CN116004818B - 结直肠癌早期诊断标记物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学及医学诊断领域，具体涉及一种结直肠癌早期诊断标记物，特别是来自血浆外泌体的miRNA标记物，以及该标记物在制备检测早期结直肠癌试剂盒中的应用。本发明所述的结直肠癌早期诊断标记物是选自以下的一种核酸分子miRNA或它们的组合：所述核酸分子包含编码血浆外泌体miR‑99b‑5p和miR‑409‑3p的核酸分子；所述的核酸分子在靶血浆外泌体中相较于对照样本，其表达上调。本发明提供的诊断试剂盒有利于无创、快捷、精准地进行结直肠癌的早期诊断。

Description

结直肠癌早期诊断标记物及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学及医学诊断领域，具体涉及一种结直肠癌早期诊断标记物，特别是来自血浆外泌体的miRNA标记物，以及该标记物在制备检测早期结直肠癌试剂盒中的应用。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是结肠或直肠的上皮性恶性肿瘤，胃肠道最常见的恶性肿瘤之一。从全球范围看，CRC在癌症发生率中总体排名第三，其中女性排第二位，男性排第三位，总体CRC死亡率排名第二。在我国，CRC年发病39.8万例，死亡18.8万例，疾病造成了极大的国民经济负担。结直肠癌发病隐匿，临床症状在早期并不明显。排便习惯和粪便性状改变常常是患者最早发生的症状，因此患者难以早期察觉，导致许多患者在诊断时已经是疾病晚期。据报道，相较发现时已经是晚期的患者，早期CRC及时得到规范治疗，5年生存期可大大提高，可达90％。CRC细胞可以通过直接浸润、淋巴转移、种植转移、血行转移等途径向邻近器官以及远隔器官转移，可导致晚期患者恶性腹水，癌性疼痛，严重降低患者生活质量。因此，结直肠癌的的防治重点在于早诊早治，在疾病早期时及时发现并治疗。

大多数CRC的发生需要经历“腺瘤-癌”的过程，这个过程可能历时几年到十几年，这为临床早期干预肿瘤提供了很大的可能性。早期筛查和诊断技术的发展进步，很大地提高了CRC患者的生存率。从20世纪70年代中期到2008-2014年，CRC的所有阶段的5年相对生存率加起来从50.6％增至65.1％，直肠癌从48.1％增至68.8％。目前我国CRC的筛查主要包括结肠镜、粪便免疫化学检测(FIT)、多靶点粪便FIT-DNA粪便隐血检测、结肠CT成像。结肠镜是临床内镜医师通过可视镜头检查整个结直肠的情况，然后对观察到的可疑病变取组织活检，通过病理诊断确诊疾病。结肠镜目前作为CRC筛查的金标准，然而，结肠镜的术前准备，较高的并发症风险和医疗费用使得患者依从性较低，阻碍了该方法作为基础筛查项目推广应用。并且，有研究显示，结肠镜检查是侵袭性很大的方法，对患者的本身具有一定伤害。FIT是通过特异性抗体检测粪便中的人类血红蛋白，提示肠道病变，因此FIT阳性者需要进一步进行结肠镜检查。粪便潜血试验(FOBT)是一种基于愈创木酯的测试，可检测粪便中的潜血，但该方法灵敏度低于FIT且容易受到饮食和药物的影响，目前多被FIT替代。一项涉及9989例的前瞻性验证性研究报告了粪便FIT-DNA鉴别诊断结直肠癌诊断灵敏度达到92.3％，而对进展期腺瘤的诊断灵敏度较低，为42.4％。目前FIT-DNA的检测成本仍较高，且对我国人群的诊断适用性仍需要进一步的多中心、大样本验证。结肠CT成像需要受检者进行肠道准备，然后用气体充盈结肠，进行全结肠的CT扫描，从而对整个结肠进行观察，确诊同样需要结合结肠镜检查。该检查应用于人群筛查需要严格肠道准备，并且由于其具有一定的辐射风险，患者依从性并不高。关于血清肿瘤标志物，CEA和CA19-9是结直肠癌相对较为特异的分子标志物，虽然有助于对疾病的预后评价，但是并不具有结直肠癌诊断的特异性，而且在肿瘤早期变化不明显，不能用于早期诊断。因此，临床上迫切需要一种特异度高、敏感性强、创伤少的诊断标志物，对CRC进行早期诊断。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类由约18-22个核苷酸构成，不具编码功能的单链小RNA。研究证实，miRNA在可在AGO2、Drosha和Dicer等生物发生途径蛋白的改变引起失控。miRNA在结直肠癌的发生、发展，侵袭、转移过程中都发挥着重要的作用。而循环miRNA能在血浆中稳定存在。许多先前的研究认为循环miRNA是一个非常有前景的癌症生物标志物，因为miRNA的表达具有组织特异性的，miRNA水平可能可以更直接地了解疾病的生物学行为。

细胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)是指从细胞中自然释放的具有膜结构的分泌型囊泡，包含各种来源的膜囊泡的异质群体，其直径范围30-1000nm。几乎所有的细胞都可以分泌EV。越来越多的研究发现，EV可作为细胞间通讯的使者。EV中可携带具有母体细胞特征性生物信息分子，如DNA、蛋白质、脂质、mRNA、miRNA以及ncRNA等，广泛存在于血液、脑脊液、尿液、羊水、乳汁、渗出液等体液中。在癌症中，肿瘤细胞生长失衡、微环境改变带来的PH改变、细胞缺氧、氧化应激等细胞的病理生理改变，可刺激肿瘤细胞产生比正常细胞更多的EV。CRC相关的EV能将生物分子通过传递给细胞引发细胞癌变。并且，肿瘤来源EV可诱导血管形成，促进癌细胞转移。EV的上述特性使其在恶性肿瘤早期筛查、诊断、病情监测、治疗等方面都显示一定的优越性，有望成为一种新的临床工具。

外泌体来源的miRNA(EV-miRNA)作为癌症生物标志物，在近年来显示出了极高的潜力。肿瘤细胞比正常细胞能产生更多的外泌体，且外泌体相对含量高，具有较高的稳定性，这对寻找生物标记物和治疗靶点非常有意义。并且，肿瘤细胞会释放出大量的携带肿瘤信息的EV，因此，相较于循环总miRNA，EV-miRNA表达谱可能更具肿瘤特异性，能更好地反应疾病特征。目前许多研究发现EV-miRNA与癌症侵袭转移相关，譬如，研究者发现黑色素瘤细胞分泌的外泌体miR-155可以诱导癌相关成纤维细胞(CAFs)促血管生成；高水平的外泌体miR-222与乳腺癌高侵袭性相关；miR-21在不同肿瘤类型中失调。

目前，关于血液样本如血清或血浆外泌体来源的miRNA作为结直肠癌诊断标志物的研究报道中，很多研究并未对差异表达的外泌体miRNA进行样本验证；且大多研究仅对单个外泌体miRNA作为结直肠癌诊断标志物进行描述，单个外泌体miRNA的检测往往特异性、敏感性、诊断价值不足。因此，需要对结直肠癌具有诊断价值的数个血浆外泌体miRNA，以及血清肿瘤标记物等形成组合进行综合评价，构建完善的评价系统，方能对外泌体miRNA组合协助结直肠癌的早期诊断产生切实的应用价值。

