TWI308872B - Improved mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine - Google Patents

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1308872 五、發明說明（1 ) 發明領域 · 本案主張優先權爲共同審理中之2000年12月19曰臨 時申請序號60 / 256，6 3 7，其全部揭示於此倂入本文參考。 本發明係關於誘發保護性免疫力對抗豬肺炎黴漿菌 之改良方法，尤其是蓮用有 效量的細菌疫苗免疫接受該細菌疫苗之動物，以單一劑量 對抗豬肺炎黴漿菌的感染。 發明背景 豬肺炎黴漿菌（約^叩/MW 爲豬黴漿菌 性肺炎的病原劑。由於此疾病降低豬隻的體重增加及不良 的餵食效率，故爲豬隻工業中經濟損失之重要原因。此疾 病引起慢性咳嗽，暗晦的毛皮，生長遲緩，以及無經濟價 値的外表持續數週。在受感染動物觀察到紫到灰色區域合 倂之特徵性病變，尤其在腹尖及心葉。雖然此疾病造成小 小的死亡率，受影響的豬隻容易因伺機性致病原而第二次 感染導致死亡或受壓迫。單單經濟損失之估計每年達2到 2 . 5億之間。 豬肺炎黴漿菌爲緩慢生長且挑剔的細菌，其缺少細胞壁 。通常很困難從呼吸道分離出來，因爲第二常見病原豬鼻 炎黴漿菌（打σ Μ “ )也座落在呼吸道。疾病 散佈係經由咳嗽產生之氣溶膠，以及經由直接接觸受影響 的豬隻或康復中的帶原豬隻。受感染豬隻與未受感染豬隻 相混導致早期及頻頻再感染。感染常開始於帶原母豬生產 1308872 五、發明說明（2 ) 時之小豬感染。由於豬群管理技術，感染可能不明顯直到 稍後的生活。外加的感染通常在斷奶後，當豬隻聚集一起 時觀察到。明顯的疾病典型於六週大或更大的豬隻觀察到 。交影響動物的生長速率及飼料轉換率明顯下降。使用抗 生素治療較昂貴且需長期使用。再感染也是一大問題。疫 苗爲目前最有效方法避免感染及其影響。 在 Fort Dodge 動物保健（Fort Dodge Animal Health, FDAH)中以Suvaxyn®Respifend® ΜΗ之名稱銷售豬肺炎黴 策菌細菌疫苗，用於作爲疫苗保護健康豬隻對抗由豬肺炎 黴漿菌引起之臨床症狀。此疫苗含有Carbopol爲佐劑， 且建議兩劑量給一週大豬隻，第二劑量爲第一次接種疫苗 後二到三週。然而，爲提供完整保護對抗疾病，兩劑量疫 田具有需弟一次處理動物之顯著缺點。 因此本發明目的係提供有效疫苗對抗豬肺炎黴漿菌，即 以單一劑量疫苗之投與而引起保護性免疫力並預防由此生 物造成之疾病。 本發明另一目的係提供疫苗組成物適用於豬隻對抗豬肺 炎黴漿菌感染及其造成之疾病，並可與其他細菌疫苗及/ 或類毒素組合使用。 本發明另一目的係提供方法用於疾病之預防或改善’其 中致因生物爲豬肺炎黴漿菌，該方法經由利用佐劑配方增 強細菌疫苗的免疫原性，以至於單一劑量疫苗投與後引起 保護性免疫力。 1308872 五、發明說明（3) 本發明其他目的及特性從本文下列之詳細說明可顯而易 見。 發明槪沭 本發明係關於疫苗組成物用於免疫動物對抗豬肺炎黴漿 菌的感染，其包括免疫量之去活性豬肺炎黴漿菌細菌疫苗 ’含有聚丙烯酸聚合物及可代謝油與聚氧乙烯-聚氧丙烯 嵌段共聚物之混合物之佐劑混合物，以及醫藥可接受載劑 ;疫苗組成物於單一劑量投與後引發對豬肺炎黴漿菌之保 護性免疫力。 本發明另一部分提供免疫原性組成物用於免疫動物對抗 豬肺炎黴漿菌的感染，其包括去活性豬肺炎黴漿菌細菌疫 苗組合上述佐劑混合物及醫藥可接受穩定劑，載劑或稀釋 劑。該疫苗組成物之佐劑以終濃度約1-25%(ν/ν)存在，以 及較佳爲約5 - 1 2 % ( v / v )。該組成物亦可包括其他疫苗成分 ，包括去活性細菌疫苗物或已純化類毒素，一或多種致病 原，例如副藉嗜血菌（仏3 ϋ 7· ·?)，出血性 巴氏桿菌，豬鏈球菌 (Streptococcum s u i s) 胸膜肺炎放線桿菌 (Actinobacfiius p〗europneu/non』’ae)，支氣管牆毒博德 氏菌，豬霍亂沙門氏桿菌 {Salmonella 以及鉤端螺旋體屬 (leptospira)，且可經由肌肉內、皮下、口服、氣溶膠或 鼻內路徑投與。 1308872 五、發明說明（4) 本發明另一部分提供方法用於保護動物對抗豬肺炎黴漿 菌引起之疾病，其係經由單一劑量投與含有去活性豬肺炎 黴漿菌細菌疫苗與佐劑混合物之上述疫苗。 發明之詳細說明 全部專利，專利申請案，以及文中引證之其他文獻皆於 此完整倂入參考。萬一出現矛盾不一致時，以本文揭示爲 優先。 文中使用“細菌疫苗”是指經去活性之細菌採集物並組 合一些佐劑，當投與動物時可引起保護性免疫力對抗疾病 或感染。 “佐劑”意指組成物含有一或多種物質在疫苗組成物中 可增強豬肺炎黴漿菌細菌疫苗的免疫原性及效力。 本說明書及申請專利範圍使用“ MHDCE” 一詞意指豬肺 炎黴漿菌DNA細胞相當物。 “免疫量”是指細菌疫苗相對於豬肺炎黴漿菌可提供免 疫力。“免疫量”將視動物種類，品種，年齡，大小，健 康狀況以及先前是否已給過疫苗對抗相同生物而定。 