26-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24-八甲基-2,5,8,11,14,17,20,23,26-九氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氮雜二十六烷-1-基)-N1-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代--7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁二氘代戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-2-(3-(2-(環戊磺醯基)-5-氧代-7,8-二氫吡啶並[4,3-d]嘧啶-6(5H)-基)丙醯胺基)-N4-甲基丁二醯胺(b-L12-1)的合成
將中間體L16-2(35mg)，中間體L1-7(9.54mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(8.64mg)，吡啶(5.35mg)及1-羥基苯並三唑(6.09mg)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(1mL)，氮氣置換3次，反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應2小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：Welch Xtimate C18 150*30mm*5um；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：25%-45%，20分鐘)得標題化合物(8.2mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=9.22(s,1H),8.72-8.64(m,1H),8.59(d,J=4.9Hz,1H),8.35-8.21(m,2H),8.09-7.91(m,2H),7.80(s,1H),7.52(s,1H),7.35-7.19(m,5H),7.18-7.15(m,1H),7.11-7.04(m,1H),6.53-6.49(m,1H),5.44 (d,J=9.8Hz,3H),4.83-4.30(m,9H),4.28-3.82(m,13H),3.78-3.48(m,18H),3.08-2.64(m,30H),2.04-1.80(m,6H),1.73-1.56(m,4H),1.53-1.39(m,1H),1.24(s,3H),1.01-0.92(m,1H),0.87(t,J=7.2Hz,3H),0.43-0.26(m,4H)
MS m/z(ESI)：979.6[(M+2H)/2]+。
實施例38、N-((4S,12S,21S)-12-苄基-21-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d2)-3,8,11,14,17,20-六氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19-六氮雜二十五烷-25-基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(b-L17-1)
步驟1：3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙酸(中間體L17-1)的合成
將化合物20(680mg)溶解於二氯甲烷(10mL)，再向反應液中加入三氟乙酸(0.68mL)，反應液在25℃下攪拌反應1小時。反應完畢後，直接減壓濃縮除去溶劑。殘留物以快速矽膠柱層析法純化(ISCO®；12g SepaFlash®快速矽膠柱，梯度0~53%四氫呋喃/石油醚，流速40mL/min)得標題化合物(200mg)。
MS m/z(ESI)：423.8[M+H]+
步驟2：樹脂負載的(32S,41S,49S)-41-苄基-32-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-49-環丙基-26,33,36,39,42,45-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,48-九氧雜-27,34,37,40,43,46-六氮雜五十烷-50-羧酸(中間體L17-2)的合成
將中間體L2-3(400mg)及中間體L17-1(106.13mg)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(10mL)中。依次加入O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(159.06mg)及N,N-二異丙基乙胺(121.46mg)，反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗滌，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(420mg)。
MS m/z(ESI)：1391.5[M+H]+。
步驟3：(32S,41S,49S)-41-苄基-32-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-49-環丙基-26,33,36,39,42,45-六氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,48-九氧雜-27,34,37,40,43,46-六氮雜五十烷-50-羧酸(中間體L17-3)的合成
將中間體L17-2(400mg)溶解於二氯甲烷(8mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(2mL)，反應液在25℃搖床中反應0.25小時。反應完畢後，反應液過濾經減壓濃縮除去溶劑。殘餘物經製備高效液相色譜純化(C18柱5um粒徑，30mm直徑，150mm長度；用水(含有0.225%甲酸)及乙腈的極性遞減的混合物作為洗脫液；乙腈梯度比例20%-40%，洗脫時間22分鐘)，得標題化合物(15mg)。
MS m/z(ESI)：1413.4[M+Na]+。
步驟4：N-((4S,12S,21S)-12-苄基-21-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'- 氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d2)-3,8,11,14,17,20-六氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16,19-六氮雜二十五烷-25-基)-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(b-L17-1)的合成
將中間體L17-3(15mg)及中間體L1-7(4.79mg)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(0.5mL)中，依次加入1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(4.13mg)，1-羥基苯並三唑(2.91mg)及吡啶(2.56mg)，氮氣置換3次。反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應1小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(C18柱5um粒徑，30mm直徑，150mm長度；用水(含有0.225%甲酸)及乙腈的極性遞減的混合物作為洗脫液；乙腈梯度比例28%-48%，洗脫時間22分鐘)得標題化合物(9mg)。
MS m/z(ESI)：899.1[(M+2H)/2]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=9.28(s,1H),8.66(s,1H),8.62-8.56(m,1H),8.30(s,1H),8.21(s,1H),8.17-8.13(m,1H),8.13-8.08(m,1H),8.01-7.95(m,1H),7.82-7.75(m,2H),7.53-7.50(m,1H),7.26(s,1H),7.24-7.21(m,4H),7.19-7.13(m,1H),6.48(s,1H),5.44(d,J=8.9Hz,4H),4.86-4.73(m,2H),4.70-4.64(m,1H),4.52-4.48(m,1H),4.44-4.36(m,1H),4.29(s,1H),4.24-4.17(m,1H),3.83-3.80(m,3H),3.74-3.67(m,10H),3.58-3.55(m,3H),3.52-3.48(m,28H),3.43-3.42(m,3H),3.24(s,3H),3.06-2.97(m,3H),2.83-2.75(m,1H),2.31-2.26(m,2H),2.08-1.94(m,6H),1.90-1.81(m,2H),1.70-1.60(m,7H),1.53-1.45(m,1H),1.38-1.31(m,2H),1.24(s,2H),0.96(s,1H),0.88(t,J=7.4Hz,3H),0.36(s,4H)
實施例39、N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-6-(2'-(環戊磺醯基)-1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-26-氧代二十六烷-26-基)-5'-氧代-5'H-螺[哌啶-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)己醯胺(b-L18-1)
步驟1：6'-(6-三級丁氧基-6-氧代己基)-2'-(環戊硫基)-5'-氧代-6',7'-二氫-5'H-螺[哌啶並-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-1-甲酸苄酯(中間體L18-1)的合成
在0℃及氮氣氣氛下，將中間體18-3(3g)溶於N,N-二甲基甲醯胺(40mL)中，向其中加入NaH(1.72g，60%有效含量)，反應在0℃下攪拌15分鐘，向其中加入雙(2-碘乙基)胺基甲酸苄酯(9.85g)。反應液在氮氣保護0℃攪拌1小時。反應完畢後，混合物倒入50mL冰水中，經乙酸乙酯萃取 (20mL×2)，合併有機相以無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮後經柱層析分離(四氫呋喃/石油醚，0-18%)得標題化合物(2.7g)。
LC-MS：m/z(ESI)：623.2[M+H]+.
步驟2：6-(2'-(環戊硫基)-5'-氧代-5'H-螺[哌啶並-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)己酸(中間體L18-2)的合成
將中間體L18-1(2.7g)溶於乙腈(5mL)，向其中加入三甲基碘矽烷(1.23mL)，反應液於25℃攪拌0.5小時。反應液經柱層析純化(柱子：Spherical C18 20-35um 100A 40g；流動相：〔A：水，B：乙腈〕；B%：10%-30%，60分鐘)得標題化合物(1.4g)。
LC-MS：m/z(ESI)：433.3[M+H]+.
步驟3：6-(2'-(環戊基硫代)-1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-26-氧代二十六烷-26-基)-5'-氧代-5'H-螺[哌啶並-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)己酸(中間體L18-3)的合成
將中間體L18-2(500mg)與2,5-二氧代吡咯烷-1-基2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26酸酯(647.86mg)溶於無水N,N-二甲基甲醯胺(2mL)，向其中加入N,N-二異丙基乙胺(302μL)，反應液於25℃攪拌1小時。反應液經柱層析純化(柱子：Spherical C18 20-35um 100A 40g；流動相：〔A：水，B：乙腈〕；B%：10%-30%，60分鐘)得標題化合物(900mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：827.6[M+H]+.
步驟4：6-(2'-(環戊磺醯基)-1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-26-氧代二十六烷-26-基)-5'-氧代-5'H-螺[哌啶並-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)己 酸(中間體L18-4)的合成
在0℃下，將中間體L18-3(0.9g)溶於無水二氯甲烷(10mL)，向其中加入間氯過氧苯甲酸(375.58mg)，反應液於25℃攪拌1小時。反應完畢後，混合物經低溫減壓濃縮，殘餘物經柱層析純化(柱子：Spherical C18 20-35um 100A 40g；流動相：〔A：水，B：乙腈〕；B%：10%-24%，60分鐘)得標題化合物(472mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：859.5[M+H]+.
