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TWI878605B - 抑制肌萎縮基因表現之雙歧乳酸桿菌 - Google Patents

抑制肌萎縮基因表現之雙歧乳酸桿菌 Download PDF

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TWI878605B TW110132582A TW110132582A TWI878605B TW I878605 B TWI878605 B TW I878605B TW 110132582 A TW110132582 A TW 110132582A TW 110132582 A TW110132582 A TW 110132582A TW I878605 B TWI878605 B TW I878605B
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Abstract

本發明之目的在於提供一種抑制肌萎縮基因表現且可適用於飲食品之源自嬰兒腸內之雙歧乳酸桿菌、及含有該雙歧乳酸桿菌之飲食品。 本發明提供一種抑制肌萎縮基因表現之短雙歧桿菌N106株(NITE BP-03231)。肌萎縮基因為MuRF1基因。又，本發明提供一種含有該雙歧乳酸桿菌之飲食品。藉此，即便為運動困難者，亦可藉由飲食來預防肌萎縮，可提高QOL。

Description

抑制肌萎縮基因表現之雙歧乳酸桿菌
本發明係關於一種抑制肌萎縮基因表現之源自嬰兒腸內之雙歧乳酸桿菌之菌株、及含有該菌體之飲料、食品。尤其是關於一種短雙歧桿菌。
世界衛生組織(WHO)定義：若65歲以上之高齡者占總人口之比例為7%～14%則為高齡化社會，若為14%〜21%則為高齡社會，若為21%以上則為超高齡社會。根據2019年日本總務省公佈之資料，推算日本65歲以上之高齡者為3588萬人，在總人口中所占之比例達到28.4%。因此，目前日本係相當於超高齡社會。認為高齡化不斷加深之原因在於，平均壽命因醫療進步等而延長。
另一方面，即便平均壽命延長，身體仍隨著年齡增長而老化。作為老化現象之一例，可例舉肌力(肌量)下降。肌肉係藉由合成與分解之平衡來形成。作為參與肌肉合成之基因，已知有PGC-1α，作為參與肌肉分解之基因，已知有MuRF1基因。可知MuRF1誘導構成骨骼肌組織之「肌蛋白重鏈」之分解。若肌肉之分解多於肌肉之合成，則會進行肌肉分解，而肌量減少。進而，若進行肌肉分解，則肌肉發生萎縮(肌萎縮)。
若肌量下降一定程度，則判斷為肌肉減少症。尤其是，若沿著骨骼分佈並支持身體活動之骨骼肌之肌量減少，則身體不能隨意活動，增加因跌倒所導致之骨折、住院、臥床不起等風險。因此，為了過上健康且文化之生活，必須防止肌量下降。
因此，為了防止肌量下降，建議進行習慣性運動。但是，因老化而發生肌肉萎縮者、臥床或者不能給運動器官(骨骼、關節)或循環器官施加負擔者(不限於高齡者)、每天忙碌者等難以繼續進行持續運動。因此，對於本人希望持續運動但無法實施者而言，難以使肌肉充分地恢復。又，於因受傷等而用石膏等固定之情形時，亦導致肌肉攣縮，而促進肌肉萎縮。 [先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：日本專利特開2005-154387號公報
(發明所欲解決之問題)
本發明係鑒於上述問題而完成者。即，本發明之目的在於提供一種藉由運動以外之方法來預防肌萎縮的方法。 (解決問題之技術手段)