本發明提供一種疫苗適用於單一劑量免疫作用，以對抗 豬肺炎黴漿菌。本發明疫苗包括佐劑混合物可增強細菌疫 苗的免疫原性，如此提供單一投與以引起保護性免疫力。 疫苗可經由技藝之標準方法製備自新鮮採集之培養（例 如參照美國專利號5,338,543或美國專利號5, 56 5，205 及以下實施例2)。亦即該生物可在培養基中繁殖，例如 1308872 五、發明說明（5 ) PPLO(胸膜肺炎類似生物）完全培養基[Difco. Laboratories]。該生物之生長以標準技術監測，例如測 定顏色變化單位（CCU )，以及達足夠高力價（t 1 t e r)時採集 。在包含於疫苗配方之前，庫存可進一步濃縮或以慣用方 法冷凍乾燥。其他方法例如敘述於Thoma s，e t a 1 ., Agri-Practice，Vol. 7 No. 5，pp.26 - 30 亦可使用。 本發明之疫苗包括去活性豬肺炎黴漿菌細菌疫苗組合與 佐劑混合物’以及一或多種醫藥可接受載劑。適合載劑包 括生理食鹽水，憐酸鹽緩衝液生理食鹽水，最小必需培養 基（MEM)或含有HEPES緩衝液之MEM。 用於本發明疫苗組成物之佐劑混合物增強免疫反應，其 含有聚丙烯酸聚合物及可代謝油，例如不飽和萜烯烴，以 鯊烷（2,3 , 10，15，19,23-六甲基二十四烷）或鯊烯爲佳，與 聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物之混合物。此等聚丙烯酸 聚合物以Carbopol爲商標名稱銷售，例如敘述於美國專 利號2，909，462以及3，790,665，此等揭示於此倂入本文 參考。聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物爲液體界面活性劑 ，輔助固體或液體組成物懸浮，例如p 1 U r un 1 c ®共聚物。 本發明疫苗組成物之刺激免疫原性佐劑混合物以v / v約 1 %至2 5%之量存在’較佳約2%至1 5%，更佳約5%至1 2%。 佐劑混合物之使用量及佐劑混合物之兩成分比例視其他細 菌疫苗或已純化類毒素之添加變化。 此佐劑混合物中，可代謝油及聚丙烯酸聚合物可以範圍 1308872 五、發明說明（6 ) 分別約10至150 ml/L以及0.5至10 m丨/L之量存在。佐 劑混合物之$父佳實施例中’可代謝油及聚氧乙烯—聚氧丙 烯嵌段共聚物成分之混合物是鯊烷及p 1 u r u n i c⑧L 1 2丨之混 合物’以約50至1〇〇 mi/L之量存在，羧亞甲基共聚物爲 Ca r bopo 1 934P以約2 m 1 /L之量存在。典型的佐劑混合物 含有約1:25至1:50比例之聚丙烯酸聚合物對可代謝油/ 聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物混合物。 較佳的聚丙烯酸聚合物爲B. F Goodrich以Carbopol 934P NF及941 NF出售者，其爲丙烯酸交聯聚烯丙基蔗糖 之共聚物’具有化學式（CH2CH000H)n。這些共聚物形成水 溶性膠，適合與水溶性載劑配方。較佳之聚氧乙烯-聚氧 丙烯嵌段共聚物爲非離子性界面活性劑，由BASF以 Plurunic®L121，L61，L81 或 L101 出售。 本發明疫苗可經由肌肉內，皮下，鼻內，腹膜內或口服 途徑，較佳爲肌肉內或皮下路徑。 用於單劑量投與之疫苗需含有相當於約lxl〇8至3U011 MHDCE/mL之一定量之豬肺炎黴漿菌細菌疫苗’較佳爲約 1 X 1 09至3x 1 09 MHDCE/mL。每一動物可經由肌肉內’皮下 或腹膜內以約1至5 mL投與’較佳爲2 mL。口服或鼻內 以1至10 mL投與，較佳爲2至5 mL ° 下列實施例意圖更進一步舉例說明本發明而非限制其範 圍。 1308872 五、發明說明（7) 實施例1 豬肺炎黴漿菌細菌疫苗 疫苗細成物之製備 病盡廬存之說明:豬肺炎黴漿菌可獲自任數個易於取得 之來源。在一較佳實施例中，可使用豬肺炎黴漿菌菌株P -5722-3。此細菌培養獲自普渡大學（west Lafayette, Indiana)C. Armstrong。依據豬肺炎黴發菌之培養處方， 於豬肺炎黴漿菌培養液中傳代七次建立主種（Mas ter Seed) ο 細朐培養=豬肺炎黴漿菌生長於含有Bacto PPL0粉末 ，酵母菌萃取物，葡萄糖，L-半胱胺酸鹽酸鹽，安比西林 (ampi C i 1 1 i η)，乙酸鉈，酚紅，抗泡劑，一般無菌豬血淸 及水之培養基爲期約18-144小時。爲了去活性，直接添 加二元次乙基亞胺（ΒΕΙ)至發酵器內之細胞培養。調整pH 至7 . 4，然後根據慣用程序採集以提供豬肺炎黴漿菌細菌 疫苗。 疫苗組成物之製備 組成物之保存及使用比例=經由添加分別不紹渦0.01% 及0 . 07%之硫柳汞及乙二胺四乙酸，四鈉鹽（EDTA )來保存 採集之細菌疫苗。安比西林U.S.P.以0.250克/升於生長 培養基中。