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CN111560467B - miR-21和miR-92a作为检测并区分HBV相关肝癌与乙型肝炎的标志物的应用 - Google Patents

miR-21和miR-92a作为检测并区分HBV相关肝癌与乙型肝炎的标志物的应用 Download PDF

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CN111560467B CN202010184874.2A CN202010184874A CN111560467B CN 111560467 B CN111560467 B CN 111560467B CN 202010184874 A CN202010184874 A CN 202010184874A CN 111560467 B CN111560467 B CN 111560467B
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Abstract

本发明首次公开了miR‑21和miR‑92a作为检测并区分HBV相关肝癌与乙型肝炎的标志物的应用。通过联合检测血清sEV中的miR‑21和miR‑92a，可高效地诊断CHB和HBV相关HCC，也可在HBV感染人群中区分CHB与HCC。而且诊断功效高，AUC达0.88，且上样量低，只需要200μL血清。诊断CHB与诊断HBV相关HCC的功效较高，可与健康人区分开，AUC达0.97以上。上样量低，也只需要200μL血清。

Description

miR-21和miR-92a作为检测并区分HBV相关肝癌与乙型肝炎的标志物的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及miR-21和miR-92a作为检测并区分HBV相关肝癌与乙型肝炎的标志物的应用。
背景技术
外泌体是一种细胞分泌的细胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)，大小约为30-150nm，内含功能性的核酸和蛋白质，是细胞间通讯中的重要一环。肿瘤细胞可通过外泌体特异性地分泌癌症相关的生物分子，从而促进癌症的发生发展。而且，外泌体可分泌到外周血中，具有溯源性，通过抽血的手段即可检测来源于肿瘤的外泌体。因此，外泌体是重要的疾病生物标志物来源。
在外泌体相关研究中，因为尚无外泌体特异性生物标志物，且难以追踪分离出来的外泌体是否起源于内含体(endosome)，因此越来越多的研究更倾向于用“小细胞外囊泡”(small extracellular vesicle,sEV)这个词来替代“外泌体”。这种sEV是指小于200nm的EV。
微小RNA(microRNA,miRNA)是一种小片段单链RNA，参与调控生物进程。在多种癌症中，肿瘤细胞的miRNA谱都发生改变。已有大量文献表明血清或血浆中的miRNA可作为肿瘤的潜在生物标志物。在外周血中，miRNA主要以3种形式存在：游离的miRNA，与蛋白质结合的miRNA，以及存在于EV中的miRNA。但是，游离的miRNA容易被体内的RNA酶降解，与蛋白质结合的miRNA难以分离检测，只有存在于EV中的miRNA是最稳定、最容易被检测的。因此，直接检测血清或血浆中的miRNA，受到的干扰相对较大，可能存在某些微量的miRNA难以被检出，或同一种miRNA的量在不同人中差异较大的情况。事实上，同一种血清或血浆miRNA的量，在不同文献中报道的变化趋势可能是相反的。例如，有文献表明血清中miR-92a在肝癌中是显著上调的，有文献却表明该miRNA是显著下调的。因此，检测血清/血浆sEV中的miRNA，比起直接检测血清/血浆中的miRNA，更准确、更可靠，使得在血清/血浆sEV中寻找miRNA生物标志物具有更重要的意义。
此外，血清/血浆sEV中某种miRNA的量是难以预测的，需要用大量的临床样品验证。在血清/血浆sEV miRNA的研究中，不同文献中可能出现相互冲突的结论。例如，血清/血浆sEV中的miR-21和miR-92a是被广泛报道的结直肠癌生物标志物，但我们的用了大量的临床样品证明血清sEV中miR-21和miR-92a的诊断功效均较低(详见实施例2)。因此，从少数文献或样品中得出的结论，并不能轻易地推广到所有临床样品中。
慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)持续感染引起的肝脏慢性炎症性疾病。HBV感染人群十分庞大，全球约20亿人曾感染HBV，其中有2.4亿人为慢性HBV感染者。与其它肝病相比，CHB和HBV相关HCC是占比最大、对健康影响最大、最受关注的疾病。如何监控CHB并从中及早筛查发现HCC，尽量避免CHB恶化成HCC，成为领域内重大问题。
