BRPI0116249B1 - composição de vacina para imunização de um animal contra infecção por mycoplasma hyopneumoniae e vacina - Google Patents

Abstract

"vacina de bacterina de mycoplasma hyopneumoniae aperfeiçoada". a invenção provê uma composição de vacina de bacterina de mycoplasma hyopneumoniae aperfeiçoada, que vantajosamente provê imunidade contra infecção depois de uma única administração. a composição compreende uma bacterina de mycoplasma hyopneumoniae inativada e uma mistura auxiliar, que, em combinação, provê imunidade contra infecção de mycoplasma hyopneumoniae depois de única administração, e elicia uma resposta imune específica para bacterina de mycoplasma hyopneumoniae e incluindo imunidade mediada por célula e imunidade local (iga secretória). em uma concretização preferida, a mistura auxiliar comprende um polímero de ácido acrílico, mais de preferência carbopol, e uma mistura de óleo metabolizável tais como um ou mais hidrocarbonetos de terpeno, de preferência esqualeno ou esqualano, e copolímero por blocos de polioxietileno-polipropileno tal como pluronic<32>. a composição de vacina pode opcionalmente incluir um conservante, de preferência timerosol e/ou edta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO DE VACINA PARA IMUNIZAÇÃO DE UM ANIMAL CONTRA INFECÇÃO POR MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE E VACINA”.

Campo da Invenção [001] Este pedido reivindica prioridade do pedido provisório co-pendente n2 de série 60/256.637, depositado em 19 de dezembro de 2000, cuja descrição total é aqui incorporada por referência.

[002] Esta invenção pertence a métodos aperfeiçoados para a indução de imunidade protetora contra Mycoplasma hyopneumoniae, especificamente empregando uma bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae em uma quantidade eficaz para imunizar um animal receptor contra infecção por Mycoplasma hyopneumoniae em uma dose única.

Fundamentos da Invenção [003] Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico de pneumonia micoplasmática. Esta doença é uma causa importante de perda econômica na indústria de suíno devido ao ganho reduzido de peso e eficácia de alimentação pobre. Esta doença causa uma tosse crônica, revestimento amorfo do cabelo (“dull hair coat"}, crescimento retardado e aparência de incapacidade para o desenvolvimento durando várias semanas. Lesões características de áreas de consolidação de cor púrpura a cinza, partícularmente nos lobos cardíacos e api-cais ventrais são observados em animais infectados. Embora a doença cause pouca mortalidade, suínos infectados são frequentemente propensos a infecções secundárias por patógenos oportunísticos, resultando em morte ou stress. Apenas perdas econômicas foram estimadas em entre 200 a 250 milhões de dólares anualmente.

[004] Mycoplasma hyopneumoniae é uma bactéria fastidiosa que carece de uma parede celular. É frequentemente difícil isolá-la do trato respiratório devido a Mycoplasma hyporthinis, um agente secundário comum também localizado no trato respiratório. A doença é espalhada por aerossol, produzido pela tosse, e por contato direto de um suíno veículo afetado ou convalescente. A mistura de animais infectados e de animais não-infectados resulta em reinfecção precoce ou frequente. A infecção frequentemente se inicia com infecção de leitões por porcas portadoras no parto. Devido a técnicas de gerenciamento de rebanho, a infecção pode não tornar-se evidente até mais tarde na vida. A infecção adicional usualmente é observada depois do desmame quando porcos são reunidos. Doença manifesta é normalmente observada em porcos com seis semanas de idade ou mais velhos. Taxas de desenvolvidas e taxas de conversão de alimento são marcadamente reduzidas em animais afetados. Tratamentos usando-se antibióticos são caros e exigem uso prolongado. Reinfecção é também um problema. Vacinas são presentemente o método mais eficaz para evitar infecções e suas consequências.

[005] Fort Dodge Animal Health (FDAH) pôs no mercado bacteri-na de Mycoplasma hyopneumoniae sob a marca registrada Suvaxyn® Respifen® MH para o uso como uma vacina para proteger suíno sádio contra sinais clínicos causados por Mycoplasma hyopneumoniae. A vacina contém Carbopol como um auxiliar e é recomendada como uma vacina de duas doses para porcos pelo menos com uma semana de idade, com a segunda dose de duas a três semanas depois da primeira vacinação. No entanto, uma vacina de duas doses tem a desvantagem óbvia de exigir uma segunda manipulação dos animais a fim de prover total proteção contra a doença.