殘留之安比西林於終產物中之濃度依採集液體 體積而異，然而殘留安比西林於全部產物中之濃度不超過 30 ug/mL ° 1308872 五、發明說明（8) 產物標準化:黴漿菌濃縮物經由DNA螢光測定分析定量 〇 製備含有一或多種萜烯烴之代謝油與聚氧乙烯-聚氧丙 烯嵌段共聚物（例如鯊烷/ P 1 u I· un i c L 1 2 1之混合物）之混合 物，經由溶解1 0 g氯化鈉，0.2 5 g氯化鉀，2 . 7 2二鹼價 磷酸鈉，0.25單鹼價磷酸鉀，20mL之 Plurunic L121(BASF 公司），40 mL 鯊烷（Kodak)，3.2 mL 之 Tween 80於900 mL純水，終至1 〇〇〇 mL。混合後可高壓消毒成 分。然後均質化混合物直至形成穩定乳狀液。可添加福馬 林多至0 · 2%終濃度或添加硫柳汞至1 : 1 0,000終濃度。 單位裝配製造一系列：另人滿意的豬肺炎黴漿菌濃度爲 無菌地組合與佐劑，防腐劑，以及稀釋劑於裝置有攪拌器 之無菌容器中，並混合不超過3 0分鐘。 對於 1,000,000 劑量之量（每 2 mL) : % vol/vol 黴漿菌濃縮物 400,000 mL 20.0 Ol.OxlO10 MHDCE/raL ) 鯊烷/Plurumc L121混合物 100,000 mL 5.0 Carbopol(2%) 200,000 mL 10.0 硫柳汞溶液1%及EDTA 7% 18,000 mL 0.9 無菌生理食鹽水 1,282,000 mL 64.1 一系列之pH調整至7.0 ± 0.2 MHDCE =豬肺炎黴漿菌DNA細胞相當物 -10- 1308872 五、發明說明（9) 之方法與技術:產物可透過無菌200 -5 0 0微米濾紙元件全部過濾，並於9 CFR 1 1 4.6記載之條 件下在用於塡充操作設計之場所塡充至無菌終容器中。以 橡膠塞子關閉玻璃或塑膠容器，並以鋁封臘封裝。每2 mL 劑量將含有少於2x 1 09豬肺炎黴漿菌DNA細胞相當物。 效力劃1_ :巨量或終容器樣品之完整產物能如下進行效 力測試： 效力測試之分析方法··使用丨Cr雌鼠六至七週齡，同一 批貨來自Harlan Sprague Daw ley或其他可接受之供應者 。未知及參考細菌疫苗各最少需20隻老鼠用於免疫化作 用。最少需5隻老鼠維持作爲未接種疫苗之對照組。測試 及參考細菌疫苗個別充分混合。經由5 / 8英吋針塡充2 5 口徑無菌拋棄式注射筒，用於腹股溝區經由皮下以宿主動 物劑量之1 / 1 01 h ( 2 mL )對老鼠接種疫苗。每組老鼠以個別 單位圈養，並自由取食及飮水14天。然後麻醉每一老鼠 。已麻醉老鼠仰臥。使用一隻手壓住頭部並從身體遠離申 展一前腿。使用解剖刀在遠離申展之前腿與胸腔之間切割 皮膚約1 / 2英吋長，切斷臂動脈。使用3 · 0 raL無針注射 筒收取切割時聚積的血液。血液換入已標示試管內使其凝 塊。以1 , 000 X g離心凝塊之試管以從凝塊分開血淸。個 別之血淸貯存在-20°C或冷凍器內直到測試。 血淸學測試=使用ELISA程序測量老鼠對參考及/或未 知細菌疫苗之抗體反應。ELI SA程序之進行是使用來自 -11- 1308872 五、發明說明（1〇)

Dynatech之拋棄式Immulon II平底微力價平板或相當物 ，以及ELISA平板讀儀。 測試試劑： 磷酸鹽緩衝之生理食鹽水-Twen(PBST)(以5N NaOH或5N HC1 調整 pH 至 7 · 2 至 7 . 4)。 每升之量 甘胺酸緩衝之生理食鹽水（GBS)(以5N NaOH或5N HC1 jg 整 pH 至 9.5 至 9_7)。_ 成分 每升之量 _ 甘胺酸 0.75 grams _ NaCl 8.50 grams _去離子水（適量） 1,000.00 ml 成分 it NaCl 8.50 grams 一 NaH2P04 0.22 grams Na2HP04 1.19 grams Tween - 20 0.50ml 去離子水（適量） 1 ,000.00 ml 正對照組血淸：正對照組血淸是從接種豬肺炎黴漿菌細 菌疫苗之老鼠血淸的匯集。 共軛物及受質： 親和力純化之抗老鼠I gG過氧化酶標識共軛物是獲自 -12- 1308872 五、發明說明（) Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.(目錄號碼 0 7 4 - 1 8 0 2 )。測定共軛物最適宜稀釋之程序詳述如下。過 氧化酶受質溶液（ABTS)是獲自Kirkegaard and Peri, y Inc 共輥物之滴定：Immulon II平底平板每井塗覆loo ui 之每ral含有20 ug稀釋於10 mM GBS之豬肺炎黴漿菌全 細胞抗原。平板在3 7 °C + 2 °C至少培育1小時，並轉移至 2-7 °C至少18小時但不超過一星期。使用平板前，以pbst 淸洗二次，每次淸洗之間給予一·分鐘浸泡時間，並輕敲至 乾燥。製備1 : 40稀釋於PBST之正對照組血淸，該稀釋之 正對照組血淸添加至平板的一半井（100 uL/井）。PBST添 加至另一半井。平板在室溫培育1小時，之後淸洗平板三 次。