RS61522B1

RS61522B1 - Bispecifična monovalentna diatela koja su sposobna za vezivanje cd123 i cd3 i njihovo korišćenje

Info

Publication number: RS61522B1
Application number: RS20210163A
Authority: RS
Inventors: Ezio Bonvini; Leslie S Johnson; Ling Huang; Paul A Moore; Gurunadh Reddy Chichili; Ralph Froman Alderson
Original assignee: Macrogenics Inc
Priority date: 2013-08-23
Filing date: 2014-08-20
Publication date: 2021-03-31
Also published as: GEAP201914100A; TWI669310B; US10787521B2; JP6524087B2; US20210047426A1; TW201542593A; US9822181B2; AP2016009029A0; EP3808776A1; IL244237A0; CR20160108A; JP2017504577A; CY1123940T1; EA201690443A1; US20180094072A1; PH12016500311A1; PE20160509A1; AU2014308905A1; SA516370567B1; SG11201601317UA

Description

Opis

Pozadina:

Oblast pronalaska:

[0001] Predmetni pronalazak je usmeren na CD123 x CD3 bi-specifična monovalentna antitela koja su sposobna istovremeno da se vezuju za CD123 i CD3 i za upotrebu takvih molekula u lečenju hematoloških malignih bolesti.

Stanje tehnike

I. CD123

[0002] CD123 (alfa receptor za interleukin 3, IL-3Ra) je molekul od 40 kDa i deo je receptora za interleukin 3 kompleks (Stomski, F.C. i sar. (1996) "Human Interleukin-3 (IL-3) indukuje disulfidom povezan IL-3 receptor alfa-I Heterodimerizacija beta-lanca, koja je potrebna za aktiviranje receptora, ali ne i vezivanje sa visokim afinitetima, "Mol. Cell. Biol. 16 (6): 3035-3046). Interleukin 3 (IL-3) pokreće ranu diferencijaciju multipotentnih matičnih ćelija u ćelije eritroida, mijeloidni i limfoidni prednici. CD123 je izražen na CD34 predanim rodonačelnicima (Taussig, D.C. et al. (2005) „Hematopoetske matične ćelije izražavaju višestruke mijeloidne markere: implikacije na poreklo i ciljanu terapiju Akutna mijeloična leukemija, "Krv 106: 4086-4092), ali ne putem CD34 / CD38-normalnih matičnih ćelija hematopoeze. CD123 je eksprimiran bazofilima, mastocitima, plazmocitoidnim dendritičnim ćelijama, određeni izraz monocitima, makrofazima I eozinofili, a mala ili nikakva ekspresija od strane neutrofila i megakariocita. Neka nehematopoetska tkiva (placenta, Leidigove ćelije testisa, određeni elementi moždanih ćelija i neke endotelne ćelije) eksprimiraju CD123; međutim izraz je uglavnom citoplazmatski.

[0003] Izvešteno je da se CD123 eksprimira leukemijskim eksplozijama i matičnim ćelijama leukemije (LSC) (Jordan, C.T. et al. (2000) „Alfa lanac receptora za Interleukin-3 je jedinstveni marker za matične ćelije humane akutne mijelogene leukemije,“Leukemija 14: 1777-1784; Jin, V. i sar. (2009) „Regulacija diferencijacije ćelija Th17 i indukcija EAE pomoću MAP3K NIK, "Krv 113: 6603-6610) (slika 1). U ljudskim normalnim populacijama prekursora, CD123 se izražava podskupom krvotvorne matične ćelije (HPC), ali ne i pomoću normalnih matičnih ćelija hematopoeze (HSC). CD123 je takođe izražen sa plazmocitoidne dendritične ćelije (pDC) i bazofili i, u manjoj meri, monociti i eozinofili (Lopez, A.F. et al. (1989) „Uzajamna inhibicija vezivanja između Interlevkina 3 i stimulišućeg kolonija granulocita-makrofaga Faktor za humane eozinofile, "Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 7022-7026; Sun, K. et al. (1996)" Monoklonsko antitelo 7G3 prepoznaje N-terminalni domen alfa lanca i funkcija receptora humanog Interleukin-3 (IL-3) kao Specifični antagonist receptora za IL-3, "Krv 87: 83-92; Munoz, L. i sar. (2001)" Interfeuni-3 receptorski alfa lanac (CD123) Široko je izražen u hematološkim malignim bolestima, "Haematologica 86 (12): 1261-1269; Masten, B.J. i sar. (2006) "Karakterizacija mijeloidnih i plazmocitoidnih dendritičnih ćelija u ljudskim plućima," J. Immunol.177: 7784-7793; Korpelainen, E.I. et al. (1995) „Interferon-gama pojačava ekspresiju receptora za interleukin-3 (IL-3) u ljudskom endotelu celije i sinergiše sa IL-3 u stimulisanju ekspresije klase II ekspresije i citokina kompleksa histokompatibilnosti Produkcija, „Krv 86: 176-182).

[0004] Izvešteno je da je CD123 prekomerno eksprimiran na malignim ćelijama u širokom spektru hematoloških malignih oboljenja uključujući akutnu mijeloičnu leukemiju (AML) i mijelodisplastični sindrom (MDS) (Munoz, L. et al. (2001) "Interleukin-3 Alfa lanac receptora (CD123) je široko izražen u hematološkim malignim bolestima, "Haematologica 86 (12): 1261-1269). Prekomerna ekspresija CD123 povezana je sa lošijom prognozom AML (Tettamanti, M.S. i sar. (2013) „Ciljanje akutnog Mijeloidna leukemija ćelijama-indukovanim ćelijamaubicama preusmerena novim CD123-specifičnim receptorima himernog antigena, "Br. J. Haematol.161: 389-401).

[0005] Smatra se da AML i MDS nastaju i da ih održava mala populacija leukemičnih matičnih ćelija (LSC), koji uglavnom miruju (tj. ne dele se brzo ćelije) i zbog toga se odupru ćelijskoj smrti (apoptoza) i konvencionalni hemoterapeutski agensi. LSC karakterišu visoki nivoi ekspresije CD123, koji nije prisutan u odgovarajuća normalna populacija hematopoetskih matičnih ćelija u normalnoj ljudskoj koštanoj srži (Jin, V. et al. (2009) "Regulacija O diferencijaciji ćelija Th17 i indukciji EAE pomoću MAP3K NIK, "Krv 113: 6603-6610; Jordan, C.T. et al. (2000)" The Alfa lanac receptora za interleukin-3 jedinstveni je marker za matične ćelije akutne mijelogene leukemije kod ljudi, „Leukemija 14: 1777-1784). CD123 je izražen u 45% -95% AML, 85% leukemije dlakavih ćelija (HCL) i 40% akutnog B limfoblastna leukemija (B-ALL). Ekspresija CD123 je takođe povezana sa višestrukim drugim malignim / pred-malignim bolestima: matične ćelije hronične mijeloične leukemije (CML) (uključujući CML blast krize); Ćelije Hodgkinovog Rida Sternberga (RS); transformisani ne-Hodgkinov limfom (NHL); neke hronične limfocitne leukemije (CLL) (CD11c ); podskup akutnih T-limfoblastna leukemija (T-ALL) (16%, većina nezrelih, uglavnom odraslih), maligniteti plazmocitoidnih dendritičnih ćelija (pDC) (DC2) i CD34 / CD38- mijelodisplastični sindrom (MDS), maligniteti ćelija srži.

[0006] AML je klonska bolest koju karakteriše proliferacija i akumulacija transformisanog mieloidnog prednika ćelija u koštanoj srži, što na kraju dovodi do hematopoetskog zatajenja. Incidencija AML se povećava sa godinama, I stariji pacijenti obično imaju lošije ishode lečenja od mlađih (Robak, T. i sar. (2009) „Akutne I nove terapije za akutnu mijeloičnu leukemiju, "Clin. Ther.2: 2349-2370). Nažalost, trenutno većina odraslih sa AML umiru od svoje bolesti.

[0007] Lečenje AML se u početku fokusira na indukciju remisije (indukciona terapija). Jednom kada se postigne remisija, lečenje se fokusira na obezbeđivanje takve remisije (terapija nakon remisije ili konsolidacije) i, u nekim slučajevima, terapija održavanja. Standardna paradigma indukcije remisije za AML je hemoterapija antraciklinom / citarabinom kombinacija, nakon čega sledi konsolidaciona hemoterapija (obično sa većim dozama istih lekova kao su korišćeni tokom perioda indukcije) ili transplantacije ljudskih matičnih ćelija, u zavisnosti od sposobnosti pacijenta da tolerize intenzivno lečenje i verovatnoća izlečenja samo hemoterapijom (videti, na primer, Roboz, G.J. (2012) „ Akutne I nove terapije za akutnu mijeloičnu leukemiju,, "Curr. Opin. Oncol.24: 711-719).

[0008] Sredstva koja se često koriste u indukcionoj terapiji uključuju citarabin i antracikline. Citarabin, takođe poznat kao AraC, ubija ćelije karcinoma (i druge brzo deliće normalne ćelije) ometajući sintezu DNK. Posledice povezani sa lečenjem AraC uključuju smanjenu otpornost na infekciju, što je rezultat smanjene proizvodnje belih krvnih zrnaca; krvarenje, kao rezultat smanjene proizvodnje trombocita; i anemija, zbog potencijalnog smanjenja crvene krvi ćelije. Ostali neželjeni efekti uključuju mučninu i povraćanje. Antraciklini (npr. Daunorubicin, doksorubicin i idarubicin) imaju nekoliko načina delovanja, uključujući inhibiciju sinteze DNK i RNK, narušavanje struktura višeg reda DNK i proizvodnja ćelija koje oštećuju slobodne radikale kiseonika. Najčešći štetni efekat antraciklina je kardiotoksičnost, koja znatno ograničava primenjenu doživotnu dozu i donekle njihovu korisnost.

[0009] Stoga, nažalost, uprkos značajnom napretku u lečenju novootkrivene AML, 20% do 40% pacijenti ne postižu remisiju standardnom indukcionom hemoterapijom, a 50% do 70% pacijenata koji ulaze u očekuje se da se prva kompletna remisija ponovi u roku od 3 godine. Optimalna strategija u vreme recidiva, ili za pacijenata sa rezistentnom bolešću, ostaje neizvesno. Transplantacija matičnih ćelija je utvrđena kao većina efikasan oblik antileukemijske terapije kod pacijenata sa AML u prvoj ili sledećoj remisiji (Roboz, G.J. (2012) " Akutne I nove terapije za akutnu mijeloičnu leukemiju,, "Curr. Opin. Oncol.24: 711-719).

II. CD3

[0010] CD3 je ko-receptor za T ćelije sastavljen od četiri različita lanca (Vucherpfennig, K.V. et al. (2010) "Strukturna biologija receptora T-ćelija: uvidi u sklop receptora, prepoznavanje liganda i pokretanje signalizacije, "Hladno" Spring Harb. Perspekt. Biol.2 (4): a005140; stranice 1-14). Kod sisara, kompleks sadrži lanac CD3γ, lanac CD3δ, i dva lanca CD3ε. Ovi lanci se povezuju sa molekulom poznatim kao receptor za T ćelije (TCR) kako bi generisali signal aktivacije u limfocitima T. U nedostatku CD3, TCR se ne sastavljaju pravilno i razgrađuju se (Thomas, S. i sar. (2010) „Lekcije iz molekularne imunologije iz prenosa gena za terapeutske T-ćelijske receptore“, imunologija 2006 Feb, 24(2).133-139)

III. Dvo-specifična tela

[0011] Sposobnost netaknutog, nemodifikovanog antitela (npr. IgG) da veže epitop antigena zavisi od prisustvo varijabilnih domena na lakim i teškim lancima imunoglobulina (tj. VL i VH domeni, respektivno). Dizajn dijatele zasnovan je na jednolančanoj Fv konstrukciji (scFv) (videti, na primer, Holliger i sar. (1993)„’ Diabodies ’: Fragmenti malih bivalentnih i bispecifičnih antitela, "Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90: 6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger i sar.); SAD 2004/0220388 (Mertens i sar.); Alt i sar. (1999) FEBS Lett.454 (1-2): 90-94; Lu, D. i sar. (2005) „A. Potpuno humano rekombinantno IgG-slično bispecifično antitelo i na receptor za epidermalni faktor rasta i na insulin poput receptora faktora rasta za pojačanu antitumorsku aktivnost, "J. Biol. Chem. 280 (20): 19665-19672; WO 02/02781 (Mertens i sar.); Olafsen, T. i sar. (2004) „Kovalentno disulfidno povezano anti-CEA telo omogućava konjugaciju specifičnu za određenu lokaciju I radioobeležavanje za primene ciljanja tumora, „Protein Eng. Des. Sel. 17 (1): 21-27; Vu, A. et al. (2001)“ Multimerizacija Himernog anti-CD20 jednolančanog Fv-Fv fuzijskog proteina posreduje se kroz razmenu promenljivih domena, " Proteinsko inženjerstvo 14 (2): 1025-1033; Asano i sar. (2004) „Dijelo za imunoterapiju raka i njegovo Funkcionalno poboljšanje fuzijom ljudskog Fc domena, "Sažetak 3P-683, J. Biochem.76 (8): 992; Takemura, S. et al. (2000) "Konstrukcija dijabetesa (malo rekombinantno bispecifično antitelo) korišćenjem sistema za premotavanje," Proteini Inž. 13 (8): 583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) „Bispecifična antitela koja uključuju T-ćelije za terapiju raka,“ Rak Res.69 (12): 4941-4944).

[0012] Interakcija lakog lanca antitela i teškog lanca antitela i, naročito, interakcija njegovog VL i VH domeni formiraju jedno od mesta vezivanja epitopa antitela. Suprotno tome, konstrukcija scFv sadrži VL I VH domen antitela sadržan u jednom polipeptidnom lancu pri čemu su domeni odvojeni fleksibilnim veznikom dovoljne dužine da omogući samostalno sklapanje dva domena u funkcionalno mesto vezivanja epitopa. Gde samo-montaža domena VL i VH onemogućen je zbog veznika nedovoljne dužine (manje od oko 12 aminokiselina ostataka), dve konstrukcije scFv međusobno komuniciraju da bi stvorile dvovalentni molekul u kome VL jednog lančani saradnici sa VH drugog (pregledano u Marvin et al. (2005) „Rekombinantni pristupi sličnim IgG-u“ Bispecifična antitela, "Acta Pharmacol. Sin.26: 649-658).

[0013] Prirodna antitela su sposobna da se vežu samo za jednu vrstu epitopa (tj. Monospecifična), iako mogu vezuju više kopija te vrste (tj. pokazuju dvovalentnost ili multivalentnost).

Nauka je primetila sposobnost da stvaraju antitela koja se od takvih prirodnih antitela razlikuju po tome što mogu da vežu dva ili više različitih epitopa vrste (tj. pokazuju bi-specifičnost ili multispecifičnost pored bi-valencije ili multi-valencije) (videti, npr. Holliger et al. (1993) „’ Dijeta ’: Mali fragmenti bivalentnih i bispecifičnih antitela,“ Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90: 6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger i sar.); SAD 2004/0220388 (Mertens i sar.); Alt i sar. (1999) FEBS Lett. 454 (1-2): 90-94; Lu, D. i dr. (2005) „Potpuno humano rekombinantno bis-specifično antitelo nalik IgG na oba receptora za epidermalni faktor rasta i receptor za rast faktora rasta sličan insulinu, za pojačanu antitumorsku aktivnost, "J. Biol. Chem.280 (20): 19665-19672; VO 02/02781 (Mertens i sar.); Mertens, N. i sar., "Novi derivati rekombinantnih bi- i trispecifičnih antitela", U: NOVEL GRANICE U PROIZVODNjI JEDINjENjA ZA BIOMEDICINSKU UPOTREBU, A. VanBroekhoven i sar. (Ur.), Kluver Academic Publishers, Dordrecht, Holandija (2001), stranice 195-208; Vu, A. i sar. (2001) „Multimerizacija Himernog anti-CD20 jednolančanog Fv-Fv fuzionog proteina posreduje se kroz razmenu promenljivih domena, „Protein Inženjering 14 (2): 1025-1033; Asano i sar. (2004) „Dijabodi za imunoterapiju raka i njeno funkcionalno poboljšanje Spajanjem humanog Fc domena, "Sažetak 3P-683, J. Biochem.

76 (8): 992; Takemura, S. i sar. (2000)" Izgradnja O dijabetesu (malo rekombinantno bispecifično antitelo) pomoću sistema za previjanje, "Protein Eng.13 (8): 583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) „Bispecifična antitela koja uključuju T-ćelije za terapiju raka,“ Cancer Res. 69 (12): 4941-4944).

[0014] Pružanje ne-monospecifičnih dijatela pruža značajnu prednost: sposobnost koaligacije i kolokalizuju ćelije koje izražavaju različite epitope. Bi-specifična antitela tako imaju široku primenu, uključujući terapija i imunodijagnostika. Bi-specifičnost omogućava veliku fleksibilnost u dizajnu i inženjerstvu dijatele u razne primene, pružajući povećanu avidnost multimernim antigenima, umrežavanje različitih antigena i usmereno ciljanje na određene tipove ćelija oslanjajući se na prisustvo oba ciljna antigena. Zbog njihove povećane valencije, niske stope disocijacije i brzi izlazak iz cirkulacije (za tela male veličine, na ili ispod ∼50 kDa), diatela molekuli poznati u struci takođe su pokazali posebnu upotrebu na polju snimanja tumora (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Ciljanje tumora pomoću disulfidnih stabilizovanih tela u ekspresiji u Pichia pastoris, "Protein Eng. 10: 1221). Važno je koliganje različitih ćelija, na primer, umrežavanje citotoksičnih T ćelija sa ćelijama tumora (Staerz et al. (1985) „Hibridna antitela mogu ciljati mesta na koja napadaju T ćelije“, Nature 314: 628-631, i Holliger et al. (1996) „Specifično ubijanje limfomskih ćelija citotoksičnim T-ćelijama koje posreduje bispecifično telo“, Protein Eng. 9: 299-305). [0015] Domene za vezivanje epitopa za epitop mogu takođe biti usmerene na površinsku odrednicu bilo koje imuno-efektorske ćelije kao što su CD3, CD16, CD32 ili CD64, koji se eksprimiraju na T limfocitima, ćelijama prirodnih ubica (NK) ili drugim mononuklearnim ćelije. U mnogim studijama je takođe utvrđeno da vezivanje dijabeta za determinante efektorskih ćelija, npr. Fcγ receptore (FcγR), aktivira efektorska ćelija (Holliger et al. (1996) "Specifično ubijanje ćelija limfoma citotoksičnim T-ćelijama posredovanim od strane bispecifičnog Diabodi, "Protein Eng. 9: 299-305; Holliger et al. (1999)" Specifična aktivacija T-ćelija karcinoembrionalnog antigena (CEA) u Karcinom debelog creva izazvan anti-CD3 x bis-specifičnim telima anti-CEA i B7 x bispecifičnim fuzionim proteinima anti-CEA, " Cancer Res. 59: 2909-2916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). Obično se aktivacija efektorskih ćelija pokreće vezivanjem antitela vezanog za efektor ćelija putem interakcije Fc-FcγR; tako da u tom pogledu molekuli dijatela mogu pokazivati Ig-sličnu funkcionalnost nezavisno od da li sadrže Fc domen (npr. kako je ispitano u bilo kom testu efektorske funkcije koji je poznat u tehnici ili je dat kao primer ovde (npr. ADCC test)). Ukrštanjem tumorskih i efektorskih ćelija, dijatelo ne samo da unosi efektorsku ćeliju unutra blizina tumorskih ćelija, ali dovodi do efikasnog ubijanja tumora (videti npr. Cao i sar. (2003) "Bispecifično antitelo Conjugates In Therapeutics, "Adv. Drug. Deliv. Rev.

55: 171-197).

[0016] Međutim, gore navedene prednosti imaju vidljivu cenu. Formiranje takvih nemonospecifičnih dijatela zahteva uspešno sastavljanje dva ili više različitih i različitih polipeptida (tj. takvo formiranje to zahteva dijatela nastaju heterodimerizacijom različitih vrsta polipeptidnog lanca). Ova činjenica je u suprotnosti na mono-specifična tela, koja se formiraju homodimerizacijom identičnih polipeptidnih lanaca. Jer moraju se obezbediti najmanje dva različita polipeptida (tj. dve vrste polipeptida) da bi se formirao nesmonospecifični dijabodi, i zato što homodimerizacija takvih polipeptida dovodi do neaktivnih molekula (Takemura, S. i sar. (2000) „Konstrukcija dijabetesa (malo rekombinantno bispecifično antitelo) korišćenjem sistema za premotavanje,“ Protein Eng. 13 (8): 583-588), proizvodnja takvih polipeptida mora biti ostvarena na takav način da spreči kovalentnu vezu između polipeptida iste vrste (tj. kako bi se sprečila homodimerizacija) (Takemura, S. i sar. (2000) "Konstrukcija O dijabetesu (malo rekombinantno bispecifično antitelo) korišćenjem sistema za premotavanje, "Protein Eng. 13 (8): 583-588). Umetnost je stoga naučila nekovalentnom povezivanju takvih polipeptida (videti, na primer, Olafsen i sar. (2004) „Kovalentni Dis-sulfidno povezano anti-CEA telo omogućava konjugaciju i radioobeležavanje specifično za određenu lokaciju za aplikacije za ciljanje tumora, "Prot. Engr. Des. Sel. 17: 21-27; Asano i sar. (2004) „Dijabodi za imunoterapiju raka i njena funkcionalnost Poboljšanje spajanjem humanog Fc domena, "Sažetak 3P-683, J. Biochem. 76 (8): 992; Takemura, S. i sar. (2000) „Konstrukcija dijabetesa (malo rekombinantno bispecifično antitelo) korišćenjem sistema za premotavanje,“ Protein Eng. 13 (8): 583-588; Lu, D. i sar. (2005) "Potpuno humano rekombinantno bispecifično antitelo nalik IgG na oba epidermalna Receptor faktora rasta i receptor faktora rasta sličan insulinu za pojačanu antitumorsku aktivnost, "J. Biol. Chem.280 (20): 19665-19672).

[0017] Međutim, struka je prepoznala da su bi-specifična antitela sastavljena od nekovalentno povezanih polipeptida su nestabilni i lako se razdvajaju na nefunkcionalne monomere (videti, na primer, Lu, D. i sar. (2005) "Potpuno humani recombinant Bispecifično antitelo nalik IgG-u i na receptor za epidermalni faktor rasta i na rast sličan insulin Receptor faktora za pojačanu antitumorsku aktivnost, "J. Biol. Chem. 280 (20): 19665-19672). [0018] Suočeni sa ovim izazovom, umetnost je uspela da razvije stabilne, kovalentno povezane heterodimerne nemonospecifične dijatela (videti, na primer, WO 2006/113665; WO/2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO/2012/162068; Johnson, S. i sar. (2010) „Regrutacija efektorskih ćelija sa novim preusmeravanjem na osnovu dvostrukog afiniteta zasnovanog na Fv Proteini vode do moćne citolize tumora i smanjenja in-vivo B-ćelija, "J. Molec. Biol.399 (3): 436-449; Veri, M.C. et al. (2010) „Terapijska kontrola aktivacije B ćelija putem regrutovanja inhibitora receptora za fcgamma IIb (CD32B) Funkcija sa novom bispecifičnom skelom za antitela, "Arthritis Rheum.62 (7): 1933-1943; Moore, P.A. et al. (2011)" Primena Molekula za dvostruko afinitetno ponovno ciljanje da bi se postiglo optimalno preusmereno ubijanje T-ćelija limfoma B-ćelija, " Blood 117 (17): 4542-4551). Takvi pristupi uključuju inženjering jednog ili više ostataka cisteina u svakog od zaposlenih vrsta polipeptida. Na primer, dodatak ostatka cisteina na C-kraj takvih konstrukcija ima pokazano je da omogućava disulfidnu vezu između polipeptidnih lanaca, stabilizujući nastali heterodimer bez ometajući karakteristike vezivanja bivalentnog molekula.

[0019] Uprkos takvom uspehu, proizvodnja stabilnih, funkcionalnih heterodimernih, nesmonospecifičnih tela mogu se dalje optimizovati pažljivim razmatranjem i postavljanjem ostataka cisteina kod jednog ili više zaposlenih polipeptidni lanci. Takva optimizovana tela mogu da se proizvedu sa većim prinosom i sa većom aktivnošću od ne-optimizovanih dijatela. Predmetni pronalazak je prema tome usmeren na problem obezbeđivanja polipeptida koji su posebno dizajnirani i optimizovana za formiranje heterodimernih tela. Pronalazak ovaj problem rešava pružanjem primernih, optimizovana CD123 x CD3 tela.

[0020] WO 2012/162067 A2 (MacroGenics, Inc.) je usmeren na molekule koji se vezuju za CD3 sposobni da se vezuju za čoveka i ne-humani CD3, i otkriva humanizovane varijante dva različita mišja anti-CD3 antitela.

Suština pronalaska:

[0021] Ovo otkriće je usmereno na CD123 x CD3 bi-specifična tela koja su sposobna istovremeno vezanje za CD123 i CD3, i za upotrebu takvih molekula u lečenju bolesti, posebno hematoloških maligniteti.

[0022] Prema prvom aspektu ovog pronalaska, obezbeđeno je dijatelo sposobno za specifično vezivanje epitop CD123 i na epitop CD3 u skladu sa patentnim zahtevom 1 ovde.

[0023] CD123 x CD3 bi-specifična antitela iz pronalaska sadrže najmanje dva različita polipeptidna lanca koji se međusobno povezuju na heterodimerni način da bi formirali jedno mesto vezivanja specifično za epitop CD123 I jedno mesto vezivanja specifično za epitop CD3.

CD telo CD123 k CD3 iz ovog pronalaska je prema tome monovalentno sposoban je da se veže za samo jednu kopiju epitopa CD123 i samo jednu kopiju epitopa CD3, ali bi-specifičan po tome što je jedno dijatelo sposobno da se istovremeno veže za epitop CD123 i za epitop CD3. Pojedinac polipeptidni lanci dijatela su kovalentno povezani jedni sa drugima, na primer disulfidnom vezom cisteina ostaci smešteni unutar svakog polipeptidnog lanca. U konkretnim opisima, dalje su data tela ovog pronalaska imaju imunoglobulin Fc domen ili domen koji veže albumin da bi produžili poluživot in vivo.

[0024] Opisani su sekvencijalno optimizovani CD123 x CD3 bi-specifični monovalentni diabodi sposoban za specifično vezivanje na epitop CD123 i na epitop CD3, pri čemu dijatelo sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, kovalentno vezan jedan za drugi, pri čemu:

A. prvi lanac polipeptida sadrži, u smeru od N-kraja do C-kraja:

i. domen 1, koji sadrži:

(1) poddomen (1A), koji sadrži VL domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD3

(VLCD3) (SEK ID NO: 21); i

(2) poddomen (1B), koji sadrži VH domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD123 (VHCD123) (SEK ID NO: 26);

pri čemu su poddomeni 1A i 1B međusobno odvojeni peptidnim veznikom (SEK ID NO: 29); ii. domen 2, pri čemu je domen 2 domen E-zavojnice (SEK ID NO: 34) ili K-zavojnica (SEK ID NO: 35),

pri čemu je domen 2 odvojen od domena 1 peptidnim veznikom (SEK ID NO: 30); i

B. drugi lanac polipeptida sadrži, u smeru od N-kraja do C-kraja:

i. domen 1, koji sadrži:

(1) poddomen (1A), koji sadrži VL domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD123 (VLCD123) (SEK ID NO: 25); i

(2) poddomen (1B), koji sadrži VH domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD3

(VHCD3) (SEK ID NO: 22);

pri čemu su poddomeni 1A i 1B međusobno odvojeni peptidnim veznikom (SEK ID NO: 29); ii. domen 2, pri čemu je domen 2 domen K-kalema (SEK ID NO: 35) ili domen E-kalema (SEK ID NO: 34),

pri čemu je domen 2 odvojen od domena 1 peptidnim veznikom (SEK ID NO: 30); i pri čemu Domen 2 prvog i drugog polipeptidnog lanca nisu oba domena E-zavojnice ili oba D-zavojnica;

i pri čemu:

(a) navedeni VL domen navedenog prvog polipeptidnog lanca i navedeni VH domen navedenog drugog polipeptidnog lanca

domen za vezivanje antigena sposoban da se specifično veže za epitop CD3; i

(b) navedeni VL domen pomenutog drugog polipeptidnog lanca i navedeni VH domen navedenog prvog polipeptidnog lanca

domen za vezivanje antigena sposoban da se specifično veže za epitop CD123.