步驟5：樹脂負載的(2S,10S)-10-苄基-23-(2'-(環戊磺醯基)-1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-26-氧代二十六烷-26-基)-5'-氧代-5'H-螺[哌啶-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)-2-環丙基-6,9,12,15,18-五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十三烷-1-羧酸(中間體L18-5)的合成
在氮氣氣氛下，中間體L1-25(308mg)，中間體L18-4(466mg)，苯並三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸鹽(309.72mg)的混合物中加入N,N-二甲基甲醯胺(6mL)及N,N-二異丙基乙胺(213.38μL)，將所得混合物在20℃下搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(20mL)及二氯甲烷(20mL)依次洗滌，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(350mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：653.0[(M+2H)/2]+
步驟6：(2S,10S)-10-苄基-23-(2'-(環戊磺醯基)-1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-26-氧代二十六烷-26-基)-5'-氧代-5'H-螺[哌啶-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)-2-環丙基-6,9,12,15,18-五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十三烷-1-羧酸(中間體L18-6)的合成
在氮氣氣氛下，中間體L18-5(350mg)溶於二氯甲烷(10mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(2.5mL)。將所得混合物在25℃下搖床搖晃0.5小時。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮至乾，經高效液相色譜法純化(柱子：C18 Welch Xtimate C18 150*30mm*5um；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：22%-52%，11分鐘)得標題化合物(10mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：653.1[(M+2H)/2]+
步驟7：N-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-6-(2'-(環戊磺醯基)-1-(2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-26-氧代二十六烷-26-基)-5'-氧代-5'H-螺[哌啶-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)己醯胺(b-L18-1)的合成
在氮氣氣氛下，中間體L18-6(10mg)，中間體L1-7(3.25mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(2.94mg)，1-羥基苯並三唑(2.07mg)及吡啶(1.85μL)的混合物中加入N,N-二甲基甲醯胺(2mL)。將所得混合物在室溫下攪拌1小時。LCMS檢測原料反應完畢後，混合物反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：C18 Welch Xtimate C18 150*30mm*5um；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：28%-48%，20分鐘)得標題化合物(7.3mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：855.9[(M+2H)/2]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=9.28(s,1H),8.67(s,1H),8.60(s, 1H),8.29(s,1H),8.15-8.06(m,2H),8.04-7.99(m,1H),7.80(s,1H),7.52(s,1H),7.28-7.19(m,5H),7.16(s,1H),6.50(s,1H),5.44(d,J=9.9Hz,4H),4.77(s,2H),4.71-4.63(m,1H),4.49(s,1H),4.39(d,J=7.0Hz,1H),4.26(t,J=6.9Hz,1H),3.95(s,1H),3.77(s,3H),3.71-3.61(m,6H),3.54-3.45(m,32H),3.44-3.40(m,6H),3.04(d,J=10.1Hz,1H),2.84-2.75(m,1H),2.65-2.56(m,2H),2.14(t,J=7.0Hz,2H),2.03-1.83(m,8H),1.73-1.50(m,10H),1.26(d,J=11.8Hz,2H),0.95(d,J=5.4Hz,1H),0.87(t,J=7.2Hz,3H),0.40-0.28(m,4H)
實施例40、(S)-N4-(26-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24-八甲基-2,5,8,11,14,17,20,23,26-九氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氮雜二十六烷-1-基)-N1-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁二氘代戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-2-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-N4-甲基丁二醯胺(b-L19-1)
步驟1：樹脂負載的(2S,10S,19S)-48-胺基-10-苄基-19-(3-(2'-(環 戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5’H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6’(7’H)-基)丙醯胺基)-2-環丙基-22,25,28,31,34,37,40,43,46-九甲基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48-十五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17,22,25,28,31,34,37,40,43,46-十四氮雜四十八烷-1-羧酸(中間體L19-1)的合成
將中間體L12-5(880mg)及中間體L17-1(393.14mg)溶於N,N-二甲基甲醯胺(15mL)中，加入O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(453.65mg)及N,N-二異丙基乙基胺(313.82uL)。反應液在25℃放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇(10mL)及二氯甲烷(10mL)依次洗，重複3次後樹脂抽濾至乾，並在真空下乾燥後得標題化合物(920mg)。
步驟2：(2S,10S,19S)-48-胺基-10-苄基-19-(3-(2-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-2-環丙基-22,25,28,31,34,37,40,43,46-九甲基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48-十五氧代-3-氧雜-5,8,11,14,17,22,25,28,31,34,37,40,43,46-十四氮雜四十八烷-1-羧酸(中間體L19-2)的合成
將中間體L19-1(920mg)加入混合溶劑二氯甲烷(8mL)及1,1,1,3,3,3-六氟異丙醇(2mL)中，在25℃搖晃0.5小時。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物直接經高效液相色譜法純化(柱子：Welch Xtimate C18 150*30mm*5um；流動相：〔A相：水(0.225%甲酸)，B相：乙腈〕；B%：18%-38%，20分鐘)得標題化合物(65mg)。
步驟3：(S)-N4-(26-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24-八甲基- 2,5,8,11,14,17,20,23,26-九氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氮雜二十六烷)-N1-((4S,12S)-12-苄基-4-環丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二噁戊環並[4,5-g]吡喃並[3',4'：6,7]吲嗪並[1,2-b]喹啉-14-基-2,2-d2)-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧雜-2,7,10,13,16-五氮雜十八烷-18-基)-2-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-N4-甲基丁二醯胺(b-L19-1)的合成
將中間體L19-2(65mg)，中間體L1-7(22.10mg)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(15.36mg)，吡啶(9.51mg)及1-羥基苯並三唑(10.82mg)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(3mL)，氮氣置換3次，反應液在25℃氮氣保護下，攪拌反應2小時。反應結束後，反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：Welch Xtimate C18 150*30mm*5um；流動相：〔A相：水(0.225%甲酸)，B相：乙腈〕；B%：21%-51%，11分鐘)得標題化合物(35mg)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=9.28(s,1H),8.69-8.55(m,2H),8.30-8.21(m,2H),8.01(m,2H),7.79(s,1H),7.52(s,1H),7.39-7.27(m,1H),7.26-7.21(m,5H),7.15(s,1H),7.11-7.00(m,1H),6.49(s,1H),5.43(d,J=5.8Hz,4H),4.86-4.70(m,2H),4.70-4.63(m,1H),4.62-4.53(m,1H),4.52-4.44(m,1H),4.40-4.17(m,10H),4.12-3.89(m,9H),3.86-3.76(m,5H),3.75-3.65(m,9H),3.63-3.52(m,2H),3.51-3.43(m,2H),3.00-2.68(m,32H),2.07-1.92(m,6H),1.91-1.80(m,2H),1.71-1.59(m,6H),1.01-0.92(m,1H),0.88(t,J=7.3Hz,3H),0.38-0.27(m,4H)
MS m/z(ESI)：1014.8[(M+2)/2]+。
實施例41、((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基甲酸4-((30S,33S,36S)-1-胺基-30-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-33-異丙基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,36-十甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十二氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,32,35-十一氮雜三十七烷-37-甲醯胺基)苄基酯(化合物b-L22-3)
步驟1：((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-氧代丙烷-2-基)胺基)-1-氧代丁酸-2-基)胺基甲酸三級丁酯(中間體L22-2)的合成
將中間體L22-1(1.9g)及二(4-硝基苯基)羰酸酯(1.76g)溶於DMF(20mL)，氮氣氛圍下加入DIEA(2.5g)，反應液在25℃下攪拌3小時。之後反應液直接濃縮除去溶劑，粗產物經快速矽膠柱(ISCO®；20g SepaFlash®快速矽膠柱，洗脫劑0~45%四氫呋喃/石油醚，梯度@ 65mL/min)純化得標題化合物(2.5g)。
MS m/z(ESI)：559.2[M+H]+
步驟2：((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基) 胺基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((三級丁氧羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苄基酯(中間體L22-3)的合成
將中間體L22-2(1g)及依喜替康甲磺酸鹽(999.20mg)溶於DMF(17mL)及吡啶(3mL)，氮氣氛圍下加入HOBt(266.10mg)及DIEA(277.65mg，374.19uL)，反應液在25℃下攪拌3小時。之後反應液直接經高效液相色譜法純化得標題化合物(1.1g)。
MS m/z(ESI)：855.2[M+H]+。
步驟3：((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基甲酸4-((S)-2-((S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苄基酯(中間體L22-4)的合成
室溫下，向中間體L22-3(1.1g)的二氯甲烷(20mL)溶液中加入三氟乙酸(5mL)，反應液在25℃攪拌1小時。之後將反應液直接濃縮後真空乾燥得標題化合物(0.9g)。
MS m/z(ESI)：755.5[M+H]+
步驟4：((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基甲酸4-((30S,33S,36S)-30-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-1-胺基-33-異丙基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,36-十甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十二氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,32,35-十一氮雜三十七烷-37-胺基)苄基酯(中間體L22-5)的合成
將中間體L22-4(135mg)及中間體L12-3(97.79mg)溶於 DMF(2mL)，氮氣氛圍下加入HBTU(74.61mg)及DIEA(38.14mg)，反應液在25℃下攪拌3小時。之後反應液直接經C18反相柱(乙腈：水=0-50%)純化得標題化合物(120mg)。
MS m/z(ESI)：1732.1[M+H]+
步驟5：((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基甲酸4-((30S,33S,36S)-1,30-二胺基-33-異丙基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,36-十甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十二氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,32,35-十一氮雜三十七烷-37-胺基)苄基酯(中間體L22-6)的合成
將中間體L22-5(60mg)溶於DMF(0.5mL)，氮氣氛圍下加入哌啶(0.1mL)，反應液在25℃下攪拌1小時。之後反應液直接經C18反相柱(乙腈：水=0-50%)純化標題化合物(50mg)。
MS m/z(ESI)：1508.8[M+H]+
步驟6：((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基甲酸4-((30S,33S,36S)-1-胺基-30-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-33-異丙基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,36-十甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十二氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,32,35-十一氮雜三十七烷-37-甲醯胺基)苄基酯(化合物b-L22-3)的合成
室溫下，向中間體L22-6(40mg)及中間體L17-1(13.47mg)的DMF(1mL)溶液中加入HBTU(20.11mg)及DIEA(10.28mg，13.86 uL)，反應液在25℃攪拌1小時。之後反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：C18 150×30mm×5um；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：26%-56%，20分鐘)得標題化合物(18.6mg)。
MS m/z(ESI)：1915.5[M+H]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=9.68-9.42(m,1H),9.35-8.93(m,1H),8.21-8.17(m,2H),8.06-8.02(m,2H),7.78(d,J=10.8Hz,2H),7.66-7.62(m,3H),7.37(d,J=8.7Hz,2H),7.32(s,1H),5.45(s,2H),5.29(s,3H),5.08(s,2H),4.79-4.63(m,1H),4.41-4.16(m,10H),4.13-3.90(m,10H),3.84(s,4H),3.75-3.62(m,5H),3.01-2.72(m,32H),2.38(s,3H),2.26-2.14(m,4H),2.09-1.85(m,8H),1.72-1.60(m,5H),1.550-1.46(m,2H),1.38-1.30(m,3H),0.91-0.81(m,9H).