共軛之血淸經PBST兩倍連續稀釋，以1 : 1 〇〇開始稀 釋以及最終爲1 : 1 0,240稀釋。100 ul之每一共軛物稀釋 液添加到4井正血淸及4井PBST，並在室溫反應半小時。 淸洗平板四次，每井添加1 00 u 1過氧化酶受質溶液（ab t s ) 。平板在Τ λ =450之雙波長設定讀取。共軛物之稀釋是挑 選當正對照組血淸値減去PBST對照組之正對照組血淸讀 取爲0.850至1.050者。 測試抗原 : 豬肺炎黴漿菌抗原爲全細胞製備物，且由Fort Dodge 動物保健提供。 ELISA進行如下：使用Dynatech Immulon II平底微力 價平板。一瓶冷凍乾燥之豬肺炎黴漿菌全細胞抗原經1 〇m 1 -13- 1308872 五、發明說明（12) 甘胺酸緩衝之生理食鹽水（GBS )再組成。再組成之黴漿菌 蛋白質濃度爲20 ug/mL。然後添加100 ul(2 ug)經稀釋 抗原到平板之全部井內。平板在37°C ±2 t至少培育1小時 ’然後轉移至2 - 7 °C最少1 8小時但最多一星期。以PBST 淸洗三次，每次淸洗之間給予一分鐘浸泡時間，並輕敲乾 燥。血淸以1 : 40稀釋於PBST中。每一平板將含有四份正 對照組血淸。每井樣品體積爲1 00 u 1。一系列測試血淸樣 品及參考血淸樣品將在同一平板上測試兩份。平板在室溫 培育1小時，並以PBST淸洗三次。稀釋於PBST之100 ul 抗老鼠IgG過氧化酶標識共轭物（Kirkegaard and Perry) 添加到全部井中，且井在室溫培育30分鐘。以PBST淸洗 四次。添加1 0〇 u 1過氧化酶受質溶液（ABTS )到全部井中 ’且培育正血淸對照組直至達 0.850至 1.050之 〇D4Q5 ( 4 5 0 )(當機械以對比於PBST對照組井爲空白）。讀取 平板且以對比於PBST井爲空白。爲求測試之正確，培育 與參考細菌疫苗之老鼠血淸必須產生0 . 5 0 0之最小平均値 ，以及未接種疫苗之對照組老鼠血淸必須不超過〇 . 1 〇〇之 最大平均値。亦或，接種參考細菌疫苗之老鼠血淸與未接 種疫苗之對照組老鼠血淸間之平均値差異必須大於或等於 0.400° —系列疫苗接種，參考疫苗接種，及對照組之平均値的 計算與評估如下：爲考濾滿意度，必須證明測試細菌疫苗 之平均之平均光密度値相等或大於參考。亦或使用〇ne_ -14- 1308872 五、發明說明（13) Tai led Student’s T-測試，測試細菌疫苗必須有意義（p $ 〇 · 05信賴程度）低於參考細菌疫苗。任何計算之T-値相 等或大於1 . 686，代表參考與測試細菌疫苗之間具有意義 之差異’並導至測試細菌疫苗被淘汰。任何計算之T -値少 於i · 686，代表令人滿意之系列。任何經此測試測定之測 試細菌疫苗有任何無關產物效力之因素令人不滿意者，則 再測試且初次測試視爲無效。 實施例2 測試疫苗： 測試用疫苗是根據詳述於實施例1之程序製備，其係使 用含有一或多種萜烯烴之代謝油與聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌 段共聚物（例如鯊烷/ P 1 u r un 1 c L 1 2 1之混合物）之混合物 5%，與0.2%聚丙烯酸聚合物（Carbopol)爲佐劑，以及每劑 量2xlOg豬肺炎黴漿菌DNA細胞相當物（MHDCE)。 實施例3 設計本硏究是爲證明經由實施例2之疫苗在三週齡豬單 一劑量疫苗接種，可引發四個月的免疫力期（D0I )。 以兩分開的動物試驗進行本硏究。在接種疫苗時，全部 兩組豬隻皆爲負血淸（抗體力價<1 0 )，代表動物對豬肺炎 黴漿菌爲易感染的。對照組中全部豬隻在挑戰（challenge) 之前仍爲負血淸。此表示已接種疫苗豬隻之免疫反應是因 爲疫苗而非其它任何環境暴露。 在第一試驗中，實施例 2之疫苗與 Boehringer -15- 1308872 五、發明說明（14) I n g e 1 h e i m ( BI )製造之 I n g e 1 v a c M . h y ο ® 市售可獲產品一 起評估，挑戰以高程度毒性之豬肺炎黴漿菌（1 . 4X 1 Q6生物） 。22隻18-21天齡豬隻肌肉內（IM)接種實施例2之疫苗， 以及 8 隻接種 Ingelvac M. hyo®[序號 271 032]。22 隻 豬作爲挑戰對照組，以及1 0隻豬作爲未挑戰對照組。接 種疫苗組及挑戰對照組豬隻在接種疫苗後四個月挑戰以毒 性豬肺炎黴漿菌。接種實施例2疫苗之豬隻具有1 5 . 9%的 平均肺病變，挑戰對照組豬隻具有1 9 . 6%的平均肺病變。 接種實施例2疫苗之接種疫苗組的平均肺病變少於對照組 ，即使豬隻已挑戰以高於愛阿華州立大學（I SU)建議之劑 量，但此差異無意義（P = 〇.19)。同樣地，當市售產品 Ingelvac M. hyo®於挑戰以相同劑量之同組動物中評估時 ，也觀察到類似程度的肺病變（1 4 . 6% )。接種I ng e 1 v a c Μ . h y o ®組與對照組之間（p = 0 . 2 7 )，以及接種I n g e 1 v a c Μ . hyo®組與接種實施例2疫苗組之間也無有意義之差異。 