TWI669310B

TWI669310B - 能夠結合ｃｄ１２３和ｃｄ３的雙特異性單價雙抗體及其用途

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Publication number: TWI669310B
Application number: TW103128712A
Authority: TW
Inventors: 愛利歐波維尼; 萊斯利強生; 玲黃; 保羅摩爾; 古蘭那達瑞迪齊齊李; 瑞夫佛曼安德森
Original assignee: 宏觀基因股份有限公司
Priority date: 2013-08-23
Filing date: 2014-08-20
Publication date: 2019-08-21
Also published as: GEAP201914100A; US10787521B2; JP6524087B2; US20210047426A1; TW201542593A; US9822181B2; RS61522B1; AP2016009029A0; EP3808776A1; IL244237A0; CR20160108A; JP2017504577A; CY1123940T1; EA201690443A1; US20180094072A1; PH12016500311A1; PE20160509A1; AU2014308905A1; SA516370567B1; SG11201601317UA

Abstract

本發明涉及具有同時結合CD123和CD3的能力之序列優化的CD123 x CD3雙特異性單價雙抗體，並且涉及這種雙抗體在血液惡性腫瘤治療中的用途。

Description

能夠結合CD123和CD3的雙特異性單價雙抗體及其用途

本發明涉及具有同時結合CD123和CD3的能力之CD123 x CD3雙特異性單價雙抗體，並且涉及這種分子在治療血液惡性腫瘤中的用途。

I. CD123

CD123 (白介素3受體α，IL-3Ra)是40 kDa的分子，並且是白介素3受體複合物的一部分(Stomski，F.C.等(1996) “Human Interleukin-3 (IL-3) Induces Disulfide-Linked IL-3 Receptor Alpha- And Beta-Chain Heterodimerization，Which Is Required For Receptor Activation But Not High-Affinity Binding”, Mol. Cell. Biol. 16 (6):3035-3046)。白介素3 (IL-3)驅動多能幹細胞早期分化成紅血球祖細胞、骨髓祖細胞和淋巴祖細胞。CD123表現在CD34+定型祖先上(Taussig, D.C.等(2005)髓細胞樣“Hematopoietic Stem Cells Express Mutiple Myeloid Leukemia: Implications For The Origin And Targeted Therapy Of Acute Myeloid Leukemia”, Blood 106:4086-4092)，但是不是通過CD34+/CD38正常的造血幹細胞被表現。CD123由嗜鹼性粒細胞、肥大細胞、漿細胞樣樹突細胞表現，單核細胞、巨噬細胞和嗜伊紅粒細胞表現一些，而嗜中性粒細胞和巨核細胞表現低或不表現。一些非造血組織(胎盤、睾丸間質細胞，某些腦細胞成分和一些內皮細胞)表現CD123；但是表現大部分是細胞質的。

據報導，CD123由白血病胚細胞和白血病幹細胞(LSC)表現(Jordan，C.T.等(2000) “The Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells”, Leukemia 14:1777-1784；Jin，W.等(2009) “Regulation Of Th17 Cell Differentiation And EAE Induction By MAP3K NIK)”, Blood 113:6603-6610) (圖1)。在人正常前驅物群體中，CD123由造血祖細胞(HPC)的亞型表現，而不被正常造血幹細胞(HSC)表現。CD123也被漿細胞樣樹突細胞(pDC)和嗜鹼性粒細胞表現，並且，以較低的程度，被單核細胞和嗜伊紅粒細胞表現(Lopez，A.F.等(1989) “Reciprocal Inhibition Of Binding Between Interleukin 3 And Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor To Human Eosinophils,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:7022-7026；Sun，Q.等(1996) “Monoclonal Antibody 7G3 Recognizes The N-Terminal Domain Of The Human Interleukin-3 (IL-3) Receptor AlphaChain And Functions As A Specific IL-3 Receptor Antagonist”, Blood 87:83-92；Muñoz，L.等(2001) “ Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies“, Haematologica 86 (12):1261-1269；Masten，B.J.等(2006) “Characterization Of Myeloid And Plasmacytoid Dendritic Cells In Human Lung”, J. Immunol. 177:7784-7793；Korpelainen，E.I.等(1995) “Interferon-Gamma Upregulates Interleukin-3 (IL-3) Receptor Expression In Human Endothelial Cells And Synergizes With IL-3 In Stimulating Major Histocompatibility Complex Class II Expression And Cytokine Production.” Blood 86:176-182)。

已經報導CD123在大範圍的血液惡性腫瘤的惡性細胞上過表現，所述血液惡性腫瘤包括急性髓細胞樣白血病(AML)和骨髓增生異常綜合症(MDS) (Muñoz，L.等(2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies”, Haematologica 86 (12):1261-1269)。CD123的過表現與AML更差的預後相關(Tettamanti，M.S.等(2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401)。

認為AML和MDS源自小量的白血病幹細胞(LSC)並通過該小量的白血病幹細胞(LSC)而得以長期存在，所述白血病幹細胞一般是靜息的(即，不快速分裂的細胞)，所以抗細胞死亡(細胞凋亡)和常規的化療劑。LSC特徵在於高水準的CD123表現，這不存在于正常人骨髓中相應的正常造血幹細胞群體中(Jin，W.等(2009) “Regulation Of Th17 Cell differentiation And EAE Induction By MAP3K NIK”, Blood 113:6603-6610；Jordan，C.T.等(2000) “The Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells”, Leukemia 14:1777-1784)。CD123在45%-95%的AML、85%的毛細胞性白血病(HCL)、和40%的急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)中表現。CD123表現也與多種其他惡性腫瘤/前惡性腫瘤(pre-malignancies)相關：慢性髓細胞樣白血病(CML)祖細胞(包括胚細胞危象(crisis)CML)、霍奇金裡德-斯泰伯格氏（Hodgkin’s Reed Sternberg） (RS)細胞、轉化的非霍奇金淋巴瘤(NHL)、一些慢性淋巴細胞性白血病(CLL) (CD11c+)、急性T成淋巴細胞白血病(T-ALL)的亞型(16%，大部分是不成熟的，大部分是成人型(adult))、漿細胞樣樹突細胞(pDC) (DC2)惡性腫瘤和CD34+/CD38-骨髓增生異常綜合症(MDS)髓細胞惡性腫瘤。

AML是一種克隆性(clonal disease)疾病，特徵在於骨髓中轉化的髓樣祖細胞的增殖和積聚，其最終導致造血功能障礙。AML的發病率隨著年齡而增加，並且年長患者通常比年輕患者具有更差的治療結果(Robak, T.等(2009) “Current And Emerging Therapies For Acute Myeloid Leukemia”, Clin. Ther. 2:2349-2370)。不幸地是，目前，大部分患有AML的成人因他們所患的疾病而死亡。

AML的治療起初集中在誘導緩解(誘導療法)。一旦實現緩解，治療轉為致力於鞏固這種緩解(緩解後或鞏固療法)，並且在一些情況下，轉為維持療法。針對AML的標準緩解誘導範例是用蒽環類抗生素/阿糖胞苷組合化療，隨後鞏固化療(通常用更高劑量的藥物，所述藥物與在誘導期間使用的藥物相同)或人幹細胞移植，這取決於患者耐受強化治療的能力和單獨用化療治癒的可能性(見，例如，Roboz，G.J. (2012) ““Current Treatment Of Acute Myeloid Leukemia,” Curr. Opin. Oncol. 24:711-719)。

誘導療法中頻繁使用的劑包括阿糖胞苷和蒽環類抗生素。阿糖胞苷，也稱為AraC，通過干擾DNA合成而殺死癌症細胞(和其他快速分裂的正常細胞)。與AraC治療相關的副作用包括對感染的抗性降低，白細胞產量減少的結果；由於血小板產量減少而出血；和由於紅細胞的潛在減少而貧血。其他副作用包括噁心和嘔吐。蒽環類抗生素(例如，柔紅黴素、多柔比星和伊達比星)具有數個作用模式，包括抑制DNA和RNA合成、破壞DNA更高級結構，和產生損傷細胞的氧自由基。蒽環類抗生素最重要的不利作用是心臟毒性，其相當限制施用的終身劑量和一定程度上限制它們的有用性。

因此，不幸地是，儘管在治療新診斷的AML中的實質性進步，但是20%至40%的患者未通過標準誘導化學療法實現緩解，並且50%至70%的進入首次完全緩解期的患者預期在3年內復發。復發時或針對患有抗性疾病的患者的最佳策略仍不確定。幹細胞移植已經證實作為處於首次或隨後緩解期的AML患者中最有效的抗白血病治療形式(Roboz，G.J。(2012) “Current Treatment Of Acute Myeloid Leukemia”, Curr. Opin. Oncol. 24:711-719)。

II. CD3

CD3是由四條不同的鏈組成的T細胞共受體(Wucherpfennig，K.W.等(2010) “Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly，Ligand Recognition，And Initiation Of Signaling,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (4):a005140； 1-14頁)。哺乳動物中，該複合物包含CD3γ鏈、CD3δ鏈和兩條CD3ε鏈。這些鏈結合稱為T細胞受體(TCR)的分子，以便在T淋巴細胞中產生活化信號。在沒有CD3的情況下，TCR不能適當裝配並且降解(Thomas，S.等(2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer”, Immunology 129 (2):170–177)。發現CD3結合所有成熟T細胞的膜，並且實際上不結合其他細胞類型的膜(見，Janeway，C.A.等(2005): “Immunobiology: The Immune System In Health And Disease”, 第六版Garland Science Publishing，NY，214- 216頁；Sun，Z. J.等(2001) “Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of CD3ε:γ Heterodimer”, Cell 105 (7):913-923；Kuhns，M.S.等(2006) “Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex”, Immunity，2006年2月；24 (2):133-139)。

III.雙特異性雙抗體

完整的未修飾的抗體(例如，IgG)結合抗原的抗原決定部位（表位）的能力取決於免疫球蛋白輕鏈和重鏈上存在的可變結構域(即，分別是VL和VH結構域)。雙抗體的設計基於單鏈Fv構建體(scFv) (見，例如，Holliger等(1993) “Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments”, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448；US 2004/0058400 (Hollinger等)；US 2004/0220388 (Mertens等)；Alt等(1999) FEBS Lett. 454 (1-2):90-94；Lu，D.等(2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280 (20):19665-19672；WO 02/02781 (Mertens等)；Olafsen，T.等(2004) “ Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,”Protein Eng. Des. Sel. 17 (1):21-27；Wu，A.等(2001) “ Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,”Protein Engineering 14 (2):1025-1033；Asano等(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” 摘要3P-683，J. Biochem. 76 (8):992；Takemura，S.等(2000) “ Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13 (8):583-588；Baeuerle，P.A.等(2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69 (12):4941-4944)。

抗體輕鏈和抗體重鏈的相互作用，特別是其VL和VH結構域的相互作用形成抗體的抗原決定部位結合位點之一。相反，scFv構建體包括單個多肽鏈中包含的抗體的VL和VH結構域，其中結構域由足夠長度的靈活連接體分開，以允許兩個結構域自裝配成功能性抗原決定部位結合位點。在VL和VH結構域的自裝配由於不足夠長(小於約12個氨基酸殘基)的連接體而變得不可能的情況下，兩個scFv構建體彼此相互作用以形成二價分子，其中一條鏈的VL結合另一條鏈的VH(參見Marvin等(2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658)。

天然抗體僅僅能夠結合一個抗原決定部位種類(即，單特異性)，雖然它們可結合該種類的多個拷貝(即，展示二價或多價)。現有技術已經指出了產生這樣的雙抗體的能力，所述雙抗體與這類天然抗體的不同之處在於能夠結合兩個或更多個不同的抗原決定部位種類 (即，展示雙特異性或多特異性，以及二價或多價) (見，例如，Holliger等(1993) “‘Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448；US 2004/0058400 (Hollinger等)；US 2004/0220388 (Mertens等)；Alt等(1999) FEBS Lett. 454 (1-2):90-94；Lu，D.等(2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280 (20):19665-19672；WO 02/02781 (Mertens等)；Mertens，N.等，“New Recombinant Bi- and Trispecific Antibody Derivatives,” In: Novel Frontiers In The Production Of Compounds For Biomedical Use, A. VanBroekhoven等(Eds.)，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，Netherlands (2001)，195-208頁；Wu，A.等(2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14 (2):1025-1033；Asano等(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” 摘要3P-683，J. Biochem. 76 (8):992；Takemura，S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13 (8):583-588；Baeuerle，P.A.等(2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69 (12):4941-4944)。

非單特異性雙抗體的供應提供明顯的優勢：共連接和共定位表現不同抗原決定部位的細胞的能力。雙特異性雙抗體因此具有廣泛的應用，包括治療和免疫診斷。雙特異性使得在各種應用中設計和改造雙抗體的具有很大的靈活性，提供對多聚抗原增強的親和力、不同抗原的交聯和依賴於存在兩個靶抗原的引導靶向特異性細胞類型。由於它們的價增加、解離速率低和從迴圈中快速清除(對於~50 kDa或低於~50 kDa的小尺寸的雙抗體)，本領域已知的雙抗體分子在腫瘤成像領域中也顯示特定的應用(Fitzgerald等(1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichiapastoris,” Protein Eng. 10:1221)。尤其重要的是共連接不同的細胞，例如，使細胞毒性T細胞與腫瘤細胞交聯(Staerz等(1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631，和Holliger等(1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305)。

雙抗體抗原決定部位結合結構域也可導向任何免疫效應細胞的表面決定簇，所述效應細胞比如CD3、CD16、CD32或CD64，所述結合結構域在T淋巴細胞、天然殺傷(NK)細胞或其他單核細胞上表現。在許多研究中，也發現結合效應細胞決定簇，例如，Fcγ受體(FcγR)的雙抗體啟動效應細胞(Holliger等(1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305；Holliger等(1999) “Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909-2916；WO 2006/113665；WO 2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；WO 2012/162068)。通常，效應細胞活化通過結合抗原的抗體經Fc-FcγR相互作用與效應細胞的結合而觸發；因此，就此而言，雙抗體分子可展示Ig樣功能性，無論它們是否包括Fc結構域(例如，如本領域已知的或本文示例的任何效應器功能試驗(例如，ADCC試驗)所驗證的)。通過交聯腫瘤和效應細胞，雙抗體不僅僅使效應細胞接近腫瘤細胞，而且導致有效的腫瘤殺傷(見例如，Cao等(2003) “Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197)。

但是，上述優勢是以高成本為代價的。形成此類非單特異性雙抗體需要成功裝配兩個或更多個獨特且不同的多肽(即，這種形成需要通過不同多肽鏈種類的異源二聚化形成雙抗體)。該事實與通過相同多肽鏈的同源二聚化形成的單特異性雙抗體形成對比。因為必須提供至少兩條不同的多肽(即，兩個多肽種類)以便形成非單特異性雙抗體，和因為這種多肽的同源二聚化導致失活的分子(Takemura，S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13 (8):583-588)，所以產生這種多肽必須以防止相同種類的多肽之間共價鍵合的方式完成(即，為了預防同源二聚化作用) (Takemura，S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13 (8):583-588)。所以，現有技術已經教導了這種多肽的非共價結合(見，例如，Olafsen等(2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27；Asano等(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” 摘要3P-683，J. Biochem. 76 (8):992；Takemura，S.等(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13 (8):583-588；Lu，D.等(2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280 (20):19665-19672)。

但是，現有技術已經認識到由非共價結合的多肽組成的雙特異性雙抗體不穩定並且容易解離成非功能單體(見，例如，Lu，D.等(2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280 (20):19665-19672)。

在面臨該挑戰的時候，現有技術已經成功開發了穩定的共價結合的異源二聚非單特異性雙抗體(見，例如，WO 2006/113665；WO/2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；WO/2012/162068；Johnson，S.等(2010) “ Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion,” J. Molec. Biol. 399 (3):436-449；Veri，M.C.等(2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,”Arthritis Rheum. 62 (7):1933-1943；Moore，P.A.等(2011) “ Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117 (17):4542-4551)。此類方法涉及將一個或多個半胱氨酸殘基改造到每個採用的多肽種類中。例如，已經顯示將半胱氨酸殘基添加至這種構建體的C-末端允許在多肽鏈之間形成二硫鍵合，使所得異源二聚物穩定，而不干擾二價分子的結合特徵。

儘管有樣的成功，但是穩定的功能性異源二聚非單特異性雙抗體的產生可以通過仔細考慮和在一個或多個採用的多肽鏈中佈置半胱氨酸殘基而得到進一步優化。可以以更高的產率產生這種優化的雙抗體，並且活性比非優化的雙抗體更高。因此，本發明涉及提供多肽的問題，所述多肽尤其被設計和優化以形成異源二聚雙抗體。本發明通過提供示例性的優化CD123 x CD3雙抗體解決了該問題。

本發明涉及CD123 x CD3雙特異性雙抗體，其具有同時結合CD123和CD3的能力，並且涉及這種分子在治療疾病，尤其是血液惡性腫瘤中的用途。

本發明一實施例的CD123 x CD3雙特異性雙抗體包括至少兩條不同的多肽鏈，其彼此以異源二聚方式結合以形成對CD123的抗原決定部位特異的一個結合位點和對CD3抗原決定部位特異的一個結合位點。因此，本發明的CD123 x CD3雙抗體是單價的，在於其僅僅能夠結合一個拷貝的CD123的抗原決定部位和僅僅能夠結合一個拷貝的CD3的抗原決定部位，但是是雙特異性的，在於單個雙抗體具有同時結合CD123的抗原決定部位和CD3的抗原決定部位的能力。雙抗體的各個多肽鏈彼此共價結合，例如通過位於每條多肽鏈內的半胱氨酸殘基的二硫鍵合。在具體的實施方式中，本發明的雙抗體進一步具有免疫球蛋白Fc結構域或白蛋白結合結構域以延長體內半衰期。

具體地，本發明也提供了序列優化的CD123 x CD3雙特異性單價雙抗體，其具有特異性結合CD123的抗原決定部位和結合CD3的抗原決定部位的能力，其中雙抗體包括彼此共價結合的第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中： A. 第一多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括： i. 結構域1，其包括： (1) 亞結構域(1A)，其包括具有結合CD3的單克隆抗體的VL結構域(VL_CD3 ) (SEQ ID NO:21) 的能力；和 (2) 亞結構域(1B)，其包括具有結合CD123的單克隆抗體的VH結構域(VH_CD123 ) (SEQ ID NO:26) 的能力；其中亞結構域1A和1B彼此通過肽連接體（連接體，linker）(SEQ ID NO:29)分開； ii. 結構域2，其中結構域2是E-螺旋(coil)結構域(SEQ ID NO:34)或K-螺旋結構域(SEQ ID NO:35)，其中結構域2通過肽連接體(SEQ ID NO:30)與結構域1分開；和 B. 第二多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括： i. 結構域1，其包括： (1) 亞結構域(1A)，其包括具有結合CD123的單克隆抗體的VL結構域(VL_CD123 ) (SEQ ID NO:25) 的能力；和 (2) 亞結構域(1B)，其包括具有結合CD3的單克隆抗體的VH結構域(VH_CD3 ) (SEQ ID NO:22) 的能力；其中亞結構域1A和1B彼此通過肽連接體(SEQ ID NO:29)分開； ii. 結構域2，其中結構域2是K-螺旋結構域(SEQ ID NO:35)或E-螺旋結構域(SEQ ID NO:34)，其中結構域2通過肽連接體(SEQ ID NO:30)與結構域1分開；和其中第一和第二多肽鏈的結構域2不都是E-螺旋結構域或不都是K-螺旋結構域；和其中： (a) 所述第一多肽鏈的所述VL結構域和所述第二多肽鏈的所述VH結構域形成具有特異性結合CD3的抗原決定部位的能力之抗原結合結構域；和 (b) 所述第二多肽鏈的所述VL結構域和所述第一多肽鏈的所述VH結構域形成具有特異性結合CD123的抗原決定部位的能力之抗原結合結構域。

本發明也提供非序列優化的CD123 x CD3雙特異性單價雙抗體，其具有特異性結合CD123的抗原決定部位和結合CD3的抗原決定部位的能力，其中雙抗體包括彼此共價結合的第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中： A. 第一多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括： i. 結構域1，其包括： (1) 亞結構域(1A)，其包括具有結合CD3的單克隆抗體的VL結構域(VL_CD3 ) (SEQ ID NO:23) 的能力；和 (2) 亞結構域(1B)，其包括具有結合CD123的單克隆抗體的VH結構域(VH_CD123 ) (SEQ ID NO:28) 的能力；其中亞結構域1A和1B彼此通過肽連接體(SEQ ID NO:29)分開； ii. 結構域2，其中結構域2是E-螺旋結構域(SEQ ID NO:34)或K-螺旋結構域(SEQ ID NO:35)，其中結構域2通過肽連接體(SEQ ID NO:30)與結構域1分開；和 B. 第二多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括： i. 結構域1，其包括： (1) 亞結構域(1A)，其包括具有結合CD123的單克隆抗體的VL結構域(VL_CD123 ) (SEQ ID NO:27) 的能力；和 (2) 亞結構域(1B)，其包括具有結合CD3的單克隆抗體的VH結構域(VH_CD3 ) (SEQ ID NO:24) 的能力；其中亞結構域1A和1B彼此通過肽連接體(SEQ ID NO:29)分開； ii. 結構域2，其中結構域2是K-螺旋結構域(SEQ ID NO:35)或E-螺旋結構域(SEQ ID NO:34)，其中結構域2通過肽連接體(SEQ ID NO:30)與結構域1分開；和其中第一和第二多肽鏈的結構域2不都是E-螺旋結構域或不都是K-螺旋結構域；和其中： (a) 所述第一多肽鏈的所述VL結構域和所述第二多肽鏈的所述VH結構域形成具有特異性結合CD3的抗原決定部位的能力之抗原結合結構域；和 (b) 所述第二多肽鏈的所述VL結構域和所述第一多肽鏈的所述VH結構域形成具有特異性結合CD123的抗原決定部位的能力之抗原結合結構域。

