TWI785815B - 用於促進益生菌生長的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示一種用於促進益生菌生長的方法，其包括：將該益生菌培養於一含有一乳酸菌菌株組合的發酵產物之培養基中。
Description
本發明是有關於一種用於促進益生菌(probiotics)生長的方法。
益生菌(probiotics)是一種有益於健康之活的微生物食品成分(microbial food ingredient)，可選擇性地刺激腸道中的原生細菌(native bacteria)的生長。益生菌已被發現到具有抑制腸胃道病原菌生長、緩和乳糖不耐症(lactose intolerance)、免疫調節(immunoregulation)、抗癌(anti-cancer)以及降血壓等功效。目前已知可作為益生菌使用的微生物包括乳桿菌屬(
Lactobacillus)、雙叉桿菌屬(
Bifidobacterium)、芽孢桿菌屬(
Bacillus)、乳球菌屬(
Lactococcus)、腸球菌屬(
Enterococcus)、酵母菌屬(
Saccharomyces)、鏈球菌屬(
Streptococcus)等物種。
益生元(prebiotics)是人體無法消化的多醣(polysaccharide)與寡醣(oligosaccharide)類化合物，能夠選擇性地促進腸內菌(特別是益生菌)的活性與生長。目前常見的益生元包括，果寡糖(fructooligosaccharides)、菊糖(inulin)、寡木醣(xylo-oligosaccharides)、果膠寡醣(pectic oligosaccharides)以及巴拉金糖(palatinose)等。
目前已有研究顯示，特定種類的益生元僅能對特定種類的益生菌發揮生長促進效用。例如，在Pranckutė R.
et al.(2016),
Int. J. Biol. Macromol., 89:669-676中，Pranckutė R.等人分別使用菊糖以及巴拉金糖來培養乾酪乳酸桿菌(
Lactobacillus casei) A11、副乾酪乳酸桿菌(
Lactobacillus paracasei) B13、乳酸乳球菌乳亞種(
Lactococcus lactissubsp.
lactis) DSM 20729以及嗜酸乳桿菌(
Lactobacillus acidophilus) DSM 20079，而實驗結果發現，菊糖僅能促進副乾酪乳酸桿菌B13的生長，至於巴拉金糖則皆無法促進該等益生菌的生長。
因此，本領域中仍然存在有一需要去開發能夠有效地促進各種不同益生菌生長之方法。
發明概要
於本發明中，申請人經實驗而發現到，組合使用唾液乳酸桿菌(
Lactobacillus salivariussubsp.
salicinius) AP-32 (BCRC 910437)、植物乳酸桿菌(
Lactobacillus plantarum) LPL28 (BCRC 910536)、嗜酸乳酸桿菌(
Lactobacillus acidophilus) TYCA06 (BCRC 910813)以及長雙歧桿菌嬰兒亞種(
Bifidobacterium longumsubsp.
infantis) BLI-02 (BCRC 910812)的發酵產物能夠有效地促進各種不同益生菌生長，且其效用明顯優於習知的益生元。
於是，在第一個方面，本發明提供一種用於促進益生菌生長的方法，其包括：將該益生菌培養於一含有一乳酸菌菌株組合的發酵產物之培養基中，其中該乳酸菌菌株組合包含有：唾液乳酸桿菌AP-32、植物乳酸桿菌LPL28、嗜酸乳酸桿菌TYCA06，以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02。
較佳地，該發酵產物是使用菌數比落在1：0.2：0.2：0.2至1：5：5：5的範圍內的唾液乳酸桿菌AP-32、植物乳酸桿菌LPL28、嗜酸乳酸桿菌TYCA06以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02進行培養而被製得的一液態培養物。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
本發明提供一種用於促進益生菌(probiotics)生長的方法，其包括：將該益生菌培養於一含有一乳酸菌菌株組合的發酵產物之培養基中，其中該乳酸菌菌株組合包含有：唾液乳酸桿菌(
Lactobacillus salivariussubsp.
salicinius) AP-32 (BCRC 910437)、植物乳酸桿菌(
Lactobacillus plantarum) LPL28 (BCRC 910536)、嗜酸乳酸桿菌(
Lactobacillus acidophilus) TYCA06 (BCRC 910813)，以及長雙歧桿菌嬰兒亞種(
Bifidobacterium longumsubsp.