此次，本發明人等著眼於已知為肌萎縮基因之MuRF1，對能否藉由飲食來抑制MuRF1表現進行研究。結果，新發現於以嬰兒糞便作為分離源之雙歧乳酸桿菌中存在抑制MuRF1表現之雙歧乳酸桿菌，從而完成了本發明。
為了解決上述課題，本發明之特徵在於其係抑制肌萎縮基因表現之屬於雙歧桿菌屬短雙歧桿菌種之雙歧乳酸桿菌。此處，本發明中所謂肌萎縮基因，其概念包括編碼直接或間接參與肌肉萎縮之蛋白質之基因序列。進而，其特徵在於肌萎縮基因為MuRF1。
又，為了解決上述課題，本發明係一種雙歧乳酸桿菌，其特徵在於上述雙歧乳酸桿菌為短雙歧桿菌N106株(NITE BP-03231)。
進而，為了解決上述課題，本發明之特徵在於其係含有上述雙歧乳酸桿菌之飲食品。 (對照先前技術之功效)
本發明之雙歧乳酸桿菌係抑制肌萎縮基因之表現。藉此，即便為運動困難者，亦可藉由飲食來預防肌萎縮，可提高生活品質(QOL，Quality of life)。又，藉由攝取雙歧乳酸桿菌，亦可調整腸內環境。
以下，對本發明詳細地進行說明。 1.短雙歧桿菌N106株(NITE BP-03231) 本發明之雙歧乳酸桿菌為短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)。本發明中之記號N106係日清食品控股股份有限公司自行賦予菌株之編號。本發明之菌株係由本發明人自嬰兒糞便首次分離所得者。
本發明之短雙歧桿菌N106株係於下述條件下寄存。 (1)寄存機關名稱：獨立行政法人製品評價技術基盤機構 專利微生物寄存中心 (2)聯繫方式：〒292-0818 千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8 122號室 (3)寄存編號：NITE BP-03231 (4)用於識別之顯示：N106 (5)寄存日：2020年6月18日
本發明之短雙歧桿菌N106株之菌學性質係如以下表1及表2所示。本菌學性質係基於伯傑氏系統細菌學手冊(Bergey's manual of systematic bacteriology)Vol. 2 (1986)中所記載之方法。表1表示與本菌株相關之形狀等，表2表示藉由API 20A(Biomerieux製造)所進行之生理-生物化學性狀試驗之結果。於表2中，「+」表示陽性，「－」表示陰性。
[表1]
培養溫度(℃) 37℃
細胞形態 桿菌
0.7～0.8×2.0～4.0 μm
革蘭氏染色性 陽性
菌落形態 培養基 GAM瓊脂培養基
培養時間 72小時
直徑 1.0～2.0 mm
色調 奶油色
形狀 圓形
隆起 透鏡狀
周緣 全緣
表面 平滑
透明度 半透明
黏稠度 黃油狀
有無芽孢 －
運動性 －
觸酶反應 －
生長溫度試驗 37℃ +
45℃ +
+：陽性，－：陰性
[表2]
   反應/酵素 效果    反應/酵素 效果
1 吲哚產生 － 11 明膠水解 －
2 脲酶 － 12 馬栗樹皮苷水解 －
3 葡萄糖醱酵性 + 13 甘油醱酵性 －
4 甘露醇醱酵性 + 14 纖維雙糖醱酵性 +
5 乳糖醱酵性 + 15 甘露糖醱酵性 +
6 蔗糖醱酵性 + 16 蜜三糖醱酵性 +
7 麥芽糖醱酵性 + 17 棉子糖醱酵性 +
8 柳苷醱酵性 + 18 山梨糖醇醱酵性 +
9 木糖醱酵性 + 19 鼠李糖醱酵性 +
10 阿拉伯糖醱酵性 － 20 海藻糖醱酵性 +
2.MuRF1表現抑制評價試驗 如下述實驗例所示，本發明之短雙歧桿菌N106株係對抑制屬於肌萎縮基因之MuRF1之表現顯現出較高活性的菌株。藉由以下試驗方法進行MuRF1之基因表現抑制評價。