本發明另外提供上述雙特異性單價雙抗體的實施方式，其中第一或第二多肽鏈另外包括白蛋白結合結構域(SEQ ID NO:36)，其經肽連接體(SEQ ID NO:31) C-末端連接至結構域2或N-末端連接至結構域1。

本發明另外提供上述雙特異性單價雙抗體的實施方式，其中第一或第二多肽鏈另外包括結構域3，其包括免疫球蛋白IgG Fc結構域的CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:37)，其中結構域3經肽連接體(SEQ ID NO:33)N-末端連接至結構域1A。

本發明另外提供上述雙特異性單價雙抗體的實施方式，其中第一或第二多肽鏈另外包括結構域3，其包括免疫球蛋白IgG Fc結構域的CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:37)，其中結構域3經肽連接體(SEQ ID NO:32) C-末端連接至結構域2。

本發明另外提供任何上述雙特異性單價雙抗體的實施方式，其中第一多肽鏈的結構域2是K-螺旋結構域(SEQ ID NO:35)和第二多肽鏈的結構域2是E-螺旋結構域(SEQ ID NO:34)。

本發明另外提供任何上述雙特異性單價雙抗體的實施方式，其中第一多肽鏈的結構域2是E-螺旋結構域(SEQ ID NO:34)和第二多肽鏈的結構域2是K-螺旋結構域(SEQ ID NO:35)。

本發明另外提供雙特異性單價雙抗體的實施方式，其具有特異性結合CD123的抗原決定部位和結合CD3的抗原決定部位的能力，其中雙抗體包括彼此共價結合的第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中所述雙特異性雙抗體包括： A. 第一多肽鏈，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1；和 B. 第二多肽鏈，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3；其中所述第一和所述第二多肽鏈通過二硫鍵彼此共價結合。

本發明的雙抗體展示出人意料的增強的功能活性，如下進一步描述。

本發明的雙抗體優選地能夠與人和靈長類CD123和CD3蛋白，優選食蟹猴(cynomolgus monkey)CD123和CD3蛋白交叉反應。

在體外細胞基試驗中，本發明的雙抗體優選地能夠消耗來自初級PBMC培養物的漿細胞樣樹突細胞(pDC)，IC50為約1 ng/ml或更小，約0.8 ng/ml或更小，約0.6 ng/ml或更小，約0.4 ng/ml或更小，約0.2 ng/ml或更小，約0.1 ng/ml或更小，約0.05 ng/ml或更小，約0.04 ng/ml或更小，約0.03 ng/ml或更小，約0.02 ng/ml或更小或約0.01ng/ml或更小。優選地，IC50是約0.01ng/ml或更小。在上述試驗中，初級PBMC的培養物可來自食蟹猴，在該情況下所述消耗是食蟹猴漿細胞樣樹突細胞(pDC)的消耗。任選地，如上所述，本發明的雙抗體能夠消耗來自PBMC原代培養物的漿細胞樣樹突細胞(pDC)，其中試驗通過或根據本文所述實施例14的方案進行，或通過本領域技術人員理解的對這種試驗的改進而進行，或通過本領域技術人員已知的其他方式進行。

本發明的雙抗體優選地在體外Kasumi-3試驗中展示細胞毒性，EC50為約0.05 ng/ml或更小。優選地，EC50是約0.04 ng/ml或更小，約0.03 ng/ml或更小，約0.02 ng/ml或更小，或約0.01 ng/ml或更小。任選地，如上所述，本發明的雙抗體可展示細胞毒性，其中試驗通過或根據如本文描述的實施例3的方案進行，或通過本領域技術人員理解的對這種試驗的改進而進行，或通過本領域技術人員已知的其他方式進行。

本發明的雙抗體優選地在體外Molm-13試驗中展示細胞毒性，EC50為約5 ng/ml或更小。優選地，EC50是約3 ng/ml或更小，約2 ng/ml或更小，約1 ng/ml或更小，約0.75 ng/ml或更小，或約0.2 ng/ml或更小。任選地，如上所述，本發明的雙抗體可展示細胞毒性，其中試驗通過或根據如本文描述的實施例3的方案進行，或通過本領域技術人員理解的這種試驗的改進而進行，或通過本領域技術人員已知的其他方式進行。

本發明的雙抗體優選地能夠抑制小鼠中MOLM-13腫瘤異種移植物的生長。優選地，本發明的雙抗體能夠以下述濃度抑制小鼠中MOLM-13腫瘤異種移植物的生長，所述濃度為至少約20 μg/kg，至少約4 μg/kg，至少約0.8 μg/kg，至少約0.6 μg/kg或至少約0.4 μg/kg。本發明優選的抗體在一段時間之後將抑制小鼠中MOLM-13腫瘤異種移植物的生長至少25%，但是可能至少約40%或更多，至少約50%或更多，至少約60%或更多，至少約70%或更多，至少約80%或更多，至少約90%或更多，或甚至完全抑制MOLM-13腫瘤生長，或造成腫瘤退化或消失。該抑制將發生在至少NSG小鼠品系中。任選地，本發明的雙抗體能夠通過或根據如本文描述的實施例6的方案、或通過本領域技術人員理解的對這種試驗的改進、或通過本領域技術人員已知的其他方式，以上述方式抑制小鼠中MOLM-13腫瘤異種移植物的生長。

本發明的雙抗體優選地能夠抑制小鼠中RS4-11腫瘤異種移植物的生長。優選地，本發明的雙抗體能夠以下述濃度抑制小鼠中RS4-11腫瘤異種移植物的生長，所述濃度為至少約0.5 mg/kg，至少約0.2 mg/kg，至少約0.1 mg/kg，至少約0.02 mg/kg或至少約0.004 mg/kg。本發明優選的抗體將在一段時間之後抑制小鼠中RS4-11腫瘤異種移植物的生長至少約25%，但可能至少約40%，至少約50%，至少約60%，至少約70%，至少約80%，至少約90%，或甚至完全抑制RS4-11腫瘤生長，或造成腫瘤退化或消失。該抑制將發生在至少NSG小鼠品系中。任選地，本發明的雙抗體能夠通過或根據如本文描述的實施例6的方案、或通過本領域技術人員理解的對這種試驗的改進、或通過本領域技術人員已知的其他方式，以上述方式抑制小鼠中RS4-11腫瘤異種移植物的生長。

本發明的雙抗體優選地能夠體外消耗AML骨髓細胞的原代培養物中的白血病母細胞。優選地，本發明的雙抗體能夠以下述濃度體外消耗AML骨髓細胞的原代培養物中的白血病母細胞，所述濃度為至少約0.01 ng/ml，至少約0.02 ng/ml，至少約0.04 ng/ml，至少約0.06 ng/ml，至少約0.08 ng/ml或至少約0.1 ng/ml。優選地，任選地在用雙抗體溫育（incubate）原代培養物約120小時之後，本發明的雙抗體能夠以下述雙抗體濃度體外消耗AML骨髓細胞的原代培養物中的白血病母細胞至小於初級白血病母細胞的總群體的20%，所述雙抗體濃度為至少約0.01 ng/ml，至少約0.02 ng/ml，至少約0.04 ng/ml，至少約0.06 ng/ml，至少約0.08 ng/ml或至少約0.1 ng/ml。優選地，在用雙抗體溫育原代培養物約120小時之後，以下述雙抗體濃度將AML骨髓細胞的原代培養物中的白血病母細胞體外消耗至小於初級白血病母細胞的總群體的20%，所述雙抗體濃度為約0.01 ng/ml或0.1 ng/ml。

本發明的雙抗體優選地能夠體外誘導AML骨髓細胞的原代培養物中T細胞群體的擴展(expansion)。優選地，這種擴展可達可在試驗中擴展的最大T細胞群體的約70%或更多。優選地，可選地在用雙抗體溫育原代培養物約120小時之後，本發明的雙抗體能夠將AML骨髓細胞的原代培養物中T細胞群體的擴展體外誘導至可在試驗中擴展的最大T細胞群體的70%或更多，雙抗體濃度為至少約0.01 ng/ml，至少約0.02 ng/ml，至少約0.04 ng/ml，至少約0.06 ng/ml，至少約0.08 ng/ml或至少約0.1 ng/ml。優選地，在用雙抗體溫育原代培養物約120小時之後，AML骨髓細胞的原代培養物中的T細胞群體體外擴展至在試驗中可擴展的最大T細胞群體的約70%或更多，雙抗體濃度為約0.01 ng/ml或約0.1 ng/ml。

本發明的雙抗體優選地能夠體外誘導AML骨髓細胞的原代培養物中的T細胞群體的活化。任選地用雙抗體溫育原代培養物約72小時之後，這種活化可發生在至少約0.01 ng/ml，至少約0.02 ng/ml，至少約0.04 ng/ml，至少約0.06 ng/ml，至少約0.08 ng/ml或至少約0.1 ng/ml的雙抗體濃度下。這種活化可通過T細胞活化標記物，比如CD25的表現測量。優選地，用雙抗體溫育原代培養物約72小時之後，如通過CD25的表現所測量的， AML骨髓細胞的原代培養物中T細胞群體的體外活化可發生在約0.01 ng/ml或約0.1 ng/ml的雙抗體濃度下。

任選地在用雙抗體溫育原代培養物約120小時之後，本發明的雙抗體優選地能夠體外消耗AML骨髓細胞的原代培養物中的白血病母細胞至小於初級白血病母細胞的總群體的20%，並且同時體外誘導AML骨髓細胞的原代培養物中的T細胞群體擴展至試驗中可擴展的最大T細胞群體的約70%或更多，雙抗體濃度為至少約0.01 ng/ml，至少約0.02 ng/ml，至少約0.04 ng/ml，至少約0.06 ng/ml，至少約0.08 ng/ml或至少約0.1 ng/ml。優選地，雙抗體濃度為約0.01 ng/ml或約0.1 ng/ml和原代培養物用雙抗體溫育約120小時。

通過或根據如本文描述的實施例8的方案、或通過本領域技術人員理解的對這種試驗的改進、或通過本領域技術人員已知的其他方式，本發明的雙抗體能夠以上述方式體外消耗AML骨髓細胞的原代培養物中的白血病母細胞和/或體外誘導AML骨髓細胞的原代培養物中T細胞群體的擴展和/或體外誘導AML骨髓細胞的原代培養物中的T細胞群體的活化。

為了避免任何懷疑，本發明的雙抗體可展示本文所述的一個、兩個、三個、大於三個或所有的功能特性。因此本發明的雙抗體可展示本文所述的功能特性的任何組合。

本發明的雙抗體可用作藥物。優選地，雙抗體用於治療與CD123的表現相關或特徵在於CD123的表現的疾病或病況(condition)。本發明也涉及本發明的雙抗體在製造藥學組合物——優選地用於治療與CD123的表現相關或特徵在於CD123的表現的疾病或病況——的中的用途，如本文進一步限定的。

與CD123的表現相關或特徵在於CD123的表現的疾病或病況可以是癌症。例如，癌症可選自：急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)，包括CML的母細胞危象(blastic crisis)和與CML相關的Abelson癌基因(Bcr-ABL易位)、骨髓增生異常綜合症(MDS)、急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)，包括Richter綜合症或CLL的Richter轉化(transformation)、毛細胞白血病(HCL)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括套細胞白血病(MCL)，和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增多症、和伯基特(Burkitt’s)淋巴瘤。

與CD123的表現相關或特徵在於CD123的表現的疾病或病況可以是炎症病況。例如，炎症病況可選自：自身免疫狼瘡(SLE)、過敏症、哮喘和類風濕性關節炎。

本發明另外提供了藥學組合物，其包括任何上述雙抗體和生理學上可接受的載體。

本發明另外提供了上述藥學組合物在治療與CD123的表現相關或特徵在於CD123的表現的疾病或病況中的用途。

本發明尤其涉及這種用途的實施方式，其中與CD123的表現相關或特徵在於CD123的表現的疾病或病況是癌症(尤其選自下述的癌症：急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)，包括母細胞危象CML和與CML相關的Abelson癌基因(Bcr-ABL易位)、骨髓增生異常綜合症(MDS)、急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)，包括Richter綜合症或CLL的Richter轉化、毛細胞性白血病(HCL)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括套細胞白血病(MCL)，和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增多症，和伯基特淋巴瘤)。

本發明也尤其涉及這種用途的實施方式，其中與CD123的表現相關或特徵在於CD123的表現的疾病或病況是炎症病況(尤其選自下述的炎症病況：自身免疫狼瘡(SLE)、過敏症、哮喘和類風濕性關節炎)。

術語，比如“約”的意思應是指定值10%，更優選地5%以內，除非上下文另外要求。

本發明涉及序列優化的能夠同時結合CD123和CD3的CD123 x CD3雙特異性單價雙抗體，並且涉及這種分子在治療血液惡性腫瘤中的用途。儘管非優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體功能完整，與通過密碼子優化的基因表現中獲得的改善類似(見，例如，Grosjean，H。等(1982) “ Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The Optimal Codon-Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes, ” Gene 18 (3):199-209)，但可能通過修飾或改善它們的序列進一步增強CD123 x CD3雙特異性雙抗體的穩定性和/或功能。

本發明的優選的CD123 x CD3雙特異性雙抗體由至少兩條多肽鏈組成，所述至少兩條多肽鏈彼此結合以形成對CD123的抗原決定部位特異的一個結合位點和對CD3抗原決定部位特異的一個結合位點(圖2)。雙抗體的各條多肽鏈彼此共價結合，例如通過位於每條多肽鏈內的半胱氨酸殘基的二硫鍵合。每條多肽鏈均包含輕鏈可變結構域的抗原結合結構域、重鏈可變結構域的抗原結合結構域和異源二聚化結構域。間插連接體肽(連接體1)將輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與重鏈可變結構域的抗原結合結構域分開。第一多肽鏈的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與第二多肽鏈的重鏈可變結構域的抗原結合結構域相互作用以便形成對第一抗原(即，CD123或CD3)特異的第一功能抗原結合位點。同樣地，第二多肽鏈的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與第一多肽鏈的重鏈可變結構域的抗原結合結構域相互作用以便形成對第二抗原(即，CD123或CD3，取決於對第一抗原的確定)特異性的第二功能抗原結合位點。因此，第一和第二多肽鏈的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域和重鏈可變結構域的抗原結合結構域的選擇是協調的，使得兩條多肽鏈總共包括能夠結合CD123和CD3的輕鏈和重鏈可變結構域的抗原結合結構域。

第一和第二多肽鏈的異源二聚體的形成可通過異源二聚化結構域驅動。這種結構域包括一條多肽鏈上的GVEPKSC (SEQ ID NO:50) (或VEPKSC；SEQ ID NO:51)和另一條多肽鏈上的GFNRGEC (SEQ ID NO:52) (或FNRGEC；SEQ ID NO:53) (US2007/0004909)。可選地，這種結構域可哥被改造以包含相反電荷的螺旋。一條多肽鏈的異源二聚化結構域包括具有至少六個、至少七個或至少八個帶正電荷氨基酸的序列，另一條多肽鏈的異源二聚化結構域包括具有至少六個、至少七個或至少八個帶負電荷氨基酸的序列。例如，第一或第二異源二聚化結構域優選地包括具有八個帶正電荷的氨基酸的序列，而異源二聚化結構域中的另一個優選地包括具有八個帶負電荷的氨基酸的序列。帶正電荷的氨基酸可以是賴氨酸、精氨酸、組氨酸等和/或帶負電荷的氨基酸可以是谷氨酸、天冬氨酸等。帶正電荷的氨基酸優選地是賴氨酸和/或帶負電荷的氨基酸優選地是谷氨酸。

本發明的CD123 x CD3雙特異性雙抗體被改造，從而這種第一和第二多肽鏈沿著它們的長度經半胱氨酸殘基彼此共價鍵合。這種半胱氨酸殘基可引入至間插連接體，所述間插連接體將多肽的VL和VH結構域分開。可選地，和更優選地，第二肽(連接體2)被引入至每條多肽鏈，例如，在多肽鏈的氨基-末端或在異源二聚化結構域和輕鏈可變結構域或重鏈可變結構域的抗原結合結構域之間佈置連接體2的位置。

在具體的實施方式中，本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性單價雙抗體進一步具有免疫球蛋白Fc結構域或白蛋白結合結構域以延長體內半衰期。

本發明的包括免疫球蛋白Fc結構域的CD123 x CD3雙特異性單價雙抗體(即，CD123 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體)由第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈組成。第一和第二多肽鏈彼此結合以形成對CD123的抗原決定部位特異的一個結合位點和對CD3抗原決定部位特異的一個結合位點。第一多肽鏈和第三多肽鏈彼此結合以形成免疫球蛋白Fc結構域(圖3A和圖3B)。雙特異性單價Fc雙抗體的第一和第二多肽鏈彼此共價結合，例如通過位於每條多肽鏈內的半胱氨酸殘基的二硫鍵合。

第一和第三多肽鏈彼此共價結合，例如通過位於每條多肽鏈內的半胱氨酸殘基的二硫鍵合。第一和第二多肽鏈各包含輕鏈可變結構域的抗原結合結構域、重鏈可變結構域的抗原結合結構域和異源二聚化結構域。間插連接體肽(連接體1)將輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與重鏈可變結構域的抗原結合結構域分開。第一多肽鏈的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與第二多肽鏈的重鏈可變結構域的抗原結合結構域相互作用以便形成對第一抗原(即，CD123或CD3)特異的第一功能抗原結合位點。同樣地，第二多肽鏈的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域與第一多肽鏈的重鏈可變結構域的抗原結合結構域相互作用以便形成對第二抗原(即，CD3或CD123，取決於對第一抗原的確認)特異性的第二功能抗原結合位點。因此，第一和第二多肽鏈的輕鏈可變結構域的抗原結合結構域和重鏈可變結構域的抗原結合結構域的選擇是協調的，使得兩條多肽鏈總共包括能夠結合CD123和CD3的輕鏈和重鏈可變結構域的抗原結合結構域。第一和第三多肽鏈每個包含完整免疫球蛋白Fc結構域的一些或所有的CH2結構域和/或一些或所有的CH3結構域以及包含半胱氨酸的肽。一些或所有的CH2結構域和/或一些或所有的CH3結構域結合，以形成本發明的雙特異性單價Fc雙抗體的免疫球蛋白Fc結構域。本發明的雙特異性單價Fc雙抗體的第一和第三多肽鏈彼此共價結合，例如通過位於多肽鏈的包含半胱氨酸的肽中的半胱氨酸殘基的二硫鍵合。

I. 序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體，“DART-A”

本發明提供序列優化的雙特異性雙抗體，其能夠同時和特異性結合CD123的抗原決定部位和結合CD3的抗原決定部位(“CD123 x CD3”雙特異性雙抗體或DART-A)。如下所討論，發現DART-A相對於類似組成的其他非序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體顯示增強的功能活性，並且因此被稱為“序列優化的” CD123 x CD3雙特異性雙抗體。

序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)包括第一多肽鏈和第二多肽鏈。雙特異性雙抗體的第一多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD3的單克隆抗體的輕鏈可變結構域(VL結構域) (VL_CD3 )、間插連接體肽(連接體1)、能夠結合CD123的單克隆抗體重鏈可變結構域(VH結構域) (VH_CD123 )和C-末端。這種VL_CD3 結構域的優選的序列是SEQ ID NO:21: QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG

VL_CD3 的抗原結合結構域包括CDR1 SEQ ID NO:38:RSSTGAVTTSNYAN、CDR2 SEQ ID NO:39:GTNKRAP，和CDR3 SEQ ID NO:40:ALWYSNLWV。

這種連接體1優選的序列是SEQ ID NO:29: GGGSGGGG。這種VH_CD123 結構域的優選的序列是SEQ ID NO:26: EVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSS

VH_CD123 的抗原結合結構域包括CDR1 SEQ ID NO:47:DYYMK，CDR2 SEQ ID NO:48:DIIPSNGATFYNQKFKG，和CDR3 SEQ ID NO:49:SHLLRAS。

第二多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD123的單克隆抗體的VL結構域(VL_CD123 )、間插連接體肽(例如，連接體1)、能夠結合CD3的單克隆抗體的VH結構域(VH_CD3 )、和C-末端。這種VL_CD123 結構域的優選的序列是SEQ ID NO:25: DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK

VL_CD123 的抗原結合結構域包括CDR1 SEQ ID NO:44:KSSQSLLNSGNQKNYLT、CDR2 SEQ ID NO:45:WASTRES，和CDR3 SEQ ID NO:46:QNDYSYPYT。

這種VH_CD3 結構域的優選的序列是SEQ ID NO:22: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS

VH_CD3 的抗原結合結構域包括CDR1 SEQ ID NO:41:TYAMN、CDR2 SEQ ID NO:42:RIRSKYNNYATYYADSVKD，和CDR3 SEQ ID NO:43:HGNFGNSYVSWFAY。

本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體被改造，從而這種第一和第二多肽沿著它們的長度經半胱氨酸殘基彼此共價鍵合。這種半胱氨酸殘基可引入至間插連接體(例如，連接體1)，所述間插連接體將多肽的VL和VH結構域分開。可選地，和更優選地，第二肽(連接體2)引入至每條多肽鏈，例如，在這種多肽鏈的VL結構域的N-末端至或VH結構域的C-末端的位置。這種連接體2的優選的序列是SEQ ID NO:30: GGCGGG。

可通過進一步改造這類多肽鏈驅動異源二聚體的形成，以包含相反電荷的多肽螺旋。因此，在優選的實施方式中，多肽鏈之一可被改造以包含“E-螺旋”結構域(SEQ ID NO: 34: EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK)，其殘基在pH 7形成負電荷，而兩條多肽鏈的另一條可被改造以包含“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO: 35: KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE) ，其殘基在pH 7形成正電荷。這種帶電結構域的存在促進第一和第二多肽之間的結合，並且因此促進異源二聚化。

