TWI718351B - 狼尾草萃取物、製造方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於狼尾草萃取物、製造方法及其用於抑制破骨細胞分化及／或活化、及預防及／或治療骨質疏鬆症之用途。

Description

狼尾草萃取物、製造方法及其用途

本發明係關於狼尾草萃取物、製造方法及其用於抑制破骨細胞分化及／或活化、及預防及／或治療骨質疏鬆症之用途。

骨質疏鬆症（osteoporosis）是目前僅次於心血管疾病的第二大流行疾病，世界衛生組織定義骨質疏鬆症為一種全身骨骼疾病，其特徵包括骨量減少、骨組織的顯微結構變差，造成骨骼脆弱，骨折危險性增高。 隨著骨質疏鬆症的流行，骨骼及關節的膳食補充品（bone and joint health supplements）的全球消費量亦逐年增長，預計在2017年將可達到90.9億美元的市場銷售額。然而，目前市面仍少見以天然草本植物為主要原料之產品。

本發明提供一種萃取組合物，其包含狼尾草萃取物，而可抑制破骨細胞（osteoclast）分化及／或活化，進而可用於預防及／或治療骨質疏鬆症者。 因此，本發明提供一種萃取組合物，其包含狼尾草萃取物，該狼尾草萃取物係以包含下列步驟之方法製備：(a)提供狼尾草；及(b)以一醇溶液萃取該狼尾草，以獲得一狼尾草醇萃取物。 本發明另提供一種萃取組合物的製造方法，其包含製備該狼尾草萃取物，且該狼尾草萃取物的製備方法包含下列步驟：(a)提供狼尾草；及(b)以一醇溶液萃取該狼尾草，以獲得一狼尾草醇萃取物。 本發明又提供一種萃取組合物的用途，係用於製備抑制破骨細胞分化及／或活化之藥物。