＜雙歧乳酸桿菌懸浮液之製備＞ 用於MuRF1表現抑制評價之受檢體(雙歧乳酸桿菌懸浮液)係將雙歧乳酸桿菌於表3所示之GAM培養基(商品名「GAM Broth」：日水股份有限公司)中於37℃下培養24小時。培養時使用厭氧產氣袋(Anaero Pack)(三菱瓦斯化學股份有限公司)，於厭氧條件下培養。其次，將經增殖之菌體進行離心分離並收集菌體。用殺菌水將所收集之菌體洗淨3次，加熱殺菌後進行冷凍。其後，使用冷凍乾燥機進行冷凍乾燥，獲得乾燥菌體粉末。使所獲得之乾燥菌體粉末懸浮於磷酸鹽緩衝液(PBS，Phosphate Buffered Saline)中，將所得者作為雙歧乳酸桿菌懸浮液。
[表3]
蛋白腖 10 g
大豆蛋白腖 3 g
朊蛋白腖 10 g
消化血清粉末 13.5 g
酵母萃取物 5.0 g
肉萃取物 2.2 g
肝臟萃取物 1.2 g
葡萄糖 3.0 g
磷酸二氫鉀 2.5 g
氯化鈉 3.05 g
可溶性澱粉 5.0 g
L-半胱胺酸鹽酸鹽 0.3 g
硫代乙醇酸鈉 0.3 g
蒸餾水 1000 mL
＜MuRF1表現抑制評價試驗＞ 為了對MuRF1表現抑制進行評價，而進行活體外(In vitro)試驗。試驗中使用人骨骼肌肌母細胞(龍沙股份有限公司)。首先，按照製造商之操作說明，於增殖用培養基(商品名「SkBM2」：龍沙股份有限公司)中添加冷凍細胞，進行培養、增殖。其次，以2.0×10 4cells接種於96孔板之各孔。於CO 2培養箱(5%CO 2、37℃)中培養3天使之黏著、增殖於培養板上，然後更換為分化用培養基(於龍沙股份有限公司製造之商品名「DMEM：F12培養基」中添加2%馬血清所製備而成者)培養5天，使之分化成肌管細胞。其後，於分化用培養基中添加上述雙歧乳酸桿菌懸浮液，使最終濃度成為10 μg/mL。又，將0.1 μM之已知於骨骼肌中會提高MuRF1表現之地塞米松(dexamethasone)添加至培養基中。培養24小時後，使用Rneasy迷你套組(QIAGEN公司)進行RNA提取。自所提取之RNA，使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(東洋紡股份有限公司)進行cDNA合成。藉由即時聚合酶鏈反應(RT-PCR，real-time polymerase chain reaction)進行基因表現測定時，使用THUNDERBIRD SYBR qPCR mix(東洋紡股份有限公司)及LightCycler 480 System II(羅氏診斷公司)。RNA提取、cDNA合成、RT-PCR係按照各套組及機器之操作說明。將用於測定之引子序列示於表4。
[表4]
引子名 序列
MuRF1_F TGGGGGAGCCACCTTCCTCT
MuRF1_R ATGTTCTCAAAGCCCTGCTCTGTCT
RPLP0_F GGAAACTCTGCATTCTCGCTTCCT
RPLP0_R CCAGGACTCGTTTGTACCCGTTG
3.飲食品 本發明之雙歧乳酸桿菌可包含於飲食品中來使用。本發明之雙歧乳酸桿菌尤其適用於飲料，例如考慮醱酵乳及乳酸菌飲料。於現行之與乳及乳製品之成分標準等相關之政府機關指令中，作為成分標準，若為醱酵乳(無脂乳固形份為8.0%以上者)或乳製品乳酸菌飲料(無脂乳固形份為3.0%以上者)，則必須為1.0×10 7cfu/mL以上，若為乳酸菌飲料(無脂乳固形份未滿3.0%者)，則必須為1.0×10 6cfu/mL以上，藉由於乳等醱酵液中增殖，或以最終製品之形態增殖，可實現上述菌數。又，除了添加有雙歧乳酸桿菌之醱酵乳及乳酸菌飲料以外，亦可用於黃油等乳製品、蛋黃醬等蛋加工品、乳酪餅等小甜麵包類等。又，亦可適用於泡麵或餅乾等加工食品。除了上述以外，本發明之食品亦可為將上述雙歧乳酸桿菌與視需要之適當載體及添加劑一起添加並進行製劑化而成之形態(例如粉末、顆粒、膠囊、錠劑等)。