為第一或第二多肽鏈提供哪種螺旋不重要。但是，本發明的優選的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(“DART-A”)的第一多肽鏈具有下述序列(SEQ ID NO:1): QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGEVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK

DART-A鏈1由下述組成: SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:29 ─ SEQ ID NO:26 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:34。編碼多核苷酸的DART-A鏈1是SEQ ID NO:2: caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgaccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccgctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtcttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcaggcaggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacggggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtggacaaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagatacagccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttgcttattggggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaa

DART-A的第二多肽鏈具有下述序列(SEQ ID NO:3): DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

DART-A鏈2由下述組成: SEQ ID NO:25 ─ SEQ ID NO:29 ─ SEQ ID NO:22 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:35。編碼多核苷酸的DART-A鏈2是SEQ ID NO:4: gacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagcgggtgactatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatcagaaaaactatctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactgctgatctattgggcttccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcacagattttaccctgacaatttctagtctgcaggccgaggacgtggctgtgtactattgtcagaatgattacagctatccctacactttcggccaggggaccaagctggaaattaaaggaggcggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatcaggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtcttccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag

如下所討論，發現序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)具有同時結合如人和猴子細胞具備的(arrayed)CD123和CD3的能力。發現DART-A的提供使得T細胞活化、介導胚細胞下降、驅動T細胞擴展、誘導T細胞活化和造成靶癌症細胞的重定向殺傷。

II. 相當的(comparative)非序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體，“DART-B”

DART-B是非序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體，其具有與DART-A的結構類似的大體結構。DART-B的第一多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD3的單克隆抗體的VL結構域(VL_CD3 、間插連接體肽(連接體1)、能夠結合CD123的單克隆抗體的VH結構域(VH_CD123 )、間插連接體2、E-螺旋結構域、和C-末端。DART-B的第一多肽鏈的VL_CD3 結構域具有下述序列(SEQ ID NO:23): DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK

DART-B的第一多肽鏈的VH_CD123 結構域具有下述序列(SEQ ID NO:28): QVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSS

因此，DART-B鏈1由下述組成： SEQ ID NO:23 ─ SEQ ID NO:29 ─ SEQ ID NO:28 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:34。DART-B的第一多肽鏈的序列是(SEQ ID NO:5): DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGSGGGGQVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK

編碼多核苷酸的DART-B鏈1是SEQ ID NO:6: gacattcagctgacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagagccagttcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaagtggcttctggagtcccttatcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcatactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccaacagtggagtagtaacccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaaggaggcggatccggcggcggaggccaggtgcagctggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtcttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcaggcaggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacggggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtggacaaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagatacagccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttgcttattggggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaa

DART-B的第二多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD123的單克隆抗體的VL結構域(VL_CD123 )、間插連接體肽(連接體1)和能夠結合CD3的單克隆抗體的VH結構域(VH_CD3 )、間插連接體2、K-螺旋結構域和C-末端。

DART-B的第二多肽鏈的VL_CD123 結構域具有下述序列(SEQ ID NO:27): DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK

DART-B的第二多肽鏈的VH_CD3 結構域具有下述序列(SEQ ID NO:24): DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS

因此，DART-B鏈2由下述組成：SEQ ID NO:27 ─ SEQ ID NO:29 ─ SEQ ID NO:24 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:35。DART-B的第二多肽鏈的序列是(SEQ ID NO:7): DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

編碼多核苷酸的DART-B鏈2是SEQ ID NO:8: gacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagcgggtgactatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatcagaaaaactatctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactgctgatctattgggcttccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcacagattttaccctgacaatttctagtctgcaggccgaggacgtggctgtgtactattgtcagaatgattacagctatccctacactttcggccaggggaccaagctggaaattaaaggaggcggatccggcggcggaggcgatatcaaactgcagcagtcaggggctgaactggcaagacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaagacttctggctacacctttactaggtacacgatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactacagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatattatgatgatcattactgccttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag

III. 序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)的修飾變體

A. 具有白蛋白結合結構域的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(具有ABD的DART-A “w/ABD”)

在本發明的第二實施方式中，序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)在雙抗體的一條或兩條多肽鏈上包括一個或多個白蛋白結合結構域(“ABD”) (具有ABD的DART-A“w/ABD”)。

如WO 2012/018687中公開，為了改善雙抗體的體內藥物代謝動力學性質，可修飾雙抗體，以在雙抗體的一個或多個末端包含血清結合蛋白的多肽部分。最優選地，這種血清結合蛋白的多肽部分安置在雙抗體的C-末端。為了該目的，尤其優選的血清結合蛋白的多肽部分是來自鏈球菌蛋白質G的白蛋白結合結構域(ABD)。鏈球菌屬(Streptococcus)菌株G148的蛋白質G的白蛋白結合結構域3 (ABD3)是尤其優選的。

鏈球菌屬菌株G148的蛋白質G的白蛋白結合結構域3 (ABD3)由形成穩定三-螺旋束並且具有廣泛白蛋白結合特異性的46個氨基酸殘基組成(Johansson，M.U。等(2002) “Structure，Specificity，And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277 (10):8114-8120)。白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質，並且在人中的半衰期為19天。白蛋白具有數個小分子結合位點，其允許它非共價結合其他蛋白質，從而延長它們的血清半衰期。

因此，這種具有白蛋白結合結構域的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體的第一多肽鏈包含第三連接體(連接體3)，其將這種多肽鏈的E-螺旋(或K-螺旋)與白蛋白結合結構域分開。這種連接體3的優選的序列是SEQ ID NO:31: GGGS。優選的白蛋白結合結構域(ABD)具有下述序列(SEQ ID NO:36): LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALP。

因此，具有白蛋白結合結構域的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體的優選的第一鏈具有下述序列(SEQ ID NO:9): QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGEVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGGGSLAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALP

具有白蛋白結合結構域的序列優化的CD123 x CD3雙抗體由下述組成: SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:29 ─ SEQ ID NO:26 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:34─ SEQ ID NO:31 ─ SEQ ID NO:36。編碼這種具有白蛋白結合結構域衍生物的序列優化的CD123 x CD3雙抗體的多核苷酸是SEQ ID NO:10: caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgaccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccgctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtcttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcaggcaggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacggggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtggacaaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagatacagccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttgcttattggggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggcgggtctctggccgaagcaaaagtgctggccaaccgcgaactggataaatatggcgtgagcgattattataagaacctgattgacaacgcaaaatccgcggaaggcgtgaaagcactgattgatgaaattctggccgccctgcct

具有白蛋白結合結構域的這種序列優化的CD123 x CD3雙抗體的第二多肽鏈具有上述序列(SEQ ID NO:3)並且由具有SEQ ID NO:4的序列的多核苷酸編碼。

B. 具有IgG Fc结构域的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(具有Fc的DART-A“w/Fc”)

在第三種實施方式中，本發明提供由三條多肽鏈組成並且具有IgG Fc結構域的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(具有Fc的DART-A“w/Fc”，形式1和形式2) (圖3A-3B)。

為了形成這種IgG Fc結構域，雙抗體的第一和第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包含含半胱氨酸的肽，(最優選地，具有氨基酸序列(SEQ ID NO:55): DKTHTCPPCP的肽1)、完整免疫球蛋白Fc結構域的一些或所有的CH2結構域和/或一些或所有的CH3結構域、和C-末端。一些或所有的CH2結構域和/或一些或所有的CH3結構域結合，以形成本發明含雙特異性單價Fc結構域的雙抗體的免疫球蛋白Fc結構域。本發明的雙特異性單價Fc雙抗體的第一和第二多肽鏈彼此共價結合，例如通過位於多肽鏈的包含半胱氨酸的肽中的半胱氨酸殘基的二硫鍵合。

第一多肽和第三多肽的CH2和/或CH3結構域不必相同，且有利的是，將它們修飾成促進這兩條多肽之間的複合。例如，可以將氨基酸取代(優選用包含形成‘突出物(knob)’的大側基的氨基酸，例如色氨酸，進行的取代)引入CH2或CH3結構域中，從而使得空間干擾會防止與類似突變的結構域的相互作用，並且會迫使突變的結構域與這樣的結構域配對：在所述結構域中，改造進了互補或適應性突變，即‘孔(hole)’，(例如用甘氨酸進行取代)。這類突變組可以被改造進任何包含雙特異性單價Fc雙抗體分子的多肽對中，並且進一步改造進所述對的多肽鏈的任何部分中。偏愛異源二聚化而不喜歡同源二聚化的蛋白質工程的方法在本領域中是熟知的，特別是相對於免疫球蛋白樣分子的改造而言，並且包括在本文中(見例如，Ridgway等(1996) “‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Proteins Engr. 9:617-621，Atwell等(1997) “ Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35，和Xie等(2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization，Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol.Methods 296:95-101；其每一篇通過參考以其整體併入本文)。優選將‘突出物’改造到第一多肽鏈的CH2-CH3結構域中，並將‘孔’改造到第三多肽鏈的CH2-CH3結構域中。因此‘突出物’會有助於防止第一多肽鏈通過其CH2和/或CH3結構域同源二聚化。因為第三多肽鏈優選含有‘孔’取代，其會與第一多肽鏈異源二聚化以及與自身同源二聚化。通過將天然IgG Fc結構域修飾為含有修飾T366W，產生優選的突出物。通過將天然IgG Fc結構域修飾為含有修飾T366S、L368A以及Y407V，產生優選的孔。為了有助於從最終的包含第一多肽鏈、第二多肽鏈以及第三多肽鏈的雙特異性單價Fc雙抗體中純化第三多肽鏈同源二聚體，第三多肽鏈的CH2和CH3結構域的蛋白A結合位點優選通過位置435 (H435R)的氨基酸取代而突變。因此，第三多肽鏈同源二聚體不會結合蛋白A，而雙特異性單價Fc雙抗體會保留其通過第一多肽鏈上的蛋白A結合位點結合蛋白A的能力。

第一多肽鏈中存在的抗體Fc結構域的CH2和CH3結構域的優選的序列是(SEQ ID NO:56): APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

第三多肽鏈中存在的抗體Fc結構域的CH2和CH3結構域的優選的序列是(SEQ ID NO:11): APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK

C. DART-A w/Fc形式1構建體

為了闡釋這種Fc雙抗體，本發明提供了DART-A w/Fc形式1構建體。DART-A w/Fc形式1構建體的第一多肽在從N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD123的單克隆抗體的VL結構域(VL_CD123 )、間插連接體肽(連接體1)、能夠結合CD3的單克隆抗體的VH結構域(VH_CD3 )、連接體2、E-螺旋結構域、連接體5、肽1，包含Fc結構域的CH2和CH3結構域的多肽和C-末端。優選的連接體5具有下述序列(SEQ ID NO:32): GGG。優選的包含Fc結構域的CH2和CH3結構域的多肽具有下述序列(SEQ ID NO:37): APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

因此，這種DART-A w/Fc形式1構建體的第一多肽由下述組成：SEQ ID NO:25 ─ SEQ ID NO:29 ─ SEQ ID NO:22 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:34 ─ SEQ ID NO:32 ─ SEQ ID NO:55 ─ SEQ ID NO:37。

這種DART-A w/Fc形式1構建體的第一多肽的優選的序列具有下述序列(SEQ ID NO:13): DFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGGGDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

編碼這種多肽的優選的多核苷酸是(SEQ ID NO:14): gacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagcgggtgactatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatcagaaaaactatctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactgctgatctattgggcttccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcacagattttaccctgacaatttctagtctgcaggccgaggacgtggctgtgtactattgtcagaatgattacagctatccctacactttcggccaggggaccaagctggaaattaaaggaggcggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatcaggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtcttccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggcggggacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

這種DART-A w/Fc形式1構建體的第二鏈在從N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD3的單克隆抗體的VL結構域(VL_CD3 )、間插連接體肽(連接體1)、能夠結合CD123的單克隆抗體的VH結構域(VH_CD123 )、連接體2、K-螺旋結構域和C-末端。因此，這種DART-A w/Fc形式1構建體的第二多肽由下述組成：SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:29 ─ SEQ ID NO:26 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:35。這種多肽具有下述序列(SEQ ID NO:15): qavvtqepsltvspggtvtltcrsstgavttsnyanwvqqkpgqaprgliggtnkrapwtparfsgsllggkaaltitgaqaedeadyycalwysnlwvfgggtkltvlggggsggggevqlvqsgaelkkpgasvkvsckasgytftdyymkwvrqapgqglewigdiipsngatfynqkfkgrvtitvdkststaymelsslrsedtavyycarshllraswfaywgqgtlvtvssggcgggkvaalkekvaalkekvaalkekvaalke

編碼這種多肽的優選的多核苷酸具有下述序列(SEQ ID NO:16): caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgaccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccgctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtgcagtccggggctgagctgaagaaacccggagcttccgtgaaggtgtcttgcaaagccagtggctacaccttcacagactactatatgaagtgggtcaggcaggctccaggacagggactggaatggatcggcgatatcattccttccaacggggccactttctacaatcagaagtttaaaggcagggtgactattaccgtggacaaatcaacaagcactgcttatatggagctgagctccctgcgctctgaagatacagccgtgtactattgtgctcggtcacacctgctgagagccagctggtttgcttattggggacagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag

這種DART-A w/Fc形式1的第三多肽鏈包括IgG Fc結構域的CH2和CH3結構域。優選的多肽由肽1 (SEQ ID NO:55)和Fc結構域的CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:11)組成並且具有SEQ ID NO:54的序列: DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK

編碼這種多肽的優選的多核苷酸具有下述序列(SEQ ID NO:12): gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgagttgcgcagtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcgtcagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccgctacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

D. DART-A w/Fc形式2構建體

作為這種DART-A w/Fc雙抗體的第二個實施例，本發明提供了三鏈雙抗體，“DART-A w/Fc雙抗體形式2” (圖3B)。

這種DART-A w/Fc形式2構建體的第一多肽在從N-末端至C-末端方向上包括N-末端、肽連接體(肽1)、包含Fc結構域的CH2和CH3結構域的多肽，其(經連接體4)連接至能夠結合CD123的單克隆抗體的VL結構域(VL_CD123 )、間插連接體肽(連接體1)、能夠結合CD3的單克隆抗體的VH結構域(VH_CD3 )、連接體2、K-螺旋結構域和C-末端。

優選的包含Fc結構域的CH2和CH3結構域的多肽具有下述序列(SEQ ID NO:37): APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

“連接體4”優選地包括氨基酸序列(SEQ ID NO:57): APSSS。優選的“連接體4”具有序列(SEQ ID NO:33): APSSSPME。因此，這種DART-A w/Fc形式2構建體的第一多肽由下述組成：SEQ ID NO:55 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:33 ─ SEQ ID NO:25 ─ SEQ ID NO:29 ─ SEQ ID NO:22 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:35。具有這種序列的多肽是(SEQ ID NO:17): DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAPSSSPMEDFVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

編碼這種多肽的優選的多核苷酸具有下述序列(SEQ ID NO:18): gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagccccttccagctcccctatggaagacttcgtgatgacacagtctcctgatagtctggccgtgagtctgggggagcgggtgactatgtcttgcaagagctcccagtcactgctgaacagcggaaatcagaaaaactatctgacctggtaccagcagaagccaggccagccccctaaactgctgatctattgggcttccaccagggaatctggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcacagattttaccctgacaatttctagtctgcaggccgaggacgtggctgtgtactattgtcagaatgattacagctatccctacactttcggccaggggaccaagctggaaattaaaggaggcggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatcaggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaaggatagattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtcttccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag

這種DART-A w/Fc形式2構建體的第二多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括能夠結合CD3的單克隆抗體的VL結構域(VL_CD3 )、間插連接體肽(連接體1)和能夠結合CD123的單克隆抗體的VH結構域(VH_CD123 )。分子的該部分(經連接體2)連接至E-螺旋結構域。因此，這種DART-A w/Fc形式2構建體的第三多肽由下述組成：SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:29 ─ SEQ ID NO:26 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:34。具有這種序列的多肽是(SEQ ID NO:1)，並且優選地由具有SEQ ID NO:2的序列多核苷酸編碼。

第三多肽鏈包括IgG Fc結構域的CH2和CH3結構域。優選的多肽由肽1 (SEQ ID NO:55)和Fc結構域的CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:11)組成並且具有SEQ ID NO:54的序列。

為了評估上面提到的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A、DART-A w/ABD、DART-A w/Fc、DART-B)的活性，產生對照雙特異性雙抗體(對照DART)。對照DART能夠同時結合FITC和CD3。其兩條多肽鏈各具有下述序列：

對照DART鏈1 (SEQ ID NO:19): DVVMTQTPFSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK

對照DART鏈2 (SEQ ID NO:20): QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGEVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSGGCGGGKVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

IV. 藥學组合物

本發明的組合物包括可用於製造藥物組合物(例如不純的或非無菌的組合物)和藥物組合物(即適合施用於受試者或患者的組合物)的散裝(bulk)藥物組合物，其可用來製備單位劑型。這類組合物包含預防有效量或者治療有效量的本發明序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體，或這類劑以及藥學上可接受的載體的組合。優選地，本發明的組合物包括預防或治療有效量的本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體和藥學上可接受的載體。

本發明也包括藥學組合物，其包括本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體，和對具體癌症抗原特異的第二治療性抗體(例如，腫瘤特異性單克隆抗體)，以及藥學上可接受的載體。

在具體實施方式中，術語“藥學上可接受的”表示獲得聯邦政府或州政府管理結構的許可或列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他通常獲得認可的藥典中，供用於動物，特別是用於人類。術語“載體”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全)、賦形劑或媒介。這類藥用載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物油、植物油或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥物組合物時，水是優選的載體。鹽水溶液和含水右旋糖以及甘油溶液可以用作液體載體，特別是對於可注射溶液而言。合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、滑石粉(chalk)、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉(dried skim milk)、甘油、丙烯、1,2-乙二醇、水、乙醇等。若需要，組合物也可以含有小量濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸浮劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋製劑等形式。

通常，本發明組合物的成分被單獨提供或以單位劑型的形式混合在一起，例如作為標明活性劑量的密封容器中的凍乾粉或無水濃縮物，所述容器如安剖或袋(sachette)。當通過輸注施用組合物時，其可以用含有無菌的藥物級水或鹽水的輸注瓶分配。如果通過注射施用所述組合物，則可以提供一安剖注射用無菌水或鹽水，以便可以在施用前混合所述組分。

可以將本發明的組合物配製為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括但不限於用陰離子形成的鹽，所述陰離子例如來源於鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子，以及用陽離子形成的鹽，所述陽離子例如來自氫氧化納、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。

本發明還提供了藥物包裝或試劑盒，其包含一個或多個容器，所述容器填充以單獨的本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體或填充以所述雙抗體和這類藥學上可接受的載體。另外，用於治療疾病的一種或多種其他預防性或治療性劑也可以包括於所述藥物包裝或試劑盒中。本發明還提供了藥物包裝或試劑盒，其包含一個或多個容器，所述容器填充以本發明藥物組合物的一種或多種成分。任選地與這類容器關聯的可以是採用管理藥物或生物產品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形的佈告(notice)，所述佈告反映了管理機構許可製造、使用或銷售，供施用於人類。

本發明提供可用於上述方法的試劑盒。試劑盒可包括本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體。試劑盒可在一個或多個容器中進一步包括用於治療癌症的一種或多種其他預防劑和/或治療劑；和/或試劑盒可進一步包括結合與癌症相關的一種或多種癌症抗原的一種或多種細胞毒抗體。在某些實施方式中，其他預防劑或治療劑是化療劑。在其他實施方式中，預防劑或治療劑是生物或激素治療劑。

V.施用方法

通過向受試者施用有效量的本發明的融合蛋白或綴合分子或包括本發明融合蛋白或綴合分子的藥物組合物，可以提供所述本發明的組合物用來治療、預防和改善與疾病、病症或感染相關的一種或多種症狀。在優選的方面，這類組合物基本上是純的(即基本上不含限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。在具體實施方式中，受試者是動物，優選哺乳動物，如非靈長類(例如牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如，猴子，如食蟹猴、人等)。在優選的實施方式中，受試者是人。

各種送遞系統是已知的，並且可以用於施用本發明的組合物，例如封裝於脂質體中、微粒、微膠囊、能表現抗體或融合蛋白的重組細胞、受體介導的內吞作用 (見，例如，Wu等(1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429-4432)，構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分等。

施用本發明分子的方法包括但不限於胃腸外施用(例如真皮內、肌肉內、腹腔內、靜脈內以及皮下)、硬膜外以及粘膜(例如鼻內和口腔途徑)。在具體實施方式中，肌肉內、靜脈內或皮下施用本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體。組合物可以通過任何方便途徑施用，例如通過輸注或大丸劑注射、通過上皮膜或粘膜與皮膚膜(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，並且可以與其他生物活性劑一起施用。給藥可以是全身的或局部的。另外，也可以應用肺給藥，例如通過使用吸入器或噴霧器，並且與煙霧化劑一起配製。見，例如，美國專利號6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公開號WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，其每一篇通過參考以其整體併入本文。

本發明還使得本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體被包裝於標有這類分子的量的密封的容器如安剖或袋中。在一實施方式中，本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體作為凍幹無菌粉或無水濃縮物提供於密封容器中，並且可以用例如水或鹽水重構至施用於受試者的適當濃度。優選地，本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體作為凍幹無菌粉提供於密封容器中，其單位劑量為至少5 μg、更優選地至少10 μg、至少15 μg、至少25 μg、至少50 μg、至少100 μg、或至少200 μg。

本發明凍幹的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體應在它們的原始容器中儲存在2和8℃之間，並且分子應在重構之後的12小時，優選地6小時，5小時，3小時，或1小時內施用。在可選的實施方式中，本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體以液體形式提供在指示分子、融合蛋白或綴合分子的量和濃度的密封容器中。優選地，本發明液體形式的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體提供在密封容器中，其中分子存在的濃度為至少1 μg/ml，更優選地至少2.5 μg/ml、至少5 μg/ml、至少10 μg/ml，至少50 μg/ml、或至少100 μg/ml。