[0025] Takođe je opisano ne-sekvencom optimizovano CD123 k CD3 bi-specifično monovalentno telo u stanju da specifično vezujući se za epitop CD123 i za epitop CD3, pri čemu dijatelo sadrži prvi polipeptidni lanac I drugi polipeptidni lanac, kovalentno vezan jedan za drugi, pri čemu:

A. prvi lanac polipeptida sadrži, u smeru od N-kraja do C-kraja:

i. domen 1, koji sadrži:

(VLCD3) (SEK ID NO: 23); i

(2) poddomen (1B), koji sadrži VH domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD123 (VHCD123) (SEK ID NO: 28);

pri čemu su poddomeni 1A i 1B međusobno odvojeni peptidnim veznikom (SEK ID NO: 29); ii. domen 2, pri čemu je domen 2 domen E-zavojnice (SEK ID NO: 34) ili K-zavojnica (SEK ID NO: 35), pri čemu je domen 2 odvojen od domena 1 peptidnim veznikom (SEK ID NO: 30); i

B. drugi lanac polipeptida sadrži, u smeru od N-kraja do C-kraja:

i. domen 1, koji sadrži:

1

(1) poddomen (1A), koji sadrži VL domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD123 (VLCD123) (SEK ID NO: 27); i

(VHCD3) (SEK ID NO: 24);

pri čemu su poddomeni 1A i 1B međusobno odvojeni peptidnim veznikom (SEK ID NO: 29); ii. domen 2, pri čemu je domen 2 domen K-kalema (SEK ID NO: 35) ili domen E-kalema (SEK ID NO: 34), pri čemu je domen 2 odvojen od domena 1 peptidnim veznikom (SEK ID NO: 30); i pri čemu Domen 2 prvog i drugog polipeptidnog lanca nisu oba domena E-zavojnice ili oba domena K-zavojnice

i pri čemu:

domen za vezivanje antigena sposoban da se specifično veže za epitop CD3; i

(b) navedeni VL domen pomenutog drugog polipeptidnog lanca i navedeni VH domen navedenog prvog polipeptidnog lanca domen za vezivanje antigena sposoban da se specifično veže za epitop CD123.

[0026] Prvi ili drugi polipeptidni lanac, gore opisanih bi-specifičnih monovalentnih tela, mogu dodatno sadrže domen koji veže albumin (SEK ID NO: 36) povezan C-terminalno za domen 2 ili N-terminalno za domen 1, putem peptidnog linkera (SEK ID NO: 31).

[0027] Prvi ili drugi polipeptidni lanac, gore opisanih bi-specifičnih monovalentnih tela, mogu dodatno sadrže domen 3 koji sadrži domen CH2 i CH3 domena imunoglobulina IgG Fc (SEK ID NO: 37), pri čemu je domen 3 povezan N-terminalno sa domenom 1A preko peptidnog veznika (SEK ID NO: 33).

[0028] Prvi ili drugi polipeptidni lanac, gore opisanih bi-specifičnih monovalentnih tela, mogu dodatno sadrže domen 3 koji sadrži domen CH2 i CH3 domena imunoglobulina IgG Fc (SEK ID NO: 37), pri čemu je domen 3 povezan, C-terminalno, sa domenom 2 preko peptidnog linkera (SEK ID NO: 32).

[0029] Dodatno opisan, Domen 2 prvog polipeptidnog lanca, od gore opisanog bi-specifičnog monovalentnog diabodies, je K-coil domen (SEK ID NO: 35), a domen 2 drugog polipeptidnog lanca je E-coil domen (SEK ID NO: 34).

[0030] Dodatno opisan, domen 2 prvog polipeptidnog lanca, gore opisanog bi-specifičnog monovalentnog diabodies, je domen E-zavojnice (SEK ID NO: 34), a domen 2 drugog polipeptidnog lanca je K-zavojnica (SEK ID NO: 35).

[0031] Takođe je opisano bi-specifično monovalentno dijatelo sposobno za specifično vezivanje za epitop CD123 I epitop CD3, pri čemu dijatelo sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, kovalentno vezani jedni za druge, pri čemu: pomenuto bi-specifično telo sadrži:

A. prvi polipeptidni lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 1; i

B. drugi polipeptidni lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 3;

pri čemu su pomenuti prvi i pomenuti drugi polipeptidni lanci kovalentno povezani jedni sa drugima disulfidnom vezom.

[0032] Rezultati pronalaska pokazuju neočekivano poboljšane funkcionalne aktivnosti kako je dalje opisano u nastavku.

[0033] Dijatela iz pronalaska su poželjno sposobna za unakrsnu reakciju i sa CD123 čoveka i primate i CD3 proteini, poželjno cinomolgus majmuni CD123 i CD3 proteini.

[0034] Dijatela iz pronalaska su poželjno sposobna da u in vitro testu na bazi ćelija iscrpe plazmacitoid dendritične ćelije (pDC) iz kulture primarnih PBMC sa IC50 od oko 1 ng / ml ili manje, oko 0,8 ng / ml ili manje, oko 0,6 ng / ml ili manje, oko 0,4 ng / ml ili manje, oko 0,2 ng / ml ili manje, oko 0,1 ng / ml ili manje, oko 0,05 ng / ml ili manje, oko 0,04 ng / ml ili manje, oko 0,03 ng / ml ili manje, oko 0,02 ng / ml ili manje ili oko 0,01 ng / ml ili manje. Po mogućnosti, IC50 je oko 0,01 ng / ml ili manje. U gore opisanom testu, kultura primarnih PBMC može biti iz cinomolgus-a majmun, u kom slučaju je spomenuto iscrpljenje plazmocitoidnih dendritičnih ćelija majmuna cinomolgus (pDC). Po želji dijatela pronalaska može biti sposoban za iscrpljivanje plazmocitoidnih dendritičnih ćelija (pDC) iz primarne kulture PBMC kao što je gore opisano, gde se ispitivanje sprovodi ili u skladu sa protokolom iz Primera 14, kao ovde opisano ili modifikovanjem takvog testa koji bi razumeli stručnjaci ili na drugi poznati nacin onima obične veštine.

[0035] Dijatela iz pronalaska poželjno pokazuju citotoksičnost u in vitro testu Kasumi-3 sa EC50 od oko 0,05 ng / ml ili manje. Poželjno je da je EC50 oko 0,04 ng / mL ili manje, oko 0,03 ng / mL ili manje, oko 0,02 ng / mL ili manje, ili oko 0,01 ng / ml ili manje. Po izboru, tela koja otkrivaju mogu pokazivati citotoksičnost kako je opisano gore gde se ispitivanje sprovodi pomoću ili u skladu sa protokolom iz Primera 3 kao što je ovde opisano, ili modifikacija takvog testa koju bi razumeli stručnjaci ili na drugi način poznat onima iz struke.

[0036] Dijatela iz pronalaska poželjno pokazuju citotoksičnost u in vitro testu Molm-13 sa EC50 od oko 5 ng / ml ili manje. Poželjno je da je EC50 oko 3 ng / mL ili manje, oko 2 ng / mL ili manje, oko 1 ng / mL ili manje, oko 0,75 ng / ml ili manje, ili oko 0,2 ng / ml ili manje. Po izboru, tela koja otkrivaju mogu pokazati citotoksičnost kako je gore opisano, pri čemu se ispitivanje sprovodi ili u skladu sa protokolom iz Primera 3 kao ovde opisano ili modifikovanjem takvog testa koji bi razumeli stručnjaci ili na drugi poznati nacin onima iz struke.

[0037] Dijatela iz pronalaska su poželjno sposobna da inhibiraju rast ksenografta tumora MOLM-13 u mišu. Poželjno je da antitela iz ovog pronalaska mogu da inhibiraju rast tumora MOLM-13 ksenografta na mišu u koncentraciji od najmanje oko 20 mg / kg, najmanje oko 4 mg / kg, najmanje oko 0,8 mg / kg, na najmanje oko 0,6 mg / kg ili najmanje oko 0,4 mg / kg. Poželjna antitela iz ovog pronalaska će inhibirati rast MOLM-13 tumorskog ksenografta u miša za najmanje 25%, ali moguće za najmanje oko 40% ili više, za najmanje oko 50% ili više, za najmanje oko 60% ili više, za najmanje oko 70% ili više, za najmanje oko 80% ili više, za najmanje oko 90% ili više, ili čak potpunim inhibiranjem rasta tumora MOLM-13 nakon nekog vremena ili uzrokovanjem tumora regresija ili nestanak. Ova inhibicija će se dogoditi za najmanje NSG soj miša. Po želji, dijatela pronalaska može biti sposobno da inhibira rast ksenografta tumora MOLM-13 kod miša u prethodno opisanom na način ili u skladu sa protokolom iz Primera 6, kao što je ovde opisano, ili njegovom modifikacijom test koji bi razumeli strucnjaci ili drugi sredstva poznata onima iz struke.

[0038] Dijatela iz pronalaska su poželjno sposobna da inhibiraju rast ksenografta tumora RS4-11 u mišu. Poželjno je da antitela iz ovog pronalaska mogu da inhibiraju rast tumora RS4-11 ksenograft na mišu u koncentraciji od najmanje oko 0,5 mg / kg, najmanje oko 0,2 mg / kg, najmanje oko 0,1 mg / kg, najmanje oko 0,02 mg / kg ili najmanje oko 0,004 mg / kg. Poželjna antitela iz ovog pronalaska će inhibirati rasta Ksenograftacija tumora RS4-11 kod miša za najmanje oko 25%, ali moguće i najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, bar oko 90%, ili čak potpunom inhibicijom RS4-11 tumora rast nakon određenog vremenskog perioda ili uzrokujući regresiju ili nestanak tumora. Ova inhibicija će se održati u najmanje NSG soj miša. Opcionalno, dijatela iz pronalaska mogu biti sposobna da inhibiraju rasta RS4-11 tumorski ksenograft na mišu na gore opisani način, ili u skladu sa protokolom iz primera 6 kako je ovde opisano, ili modifikovanjem takvog testa koji bi razumeli strucnjaci ili drugi sredstva poznata onima iz struke.

[0039] Dijatela iz ovog pronalaska su poželjno sposobna da iscrpe leukemične blast ćelije in vitro u primarnoj kultura AML ćelija koštane srži. Poželjno je da tela otkrivanja mogu da iscrpe leukemičnu eksploziju ćelije in vitro u primarnoj kulturi ćelija koštane srži AML u koncentracijama od najmanje oko 0,01 ng / ml, najmanje oko 0,02 ng / ml, najmanje oko 0,04 ng / ml, najmanje oko 0,06 ng / ml, najmanje oko 0,08 ng / ml ili najmanje oko 0,1 ng / ml. Poželjno je da antitela iz pronalaska mogu da iscrpe leukemične blast ćelije in vitro u primarnoj kulturi AML ćelija koštane srži na manje od 20% ukupne populacije primarnih leukemičnih blast ćelija pri koncentraciji dijabetesa od najmanje oko 0,01 ng / ml, najmanje oko 0,02 ng / ml, najmanje

1

oko 0,04 ng / ml, najma nje oko 0,06 ng / ml, najmanje oko 0,08 ng / ml ili najmanje oko 0,1 ng / ml, opciono nakon inkubacije primarne kulture sa dijabetesom tokom oko 120 sati. Poželjno je da se leukemične blast ćelije iscrpe in vitro u primarnoj kulturi ćelija AML koštane srži na manje od 20% od ukupne populacije primarnih leukemičnih blast ćelija u koncentracijama dijabetesa od oko 0,01 ng / ml ili 0,1 ng / ml nakon inkubacije primarne kulture sa dijabetesom oko 120 sati.

[0040] Dijatela iz pronalaska su poželjno sposobna da indukuju širenje populacije T ćelija in vitro u primarnoj kulturi ćelija koštane srži AML. Poželjno je da takvo širenje može biti oko 70% ili više od maksimuma Populacija T ćelija koja se može proširiti u analizi. Poželjno je da dijatela iz pronalaska mogu biti u stanju indukovanje širenja populacije T ćelija in vitro u primarnoj kulturi ćelija koštane srži AML na oko 70% ili više maksimalne populacije T ćelija koja se može proširiti u testu pri koncentracijama dijabetesa od najmanje oko 0,01 ng / ml, najmanje oko 0,02 ng / ml, najmanje oko 0,04 ng / ml, najmanje oko 0,06 ng / ml, najmanje oko 0,08 ng / ml ili najmanje oko 0,1 ng / ml, opciono nakon inkubacije primarne kulture sa dijabetesom tokom oko 120 sati. Poželjno je T. populacija ćelija se in vitro proširuje u primarnoj kulturi ćelija koštane srži AML na oko 70% ili više od maksimuma Populacija T ćelija koja se može proširiti u testu pri koncentracijama dijabetesa od oko 0,01 ng / ml ili oko 0,1 ng / ml nakon inkubacije primarne kulture sa dijabetesom oko 120 sati.

[0041] Dijatela iz pronalaska su poželjno sposobna da indukuju aktivaciju populacije T ćelija in vitro u primarnoj kulturi ćelija koštane srži AML. Takva aktivacija može se desiti pri koncentracijama dijabetesa od najmanje oko 0,01 ng / ml, najmanje oko 0,02 ng / ml, najmanje oko 0,04 ng / ml, najmanje oko 0,06 ng / ml, najmanje oko 0,08 ng / ml ili najmanje oko 0,1 ng / ml, opciono nakon inkubacije primarne kulture sa dijabetesom tokom oko 72 sata. Takva aktivacija se može meriti ekspresijom markera aktivacije T ćelija kao što je CD25. Poželjno je aktiviranje T. može doći do populacije ćelija in vitro u primarnoj kulturi ćelija koštane srži AML mereno ekspresijom CD25 pri koncentracijama dijabetesa od oko 0,01 ng / ml ili oko 0,1 ng / ml nakon inkubacije primarne kulture sa dijabetesom oko 72 sata.

[0042] Dijatela pronalaska su poželjno sposobna da iscrpe leukemične blast ćelije in vitro u primarnom kulture ćelija koštane srži AML na manje od 20% ukupne populacije primarnih leukemičnih blast ćelija i na istovremeno indukujući širenje populacije T ćelija in vitro u primarnoj kulturi ćelija AML koštane srži na oko 70% ili više maksimalne populacije T ćelija koje se mogu proširiti u testu pri koncentracijama dijabetesa od najmanje oko 0,01 ng / ml, najmanje oko 0,02 ng / ml, najmanje oko 0,04 ng / ml, najmanje oko 0,06 ng / ml, najmanje oko 0,08 ng / ml ili najmanje oko 0,1 ng / ml, opciono nakon inkubacije primarne kulture sa dijabetesom tokom oko 120 sati. Poželjno je da su koncentracije u dijabetesu oko 0,01 ng / ml ili oko 0,1 ng / ml, a primarna kultura se inkubira sa dijabetesom oko 120 sati.

[0043] Dijatela iz ovog pronalaska mogu biti sposobna da iscrpe leukemične blast ćelije in vitro u primarnoj kulturi AML ćelija koštane srži i / ili indukujući širenje populacije T ćelija in vitro u primarnoj kulturi AML kosti ćelije srži i / ili indukovanje aktivacije populacije T ćelija in vitro u primarnoj kulturi ćelija AML koštane srži na gore opisani način, ili u skladu sa protokolom iz Primera 8, kao što je ovde opisano, ili modifikacijom takvog testa koji bi razumeli strucnjaci ili drugi sredstva poznata onima iz struke.

[0044] Da bi se izbegla bilo kakva sumnja, dijatela otkrivanja mogu pokazivati jedno, dva, tri, više od tri ili svi ovde opisani funkcionalni atributi. Tako dijatela otkrivanja mogu pokazivati bilo koju kombinaciju ovde opisani funkcionalni atributi.

[0045] Dijatela iz ovog pronalaska mogu biti za upotrebu kao farmaceutska sredstva. Poželjno je da su antitela za upotrebu u lečenje bolesti ili stanja povezanih sa ili okarakterisanih ekspresijom CD123. Opisana je upotreba dijatela iz pronalaska u proizvodnji farmaceutskog preparata, poželjno za lečenje bolest ili stanje povezano sa ili okarakterisano ekspresijom CD123 kako je ovde dalje definisano.

[0046] Bolest ili stanje povezano sa ili koje karakteriše ekspresija CD123 može biti rak. Za na primer, rak se može odabrati iz grupe koju čine: akutna mijeloična leukemija (AML), hronična mijelogena leukemija (CML), uključujući blastičnu krizu CML i Abelson onkogen povezan sa HML (translokacija Bcr-ABL), mijelodisplastični sindrom (MDS), akutna limfoblastna leukemija B (B-ALL), hronična limfocitna leukemija (CLL), uključujući Richterov sindrom ili Richterova transformacija CLL, leukemija dlakavih ćelija (HCL), blastični plazmocitoidni dendrit ćelijska neoplazma (BPDCN), ne-Hodgkinovi limfomi (NHL), uključujući leukemiju mantelnih ćelija (MCL) i mali limfocit limfom (SLL), Hodgkinov limfom, sistemska mastocitoza i Burkittov limfom.

[0047] Bolest ili stanje povezano sa ili koje karakteriše ekspresija CD123 može biti zapaljenje stanje. Na primer, zapaljensko stanje se može odabrati iz grupe koju čine: Autoimunski lupus (SLE), alergija, astma i reumatoidni artritis.

[0048] Dodatno je opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži bilo koje od gore opisanih tela i fiziološki prihvatljiv nosač.

[0049] Takođe je opisana upotreba gore opisane farmaceutske kompozicije u lečenju bolesti ili stanje povezano sa ili karakteriše ekspresija CD123. Otkrivanje je posebno usmereno na opis takve upotrebe, pri čemu je povezana bolest ili stanje sa ili ga karakteriše ekspresija CD123 je rak (naročito rak odabran iz grupe koju čine:

akutna mijeloična leukemija (AML), hronična mijelogena leukemija (CML), uključujući blastičnu krizu CML i Abelson-a onkogen povezan sa CML (translokacija Bcr-ABL), mijelodisplastični sindrom (MDS), akutna B limfoblastna leukemija (B-ALL), hronična limfocitna leukemija (CLL), uključujući Richterov sindrom ili Richterovu transformaciju CLL, dlakavi ćelijska leukemija (HCL), blastna plazmocitoidna dendritična ćelijska neoplazma (BPDCN), ne-Hodgkinovi limfomi (NHL), uključujući leukemija mantel ćelija (MCL) i mali limfocitni limfom (SLL), Hodgkinov

1

limfom, sistemska mastocitoza I Burkittov limfom). Otkrivanje je takođe posebno usmereno na opis takve upotrebe, gde je bolest ili stanje povezano sa ili karakteriše ekspresija CD123 je zapaljensko stanje (posebno upalno stanje odabrano iz grupe koju čine: Autoimunski lupus (SLE), alergija, astma i reumatoidni artritis).

[0052] Termini kao što su „oko“ treba da imaju u vidu 10%, poželjnije unutar 5%, od navedene vrednosti, osim ako kontekst ne zahteva drugačije.

Kratak opis slika nacrta:

[0053]

Slika 1 pokazuje da je poznato da se CD123 eksprimira na leukemičnim matičnim ćelijama.

Slika 2 ilustruje strukture prvog i drugog polipeptidnog lanca dvolanca CD123 x CD3 bispecifični monovalentno telo iz ovog pronalaska.

Slike 3A i 3B ilustruju strukture dve verzije prvog, drugog i trećeg polipeptidnog lanca trolančana CD123 x CD3 bi-specifična monovalentna Fc dijatela iz ovog pronalaska (verzija 1, slika 3A; verziju 2, slika 3B).

Slika 4 (paneli A-E) pokazuje sposobnost različitih CD123 x CD3 bi-specifičnih antitela da posreduju preusmerene T ćelije ubijanje ciljnih ćelija koje pokazuju različitu količinu CD123. Na slici su date krive doza-odgovor koje to pokazuju CD123 x CD3 bi-specifično dijatelo optimizovano za sekvencu ("DART-A") koje ima domen koji veže albumin (DARTA) sa ABD "v / ABD") pokazao veću citotoksičnost od kontrolnog bi-specifičnog dijatela (Control DART) ili optimizovano CD123 k CD3 bi-specifično telo ("DART-B") u više tipova ciljnih ćelija: RS4-11 (Panel A); TF-1 (Panel B); Molm-13 (Panel C); Kasumi-3 (Panel D); i THP-1 (Panel E) u odnosu E: T (efektor: cilj) od 10: 1.

Slika 5 (paneli A-D) prikazuje sposobnost dijabetesa CD123 x CD3 bi-specifičnog (DART-A) optimizovanog za sekvence, CD123 k CD3 bi-specifično dijatelo optimizovano za sekvencu koje ima domen koji veže albumin (DART-A sa ABD "v / ABD") i dijagnostikovano CD123 x CD3 bi-specifično telo sa1212 k CD3 koje imaju imunoglobulin IgG Fc domen (DART-A sa Fc „v / Fc“) za posredovanje aktivacije T ćelija tokom preusmerenog ubijanja ciljnih ćelija. Slika prikazuje krive doza-odgovor koje pokazuju citotoksičnost posredovanu DART-A, DART-A v / ABD i DART-A v / Fc u Kasumi- 3 (Panel A) i THP-1 (Panel B) ćelije i prečišćene CD8 T ćelije u omjeru E: T (efektorska ćelija: ciljna ćelija) od 10: 1 (18 satna

1

inkubacija). Paneli C i D prikazuju krive reakcije doze aktiviranja T ćelija pomoću markera CD25 na CD8 T ćelije u prisustvu (Panel D) i odsustvu (Panel C) ciljnih ćelija.

Slika 6 (paneli A-B) prikazuje nivoe enzima B i perforina u CD4 i CD8 T ćelijama nakon tretmana sa CD123 k CD3 bi-specifično dijatelo (DART-A) (tabla A) ili kontrolno bispecifično telo (Control) DART) (Panel B) u prisustvu Kasumi-3 ciljnih ćelija i odmarajućih T ćelija u omjeru E: T od 10: 1.

Slika 7 (paneli A-B) prikazuje in vivo antitumorsku aktivnost sekvencije optimizovane CD123 x CD3 bi-specifične diabodi (DART-A) u nanogramima po nivoima doziranja po kilogramu. MOLM-13 ćelije (srednja ekspresija CD123) su zajedno pomešane sa T ćelijama i implantirane supkutano (T: E 1: 1) u NSG miševe. Intravenski tretman je bio jednom dnevno tokom 8 dana (KDk8) počev od implantacije. Razne koncentracije DART-A upoređene su sa kontrolnom bi-specifičnošću diabodi (Control DART). Panel A prikazuje Molm-13 ćelije same ili sa T ćelijama i efekat različitih doza DART-A na zapremini tumora čak i preko 30 dana. Panel B prikazuje efekat povećanja doza DARTA na zapremini tumora viđenom kod NSG miševa koji su primali MOLM-13 ćelije i T ćelije (T: E 1: 1) tokom vremena od 0-18 dana.

Slika 8 prikazuje in vivo antitumorsku aktivnost sekvence optimizovanog dijabetesa CD123 x CD3 bi-specific (DARTA) na RS4-11 ćelijama (SVE sa monocitnim karakteristikama). Ćelije su pomešane sa T ćelijama i implantirane subkutano (T: E 1: 1) kod NSG miševa. Intravenski tretman je bio jednom dnevno tokom 4 dana (KDk4) počevši od implantacije. Razno koncentracije DART-A upoređene su sa kontrolnim bi-specifičnim dija telom (Control DART).

Slika 9 (paneli A-B) prikazuje eksplozije CD123 u mononukleocitima koštane srži (BM MNC) i perifernoj krvi mononukleociti (PBMC) od AML pacijenta 1 (Panel A) u poređenju sa Kasumi-3 AML ćelijskom linijom (Panel B).

Na slici 10 (paneli A-C) prikazana je sposobnost sekvencijalno optimizovanog dijatela CD123 k CD3 bi-specific (DART-A) za posredovanje smanjenja eksplozije u primarnom AML za 120h (Panel A), podstaknite širenje T ćelija u primarnom AML za 120h (Panel B) i indukuju aktivaciju T ćelija u AML u 48 sati i 72 sata (Panel C).

Slika 11 (paneli A-H) prikazuje identifikaciju populacije eksplozija CD123 u primarnom uzorku SVIH PBMC. Paneli A i E prikazuju prednje i bočno rasejanje ulazne populacije

1

normalnih PBMC (Panel A) i ALL PBMC (Panel E). Paneli B i F pokazuju identifikaciju populacije limfocita kao primarno B ćelija (Panel B) i leukemične blast ćelije (Panel F). Paneli C i G pokazuju identifikaciju populacije limfocita koji jesu CD123 . Paneli D i H pokazuju identifikaciju CD19 ćelija i CD123 ćelija.

Slika 12 (paneli A-B) prikazuje identifikaciju CD4 i CD8 populacija T ćelija u primarnom uzorku SVI PBMC. Tabla A prikazuje rasejanje unapred i bočno od ulaznih SVIH PBMC-ova. Panel B prikazuje CD4 ili CD8 populacije T ćelija prisutnih u uzorcima. Brojevi ukazuju da CD4 T ćelije predstavljaju približno 0,5% ukupnih ćelija i CD8 T ćelije predstavljaju približno 0,4% ukupnih ćelija prisutnih u uzorku SVIH PBMC.

Slika 13 (paneli A-H) prikazuje sposobnost dijabetesa CD123 x CD3 bi-specifičnog (DART-A) optimizovanog za sekvence za posredovanje SVIH eksplozija sa autolognim CTL-om. Paneli A i E pokazuju prednje i bočno rasejanje ulaza populacija normalnih PBMC (Panel A) i SVIH PBMC (Panel E). PBMC nisu bili tretirani (paneli B i F), tretirani sa kontrolnim bispecifičnim dijatelom (Control DART) (paneli C i G) ili tretirani sa DART-A (paneli D i H) i inkubirano 7 dana, praćeno bojenjem za CD34 i CD19.

Slika 14 (paneli A-L) prikazuje sposobnost dijabetesa CD123 x CD3 bi-specifičnog (DART-A) optimizovanog za sekvence za posredovanje širenja T ćelija (paneli A, B, C, G, H i I) i aktivacije (paneli D, E, F, J, K i L) u normalnim uslovima PBMC (paneli A-F) i SVI PBMC (paneli G-L). Ćelije nisu tretirane (paneli A, D, G i J) ili su tretirane sa kontrolnim bispecifičnim dijabetesom (Control DART) (paneli B, E, H i K) ili DART-A (paneli C, F, I i L) tokom 7 dana.

Slika 15 (paneli A-C) prikazuje identifikaciju populacije AML blasta i T ćelija u primarnom uzorku AML. Tabela A prikazuje rasejanje unapred i bočno od ulaznih AML PBMC-ova. Panel B prikazuje identifikaciju AML-a populacija eksplozija u uzorku AML. Panel C prikazuje identifikaciju populacije T ćelija u uzorku AML.

Slika 16 (paneli A-C) prikazuje sposobnost dijabetesa specifičnog za CD123 x CD3 bispecifično (DART-A) da posreduje u smanjenju AML eksplozije autolognim širenjem CTL i T ćelija. Primarni PBMC AML od pacijenta 2 su inkubirani sa PBS, kontrolnim bi-specifičnim dijabetesom (Control DART) ili DART-A tokom 144h. Blast ćelije (Panel A), Prebrojane su CD4 T ćelije (Panel B) i CD8 T ćelije (Panel C).

1

Slika 17 (paneli A-D) pokazuje sposobnost dijabetesa CD123 x CD3 bi-specific (DART-A) optimizovanog za sekvence da posreduje u aktiviranju T ćelija u AML. Izraz CD25 (Panel A) i Ki-67 (Panel B) je određen za CD4 i CD8 T ćelije AML pacijenta 2 nakon inkubacije sa kontrolnim bi-specifičnim dijatelom (Control DART) ili DARTA sa autolognim PBMC. Za CD4 je određen nivo perforina (Panel C) i granzima B (Panel D) i CD8 T ćelije AML pacijenta 2 nakon inkubacije sa Control DART ili DART-A sa autolognim PBMC.