實施例42、((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基甲酸4-((42S,45S,48S)-1-胺基-42-(3-(2'-(環戊基磺醯)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃並-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-45-異丙基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,48-十四甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46-十六氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,44,47-十五氮雜四十九烷-49-醯胺基)苄基酯(化合物b-L23-3)
步驟1：(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-氧代丙烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)胺基)-4-氧代丁酸烯 丙酯(中間體L23-2)的合成
將中間體L22-4(300mg)及化合物L23-1(86.44mg)溶於DMF(4mL)中，向其中加入HBTU(110.99mg)及DIEA(84.76mg)。反應液於氮氣氛圍下25℃攪拌1小時。之後混合物直接經反相純化(柱子：C18(12g)；流動相：〔A：水，B：乙腈〕；B%：0%-100%，60mL/min)得標題化合物(180mg)。
MS m/z(ESI)：1132.6[M+H]+。
步驟2：(S)-3-胺基-4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-氧代丙烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)胺基)-4-氧代丁酸烯丙酯(中間體L23-3)的合成
將中間體L23-2(170mg)溶於DMF(1.5mL)及哌啶(0.3mL)中，於氮氣保護下25℃攪拌1小時。之後直接經反相純化(柱子：C18(40g)；流動相：〔A：水，B：乙腈〕；B%：0%-40%，60mL/min)得標題化合物(100mg)。
MS m/z(ESI)：910.4[M+H]+。
步驟3：(S)-3-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基甲醯基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-氧代丙烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)胺基)-4-氧代丁酸烯丙酯(中間體L23-4)的合成
將中間體L23-3(30mg)及中間體L17-1(15.36mg)溶於DMF(1mL)中，向其中加入HBTU(25.01mg)及DIEA(12.78mg)。反應液於氮氣中25℃攪拌1小時。之後混合物直接經反相純化(柱子：C18(12g)；流動相：〔A：水，B：乙腈〕；B%：0%-100%，40mL/min)得標題化合物(15mg)。
MS m/z(ESI)：1315.5[M+H]+。
步驟4：(S)-3-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基甲醯基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-氧代丙烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)胺基)-4-氧代丁酸(中間體L23-5)的合成
將中間體L23-4(14mg)溶於DMF(0.5mL)中，向其中加入四三苯基膦鈀(3.69mg)及1,3-巴比妥酸(2.49mg)。反應液於氮氣保護下25℃攪拌1小時。之後混合物直接經反相純化(柱子：C18(12g)；流動相：〔A：水，B：乙腈〕；B%：0%-90%，40mL/min)得標題化合物(13mg)。
MS m/z(ESI)：1275.2[M+H]+。
步驟5：N-(N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基甘胺醯基)-N-甲基甘胺酸三級丁酯(中間體L23-6)的合成
將Fmoc-肌胺酸(50g)溶於二氯甲烷(500mL)，向反應液加入HATU(66.65g)及DIEA(83.92mL)，將所得混合物在25℃下攪拌1小時，向反應液加入N-甲基甘胺酸三級丁酯鹽酸鹽(29.17g)。反應液在25℃攪拌2小 時。之後混合物用200mL水稀釋，經二氯甲烷萃取(100mL×3)，合併有機相以無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮後得標題化合物(115g)。
LC-MS：m/z(ESI)：439.2[M+H]+
步驟6：N-(N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基甘胺醯基)-N-甲基甘胺酸(中間體L23-7)的合成
將中間體L23-6(110g)溶於鹽酸二氧六環(400mL)，反應液在25℃攪拌16小時。反應完畢後，減壓濃縮後經柱層析分離(甲醇/二氯甲烷，0-9%)得標題化合物(40g)。
LC-MS：m/z(ESI)：383.2[M+H]+
步驟7：1-(9H-芴-9-基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十三甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十三氧代-2-氧雜-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十三氮雜四十二烷-42-酸(中間體L23-8)的合成
該化合物由多肽固相合成法合成，步驟如下：
9)在氮氣保護下向CTC樹脂(1.17mmol/g，15g)與N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-甲基甘胺酸(5.5g)的混合物中加入二氯甲烷；
10)滴加二異丙基乙胺DIEA(40mL)並混合攪拌16小時；
11)過濾樹脂並用甲醇(100mL)及DCM(100mL)洗滌三次；
12)加入20%哌啶/DMF溶液並反應1小時；
13)過濾樹脂並用甲醇(100mL)及DCM(100mL)洗滌三次；
14)根據樹脂重量，加入中間體L23-7(2.0eq.)，之後加入HBTU(3eq.)與DIEA(6.0eq.)。反應在氮氣鼓泡條件下進行1小時；
15)重複步驟3-6五次。
固相製備完畢後，向所得混合物中加入20% HFIP/DCM溶液(12.5mL)並攪拌反應1小時。之後過濾，收集濾液後濃縮，得標題化合物(150mg)。
MS m/z(ESI)：1164.8[M+H]+。
步驟8：(38-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二甲基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十三氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氮雜三十八烷基)(甲基)胺基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(中間體L23-9)的合成
將中間體L23-8(130mg)溶於DMF(2mL)中，依次加入氯化銨(17.92mg)及HATU(84.25mg)，DIEA(11.97μL)。反應液在25℃攪拌1小時。反應結束後，經反相柱純化(柱子：Spherical C18 20-35um 100A 20g；流動相：〔A：水，B：乙腈〕；B%：10%-30%，60分鐘)得標題化合物(80mg)。
MS m/z(ESI)：1163.6[M+H]+。
步驟9：N-(2-胺基-2-氧代乙基)-N-甲基-2-(N,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十一烷甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十一氮雜三十四烷-34-甲醯胺基)乙醯胺(中間體L23-10)的合成
將中間體L23-9(70mg)溶於DMF(0.5mL)中，加入二乙胺(30.99μL)。反應液在25℃攪拌2小時。反應結束後，經反相柱純化(柱子：Spherical C18 20-35um 100A 20g；流動相：〔A：水，B：乙腈〕；B%：10%-30%，60分鐘)得標題化合物(32mg)。
LC-MS：m/z(ESI)：941.3[M+H]+
步驟10：((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基甲酸4-((42S,45S,48S)-1-胺基-42-(3-(2'-(環戊基磺醯)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃並-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-45-異丙基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,48-十四甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46-十六氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,44,47-十五氮雜四十九烷-49-醯胺基)苄基酯(化合物b-L23-3)的合成
將中間體L23-5(13mg)及中間體L23-10(9.59mg)溶於DMF(0.5mL)中，向其中加入HBTU(7.73mg)及DIEA(3.95mg)。反應液於氮氣中25℃攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，經製備高效液相色譜純化(Welch Xtimate C18柱5um二氧化矽，30mm直徑，150mm長度；用水(含0.225%甲酸)及乙腈的極性遞減的混合物作為洗脫液；乙腈梯度比例26%-56%，洗脫時間11分鐘)得標題化合物(2.7mg)。
MS m/z(ESI)：1099.9[(M+2H)/2]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=9.67-9.42(m,1H),9.29(s,1H),8.46-8.24(m,1H),8.16-8.02(m,2H),7.78(d,J=11.0Hz,1H),7.69-7.61(m,2H),7.37(d,J=7.9Hz,2H),7.31(s,1H),6.53(s,1H),5.45(s,2H),5.29(s,3H),5.08(s,2H),4.78-4.64(m,1H),4.42-4.19(m,14H),4.12-3.89(m,14H),3.84(s,5H),3.74-3.62(m,4H),3.18-3.05(m,2H),3.00-2.65(m,45H),2.38(s,3H),2.25-2.14(m,2H),2.11-1.76(m,9H),1.72-1.61(m,5H),1.54-1.40(m,1H),1.37-1.29(m,3H),0.93-0.80 (m,10H).
實施例43、((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙烷-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)(甲基)胺基甲酸4-((30S,33S,36S)-1-胺基-30-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-33-異丙基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十二氧代-36-(3-脲基丙基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,32,35-十一氮雜三十七烷-37-醯胺基)苄基酯(化合物b-L26-4)
步驟1：3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙酸五氟苯酯(中間體L26-1)的合成
將中間體L17-1(0.5g)及五氟苯酚(325.98mg)溶於DMF(5mL)，氮氣氛圍下加入EDCI(425.68mg)，反應液在25℃下攪拌1小時。之後反應液直接經C18反相柱(100%乙腈)純化得標題化合物(600mg)。
MS m/z(ESI)：590.3[M+H]+
步驟2：(S)-1,30-二胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28-十氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氮雜三十一烷-31-酸(中間體L26-2)的合成
將中間體L12-3(1g)溶於四氫呋喃(10mL)及水(5mL)中，加入濕鈀碳(244.36mg)，隨後在氫氣氛圍下反應液在25℃下攪拌16小時。之後反應液直接過濾濃縮後得標題化合物(0.7g)。
MS m/z(ESI)：772.3[M+H]+。
步驟3：(S)-1-胺基-30-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃並-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28-十氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氮雜三十一烷-31-酸(中間體L26-3)的合成
將中間體L26-2(300mg)及中間體L26-1(206.23mg)溶於DMF(3mL)，氮氣氛圍下加入DIEA(150.71mg)，反應液在25℃下攪拌1小時。之後反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：C18 150×30mm×5um；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：13%-33%，10分鐘)得標題化合物(100mg)。
MS m/z(ESI)：1177.5[M+H]+
步驟4：((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)- 1-羥基-1-苯基丙烷-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)(甲基)胺基甲酸4-((30S,33S,36S)-1-胺基-30-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-33-異丙基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十二氧代-36-(3-脲基丙基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,32,35-十一氮雜三十七烷-37-醯胺基)苄基酯(化合物b-L26-4)的合成
室溫下，將中間體L26-3(20mg)及化合物L26-4(19.08mg)溶於DMF(0.5mL)，氮氣氛圍下加入正丁基磷酸三酐(T4P)(24.48mg，50%有效含量)及DIEA(8.78mg，11.84uL)，反應液在25℃攪拌1小時。之後反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：C18 150×40mm；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：20%-60%，9分鐘)得標題化合物(11mg)。
MS m/z(ESI)：1142.6[(M+2H)/2]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=9.80-9.51(m,1H),9.32-9.23(m,1H),8.40-8.27(m,1H),8.18-7.95(m,2H),7.89(d,J=9.0Hz,1H),7.62(s,2H),7.33-7.23(m,6H),7.17(s,2H),5.97(s,1H),5.40(s,3H),5.15-4.91(m,2H),4.79-4.57(m,2H),4.49(d,J=5.9Hz,2H),4.37-4.19(m,10H),4.13-3.66(m,22H),3.61-3.54(m,1H),3.25-3.17(m,9H),3.12(s,2H),3.02-2.71(m,34H),2.31-2.23(m,1H),2.16-1.90(m,11H),1.84-1.57(m,12H),1.56-1.20(m,8H),1.06-0.97(m,6H),0.91-0.72(m,26H).
