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TWI672319B - 用於確認、預測以及治療癌症的方法 - Google Patents

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TWI672319B
TWI672319B TW107105359A TW107105359A TWI672319B TW I672319 B TWI672319 B TW I672319B TW 107105359 A TW107105359 A TW 107105359A TW 107105359 A TW107105359 A TW 107105359A TW I672319 B TWI672319 B TW I672319B
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陳宜民
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高雄醫學大學
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Abstract

本發明所揭露的是檢測癌症或進行癌症風險評估的方法，其中該癌症具有突變的PREX2表現。該癌症可為原發性癌症、轉移性癌症或復發性癌症。根據本發明的實施例，突變為G258V、S1113R、E1346D或K400fs。本發明也揭露治療所需個體的方法。

Description

用於確認、預測以及治療癌症的方法
本發明關於癌症診斷、預後、治療及其醫療應用等領域。更具體而言，本發明關於診斷一個體是否罹患一癌症或者對於該個體罹患該癌症進行風險評估的方法，以及針對有上述需要的個體的治療方法。
癌症是一種複雜的疾病，其中在一特定組織中的細胞對於組織內調控細胞分化、存活、增殖和死亡的訊號不再完全地反應。結果，這些細胞累積在組織內，並造成局部損傷和發炎反應。時至今日，已經在人類身上確定超過200種不同類型的癌症。
肝細胞癌(HCC)是世界上最常見的癌症之一。在成年男性方面，它是世界上最常被診斷出的癌症的第五名，且是癌症相關死亡的第二大原因。至於成年女性方面，它是最常被診斷出的癌症的第七名以及癌症死亡的第六大原因。各種因素已被報導與HCC發展有關，包括酒精濫用、病毒感染(例如B型肝炎病毒(HBV)或C型肝炎病毒(HCV)感染)、肝硬化、肥胖、第II型糖尿病和食品污染(例如黃麴毒素和砷)。
時至今日，移植手術仍然是HCC患者的首選。然而，高品質的死亡捐贈者器官的供應量有限。已經開發了數種替代療法以補償患者 無法進行移植手術或延遲復發，例如切除、射頻燒灼術(RFA)、化療、經導管動脈化療栓塞和放射線治療。一般來說，HCC的早期診斷對於最佳化治療策略是至關重要的。相較於晚期HCC缺少有效治療手段，早期HCC檢測可望使用可能治癒的治療方法，從而提高患者的存活率。據報導，確診為罹患晚期HCC的患者的5年存活率為0%到10%。相比之下，當在早期檢測到HCC時，5年存活率超過50%。不幸的是，大多數HCC患者由於沒有HCC早期的症狀或體徵，終至HCC晚期才被確診。
有鑑於此，本領域亟需發展一種早期檢測HCC的方法，以便提供給患者適當和迅速的治療。
以下提出本發明的簡化的發明內容，以提供本領域人士了解本發明的大致輪廓。本發明內容並未對本發明進行廣泛地概述，也未確認本發明的關鍵/重要元素或描述本發明的範圍。其唯一的目的僅在於為了稍後更詳細的描述，而在此僅以簡化的形式提出一些概念，以作為一個開場白。
本發明揭露一種醫藥組合物，用於治療罹患一癌症或者具有發展成為該癌症的風險的一個體，該個體所表現的磷酯酸肌醇-3,4,5-三磷酸依賴的Rac交換因子2(Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate-dependent Rac exchange factor 2,PREX2)帶有選自由：G258V、S1113R、E1346D及K400fs及其組合所組成的群組的一多胜肽，該醫藥組合物包括：具有一第一醫藥上有效量的一治療分子，選自由一抗癌藥物、SEQ ID NO：1的胜肽、SEQ ID NO：2的胜肽及一小干擾RNA所組成的群組其中之一；以及具有一第二醫藥 上有效量的一標靶分子，耦合於該治療分子且對該PREX2基因具有一結合親和力，其中該標靶分子為一抗體或一適體(aptamer)。
本發明揭露一種用於診斷一個體是否罹患一癌症的套組，包括：一第一對引子，用以在一聚合酶鏈反應中辨識該個體的一生物樣本中的PREX2基因，擴增後而獲得一擴增產物；以及一基因檢測探針，用以檢驗該擴增產物的序列，其中，當該PREX2基因具有選自由G773T、A3337C、A4038T以及1200delG及其組合所組成的群組中的一突變時，確認該個體罹患該癌症。
本發明還揭露一種確認一個體罹患一癌症或者具有發展成為與該癌症相關聯之一病症的風險的方法，包括：自該個體取得一生物樣本；從該生物樣本中提取一DNA；檢測該DNA中的PREX2基因是否存在一突變；以及當該突變存在時，確認該個體罹患該癌症或者具有發展成為與該癌症相關聯之該病症的風險。
對於所屬技術領域中具有通常知識者而言，在詳閱以下詳細說明和所附圖式之後，本發明的目標和優點將更為顯而易見。
為了讓本發明之上述目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明。
圖1A繪示對Huh7-GNMT穩定細胞依序進行共免疫沉澱(Co-IP)試驗以及免疫墨點(IB)分析。
圖1B繪示對小鼠肝裂解物依序進行交互Co-IP試驗以及IB分析。
圖1C繪示以或未以蛋白酶體抑制劑MG132處理的HepG2-GNMT穩定細胞的IB分析。
圖1D繪示以指定質體轉染Huh7細胞並使用35硫-甲硫胺酸/半胱胺酸合併測量以確定PREX2半衰期。
圖1E繪示轉染Myc-PREX2、HA-Ub(泛素)以及Flag-GNMT的Huh7細胞的活體內泛素化試驗。
圖1F繪示以靶定GNMT或LacZ(shLacZ)的慢病毒表現短髮夾RNA(shRNA)轉染Huh細胞，並進行其IB分析。
圖1G繪示在14-15個月大的雌性野生型小鼠(5隻)和GNMT-/-小鼠(18隻)肝臟中PREX2和pAKT(Ser473)蛋白質表現的IB和定量分析。定量結果以平均值±平均值的標準誤差(SEM.)呈現，*p<0.05。