本發明提供一種萃取組合物，其包含狼尾草萃取物，該狼尾草萃取物係以包含下列步驟之方法製備：(a)提供狼尾草；及(b)以一醇溶液萃取該狼尾草，以獲得一狼尾草醇萃取物。 本發明另提供該萃取組合物的製備方法，其包含製備該狼尾草萃取物，且該狼尾草萃取物的製備方法包含下列步驟：(a)提供狼尾草；及(b)以一醇溶液萃取該狼尾草，以獲得一狼尾草醇萃取物。 參考以下對本發明之各態樣、實例、及伴隨相關描述之化學圖式及表格的詳細描述，可更容易地瞭解本發明。在揭示及描述本發明之萃取物、組合物及／或方法之前，應瞭解，除非由申請專利範圍另外特別地指出，否則本發明不受限於特定製備方法、載劑或調配物、或將本發明萃取物調配成用於局部、經口或非經腸投予之產物或組合物的特定模式，此係由於熟習相關技術之通常知識者非常清楚此等事情是可以加以變化的。亦應瞭解，本文所用之術語僅用於描述特定態樣之目的而不意欲用於限制性本發明之範疇。 除非另外指出，否則如本發明所用之以下術語應解釋為具有以下含義。 範圍在本文中通常表述為「約」一個特定值及／或至「約」另一個特定值。當表述此類範圍時，一態樣為包括一個特定值及／或至另一個特定值之範圍。類似地，當值藉由使用字「約」表述為近似值時，應瞭解特定值可形成另一態樣。另外應瞭解，每一範圍之各端點皆有顯著性，一端點與另一端點既有相關性，亦彼此獨立。 「視情況」或「視情況地」意謂隨後所述之事件或狀況可能發生或可能不發生，且該描述包括該事件或狀況發生之情況及其未發生之情況。舉例而言，「視情況包含藥劑」意謂該藥劑可能存在或可能不存在。 必須指出，除非上下文另外清楚規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一」及「該」包括複數個所指標的物。因此，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。 如本文所用之術語「個體」表示任何動物，較佳為哺乳動物，且更佳為人類。個體之實例包括人類、非人類靈長類動物、齧齒動物、天竺鼠、兔、綿羊、豬、山羊、母牛、馬、狗及貓。 術語如本文所提供之化合物的「有效量」意謂該萃取物之量足以提供對所需功能之所需調節。如下文所指出，確實的需要量將在個體之間有變化，此視個體之疾病病況、身體狀況、年齡、性別、物種及體重、組合物之特性及配方等而定。給藥方案可經調整以誘導最佳治療反應。舉例而言，可每日投予若干分次劑量，或可依治療情形之緊急程度按比例減少劑量。因此，很難指定確實的「有效量」。然而，本發明領域中具有通常知識者使用常規實驗即可確定適當的有效量。 如本文所用之術語「預防」係指延緩易感個體症狀之發作，減少病症或病狀出現，或抑制病症或病狀出現，或停滯病症或病狀之發展。 如本文所用之術語「治療」表示逆轉、減輕或改善此術語所適用之病症或病狀、或該病症或病狀之一或多種症狀，或抑制其進展。 如本文所用之術語「載劑」或「賦形劑」係指自身並不為治療劑，而是用作用於將治療劑傳遞至個體之載劑及／或稀釋劑及／或佐劑或媒劑，或添加至調配物中以改善調配物之處理或儲存性質或允許或有助於組合物之劑量單位形成適於投予之劑量單位的任何物質。適合之載劑或賦形劑為一般熟習製造醫藥調配物或食品之通常知識者所熟知。載劑或賦形劑可包括（舉例而言但不限於）緩衝劑、稀釋劑、崩解劑、黏合劑、黏著劑、濕潤劑、聚合物、潤滑劑、滑動劑、為遮蔽或抵消不良味道或氣味而添加之物質、調味劑、染料、芳香劑及為改善組合物之外觀而添加之物質。可接受之載劑或賦形劑包括檸檬酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑、碳酸氫鹽緩衝劑、硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸及硫酸之鈉鹽及鈣鹽、碳酸鎂、滑石、明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、果膠、糊精、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、澱粉、明膠、纖維素物質（諸如烷酸之纖維素酯及纖維素烷基酯）、低熔點蠟、可可脂、胺基酸、尿素、醇類、抗壞血酸、磷脂、蛋白質（例如血清白蛋白）、乙二胺四乙酸（EDTA）、二甲亞碸（DMSO）、氯化鈉或其他鹽、脂質體、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油或粉末、聚合物（諸如聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇及聚乙二醇）、及其他醫藥學上可接受之物質。載劑不應破壞治療劑之藥理學活性，且在以足以傳遞治療量之藥劑的劑量投予時應無毒性。 