Slika 18 (paneli A-D) pokazuje da je sposobno za sekvencu optimizovano CD123 x CD3 bispecifično telo (DART-A) unakrsne reakcije sa proteinima CD123 i CD3 kao i sa ljudima i sa primatima. Paneli prikazuju BIACORE ™ senzogram tragovi rezultata analiza sprovedenih za procenu sposobnosti DART-A da se veže za čoveka (paneli A i C) I nehumani primati (paneli B i D) CD3 (paneli A i B) i CD123 (paneli C i D) proteini. KD date su vrednosti.

Slika 19 (paneli A-B) pokazuje sposobnost dijabetesa CD123 x CD3 bi-specifičnog (DART-A) optimizovanog za sekvence da posreduje autologno iscrpljivanje monocita in vitro sa PBMC-ima kod ljudi i majmuna cinomolgus. Prisutni paneli rezultati krive doze-odgovora DART-A posredovane citotoksičnosti sa primarnim humanim PBMC (Panel A) ili PBMC majmuna cinomolgus (Panel B).

Slika 20 (paneli A-N) pokazuje sposobnost dijabetesa CD123 x CD3 bi-specifičnog (DART-A) optimizovanog za sekvence da posreduje u iscrpljivanju pDC kod majmuna cinomolgus bez sistemske indukcije citokina. Emisija A-D panela rezultati kontrole dobijeni u 4h i 4d sa vozilom i nosačem. Paneli E-H prikazuju rezultate kontrole dobijene u 4h I 4d sa kontrolnim bi-specifičnim dija-telom (Control DART). Paneli I-N prikazuju rezultate dobijene za 4h i 4d pri 10 ng / kg / da pri 4d sa 30 ng / kg / d DART-A.

Slika 21 (paneli A-D) prikazuje sposobnost dijamanta CD123 x CD3 bi-specifičnog (DART-A) optimizovanog za sekvence da posreduje u zavisnosti od doze osiromašenja pDC kod majmuna cinomolgus. Majmunima Cinomolgus su dozirane DART-A pri 0,1, 1, 10, 30100, 300 ili 1000 ng / kg. PBMC su procenjeni u naznačeno vreme i ukupne B ćelije (Panel A), prebrojani su monociti (Panel B), NK ćelije (Panel C) i pDC (Panel D).

Slika 22 (paneli A-D) pokazuje sposobnost dijabetesa CD123 x CD3 bi-specifičnog (DART-A) optimizovanog za sekvence da povremeno moduliraju T ćelije kod majmuna cinomolgus. Majmunima Cinomolgus su dozirani DART-A na at 0,1, 1, 10, 30100, 300 ili

1

1000 ng / kg. PBMC su procenjeni u naznačeno vreme i ukupne T ćelije (Panel A), Prebrojane su CD4 T ćelije (Panel B), CD69 ćelije (Panel C) i CD8 T ćelije (Panel D).

Slika 23 prikazuje SDS-PAGE analizu prečišćenog DART-A proteina pod redukcionim (levo) i nereduktivnim (desno) uslovi.

Slike 24A-24B pokazuju fizičko-hemijske karakteristike prečišćenog DART-A. Slika 24A: SEC profil DARTA protein na kalibrisanoj koloni TSK G3000SVkL. Slika 24B: Maseni spektar DART-A proteina.

Slike 25A-25D pokazuju SPR analizu vezivanja DART-A za imobilisani CD123 čoveka ili majmuna cynomolgus i CD3. Isprekidane linije predstavljaju globalno uklapanje u 1: 1 Langmuir-ov model dobijenih eksperimentalnih krivih vezivanja u koncentracijama DART-A od 0, 6.25, 12.5, 25, 50 ili 100 nM (neprekidne linije). Podaci su reprezentativni za tri nezavisni eksperimenti.

Slike 26A-26E pokazuju da je DART-A mogao istovremeno povezati i CD3 i CD123. Slika 26A- 26B daje rezultate bifunkcionalne ELISA analize i pokazuje istovremeno angažovanje oba ciljana antigena DART-A. ELISA ploče su presvučene humanim CD123 (slika 26A) ili CD123 majmuna cinomolgus (slika 26B). Titriranje DART-A i kontrolne DART koncentracije praćeno je detekcijom sa humanim CD3-biotinom. Slike 26C-26E pokazuju vezivanje DART-A za ćelijsku površinu na ciljnoj ćeliji CD123 Molm-13 (slika 26C), humani T ćelije (slika 26D) i cinomolgus T ćelije (slika 26E). Vezivanje je otkriveno FACS analizom koristeći monoclonal antitelo specifično za E-zavojnicu i K-zavojnicu DART-A ili Control DART molekula.

Slike 27A-27H pokazuju sposobnost DART-A da posreduje u preusmerenom ubijanju ciljne ćelije pomoću efektora čoveka ili majmuna ćelije protiv CD123 Kasumi-3 leukemičnih ćelijskih linija, pokazuju sposobnost molekula da se vežu za podskupove normalni cirkulišući leukociti, uključujući pDC i monocite, i pokazuju sposobnost molekula da iscrpe CD14-CD123visoke ćelije (pDC i bazofili) bez uticaja na monocite (CD14 ćelije).

Slika 27A prikazuje relativna mesta vezivanja anti-CD123-PE na ćelijskim linijama leukemije U937 i Kasumi-3, kako je utvrđeno KFACS analizom.

Slika 27B prikazuje relativno nizak procenat citotoksičnosti posredovane DART-A ili Control DART na AML ćelijskoj liniji (Ćelije U937) koje, kao što je prikazano na slici 27A, imaju relativno malo mesta za vezivanje CD123). Slika 27C prikazuje procenat citotoksičnost

2

posredovana DART-A ili Control DART u prisustvu prečišćenih humanih T ćelija (kao efektorske ćelije) na AML ćelijska linija (ćelije Kasumi-3) koje, kao što je prikazano na slici 27A, imaju značajan broj CD123 mesta vezivanja.

Na slikama 27B-27C, odnos E: T je 10: 1. Slika 27D prikazuje procenat citotoksičnosti posredovane DART-A ili Kontrolišite DART u prisustvu prečišćenih PBMC majmuna cinomolgus (kao efektorske ćelije) na ćelijama Kasumi-3 (E: T odnos je 15: 1) i pokazuje da DART-A može da veže T ćelije majmuna cinomolgus. Slika 27E prikazuje relativnog mesta vezivanja protiv CD123-PE na ćelijama Kasumi-3, ljudskim monocitima, ljudskim plazmocitoidnim dendritičnim ćelijama („pDC“), monociti majmuna cinomolgus i plazmocitoidne dendritične ćelije majmuna cinomolgus majmuna kako je određeno KFACS analiza. Slika 27F prikazuje sposobnost DART-A da iscrpi ćelije CD14-CD123lo. Slika 27G pokazuje sposobnost DART-A za iscrpljivanje ćelija CD14-CD123Hi čoveka. Slika 27H prikazuje sposobnost DART-A da iscrpi cynomolgus majmun CD14- CD123Hi ćelije. Citotoksičnost je određena oslobađanjem LDH, sa EC50 vrednostima utvrđenim korišćenjem GraphPad PRISM® softver.

Slika 28 prikazuje upotrebu modela sa dva odeljenja za procenu farmakokinetičkih parametara DART-A. Podaci pokazuju kraj infuzione (EOI) serumske koncentracije DART-A kod majmuna cinomolgus nakon prijema 96- satna infuzija pri 100 ng / kg / dan 300 ng / kg / dan, 600 ng / kg / dan i 1000 ng / kg / dan Doza. Svaka tačka predstavlja znak pojedinačna životinja; vodoravne linije predstavljaju srednju vrednost za doznu grupu.

Slike 29A-29C prikazuju efekat infuzija DART-A na proizvodnju citokina, IL-6. Nivo seruma IL-6 (prosečno 6 SEM) kod majmuna infuziranih DART-A prikazane su u grupi za lečenje. Lečeni su majmuni Cinomolgus sa kontrolom vozila 1. dana, praćene 4 nedeljne infuzije bilo kog vozila (grupa 1) (slika 29A) ili DART-A primenjuje se u obliku četvorodnevnih sedmičnih infuzija počev od dana 8, 15, 22 i 29 (grupe 2-5) (slika 29B) ili kao 7-dnevna / sedmična infuzija tokom 4 nedelje počev od 8. dana (grupa 6) (slika 29C). Intervali lečenja označeni su sa ispunjene sive šipke.

Slike 30A-30F prikazuju efekat infuzije DART-A na iscrpljivanje CD14- / CD123 ćelija (slike 30A-30C) i CD303 ćelije (slike 30D-30F). Srednja vrednost 6 SEM nivoa cirkulacije CD14- / CD123 (slike 30A- 30C) ili CD303 (slike 30D-30F) po danu studija i po grupama. Lečeni su majmuni Cinomolgus kontrola vozila prvog dana, praćena 4 infuzije nedeljno bilo kojim vozilom (grupa 1) (slike 30A i 30D) ili DARTA primenjene u obliku četvorodnevnih sedmičnih infuzija počev od dana 8, 15, 22 i 29 (grupe 2-5) (slike 30A i 30E) ili kao infuzija od 7 dana u nedelji tokom 4 nedelje počev od Dana 8 (Grupa 6) (Slike 30C i 30F). Intervali lečenja označene su ispunjenim sivim trakama.

Slike 31A-31I prikazuju uočene promene u populacijama T ćelija (slike 31A-31C), CD4 populacije ćelija (Slike 31D-31F) i populacije ćelija CD8 (Slike 31G-31I) koje su primale DART-A primenjene u obliku infuzije od 4 dana počev od Dana 8, 15, 22 i 29. Legenda: CD25 (sivi kvadratići); CD69 (sivi trouglovi), PD-1 (beli trouglovi); Tim-3 (beli kvadratići). T ćelije su nabrojane preko CD4 i CD8 markera, umesto kanonskog CD3, do eliminisati moguće smetnje u DART-A. Majmuni Cinomolgus su tretirani kontrolom vozila 1. dana, praćene 4 nedeljne infuzije bilo kog vozila (grupa 1) ili DART-A davane kao četvorodnevne sedmične infuzije počev od na dan 8, 15, 22 i 29 (grupa 5) ili kao sedmodnevna infuzija tokom 4 nedelje počev od dana 8 (grupa 6). Lečenje intervali su označeni ispunjenim sivim trakama. Srednja vrednost 6 SEM apsolutnog broja ukupnih cirkulišućih T ćelija po Danu studija i prikazana je grupa (slike 31A-31C). Relativne vrednosti (srednji procenat 6 SEM) CD25 , CD69 , Prikazani su PD-1 i Tim-3 CD4 (slike 31D-31E) ili CD8 T ćelije (slike 31F-31H) prema danu studije i po grupama.

Slike 32A-32F pokazuju uočene promene populacija ćelija T CD4 (slike 32A-32C) i populacija ćelija CD8 (Slike 32D-32F) tokom i nakon kontinuirane sedmodnevne infuzije DART-A. Srednjih 6 SEM procenata CD25 , CD69 , PD-1 i Tim-3 na CD4 (slike 32A-32C) ili CD8 (slike 32D-32F) T ćelije do dana studija za grupe 2, 3 i 4 prikazani su lukovi. Lukovi intervala obrade označeni su ispunjenim sivim trakama. Legenda: CD25 (siva kvadrati); CD69 (sivi trouglovi), PD-1 (beli trouglovi); Tim-3 (beli kvadratići).

Slike 33A-33F pokazuju uočene promene populacija ćelija T CD4 (slike 33A-33C) i populacija ćelija CD8 (Slike 33D-33F) tokom i nakon kontinuirane sedmodnevne infuzije DART-A. Srednjih 6 SEM procenata CD4 naivne (CD95- / CD28 ), CMT (CD95 / CD28 ) i EMT (CD95 / CD28-) T ćelije u CD4 populaciji (slike) 33A-33C) ili populacija CD8 (slike 33D-33F) do Dana studija za grupe 2, 3 i 4 su prikazane. Cinomolgus majmuni su tretirani sa kontrolom nosača 1. dana, praćene 4 nedeljne infuzije ili DART-A primenjene kao Četvorodnevne sedmične infuzije koje počinju na dane 8, 15, 22 i 29 (grupe 2-4). Intervali lečenja označeni su sa ispunjene sive šipke. Legenda: Naivan (beli trouglovi); CMT (crni trouglovi), EMT (sivi kvadratići).

Slika 34 prikazuje DART-A posredovanu citotoksičnost protiv ćelija Kasumi-3 sa PBMC bilo od naivnih majmuna ili od majmuni lečeni višestrukim infuzijama DART-A.

Slike 35A-35F pokazuju da je izlaganje DART-A povećalo relativnu frekvenciju CD4 ćelija centralne memorije I CD8 ćelije efektorske memorije na štetu odgovarajuće populacije naivnih T ćelija. Srednjih 6 procenata SEM CD4 naivnih (CD95- / CD28 ), CMT (CD95 / CD28 ) i EMT (CD95 / CD28-) T ćelija u CD4 populaciji (slike 35A-35C) ili u populaciji CD8 (slike 35D-35F) po danu studije i po grupama. Majmuni Cinomolgus su tretirani kontrolom vozila prvog dana, praćene 4 infuzije nedeljno bilo kojim vozilom (grupa 1) ili DART-A primenjuje se u obliku četvorodnevnih nedeljnih infuzija počev od dana 8, 15, 22 i 29 (grupa 5) ili u obliku sedmodnevnih infuzija tokom 4 nedelje počev od Dana 8 (Grupa 6). Intervali tretmana označeni su ispunjenim sivim trakama. Legenda: Naivan (beli trouglovi); CMT (crni trouglovi), EMT (sivi kvadratići).

Slike 36A-36F pokazuju efekat DART-A na parametre crvenih ćelija kod majmuna koji su primili infuziju molekula. Nivoi cirkulišućeg eritrocita (slike 36A-36C) ili retikulocita (slike 36D-36F) (u proseku 6 SEM) u uzorcima prikazani su sakupljeni u naznačenim vremenskim tačkama od majmuna lečenih DART-A.

Slike 37A-37B pokazuju da učestalost (srednji procenat 6 SEM) CD123 ćelija (slika 37A) ili HSC (CD34 / CD38- / CD45- / CD90 ćelije) (slika 37B) unutar Lin-ćelijske populacije u uzorcima koštane srži u naznačenim vremenskim tačkama od majmuna lečenih DART-A. Majmuni Cinomolgus su lečeni vozilom kontrola 1. dana, praćena 4 nedeljne infuzije bilo kog vozila (grupa 1) ili DART-A koja se daje kao četvorodnevna sedmična infuzije koje počinju na dane 8, 15, 22 i 29 (grupe 2-5) ili kao sedmodnevna sedmična infuzija tokom 4 nedelje počev od dana 8 (grupa 6).

Detaljan opis pronalaska:

[0054] Opisana su bi-specifična monovalentna antitela CD123 x CD3 bi-specifična koja su sposobna da istovremeno vezujući se za CD123 i CD3 i za upotrebu takvih molekula u lečenju hematoloških malignih bolesti. Iako su ne-optimizovana CD123 k CD3 bi-specifična tela u potpunosti funkcionalna, analogno dobijenim poboljšanjima u ekspresiji gena kroz optimizaciju kodona (videti, na primer, Grosjean, H. et al. (1982) „Preferencijalna upotreba kodona u Prokariotski geni: efikasna energija interakcije kodon-antikodon i efikasna upotreba kodona Izraženi geni "Gen 18 (3): 199-209), moguće je dodatno poboljšati stabilnost i / ili funkciju CD123 k CD3 bi-specifična antitela modifikovanjem ili dorađivanjem njihovih sekvenci.

[0055] Poželjna CD123 x CD3 bi-specifična antitela iz ovog pronalaska sastoje se od najmanje dva polipeptidni lanci koji se međusobno povezuju da bi formirali jedno mesto vezivanja specifično za epitop CD123 i jedno mesto vezivanja specifično za epitop CD3 (slika 2).

2

Pojedinačni polipeptidni lanci dijatela su kovalentni vezani jedni za druge, na primer disulfidnom vezom ostataka cisteina smeštenih unutar svakog polipeptidnog lanca. Svaki polipeptidni lanac sadrži domen koji veže antigen promenljivog domena lakog lanca, vezujući antigen Domen promenljivog domena teškog lanca i domen heterodimerizacije. Intervencioni linker peptid (Linker 1) razdvaja domen vezivanja antigena promenljivog domena lakog lanca od domena vezanja antigena domena Promenljivi domen teškog lanca. Domen za vezivanje antigena promenljivog domena lakog lanca prvog polipeptida lanac komunicira sa domenom vezivanja antigena promenljivog domena teškog lanca drugog polipeptidnog lanca kako bi se formiralo prvo funkcionalno mesto vezivanja antigena koje je specifično za prvi antigen (tj. CD123 ili CD3). Slično tome, domen vezivanja za antigen promenljivog domena lakog lanca drugog polipeptidnog lanca komunicira sa domen za vezivanje antigena promenljivog domena teškog lanca prvog polipeptidnog lanca kako bi se formirao drugi funkcionalno mesto vezivanja antigena koje je specifično za drugi antigen (tj. CD123 ili CD3, u zavisnosti od identitet prvog antigena). Dakle, izbor domena koji vezuje antigen promenljivog domena lakog lanca I koordiniraju se domeni vezivanja antigena promenljivog domena teškog lanca prvog i drugog polipeptidnog lanca, tako da dva polipeptidna lanca zajedno čine domene vezivanja antigena lakog i teškog lanca Promenljivi domeni koji se mogu vezati za CD123 i CD3.

[0056] Formiranje heterodimera prvog i drugog polipeptidnog lanca može se pokretati heterodimerizovanjem domeni. Takvi domeni uključuju GVEPKSC (SEK ID NO: 50) (ili VEPKSC; SEK ID NO: 51) na jednom polipeptidnom lancu i GFNRGEC (SEK ID NO: 52) (ili FNRGEC; SEK ID NO: 53) na drugom polipeptidnom lancu (US2007 / 0004909). Alternativno, takvi domeni mogu biti projektovani tako da sadrže zavojnice suprotnih naboja. Domen heterodimerizacije jedan od polipeptidnih lanaca sadrži sekvencu od najmanje šest, najmanje sedam ili najmanje osam pozitivno naelektrisanih aminokiseline, a domen heterodimerizacije drugog polipeptidnog lanca sadrži sekvencu od najmanje šest, najmanje sedam ili najmanje osam negativno naelektrisanih aminokiselina. Na primer, prva ili druga heterodimerizacija domen će poželjno sadržavati sekvencu od osam pozitivno naelektrisanih aminokiselina, a drugu heterodimerizovanu domeni će poželjno sadržavati sekvencu od osam negativno naelektrisanih aminokiselina. Pozitivno naelektrisani amino kiselina može biti lizin, arginin, histidin i / ili negativno naelektrisana aminokiselina može biti glutaminska kiselina ili asparaginska kiselina. Pozitivno naelektrisana aminokiselina je poželjno lizin i / ili negativno naelektrisana aminokiselina je poželjno glutaminska kiselina.

[0057] CD123 x CD3 bi-specifična antitela iz ovog pronalaska su projektovana tako da takva prva i druga polipeptidni lanci se kovalentno vezuju jedni za druge preko ostataka cisteina duž njihove dužine. Takvi ostaci cisteina mogu biti uvedeni u interventni linker koji razdvaja VL i VH domene polipeptida. Alternativno, I još poželjnije, drugi peptid (Linker 2) se uvodi u svaki polipeptidni lanac, na primer, na aminoterminusu polipeptidnih lanaca ili položaj koji postavlja Linker 2 između domena heterodimerizacije I Domen za vezivanje antigena promenljivog domena lakog lanca ili promenljivi domen teškog lanca.

[0058] U konkretnim opisima, sekvencijski optimizovana CD123 x CD3 bi-specifična monovalentna antitela sadašnjosti otkriće dalje sadrže imunoglobulin Fc domen ili domen koji veže albumin da bi se produžio poluživot in vivo. [0059] CD123 k CD3 bi-specifična monovalentna antitela iz ovog pronalaska koja sadrže immunoglobulin Fc domen (tj. CD123 x CD3 bi-specifična monovalentna Fc tela) sastoje se od prvog polipeptidnog lanca, drugog polipeptidni lanac i treći polipeptidni lanac. Prvi i drugi polipeptidni lanci međusobno se povezuju sa formiraju jedno mesto vezivanja specifično za epitop CD123 i jedno mesto vezivanja specifično za epitop CD3. Prvi polipeptidni lanac i treći polipeptidni lanac međusobno se povezuju da bi formirali imunoglobulin Fc domen (Slika 3A i slika 3B). Prvi i drugi polipeptidni lanci bi-specifičnog monovalentnog Fc dija tela su kovalentno vezane jedna za drugu, na primer disulfidnom vezom ostataka cisteina smeštenih unutar svakog polipeptida lanac.

[0060] Prvi i treći polipeptidni lanci su kovalentno povezani jedni sa drugima, na primer disulfidnom vezom ostataka cisteina smeštenih unutar svakog polipeptidnog lanca. Prvi i drugi polipeptidni lanac sadrže po jedan Domen za vezivanje antigena promenljivog domena lakog lanca, domen za vezivanje antigena promenljive teškog lanca Domen i domen heterodimerizacije. Intervencioni vezni peptid (Linker 1) razdvaja domen za vezanje antigena promenljivog domena lakog lanca iz domena vezanja antigena promenljivog domena teškog lanca. Antigen Vezujući domen promenljivog domena lakog lanca prvog polipeptidnog lanca komunicira sa vezivanjem antigena Domen promenljivog domena teškog lanca drugog polipeptidnog lanca kako bi se formirao prvi funkcionalni antigen mesto vezivanja koje je specifično za prvi antigen (tj. CD123 ili CD3). Slično tome, domen vezanja antigena Laki lanac promenljivi domen drugog polipeptidnog lanca komunicira sa antigen vezujućim domenom teškog Lančani promenljivi domen prvog polipeptidnog lanca kako bi se formiralo drugo funkcionalno mesto vezivanja antigena koje je specifični za drugi antigen (tj. CD3 ili CD123, u zavisnosti od identiteta prvog antigena). Prema tome izbor domena vezivanja antigena promenljivog domena lakog lanca i domena vezivanja antigena domena Varijabilni domen teškog lanca prvog i drugog polipeptidnog lanca su koordinirani, tako da dva polipeptida lanci kolektivno sadrže domene vezanja antigena i promenljive domene teškog lanca sposobni za vezivanje do CD123 i CD3. Svaki od prvih i trećih polipeptidnih lanaca sadrži deo ili sve domene CH2 i / ili neke od njih sav CH3 domen kompletnog Fc domena imunoglobulina i peptid koji sadrži cistein. Neki ili svi CH2 domen i / ili neki ili svi CH3 domeni udružuju se da bi formirali imunoglobulin Fc domen bispecifičnog monovalentna Fc tela u ovom otkriću. Prvi i treći polipeptidni lanci bi-specifičnih monovalentna Fc tela u ovom otkriću su kovalentno vezana jedno za drugo, na primer disulfidom vezivanje ostataka cisteina smeštenih unutar peptida koji sadrži cistein polipeptidnih lanaca.

2

I. Dijatelo specifično za CD123 k CD3 optimizovano za sekvencu, "DART-A"

[0061] Opisano je bi-specifično dijatelo optimizovano za sekvencu sposobno da se istovremeno i specifično veže za njega epitop CD123 i na epitop CD3 (bi-specifično dijatelo "CD123 x CD3" ili DART-A). Kao što je objašnjeno u nastavku, Utvrđeno je da DART-A pokazuje pojačanu funkcionalnu aktivnost u odnosu na druge bispecifične CD123 x CD3 optimizovane bez sekvence dijatela sličnog sastava, i tako se naziva dijabetesom CD123 x CD3 bi-specifično "optimizovano za sekvencu". [0062] Dija-telo specifično za CD123 x CD3 bi-specifično (DART-A) optimizovano za sekvencu sadrži prvi polipeptidni lanac I drugi polipeptidni lanac. Prvi polipeptidni lanac bi-specifičnog dijatela će se sastojati od N-terminala do Cterminala smer, N-kraj, promenljivi domen lakog lanca (VL domen) monoklonskog antitela sposobnog za vezujući se za CD3 (VLCD3), intervenirajući linker peptid (Linker 1), promenljivi domen teškog lanca (VH domen) monoklonsko antitelo sposobno da se veže za CD123 (VHCD123) i C-kraj. Poželjna sekvenca za takav VLCD3 Domen je SEK ID NO: 21:

[0063] Domen za vezanje antigena VLCD3 sadrži CDR1 SEK ID NO: 38: RSSTGAVTTSNIAN, CDR2 SEK ID NO: 39: GTNKRAP i CDR3 SEK ID NO: 40: ALVISNLVV.

[0064] Poželjna sekvenca za takav Linker 1 je SEK ID NO: 29: GGGSGGGG. Poželjna sekvenca za takav VHCD123 domen je SEK ID NO: 26:

[0065] Domen za vezanje antigena VHCD123 sadrži CDR1 SEK ID NO: 47: DIIMK, CDR2 SEK ID NO: 48: DIIPSNGATFINKKFKG i CDR3 SEK ID NO: 49: SHLLRAS.

[0066] Drugi polipeptidni lanac će sadržati, u smeru od N-kraja do C-kraja, N-kraj, VL domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD123 (VLCD123), intervenirajući linker peptid (npr. Linker 1), VH domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD3 (VHCD3) i C-kraj. Poželjna sekvenca za takav VLCD123 domen je SEK ID NO: 25:

2

[0067] Domen za vezanje antigena VLCD123 sadrži CDR1 SEK ID NO: 44: KSSKSLLNSGNKKNILT, CDR2 SEK ID NO: 45: VASTRES i CDR3 SEK ID NO: 46: KNDISIPIT.

[0068] Poželjna sekvenca za takav VHCD3 domen je SEK ID NO: 22:

[0069] Domen za vezanje antigena VHCD3 sadrži CDR1 SEK ID NO: 41: TIAMN, CDR2 SEK ID NO: 42: RIRSKINNIATIIADSVKD i CDR3 SEK ID NO: 43: HGNFGNSIVSVFAI.

[0070] Ovde opisana bi-specifična antitela CD123 k CD3 optimizovana za sekvencu su projektovana tako da takva prvi i drugi polipeptidi kovalentno se vezuju jedni za druge preko ostataka cisteina duž njihove dužine. Takav cistein ostaci se mogu uvesti u intervenirajući linker (npr. Linker 1) koji razdvaja VL i VH domene polipeptidi. Alternativno, i još poželjnije, drugi peptid (Linker 2) se uvodi u svaki polipeptidni lanac, na primer, na položaju N-terminal do VL domena ili C-terminal do VH domena takvog polipeptidnog lanca. A. poželjna sekvenca za takav Linker 2 je SEK ID NO: 30: GGCGGG.

[0071] Stvaranje heterodimera može se voditi daljim inženjeringom takvih polipeptidnih lanaca da sadrže polipeptid zavojnice suprotnog naboja. Prema tome, u poželjnom opisu, jedan od polipeptidnih lanaca će biti projektovan da sadrži domen „E-zavojnice“ (SEK ID NO: 34: EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK) čiji će ostaci činiti negativan puni se na pH 7, dok će drugi od dva polipeptidna lanca biti projektovan tako da sadrži domen „K-zavojnice“ (SEK ID NE: 35: KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE) čiji će ostaci stvarati pozitivan naboj pri pH 7. Prisustvo takvih naelektrisanih domena promoviše povezanost između prvog i drugog polipeptida i na taj način podstiče heterodimerizovanje. [0072] Nije bitno koja je zavojnica dovedena do prvog ili drugog polipeptidnog lanca. Međutim, poželjna sekvenca je optimizovana CD123 k CD3 bi-specifično dijatelo, ovde opisano, ("DART-A") ima prvi polipeptidni lanac koji ima sekvenca (SEK ID NO: 1):

2

[0075] DART-A Lanac 2 sastoji se od: SEK ID NO: 25 - SEK ID NO: 29 - SEK ID NO: 22 - SEK ID NO: 30 - SEK ID NE: 35. Polinukleotid koji kodira DART-A lanac 2 je SEK ID NO: 4:

2

[0076] Kao što je dole diskutovano, utvrđeno je da dijabetes telo specifično za CD123 x CD3 bispecifično (DART-A) ima sposobnost simultanog vezivanja CD123 i CD3 u nizu ljudskih i majmunskih ćelija. Obezbeđenje DART-A je bilo utvrđeno je da uzrokuje aktivaciju T ćelija, posreduje u smanjenju eksplozije, pokreće ekspanziju T ćelija, indukuje aktivaciju T ćelija I izazvati preusmereno ubijanje ciljnih ćelija karcinoma.