目前对HBV感染或CHB的血清学检测，主要以“乙肝两对半”为主，即检测HBV相关的抗原抗体。对HCC的血清学检测，主要以甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)为主。这种基于免疫法的检测，难以检测极微量的蛋白质，也难以检测极早期的病变，使得诊断和治疗滞后，错过最佳时期。寻找更加灵敏、高效的血清生物标志物，显得十分重要。
血清EV中的miRNA有重大的HBV相关HCC诊断前景，已有不少文献表明血清EV中的miRNA具有潜在的诊断功效。但这些文献普遍存在着一些问题，如样本量不足、设计实验组和对照组时没有考虑HBV感染情况、诊断功效不明确(无ROC曲线)以及AUC偏低等。
发明内容
本发明第一个方面的目的，在于针对乙型肝炎中尚无早期预警其转化为肝癌的高效的指标，提供一种在临床上容易实现的检测指标(血清EV miR-21和miR-92a)，在HBV感染的人群中筛查出将会恶化成肝癌的患者。
本发明第二个方面的目的，在于提供miR-21的引物、探针和miR-92a的引物、探针在制备检测并区分HBV相关肝癌与乙型肝炎的试剂中的应用。
本发明第三个方面的目的，在于提供
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，在于提供miR-21和miR-92a作为检测并区分HBV相关肝癌与乙型肝炎的标志物的应用。
本发明的第二个方面，提供miR-21的引物、探针和miR-92a的引物、探针在制备检测并区分HBV相关肝癌与乙型肝炎的试剂中的应用。
本发明的第三个方面，miR-21的引物、探针和miR-92a的引物、探针在制备检测并区分HBV相关肝癌与乙型肝炎的试剂盒中的应用。
根据本发明第一至第三任一个方面所述的应用，miR-21和miR-92a为血清中的miR-21和miR-92a。
根据本发明第一至第三任一个方面所述的应用，miR-21和miR-92a为血清中小细胞外囊泡中的miR-21和miR-92a。
根据本发明第二或第三个方面所述的应用，所述miR-21的引物、探针的序列为：
反转录引物miR-21-RT：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA(SEQ ID NO:1)，
上游引物miR-21-F：GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG(SEQ ID NO:2)，
下游引物miR-21-R：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:3)，
探针miR-21-P：CTGGATACGACTCAACA(SEQ ID NO:4)。
根据本发明第二或第三个方面所述的应用，所述miR-92a的引物、探针序列为：
反转录引物miR-92a-RT：
GTCGTATCCAGTGCTGGGTCCGAGTGATTCGCGCTGGATACGACACAGGCCG(SEQ ID NO:5)，
上游引物miR-92a-F：CCCTGTATTGCACTTGTCC(SEQ ID NO:6)，
下游引物miR-92a-R：CAGTGCTGGGTCCGAGTGA(SEQ ID NO:7)，
探针miR-92a-P：CGGCCTGTGTCGTATCCA(SEQ ID NO:8)。
本发明的第四个方面，提供一种非疾病诊断目的的检测并区分HBV相关肝癌与乙型肝炎的方法，包括以下步骤：
S1.提取血清样本中的小细胞外囊泡中；
S2.提取步骤S1中小细胞外囊泡中的miRNA；
S3.将步骤S2 miRNA中的miR-21和miR-92a逆转录为cDNA；
S4.采用权利要求5和6中引物、探针对S3中cDNA进行对miR-21和miR-92a的qPCR检测，根据检测结果，区分HBV相关肝癌与乙型肝炎。
根据本发明第四个方面所述的方法，步骤S4所述区分HBV相关肝癌与乙型肝炎的方法为：
当样本中miR-21的定量结果和miR-92a的定量结果与健康人的定量结果都没有显著差异，则说明样本的来源不患HBV相关肝癌与乙型肝炎；
当样本中miR-21的定量结果和miR-92a的定量结果与健康人的定量结果都有显著差异，且样本中miR-21的定量结果与乙型肝炎组的定量结果之间具有显著差异，则说明样本的来源患有HBV相关肝癌；
当样本中miR-21的定量结果和miR-92a的定量结果与健康人的定量结果都有显著差异，且样本中miR-21的定量结果与HBV相关肝癌组的定量结果之间没有显著差异，则说明样本的来源患有乙型肝炎。
根据本发明第四个方面所述的方法，步骤S4所述区分HBV相关肝癌与乙型肝炎的方法为：
将样本的miR-21定量值经log10转换后，分别代入公式1、公式2和公式3中的x1处，将样本的miR-92a定量值经log10转换后，分别代入公式1、公式2和公式3中的x2处；
当公式1中的p1<0.1，且公式2中的p2<0.12，则说明样本的来源不患HBV相关肝癌与乙型肝炎；