圖2A繪示轉染Myc-PREX2、HA-Ub以及各種E3接合酶(ligase)的HEK293T細胞的活體內泛素化試驗。
圖2B繪示控制組Huh7細胞或帶有HectH9壓低作用的Huh7細胞的IB分析。
圖2C繪示以放線菌酮(CHX)處理控制組Huh7細胞或帶有HectH9壓低作用的Huh7細胞一段指定時數，並進行IB分析。
圖2D繪示經蛋白酶體抑制劑MG132處理的控制組Huh7細胞或帶有HectH9壓低作用的Huh7細胞的活體內泛素化試驗。
圖3A繪示控制組Huh7細胞或帶有HectH9壓低作用的Huh7細胞裂解後的IB分析。
圖3B繪示控制組Huh7細胞或帶有HectH9壓低作用的Huh7 細胞的細胞增殖。
圖3C繪示承有控制組Huh7細胞或帶有HectH9壓低作用的Huh7細胞的非肥胖性糖尿病/嚴重合併性免疫缺失症(NOD/SCID)小鼠(每組5隻)中的HCC腫瘤生長情形。
圖3D繪示異種移植腫瘤中Ki-67蛋白質表現的組織學和定量分析其中刻度線代表300μm，*p<0.05以及**p<0.01。
圖4A繪示51對HCC腫瘤和腫瘤相鄰(TA)組織中PREX2表現的IB和定量分析，** p<0.01。
圖4B繪示51對HCC腫瘤和TA組織中PREX2 mRNA水平的即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)分析。
圖4C繪示PREX2蛋白質表現與GNMT的皮爾森(Pearson)相關性分析。
圖4D繪示具有高或低PREX2蛋白質表現的51例HCC患者的Kaplan-Meier作圖分析。
圖5繪示在HCC腫瘤中PREX2內的非沉默突變。
圖6繪示PREX2基因體覆蓋率的定序深度，示意了人類HCC第8對染色體(chr8)整個PREX2的讀取區的長條圖，其中涵蓋了相匹配生質譜系DNA和~288kbp讀取區(chr8：68864603-69143897)。
以下所提供的詳細描述與圖式是欲作為本發明實施例之說明之用，然而這些實施例並非可代表本發明可被構成或被使用的特定形式。
在本文所參考的任何現有技術不是、以及不應當視為承認或 以任何形式說明這種現有技術形成習用技術的一部分。
在本發明中，除非上下文另有要求，詞語“包括”、“包含”和“含有”將被理解為表示包括步驟或者要素或者步驟或要素的組合，但不排除任何其它步驟或者要素或者步驟或要素的組合。因此，使用術語“包括”之類表示所列要素是必須的或強制性的，但其它要素是任選的並且可有可無的。“由...組成”是指包括並限於“由...組成”之後的。因此，“由......組成”表示所列要素是必須的或強制性的，並且沒有任何其他要素可存在。“基本上由...組成”是指包括短語後列出的任何要素，並且限於不干擾或促進在本案的所列要素中指定的活性或作用的其它元件。因此，“基本上由...組成”一語表示所列要素是必須的或強制性的，但其它要素是任選的，以及取决於其是否影響所列要素的活性或作用而可有可無。
本發明論及了範例的功能，並闡述了該範例用於組成及操作該範例的步驟的順序。但是，相同或等價的功能或順序仍可以透過其他額外的範例來完成。
為了方便起見，這裡集合了用於說明書、範例和附加的申請專利範圍的某些術語。除非本文另有定義外，本發明所使用的科學及技術用語應具有讓本領域人士一般性地理解並及使用的意義。而且，除非應上下文所需，將被了解的是，單數的術語應包含其複數形式，且複數形式應包括單數形式。具體地說，如本文和申請專利範圍所使用的，單數形式的“一”包括了複數形式的參照，除非前後文清楚地表明了另一種情況。而且，如本文和申請專利範圍所使用的，術語“至少一”以及“一或多個”具有相同意義，且包括一、二、三或多個。
儘管本發明非限制的範圍所提出的數值範圍和參數是近似值，然而在具體範例中所提出的數值卻是儘可能精確地來描述。然而，任何數值固有地包含由各別的測試測量所發現的標準差所必然導致的某些的誤差。而且，如本文所使用的，術語“大約”一般意指在10%、5%、1%或0.5%的給定值或範圍之內。替代地，當由本領域一般技藝人士所考量，術語“約當”或“近似”意指在平均值的可接受的標準誤差之內。除了在操作/實施的範例中，或除非另有明文規定，本文所揭露的所有用於材料的數量、時間週期、溫度、操作條件、數量比，以及諸如此類的數值範圍、數量、數值和百分比應被理解為在所有情況下被術語“約當”或“近似”所修改。因此，除非相反地指出，否則在本發明和附加的申請專利範圍中所提出的數值參數是可以根據需要而變化的近似值。至少，每個數值參數至少應根據所報告的有效數字的數目並以應用一般捨入法來解釋。
如本文所提及的術語“有效量”指定了足以產生所需反應的成份的數量。再者，為了治療目的，有效量是成份的任何有毒或有害影響可藉由治療性的有益效果所彌補。特定有效或足夠的數量將隨著因素而變化，例如治療的特定條件、患者的身體狀況(例如患者的體重、年齡或性別)、治療的哺乳類或動物的種類、治療持續時間、同步療法(如果有的話)的性質，以及所使用的特定配方和化合物或其衍生物的結構。有效量可以表示成例如：克、毫克或微克，或者每公斤體重的毫克數(mg/Kg)。替代地，有效量可以表示成為在活性成份的濃度(例如，本發明的治療分子)，如莫耳濃度、重量濃度、體積濃度、重量莫耳濃度(molality)、莫耳分率、重量分率和混合比。尤其，與本文描述的治療分子有關聯而使用的 術語“治療上有效量”意指足以緩解或改善與個體癌症相關聯的症狀的治療分子的量。在本領域具有一般技能的人士可以基於由動物模式而確定的劑量，來計算用於藥物(例如本案的治療分子)的人體當量劑量(HED)。例如，本領域人士可以遵循美國食品和藥物管理局(FDA)所發行的有關於“評估成人健康志願者在初步臨床試驗中的最大安全起始劑量”的行業指南，以評估用於人類個體的最大安全劑量。
術語“個體”意指哺乳類，包括本發明的方法可以治療的人類物種。術語“個體”意欲指向男性和女性性別，除非某一種性別已被明確指出。
GNMT結合蛋白磷酯酸肌醇-3,4,5-三磷酸依賴的Rac交換因子2(Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate-dependent Rac exchange factor 2,PREX2)為PTEN的結合蛋白且會抑制PTEN活性。然而，本發明至少部分基於以下說明：在PREX2基因中某些點突變與癌症發展、轉移和/或復發相關聯。