infantis) BLI-02 (BCRC 910812)。
依據本發明，該含有發酵產物的培養基可藉由對一適於乳酸菌生長的基礎培養基添加該發酵產物而被製得。較佳地，該基礎培養基中添加有0.1-10 wt%的發酵產物，更佳地，0.25-0.5 wt%的發酵產物。在本發明的一個較佳具體例中，該基礎培養基中添加有0.25 wt%的發酵產物。在本發明的另一個較佳具體例中，該基礎培養基中添加有0.5 wt%的發酵產物。
依據本發明，適於乳酸菌生長的基礎培養基是熟習此項技藝者所熟知的，並且可以是自行配製的，或者是商業上可購得的產品，這包括，但不限於：MRS肉湯培養基(MRS broth)。
依據本發明，適用於本發明的基礎培養基可包含有一選自於由下列所構成之群組中的碳源(carbon source)：葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、乳糖(lactose)、蔗糖(sucrose)、麥芽糖(maltose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)、海藻糖(trehalose)、澱粉(starch)、馬鈴薯澱粉(potato starch)、麥芽萃取物(malt extract)、麥芽糊精(maltodextrin)，以及它們的組合。較佳地，該基礎培養基包含有1-5 wt%的葡萄糖。在本發明的一個較佳具體例中，該基礎培養基包含有5 wt%的葡萄糖。
依據本發明，適用於本發明的基礎培養基可包含有一選自於由下列所構成之群組中的氮源(nitrogen source)：(NH
4)
2SO
4、(NH
4)
3PO
4、NH
4NO
3、NH
4Cl、酪蛋白胺基酸(casamino acid)、蛋白腖(peptone)、聚蛋白腖(polypeptone)、胰化腖(tryptone)、肉類萃取物(meat extract)、酵母萃取物(yeast extract)、酵母粉(yeast powder)、牛奶、脫脂奶粉、大豆粉(soybean flour)、乳清，以及它們的組合。較佳地，該基礎培養基包含有2-15 wt%的脫脂奶粉、3-10 wt%的蛋白腖以及1-5 wt%的酵母萃取物。在本發明的一個較佳具體例中，該基礎培養基包含有12 wt%的脫脂奶粉、7 wt%的蛋白腖以及3 wt%的酵母萃取物。
如本文中所使用的，術語“培養(culturing)”、“發酵(fermentation)”以及“培育(cultivation)”可被交換地使用。有關培養的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在此方面，可以參考，例如，Hsieh P.S.
et al. (2013),
New Microbiol.,36:167-179。
依據本發明，該培養可在一範圍落在25℃至40℃內的溫度下被進行。在本發明的一個較佳具體例中，該培養是於37℃下被進行。
依據本發明，該培養可被進行歷時在一範圍落在6至12小時內的時間。在本發明的一個較佳具體例中，該培養被進行歷時6小時。
依據本發明，該發酵產物是使用菌數比落在1：0.2：0.2：0.2至1：5：5：5的範圍內的唾液乳酸桿菌AP-32、植物乳酸桿菌LPL28、嗜酸乳酸桿菌TYCA06以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02進行培養而被製得的一液態培養物。在本發明的一個較佳具體例中，唾液乳酸桿菌AP-32、植物乳酸桿菌LPL28、嗜酸乳酸桿菌TYCA06以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02的菌數比是1：1：1：1。
依據本發明，適用於該乳酸菌菌株組合的培養基與培養條件是如上所述。
依據本發明，該液態培養物可經固液分離處理而實質上不含有(substantially free of)菌體。
如本文中所使用的，術語“實質上不含有”意指一被具體指明的組分缺少有意義的含量。較佳地，該組分的含量對於該乳酸菌菌株組合的發酵產物的性質不具有可測量的影響(measurable effect)。更佳地，該乳酸菌菌株組合的發酵產物完全不含有該組分。
依據本發明，該固液分離處理是選自於下列所構成的群組：離心處理(centrifugation treatment)、過濾處理(filtration treatment)、濃縮處理(concentration treatment)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該固液分離處理是離心處理。
依據本發明，該液態培養物可進一步進行一選自於下列的乾燥處理而呈粉末狀：冷凍-乾燥(freeze-drying)、噴霧乾燥(spray-drying)，以及流化床乾燥(bed drying)。
如本文中所使用的，術語“益生菌”與“益生性微生物(probiotic microbes)”可被交換地使用，並且意指活性微生物(live microorganisms)的製備物(preparations)，當被一人類或動物攝食(ingested)之後，該等微生物可以維持(remain)並存活在胃腸道之中，而且能夠發揮所欲的效用。