本發明所述之狼尾草係指禾本科（Poaceae）狼尾草屬（Pennisetum），較佳為Pennisetum purpureum Schumach., 1827，其又稱象草，為原產自南非的多年生草種，是國內主要芻料作物之一。舉例而言，本發明所述之狼尾草可為農委會畜產試驗所研發之狼尾草台畜草一至七號（Pennisetum purpureum Schum., CV.TLG1-7），或是後續新改良之品種。狼尾草具有良好生力、環境忍耐力以及具備極佳的價格競爭力，相較於傳統中草藥更有大規模商業化的優勢。更佳地，本發明之狼尾草可指高莖狼尾草台畜草二號，其已由衛生福利部食品藥物管理署核可為可供食品使用之原料，可用於食品、生技或是醫藥領域，使用上無安全之疑慮。 本發明之狼尾草較佳為狼尾草全株，且於步驟(a)之狼尾草較佳於萃取前經清洗、乾燥及粉碎處理。舉例而言，可使用清水清洗狼尾草所沾附之汙泥等，續於例如約30°C至約70°C之溫度乾燥約12至約48小時，較佳於約50°C之溫度乾燥約24小時，至其含水量小於約10%。而後，可使用例如粉碎機進行粉碎，以提高萃取效率。 於步驟(b)中，所述醇可為具有碳數1至7之醇，且可指直鏈或支鏈、具取代或不具取代、單元或多元、飽和或不飽和之醇，較佳係為不具取代、單元及飽和醇。另一方面，較佳為1至4碳數之醇。於本發明之一較佳具體實施例中，係為甲醇、乙醇、正丙醇（n-propanol）、異丙醇（isopropanol）、正丁醇、異丁醇（iso-butanol）、仲丁醇（sec-butanol）、叔丁醇（tert-butanol）、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇、3-甲基-2-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2,2-二甲基-1-丙醇、1-己醇、2,4-己二烯-1-醇、2-甲基-環戊醇、環己醇、1-庚醇、2-庚醇或環庚醇，且可單獨使用或混合多種使用；尤佳地，係為甲醇或乙醇；最佳為乙醇，例如濃度95%之乙醇水溶液。 於本發明之一較佳具體實施例中，該狼尾草係浸於該醇溶液中以供萃取，更佳地，該狼尾草係浸於該醇溶液中，並經超音波震盪以供萃取，例如經超音波震盪1至12小時。該狼尾草與醇溶液之比例並無限制，在本發明之較佳具體實施例中，狼尾草與醇溶液之比例為約1：1至約1：30；較佳地，約1：2至約1：20；尤佳地，約1：3至約1：10。 於萃取後，可移除固體部分，以獲得該狼尾草醇萃取物。去除固體部份之方法係為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知，例如但不限於使用過濾、離心、沉澱等方式。於本發明之一較佳具體實施例中，該萃取步驟(b)可重複實施，並收集合併該狼尾草醇萃取物。 較佳地，本發明之狼尾草萃取物的製備方法另包含：(c)以乙酸乙酯萃取該狼尾草醇萃取物，以獲得一狼尾草乙酸乙酯部分萃取物。舉例而言，可使用乙酸乙酯對該狼尾草醇萃取物進行分層萃取。亦即，上述步驟(c)可包含：(c1) 將該狼尾草醇萃取物混合於乙酸乙酯與水之混合液；(c2)靜置至乙酸乙酯與水分層；及(c3)收集乙酸乙酯層。 於本發明一較佳具體實施例中，係提供包含體積比約1：5至約5：1之乙酸乙酯與水的混合液，較佳體積比約1：3至約3：1，更佳為體積比約1：1；將該狼尾草醇萃取物充分混合於該混合液中，續靜置至該混合液分層為乙酸乙酯層與水層，收集乙酸乙酯層以獲得該狼尾草乙酸乙酯部分萃取物。類似地，該萃取步驟(c)可重複實施，例如重複萃取3至10次，並收集合併該狼尾草乙酸乙酯部分萃取物。 較佳地，根據本發明之方法可進一步包含濃縮及／或乾燥該狼尾草萃取物。濃縮及乾燥之方法係為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知，例如使用減壓濃縮，以及自然風乾或冷凍乾燥等。較佳地，上述狼尾草醇萃取物及狼尾草乙酸乙酯部分萃取物皆經減壓濃縮至乾燥。 於本發明之一較佳具體實施例中，該狼尾草醇萃取物及狼尾草乙酸乙酯部分萃取物分別經高效液相層析（High-performance liquid chromatography，簡稱HPLC）分析，以建立其HPLC指紋圖譜。分析條件如下： 管柱：Ultra C18（5 μm x 250 mm x 4.6 mm）； 進樣：溶劑為甲醇，樣品濃度1000 ppm，注射體積20μL； 流析：流動相為甲醇，流速1 mL/min； 偵測：偵測波長400 nm。 該狼尾草醇萃取物及狼尾草乙酸乙酯部分萃取物的HPLC指紋圖譜分別如圖1及圖2所示，且各圖中主要波峰之滯留時間（retention time）如下表1所示：表 1 ：狼尾草醇萃取物（圖 1 ）及乙酸乙酯部分萃取物（圖 2 ）主要波峰滯留時間