在第二試驗中，實施例2之疫苗評估是經由在接種疫苗 後四個月，挑戰以ISU建議程度之毒性豬肺炎黴漿菌 (1.0x1 06生物）。23隻21天齡豬隻接種一劑量之疫苗，25 隻豬作爲挑戰對照組，以及7隻豬作爲未挑.戰對照組。接 種疫苗組及挑戰對照組豬隻在接種疫苗後四個月挑戰以毒 1生豬肺炎黴漿菌。對照組具有1 〇 . 4%的平均肺病變，以及 接種疫苗組具有5 . 5%的平均肺病變。接種疫苗組與對照組 之間之差異有意義（P = 〇 · 〇 3 1 )。此表示實施例2之疫苗有 -16- 1308872 五、 發明說明 ( 1 ί 0 效 於 刺激保 護 性 免 疫力，即在三週齡豬隻單一劑量疫 苗接 種 後 至少維 持 四 個 月。 當 合倂並 分 析 兩 試驗中實施例2之疫苗之相關數據 時， 接 種 疫苗組 的 平 均肺病變有意義低於對照組。 結 論爲在 二 週 齡 豬隻單一劑量疫苗接種後四個月， 實施 例 2 之疫苗 誘 發 保 護性免疫力對抗毒性豬肺炎黴漿菌 〇 M. 驗 數據 本硏究進 行 兩 分 開試驗。在試驗一中，使用M i c r 〇 soft Ex c e 1隨機 作 用 程 式將67隻豬分配到4組。24隻1 8-21 天 齡 豬隻肌 肉 內 (I Μ )接種單一劑量根據實施例2製備 之疫 田 0 24隻豬作爲挑戰對照組，以及10隻豬作爲未挑 戰對 昭 y i \ \ 組 0 9隻 豬 隻 肌 肉內接種市售產品Ingelvac M. hyo®[ 序 號 271 032 ，Bo shringer Ingelheim(BI)製造]，如 標示 指 示 。5隻 豬 因 無 /\ \\ 關疫苗接種之原因死於疫苗接種保 持期 間 〇 接種疫 田 組 及 挑戰對照組之剩餘豬隻在接種疫苗 後四 個 月 挑戰以 1 4 mL 毒性豬肺炎黴漿菌（1 . 4x 1 06生物） 。挑 戰 後 30天 將 全 部四組豬安樂死，並計分試驗中每 隻豬 的 肺 病變。 在 第二試 驗 中 25隻21天齡豬隻肌肉內接種單一 劑量 根 據 實施例 2 製 備 之疫苗。25隻豬作爲挑戰對照組， 以及 10 隻豬作爲未挑戰對照組。疫苗接種保持期間，2隻 豬死 於 te / > \N 關疫苗 接 種 之 原因，1隻豬遭誤賣。接種疫苗組 及挑 戰 對 照組之 剩 餘 猶 隻在接種疫苗後四個月挑戰以1 〇 mL毒 -17- 1308872 五、發明說明（16) 性豬肺炎黴漿菌（1 . 0 X 1 06生物）。挑戰後觀察期間，2隻豬 死於無關疫苗接種/挑戰之原因。挑戰後30天，將全部三 組剩餘豬隻安樂死，並計分試驗中每隻豬的肺病變。 接種疫苗： 接種疫苗組中每一豬隻，在頸側經由肌肉內給與2 mL 劑量之測試疫苗。 挑戰及屍體検驗： 毒性豬肺炎黴漿菌挑戰庫存，是從愛阿華州立大學（I SU) 由Dr. Eileen Thacker製備之冷凍（-70t )肺藏均質物。 挑戰庫存經確認其純度且每mL含約1 07豬肺炎黴漿菌。建 議挑戰劑量爲10 mL之丨：100經稀釋庫存（亦即ι.ΟχίΟ6生 物）。 第一組試驗中接種疫苗組及挑戰對照組之豬隻挑戰以1 4 mL之1 : 100經稀釋庫存（亦即1 . 4xl06生物）。建議第二組 試驗中豬隻挑戰以10 mL之1 : 100經稀釋庫存（亦即

CM 1 . 0 X 1 06 生物）。 在挑戰日，均質物在溫水之下快速融解並依據I SU之建 議使用無菌豬肺炎黴漿菌生長培養基稀釋。以Xylazine_ Ketamine-TelazolTM 之混合物（由 50mg/mL Xylazine ， 50mg/mL Ketamine 及 100mg/mL Telazol 組成）使豬隻鎭靜 。此麻醉性混合物之給予爲1Μ於0.0 1 - 0.02 mL/ ] b .體重 。每隻豬氣管內給予單一 14 mL(第一試驗）或10 mL劑量（ 第二試驗）之挑戰物質。爲確定針之位置正確，投與挑戰 -18- 1308872 五、發明說明（17) 劑量之前將空氣引入針筒。未接種疫苗之未挑戰對照組豬 隻保持於分開之空間內且不被挑戰。 挑戰後30天（DPC)，將全部豬隻安樂死。移除肺臟並由 不知測試組別之個人計分整體之肺病變。 樣品收集及測試： 在接種疫苗日（0 DPV )，接種疫苗後一個月（1 MPV)， 4 MPV/0 DPV，以及30 DPC，從全部豬隻收集血液樣品作 爲競爭性EL I S A套組（DAKO Co .製造）偵測對抗豬肺炎黴漿 菌之血淸抗體之用。血液樣品測試之前貯存在-。 數據分析: 肺病變計分是以變異性之分析（AN0VA)比較接種疫苗組 與未接種疫苗組二者。肺計分經a r c s i n e轉換以改善誤差 之分布。 結果與討論 血淸學：經由市售競爭性ELISA套組，使用1:10血淸 稀釋於全部測試，對兩組試驗之全部豬隻測試對抗豬肺炎 黴漿菌之血淸抗體。在接種疫苗時，全部豬隻皆爲負血淸 (抗體力價<10)，代表動物對豬肺炎黴漿菌爲易感染的。 對照組中全部豬隻在挑戰之前仍爲負血淸。此表示已接種 疫苗豬隻之免疫反應是因爲疫苗而非其它任何環境暴露。 