有效治療、預防或改善與病症相關的一個或多個症狀的本發明的組合物的量可通過標準臨床技術測定。製劑中採用的精確劑量也取決於施用的途徑和病況的嚴重性，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況決定。有效的劑量可從源自體外或動物模型測試系統的劑量回應曲線推斷。

對於本發明包括的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體，優選地基於接受受試者的體重(kg)測定施用至患者的劑量。施用的劑量通常從至少約0.3 ng/kg每天至約0.9 ng/kg每天，從至少約1 ng/kg每天至約3 ng/kg每天，從至少約3 ng/kg每天至約9 ng/kg每天，從至少約10 ng/kg每天至約30 ng/kg每天，從至少約30 ng/kg每天至約90 ng/kg每天，從至少約100 ng/kg每天至約300 ng/kg每天，從至少約200 ng/kg每天至約600 ng/kg每天，從至少約300 ng/kg每天至約900 ng/kg每天，從至少約400 ng/kg每天至約800 ng/kg每天，從至少約500 ng/kg每天至約1000 ng/kg每天，從至少約600 ng/kg每天至約1000 ng/kg每天，從至少約700 ng/kg每天至約1000 ng/kg每天，從至少約800 ng/kg每天至約1000 ng/kg每天，從至少約900 ng/kg每天至約1000 ng/kg每天，或至少約1,000 ng/kg每天。

在另一實施方式中，患者施用的治療方案包括一個或多個劑量的這種預防或治療有效量的本發明包括的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體，其中治療方案在2天、3天、4天、5天、6天或7天內施用。在某些實施方式中，治療方案包括間歇地施用本發明包括的預防或治療有效量的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體的劑量(例如，在給定周的第1天、第2天、第3天和第4天施用劑量並且在相同周的第5天、第6天和第7天不施用預防或治療有效量的本發明包括的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體的劑量)。典型地，有1、2、3、4、5或更多個治療過程。每個過程可以是相同方案或不同的方案。

在另一實施方式中，在方案(一個或多個)的四分之一、二分之一或三分之二或四分之三(例如，在4個過程治療的第一、第二或協力廠商案中)內逐漸增加施用的劑量，直到達到本發明包括的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體的日預防或治療有效量。

表1提供上面針對典型治療過程描述的不同劑量方案的5個例子。

施用本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體的劑量和頻率可通過修飾比如，例如，脂質化而增強序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體的吸收和組織滲透被降低或改變。

可計算施用至患者的本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體的劑量，以用作單一劑療法。可選地，本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體結合其他治療性組合物使用，並且施用至患者的劑量小於當所述分子作為單一劑療法使用時的劑量。

本發明的藥學組合物可局部施用至需要治療的區域；這可通過例如，但不限於下述方式實現：局部輸注、注射或移植物手段，所述移植物是多孔的、非多孔的或明膠材料，包括膜，如矽橡膠(sialastic)膜或纖維。優選地，當施用本發明的分子時，必須小心施用所述分子不吸收的材料。

本發明的組合物可在泡，尤其脂質體中遞送(見Langer (1990)“New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533)；Treat等，在Liposomes i n t he Therapy o f Infectious Disease a nd Cancer ，Lopez-Berestein和Fidler (eds.)，Liss，New York，353-365頁(1989)中；Lopez-Berestein，同上，317-327頁；通常參見同上)。

可以在控釋系統或緩釋系統中遞送本發明的組合物。可以使用本領域技術人員已知的任何技術產生包含本發明的一種或多種序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體的緩釋製劑。見例如美國專利第4,526,938號；PCT公開WO 91/05548；PCT 公開WO 96/20698; Ning等(1996),“IntratumoralRadioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179‑189，Song等(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372‑397；Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‑854；和Lam等(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759‑760，其每一篇通過參考以其整體併入本文。在一種實施方式中，泵可用於控釋系統中(見Langer，上文；Sefton，(1987)“Implantable Pumps,” CRC CRC Crit. Rev. Biomed. Eng.14:201-240；Buchwald等(1980)“Long-Term ， Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,” Surgery 88:507-516；和Saudek等(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,” N. Engl. J. Med. 321:574-579)。在另一實施方式中，聚合材料可用于實現分子的控釋(見例如，M EDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE，Langer和Wise (eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida (1974)；CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY，DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE，Smolen和Ball (eds.)，Wiley，New York (1984)；Levy等(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,” Science 228:190-192；During等(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,” Ann. Neurol. 25:351-356；Howard等(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,” J. Neurosurg. 7(1):105-112)、美國專利號5,679,377、美國專利號5,916,597、美國專利號5,912,015、美國專利號5,989,463、美國專利號5,128,326、PCT公開號WO 99/15154和PCT公開號WO 99/20253)。緩釋製劑所用的聚合物的實例包括但不限於聚(2-甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物(poly(ethylene-co-vinyl acetate))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)以及聚原酸酯(polyorthoeste)。控釋系統可接近治療靶標 (例如，肺)佈置，因此僅僅需要全身劑量的一部分(見，例如，Goodson，在MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE，同上，2卷，115-138頁(1984)中)。根據Dunn等 (見U.S. 5,945,155)，使用可用作控釋移植物的聚合物組合物。該特定方法基於聚合物系統中生物活性材料原位控釋的治療效果。移植通常發生于患者身體內需要治療的任何地方。使用非聚合物持續送遞系統，由此受試者身體內的非聚合物移植物被用作藥物送遞系統。一旦移植到身體中，移植物的有機溶劑會從組合物中消散、分散或滲漏到周圍組織液中，並且非聚合物材料會逐漸凝結或沉澱，形成固體微孔基質(參見U.S. 5,888,533)。

控釋系統在Langer (1990,“New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533)的綜述中有論述。可以使用本領域技術人員已知的任何技術來生產包含本發明的一種或多種治療劑的緩釋製劑。見例如美國專利第4,526,938號；國際公開第WO 91/05548和WO 96/20698號；Ning等(1996)“IntratumoralRadioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained‑Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179‑189, Song等 (1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long‑Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372‑397; Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‑854; and Lam等 (1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759‑760，每一上述文獻通過引用以其整體併入本文。

在本發明的組合物是編碼本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體的核酸時，核酸可體內施用，以通過如下方式促進其編碼的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體的表現：將核酸構建為適當的核酸表現載體的一部分並且施用它從而其成為細胞內的，例如，通過使用逆轉錄病毒載體(見美國專利號4,980,286)，或通過直接注射，或通過使用微粒轟擊(例如，基因槍；生物彈道技術(Biolistic)，Dupont)，或用脂質或細胞-表面受體或轉染劑塗覆，或通過使其與已知進入核的同源框樣肽一起施用(見例如，Joliot等(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad.Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868)等。可選地，可以將核酸引入細胞內並通過同源重組整合到宿主細胞DNA中，以進行表現。

用治療或預防有效量的本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體治療受試者可包括單一治療或，優選地，可包括一系列治療。在優選的實施例中，用本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體每週治療受試者一次，持續約1至10周，優選地2至8周，更優選地約3至7周，和甚至更優選地約4、5或6周。本發明的藥學組合物可一天施用一次，一天兩次，或一天三次。可選地，藥學組合物可一周施用一次，一周兩次，每兩週一次，一個月一次，每六週一次，每兩個月一次，一年兩次或每年一次。應當認識到，用於治療的分子的有效劑量可以隨著具體治療的過程增加或降低。

VI. 本發明的組合物的用途

本發明的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體具有治療任何與CD123的表現相關或特徵在於CD123的表現的疾病或病況的能力。因此，這種分子可用于診斷或治療急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)，包括CML的母細胞危象和與CML相關的Abelson癌基因(Bcr-ABL易位)、骨髓增生異常綜合症(MDS)、急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)，包括Richter綜合症或CLL的Richter轉化、毛細胞性白血病(HCL)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括套細胞白血病(MCL)，和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增多症，和伯基特淋巴瘤(見實施例2)；自身免疫狼瘡(SLE)、過敏症、哮喘和類風濕性關節炎，但不限於上述疾病或病況。本發明的雙特異性雙抗體可另外用於製造用於治療上述病況的藥物。

已經一般性描述了本發明，通過參考下述實施例本發明將更容易理解，通過示例的方式提供所述實施例並且不旨在限制本發明，除非另外說明。

一、實施例1

CD123 x CD3雙特異性雙抗體和對照蛋白質的構建：

表2包含被表現和純化的雙特異性雙抗體的列表。序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)和非序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-B)能夠同時結合CD123和CD3。對照雙特異性雙抗體(對照DART)能夠同時結合FITC和CD3。雙特異性雙抗體是所敘述的氨基酸序列的異源二聚體或異源三聚體。形成雙特異性雙抗體的方法提供在WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/080538、WO 2012/018687、WO 2012/162068和WO 2012/162067中。

二、實施例2

對靶細胞進行抗體標記用於定量FACS (QFACS)：

從培養物收穫總計10⁶ 個靶細胞，重懸在FACS緩衝液(PBS + 1% BSA+ 0.1% NaAzide)中的10%人AB血清中並且溫育5 min，阻斷Fc受體。具有不同抗體結合能力的抗體標記微球(Antibody labeling of microspheres) (Quantum™ Simply Cellular® (QSC), Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN)和靶細胞用抗CD123 PE抗體(BD Biosciences)根據製造商的說明進行標記。簡言之，將一滴各種QSC微球添加至5 mL聚丙烯管，並且以1 µg/mL濃度將PE標記的抗CD123抗體添加至靶細胞和微滴二者中。在黑暗中4℃下溫育管30分鐘。通過添加2mL FACS緩衝液並且在2500 x G下離心5分鐘，洗滌細胞和微球。洗滌之後，添加一滴空白微球群體。首先在流式細胞儀上分析微滴，以設置測試特定的儀器設置(instrument setting) (PMT電壓和補償)。使用相同的儀器設置，記錄微球和靶細胞的幾何平均螢光值。從微球群體的幾何平均螢光產生微球群體上抗體結合位元點的標準曲線。基於靶細胞的幾何平均螢光使用QuickCal電子錶(Bangs Laboratories)針對為微球產生的標準曲線計算靶細胞上的抗體結合位點。

為了測定用於評估CD123 x CD3雙特異性雙抗體的適當的靶細胞系，通過定量FACS (QFACS)評估在靶系Kasumi-3 (AML)、Molm13 (AML)、THP-1 (AML)、TF-1 (紅白血病)和RS4-11 (ALL)上的CD123表面表現水準。使用QFACS試劑盒計算細胞表面上CD123抗體結合位點的絕對數目。如表3中所顯示，細胞系上CD123抗體結合位元點的絕對數目的順序為Kasumi-3 (高) ＞ Molm13 (中) ＞ THP-1 (中) ＞ TF-1 (中低) ＞ RS4-11 (低)。三個最高表現細胞系是AML細胞系：Kasumi-3、MOLM13和THP-1。非AML細胞系：TF-1和RS4-11分別具有中–低/低表現的CD123。

三、實施例3

CTL細胞毒性試驗(LDH釋放試驗)：

用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液分離附著靶腫瘤細胞並且通過以1000 rpm離心5 min進行收集。從培養物中收穫懸浮靶細胞系，用試驗培養基洗滌。通過錐蟲藍排斥使用Beckman Coulter Vi-細胞計數器測量細胞濃度和生存力。將靶細胞在試驗培養基中稀釋至4 x10⁵ 細胞/mL。將50 μL稀釋細胞懸液添加至96孔U-底細胞(bottom cell)培養物處理的板(BD Falcon Cat#353077)。

測量靶最大釋放(MR)、抗體非依賴性細胞毒性(AICC)和靶細胞自發釋放(SR)的三組對照如下設置： 1) MR: 沒有CD123 x CD3雙特異性雙抗體的200 μL試驗培養基和50 μL靶細胞；在實驗結束時添加的洗滌劑以測定最大LDH釋放。 2) AICC: 沒有CD123 x CD3雙特異性雙抗體的50 μL試驗培養基，50 µL靶細胞和100 µL T細胞。 3) SR: 沒有CD123 x CD3雙特異性雙抗體的150 µL培養基和50 µL靶細胞。

CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A、DART-A w/ABD和DART-B)和對照首先稀釋至4 μg/mL的濃度，並且然後進行連續稀釋下降至最終濃度為0.00004 ng/mL (即，40 fg/mL)。將50 µL的稀釋物添加至包含50 μL靶細胞/孔的板。

用試驗培養基洗滌純化的T細胞一次並且以2 x 10⁶ 細胞/mL的細胞密度重懸於試驗培養基中。將100 µL中的2 x 10⁵ 個T細胞添加至每個孔，終效應器與靶細胞(E:T)比為10:1。在37℃下5% CO₂ 中溫育板約18小時。

溫育之後，將25 μL的10x溶解液(Promega # G182A)或1 mg/mL毛地黃皂苷添加至最大值釋放對照孔，通過吹吸(pipetting)3次進行混合，並且溫育板10 min以完全溶解靶細胞。板在1200 rpm下離心5分鐘，並且將50mL的上清液從每個試驗板孔轉移至平底ELISA板和將50ml的LDH底物溶液(Promega #G1780)添加至每個孔。板在室溫下(RT)黑暗中溫育10-20 min，然後添加50 µL的終止液。在Victor2 Multilabel板讀取器(Perkin Elmer #1420-014)上在490 nm下1小時之內測量光密度(O.D.)。如下所述計算細胞毒性的百分數並且使用GraphPad PRISM5®軟體產生劑量響應曲線。

從O.D.資料使用下述式計算比細胞溶解：細胞毒性(%) = 100 x (樣品的OD – AICC的OD) / (MR的OD – SR的OD)

重定向殺傷具有不同水準CD123表面水準的靶細胞系：

CD123 x CD3雙特異性雙抗體以亞-ng/mL (sub-ng/mL)範圍內實現50%的最大活性(EC50)需要的濃度顯示有效的重定向殺傷能力，不考慮具有高CD123表現，Kasumi-3 (EC50=0.01 ng/mL) (圖4圖D)，中CD123-表現，Molm13 (EC50=0.18 ng/mL)和THP-1 (EC50=0.24 ng/mL) (圖4，分別為圖C和E)和中低或低CD123表現，TF-1 (EC50=0.46 ng/mL)和RS4-11 (EC50=0.5 ng/mL) (圖4，分別為圖B和A)的靶細胞系中的CD3抗原決定部位結合特異性(DART-A對DART-B)。類似地，也用具有來自不同供體的T細胞的多靶細胞系觀察到了CD123 x CD3雙特異性分子介導的重定向殺傷並且在不表現CD123的細胞系中沒有觀察到重定向殺傷活性。結果總結在表4中。

儘管重複該實施例是必要的，但是應認識到本領域技術人員在合理的和可接受的限制內，可以適於重複所述結果的方式改變上述方案。因此，舉例的方案不旨在限於具體的嚴格方式。

四、實施例4

通過序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A、DART-A w/ABD和DART-A w/Fc)的重定向殺傷期間的T細胞活化：

序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體顯示有效的重定向殺傷能力，無論在具有高CD123表現，Kasumi-3，和中THP-1，CD123-表現，(圖5，分別為圖A和B)的靶細胞系中是否存在半衰期延長技術(DART-A對DART-A w/ABD對DART-A w/Fc)。為了表徵序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體介導重定向殺傷過程期間的T細胞活化，來自重定向殺傷試驗的T細胞針對T細胞活化標記物CD25被染色，並且通過FACS被分析。如圖5中圖D所顯示，CD8 T細胞中的CD25以劑量依賴性方式被上調，表示序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體在重定向殺傷的過程中誘導T細胞活化。相反地，在沒有靶細胞的情況下，沒有活化CD8 T細胞(圖5，圖C)，表示序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體在沒有靶細胞的情況下不啟動T細胞。同樣地，當與靶細胞和對照雙特異性雙抗體(對照DART)一起溫育時， CD8 T細胞不被啟動(圖5，圖D)，表示需要用序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體交聯T細胞和靶細胞。

五、實施例5

粒酶B和穿孔蛋白的細胞內染色：

為了測定T細胞中粒酶B和穿孔蛋白的細胞內水準，如上述設置CTL試驗。約18小時之後，來自試驗板的細胞用抗CD4和抗CD8抗體通過在4℃下溫育30分鐘進行染色。表面染色之後，細胞在100 µL固定和透化緩衝液(BD BioSciences)中在4℃下溫育20 min。用透化/洗滌緩衝液(BD BioSciences)洗滌細胞並且在50 µL的粒酶B和穿孔蛋白抗體混合物(在1X透化/洗滌緩衝液中製備)中在4℃下溫育30分鐘。然後用250 µL透化/洗滌緩衝液洗滌細胞並且重懸於透化/洗滌緩衝液中，用於FACS收集。

重定向殺傷期間T細胞中通過序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A) 上調粒酶B和穿孔蛋白：

為了研究序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)介導的T細胞的細胞毒性的可能的機制，測量T細胞中重定向殺傷之後細胞內粒酶B和穿孔蛋白水準。在用DART-A溫育T細胞和Kasumi-3細胞之後觀察到CD8和CD4 T細胞二者中粒酶B和穿孔蛋白水準的劑量依賴性上調(圖6，圖A)。有趣地，與CD4 T細胞相比，CD8 T細胞中的上調幾乎高兩倍(圖6，圖A)。當在存在粒酶B和穿孔蛋白抑制劑的情況下進行試驗時，沒有觀察到細胞殺傷。當T細胞用Kasumi-3靶細胞和對照雙特異性雙抗體(對照DART)溫育時，CD8或CD4 T細胞中沒有粒酶B或穿孔蛋白的上調(圖5，圖B)。這些資料指示DART-A介導的靶細胞殺傷可通過粒酶B和穿孔蛋白機制介導。

六、實施例6

序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)的體內抗腫瘤活性：

從人全血分離PBMC和T細胞

通過使用Ficoll梯度離心從全血分離來自健康的人供體的PBMC。簡單地，用無菌PBS1:1稀釋全血。三十五ml的稀釋血液在50-mL管的15 mL Ficoll-Paque^TM Plus上分層，並且以1400 rpm使管離心20 min，停止。將兩個相之間的淡黃色塗層(coat layer)收集在50 mL管中，並且用45 mL PBS通過使管在600 x g (1620 rpm)下離心5 min進行洗滌。丟棄上清液並且用PBS洗滌細胞沉澱物一次並且通過錐蟲藍染料排斥測定活細胞數量。將PBMC重懸于完全培養基(RPMI 1640、10%FBS、2 mM穀氨醯胺、10mM HEPES、100μ/100μ/mL青黴素/鏈黴素(P/S)中至2.5x10⁶ 細胞/mL的終濃度。

T細胞分離

通過陰性選擇從來自人全血的PBMC使用Dynabeads Untouched Human T Cell (Dynabeads未接觸的人T細胞)分離試劑盒(Life Technologies)根據製造商的說明分離未接觸的T細胞。分離之後，在具有10% FBS，1%青黴素/鏈黴素的RPMI培養基中培養T細胞過夜。

腫瘤模型

以1:5比組合人T細胞和腫瘤細胞(Molm13或RS4-11) (分別1 x 10⁶ 和5 x 10⁶ )並且懸浮在200 µL的無菌生理鹽水中並且在研究的第0天(SD0)皮下(SC)注射。序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)或對照雙特異性雙抗體(對照DART)經尾靜脈注射以100 µL靜脈內(IV)施用，如表5 (MOLM13)和表6 (RS4-11)中概括。

資料收集和統計分析

動物體重-在腫瘤細胞注射開始時每週記錄個體動物體重兩次直到研究結束。

垂死率(Moribundity)/死亡率-每週兩次觀察動物的一般垂死率和每天觀察死亡率。基於包括總體觀察和體重減輕的因素，動物死亡評估為藥物相關的或技術的；每天記錄動物死亡。

腫瘤體積-從腫瘤植入的一周內開始，每週兩次記錄個體腫瘤體積和持續直到研究結束。

通過資料計，檢查經歷技術或藥物相關死亡的動物。

腫瘤生長抑制-使用下式計算每個包含治療（處理）動物的組的腫瘤生長抑制(TGI)值：

通過TGI計算，檢查經歷部分或完全應答的動物，或經歷技術或藥物相關死亡的動物。化合物活性的國家癌症研究所(National Cancer Institute)標準是TGI＞58% (Corbett等(2004)Anticancer Drug Development Guide ；Totowa，NJ: Humana 99-123)。

部分/完全腫瘤應答–在第1天具有小於1mm³ 腫瘤測量的個體小鼠歸類為具有部分應答(PR)並且使用下式測定腫瘤退化百分數(%TR)值：

缺少明顯腫瘤的個體小鼠被歸類為經歷完全應答(CR)。

腫瘤體積統計–在治療組和對照組之間進行統計分析，比較腫瘤體積。為了這些分析，採用雙因素方差分析，隨後應用Bonferroni後檢驗。使用GraphPad PRISM®軟體(版本5.02)進行所有分析。通過分析，檢查來自經歷技術或藥物相關死亡的個體動物的體重和腫瘤資料。但是，來自報告部分或完全應答的動物的腫瘤資料包括在這些計算中。

MOLM13結果

AML細胞系MOLM13與活化的T細胞預混合並且在SD0，SC植入NOD/SCID γ (NSG)敲除小鼠中(N = 8/組)，如上詳述。媒介處理組(單獨MOLM13細胞或加T細胞)中的MOLM13腫瘤顯示體內相對侵略性(aggressive)的生長特徵(圖7，圖A和B)。在SD8，腫瘤媒介處理組的平均腫瘤體積是129.8 ± 29.5 mm³ 並且到SD15，腫瘤已經達到的平均體積為786.4 ± 156.7 mm³ 。在SD18實驗結束時，腫瘤已經達到的平均體積為1398.8 ± 236.9 mm³ 。