[006] É portanto um objetivo desta invenção prover uma vacina eficaz contra Mycoplasma hyopneumoniae que elicia imunidade protetora e previne doença causada por este organismo com uma administração de uma dose única de vacina.

[007] É um outro objetivo da invenção prover uma composição de vacina adequada para o uso em suíno contra infecção e doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae, e que pode ser usada em combinação com outras bacterinas e/ou toxóides.

[008] É ainda um outro objetivo da presente invenção prover um método para a prevenção ou melhoramento da doença em que o organismo causador seja Mycoplasma hyopneumoniae por utilização de uma formulação auxiliar, que aumente a imunogenicidade da bacterina de modo a eliciar imunidade protetora depois de uma dose única da vacina, [009] Outros objetivos e características desta invenção se tornarão evidentes a partir da descrição detalhada indicada aqui mais abaixo, Sumário da Invenção [0010] A presente invenção refere-se a uma composição de vacina para a imunização de um animal contra infecção por Mycoplasma hyopneumoniae compreendendo uma quantidade imunizante de uma bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae ativada; uma mistura auxiliar compreendendo um polímero de ácido acrílico e uma mistura de um óleo metabolizável e um copolimero em blocos de polioxietileno-polioxipropileno; e um veículo farmacêutica mente aceitável, composição de vacina essa que, depois de uma única administração, elicia imunidade protetora contra Mycoplasma hyopneumoniae.

[0011] Em um outro aspecto, a presente invenção provê uma composição imunogênica para a imunização de um animal contra infecção por Mycoplasma hyopneumoniae, compreendendo uma bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae inatívada combinada com a mistura auxiliar acima e um diluente, veículo ou estabilizador farmaceuti-camente aceitável. O auxiliar está usualmente presente nesta composição de vacina em uma concentração final de cerca de 1-25% (v/v), e de preferência cerca de 5-12% (v/v). A composição pode também incluir outros componentes de vacina, incluindo bacterinas inativadas ou toxóides purificados, de um ou mais patógenos, tais como Haemonphi-lus parasuís, Pasteurella multiocida, Streptococcum suis, Actinobaci-llus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholera-esuis e Leptospira e pode ser administrada por rotas intramuscular, subcutânea, oral, aerossol ou intranasal, [0012] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção provê um método para a proteção de um animal contra doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae por administração de uma dose única da vacina exposta acima compreendendo bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae inativada e a mistura auxiliar.

Descrição Detalhada da Invenção [0013] Todas as patentes, pedidos de patente e outra literatura citados aqui são aqui incorporados por referência em sua totalidade. No caso de inconsistências, a presente descrição prevalecerá.

[0014] Como usado aqui, uma "bacterina" é uma colheita de bactérias que foi inativada e que, em combinação com certos auxiliares, pode eliciar imunidade protetora para proteger contra doença ou infecção quando administrada a animais.

[0015] “Auxiliares" significa uma composição constituída de uma ou mais substâncias que aumentam a imunogenicidade e a eficácia de bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae em uma composição de vacina.

[0016] Como usado no relatório e nas reivindicações, o termo MHDCE designa equivalentes de célula de DNA de Mycoplasma hyopneumoniae, [0017] A “quantidade imunizante” é a quantidade de bacterina que proverá imunidade vis à vis Mycoplasma hyopneumoniae. A "quantidade imunizante" dependerá da espécie, da raça, da idade, do tama- nho, do estado de saúde e de se o animal recebeu anteriormente uma vacina contra o mesmo organismo.

[0018] A presente invenção provê uma vacina contra Mycoplasma pneumoniae que é adequada para imunização de dose única. A vacina da presente invenção inclui uma mistura auxiliar que aumenta a imu-nogenicidade da bacterina e assim provê uma única administração para eliciar imunidade protetora.