依據本發明，該益生菌可選自於由下列所構成的群組：乳酸桿菌屬物種(
Lactobacillusspp.)、乳球菌屬物種(
Lactococcusspp.)、小球菌屬物種(
Pediococcusspp.)、腸球菌屬物種(
Enterococcusspp.)、鏈球菌屬物種(
Streptococcusspp.)、雙歧桿菌屬物種(
Bifidobacteriumspp.)、芽孢桿菌屬物種(
Bacillusspp.)、明串珠菌屬物種(
Leuconostocspp.)，以及它們的組合。
較佳地，該乳酸桿菌屬物種是選自於由下列所構成的群組：加氏乳酸桿菌(
Lactobacillus gasseri)、發酵乳酸桿菌(
Lactobacillus fermentum)、約氏乳酸桿菌(
Lactobacillus johnsonii)、羅伊氏乳酸桿菌(
Lactobacillus reuteri)、瑞士乳酸桿菌(
Lactobacillus helveticus)、乾酪乳酸桿菌(
Lactobacillus casei)、副乾酪乳酸桿菌(
Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳酸桿菌(
Lactobacillus rhamnosus)、戴白氏乳酸桿菌(
Lactobacillus delbrueckii)、保加利亞乳酸桿菌(
Lactobacillus bulgaricus)、唾液乳酸桿菌(
Lactobacillus salivarius)、植物乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該乳酸桿菌屬物種是選自於由下列所構成的群組：加氏乳酸桿菌AI-88、加氏乳酸桿菌LG21、發酵乳酸桿菌CECT5716、約氏乳酸桿菌MH-68、羅伊氏乳酸桿菌GL-104、瑞士乳酸桿菌RE-78、副乾酪乳酸桿菌MP137、副乾酪乳酸桿菌ET-66、鼠李糖乳酸桿菌MP108、鼠李糖乳酸桿菌CT-53、鼠李糖乳酸桿菌LGG、植物乳酸桿菌LPL28、植物乳酸桿菌TSP05、嗜酸乳酸桿菌TYCA06以及嗜酸乳酸桿菌LA-5。
較佳地，該乳球菌屬物種是乳酸乳球菌(
Lactococcus lactis)[例如，乳酸乳球菌乳亞種(
Lactococcus lactissubsp.
lactis)]。在本發明的一個較佳具體例中，該乳球菌屬物種是乳酸乳球菌乳亞種LY-66。
較佳地，該鏈球菌屬物種是嗜熱鏈球菌(
Streptococcus thermophilus)。在本發明的一個較佳具體例中，該鏈球菌屬物種是嗜熱鏈球菌SY-66以及嗜熱鏈球菌UASt-09。
較佳地，該雙歧桿菌屬物種是選自於由下列所構成的群組：動物雙歧桿菌(
Bifidobacterium animalis)[例如，動物雙歧桿菌乳亞種(
Bifidobacterium animalissubsp.
lactis)以及動物雙歧桿菌乳雙歧亞種(
Bifidobacterium animalissubsp.
lactis Bb)]、短雙歧桿菌(
Bifidobacterium breve)、長雙歧桿菌(
Bifidobacterium longum)[例如，長雙歧桿菌嬰兒亞種]、兩歧雙歧桿菌(
Bifidobacterium bifidum)、乳雙歧桿菌(
Bifidobacterium lactis)、青春雙歧桿菌(
Bifidobacterium adolescentis)、嬰兒雙歧桿菌(
Bifidobacterium infantis)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該雙歧桿菌屬物種是選自於由下列所構成的群組：動物雙歧桿菌乳亞種CP-9、動物雙歧桿菌乳亞種BB-12、動物雙歧桿菌乳雙歧亞種BB-115、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02、短雙歧桿菌Bv-889以及長雙歧桿菌BB536。
較佳地，該益生菌是一含有乳酸桿菌屬物種與雙歧桿菌屬物種的組合，例如，鼠李糖乳酸桿菌、動物雙歧桿菌以及長雙歧桿菌的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該益生菌是一含有鼠李糖乳酸桿菌MP108、動物雙歧桿菌乳雙歧亞種BB-115以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02的組合。
本發明亦提供一種用於生產益生菌的方法，其包括：將該益生菌培養於一如上所述之含有一乳酸菌菌株組合的發酵產物之培養基中。
較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
實施例 一般實驗材料： 1. 發酵培養基：
在下面的實施例中所使用的發酵培養基具有一如下面表1所示的配方。
表1. 發酵培養基的配方
2. 乳酸菌菌株：
| 成分 | 含量(wt%) |
| 葡萄糖 | 1-5 |
| 脫脂奶粉 | 2-15 |
| 蛋白腖(peptone) | 3-10 |