接種疫苗組中全部豬隻及挑戰對照組中大部分豬隻（22隻 中1 8隻於試驗一，以及25隻中1 5隻於試驗二），在挑戰 後血淸轉換對抗豬肺炎黴漿菌’然而未經挑戰之動物仍爲 -1 9- 1308872 五、發明說明（18) 負血淸。如此意指挑戰爲豬肺炎黴漿菌專一性。測試動物 之血淸學狀況綜合整理於表1。 第一試驗之免痔原件測試： 進行第一試驗測定實施例2之疫苗若可刺激強烈的免疫 力，其於接種疫苗後四個月能否保護對抗高於SUI建議程 度之挑戰。此試驗也比較實施例2之疫苗與市售產品 Ingelvac M. hyo®在接種疫苗四個月後剌激保護性免疫力 之能力。 25隻豬接種FDAH Suvaxyn MH-One以及8隻豬接種已許 可產品Ingelvac M. hyo®序號271,032，每隻豬挑戰以 1 . 4x1 06生物之挑戰物質（SUI建議每隻豬1 . 0x1 06生物， 參照5 · 5節）。22隻豬作爲挑戰對照組，以及1 0隻豬作爲 未挑戰對照組。肺病變百分比綜合整理於表2。接種實施 例2疫苗之豬隻具有15. 9%的平均肺病變，挑戰對照組豬 隻具有19. 6%的平均肺病變。接種實施例2疫苗之接種疫 苗組的肺病變少於對照組，即使豬隻已挑戰以較高劑量之 豬肺炎黴漿菌。然而此差異無意義（p = 0.19)。同樣地，當 巾售產品Ingelvac M. hyo®於挑戰以相同劑量之同組動 物中評估時，也觀察到類似程度的肺病變（1 4 . 6%)。接種 Ingelvac M. hyo®組與對照組之間（p = 0.27)，以及接種 Ingelvac M. hyo®組與接種實施例2疫苗組之間並無有意 義之差異（p = 0.88)。 雖然接受實施例2疫苗組之肺病變記錄無有意義之減少 -20- 1308872 五、發明說明（19) ，此試驗所獲數據指出本試驗所用之較高挑戰劑量 (1 . 4 X 1 〇6生物），甚至對於市售I n g e I V a c產品刺激之豬隻 免疫力也許是壓倒性無法抵擋的。雖然較大之組群大小可 能證明有意義，然而此挑戰程度也許不適用於20 - 25組群 大小動物之接種疫苗/挑戰硏究評估。 第_二_試驗之免痔原件測試： 評估試驗二中接種疫苗組與挑戰對照組之豬隻，接種疫 苗後四個月以如SUI建議之挑戰劑量（l.OxlO6生物）來證 明四個月的D0I。肺病變百分比綜合整理於表3。對照組 具有10.4%的平均肺病變。接種疫苗組具有5. 5%的平均肺 病變。接種疫苗組與對照組間之差異有意義（p = 0 . 03 1 )。 此表示實施例2之疫苗有效於刺激保護性免疫力，即在三 週齡豬隻單一劑量疫苗接種後至少維持四個月。 兩試驗結果合倂之評估: 雖然兩試驗有意義不同，但在組群之試驗功效無意義。 兩試驗間之組群功效大小類似。如此，可評估組群功效而 無需顧及試驗。由於全部模式之分析顯示組群與試驗間之 交互作用沒有意義，故支持兩試驗之組群功效相同之看法 ’並證明從兩試驗之數據合倂爲單一分析。正因如此，當 兩試驗有關實施例2疫苗之數據合倂，且以組群與試驗爲 獨立的變數（減少模式）分析肺病變可獲之arcsine轉換時 ’組群具有統計意義（p = 〇 . 〇 1 3 )。 -21 - 1308872 五、發明說明（2〇) 表1 :對照組及接種疫苗豬隻對豬肺炎黴漿菌之血淸學狀 況之整理槪述 試驗一 正/負（1 : 1 0 )於 組群 豬隻數量 0 DPV -1DPC 30DPC FDAH疫苗 22 0/22 0/22 22/22 BI疫苗 8 0/8 4/8 8/8 挑戰對照組 22 0/22 0/22 18/22 未挑戰對照組 10 0/10 0/10 0/10 試驗二 正/負（1 : 1 0 )於 組群 豬隻數量 0 DPV -3DPC 30DPC FDAH疫苗 23 0/23 6/23 23/23 挑戰對照組 25 0/25 0/25 14/25 未挑戰對照組 7 0/7 0/7 0/7 -22- 1308872 五、發明說明（2〇 表2 :試驗一中肺病變百分比之整理槪述（超過劑量）* 組群 豬隻數量 肺病變平均百分比 P値 FDAH疫苗 22 15.9% 0.19** BI疫苗 8 14.6% 0.27*** 挑戰對照組 22 19.6% 未挑戰對照組 10 0% 0.88**** *每隻豬挑戰以1·4χ106生物（SUI建議劑量爲每隻豬 1 . 0x1 06 生物） * * FDAH疫苗組與對照組間之比較 *** ΒΙ疫苗組與對照組間之比較 * * * * ΒI疫苗組與FDAH疫苗組間之比較 表3 :試驗二中肺病變百分比之整理槪沭（建議劑量） 組群 豬隻數量 肺病變平均百分比 P値 FDAH疫苗 23 5.50% 0.031** 挑戰對照組 25 10.40% 未挑戰對照組 7 0.77% *豬隻挑戰以SUI建議劑量（每隻豬i.owo6生物） * * FDAH疫苗組與對照組間之比較 實施例4 單一劑量_投.皇古個_』|_^經由本發明疫苗組成物誘發長期免 疫力對抗毒性挑戰之i平1 -23- 1308872