根據本發明之萃取組合物較佳為醫藥組合物或食品組合物。 本發明之醫藥組合物可藉由本發明領域中已知之任何方法局部或全身投予，包括但不限於藉由肌肉內、皮內、靜脈內、皮下、腹膜內、鼻內、經口、黏膜或外部途徑投予。適當的投藥途徑、調配方法及投藥時程可由本發明領域中具有通常知識者來決定。在本發明中，醫藥組合物可根據相應投藥途徑以多種方式調配，諸如液體溶液、懸浮液、乳液、糖漿、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物、散劑、顆粒、安瓿、注射液、輸注液、套組、軟膏、洗劑、擦劑、乳膏或其組合。視情況，其可經滅菌或與任何醫藥學上可接受之載劑或賦形劑混合，其中有許多醫藥學上可接受之載劑或賦形劑已為一般技術者所知。 本發明所言之外部途徑亦可稱為局部投藥，包含但不限於以吹氣或吸入投藥。局部投藥之各類製劑實例包含軟膏、乳液、乳霜、凝膠、發泡體，以經皮貼片輸送之製劑，吸入或吹氣用之粉末、噴霧劑、氣溶膠、膠囊或藥匣，或滴劑（例如眼用或鼻用滴劑），供霧化用溶液／懸浮液、栓劑、陰道藥栓、駐留灌腸劑及咀嚼劑或可吸入之錠劑或藥片或脂質或為膠囊製劑。 軟膏、乳霜及凝膠可例如配合水性或油性基質，且添加適用增稠劑及／或膠凝劑及/或溶劑調配。該基質因此可包含例如水及／或油，如液態鏈烷或植物油，如花生油或蓖麻油，或溶劑如聚乙二醇。可依據基質性質使用之增稠劑及膠凝劑包含軟質鏈烷、硬脂酸鋁、鯨醯硬脂基醇、聚乙二醇、毛脂肪、蜜蠟、羧基聚亞甲基及纖維素衍生物，及／或單硬脂酸甘油酯，及／或非離子性乳化劑。 乳液可配合水性或油性基質調配，且通常亦含有一或多種乳化劑、安定劑、分散劑、懸浮劑或增稠劑。 外塗用粉末可配合任何適用之粉末狀基質形成，例如滑石、乳糖或澱粉。滴劑可配合水性或非水性基質調配，且亦包括一或多種分散劑、溶解劑、懸浮劑或保存劑。 噴霧組合物可例如調配成水溶液或懸浮液，或調配成自預加壓袋輸送之氣溶膠，如劑量吸入器，且配合使用適用之液化推進劑。適用於吸入用之氣溶膠組合物可為懸浮液或溶液，該氣溶膠組合物可視情況含有額外之技藝中習知之調配佐藥，如介面活性劑例如油酸或卵磷脂及共溶劑例如乙醇。 局部用製劑可藉由每天對欲作用之區域施用一或多次投藥；且在皮膚區域上較佳使用覆蓋貼片。可藉由黏著劑儲存系統持續或延長輸送。 根據本發明之食品組合物中，該萃取組合物可在食品製造過程中，添加於習用之食品組合物中（亦即可食用之食品或飲品或其前驅物）。幾乎所有之食品組合物皆可添加根據本發明之該萃取組合物。可添加根據本發明之該萃取組合物之食品組合物包含，但不限於糖果、烘焙食品、冰淇淋、乳製品、甜品及風味小點、小吃、肉類替代產品、快餐食品、湯類、麵食、麵條、罐頭食品、冷凍食品、乾製食品、冷藏食品、油脂、嬰兒食品、軟食物、或麵包塗醬或其混合物。 本發明另提供一種如前述萃取組合物之用途，其係用以製備抑制破骨細胞分化及／或活化之藥物。 本發明又提供一種如前述萃取組合物之用途，其係用以製備預防及／或治療骨質疏鬆症之藥物。 本發明再提供一種於一個體中抑制其破骨細胞分化及／或活化，及預防及／或治療骨質疏鬆症之方法，其包含給予該個體有效量之如前述萃取組合物及視需要之醫藥上可接受之載劑或賦形劑。亦即，根據本發明之萃取組合物可藉由抑制該個體中破骨細胞分化及／或活化，進而於該個體中預防及／或治療骨質疏鬆症。 於本發明之一具體實施例中，於RAW 264.7小鼠巨噬細胞株為模型之測試中，以狼尾草萃取物共同培養可顯著抑制RANKL所引發之破骨細胞分化及活化，代表包含狼尾草萃取物之萃取組合物具有預防及治療骨質疏鬆症之療效。 於本發明之一較佳具體實施例中，根據本發明之萃取組合物的用途，其係用以製備抑制NFATc1進入細胞核，而抑制破骨細胞分化之藥物。 以下之非限制性之實例有助於本發明所屬技術領域中具通常知識者實施本發明。該等實例不應視為過度地限制本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。實例 1 ：狼尾草醇萃取物之細胞毒性測試 狼尾草醇萃取物之製備：取新鮮狼尾草，經清洗、乾燥及粉碎後，以95%之乙醇水溶液進行萃取，其中狼尾草與乙醇水溶液之體積比為1：3至1：10，並以超音波震盪，收集液體部分經減壓濃縮後獲得狼尾草醇萃取物。 取RAW 264.7小鼠巨噬細胞於24孔盤（5 x 10⁵ 細胞／孔）中以DMEM培養基（Dulbecco's modified Eagle medium）進行繼代培養，並分別加入狼尾草醇萃取物（濃度：5 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml），於培養24小時後，將培養液更換成含有0.5 mg/ml細胞存活率分析試劑（即MTT試劑）之α基礎培養基（α-minimal essential medium，簡稱α-MEM），於37°C下培養2至3小時，再將上層培養液吸除，加入200 μl DMSO將細胞溶解，使用酵素免疫分析測讀儀（ELISA reader）以波長540 nm的吸光值測定細胞存活率。以未加入狼尾草醇萃取物之組別作為控制組，並定為100%存活率，結果如圖3所示。 由上述結果顯示，各種濃度之狼尾草醇萃取物皆未對細胞存活率造成顯著差異，故狼尾草醇萃取物至少於50 μg/ml以下之濃度不具細胞毒性。實例 2 ：狼尾草醇萃取物抑制破骨細胞分化之測試 取RAW 264.7小鼠巨噬細胞於24孔盤（5 x 10⁵ 細胞／孔）中以DMEM培養基進行繼代培養培養24小時後，更換為α基礎培養基（α-MEM），並加入10%胎牛血清（fetal bovine serum，簡稱FBS）、 100 ng/ml核因子κ-B配體受體致活劑（Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，簡稱RANKL）及狼尾草醇萃取物（濃度如下表2所示）共培養5天，續將細胞與10%福馬林（formalin）共同處理10分鐘，而後進行抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，簡稱TRAP）染色，如圖4A至圖4E所示。另測量控制組2-2與實驗組2-1、2-2及2-3之破骨細胞內TRAP活性，以控制組2-2定為100%，測試結果如圖5所示。TRAP為破骨細胞的標記（marker）之一，可用以判斷破骨細胞的分化／活化狀態。表 2 ：狼尾草醇萃取物抑制破骨細胞分化／活化之測試條件及結果