| 酵母萃取物(yeast extract) | 1-5 |
| 磷酸氫二鉀(potassium hydrogen phosphate) | 0.05-0.2 |
| 檸檬酸鈉(sodium citrate) | 0-0.01 |
| 硫酸錳 | 0-0.01 |
| 麩胺酸鈉(monosodium glutamate, MSG) | 1-5 |
| Tween 80 | 0.05-0.2 |
| 餘量為去離子水 |
在下面實施例中拿來進行功效評估的乳酸菌菌株已被揭露於TW I709374 B中，並已被寄存於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。另外，該等乳酸菌菌株亦有依據布達佩斯條約(the Budapest Treaty)的規定被寄存於中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)以及中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)。為表清楚，各個乳酸菌菌株的相關資訊(包括：學名、寄存編號以及寄存日期等)已被整合於下面表2中。
表2. 各個乳酸菌菌株的相關資訊
註：唾液乳酸桿菌AP-32以及嗜酸乳酸桿菌TYCA06已可自由分讓。
3. 在下面的實施例中所使用的各個益生元及其來源已被整合於下面表3中。
表3. 各個益生元的來源
4. 益生菌菌液的製備：
| 菌株 | 寄存編號 | 寄存日期 |
| 唾液乳酸桿菌( Lactobacillus salivariussubsp. salicinius) AP-32 | BCRC 910437 | 2009/7/30 |
| CCTCC No. M 2011127 | 2011/04/10 | |
| 植物乳酸桿菌( Lactobacillus plantarum) LPL28 | BCRC 910536 | 2011/12/27 |
| CGMCC No.17954 | 2019/06/18 | |
| 嗜酸乳酸桿菌( Lactobacillus acidophilus) TYCA06 | BCRC 910813 | 2018/01/18 |
| CGMCC No.15210 | 2018/01/15 | |
| 長雙歧桿菌嬰兒亞種( Bifidobacterium longumsubsp. infantis) BLI-02 | BCRC 910812 | 2018/01/18 |
| CGMCC No.15212 | 2018/01/15 |
| 益生元 | 來源 |
| 人乳寡糖 (human milk oligosaccharides) | 杜邦公司 |
| 麥芽糊精(maltodextrin) | 新和食品股份有限公司 |
| 果寡糖(fructooligosaccharides) | 綠立生醫國際股份有限公司 |
| 半乳寡糖(galactooligosaccharides) | |
| 山梨醇(sorbitol) | 盛源食品原料股份有限公司 |
| 赤藻糖醇(erythritol) | 信意企業股份有限公司 |
| 菊糖(inulin) | 元弘草本科研有限公司 |
在下面的實施例中所使用的益生菌菌株及其來源已被整合於下面表4中。
表4. 各個益生菌菌株
| 菌屬 | 菌株 | 來源 |
| 乳酸桿菌 ( Lactobacillus) | 加氏乳酸桿菌( Lactobacillus gasseri) AI-88 (BCRC 910943；CGMCC No.18693) | 自行分離自母乳 |
| 加氏乳酸桿菌LG21 | 購自於明治(日本) | |
| 發酵乳酸桿菌( Lactobacillus fermentum) CECT5716 | 購自於Biosearch Life (西班牙) | |
| 約氏乳酸桿菌( Lactobacillus johnsonii) MH-68 (BCRC 910438) | 自行分離自健康人體腸道 | |
| 羅伊氏乳酸桿菌( Lactobacillus reuteri) GL-104 (BCRC 910404；CCTCC No. M 209138) | 自行分離自健康人體腸道 | |
| 瑞士乳酸桿菌( Lactobacillus helveticus) RE-78 (BCRC 910537；CGMCC No.13513) | 自行分離自泡菜 | |
| 副乾酪乳酸桿菌( Lactobacillus paracasei) MP137 (BCRC 910484；CGMCC No.21224) | 自行分離自健康嬰兒腸道 | |
| 副乾酪乳酸桿菌ET-66 (BCRC 910753；CGMCC No.13514) | 自行分離自母乳 | |
| 鼠李糖乳酸桿菌( Lactobacillus rhamnosus) MP108 (BCRC 910483；CGMCC No.21225) | 自行分離自健康嬰兒腸道 | |
| 鼠李糖乳酸桿菌CT-53 (BCRC 910468；CCTCC No.2011129) | 自行分離自人體陰道 | |
| 鼠李糖乳酸桿菌LGG | 購自於Chr. Hansen (丹麥) | |