名称为“基于外泌体LncCLDN23表达水平的结直肠癌早期转移诊断试剂盒”、申请号为CN202110138441.8的中国发明专利申请(公开号：CN112779336A，公开日：2021年5月11日)中公开了一种基于外泌体LncCLDN23表达水平的结直肠癌早期转移诊断试剂盒，该试剂盒包括外泌体LncCLDN23的实时定量PCR扩增引物。通过实时定量PCR检测血浆中的外泌体LncCLDN23的含量，为预测结直肠癌早期转移提供重要参考。该专利并未选择外泌体miRNA作为标志物检测其表达水平，从而为结直肠癌的早期诊断与筛查提高重要依据。名称为“一种外泌体膜蛋白作为结肠癌诊断标志物的应用以及结肠癌早期诊断试剂盒”、申请号为CN202110039502.5的中国发明专利申请(公开号：CN112379096A，公开日：2021年2月19日)中公开了一种外泌体膜蛋白作为结肠癌诊断标志物的应用以及结肠癌早期诊断试剂盒。该专利通过实验确定了外泌体的CD33和CD147蛋白可以作为结肠癌诊断标志物，对其进行检测可以实现对结肠癌的早期精确诊断。该专利同样未选择外泌体miRNA作为结直肠癌的早期诊断标志物。名称为“用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物及诊断试剂盒”、申请号为CN201811126210.X的中国发明专利申请(公开号：CN109439749A，公开日：2019年3月8日)提供了用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物，所述标志物选自let-7b-3p、let-7b-5p、miR-150-3p、miR-145-3p、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-15b-3p、miR-125a-5p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p和miR-92b-5p中的至少一种。该专利基于无创检测技术开发的结直肠癌诊断及复发监控的方法，在早期结直肠癌中具有高灵敏度及高特异性，多个miRNA标志物联合AUC最高可达0.99，具有极其优越的诊断性能。然而，该专利并未筛选高度差异表达的血浆外泌体miRNA，并与血清肿瘤标志物进行组合从而提高结直肠癌早期诊断的灵敏度与特异性。

到目前为止，已有报道称miR-99b-5p和miR-409-3p在胃癌、前列腺癌、肺癌等肿瘤的发生、发展过程中具有重要意义，但是，关于miR-99b-5p和miR-409-3p在结直肠癌患者血浆外泌体中的表达情况和早期诊断尚未见具体研究报道。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于针对目前结直肠癌血液标志物诊断疾病特异度低、敏感度低等问题，提供一种结直肠癌早期诊断标记物，以及应用方法，形成组合结果评价系统，有利于无创、快捷、精准地进行结直肠癌的早期诊断。

技术方案

本发明的第一个方面，提供了结直肠癌早期诊断标记物，是选自以下的一种核酸分子miRNA或它们的组合：所述核酸分子包含编码血浆外泌体miR-99b-5p和miR-409-3p的核酸分子；所述的核酸分子在靶血浆外泌体中相较于对照样本，其表达上调。

本发明的第二个方面，提供了用于鉴别早期结直肠癌的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括本发明所述的结直肠癌早期诊断标志物。

本发明所述的核酸分子中的至少一种在目的血浆和健康对照血浆的外泌体中表达具有差异性。其中以健康志愿者血浆样本为对照，miR-99b-5p在结直肠癌患者血浆外泌体中高表达，且早期高于晚期；以健康志愿者血浆样本为对照，miR-409-3p在结直肠癌患者血浆外泌体中高表达。

因此，所述的两种外泌体miRNA中的至少一种核酸分子差异性表达的特征是结直肠癌存在的指征。

本发明的第三个方面，在本发明所述的用于鉴别早期结直肠癌的诊断试剂盒中还包括血清肿瘤标志物CEA。

技术效果

本发明通过筛选在血浆外泌体中结直肠癌患者中有差异表达的外泌体miRNA，从而确定那些对结直肠癌具有诊断生物标志物潜能的外泌体miRNA，再对候选外泌体miRNA进行血浆样本的验证。结果显示，miR-99b-5p和miR-409-3p在结直肠癌中高表达。并且，发明人发现miR-99b-5p的表达在早期高于晚期，在结肠高于直肠。提示miR-99b-5p在早期结直肠癌具有重要意义。同时，发明人也发现外泌体miRNA组合可用于鉴别诊断早期结直肠癌，miR-99b-5p和miR-409-3p合组合的ROC曲线下面积(Area under the ROC curve，AUC)为0.741(95％CI＝0.592-0.891，Sensitivity＝77.3％，Specificity＝78.3％，P＝0.006)；miR-99b-5p、miR-409-3p与CEA组合AUC为0.812(95％CI＝0.692-0.944，Sensitivity＝90.9％，Specificity＝65.2％，P<0.001)。结果显示，外泌体miRNA组合的鉴别诊断能力要高于单个外泌体miRNA，具有作为结直肠癌早期筛查的标志物的潜力。本发明将有助于促进血浆外泌体miRNA作为无创诊断生物标志物用于结直肠癌的早期诊断。