II. Uporedni CD123 x CD3 Bi-Specific Diabodi optimizovan za sekvencu, "DART-B"

[0077] DART-B je ne-sekvencijalno optimizovano CD123 k CD3 bi-specifično telo sa bruto strukturom koja je slična onom iz DART-A. Prvi polipeptidni lanac DART-B će sadržati Nterminus, u smeru od N-kraja do C-kraja, VL domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD3 (VLCD3), intervenirajući linker peptid (Linker 1), VH domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD123 (VHCD123), intervenišući Linker 2, E-kalem Domen i C-kraj. VLCD3 domen prvog polipeptidnog lanca DART-B ima sekvencu (SEK ID NO: 23):

[0078] VHCD123 domen prvog polipeptidnog lanca DART-B ima sekvencu (SEK ID NO: 28):

2

[0081] Drugi polipeptidni lanac DART-B će sadržati, u smeru od N-kraja do C-kraja, N-kraj, VL domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD123 (VLCD123), intervenirajući linker peptid (Linker 1) i VH domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD3 (VHCD3), intervenišući Linker 2, K-coil domen, i C-kraj.

[0082] VLCD123 domen drugog polipeptidnog lanca DART-B ima sekvencu (SEK ID NO: 27):

1

III. Modifikovane varijante sekvence optimiziranog CD123 x CD3 Bi-Specific Diabodi (DART-A)

A. CD123 x CD3 bi-specifično telo sa optimizovanom sekvencom koje ima domen koji veže albumin (DART-A sa ABD "sa ABD")

[0086] Dodatno opisano, sekvencom optimizovano CD123 x CD3 bi-specifično dijatelo (DART-A) sadrži jedan ili više domena koji veže albumin ("ABD") (DART-A sa ABD "v / ABD") na jednom ili oba polipeptidna lanca diatela.

[0087] Kao što je otkriveno u WO 2012/018687, u cilju poboljšanja in vivo farmakokinetičkih svojstava dijatela, dijatela mogu biti modifikovana tako da sadrže polipeptidni deo proteina koji veže serum na jednom ili više krajeva dijabodi. Najpoželjnije je da takav polipeptidni deo proteina koji veže serum bude instaliran na C-kraju dijabodi. Posebno poželjni polipeptidni deo proteina koji veže serum za ovu svrhu je albumin-Vezujući domen (ABD) iz streptokoknog proteina G. Domena za vezanje albumina 3 (ABD3) proteina G streptokoka soj G148 je posebno poželjan.

[0088] Domen za vezivanje albumina 3 (ABD3) proteina G Streptococcus soja G148 sastoji se od 46 aminokiselina ostaci koji čine stabilan snop od tri zavojnice i imaju široku specifičnost za vezivanje albumina (Johansson, M.U. i sar. (2002) „Struktura, specifičnost i način interakcije za bakterijske module koji vezuju albumine“, J. Biol. Chem. 277 (10): 8114-8120). Albumin je najzastupljeniji protein u plazmi i ima poluživot od 19 dana kod ljudi. Albumin poseduje nekoliko mesta za vezivanje malih molekula koja mu omogućavaju da se nekovalentno veže za druge proteine i da se time produžava njihov poluživot u serumu.

2

[0089] Dakle, prvi polipeptidni lanac takvog dia-tela specifičnog za CD123 x CD3 bi-specifičnog sekvencije ima Domen za vezivanje albumina sadrži treći povezivač (Linker 3), koji razdvaja E-zavojnicu (ili K-zavojnicu) takvog polipeptida lanac iz domena koji veže albumine. Poželjna sekvenca za takav Linker 3 je SEK ID NO: 31: GGGS. Preferirana Domen za vezivanje albumina (ABD) ima sekvencu (SEK ID NO: 36): LAEAKVLANRELDKIGVSDIIKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALP.

[0090] Dakle, poželjni prvi lanac dijabetesa CD123 k CD3 bi-specifičnog optimizovanog za sekvencu koji ima albumin-Vezujući domen ima sekvencu (SEK ID NO: 9):

[0091] Dijatelo CD123 x CD3 optimizovano za sekvencu koje ima domen koji veže albumin sastoji se od: SEK ID NO: 21 - SEK ID NO: 29 - SEK ID NO: 26 - SEK ID NO: 30 - SEK ID NO: 34 - SEK ID NO: 31 - SEK ID NO: 36. A. olinukleotid koji kodira takvo CD123 x CD3 dijatelo optimizovano za sekvencu koja ima derivat domena koji veže albumin ative je SEK ID NO: 10:

[0092] Drugi polipeptidni lanac takvog dijabetesa CD123 x CD3 optimizovanog za sekvencu koji ima vezujuće albumin Domen ima gore opisanu sekvencu (SEK ID NO: 3) i kodiran je polinukleotidom koji ima sekvence SEK ID NO: 4.

B. Dvospecifična tela sa opticajem CD123 x CD3 k CD3 koja imaju IgG Fc domen (DART-A sa Fc "v / Fc")

[0093] Dodatno je opisano CD123 x CD3 bi-specifično dija-telo optimizovano za sekvencu sastavljeno od tri polipeptida lanci i poseduju IgG Fc domen (DART-A sa Fc „v / Fc“ verzija 1 i verzija 2) (slika 3A-3B).

[0094] Da bi se formirao takav IgG Fc domen, prvi i treći polipeptidni lanac dijatelesa sadrže, u Nterminalu do C-terminalnog smera, peptid koji sadrži cistein, (najpoželjnije Peptid 1 koji ima aminokiselinsku sekvence (SEK ID NO: 55): DKTHTCPPCP), neki ili svi CH2 domeni i / ili neki ili svi CH3 domeni kompletan Fc domen imunoglobulina i C-kraj. Neki ili svi CH2 domeni i / ili neki ili svi saradnik domena CH3 za formiranje imunoglobulinskog Fc domena bi-specifičnog monovalentnog Fc domena koji sadrži ovde opisana dijatela. Prvi i drugi polipeptidni lanci opisanih bi-specifičnih monovalentnih Fc tela ovde su kovalentno vezani jedni za druge, na primer disulfidnom vezom ostataka cisteina koji se nalaze unutar peptid polipeptidnih lanaca koji sadrži cistein.

[0095] CH2 i / ili CH3 domeni prvog i trećeg polipeptida ne moraju biti identični i povoljno su modifikovani da podstiču kompleksiranje između dva polipeptida. Na primer, zamena aminokiselina (poželjno supstitucija sa aminokiselinom koja sadrži glomaznu bočnu grupu koja formira ’dugme’, npr. triptofan) može se uvesti u CH2 ili CH3 domen takav da će sterička interferencija sprečiti interakciju sa slično mutiranim domenom i hoće obavezati mutirani domen na uparivanje sa domenom u kojem je bila komplementarna ili prilagodljiva mutacija projektovano, tj. „rupa“ (npr. supstitucija glicinom). Takvi setovi mutacija mogu se inženjerirati u bilo koji par polipeptidi koji sadrže bi-specifični monovalentni molekul Fc dija tela, i dalje, projektovani u bilo koji deo polipeptidni lanci pomenutog para. Metode inženjerstva proteina koje favorizuju heterodimerizaciju u odnosu na homodimerizaciju su dobro poznati u struci, posebno

4

u pogledu inženjerstva molekula sličnih imunoglobulinu, i obuhvaćeni su ovde (vidi, na primer, Ridgvai et al. (1996) "’ Knobs-Into-Holes ’Engineering Of Antbodi CH3 Domains for Heavi Chain Heterodimerizacija, "Protein Engr. 9: 617-621, Atvell et al. (1997)" Stabilni heterodimeri iz preoblikovanja domena Interfejs homodimera pomoću biblioteke Phage Displai, "J. Mol. Biol.

270: 26-35, i Ksie et al. (2005)" Novi format Bispecifičnih antitela: visoko efikasna heterodimerizacija, ekspresija i liza tumorskih ćelija, "J. Immunol. Methods 296: 95-101). Poželjno je da je „dugme“ napravljeno u domenima CH2-CH3 prvog polipeptidnog lanca i „rupe“ je inženjerizovan u CH2-CH3 domene trećeg polipeptidnog lanca. Tako će „dugme“ pomoći u sprečavanju prvog polipeptidni lanac od homodimerizovanja preko njegovih CH2 i / ili CH3 domena. Kao treći polipeptidni lanac poželjno sadrži supstituciju „rupe“ koju će heterodimerizovati prvim polipeptidnim lancem, kao i homodimerizovati samim sobom. Preferirano dugme se kreira modifikovanjem izvornog IgG Fc domena da sadrži modifikaciju T366V. Preferirana rupa je stvoren modifikovanjem izvornog IgG Fc domena da sadrži modifikaciju T366S, L368A i I407V. Za pomoć u prečišćavanju treći homodimer polipeptidnog lanca iz konačnog bi-specifičnog monovalentnog Fc dijatela koji sadrži prvo, drugo I treći polipeptidni lanci, poželjno je mesto vezivanja proteina A CH2 i CH3 domena trećeg polipeptidnog lanca mutiran supstitucijom aminokiselina na položaju 435 (H435R). Tako se treći homodimer polipeptidnog lanca neće vezati na protein A, dok će bi-specifično monovalentno Fc telo u celini zadržati sposobnost da veže protein A putem vezivanja proteina A mesto na prvom lancu polipeptida.

[0096] Poželjna sekvenca za CH2 i CH3 domene Fc domena antitela prisutna u prvom polipeptidu lanac je (SEK ID NO: 56):

[0097] Poželjna sekvenca za CH2 i CH3 domene Fc domena antitela prisutna u trećem polipeptidu lanac je (SEK ID NO: 11):

C. DART-A v / Fc Verzija 1 Konstrukcija

[0098] Da bi se ilustrovala takva Fc tela, obezbeđen je DART-A v / Fc verzija 1 konstrukcije. Prvi polipeptid konstrukcije DART-A v / Fc verzije 1 sadrži, u smeru od N-terminala do C-terminala, N-kraj, VL domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD123 (VLCD123), intervenirajući linker peptid (Linker 1), VH domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD3 (VHCD3), Linker 2, E-coil domen, Linker 5, Peptid 1, a polipeptid koji sadrži CH2 i CH3 domene Fc domena i C-kraja. Poželjni Linker 5 ima sekvenca (SEK ID NO: 32): GGG. Poželjni polipeptid koji sadrži CH2 i CH3 domene Fc domena ima sekvencu (SEK ID NO: 37):

[0099] Dakle, prvi polipeptid takvog DART-A v / Fc verzije 1 konstrukta sastoji se od: SEK ID NO: 25 – SEK ID NO: 29 - SEK ID NO: 22 - SEK ID NO: 30 - SEK ID NO: 34 - SEK ID NO: 32 -SEK ID NO: 55 - SEK ID NO: 37.

[0100] Poželjna sekvenca prvog polipeptida takvog DART-A v / Fc verzija 1 konstrukcije ima sekvence (SEK ID NO: 13):

[0101] Poželjni polinukleotid koji kodira takav polipeptid je (SEK ID NO: 14):

[0102] Drugi lanac takve konstrukcije DART-A v / Fc verzije 1 će se sastojati od N-terminala do C-terminala smer, N-kraj, VL domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD3 (VLCD3), intervenier linker peptid (Linker 1), VH domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD123 (VHCD123), Linker 2, K-kalem Domen i C-kraj. Dakle, drugi polipeptid takve konstrukcije DART-A v / Fc verzije 1 sastoji se od: SEK ID NO: 21 - SEK ID NO: 29 - SEK ID NO: 26 - SEK ID NO: 30 - SEK ID NO: 35. Takav polipeptid ima sekvence (SEK ID NO: 15):

[0103] Poželjni polinukleotid koji kodira takav polipeptid ima sekvencu (SEK ID NO: 16):

[0104] Treći polipeptidni lanac takve DART-A v / Fc verzije 1 sadržaće CH2 i CH3 domene an IgG Fc domen. Poželjni polipeptid koji se sastoji od peptida 1 (SEK ID NO: 55) i domena CH2 i CH3 Fc domena (SEK ID NO: 11) i ima sekvencu SEK ID NO: 54:

[0105] Poželjni polinukleotid koji kodira takav polipeptid ima sekvencu (SEK ID NO: 12):

D. DART-A v / Fc Verzija 2 Konstrukcija

[0106] Kao drugi primer takvog DART-A v / Fc dijatele, otkriće daje trolančano telo, "DARTA v / Fc Diabodi verzija 2 "(slika 3B).

[0107] Prvi polipeptid takve konstrukcije DART-A v / Fc verzije 2 sadrži, u N-terminalu u C-terminal smer, N-kraj, peptidni linker (Peptid 1), polipeptid koji sadrži CH2 i CH3 domene Fc Domen povezan (preko Linker-a 4) sa VL domenom monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD123 (VLCD123), intervenirajući linker peptid (Linker 1), VH domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD3 (VHCD3), Linker 2, domen K-zavojnice i C-kraj.

[0108] Poželjni polipeptid koji sadrži CH2 i CH3 domene Fc domena ima sekvencu (SEK ID NE: 37):

[0109] "Linker 4" će poželjno sadržavati aminokiselinsku sekvencu (SEK ID NO: 57): APSSS. Poželjni "Linker 4" ima sekvencu (SEK ID NO: 33): APSSSPME. Dakle, prvi polipeptid takve konstrukcije DART-A v / Fc verzije 2 sastoji se od: SEK ID NO: 55 - SEK ID NO: 37 - SEK ID NO: 33 - SEK ID NO: 25 - SEK ID NO: 29 - SEK ID NO: 22 - SEK ID NO: 30 - SEK ID NO: 35. Polipeptid koji ima takvu sekvencu je (SEK ID NO: 17):

[0110] Poželjni polinukleotid koji kodira takav polipeptid ima sekvencu (SEK ID NO: 18):

4

[0111] Drugi polipeptidni lanac takve konstrukcije DART-A v / Fc verzije 2 sadrži, u N-terminalu do Cterminala smer, VL domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD3 (VLCD3), intervenier linker peptid (Linker 1) i VH domen monoklonskog antitela sposobnog da se veže za CD123 (VHCD123). Ovaj deo molekul je povezan (putem Linker-a 2) sa domenom E-zavojnice. Dakle, treći polipeptid takve DART-A v / Fc verzije 2 konstrukcija se sastoji od: SEK ID NO: 21 -SEK ID NO: 29 - SEK ID NO: 26 - SEK ID NO: 30 - SEK ID NO: 34. A. polipeptid koji ima takvu sekvencu je (SEK ID NO: 1), i poželjno je kodiran polinukleotidom koji ima sekvenca SEK ID NO: 2. Treći polipeptidni lanac će sadržati CH2 i CH3 domene IgG Fc domena. Poželjni polipeptid sastoji se od peptida 1 (SEK ID NO: 55) i CH2 i CH3 domena Fc domena (SEK ID NO: 11) I ima sekvencu SEK ID NO: 54.

[0113] U cilju procene aktivnosti gore pomenutih CD123 k CD3 bi-specifičnih antitela (DART-A, DART-A v / ABD, DART-A v / Fc, DART-B), proizvedeno je kontrolno bi-specifično telo (Control DART). Kontrolni DART je sposoban da se istovremeno veže za FITC i CD3. Njegova dva polipeptidna lanca imaju sledeće odgovarajuće sekvence:

Kontrolni DART lanac 1 (SEK ID NO: 19):

IV. Farmaceutske kompozicije

[0114] Sastavi iz ovog pronalaska uključuju masovne lekovite kompozicije korisne u proizvodnji farmaceutskih proizvoda kompozicije (npr. nečiste ili nesterilne kompozicije) i farmaceutske kompozicije (tj. kompozicije koje su pogodan za primenu kod subjekta ili pacijenta) koji se mogu koristiti u pripremi jediničnih oblika doziranja. Takva kompozicije sadrže profilaktički ili terapeutski efikasnu količinu CD123 k CD3 optimizovane za sekvence bi-specifična antitela iz ovog pronalaska, ili kombinacija takvih sredstava i farmaceutski prihvatljivih nosač. Poželjno je da kompozicije pronalaska sadrže profilaktički ili terapeutski efikasnu količinu CD123 x CD3 bispecifično dvotelo otkrivanja i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0115] Takođe su opisani farmaceutski sastavi koji sadrže CD123 x CD3 bi-specifičan za sekvencu optimizovani ovde opisana antitela i drugo terapeutsko antitelo (npr. specifično za monoklonsko antitelo za tumor) koje je specifično za određeni antigen karcinoma i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0116] U određenom opisu, izraz "farmaceutski prihvatljiv" znači odobren od strane regulatorne agencije savezna ili državna vlada ili navedena u američkoj farmakopeji ili drugoj opštepriznatoj farmakopeji za upotreba kod životinja, a naročito kod ljudi. Izraz "nosač" odnosi se na razblaživač, pomoćno sredstvo (npr. Freundov adjuvans (kompletan i nepotpun), pomoćna supstanca ili nosač kojim se terapija primenjuje. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući ona naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, poput kao ulje kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje i sezamovo ulje. Voda je preferirani nosač kada je farmaceutski sastav primenjuje se intravenozno. Slani rastvori i vodeni rastvori dekstroze i glicerola takođe se mogu koristiti kao tečni nosači, posebno za injekcione rastvore. Pogodne farmaceutske pomoćne supstance uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharoza, želatin, slad, pirinač, brašno, kreda, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeni obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, voda i etanol. Sastav, po želji, takođe može da sadrži manje količine sredstava za vlaženje ili emulgovanje ili sredstava za puferiranje pH. Ovi sastavi mogu imati oblik rastvora, suspenzija, emulzija, tablete, pilule, kapsule, praškovi i formulacije sa produženim oslobađanjem.

[0117] Generalno, sastojci smeša iz ovog pronalaska se isporučuju odvojeno ili pomešani zajedno u obliku jedinične doze, na primer, kao suvi liofilizovani prah ili koncentrat bez vode u hermetički zatvorenoj posudi kao što je ampula ili vrećica koja označava količinu aktivnog sredstva. Tamo gde sastav treba da administrira infuzije, može se izdati u bočici za infuziju koja sadrži sterilnu farmaceutsku vodu ili fiziološki rastvor. Gde sastav se daje injekcijom, može se obezbediti ampula sterilne vode za injekcije ili fiziološkog rastvora tako da se sastojci se mogu mešati pre primene.

[0118] Sastavi pronalaska mogu se formulisati kao neutralni ili solni oblici. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju one nastale sa anionima poput onih dobijenih iz hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline, i oni nastali sa kationima kao što su oni izvedeni iz natrijuma, kalijuma, amonijuma, kalcijuma, željeznih hidroksida izopropilamin, trietilamin, 2-etilamino etanol, histidin, prokain.

[0119] Takođe je opisano farmaceutsko pakovanje ili komplet koji sadrži jedan ili više kontejnera napunjenih optimiziranim za sekvence CD123 x CD3 bi-specifična antitela, ovde opisana, sama ili sa takvim farmaceutski prihvatljivim nosačem. Pored toga, jedno ili više drugih profilaktičkih ili terapijskih sredstava korisnih za lečenje bolesti takođe mogu biti uključeni u farmaceutsko pakovanje ili komplet. Opisano je farmaceutsko pakovanje ili komplet koji sadrži jedan ili više kontejnera napunjenih jednim ili više sastojaka farmaceutskih kompozicija iz ovog pronalaska. Po želji povezan sa takvim kontejnerom/ima može biti obaveštenje u obliku koji propisuje vladina agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskim ili biološkim

4

proizvodima, u kome obaveštenje odražava odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za ljudska administracija.

[0120] Takođe su opisani kompleti koji se mogu koristiti u gore navedenim metodama. Komplet može sadržati CD123 optimizovan za sekvence x CD3 bi-specifična antitela koja su ovde opisana. Komplet može dalje da sadrži jedan ili više drugih profilaktičkih i / ili terapijskih agensi korisni za lečenje karcinoma, u jednom ili više kontejnera; i / ili komplet može dalje da sadrži jedan ili više citotoksičnih antitela koja vezuju jedan ili više antigena raka povezanih sa rakom. U određenim opisima, drugo profilaktičko ili terapijsko sredstvo je hemoterapeut. U drugim opisima, profilaktičko ili terapijsko sredstvo je biološki ili hormonalni terapeut.

V. Metode administracije

[0121] Sastavi iz ovog pronalaska mogu se obezbediti za lečenje, profilaksu i poboljšanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, poremećajem ili infekcijom davanjem subjektu efikasnog količina fuzionog proteina ili konjugovanog molekula iz pronalaska, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži fuzioni protein ili konjugovani molekul pronalaska. U poželjnom aspektu, takve kompozicije su u osnovi prečišćeni (tj. u suštini bez supstanci koje ograničavaju njegov efekat ili proizvode neželjene neželjene efekte). U određenom Opis, subjekat je životinja, poželjno sisar kao što je neprimat (npr. govedo, konj, mačka, pas, glodavac) ili primat (npr. majmun kao što je, majmun cinomolgus, čovek). U poželjnom opisu, predmet je čovek.

[0122] Poznati su različiti sistemi za isporuku i mogu se koristiti za administriranje kompozicija pronalaska, npr. kapsulacija u liposome, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne da izraze antitelo ili fuzioni protein, endocitoza posredovana receptorima (videti, npr., Vu et al. (1987) „Receptor-posredovana in vitro transformacija gena“ Prema rastvorljivom sistemu nosača DNK, "J. Biol. Chem.262: 4429-4432), konstrukcija nukleinske kiseline kao deo retrovirusni ili drugi vektor.

[0123] Metode davanja molekula pronalaska uključuju parenteralno davanje (npr. Intradermalno, intramuskularno, intraperitonealno, intravenozno i potkožno), epiduralno i mukozno (npr. intranazalno i oralno). Takođe su opisana, ovde opisana bi-specifična antitela sa CD123 x CD3 bi-specifična, opisana ovde, primenjuju se intramuskularno, intravenozno ili potkožno. Sastavi se mogu davati bilo kojim pogodnim putem, na primer na primer, infuzijom ili bolus injekcijom, apsorpcijom kroz epitelne ili sluzokožne obloge (npr. oralna sluznica, rektalne i crevne sluznice) i može se primenjivati zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Administracija moze biti sistemski ili lokalni. Pored toga, plućna administracija se takođe može primeniti, npr. Upotrebom inhalatora ili nebulizatora, i formulacija sa aerosolnim sredstvom. Videti, na primer, američki patent br. 6,019,968; 5,985, 320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; i 4.880.078; i PCT publikacija br. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; i WO 99/66903.

[0124] Takođe opisana, spakovana CD123 x CD3 bi-specifična antitela, ovde opisana, su upakovana u hermetički zatvorenoj posudi kao što je ampula ili kesica koja označava količinu molekula. U jednom primeru, CD123 k CD3 bi-specifična antitela koja su ovde opisana isporučuju se u obliku suvog sterilisanog liofilizovanog koncentrat bez praha ili vode u hermetički zatvorenoj posudi i može se rekonstituisati, na primer, vodom ili fiziološkim rastvorom do odgovarajuće koncentracije za primenu kod subjekta. Poželjno je da je CD123 x CD3 bispecifični optimizovan za sekvence ovde opisana dijatela se isporučuju u obliku suvog sterilnog liofilizovanog praha u hermetički zatvorenoj posudi u jediničnoj dozi od najmanje 5 mg, poželjnije najmanje 10 mg, najmanje 15 mg, najmanje 25 mg, najmanje 50 mg, najmanje 100 mg ili najmanje 200 mg.

[0125] Ovde opisana liofilizovana CD123 x CD3 bi-specifična bi-specifična antitela treba da se čuvaju na između 2 i 8 ° C u svom originalnom kontejneru, a molekule treba primeniti u roku od 12 sati, po mogucnosti u roku od 6 sati, u roku od 5 sati, u roku od 3 sata ili u roku od 1 sata nakon rekonstitucije. U alternativnom opisu, CD123 x CD3 bi-specifična antitela sa sekvencom optimizovana ovde opisana isporučuju se u tečnom obliku u hermetički zatvorena posuda koja označava količinu i koncentraciju molekula, fuzionog proteina ili konjugovanog molekula. Poželjno je da se isporuče tečni oblik ovde opisanih bi-specifičnih antitela CD123 x CD3 bispecifičnih u hermetički zatvorenoj posudi u kojoj su molekuli prisutni u koncentraciji od najmanje 1 mg / ml, još poželjnije najmanje 2,5 mg / ml, najmanje 5 mg / ml, najmanje 10 mg / ml, najmanje 50 mg / ml ili najmanje 100 mg / ml. [0126] Količina kompozicije pronalaska koja će biti efikasna u lečenju, prevenciji ili poboljšanju jednog ili više simptoma povezanih sa poremećajem može se utvrditi standardnim kliničkim tehnikama. Tačna doza koja će se koristiti u formulaciji takođe će zavisiti od načina davanja i ozbiljnosti stanje, i o njemu treba odlučiti u skladu sa presudom lekara i okolnostima svakog pacijenta. Efektivne doze mogu se ekstrapolovati iz krivih doza-reakcija izvedenih iz sistema ispitivanja in vitro ili životinjskog modela.

[0127] Za ovde opisana bi-specifična antitela CD123 x CD3 bi-specifična sa optimizacijom sekvence, doza data pacijenta je poželjno odrediti na osnovu telesne težine (kg) subjekta primaoca. Primenjena doza je tipično od najmanje oko 0,3 ng / kg dnevno do oko 0,9 ng / kg dnevno, od najmanje oko 1 ng / kg dnevno do oko 3 ng / kg dnevno, od najmanje oko 3 ng / kg dnevno do oko 9 ng / kg dnevno, od najmanje oko 10 ng / kg dnevno do oko 30 ng / kg dnevno, od najmanje oko 30 ng / kg dnevno do oko 90 ng / kg dnevno, od najmanje oko 100 ng / kg dnevno do oko 300 ng / kg dnevno, od najmanje oko 200 ng / kg dnevno do oko 600 ng / kg dnevno, od najmanje oko 300 ng / kg dnevno do oko 900 ng / kg dnevno, od najmanje oko 400 ng / kg dnevno do oko 800 ng / kg dnevno, od najmanje oko 500 ng / kg dnevno do oko 1000 ng

4

/ kg dnevno, od najmanje oko 600 ng / kg dnevno do oko 1000 ng / kg dnevno, od najmanje oko 700 ng / kg dnevno do oko 1000 ng / kg dnevno, od najmanje oko 800 ng / kg dnevno dnevno do oko 1000 ng / kg dnevno, od najmanje oko 900 ng / kg dnevno do oko 1000 ng / kg dnevno, ili najmanje oko 1.000 ng / kg dnevno.

[0128] U drugom opisu, pacijentu se daje režim lečenja koji sadrži jednu ili više doza takvog profilaktički ili terapeutski efikasna količina opisanih dijabetesa CD123 x CD3 bi-specifična za sekvencu optimizovana ovde, pri čemu se režim lečenja primenjuje tokom 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana ili 7 dana. U određenim opisima, režim lečenja uključuje povremenu primenu doza profilaktički ili terapeutski efikasne količine ovde opisanih bi-specifičnih antitela CD123 x CD3 bi-specifičnih (za na primer, davanje doze 1., 2., 3. i 4. dana date nedelje, a ne davanje doze profilaktički ili terapeutski efikasna količina opisanih dijabetesa CD123 k CD3 bispecifična za sekvencu optimizovana ovde 5. dana, 6. i 7. dana iste nedelje). Tipično postoji 1, 2, 3, 4, 5 ili više kurseva lečenja. Svaki kurs može biti isti režim ili drugačiji režim.