根據本發明的某些實施例，這些點突變包括3種非沉默突變和一個框架轉移截斷突變；由此被編碼的PREX2多胜肽因而分別包括G258V、S1113R、E1346D和K400fs(一種截斷形式的PREX2多胜肽)的突變。PREX2基因表達譜(expression profile)提供了一種可能的手段，以有效地檢測癌細胞或腫瘤細胞或進行預測一個體他/她是否罹患癌症或者具有罹患癌症的風險。
因此，本發明的第一面向指向一種用於進行一個體癌症的預後或進行該個體的癌症風險評估的方法。該方法包括：(a)自該個體取得生 物樣本；(b)從該生物樣本中提取DNA；以及(c)檢測該PREX2基因是否存在一突變。
根據本發明的某些實施例，生物樣本取自罹患癌症或者可能發展成為癌症的個體。生物樣本可為生物檢體樣本、全血樣本、血漿樣本、血清樣本、尿液樣本或黏液樣本。在一較佳實施例中，生物樣本是包含循環流動的癌細胞的全血樣本。之後，藉由使用商用套組(例如Quiagen DNA提取套組)或藉由本領域人士所熟悉的任何方法(例如裂解緩衝液或超音波處理)，便可以從生物樣本提取DNA。所提取的DNA接著作為模板，以藉由一試驗法(例如直接定序、單股構形多形性(SSCP)、變性梯度膠體電泳(DGG)或溫度梯度膠體電泳(TGGE))分析基因圖譜。根據一可行的範例，為了確認突變是否存在於該生物樣本的目的，以HaloPlex標靶富集定序分析所提取的DNA。
根據本發明的實施例，突變為G773T、A3337C、A4038T或1200 delG；以及出現突變表明該個體罹患癌症或具有發展成為癌症的風險，其中G773T是指在PREX2基因第773核苷酸處的鳥糞嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)取代，A3337C是指在PREX2基因第3337核苷酸處的腺嘌呤(A)被胞嘧啶(C)取代，A4038T是指在PREX2基因第4038核苷酸處的腺嘌呤(A)被胸腺嘧啶(T)取代，而1200 delG則是指PREX2基因第1200核苷酸處的鳥糞嘌呤(G)缺失。
根據本發明的某些實施例，癌細胞可同時包括PREX2基因中一個以上的突變；亦即癌細胞可同時包括PREX2基因中G773T、A3337C、A4038T或1200 delG中的任何二、三或四個突變。
根據本發明的某些實施例，PREX2基因中G773T、A3337C、A4038T或1200 delG的突變分別導致PREX2多胜肽中G258V、S1113R、E1346D和K400fs的突變。因此，除了檢測PREX2基因的突變，亦可透過分析PREX2蛋白質序列確認或預測癌細胞。因此，用於透過檢測突變的多胜肽而進行個體癌症的預後或進行該個體的癌症風險評估的方法包括步驟：(a)自該個體取得生物樣本；(b)從該生物樣本分離PREX2蛋白質；(c)檢測該PREX2多胜肽是否存在突變，其中該突變是G258V、S1113R、E1346D或K400fs。
根據本發明的實施例，突變發生在PREX2基因的第773及第4038核苷酸之間。
根據本發明的另一實施例，突變選自由G773T、A3337C、A4038T、1200 delG及其組合所組成的群組。
根據本發明的實施例，當在PREX2多胜肽檢測到突變時，則該個體或罹患癌症或者具有發展成為癌症的風險。
生物樣本可為生物檢體樣本、全血樣本、血漿樣本、血清樣本、尿液樣本或黏液樣本。根據一個可行的範例，生物樣本是包含循環流動的癌細胞的全血樣本。之後，全蛋白質是由該生物樣本分離出來。適用於從生物樣本中分離蛋白質的示範方法包括但不侷限於：重複地凍融、超音波法、均質化(例如使用法式壓碎機或滾珠)以及含或不含酵素(例如溶菌酶)的洗滌劑(例如十二烷基硫酸鈉(SDS)、Triton X-100或NP-40)進行處理。所分離的蛋白質可進行定序檢驗，例如質譜法、硫代醯化作用或Edman降解反應，以確認上述突變是否存在。
如上所述，癌細胞可同時包括PREX2基因中一個以上的突變，其隨後編碼為包括了一個以上突變的PREX2胜肽。在一個實施例中，具有經突變的PREX2胜肽的癌細胞表現出包含G258V、S1113R、E1346D和K400fs其中任何二者。在另一個實施例中，具有經突變的PREX2胜肽的癌細胞表現出包含G258V、S1113R、E1346D和K400fs其中任何三者。在額外的一個實施例中，在癌細胞表面上表現的經突變PREX2胜肽同時包含G258V、S1113R、E1346D和K400fs。
可以理解的是，存在於PREX2基因或PREX2多胜肽的突變可應用於進行關於癌症是否在一個體擴散或復發的預後。在臨床實務中，相較於原始癌症(也已知為原發性癌症)，轉移和復發性的癌細胞通常會發展出抗藥性以及增加侵入特性。據報導，原發性腫瘤切除後，取決於癌症類型，超過半數的癌症患者死於發展了數月、數年或甚至數十年的轉移或復發性癌症。癌症轉移或復發的早期識別可使得個體及時得到適當的治療，以至於提高他/她的治療效果和壽命。
根據本發明某些實施例，在PREX2基因(即G773T、A3337C、A4038T或1200 delG)或PREX2多胜肽(即G258V、S1113R、E1346D或K400fs)存在突變表明該個體處於發展轉移性和/或復發性癌症的風險中。
基本上，個體是哺乳類，較佳地是人類。根據本發明的某些實施例，個體是亞洲人。在一特定範例中，個體是中國人。
由本發明任何方法所診斷或預測的癌細胞可由胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、胰臟癌，腎癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巢癌、腦腫瘤、前列腺癌、肝細胞癌、黑色素瘤、食道癌、多發性骨髓瘤或頭部和頸部鱗狀 細胞癌分離出來。根據一特定範例，癌症為HCC。
本發明的另一方面了指向一種方法，用於治療以本發明方法確認帶有一原位性癌症、轉移性癌症和/或復發性癌症的個體。該方法包括：將一有效量的治療分子投藥予該個體。