實施例44、(2-(2-氯-4-(3-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代異吲 哚啉-5-基)甲基)脲基)苯乙氧基)乙基)(甲基)胺基甲酸4-((30S,33S,36S)-1-胺基-30-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-33-異丙基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十二氧代-36-(3-脲基丙基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,32,35-十一氮雜三十七烷-37-醯胺基)苄基酯(化合物b-L27-5)
步驟1：(2-(2-氯-4-(3-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代異吲哚啉-5-基)甲基)脲基)苯乙氧基)乙基)(甲基)胺基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((三級丁氧羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基酯(中間體L27-3)的合成
將化合物L27-1(100mg)及化合物L27-2(90mg，參考專利WO2021198965報導方法合成)溶於DMF(1mL)，氮氣氛圍下加入DIEA(60.08mg)，反應液在25℃下攪拌1小時。之後反應液用乙酸乙酯(30mL)稀釋，並水洗(30mL×3)，合併有機相用無水硫酸鈉乾燥。過濾後濾液減壓濃縮，殘餘物經快速矽膠柱(ISCO®；20g SepaFlash®快速矽膠柱，洗脫劑0~100%四氫呋喃/石油醚，梯度@ 40mL/min)純化得標題化合物(100mg)。
MS m/z(ESI)：1033.3[M+H]+。
步驟2：(2-(2-氯-4-(3-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代異吲哚啉-5-基)甲基)脲基)苯乙氧基)乙基)(甲基)胺基甲酸4-((S)-2-((S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基酯(中間體L27-4)的合成
0℃下，向中間體L27-3(100mg)的二氯甲烷(1mL)溶液中加入三氟乙酸(0.2mL)，反應液在25℃攪拌1小時。之後將反應液直接濃縮後真空乾燥後直接經高效液相色譜法純化(柱子：C18 150×30mm；流動相：〔A：水(0.00025%鹽酸)，B：乙腈〕；B%：12%-52%，9分鐘)得標題化合物(13mg)。
MS m/z(ESI)：933.6[M+H]+
步驟3：(2-(2-氯-4-(3-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代異吲哚啉-5-基)甲基)脲基)苯乙氧基)乙基)(甲基)胺基甲酸4-((30S,33S,36S)-1-胺基-30-(3-(2'-(環戊磺醯基)-5'-氧代-2,3,5,6-四氫-5'H-螺[吡喃-4,8'-吡啶並[4,3-d]嘧啶]-6'(7'H)-基)丙醯胺基)-33-異丙基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十二氧代-36-(3-脲基丙基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,32,35-十一氮雜三十七烷-37-醯胺基)苄基酯(化合物b-L27-5)的合成
室溫下，向中間體L27-4(11mg)及化合物L26-3(13.87mg)的DMF(0.5mL)溶液中加入正丁基磷酸三酐(12.73mg，50%含量)及DIEA(4.57mg，6.16uL)，反應液在25℃攪拌1小時。之後反應液直接經高效液相色譜法純化(柱子：C18 150×30mm；流動相：〔A：水(0.225%甲酸)，B：乙腈〕；B%：22%-62%，9分鐘)得標題化合物(6.5mg)。
MS m/z(ESI)：1046.9[(M+2H)/2]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=10.99(s,1H),9.79-9.52(m,1H),9.29(s,1H),8.79(s,1H),8.41-8.21(m,1H),8.10-7.90(m,2H),7.73-7.58(m,4H),7.52(s,1H),7.44(d,J=8.1Hz,1H),7.30(s,2H),7.23-7.05(m,3H),6.81(t,J=5.6Hz,1H),5.98(d,J=2.3Hz,1H),5.42(s,2H),5.13-5.09(m,1H),4.98(s,2H),4.81-4.65(m,1H),4.41(d,J=8.0Hz,3H),4.37-4.19(m,10H),4.14-3.99(m,6H),3.97-3.86(m,4H),3.85-3.74(m,6H),3.73-3.65(m,3H),3.59-3.45(m,8H),3.02-2.89(m,12H),2.89-2.73(m,22H),2.64-2.57(m,2H),2.41-2.37(m,1H),2.09-1.91(m,8H),1.84-1.75(m,1H),1.70-1.61(m,6H),1.48-1.44(m,3H),1.39-1.31(m,2H),0.89-0.78(m,8H).
實施例45、藥物-連接子對照1~5的製備或來源
藥物-連接子對照1的製備參考專利文獻CN111065621A，
藥物-連接子對照2參考實施例22及專利文獻CN111065621A報導的方法製備得到，
藥物-連接子對照3購買於MCE(貨號：HY-15575)，
藥物-連接子對照4的製備參考專利文獻WO2021198965A1，
藥物-連接子對照5購買於MCE(貨號：HY-147270)，
測試例1、抗體偶聯物的理化性質測試
1.1 抗體：
1.1.1 抗人HER2單株抗體的構建及生產
抗人HER2單株抗體的序列如下表1所示，將重鏈及輕鏈核苷酸序列分別選殖到pTT5載體(購自優寶生物)中，並按已建立的常規的標準分子生物學方法製備質體。將表現載體及轉染試劑PEI(Polysciences，貨號：24765-1)加入OPTI-MEM(Gibco，貨號：11058021)中混勻後靜置15分鐘，加入Expi293F細胞(廠家：Thermofisher，貨號：A14527)中，放入5% CO2，120rpm，37℃搖床培養。轉染第二天，加入OPM-293 ProFeed(上海奧浦邁，貨號：F081918-001)及6g/L葡萄糖(廠家：Sigma，貨號：G7528)。轉染第六天，收集細胞上清。
表1 抗人HER2抗體Trastuzumab胺基酸序列訊息及其CDR分析(根據Kabat劃分)
1.1.2 抗人EGFR及cMet雙特異抗體的構建及生產
參照實施例1.1.1方法，將編碼前述抗體VH及VL的核酸序列構建質體(序列來源WO2024002938A1，參照表2)，並在Expi293F細胞中進行轉染，獲得表現上清。
表2 抗人EGFR-cMet雙特異性抗體EGFR-cMet-Ab序列訊息
1.1.3 抗人CDH6抗體的構建及生產
抗人CDH6抗體CDH6-Ab-1藉由免疫小鼠產生。免疫原為人 CDH6-hFc蛋白及過表現人CDH6的HEK293T細胞，選擇血清中抗體滴度高的小鼠的脾淋巴細胞製備融合瘤細胞，藉由ELISA、FACS等所屬技術領域中常規方法篩選得到陽性融合瘤細胞株，用無血清細胞培養法進一步製備抗體，並純化抗體及定序，得到鼠源抗人CDH6抗體及其可變區序列。藉由比對IMGT(http：//imgt.cines.fr)人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫及MOE(Molecular Operating Environment)軟體，分別挑選與鼠源抗體同源性高的重鏈及輕鏈可變區種系基因作為模板，將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列，在此基礎上，根據需要，進行回復突變以保證原有的親和力及/或進行熱點突變以消除分子修飾風險。最終優化的人源化抗體CDH6-Ab-1對應的VH及VL以及根據Kabat形式劃分的CDR序列如表3所示。
表3 抗人CDH6抗體CDH6-Ab-1序列訊息及其CDR序列(根據Kabat劃分)
參照實施例1.1.1方法，將編碼前述抗體VH及VL的核酸序列構建質體，並在Expi293F細胞中進行轉染，獲得表現上清。
1.2抗體純化
利用Protein A親和層析(Cytiva，貨號17549802)，從細胞培養上清中純化上述抗體。Protein A親和柱利用0.5M NaOH洗3-5倍柱體積，接著利用純水清洗3-5倍柱體積。利用如1×PBS(pH 7.4)緩衝體系作為平衡緩衝液對層析柱平衡3-5倍柱體積。細胞上清利用低流速上樣結合，結合完畢後用1×PBS(pH 7.4)洗滌層析柱3-5倍柱體積至紫外吸收回落至基線。利用洗脫液(50mM醋酸緩衝液，pH 3.5)進行樣品洗脫，根據紫外監測收集洗脫峰，洗脫產物利用1M Tris-HCl pH 8.0快速調節pH至5-6暫存。採用超濾、透析或脫鹽柱等置換緩衝液體系，或者利用如分子篩等去除洗脫產物中的聚體成分以提高樣品純度。純化後符合純度要求的蛋白，用0.22μm的濾器(Millipore，貨號SLGVR13SL)進行無菌過濾，SEC-HPLC純度檢測合格後分裝，於-80℃保存備用。
1.3.1 抗體藥物偶聯物的製備方法1
將10倍摩爾當量的TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽)加入2-10mg/ml的抗體溶液(1×PBS，1mM EDTA，pH 7.4)中，37℃混勻培養2小時，再加入15倍摩爾當量的藥物-連接子化合物(由實施例22-45製備或購買獲得)，25℃混勻反應4小時。反應結束 後，用20mM組胺酸pH 6.0緩衝液超濾換液3次，除去殘留未反應的游離小分子，利用SEC-HPLC檢測樣品純度，利用LC-MS質譜檢測偶聯情況。
1.3.2 抗體藥物偶聯物的製備方法2(適用於製備DAR約為4的ADC分子)
將2.5倍摩爾當量的TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽)加入2-10mg/ml的抗體溶液(1×PBS，1mM EDTA，pH 7.4)中，37℃混勻培養2小時，再加入8倍摩爾當量的藥物-連接子化合物(由實施例22-45製備或購買獲得)，25℃混勻反應4小時。反應結束後，用20mM組胺酸、pH為6.0的緩衝液超濾換液3次，除去殘留未反應的游離小分子，利用SEC-HPLC檢測樣品純度，利用LC-MS質譜檢測偶聯情況。
1.4 抗體藥物偶聯物純度檢測(SEC-HPLC)
應用SEC-HPLC法分析待測蛋白樣品，表徵重組蛋白的分子大小均一性，測定重組蛋白的純度。本法所用的HPLC為Agilent 1260，色譜柱為TSKgel G3000SWXL來自Tosoh Bioscience，流動相為200mM磷酸緩衝液pH 7.0包含10%異丙醇，檢測溫度為25℃，流速為0.5mL/min，檢測波長為280nm，目標蛋白上樣量為50μg，分析時間為40分鐘。對SEC-HPLC數據，應用手動積分法分析色譜圖，按照面積歸一法計算蛋白純度，主峰認為係單體，主峰前的色譜峰稱為聚集體，主峰後的色譜峰稱為碎裂體。檢測結果如表4所示，相較於對照ADC7、對照ADC8及對照ADC9，ADC-L26-4(DAR8)、ADC-L27-5(DAR8)、ADC-L22-3(DAR8)及ADC-L23-3的SEC純度顯著改善。