[0129] U drugom opisu, primenjena doza eskalira tokom prve četvrtine, prve polovine ili prve dve trećine ili tri četvrtine režima (npr. tokom prvog, drugog ili trećeg režima lečenja od 4 kursa) do dnevnog profilaktički ili terapeutski efikasna količina opisanih dijabetesa CD123 k CD3 bispecifična za sekvencu optimizovana ovde se postiže.

Tabela 1 pruža 5 primera različitih gore opisanih režima doziranja za tipičan tok lečenja

[0130] Doziranje i učestalost primene ovde opisanih bi-specifičnih antitela CD123 x CD3 bispecifičnih, optimizovanih za sekvencu, mogu se smanjiti ili promeniti pojačavanjem unosa i prodiranja u tkivo bi-specifičnih antitela CD123 x CD3 bi-specifičnih modifikacijama, kao što su, na primer, lipidiranje.

4

[0131] Doziranje ovde opisanih bi-specifičnih antitela CD123 x CD3 bi-specifičnih sekvenci optimizovanih za sekvencu može se izračunati za upotrebu kao terapija pojedinačnim agensom. Alternativno, ovde opisana bispecifična antitela CD123 x CD3 optimizovana u sekvenci se koriste u kombinaciji sa drugim terapijskim kompozicijama, a doza koja se daje pacijentu je niža nego kada se pomenuti molekuli koriste kao terapija pojedinačnim agensom.

[0132] Farmaceutske smeše pronalaska mogu se primenjivati lokalno u područje kome je potrebno lečenje; to se može postići, na primer, a ne ograničavanjem, lokalnom infuzijom, injekcijom ili pomoću implantata, pri čemu je navedeni implantat od poroznog, neporoznog ili želatinoznog materijala, uključujući membrane, kao što je sialastična membrane ili vlakna. Poželjno, kada se daje molekul pronalaska, mora se voditi računa da se koriste materijali koje molekul ne apsorbuje.

[0133] Sastavi iz pronalaska mogu se isporučiti u vezikulu, naročito u liposomu (videti Langer (1990) "Nev Methods Of Drug Deliveri", Science 249: 1527-1533); Treat and al., U Liposomi u terapiji zaraznih bolesti i raka, Lopez-Berestein i Fidler (ur.), Liss, Nev Iork, str.353- 365 (1989); Lopez-Berestein, isto, str.317-327; vidi generalno ibid.).

Ovde opisane kompozicije mogu se isporučivati u sistemu sa kontrolisanim ili odloženim oslobađanjem. Bilo koji tehnika poznata stručnjaku u tehnici može se koristiti za proizvodnju formulacija sa odloženim oslobađanjem koje sadrže jednu ili više CD123 x CD3 bi-specifična antitela sa sekvencom optimizovana ovde opisana. Videti, na primer, američki patent br.

4,526,938; PCTpublication VO 91/05548; PCT publikacija VO 96/20698; Ning i sar. (1996) „Intratumoralna radioimunoterapija A. Ksenografta za rak debelog creva čoveka, koristeći gel sa produženim oslobađanjem, „Radioterapija i onkologija 39: 179-189, Song et al.

(1995) „Targeting pluća posredstvom dugo cirkulišućih emulzija posredovanih antitelima,“ PDA Journal of Pharmaceutical Science & Tehnologija 50: 372-397; Cleek i sar. (1997) „Biorazgradivi polimerni nosači za bFGF antitelo za kardiovaskularne bolesti Aplikacija, "Pro. Int’l. Simp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-854; i Lam et al. (1997)" Mikrokapsulacija Rekombinantno humanizovano monoklonsko antitelo za lokalnu isporuku, „Proc. Int’l. Simp. Control Rel. Bioact. Mater. 24: 759-760. U jednom opisu, pumpa se može koristiti u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem (videti Langer, supra; Sefton, (1987) „Implantabilne pumpe“, CRC kritika. Vlč. Biomed. Inž. 14: 201-240; Buchvald i sar. (1980) „Dugotrajni, kontinuirani intravenski Administracija heparina pomoću ugrađene pumpe za infuziju kod ambulantnih pacijenata sa rekurentnom venom Tromboza, "Hirurgija 88: 507-516; i Saudek i sar. (1989)" Prethodno ispitivanje programabilnog implantata Sistem lekova za isporuku insulina, "N. Engl. J. Med.321: 574-579). U drugom opisu, polimerni materijali mogu se koristi za postizanje kontrolisanog oslobađanja molekula (videti npr. MEDICINSKE PRIMENE KONTROLISANOG OTPUSTA, Langer i Vise (ur.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); KONTROLISANA DOSTUPNOST DROGA, DIZAJN I PERFORMANSE PROIZVODA LEKOVA, Smolen and Ball (ur.), Vilei, Nev

4

Iork (1984); Levi i sar. (1985) "Inhibicija kalcifikacije bioprotetskih srčanih ventila lokalnim difosfonatom sa kontrolisanim oslobađanjem," Nauka 228: 190-192; Tokom et al. (1989) „Kontrolisano oslobađanje dopamina iz polimernog implantata mozga: karakterizacija in vivo,“ Ann. Neurol.25: 351-356; Hovard i sar. (1989) „Intracerebralna isporuka lekova kod pacova sa lezijom Deficiti pamćenja, "J. Neurosurg. 7 (1): 105-112); Američki patent br. 5,679,377; američki patent br. 5,916,597; američki patent br. 5,912,015; Američki patent br. 5,989,463; Američki patent br.5,128,326; PCT publikacija br. WO 99/15154; i PCT objava Br. WO 99/20253). Primeri polimera koji se koriste u formulacijama sa odloženim oslobađanjem uključuju poli (2-hidroksi etil metakrilat), poli (metil metakrilat), poli (akrilna kiselina), poli (etilenko-vinil acetat), poli (metakrilna kiselina), poliglikolidi (PLG), polianhidridi, poli (N-vinil pirolidon), poli (vinil alkohol), poliakrilamid, poli (etilen glikol), polilaktidi (PLA), poli (laktid-ko-glikolidi) (PLGA) i poliorthoesteri. Može se postaviti sistem sa kontrolisanim otpuštanjem u blizini terapijske mete (npr. pluća), zahtevajući tako samo delić sistemske doze (vidi, npr., Goodson, u MEDICINSKE PRIMENE KONTROLISANOG IZDAVANjA, supra, vol. 2, str. 115-138 (1984). Polimerni kompozicije korisne kao implantati sa kontrolisanim otpuštanjem mogu se koristiti prema Dunn et al. (Vidi SAD 5.945.115).

[0135] Sistemi sa kontrolisanim oslobađanjem razmatrani su u pregledu Langer-a (1990, "Nev Methods Of Drug Deliveri," Nauka 249: 1527-1533). Bilo koja tehnika poznata stručnjaku u ovoj oblasti može se koristiti za proizvodnju produženog oslobađanja formulacije koje sadrže jedno ili više terapeutskih sredstava iz ovog pronalaska. Videti, na primer, američki patent br.4,526,938; International Publikacija br. WO 91/05548 i WO 96/20698; Ning i sar. (1996) „Intratumoralna radioimunoterapija Ksenograft za rak debelog creva kod čoveka pomoću gela sa produženim oslobađanjem, „Radioterapija i onkologija 39: 179-189, Song et al. (1995) „Targeting pluća posredstvom dugo cirkulišućih emulzija posredovanih antitelima,“ PDA Journal of Pharmaceutical Science &Tehnologija 50: 372-397; Cleek i sar. (1997) „Biorazgradivi polimerni nosači za bFGF antitelo za kardiovaskularne bolesti Aplikacija, "Pro. Int’l. Simp. Control. Rel. Bioact. Mater.24: 853-854; i Lam et al. (1997)" Mikrokapsulacija Rekombinantno humanizovano monoklonsko antitelo za lokalnu isporuku, „Proc. Int’l. Simp. Control Rel. Bioact. Mater.24: 759-760.

[0136] Gde je ovde opisana kompozicija nukleinska kiselina koja kodira CD123 x CD3 bispecifični CD123 x CD3 dijatelo koje je ovde opisano, nukleinska kiselina se može primeniti in vivo da pospeši ekspresiju svoje kodirane CD123 x CD3 bi-specifično dija-telo optimizovano za sekvencu, konstruisujući ga kao deo odgovarajuće ekspresije nukleinske kiseline vektor i administriranje tako da postane unutarćelijski, npr. upotrebom retrovirusnog vektora (videti U.S. Patent No. 4.980.286), ili direktnim ubrizgavanjem, ili upotrebom bombardiranja mikročestica (npr. Genski pištolj; Biolistic, Dupont) ili premazom sa lipidima ili receptorima na ćelijskoj površini ili agensima za transfekciju, ili davanjem u vezi sa homeoboksom sličnim peptidome za

4

koje je poznato da ulaze u jezgro (vidi npr. Joliot i sar. (1991) „Antennapedia Homeobok peptid reguliše neuralne Morfogeneza, "Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 1864-1868). Alternativno, nukleinska kiselina se može uvesti unutarćelijski i ugrađena u DNK ćelije domaćina za ekspresiju homolognom rekombinacijom.

[0137] Lečenje subjekta terapeutski ili profilaktički efikasnom količinom CD123 optimizovane za sekvence x CD3 bi-specifična antitela koja su ovde opisana mogu da uključuju jedan tretman ili, poželjno, mogu da uključuju seriju tretmani. U poželjnom primeru, subjekat se leči CD123 x CD3 bi-specifičnim telima optimizovanim za sekvence ovde opisani jedanput nedeljno, između oko 1 do 10 nedelja, poželjno između 2 do 8 nedelja, još poželjnije između oko 3 do 7 nedelja, a još poželjnije oko 4, 5 ili 6 nedelja. Farmaceutske smeše ovde opisani mogu se primenjivati jednom dnevno, dva puta dnevno ili tri puta dnevno. Alternativno, farmaceutski kompozicije se mogu davati jednom nedeljno, dva puta nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom mesečno, jednom u šest nedelje, jednom u dva meseca, dva puta godišnje ili jednom godišnje. Takođe će biti cenjeno da efikasna doza molekuli koji se koriste za lečenje mogu se povećavati ili smanjivati tokom određenog tretmana.

VI. Upotrebe kompozicija prema pronalasku

[0138] Ovde opisana bi-specifična antitela CD123 x CD3 bi-specifična sa sekvencom, imaju sposobnost lečenja bilo kog bolest ili stanje povezano sa ili karakterizovano ekspresijom CD123. Dakle, bez ograničenja, takvi molekuli može biti zaposlen u dijagnozi ili lečenju akutne mijeloične leukemije (AML), hronične mielogene leukemije (CML), uključujući blastičnu krizu CML i Abelson onkogen povezan sa CML (Bcr-ABL translokacija), mijelodisplastična sindrom (MDS), akutna limfoblastna leukemija B (B-ALL), hronična limfocitna leukemija (CLL), uključujući Richterovu sindrom ili Richterova transformacija CLL, leukemija dlakavih ćelija (HCL), neoplazma blastne plazmocitoidne dendritične ćelije (BPDCN), ne-Hodgkinovi limfomi (NHL), uključujući leukemiju mantelnih ćelija (MCL) i mali limfocitni limfom (SLL), Hodgkinov limfom, sistemska mastocitoza i Burkittov limfom (videti Primer 2); Autoimunski lupus (SLE), alergija, astma i reumatoidni artritis. Ovde opisana bi-specifična antitela mogu se dodatno koristiti u proizvodnju lekova za lečenje gore opisanih stanja.

[0139] Nakon što smo sada opšte opisali otkriće, isto će se lakše razumeti putem reference na sledeće primere koji su dati kao ilustracija i nisu namenjeni ograničavanju sadašnjosti obelodanjivanje ukoliko nije navedeno.

Primer 1

Konstrukcija bi-specifičnih antitela CD123 k CD3 i kontrolnog proteina

4

[0140] Tabela 2 sadrži listu bi-specifičnih tela koja su eksprimirana i prečišćena. CD123 optimizovan za sekvence x CD3 bi-specifično dijatelo (DART-A) i CD123 k CD3 bi-specifično telo (DART-B) su sposoban da se istovremeno veže za CD123 i CD3. Kontrolno bi-specifično dijatelo (Control DART) je sposobno istovremeno vezujući za FITC i CD3. Dvo-specifična antitela su heterodimeri ili heterotrimeri pomenutih aminokiselinske sekvence. Metode za formiranje bi-specifičnih antitela su date u WO 2006/113665, WO 2008/157379, WO 2010/080538, WO 2012/018687, WO 2012/162068 i WO 2012/162067.

Primer 2

Označavanje antitela ciljnih ćelija za kvantitativni FACS (KFACS)

[0141] Iz kulture je sakupljeno ukupno 106 ciljnih ćelija, resuspendovanih u 10% humanog AB seruma u FACS pufer (PBS 1% BSA 0,1% NaAzid) i inkubiran 5 minuta za blokiranje Fc receptora. Označavanje antitela mikrosfera sa različitim kapacitetima vezivanja antitela (Kuantum ™ Simpli Cellular® (KSC), Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN) i ciljne ćelije su obeležene anti-CD 123 PE antitelom (BD Biosciences) prema proizvođačevim uputstva. Ukratko, jedna kap svake KSC mikrosfere dodata je u 5 ml polipropilensku epruvetu i PE označen kao anti-CD 123 antitelo je dodato u koncentraciji od 1 mg / ml i ciljnim ćelijama i mikrosferama. Cevi u inkubirane u u mraku 30 minuta na 4 ° C. Ćelije i mikrosfere su isprane dodavanjem 2 ml FACS pufera i centrifugiranjem na 2500 k G tokom 5 minuta. Dodana je jedna kap slepe populacije mikrosfere nakon pranja. Mikrosfere su bile prvo analizirano na protočnom citometru da bi se postavile postavke instrumenta specifične za ispitivanje (naponi i kompenzacija PMT). Koristeći zabeležene su iste postavke instrumenta, srednje geometrijske vrednosti fluorescencije mikrosfera i ciljnih ćelija. A. standardna kriva mesta vezivanja antitela na populacijama mikrosfere generisana je iz geometrijske srednje fluorescencije populacija mikrosfere. Mesta vezivanja antitela na ciljnim ćelijama izračunata su na osnovu geometrijske srednje fluorescencije ciljnih ćelija koristeći standardnu krivu generisanu za mikrosfere u tabeli KuickCal (Bangs Laboratories).

[0142] Da bi se utvrdile pogodne ciljne ćelijske linije za procenu CD123 k CD3 bi-specifičnih antitela, ekspresija površine CD123 nivoi na ciljnim linijama Kasumi-3 (AML), Molm13 (AML), THP-1 (AML), TF-1 (eritroleukemija) i RS4-11 (ALL) su procenjeni kvantitativnim FACS (KFACS). Apsolutni broj mesta za vezivanje antitela na CD123 na ćeliji površine izračunati su pomoću KFACS kompleta. Kao što je prikazano u tabeli 3, apsolutni broj mesta vezivanja za CD123 antitela na ćelijskim linijama su bile reda Kasumi-3 (visoka)> Molm13 (srednja)> THP-1 (srednja)> TF-1 (srednje niska)> RS4-11 (nisko). Tri ćelijske linije koje najviše izražavaju bile su AML ćelijske linije: Kasumi-3, MOLM13 i THP-1. Ne-AML ćelijske linije: TF-1 i RS4-11 su imale srednje nisku / nisku ekspresiju CD123, respektivno.

1

Primer 3

CTL test citotoksičnosti (test oslobađanja LDH)

[0143] Adherente ciljne tumorske ćelije su odvojene sa 0,25% rastvora tripsina-EDTA i sakupljene centrifugiranjem pri 1000 o / min tokom 5 min. Suspenzione ciljne ćelijske linije su sakupljene iz kulture, isprane podlogom za ispitivanje. Koncentracija ćelija i vitalnost izmereni su isključivanjem Tripan Blue korišćenjem brojača Beckman Coulter Vi-Cell. Ciljne ćelije su razblažene do 4k105 ćelija / ml u mediju za ispitivanje.50 mL razblažene ćelijske suspenzije je dodato u Ploča tretirana sa ćelijskom kulturom sa U-dnom sa 96 jažica (BD Falcon Cat # 353077).

[0144] Tri seta kontrola za merenje ciljanog maksimalnog oslobađanja (MR), ćelijska citotoksičnost nezavisna od antitela (AICC) i spontano oslobađanje ciljnih ćelija (SR) podešeni su kako sledi:

1) MR: medijum za ispitivanje od 200 ml bez CD123 x CD3 bi-specifičnih antitela i 50 ml ciljnih ćelija; dodan deterdžent

na kraju eksperimenta za određivanje maksimalnog oslobađanja LDH.

2) AICC: 50 ml medijuma za ispitivanje bez CD123 x CD3 bi-specifičnih antitela, 50 ml ciljnih ćelija i 100 ml T ćelija.

3) SR: 150 ml medijuma bez CD123 x CD3 bi-specifičnih antitela i 50 ml ciljnih ćelija.

[0145] CD123 k CD3 bi-specifična tela (DART-A, DART-A sa ABD i DART-B) i kontrole su prvobitno razblažene do koncentracije od 4 mg / ml, a zatim su pripremljena serijska razblaženja do krajnje koncentracije od 0,00004 ng / ml (tj.40 fg / ml).50 ml rastvora je dodato na ploču koja sadrži 50 ml ciljnih ćelija / jamicu. Prečišćene T ćelije su isprane jednom sa testmedijumom i resuspendovane u testnom medijumu sa gustinom ćelija od 2 k 106 ćelija / ml. U svaku jažicu dodane su 2 k 105 T ćelija u 100 ml, za konačni odnos efektor-ciljna ćelija (E: T) od 10: 1.Ploče su inkubirane približno 18 sati na 37 ° C u 5% CO2. Posle inkubacije, 25 ml 10k rastvora lize (Promega # G182A) ili 1 mg / ml digitonina je dodato u jamice za kontrolu maksimalnog otpuštanja, pomešane pipetiranjem 3 puta, a ploče su inkubirane 10 minuta da bi se potpuno lizirao ciljne ćelije. Ploče su centrifugirane na 1200 obrtaja u minuti tokom 5 minuta i iz svake je premešteno 50 ml supernatanta probnu ploču na ploču ELISA sa ravnim dnom i u svaku je dodato 50 ml rastvora LDH supstrata (Promega # G1780) dobro. Ploče su inkubirane

2

10-20 min na sobnoj temperaturi (RT) u mraku, a zatim je dodato 50 ml Stop rastvora. Optička gustina (O.D.) je izmerena na 490 nm u roku od 1 sata na Victor2 Multilabel čitaču pločica (Perkin Elmer # 1420-014). Procenat citotoksičnosti izračunat je kao što je opisano u nastavku i generisane su krive doza-odgovor pomoću softvera GraphPad PRISM5®.

[0148] Specifična liza ćelija je izračunata iz O.D. podaci koristeći sledeću formulu:

Citotoksin (%) = 100 x (OD uzorka – AICC OS) / (OD MRa – od SRa)

Preusmereno ubijanje ciljnih ćelijskih linija različitim nivoima površine CD123:

[0149] CD123 x CD3 bi-specifična antitela pokazala su moćnu preusmerenu sposobnost ubijanja sa potrebnim koncentracijama da se postigne 50% maksimalne aktivnosti (EC50s) u opsegu ispod ng / ml, bez obzira na specifičnost vezivanja za CD3 epitop (DARTA nasuprot DART-B) u ciljnim ćelijskim linijama sa visokom ekspresijom CD123, Kasumi-3 (EC50 = 0,01 ng / ml) (slika 4, panel D), srednja ekspresija CD123, Molm13 (EC50 = 0,18 ng / mL) i THP-1 (EC50 = 0,24 ng / mL) (slika 4, pano C i E, respektivno) i srednje niske ili niske ekspresije CD123, TF-1 (EC50 = 0,46 ng / ml) i RS4-11 (EC50 = 0,5 ng / ml) (Slika 4, Panel B i A, respektivno). Slično tome, preusmereno usmrćivanje posredovano preusmeravanjem bispecifičnih molekula CD123 k CD3 takođe primećeno kod više ciljnih ćelijskih linija sa T ćelijama različitih davalaca i nije bilo preusmerene aktivnosti ubijanja primećeno u ćelijskim linijama koje ne eksprimiraju CD123. Rezultati su sumirani u tabeli 4.

[0150] Ako bude potrebno ponoviti ovaj primer, imaće se u vidu da stručnjak može, u roku od razumna i prihvatljiva ograničenja, variraju gore opisani protokol na način prikladan za kopiranje opisanog rezultati. Dakle, primera protokola nije predviđeno da se poštuje na tačno rigidan način.

Primer 4

Aktiviranje T ćelija tokom preusmerenog ubijanja dijagnostifikovanim CD123 x CD3 bispecifičnim telima (DARTA, DART-A sa ABD i DART-A sa w/ Fc)

[0151] Dijatela specifična za sekvencu optimizovana CD123 k CD3 pokazala su moćnu sposobnost preusmeravanja bez obzira prisustva ili odsustva tehnologije produženja poluvremena (DART-A nasuprot DART-A sa ABD nasuprot DART-A sa / Fc) u ciljnim ćelijskim linijama sa visokom ekspresijom CD123, Kasumi-3 i srednjom, THP-1, ekspresijom CD123, (slika 5, paneli A i B, respektivno) Da bi se okarakterisala aktivacija T ćelija tokom dia-tela specifičnog za CD123 x CD3 bi-specifično posredovani preusmereni proces ubijanja, T ćelije iz preusmerenih testova ubijanja obojene su za marker aktivacije T ćelija CD25 i analizirao FACS. Kao što je prikazano na slici 5, Panel D, CD25 je regulisan u CD8 T ćelijama u zavisnosti od doze način koji ukazuje da CD123 x CD3 bi-specifična antitela optimizovana za sekvencu indukuju aktivaciju T ćelija u procesu preusmerenog ubistva. Suprotno tome, u odsustvu ciljnih ćelija nema aktivacije CD8 T ćelija (slika 5, pano C) ukazujući na sekvencu optimizovana CD123 k CD3 bi-specifična antitela ne aktiviraju T ćelije u odsustvu cilja ćelije. Slično tome, CD8 T ćelije se ne aktiviraju kada se inkubiraju sa ciljnim ćelijama i kontrolnim bi-specifičnim dijabetesom (Control DART) (slika 5, pano D) koji ukazuje na zahtev za unakrsnim povezivanjem T ćelije i ciljne ćelije sa sekvencom optimizovanom CD123 x CD3 bi-specifična antitela.

Primer 5

Intracelularno bojenje za granzim B i perforin

[0152] Da bi se odredili unutarćelijski nivoi granzima B i perforina u T ćelijama, podešen je CTL test kako je opisano gore. Posle približno 18 h, ćelije sa probne ploče obojene su anti-CD4 i anti-CD8 antitelima inkubiranje 30 minuta na 4 ° C. Nakon površinskog bojenja, ćelije su inkubirane u fiksiranju i permeabilizaciji od 100 ml pufer (BD BioSciences) 20 minuta na 4 ° C. Ćelije su isprane permeabilizacionim puferom (BD BioSciences) I inkubirano u 50 ml granzima B i mešavine antitela za perforin (pripremljeno u IKS puferu za permeabilizaciju / pranje) na 4 °

4

C tokom 30 minuta. Zatim su ćelije isprane sa 250 ml permeabilizacije / pufera za ispiranje i resuspendovane u permeabilizaciji / tampon za pranje za akviziciju FACS.

Povišena regulacija granzima B i performansi pomoću sekvencije optimizovane CD123 k CD3 bi-specifično telo (DARTA) U T ćelijama tokom preusmerenog ubistva

[0153] Istražiti mogući mehanizam za sekvencu optimizovanog CD123 k CD3 bi-specifičnog dijatela (DART-A) posredovana citotoksičnost od strane T ćelija, nivoi unutarćelijskog granzima B i perforina izmereni su u T ćelijama nakon preusmerenja ubijanje. Primećena je doze-zavisna regulacija granzima B i nivoa perforina u CD8 i CD4 T ćelijama nakon inkubacije T ćelija i ćelija Kasumi-3 sa DART-A (slika 6, pano A). Zanimljivo je da je regulacija bila gotovo dvostruko veći u CD8 T ćelijama u poređenju sa CD4 T ćelijama (slika 6, pano A). Kada je ispitivanje izvršeno u prisustvo granzima B i inhibitora perforina nije primećeno ubijanje ćelija. Nije bilo regulisanja granzima B ili perforin u CD8 ili CD4 T ćelijama kada su T ćelije inkubirane sa Kasumi-3 ciljnim ćelijama i kontrolnom bi-specifičnom diabodi (Control DART) (slika 5, tabla B). Ovi podaci ukazuju da ubijanje ciljnih ćelija posreduje DART-A posredovani kroz mehanizam granzima B i perforina.

Primer 6

In vivo antitumorska aktivnost dijagnostikovanog CD123 x CD3 bi-specifičnog tela (DART-A)

Izolacija PBMC i T ćelija iz ljudske pune krvi

[0154] PBMC iz zdravih humanih davalaca izolovani su iz pune krvi upotrebom Ficoll gradijentnog centrifugiranja. U kratka, cela krv je razblažena 1: 1 sterilnim PBS. Trideset pet ml razblažene krvi naneto je na 15 ml Ficoll- Pakue ™ Plus u epruvetama od 50 ml i epruvete su centrifugirane pri 1400 o / min tokom 20 minuta sa isključenom kočnicom. Buffi kaput sloj između dve faze sakupljen je u epruvetu od 50 ml i ispran sa 45 ml PBS centrifugiranj em epruveta pri 600 k g (1620 o / min) tokom 5 min. Supernatant je odbačen i ćelijska peleta je isprana jednom sa PBS I broj održivih ćelija određen je isključivanjem boje Tripan Blue. PBMC su resuspendovani do konačne koncentracije od 2,5k106 ćelija / ml u potpunom medijumu (RPMI 1640, 10% FBS, 2 mM glutamina, 10 mM HEPES, 100 m / 100 m / ml penicilina / Streptomicin (P / S).

[0156] Ljudske T ćelije i tumorske ćelije (Molml3 ili RS4-11) su kombinovane u omjeru 1: 5 (1 k 106 i 5 k 106, respektivno) i suspendovan u 200 ml sterilnog rastvora soli i injektiran supkutano (SC) na Dan ispitivanja 0 (SD0). Dija-telo specifično za CD123 k CD3 bi-specifično (DART-A) ili kontrolno bi-specifično telo (Control DART) primenjen intravenozno (IV) injekcijama u repne vene u 100 ml, kako je navedeno u Tabeli 5 (MOLM13) i Tabeli 6 (RS4-11).

Prikupljanje podataka i statistička analiza:

[0157] Težina zivotinja - Pojedinačne težine životinja beležene su dva puta nedeljno do završetka studije u početku vreme injekcije tumorskih ćelija.

[0158] Moribunditet / mortalitet - Životinje su posmatrane dva puta nedeljno zbog opšteg morbiliteta i dnevno zbog mortaliteta. Smrt životinja je procenjena kao povezana sa drogom ili tehnički na osnovu faktora uključujući bruto posmatranje i gubitak težine; svakodnevno se beležilo uginuće životinja.

[0159] Zapremina tumora - Pojedinačne količine tumora beležene su dva puta nedeljno, počev od jedne nedelje od tumora implantacija i nastavlja se do završetka studije.

duzina(mm) x sirina<2>

Zapremina tumora

[0160] Životinje koje su doživele tehničku smrt ili smrt zbog droga bile su cenzurisane iz izračunavanja podataka.

[0161] Inhibicija rasta tumora - Izračunate su vrednosti inhibicije rasta tumora (TGI) za svaku grupu koja sadrži tretirane životinje koristeći formulu:

Konacna zapremina tumora (tretirana) – Pocetna zapremina tumora (tretirana)

Konacna zapremina tumora (kontrolisana) – Pocetna zapremina tumora (kontrolisana)

[0162] Životinje koje imaju delimični ili potpuni odgovor, ili životinje koje dožive tehničku smrt ili smrt zbog droga su cenzurisani iz izračuna TGI. Kriterijumi Nacionalnog instituta za rak za aktivnost jedinjenja su TGI> 58% (Corbett et al. (2004) Vodič za razvoj lekova protiv raka; Totova, Nj: Humana 99-123).