| 植物乳酸桿菌LPL28 (BCRC 910536；CGMCC No.17954) | 自行分離自味噌 | |
| 植物乳酸桿菌TSP05 (BCRC 910855；CGMCC No.16710) | 自行分離自泡菜 | |
| 嗜酸乳酸桿菌TYCA06 (BCRC 910813；CGMCC No.15210) | 自行分離自健康人體腸道 | |
| 嗜酸乳酸桿菌LA-5 | 購自於Chr. Hansen (丹麥) | |
| 乳球菌( Lactococcus) | 乳酸乳球菌乳亞種( Lactococcus lactissubsp. lactis) LY-66 (BCRC 911055；CGMCC No.21838) | 自行分離自健康人體腸道 |
| 鏈球菌( Streptococcus) | 嗜熱鏈球菌( Streptococcus thermophilus) SY-66 (BCRC 911043；CGMCC No.21839) | 自行分離自發酵乳製品 |
| 嗜熱鏈球菌UASt-09 | 購自於Chr. Hansen (丹麥) | |
| 雙歧桿菌 ( Bifidobacterium) | 動物雙歧桿菌乳亞種( Bifidobacterium animalissubsp. lactis) CP-9 (BCRC 910645；CCTCC No. M 2014588) | 自行分離自母乳 |
| 動物雙歧桿菌乳亞種BB-12 | 購自於Chr. Hansen (丹麥) | |
| 動物雙歧桿菌乳雙歧亞種( Bifidobacterium animalissubsp. lactis Bb) BB-115 (BCRC 911045；CGMCC No.21840) | 自行分離自健康人體腸道 | |
| 長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02 (BCRC 910812；CGMCC No.15212) | 自行分離自母乳 | |
| 短雙歧桿菌( Bifidobacterium breve) Bv-889 (BCRC 910844；CGMCC No.16145) | 自行分離自母乳 | |
| 長雙歧桿菌( Bifidobacterium longum) BB536 | 購自於森永(日本) |
首先，將上述益生菌菌株分別接種至補充有0.05%半胱胺酸(cysteine)的MRS肉湯培養基(MRS broth)(BD, Cat. No. DF0881-17-5)中，並於培養箱(37℃、5% CO
2)中進行培養歷時16小時，俾以活化菌株。接著，將經活化的菌株分別以一為10% (v/v)的接種量接種至MRS肉湯培養基中，並在培養箱(37℃、5% CO
2)中進行繼代培養(subculture)歷時24小時。之後，以MRS肉湯培養基將所形成的培養物調整為一具有1×10
9CFU/mL的細菌濃度，而得到各個益生菌的菌液。另外，將鼠李糖乳酸桿菌MP108、動物雙歧桿菌乳雙歧亞種BB-115以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02的菌液各取部分並以等體積(1:1:1)混合而得到一混合菌液。
一般實驗方法： 1. 統計學分析(statistical analysis)：
在下面的實施例中，各組的實驗被重複3次，而實驗數據是以“平均值(mean)±平均值的標準誤差(standard error of the mean, SEM)”來表示。所有的數據是藉由雙尾史徒登氏t-試驗(two-tailed Student’s t-test)來作分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是
p＜0.05，這表示有統計學顯著性(statistical significance)。
實施例 1. 乳酸菌發酵產物的製備：
首先，將上面“一般實驗材料”的第2項當中所述的4種乳酸菌菌株分別接種至100 mL之上面“一般實驗材料”的第1項當中所述的發酵培養基中，並於37℃下進行培養歷時24小時，俾以活化菌株。接著，將所得到的經活化的菌株(其具有一約為1×10
9CFU/mL的濃度)分別以一為3% (v/v)的接種量接種至5 L的發酵培養基中，並於一厭氧條件下以及37℃下進行發酵培養歷時隔夜，藉此而得到該4種乳酸菌菌株的發酵培養物。
此外，將該等經活化的乳酸菌菌株培養物依據表5所示的比例來進行混合而得到5種乳酸菌菌株組合(亦即菌株組合1至5)，並分別以一為3% (v/v)的接種量接種至5 L的發酵培養基中，並於一厭氧條件下以及37℃下進行發酵培養歷時隔夜，藉此而得到菌株組合1至5的發酵培養物。
之後，將該4種乳酸菌菌株以及該5種菌株組合的發酵培養物進行離心來使菌體沉澱，然後收集上澄液並依序進行加熱滅菌處理以及噴霧乾燥處理(spray-drying treatment)，藉此而得到呈粉末狀的乳酸菌發酵產物。
表5. 各個菌株組合所使用的菌數比
實施例 2. 乳酸菌發酵產物在促進益生菌生長上的效用評估 實驗方法：
| 菌株組合 | AP-32：LPL28：TYCA06：BLI-02 |