表4 SEC-HPLC法分析抗體藥物偶聯物純度
1.5 抗體藥物偶聯物DAR值檢測(LC-MS質譜)
應用LC-MS質譜分析待測ADC樣品，表徵其DAR值。取~50μg ADC樣品，加入PNGase F 1μl，37℃培養4小時，加入終濃度20mM DTT，37℃ 培養1小時，樣品離心待測。本法所用的HPLC為Thermo Vanquish，色譜柱為Protein BEH SEC(Waters)，流動相為25%乙腈溶液(含0.1%甲酸0.05%TFA)，流速為0.2mL/min，檢測波長為280nm，分析時間為30分鐘。本法所用的高分辨質譜為Q Exactive Plus。質譜參數為Spray Voltage(噴霧電壓)：3.8kV；Capillary Temp(毛細管加熱溫度)：300℃；S-lens：50；Sheath Gas(鞘氣流速)：35arb；Aux Gas(輔助氣流速)：10arb，Probe Heater Temp(輔助氣加熱溫度)：300℃；Full MS Scan range(母離子掃描範圍)：810-3500m/z，Resolution(分辨率)：17500；AGC(目標離子注入數量)：3e6；Maximum IT(最大離子注入時間)：200ms；Microscans：10；In-source CID：20eV。應用質譜數據分析軟體Biopharma Finder 4.1分析質譜原始數據，通用Respect算法去卷積處理，分別計算出輕重鏈質譜峰的分子量訊息及各組分的質譜響應訊號，根據樣品偶聯小分子的相應質譜響應值計算樣品的DAR值。
經計算，各ADC樣品檢測結果如表5所示：
表5 LC-MS質譜法檢測抗體藥物偶聯物DAR值
ADC-L2-1b係根據Trastuzumab與實施例25偶聯製備獲得的ADC樣品。
ADC-L6-1a係根據Trastuzumab與實施例32偶聯製備獲得的ADC樣品。
ADC-L12-1a係根據Trastuzumab與實施例37偶聯製備獲得的ADC樣品。
1.6抗體-藥物偶聯物疏水性檢測(HIC-HPLC)
應用HIC-HPLC法分析待測樣品，表徵其DAR值。本法所用的 HPLC為Agilent 1260，色譜柱為TSKgel Butyl-NPR來自Tosoh Bioscience，流動相A為1.5M硫酸銨、50mM磷酸緩衝液pH 7.0，流動相B為25mM磷酸緩衝液pH 7.0包含20%異丙醇，檢測溫度為25℃，流速為0.5mL/min，檢測波長為280nm。待測樣品先濃縮到1mg/mL，接著加入2M硫酸銨、100mM磷酸緩衝液pH 7.0溶液，最終使硫酸銨的濃度為0.8M，混合均勻，取上清，上樣量為40μg，流動相梯度為在35分鐘時間內，流動相B從0%增加至70%，分析時間為50分鐘。對HIC-HPLC數據，應用手動積分法分析色譜圖，依據抗體的出峰時間判斷疏水性。檢測結果如表6所示：
表6 HIC-HPLC檢測抗體藥物偶聯物疏水性
測試例2 抗體偶聯物的血漿穩定性測試
2.1抗體偶聯物的血漿穩定性測試1
取一定量的ADC樣品，加入到已去除IgG的無菌人血漿中，使得ADC的終濃度係0.5mg/ml，置於37℃培養箱培養0天、3天、7天，培養結束後儲存於-80℃冰箱中。每管加入50μL Protein A填料(MabSelect SuRe)，混勻儀晃動吸附1小時，經過洗滌、洗脫及Tris-HCl中和步驟，獲得培養後的ADC樣品，藉由LC-MS檢測其DAR值變化，以判定樣品的血漿穩定性，測試結果如表7所示。
表7 抗體偶聯藥物的體外血漿穩定性
實驗結果表明，相較於對照ADC，本發明的ADC在血漿培養過程中DAR值未見明顯變化，在血漿中具有更佳的穩定性。
2.2抗體藥物偶聯物的血漿穩定性測試2
取一定量的ADC樣品，加入到已去除IgG的無菌人血漿中，使得ADC的終濃度係0.5mg/ml，置於37℃培養箱培養0天、3天、7天，培養結束後儲存於-80℃冰箱中。每管加入50μL Protein A填料(MabSelect SuRe)，混勻儀晃動吸附1小時，經過洗滌、洗脫及Tris-HCl中和步驟，獲得培養後的ADC樣品，藉由SEC-HPLC檢測純度變化，測試結果如表8所示。
表8 抗體藥物偶聯物的體外血漿穩定性
「-」表示未檢測到。
實驗結果表明，與對照組相比，本發明的ADC在血漿培養過程中SEC單體純度未見明顯變化，在血漿中具有更佳的穩定性。
測試例3：抗體偶聯物的生物學活性及相關性質測試
3.1 抗體藥物偶聯物對腫瘤細胞抗增殖活性測試
3.1.1、抗Her2-ADC對腫瘤細胞抗增殖活性測試
細胞與材料：HER2高表現的人乳腺癌細胞株SKBR3購於ATCC，EMEM培養基(ATCC#30-2003)購於ATCC，McCoy's 5a培養基(Gibco#16600-082)，1640培養基(Gibco#A10491-01)，青黴素-鏈黴素(Gibco#15140-122)，及0.25% Trypsin-EDTA(Gibco#25200-056)購於Gibco公司(美國)，人胰島素(Solarbio# 40112ES25)購於Solarbio公司，96孔盤(Greiner Bio-one#655098)購於康寧公司(美國)，Cell-Titer Glo試劑(Promega#G7568)購於普洛麥格公司(美國)。
細胞培養：SKBR3細胞用含10%胎牛血清+1%青黴素-鏈黴素的McCoy's 5a培養液，在37℃、5%CO2條件下培養，處於對數生長期細胞方可用於實驗。
細胞增殖活性檢測：利用Cell-Titer Glo試劑檢測ADC對SKBR3細胞株增殖的抑制活性。將SKBR3細胞從細胞培養瓶內消化吹散處理，用對應 的新鮮培養基重懸，調整細胞密度。SKBR3細胞為5000個細胞/90μL/孔，接種於96孔盤中，置於37℃、5% CO2條件下培養過夜。用完全培養基稀釋ADC濃度至5000nM，並進行5倍梯度稀釋，共8個濃度梯度，接著轉移10μL ADC稀釋溶液至96孔盤中，即ADC起始終濃度為500nM。96孔盤置於37℃、5% CO2條件下培養3天。加入Cell-Titer Glo試劑，檢測細胞活性。
另設陰性對照組及陽性對照組分別作為Bottom及Top。陰性對照組為不加細胞，僅加同體積的培養基，其他操作與實驗組一致；陽性對照組為不加受試抗體，其他操作與實驗組一致。
數據分析：
計算抑制百分數(% Inhibition)並擬合得到化合物的IC50。
抑制百分數(% Inhibition)=1-100% *(Signal-Bottom)/(Top-Bottom)。
Signal指實驗組的訊號值，Bottom指陰性對照組的平均訊號值，Top指陽性對照組的平均訊號值。
實驗結果：
在本實驗條件下，本發明ADC對Her2高表現的人乳腺癌細胞株SKBR3展現出較強的增殖抑制活性。
表9 ADC抗腫瘤細胞增殖活性(SKBR3細胞株)
ADC-L2-1b係根據Trastuzumab與實施例25偶聯製備獲得的ADC樣品。
ADC-L6-1a係根據Trastuzumab與實施例32偶聯製備獲得的ADC樣品。
3.1.2、抗Her2-ADC對腫瘤細胞NCI-N87抗增殖活性測試
細胞與材料：HER2高表現的人胃癌細胞株NCI-N87購於中國科學院細胞庫，1640培養基(Gibco#A10491-01)，青黴素-鏈黴素(Gibco#15140-122)，及0.25% Trypsin-EDTA(Gibco#25200-056)購於Gibco公司(美國)，96孔盤(Greiner Bio-one#655098)購於康寧公司(美國)，Cell-Titer Glo試劑(Promega#G7568)購於普洛麥格公司(美國)。
細胞培養：NCI-N87細胞用含10%胎牛血清+1%青黴素-鏈黴素的1640培養液。細胞在37℃、5%CO2條件下培養，處於對數生長期細胞方可用於實驗。
細胞增殖活性檢測：利用Cell-Titer Glo試劑檢測ADC對NCI-N87細胞株增殖的抑制活性。將NCI-N87細胞從細胞培養瓶內消化吹散處理，用對應的新鮮培養基重懸，調整細胞密度。NCI-N87細胞為6000個細胞/90μL/孔，接種於96孔盤中，置於37℃、5% CO2條件下培養過夜。用完全培養基稀釋ADC濃度至5000nM，並進行5倍梯度稀釋，共8個濃度梯度，接著轉移10μL ADC稀釋溶液至96孔盤中，即ADC起始終濃度為500nM。96孔盤置於37℃、 5% CO2條件下培養3天。加入Cell-Titer Glo試劑，檢測細胞活性。
另設陰性對照組及陽性對照組分別作為Bottom及Top。陰性對照組為不加細胞，僅加同體積的培養基，其他操作與實驗組一致；陽性對照組為不加受試抗體，其他操作與實驗組一致。
數據分析：
計算抑制百分數(% Inhibition)並擬合得到化合物的IC50。
抑制百分數(% Inhibition)=1-100% *(Signal-Bottom)/(Top-Bottom)。
Signal指實驗組的訊號值，Bottom指陰性對照組的平均訊號值，Top指陽性對照組的平均訊號值。
Graphpad曲線擬合，計算抑制分數為50%時的藥物濃度，作為絕對IC50。
實驗結果：
在本實驗條件下，本發明ADC對Her2高表現的人胃癌細胞株NCI-N87展現出較強的增殖抑制活性。
表10 ADC抗腫瘤細胞增殖活性(NCI-N87細胞株)
ADC-L2-1b係根據Trastuzumab與實施例25偶聯製備獲得的ADC樣品。
ADC-L12-1a係根據Trastuzumab與實施例37偶聯製備獲得的ADC樣品。
3.1.3 抗Her2-ADC對腫瘤細胞SKBR3抗增殖活性測試
細胞與材料：Her2高表現的人乳腺癌細胞株SKBR3購於ATCC，McCoy's 5a培養基(Gibco#16600-082)，青黴素-鏈黴素(Gibco#15140-122)，及0.25% Trypsin-EDTA(Gibco#25200-056)購於Gibco公司(美國)，96孔盤(Greiner Bio-one#655098)購於康寧公司(美國)，Cell-Titer Glo試劑(Promega#G7568)購於普洛麥格公司(美國)。
細胞培養：SKBR3細胞用含10%胎牛血清+1%青黴素-鏈黴素的McCoy's 5a培養液，在37℃、5%CO2條件下培養，處於對數生長期細胞方可用於實驗。
細胞增殖活性檢測：利用Cell-Titer Glo試劑檢測ADC對SKBR3細胞株增殖的抑制活性。將SKBR3細胞從細胞培養瓶內消化吹散處理，用對應的新鮮培養基重懸，調整細胞密度。SKBR3細胞為5000個細胞/90μL/孔，接種於96孔盤中，置於37℃、5% CO2條件下培養過夜。用完全培養基稀釋ADC濃度至100nM，並進行3倍梯度稀釋，共8個濃度梯度，接著轉移10μL ADC稀釋 溶液至96孔盤中，即ADC起始終濃度為10nM。96孔盤置於37℃、5% CO2條件下培養3天。加入Cell-Titer Glo試劑，檢測細胞活性。
另設陰性對照組及陽性對照組分別作為Bottom及Top。陰性對照組為不加細胞，僅加同體積的培養基，其他操作與實驗組一致；陽性對照組為不加受試抗體，其他操作與實驗組一致。
數據分析：
