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TWI724521B - 利用胞外囊泡診斷疾病的方法 - Google Patents

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TWI724521B
TWI724521B TW108131329A TW108131329A TWI724521B TW I724521 B TWI724521 B TW I724521B TW 108131329 A TW108131329 A TW 108131329A TW 108131329 A TW108131329 A TW 108131329A TW I724521 B TWI724521 B TW I724521B
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cancer
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楊崑德
陳治平
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台灣基督長老教會馬偕醫療財團法人馬偕紀念醫院
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Abstract

本揭示內容是關於用以診斷一個體之癌症、退化性疾病、感染性疾病及老化的方法。依據本揭示內容某些實施方式，該方法包含(a)由該個體取得一生物檢體；(b)由該生物檢體分離複數個胞外囊泡；(c)決定該複數個胞外囊泡中特殊生物標記的表現量；以及(d)依據步驟(c)決定之該生物標記的表現量來診斷或預斷該癌症、該退化性疾病、該感染性疾病或該老化。

Description

利用胞外囊泡診斷疾病的方法
本揭示內容是關於疾病診斷及治療的領域。更具體來說，本揭示內容是藉由決定一個體之胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)中一或多個生物標記的表現量來確認需要治療之個體的方法，以及基於該確認結果來預斷或診斷疾病，並對該個體投予一適當的治療。
胞外囊泡是一種源自細胞的膜狀囊泡，會出現在不同來源的組織液中，包含血液、尿液、腦脊液、胸水、惡性腹水、母乳、羊水、產道液體、腸胃道液體、支氣管肺泡灌洗液及唾液。胞外囊泡可由一供體細胞(例如，一內皮細包、一上皮細胞、一淋巴球或一癌細胞)或遠端組織(例如，腦、心臟、胰臟、肺臟、腎臟或胎盤)所分泌釋放；之後，一受體細胞可藉由胞飲作用(endocytosis)、膜融合(membrane fusion)或特定的配體-受器內化反應(ligand-receptor internalization)來吸收釋出的胞外囊泡，據以將胞外囊泡之內含物(例如，核酸、脂多醣、蛋白及/或脂質)由供體細胞傳遞至受體細胞。已知胞外囊泡媒介不同的生理及病理反應，包含器官發育、細胞與細胞間的訊息溝通、腫瘤轉移，以及免疫相關疾病(例如，自體免疫疾病、退化性疾病，或是發炎性疾病)的生成及進程。
基於胞外囊泡的內含物反應了供體細胞的狀態，胞外囊泡可作為一種生物標記，應用於診斷、預斷疾病及流行病學等不同領域。然而，生理及病理反應具有高度複雜性及不可預期性，因此，相關領域仍亟需確認胞外囊泡中與特定疾病(例如，癌症、退化性疾病，或是感染性疾病)以及／或是狀態(例如，老化狀態)相關的生物標記，使習知技藝人士可經由分析該些胞外囊泡之生物標記來準確預斷或診斷該些疾病或狀態的發生，並據以對有需要之個體及時投予適當的治療。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容的第一態樣是關於一種由一個體之生物檢體來診斷或預斷一癌症、一退化性疾病、一感染性疾病或老化的方法。本發明方法包含： (a)由該生物檢體分離複數個胞外囊泡； (b)決定該複數個胞外囊泡中一生物標記的表現量；以及 (c)依據步驟(b)決定之該生物標記的表現量來診斷或預斷該癌症、該退化性疾病、該感染性疾病或該老化，其中當與一取自一健康個體之對照樣本中該生物標記的表現量相比較，該複數個胞外囊泡中生物標記的表現量的不同可指出該個體具有該癌症、該退化性疾病或該感染性疾病，具有罹患該癌症、該退化性疾病或該感染性疾病的風險，或是處於老化狀態。
在本揭示內容中，主要是以具有獨特抗體及／或新穎適體(aptamer)之雙特異性(bi-specific)與多特異性(multi-specific)模組來偵測一或多種生物標記之表現模式(expression pattern)。
依據本揭示內容實施方式，在診斷或預斷該癌症時，該胞外囊泡的生物標記是選自由E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、誘導型共刺激分子-配體(inducible costimulator-ligand, ICOS-L)、皮離蛋白(dermcidin)、具有EF-手域1之細胞生長調控蛋白(cell growth regulator with EF-hand domain 1, CGREF1)、cochlin蛋白、雙調蛋白(amphiregulin, AREG)、富含白胺酸α的醣蛋白(leucin-rich alpha-glycoprotein, LRG)、鳥嘌呤去胺酶(guanine deaminase)、S100鈣結合蛋白A8 (S100 calcium-binding protein A8, S100A8)、黏蛋白5AC (mucin 5AC, Muc5AC)、嗜中性球明膠相關性脂質運載蛋白(neutrophil-gelatinase associated lipocalin, NGAL)、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-410-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-186-5p及其組合所組成的群組。
在診斷或預斷該退化性疾病時，該胞外囊泡的生物標記是選自由上皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、趨化蛋白(fractalkine)、α-突觸核蛋白(α-synuclein)、L1細胞黏著分子(L1 cell adhesion molecule, L1CAM)、干擾素-α (interferon-alpha, IFN-α)、IFN-γ、生長調控蛋白(growth-regulated protein, GRO)、介白素-10 (interleukin-10, IL-10)、單核球趨化蛋白3 (monocyte-chemotactic protein 3, MCP-3)、胞外體DNA (exosome DNA, exoDNA)及其組合所組成的群組.
在診斷或預斷該感染性疾病時，該胞外囊泡的生物標記是一核酸、脂多醣(lipopolysaccharide)、脂質及／或蛋白質，例如非結構蛋白1 (non-structural protein 1, NS-1)。
在診斷或預斷該老化時，該胞外囊泡的生物標記是選自由α-突觸核蛋白、L1CAM、S100A8、EGF、顆粒性白血球群落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF)、顆粒性巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)、GRO、介白素-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1RA)、IL-1α、IL-4、IL-6、IL-8、干擾素γ誘導蛋白10 (interferon gamma-induced protein 10, IP-10)、單核球趨化蛋白1　(monocyte-chemotactic protein 1, MCP-1)、巨噬細胞發炎蛋白1β (macrophage inflammatory protein-1 beta, MIP-1β)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、趨化蛋白、IFN-α、IFN-γ、巨噬細胞衍生趨化因子(macrophage-derived chemokine, MDC)、exoDNA及其組合所組成的群組。
依據本揭示內容實施方式，各該複數個胞外囊泡的特徵在於具有至少一標記表現於其中及／或其表面，其中該標記是選自由CD9、CD63、CD81、熱休克蛋白60 (heat shock protein 60, HSP60)、HSP90及HSP105所組成的群組；以及具有大小介於30到450奈米的粒徑尺寸。
例示性之適用以本發明方法診斷或預斷的癌症包含，但不限於，胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、腎臟癌、大腸直腸癌、子宮頸癌、卵巢癌、腦癌、前列腺癌、肝癌、黑色素瘤、食道癌、多發性骨髓瘤，以及頭頸部鱗狀細胞癌。
例示性之適用以本發明方法診斷或預斷的退化性疾病包含，但不限於，帕金森氏症(Parkinson’s disease)、阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、失智症、中風、慢性腎臟損傷、慢性肺臟損傷及聽力損失。
可藉由本發明方法診斷或預斷的感染性疾病可由細菌、病毒或真菌所引發。
依據本揭示內容某些實施方式，生物檢體可以是血液、尿液、腦脊液、胸水、惡性腹水、母乳、羊水、產道液體、腸胃道液體、支氣管肺泡灌洗液或唾液。
依據本揭示內容某些實施例，為診斷或預斷癌症，生物檢體是一由個體所分離的尿液檢體，且胞外囊泡的生物標記是選自由E-鈣黏蛋白、S100A8、Muc5AC及其組合所組成的群組，其中當與對照樣本相比較，該生物標記的表現量較高時，可指出該個體具有該癌症，或具有罹患該癌症的風險。