当公式1中的p1>0.1，且公式3中的p3>0.31，则说明样本的来源患有HBV相关肝癌；
当公式2中的p2>0.12，且公式3中的p3<0.31，则说明样本的来源患有乙型肝炎；
公式1：
公式2：
公式3：
本发明的有益效果：
本发明首次发现联合血清sEV中的miR-21和miR-92a，可高效地诊断CHB和HBV相关HCC，也可在HBV感染人群中区分CHB与HCC。该发现诊断功效较高，具有在CHB人群中预警HCC的潜力，在HBV感染的人群中筛查出将会恶化成肝癌的患者。可在HBV感染人群中区分CHB与HCC，具有在CHB人群中预警患HCC的潜力。而且诊断功效高，AUC达0.88。诊断CHB与诊断HBV相关HCC的功效较高，可与健康人区分开，AUC达0.97以上。上样量低，只需要200μL血清。
附图说明
图1肝癌、肝炎与健康组的miRNA定量值差异分析。注：定量值经log10转换后进行分析，其中，HBV相关肝癌组(HCC)n＝47，慢乙肝组(CHB)n＝77，健康组(Normal)n＝569。图A、F：定量值分布情况。*代表与任一其它组比较，P<0.05，多组间差异分析采用Kruskal-Wallis test，进一步采用Dunn's test进行多重比较。图B、G：定量值的bootstrap分析。以bias-corrected and accelerated(BCa)bootstrap法进行10000次重取样并确定均值的95％置信区间。*表示定量值的均值，线段表示重取样后均值的95％置信区间。图C～E、H～J：定量值的ROC曲线分析。红圈表示该指标约登指数(Youden's index)最大时选取的阈值，该阈值及其相应的灵敏度和特异性已标出。图K～M：联合miR-21和miR-92a定量值的ROC曲线分析。
图2结直肠癌组、腺瘤组与健康组的miRNA定量值差异分析。注：定量值经log10转换后进行分析，结直肠癌组(CRC)n＝288，腺瘤组(Adenoma)n＝135，健康组(Normal)n＝569。图A、E：定量值分布情况。*代表与任一其它组比较，P<0.05，多组间差异分析采用Kruskal-Wallis test，进一步采用Dunn's test进行多重比较。图B～D、F～H：定量值的ROC曲线分析。红圈表示该指标约登指数(Youden's index)最大时选取的阈值，该阈值及其相应的灵敏度和特异性已标出。
图3鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌与健康组的miRNA定量值差异分析。注：定量值经log10转换后进行分析，其中，鼻咽癌组(NPC)n＝38，肺癌组(lung cancer)n＝28，乳腺癌组(breast cancer)n＝22，膀胱组(bladder cancer)n＝31，健康组(Normal)n＝569。图A、G：定量值分布情况。*P<0.05，多组间差异分析采用Kruskal-Wallis test，进一步采用Dunn'stest进行多重比较。图B、H：定量值的bootstrap分析。以bias-corrected and accelerated(BCa)bootstrap法进行10000次重取样并确定均值的95％置信区间。*表示定量值的均值，线段表示重取样后均值的95％置信区间。图C～F、I～L：定量值的ROC曲线分析。
图4miR-92a引物序列的优化。图A：G1～G3引物组的扩增曲线(SYBR法)。图B～D：G1～G3引物组的溶解曲线(SYBR法)。图E：G2引物组与miR-92a引物组的扩增曲线(探针法)。Positive表示阳性样品，negative表示阴性样品，NTC表示空白对照。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例中所用的原料如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。
实施例1血清sEV中miR-21和miR-92a的区分功能
首先提取血清中的sEV，然后提取其miRNA，再逆转录为DNA，然后用qPCR方法对miR-21和miR-92a进行绝对定量，最后对定量值进行分析。
1)sEV提取：用外泌体分离试剂盒(广州海力特生物科技有限公司)提取sEV。操作步骤按照说明书进行。具体地，取200μL血清，加入100μL提取液A和5μL提取液B，混匀，常温孵育10min。将混合液转移至Exo柱上层滤腔，以3000×g离心10min，弃掉上次滤腔。收集中间层滤腔截留物，即为sEV。