[0163] Delimični / potpuni odgovor tumora - Pojedinačni miševi koji imaju tumore veličine manje od 1 mm3 na dan 1 su klasifikovani kao da imaju delimični odgovor (PR) i upotrebom je utvrđena vrednost procenta regresije tumora (% TR) Formula:

[0164] Pojedinačni miševi kojima nema opipljivih tumora klasifikovani su kao da su podvrgnuti potpunom odgovoru (CR).

[0165] Statistika obima tumora - Izvršene su statističke analize između poređenih lečenih i kontrolnih grupa zapremine tumora. Za ove analize su korišćene dvosmerne analize varijanse praćene Bonferroni post-testom. Sve analize su izvršene pomoću softvera GraphPad PRISM® (verzija 5.02). Podaci o težini i tumorima od pojedinaca životinje koje su doživele tehničku smrt ili smrt zbog droga cenzurisane su iz analize. Međutim, podaci o tumorima životinja izveštavanje o delimičnim ili potpunim odgovorima uključeno je u ove proračune.

Rezultati MOLM13

[0166] AML ćelijska linija MOLM13 je prethodno pomešana sa aktiviranim T ćelijama i implantirana SC u NOD / SCID gama (NSG) nokaut miševi (N = 8 / grupa) na SD0 kako je gore opisano. Tumori MOLM13 u grupi koja se leči vehiklom (MOLM13 ćelije same ili plus T ćelije) pokazale su relativno agresivan profil rasta in vivo (slika 7, paneli A i B). U SD8, prosečna zapremina tumora u grupi koja je lečena nosačem iznosila je 129,8629,5 mm3, a za SD15 tumori dostigla prosečnu zapreminu od 786,46156,7 mm3. Do kraja eksperimenta na SD18, tumori su dostigli prosečna zapremina od 1398,86236,9 mm3.

[0167] Lečenje DART-A započeto je istog dana kada je implantirana smeša tumorskih ćelija / T ćelija [(SD0)] I nastavljeno je sa dnevnim injekcijama tokom dodatnih 7 dana, ukupno 8 dnevnih injekcija. Životinje su bile tretirani DART-A na 9 nivoa doza (0,5, 0,2, 0,1, 0,02 i 0,004 mg / kg i 20, 4, 0,8 i 0,16 mg / kg). Rezultati su prikazano na slici 7, ploča A (0,5, 0,2, 0,1, 0,02 i 0,004 mg / kg) i slici 7, ploča B (20, 4, 0,8 i 0,16 mg / kg). Do 11. dana studije, rast tumora MOLM13 bio je značajno inhibiran na 0,16, 0,5, 0,2, 0,1, 0,02 i 0,004 nivoi doze mg / kg (p <0,001). Štaviše, tretman miševa koji nose tumore MOLM13 u dozi od 20 i 4 mg / kg nivoi su rezultirali 8/8 i 7/8 CR, respektivno. Do kraja eksperimenta na SD18, prosečna zapremina tumori tretirani DART-A sa 0,8 - 20 mg / kg) kretali su se u rasponu od 713,6,06267,4 do 0 mm3, a svi su bili značajno manji od tumora u kontrolnoj grupi koja se leči nosačem. Vrednosti TGI su bile 100, 94 i 49% za 20, 4 I Grupe doza od 0,8 mg / kg. U poređenju sa grupom tumorskih ćelija MOLM13 tretiranom nosačem, grupe koje primio DART-A na nivou doze od 20 i 4 mg / kg dostigao je statističku značajnost SD15 dok je grupa lečena 0,8 mg / kg dostiglo je značaj na SD18.

Rezultati RS4-11

[0168] ALL ćelijska linija RS4-11 je prethodno pomešana sa aktiviranim T ćelijama i implantirana SC u NOD / SCID gama nokaut miševi (N = 8 / grupa) na SD0 kako je gore opisano. Tumori RS4-11 u grupi koja se leči vehiklom (same ćelije RS4-11 ili plus T ćelije) pokazali su relativno agresivan profil rasta in vivo (slika 8).

[0169] Lečenje DART-A započeto je istog dana kada je implantirana smeša tumorskih ćelija / T ćelija [(SD0)] I nastavljeno sa dnevnim injekcijama tokom dodatna 3 dana, ukupno 4 dnevne injekcije. Životinje su bile lečeni DART-A u 5 nivoa doza (0,5, 0,2, 0,1, 0,02 i 0,004 mg / kg). Rezultati su prikazani na slici 8.

[0170] Dijatelo CD123 x CD3 bi-specifično optimizovano za sekvencu (DART-A) efikasno inhibira rast oba MOLM13 AML i RS4-11ALL tumori implantirali su SC u NOD / SCID miševe u kontekstu Vinnovog modela prilikom doziranja započeta je na dan implantacije i nastavljena 3 ili više dana uzastopno. Na osnovu utvrđenih kriterijuma Nacionalni institut za rak, DART-A na nivou doze od 0,1 mg / kg i većem (TGI> 58) smatra se aktivnim u RS4-11 model i DART-A doza od 0,004 mg / kg i više bila je aktivna u modelu MOLM13. Donji DART-A doze povezane sa inhibicijom rasta tumora u modelu MOLM13 u poređenju sa modelom RS4-11 su u skladu sa in vitro podacima koji pokazuju da ćelije MOLM13 imaju viši nivo ekspresije CD123 od RS4-11 ćelija, što je koreliralo sa povećanom osetljivošću na DART-A posredovanu citotoksičnost in vitro u MOLM13 ćelijama.

[0171] Ako bude potrebno ponoviti ovaj primer, imaće se u vidu da stručnjak može u roku od razumna i prihvatljiva ograničenja, variraju gore opisani protokol na način prikladan za kopiranje opisanog rezultati. Dakle, primera protokola nije predviđeno da se poštuje na tačno rigidan način.

Primer 7

Ekspresija površine CD123 na leukemičnim eksplozivnim ćelijama i matičnim ćelijama u uzorku primarnog tkiva pacijenta sa AML 1

[0172] Da bi se definisao obrazac ekspresije CD123 u primarnim uzorcima AML pacijenta 1, krioprezervirani primarni AML pacijent uzorci koštane srži i PBMC procenjeni su na ekspresiju površine CD123 na leukemičnim blast ćelijama.

[0173] Uzorak AML koštane srži - klinički izveštaj

Starost: 42

Žensko

Podtip AML: M2

Procenat ćelija karcinoma na osnovu morfologije: 67,5%

[0174] Imunofenotipizacija koštane srži:

CD15 = 19%, CD33 = 98,5%, CD38 = 28,8%, CD45 = 81,8%, CD64 = 39,7%,

CD117 = 42,9%, HLA-DR = 17%, CD2 = 1,8%, CD5 = 0,53%, CD7 = 0,2%,

CD10 = 0,41%, CD19 = 1,1%, CD20 = 1,4%, CD22 = 0,71% CD34 = 0,82%

CD123 ekspresija u leukemičnim ćelijama blasta u mononukleocitima koštane srži (BM MNC) [0175] Ukupno 0,5k106 mononukleocita koštane srži (BM MNC) i mononukleociti periferne krvi (PBMC)) od AML pacijenta 1 su procenjeni na ekspresiju CD123. Kao kontrola uključena je ćelijska linija Kasumi-3. Leukemic blast ćelije su identifikovane pomoću mieloidnog markera CD33. Kao što je prikazano na Slici 9, Panel A, 87% ćelija iz AML koštana srž pacijenta 1 sa CD123 i CD33. Nivoi ekspresije CD123 bili su nešto niži od CD123 visoko ekspresirajuća Kasumi-3 AML ćelijska linija (slika 9, pano B).

Primer 8

Autologni CTL test ubijanja korišćenjem primarnih uzoraka AML pacijenta

[0176] Primarni AML uzorak u krio konzervaciji (mononukleociti koštane srži (BMNC) i mononukleociti periferne krvi (PBMC)) od AML pacijenta 1 odmrznuti su u RPMI 1640 sa 10% FBS i ostavljeni da se oporave preko noći na 37 ° C u 5% CO2. Ćelije su isprane sa medijumom za ispitivanje (RPMI 1640 10% FBS) i određen je broj održivih ćelija isključenjem Tripan Blue.

150.000 ćelija / jažici u testnom medijumu od 150 ml dodato je u ploču sa donjim dnom sa 96 jažica (BD Biosciences). Dija-telo specifično za CD123 k CD3 bi-specifično (DART-A) optimizovano za sekvencu je razblaženo na 0,1 i 0,01 ng / ml I U svaku jažicu je dodato 50 mL svakog razblaženja (konačna zapremina = 200 mL). Kontrolno bi-specifično dijatelo (Control DART) je bilo razblažen na 0,1 ng / ml i u svaku jažicu je dodato 50 ml svakog razblaženja (konačna zapremina = 200 ml). Odvojena probna ploča je postavljen za svaku vremensku tačku (48, 72, 120 i 144 sata) i ploče su inkubirane na 37 ° C u 5% CO2 inkubatoru. U svakoj vremenskoj tački, ćelije su obojene antitelima CD4, CD8, CD25, CD45, CD33 i CD123. Označene ćelije su analizirano u protočnom citometru FACS Calibur opremljenom softverom za akviziciju CellKuest Pro, verzija 5.2.1 (BD Biosciences). Analiza podataka izvršena je pomoću softvera Flovjo v9.3.3 (Treestar, Inc). Mereno je širenje T ćelije getiranjem na CD4 i CD8 populacije i aktivacija je određena merenjem srednjeg intenziteta fluorescencije CD25 (MFI) na CD4 i CD8 populacijama. Populacija leukemičnih blast ćelija identifikovana je CD45 CD33 getiranjem.

Autologno iscrpljivanje ćelija tumora, širenje i aktiviranje T ćelija CD123 x CD3 Bi-Specifično telo (DART-A) u primarnim uzorcima pacijenta sa AML 1 Specifično telo (DART-A) u primarnim uzorcima pacijenta sa AML 1

[0177] Da bi se utvrdila aktivnost sekvencije optimizovane CD123 x CD3 bi-specifičnim dijatelom (DART-A) u AML pacijent 1, uzorci pacijenta su inkubirani sa 0,1 ng / ml ili 0,01 ng / ml DART-A i procentima leukemične eksplozije ćelije i T ćelije su merene u različitim vremenskim tačkama nakon tretmana. Leukemične blast ćelije identifikovane su pomoću CD45 / CD33 rešetka. Inkubacija primarnih uzoraka AML koštane srži sa DART-A rezultirala je iscrpljivanjem populacija leukemičnih ćelija tokom vremena (slika 10, pano A), praćena istovremenim širenjem rezidualnog T ćelija (slika 10, pano B) i indukcija markera aktivacije T ćelija (slika 10, ploča C). U DART-A lečeno u uzorcima, T ćelije su proširene sa oko 7% na oko 80% za 120 sati. Aktivacija T ćelija izmerena CD25 ekspresija na CD4 i CD8 ćelijama dostigla je maksimum za 72 sata i smanjila se za vremensku tačku od 120 h.

[0178] Ako bude potrebno ponoviti ovaj primer, imaće se u vidu da stručnjak može, u roku od razumna i prihvatljiva ograničenja, variraju gore opisani protokol na način prikladan za kopiranje opisanog rezultati. Dakle, primera protokola nije predviđeno da se poštuje na tačno rigidan način.

Primer 9

Ekspresija površine CD123 na leukemičnim eksplozivnim ćelijama i matičnim ćelijama u uzorku primarnog tkiva od svih pacijenata

[0179] Da bi se definisao obrazac ekspresije CD123 u SVIH primarnih uzoraka pacijenta, krioprezerviranim primarnim SVIM pacijentima Uzorak PBMC je procenjen na površinsku ekspresiju CD123 na leukemičnim blast ćelijama.

Ekspresija CD123 u leukemičnim blast ćelijama u mononukleocitima periferne krvi (PBMC)

[0180] Ukupno 0,5k106 mononukleocita periferne krvi (PBMC)) od zdravog davaoca i SVIH pacijenata je procenjeno na ekspresiju CD123. Kao što je prikazano na slici 11, paneli E-H, velika većina ćelija iz SVE kosti srž izražena CD123. Suprotno tome, kao što se očekivalo u normalnim donatorskim B ćelijama su CD123 negativni i pDC I monociti su CD123 pozitivni (slika 11, ploča D).

[0181] Populacija T ćelija je identifikovana u uzorku svih patenata bojanjem ćelija za CD4 i CD8. Kao što je prikazano na slici 12, Panel B, samo mali deo ukupnih PBMC-a u uzorku SVE pacijenta čine T ćelije (približno 0,5% su CD4 T ćelije i približno 0,4% su CD8 T ćelije.

Primer 10

Autologni CTL test ubijanja korišćenjem SVIH primarnih uzoraka pacijenta

Kriokonzervirani primarni ALL uzorak (mononukleociti periferne krvi (PBMC)) odmrznuti su u RPM 11640 sa 10% FBS i ostavljeno da se preko noći povrati na 37 ° C u 5% CO2. Ćelije su isprane podlogom za ispitivanje (RPMI 1640 10% FBS) i broj održivih ćelija određen je

1

isključivanjem Tripan Blue. 150.000 ćelija / jamica u testu od 150 ml medijum je dodat u ploču sa U jednom sa 96 jažica (BD Biosciences). Dijatelo specifično za CD123 x CD3 bi-specific (DART-A) je razblažen na 10, 1 ng / ml i u svaku jažicu je dodato 50 ml svakog razblaženja (konačna zapremina = 200 ml). A. postavljena je zasebna probna ploča za svaku vremensku tačku (48, 72, 120 i 144 sata) i ploče su inkubirane na 37 ° C u inkubator sa 5% CO2. U svakoj vremenskoj tački, ćelije su obojene antitelima CD4, CD8, CD25, CD45, CD33 i CD123. Označene ćelije su analizirane u protočnom citometru FACS Calibur opremljenom softverom za akviziciju CellKuest Pro, verziju 5.2.1 (BD Biosciences). Analiza podataka izvršena je pomoću softvera Flovjo v9.3.3 (Treestar, Inc). Proširenje ćelije T je mereno getiranjem na CD4 i CD8 populacijama, a aktivacija je određena merenjem CD25 MFI na CD4 i CD8 populacije. Populacija leukemičnih blast ćelija identifikovana je CD45 CD33 getiranjem.

Autologno iscrpljivanje ćelija tumora, širenje i aktiviranje T ćelija CD123 x CD3 Bi-specifično telo (DART-A) u primarnim uzorcima SVIH pacijenata

[0183] Da bi se utvrdila aktivnost posredovana CD123 x CD3 bi-specifičnim dija-telom (DART-A) posredovanjem u SVE primarni uzorci pacijenta, uzorci pacijenata inkubirani su sa 1 ng / mL DART-A i procentima leukemije blast ćelije i T ćelije su merene u različitim vremenskim tačkama nakon tretmana. Identifikovane su leukemične blast ćelije CD45 / CD33 mrežom. Inkubacija primarnih SVIH uzoraka koštane srži sa DART-A rezultirala je iscrpljivanjem populacija leukemičnih ćelija tokom vremena u poređenju sa nelečenom kontrolom ili Control DART-om (slika 13, Panel H naspram panela F i G). Kada su prebrojane T ćelije (bojenje CD8 i CD4) i analizirana aktivacija (bojenje CD25), T ćelije su se proširile i aktivirale u uzorku DART-A (slika 14, paneli I i L, respektivno) u poređenju sa neobrađeni ili kontrolni DART uzorci (slika 14, paneli H, G, K i J, respektivno).

Primer 11

Ekspresija površine CD123 na leukemičnim eksplozivnim ćelijama i matičnim ćelijama u uzorku primarnog tkiva pacijenta sa AML 2

[0184] Da bi se definisao obrazac ekspresije CD123 u primarnim uzorcima pacijenta sa AML 2, krioprezervirani primarni AML pacijent uzorci koštane srži i PBMC procenjeni su na ekspresiju površine CD123 na leukemičnim blast ćelijama.

Ekspresija CD123 u leukemičnim eksplozivnim ćelijama u mononukleocitima koštane srži (BMNC)

2

[0185] Ukupno 0,5k106 mononukleocita koštane srži (BM MNC) i mononukleociti periferne krvi (PBMC)) od AML pacijenta 2 je procenjeno na identifikaciju leukemičnih blast ćelija. Leukemične blast ćelije su identifikovane korišćenjem mieloidni markeri CD33 i CD45. Kao što je prikazano na slici 15, pano B, 94% ćelija iz AML koštane srži je leukemične blast ćelije. Populacija T ćelija je identifikovana ekspresijom CD3. Kao što je prikazano na slici 15, okvir C, približno 15% ćelija iz AML koštane srži i uzorka PBMC su T ćelije.

Primer 12

Autologni CTL test ubijanja primenom AML pacijenta 2 primarna uzorka

[0186] Primarni uzorak AML koji se konzervira (mononukleociti koštane srži (BM MNC) i mononukleociti periferne krvi (PBMC)) od pacijenta 2 sa AML odmrznuti su u RPMI 1640 sa 10% FBS i ostavljeni da se oporave preko noći na 37 ° C u 5% CO2. Ćelije su isprane sa medijumom za ispitivanje (RPMI 1640 10% FBS) i određen je broj održivih ćelija isključenjem Tripan Blue. 150.000 ćelija / jažici u testnom medijumu od 150 ml dodato je u ploču sa donjim dnom sa 96 jažica (BD Biosciences). CD123 k CD3 bi-specifično dijatelo (DART-A) optimizovano po sekvenci i kontrolira bi-specifično telo (Control) DART) su razblaženi na 0,1, a u svaku jažicu je dodato 0,01 ng / ml i 50 ml svakog razblaženja (konačna zapremina = 200 ml). Za svaku vremensku tačku (48, 72, 120 i 144 sata) postavljena je posebna test ploča i ploče su inkubirane na 37 ° C u 5% CO2 inkubatoru. U svakoj vremenskoj tački, ćelije su obojene antitelima CD4, CD8, CD25, CD45, CD33 i CD123. Označene ćelije su analizirane u protočnom citometru FACS Calibur opremljenom softverom za akviziciju CellKuest Pro, verziju 5.2.1 (BD Biosciences). Analiza podataka izvršena je pomoću softvera Flovjo v9.3.3 (Treestar, Inc). Proširenje T ćelija je bilo mereno getiranjem na CD4 i CD8 populacijama, a aktivacija je određena merenjem CD25 MFI na CD4 i CD8 populacije. Populacija leukemičnih blast ćelija identifikovana je CD45 CD33 getiranjem.

Autologno iscrpljivanje ćelija tumora, širenje i aktiviranje T ćelija u primarnim uzorcima pacijenta AML 2

[0187] Da bi se utvrdila aktivnost sekvencije optimizovana za CD123 k CD3 bi-specifična dijatela (DART-A) u AML pacijent primarni pacijent 2 uzorka, uzorci pacijenta su inkubirani sa 0,1 ili 0,01 ng / ml DART-A i procentima leukemičnih blast ćelija i T ćelija mereni su u različitim vremenskim tačkama nakon tretmana. Inkubacija primarne Uzorci AML koštane srži sa DART-A rezultirali su iscrpljivanjem populacije leukemičnih ćelija tokom vremena (slika 16, Panel A), praćen istovremenim širenjem rezidualnih T ćelija (i CD4 i CD8) (Slika 16, Panel B i slika 16, ploča C, respektivno). Da bi se utvrdilo da li su T ćelije aktivirane, ćelije su obojene za CD25 ili Ki-67, oba markera aktivacije T ćelija. Kao što je prikazano na slici 17, paneli A i B, inkubacija primarne AML koštane srži uzorci sa DART-A rezultirali su aktivacijom T ćelija. Ovi podaci predstavljaju vremensku tačku 144h.

Intracelularno bojenje za granzim B i perforin

[0188] Da bi se odredili unutarćelijski nivoi granzima B i Perforina u T ćelijama, podešen je CTL test. Posle otprilike 18 h, ćelije sa probne ploče obojene su anti-CD4 i anti-CD8 antitelima inkubacijom tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon površinskog bojenja, ćelije su inkubirane u puferu za fiksaciju i permeabilizaciju od 100 ml tokom 20 minuta na 4 ° C. Ćelije su isprane permeabilizacionim puferom i inkubirane u 50 ml granzima B i perforin antitela smeša pripremljena u 1Ks pufera za perm / pranje na 4 ° C tokom 30 minuta. Zatim su ćelije isprane sa 250 ml pufera Perm / Vash i ponovo suspendovan u puferu Perm / Vash za akviziciju FACS-a.

Povišena regulacija granzima B i performansi pomoću sekvencije optimizovane CD123 x CD3 bi-specifičnog tela (DARTA) u T ćelijama tokom preusmerenog ubistva.

[0189] Istražiti mogući mehanizam za sekvencu optimizovanog CD123 k CD3 bi-specifičnog dijatela (DART-A) posredovana citotoksičnost od strane T ćelija, nivoi unutarćelijskog granzima B i perforina izmereni su u T ćelijama nakon preusmerenja ubijanje. Nije bilo pojačane regulacije granzima B i perforina kada su T ćelije inkubirane sa kontrolnom bi-specifičnošću diabodi (Control DART). Primećena je regulacija nivoa granzima B i perforina i u CD8 i u CD4 T ćelijama sa CD123 k CD3 bi-specifičnim dija-telom (DART-A) optimizovanim za sekvencu (slika 17, paneli C i D). Zanimljivo je da povećana regulacija bila je gotovo dvostruko veća u CD8 T ćelijama u poređenju sa CD4 T ćelijama (Slika 17, Panel C i Slika 17, Panel D). Ovi podaci ukazuju da je ubijanje ciljnih ćelija posredovano DART-A posredovano granzimom B i perforinom staza.

Primer 13

CD123 x CD3 bi-specifični dijatesti optimizovani nizom unakrsnih reakcija sa primatima CD123 i CD3 koji nisu ljudi

[0190] U cilju kvantifikovanja stepena vezivanja između sekvenci optimizovanih CD123 x CD3 bi-specifičnog dija tela (DART-A) i CD3 na čoveku ili cinomolgus majmunu, izvršene su analize

4

BIACORE ™. BIACORE ™ analize izmeri off-rate disocijacije, kd. Afinitet vezivanja (KD) između antitela i njegove ciljne funkcije je funkcija kinetičke konstante asocijacije (na brzinu, ka) i disocijacije (van brzine, kd) prema formuli: KD = [kd] / [ka]. Analiza BIACORE ™ koristi površinsku plazmonsku rezonancu za direktno merenje ovih kinetičkih parametara. Rekombinantni CD3 čoveka ili majmuna cinomolgus je direktno imobilizovan za nosač. Prečišćeni čovek ili majmun cynomolgus CD123 je uhvaćen i otuđen za potporu. Izmeren je vremenski tok disocijacije i dvovalentno uklapanje podaci sprovedeni. Konstante vezivanja i afinitet su dobijeni primenom vezivanja u vezi 1: 1. Rezultati BIACORE ™ analize na kojima se upoređuje vezivanje za proteine CD123 i CD3 majmuna majmuna u odnosu na cinomologus majmuna prikazane su na slici 18. Afiniteti vezivanja za proteine majmuna cinomolgus CD123 (slika 18D) i CD3 (slika 18B) uporedivi su sa afiniteti vezivanja za humane proteine CD123 (slika 18C) i CD3 (slika 18A).

Primer 14

Iscrpljivanje monologusa autologusa in vitro sa PBMC-ima kod ljudi i Cinomolgus majmuna

[0191] PBMC iz uzoraka cele krvi čoveka ili majmuna cinomolgus dodani su u ploče sa dnom U sa gustinom ćelija od 200.000 ćelija / jamici u 150 ml podloge za ispitivanje. Razblaženja bispecifičnih dodija CD123 x CD3 optimizovanih za sekvence (DART-A ili DART-A sa ABD) pripremljeni su u testnom medijumu. Bilo je 50 ml svakog razblaženja DART-A ili DART-A sa ABD dodata na ploču koja sadrži PBMC u duplikatnim jamicama. Ploče su inkubirane 18-24 sata na 37 ° C. Supernatanti su korišćeni za određivanje citotoksičnosti kao što je gore opisano. Kao što je prikazano na slici 19 (paneli A i B), iscrpljivanje ćelije pDCs su primećene i na ljudskim (Slika 19, Panel A) i na PBMC majmuna cinomolgus (Slika 19, Panel B). Ovi rezultati ukazuju da se pDC u cirkulaciji može koristiti kao farmakodinamički marker za pretkliničke studije toksikologije kod majmuna cinomolgus.

[0192] Ako bude potrebno ponoviti ovaj primer, imaće se u vidu da stručnjak može, uz razumna i prihvatljiva ograničenja, variraju gore opisani protokol na način prikladan za kopiranje opisanog rezultati. Dakle, primera protokola nije predviđeno da se poštuje na tačno rigidan način.

Primer 15

Iscrpljivanje plazmocitoidnih dendritičnih ćelija kod majmuna Cinomolgus tretiranih CD123 x CD3 optimizovanim za sekvence dvospecifično telo (DART-A)

[0193] Kao deo studije toksikologije za određivanje raspona doza, majmunima cinomolgus su davani sekvencijalno optimizovani CD123 x CD3 bi-specifično dijatelo (DART-A) kao 4-dnevne infuzije u dozama od 0,1, 1, 10, 30100, 300 ili 1000 ng / kg. Kontrolni DART je primenjen na 100 ng / kg. Da bi se identifikovali pDC i populacije monocita kod majmuna cynomolgus PBMC, ćelije su obeležene CD14-FITC antitelom. Monociti su identifikovani kao CD14 populacija i pDC su identifikovani kao CD14-CD123 populacija. Kao što je prikazano na slici 20, ploče K i L, pDC su osiromašeni kao već 4 dana nakon infuzije sa samo 10 ng / kg DART-A. Nije opaženo iscrpljivanje pDC u kontrolnoj bi-specifičnosti majmuni tretirani dijabodi-om (Control DART) ili majmuni tretirani vozilom i nosačem u 4d vremenskoj tački (slika 20, Paneli G, H, C i D, respektivno). Određeni su nivoi citokina u interferonu-gama, TNF-alfa, IL6, IL5, IL4 i IL2 na 4 sata nakon infuzije. U poređenju sa životinjama tretiranim DART-A bilo je malo ili nimalo povišenja nivoa citokina za kontrolu DART-a ili životinja.

[0194] Slika 21 i slika 22 daju rezultate FACS analize za B ćelije (CD20 ) (slika 21, pano A), monociti (CD14 ) (Slika 21, Panel B), NK ćelije (CD159 CD16 ) (Slika 21, Panel C), pDC (CD123HI, CD14-) (Slika 21, Panel D) i T ćelije (ukupno, CD4 i CD8 ) (Slika 22, Panel A, Slika 22, Panel B i Slika 22, Panel D, respektivno).

[0195] Lečenje majmuna sa Control DART nije imalo primetnih efekata na T ili B limfocite, NK ćelije, monocite i pDC. Lečenje majmuna sa DART-A u dozama od 10 ng / kg / d ili više rezultiralo je ukidanjem pDC (Slika 21, Panel D). Iscrpljivanje pDC je bilo potpuno i trajno, vraćajući se na nivo pre doze nekoliko nedelja nakon završetak doziranja. Nivoi cirkulišućeg limfocita T smanjili su se nakon primene DART-A, ali su se vratili u predozu nivo do kraja svakog nedeljnog ciklusa, što sugeriše promene u trgovini ljudima, a ne istinsko iscrpljivanje. I CD4 I CD8 T limfociti sledili su isti obrazac. Marker za aktivaciju T-limfocita, CD69 (slika 22, tabla C), bio je samo marginalno pozitivan među ćelijama u cirkulaciji i nije praćen sa DART-A doziranjem. B limfociti, monociti I NK ćelije su fluktuirale tokom doziranja DART-A sa značajnom promenljivošću primećenom među majmunima. Trend ka povećanom nivou cirkulacije B limfocita i monocita primećen je kod oba majmuna u najvišim dozama.