依據本揭示內容某些實施例，胞外囊泡的生物標記是用以診斷或預斷癌症，其中當與對照樣本相比較，該生物檢體中E-鈣黏蛋白、ICOS-L、Muc5AC、皮離蛋白、CGREF1、cochlin蛋白、AREG、LRG、鳥嘌呤去胺酶、S100A8、NGAL、hsa-miR-10a-5p或hsa-miR-182-5p的表現量較高時，以及／或是當與對照樣本相比較，該生物檢體中hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-410-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-186-5p的表現量較低時，可指出該個體具有該癌症，或具有罹患該癌症的風險。
依據本揭示內容某些實施例，用以診斷或預斷該退化性疾病的生物檢體是一由個體所分離的血液檢體、唾液檢體或尿液檢體，且胞外囊泡的生物標記是選自由EGF、趨化蛋白、L1CAM、α-突觸核蛋白、IFN-α、IFN-γ、GRO、IL-10、MCP-3、exoDNA及其組合所組成的群組，其中當與對照樣本相比較，該生物檢體中EGF、趨化蛋白、IFN-α、IFN-γ、GRO、IL-10或MCP-3的表現量較低時，以及／或是當與對照樣本相比較，該生物檢體中L1CAM、α-突觸核蛋白或exoDNA的表現量較高時，可指出該個體具有該退化性疾病，或具有罹患該退化性疾病的風險。
依據本揭示內容某些實施例，用以診斷或預斷該感染性疾病的生物檢體是一由個體所分離的血液或尿液檢體，其中胞外囊泡的生物標記是一核酸、脂多醣或微生物蛋白(例如，NS-1)，且當與對照樣本相比較，該生物標記的表現量較高時，可指出該個體具有該感染性疾病，或具有罹患該感染性疾病的風險。
依據本揭示內容某些實施方式，本發明方法可用以診斷或預斷一個體的老化(即，診斷或預斷一個體是否處於老化狀態)。在一實施例中，胞外囊泡的生物檢體是一由個體所分離的血液檢體，且生物標記是選自由L1CAM、S100A8、α-突觸核蛋白、二基胜肽酶-4 (dipeptidyl peptidase 4, DPP4)、CD90、肝配受器A2 (ephrin receptor A2, EphA2)、IL-2、 IL-12、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotropic factor, BDNF)、b2微球蛋白(b2-microglobulin, B2M)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)、神經絲輕鏈(neurofilament light chain, NFL)、EGF、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-1RA、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1β、TNF-α及其組合所組成的群組，其中當與對照樣本相比較，該生物檢體中EGF的表現量較低時，以及／或是當與該對照樣本相比較，該生物檢體中G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-1RA、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1β或TNF-α的表現量較高時，可指出該個體是處於老化狀態。或者是，胞外囊泡的生物檢體可以是一由個體所分離的尿液檢體，且生物標記是選自由S100A8、DPP4、CD90、EphA2、L1CAM、IL-2、IL-12、BDNF、B2M、CTGF、NFL、EGF、bFGF、G-CSF、趨化蛋白、IFN-α、IFN-γ、MDC、IL-1RA、IL-1α、IL-4、IL-6、IL-8、GRO、IP-10、MCP-1、L1CAM、α-突觸核蛋白、exoDNA及其組合所組成的群組，其中當與對照樣本相比較，該生物檢體中EGF、bFGF、G-CSF、趨化蛋白、IFN-α、IFN-γ、MDC、IL-1RA、IL-1α或IL-4表現量較低時，以及／或是當與對照樣本相比較，該生物檢體中S100A8、IL-6、IL-8、GRO、IP-10、MCP-1、L1CAM、α-突觸核蛋白或exoDNA表現量較高時，可指出該個體是處於老化狀態。
基於診斷或預斷結果，習知技藝人士可對罹患癌症、退化性疾病或感染性疾病的個體，具有罹患癌症、退化性疾病或感染性疾病風臉的個體，或處於老化狀態的個體，投予一有效量的治療藥劑，例如一抗癌藥劑、一抗退化藥劑、一抗感染藥劑(舉例來說，一抗細菌、抗病毒或抗真菌藥劑)，或一抗老化藥劑，以預防或抑制該疾病/狀態的發生及／或進程。據此，本揭示內容的另一態樣提供了一種用以治療一個體之癌症、退化性疾病、感染性疾病或老化的方法。本發明方法包含： (a)由該個體取得一生物檢體； (b)由該生物檢體分離複數個胞外囊泡； (c)決定該複數個胞外囊泡中一生物標記的表現量；以及 (d)依據步驟(c)決定之該生物標記的表現量來治療該癌症、該退化性疾病,該感染性疾病或該老化，其中當與一取自一健康個體之對照樣本中該生物標記的表現量相比較，該複數個胞外囊泡中生物標記的表現量的不同時，則對該個體投予一有效量的治療藥劑。
本發明治療方法的特徵與上述診斷/預斷方法相當類似，為求簡潔，在此不再贅述。
本發明方法的個體較佳是一哺乳動物。依據本揭示內容某些實施例，該個體是一人類。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
I. 定義
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
在本揭示內容中，「診斷」(diagnosis)一詞係指習知技藝人士用以評估及/或決定一個體罹患或產生一特定疾病或狀態之可能性的方法。在本揭示內容中「診斷」(diagnosis)一詞包含利用本發明特定生物標記的表現量(非必要地，可與其他臨床特徵合併使用)來達到診斷一個體之癌症、退化性疾病、感染性疾病或老化的目的。該診斷「確定」不必然表示該診斷是100%準確的。 許多生物標記指出多種病症。本揭示內容之診斷方法可單獨進行，或與其他用以分析疾病、病症或症徵之診斷及/或分期方法同時進行。相較於位於診斷閾值另一側的個體，位於由生物標記表現量所建立之診斷閾值一側的個體更有可能罹患或產生一疾病或一狀態。
「風險」(risk)一詞於此是指一項可能會產生不良結果的可能性，例如，舉例來說，癌症、退化性疾病、感染性疾病及老化等疾病或狀態的發生、進程或復發。
當與個體連用時，「投予」(administered或administering) 在本揭示內容係指一傳遞送模式，其包含，但不限於，靜脈內、關節內、腫瘤內、肌肉內、腹腔內、動脈內、顱內或皮下遞送本揭示內容之藥劑(例如，一抗癌、抗退化、抗病毒或抗老化藥劑)。
「治療」(treatment或treat)一詞此處是包含對一哺乳動物(特別是人類)進行預防性(例如，預防性藥物(prophylactic))、治療性(curative)或舒減性(palliative)治療；且包含(1)預防、治療或減緩一個體罹患一疾病或一狀態(例如癌症、退化性疾病、感染性疾病，或是老化) ，其中該個體為罹患該疾病或該狀態之高風險族群，或是已罹患該疾病或該狀態而尚未確診斷定；(2)抑制一疾病或一狀態(例如抑制其發生)；或是(3)減輕一疾病或一狀態(例如減輕與該疾病或該狀態相關之徵狀)。
「有效量」(effective amount) 在此處係指一藥物的用量足以產生欲求的療效反應。有效量亦指一種化合物或組合物，其治療利益效果超越其毒性或有害影響。具體的有效量取決於多種因素，如欲治療的特定狀況、患者的生理條件(如，患者體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動物或動物的類型、治療持續時間、目前療法(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將有效量表示成藥物的總重量(譬如以克、毫克或微克為單位)或表示成藥物重量與體重之比例(其單位為毫克/公斤(mg/kg))。或者是，可將有效量表示成活性成分(例如，本揭示內容之抗癌、抗退化、抗病毒或抗老化藥劑)的濃度，例如莫耳濃度、重量濃度、體積濃度、重量莫耳濃度、莫耳分率、重量分率及混合比值。具體來說，「有效量」(effective amount)一詞若與本揭示內容之藥劑共同使用時，是指足以減少或減緩個體體內與癌症、退化性疾病、感染性疾病或老化相關之病徵的藥劑劑量。習知技藝人士可依據動物模式的劑量來計算藥物(例如，本揭示內容之抗癌、抗退化、抗病毒或抗老化藥劑)的人體等效劑量(human equivalent dose, HED)。舉例來說，習知技藝人士可依據美國食品藥物管理局(US Food及Drug Administration, FDA)所公告之「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式之最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算人體使用之最高安全劑量。
「個體」(subject)與「病患」(patient)在本揭示內容為可互換的詞彙，是指包含人類的動物，其可接受本發明方法的預斷、診斷及／或治療。除非特定指出，否則「個體」(subject) 或「病患」(patient)一詞同時意指男性及女性。
「健康個體」(healthy subject)一詞是指不具一疾病或狀態的個體，例如未罹患癌症、退化性疾病或感染性疾病的個體，或是不是處於老化狀態的個體(即，年齡小於50歲的個體)。一般來說，「健康個體」(healthy subject)一詞是指一個體，其經診斷後未罹患或具有一疾病或狀態，且未表現出二或多種(例如，二、三、四或五種)與該疾病或狀態相關的病徵。