根據本發明的一實施例，該治療分子是甘胺酸N-甲基轉移酶(Glycine N-Methyltransferase,GNMT)，其包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列。根據本發明的另一實施例，治療分子是泛素接合酶(同源於E6AP羧基末端同源蛋白9,HectH9)，其包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列。根據本發明的另一實施例，治療分子是小干擾RNA(siRNA)，其下調節PREX2 mRNA的表現。替代地，治療分子可以是抗癌藥物，其選自由：抗雌激素(例如：tamoxifen、raloxifene以及megestrol)、LHRH促效劑(例如：goscrclin和leuprolide)、抗雄激素(例如：flutamide和bicalutamide)、光動力療法(例如：vertoporfin(BPD-MA)、酞青素(phthalocyanine)、光敏劑(photosensitizer)Pc4及去甲氧基竹紅菌素(demethoxy-hypocrellin A,2BA-2-DMHA))、氮芥(例如：環磷酸醯胺(cyclophosphamide)、依弗醯胺(ifosfamide)、氯乙環磷醯胺(trofosfamide)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、雌氮芥(estramustine)及黴法蘭(melphalan))、亞硝基尿素(例如：雙氯乙基亞硝基尿素(carmustine,BCNU)和環己亞硝基尿素(lomustine,CCNU))、烷基磺酸鹽(例如：busulfan和treosulfan)、三氮烯(例如：dacarbazine和temozolomide)、含鉑化合物(例如：cisplatin、carboplatin和oxaliplatin)、長春生物鹼(例如：vincristine、vinblastine、vindesine和vinorelbine)、紫杉醇類(例如：紫杉醇(paclitaxel)或紫杉醇等價物，例如連結奈米粒子白蛋白的紫杉醇(Abraxane)、連結二 十二碳六烯酸的紫杉醇(DHA-paclitaxel、Taxoprexin)、連結聚麩胺酸的紫杉醇(PG-paclitaxel、paclitaxel poliglumex、CT-2103、XYOTAX)、腫瘤活化前驅藥物(TAP)ANG1005(連結至三個紫杉醇分子的Angiopep-2)、紫杉醇-EC-1(連結至erbB2識別胜肽EC-1的紫杉醇)，與葡萄糖共軛的紫杉醇(例如：2'-paclitaxel methyl 2-glucopyranosyl succinate、docetaxel、taxol、表鬼臼毒素(epipodophyllin)(例如：依托泊苷(etoposide)、依托泊苷磷酸鹽(etoposide phosphate)、teniposide、topotecan、9-aminocamptothecin、camptoirinotecan、irinotecan、crisnatol、mytomycin C)、抗代謝藥、DHFR抑制劑(例如：methotrexate、dichloromethotrexate、trimetrexate、edatrexate)、IMP脫氫酶抑制劑(例如：mycophenolic acid、tiazofurin、ribavirin、and EICAR)、核糖核苷酸還原酶抑制劑(例如：羥基尿素與去鐵胺)、尿嘧啶類似物(例如：5-氟尿嘧啶(5-FU)、floxuridine、doxifluridine、ratitrexed、tegafur-uracil、capecitabine)、胞嘧啶類似物(例如：cytarabine(ara C)、cytosine arabinoside與fludarabine)、嘌呤類似物(例如：mercaptopurine與Thioguanine)、維生素D3類似物(例如：EB 1089、CB 1093與KH 1060)、異戊二烯化抑制劑(例如：洛伐他汀(lovastatin))、多巴胺能神經毒素(例如：1-methyl-4-phenylpyridinium ion)、細胞週期抑制劑(例如：staurosporine)、放線菌素(例如：actinomycin D與dactinomycin)、博萊黴素(例如：bleomycin A2、bleomycin B2、peplomycin)、蒽環類藥物(例如：daunorubicin、doxorubicin、pegylated liposomal doxorubicin、idarubicin、epirubicin、pirarubicin、zorubicin、mitoxantrone)、MDR抑制劑(比如：verapamil)、鈣離子三磷酸腺苷酶抑制劑(例如：thapsigargin)、imatinib、 沙利竇邁(thalidomide)、lenalidomide、酪胺酸激酶抑制劑(例如：axitinib(AG013736)、bosutinib(SKI-606)、cediranib(RECENTINTM、AZD2171)、dasatinib(SPRYCEL®、BMS-354825)、erlotinib(TARCEVA®)、gefitinib(IRESSA®)、imatinib(Gleevec®、CGP57148B、STI-571)、lapatinib(TYKERB®、TYVERB®)、lestaurtinib(CEP-701)、neratinib(HKI-272)、nilotinib(TASIGNA®)、semaxanib(semaxinib、SU5416)、sunitinib(SUTENT®、SU11248)、toceranib(PALLADIA®)、vandetanib(ZACTIMA®、ZD6474)、vatalanib(PTK787、PTK/ZK)、trastuzumab(HERCEPTIN®)、bevacizumab(AVASTIN®)、rituximab(RITUXAN®)、cetuximab(ERBITUX®)、panitumumab(VECTIBIX®)、ranibizumab(Lucentis®)、nilotinib(TASIGNA®)、sorafenib(NEXAVAR®)、everolimus(AFINITOR®)、alemtuzumab(CAMPATH®)、gemtuzumab ozogamicin(MYLOTARG®)、temsirolimus(TORISEL®)、ENMD-2076、PCI-32765、AC220、dovitinib