| 1 | 1：0.2：0.2：0.2 |
| 2 | 1：1：1：1 |
| 3 | 1：5：1：1 |
| 4 | 1：1：5：1 |
| 5 | 1：1：1：5 |
首先，將上面實施例1所得到的9種乳酸菌發酵產物分別以0.5 wt%的含量配於4.5 mL的發酵培養基中，接著將上面“一般實驗材料”的第4項當中所得到的鼠李糖乳酸桿菌MP108的菌液分為4個單菌比較組(亦即，單菌比較組1至4)、5個複合菌實驗組(亦即，複合菌實驗組1至5)以及1個對照組(各組皆為5 μL)，並且依據下面表6所示將各個單菌比較組與複合菌實驗組的菌液接種至含有不同乳酸菌發酵產物的發酵培養基中，而對照組的菌液則接種至不含有任何乳酸菌發酵產物的發酵培養基中，繼而在37℃下予以培養歷時6小時。
表6. 各組接種的發酵培養基所含有的乳酸菌發酵產物
| 組別 | 乳酸菌發酵產物 |
| 單菌比較組1 | 唾液乳酸桿菌AP-32 |
| 單菌比較組2 | 植物乳酸桿菌LPL28 |
| 單菌比較組3 | 嗜酸乳酸桿菌TYCA06 |
| 單菌比較組4 | 長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02 |
| 複合菌實驗組1 | 菌株組合1 |
| 複合菌實驗組2 | 菌株組合2 |
| 複合菌實驗組3 | 菌株組合3 |
| 複合菌實驗組4 | 菌株組合4 |
| 複合菌實驗組5 | 菌株組合5 |
| 對照組 | - |
之後，對各組所得到的發酵培養物各取0.02 mL並以分光光度計在波長600 nm下測量吸光值(OD
600)。另外，一未經接種菌液且不含有任何乳酸菌發酵產物的發酵培養基被拿來作為空白對照組，並以相同的方式來測量吸光值(OD
600)。
各組的鼠李糖乳酸桿菌MP108的相對生長倍數是藉由將各組發酵培養物所測得的吸光值(OD
600)代入下列公式(I)而被計算出：
公式 (I) ： A ＝ (B-D)/(C-D)其中：A＝相對生長倍數
B＝各組所測得的OD
600吸光值
C＝對照組所測得的OD
600吸光值
D＝空白對照組所測得的OD
600吸光值
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
結果：
所得到的結果被顯示於圖1中。由圖1可見，與對照組相較之下，單菌比較組1至4的相對生長倍數並無顯著差異，而複合菌實驗組1至5的相對生長倍數皆有顯著地升高，並且其中複合菌實驗組2提升的倍數幅度更是高於其他複合菌實驗組所具者。這個實驗結果顯示：組合使用唾液乳酸桿菌AP-32、植物乳酸桿菌LPL28、嗜酸乳酸桿菌TYCA06以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02的發酵產物能夠協同地促進鼠李糖乳酸桿菌MP108的生長。
實施例 3. 乳酸菌菌株組合的發酵產物在促進不同益生菌生長上的效用評估
為了進一步評估含有唾液乳酸桿菌AP-32、植物乳酸桿菌LPL28、嗜酸乳酸桿菌TYCA06以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02的菌株組合的發酵產物是否亦能用於促進其他的益生菌生長，下面的實驗被進行。
實驗方法：
首先，將上面實施例1所得到的菌株組合2的乳酸菌發酵產物以0.5 wt%的含量配於4.5 mL的發酵培養基中。接著，將上面“一般實驗材料”的第4項當中所得到的各個益生菌菌液分別分成1個複合菌組以及1個對照組(各組皆為5 μL)。然後將複合菌組的益生菌菌液接種至含有菌株組合1的乳酸菌發酵產物的發酵培養基中，而對照組的菌液則接種至不含有任何乳酸菌發酵產物的發酵培養基中，繼而在37℃下予以培養歷時6小時。之後，參照實施例2中所描述的方法來進行相對生長倍數的測定以及數據分析。
結果：
所得到的結果被顯示於下面表7中。由表7可見，與對照組相較之下，各個乳酸桿菌、乳球菌、鏈球菌以及雙歧桿菌菌株的相對生長倍數皆有顯著地升高。這個實驗結果顯示：組合使用唾液乳酸桿菌AP-32、植物乳酸桿菌LPL28、嗜酸乳酸桿菌TYCA06以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02的發酵產物能夠有效地促進各種不同菌種的益生菌生長。
表7. 乳酸菌發酵產物促進不同益生菌的相對生長倍數
註：“*”、“**”與“***”分別表示當與對照組作比較，
p＜0.05、
p＜0.01與
p＜0.001。
實施例 4. 乳酸菌菌株組合的發酵產物與習知益生元在促進益生菌生長上的效用比較 實驗方法：
| 益生菌 | 相對生長倍數 |
| 加氏乳酸桿菌AI-88 | 1.62 ± 0.11 *** |
| 加氏乳酸桿菌LG21 | 1.15 ± 0.01 ** |
| 發酵乳酸桿菌CECT5716 | 1.46 ± 0.05 *** |
| 約氏乳酸桿菌MH-68 | 1.31 ± 0.07 ** |
| 羅伊氏乳酸桿菌GL-104 | 1.39 ± 0.02 *** |
| 瑞士乳酸桿菌RE-78 | 1.42 ± 0.09 ** |
| 副乾酪乳酸桿菌MP137 | 1.17 ± 0.05 ** |