在本揭示內容中，「處於老化狀態」(in an aging state)一詞是指一年齡大於50歲的個體，且具有一或多種與老化相關的表徵或病徵，舉例來說，頭髮顏色改變、聽力喪失、皺紋、遭受感染的機率增加、中暑或體溫過度的風險增加，以及駝背姿勢。
II. 發明詳細說明
(i) 用以診斷或預斷疾病或狀態的方法
本揭示內容至少部分是基於發明人發現相較於由一對照個體(即，一未罹患癌症、退化性疾病或感染性疾病的個體，或一不是處於老化狀態的個體)所得到的胞外囊泡，由一罹患癌症、退化性疾病或感染性疾病的個體，或一處於老化狀態(即，年齡大於50歲)的個體所得到的胞外囊泡，其囊泡中及／或囊泡表面的某些生物標記具有較高或較低的表現量。因此，本揭示內容提供了一種藉由決定一或多生物標記的表現量來診斷或預斷癌症、退化性疾病、感染性疾病或老化的方法，據此，一習知技藝人士或臨床醫療人員可即時對有需要的個體投予一適當的治療。
用以診斷或預斷一個體之癌症、退化性疾病、感染性疾病或老化的方法包含： (a)由該個體取得一生物檢體； (b)由該生物檢體分離複數個胞外囊泡； (c)決定該複數個胞外囊泡中特殊生物標記的表現量；以及 (d) 依據步驟(c)決定之該生物標記的表現量來診斷或預斷該癌症、該退化性疾病、該感染性疾病或該老化，其中當與一取自一健康個體之對照樣本中該生物標記的表現量相比較，該複數個胞外囊泡中生物標記的表現量的不同(即，較高或較低)時，可指出該個體 具有該癌症、該退化性疾病或該感染性疾病， 具有罹患該癌症、該退化性疾病或該感染性疾病的風險，或是 處於老化狀態。
在步驟(a)中，先由該個體取得一生物檢體。依據操作或使用目的不同，該生物檢體可以是一血液、尿液、腦脊液、胸水、惡性腹水、母乳、羊水、產道液體、腸胃道液體、支氣管肺泡灌洗液，唾液，或其他包含胞外囊泡的生物液體。本發明方法的個體是一哺乳動物，舉例來說，人類、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔子、狗、貓、牛、山羊、綿羊、猴子及馬。依據較佳的實施方式，該個體是人類。
接著，如步驟(b)所述，由該生物檢體分離複數個胞外囊泡。可利用任何本發明所屬技術領域具有通常知識者所知的方法來分離胞外囊泡，例如差速離心(differential centrifugation)、蔗糖梯度離心(sucrose gradient centrifugation)、微過濾(microfiltration)、免疫層析法(immunochromatography)、抗體包覆磁珠(antibody-coated magnetic beads)，以及商業試劑盒(例如，EXOQUICKTM )。依據本揭示內容實施方式，各經分離的胞外囊泡的特徵在於：(1)具有特定標記(即，CD9、CD63、CD81、HSP60、HSP90及／或 HSP105)表現於其中及／或其表面；以及(2)具有大小介於30到450奈米的粒徑尺寸(即，各胞外囊泡的粒徑尺寸可以是30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440或450奈米)；該胞外囊泡包含胞外體(exosome；粒徑大小介於30到150奈米之間)及微囊泡(microvesicle；粒徑大小介於150到450奈米之間)。
分析經分離的胞外囊泡，以確認表現於胞外囊泡中及／或胞外囊泡表面的一或多個生物標記(step (c))；之後，習知技藝人士或臨床醫療人員可依該一或多生物標記診斷或預斷該個體是否罹患一疾病或狀態(即，一癌症、一退化性疾病、一感染性疾病或老化)，或具有罹患該疾病或狀態的風險(步驟(d))。在本揭示內容中，主要是以具有獨特抗體及／或新穎適體之雙特異性與多特異性模組來偵測一或多種生物標記之表現模式。依據本揭示內容實施方式，該胞外囊泡的生物標記是一蛋白或一核酸。例示性之用以決定蛋白表現量的方法包含，但不限於，西方墨點分析、酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、流式細胞儀、微珠測定、免疫層析法、免疫化學發光分析(immunochemiluminescence)，以及生物晶片。例示性之用以決定核酸表現量的方法包含，但不限於，光譜分析、聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)、定量PCR (quantitative PCR, qPCR)、去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)定序，以及核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)定序。
當可想見，步驟(c)所決定的生物標記可隨著生物檢體及本發明方法診斷或預斷的疾病/狀態種類的不同而有所差異。依據本揭示內容某些實施方式，本發明方法是用以診斷或預斷一癌症；在該些實施例中，胞外囊泡的生物標記是選自由E-鈣黏蛋白、ICOS-L、Muc5AC、皮離蛋白、CGREF1、cochlin蛋白、AREG、LRG、鳥嘌呤去胺酶 、S100A8、NGAL、hsa-miR-10a-5p (登錄號：MIMAT0000253)、hsa-miR-182-5p (登錄號：MIMAT0000259)、hsa-miR-10b-5p (登錄號：MIMAT0000254)、hsa-miR-22-3p (登錄號：MIMAT0000077)、hsa-miR-181a-5p (登錄號：MIMAT0000256)、hsa-miR-21-5p (登錄號：MIMAT0000076)、hsa-miR-143-3p (登錄號：MIMAT0000435)、hsa-miR-127-3p (登錄號：MIMAT0000446)、hsa-miR-221-3p (登錄號：MIMAT0000278)、hsa-miR-222-3p (登錄號：MIMAT0000279)、hsa-let-7i-5p (登錄號：MIMAT0000415)、hsa-miR-27b-3p (登錄號：MIMAT0000419)、hsa-miR-26a-5p (登錄號：MIMAT0000082)、hsa-miR-100-5p (登錄號：MIMAT0000098)、hsa-miR-151a-3p (登錄號：MIMAT0000757)、hsa-miR-92a-3p (登錄號：MIMAT0000092)、hsa-miR-21-3p (登錄號：MIMAT0004494)、hsa-miR-125b-5p (登錄號：MIMAT0000423)、hsa-miR-181b-5p (登錄號：MIMAT0000257)、hsa-miR-31-5p (登錄號：MIMAT0000089)、hsa-miR-30a-5p (登錄號：MIMAT0000087)、hsa-let-7f-5p (登錄號：MIMAT0000067)、hsa-miR-199a-3p (登錄號：MIMAT0000232)、hsa-miR-28-3p (登錄號：MIMAT0004502)、hsa-miR-148a-3p (登錄號：MIMAT0000243)、hsa-miR-409-3p (登錄號：MIMAT0001639)、hsa-miR-16-5p (登錄號：MIMAT0000069)、hsa-miR-99b-5p (登錄號：MIMAT0000689)、hsa-miR-381-3p (登錄號：MIMAT0000736)、hsa-miR-25-3p (登錄號：MIMAT0000081)、hsa-miR-410-3p (登錄號：MIMAT0002171)、hsa-miR-29a-3p (登錄號：MIMAT0000086)、hsa-miR-199b-3p (登錄號：MIMAT0004563)、hsa-miR-125a-5p (登錄號：MIMAT0000443)、hsa-miR-186-5p (登錄號：MIMAT0000456)及其組合所組成的群組。在某些實施例中，生物檢體是一取自個體的尿液檢體，且生物標記是選自由E-鈣黏蛋白、S100A8、Muc5AC、α-突觸核蛋白、L1CAM及其組合所組成的群組，其中當與對照樣本相比較，生物檢體中生物標記的表現量較高時，可指出該個體具有癌症，或具有罹患癌症的風險。在某些實施例中，當與該對照樣本相比較，該生物檢體中E-鈣黏蛋白、ICOS-L、Muc5AC、皮離蛋白、CGREF1、cochlin蛋白、AREG、LRG、鳥嘌呤去胺酶、S100A8、NGAL、hsa-miR-10a-5p或hsa-miR-182-5p的表現量較高時，可指出該個體具有癌症，或具有罹患癌症的風險。在某些實施例中，, 當與該對照樣本相比較，該生物檢體中hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-410-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-186-5p的表現量較低時，可指出該個體具有癌症，或具有罹患癌症的風險。
依據本揭示內容某些實施方式，本發明方法是用以診斷或預斷一退化性疾病；在該些實施例中，胞外囊泡的生物標記是選自由ICOS-L、Muc5AC、皮離蛋白、CGREF1、cochlin蛋白、AREG、LRG、鳥嘌呤去胺酶、S100A8、DPP4、CD90、EphA2 IL-2、IL-12、BDNF、B2M、CTGF、NFL、NGAL、α-突觸核蛋白、L1CAM、EGF、趨化蛋白、IFN-α、IFN-γ、GRO、IL-10、MCP-1、MCP-3、exoDNA及其組合所組成的群組。在某些實施例中，生物檢體是一取自個體的血液檢體或尿液檢體，其中當與對照樣本相比較，生物檢體中EGF、趨化蛋白、IFN-α、IFN-γ、GRO、IL-10或MCP-3的表現量較低時，可指出該個體具有退化性疾病，或具有罹患退化性疾病的風險。在某些實施例中，生物檢體是一取自個體的血液檢體、唾液檢體或尿液檢體，其中當與對照樣本相比較，生物檢體中exoDNA的表現量較高時，可指出該個體具有退化性疾病，或具有罹患退化性疾病的風險。