lactate(TKI258、CHIR-258)、BIBW 2992(TOVOKTM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120(VARGATEF®)、AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、tivozanib(AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647和/或XL228)、蛋白酶體抑制劑(例如：bortezomib(Velcade))、mTOR抑制劑(例如：rapamycin、temsirolimus(CCI-779)、everolimus(RAD-001)、ridaforolimus、AP23573(Ariad)、AZD8055(AstraZeneca)、BEZ235(Novartis)、BGT226(Norvartis)、XL765(Sanofi Aventis)、PF-4691502(Pfizer)、GDC0980(Genetech)、SF1126(Semafoe)與OSI-027(OSI))、oblimersen、gemcitabine、carminomycin、leucovorin、pemetrexed、cyclophosphamide、dacarbazine、procarbizine、prednisolone、dexamethasone、campathecin、plicamycin、asparaginase、aminopterin、methopterin、porfiromycin、melphalan、leurosidine、leurosine、chlorambucil、trabectedin、procarbazine、discodermolide、carminomycin、aminopterin與hexamethyl melamine所組成的群組。
可以理解的是，在PREX2基因或在PREX2多胜肽具有突變的個體替代地可以接受常規治療(例如切除、射頻燒灼術(RFA)、化療、經導管動脈化療栓塞及放射線治療)、抗血管增生療法或免疫療法。
本發明另一方面是有關一種治療罹患或被懷疑罹患癌症的患者的方法。根據本發明的某些實施例，該癌症有在患者身上/體內過度表現的PREX2。根據本發明其他實施例，該癌症有在患者身上/體內表現的經突變PREX2，其中經突變的PREX2包括選自由G258V、S1113R、E1346D及K400fs所組成的群組的至少一突變。本發明包括將有效量的治療分子投藥予個體。
較佳地，治療分子是PREX2抑制劑。根據本發明的一個實施例，PREX2抑制劑是下調節PREX2 mRNA表現的小干擾RNA。根據本發明的另一實施例，PREX2抑制劑是包括SEQ ID NO：1或2序列的多胜肽，該多胜肽經由增強PREX2的降解作用而抑制癌細胞增殖和/或誘導癌細胞死亡(即壞死或細胞凋亡)。根據本發明一個可行的實施例，SEQ ID NO：1或2的多胜肽增加癌細胞對抗癌藥物(例如索拉非尼(sorafenib))的敏感性。
SEQ ID NO：1或2的多胜肽可由哺乳類系統生成。尤其，編 碼SEQ ID NO：1或2的多胜肽的核苷酸可透過磷酸鈣共沉澱、電穿孔、細胞核轉染、細胞擠壓(輕柔地擠壓細胞膜)、聲穿孔法(以高強度超音波誘導在細胞膜的孔形成作用)、光轉染(以高度聚焦雷射在細胞膜產生小孔)、穿刺轉染(插入連結到奈米纖維表面的細胞DNA)、基因槍(“射入”到與惰性固體的奈米粒子耦合的細胞核DNA)、磁轉染(利用磁力而將DNA傳送到標靶細胞)、病毒轉導(使用病毒作為載體而將DNA傳送到標靶細胞)或透過樹枝狀聚合物、脂質體或陽離子聚合物而被引入哺乳類細胞(例如293T細胞)。導入了聚核苷酸的細胞隨後在適當條件下培養(取決於細胞類型，例如用於293T細胞的37℃與5% CO2)，以便產生本發明的多胜肽。替代地，SEQ ID NO：1或2的多胜肽可以透過常用方法來合成，例如α-氨基基團的叔丁氧羰基(t-BOC)或使芴甲氧羰基(FMOC)的保護作用。這兩種方法都涉及逐步合成，即在每個步驟中，從胜肽的羧基端開始添加單一的胺基酸。本發明的胜肽也可透過熟知的固相胜肽合成方法來合成。
較佳地，本發明的治療分子與標靶分子耦合，該標靶分子呈現對癌細胞上表現的多胜肽(即PREX2或包含G258V、S1113R、E1346D和/或K400fs的經突變PREX2多胜肽)的結合親和力。因此，一旦給藥予個體，治療分子就可以透過標靶分子與多胜肽之間的相互作用而趨向癌細胞。取決於所欲目的，標靶分子可為抗體或適體。
根據本發明任何方面及實施例，可由本發明方法治療的示例性癌症包括但不限於：胃癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、胰臟癌，腎癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巢癌、腦腫瘤、前列腺癌、肝細胞癌、黑色素瘤、食道癌、多發性骨髓瘤及頭部和頸部鱗狀細胞癌。根據一個範例，癌症為HCC。
根據一個具體實施例，癌症為抗藥性癌症。
基本上，根據本發明任何方面及實施例，可由本發明方法治療的個體為哺乳類，例如：人類、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔子、狗、貓、牛、山羊、綿羊、猴子和馬。較佳地，該個體為人類。根據一個可行範例，該個體為亞洲人。
本發明的方法可以單獨地或與在癌症治療上有某些有益效果的額外療法組合，而施加於個體。取決於治療目的，本發明的方法可以在進行額外療法之前、期間或之後施加於個體。
根據本發明的任何方面和實施例的治療分子可透過選自由口服、腸內、鼻腔、局部、黏膜和腸外給藥所組成的群組給藥予該個體，其中腸外是皮下、腫瘤內、皮內、肌肉、關節、靜脈、脊椎內或腹腔注射中的任一者。
以下範例是提供用於闡明本發明的特定方面，並且幫助本領域人士實施本發明。這些範例在任何方面都不能被認為來限縮本發明的範圍。而且，毋須進一步的努力，本領域人士即可根據本文的描述，利用本發明至其最大範圍。本文引用的所有文獻均以其全文作為本申請案的參照。
範例
材料與方法
PREX2表現