由圖4A及4B可見，RANKL可誘導破骨細胞分化，而形成多核的特徵。參照圖4C、4D及4E可知，狼尾草醇萃取物可抑制破骨細胞分化。再者，如圖5所示，狼尾草醇萃取物可抑制破骨細胞內TRAP活性。由此可知，狼尾草確實可抑制破骨細胞分化及／或活化，進而可以用於預防及／或治療骨質疏鬆症。實例 3 ：狼尾草乙酸乙酯部分萃取物抑制破骨細胞分化之測試 狼尾草乙酸乙酯部分萃取物之製備：取上述狼尾草醇萃取物，混合於體積比為1：1之乙酸乙酯／水混合液中，靜置分層後收取乙酸乙酯層，續減壓濃縮後獲得狼尾草乙酸乙酯部分萃取物。 取RAW 264.7小鼠巨噬細胞於24孔盤（5 x 105細胞／孔）中以DMEM培養基進行繼代培養培養24小時後，更換為α基礎培養基（α-MEM），並加入10% FBS、100 ng/mlRANKL及／或50 μg/ml狼尾草乙酸乙酯部分萃取物（如下表3所示）共培養5天，續將細胞與10%福馬林共同處理10分鐘，而後進行TRAP染色，如圖6A至圖6C所示。表 3 ：狼尾草乙酸乙酯部分萃取物抑制破骨細胞分化／活化之測試條件及結果