依據本揭示內容某些實施方式，本發明方法是用以診斷或預斷一感染性疾病。在某些實施例中，生物檢體是一取自個體的尿液檢體，其中胞外囊泡的生物標記是一微生物核酸、脂多醣及／或蛋白(例如NS-1蛋白)，且當與對照樣本相比較，生物檢體中生物標記的表現量較高時，可指出該個體具有感染性疾病，或具有罹患感染性疾病的風險。
依據本揭示內容替代性實施方式，本發明方法是用以診斷或預斷一個體的老化狀態。在某些實施例中，生物檢體是一取自個體的血液檢體，其中當與對照樣本相比較，生物檢體中胞外囊泡之EGF的表現量較低時，可指出該個體是處於老化狀態。在某些實施例中，生物檢體是一取自個體的血液檢體，其中當與對照樣本相比較，生物檢體中胞外囊泡之G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-1RA、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1β或TNF-α的表現量較高時，可指出該個體是處於老化狀態。在某些實施例中，生物檢體是一取自個體的尿液檢體，其中當與對照樣本相比較，生物檢體中胞外囊泡之EGF、bFGF、G-CSF、趨化蛋白、IFN-α、IFN-γ、MDC、IL-1RA、IL-1α或IL-4表現量較低時，可指出該個體是處於老化狀態。在某些實施例中，生物檢體是一取自個體的尿液檢體，其中當與對照樣本相比較，生物檢體中胞外囊泡之S100A8、DPP4、CD90、EphA2、IL-2、IL-12、BDNF、B2M、CTGF、NFL、IL-6、IL-8、GRO、IP-10、MCP-1、L1CAM、α-突觸核蛋白或exoDNA表現量較高時，可指出該個體是處於老化狀態。在某些實施例中，當與對照樣本相比較，生物檢體中胞外囊泡之hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-410-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-186-5p較低時，可指出該個體是處於老化狀態，或是有發展為罹患或未罹患退化性疾病之老化狀態的風險。
例示性之適用以本發明方法診斷或預斷的癌症包含，但不限於，胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、腎臟癌、大腸直腸癌、子宮頸癌、卵巢癌、腦癌、前列腺癌、肝癌、黑色素瘤、食道癌、多發性骨髓瘤，以及頭頸部鱗狀細胞癌。
例示性之適用以本發明方法診斷或預斷的退化性疾病包含，但不限於，帕金森氏症、阿茲海默症、失智症、中風、慢性腎臟損傷、慢性肺臟損傷及聽力損失
可藉由本發明方法診斷或預斷的感染性疾病可以由一細菌、一病毒或一真菌所引發。
(ii) 用以治療疾病或狀態的方法
本揭示內容亦提供一種基於本揭示內容第(I) 部分所述之診斷或預斷結果，據以治療一個體之癌症、退化性疾病、感染性疾病或老化的方法。具體來說，用以治療一個體之癌症、退化性疾病、感染性疾病或老化的方法包含： (a)由該個體取得一生物檢體； (b)由該生物檢體分離複數個胞外囊泡； (c)決定該複數個胞外囊泡之特定生物標記的表現量；以及 (d)基於步驟(c)決定的生物標記的表現量來治療該癌症、退化性疾病、感染性疾病或老化，其中當與一取自一健康個體之對照樣本中該生物標記的表現量相比較，該生物樣本中該生物標記的表現量的不同(即，較高或較低)時，則對該個體投予一有效量之治療藥劑。
治療方法之步驟(a)-(c)與本揭示內容第(I) 部分的診斷或預斷方法相似，因此，為求簡潔，在此不再贅述。
在步驟(d)中，習知技藝人士或臨床醫療人員可依據步驟(c)決定的表現量，對一有需要的個體投予一有效量的治療藥劑(例如，一抗癌藥劑、一抗退化藥劑、一抗病毒藥劑，或是一抗老化藥劑)。具體來說，如本揭示內容第(I) 部分所述，當一個體的一或多個生物標記與對照檢體不同，則表示該個體具有或有罹患癌症、退化性疾病或感染性疾病的風險，或是處於老化狀態；因此，習知技藝人士或臨床醫療人員可對該個體投予一適當的治療，據以預防、改善及／或減緩該癌症、退化性疾病、感染性疾病或老化的發生，或是與該癌症、退化性疾病、感染性疾病或老化相關的病徵。
在本揭示內容中，是對相較於健康個體，胞外囊泡之一或多個生物標記具有偏差表現模式之個體投予該治療藥劑，其中該治療藥劑可以是一促效劑(agonist；例如RNA促效劑)或一拮抗劑(antagonist；例如RNA拮抗劑、抗體或適體)，據以改善該個體之胞外囊泡中一或多個生物標記的偏差表現模式。
例示性之抗癌藥劑包含，但不限於，薑黃素、干擾素(interferon, IFN)、細胞激素、抗體(例如曲妥珠單抗(trastuzumab, HERCEPTIN®)、T-DM1、貝伐單抗(bevacizumab, AVASTIN®)、西妥昔單抗(cetuximab, ERBITUX®)、帕尼單抗(panitumumab, VECTIBIX®)、利妥昔(rituximab, RITUXAN®)及百克沙(tositumomab, BEXXAR®))、抗雌性素(anti-estrogen，例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)及甲地孕酮(megestrol))、黃體釋素促效劑(LHRH agonist，例如戈舍瑞林(goscrclin)及醋酸亮丙瑞林(leuprolide))、抗雄性素(anti-androgen，例如氟他胺(flutamide)及比卡魯胺(bicalutamide))、光動力治療(photodynamic therapies，例如維替泊芬(vertoporfin, BPD-MA)、酞菁(phthalocyanine)、光敏劑Pc4 (photosensitizer Pc4)及去甲氧基竹紅菌素(demethoxy-hypocrellin A, 2BA-2-DMHA))、氮芥(nitrogen mustard，例如環磷醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氯乙環磷醯胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、雌莫司汀(estramustine)及美法崙(melphalan))、亞硝基尿素(nitrosoureas，例如卡莫司汀(carmustine, BCNU)及洛莫司汀(lomustine, CCNU))、烷基磺酸(alkylsulphonate，例如白消安(busulfan)及蘇消安(treosulfan))、三氮烯(triazene，例如達卡巴嗪(dacarbazine)及替莫唑胺(temozolomide))、含鉑化合物(platinum containing compound，例如順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)及奧沙利鉑(oxaliplatin))、長春花生物鹼(vinca alkaloid，例如長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)及長春瑞濱(vinorelbine))、類紫杉醇(taxoid，例如紫杉醇(paclitaxel)或與奈米粒子白蛋白結合之紫杉醇(Abraxane)、與十二碳六烯酸結合之紫杉醇(DHA-paclitaxel, Taxoprexin)、與聚谷氨酸結合之紫杉醇(PG-paclitaxel, paclitaxel poliglumex, CT-2103, XYOTAX)、腫瘤活化前趨藥物ANG1005(Angiopep-2 bound to three molecules of paclitaxel)、紫杉醇-EC-1 (paclitaxel bound to the erbB2-recognizing peptide EC-1)及與葡萄糖結合之紫杉醇(例如依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)、9-氨基喜樹鹹(9-aminocamptothecin)、康托替康(camptoirinotecan)、伊立替康(irinotecan)、甲磺酸(crisnatol)及絲裂黴素C (mytomycin C))等紫杉醇等效物)、抗代謝藥物(anti-metabolite)、二氫葉酸還原酶抑制劑(DHFR inhibitor，例如氨甲喋呤(methotrexate)、二氯甲氨蝶呤(dichloromethotrexate)、三甲蝶呤(trimetrexate)及依達曲沙(edatrexate))、肌苷-5'-單磷酸去氫酶抑制劑(IMP dehydrogenase inhibitor，例如黴酚酸(mycophenolic acid)、噻唑呋林(tiazofurin)、利巴韋林(ribavirin)及EICAR))、核糖核苷酸還原酶抑制劑(ribonuclotide reductase inhibitor，例如羥基尿素(hydroxyurea)及去鐵胺(deferoxamine))、尿嘧啶相似物(uracil analog，例如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)、氟尿苷(floxuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、雷替曲塞(ratitrexed)、替加氟尿嘧啶(tegafur-uracil)及卡培他濱(capecitabine))、胞嘧啶相似物(cytosine analog，例如阿糖胞苷(cytarabine, ara C或cytosine