從HCC患者分離出腫瘤(T)組織、腫瘤相鄰(TA)組織和周邊血液單核細胞(PBMC)，接著進行反轉錄、即時聚合酶連鎖反應(即時PCR，real-time PCR)和免疫墨點分析。針對PREX2而用於即時PCR的引 子為PREX2-F：5’-GAGATTGCCG CACCAGAGA-3’(SEQ ID NO：3)和PREX2-R：5’-TCAAGGACAT GGTGCATAAA TCC-3’(SEQ ID NO：4)；以及用於TATA盒結合蛋白(TATA-box binding protein,TBP)的引子為TBP-F：5’-CAGAAGTTGG GTTTTCCAGT CAA-3’(SEQ ID NO：5)和TBP-R：5’-ACATCACAGC TCCCCACCAT-3’(SEQ ID NO：6)。預測的週期閾值(CT)被匯出到EXCEL試算表進行分析。使用比較性CT法以測定相對於TBP的基因表現的倍數差異。用於免疫墨點法的抗體為抗PREX2抗體(Sigma)以及抗β肌動蛋白(anti-β-actin,Sigma)。
基因突變的突變
以HaloPlex標靶富集定序法分析從30位HCC患者的腫瘤、TA組織或周邊血液單核球細胞所提取的DNA。
HaloPlex標靶富集定序法
在Illumina定序法進行之前，所有的DNA樣本需先通過數個品質標準評估。使用Epoch系統(BioTek)測定DNA濃度，且超過500奈克(ng)的DNA含量列入考量。此外，以凝膠電泳檢查DNA的結構完整性，並且不再考慮被分解的樣本。如製造商指南所建議，使用HaloPlex標靶富集系統(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)來捕捉基因體DNA，並以特殊設計的探針確定PREX2序列。來自HCC樣本的基因體DNA(200-250ng)被限制酶切成片段，並與探針進行雜交而環狀化，而該探針兩端與目標片段互補。該探針包含一個方法限定的定序基元(sequencing motif)，其在環狀化期間被併入。環狀分子隨後被黏接而封閉，並且使用卵白素(streptavidin)珠捕捉目標DNA。擴增後的環狀DNA目標物被富集及進行 定序。
序列資料的處理與體細胞突變的鑑別
使用GEMINI大型電腦程式和CLC基因體工作平台(http：//www.clcbio.com/products/clc-genomics.workbench/)執行配接序列裁剪(adapter sequence trimming)、品質過濾、覆蓋率測定和序列重疊群(contig)的最初組裝。藉由將讀取再比對(read realignment)與單核苷酸多型性資料庫(dbSNP)進行比對而確定候選的單核苷酸多型性(SNP)和插入-刪除(insertion-deletion,indel)突變。為了確認體細胞的取代和插入-刪除，使用GEMINI而比較來自HCC腫瘤及相匹配生殖譜系(germline)DNA的再比對以及參考基因體(Ref_NCBI_GRCh37_hg19)，而過濾出存在於dbSNP資料庫的已知SNP。
範例1：PREX2表現之調控
1.1 GNMT和PREX2之間的交互作用
為了測試GNMT是否與PREX2進行相互作用，HEK293T細胞共轉染了PREX2和GNMT表現質體，且使用來自該HEK293T細胞的細胞裂解物進行免疫沉澱(IP)試驗。交互共同免疫沉澱(reciprocal Co-IP)試驗的數據證實了GNMT與PREX2進行共免疫沉澱。再者，純化在Huh7細胞過度表現的重組GNMT，接著進行Co-IP和免疫墨點試驗的分析。
請參閱圖1A-圖1G，該圖組繪示了GNMT與PREX2反應、並且負向調控由PREX2中介的AKT訊號。如圖1A的數據所示，GNMT與內源性PREX2進行交互作用。為了證明GNMT在生理條件下與PREX2進行相互作用，使用小鼠肝臟裂解物進行交互Co-IP試驗，結果證實：內源性GNMT 專一性地與內源性PREX2進行共免疫沉澱(請參閱圖1B)。為了繪製結合域，不同的Myc標記的PREX2截斷突變體在HEK293T細胞與旗幟(FLAG)標記的GNMT共同表現。發現到配對的PDZ域中介了其與GNMT的相互作用。此外，使用純化的GST-GNMT和PREX2以His-Myc標記的PDZ域的體外下拉實驗證實：GNMT直接結合至PREX2。
為了確認PREX2與GNMT進行交互作用的效果，監測過度表現GNMT的HCC細胞中的PREX2表現。結果發現，過度表現GNMT的HepG2細胞中內源性PREX2表現明顯地減少，而蛋白酶體抑制劑-MG132的處理可反轉這種效果(請參閱圖1C)。此外，當一個含有小於0.5%其酵素活性的突變體GNMT-N140S在HepG2細胞表現時，觀察到類似的現象。實驗數據顯示，由GNMT所引起的內源性PREX2的減少與其甲基轉移酶活性無關。此外，脈衝追踪實驗顯示：GNMT的表現明顯地縮短了PREX2的半衰期，從15小時縮短至9.4小時(請參閱圖1D)。以放線菌酮(cycloheximide,CHX)處理細胞後，觀察到類似的結果。由於標靶蛋白上的K48連結多泛素鏈是蛋白酶體降解的主要訊號，因此進行泛素化試驗以探討GNMT是否在PREX2蛋白上提昇K48連結的泛素化形成作用。圖1E的實驗數據顯示，在MG132存在下，GNMT過度表現提昇PREX2的K48連結的泛素化。由於PREX2是PI3K-AKT路徑的一個組成部分，因此進行免疫墨點試驗以確認這種相互作用對於PI3K-AKT梯瀑的影響。Huh7細胞中的GNMT壓低作用(knockdown)導致PREX2蛋白的顯著增加，同時它不影響PREX2 mRNA的水平(請參閱圖1F)。然而，AKT在Thr308和Ser473處的磷酸化隨之增加(請參閱圖1F)。這種增加的AKT磷酸化被發現與肝醣合成酶激酶3β(請參閱圖1F中的 GSK3β，是一種已知的AKT受體)AKT的磷酸化水平相關聯。此外，AKT磷酸化的增加取決於PREX2，因為GNMT和PREX2兩者表現的抑制作用反轉了AKT活化作用。為了進一步探討活體內GNMT缺陷是否與PREX2表現相關聯，以免疫墨點及定量來測量野生型小鼠和GNMT -/-小鼠肝臟中的PREX2蛋白豐富程度。相較於野生型小鼠，GNMT-/-小鼠具有明顯較高的PREX2蛋白質水平，且這樣的關聯性與AKT活化作用有關(請參閱圖1G)。綜合上述，這些結果顯示GNMT透過泛素-蛋白酶體路徑而負向調控PREX2的功能。
1.2 HectH9和PREX2之間的交互作用