| 副乾酪乳酸桿菌ET-66 | 1.27 ± 0.04 *** |
| 鼠李糖乳酸桿菌CT-53 | 1.28 ± 0.11 ** |
| 鼠李糖乳酸桿菌MP108 | 1.34 ± 0.03 *** |
| 鼠李糖乳酸桿菌LGG | 1.15 ± 0.03 * |
| 植物乳酸桿菌LPL28 | 1.26 ± 0.05 ** |
| 植物乳酸桿菌TSP05 | 1.21 ± 0.25 * |
| 嗜酸乳酸桿菌TYCA06 | 1.64 ± 0.04 ** |
| 嗜酸乳酸桿菌LA-5 | 1.77 ± 0.01 ** |
| 乳酸乳球菌乳亞種LY-66 | 1.16 ± 0.04 * |
| 嗜熱鏈球菌SY-66 | 1.33 ± 0.04 *** |
| 嗜熱鏈球菌UASt-09 | 1.20 ± 0.03 ** |
| 動物雙歧桿菌乳雙歧亞種BB-115 | 1.13 ± 0.03 ** |
| 動物雙歧桿菌乳亞種CP-9 | 1.12 ± 0.03 ** |
| 動物雙歧桿菌乳亞種BB-12 | 1.27 ± 0.07 ** |
| 長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02 | 1.29 ± 0.04 ** |
| 短雙歧桿菌Bv-889 | 1.21 ± 0.04 * |
| 長雙歧桿菌BB536 | 1.49 ± 0.05 *** |
首先，將上面“一般實驗材料”的第3項當中所述的6種益生元以及上面實施例1所得到的菌株組合2的乳酸菌發酵產物分別以0.25 wt%與0.5 wt%的含量配於4.5 mL的發酵培養基中。接著，將上面“一般實驗材料”的第4項當中所得到的鼠李糖乳酸桿菌MP108的菌液分成2個人乳寡糖組(亦即人乳寡糖X1組與X2組)、2個麥芽糊精組(亦即麥芽糊精X1組與X2組)、2個果寡糖組(亦即果寡糖X1組與X2組)、2個半乳寡糖組(亦即半乳寡糖X1組與X2組)、2個山梨醇組(亦即山梨醇X1組與X2組)、2個赤藻糖醇組(亦即赤藻糖醇X1組與X2組)、2個菊糖組(亦即菊糖X1組與X2組)、2個複合菌組(亦即複合菌X1組與X2組)，以及2個對照組(亦即對照X1組與X2組)，各組皆為5 μL。然後將各組的鼠李糖乳酸桿菌MP108菌液接種至含有具有對應濃度(X1組與X2組分別對應於0.25 wt%與0.5 wt%)的益生元或乳酸菌發酵產物的發酵培養基中，而對照組的菌液則接種至不含有任何乳酸菌發酵產物的發酵培養基中，繼而在37℃下予以培養歷時6小時。之後，參照實施例2中所描述的方法來進行各組鼠李糖乳酸桿菌MP108的相對生長倍數的測定以及數據分析。
此外，為了瞭解本發明所使用的菌株組合的乳酸菌發酵產物相較於習知益生元在促進其他益生菌或經混合的複數種益生菌的生長上的效用，參照上面針對鼠李糖乳酸桿菌MP108所描述的方式來進行實驗，不同之處在於：以上面“一般實驗材料”的第4項當中所得到的動物雙歧桿菌乳亞種CP-9的菌液以及混合菌液分別來代替鼠李糖乳酸桿菌MP108的菌液。
結果：
所得到的結果被顯示於圖2至圖4中。由圖2至圖4可見，無論是對於鼠李糖乳桿菌MP108、動物雙歧桿菌乳亞種CP-9以及混合益生菌，各種習知的益生元皆不必然能夠有效地發揮促進益生菌生長的效用，相對地，含有唾液乳酸桿菌AP-32、植物乳酸桿菌LPL28、嗜酸乳酸桿菌TYCA06以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02的菌株組合之發酵產物皆能夠大幅地促進生長。
這個實驗結果顯示：組合使用唾液乳酸桿菌AP-32、植物乳酸桿菌LPL28、嗜酸乳酸桿菌TYCA06以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02的發酵產物在不同濃度下皆能有效地促進一或多種益生菌的生長，並且可供用於取代習知的益生元。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中：
圖1顯示各組鼠李糖乳桿菌MP108被處理以不同的乳酸菌發酵產物後所測得的相對生長倍數，其中“*”、“**”與“***”分別表示當與對照組作比較，
p＜0.05、
p＜0.01與
p＜0.001；
圖2顯示各組鼠李糖乳桿菌MP108被處理以乳酸菌發酵產物以及各種益生元後所測得的相對生長倍數，其中“*”、“**”與“***”分別表示當與對照組作比較，
p＜0.05、
p＜0.01與
p＜0.001；
圖3顯示各組動物雙歧桿菌乳亞種CP-9被處理以乳酸菌發酵產物以及各種益生元後所測得的相對生長倍數，其中“*”與“**”分別表示當與對照組作比較，
p＜0.05與
p＜0.01；以及
圖4顯示各組混合益生菌被處理以乳酸菌發酵產物以及各種益生元後所測得的相對生長倍數，其中“*”與“**”分別表示當與對照組作比較，
p＜0.05與
p＜0.01。
TW中華民國；食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)；2011/12/27；BCRC 910536。
TW中華民國；食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)；2018/01/18；BCRC 910812。