arabinoside)及氟達拉濱(fludarabine))、嘌呤相似物(purine analog，例如巰基嘌呤(mercaptopurine)及硫鳥嘌呤(Thioguanine))、維生素D3相似物(Vitamin D3 analog，例如EB 1089、CB 1093及KH 1060)、異戊二烯抑制劑(isoprenylation inhibitor，例如洛伐他汀(lovastatin))、多巴胺能神經毒素(dopaminergic neurotoxin，例如1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion))、細胞週期抑制劑(例如星形孢菌素(staurosporine))、放線菌素(actinomycin，例如放線菌素D)、博萊黴素(bleomycin，例如博萊黴素A2、博萊黴素B2及培洛黴素(peplomycin))、蒽環類藥物(anthracycline，例如柔紅黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、聚乙二醇化脂質體多柔比星(pegylated liposomal doxorubicin)、伊達比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、佐柔比星(zorubicin)及米托蒽醌(mitoxantrone))、多重抗藥性抑制劑(MDR inhibitor，例如維拉帕米(verapamil))、鈣離子三磷酸腺苷酶抑制劑(Ca2+ATPase inhibitor，例如毒胡蘿蔔素(thapsigargin))、伊馬替尼(imatinib)、沙利度胺(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide)、酪胺酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，例如阿西替尼(axitinib, AG013736)、波舒(bosutinib, SKI-606)、尼布(cediranib, RECENTINTM, AZD2171)、達沙替尼(dasatinib, SPRYCEL®, BMS-354825)、厄洛替尼(erlotinib, TARCEVA®)、吉非替尼(gefitinib, IRESSA®)、伊馬替尼(imatinib, Gleevec®, CGP57148B, STI-571)、拉帕替尼(lapatinib, TYKERB®, TYVERB®)、來他替尼(lestaurtinib, CEP-701)、那替尼(neratinib, HKI-272)、尼洛(nilotinib, TASIGNA®)、馬沙尼(semaxanib, semaxinib, SU5416)、舒尼替尼(sunitinib, SUTENT®, SU11248)、托西尼布(toceranib, PALLADIA®)、凡德他尼(vandetanib, ZACTIMA®, ZD6474)、瓦他拉尼(vatalanib, PTK787, PTK/ZK)、曲妥珠單抗(trastuzumab, HERCEPTIN®)、貝伐單抗(bevacizumab, AVASTIN®)、利妥昔單抗(rituximab, RITUXAN®)、西妥昔單抗(cetuximab, ERBITUX®)、帕尼單抗(panitumumab, VECTIBIX®)、蘭尼單抗(ranibizumab, Lucentis®)、尼洛(nilotinib, TASIGNA®)、索拉非尼(sorafenib, NEXAVAR®)、依維莫司(everolimus, AFINITOR®)、阿崙單抗(alemtuzumab, CAMPATH®)、吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin, MYLOTARG®)、西羅莫司(temsirolimus, TORISEL®)、ENMD-2076、PCI-32765、AC220、多韋替尼乳酸鹽(dovitinib lactate, TKI258, CHIR-258)、BIBW 2992 (TOVOKTM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120 (VARGATEF®)、AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、替洛尼(tivozanib, AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647、及/或XL228)、蛋白酶抑制劑(proteasome inhibitor，例如硼替佐米(bortezomib, Velcade))、哺乳類斥消靈標的蛋白抑制劑(mTOR inhibitor，例如雷帕黴素(rapamycin)、西羅莫司(temsirolimus, CCI-779)、依維莫司(everolimus, RAD-001)、雷帕黴素衍生物(ridaforolimus, AP23573, Ariad)、AZD8055 (AstraZeneca)、BEZ235 (Novartis)、BGT226 (Norvartis)、XL765 (Sanofi Aventis)、PF-4691502 (Pfizer)、GDC0980 (Genetech)、SF1126 (Semafoe)及OSI-027 (OSI))、奧利默森(oblimersen)、吉西他濱(gemcitabine)、洋紅黴素(carminomycin)、亞葉酸鈣(leucovorin)、培美曲塞(pemetrexed)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、達卡巴嗪(dacarbazine)、甲基芐肼(procarbizine或procarbazine)、潑尼松龍(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、喜樹鹼(campathecin)、普卡黴素(plicamycin)、天門冬醯胺酶(asparaginase)、氨基蝶呤(aminopterin)、甲氨蝶呤(methopterin)、紫菜黴素(porfiromycin)、美法崙(melphalan)、異長春鹼(leurosidine)、環氧長春鹼(leurosine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、曲貝替定(trabectedin)、海綿內酯(discodermolide)、洋紅黴素(carminomycin)及六甲基三聚氰胺(hexamethyl melamine)。
例示性的抗退化藥劑包含，但不限於，薑黃素、支鏈胺基酸(branched-chain amino acid, BCAA；包含白胺酸(leucine)、異白胺酸(isoleucine)，以及纈胺酸(valine))、膽鹼酯酶抑制劑(例如，多奈派齊(donepezil, Aricept)、加蘭他敏(galantamine, Razadyne)，及憶思能(rivastigmine, Exelon))、美金剛(memantine, Namenda)、ω3脂肪酸(omega-3 fatty acid)、銀杏(ginkgo)、維生素(包含維生素A、維生素C、維生素D及維生素E)、左旋多巴(levodopa)、碳多巴(carbidopa)、多巴胺促效劑(dopamine agonist；例如，普拉克索(pramipexole, Mirapex)、羅匹尼羅(ropinirole, Requip)、羅替高汀(rotigotine, Neupro)，及阿朴嗎啡(apomorphine, Apokyn))、單胺氧化酶抑制劑(MAO抑制劑；例如，希利治林(selegiline, Eldepryl, Zelapar)、雷沙治林(rasagiline, Azilect)，及沙非(safinamide, Xadago))、兒茶酚O-甲基轉移酶抑制劑(COMT抑制劑；例如，恩他卡朋(entacapone, Comtan)及託卡朋(tolcapone, Tasmar))、抗膽鹼(anticholinergic；例如，苯甲托品(benztropine, Cogentin)及苯海索(trihexyphenidyl))，以及金剛烷胺(amantadine)。
例示性之抗感染劑包含，但不限於，LL37、IFN-α、親水性及疏水性抗生素及適體。
例示性之抗老化劑包含，但不限於，薑黃素、輔酶Q10、葉黃素(xanthophyll，例如蝦青素、岩藻黃素(fucoxanthin)及玉米黃質(zeaxanthin))、L-麩胺基硫、類視色素(retinoid)、α-羥酸、β-羥酸及黃體素(lutein)。或者是，抗老化劑可以是一蛋白醣、一醣蛋白或一醣脂質，其非必要性地可裝載至一骨架上，以增加其組織局部性分布。
可利用適當路徑對該個體投予本發明治療藥劑，例示性之適當路徑包含，局部、黏膜(例如，結膜內、鼻腔內或氣管內)、口服、脊髓內、靜脈內、動脈內、肌肉內、皮下、關節內、心室內、腦室內、腹腔內、腫瘤內，以及中耳內投予。
當可想見，可單獨對個體施予本發明方法，或將本發明方法與另一療法合併施予至個體，其中所述另一療法對治療癌症、退化性疾病、感染性疾病或老化有所助益，舉例來說，抗氧化劑或免疫療法。依據治療目的不同，本發明方法可於施予所述另一療法之前、同時或之後，投予至個體。
(iii) 生物標記的用途