在泛素化路徑中，E3接合酶(E3 ligase)擔任系統中特定的受體-識別要素。為了確認可種E3接合酶負責泛素依賴的PREX2分解作用，在MG132存在的前提下，篩選用於PREX2泛素化的一群E3接合酶。
請參閱圖2A-2D，其繪示HectH9連同PREX2，可導致其泛素化和分解作用。實驗結果表明，在那些E3接合酶中，與同源於E6AP羧基末端同源蛋白9(HectH9，也已知為HuWe1、Mule或ARF-BP1)大大地增強活體內PREX2的泛素化(請參閱圖2A)。HectH9屬於泛素接合酶的Hect域家族，其特徵在於具有保留的羧基末端催化域。許多HectH9受體已被報導參與了細胞凋亡(Mcl-1)和轉錄調控(p53、c-Myc和N-Myc)。Co-IP試驗證實：HectH9與PREX2中配對的PDZ和Inspx4域進行交互作用。為了確認HectH9是否影響PREX2的穩態水平，以免疫墨點分析檢測具有HectH9壓低作用的HCC細胞中的內源性PREX2表現。相較於對照組，感染表現shRNA的慢病毒(lentivirus)的Huh7細胞增加了PREX2蛋白質的水平，而該shRNA 靶定了HectH9(請參閱圖2B)。在HepG2細胞也觀察到類似的效果。放線菌酮處理組顯示：在HectH9耗盡後的PREX2豐富度的增加主要是由於PREX2蛋白質的半衰期增加所致(請參閱圖2C)。值得注意的是，PREX2的內源性K-48連結的泛素化的水平在HectH9耗盡時明顯地減少(請參閱圖2D)。
1.3 HectH9抑制腫瘤生長
為了確認在HCC細胞中由HectH9所引發的PREX2分解作用的生物學意義，HectH9在一對PTEN-野生型細胞株Huh7和HepG2中被壓低，隨後測量AKT路徑的活性。請參閱圖3A-3D，其繪示HectH9調控由PREX2中介的AKT訊號、細胞生長以及HCC腫瘤生長。在Huh7細胞的HectH9抑制作用增加了AKT和AKT受體(包括GSK3β、Foxol和Foxo3a)的磷酸化(請參閱圖3A)以及增強的細胞增殖(請參閱圖3B)。同樣地，在HepG2細胞觀察到升高的細胞增殖。此外，增加的AKT磷酸化和細胞增殖依賴於PREX2的功能，因為抑制HectH9和PREX2兩者的表現反轉了AKT活化作用和細胞增殖。
為了進一步探討HectH9可否在體內調控肝癌的發展，在一個異種移植模式中，監測HectH9表現對於腫瘤生長的影響。透過RNAi干擾的HectH9壓低作用大大地增加了異種移植腫瘤的生長(請參閱圖3C)。此外，HectH9和PREX2兩者表現的抑制作用反轉了腫瘤生長，表明HectH9中介的HCC腫瘤生長依賴於PREX2的功能(請參閱圖3C)。免疫組織化學染色的實驗數據表明：HectH9抑制作用將導致Ki-67表現的上調節，而進一步的PREX2表現的壓低作用可以挽回這樣的效應(請參閱圖3D)。因此，在HCC細胞中HectH9的調節依賴於PREX2的功能。
1.4 GNMT、PREX2和HectH9之間的交互作用
進行循序Co-IP試驗以評估GNMT、PREX2和HectH9之間的相互作用關係。結果顯示：GNMT、PREX2的配對PDZ域和HectH9都出現於第二個Co-IP，表明它們形成複合體。此外，Co-IP實驗顯示：當GNMT共同表現時，HectH9更有效地與PREX2進行交互作用。為了確認GNMT中介的PREX2調控作用是否與HectH9相關聯，在GNMT過度表現的HCC細胞中壓低HectH9。令人吃驚的是，Huh7細胞中HectH9的耗盡反轉了GNMT中介的PREX2表現的下調節。同樣地，在HepG2細胞觀察到PREX2表現上類似的效應。此外，Huh7細胞中HectH9的耗盡導致了抑制在PREX2中由GNMT提昇的K48連結泛素化作用。GNMT的過度表達顯著地降低Huh7的增殖，然而此效應在HectH9耗盡後反轉。因此，以GNMT調節PREX2與HectH9相關聯。
範例2：HCC患者的PREX2表現
2.1 HCC患者中PREX2的過度表現
GNMT表現在人類HCC細胞株和腫瘤組織中皆被下調節。為了探討在臨床樣本中PREX2表現情況，檢驗了從HCC患者分離出的腫瘤(T)組織和與腫瘤相鄰(TA)組織中的PREX2表現。
請參閱圖4A-圖4D，其繪示在人類HCC之中PREX2的表現特性及其生存情形。如西方墨點試驗的實驗數據所示，在54.9%(28/51)的HCC患者中，腫瘤組織(T組)的PREX2蛋白質的水平明顯地高於相應的與腫瘤相鄰組織(TA組)(請參閱圖4A)。相比之下，PREX2 mRNA的水平在T組和TA組兩者中是類似的(請參閱圖4B)，進一步支持了由GNMT調節PREX2 表現是一種轉譯後調控作用的見解。進一步檢驗由88個HCC患者組成的另一群體中的PREX2 mRNA表現，亦觀察到類似的結果。再者，在T組和TA組中發現GNMT和PREX2蛋白質水平之間存在顯著的負相關(請參閱圖4C，r=-0.28；p=0.017)。另外，PREX2過度表現與患者以下臨床特徵顯著相關：病毒感染(p=0.004)、腫瘤大小(p=0.03)和甲胎蛋白(AFP)水平(p=0.04)。多元邏輯斯迴歸顯示PREX2的表現與HBV感染呈現顯著相關(勝算比=14.07，p=0.01)。此外，腫瘤組織中較高水平的PREX2與較差的存活率相關聯(請參閱圖4D，p=0.02)。使用Cox比例風險模型評估與HCC患者預後相關聯的因子，結果表明：死亡與PREX2過度表現之間的關聯性具有統計學意義(風險比=3.36，p=0.03)。綜合上述，結果顯示，PREX2蛋白質表現的水平可用於預測HCC患者的生存結果。
2.2 在HCC腫瘤中PREX2突變
稍早曾報導PREX2在黑色素瘤群體中有14%頻率的PREX2非同義體細胞突變。為了探討HCC患者中的PREX2基因是否也存在體細胞突變，以HaloPlex標靶富集定序法分析從30的HCC患者的腫瘤、TA組織及周邊血液單核細胞所提取的PREX2基因體。請參閱圖5，其繪示在HCC腫瘤中PREX2內的非沉默突變，其中從30個HCC腫瘤的Illumina定序檢測非沉默體細胞突變，fs表示框移刪除突變(frameshift deletion mutation)，DH表示DBL同源域，PH表示plekstrin同源域，DEP表示「蓬亂(Dishevelled)、Egl-10以及Pleckstrin域，PREX2的羧基端片段呈現出與肌醇磷酸酶域的序列同源性。繪製到人類PREX2基因體的原始序列的覆蓋率為98.22%，而且圖6示出了定序深度。總共發現14個(46.7%)HCC腫瘤伴隨了16個(53.3%)體細 胞突變，其中包括12個同義突變和4個(13.3%)非沉默突變(請參閱表1)。在這4個非沉默突變中，有3個非同義突變和1個框移截斷突變(請參見圖5)。