計算抑制百分數(% Inhibition)並擬合得到化合物的IC50。
抑制百分數(% Inhibition)=1-100% *(Signal-Bottom)/(Top-Bottom)。
Signal指實驗組的訊號值，Bottom指陰性對照組的平均訊號值，Top指陽性對照組的平均訊號值。
實驗結果：
在本實驗條件下，本發明ADC對Her2高表現的人乳腺癌細胞株SKBR3展現出較強的增殖抑制活性。
表11 ADC抗腫瘤細胞增殖活性(SKBR3細胞株)
3.1.4、抗Her2-ADC對腫瘤細胞NCI-N87抗增殖活性測試
細胞與材料：Her2高表現的人胃癌細胞株NCI-N87購於中國科學院細胞庫，1640培養基(Gibco#A10491-01)，青黴素-鏈黴素(Gibco#15140- 122)，及0.25% Trypsin-EDTA(Gibco#25200-056)購於Gibco公司(美國)，96孔盤(Greiner Bio-one#655098)購於康寧公司(美國)，Cell-Titer Glo試劑(Promega#G7568)購於普洛麥格公司(美國)。
細胞培養：NCI-N87細胞用含10%胎牛血清+1%青黴素-鏈黴素的1640培養液。細胞在37℃、5%CO2條件下培養，處於對數生長期細胞方可用於實驗。
細胞增殖活性檢測：利用Cell-Titer Glo試劑檢測ADC對NCI-N87細胞株增殖的抑制活性。將NCI-N87細胞從細胞培養瓶內消化吹散處理，用對應的新鮮培養基重懸，調整細胞密度。NCI-N87細胞為3000個細胞/90μL/孔，接種於96孔盤中，置於37℃、5% CO2條件下培養過夜。用完全培養基稀釋ADC濃度至250nM，並進行4倍梯度稀釋，每個ADC共8個濃度梯度，接著轉移10μL ADC稀釋溶液至96孔盤中，即ADC起始終濃度為25nM。96孔盤置於37℃、5% CO2條件下培養5天。加入Cell-Titer Glo試劑，檢測細胞活性。
另設陰性對照組及陽性對照組分別作為Bottom及Top。陰性對照組為不加細胞，僅加同體積的培養基，其他操作與實驗組一致；陽性對照組為不加受試抗體，其他操作與實驗組一致。
數據分析：
計算抑制百分數(% Inhibition)並擬合得到化合物的IC50。
抑制百分數(% Inhibition)=1-100% *(Signal-Bottom)/(Top-Bottom)。
Signal指實驗組的訊號值，Bottom指陰性對照組的平均訊號值，Top指陽性對照組的平均訊號值。
Graphpad曲線擬合，計算抑制分數為50%時的藥物濃度，作為絕對IC50。
實驗結果：
在本實驗條件下，本發明ADC對Her2高表現的人胃癌細胞株NCI-N87展現出較強的增殖抑制活性。
表12 ADC抗腫瘤細胞增殖活性(NCI-N87細胞株)
3.1.5、抗EGFR-cMet-ADC對腫瘤細胞抗增殖活性測試
細胞與材料：EGFR中表現、cMEt中表現的HCT116細胞購自ATCC，貨號CCL-247，培養基為含10%FBS的McCoy's 5a培養基。EGFR低表現、cMEt低表現的Capan-1細胞購自南京科佰生物科技有限公司，貨號CBP60543，培養基為含20%FBS的IMDM培養基，EGFR高表現、cMEt高表現的PC9-hEGFR-Del19-T790M-C797S(PC9-DTC)細胞由中美冠科生物技術(太倉)有限公司構建，培養基為含10%FBS及0.5μg/ml嘌呤黴素的RPMI1640培養基。EGFR高表現cMet中表現的HCC827細胞購自ATCC，貨號CRL-2868，培養基為含10%FBS的RPMI 1640培養基。
細胞增殖活性檢測：將HCT116、Capan-1、PC9-DTC及HCC827 細胞用胰酶(購自Gibco，貨號25200072)消化後，用各自對應培養基重懸，調整細胞密度。將細胞分別接種於96孔盤(購自corning，貨號3610)中，細胞密度如下：HCT116細胞0.6×103個細胞/90μL、Capan-1細胞4.0×103個細胞/90μL，PC9-DTC細胞1.8×103個細胞/90μL，HCC827細胞3.0×103個細胞/90μL，並置於37℃，5% CO2培養箱中培養過夜。第二天，按照實驗設計用完全培養基梯度稀釋抗體偶聯藥物，轉移10μL稀釋後的抗體偶聯藥物至對應孔盤中。細胞板置於37℃，5% CO2培養箱中培養5天。5天後，每孔中加入50μL KeyTec®Luminescent Cell Viability Detection Kit檢測試劑(購自vkey-bio，貨號A2010003N，使用方法參照產品說明書)，在Envision儀器(購自PerkinElmer，型號Envision 2105)上讀取螢光值檢測細胞活力。
另設陽性對照組及陰性對照組作為殺傷0%及100%對照。陽性對照組為不加受試藥物，其他操作與實驗組一致結果，陰性對照組為不加細胞，僅加同體積的培養基，其他操作與實驗組一致。細胞增殖抑制率率計算公式：抑制率=((陽性對照-樣品孔讀值)/(陽性對照-陰性孔讀值))×100%，藉由該公式獲得對應藥物在不同細胞的抑制率，其中最大抑制率用Emax表示。採用GraphPad Prism 9.0軟體製圖並計算IC50。
結果如表13所示。抗EGFR-cMet-ADC藥物在體外對表現EGFR及cMET的腫瘤細胞具有較好的增殖抑制活性。
表13 對具有不同EGFR及cMET表現水準的腫瘤細胞增殖的抑制作用
3.2 抗EGFR-cMet-ADC對體內藥效評價
3.2.1. 抗EGFR-cMet-ADC在HCC827皮下瘤模型的藥效評價
實驗試劑：
肺癌HCC827細胞：上海中科院，EGFR，cMet高表現
RPMI-1640培養液：Gbico；Cat No.：A104910
胎牛血清：Gibco；Cat No.：10099-141C
0.25%胰酶-EDTA：Gibco,Cat No.：25200-072
D-PBS(無鈣鎂離子磷酸鹽緩衝液)：Hyclone,Cat.No.：SH30256.01
Matrigel：Corning,Cat.No.：356237
實驗方法：
動物訊息：Balb/c nude小鼠，雌性，5-6周，體重約14-20克，動物購自北京維通利華生物技術有限公司，將小鼠飼養在SPF級的環境中，每個籠位單獨送排風，所有動物都可以自由獲取標準認證的商業實驗室飲食及自由飲水。
細胞培養：肺癌HCC827細胞株體外培養，培養條件為RPMI-1640(細胞培養液)中加入10%胎牛血清，1% Pen Strep，37℃、5%CO2培養箱。一周兩次用0.25%胰酶-EDTA消化液進行常規消化處理傳代。當細胞飽和度為80%-90%，數量達到要求時，收取細胞，計數。
細胞接種：將0.2ml/(含1×107)HCC827細胞懸液(RPMI-1640：Matrigel，體積比為1：1)皮下接種於每隻小鼠的腰背部。在接種細胞後 第8天，依據腫瘤體積隨機分組給藥，分組當天為Day 0(第0天)。
給藥：ADC2-L19-1、對照ADC10及對照ADC-ISO-2給藥劑量均為1.5mg/kg，尾靜脈(Intravenous Injections，IV)單次給藥。每組6隻小鼠。
腫瘤測量及實驗指標：
每週兩次用遊標卡尺測量腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為：V=0.5a x b2，a及b分別表示腫瘤的長徑及短徑。每週兩次測量小鼠體重。
化合物的抑瘤療效用腫瘤生長抑制率TGI(%)來評價。TGI(%)=〔(1-(某處理組給藥結束時平均瘤體積-該處理組開始給藥時平均瘤體積)/(溶劑對照組治療結束時平均瘤體積-溶劑對照組開始治療時平均瘤體積)〕x 100%。
實驗結果：
見表14，圖1及圖2。
表14. HCC827皮下瘤模型腫瘤體積
實驗結論：
在小鼠皮下移植瘤HCC827模型中，本發明化合物ADC2-L19-1在1.5mg/kg尾靜脈單次給藥對腫瘤生長具有顯著抑制作用(P<0.0001)；且顯著優於等劑量的對照ADC10及對照ADC-ISO-2(P<0.05，P<0.0001)。本發明ADC分子在上述試劑量下未發現影響小鼠體重，亦未引起任何小鼠死亡，小鼠可以耐受。
3.2.2. 抗EGFR-cMet-ADC在HCT116皮下瘤模型藥效評價
實驗試劑：
腸癌HCT116細胞：ATCC
McCOY'5A培養液：Gbico；Cat No.：16600-082
胎牛血清：Gibco；Cat No.：10099-141C
0.25%胰酶-EDTA：Gibco,Cat No.：25200-072
D-PBS(無鈣鎂離子磷酸鹽緩衝液)：Hyclone,Cat.No.：SH30256.01
Matrigel：Corning,Cat.No.：356237
實驗方法：
動物訊息：Balb/c nude小鼠，雌性，5-6周，體重約14-20克，動物購自北京維通利華生物技術有限公司，將小鼠飼養在SPF級的環境中，每 個籠位單獨送排風，所有動物都可以自由獲取標準認證的商業實驗室飲食及自由飲水。
細胞培養：腸癌HCT116細胞株體外培養，培養條件為McCOY'5A(細胞培養液)中加入10%胎牛血清，1% Pen Strep，37℃、5%CO2培養箱。一周兩次用0.25%胰酶-EDTA消化液進行常規消化處理傳代。當細胞飽和度為80%-90%，數量達到要求時，收取細胞，計數。
細胞接種：將0.1ml/(含2.5×106)HCT116細胞懸液(RPMI-1640：Matrigel，體積比為1：1)皮下接種於每隻小鼠的腰背部。在接種細胞後第7天，依據腫瘤體積隨機分組給藥，分組當天為Day 0(第0天)。
給藥：對照ADC10及ADC2-L19-1的給藥劑量選用1.5mg/kg，在day0(第0天)，day14(第14天)尾靜脈(Intravenous Injections，IV)給藥。每組6隻小鼠。
腫瘤測量及實驗指標：
每週兩次用遊標卡尺測量腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為：V=0.5a x b2，a及b分別表示腫瘤的長徑及短徑。每週兩次測量小鼠體重。
化合物的抑瘤療效用腫瘤生長抑制率TGI(%)來評價。TGI(%)=〔(1-(某處理組給藥結束時平均瘤體積-該處理組開始給藥時平均瘤體積)/(溶劑對照組治療結束時平均瘤體積-溶劑對照組開始治療時平均瘤體積)〕x 100%。
實驗結果：
見表15，圖3及圖4。
表15. HCT116皮下瘤模型腫瘤體積
實驗結論：
在小鼠皮下移植瘤HCT116模型中，對照ADC10及ADC2-L19-1在1.5mg/kg尾靜脈給藥兩次(day0，day14)對腫瘤生長均具有顯著抑制作用(P<0.01，P<0.0001)；且ADC2-L19-1顯著優於對照ADC10(P<0.05)。本發明ADC分子在上述試劑量下未發現影響小鼠體重，亦未引起任何小鼠死亡，小鼠可以耐受。
3.2.3. 抗EGFR-cMet-ADC在PC9-6皮下瘤模型藥效評價
實驗試劑：
人肺癌PC9-6細胞：(PC9-6為中美冠科由PC9母細胞改造，hEGFR-Del19-T790M-C797S)
RPMI-1640培養液：Gbico；Cat No.：A104910
胎牛血清：Gibco；Cat No.：10099-141C
0.25%胰酶-EDTA：Gibco,Cat No.：25200-072
D-PBS(無鈣鎂離子磷酸鹽緩衝液)：Hyclone,Cat.No.：SH30256.01
Matrigel：Corning,Cat.No.：356237