在植入腫瘤細胞/T細胞混合物的同一天[(SD0)]開始DART-A的治療，並且隨後繼續每天注射進行另外7天，總共8天注射。以9個劑量水準(0.5、0.2、0.1、0.02和0.004 mg/kg和20、4、0.8和0.16 µg/kg)用DART-A治療動物。結果顯示在圖7，圖A (0.5、0.2、0.1、0.02，和0.004 mg/kg)和圖7，圖B (20、4、0.8和0.16 µg/kg)中。到研究第11天，MOLM13腫瘤的生長被0.16、0.5、0.2、0.1、0.02和0.004 mg/kg劑量水準顯著抑制(p ＜ 0.001)。而且，以20和4 µg/kg劑量水準治療負載MOLM13腫瘤小鼠分別產生8/8和7/8 CR。在SD18實驗結束時，用DART-A以0.8 – 20 µg/kg)治療的腫瘤的平均體積範圍從713.6.0 ± 267.4至0 mm³ ，所有這些顯著比媒介處理的對照組中腫瘤更小。TGI值對於20、4和0.8 µg/kg劑量組分別是100、94和49%。與媒介處理的MOLM13腫瘤細胞組相比較，接收20和4 µg/kg劑量水準DART-A的組到SD15達到統計顯著性，而用0.8 µg/kg治療的組在SD18達到統計顯著性。

RS4-11結果

ALL細胞系RS4-11與活化的T細胞預混合並且在NOD/SCID γ敲除小鼠(N = 8/組)中在SD0 SC植入，如上詳述。媒介處理組(單獨RS4-11細胞或加T細胞)中的RS4-11腫瘤顯示體內相對侵略性的生長特徵(圖8)。

在植入腫瘤細胞/T細胞混合物的同一天[ (SD0)]開始用DART-A進行治療，並且隨後繼續每天注射進行另外3天，總共4天注射。以5個劑量水準(0.5、0.2、0.1、0.02和0.004 mg/kg)用DART-A治療動物。結果顯示在圖8中。

在Winn模型的情況下，當在注入的當天開始給藥並且持續3天或更多連續天時，序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)有效抑制在NOD/SCID小鼠中SC植入的MOLM13 AML和RS4-11ALL腫瘤的生長。基於國家癌症研究所確定的標準，0.1 mg/kg劑量水準和更高(TGI ＞58)的DART-A認為在RS4-11模型中有活性，並且0.004 mg/kg和更高的DART-A劑量在MOLM13模型中有活性。與RS4-11模型相比抑制MOLM13模型中腫瘤生長相關的較低的DART-A劑量與體外資料一致，表明MOLM13細胞具有比RS4-11細胞更高水準的CD123表現，其與對MOLM13細胞中體外DART-A介導細胞毒性增加的靈敏度相關聯。

七、實施例7

來自AML患者1的初級組織樣品中白血病胚細胞和幹細胞上的CD123表面表現：

為了定義AML患者1初級樣品中CD123表現模式，評估冷凍保存的原發性AML患者骨髓和PBMC樣品的白血病胚細胞上的CD123表面表現。

AML骨髓樣品–臨床報導年齡：42 性別：雌性 AML亞型：M2 基於形態的癌症細胞百分數：67.5% 骨髓免疫表型分型： CD15=19%、CD33=98.5%、CD38=28.8%、CD45=81.8%、CD64=39.7%、CD117=42.9%、HLA-DR=17%、CD2=1.8%、CD5=0.53%、CD7=0.2%、CD10=0.41%、CD19=1.1%、CD20=1.4%、CD22=0.71% CD34=0.82%

骨髓單核細胞(BM MNC)中的白血病胚細胞中的CD123表現：

評估來自AML患者1總計0.5x106骨髓單核細胞(BM MNC)和外周血單核細胞(PBMC))的CD123表現。包括Kasumi-3細胞系作為對照。使用骨髓樣標記CD33鑒定白血病胚細胞。如圖9，圖A中所顯示，來自患者1的AML骨髓的87%的細胞表現CD123和CD33。CD123表現水準比CD123高-表現Kasumi-3 AML細胞系稍低(圖9，圖B)。

八、實施例8

使用AML患者初級樣本的自體CTL殺傷試驗：

將來自AML患者1的冷凍保存原發性AML樣品(骨髓單核細胞(BMNC)和外周血單核細胞(PBMC))融解在具有10% FBS的RPMI1640中，並且允許在37℃下5% CO2中過夜回收。用試驗培養基(RPMI 1640+10%FBS)洗滌細胞並且通過錐蟲藍排斥測定活細胞數量。以150μL試驗培養基中的150,000細胞/孔添加至96孔U-底板(BD Biosciences)。序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)被稀釋至0.1和0.01 ng/mL，和將50μL每種稀釋物添加至每個孔(終體積= 200μL)。將對照雙特異性雙抗體(對照DART)稀釋至0.1 ng/mL，和將50μL的每種稀釋物添加至每個孔(終體積= 200μL)。針對每個時間點(48、72、120和144小時)設置單獨的試驗板，並且在37℃下5% CO2培養箱中溫育板。在每個時間點，用CD4、CD8、CD25、CD45、CD33和CD123抗體使細胞染色。在配備CellQuest Pro收集軟體，版本5.2.1的FACS Calibur流式細胞儀(BD Biosciences)中分析標記的細胞。使用Flowjo v9.3.3軟體(Treestar，Inc)進行資料分析。通過對CD4+和CD8+群體進行門控(gating)測量T細胞擴展，並且通過測量CD4+和CD8+ -門控群體的CD25平均螢光強度(MFI)測定活化。通過CD45+CD33+門控鑒定白血病胚細胞群體。

通過序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)在來自AML患者1的初級樣本中進行自體腫瘤細胞消耗、T細胞擴展和活化：

為了確定序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)在AML患者1仲介導的活性，用0.1 ng/mL或0.01 ng/mL的DART-A溫育患者樣品，並且在處理後的不同時間點測量白血病胚細胞和T細胞的百分數。通過CD45+/CD33+門控鑒定白血病胚細胞。用DART-A溫育原發性AML骨髓樣品導致白血病細胞群體隨著時間的消耗(圖10，圖A)，伴隨著殘留T細胞的伴隨擴展(圖10，圖B)和T細胞活化標記物的誘導(圖10，圖C)。在DART-A治療的樣品中，T細胞到120小時從約7 %擴展至約80%。通過CD4和CD8細胞上CD25表現測量的T細胞活化在72小時達到高峰並且到120小時時間點下降。

儘管重複該實施例是必要的，但是應認識到本領域技術人員，在合理的和可接受的限制內，可以適於重複所述結果的方式改變上述方案。因此，舉例的方案不旨在限於具體的嚴格方式。

九、實施例9

來自ALL患者的初級組織樣品中白血病胚細胞和幹細胞上的CD123表面表現：

為了定義ALL患者初級樣品中的CD123表現模式，評估冷凍保存的原發性ALL患者PBMC樣品在白血病胚細胞上的CD123表面表現。

外周血單核細胞(PBMC)中的白血病胚細胞中的CD123表現：

評估來自健康供體和ALL患者總計0.5x106個外周血單核細胞(PBMC)的CD123表現。如圖11，圖E-H中所顯示，來自ALL骨髓的絕大部分細胞表現CD123。相反地，如在正常供體中期望的，B細胞是CD123陰性的，並且pDC和單核細胞是CD123陽性的(圖11，圖D)。

通過對CD4和CD8細胞染色鑒定ALL患者樣品中的T細胞群體。如圖12，圖B中所顯示，ALL患者樣品中總PBMC的僅一小部分是T細胞(約0.5%的是CD4 T細胞和約0.4%是CD8 T細胞。

十、實施例10

使用ALL患者初級樣本的自體CTL殺傷試驗：

將冷凍保存的原發性ALL樣本(外周血單核細胞(PBMC))融解在具有10% FBS的RPMI1640中，並且允許在37℃下5% CO2中回收過夜。用試驗培養基(RPMI 1640+10%FBS)洗滌細胞並且通過錐蟲藍排斥測定活細胞數量。以150μL試驗培養基中的150,000細胞/孔添加至96孔U-底板(BD Biosciences)。將序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)稀釋至10，1 ng/mL，和將50μL的每種稀釋物添加至每個孔(終體積= 200μL)。針對每個時間點(48、72、120和144小時)設置單獨的試驗板，並且板在37℃下5% CO2培養箱中溫育。在每個時間點，用CD4、CD8、CD25、CD45、CD33和CD123抗體使細胞染色。在配備CellQuest Pro收集軟體，版本5.2.1的FACS Calibur流式細胞儀(BD Biosciences)中分析標記的細胞。使用Flowjo v9.3.3軟體(Treestar，Inc)進行資料分析。通過對CD4+和CD8+群體門控測量T細胞擴展並且通過測量CD4+和CD8+ -門控的群體上的CD25 MFI測定活化。通過CD45+CD33+門控鑒定白血病母細胞群體。

在ALL患者的初級樣本中通過序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)進行的自體腫瘤細胞消耗、T細胞擴展和活化：

為了確定序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)在ALL患者原發性患者樣品仲介導的活性，用1 ng/mL的DART-A溫育患者樣品，並且在處理後的不同時間點測量白血病胚細胞和T細胞的百分數。通過CD45+/CD33+門控鑒定白血病胚細胞。與未處理的對照或對照DART相比，用DART-A溫育原發性ALL骨髓樣品導致白血病細胞群體隨著時間的消耗(圖13，圖H對圖F和G)。當T細胞被計數(CD8和CD4染色)和活化(CD25染色)被分析時，與未處理的或對照DART樣品(圖14，分別為圖H、G、K和J)相比，T細胞擴展並且在DART-A樣品中活化(圖14，分別為圖I和L)。

十一、實施例11

AML患者2的初級組織樣品中白血病胚細胞和幹細胞上的CD123表面表現：

為了定義AML患者2初級樣品中的CD123表現模式，評估冷凍保存的原發性AML患者骨髓和PBMC樣品在白血病胚細胞上的CD123表面表現。

骨髓單核細胞(BMNC)的白血病胚細胞中的CD123表現：

評估AML患者2的總計0.5x106骨髓單核細胞(BM MNC)和外周血單核細胞(PBMC))用於白血病胚細胞鑒定。使用骨髓樣標記CD33和CD45鑒定白血病胚細胞。如圖15，圖B中所顯示，來自AML骨髓的細胞的94%是白血病胚細胞。通過CD3表現鑒定T細胞群體。如圖15，圖C中所顯示，來自AML骨髓和PBMC樣品的細胞的約15%是T細胞。

十二、實施例12

使用AML患者2初級樣本的自體CTL殺傷試驗：

將來自AML患者2的冷凍保存的原發性AML樣品(骨髓單核細胞(BM MNC)和外周血單核細胞(PBMC))融解在具有10% FBS的RPMI 1640中，並且允許在37℃下5% CO2中回收過夜。用試驗培養基(RPMI 1640+10%FBS)洗滌細胞並且通過錐蟲藍排斥測定活細胞數量。以150μL試驗培養基中的150,000細胞/孔添加至96孔U-底板(BD Biosciences)。將序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)和對照雙特異性雙抗體(對照DART)稀釋至0.1，和將0.01 ng/mL和50μL的每種稀釋物添加至每個孔(終體積= 200μL)。針對每個時間點(48、72、120和144小時)設置單獨的試驗板並且在37℃下5% CO2培養箱中溫育板。在每個時間點，用CD4、CD8、CD25、CD45、CD33和CD123抗體使細胞染色。在配備CellQuest Pro收集軟體，版本5.2.1的FACS Calibur流式細胞儀(BD Biosciences)中分析標記的細胞。使用Flowjo v9.3.3軟體(Treestar，Inc)進行資料分析。通過對CD4+和CD8+群體門控測量T細胞擴展並且通過測量CD4+和CD8+ -門控的群體上的CD25 MFI測定活化。通過CD45+CD33+門控鑒定白血病胚細胞群體。

AML患者2的初級樣本中的自體腫瘤細胞消耗、T細胞擴展和活化：

為了確定序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)在AML患者原發性患者2樣品仲介導的活性，用0.1或0.01 ng/mL的DART-A溫育患者樣品，並且在處理後的不同時間點測量白血病胚細胞和T細胞的百分數。用DART-A溫育原發性AML骨髓樣品導致隨著時間的白血病細胞群體的消耗(圖16，圖A)，伴隨著殘留T細胞的伴隨擴展(CD4和CD8) (分別為圖16，圖B和圖16，圖C)。為了確定T細胞是否被活化，針對T細胞活化的兩個標記物CD25或Ki-67，將細胞染色。如圖17，圖A和B中所顯示，用DART-A溫育原發性AML骨髓樣品導致T細胞活化。這些資料表示144h時間點。

粒酶B和穿孔蛋白的細胞內染色：

為了確定T細胞中粒酶B和穿孔蛋白的細胞內水準，設置CTL試驗。在約18 h之後，用抗CD4和抗CD8抗體通過在4℃下溫育30分鐘使來自試驗板的細胞染色。表面染色之後，細胞在4℃下在100 μl固定和透化緩衝液中溫育20 min。用透化/洗滌緩衝液洗滌細胞並且在1X Perm(透化)/洗滌緩衝液中製備的50 μL的粒酶B和穿孔蛋白抗體混合物中4℃下溫育30分鐘。然後用250 μl Perm/洗滌緩衝液洗滌細胞並且重懸於Perm/洗滌緩衝液中用於FACS收集。

在重定向殺傷期間通過序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)在T細胞上調粒酶B和穿孔蛋白：

為了研究序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)通過T細胞介導的細胞毒性的可能機制，在重定向殺傷之後測量T細胞中的細胞內粒酶B和穿孔蛋白水準。當T細胞用對照雙特異性雙抗體(對照DART)溫育時，沒有粒酶B和穿孔蛋白的上調。用序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)，在CD8和CD4 T細胞中都觀察到粒酶B和穿孔蛋白水準的上調(圖17，圖C和D)。有趣地，與CD4 T細胞相比，CD8 T細胞中的上調幾乎高兩倍(圖17，圖C和圖17，圖D)。這些資料表示DART-A介導的靶細胞殺傷通過粒酶B和穿孔蛋白通路介導。

十三、實施例13

序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體與非人靈長類CD123和CD3蛋白交叉反應：

為了測量序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)和人或食蟹猴CD3之間的结合程度，進行BIACORETM分析。BIACORETM分析测量解离速率，kd。抗体和其靶之间的结合亲和力(KD)是根据下式结合(结合速率(on rate)，ka)和解离(解离速率(off-rate)，kd)的动力学常数的函数：KD = [kd]/[ka]。BIACORETM分析使用表面等离子体共振以直接测量这些动力学参数。重组人或食蟹猴CD3直接被固定至支持物上。捕获纯化的人或食蟹猴CD123並且固定至支持物。测量解離的時間過程並且進行数据的二价拟合(bivalent fit)。使用1:1结合擬合获得结合常數和亲和力。比较结合人對比食蟹猴CD123和CD3蛋白的BIACORETM分析的结果显示在图18中。对食蟹猴CD123 (图18D)和CD3 (图18B)蛋白的结合亲和力與對人CD123 (图18C)和CD3 (图18A)蛋白的结合亲和力相當。

十四、實施例14

用人和食蟹猴PBMC進行體外自體單核細胞消耗：

來自人或食蟹猴全血樣品的PBMC以150 µL的試驗培養基中200,000細胞/孔的細胞密度添加至U-底板。在試驗培養基中製備序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A或DART-A w/ABD)的稀釋物。將50 µL的每種DART-A或DART-A w/ABD稀釋物添加至包含PBMC的板的兩個孔中。在37℃下溫育板~ 18 - 24 h。上清液用於測定細胞毒性，如上述。如圖19 (圖A和B)中所顯示，在人(圖19，圖A)和食蟹猴PBMC (圖19，圖B)二者中觀察到pDC細胞的消耗。這些結果指示迴圈pDC可在食蟹猴中用作臨床前毒理學研究的藥物動力學標記物。

十五、實施例15

用序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)處理的食蟹猴中的漿細胞樣樹突細胞消耗：

作為發現劑量範圍的毒理學研究的一部分，以0.1、1、10、30、100、300或1000ng/kg劑量，作為4天（4d）輸注對食蟹猴施用序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)。以100 ng/kg施用對照DART。為了鑒定食蟹猴PBMC中的pDC和單核細胞群體，用CD14-FITC抗體標記細胞。單核細胞鑒定為CD14+群體並且pDC鑒定為CD14-CD123+群體。如圖20圖K和L中所顯示，在用少至10 ng/kg DART-A輸注後最早4天消耗pDC。在4d時間點，在對照雙特異性雙抗體- (對照DART)處理的猴子或媒介+載體處理的猴子中沒有看到pDC消耗(圖20，分別為圖G、H、C和D)。在輸注之後4小時（4 hr），測定干擾素-γ、TNF-α、IL6、IL5、IL4和IL2的細胞因數水準。與對照DART或媒介處理的動物相比，在DART-A處理的動物中幾乎沒有細胞因數水準的升高。

圖21和圖22提供對B細胞(CD20+) (圖21，圖A)，單核細胞(CD14+) (圖21，圖B)，NK細胞(CD159+CD16+) (圖21，圖C)，pDC (CD123HI，CD14-) (圖21，圖D)，和T細胞(總的，CD4+，和CD8+) (分別為圖22，圖A，圖22，圖B，和圖22，圖D)的FACS分析的結果。

用對照DART處理猴子對T或B淋巴細胞、NK細胞、單核細胞和pDC沒有顯著的影響。用DART-A以10 ng/kg/d或更高劑量處理猴子導致pDC的消除(圖21，圖D)。pDC的消耗是完全的和持久的，在完成給藥之後的數周回到給藥前水準。當施用DART-A時，T淋巴細胞的迴圈水準下降，但是在每週迴圈結束時回到給藥前水準，表明是運輸(trafficking)的改變而不是真正的消耗。CD4和CD8 T淋巴細胞二者按照相同的模式。T-淋巴細胞活化標記物，CD69 (圖22，圖C)，在迴圈細胞中僅僅是可疑陽性的(marginally positive)，並且不跟蹤DART-A給藥。B淋巴細胞、單核細胞和NK細胞隨著DART-A給藥變動，在猴子中觀察到實質變化。在最高劑量的兩個猴子中都觀察到增加的迴圈水準的B淋巴細胞和單核細胞的趨勢。

總之，上述結果表明了序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)的治療性效力。序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)可用作用於治療多種疾病和病況的治療劑，所述疾病和病況包括：AML、ABL (ALL)、CLL、MDS、pDCL、套細胞白血病、毛細胞性白血病、CLL的Ricter轉化、CML的母細胞危象、BLL (亞型是CD123+) (見實施例2)；自身免疫狼瘡(SLE)、過敏症(嗜鹼性粒細胞是CD123+)、哮喘等。

十六、實施例16

序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)和非序列優化的CD123 xCD3雙特異性雙抗體(DART-B)的可比較性質：

序列優化的CD123xCD3雙特異性雙抗體出人意料的優勢和特性

如上討論，類似地設計DART-A和DART-B並且兩個構建體的第一多肽在從N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD3的單克隆抗體的VL結構域(VL_CD3 )、間插連接體肽(連接體1)、能夠結合CD123的單克隆抗體的VH結構域(VH_CD123 )、連接體2、E-螺旋結構域和C-末端。同樣地，兩個構建體的第二多肽在從N-末端至C-末端方向上包括N-末端、能夠結合CD123的單克隆抗體的VL結構域(VL_CD123 )、間插連接體肽(連接體1)、能夠結合CD3的單克隆抗體的VH結構域(VH_CD3 )、連接體2、K-螺旋結構域和C-末端。

如實施例1中指示，發現CD123 x CD3雙特異性雙抗體能夠同時結合CD3和CD123。另外，如實施例3和圖4，圖C和D中公開，兩種CD123 x CD3雙特異性雙抗體以亞ng/mL範圍實現50%的最大活性(EC50)需要的濃度展示有效的重定向殺傷能力，不考慮具有高CD123表現的靶細胞系中CD3抗原決定部位結合特異性(DART-A對DART-B)。因此，CD123 x CD3雙特異性雙抗體具體序列的微小改變不完全消除生物活性。

但是，在所有測試的細胞系中，發現DART-A比DART-B更有活性和更有效重定向殺傷(見，例如，圖4，圖A、C和D)。因此DART-A展示比類似的DART-B出人意料的優勢。

十七、實施例17

用於治療血液惡性腫瘤的DART-A非人靈長類藥理學：

白介素3 (IL-3)受體α鏈CD123在寬範圍的血液惡性腫瘤中的惡性細胞上過表現(Munoz，L.等(2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86:1261-1269；Testa, U.等(2014) “CD123 Is A Membrane Biomarker And A Therapeutic Target In Hematologic Malignancies,” Biomark. Res. 2:4)，並且與差的預後相關(Vergez, F.等(2011) “High Levels Of CD34+CD38low/-CD123+ Blasts Are Predictive Of An Adverse Outcome In Acute Myeloid Leukemia: A Groupe Ouest-Est Des Leucemies Aigues Et Maladies Du Sang (GOELAMS) Study,” Haematologica 96:1792-1798)。而且，已經報導CD123由白血病幹細胞(LSC)表現(Jordan, C.T.等(2000) “The Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells,” Leukemia 14:1777-1784；Jin，L.等(2009) “ Monoclonal Antibody-Mediated Targeting Of CD123, IL-3 Receptor Alpha Chain, Eliminates Human Acute Myeloid Leukemic Stem Cells,” Cell Stem Cell 5:31-42)，這是吸引人的特徵，該特徵確保靶向這種疾病的根本原因(root cause)。與該結論一致，CD123也參與維持白血病生成的IL-3自分泌環，如通過CD123-阻礙單克隆抗體降低白血病幹細胞移植物移入和改善急性骨髓性白血病(AML)小鼠模型中存活的能力所顯示(Jin, L.等(2009) “Monoclonal Antibody-Mediated Targeting Of CD123, IL-3 Receptor Alpha Chain, Eliminates Human Acute Myeloid Leukemic Stem Cells,” Cell Stem Cell 5:31-42)。但是，在高風險AML患者的1期研究中，單克隆抗體不展示抗白血病活性(Roberts, A. W.等(2010) “A Phase I Study Of Anti-CD123 Monoclonal Antibody (mAb) CSL360 Targeting Leukemia Stem Cells (LSC) In AML,” J. Clin. Oncol. 28 (Suppl):e13012)。因此，包括消耗策略的可選的CD123-靶向方法是期望的。儘管正常造血祖細胞(HPC)的亞型表現CD123，造血幹細胞(HSC)幾乎不表現至不表現CD123 (Jordan，C.T.等(2000) “The Interleukin-3 Receptor Alpha Chain Is A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells,” Leukemia 14:1777-1784；Jin，W.等(2009) “Regulation Of Th17 Cell differentiation And EAE Induction By MAP3K NIK,” Blood 113:6603-6610)，表明CD123細胞-消耗策略允許經正常造血作用進行重構。