[0019] A vacina pode ser preparada a partir de culturas frescamente colhidas por métodos que são padrão na técnica (ver, por exemplo, a patente U.S. ne 5.338.543 ou a patente U.S. nQ 5.565.205, bem como o exemplo 2 abaixo). Isto é, o organismo pode ser propagado em um meio de cultura tal como meio completo de PPLO (organismo de tipo Pleuropneumonia) [Difco]. Laboratories]. O crescimento do organismo é monitorado por técnicas padrão tais como determinação de unidades de mudança de cor (CCU), e é colhido quando um título suficientemente alto for alcançado. Os estoques podem ser ulteriormente concentrados ou liofilizados por métodos convencionais antes da inclusão na vacina para formulação. Outros métodos, tais como aqueles descritos em Thomas e outros, Agri-Practice, vol. 7 nQ 5, págs. 26-30, podem ser empregados.

[0020] A vacina da presente invenção compreende bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae inativada combinada com a mistura auxiliar e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Veículos adequados para o uso incluem meios aquosos, por exemplo, solução salina, solução salina tamponada por fosfato, meios essenciais mínimos (MEM) ou MEM com tampão de HEPES.

[0021] A mistura auxiliar para o uso nas composições de vacina da presente invenção aumenta a resposta imune e compreende uma mistura de um polímero de ácido acrílico com uma mistura de óleo meta-bolizável, por exemplo, um hidrocarboneto de terpeno insaturado ou um seu produto de hidrogenação, de preferência esqualano (2,3,10,15,19,23-hexametiltetracosano) ou esqualano, e um copolíme-ro em blocos de polioxietileno-polioxipropileno. Tal polímero de ácido acrílico pode der um homopolímero ou um copolímero. O polímero de ácido acrílico é de preferência um carbômero. Carbômeros estão comercialmente disponíveis sob a marca registrada Carbopol. Polímeros de ácido acrílico são descritos, por exemplo, nas patentes U.S. nos. 2.909.462 e 3.790.665 cujas descrições são incorporadas aqui por referência. Os copolímeros por blocos de polioxietileno-polioxipropileno são tensoativos, de preferência tensoativos líquidos, que auxiliam na suspensão de componentes sólidos e líquidos. Os tensoativos estão comercialmente disponíveis como polímeros sob a marca registrada Pluronic®. O tensoativo preferido é poloxâmero 401 que está comercialmente disponível sob a marca registrada Pluronic® L121.

[0022] A mistura de auxiliar de estimulação imunogênica está tipicamente presente na composição de vacina da invenção em quantidades de v/v de cerca de 1% a 25%, de preferência cerca de 2 a 15%, mais de preferência cerca de 5% a 12% de v/v. A quantidade de uso de mistura auxiliar e a razão dos dois componentes do auxiliar podem variar dependendo da adição de outras bacterinas ou toxóides purificados. A mistura auxiliar em geral compreende um óleo metabolizável, um polímero de ácido acrílico e um copolímero em blocos de polioxieti-leno-polioxipropileno formulado como uma emulsão em um meio aquoso.

[0023] Nesta mistura auxiliar, o óleo metabolizável e o polímero de ácido acrílico podem estar presentes em quantidades que variam de cerca de 10 a 150 ml/l e cerca de 0,5 a 10 g/l, respectivamente. Em uma concretização preferida da mistura auxiliar, a mistura do óleo metabolizável e do componente de copolímero em blocos de polioxietile-no-polioxipropileno é uma mistura de esqualano e Pluronic® L121 (po- loxâmero 401) que pode estar presente em uma quantidade de cerca de 50 a 100 ml/l e o polímero de carboximetileno é Carbopol 934P (Carbâmero 934P) pode estar presente em uma quantidade de cerca de 2 ml/l. Tipicamente, a mistura auxiliar contém cerca de uma razão de 1:25 a 1:50 de mistura de polímero de ácido acrílico para óleo me-tabolizável/copolímero em blocos de polioxietileno-polipropileno.

[0024] Polímeros de ácido acrílico preferidos são aqueles postos no mercado pela B. F Goodrich como Carbopol 934 P NF e 941 NF que são polímeros de ácido acrílico reticulados com polialilsacarose e que têm a fórmula química (CH2CHOOOH)n. Estes polímeros formam géis aquosos que adequadamente formulam com veículos aquosos. Copolímeros por blocos de polioxietileno-polipropileno preferidos são tensoativos não-iônicos postos no mercado pela BASF como Pluro-nic® L121, L61, L81 ou L101.

[0025] A vacina da presente invenção pode ser administrada por rotas intramuscular, subcutânea, intranasal, intraperitoneal ou oral, de preferência por rotas intramuscular ou subcutânea.