本揭示內容另一態樣是關於生物標記用於製備試劑盒的用途。本揭示內容的用途的特徵在於： 該生物標記為表現於胞外囊泡的一蛋白或一核酸； 該試劑盒用於診斷或預斷一個體的一癌症、一退化性疾病、一感染性疾病或一老化，其中 在診斷或預斷該癌症時，該生物標記是選自由E-鈣黏蛋白、ICOS-L、Muc5AC、皮離蛋白、CGREF1、cochlin蛋白、AREG、LRG、鳥嘌呤去胺酶 、S100A8、NGAL、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-410-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-186-5p及其組合所組成的群組所組成的群組； 在診斷或預斷該退化性疾病時，該生物標記是選自由DPP4、CD90、EphA2、IL-2、IL-12、BDNF、B2M、CTGF、NFL、L1CAM、α-突觸核蛋白、EGF、趨化蛋白、IFN-α、IFN-γ、GRO、IL-10、MCP-3、核酸(例如exoDNA)及其組合所組成的群組所組成的群組； 在診斷或預斷該感染性疾病時，該生物標記是NS-1； 在診斷或預斷該老化時，該生物標記是選自由S100A8、DPP4、CD90、EphA2、IL-2、IL-12、BDNF、B2M、CTGF、NFL、EGF、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-1RA、IL-1α、IL-4、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1β、TNF-α、bFGF、趨化蛋白、IFN-α、IFN-γ、MDC、L1CAM、α-突觸核蛋白、核酸(例如exoDNA)及其組合所組成的群組所組成的群組；以及 依據該生物標記的表現量來診斷或預斷該個體是否具有該癌症、該退化性疾病、該感染性疾病或該老化，其中當與一取自一健康個體之對照樣本中該生物標記的表現量相比較，該生物樣本中該生物標記的表現量的不同可指出該個體具有或具有罹患該癌症、該退化性疾病或該感染性疾病的風險，或是處於老化狀態。
用以決定生物標記表現量的方法，以及之後依據表現量來診斷或預斷疾病/狀態的方法，與本揭示內容第(I) 部分所述之方法相似，因此，為求簡潔，在此不再贅述。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。實施例
材料及方法
由不同細胞分離胞外囊泡
將由臍帶分離之間葉幹細胞及DLD-1癌細胞以每毫升1×105 細胞的濃度分別培養於包含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的培養液24小時，之後以無血清培養液置換。48小時後，以孔徑大小為0.45微米的微過濾器過濾無血清的培養液(上清液)，藉以移除細胞碎屑及可能的細菌污染；之後注入0.03微米的過濾器，以收集及濃縮(200倍)保留於0.03微米過濾器上的胞外囊泡。收集到的胞外囊泡的粒徑大小介於30到450奈米之間。在本實驗中，將由ucMSC收集的胞外囊泡命名為「MEV」，而將由DLD-1收集的胞外囊泡命名為「DEV」。依據奈米粒子追蹤分析儀的分析結果，MEV及DEV的平均蛋白濃度為每毫升1085.1微克(1085.1 μg/ml；約為每毫升5.0×1010 到10×1010 個囊泡)。
由組織液分離胞外囊泡
本研究包含四組個體：(1)罹患頭頸部癌的癌症病患；(2)帕金森氏症病患；(3)感染登革病毒且具有登革熱的病患；以及(4)年齡大於50歲的個體。由該些個體分離其血液及尿液檢體。
將由尿液檢體(30毫升)所分離的胞外囊泡進行一系列的離心(100倍濃縮)，並以0.45微米、0.22微米及0.02微米過濾膜過濾。收集滴液分餾段以分析純化效率。
以EXOQUICKTM 沉澱由血漿來製備血液的胞外囊泡。簡單來說，將0.5毫升的血漿注入0.126毫升的EXOQUICKTM 沉澱，於4°C反應30鐘後，以1,500 ×g的轉速離心30分鐘。將血漿胞外囊泡的沉澱物重新懸浮為0.5毫升，並分裝為5等分。收集上清液以分析純化效率。
決定 MEV 及 DEV 的表現資料
以蛋白分析試劑盒來測量MEV及DEV的蛋白濃度，之後利用ITRAQ™ (同量異位標誌以進行相對及絕對定量分析)處理3批檢體之混合蛋白質。ITRAQ™試驗是基於以化合物(其可產生同量異位片段)標誌之胜肽來定量分析蛋白含量的方法。Applied Biosystems ITRAQ™試劑 (Applied Biosystems Inc., USA)包含四種同質性(不同質量)異位試劑：ITRAQ™試劑114、ITRAQ™試劑115、ITRAQ™試劑116，以及ITRAQ™試劑117，以標記EV的蛋白，之後以LC/MS-MS進行分析。ITRAQ™共確認1034種蛋白，其中相較於MEV，在1034種蛋白中共有11種蛋白於DEV中具有較高的表現量。所述11種於DEV中具有較高表現量的蛋白分別為E-鈣黏蛋白、ISCO-L、Muc5AC、皮離蛋白、CGREF1、cochlin蛋白、AREG、LRG、鳥嘌呤去胺酶、S100A8及NGAL。
決定 MEV 及 DEV 的 miRNA 表現資料
以裂解試劑收集MEV或DEV的RNA檢體，其中是將700微升的裂解緩衝液加入MEV或DEV沉澱物，於室溫均質化處理5分鐘，之後加入140微升的氯仿，劇烈振盪15秒。以 12,000 g的轉速於4°C離心15分鐘，以收集總RNA檢體。將收集的RNA檢體注入TRUSEQ®小RNA庫製備試劑盒，並以5'及3'連接子接合RNA片段的二端，以製備cDNA產物(約為140 bp)。以次世代定序(next generation sequencing, NGS)來分析MEV及DEV的miRNA表現資料。結果顯示共有36種miRNA於MEV及DEV中具有不同的表現量，其中相較於MEV，2種miRNA (即miR-10a及miR-182a)於DEV中具有較高的表現量，而有34種miRNA於 DEV中具有較低的表現量。以RT-PCT定量確認其中10種miRNA。
西方墨點分析
於變性條件下，將20微克之取自血液、唾液或尿液之胞外囊泡的總蛋白進行SDS-PAGE試驗。電泳分析後，以半乾式轉染裝置將蛋白凝膠轉染至硝化鑯維膜上。將膜置於溶於Tris緩衝液(50 mM)之脫脂牛奶中，以阻斷非專一性結合；之後加入抗體(1: 2,000稀釋)或適體(100 nM, 舉例來說，序列編號：1或2之適體，其分別對E-鈣黏蛋白及黏蛋白5AC具有專一性)。以Tris緩衝液洗滌，以移除未結合之抗體或適體，之後以卵白素-HRP化學發光反應來偵測特定蛋白的表現量。
以免疫化學發光分析捕捉組織液中特定胞外囊泡
將1-10毫升的組織液注入磁性圓筒中。以高親和性磁珠捕捉胞外囊泡，並使未結合之溶液滴入滴液分餾段。利用免疫印漬法(immunoblot)、親和性連接螢光轉導(affinity-linked fluorophotonic transduction)、化學發光分析或磁電轉導(magnetoelectronic transduction)來捕捉以配體包覆的磁珠，據以偵測特定蛋白(以抗體或適體捕捉或偵測)或核酸(例如，miRNA)(以RT-PCT或適體捕捉或偵測)的表現。
以免疫層析法捕捉組織液中特定胞外囊泡
將胞外囊泡與抗CD63、抗CD9或抗CD81抗體(1: 1,000稀釋)混合作用5分鐘，之後進行免疫層析法15分鐘，其中是以玻璃纖維建構條帶上極，且以對特定胞外囊泡之生物標記具有高度親和力的適體點漬之。亦或是可以對胞外囊泡之生物標記具有專一性的抗體來取代上述用以標記胞外囊泡之適體。在本實驗中，將10微升的胞外囊泡(多於100或1000個囊泡(顆粒))與20微升的抗體(每毫升0.2毫克)或適體(100 nM，有或無與金奈米粒子(40奈米，20 OD)以1:1比例預先沉澱)混合，之後以60微升的Tris緩衝液(50 mM)點漬於免疫層析條帶的底部。大分子會在免疫層析中移動到條點的上極，其中在玻璃纖維區域具有100 nM之適體，可專一性保留胞外囊泡。在有金奈米粒子連接的情況下，無須使用二級抗體來顯色；而在無金奈米粒子連接的情況下，則需使用具有化學發生或螢光特性的二級抗體，以偵測特定胞外囊泡中生物標記的表現量。
偵測組織液之胞外囊泡的 miRNA
利用EXOQUICKTM 以4:1的比例來沉澱個體之血液或尿液檢體中的胞外囊泡。洗滌及裂解胞外囊泡沉澱物，以釋放其中的miRNA。將miRNA反轉錄為cDNA後，藉由特定引子進行定量PCR反應。舉例來說，hsa-miR-182-5p具有序列編號：3的序列，其可利用序列編號：4及5的引子來進行分析；hsa-miR-127-3p具有序列編號：6的序列，其可利用序列編號：7及8的引子來進行分析；hsa-miR-183-5p具有序列編號：9的序列，其可利用序列編號：10及11的引子來進行分析；hsa-miR-143-3p具有序列編號：12的序列，其可利用序列編號：13及14的引子來進行分析；hsa-miR-181a-5p具有序列編號：15的序列，其可利用序列編號：16及17的引子來進行分析；hsa-let-7a-5p具有序列編號：18的序列，其可利用序列編號：19及20的引子來進行分析；hsa-let-7f-5p具有序列編號：21的序列，其可利用序列編號：22及23的引子來進行分析；hsa-miR-199a-3p具有序列編號：24的序列，其可利用序列編號：25及26的引子來進行分析；hsa-miR-29a-5p具有序列編號：27的序列，其可利用序列編號：28及29;及hsa-miR-10a具有序列編號：30的序列，其可利用序列編號：31及32。
偵測組織液之胞外囊泡的 exoDNA
以橘G光譜分析(Orange G spectrophotometry)來檢測由個體之尿液所分離的胞外囊泡，據以偵測其exoDNA。簡單來說，將濃縮的胞外囊泡檢體與Tris緩衝液以1:4的比例混合，並加熱30分鐘以裂解胞外囊泡。取20微升的胞外囊泡溶液與0.015%橘G溶液混合，以染色雙股DNA，之後稀釋至200微升，於476/590奈米之激發/發散波長下進行光譜分析。基於已知DNA濃度所建立的標準曲線來計算exoDNA的濃度，並以1毫克之由BCA蛋白試驗測得的總胞外囊泡蛋白量進行標準化計算。
實施例 1 確認分離之胞外囊泡