2)miRNA提取：按照miRcute血清/血浆miRNA提取分离试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)说明书进行提取。具体地，将提取后的sEV转移至EP管中，加入900μL裂解液MZA，振荡混匀30s。室温放置5min，加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置5min。以13400g，4℃离心15min，将上层透明水相转移至新EP管中。根据转移液的体积，缓慢加入转移液2倍体积的无水乙醇，混匀，转入吸附柱miRelute，室温放置2min。以13400g离心30s，弃掉流出液，保留吸附柱miRelute。向吸附柱miRelute中加入700μL去蛋白液MRD，室温静置2min。以13400g离心30s，弃掉流出液。向吸附柱miRelute中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min。以13400g离心30s，弃掉流出液。再次加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，离心(13400g，30s)，弃掉流出液。在室温条件下以13400g离心2min，弃收集管。将吸附柱miRelute转入一个新的EP管中，向吸附膜中心位置加30μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min。在室温条件下以13400g离心2min。收集滤出液，即为miRNA。
3)逆转录和qPCR：用微小核糖核酸(microRNA-21)定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)及微小核糖核酸(microRNA-92a)定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(广州海力特生物科技有限公司)对上述miRNA进行逆转录和qPCR定量。该方法通过用特异性逆转录引物，逆转录靶标miRNA，再用基于TaqMan MGB探针技术的绝对定量方法，对靶标miRNA进行qPCR定量。操作步骤按说明书进行。
microRNA-21和microRNA-92a的引物、探针序列如下所示：
反转录引物miR-21-RT：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA(SEQ ID NO:1)，
上游引物miR-21-F：GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG(SEQ ID NO:2)，
下游引物miR-21-R：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:3)，
探针miR-21-P：(6-FAM)CTGGATACGACTCAACA(MGB)(SEQ ID NO:4)。
反转录引物miR-92a-RT：
GTCGTATCCAGTGCTGGGTCCGAGTGATTCGCGCTGGATACGACACAGGCCG(SEQ ID NO:5)，
上游引物miR-92a-F：CCCTGTATTGCACTTGTCC(SEQ ID NO:6)，
下游引物miR-92a-R：CAGTGCTGGGTCCGAGTGA(SEQ ID NO:7)，
探针miR-92a-P：VIC/FAM-CGGCCTGTGTCGTATCCA-MGB(SEQ ID NO:8)。
为了更加精确地定量检测microRNA-21和microRNA-92a的含量，发明人的研究团队共设计了4组microRNA-92a引物组合，并从中筛选出检测效果最好的一组microRNA-92a引物及探针(上述序列)。我们首先用SYBR法评价G1～G3这3组引物组的扩增效果。具体表现为，在G1-G3这3组引物组比较中，G2组引物组在阳性样品中扩增信号较强，在阴性样品中扩增信号最弱，Ct值最大，且阳性样品和阴性样品的Ct值差最大(图4A)；与G1、G3组引物组(图4B、D)相比，G2引物组(图4C)的溶解曲线峰较为集中，阴性样品的信号较低。然后，我们用探针法比较上文引物组(简称为：miR-92a)与G2引物组的扩增效果。具体表现为，miR-92a引物组比G2引物组扩增信号更强，Ct值更小，效果更好。因此，上述microRNA-92a引物探针组简称效果最好。其余候选引物组(G1-G3)序列如下：
反转录引物G1-RT：
GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACAGGCCG(SEQ ID NO:9)，
上游引物G1-F：CGGGGTATTGCACTTGTCC(SEQ ID NO:10)，
下游引物G1-R：GTATCCAGTGCGTGTCGTG(SEQ ID NO:11)；
反转录引物G2-RT：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGGCCG(SEQ ID NO:12)，
上游引物G2-F：CCCCGTATTGCACTTGTCC(SEQ ID NO:13)，