實驗方法：
動物訊息：Balb/c nude小鼠，雌性，5-6周，體重約14-20克，動物購自北京維通利華生物技術有限公司，將小鼠飼養在SPF級的環境中，每個籠位單獨送排風，所有動物都可以自由獲取標準認證的商業實驗室飲食及自由飲水。
細胞培養：人肺癌PC9-6細胞株體外培養，培養條件為RPMI-1640(細胞培養液)中加入10%胎牛血清，1% Pen Strep，0.5μg/ml Puromycin，37℃、5%CO2培養箱。一周兩次用0.25%胰酶-EDTA消化液進行常規消化處理傳代。當細胞飽和度為80%-90%，數量達到要求時，收取細胞，計數。
細胞接種：將0.1ml/(含5×106)PC9-6細胞懸液(RPMI-1640：Matrigel，體積比為1：1)皮下接種於每隻小鼠的腰背部。在接種細胞後第7天，依據腫瘤體積隨機分組給藥，分組當天為Day0(第0天)。
給藥：對照ADC10及ADC2-L19-1的給藥劑量選用1.5mg/kg，在分組後day0(第0天)，day8(第8天)，day14(第14天)尾靜脈(Intravenous Injections，IV)給藥。每組6隻小鼠。
腫瘤測量及實驗指標：
每週兩次用遊標卡尺測量腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為： V=0.5a x b2，a及b分別表示腫瘤的長徑及短徑。每週兩次測量小鼠體重。
化合物的抑瘤療效用腫瘤生長抑制率TGI(%)來評價。TGI(%)=〔(1-(某處理組給藥結束時平均瘤體積-該處理組開始給藥時平均瘤體積)/(溶劑對照組治療結束時平均瘤體積-溶劑對照組開始治療時平均瘤體積)〕x 100%。
實驗結果：
見表16，圖5及圖6。
表16. PC9-6皮下瘤模型腫瘤體積
實驗結論：
小鼠皮下移植瘤PC9-6模型中，在1.5mg/kg尾靜脈給藥3次(day0，day8，day14)的情況下，本發明化合物ADC2-L19-1及對照ADC10對腫瘤生長均具有顯著抑制作用(P<0.0001，P<0.0001)；且ADC2-L19-1顯著優於對照ADC10(P<0.05)。本發明ADC分子在上述給藥試劑量下未發現影響小鼠體重，亦未引起任何小鼠死亡，小鼠可以耐受。
3.3 CDH-6 ADC對PA-1皮下瘤模型藥效評價
動物訊息：BALB/c nude小鼠，雌性，6-8周，體重約16-22克，動物購自北京維通利華生物技術有限公司，將小鼠飼養在SPF級的環境中，每個籠位單獨送排風，所有動物都可以自由獲取標準認證的商業實驗室飲食及自由飲水。
細胞訊息：中表現人CDH6的人卵巢癌PA-1細胞株(來自南京科佰)體外培養，培養條件為MEM(Gbico；Cat No.：32561-037)中加入10%胎牛血清(Gbico；Cat No.：10091-148)，1% Pen Strep，1% NEAA，1mM丙酮酸鈉(Gbico；Cat No.：11360-070)，37℃、5%CO2培養箱。一週一次用versene消化液(Gbico；Cat No.：15040-066)進行常規消化處理傳代。當細胞飽和度為80%-90%，數量達到要求時，收取細胞，計數。
細胞接種：將0.2ml/(含1×107)PA-1細胞懸液(MEM：Matrigel，體積比為1：1)皮下接種於每隻小鼠的腋下。接種細胞後第14天，依據腫瘤體積隨機分組給藥，分組當天為Day0(第0天)。
給藥：ADC3-L19-1、ADC3-L12-1、對照ADC11、對照ADC-ISO-1及對照ADC-ISO-2的給藥劑量為1mg/kg，在Day0進行尾靜脈單次給藥， 每組6隻小鼠。
腫瘤測量及實驗指標：每週兩次用遊標卡尺測量腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為：V=0.5a x b2，a及b分別表示腫瘤的長徑及短徑。每週兩次測量小鼠體重。
化合物的抑瘤療效用腫瘤生長抑制率TGI(%)來評價。TGI(%)=〔(1-(某處理組給藥結束時平均瘤體積-該處理組開始給藥時平均瘤體積)/(溶劑對照組治療結束時平均瘤體積-溶劑對照組開始治療時平均瘤體積)〕x 100%。
實驗結果：如表17及圖7所示，在小鼠皮下移植瘤PA-1模型中，與溶劑對照組相比，對照ADC11，ADC3-L19-1，ADC3-L12-1在1mg/kg劑量單次尾靜脈給藥對腫瘤生長均具有顯著抑制作用(P<0.0001，P<0.0001，P<0.0001)；相比於對照ADC11，ADC3-L19-1及ADC3-L12-1的Day 30(第30天)的TGI更優，顯現出更大的抑瘤潛力。本發明ADC分子在上述給藥試劑量下未發現影響小鼠體重，亦未引起任何小鼠死亡，小鼠可以耐受。
表17. PA-1皮下瘤模型腫瘤體積
〔相關申請的交叉引用〕
本發明主張2023年11月14日向中國國家知識產權局提交的第202311515509.5號專利申請以及2024年02月06日向中國國家知識產權局提交的第202410173706.1號專利申請的權益及優先權，在此將其等的全部內容以援引的方式整體併入本說明書中。
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Claims (23)

  1. 一種配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其特徵係其結構通
    式為Pc-(L-D)n，
    其中，
    Pc為配體單元；
    D為藥物單元；
    L為以下結構的連接子單元，a端與配體單元連接，
    其中，
    X1、X2、X3各自獨立地選自N或CRa1，且X1、X2、X3中的至少一個選自N，該Ra1選自H、鹵素、CN、C1-C3烷基、C2-C3烯基、C2-C3炔基、C3-C6環烷基或4-7元雜環基；
    n1、n2各自獨立地選自0、1、2；
    X4、X5各自獨立地選自C(=O)、C(Rb1)(Rb2)、O、S、S(=O)、S(=O)2、NRb3或其等的任意組合，該Rb1、Rb2、Rb3各自獨立地選自H或Rc1，或者Rb1、Rb2與其等連接的碳原子共同形成C3-C6環烷基或4-7元雜環基，該C3-C6環烷基或4-7元雜環基任意地被一個或複數個Rc1取代；
    每一個Rc1獨立地選自鹵素、CN、C1-C6烷基、C3-C6環烷基或者親水性基團；
    La選自或，Rb4、Rb5各自獨立地選自H、鹵素、CN、C1-C3烷基、OH、O(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C3烷基)或N(C1-C3烷基)2，或者Rb4、Rb5與其等連接的碳原子共同形成C3-C6環烷基或4-7元雜環基，m4選自1~10的整數，La的c端與Lb連接；
    Lb選自化學鍵或，m5選自0~24的整數，m6選自1~10的整數，每一個Rb6、Rb7、Rb8各自獨立地選自H或Rc6，該Rc6選自鹵素、CN、C1-C6烷基、C3-C6環烷基或者親水性基團，Lb的d端與Lc連接；
    Lc選自Y1-Y2-Y3，Y1選自化學鍵或，m7選自1~6的整數，Y2選自由2-10個胺基酸構成的肽殘基，Y3選自或，Lc的b端與藥物單元D連接；
    n為1~16的實數。
  2. 如請求項1所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，X1、X2均選自N，X3選自CH。
  3. 如請求項1或2所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，n1、n2各自獨立地選自0或1；或者，n1選自1，n2選自0。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，X4、X5各自獨立地選自C(=O)或C(Rb1)(Rb2)，該Rb1、Rb2各自獨立地選自H或Rc1，或者Rb1、Rb2與其等連接的碳原子共同形成C3-C6環烷基或4-7元 雜環基，該C3-C6環烷基或4-7元雜環基任意地被一個或複數個Rc1取代；或者，X4選自C(=O)，X5選自C(Rb1)(Rb2)，該Rb1、Rb2各自獨立地選自H或Rc1，或者Rb1、Rb2與其等連接的碳原子共同形成C3-C6環烷基或4-7元雜環基，該C3-C6環烷基或4-7元雜環基任意地被一個或複數個Rc1取代；或者，
    X4選自C(=O)，X5選自C(Rb1)(Rb2)，該Rb1、Rb2各自獨立地選自H或Rc1，或者Rb1、Rb2與其等連接的碳原子共同形成C4-C6環烷基或4-6元含有1個O原子或1個N原子的雜環基，該4-6元含有1個O原子或1個N原子的雜環基任意地被一個Rc1取代。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，Lb選自化學鍵、或，其中，m5選自1~16的整數，或者，m5選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16，m6選自1~6的整數，或者，m6選自1、2、3、4、5或6，或者，m6為2，Rb7、Rb8各自獨立地選自H或Rc6，Lb的d端與Lc連接；或者，
    Lb選自化學鍵或，其中，Rb7為H，且Rb8為Rc6，Lb的d端與Lc連接。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，每一個Rc1及Rc6各自獨立地選自鹵素、CN、C1-C6烷基、C3-C6環烷基或者親水性基團，該親水性基團包含一個或複數個以下原子團或結構片 段：C(=O)、OH、O(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C3烷基)、N(C1-C3烷基)2、C1-C4烷基-O、NHC(=O)、N(CH3)C(=O)、C(=O)NH2、S(=O)2NH2、C(=O)NH(C1-C3烷基)、S(=O)2NH(C1-C3烷基)、C(=O)N(C1-C3烷基)2、S(=O)2N(C1-C3烷基)2、、、；或者，
    每一個Rc1及Rc6獨立地選自鹵素、CN、C1-C6烷基、C3-C6環烷基或者W1-W2-W3-W4-W5，每一個W1、W2、W3、W4各自獨立地選自化學鍵、A-(C1-C4烷基-O)m1或[A-(CRd1Rd2)m2-NRd3]m3-B，每一個A及B獨立地選自化學鍵、C1-C10亞烷基、C3-C6亞環烷基、4-7元亞雜環基、O、S、NRd4、C=O、C(=O)NRd5、S(=O)2、S(=O)2NRd6、S(=O)(=NRd7)、或其等的任意組合，該Rd1、Rd2、Rd3、Rd4、Rd5、Rd6、Rd7、Rd8各自獨立地選自H、C1-C6烷基、C3-C6環烷基、4-7元雜環基或(C1-C4烷基-O)k1-C1-C6烷基，該C1-C6烷基、C3-C6環烷基或4-7元雜環基任意被鹵素、CN、OH、O(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C3烷基)、N(C1-C3烷基)2、C(=O)NH2、NHC(=O)NH2或COOH取代，m1選自0~30的整數，m2選自1~5的整數，m3、k1各自獨立地選自1~30的整數，W5選自H、C1-C6烷基、C3-C6環烷基、4-7元雜環基、OH、O(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C3烷基)、N(C1-C3烷基)2、C(=O)NH2、S(=O)2NH2、C(=O)NH(C1-C3烷基)、S(=O)2NH(C1-C3烷基)、C(=O)N(C1-C3烷基)2、S(=O)2N(C1-C3烷基)2、、或；或者，