本发明通过联合检测结直肠癌患者和健康体检者血浆中外泌体miR-99b-5p、miR-409-3p的表达水平，分析外泌体miR-99b-5p、miR-409-3p以及血清肿瘤标志物CEA单独和联合诊断结直肠癌的特异性、敏感性和受试者特征曲线的曲线下面积，得出诊断结直肠癌的外泌体miRNA表达水平节点。

本发明的优势在于：

(1)外泌体miRNAs是一种新型的液体活检生物标志物，更为灵敏、稳定且无创，所需的样本量较少，患者容易接受，其成功开发有助于结直肠癌的辅助诊断。

(2)首次确定了外泌体miR-99b-5P和miR-409-3p作为结直肠癌早期诊断的标记，建立了崭新的结直肠癌早期诊断检测指标。

(3)基于多个miRNAs设计的产品相较于单一miRNAs的产品，在灵敏度和特异性上会更优，且可以减少因单一指标个体表达差异导致的误差，使结果更加准确。

(4)联合结直肠癌的特异性血清标志物CEA，针对性更强，灵敏度和特异性更优，且更具备说服力。

附图说明

图1A和图1B为本发明所提取外泌体的电镜(TEM)鉴定图。A：比例尺500nm；B：比例尺100nm。

图1C为本发明所提取外泌体的纳米颗粒跟踪分析(NTA)图。左：样本EV颗粒粒径分布图；右：粒子在检测窗口的显示情况。

图1D为本发明所提取外泌体的Western Blotting鉴定图。

图2为miRNA在16例血浆EV-RNA样本中的平均相对表达量。

图3为miR-99b-5p、miR-409-3p在血浆外泌体(EV)中的表达水平。

图4A和图4B为ROC曲线分析miR-99b-5p和miR-409-3p鉴定结直肠癌的诊断效能。

图4C和图4D为ROC曲线分析miR-99b-5p和miR-409-3p鉴定早期结直肠癌的诊断效能。

图4E为ROC曲线分析CEA鉴定早期结直肠癌的诊断效能。

图5A为ROC曲线分析miR-99b-5p和miR-409-3p组合鉴定早期结直肠癌的诊断效能。

图5B为ROC曲线分析miR-99b-5p、miR-409-3p和CEA组合鉴定早期结直肠癌的诊断效能。

具体实施方式

下面通过具体实施例结合所附的附图对本发明做进一步的详细说明。

外泌体提取试剂盒exoRNeasy Midi Kit(Qiagen，德国)、Buffer XE(Qiagen，德国)，蛋白浓度检测试剂盒Pierce^TM BCA Protein Assay Kit(Thermo，美国)，miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(天根公司，中国)、miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(天根公司，中国)用于实时荧光定量PCR进行miRNA定量、以及Illumina HiSeqTM2500(Illumina，美国)用于miRNA测序。

实施例1：受试者及样本提取

样本由广州医科大学附属第三医院提供。其中结直肠癌患者(CRC)12例，以及健康受试者(Healthy control，HC)4例。

实施例2：外泌体的提取

使用EDTA抗凝管采集CRC患者及健康体检者空腹外周血4ml，抽血后立即颠倒混匀5-8次，室温放置，2小时内进行3500rpm，10min离心，小心收集上清液即血浆于冻存管(勿吸取到血浆下层的血细胞)，冻存于负80℃冰箱中储存直到使用。