使得患者自身的T淋巴細胞靶向白血病細胞代表了有希望的治療血液惡性腫瘤的免疫治療策略。該方法的治療潛能已經使用患有B細胞淋巴瘤和B-前驅物急性成淋巴細胞白血病的患者中的blinatumomab (能夠結合CD3和B細胞CD19抗原的基於雙特異性抗體的BiTE)被嘗試過(Klinger，M.等(2012) “Immunopharmacologic Response Of Patients With B-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia To Continuous Infusion Of T Cell-Engaging CD19/CD3-Bispecific BiTE Antibody Blinatumomab,” Blood 119:6226-6233；Topp，M.S.等(2012) “Long-Term Follow-Up Of Hematologic Relapse-Free Survival In A Phase 2 Study Of Blinatumomab In Patients With MRD In B-Lineage ALL,” Blood 120:5185-5187；Topp，M.S.等(2011) “Targeted Therapy With The T-Cell-Engaging Antibody Blinatumomab Of Chemotherapy-Refractory Minimal Residual Disease In B-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia Patients Results In High Response Rate And Prolonged Leukemia-Free Survival,” J. Clin. Oncol. 29:2493-2498)。

本發明的CD123 x CD3雙特異性雙抗體分子，比如DART-A，包括可選的基於雙特異性抗體的模式(modality)，其提供改善的穩定性和更有力的製造性質(Johnson，S.等(2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399:436-449；Moore，P.A.等(2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117:4542-4551)。

為了表明本發明CD123 x CD3雙特異性雙抗體分子的卓越性和效力，確認了上述DART-A的在體外和白血病的臨床前模型中的生物活性，並且相對於上述對照DART (對CD3和螢光素雙特異性)或對CD123和螢光素雙特異性)的“對照DART-2”，在短尾猴(cynomolgus macaques) (短尾猿，Macaca fascicularis)中評估了其藥代動力學，藥物動力學和安全藥理學。

“對照DART-2”的第一多肽鏈的氨基酸序列(CD123VL ─連接體─ 4-4420VH ─連接體─ E-螺旋；連接體加底線) (SEQ ID NO:58) ： DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY PYTFGQGTKL EIKGGGSGGGGEVKLDETGG GLVQPGRPMK LSCVASGFTF SDYWMNWVRQ SPEKGLEWVA QIRNKPYNYE TYYSDSVKGR FTISRDDSKS SVYLQMNNLR VEDMGIYYCT GSYYGMDYWG QGTSVTVSSG GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEK

“對照DART-2”的第二多肽鏈的氨基酸序列(4420VL ─連接體─ CD123VH ─連接體─ K-螺旋) (SEQ ID NO:59)： DVVMTQTPFSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPK VLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVP WTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFT DYYMKWVRQAPGQGLEWIGDIIPSNGATFYNQKFKGRVTITVDKSTSTAY MELSSLRSEDTAVYYCARSHLLRASWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGGKVAA LKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

雙功能ELISA：

在室溫下，用PBS (PBST/BSA)中的0.5% BSA、0.1% Tween-20封閉用碳酸氫鹽緩衝液中可溶性人或食蟹猴IL3R- α (0.5 μg/mL)塗覆過夜的MaxiSorp ELISA板(Nunc) 30分鐘。施加DART-A分子，隨後連續添加人CD3εδ-生物素和鏈黴抗生物素HRP (Jackson ImmunoResearch)。通過將四甲基聯苯胺(BioFX)轉化為底物5 min檢測HRP活性；用40µL/孔的1% H2SO4終止反應並且在450 nm下讀取吸光度。

表面等離子體共振分析：

使用BIAcore 3000生物感測器(biosensor) (GE，Healthcare)分析DART-A結合人和食蟹猴CD3或CD123蛋白的能力，如Johnson，S.等(2010) (“Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399:436-449)和Moore，P.A.等(2011) (“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117:4542-4551)描述。簡言之，通過注射0.2M N-乙基-N-(3二乙氨基-丙基)碳二亞胺和0.05M N-羥基-琥珀醯亞胺活化CM5感測器晶片上的羧基基團。將可溶性CD3或CD123 (1μg/ml)注射在10mM鈉-乙酸酯，pH 5.0中的活化的CM5表面上，流速為5 μL/min，隨後注射1 M乙醇胺用於鈍化。在10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA和0.005% P20表面活性劑中進行結合實驗。通過脈衝注射10mM甘氨酸，pH 1.5進行固定的受體表面的再生。通過將結合曲線整體擬合至Langmuir 1:1結合模型測定KD值(BIA評估軟體v4.1)。

細胞殺傷試驗：

用於細胞殺傷試驗的細胞系獲得自美國菌種保藏中心(ATCC) (Manassas，VA)。使用Ficoll-Paque Plus試劑盒(GE Healthcare)，將PBMC從健康的供體血液分離；用陰性選擇試劑盒(Life Technologies)純化T細胞。使用Quantum Simply細胞珠(Bangs Laboratories，Inc.，Fishers，IN)測定CD123細胞-表面密度。如Moore，P.A.等描述，進行細胞毒性試驗(2011) (“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117:4542-4551)。簡言之，用連續稀釋的DART-A或對照DART蛋白質在存在T細胞的情況下以指示的效應細胞：靶細胞比處理靶細胞系(105細胞/mL)，並且在37℃溫育過夜。隨著培養物上清液中乳酸脫氫酶(LDH，Promega)的釋放測定細胞殺傷。對於基於流式(flow-based)的殺傷，用CMTMR (Life Technologies)標記靶細胞並且使用FACSCalibur流式細胞儀監測細胞殺傷。通過使用PRISM® 5軟體(GraphPad)分析資料並且表示為細胞毒性百分數。

食蟹猴藥理學：

在Charles River實驗室(Reno，NV)根據當地機構動物管理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)的指南進行非人靈長類實驗。使用電池供電的可程式設計輸注泵(CADD-Legacy®，SIMS Deltec, Inc., St. Paul, MN)，通過股和頸靜脈埠經靜脈內輸注向為目的飼養的、中國起源的幼稚(naïve)食蟹猴(Macaca fascicularis) (年齡範圍2.5-9年，體重範圍2.7-5kg)提供媒介或DART-A。在指定的時間點將外周血或骨髓樣品收集在包含抗凝血劑的管中。用配備488nm、640nm和405nm雷射器的LSR Fortessa分析器(BD Biosciences)和下述抗體進行細胞-表面表型分析：CD4-V450、CD8-V450、CD123-PE-Cy7、CD45-PerCP、CD4-APC-H7、CD8-FITC、CD25-PE-Cy7、CD69-PerCP、PD-1-PE、TIM3-APC、CD3-Pacific Blue、CD95-APC、CD28-BV421、CD16-FITC、CD3-Alexa488、CD38-PE、CD123-PE-Cy7、CD117-PerCP-Cy5.5、CD34-APC、CD90-BV421、CD45RA-APC -H7和CD33-APC (BD Biosciences)。使用TruCOUNT (BD Biosciences)測定細胞的絕對數目。用非人靈長類Th1/Th2細胞因數細胞計數珠陣列試劑盒(Cytokine Cytometric Bead Array Kit) (BD Bioscience)測量IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α和IFN-γ細胞因數的血清水準。使用具有電化學發光檢測(MesoScale Diagnostics，MSD，Rockville，MD)的夾心免疫測定測量猴子血清樣品中DART-A的濃度。簡言之，用重組人IL-3 Ra (R&D System)塗覆試驗板(MSD)並且用5 % BSA封閉。施加校準標準品或稀釋測試樣品，隨後添加顯示對上述分子的E-螺旋(SEQ ID NO:34)和K-螺旋(SEQ ID NO:35)結構域特異性結合的生物素化的單克隆抗體。添加SULFO-TAG™標記的鏈黴抗生物素綴合物(MSD)，並且在MSD SECTOR®成像器中分析複合物的形成。從通過將光強度資料擬合在五參數邏輯模型中產生的標準曲線測定DART-A濃度。

純化的DART-A的物理化學表徵顯示分子量為58.9 kDa的均質異源二聚物(圖23；圖24A-24B)，其在2–8℃下PBS中穩定多達12個月。SPR分析表明DART-A與對應的可溶性人和食蟹猴CD3和CD123抗原幾乎相同的結合親和力(圖25A-25D和表7)。此外，DART-A同時結合採用用於捕獲的人或猴子CD123和用於檢測的人CD3的ELISA形式的抗原(圖26A-26B)，並且表明與人和猴子T淋巴細胞類似的結合(圖26C-26E)。表7中的資料是3個獨立實驗的平均值，每個實驗重複一次。

DART-A通過人或食蟹猴T淋巴細胞介導重定向殺傷：

DART-A通過抗CD123+ Kasumi-3白血病細胞系的人或猴子效應細胞介導重定向靶細胞殺傷(圖27A-27D)，其伴隨著活化標記物的誘導。沒有觀察到抗CD123-陰性靶標(U937細胞)的活性或用對照DART的活性，表明T細胞活化嚴格依賴於靶細胞結合，並且CD3通過DART-A的單價結合不足以觸發T細胞活化。因為CD123被包括pDC和單核細胞的正常迴圈白細胞的亞型表現(圖27E)，所以進一步研究正常人和猴子PBMC中的DART-A的作用。

在人PBMC中觀察到分級作用，早在開始處理後的3小時觀察到CD14-CD123高細胞(pDC和嗜鹼性粒細胞)的劑量依賴性快速消耗，而單核細胞(CD14+細胞)此時間點仍不受影響(圖27F-27G)。CD14-CD123高細胞消耗在所有DART-A分子濃度下隨著時間增加，而單核細胞到6小時稍微下降並且僅僅在18小時之後並且濃度大於1 ng/mL時被消耗。用DART-A溫育猴子PBMC導致相當的CD14-CD123高細胞的劑量依賴性消耗(圖27H)，進一步支持該種類對DART-A藥理學的相關性(CD14+猴子細胞幾乎不表現至不表現CD123並且不被消耗)。

食蟹猴中的DART-A的藥代動力學：

食蟹猴被選擇為用於DART-A分析的合適藥理學模型，這是基於兩個靶抗原在該物種中相比于在人中的等價分佈，其中在人中的分佈是基於用前驅物mAb的免疫組織化學，與公開的資訊一致(Munoz，L.等(2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86:1261-1269；Korpelainen, E.I.等(1996) “IL-3 Receptor Expression, Regulation And Function In Cells Of The Vasculature,” Immunol. Cell Biol. 74:1-7)。

根據本發明進行的研究包括6個治療，每組由8個食蟹猴(4雄性，4雌性)組成(表8)。所有的組第一次輸注接收媒介對照；然後靜脈內施用媒介或DART-A，達4個周週期（4 weekly cycles）。第1組動物的所有4次隨後的輸注均接收媒介對照，而第2-5組對於所有隨後的輸注均接收每週逐漸增加劑量的DART-A，一周4天。第6組動物對於所有的輸注均以每週7-天連續的逐漸增加劑量的DART-A處理。設計4-天-輸注/3-天-不輸注和7-天-輸注計畫以區分與DART-A施用相關的持久性作用和瞬間作用。在處理期結束時(第36天)，處死每組的兩個雄性和2個雌性，而剩餘的猴子在4-周恢復後(第65天)進行屍體剖檢。猴子的亞群發展了針對CD3和CD123二者的人源化Fv的抗藥物抗體(ADA)並且從PK分析中排除在出現ADA之後的資料點。在研究期間，所有的猴子暴露於DART-A。

二室模型用於評估PK參數(表9和圖28)。T1/2α短(4-5min)，反映與循環靶標快速結合；T1/2β也是快速的，如對該尺寸的分子預期的，其遭受腎清除。在每次輸注結束時從第6組猴子收集的血清樣品的分析顯示DART-ACmax的劑量依賴性增加。表9中，媒介是PBS，pH 6.0，含有0.1 mg/mL重組人白蛋白、0.1 mg/mL PS-80和0.24 %苯甲醇，其在各輸注周的前4天期間用於所有媒介輸注，然後各個周輸注的剩餘3天輸注不含苯甲醇的相同製劑。隨著連續IV輸注pH 6.0，包含0.1 mg/mL重組人白蛋白、0.1 mg/mL PS-80和0.24 %苯甲醇PBS溶液，以需要的濃度施用指定次數的DART-A。

DART-A-處理的食蟹猴中的細胞因數釋放：

基於之前的類似化合物的經驗，考慮到DART-A的T細胞活化性質，預期伴隨著輸注的迴圈細胞因數的增加，因此低的開始劑量被用作“脫敏”策略(見，例如，Topp，M.S.等(2011) “Targeted Therapy With The T-Cell-Engaging Antibody Blinatumomab Of Chemotherapy-Refractory Minimal Residual Disease In B-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia Patients Results In High Response Rate And Prolonged Leukemia-Free Survival,” J. Clin. Oncol. 29:2493-2498；Bargou, R.等(2008) “Tumor Regression In Cancer Patients By Very Low Doses Of A T Cell-Engaging Antibody,” Science 321:974-977)。測試的細胞因數中，IL-6顯示輸注後的最小量級的最大改變，儘管本質上是暫態的，並且具有大的動物間和組間不同(圖29A-29C)。在媒介輸注之後也觀察到IL-6小的暫態增加(所有的第1組和所有的第1天輸注)，指示該細胞因數對操作應激的敏感性。但是，在第一次DART-A輸注(100ng/kg/天)之後，在一些猴子中看到血清IL-6的DART-A-依賴性增加(＜80pg/mL)，其到72小時回到基線。有趣地，IL-6釋放的量級隨著各連續DART-A輸注而下降，甚至在劑量水準增加至多達1000 g/kg/天時。也觀察到血清TNF-α (＜10pg/mL)的最小和暫態DART-A相關的增加；如利用IL-6，在第一次輸注之後觀察到TNF-α釋放的最大量級。當與對照比較時，在整個研究中，IL-5、IL-4、IL‑2或IFN-γ的水準沒有DART-A相關的改變。總之，回應用DART-A處理猴子的細胞因數釋放是最小的、暫態的並且表示經受試者內劑量遞增易控制的第一劑量作用。

DART-A介導的迴圈CD14-/CD123+白細胞的體內消耗：

遍及整個研究測量CD14-/CD123+細胞的迴圈絕對水準作為藥效終點。儘管對照組1中的CD123+細胞數量長時間保持穩定，在遍及所有活性治療組的所有動物中，DART-A處理與可從開始第一次DART-A輸注(100 ng/kg/天)之後的第一時間點測量的(72小時)觀察到的迴圈CD14-/CD123+細胞的劇烈消耗相關(從研究前基線的94-100%) (圖30A-30C)。消耗是持久的，因為其在第2-5組中在每週3-天給藥假期期間持續，僅僅在延長的恢復期間回到基線水準。為了消除DART-A掩蓋或調節CD123的可能性(考慮到低的迴圈DART-A水準，這不太可能發生)，通過正交標記物CD303對pDC計數。與CD123資料一致，CD303+ pDC在用DART-A處理的猴子中類似地被消耗(圖30D-30F)。

迴圈T-淋巴細胞水準，活化和亞型分析：

與迴圈CD123+細胞持續的消耗相反，按照4-天-輸注/3-天-不輸注計畫施用的DART-A (組2-5)與迴圈T細胞的每週波動相關，而作為連續7-天輸注的施用導致在第一次施用之後類似地降低的迴圈T細胞水準，其甚至在給藥期間也緩慢恢復而沒有波動(圖31A-31C)。兩個給藥策略之間的差異指示DART-A對T淋巴細胞的作用與運輸和/或邊緣化(margination)一致，而不與消耗一致。停止給藥之後，在恢復期的期間中， T細胞反彈至高於基線約2倍的水準。DART-A的輸注與表現晚期活化標記物PD-1，尤其是在CD4+細胞中，的T細胞的暴露-依賴性、逐漸增加的頻率相關，其中第6給藥組展示最高的總體水準(圖31D-31I和圖32A-32F和圖33A-33F)。在CD4+ T細胞上沒有檢測到與T細胞枯竭相關的標記物Tim-3，並且在CD8+細胞(5.5-9.7%)和包括20.5-35.5%的CD8+/PD-1+雙陽性細胞中為為低頻率。在迴圈細胞中，在早期T細胞活化標記物CD69中沒有一致的變化，並且僅CD25表現有適度變化。

為了排除體內暴露後的枯竭，比較分離自接收多次DART-A輸注的食蟹猴的效應細胞的離體細胞毒素潛能與來自幼稚猴的細胞的離體細胞毒素潛能。如圖34中所顯示，分離自DART-A處理的猴子的PBMC顯示與分離自幼稚猴子的細胞相當的細胞毒性，指示體內暴露於DART-A未不利影響T細胞殺傷靶細胞的能力。

DART-A暴露以對應的幼稚T細胞群體為代價增加中心記憶CD4細胞和效應記憶CD8+細胞的相對頻率(圖35A-35F和圖32A-32F和圖33A-33F)，指示DART-A暴露促進這些細胞的擴展和/或活動。

對血細胞生成和骨髓前驅物的影響：

DART-A在以所有劑量測試的猴子中非常耐受；但是，在最高劑量下觀察到了紅細胞參數的可逆減少(圖36A-36C)。頻繁血液取樣可能已經成為潛在的貢獻因素，因為媒介處理的動物顯示紅細胞群的中等下降。在所有動物中觀察到了網狀細胞應答；但是，在最高暴露下(第6組)，對於紅細胞群的類似減少，應答似乎沒有那麼強(圖36D-36F)。遍及整個研究的骨髓塗片的形態學分析是普通的。但是，流式細胞術分析揭示，在給藥期結束時，在DART-A處理的動物中，不成熟譜系-陰性(Lin-)骨髓群體中的CD123+細胞的頻率下降，到恢復時間結束時回到基線水準(圖37A-37B)。HSC (定義為Lin-/CD34+/CD38-/CD45RA-/CD90+細胞(Pang, W.W.等(2011) “Human Bone Marrow Hematopoietic Stem Cells Are Increased In Frequency And Myeloid-Biased With Age,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 108:20012-20017))顯示大的組間變化；與對應的給藥前水準相比，第4-6組DART-A處理的猴子顯示一些明顯的下降，但是，與媒介處理的動物相比，在所有的處理的組中沒有看到下降。這些資料指示HSC不易受DART-A靶向的影響並且與觀察的DART-A處理對血細胞生成的不利作用的可逆性一致。

如上表明，就按照每週4-天-輸注/3-天-不輸注的計畫或7-天-輸注計畫的輸注4周，以100ng/kg/天的開始劑量，每週逐步增加至300、600和1,000ng/kg/天而言，施用DART-A至食蟹猴是良好耐受的。在第一次施用開始之後觀察迴圈CD123+細胞，包括pDC的消耗，其在整個研究中在所有劑量和計畫下均持續。也觀察到骨髓CD123+前驅物的可逆減少。細胞因數釋放，作為CD3-靶向療法的重要安全性考慮，似乎是可控的並且與第一-劑量作用一致。在最高劑量下注意到中度可逆貧血，但沒有注意到其他(中靶或脫靶)不利事件。

考慮到直向同源物之間的高同源性和DART-A以類似的親和性與抗原結合並且在兩個物種仲介導重定向T細胞殺傷的能力，食蟹猴是DART-A藥理學評估的合適動物模型。此外，兩種抗原在猴子和人中，包括通過造血前驅物的類似表現和多個組織中內皮細胞的細胞質中協調表現。較例外的是在人而不是猴子睾丸間質細胞中的表現，以及與人相比在猴子中的CD123水準低-至-不存在。

與涉及T細胞活化的治療性策略相關的主要考慮包括細胞因數的釋放和脫靶細胞毒素作用。用具有二價CD3識別的CD3xCD123雙特異性scFv免疫融合(immunofusion)構建體進行的最近的研究顯示體外抗白血病活性，但是造成T細胞的非特異性活化和IFN-γ分泌(Kuo，S.R。等(2012) “Engineering A CD123xCD3 Bispecific scFv Immunofusion For The Treatment Of Leukemia And Elimination Of Leukemia Stem Cells,” Protein Eng. Des. Sel. 25:561-569)。每個結合臂的單價性質和DART-A的高度均質單體形式確保T細胞活化專有地依賴於靶細胞結合：在沒有靶細胞的情況下或通過使用僅僅包括CD3-靶向臂的對照DART分子沒有觀察到T細胞活化。此外，高劑量(多達100ug/kg/天)的對照DART分子不觸發食蟹猴中的細胞因數釋放。

100ng/kg/天的DART-A分子開始劑量是良好耐受的，具有最小的細胞因數釋放。但是，在高的開始劑量(5μg/kg/天)下部出現細胞因數劇烈釋放(storm)；然而，經逐步的每週劑量增加可安全達到這種劑量，指示DART-A介導的細胞因數釋放似乎主要是第一-劑量作用。CD123+靶細胞的消耗，從而消除CD3連接源，可闡釋第一-劑量作用：在低至3-10ng/kg/天的劑量下觀察到幾乎完全的CD123+細胞消耗，指示在與細胞毒性相比改變的劑量應答之後體內細胞因數釋放。細胞毒性的劑量應答曲線和人T細胞釋放的細胞因數也與該觀察一致。