五、發明說明（22) 使用本質相同於實施例1及2所述程序及運用以下所示 量製備測試疫苗A。 測試疫苗A 對於 1，000,000 劑量之量（每 2 mL) : % vol/vol 黴漿菌濃縮物 (>1.0x10丨0 MHDCE/mL ) 1200,000 mL 60.0 鯊烷/Plurunic L121混合物 200,000 mL 10.0 Carbopol(2%) 200,000 mL 10.0 硫柳汞溶液1%及EDTA 7% 18,000 mL 0.9 無菌生理食鹽水 382,000 mL 19.1 系列之pH調整至7 . 0 ± 0 . 2 MHDCE =豬肺炎黴漿菌DNA細胞相當物 總結槪述 此評估記錄33隻21天齡豬隻。20隻豬在三週齡時肌肉 內（IM)接種單一劑量疫苗A。10隻豬作爲未接種疫苗對照 組，以及3隻豬作爲未挑戰環境對照組。 在接種疫苗時，全部豬隻皆爲負血淸（抗體力價< 1 〇 )， 代表動物對豬肺炎黴漿菌爲易感染的。對照組中全部豬隻 在挑戰之前仍爲負血淸。此表示已接種疫苗豬隻之免疫反 應是因爲疫苗而非其它任何環境暴露。 接種疫苗六個月後，20隻接種疫苗豬隻及10隻未接種 疫苗對照組豬隻挑戰以毒性豬肺炎黴漿菌（每隻豬丨〇 . x 1 〇6 生物）。接種疫苗之豬隻具有3. 6%的平均肺病變計分，挑 -24- 1308872 五、發明說明（23) 戰對照組豬隻具有1 4 · 6%的平均肺病變計分。接種疫苗組 之肺病變有意義少於對照組（p = 〇 . 02 1 5 )。 此評估所獲數據證明測試疫苗A在單一劑接種疫苗六個 月後含有長期保護性免疫力對抗豬肺炎黴漿菌。 實驗設計： 使用M i c r 〇 s 〇 f t Ex c e 1隨機作用程式將一窩3 3隻2 1天 齢豬隻分配到3組（接種疫苗組，挑戰對照組，以及未挑 戰環境對照組）。20隻豬在三週齡時肌肉內接種單一劑量 測試疫苗A。1 0隻豬作爲挑戰對照組，以及3隻豬作爲未 環境對照組。接種疫苗組及挑戰對照組之豬隻在接種疫苗 後六個月每豬隻挑戰以1 〇 mL毒性豬肺炎黴漿菌培養物 (1 . Ox 1 06生物）。3隻未接種疫苗之豬隻使用作爲未挑戰對 照組。經挑戰豬隻及未挑戰對照組在挑戰後26天將其安 樂死，並計分每隻豬的肺病變。 接種疫苗組中每一豬隻’在頸側經由肌肉內給與2 mL 劑量之測試疫苗。 桃戰及屍體檢驗 毒性豬肺炎黴漿菌挑戰庫存，是從愛阿華州立大學（ISU) 由Dr. Eileen Thacker製備之冷凍（_7〇C)肺藏均質物。 挑戰庫存經確認其純度且每mL含約1 〇7豬肺炎黴漿菌。 豬隻挑戰以1 〇 mL之I : 1 〇〇經稀釋庫存（亦即約1 . 〇X 1 〇6 生物）。 在挑戰日，均質物在溫水之下快速融解並依據1 su之建 -25- 1308872 五、發明說明（24) 議使用無菌豬肺炎黴漿菌生長培養基稀釋。以Xylazine_ Ketamine-TelazolTM 之混合物（由 50mg/mL Xylazine ， 50mg/mL Ketamine 及 100mg/mL Telazol 組成）使豬隻鎭靜 。此麻醉性混合物之給予爲丨Μ於0 . 0 1 - 0 · 02 mL/ 1 b .體重 。每隻豬氣管內給予單一 10 raL劑量之挑戰物質（l.〇xi〇6 生物）。爲確定針之位置正確，投與挑戰劑量之前將空氣 引入針筒。未接種疫苗之未挑戰對照組豬隻保持於分開之 空間內且不被挑戰。 挑戰後26天（DPC )，將全部豬隻安樂死。移除肺臟並如 實施例3所述計分整體之肺病變。 樣品收集及測試 · 在接種疫苗日（0 DPV)，35 DPV，- 1 DPC，以及26 DPC 從全部豬隻收集血液樣品作爲競爭性EL I S A套組（DAKO Co . 製造）偵測對抗豬肺炎黴漿菌之血淸抗體之用。血液樣品 測試之前貯存在S - 20°C。 數據分析= 肺病變計分是以單方AN0VA比較接種疫苗組與對照組。 肺計分經arcsine轉換以改善誤差之分布。由於肺病變計 分之標準性假定受到質疑，肺病變計分及a r c s i n e轉換之 肺病變計分二者皆經WiICQXOn Rank Sum測試分析。有 意義程度設在p<0.05。使用無參數的Wilcoxon Rank Sum 測試結果作爲報告。 結果與討論 -26- 1308872 五、發明說明（25) 血淸學 經由市售競爭性EL I S A套組，使用1 : 1 〇血淸稀釋於全 部測試，對全部豬隻測試對抗豬肺炎黴漿菌之血淸抗體。 經套組指示而具有可疑測試結果之樣品視爲正於數據之分 析處理。在接種疫苗時，全部豬隻皆爲負血淸（抗體力價 < 10 )，代表動物對豬肺炎黴漿菌爲易感染的。對照組中全 部豬隻在挑戰之前仍爲負血淸。接種疫苗後，20隻接種疫 苗豬中1 5隻（I 5 / 20 )至少一次對豬肺炎黴漿菌變爲正血淸 (樣品收集於3 5 DPV及-1 DPC)。此代表接種疫苗豬隻中 的免疫反應是因爲疫苗而非其它任何環境暴露。接種疫苗 組中全部豬隻及挑戰對照組1 0隻豬中有4隻，在挑戰後 對豬肺炎黴漿菌變爲正血淸，然而未經挑戰之動物仍爲負 血淸。測試動物之血淸學狀況綜合整理於表4。 肺病變計分 接種測試疫苗A之20隻豬以及未接種疫苗對照組之1 0 隻豬，在接種疫苗六個月後挑戰以毒性豬肺炎黴漿菌 (1 . Ox 1 06生物）。