[0196] Ukratko, gornji rezultati pokazuju terapijsku efikasnost CD123 k CD3 optimizovane za sekvence bi-specifično dijatelo (DART-A). Može se koristiti sekvenca optimizovana za CD123 k CD3 bi-specifično telo (DART-A) kao terapeutsko sredstvo za lečenje više bolesti i stanja, uključujući: AML, ABL (ALL), CLL, MDS, pDCL, leukemija mantel ćelija, leukemija dlakavih ćelija, bogatija transformacija CLL, blastična kriza CML, BLL (podskup su CD123 ) (videti Primer 2); Autoimunski lupus (SLE), alergija (bazofili su CD123 ), astma.

Primer 16

Uporedna svojstva bi-specifičnog dija-tela (DART-A) optimizovanog za sekvence CD123 x CD3 i (DART-A) I Optimizovano CD123 x CD3 bi-specifično telo (DART-B) Neočekivana prednost i atributi sekvence- Optimizovana bi-specifična dijabetesa CD123 x CD3

[0197] Kao što je gore razmatrano, DART-A i DART-B su slično dizajnirani i prvi polipeptid obe konstrukcije sadrže, u smeru od N-kraja do C-kraja, N-kraj, VL domen monoklonskog antitela sposobnog za vezanje za CD3 (VLCD3), intervenirajući linker peptid (Linker 1), VH domen monoklonskog antitela sposoban za vezanje za CD123 (VHCD123), linker 2, domen E-zavojnice i C-kraj. Isto tako, drugi polipeptid oba konstrukcije sadrže, u smeru od N-kraja do C-kraja, N-kraj, VL domen monoklonskog antitela sposoban da se veže za CD123 (VLCD123), intervenirajući linker peptid (Linker 1), VH domen monoklonskog antitela sposoban da se veže za CD3 (VHCD3), Linker 2, K-coil domen i C-terminal.

[0198] Kao što je naznačeno u Primeru 1, utvrđeno je da su oba CD123 k CD3 bi-specifična antitela sposobna da istovremeno vezanje za CD3 i CD123. Pored toga, kao što je otkriveno u Primeru 3 i na Slici 4, paneli C i D, dva CD123 k CD3 bi-specifična antitela pokazala su moćnu preusmerenu sposobnost ubijanja sa koncentracijama potrebnim za postizanje 50% od maksimalna aktivnost (EC50s) u opsegu ispod ng / ml, bez obzira na specifičnost vezivanja za CD3 epitop (DART-A nasuprot DART-B) u ciljnim ćelijskim linijama sa visokom ekspresijom CD123. Dakle, male varijacije u specifičnim sekvencama CD123 k CD3 bi-specifična antitela ne ukidaju u potpunosti biološku aktivnost.

[0199] Međutim, u svim testiranim ćelijskim linijama utvrđeno je da je DART-A aktivniji i snažniji u preusmerenom ubijanju od DART-B (videti, na primer, sliku 4, paneli A, C i D). Tako je DART-A pokazao neočekivanu prednost u odnosu na slične DART-B.

Primer 17

Ne-humana farmakologija primata DART-A za lečenje hematoloških malignih bolesti

[0200] Alfa lanac receptora za interleukin 3 (IL-3), CD123, prekomerno se eksprimira na malignim ćelijama u širokom opsegu hematoloških malignih oboljenja (Munoz, L. i sar. (2001) „Interfeukin-3 receptorski alfa lanac (CD123) je široko izražen U Hematologic Malignancies, „Haematologica 86: 1261-1269; Testa, U. et al. (2014)“ CD123 je membranski biomarker I terapeutski cilj u hematološkim malignim bolestima, "Biomark. Res.2: 4) i povezan je sa lošom prognozom (Vergez, F. i sar. (2011) „Visoki nivoi CD34 CD38 niži / -CD123 eksplozije predviđaju štetan rezultat Akutna mijeloična leukemija: A Groupe Ouest-Est Des Leucemies Aigues Et Maladies Du Sang (GOELAMS) studija, "Haematologica" 96: 1792-1798). Štaviše, zabeleženo je da CD123 eksprimiraju matične ćelije leukemije (LSC) (Jordan, C.T. et al. (2000) „Alfa lanac receptora za Interleukin-3 je jedinstveni marker za humanu akutnu mijelogenu leukemiju Matične ćelije, "Leukemija 14: 1777-1784; Jin, L. i sar. (2009)" Monoklonsko ciljanje CD123, IL-3 posredovano antitelima Alfa lanac receptora eliminiše ljudske akutne mijeloične leukemične matične ćelije, "Matične ćelije ćelija 5: 31-42), što je atraktivna karakteristika koja omogućava ciljanje osnovnog uzroka takvih bolesti. U skladu sa ovim zaključkom, i CD123 učestvuje u IL-3 autokrinoj petlji koja održava leukemogenezu, što pokazuje sposobnost monoklonskog blokatora CD123 antitelo za smanjenje leukemičnog ugrađivanja matičnih ćelija i poboljšanje preživljavanja u mišjem modelu akutnog mijelogenog leukemija (AML) (Jin, L. i sar. (2009) "Monoklonsko ciljanje CD123, IL-3 receptorski alfa lanac, posredovano antitelima, Eliminiše ljudske akutne mijeloične leukemične matične ćelije, "Matične ćelije ćelija 5: 31-42). U fazi 1 studije u visoko rizičnom AML pacijenata, međutim, monoklonsko antitelo nije pokazalo antileukemijsku aktivnost (Roberts, A. V. et al. (2010) "A Phase I Studija monoklonskih antitela protiv CD123 (mAb) CSL360 ciljanih matičnih ćelija leukemije (LSC) u AML, "J. Clin. Oncol. 28 (Suppl): e13012). Stoga su poželjni alternativni pristupi ciljanju na CD123, uključujući strategije iscrpljivanja. Iako CD123 se izražava podskupom normalnih krvotvornih krvotvornih ćelija (HPC), ekspresija hematopoetskih matičnih ćelija (HSC) malo do nimalo CD123 (Jordan, C.T. et al. (2000) „Interfeuni-3 receptorski alfa lanac je jedinstveni marker za čoveka Matične ćelije akutne mijelogene leukemije, "Leukemia 14: 1777-1784; Jin, V. et al. (2009)" Regulacija ćelije Th17 Diferencijacija i indukcija EAE MAP3K NIK, "Krv 113: 6603-6610), ukazujući na to da strategije za iscrpljivanje ćelija CD123 omogućavaju rekonstituciju putem normalne hematopoeze.

[0201] Omogućavanje sopstvenih T limfocita pacijentu da ciljaju leukemične ćelije predstavlja obećavajuću imunoterapijsku terapiju strategija lečenja hematoloških malignih oboljenja. Pokušavan je terapijski potencijal ovog pristupa korišćenjem blinatumomaba (BiTE na bazi bispecifičnog antitela, koji ima sposobnost da veže CD3 i CD19 antigen B ćelije) u pacijenti sa limfomima B ćelija i akutnom limfoblastnom leukemijom B-prekursora (Klinger, M. i sar. (2012) "Immunopharmacologic Odgovor pacijenata sa akutnom limfoblastnom leukemijom B-linije na kontinuiranu infuziju T-ćelija Angažovanje CD19 / CD3-bispecifičnog BiTE antitela Blinatumomab, "Krv 119: 6226-6233; Topp, M.S. i sar. (2012)" Long- Terminsko praćenje hematološkog preživljavanja bez relapsa u fazi 2 studije blinatumomaba kod pacijenata sa MRD u B-Lineage ALL, "Blood 120: 5185-5187; Topp, M.S. i sar. (2011)" Ciljna terapija antitelom koje uključuje T-ćelije Blinatumomab hemoterapije-vatrostalne minimalne rezidualne bolesti u akutnoj limfoblastnoj leukemiji B-loze Rezultati pacijenata su visoka stopa odgovora i produženo preživljavanje bez leukemije, "J. Clin. Oncol.29: 2493-2498).

[0202] Molekuli CD123 x CD3 bi-specifični diatelo iz ovog pronalaska, kao što je DART-A, sadrže

alternativni bi-specifični modalitet zasnovan na antitelima koji nudi poboljšanu stabilnost i robusnija svojstva proizvodljivosti (Johnson, S. i sar. (2010) „Regrutovanje efektorskih ćelija sa novim dvostrukim afinitetnim preusmeravanjem proteina na bazi Fv dovodi do Potentna citoliza tumora i in vivo iscrpljivanje B-ćelija, "J. Mol. Biol.399: 436-449; Moore, P.A. i sar. (2011)"

Primena

Molekula za dvostruko srodstvo afiniteta za postizanje optimalnog preusmerenog ubijanja T-ćelija limfoma B-ćelija, "Krv 117: 4542-4551).

[0203] Da bi se demonstrirala superiornost i efikasnost bi-specifičnih molekula dija-tela CD123 x CD3 ovog pronalaska, biološka aktivnost gore opisanog DART-A u in vitro i pretkliničkim modelima leukemija i njena farmakokinetika, farmakodinamika i bezbednosna farmakologija u cinomolgus-u makaka (Macaca fascicularis) procenjena je u odnosu na bilo koji od gore opisanih Control DART (bi-specifičan za CD3 i fluorescein) ili „Control DART-2“ koji je bio bispecifičan za CD123 i fluorescein).

[0204] Aminokiselinska sekvenca prvog polipeptidnog lanca „Control DART-2“ (CD123VL -Linker - 4-4420VH - Linker - E-kalem; povezivači su podvučeni) (SEK ID NO: 58):

[0205] Aminokiselinska sekvenca drugog polipeptidnog lanca „Control DART-2“ (4420VL -Linker-CD123VH - Linker - K-kalem) (SEK ID NO: 59):

Bifunkcionalni ELISA

[0206] MakiSorp ELISA ploča (Nunc) presvučena preko noći rastvorljivim humanim ili cinomolgus IL3R-alfa (0,5 mg / ml) u bikarbonatnom puferu je blokiran sa 0,5% BSA; 0,1% Tveen-20 u PBS (PBST / BSA) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Primenjeni su molekuli DART-A, praćeni sekvencijalnim dodavanjem humanog CD3εδ-biotina i streptavidina HRP (Jackson ImmunoResearch). Aktivnost HRP-a otkrivena je konverzijom tetrametilbenzidina (BioFKS) kao supstrata tokom 5 min; reakcija je prekinuta sa 40 ml / jamici 1% H2S04 i apsorbancija je očitana na 450 nm.

Analiza površinske plazmonske resonance

[0207] Sposobnost DART-A da se veže za CD3 ili CD123 proteine majmuna i cinomolgus majmuna analizirana je korišćenjem biosenzor BIAcore 3000 (GE, Healthcare) kako su opisali Johnson, S. et al. (2010) („Regrutacija efektorskih ćelija sa Novo dvostruko afinitetno ponovno ciljanje proteina na bazi Fv dovodi do potentne citolize tumora i smanjenja B-ćelija in vivo, „J. Mol. Biol. 399: 436-449) i Moore, P.A. et al. (2011) („Primena molekula za ponovno ciljanje dvostrukim afinitetom Optimalno preusmereno ubijanje T-ćelijskog limfoma B-ćelija, "Krv 117: 4542-4551). Ukratko, karboksilne grupe na CM5 senzorski čip su aktivirani injekcijom 0,2M N-etil-N- (3-dietilamino-propil) karbodiimida i 0,05M N-hidroksisukcinimida. Rastvorljivi CD3 ili CD123 (1 mg / ml) ubrizgava se preko aktivirane površine CM5 u 10 mM natrijum-acetata, pH 5,0, pri brzini protoka 5 ml / min, praćen 1 M etanolaminom za deaktiviranje. Godine izvedeni su eksperimenti vezivanja 10mM HEPES, pH 7,4, 150mM NaCl, 3mM EDTA i 0,005% P20 surfaktanta. Regeneracija imobilizovanog receptora površine izvedeno je pulsnim ubrizgavanjem 10mM glicina, pH 1,5. Vrednosti KD određene su globalnim prilagođavanjem vezivanja krive prema modelu vezivanja Langmuir 1: 1 (BIAevaluation softvare v4.1).

Analiza ubijanja ćelija

[0208] Ćelijske linije korišćene za testove ubijanja ćelija dobijene su iz Američke zbirke tipičnih kultura (ATCC) (Manassas, VA). PBMC su izolovani iz zdrave donatorske krvi koristeći komplet Ficoll-Pakue Plus (GE Healthcare); T ćelije prečišćeni su negativnim kompletom za odabir (Life Technologies). Gustina površine CD123 ćelija je određena korišćenjem Kuantum-a Jednostavno ćelijske perlice (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN). Analize citotoksičnosti su izvedene kako je opisao Moore, P.A. et al. (2011) („Primena molekula za dvostruko afinitetno ponovno ciljanje za postizanje optimalne preusmerene T-ćelije Ubistvo limfoma B-ćelija, "Krv 117: 4542-4551). Ukratko, ciljne ćelijske linije (105 ćelija / ml) tretirane su serijskim razblaženja DART-A ili Control DART proteina u prisustvu T ćelija u naznačenim efektorskim ćelijama: odnosi ciljanih ćelija i inkubirano preko noći na 37 ° C. Ubijanje ćelija određeno je kao oslobađanje laktat dehidrogenaze (LDH, Promega) u kulturi supernatant. Za ubijanje zasnovano na protoku, ciljne ćelije su obeležene CMTMR (Life Technologies) i ubijanjem ćelija praćen je pomoću protočnog citometra FACSCalibur. Podaci su analizirani pomoću softvera PRISM® 5 (GraphPad) I predstavljena kao procenat citotoksičnosti.

Farmakologija majmuna Cinomolgus

[0209] Eksperimenti sa primatima na ljudima nisu izvedeni u laboratorijama Charles River (Reno, NV), prema smernice lokalnog Institucionalnog odbora za negu i upotrebu životinja (IACUC). Namenski uzgajani, naivni majmuni cynomolgus (Macacafascicularis) kineskog porekla (raspon starosti 2,5-9 godina, raspon težine 2,7-5 kg) obezbeđeni su vozilom ili DART-A putem intravenske infuzije kroz femoralni i vratni otvor pomoću infuzijskih pumpi na baterijski pogon koji se mogu programirati (CADD-Legaci®, SIMS Deltec, Inc., St. Paul, MN). Uzorci periferne krvi ili koštane srži prikupljeni su u antikoagulansu koji sadrže cevi u naznačenim vremenskim tačkama. Analize fenotipa ćelijske površine izvedene su pomoću LSR Fortessa analizator (BD Biosciences) opremljen sa 488nm, 640nm i 405nm laserima i sledećim antitelima: CD4- V450, CD8-V450, CD123-PE-Ci7, CD45-PerCP, CD4-APC-H7, CD8-FITC, CD25-PE-Ci7, CD69-PerCP, PD-1-PE, TIM3-APC, CD3-Pacifičko plava, CD95-APC, CD28-BV421, CD16-FITC, CD3-Aleka488, CD38-PE, CD123-PE-Ci7, CD117-PerCP-Ci5.5, CD34-APC, CD90-BV421, CD45RA-APC -H7 i CD33-APC (BD Biosciences). Apsolut broj ćelija je određen pomoću TruCOUNT (BD Biosciences). Serumski nivoi IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, TNF-α I IFN-i citokini su mereni pomoću ne-humanog kompleta citometrijskih nizova citokinskih perlata Th1 / Th2 (BD Bioscience). Koncentracija DART-A u uzorcima seruma majmuna izmerena je pomoću sendvič imunoanalize sa detekcija elektrohemiluminescencije (MesoScale Diagnostics, MSD, Rockville, MD). Ukratko, test ploča (MSD) je bila obložen rekombinantnim humanim IL-3 Ra (R&D sistem) i blokiran sa 5% BSA. Standardi za kalibraciju ili razređeni test primenjeni su uzorci, praćeni dodavanjem biotinilovanog monoklonskog antitela koje pokazuje specifično vezivanje za gore opisani E-kalem (SEK ID NO: 34) i K-kalem (SEK ID NO: 35) domeni molekula A SULFO-TAG ™ obeleženi dodan je streptavidin konjugat (MSD) i formiranje kompleksa je analizirano u MSD SECTOR® snimaču. Koncentracije DART-A određene su na osnovu standardnih krivih generisanih uklapanjem podataka o intenzitetu svetlosti u petparametar logistički model. Fizičko-hemijska karakterizacija prečišćenog DART-A pokazala je homogeni heterodimer sa molekulska masa od 58,9 kDa (slika 23; slike 24A-24B), koja je bila stabilna na 2-8 ° C do 12 meseci u PBS. SPR analiza je pokazala gotovo identične afinitete vezivanja DART-A za odgovarajući rastvorljivi čovek i cynomolgus majmuni CD3 i CD123

1

antigeni (slike 25A-25D i tabela 7). Dalje, DART-A je istovremeno vezao oba antigeni u ELISA formatu koji su koristili CD123 čoveka ili majmuna za hvatanje i humani CD3 za otkrivanje (slike 26A-26B), i pokazali slično vezivanje za T-limfocite čoveka i majmuna (slike 26C-26E). Podaci u Tabela 7 su proseci 3 nezavisna eksperimenta, svaki izveden u duplikatima.

DART-A posreduje u usmerenom ubistvu limfocita čoveka ili majmuna Cinomolgus

[0211] DART-A posredovano preusmereno ciljno ubijanje ćelija efektorskim ćelijama čoveka ili majmuna protiv CD123 Kasumi-3 leukemične ćelijske linije (slika 27A-27D), koja je praćena indukcijom markera aktivacije. Nijedna aktivnost nije bila posmatrano protiv CD123 negativnih ciljeva (ćelije U937) ili sa Control DART-om, ukazujući da je aktivacija T ćelija strogo zavisno od angažovanja ciljne ćelije i da monovalentno angažovanje CD3 pomoću DART-A nije bilo dovoljno za pokretanje Aktivacija T ćelija. Budući da se CD123 izražava podskupovima normalnih cirkulišućih leukocita, uključujući pDC i monocite (Slika 27E), efekat DART-A je dalje ispitivan u normalnim PBMC-ima čoveka i majmuna.

[0212] Postepeni efekat je primećen među humanim PBMC, sa dozom zavisnim brzim iscrpljenjem CD14-CD123 visoko ćelije (pDC i bazofili) posmatrane već 3 sata nakon početka lečenja, dok su monociti (CD14 ćelije) ostao nepromenjen u ovom trenutku (slike 27F-27G). Iscrpljivanje visokih ćelija CD14-CD123 povećavalo se tokom vremena sve koncentracije DART-A molekula, dok su monociti blago smanjeni za 6 sati i iscrpljeni tek nakon 18 sati sata i pri koncentracijama većim od 1 ng / mL. Inkubacija PBMC majmuna sa DART-A rezultirala je uporedivim doza zavisno iscrpljivanje visokih ćelija CD14-CD123 (slika 27H), dalje podržavajući značaj ove vrste za DART-A farmakologija (CD14 ćelije majmuna ne izražavaju malo ili nimalo CD123 i nisu iscrpljene).

Farmakokinetika DART-A kod majmuna Cinomolgus

2

[0213] Majmun cinomolgus je izabran kao odgovarajući farmakološki model za DART-A analizu na osnovu na ekvivalentnu distribuciju oba ciljana antigena u ovoj vrsti u poređenju sa ljudima na osnovu imunohistohemije sa prekursorskim mAb, u skladu sa objavljenim informacijama (Munoz, L. et al. (2001) "Interleukin-3 Receptor Alpha Lanac (CD123) je široko izražen u hematološkim malignitetima, "Haematologica 86: 1261-1269; Korpelainen, E.I. et al. (1996) "Ekspresija, regulacija i funkcija receptora IL-3 u ćelijama vaskularne ćelije," Immunol. Cell Biol.

74: 1-7).

[0214] Sprovedena studija je obuhvatila 6 lečenih grupa koje su se sastojale od 8 majmuna cinomolgus po grupi (4 mužjaka, 4 ženke) (tabela 8). Sve grupe su dobile kontrolu vozila za prvu infuziju; zatim je primenjeno vozilo ili DART-A intravenozno tokom 4 nedeljna ciklusa. Životinje grupe 1 su dobile kontrolu vozila za sve 4 naredne infuzije, dok Grupe 2-5 su primale nedeljne eskalirajuće doze DART-A tokom 4 dana u nedelji za sve naredne infuzije. Grupa 6 životinja tretirani su sedmodnevnim neprekidnim eskalirajućim dozama DART-A za sve infuzije. Četvorodnevni / 3-slobodni I Rasporedi od 7 dana dizajnirani su da prave razliku između trajnih i prolaznih efekata povezanih sa administracijom DART-A. Dva muškarca i 2 žene u grupi su žrtvovana na kraju faze lečenja (36. dan), dok je preostali majmuni su izvađeni nakon 4-nedeljnog oporavka (dan 65). Podgrupa majmuna razvila je anti-drogu antitela (ADA) usmerena protiv humanizovanog Fv i sa CD3 i sa CD123 i sa podacima koji prate pojavu ADA su isključeni iz PK analize. Svi majmuni su bili izloženi DART-A tokom perioda ispitivanja.

[0215] Za procenu PK parametara korišćen je model sa dva odeljenja (tabela 9 i slika 28). T1 / 2α je bio kratak (4-5min), što odražava brzo vezivanje za ciljeve u krugu; T1 / 2β je takođe bio brz, kao što se očekivalo za molekul ove veličine, koja podleže bubrežnom klirensu. Analiza uzoraka seruma prikupljenih na kraju svake infuzije od majmuna grupe 6 pokazao je povećanje doze DART-A Cmak zavisno od doze. U tabeli 9, nosač je bio PBS, pH 6,0, koji sadrži 0,1 mg / ml rekombinantni humani albumin, 0,1 mg / ml PS-80 i 0,24% benzil alkohol korišćeni su za sve infuzije u vozilu tokom prva 4 dana svake infuzione nedelje pratili su istu formulaciju bez benzil alkohola tokom preostala 3 dana svake nedeljna infuzija. DART-A je davan u naznačena vremena kao kontinuirana IV infuzija rastvora PBS, pH 6,0, koji sadrži 0,1 mg / ml rekombinantnog humanog albumina, 0,1 mg / ml PS-80 i 0,24% benzil alkohola na potrebnom nivou koncentracija.

Oslobađanje citokina kod majmuna Cinomolgus koji se leče DART-A

[0216] S obzirom na svojstva aktiviranja T ćelija DART-A, povećanje cirkulišućih citokina praćeno infuzijom je predviđena i zato je niska početna doza korišćena kao strategija „desenzibilizacije“, zasnovana na prethodnom iskustvu sa sličnim jedinjenjima (videti, na primer, Topp, M. S. i sar. (2011) „Ciljna terapija antitelom koje uključuje T-ćelije“ Blinatumomab hemoterapije-vatrostalne minimalne rezidualne bolesti u akutnoj limfoblastnoj leukemiji B-loze Rezultati pacijenata u visokoj stopi odgovora i produženom preživljavanju bez leukemije, "J. Clin. Oncol. 29: 2493-2498; Bargou, R. i sar. (2008) „Regresija tumora kod pacijenata sa karcinomom u vrlo malim dozama antitela koja uključuju T ćelije“, Science 321: 974-977). Od testiranih citokina, IL-6 je pokazao najveće promene nakon infuzije, mada prolazne prirode, minimalne veličine i sa velikim varijacijama među životinjama i među grupama (slike 29A-29C). Mala, prolazna povećanja u IL-6 takođe su primećeni nakon infuzija u vozilu (sve infuzije Grupe 1 i svih Dana 1), što ukazuje na osetljivost ovog citokin do manipulativnog stresa. Bez obzira na to, primećeno je povećanje serumskog IL-6 (<80pg / mL) u zavisnosti od DART-A neki majmuni

4

nakon prve infuzije DART-A (100 ng / kg / dan), koja se vratila na početno stanje za 72 sata. Zanimljivo, veličina otpuštanja IL-6 smanjivala se sa svakom uzastopnom infuzijom DART-A, čak i kada je nivo doze bio povećan do 1000 ng / kg / dan. Takođe su primećeni minimalni i prolazni porasti TNF-α u serumu (<10pg / mL) povezani sa DART-A; kao i kod IL-6, najveća veličina oslobađanja TNF-α je primećena nakon prve infuzije. Nije bilo DART-A povezane promene nivoa IL-5, IL-4, IL-2 ili IFN-γ tokom studije u poređenju sa kontrolama. U Zaključak je da je oslobađanje citokina kao odgovor na lečenje majmuna DART-A bilo minimalno, prolazno i zastupljeno efekat prve doze kojim se može upravljati eskalacijom doze unutar subjekta.

Iscrpljivanje cirkulišućih CD14- / CD123 leukocita posredstvom DART-a in vivo

[0217] Apsolutni nivoi CD14- / CD123 ćelija u cirkulaciji mereni su tokom studije kao farmakodinamički krajnja tačka. Iako je broj CD123 ćelija u kontrolnoj grupi 1 tokom vremena ostao stabilan, tretman DART-A bio je povezan sa opsežnim iscrpljivanjem cirkulišućih CD14- / CD123 ćelija (94-100% u odnosu na početno ispitivanje) od prve izmerene vremenske tačke (72 sata) nakon početka prve infuzije DART-A (100 ng / kg / dan) kod svih životinja u svim aktivnim grupama za lečenje (slike 30A-30C). Iscrpljivanje je bilo trajno, jer je trajalo tokom trodnevnih nedeljnika doziranje odmora u grupi 2-5, vraćanje na početne nivoe samo tokom produženog perioda oporavka. Da bi se eliminisao mogućnost DART-A maskiranja ili modulacije CD123 (malo verovatni scenario, s obzirom na niske nivoe DART-A u cirkulaciji), pDC su nabrojani pravokutnim markerom, CD303. U skladu sa podacima CD123, CD303 pDC su bili slično osiromašeni kod majmuna lečenih DART-A (slike 30D-30F).

Cirkulacija nivoa T-limfocita, aktivacija i analiza podskupa

[0218] Za razliku od upornog iscrpljivanja cirkulišućih CD123 ćelija, DART-A je primenjen 4 dana / 3 slobodni dan (grupe 2-5) bili su povezani sa nedeljnim fluktuacijama u T ćelijama u cirkulaciji, dok je primena kao kontinuirane infuzije od 7 dana rezultirale su slično smanjenim nivoom T ćelija u cirkulaciji nakon prve primene koja polako se oporavlja bez fluktuacije čak i tokom perioda doziranja (slike 31A-31C). Razlika između njih dvoje strategije doziranja pokazuju da je efekat DART-A na T limfocite u skladu sa trgovinom ljudima i / ili marginacijom, a ne iscrpljivanje. Nakon prestanka doziranja, T ćelije su se vratile na nivo približno dvostruko veći od početnog nivoa za vreme perioda oporavka. Infuzija DART-A povezana je sa progresivnom zavisnošću od izloženosti povećana učestalost T ćelija koje izražavaju marker kasne aktivacije, PD-1, posebno u CD4 ćelijama, sa dozom grupe 6 koji prikazuju najviše ukupne nivoe (slike 31D-31I i slike 32A-32F i slike 33A-33F). Tim-3, marker povezan sa iscrpljenošću T ćelija, nije otkriven na CD4 T ćelijama i samo na niskoj frekvenciji među CD8 + ćelijama (5,5-9,7%) i obuhvata 20,5-35,5% dvostruko pozitivnih ćelija CD8 / PD-1 . Nije bilo doslednih promena u rani marker aktivacije T ćelija, CD69, i samo skromne varijacije u ekspresiji CD25 među ćelijama u cirkulaciji.

[0219] Da bi se isključila iscrpljenost nakon in vivo izlaganja, ek vivo citotoksični potencijal efektorskih ćelija izolovanih iz majmunima cinomolgus koji su primali višestruke infuzije DART-A upoređivan je sa onim ćelijama naivnih majmuna. Kao što prikazan na slici 34, PBMC izolovan od majmuna tretiranih DART-A pokazuje citotoksičnost uporedivu sa onom izolovanih ćelija od naivnih majmuna, što ukazuje da in vivo izlaganje DART-A ne negativno utiče na sposobnost T ćelija da ubiju ciljne ćelije.