其中DART-A-誘導的PD1上調可起作用的T細胞脫敏好像也有助於在第一次輸注DART-A之後限制細胞因數釋放。最近的研究顯示，在炎症位元點的抗原-誘導的T細胞捕獲(arrest)之後增加的PD-1表現通過與PD-L1相互作用，有助於使停止信號終止，因此使細胞釋放和脫敏(Honda，T。等(2014) “Tuning Of Antigen Sensitivity By T Cell Receptor-Dependent Negative Feedback Controls T Cell Effector Function In Inflamed Tissues,” Immunity 40:235-247；Wei, F.等(2013) “Strength Of PD-1 Signaling Differentially Affects T-Cell Effector Functions,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 110:E2480-E2489)。TCR信號傳導強度的PD-1抵消不均勻：而增殖和細胞因數產生好像對PD-1抑制最敏感，細胞毒性最不受影響(Wei, F.等(2013) “Strength Of PD-1 Signaling Differentially Affects T-Cell Effector Functions,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 110:E2480-E2489)。一致地，來自暴露於多次DART-A輸注的猴子的T細胞的離體細胞毒素潛能與來自幼稚猴子的T細胞的相當，儘管前者中增加的PD-1水準。此外，PD-1上調不伴隨著TIM3表現，其是T細胞枯竭的特點，如暴露於CD3抗體或慢性感染的延長刺激的T細胞所顯示(Gebel, H.M.等(1989) “T Cells From Patients Successfully Treated With OKT3 Do Not React With The T-Cell Receptor Antibody，” Hum. Immunol. 26:123-129；Wherry, E.J. (2011) “T Cell Exhaustion” Nat. Immunol. 12:492-499)。

DART-A處理的猴子中迴圈CD123+細胞的消耗是快速的，並且以4-天-輸注/3-天-不輸注的計畫在每週給藥假期期間是持續的，與靶細胞消除一致。相反，迴圈T細胞的暫態波動可能是作為DART-A的功能從組織和淋巴器官運輸或運輸至組織和淋巴器官的結果。DART-A暴露促進經歷T淋巴細胞的抗原的擴展和/或活動，所述細胞優選是組織的發源地(home)並且更容易發揮細胞毒素效應功能(Mirenda, V.等(2007) “Physiologic And Aberrant Regulation Of Memory T-Cell Trafficking By The Costimulatory Molecule CD28,” Blood 109:2968-2977；Marelli-Berg，F.M.等(2010) “Memory T-Cell Trafficking: New Directions For Busy Commuters,” Immunology 130:158-165)。

CD123+正常細胞的消耗可攜帶潛在的易感性。相比單核細胞和嗜伊紅粒細胞中的低水準，pDC和嗜鹼性粒細胞表現高水準的CD123 (Lopez，A.F.等(1989) “Reciprocal Inhibition Of Binding Between Interleukin 3 And Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating因數To Human Eosinophils,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:7022-7026；Munoz，L.等(2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86:1261-1269；Masten，B.J.等(2006) “Characterization Of Myeloid And Plasmacytoid Dendritic Cells In Human Lung,” J. Immunol. 177:7784-7793；Korpelainen，E.I.等(1995) “Interferon-Gamma Upregulates Interleukin-3 (IL-3) Receptor Expression In Human Endothelial Cells And Synergizes With IL-3 In Stimulating Major Histocompatibility Complex Class II Expression And Cytokine Production,” Blood 86:176-182)。pDCs已經顯示在控制小鼠或猴子的感染模型中的某些病毒起作用，儘管它們對控制針對流感的免疫應答似乎不是關鍵的(Colonna, M.等(1997) “Specificity And Function Of Immunoglobulin Superfamily NK Cell Inhibitory And Stimulatory Receptors,” Immunol. Rev. 155:127-133；Smit, J.J.等(2006) “Plasmacytoid Dendritic Cells Inhibit Pulmonary Immunopathology And Promote Clearance Of Respiratory Syncytial Virus,” J. Exp, Med. 203:1153-1159)。在腫瘤模型中，pDC可促進腫瘤生長和轉移，而pDC消耗導致腫瘤抑制(Sawant, A.等(2012) “Depletion Of Plasmacytoid Dendritic Cells Inhibits Tumor Growth And Prevents Bone Metastasis Of Breast Cancer Cells,” J. Immunol. 189:4258-4265)。在用DART-A處理的一些猴子中觀察到了暫態、中度、劑量非依賴性面部腫脹；但是，在這些猴子中或當人嗜鹼性粒細胞經DART-A介導的T細胞殺傷溶解時沒有觀察到增加的組胺水準。單核細胞消耗可攜帶增加的感染風險；因此應監測人中pDC、嗜鹼性粒細胞或嗜伊紅粒細胞消耗的結果。

表現CD123的定向造血前驅物，比如常見的髓性前驅物(CMP) (Jordan，C.T.等(2000) “The Interleukin-3 Receptor Alpha ChainIs A Unique Marker For Human Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells,” Leukemia 14:1777-1784；Rieger, M.A.等(2012) “Hematopoiesis,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4:a008250)，可被DART-A靶向，這是以最高劑量施用DART-A之後觀察到的中度貧血的一種可能的解釋。紅細胞生成的網狀細胞應答好像在所有DART-A劑量水準起作用；但是，對於紅細胞參數的相應下降，經歷最大DART-A暴露的動物(組6，7-天-輸注)顯示降低的網狀細胞應答，提示對前驅物(例如，CMP)可能的細胞毒素活性。在停止DART-A處理之後該作用是可逆的，與從剩餘(spared)CD123低/陰性HSC的再生一致。

消耗CD123+細胞的可選方法包括第二代CD123-特異性Fc-增強的單克隆抗體(Jin，L.等(2009) “Monoclonal Antibody-Mediated Targeting Of CD123, IL-3 Receptor Alpha Chain, Eliminates Human Acute Myeloid Leukemic Stem Cells,” Cell Stem Cell 5:31-42；Roberts, A. W.等(2010) “A Phase I Study Of Anti-CD123 Monoclonal Antibody (mAb) CSL360 Targeting Leukemia Stem Cells (LSC) In AML,” J. Clin. Oncol. 28 (Suppl):e13012)，IL-3結合的白喉毒素(Frankel，A。等(2008) “Phase I Clinical Study Of Diphtheria Toxin-Interleukin 3 Fusion Protein In Patients With Acute Myeloid Leukemia And Myelodysplasia,” Leuk. Lymphoma 49:543-553)，細胞因數-誘導的、表現CD123特異性嵌合抗原受體(CAR)的殺傷(CIK)細胞 (Tettamanti，S.等(2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401)和CD123 CAR T細胞(Gill，S.等(2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,” Blood 123 (15): 2343-2354；Mardiros，A.等(2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,” Blood 122:3138-3148)。CAR T細胞在彌散性AML異源模型中展示有力的體外白血病母細胞殺傷和抗白血病活性(Mardiros，A.等(2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,” Blood 122:3138-3148)。最近的研究報導在CD123 CAR T細胞轉移之後移植人CD34+細胞的NSG小鼠中正常造血作用消除(Gill，S.等(2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,” Blood 123 (15): 2343-2354)，儘管其他人還未觀察到類似的體外或體內效果(Tettamanti，S.等(2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401；Pizzitola，I.等(2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62)。在上面討論的實驗中，觀察到了CD123+骨髓前驅物群體的消耗，但是其在恢復期間逆轉；此外，在所有測試的DART-A劑量水準，該少數群體的消耗不導致骨髓細胞性或類紅細胞與髓樣細胞(E:M)比的改變。這些差異強調了DART-A相對於細胞療法的潛在優勢，因為其提供依賴於自體T細胞的可滴定系統，與可能更難以控制的“超動力(supercharged)”離體轉導細胞形成對比。CD123在多種血液惡性腫瘤，包括AML、毛細胞性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅生物(BPDCNs)、B-前驅物急性成淋巴細胞白血病(B-ALL)和慢性淋巴細胞性白血病的亞型、霍奇金疾病Reed-Stemberg細胞中，以及在骨髓增生異常綜合症和系統性肥大細胞增多症中過表現(Kharfan-Dabaja, M.A.等(2013) “Diagnostic And Therapeutic Advances In BlasticPlasmacytoid Dendritic Cell Neoplasm: A Focus On Hematopoietic Cell Transplantation,” Biol. Blood Marrow Transplant,” 19:1006-1012；Florian, S.等(2006) “Detection Of Molecular Targets On The Surface Of CD34+/CD38-- Stem Cells In Various Myeloid Malignancies,” Leuk. Lymphoma；Munoz，L.等(2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86:1261-1269；Fromm, J.R. (2011) “Flow Cytometric Analysis Of CD123 Is Useful For Immunophenotyping Classical Hodgkin Lymphoma,” Cytometry B Clin. Cytom. 80:91-99)。在非人靈長類中觀察到的可預測的藥效活性和可控制的安全性特徵進一步支援了DART-A作為這些病症的免疫療法的臨床效用和效力。

總之，DART-A是基於抗體的分子，其結合TCR的CD3ε亞單位，以重定向抵抗表現在多種血液惡性腫瘤中被上調的抗原CD123的細胞的T淋巴細胞。DART-A以類似的親和力結合人和食蟹猴二者的抗原並且將來自兩個物種的T細胞重定向以殺傷CD123+細胞。用每週逐漸增加劑量的DART-A一周輸注4或7天的猴子在處理啟動之後72h顯示迴圈CD123+細胞的消耗，其在4周處理期間持續，與給藥計畫無關。也出現迴圈T細胞的下降，但是在按照4-天劑量計畫的猴子中隨後的輸注之前恢復至基線，與DART-A介導的活動一致。DART-A施用增加迴圈PD1+，但是不增加TIM-3+T細胞；此外，來自處理的猴子的T細胞的離體分析顯示未改變的重定向靶細胞溶解，指示沒有枯竭。在DART-A第一次輸注之後，而不是在隨後施用——即使在劑量逐漸增加時——之後，毒性限於細胞因數的最小暫態釋放，和伴隨CD123+骨髓祖先的減少的紅細胞群的最小可逆下降。血液惡性腫瘤中DART-A的臨床測試似乎被批准。

本說明書提到的所有出版物和專利通過參考併入本文，如同好像具體和單獨指出每個單個出版物或專利申請通過參考以其整體併入的程度。儘管已經結合其具體實施方式描述了本發明，但是應當理解，其能夠被進一步修飾並且本申請旨在覆蓋根據本發明原理的本發明的任何變型、用途或改變，並且包括與本公開的偏離，只要在本發明所屬領域的已知或習慣實踐內並且如可應用至本文之前所闡釋的本質特徵。

HSC‧‧‧造血幹細胞

LSC‧‧‧白血病幹細胞

AML‧‧‧急性髓細胞樣白血病

VL‧‧‧結構域

VH‧‧‧結構域

BM MNC‧‧‧骨髓單核細胞

MFI‧‧‧平均螢光強度

PBMC‧‧‧外周血單核細胞

ALL‧‧‧患者

PBS‧‧‧磷酸鹽緩衝液

4d‧‧‧4天

4hr‧‧‧4小時

EOI‧‧‧輸注結束

PreD1‧‧‧第1天開始

PreD8‧‧‧第8天開始

PreD16‧‧‧第16天開始

PreD29‧‧‧第29天開始

PreD36‧‧‧第36天開始

PreD43‧‧‧第43天開始

圖1顯示已知CD123表現在白血病幹細胞上。圖2闡釋本發明的雙鏈CD123 x CD3雙特異性單價雙抗體的第一和第二多肽鏈的結構。圖3A和3B闡釋本發明的三鏈CD123 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體的第一、第二和第三多肽鏈的兩種形式(version)的結構(形式1，圖3A；形式2，圖3B)。圖4 (圖A-E)顯示不同的CD123 x CD3雙特異性雙抗體介導T細胞重定向（redirected）的殺傷展示不同量CD123的靶細胞的能力。該圖提供劑量回應曲線，其指示在以10:1的E:T (效應器：靶)比例下，在多個靶細胞類型：RS4-11 (圖A)；TF-1 (圖B)；Molm-13 (圖C)；Kasumi-3 (圖D)；和THP-1 (圖E) 中，具有白蛋白結合結構域的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(“DART-A”) (具有ABD的DART-A “w/ABD”)顯示比對照雙特異性雙抗體(對照DART)或非序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(“DART-B”)更大的細胞毒性。圖5 (圖A-D)顯示序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)，具有白蛋白結合結構域的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(具有ABD的DART-A “w/ABD”)和具有免疫球蛋白IgG Fc結構域的序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(具有Fc的DART-A“w/Fc”)重定向殺傷靶細胞期間介導T細胞活化的能力。該圖示出劑量回應曲線，其顯示DART-A、DART-A w/ABD和DART-A w/Fc在Kasumi-3 (圖A)和THP-1 (圖B)細胞和純化CD8 T細胞中以10:1的E:T (效應細胞:靶細胞)比介導的細胞毒性(18小時溫育)。圖C和D顯示在存在(圖D)和沒有(圖C)靶細胞的情況下，使用CD8 T細胞上標記物CD25的T細胞活化的劑量回應曲線。圖6 (圖A-B)顯示以10:1的E:T比，在存在Kasumi-3靶細胞和靜息T細胞的情況下，在用序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A) (圖A)或對照雙特異性雙抗體(對照DART) (圖B)處理之後CD4和CD8 T細胞中的粒酶B和穿孔蛋白水準。圖7 (圖A-B)顯示以納克每千克劑量水準，序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)的體內抗腫瘤活性。MOLM-13細胞(中等CD123表現)與T細胞共混合並且在NSG小鼠中皮下注入(T:E 1:1)。注入開始時，每天靜脈內處理一次共8天(QDx8)。各種濃度的DART-A與對照雙特異性雙抗體(對照DART)比較。圖A顯示單獨Molm-13細胞或與T細胞一起，和各種劑量的DART-A對甚至至超過30天時間時腫瘤體積的影響。圖B顯示增加劑量的DART-A對接收MOLM-13細胞和T細胞(T:E 1:1)共0-18天時間段的NSG小鼠中觀察到的腫瘤體積的影響。圖8顯示序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)對RS4-11細胞(具有單核細胞特徵的ALL)的體內抗腫瘤活性。細胞與T細胞共混合並且在NSG小鼠中皮下注入(T:E 1:1)。注入開始時，每天靜脈內處理一次共4天(QDx4)。各種濃度的DART-A與對照雙特異性雙抗體(對照DART)比較。圖9 (圖A-B)顯示來自AML患者1 (圖A)的骨髓單核細胞(BM MNC)和外周血單核細胞(PBMC)中的CD123+胚細胞與Kasumi-3 AML細胞系(圖B)的比較。圖10 (圖A-C)顯示能力序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)以下的能力：在120h時介導原發性AML中胚細胞下降(圖A)、在120h時驅動原發性AML中的T細胞擴展(圖B)和在48h和72 h時誘導AML中T細胞活化(圖C)。圖11 (圖A-H)顯示在ALL PBMC的初級樣品中CD123+胚細胞群體的鑒定。圖A和E顯示正常PBMC (圖A)和ALL PBMC (圖E)的輸入群體的正向分散(scatter)和側向分散。圖B和F顯示作為主要B細胞(圖B)和白血病胚細胞(圖F)的淋巴細胞群體的鑒定。圖C和G顯示作為CD123+的淋巴細胞的群體的鑒定。圖D和H顯示CD19+細胞和CD123+細胞的鑒定。圖12 (圖A-B)顯示ALL PBMC的初級樣品中T細胞的CD4和CD8群體的鑒定。圖A顯示輸入ALL PBMC的正向分散和側向分散。圖B顯示樣品中存在的T細胞的CD4或CD8群體。數字指示CD4 T細胞占ALL PBMC樣品中存在的總細胞的約0.5%和CD8 T細胞占總細胞的約0.4%。圖13 (圖A-H)顯示序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)用自體CTL介導ALL胚細胞消耗的能力。圖A和E顯示正常PBMC (圖A)和ALL PBMC(圖E)的輸入群體的正向分散和側向分散。PBMC未處理(圖B和F)、用對照雙特異性雙抗體(對照DART)處理(圖C和G)或用DART-A處理(圖D和H)，並且溫育7天隨後對CD34和CD19染色。圖14 (圖A-L)顯示序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)在正常PBMC (圖A-F)和ALL PBMC (圖G-L)仲介導T細胞擴展(圖A，B，C，G，H和I)和活化(圖D，E，F，J，K和L)的能力。細胞未處理(圖A，D，G和J)、或用對照雙特異性雙抗體(對照DART) (圖B，E，H和K)或DART-A (圖C，F，I和L)處理7天。圖15 (圖A-C)顯示原發性AML樣品中AML胚細胞群體和T細胞的鑒定。圖A顯示輸入AML PBMC的正向分散和側向分散。圖B顯示AML樣品中AML胚細胞群體的鑒定。圖C顯示AML樣品中T細胞群體的鑒定。圖16 (圖A-C)顯示序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)用自體CTL介導AML胚細胞消耗和T細胞擴展的能力。用PBS(磷酸鹽緩衝液)、對照雙特異性雙抗體(對照DART)或DART-A溫育來自患者2的原發性AML PBMC達144h。計數胚細胞(圖A)、CD4 T細胞(圖B)和CD8 T細胞(圖C)。圖17 (圖A-D)顯示序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)介導AML中T細胞活化的能力。用對照雙特異性雙抗體(對照DART)或具有自體PBMC的DART-A溫育之後，測定來自AML患者2的CD4和CD8 T細胞的CD25 (圖A)和Ki-67 (圖B)表現。用對照DART或具有自體PBMC的DART-A的溫育之後，測定來自AML患者2的CD4和CD8 T細胞的穿孔蛋白(圖C)和粒酶B (圖D)的水準。圖18 (圖A-D)顯示序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)能夠與人和靈長類CD123和CD3蛋白交叉反應。圖顯示為了評估DART-A結合人(圖A和C)和非人靈長類(圖B和D) CD3 (圖A和B)和CD123 (圖C和D)蛋白質能力而進行的分析結果的BIACORETM傳感跡線圖(sensogram trace)。提供了KD值。圖19 (圖A-B)顯示序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)用人和食蟹猴PBMC體外介導自體單核細胞消耗的能力。圖呈現通過初級人PBMCs (圖A)或食蟹猴PBMC (圖B)的DART-A介導的細胞毒性劑量回應曲線的結果。圖20 (圖A-N)顯示序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A) 在沒有全身細胞因數誘導的情況下介導食蟹猴中pDC消耗的能力。圖A-D顯示用媒介和載體在4h和4d獲得的對照結果。圖E-H顯示用對照雙特異性雙抗體(對照DART)在4h和4d獲得的對照結果。圖I-N顯示以10 ng/kg/d在4h和4d獲得的結果和用30 ng/kg/d的DART-A在4d獲得的結果。圖21 (圖A-D)顯示序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)介導食蟹猴中pDC的劑量依賴性消耗的能力。食蟹猴以0.1、1、10、30、100、300或1000ng/kg劑量施用DART-A。在指定的時間評估PBMC並且計數總B細胞(圖A)、單核細胞(圖B)、NK細胞(圖C)和pDC (圖D)。圖22 (圖A-D)顯示序列優化的CD123 x CD3雙特異性雙抗體(DART-A)間歇地調節食蟹猴中T細胞的能力。食蟹猴以0.1、1、10、30、100、300或1000ng/kg的劑量施用DART-A。在指定的時間評估PBMC並且計數總T細胞(圖A)、CD4 T細胞(圖B)、CD69細胞(圖C)和CD8 T細胞(圖D)。圖23顯示在還原(左)和非還原(右)條件下，純化DART-A蛋白的SDS-PAGE分析。圖24A-24B顯示純化DART-A的物理化學表徵。圖24A：校準的TSK G3000SWxL柱上DART-A蛋白的SEC圖譜(profile)。圖24B：DART-A蛋白的質譜。圖25A-25D顯示結合固定的人或食蟹猴CD123和CD3的DART-A的SPR分析。虛線表示對以0、6.25、12.5、25、50或100nM的DART-A濃度獲得的實驗結合曲線(連續的線)的1:1 Langmuir模型的整體擬合。資料是三個獨立實驗的代表。圖26A-26E顯示DART-A能夠同時結合CD3和CD123二者。圖26A-26B提供雙功能ELISA的結果並且表明同時結合DART-A的兩個靶抗原。用人CD123 (圖26A)或食蟹猴CD123 (圖26B)塗覆ELISA板。用滴定法測量DART-A和對照DART濃度，然後用人CD3-生物素進行檢測。圖26C-26E顯示CD123+ Molm-13靶細胞(圖26C)、人T細胞(圖26D)和食蟹猴T細胞(圖26E)上DART-A的細胞-表面結合。通過FACS分析使用對DART-A或對照DART分子的E-螺旋和K-螺旋區域特異的單克隆抗體檢測結合。圖27A-27H顯示DART-A介導通過人或猴子抗CD123+ Kasumi-3白血病細胞系的效應細胞重定向的靶細胞殺傷的能力，表明分子結合正常迴圈的白細胞，包括pDC和單核細胞的亞型的能力和表明分子消耗CD14-CD123高細胞(pDC和嗜鹼性粒細胞)而不影響單核細胞(CD14+細胞)的能力。圖27A顯示如通過QFACS分析測定的U937和Kasumi-3白血病細胞系上相關的抗CD123-PE結合位點。圖27B顯示DART-A或對照DART介導的對AML細胞系(U937細胞)的相對低百分數的細胞毒性，所述AML細胞系，如圖27A中所顯示，具有相對少的CD123結合位點)。圖27C顯示DART-A或對照DART在存在純化的人T細胞(作為效應細胞)的情況下介導的對AML細胞系(Kasumi-3細胞)的細胞毒性百分數，所述AML細胞系，如圖27A中所顯示，具有許多CD123結合位點。在圖27B-27C中，E:T比是10:1。圖27D顯示DART-A或對照DART在存在純化食蟹猴PBMC (作為效應細胞)的情況下介導的對Kasumi-3細胞的細胞毒性的百分數(E:T比是15:1)，並且表明DART-A可結合食蟹猴T細胞。圖27E顯示Kasumi-3細胞、人單核細胞、人漿細胞樣樹突細胞(“pDC”)、食蟹猴單核細胞和食蟹猴漿細胞樣樹突細胞上的相關抗CD123-PE結合位點，如通過QFACS分析測定的。圖27F顯示DART-A消耗CD14– CD123低細胞的能力。圖27G顯示DART-A消耗人CD14– CD123高細胞的能力。圖27H顯示DART-A消耗食蟹猴CD14– CD123高細胞的能力。通過LDH釋放測定細胞毒性，使用GraphPad PRISM®軟體測定EC50值。圖28顯示評估DART-A的藥物代謝動力學參數的二室模型(two-compartment model)的用途。資料顯示在以100 ng/kg/天、300 ng/kg/天、600 ng/kg/天和1000 ng/kg/天劑量接收96小時輸注之後，食蟹猴中DART-A的輸注結束(EOI)血清濃度。每個點表示個體動物；水平線表示劑量組的平均值。圖29A-29C顯示DART-A輸注對細胞因數IL-6產量的影響。輸注DART-A的猴子中血清IL-6水準(平均值± SEM)由處理組顯示。食蟹猴在第1天用媒介對照處理，隨後每4週一次輸注媒介(組1) (圖29A)或DART-A，所述DART-A在第8、15、22和29天開始以每週4天輸注施用(組2-5) (圖29B)或在第8天開始以7天/周輸注共4周(組6) (圖29C)。處理間隔由填充的灰色條指示。圖30A-30F顯示DART-A輸注對CD14-/CD123+細胞(圖30A-30C)和CD303+細胞(圖30D-30F)消耗的影響。按研究天數和組顯示CD14-/CD123+ (圖30A-30C)或CD303+ (圖30D-30F)的迴圈水準的平均值± SEM。在第1天用媒介對照處理食蟹猴，隨後每4週一次輸注媒介(組1) (圖30A和30D)或DART-A，所述DART-A在第8、15、22和29天開始以每週4天輸注施用(組2-5) (圖30A和30E)或在第8天開始以7天/周輸注共4周(組6) (圖30C和30F)。處理間隔由填充的灰色條指示。圖31A-31I顯示觀察的接收在第8、15、22和29天開始的4天輸注施用的DART-A 的T細胞群體(圖31A-31C)、CD4+細胞群體(圖31D-31F)和CD8+細胞群體(圖31G-31I)的改變。圖例：CD25+ (灰色正方形)；CD69+ (灰色三角形)，PD-1+ (白色三角形)；Tim-3+ (白色正方形)。經CD4和CD8標記物，而不是經規範的CD3對T細胞計數，以消除對DART-A可能的干擾。在第1天用媒介對照處理食蟹猴，隨後每4周1次輸注媒介(組1)或DART-A，所述DART-A在第8、15、22和29天開始以每週4天輸注施用(組5)或在第8天開始以7天/周輸注共4周(組6)。處理間隔由填充的灰色條指示。按研究天數和組顯示總迴圈T細胞的絕對數的平均值± SEM (圖31A-31C)。按研究天數和組顯示CD4 (圖31D-31E)或CD8 T細胞(圖31F-31H)的CD25+、CD69+、PD-1+和Tim-3+的相對值(平均百分數± SEM)。圖32A-32F顯示觀察的連續7天輸注DART-A期間和之後T CD4+細胞群體(圖32A-32C)和CD8+細胞群體(圖32D-32F)的改變。按研究天數針對組2、3和4顯示CD4 (圖32A-32C)或CD8 (圖32D-32F) T細胞上CD25+、CD69+、PD-1+和Tim-3+的平均值± SEM百分數。處理間隔由填充的灰色條指示。圖例：CD25+ (灰色正方形)；CD69+ (灰色三角形)，PD-1+ (白色三角形)；Tim-3+ (白色正方形)。圖33A-33F顯示連續7天輸注DART-A期間和之後觀察的T CD4+細胞群體(圖33A-33C)和CD8+細胞群體(圖33D-33F)的改變。按研究天數針對組2、3和4顯示CD4+群體(圖33A-33C)或CD8群體(圖33D-33F)中CD4+幼稚(CD95-/CD28+)、CMT (CD95+/CD28+)和EMT (CD95+/CD28-) T細胞的平均值± SEM百分數。在第1天用媒介對照處理食蟹猴，隨後每4周1次輸注或DART-A，所述DART-A在第8、15、22和29天開始以每週4-天輸注施用(組2-4)。處理間隔由填充的灰色條指示。圖例：幼稚(naïve)(白色三角形)；CMT (黑色三角形)，EMT (灰色正方形)。圖34顯示通過來自用多次輸注的DART-A處理的幼稚猴子或猴子的PBMC的DART-A介導的對Kasumi-3細胞的細胞毒性。圖35A-35F顯示DART-A暴露以對應的幼稚T細胞群體為代價增加中心記憶CD4細胞和效應器記憶CD8+細胞的相對頻率。按研究天數和組顯示CD4+群體(圖35A-35C)或CD8+群體(圖35D-35F)中CD4+幼稚(CD95-/CD28+)、CMT (CD95+/CD28+)和EMT (CD95+/CD28-) T細胞的平均值± SEM百分數。在第1天用媒介對照處理食蟹猴，隨後每4周1次輸注媒介(組1)或DART-A，所述DART-A在第8、15、22和29天開始以每週4-天輸注施用(組5)或在第8天開始以7天/周輸注共4周(組6)。處理間隔由填充的灰色條指示。圖例：幼稚(白色三角形)；CMT (黑色三角形)，EMT (灰色正方形)。圖36A-36F顯示DART-A對已經接收分子輸注的猴子中紅細胞參數的影響。顯示在指定的時間點從用DART-A處理的猴子收集的樣品中迴圈RBC (圖36A-36C)或網狀細胞(圖36D-36F)水準(平均值± SEM)。圖37A-37B顯示在指定的時間點從用DART-A處理的猴子收集的骨髓樣品中Lin-細胞群體中CD123+細胞(圖37A)或HSC (CD34+/CD38-/CD45-/CD90+細胞) (圖37B)的頻率(平均百分數± SEM)。在第1天用媒介對照處理食蟹猴，隨後每4周1次輸注媒介(組1)或DART-A，所述DART-A在第8、15、22和29天開始以每週4天輸注施用(組2-5)或在第8天開始以7天/周輸注共4周(組6)。