    每一個Rc1及Rc6獨立地選自W1-W2-W3-W4-W5，W1、W2均選自化學鍵，W3選自化學鍵或A-(C1-C4烷基-O)m1，W4選自A-(C1-C4烷基-O)m1或[A-(CRd1Rd2)m2- NRd3]m3-B，每一個A及B獨立地選自化學鍵、C1-C10亞烷基、C3-C6亞環烷基、4-7元亞雜環基、O、S、NRd4、C=O、C(=O)NRd5、S(=O)2、S(=O)2NRd6、S(=O)(=NRd7)、或其等的任意組合，該Rd1、Rd2、Rd3、Rd4、Rd5、Rd6、Rd7、Rd8各自獨立地選自H、C1-C6烷基、C3-C6環烷基、4-7元雜環基或(C1-C4烷基-O)k1-C1-C6烷基，該C1-C6烷基、C3-C6環烷基或4-7元雜環基任意被鹵素、CN、OH、O(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C3烷基)、N(C1-C3烷基)2、C(=O)NH2、NHC(=O)NH2或COOH取代，m1選自0~30的整數，m2選自1~5的整數，m3、k1各自獨立地選自1~30的整數，W5選自H、C1-C6烷基、C3-C6環烷基、4-7元雜環基、OH、O(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C3烷基)、N(C1-C3烷基)2、C(=O)NH2、S(=O)2NH2、C(=O)NH(C1-C3烷基)、S(=O)2NH(C1-C3烷基)、C(=O)N(C1-C3烷基)2、S(=O)2N(C1-C3烷基)2、、或；或者，
    每一個Rc1獨立地選自A-(C1-C4烷基-O)m1-W5或[C(=O)-CH2-NRd3]m3-B-W5，A選自化學鍵或C=O，Rd3選自C1-C6烷基，B選自C1-C10亞烷基、C=O或其等的組合C(=O)-C1-C10亞烷基，W5選自C1-C6烷基、C(=O)NH2或S(=O)2NH2，m1及m3獨立地選自1~24的整數；或者，
    每一個Rc1獨立地選自、
    ；或者，
    每一個Rc1獨立地選自、
    ；或者，
    每一個Rc6獨立地選自W1-W2-W3-W4-W5，W1、W2均選自化學鍵，W3選自化學鍵或A-(C1-C4烷基-O)m1，W4選自A-(C1-C4烷基-O)m1或[C(=O)-CH2-NRd3]m3-B，每一個A及B獨立地選自化學鍵、C1-C6亞烷基、NRd4、C(=O)、C(=O)NH、S(=O)2、S(=O)2NRd6、S(=O)(=NRd7)、或其等的任意組合，該Rd1、Rd2、Rd3、Rd4、Rd6、Rd7、Rd8各自獨立地選自H、C1-C6烷基或(C1-C4烷基-O)k1-C1-C6烷基，m1選自0~24的整數，m2選自1~5的整數，m3、k1各自獨立地選自1~24的整數，W5選自C1-C6烷基、NH2、或；或者，
    Rc6選自、、
  7. 如請求項1至6中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，La選自或，Rb4、Rb5各自獨立地選自H，m4選自1~6的整數，La的c端與Lb連接；或者，La選自，Rb4、Rb5各自獨立地選自H，m4選自1~6的整數，La的c端與Lb連接。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，Lc選自Y1-Y2-Y3，Y1選自化學鍵或，Y2選自Val-Cit、Val-Ala、Gly-Gly-Phe-Gly、Ala-Ala-Ala的二肽、三肽或四肽殘基，Y3選自或，Lc的b端與藥物單元D連接；或者，
    Lc選自、、
    Lc的b端與藥物單元D連接。
  9. 如請求項1所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，連接子單元L選自以下結構：
    或
  10. 如請求項1至9中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，該藥物單元D選自細胞毒性藥物及蛋白降解劑。
  11. 如請求項10所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，該細胞毒性藥物選自微管蛋白抑制劑、DNA損傷劑或拓撲異構酶抑制劑，該微管蛋白抑制劑例如為海兔毒素(dolastatin)類、澳瑞他汀(auristatin)類、美登素(maytansine)類、微管溶素(Tubulysins)類或隱黏菌素(cryptomycins)類藥物，該DNA損傷劑例如為PBD類、杜卡黴素(duocarmycin)類或卡齊黴素(calicheamicin)類藥物，該拓撲異構酶抑制劑例如為喜樹鹼類藥物；或者，
    該細胞毒性藥物選自喜樹鹼、羥基喜樹鹼、9-胺基喜樹鹼、SN-38、伊立替康、拓撲替康、貝洛替康、盧比替康、放線菌素D、多柔比星、多卡米星，柔紅黴素、米托蒽醌、鬼臼毒素、依託泊苷、長春新鹼、長春鹼、紫杉醇、多西他賽、卡巴他賽、美登素、類美登素、DM1、DM3、DM4、卡齊黴素、MMAE、MMAF及Tubulysin D；或者，
    該細胞毒性藥物選自拓撲異構酶I抑制劑或澳瑞他汀類藥物；或者，
    該蛋白降解劑選自GSPT1蛋白降解劑；或者，
    該藥物單元D選自、、
    或者，
    該藥物單元D選自、、
  12. 如請求項1所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，該通式為Pc-(L-D)n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽選自以下化合物或其藥學上可接受的鹽：
  13. 如請求項1至12中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，該配體單元Pc選自多肽、抗體或其抗原結合片段；或者，該配體單元Pc特異性結合選自以下群組的一種或多種抗原：HER2(ErbB2)、p95HER2、HER3(ErbB3)、CD3、CD16、ROR1、DLL3、CDH6、CD70、CD5、CD20、BCMA、EGFR、VEGF、Trop-2、Claudin6、Claudin18.2、c-MET、CD30、MUC1、Nectin-4、CD22、CD74、CD19、CD79b、MSLN、TOPO2、EpCAM、CEACAM-5、Mesothelin、PD-L1、PSMA、ROR1、ROR2、CD25、CD33、CD123、FLT3、CD174、CD166、CD326、CD71、LIV-1、MUC16、ENPP3、TDGF1、ETBR、TIM1、TIM3、LRRC15、CanAg/AFP、FAP、SLITRK6、KIT/CD117、STEAP1、SLAMF7/CS1、NaPi2B/SLC34A2、GPNMB、AXL、B7-H3(CD276)、PTK7/CCK4、PRLR、EFNA4、5T4、NOTCH3、CD142、CA6、GPR20、EphA2、LYPD3、FGFR2、FGFR3、FRα、CEACAMs、GCC、IntegrinAv、CAIX、P-cadherin、GD3、cadherin6、LAMP1、CD56、CD37、CD47、CD138或CD352。
  14. 如請求項1至13中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，n選自1-8的實數；或者，n選自2-8的實數；或者，n選自6-8的實數。
  15. 一種式(L)所示的連接子單元，用於連接配體單元及藥物單元得到配體-藥物偶聯物，其特徵係
    其中，X1、X2、X3、X4、X5、La、Lb、Lc、n1及n2如請求項1至8中任一項請求項所定義，L的a端與配體單元連接，b端與藥物單元連接。
  16. 如請求項15所述之連接子單元，其中，該式(L)所示的連接子單元選自以下結構單元：
    或
  17. 一種式(II)所示的藥物-連接子化合物或其藥學上可接受的鹽，其特徵係
    其中，X1、X2、X3、X4、X5、La、Lb、Lc、n1、n2如請求項1至8中任一項請求項所定義，以及該藥物單元D如請求項10至11中任一項請求項所定義；
    X選自不存在、O或NRe1；
    R1選自N(Re2)(Re3)、C1-C10烷基、C3-C10環烷基、4-14元雜環基、C6-C10芳基或5-10元雜芳基；該C1-C10烷基、C3-C10環烷基、4-14元雜環基、C6-C10芳基或5-10元雜芳基任意被一個或複數個Rf取代，每一個Rf獨立地選自鹵素、CN、=O、C1-C3烷基、OH、O(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C3烷基)或N(C1-C3烷基)2；
    Re1、Re2、Re3各自獨立地選自H、C1-C6烷基、C3-C6環烷基或4-7元雜環基。
  18. 如請求項17所述之藥物-連接子化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，
    X選自O；及/或
    R1選自C1-C6烷基或C3-C6環烷基，該C1-C6烷基或C3-C6環烷基任意被一個或複數個Rf取代；或者，R1選自甲基、三級丁基或環戊基。
  19. 如請求項17所述之藥物-連接子化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，該式(II)所示的藥物-連接子化合物或其藥學上可接受的鹽選自以下化合物或其藥學上可接受的鹽：
  20. 一種藥物組成物，其特徵係其包含請求項1至14中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的輔料。
  21. 一種治療哺乳動物腫瘤的方法，其特徵係包含對需要該治療的哺乳動物，理想為人類，給予治療有效量的請求項1至14中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，或給予治療有效量的請求項20所述之藥物組成物。
  22. 一種請求項1至14中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或請求項20所述之藥物組成物在製備治療腫瘤的藥物中的用途。
  23. 如請求項1至14中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，或如請求項20所述之藥物組成物，其中，該配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，或者該藥物組成物，其係用於治療腫瘤。
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CN113549127A (zh) * 2020-04-24 2021-10-26 上海翰森生物医药科技有限公司 长春新碱及其抗体偶联物、其制备方法和医药用途
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