使用exoRNeasy Midi Kit(Qiagen，德国)和Buffer XE(Qiagen，德国)提取血浆外泌体。按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

(1)将-80℃冻存的血浆在常温下溶解，然后进行2步血浆预处理步骤：

离心：3000g，4℃，15min，取上清；16000g，4℃，20min，取上清1ml。

(2)将血浆样品与XBP按照体积1：1加入Buffer XBP，轻轻颠倒试管5次，充分混合，使混合液升温至室温。

(3)将样品/XBP混合物添加到离心柱上，离心：500g，1min，室温。弃流穿液，然后将柱子放回同一收集管中。确保所有液体都已通过膜。注意：如果任何液体残留在膜上，以3000g的转速再次旋转1min，以确保所有液体都已通过膜。

(4)将3.5ml的XWP缓冲液添加到离心柱中，离心3000g，5min，以洗涤离心柱并除去残留的缓冲液。丢弃流穿液和收集管，并将离心柱转移到新的收集管中。

(5)加入Buffer XE 400ul，孵育1min，离心500g，5min，室温。

(6)将洗脱液再次加入膜上，孵育1min，离心3000g，5min，室温。

(7)将得到的洗脱液，即血浆EV提取样品，分装冻存于-80℃。

参见图1A-D，所提取的外泌体的鉴定结果具体如下：

1)电镜显示：如图1A-B所示，外泌体形态结构完整，有双侧膜结构，且分布均匀；

2)纳米颗粒跟踪分析(NTA)结果：如图1C所示，外泌体的平均粒径(直径)在168nm左右；

3)蛋白质印迹分析：如图1D所示，外泌体表达EV特征蛋白CD63、CD81TSG101及Alix蛋白。

实施例3：外泌体miRNA的提取

使用exoRNeasy Midi Kit进行血浆中外泌体miRNA的提取。参照试剂盒说明书操作。

(1)血浆在常温下解冻，血浆预处理步骤：2次离心：1ml血浆。

3000g，4℃，15min，取上清→900ul；

16000g，4℃，20min，取上清→取上清800ul。

(2)样品：XBP＝1：1加入Buffer XBP。充分混合。

(3)将样品/XBP混合物添加到离心柱上，

离心：500g，1min，室温；

再次离心：3000g，1min，室温；

丢弃流穿液，然后将柱子放回同一收集管中。确保所有液体都已通过膜。

(4)将3.5ml的XWP缓冲液添加到离心柱中，以洗涤柱并除去残留的缓冲液。离心：3000g，1min，室温；丢弃流通液和收集管。

(5)将离心柱转移到新鲜的收集管中。

(6)向膜中加入700μl QIAzol裂解液。以3000g，5min，室温；以收集裂解物，然后完全转移至EP管中。加入人工合成的5’磷酸化RNA，即外参cel-miR-39-3p 10ul(2×10^-7uM)。

(7)短暂涡旋振荡装有裂解物的试管，并在室温下孵育5min。

(8)向装有裂解物的试管中加入90μl氯仿，并盖紧盖子。剧烈摇动15秒钟，然后在室温下孵育3min。

(9)在4℃下以12000g离心15min。离心后，样品分为三个阶段：上层无色水含RNA的相稀薄的白色相间；和较低的红色有机相。RNA存在于上层水相中。

(10)将上层水相转移到新的EP管中。250ul/样品，避免转移任何相间材料。加入2体积的无水乙醇，即500ul，混匀。

(11)吸取样品(包括可能形成的任何沉淀物)移入2ml收集管中的RNeasyMinElute旋转柱中。轻轻合上盖子，离心：12000g，30s，室温。丢弃流穿液。在下一步中重复使用收集管。其余样品重复该步骤。

(12)将700μl缓冲液RWT添加到RNeasy MinElute离心柱中。轻轻合上盖子，并以12000g，离心30s，室温。丢弃流通液。在下一步中重新使用收集管。