Claims (9)
- 一種用於促進益生菌生長的方法，其包括：將該益生菌培養於一含有一乳酸菌菌株組合的發酵產物之培養基中，其中該乳酸菌菌株組合包含有：唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32(BCRC 910437)、植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)LPL28(BCRC 910536)、嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06(BCRC 910813)，以及長雙歧桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02(BCRC 910812)，其中該發酵產物是一未經固液分離處理來移除菌體或上澄液的液態培養物，或一經固液分離處理而實質上不含有菌體的液態培養物。
- 如請求項1的方法，其中該發酵產物是使用菌數比落在1：0.2：0.2：0.2至1：5：5：5的範圍內的唾液乳酸桿菌AP-32、植物乳酸桿菌LPL28、嗜酸乳酸桿菌TYCA06以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02進行培養而被製得的一液態培養物。
- 如請求項2的方法，其中該菌數比是1：1：1：1。
- 如請求項2的方法，其中該液態培養物經固液分離處理而實質上不含有菌體。
- 如請求項1的方法，其中該益生菌是選自於由下列所構成的群組：乳酸桿菌屬物種(Lactobacillus spp.)、乳 球菌屬物種(Lactococcus spp.)、小球菌屬物種(Pediococcus spp.)、腸球菌屬物種(Enterococcus spp.)、鏈球菌屬物種(Streptococcus spp.)、雙歧桿菌屬物種(Bifidobacterium spp.)、芽孢桿菌屬物種(Bacillus spp.)、明串珠菌屬物種(Leuconostoc spp.)，以及它們的組合。
- 如請求項5的方法，其中該乳酸桿菌屬物種是選自於由下列所構成的群組：加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)、發酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)、約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)、羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri)、瑞士乳酸桿菌(Lactobacillus helveticus)、乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus casei)、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、戴白氏乳酸桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)、植物乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌，以及它們的組合。
- 如請求項5的方法，其中該乳球菌屬物種是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
- 如請求項5的方法，其中該鏈球菌屬物種是嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)。
- 如請求項5的方法，其中該雙歧桿菌屬物種是選自於由下列所構成的群組：動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)，以及它們的組合。
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-
2022
- 2022-04-19 US US17/724,341 patent/US11999944B2/en active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 期刊 Iliya D. Kwoji et al., Multi-Strain Probiotics: Synergy among Isolates Enhances Biological Activities, 10, Biology, 2021, 322. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20230100778A1 (en) | 2023-03-30 |
| US11999944B2 (en) | 2024-06-04 |
| TW202313959A (zh) | 2023-04-01 |
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