利用奈米粒子追蹤分析儀及西方墨點技術來分析以材料及方法所述流程所分離的胞外囊泡，據以確認其數量，以及四穿膜蛋白(tetraspanin；包含CD9、CD63及CD81)及囊泡蛋白(包含HSP60、HSP90及HSP105)的表現量。由奈米粒子追蹤分析儀的分析結果可知，依據尿液濃度的不同，尿液胞外囊泡(以下簡稱「 UEV」)的囊泡數量約為0.5×1011 到5.1×1011 個，而血漿胞外囊泡(以下簡稱「PEV」) 的囊泡數量則約為5.4×1011 到7.8×1011 個，其中胞外囊泡分餾段(即，保甶於過濾膜或經EXOQUICKTM 沉澱的成分)的囊泡數量顯著高於滴液分餾段的囊泡數量(結果未顯示)。UEV及PEV的粒徑大小約介於80及160奈米之間。
西方墨點分析的結果指出，由血漿、尿液及唾液所分離的胞外囊泡(即，PEV、UEV及SEV)皆會表現四穿膜蛋白(即，CD9、CD63及／或CD81)(第1圖)以及囊泡蛋白(即，HSP60、HSP90及／或HSP105)，其中CD9於UEV的表現量會高於PEV的表現量，而CD81於PEV的表現量則會高於UEV的表現量(第1圖)。於滴液分餾店無偵測到任何四穿膜蛋白的表現(第1圖)。基於該表現差異，CD9及CD81可分別作為後續實驗中捕捉UEV及PEV的標的。
實施例 2 確認由癌化及非癌化之細胞或組織分離之胞外囊泡的表現差異
2.1 MEV 及 DEV 中生物標記的表現量
首先以ITRAQ™來分析MEV及DEV的蛋白表現資料。分析結果指出，當將差異設定為改變>5倍或>1/5倍時，共有21種蛋白於MEV及DEV中具有不同的表現量，其中相較於MEV，11種蛋白於DEV中具有較高的表現量，包含E-鈣黏蛋白、ICOS-L、Muc5AC、皮離蛋白、CGREF1、cochlin蛋白、AREG、LRG、鳥嘌呤去胺酶、S100A8及NGAL (結果未顯示)。西方墨點分析結果更進一步確認，DEV中E-鈣黏蛋白及S100A8的表現量明顯高於MEV中E-鈣黏蛋白及S100A8的表現量(第2A圖)。
除了蛋白表現資料外，本實施例亦分析MEV及DEV的miRNA表現資料，結果總結於表1中。相較於MEV，hsa-miR-10a-5p及hsa-miR-182-5p於DEV中具有較高的表現量，而hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-410-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-125a-5p及hsa-miR-186-5p則於DEV中具有較低的表現量(表1)。
表1  MEV及DEV的miRNA表現資料
hsamiR 編號 DEV 螢光單位 MEV 螢光單位
hsa-miR-10a-5p 913,4 216,5
hsa-miR-10b-5p 16,1 126,3
hsa-miR-22-3p 1,2 69,4
hsa-miR-181a-5p 2,5 73,4
hsa-miR-21-5p 1,6 63,1
hsa-miR-143-3p UD 63,5
hsa-miR-127-3p UD 34,6
hsa-miR-191-5p 20,0 20,5
hsa-miR-221-3p 1,4 23,4
hsa-miR-222-3p 2,3 14,6
hsa-let-7i-5p UD 17,2
hsa-miR-27b-3p 0.6 14,6
hsa-miR-26a-5p 2,2 12,8
hsa-miR-100-5p   UD 9,4
hsa-miR-151a-3p 2,7 7,3
hsa-miR-92a-3p 2,1 6,7
hsa-miR-21-3p UD 13,8
hsa-miR-125b-5p   UD 5,5
hsa-miR-181b-5p UD 9,6
hsa-miR-31-5p   UD 8,3
hsa-miR-30a-5p   UD 7,6
hsa-let-7f-5p 2,6 5,6
hsa-miR-199a-3p   UD 10,6
hsa-miR-28-3p 1,6 6,0
hsa-miR-148a-3p 1,2 5,8
hsa-miR-409-3p   UD 6,7
hsa-miR-16-5p UD 8,3
hsa-miR-99b-5p UD 4,5
hsa-miR-381-3p   UD 6,6
hsa-miR-25-3p 1,2 5,3
hsa-miR-410-3p UD 4,6
hsa-miR-182-5p 8,4 1,0
hsa-miR-29a-3p   UD 4,5
hsa-miR-199b-3p UD 5,3
hsa-miR-125a-5p UD 2,0
hsa-miR-186-5p 0.5 3,4
UD:無法偵測。
第2B及2C圖的量化結果亦確認miR-181a及miR-127a於MEV的表現量顯著高於DEV中的表現量.
2.2 具有或不具有癌症之個體中生物標記的表現量
本實施例將進一步確認實施例2.1所分析的表現差異，其中是分別由健康個體以及罹患頭頸部癌之癌症病患取得尿液檢體，並依據材料及方法所述之流程由該尿液檢體分離胞外囊泡。如第3圖結果所述，相較於對照組(即，由健康個體所分離的UEV)，E-鈣黏蛋白及黏蛋白5AC於癌症病患之UEV中具有明顯較高的表現量。
該些結果證實，任一種第2-3圖及表1所列示之生物標記皆可用以區分癌化及非癌化組織／細胞，因此，可作為用以預斷或診斷癌症發生之癌症標記。
實施例 3 確認健康個體及帕金森氏症病患之胞外囊泡的表現差異
分別由罹患或未罹患帕金森氏症的老年人(年齡大於50歲)分離其尿液檢體，之後依據材料及方法所述之流程由該尿液檢體分離胞外囊泡。如表2所總結，相較於由健康個體所分離的UEV，帕金森氏症病患之UEV具有較低量之EGF、趨化蛋白、IFN-α、IFN-γ、GRO、IL-10及MCP-3。
表2  罹患或未罹患帕金森氏症之UEV中特定生物標記的表現量
生長因子/ 細胞激素 老年人 微微克/ 毫升(SE) 帕金森氏症 微微克/ 毫升(SE)
EGF* 1523 (266) 1109 (113)
FGF-2 6.3 (3.3) 5.9 (1.6)
趨化蛋白* 26 (10) 18 (5)
IFN-α2* 14.5 (4.5) 9.0 (1.3)
IFN-γ* 4.6 (2.0) 1.4 (0.5)
GRO* 41 (19) 16 (5)
IL-10* 271 (89) 77 (35)
MCP-3* 5.7 (2.0) 2.2 (0.9)
(1) * P>0.05。 (2) 老年人及年輕人的數量分別為10及24。
結果證實，EGF、趨化蛋白、IFN-α、IFN-γ、GRO、IL-10及MCP-3皆可作用預斷或診斷帕金森氏症的生物標記。
實施例 4 確認健康個體或具有登革熱病患之胞外囊泡的表現差異
分別由健康個體及具有登革熱的病患分離其血液及尿液檢體。依據材料及方法所述之流程由該血液及尿液檢體分離胞外囊泡。如第4A圖所示，可於經DEV感染之病患的PEV及UEV中偵測到微生物抗原NS-1，而於非胞外囊泡分餾段(Soln)中，則無法偵測到NS-1的訊號。第4B圖的數據更進一步指出，在6位疑似登革熱之病患的尿液所分離的胞外囊泡中，共有5位出現NS-1表現的陽性反應。於第4A及4B圖中，是以箭號指出由與金奈米顆粒鍵結之免疫層析法所偵測的NS-1訊號。本發明首度證實可於血液及尿液的胞外囊泡(特別是尿液的胞外囊泡)，而不在非胞外囊泡的分餾段(Soln)，偵測到登革NS1蛋白，且可基於該表現來預斷或診斷一微生物(例如登革病毒)的感染。
實施例 5 確認年輕人及老年人之胞外囊泡的表現差異
分別由年齡小於或大於50歲的個體分離其血液及尿液檢體，之後依據材料及方法所述之流程由該血液及尿液檢體分離胞外囊泡。表3-4及第5A-5B圖分別闡述經分離之PEV及UEV的表現差異。
相較於年輕人的PEV，於老年人(即，處於老化狀態的個體)之PEV可觀察到較低量的EGF，以及較高量的G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-1RA、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1β及TNF-α (表3)。
表3  年齡小於或大於50歲之個體之PEV中特定生物標記的表現量
濃度(pg/ml) EV ( 年輕成年人) EV ( 老年人)
平均值，微微克/ 毫升(SE) 平均值，微微克/ 毫升(SE)
EGF 1219 (894) 732 (189)
G-CSF 36 (21) 155 (84)
GM-CSF 8 (3) 16 (6)
GRO 3 (1) 109 (104)
IL1-RA 11 (6) 84 (63)
IL-6 2 (1) 123 (115)
IL-8 ND 77 (77)
IP-10 ND 2452 (640)
MCP-1 6 (4) 716 (671)
MIP-1β 7 (2) 65 (41)
TNF-α 15 (5) 24 (10)
UEV則具有與PEV不同的表現態樣。如表4所總結，相較於年輕人的UEV，老年人(即，處於老化狀態的個體)之UEV具有較低量的EGF、bFGF、G-CSF、趨化蛋白、IFN-α、IFN-γ、MDC、IL-1RA、IL-1α及IL-4，以及較高量的GRO、IL-6、IL-8、IP-10及MCP-1。
表4  年齡小於或大於50歲之個體之UEV中特定生物標記的表現量
生長因子/ 細胞激素 EV ，年輕成年人(SE) ( 微微克/ 毫升) EV ，老年人(SE) ( 微微克/ 毫升)
EGF 3319 (392) 1523 (266)
FGF-2 15 (5) 6 (3)
G-CSF 1542 (461) 384 (90)
趨化蛋白 86 (42) 26 (11)
IFN-α2 40 (19) 15 (5)
IFN-γ 14 (10) 5 (2)
MDC 162 (44) 48 (19)
IL1-RA 470 (168) 115 (38)