实施例4：NGS测序分析miRNA

将提取的血浆外泌体miRNA进行建库测序。

(1)样品RNA首先用Qubit(Bio-Rad，美国)和Agilent2200(Agilent，美国)进行RNA浓度检测。

(2)通过Agilent 2200TapeStation(Agilent，美国)进行文库质检。

(3)使用Illumina HiSeqTM2500(Illumina，美国)进行测序鉴定。

(4)对鉴定出来的miRNA进行表达量计算。miRNA的表达量校正方法RPM(thenumber of reads per million of miRNA)＝计算每百万Clean Reads中比对到特定miRNA的reads数目(the number of reads per million clean tag)。

(5)使用edgeR R语言软件包进行miRNA表达差异分析，将在组间异常表达的miRNA在样本中的平均RPM表达量作log2(RPM)转换，绘制miRNA在血浆EV-RNA样本中的平均相对表达量条形图，见图2。通过差异倍数(|log2(Fold Change)|>1)和显著水平(P value<0.05)两个水平，得到在各比较组间差异表达的miRNA：miR-99b-5p和miR-409-3p。

实施例5：实时荧光定量PCR验证差异表达的miRNA

通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法定量检测miR-99b-5p和miR-409-3p的表达水平。对于RT-qPCR得到的Cq值，使用2-ΔCq方法对miRNA表达进行相对定量。2-ΔCq公式为：ΔCq＝Cq(candidate miRNA)-Cq(reference miRNA)，从而得到miRNA表达水平在CRC组相对健康对照组的差异倍数(fold change)，见图3。

实施例6：验证miRNA组合对结直肠癌的早期诊断效能

以外泌体miR-99b-5p、miR-409-3p、肿瘤标记物CEA及其组合作为检测对象，通过SPSS软件的“ROC曲线图”功能，绘制ROC曲线，参见图4A-E及图5A-B。获得95％置信区间(95％Confidence interval，95％CI)和ROC曲线下面积(Area under ROC curve，AUC)。使用约登指数最大值来确定ROC曲线截断值对应的敏感性和特异性。对于早期结直肠癌，分析显示：

(1)miR-99b-5p：AUC＝0.735，95％CI＝0.587-0.884，Sensitivity(敏感性)＝72.7％，Specificity(特异性)＝78.3％，P＝0.007；miR-409-3p：AUC＝0.611，95％CI＝0.443-0.778，Sensitivity(敏感性)＝63.6％，Specificity(特异性)＝60.9％，P＝0.206；CEA：AUC＝0.820，95％CI＝0.695-0.945，Sensitivity(敏感性)＝72.7％，Specificity(特异性)＝87％，P<0.001，见图4C。

(2)miR-99b-5p和miR-409-3p组合：AUC＝0.741，95％CI＝0.592-0.891，Sensitivity(敏感性)＝77.3％，Specificity(特异性)＝78.3％，P＝0.006，见图5A；miR-99b-5p和miR-409-3p和CEA组合：AUC＝0.812，95％CI＝0.679-0.945，Sensitivity(敏感性)＝90.9％，Specificity(特异性)＝65.2％％，P<0.001，见图5B。数据结果表明，miR-99b-5p和miR-409-3p和CEA组合对于早期结直肠癌的敏感性高达90.9％，具有极高的诊断效能。

基于上面的数据以及结论，并结合本领域的现有技术，单独的miR-99b-5p或miR-409-3p，miR-99b-5p或miR-409-3p的组合，或者miR-99b-5p、miR-409-3p和CEA的组合都可用于构建区分一个结直肠癌患者和一个健康个体的诊断试剂盒，用于检测早期结直肠癌。

Claims (1)

1.检测结直肠癌早期诊断标志物表达水平的试剂用于制备鉴别早期结直肠癌的诊断试剂盒的用途，所述结直肠癌早期诊断标志物是编码血浆外泌体miR-99b-5p和miR-409-3p的核酸分子以及血清肿瘤标志物CEA。