本發明之雙歧乳酸桿菌除了包含於一般之飲料或食品中有用以外，包含於特定保健用食品、營養輔助食品等中亦有用。
又，本發明之雙歧乳酸桿菌除了應用於食品以外，亦可應用於化妝水等化妝品領域；整腸劑等醫藥品領域；潔牙粉等日用品領域；青貯料、動物用餌料、植物液體肥料等動物飼料•植物肥料領域。 (產業上之可利用性)
本發明之雙歧乳酸桿菌(短雙歧桿菌N106株)對抑制屬於肌萎縮基因之MuRF1之表現具有較高之活性。 [實施例]
以下，表示本發明之實施例，但本發明並不限定於以下實施例。
＜試驗例1＞MuRF1表現抑制評價 對本發明之短雙歧桿菌N106株及本公司持有之11株比較菌株評價對MuRF1表現抑制之活性。
首先，對於本發明之菌株、下述標準株及比較菌株，分別於表3所示之GAM培養基(商品名「GAM Broth」：日水股份有限公司)中於37℃下培養24小時。培養時使用厭氧產氣袋(三菱瓦斯化學股份有限公司)，於厭氧條件下培養。其次，將經增殖之菌體進行離心分離並收集菌體。用殺菌水將所收集之菌體洗淨3次，加熱殺菌後進行冷凍。其後，使用冷凍乾燥機進行冷凍乾燥，獲得乾燥菌體粉末。使所獲得之乾燥菌體粉末懸浮於PBS中，將所得者作為雙歧乳酸桿菌懸浮液。
其次，將人骨骼肌肌母細胞以2.0×10 4cells/well接種於96孔板並培養3天，進而更換為分化用培養基並培養5天，藉此使之分化成肌管細胞。其次，添加各試樣群，使最終濃度成為10 μg/mL。又，將0.1 μM之地塞米松添加至培養基中。培養24小時後，自細胞提取RNA，藉由RT-PCR進行基因表現測定。再者，將僅添加有地塞米松而未添加雙歧乳酸桿菌懸浮液者作為對照。
將添加了各試樣群之情形時之結果示於圖1。結果係以MuRF1/RPLP0之值表示，將對照設為『1』以進行比較。
如圖1所示可知，於雙歧乳酸桿菌中，若存在促進MuRF1表現者，則亦存在抑制MuRF1表現者。其中，N106、N185株對抑制MuRF1表現顯現出較高之活性。
＜試驗例2＞短雙歧桿菌N106株之優勢評價 其次，為了確認本發明之短雙歧桿菌N106株之優勢，藉由與標準株之短雙歧桿菌JCM1192之比較來進行評價。試驗係藉由與試驗例1相同之方法進行3次，使用其平均值進行比較。將結果示於圖2。
根據圖2亦可知，添加了短雙歧桿菌N106株之群與對照群進行比較，MuRF1表現受到顯著抑制。
如以上所說明，可知本發明之短雙歧桿菌N106株具有有效地抑制屬於肌萎縮基因之MuRF1之表現的功能。
圖1係將本發明之菌株與比較菌株之MuRF1表現抑制效果進行比較之圖。 圖2係將本發明之菌株與標準株之MuRF1表現抑制效果進行比較之圖。
寄存國家　　JP日本 寄存機構 獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心
寄存日期 2020/06/18
寄存號碼 BP-03231
Figure 110132582-A0305-15-0001-1
Figure 110132582-A0305-15-0002-2

Claims (3)

  1. 一種短雙歧桿菌N106株(NITE BP-03231)之雙歧乳酸桿菌，其抑制肌萎縮基因之表現。
  2. 如請求項1之雙歧乳酸桿菌，其中，肌萎縮基因為MuRF1基因。
  3. 一種飲食品，其含有請求項1或2之雙歧乳酸桿菌。
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