另將控制組3-1、3-2及實驗組3-1進行活化T细胞核內因子（Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1，簡稱NFATc1）及4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，簡稱DAPI）染色，結果分別如圖7A至圖7C所示。 由圖6A至圖6C可見，狼尾草乙酸乙酯部分萃取物可抑制破骨細胞分化，進而可以用於預防及／或治療骨質疏鬆症。再者，如圖7A至圖7C所示，狼尾草乙酸乙酯部分萃取物可能透過抑制NFATc1進入細胞核，而抑制破骨細胞分化。 上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制本發明。習於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。

圖1顯示狼尾草醇萃取物的高效液相層析圖譜； 圖2顯示狼尾草乙酸乙酯部分萃取物的高效液相層析圖譜； 圖3顯示狼尾草醇萃取物之細胞毒性測試結果； 圖4A、圖4B、圖4C、圖4D及圖4E顯示狼尾草醇萃取物抑制破骨細胞分化測試結果； 圖5顯示狼尾草醇萃取物抑制破骨細胞活化測試結果； 圖6A、圖6B及圖6C顯示狼尾草乙酸乙酯部分萃取物抑制破骨細胞分化測試結果； 圖7A、圖7B及圖7C顯示狼尾草乙酸乙酯部分萃取物抑制NFATc1進入細胞核測試結果。

Claims (6)

1. 一種萃取組合物的用途，係用於製備抑制破骨細胞分化及/或活化之藥物，其中該萃取組合物包含狼尾草萃取物，該狼尾草萃取物係以包含下列步驟之方法製備：(a)提供狼尾草；及(b)以一濃度95%之乙醇水溶液萃取該狼尾草，以獲得一狼尾草乙醇萃取物。
2. 如請求項1之萃取組合物的用途，其中步驟(a)之狼尾草係經清洗、乾燥及/或粉碎處理。
3. 如請求項1之萃取組合物的用途，其中該狼尾草萃取物的製備方法另包含：(c)以乙酸乙酯萃取該狼尾草乙醇萃取物，以獲得一狼尾草乙酸乙酯部分萃取物。
4. 如請求項3之萃取組合物的用途，其中步驟(c)包含：(c1)將該狼尾草乙醇萃取物混合於乙酸乙酯與水之混合液；(c2)靜置至乙酸乙酯與水分層；及(c3)收集乙酸乙酯層。
5. 如請求項1至4中任一項之萃取組合物的用途，係用於製備預防及/或治療骨質疏鬆症之藥物。
6. 如請求項1至4中任一項之萃取組合物的用途，其係用以製備抑制NFATc1進入細胞核，而抑制破骨細胞分化之藥物。

Images