[0220] Izlaganje DART-A povećalo je relativnu frekvenciju CD4 ćelija centralne memorije i efektorske memorije CD8 ćelije na štetu odgovarajuće populacije naivnih T ćelija (slike 35A-35F i slike 32A-32F i slike 33A-33F), što ukazuje da je izlaganje DART-A pospešilo širenje i / ili mobilizaciju ovih ćelija.

Efekti na hematopoezu i prekursore koštane srži

[0221] DART-A se dobro podnosio kod majmuna u svim testiranim dozama; međutim, reverzibilno smanjenje parametara crvenih ćelija primećeni su u najvišim dozama (slike 36A-36C). Učestalo uzimanje krvi moglo je potencijalno doprineti tome faktor, jer su životinje tretirane vozilima pokazale umeren pad mase crvenih ćelija. Primećen je retikulocitni odgovor kod svih životinja; pri najvećoj izloženosti (Grupa 6), međutim, odgovor je izgledao nešto manje robustan za slično smanjenje u masi crvenih ćelija (slike 36D-36F). Morfološka analiza razmaza koštane srži tokom studije bila je neupadljiva. Analiza protočne citometrije, međutim, otkrila je da je učestalost CD123 ćelija unutar nezrele loze negativna Populacije koštane srži (Lin-) smanjile su se kod životinja tretiranih DART-A na kraju perioda doziranja, vraćajući se do osnovnih nivoa do kraja vremena oporavka (slika 37A-37B). HSC (definisan kao Lin- / CD34 / CD38- / CD45RA- / CD90 ćelije (Pang, V. V. i sar. (2011) "Matične ćelije hematopoeze ljudske koštane srži" Povećavaju se frekvencije i mijeloidni su skloni uzrastu, "Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 108: 20012-20017)) pokazao je velika varijabilnost među grupama; Majmuni tretirani DART-A grupom 4-6 pokazuju očigledno smanjenje u poređenju sa odgovarajućim nivoi pre doze, međutim, nije primećen pad kod svih tretiranih grupa u poređenju sa životinjama tretiranim nosačem. Ovi podaci ukazuju da su HSC manje podložni ciljanju pomoću DART-A i u skladu su sa uočenom reverzibilnošću negativnih efekata tretmana DART-A na hematopoezu.

[0222] Kao što je gore pokazano, u pogledu infuzija tokom 4 nedelje po nedeljnom rasporedu od 4 dana na / 3 dana ili 7-dnevni raspored po početnim dozama od 100 ng / kg / dan koje su postepeno eskalirale na 300, 600 I 1.000 ng / kg / dan, primena DART-A majmunima cinomolgus se dobro podnosila. Osiromašenje cirkulišućeg CD123 ćelije, uključujući pDC, primećene su nakon početka prve primene i opstale su tokom cele studije u svim dozama i rasporedima. Takođe je primećeno reverzibilno smanjenje prekursora CD123 koštane srži. Oslobađanje citokina, kao značajna zabrinutost za bezbednost kod CD3 ciljanih terapija, činilo se upravljivim i u skladu sa efektom prve doze. Umereno je reverzibilna anemija zabeležena je kod najvećih doza, ali nisu zabeleženi nikakvi drugi (ne-ciljani) neželjeni događaji.

[0223] Majmun cinomolgus je odgovarajući životinjski model za farmakološku procenu DART-A, s obzirom na visoku homologiju između ortologa i sposobnost DART-A da se veže sličnim afinitetom za antigene I posreduju u preusmerenom ubijanju T ćelija kod obe vrste. Dalje, oba antigena se podudarno izražavaju kod majmuna i ljudi, uključujući sličnu ekspresiju hematopoetskim prekursorima i u citoplazmi endotela više tkiva. Manji izuzeci su ekspresija u testisnim Leidigovim ćelijama kod ljudi, ali ne i kod majmuna i osoba sa malim odsustvom CD123 u monocitima majmuna u poređenju sa ljudima. [0224] Primarna briga povezana sa terapijskim strategijama koje uključuju aktivaciju T ćelija uključuje oslobađanje citokini i vanciljni citotoksični efekti. Nedavna studija sa CD3xCD123 bi-specifičnim scFv imunofuzionim konstruktom sa dvovalentnim prepoznavanjem CD3 pokazao je antileukemijsku aktivnost in vitro, ali je izazvao nespecifičnu aktivaciju T ćelija i IFN-γ sekreciju (Kuo, S.R. i sar. (2012) "Inženjering CD123kCD3 Bispecific scFv imunofuzija za lečenje O leukemiji i eliminaciji matičnih ćelija leukemije, "Protein Eng. Des. Sel.25: 561-569). Monovalentna priroda svaki vezujući krak i visoko homogeni monomerni oblik DART-A osiguravaju da zavisi aktivacija T ćelija isključivo nakon angažovanja ciljne ćelije: nije primećena aktivacija T ćelija u odsustvu ciljnih ćelija ili korišćenjem DART molekula koji je uključivao samo ruku usmjerenu na CD3. Dalje, velike doze (do 100 ug / kg / dan) Kontrolni molekul DART nije pokrenuo oslobađanje citokina kod majmuna cinomolgus. Početna doza molekula DART-A od 100 ng / kg / dan dobro se podnosi, sa minimalnim oslobađanjem citokina. Citokin međutim, oluja se dogodila sa visokom početnom dozom (5 mg / kg / dan); međutim, do takve doze se moglo doći sigurno postepeno povećanje sedmične doze, što ukazuje da se čini da je oslobađanje citokina posredovano DART-om prvenstveno prva doza cffcct. Osiromašenje ciljnih ćelija CD123 , čime se eliminiše izvor ligacije CD3, može objasniti prvu dozu efekat: primećeno je gotovo potpuno iscrpljivanje ćelija CD123 pri dozama od 3-10 ng / kg / dan, što ukazuje da oslobađanje citokina in vivo prati promenljivi odgovor doze u poređenju sa citotoksičnošću. Profili doze i odgovora na citotoksičnost i oslobađanje citokina od strane ljudskih ćelija T takođe je bilo u skladu sa ovim zapažanjem.

[0226] Čini se da takođe doprinosi desenzibilizacija T ćelija, u kojoj DAR-A indukovana PD1 regulacija može da igra ulogu. da ograniči oslobađanje citokina nakon prve infuzije DART-A. Nedavne studije pokazuju da povećana ekspresija PD-1 nakon antigen-indukovano zaustavljanje T ćelija na mestima upale doprinosi, interakcijom sa PD-L1, prekidu zaustavnog signala, oslobađanjem i desenzibilizacijom ćelija (Honda, T. i sar. (2014) „Podešavanje osetljivosti na antigene pomoću T ćelije Negativne povratne sprege zavisne od receptora kontrolišu funkciju efektora T ćelija u upaljenim tkivima, „Imunitet 40: 235-247; Vei, F. i sar. (2013) „Snaga PD-1 signalizacije diferencijalno utiče na funkcije efektora T-ćelija“, Proc. Natl. Acad. Sci. (SAD) 110: E2480-E2489). PD-1 suzbijanje snage TCR signalizacije nije ujednačeno: dok proliferacija I proizvodnja citokina izgleda najosetljivija na inhibiciju PD-1, citotoksičnost je najmanje pogođena (Vei, F. et al. (2013) „Snaga PD-1 signalizacije diferencijalno utiče na funkcije efektora T-ćelija“, Proc. Natl. Acad. Sci. (SAD) 110: E2480-E2489). Dosledno, ek vivo citotoksični potencijal T ćelija majmuna izloženih višestrukim infuzijama DART-A bio uporediv sa T ćelijama naivnih majmuna, uprkos povećanom nivou PD-1 kod prethodnih. Štaviše, PD- regulacija nije praćena ekspresijom TIM3, obeležjem iscrpljenosti T ćelija, kao što je prikazano za izložene T ćelije na dugotrajnu stimulaciju sa CD3 antitelima ili hroničnim infekcijama (Gebel, H.M. et al. (1989) "T-ćelije pacijenata Uspešno tretirani sa OKT3 Ne reagujte sa antitelom na T-ćelijski receptor, "Hum. Immunol.26: 123-129; Vherri, E.J. (2011) „Iscrpljivanje T ćelija“, Nat. Immunol.12: 492-499).

[0227] Osiromašenje cirkulišućih CD123 ćelija kod majmuna tretiranih DART-A bilo je brzo i nastavljeno tokom nedeljno doziranje praznika u rasporedu od 4 dana na dan / 3 dana slobodnog dana, u skladu sa eliminacijom ciljne ćelije. Nasuprot tome, prolazno fluktuacije u cirkulišućim T ćelijama verovatno su rezultat trgovine od / do tkiva i limfoidnih organa u funkciji DART-A. Izloženost DART-A promoviše ekspanziju i / ili mobilizaciju T limfocita, ćelija, iskusnih sa antigenom koji preferiraju dom tkiva i lakše vrše citotoksičnu efektorsku funkciju (Mirenda, V. i sar. (2007) "Phisiologic I nepravilno regulisanje trgovine memorijskim T-ćelijama Kostimulacijskim molekulom CD28, "Krv 109: 2968-2977; Marelli-Berg, F.M. et al. (2010) „Trgovina memorijskim T-ćelijama: nova uputstva za zauzeća privremena putovanja“, Imunologija 130: 158-165).

[0228] Osiromašenje CD123 normalnih ćelija može nositi potencijalne obaveze. pDC i bazofili izražavaju visok nivo CD123, u poređenju sa nižim nivoima monocita i eozinofila (Lopez, A.F. i sar. (1989) „Uzajamna inhibicija Vezivanje između Interleukin-a 3 i faktora stimulisanja kolonija granulocita-makrofaga sa ljudskim eozinofilima, „Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 7022-7026; Munoz, L. i sar. (2001) „Interfeukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) je široko rasprostranjen Izraženo u hematološkim malignitetima, "Haematologica 86: 1261-1269; Masten, B.J. i sar. (2006)" Karakterizacija Mijeloidnih i plazmocitoidnih dendritičnih ćelija u plućima čoveka, "J. Immunol. 177: 7784-7793; Korpelainen, E.I. i sar. (1995) „Interferon-gama pojačava ekspresiju receptora za interleukin-3 (IL-3) u ljudskim endotelnim ćelijama i sinergiše ih Sa IL-3 u stimulisanju ekspresije velikog kompleksa histokompatibilnosti klase II i stvaranja citokina, "Krv 86: 176-182). Pokazalo se da pDC igraju ulogu u kontroli određenih virusa u modelima miša ili majmuna infekcije, iako se ne čine kritičnim za kontrolu imunološkog odgovora na grip (Colonna, M. i sar. (1997) "Specifičnost i funkcija imunoglobulinskih superfamilija NK ćelijskih inhibitornih i stimulativnih receptora," Immunol. Rev. 155: 127-133; Smit, J.J. et al. (2006) „Plazmocitoidne dendritične ćelije sprečavaju plućnu imunopatologiju i promovišu Čišćenje respiratornog sincicijskog virusa, "J. Ekp. Med. 203: 1153-1159). U modelima tumora, pDC mogu promovisati tumor rast i metastaze, dok je iscrpljivanje pDC rezultiralo inhibicijom tumora (Savant, A. et al. (2012) "Iscrpljivanje plazmocitoida Dendritične ćelije inhibiraju rast tumora i sprečavaju metastazu u ćelijama raka dojke u kostima, "J. Immunol.189: 4258-4265). Prolazno, skromno oticanje lica nezavisno od doze primećeno je kod nekih majmuna lečenih DART-A; međutim, nije primećen povišen nivo histamina kod ovih majmuna ili kada su to bili ljudski bazofili lizirano ubijanjem T ćelija posredstvom DART-A. Osiromašenje monocita može nositi povećani rizik od infekcije; posledica na taj način treba nadgledati smanjenje pDC, iscrpljivanje bazofila ili eozinofila kod ljudi.

[0229] Predani hematopoetski prekursori koji eksprimiraju CD123, poput uobičajenog mijeloidnog prekursora (CMP) (Jordan, C.T. i sar. (2000) „Alfa lanac receptora za Interleukin-3 je jedinstveni marker za humani akutni mijelogeni Matične ćelije leukemije, "Leukemia 14: 1777-1784; Rieger, M.A. i sar. (2012)" Hematopoiesis, "Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4: a008250), može biti meta DART-A, moguće objašnjenje za umerenu anemiju uočenu nakon promene DART-A u najvišoj dozi. Izgleda da je odgovor eritropoetskog retikulocita funkcionisao na svim DARTA nivo doze; međutim, za srazmeran pad parametara crvenih ćelija, životinje podvrgnute najvećem DART-A izloženost (Grupa 6, sedmodnevna infuzija) pokazala je smanjeni retikulocitni odgovor, što ukazuje na moguću citotoksičnu aktivnost na prekursore (npr. CMP). Efekat je bio reverzibilan nakon prestanka tretmana DART-A, u skladu sa ponovnim naseljavanjem iz pošteđenog CD123 niskog / negativnog HSC-a.

[0230] Alternativni pristupi za iscrpljivanje CD123 ćelija uključuju drugu generaciju CD123-specifičnog Fc-pojačanog monoklonsko antitelo (Jin, L. i sar. (2009) "Monoklonsko ciljanje posredovano antitelima na CD123, IL-3 receptor alfa Chain, Eliminiše ljudske akutne mijeloične leukemične matične ćelije, "Matične ćelije ćelija 5: 31-42; Roberts, A. V. et al. (2010)" Studija I faze anti-CD123 monoklonskih antitela (mAb) CSL360 ciljanih matičnih ćelija leukemije (LSC) U AML, „J. Clin. Oncol.28 (Suppl): e13012), IL-3 vezani difterijski toksin (Frankel, A. i sar. (2008) „Faza I Klinička studija difterije Toksin-Interleukin 3 fuzijski protein kod pacijenata sa akutnom mijeloičnom leukemijom i mijelodisplazijom, "Leuk. Limfom 49: 543-553), ćelije ubice izazvane citokinom (CIK) koje eksprimiraju CD123 specifične himerne antigenske receptore (CAR) (Tettamanti, S. i sar. (2013) „Ciljanje akutne mijeloične leukemije ćelijama-indukovanim ćelijama ubicama preusmerenim romanom CD123- Specifični receptor za himerni antigen, "Br. J. Haematol.161: 389-401) i CD123 CAR T ćelije (Gill, S. et al. (2014) „Efikasnost protiv humane akutne mijeloične leukemije i mijeloablacije normalne hematopoeze u mišjem modelu Korišćenje T-ćelija modifikovanih himernim antigenom, "Krv 123 (15): 2343-2354; Mardiros, A. i sar. (2013)" T-ćelije Izražavanje specifičnih za CD123 himernih receptora antigena pokazuje specifične funkcije citolitičkog efektora i antitumor Efekti protiv humane akutne mijeloične leukemije, "Krv 122: 3138-3148). CAR T ćelije su pokazale snažnu eksploziju leukemije ubijanje ćelija in vitro i antileukemijska aktivnost u ksenogenom modelu diseminovane AML (Mardiros, A. i sar. (2013) "T Ćelije koje ekspresuju CD123-specifične himerne receptore antigena pokazuju specifične funkcije citolitičkog efektora i antitumor Efekti protiv humane akutne mijeloične leukemije, "Krv 122: 3138-3148). Nedavna studija izvestila je o ablaciji normalne hematopoeze kod NSG miševa kojima su ugrađene humane CD34 ćelije nakon prenosa CD123 CAR T ćelija (Gill, S. et al. (2014) „Efikasnost protiv humane akutne mijeloične leukemije i mijeloablacije normalne hematopoeze u mišjem modelu Korišćenjem T ćelija modifikovanih himernim antigenom, "Krv 123 (15): 2343-2354), mada drugi to nisu primetili slični efekti in vitro ili in vivo (Tettamanti, S. i sar. (2013) „Ciljanje akutne mijeloične leukemije indukovanim citokinima“ Ćelije ubice preusmerene novim romanskim receptorima himernog antigena specifičnim za CD123, "Br. J. Haematol. 161: 389-401; Pizzitola, I. i dr. (2014) „Himerni receptori antigena protiv CD33 / CD123 antigena efikasno ciljaju primarni akutni mijeloid Ćelije leukemije in vivo, "Leukemia doi: 10.1038 / leu.2014.62). U gore pomenutim eksperimentima, smanjenje CD123 primećene su populacije prekursora koštane srži, ali obrnute tokom oporavka; nadalje, iscrpljivanje ove manjine populacija nije rezultirala promenama u ćelijskoj koštanoj srži ili odnosu eritroida i mijeloidnih ćelija (E: M) u svim dozama DART-A testirani nivoi. Ove razlike podvlače potencijalne prednosti DART-A u odnosu na ćelijske terapije, jer pruža a titrabilni sistem koji se oslanja na autologne T ćelije za razliku od "supernapunjenih" ek vivo transdukovanih ćelija koje mogu biti teže kontrolisati. CD123 je prekomerno izražen u nekoliko hematoloških malignih oboljenja, uključujući AML, leukemiju dlakavih ćelija, blastne plazmocitoidne dendritične ćelijske novotvorine (BPDCN), podskupina B-prekursora akutne limfoblastne leukemije (B-ALL) i hronične limfocitne leukemije, Hodgkinove bolesti Reed-Stembergove ćelije, kao i kod mijelodisplastičnog sindroma i sistemska mastocitoza (Kharfan-Dabaja, M.A. i sar. (2013) „Dijagnostički i terapijski napredak u blastičnom plazmocitoiduNeoplazma dendritičnih ćelija: fokus na transplantaciji hematopoetskih ćelija, „Biol. Transplantacija krvne srži.19: 1006-1012; Florian, S. i sar. (2006) „Otkrivanje molekularnih ciljeva na površini CD34 / CD38-- matičnih ćelija U Razni mijeloidni maligniteti Leuk. Limfom 47: 207-222; Munoz, L. i sar. (2001) „Interleukin-3 receptor alfa Lanac (CD123) je široko izražen u hematološkim malignim bolestima, "Haematologica 86: 1261-1269; Fromm, J.R. (2011) „Protočna citometrijska analiza CD123 korisna je za imunofenotipizaciju klasičnog Hodgkina Limfom, "Citometri B Clin. Citom. 80: 91-99). Predvidljiva farmakodinamička aktivnost i bezbednost kojom se može upravljati profil primećen kod primata koji nisu ljudi dalje podržava kliničku korisnost i efikasnost DART-A kao imunoterapije za ove poremećaje.

[0231] Ukratko, DART-A je molekul zasnovan na antitelima koji uključuje CD3s podjedinicu TCR-a za preusmeravanje T limfocita protiv ćelija koje eksprimiraju CD123, antigen pojačan u nekoliko hematoloških malignih bolesti. DART-A se vezuje za oboje antigeni čoveka i cinomolgus majmuna sa sličnim afinitetima i preusmeravaju T ćelije obeju vrsta da ubiju CD123 ćelije. Majmuni infuzirani 4 ili 7 dana u nedelji sa nedostupnim dozama DART-A pokazuju smanjenje cirkulacije CD123 ćelije 72h nakon započinjanja lečenja koje su trajale tokom 4 nedelje lečenja, bez obzira na doziranje raspored. Takođe se desilo smanjenje cirkulišućih T ćelija, ali oporavljeno do početnog nivoa pre sledeće infuzije u majmuni na 4-dnevnom rasporedu doza, u skladu sa DART-A posredovanom mobilizacijom. Povećana je administracija DART-A cirkulišuće PD1 , ali ne i TIM-3 , T ćelije; štaviše, ek vivo analiza T ćelija tretiranih majmuna pokazala se nepromenjenom preusmerena liza ciljne ćelije, što ukazuje da nema iscrpljenosti. Toksičnost je bila ograničena na minimalno prolazno oslobađanje citokina nakon prve infuzije DART-A, ali ne i nakon sledećih primena, čak i kada je doza eskalirala, i a minimalno reverzibilno smanjenje mase crvenih ćelija sa istovremenim smanjenjem CD123 prednika koštane srži. Klinička čini se da je ispitivanje DART-A na hematološke maligne bolesti opravdano.

1

�

11

��

�

��

�

11

��

Claims

Patetni zahtevi

1. Diatelo sposobno za specifično vezivanje za epitop CD123 i za epitop CD3, naznačeno time da diatelo sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, kovalentno povezani jedan sa drugim, pri čemu:

A. prvi polipeptidni lanac sadrži, u smeru od N-završetka do C-završetka:

i. domen 1, koji obuhvata

(1) poddomen (1A), koji sadrži VL domen monoklonskog antitela sposobnog za vezivanje za CD3 (VLCD3) i koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 21; i

(2) poddomen (1B), koji sadrži VH domen monoklonskog antitela sposobnog za vezivanje za CD123 (VHCD123) i koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 26, pri čemu su pomenuti poddomeni 1A i 1B međusobno odvojeni peptidnim veznikom koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 29;

ii. domen 2, pri čemu je navedeni domen 2 domen E-spirale

koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 34; ili domen K-spirale koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 35, pri čemu je navedeni domen 2 odvojen

od pomenutog domena 1 pomoću peptidnog veznika koji ima aminokiselinsku

sekvencu SEK ID BR: 30; i

B. drugi polipeptidni lanac sadrži, u smeru od N-završetka do C-završetka:

i. domen 1, koji obuhvata

(1) poddomen (1A), koji sadrži VL domen monoklonskog antitela sposobnog za vezivanje za CD123 (VLCD123) i koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 25; i (2) poddomen (1B), koji sadrži VH domen monoklonskog antitela sposobnog za vezivanje na CD3 (VHCD3) i koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 22, pri čemu su pomenuti poddomeni 1A i 1B međusobno odvojeni peptidnim veznikom koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 29;

ii. Domen 2, pri čemu je navedeni domen 2 domen K-spirale koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 35; i ili domen E-zavojnice koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 34, pri čemu je navedeni domen 2 odvojen od navedenog domena 1 peptidnim veznikom koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 30; i pri čemu navedeni domen 2 pomenutog prvog i pomenutog drugog polipeptidnog lanca nisu oba domeni E-zavojnice ili oba domeni K-zavojnice,

i pri čemu:

(a) pomenuti VL domen pomenutog prvog polipeptidnog lanca i pomenuti VH domen pomenutog drugog polipeptidnog lanca obrazuju antigen vezujući domen sposoban za specifično vezivanje za epitop CD3; i

(b) pomenuti VL domen pomenutog drugog polipeptidnog lanca i navedeni VH domen pomenutog prvog polipeptidnog lanca obrazuju antigen vezujući domen sposoban za specifično vezivanje za epitop CD123.

2. Diatelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da pomenuti prvi polipeptidni lanac dodatno sadrži domen za vezivanje albumina koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 36 povezan sa navedenim domenom 2 putem peptidnog veznika koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 31.

3. Diatelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da pomenuti drugi polipeptidni lanac dodatno sadrži domen 3 koji obuhvata CH2 i CH3 domen imunoglobulinskog Fc domena koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 37, pri čemu je navedeni domen 3 povezan sa navedenim domenom 1 putem peptidnog linkera koji poseduje aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 33.

4. Diatelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da pomenuti prvi polipeptidni lanac dodatno sadrži domen 3 koji obuhvata CH2 i CH3 domen imunoglobulinskog Fc domena koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 37, pri čemu je navedeni domen 3 povezan sa navedenim domenom 1 putem peptidnog linkera koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 33.

5. Diatelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da pomenuti drugi polipeptidni lanac dodatno sadrži domen 3 koji obuhvata CH2 i CH3 domen imunoglobulinskog Fc domena koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 37, pri čemu je navedeni domen 3 povezan sa navedenim domenom 2 putem peptidnog linkera koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 32.

6. Diatelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da pomenuti prvi polipeptidni lanac dodatno sadrži domen 3 koji obuhvata CH2 i CH3 domen imunoglobulinskog Fc domena koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 37, pri čemu je navedeni domen 3 povezan sa navedenim domenom 2 putem peptidnog linkera koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 32.

7. Diatelo prema bilo kom od patentnih zahteva 3-6, naznačeno time, da pomenuto diatelo dalje sadrži treći polipeptidni lanac koji sadrži CH2 i CH3 domen imunoglobulinskog Fc domena koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 11.

8. Diatelo prema bilo kom od patentnih zahteva 3-7, dalje sadrži peptid koji sadrži cistein N terminalno prema pomenutom CH2 i CH3 domenu pomenutog imunoglobulinskog Fc domena, pomenuti peptid koji sadrži cistein ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 55.

9. Diatelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, pri čemu je pomenuti domen 2 pomenutog prvog polipeptidnog lanca domen K-zavojnice koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 35 i pomenuti domen 2 pomenutog drugog polipeptidnog lanca je domen E-zavojnice koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 34.

10. Diatelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, pri čemu je pomenuti domen 2 pomenutog prvog polipeptidnog lanca domen E-zavojnice koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 34 i pomenuti domen 2 pomenutog drugog polipeptidnog lanca je K-spiralni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 35.

11. Diatelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time da je diatelo sposobno za unakrsno reagovanje i sa humanim i sa proteinima CD123 i CD3 primata.

12. Diatelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu:

12

A. prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: l; i

B. drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 3.

13. Diatelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da diatelo dalje sadrži treći polipeptidni lanac, pri čemu:

A. prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 15;

B. drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 13; i

C. treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 54.

14. Diatelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da diatelo dalje sadrži treći polipeptidni lanac, pri čemu:

A. prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 1;

B. drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 17; i

C. treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 54.

15. Diatelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, za upotrebu kao lek.

16. Diatelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-14, za upotrebu u lečenju bolesti ili stanja povezanih sa ili karakterisanih ekspresijom CD123, pri čemu je navedena bolest ili

stanje rak ili inflamatorno stanje.

17. Diatelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, naznačeno time da je pomenuta bolest ili stanje rak, a pomenuti kancer je odabran iz grupe koju čine: akutna mijeloidna leukemija (AML), hronična mijelogena leukemija (CML), uključujući blastičnu krizu CML-a i Abelson onkogen udružen sa CML-om (Bcr-ABL translokacija), mijelodisplastični sindrom (MDS), akutna B limfoblastna leukemija (B-ALL), hronična limfocitna leukemija (CLL), uključujući Richterov sindrom ili Richterovu transformaciju CLL, leukemija dlakastih ćelija (HCL), blastična plazmacitoidna dendritiska neoplazma (BPDCN), ne-Hodžkinov limfom (NHL), uključujući leukemiju mantelnih ćelija (MCL) i mali limfocitni limfom (SLL), Hodžkinov limfom, sistemska mastocitoza i Burkitov limfom.

12

18. Diatelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, naznačeno time da je pomenuta bolest ili stanje inflamatorno stanje, a pomenuto inflamatorno stanje je odabrano iz grupe koja se sastoji od: Autoimunog lupusa (SLE), alergije, astme i reumatoidnog artritisa.

19. Farmaceutski preparat koji sadrži diatelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 14 i fiziološki prihvatljiv nosač.

20. Farmaceutski preparat prema patentnom zahtevu 19, za upotrebu u lečenju bolesti ili stanja povezanih sa ili karakterisanih ekspresijom CD123, pri čemu je navedena bolest ili stanje rak ili inflamatorno stanje.

21. Farmaceutski preparat za upotrebu prema patentnom zahtevu 20, naznačen time, da je navedena bolest ili stanje rak, i pri čemu je pomenuti kancer odabran iz grupe koju čine: akutna mijeloidna leukemija (AML), hronična mijelogena leukemija (CML), uključujući blastičnu krizu CML-a i Abelson onkogen udružen sa CML-om (Bcr-ABL translokacija), mijelodisplastični sindrom (MDS), akutna B limfoblastna leukemija (B-ALL), hronična limfocitna leukemija (CLL), uključujući Richterov sindrom ili Richterovu transformaciju CLL, leukemija dlakastih ćelija (HCL), blastična plazmacitoidna dendritska neoplazma (BPDCN), ne-Hodžkinov limfom (NHL), uključujući leukemiju mantelnih ćelija (MCL) i mali limfocitni limfom (SLL), Hodžkinov limfom, sistemska mastocitoza i Burkitov limfom.

22. Farmaceutski preparat za upotrebu prema patentnom zahtevu 20, naznačen time, da je navedena bolest ili stanje upalno stanje, pri čemu je pomenuto inflamatorno stanje odabrano iz grupe koju čine: Autoimuni lupus (SLE), alergija, astma i reumatoidni artritis.

12