下游引物G2-R：GTGCAGGGTCCGAGGTATT(SEQ ID NO:14)；
反转录引物G3-RT：
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAGGCCG(SEQ ID NO:15)，
上游引物G3-F：GCCCCTATTGCACTTGTCC(SEQ ID NO:16)，
下游引物G3-R：CTCAACTGGTGTCGTGGAGT(SEQ ID NO:17)。
根据试剂盒说明书，对microRNA-21和microRNA-92a进行qPCR定量的操作具体为，按比例(逆转录反应液13μL/测试+miR-21或miR-92a RT引物1μL/测试+逆转录酶系1μL/测试)取相应体积组分，充分混匀后按15μL/孔分装至PCR反应板上。向反应板中加入5μL/孔的核酸样本(待测核酸样本、miR-21或miR-92a定量参考品)，混匀，盖好反应板薄膜，1000rpm离心1min。立即按以下参数进行逆转录反应：25℃×5min；42℃×60min；70℃×15min；4℃∞。即获得cDNA。
然后，按比例(miR-21或miR-92a反应液29.4μL/测试+PCR酶0.6μL/测试)取相应体积组分，充分混匀后按30μL/孔分装至PCR反应板上。向反应板中加入20μL/孔的逆转录后的cDNA，混匀，盖好反应板薄膜，1000rpm离心1min。立即按以下参数进行qPCR：95℃×10min；95℃×15s，65℃×1min(FAM通道荧光采集)，循环40次。即获取目标样品的miR-21和miR-92a定量数据。
对47例HBV相关HCC样本、77例CHB样本与569例健康人样本(Normal)进行比较，分别确定本发明对CHB和HBV相关HCC的诊断功效，以及区分两者的诊断功效。我们用了大规模的健康对照样本，尽可能地反映人群中的实际情况，增加统计功效和结果的可信度。由于健康人样本数是HCC或CHB样本数的8倍以上，除了普通的差异分析，我们还增加了bootstrap分析，提高统计功效，直观地反映差异情况。具体地，以bias-corrected and accelerated(BCa)bootstrap法进行10000次重取样并确定均值的95％置信区间。若两组95％置信区间有重叠，则差异不明显，若不重叠，则差异明显。我们用接受者操作特性(receiveroperating characteristic,ROC)曲线最终确定指标的诊断功效，用AUC表示，AUC越接近1，则诊断功效越高。结果如附图1所示。
从附图1中结果可以看出，我们发现CHB组的miR-21都分别显著高于其它组，HCC组显著高于Normal组(图1A，P<0.05)。我们通过bootstrap分析发现，CHB组分别与其它组的miR-21定量值均值的95％置信区间不重叠，但HCC组与Normal组有部分重叠(图1B)。
ROC曲线表明，区分HCC组与Normal组的miR-21的AUC为0.68(图1C)，区分CHB组与Normal组的miR-21的AUC为0.89(图1D)，区分HCC组与CHB组的miR-21的AUC为0.73(图1E)。上述结果表明，血清sEV中miR-21定量值可区分CHB与健康人，但区分HBV相关HCC与CHB或区分CHB与健康人的诊断功效则较低。
HCC组与CHB组的血清sEV miR-92a定量值分别显著高于Normal组(图1F，P<0.05)，HCC组与CHB组的值无显著差异(图1F)。经bootstrap法分析后发现，HCC组与CHB组的95％置信区间分别与Normal组不重叠，HCC组和CHB组的95％置信区间有部分重叠(图1G)，结果与上述检验结果一致。ROC曲线表明，区分HCC组与Normal组的miR-92a的AUC为0.96(图1H)，区分CHB组与Normal组的miR-92a的AUC为0.97(图1I)，HCC组与CHB组的miR-92a的AUC为0.66(图1J)。上述结果表明，血清sEV中的miR-92a可区分HBV相关HCC患者与健康人，可区分CHB患者与健康人，区分HBV相关HCC与CHB患者的诊断功效则较低。
用logistic regression方法联合miR-21和miR-92a两个指标时，ROC曲线表明，区分HCC组与Normal组的AUC为0.98(图1K)，区分CHB组与Normal组的AUC为0.97(图1L)，区分HCC组与CHB组的AUC为0.88(图1M)。上述结果表明，联合血清sEV中的miR-21和miR-92a两个指标，可提高区分HBV相关HCC患者与CHB患者的诊断功效，且诊断功效较高，具区分HBV相关HCC患者与健康人的诊断功效，具区分CHB患者与健康人的诊断功效。