[0026] A vacina da invenção em geral compreende o Mycoplasma hyopneumoniae inativado, um óleo metabolizável, um copolímero em blocos de polioxietileno-polipropileno e um polímero de ácido acrílico na forma de um óleo em emulsão aquosa. A vacina de preferência contém o polímero de ácido acrílico em uma concentração dentro da faixa de 0,5 a 10 g/l. A vacina de preferência contém o óleo metabolizável em uma concentração dentro da faixa de 2 a 6 ml/l. A vacina de preferência contém o copolímero em blocos de polioxietileno-propileno em uma concentração dentro da faixa de 1 a 3 ml/l.

[0027] Para administração de dose única, a vacina deve de preferência conter uma quantidade de bacterina de Mycoplasma pneuno-moniae que corresponde a cerca de 1x108 a 3x1011 MHDCE/ml, de preferência cerca de 1x109 a 3x109 MHDCE/ml. Cerca de um a cinco ml, de preferência 2 ml, podem ser administrados por animal, intra-muscularmente, subcutaneamente ou intraperitoneamente. Um a dez ml, de preferência de 2 a 5 ml, podem ser administrados oralmente ou intranasalmente.

[0028] Pretende-se que os seguintes exemplos ilustrem a invenção sem limitar seu escopo.

Exemplo 1 Preparação de Bacterina de Mycopiasma hyopneumoniae da Composição de Vacina [0029] Descrição de Estoques Virais. Mycopiasma hyopneumoniae pode ser obtido a partir de qualquer número de fontes prontamente disponíveis. Em uma concretização, Cepa de Mycopiasma hyopneumoniae P-5722-3 pode ser usada. A cultura foi obtida a partir de C. Arms-trong, Purdue University, West Lafayette, Indiana. Após o recebimento da cultura de Mycopiasma hyopneumoniae, ela foi passada em caldo de Mycopiasma hyopneumoniae várias vezes para estabelecer a Semente Principal.

[0030] Cultura de Célula. Mycopiasma hyopneumoniae foi desenvolvido em um meio compreendendo Pó de Bacto PPLO, extrato de levedura, glicose, cloridrato de L-cisteína, ampicilina, acetato de tálio, fenol vermelho, anti-espuma, soro de suíno estéril normal e água durante períodos que variam de 18-144 horas. Para inativação, etilenoi-mina binária (BEI) é adicionado dirigido para a cultura de produção dentro do recipiente de fermentação. O pH é ajustado para 7,4, e então é colhido de acordo com os procedimentos convencionais para prover bacterina de Mycopiasma hyopneumoniae.

Preparação da Composição de Vacina [0031] Composição de Conservantes e Proporções Usadas. A bacterina colhida é preservada pela adição de timerosal e ácido etileno diamineto tetra-acético, sal de tetra-sódio (EDTA) em não mais do que 0,01% e 0,07%, respectivamente, Ampicilina U.S.P. está presente no meio de crescimento a 0,250 gramas/litro. A concentração da ampicilina residual variará no produto final dependendo do volume de fluidos de colheita, com a concentração de ampicilina residual no produto completado não exceder de 30 ug/mL

Padronização do Produto. O concentrado de Mycoplasma é quantificado por um Ensaio Fluorométrico de DNA.

[0032] Uma mistura de um óleo metabolizável que compreende um ou mais hidrocarbonetos de terpeno e um copolímero em blocos de polioxietileno-polipropileno, por exemplo, uma mistura de Esquala-no/Pluronic L121, é preparada por dissolução de 10 g de cloreto de sódio, 0,25 g de cloreto de potássio, 2,72 g de dibásico de fosfato de sódio, 0,25 de monobásico de fosfato de potássio, 20 ml de Pluronic LI21 (BASF Corporation), 40 mi de Esqualano (Kodak), 3,2 ml de Tween 80 em 900 ml de água purificada, q.s. até 1000 ml. Depois da misturação, os ingredientes podem ser tratados em autoclave. A mistura é então homogeneizada até que uma emulsão estável seja formada. Formalina pode ser adicionada até uma concentração final de 0,2% ou timerosal pode ser adicionado para uma concentração final de 1:10.000.