3隻豬作爲未挑戰對照組。挑戰之後，20 隻接種疫苗豬隻中有8隻（40%)無肺病變之進展，然而10 隻對照組中只有1隻（1 0% )無肺病變之進展。肺病變百分 比綜合整理於表5。接種疫苗之豬隻具有3.6%的平均肺病 變計分，挑戰對照組豬隻具有1 4 . 6%的平均肺病變計分。 接種疫苗組之肺病變有意義少於對照組（p = 0.021 5 )。 -27- 1308872 五、發明說明（26) 表4 :本硏究豬隻對黴漿菌之血淸學狀況* _______ 正之數量（1:10W全部 組群 處理 mMMM- 0 DPV1 35 DPV -1 DPC*** 26 DPC 1 疫苗/挑戰 20 0/20 9/20 12/20 20/20 2 對照組/挑戰 10 0/10 0/10 0/10 4/10 3 對照組/無挑戰 3 0/3 0/3 0/3 0/3 *使用市售套組經由ELI SA測試血淸樣品對豬肺炎黴漿 菌之血淸抗體。全部樣品以1 : 1 0血淸稀釋進行測試 。結果依照套組指示解釋。在1 : 1 0可疑的測試樣品 視爲正。 ** DPV =接種疫苗後之天數 DPC =挑戰後之天數 表5 :挑戰..以.暖趾炎-徽漿菌及無桃戰對昭細豬隻之肺病戀 計分（％)之整珲槪沭 組群 處理 豬隻數景 肺病變計分 標準偏差 平均低於 平均高於 P値1 95%CL2 95%CL 1 疫苗/挑戰 20 3.6 7.6 0.07 7.19 0.0215 2 對照組/挑戰 10 14.6 20.0 0.33 28.94 3 對照組/無挑戰 3 1.8 1.8 -2.67 6.27 • 28- 1 * 2 P値是來自第1及2組之比較 2 CL =信賴程度 1308872 五、發明說明（27) 從表4及5所示數據可發現測試疫苗A在三週齡豬隻單 一劑量疫苗接種後六個月可誘發保護性免疫力對抗毒性豬 肺炎黴漿菌之挑戰。 -29-

Claims (1)

1. I308S72 •、申請專利範圍 第 90 1 3 1 03 9 號「改良之豬肺炎黴漿菌UFCYVDU 細菌疫苗」專利案 (2 0 0 9年1月修正） 六申請專利範圍 1. 一種用於免疫動物對抗豬肺炎黴漿菌 之疫苗組成物，其包括 免疫量1X108至3X1011 MHDCE/mL之豬肺炎黴漿菌細 菌疫苗， 含有聚丙烯酸聚合物及可代謝油與聚氧乙烯-聚氧丙烯 嵌段共聚物之混合物之佐劑混合物，以及 醫藥可接受載劑； 其中該疫苗組成物於單一劑量投與後引發對豬肺炎黴 漿菌之保護性免疫力。 2. 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，其中佐劑混合物 由聚丙烯酸聚合物及含有一或多種萜烯烴之可代謝油與 聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物之混合物，以約1:25至 1 : 50比例之聚丙烯酸聚合物對可代謝油/聚氧乙烯-聚氧 丙烯嵌段共聚物混合物構成。 3. 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，其中佐劑混合物 含有約1-25% v/v之疫苗組成物。 4. 如申請專利範圍第3項之疫苗組成物，其中聚丙烯酸聚 合物以約1 % v / v之終濃度存在，以及萜烯烴/聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物之混合物以約5%至10% v/v之終濃 1308872 、申請專利範圍 度存在。 5. 如申請專利範圍第3項之疫苗組成物，其中佐劑混合物 含有約2%-15% v/v之疫苗組成物。 6. 如申請專利範圍第5項之疫苗組成物’其中佐劑混合物 含有約5% - 1 2% v / v之疫苗組成物。 7. 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，其中可代謝油爲 鯊烷或鯊烯。 8. 如申請專利範圍第6項或第7項之疫苗組成物，其中聚 丙烯酸聚合物爲卡波普（Carbopol )。 9. 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，進一步含有至少 —種細菌疫苗選自副豬嗜血菌（A / s) ，出血性巴氏桿菌51 few re//a則"·/〇(：/心），緒鏈球 菌⑽ ，胸膜肺炎放線桿菌 Wewopw⑽仰hi?)，支氣管膿毒博德 氏菌々ro/JcA/sepi/ca) ’豬霍亂沙門氏桿菌 (iSW/wore/h 以及鉤端螺旋體屬細菌 (leptospira)。 10. 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，其中該細菌疫苗 之免疫量爲 lxlO9 至 3xl09 MHDCE/mL。 11. 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，其中該疫苗組成 物可經由肌肉內，皮下，腹膜內，氣溶膠，口服或鼻內 投與至動物。