经logistic regression方法联合miR-21和miR-92a两个指标后，在比较CHB组与Normal组时，可获得公式1；在比较CHB组与Normal组时，可获得公式2；在比较HCC组与CHB组时，可获得公式3。将样本的miR-21定量值经log10转换后，分别代入公式1、公式2和公式3中的x1处，将样本的miR-92a定量值经log10转换后，分别代入公式1、公式2和公式3中的x2处。我们将各公式计算出的p值分别进行ROC曲线分析，并选择约登指数(Youden's index＝sensitivity+specificity)最大时的p值作为cut-off值。各公式的cut-off值分别为：p1＝0.1，p2＝0.12，p3＝0.31。所以，将待测样本的miR-21定量值和miR-92a定量值经log10转换后，分别代入3个公式中的x1处和x2处；当公式1中的p1<0.1，且公式2中的p2<0.12，则说明样本的来源不患HBV相关肝癌与乙型肝炎；当公式1中的p1>0.1，且公式3中的p3>0.31，则说明样本的来源患有HBV相关肝癌；当公式2中的p2>0.12，且公式3中的p3<0.31，则说明样本的来源患有乙型肝炎。
公式1：
公式2：
公式3：
对比实施例1血清sEV中miR-21和miR-92a不具有直肠癌诊断功效
对288例结直肠癌(CRC)样本、135例腺瘤(Adenoma)样本与569例健康人样本(Normal)进行比较，分别确定本发明对CRC和腺瘤的诊断功效，以及区分两者的诊断功效。分析方法与实施例1类似。分析结果见附图2。
从实验结果中发现，结直肠癌组和腺瘤组的miR-21(图2A，P<0.05)都分别显著低于健康组，结直肠癌组和腺瘤组两组间无显著差异。ROC曲线表明，miR-21定量值区分结直肠癌组与健康组的曲线下面积(AUC)为0.68(图2B)，区分腺瘤组与健康组的AUC为0.63(图2C)，区分结直肠癌组与腺瘤组的AUC为0.53(图2D)。在结直肠癌组、腺瘤和健康组中，任意2组间的miR-92a定量值比较，均无显著差异(图2E)。ROC曲线表明，miR-92a定量值区分结直肠癌组与健康组的AUC为0.51(图2F)，区分结腺瘤组与健康组的AUC为0.54(图2G)，区分结直肠癌组与腺瘤组的AUC为0.54(图2H)。上述结果表明，在血清sEV中，无论是miR-21还是miR-92a，区分结直肠癌患者、腺瘤患者与健康人三者间的诊断功效均较低，与文献报道的不一致。
对比实施例2血清sEV中miR-21和miR-92a不具有的诊断功效
发明人的研究团队，使用实施例1中类似的分析方法对38例鼻咽癌样本(NPC)、28例肺癌样本(lung cancer)、22例乳腺癌样本(breast cancer)、31例膀胱癌样本(bladdercancer)与569例健康人样本(Normal)进行比较，分别确定本发明对上述4种癌症的诊断功效。结果如附图3所示。
从实验结果中发现，肺癌组分别和鼻咽癌组与健康组的miR-21定量值间有显著差异(图3A，P<0.05)，其它各组间都分别无显著差异(图3A)。我们用bootstrap方法分析发现，肺癌组分别和鼻咽癌组与健康组的miR-21定量值均值的95％置信区间不重叠，其它各组均有部分重叠(图3B)。ROC曲线表明，区分鼻咽癌组与健康组的AUC为0.56(图3C)，区分肺炎组与健康组的AUC为0.68(图3D)，区分乳腺癌组与健康组的AUC为0.52(图3E)，区分膀胱癌组与健康组的AUC为0.54(图3F)。上述结果表明，血清sEV中的miR-21区分上述4种癌症患者与健康人的诊断功效均较低。
鼻咽癌组分别和肺癌组与健康组的miR-92a定量值间有显著差异，其它各组间均无显著差异(图3G)。经bootstrap法分析后发现，鼻咽癌组与肺癌组的95％置信区间无重叠，其它各组间的95％置信区间均有部分重叠(图3H)。ROC曲线表明，区分鼻咽癌组与健康组的AUC为0.64(图3I)，区分肺炎组与健康组的AUC为0.60(图3J)，区分乳腺癌组与健康组的AUC为0.54(图3K)，区分膀胱癌组与健康组的AUC为0.57(图3L)。上述结果表明，血清sEV中的miR-92a区分健康人与鼻咽癌、肺癌、乳腺癌或膀胱癌患者的诊断功效均较低。
综上，实施例1表明血清sEV中miR-21和miR-92a对CHB和HBV相关HCC的诊断功效较高，且具在HBV感染人群中区分CHB与HCC的诊断功效，且诊断功效较高。对比实施例1结果表明血清EV中miRNA的量与文献报道的不一致，文献的结果不能一概而论地拓展到所有临床样本中。对比实施例1和对比实施例2的结果共同表明了本发明具有一定的疾病特异性，血清EV中的miR-21与miR-92a在其它5种癌症中不具诊断功效。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 暨南大学
广州海力特生物科技有限公司
<120> miR-21和miR-92a作为检测并区分HBV相关肝癌与乙型肝炎的标志物的应用
<130>
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactcaaca 50