<110> 宏觀基因股份有限公司

<120> 能夠結合CD123和CD3的雙特異性單價雙抗體及其用途

<130> 1301.0109PCT

<150> US 61/907,749

<151> 2013-11-22

<150> US 61/869,510

<151> 2013-08-23

<160> 59

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 272

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-A的第一多肽鏈

<400> 1

<210> 2

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼DART-A的第一多肽鏈的核酸分子

<400> 2

<210> 3

<211> 280

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-A的第二多肽鏈

<400> 3

<210> 4

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼DART-A的第二多肽鏈的核酸分子

<400> 4

<210> 5

<211> 268

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-B的第一多肽鏈

<400> 5

<210> 6

<211> 804

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼DART-B的第一多肽鏈的核酸分子

<400> 6

<210> 7

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-B的第二多肽鏈

<400> 7

<210> 8

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼DART-B的第二多肽鏈的核酸分子

<400> 8

<210> 9

<211> 322

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有白蛋白結合位點的CD123 x CD3雙抗體多肽鏈

<400> 9

<210> 10

<211> 966

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼具有白蛋白結合位元點的CD123 x CD3雙抗體多肽鏈的多核苷酸

<400> 10

<210> 11

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修飾的人抗體Fc區的CH2-CH3結構域

<400> 11

<210> 12

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼肽1和IgG Fc區的CH2和CH3結構域的核酸分子

<400> 12

<210> 13

<211> 510

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-A w/Fc形式1構建體的第一多肽鏈

<400> 13

<210> 14

<211> 1530

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼DART-A w/Fc形式1構建體的第一多肽鏈的核酸分子

<400> 14

<210> 15

<211> 272

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-A w/Fc形式1構建體的第二多肽鏈

<400> 15

<210> 16

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼DART-A w/Fc形式1構建體的第二多肽鏈的核酸分子

<400> 16

<210> 17

<211> 515

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-A w/Fc形式2構建體的第一多肽鏈

<400> 17

<210> 18

<211> 1545

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼DART-A w/Fc形式2構建體的第一多肽鏈的核酸分子

<400> 18

<210> 19

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對照DART的第一多肽鏈

<400> 19

<210> 20

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對照DART的第二多肽鏈

<400> 20

<210> 21

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-A的輕鏈CD3-結合結構域

<400> 21

<210> 22

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-A的重鏈CD3-結合結構域

<400> 22

<210> 23

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-B的輕鏈CD3-結合結構域

<400> 23

<210> 24

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-B的重鏈CD3-結合結構域

<400> 24

<210> 25

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-A的輕鏈CD123-結合結構域

<400> 25

<210> 26

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-A的重鏈CD123-結合結構域

<400> 26

<210> 27

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-B的輕鏈CD123-結合結構域

<400> 27

<210> 28

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-B的重鏈CD123-結合結構域

<400> 28

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接體1多肽

<400> 29

<210> 30

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接體2多肽

<400> 30

<210> 31

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接體3多肽

<400> 31

<210> 32

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接體5多肽

<400> 32

<210> 33

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接體4多肽

<400> 33

<210> 34

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E-螺旋結構域

<400> 34

<210> 35

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> K-螺旋結構域

<400> 35

<210> 36

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 優選的白蛋白結合結構域

<400> 36

<210> 37

<211> 217

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(217)

<223> 人Fc區的CH2-CH3結構域

<400> 37

<210> 38

<211> 14

<212> PRT

<213> 小白鼠(Mus musculus)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(14)

<223> 抗-CD3抗體的輕鏈可變結構域的CDR1

<400> 38

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 小白鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(7)

<223> 抗-CD3抗體的輕鏈可變結構域的CDR2

<400> 39

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> 小白鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(9)

<223> 抗-CD3抗體的輕鏈可變結構域的CDR3

<400> 40

<210> 41

<211> 5

<212> PRT

<213> 小白鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(5)

<223> 抗-CD3抗體的重鏈可變結構域的CDR1

<400> 41

<210> 42

<211> 19

<212> PRT

<213> 小白鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(19)

<223> 抗-CD3抗體的重鏈可變結構域的CDR2

<400> 42

<210> 43

<211> 14

<212> PRT

<213> 小白鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(14)

<223> 抗-CD3抗體的重鏈可變結構域的CDR3

<400> 43

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> 小白鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(17)

<223> 抗-CD123抗體的輕鏈可變結構域的CDR1

<400> 44

<210> 45

<211> 7

<212> PRT

<213> 小白鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(7)

<223> 抗-CD123抗體的輕鏈可變結構域的CDR2

<400> 45

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> 小白鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(9)

<223> 抗-CD123抗體的輕鏈可變結構域的CDR3

<400> 46

<210> 47

<211> 5

<212> PRT

<213> 小白鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(5)

<223> 抗-CD123抗體的重鏈可變結構域的CDR1

<400> 47

<210> 48

<211> 17

<212> PRT

<213> 小白鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(17)

<223> 抗-CD123抗體的重鏈可變結構域的CDR2

<400> 48

<210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> 小白鼠

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(7)

<223> 抗-CD123抗體的重鏈可變結構域的CDR3

<400> 49

<210> 50

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 異源二聚化結構域

<400> 50

<210> 51

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 異源二聚化結構域

<400> 51

<210> 52

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 異源二聚化結構域

<400> 52

<210> 53

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 異源二聚化結構域

<400> 53

<210> 54

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DART-A w/Fc形式1構建體的第三多肽鏈

<400> 54

<210> 55

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽1

<400> 55

<210> 56

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc區的優選CH2和CH3結構域

<400> 56

<210> 57

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接體4多肽

<400> 57

<210> 58

<211> 273

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "對照DART-2"的第一多肽鏈的氨基酸序列

<400> 58

<210> 59

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> "對照DART-2"的第二多肽鏈的氨基酸序列

<400> 59

Claims

一種序列優化的雙抗體，具有特異性結合CD123的抗原決定部位和結合CD3的抗原決定部位的能力，其中該雙抗體包括彼此共價結合的一第一多肽鏈和一第二多肽鏈，其中：A.該第一多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括：i.結構域1，其包括(1)亞結構域1A，其包括具有結合CD3的能力之單克隆抗體的VL結構域VL_CD3，該VL_CD3具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列；以及(2)亞結構域1B，其包括具有結合CD123的能力之單克隆抗體的VH結構域VH_CD123，該VH_CD123具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列，其中，該第一多肽鏈的該亞結構域1A和該第一多肽鏈的該亞結構域1B彼此通過具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的肽連接體分開；ii.結構域2，其中該第一多肽鏈的該結構域2是具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的E-螺旋結構域或具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的K-螺旋結構域，並且該結構域2和該結構域1通過具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的肽連接體分開；以及B.該第二多肽鏈在從N-末端至C-末端方向上包括：i.結構域1，其包括(1)亞結構域1A，其包括具有結合CD123的能力之單克隆抗體的VL結構域VL_CD123，該VL_CD123具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列；和(2)亞結構域1B，其包括具有結合CD3的能力之單克隆抗體的VH結構域VH_CD3，該VH_CD3具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列，其中，該第二多肽鏈的該亞結構域1A和該第二多肽鏈的該亞結構域1B彼此通過具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的肽連接體分開；ii.結構域2，其中該第二多肽鏈的該結構域2是具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的K-螺旋結構域或具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的E-螺旋結構域，並且該第二多肽鏈的該結構域2和該第二多肽鏈的該結構域1通過具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的肽連接體分開；其中，該第一多肽鏈的該結構域2和該第二多肽鏈的該結構域2不同時是E-螺旋結構域，以及該第一多肽鏈的該結構域2和該第二多肽鏈的該結構域2亦不同時是K-螺旋結構域；以及其中：(a)該第一多肽鏈的該VL結構域和該第二多肽鏈的該VH結構域形成具有特異性結合CD3的抗原決定部位的能力之抗原結合結構域；以及(b)該第二多肽鏈的該VL結構域和該第一多肽鏈的該VH結構域形成具有特異性結合CD123的抗原決定部位的能力之抗原結合結構域。
如請求項1所述的雙抗體，其中該第一多肽鏈另外包括經肽連接體連接至該結構域2的白蛋白結合結構域，其中該肽連接體具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列，該白蛋白結合結構域具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列。
如請求項1所述的雙抗體，其中該第二多肽鏈另外包括結構域3，該結構域3包括免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域，其中該CH2和CH3結構域具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列，其中該結構域3經肽連接體連接至該結構域1，其中該肽連接體具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列。
如請求項1所述的雙抗體，其中該第一多肽鏈另外包括結構域3，該結構域3包括免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域，其中該CH2和CH3結構域具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列，其中該結構域3經肽連接體連接至該結構域1，其中該肽連接體具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列。
如請求項1所述的雙抗體，其中該第二多肽鏈另外包括結構域3，該結構域3包括免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域，其中該CH2和CH3結構域具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列，其中該結構域3經肽連接體連接至該結構域2，其中該肽連接體具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
如請求項1所述的雙抗體，其中該第一多肽鏈另外包括結構域3，該結構域3包括免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域，其中該CH2和CH3結構域具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列，其中該結構域3經肽連接體連接至該結構域2，其中該肽連接體具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
如請求項3所述的雙抗體，其中該雙抗體進一步包括第三多肽鏈，該第三多肽鏈包括免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域，其中該CH2和CH3結構域具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
如請求項4所述的雙抗體，其中該雙抗體進一步包括第三多肽鏈，該第三多肽鏈包括免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域，其中該CH2和CH3結構域具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
如請求項5所述的雙抗體，其中該雙抗體進一步包括第三多肽鏈，該第三多肽鏈包括免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域，其中該CH2和CH3結構域具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
如請求項6所述的雙抗體，其中該雙抗體進一步包括第三多肽鏈，該第三多肽鏈包括免疫球蛋白Fc結構域的CH2和CH3結構域，其中該CH2和CH3結構域具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
如請求項3所述的雙抗體，其中該雙抗體進一步包括具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的包含半胱氨酸的肽和至該免疫球蛋白Fc結構域的該CH2和CH3結構域的N-末端。
如請求項4所述的雙抗體，其中該雙抗體進一步包括具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的包含半胱氨酸的肽和至該免疫球蛋白Fc結構域的該CH2和CH3結構域的N-末端。
如請求項5所述的雙抗體，其中該雙抗體進一步包括具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的包含半胱氨酸的肽和至該免疫球蛋白Fc結構域的該CH2和CH3結構域的N-末端。
如請求項6所述的雙抗體，其中該雙抗體進一步包括具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的包含半胱氨酸的肽和至該免疫球蛋白Fc結構域的該CH2和CH3結構域的N-末端。
如請求項7所述的雙抗體，其中該雙抗體進一步包括具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的包含半胱氨酸的肽和至該免疫球蛋白Fc結構域的該CH2和CH3結構域的N-末端。
如請求項8所述的雙抗體，其中該雙抗體進一步包括具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的包含半胱氨酸的肽和至該免疫球蛋白Fc結構域的該CH2和CH3結構域的N-末端。
如請求項9所述的雙抗體，其中該雙抗體進一步包括具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的包含半胱氨酸的肽和至該免疫球蛋白Fc結構域的該CH2和CH3結構域的N-末端。
如請求項10所述的雙抗體，其中該雙抗體進一步包括具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的包含半胱氨酸的肽和至該免疫球蛋白Fc結構域的該CH2和CH3結構域的N-末端。
如請求項1所述的雙抗體，其中該第一多肽鏈的該結構域2是具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的K-螺旋結構域和該第二多肽鏈的該結構域2是具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的E-螺旋結構域。
如請求項1所述的雙抗體，其中該第一多肽鏈的該結構域2是具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的E-螺旋結構域和該第二多肽鏈的該結構域2是具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的K-螺旋結構域。
如請求項1所述的雙抗體，其中該雙抗體能夠與人和靈長類CD123和CD3蛋白都交叉反應。
一種雙特異性雙抗體，其具有特異性結合CD123的抗原決定部位和結合CD3的抗原決定部位的能力，其中該雙特異性雙抗體包括彼此共價結合的第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中該雙特異性雙抗體包括：A.第一多肽鏈，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；和B.第二多肽鏈，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：3；其中該第一多肽鏈和該第二多肽鏈通過二硫鍵彼此共價結合。
一種雙特異性雙抗體，其具有特異性結合CD123的抗原決定部位和結合CD3的抗原決定部位的能力，其中該雙特異性雙抗體包括彼此共價結合的第一多肽鏈和第二多肽鏈，並且進一步包括第三多肽鏈，其中該雙特異性雙抗體包括：A.第一多肽鏈，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：13；B.第二多肽鏈，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：15；和C.第三多肽鏈，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：54；其中該第一多肽鏈和該第二多肽鏈通過二硫鍵彼此共價結合。
一種雙特異性雙抗體，其具有特異性結合CD123的抗原決定部位和結合CD3的抗原決定部位的能力，其中該雙特異性雙抗體包括彼此共價結合的第一多肽鏈和第二多肽鏈，並且進一步包括第三多肽鏈，其中該雙特異性雙抗體包括：A.第一多肽鏈，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：17；B.第二多肽鏈，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；和C.第三多肽鏈，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：54；其中該第一多肽鏈和該第二多肽鏈通過二硫鍵彼此共價結合。
如請求項1至24中之任一項所述的雙抗體，其用作藥物。
如請求項1至24中之任一項所述的雙抗體，其用於治療與CD123的表現相關或特徵在於CD123的表現的疾病或病況。
如請求項26所述的雙抗體，其中該與CD123的表現相關或特徵在於CD123的表現的疾病或病況是癌症。
如請求項27所述的雙抗體，其中該癌症選自：急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)，包括CML的母細胞危象和與CML相關的Abelson癌基因(Bcr-ABL易位)、骨髓增生異常綜合症(MDS)、急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)，包括Richter綜合症或CLL的Richter轉化、毛細胞性白血病(HCL)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括套細胞白血病(MCL)，和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增多症，和伯基特淋巴瘤。
如請求項26所述的雙抗體，其中該與CD123的表現相關或特徵在於CD123的表現的疾病或病況是炎症病況。
如請求項29所述的雙抗體，其中該炎症病況選自：自身免疫狼瘡(SLE)、過敏症、哮喘和類風濕性關節炎。
一種藥學組合物，包括如請求項1至24中之任一項所述的雙抗體以及生理學上可接受的載體。
如請求項31所述的藥學組合物在製備用於治療與CD123的表現相關或特徵在於CD123的表現的疾病或病況的藥物中的用途。
如請求項32所述的用途，其中該與CD123的表現相關或特徵在於CD123的表現的疾病或病況是癌症。
如請求項33所述的用途，其中該癌症選自：急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)，包括CML的母細胞危象和與CML相關的Abelson癌基因(Bcr-ABL易位)、骨髓增生異常綜合症(MDS)、急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)，包括Richter綜合症或CLL的Richter轉化、毛細胞性白血病(HCL)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括套細胞白血病(MCL)，和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增多症，和伯基特淋巴瘤。
如請求項32所述的用途，其中該與CD123的表現相關或特徵在於CD123的表現的疾病或病況是炎症病況。
如請求項35所述的用途，其中該炎症病況選自：自身免疫狼瘡(SLE)、過敏症和哮喘。