綜合上述，20%(6/30)的HCC樣本在其PREX2基因中至少具有1個非沉默突變。此外，突變等位基因頻率(mutant allele frequency)和基因型的分析顯示，所有這三種非同義突變為異型合子(請參閱表2)。
因此，可知G773T是指在PREX2基因第773核苷酸處的鳥糞 嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)取代，從而導致了G258V的非沉默突變，A3337C是指在PREX2基因第3337核苷酸處的腺嘌呤(A)被胞嘧啶(C)取代，從而導致了S1113R的非沉默突變，A4038T是指在PREX2基因第4038核苷酸處的腺嘌呤(A)被胸腺嘧啶(T)取代，從而導致了E1346D的非沉默突變，而1200 delG則是指PREX2基因第1200核苷酸處的鳥糞嘌呤(G)缺失，從而導致了K400fs的非沉默突變。
此外，由表2亦可知，13.3%(4/30)的HCC樣本具有一個PREX2框移刪除突變(K400fs)，其導致了只含有DH和PH域的一種截斷形式的PREX2蛋白質。由於DH域負責GEF活性的調控且PH域抑制了PTEN磷酸酶活性，因此需要進一步的研究來說明其在HCC腫瘤形成中的角色扮演。
綜合上述，本案確定了一種在腫瘤環境中PREX2表現失調的新穎致癌機制，其中GNMT表現是被下調節的。本案的實驗數據顯示PREX2蛋白質表現的水平可用於預測HCC患者的預後；PREX2及其多個突變體可作為用於HCC的新穎治療標靶，可知本發明的醫藥組合物及套組可用於HCC等癌症的診斷、預後以及治療應用，確實具有新穎性和進步性。
是以，縱使本案已由上述之實施例所詳細敘述而可由所屬技術領域中具有通常知識者任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。
<110> 高雄醫學大學
<120> 用於確認、預測以及治療癌症的方法
<150> US 62/462,964
<151> 2017-02-24
<160> 6
<210> 1
<211> 295
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<223> 小鼠甘胺酸甲基轉移酶(GNMT)羧基端片段
<400> 1
<210> 2
<211> 4374
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<223> 小鼠同源於E6AP羧基末端同源蛋白9(HectH9)羧基端片段
<400> 2
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PREX2-F primer
<400> 3
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
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<223> PREX2-R primer
<400> 4
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> TBP-F primer
<400> 5
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> TBP-R primer
<400> 6

Claims (6)

  1. 一種確認一個體罹患肝細胞癌(HCC)或者具有發展成為與該肝細胞癌相關聯之一病症的風險的方法，包括：自該個體取得一生物樣本；從該生物樣本中提取一DNA；檢測該DNA中的磷酯酸肌醇-3,4,5-三磷酸依賴的Rac交換因子2(Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate-dependent Rac exchange factor 2,PREX2)基因是否存在一突變，其中該突變選自由G773T、A4038T、1200 delG及其組合所組成的群組；以及當該突變存在時，確認該個體罹患該肝細胞癌或者具有發展成為與該肝細胞癌相關聯之該病症的風險。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該生物樣本選自由一生物檢體樣本、一全血樣本、一血漿樣本、一血清樣本、一尿液樣本及一黏液樣本所組成的群組其中之一。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該生物樣本是包含循環流動的癌細胞的一全血樣本。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該突變是藉由選自由：直接定序、單股構形多形性(SSCP)、變性梯度膠體電泳(DGG)以及溫度梯度膠體電泳(TGGE)所組成的群組中的一檢測而被檢測。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該病症係該癌症之轉移或復發。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該個體係一人類。
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Pandiella, Atanasio, and Juan Carlos Montero. "Molecular pathways: P-Rex in cancer." Clinical Cancer Research 19.17 (2013): 4564-4569. 李國睿, 碩士學位論文, "定性分析PREX2在肝癌發展過程中所扮演之角色", 高雄醫學大學, 2017/02/20 *
李國睿, 碩士學位論文, "定性分析PREX2在肝癌發展過程中所扮演之角色", 高雄醫學大學, 2017/02/20

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