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcccgctagc ttatcagact gatg 24
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctggatacga ctcaaca 17
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtcgtatcca gtgctgggtc cgagtgattc gcgctggata cgacacaggc cg 52
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccctgtattg cacttgtcc 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cagtgctggg tccgagtga 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cggcctgtgt cgtatcca 18
<210> 9
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacac aggccg 56
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cggggtattg cacttgtcc 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gtatccagtg cgtgtcgtg 19
<210> 12
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacaggc cg 52
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ccccgtattg cacttgtcc 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gtgcagggtc cgaggtatt 19
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagacag gccg 44
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gcccctattg cacttgtcc 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctcaactggt gtcgtggagt 20

Claims (6)

1.检测miR-21和miR-92a的表达水平的物质在制备检测并区分HBV相关肝癌与乙型肝炎的产品中的应用，所述miR-21和miR-92a为血清中小细胞外囊泡中的miR-21和miR-92a。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂盒。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于：
所述物质为miR-21的引物、探针和miR-92a的引物、探针。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述miR-21的引物、探针的序列为：
反转录引物miR-21-RT：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA（SEQ ID NO:1），
上游引物miR-21-F：GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG（SEQ ID NO:2），
下游引物miR-21-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQ ID NO:3），
探针miR-21-P：CTGGATACGACTCAACA（SEQ ID NO:4）。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述miR-92a的引物、探针序列为：
反转录引物miR-92a-RT：
GTCGTATCCAGTGCTGGGTCCGAGTGATTCGCGCTGGATACGACACAGGCCG（SEQ ID NO:5），
上游引物miR-92a-F：CCCTGTATTGCACTTGTCC（SEQ ID NO:6），
下游引物miR-92a-R：CAGTGCTGGGTCCGAGTGA（SEQ ID NO:7），
探针miR-92a-P： CGGCCTGTGTCGTATCCA（SEQ ID NO:8）。
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