IL-1α 2.7 (1.0) 0.4 (0.2)
IL-4 23 (15) 9 (4)
GRO 15 (5 ) 41 (19)
IL-6 0.6 (0.3) 2.5 (1.9)
IL-8 14 (8) 46 (34 )
IP-10 23 (6) 29 (16)
MCP-1 108 (37) 176 (58)
第5A及5B圖的結果進一步指出，相較於不是處於老化狀態之個體的UEV (於第5A及5B圖標示為「年輕」)，在處於老化狀態之個體的UEV (於第5A及5B圖標示為「老化」)中，可分別以免疫印漬及免疫色層分析觀察到較高量之S100A8及α-突觸核蛋白。
該些結果指出，任一種S100A8、EGF、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-1RA、IL-1α、IL-4、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1β、TNF-α、bFGF、趨化蛋白、IFN-α、IFN-γ、MDC、L1CAM或α-突觸核蛋白，或是其不同組合皆可作為診斷個體是否處於老化狀態的生物標記。
本發明亦研究年輕人及罹患或未罹患帕金森氏症之老年人的UEV是否具有不同表現量之L1CAM及exoDNA。如第6圖及表5所闡述，相較於年齡大於50歲之個體，年齡小於50歲之個體具有較低量的L1CAM及exoDNA，而較高量的CD9；L1CAM及exoDNA的表現量會於罹患帕金森氏症之個體的UEV中明顯增加。年輕人及老年人之L1CAM及CD9的表現差異可作為區分老化與否的指標。
表5  特定個體之ExoDNA的濃度
濃度 (ng/μg/mg蛋白) 年輕人 老人年 罹患帕金森氏症的老年人
exoDNA (SE) 118.27 (50.92)* 363.09 (89.39)*,# 1042.78 (297.95)*,#
1.以橘G光譜分析來檢測exoDNA。 2. SE為標準差(standard error)(n=10)。 3. *代表組間P>0.05；且**代表組間P> 0.01。
總結上述，本揭示內容證實數種生物標記，其於具有或不具有特定疾病或狀態(包含癌症、退化性疾病、感染性疾病，以及老化)的個體呈現不同的表現量。基於本揭示內容的研究結果，習知技藝人士或臨床醫療人員可預斷或早期診斷該些疾病或狀態，據此對有治療需要的個體及時投予適當治療，以有效抑制該個體之疾病或狀態的發生或進程。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
第1圖是依據本揭示內容實施例1所闡述之西方墨點分析結果，其係關於胞外囊泡或滴液分餾段(drop-through fragment)中特定標記的表現量。PEV：由血漿檢體所分離的胞外囊泡。UEV：由尿液檢體所分離的胞外囊泡。MEV：由臍帶間葉幹細胞(mesenchymal stem cell，即ucMSC)所分離的胞外囊泡。SEV：由唾液檢體所分離的胞外囊泡。Soln：血漿檢體、尿液檢體、ucMSC或唾液檢體的滴液分餾段。
第2A圖是依據本揭示內容實施例2.1所闡述之免疫印漬分析數據，其中相較於由ucMSC所分離的胞外囊泡(即，MEV)，E-鈣黏蛋白及S100A8在由DLD-1癌細胞所分離的胞外囊泡(即，DEV)中具有較高的表現量。
第2B及2C圖是依據本揭示內容實施例2.1所繪示之柱狀圖，其分別闡述MEV及DEV的miRNA表現資料。
第3圖是依據本揭示內容實施例2.2所闡述之色層分析結果，其中相較於由癌症病患之血液所分離的胞外囊泡(於第3圖之左圖標示為「癌症」)，E-鈣黏蛋白及黏蛋白5AC在由健康個體之血液所分離的胞外囊泡(於第3圖之左圖標示為「對照組」)中具有較低的表現量。本實驗是藉由雙效捕捉胞外囊泡來進行，其中是將1:2,000稀釋之抗CD63抗體(每毫升0.2毫克)與胞外囊泡置於檢體注入區域，並將E-鈣黏蛋白及黏蛋白5AC的適體分別標記於色層分析條件之上極。之後以與卵白素-山葵過氧化酶(streptavidin-horse-radish peroxidase, streptavidin-HRP)鍵結之二級抗體(1:2,000)進行呈色反應，以觀查化學發光影像。
第4A及4B圖是依據本揭示內容實施例4所闡述之免疫層析法的照片，其中是由具有登革熱之病患的血漿或尿液分離胞外囊泡，並以與金奈米顆米鍵結之抗NS-1抗體捕捉，結果指出可於該胞外囊泡中偵測到NS-1的表現，而不會於非胞外囊泡之滴液分餾段偵測到NS-1的表現(第4A圖)；在6位疑似登革熱之病患的尿液所分離的胞外囊泡中，共有5位出現NS-1表現的陽性反應。血漿：由經登革熱病毒(dengue virus, DEV)感染之病患所取得的血漿檢體。PEV：由經DEV感染之病患的血漿檢體所分離的胞外囊泡。pSoln：經DEV感染之病患的血漿檢體的滴液分餾段。UEV：由經DEV感染之病患的尿液檢體所分離的胞外囊泡。uSoln：經DEV感染之病患的尿液檢體的滴液分餾段。尿液：由經DEV感染之病患所取得的尿液檢體。箭號所指為NS-1訊號。UEV1-6：分別由編號1-6疑似登革感染之病患的尿液檢體所分離的胞外囊泡。
第5A及5B圖分別為依據本揭示內容實施例5所闡述之免疫印漬及色層分析結果，其中相較於年輕個體(年齡小於50歲)的胞外囊泡，S100A8 (第5A圖)及α-突觸核蛋白(第5B圖)於老化個體(年齡大於50歲)胞外囊泡具有較高的表現量。本代表性結果是有再現性的3組配對實驗的一組。
第6圖為依據本揭示內容實施例5所闡述之西方墨點分析結果，其係關於年輕個體及罹患或未罹患帕金森氏症之老年個體的生物標記表現差異。年輕UEV：由年齡小於50歲之個體所分離的UEV。老年UEV：由年齡大於50歲之個體所分離的UEV。PD UEV：由年齡大於50歲且患有帕金森氏症之個體所分離的UEV。年輕uSoln：年齡小於50歲之個體的尿液檢體的滴液分餾段。老年uSoln：年齡大於50歲之個體的尿液檢體的滴液分餾段。PD uSoln：年齡大於50歲且患有帕金森氏症之個體的尿液檢體的滴液分餾段。本代表性結果是有再現性的5組配對照實驗的一組。
無
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Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Figure 12_A0101_SEQ_0008

Claims (6)

  1. 一種利用一個體之生物檢體來診斷該個體之頭頸部癌、大腸直腸癌、帕金森氏症或登革病毒感染的方法，其中該個體為一人類，且該方法包含(a)由該生物檢體分離複數個胞外囊泡；(b)決定該複數個胞外囊泡中生物標記的表現量，其中在診斷該頭頸部癌時，該生物標記是E-鈣黏蛋白及黏蛋白5AC(mucin 5AC,Muc5AC)；在診斷該大腸直腸癌時，該生物標記是E-鈣黏蛋白、S100A8、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-25-3p、 hsa-miR-410-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-125a-5p及hsa-miR-186-5p；在診斷該帕金森氏症時，該生物標記是EGF、趨化蛋白、L1CAM、IFN-α、IFN-γ、GRO、IL-10、MCP-3及exoDNA；以及在診斷該登革病毒感染時，該生物標記是NS-1；以及(c)依據步驟(b)決定之該生物標記的表現量來診斷或預斷該頭頸部癌、該大腸直腸癌、該帕金森氏症或該登革病毒感染，其中當與一取自一健康個體之對照樣本之複數個胞外囊泡中該生物標記的表現量相比較，該生物檢體之該複數個胞外囊泡中該E-鈣黏蛋白及黏蛋白5AC的表現量較高時，則指出該個體具有該頭頸部癌；當與一取自一健康個體之對照樣本之複數個胞外囊泡中該生物標記的表現量相比較，該生物檢體之該複數個胞外囊泡中該E-鈣黏蛋白、S100A8、hsa-miR-10a-5p及hsa-miR-182-5p的表現量較高，且該hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-100-5p、 hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-410-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-125a-5p及hsa-miR-186-5p的表現量較低時，則指出該個體具有該大腸直腸癌；當與一取自一健康個體之對照樣本之複數個胞外囊泡中該生物標記的表現量相比較，該生物檢體之該複數個胞外囊泡中該L1CAM及exoDNA的表現量較高，且該EGF、趨化蛋白、IFN-α、IFN-γ、GRO、IL-10及MCP-3的表現量較低時，則指出該個體具有該帕金森氏症；以及當與一取自一健康個體之對照樣本之複數個胞外囊泡中該生物標記的表現量相比較，該生物檢體之該複數個胞外囊泡中該NS-1的表現量較高時，則指出該個體具有該登革病毒感染。
  2. 如請求項1所述之方法，其中各該複數個胞外囊泡的特徵在於，具有至少一標記表現於其中及/或其表面，其中該 標記是選自由CD9、CD63、CD81、HSP60、HSP90及HSP105所組成的群組；以及具有大小介於30到450奈米的粒徑尺寸。
  3. 如請求項1所述之方法，其中該生物檢體是血液、尿液、腦脊液、胸水、惡性腹水、母乳、羊水、產道液體、腸胃道液體、支氣管肺泡灌洗液或唾液。
  4. 如請求項3所述之方法，其中在診斷該頭頸部癌時，該生物檢體是該尿液。
  5. 如請求項3所述之方法，其中在診斷該帕金森氏症時，該生物檢體是該尿液。
  6. 如請求項3所述之方法，其中在診斷該登革病毒感染時，該生物檢體是該血液或尿液。
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