[0033] Conjunto de Unidades para Produzir uma série. Concentrados de Mycoplasma hyopneumoniae satisfatórios são assepticamente combinados com os auxiliares, o conservante e o diluente em um recipiente estéril equipado com um agitador e são misturados por não menos do que 30 minutos.

Quantidades para 1.000.000 doses (2 ml cada): % de vol/vol [0034] Ο ρΗ da série é ajustado para 7,0±0,2. MHDCE = equivalentes de célula de DNA de Mycoptasma hyopneu-moniae [0035] Método e Técnica de Enchimento e Seiamento de Recipientes Finais: O produto pode ser grosseira mente filtrado através de um elemento de filtragem de 200-500 micra estéril e introduzido sob condições especificadas em 9 CFR 114,6 em recipientes finais esterilizados em uma câmara designada para operações de enchimento. Os recipientes de vidro ou de plástico são fechados com uma tampa de borracha e são selados por selagem por dobramento com lacre de alumínio. Cada dose de 2,0 ml conterá não menos do que 2 x 109 equivalentes de célula de DNA de Mycoplasma hyopneumoniae, [0036] Testaqem quanto a Potência. Amostras do produto completado de recipiente final ou a granel podem ser testadas quanto a potência como se segue: [0037] Método de Ensaio para Testaqem de Potência: Camundon-gos fêmeas de ICR, de seis a sete semanas de idade, de uma consignação, da Harlan Sprague Dawley ou outros fornecedores aceitáveis, são usados. Um mínimo de 20 camundongos são necessários para imunização com cada bacterina de Referência ou Desconhecida. Um mínimo de cinco camundongos são retidos como controles não-incubados. Bacterinas de teste e de referência são individualmente misturadas totalmente. Seringas descartáveis, estéreis, providas com agulhas de calibre de 25 de 1,58 cm (5/8 de polegadas) , são usadas para inocular os camundongos subcutaneamente na região inguinal com 1/10 de uma dose de animal hospedeiro (0,2 ml). Cada grupo de camundongos é alojado como uma unidade individual e é permitido acesso livre a alimento e água por 14 dias. Cada camundongo é então anestesiado. O camundongo anestesiado é colocado sobre suas costas. Usando-se uma mão, a cabeça é mantida para baixo e uma perna da frente e estendida longe do corpo. Usando-se um bisturi, uma incisão de pele é feita cerca de 1,27 cm (1/2 polegada) de comprimento entre a perna da frente estendida e o tórax, separando-se a artéria braquial. Usando-se uma seringa de 3,0 mi, sem agulha, o sangue é acumulado na incisão, é coletado, O sangue descarregado para dentro de um tubo de teste marcado e é deixado coagular-se. Os tubos coagulados são centrifugados a 1.000 x g para separar o soro do coágulo. Soros individuais são armazenados a -20 ou mais frio até serem testados, [0038] Testaoem Sorológica: Um procedimento ELISA é usado para medir a resposta de anticorpo de camundongos às bacterinas de Referência e/ou Desconhecida. O procedimento ELISA é conduzido usando-se Placas de Microtftulo de Fundo Chato Immulon II descartáveis da Dynatech ou equivalente e uma Leitora de Placa de ELISA. Reaqentes de Teste: [0039] Solução salina tamponada por fosfato-Tween (PBST) (pH ajustado para 7,2 a 7,4 com NaOH a 5 N ou HCI a 5 N).

Quantidade por litro Solução salina tamponada por glícína (GBS) (pH ajustado para 9,5 a 9,7 com NaOH a 5 N ou HCI a 5 N).

[0040] Soro de Controle Positivo: O Soro de Controle Positivo é uma combinação de soros de camundongos vacinados com bacterina de Mycopiasma hyopneumoniae.

Conjugado e Substrato: [0041] Conjugado marcado com peroxidase de IgG de anti-rato purificado por afinidade é isolado a partir de Kirkegaard e Perry Laboratories, Inc. (catálogo n2 074-1802), O procedimento para a determinação da ótima diluição de conjugado é detalhado abaixo. As soluções de substratos de peroxidase (ABTS) são obtidas a partir de Kirkegaard e Perry Laboratories, Inc.

[0042] Titulação de Conjugado: Uma Placa de fundo chato Immu-lon II é revestida com 100 ul por cavidade de 20 ug por ml de antígeno de célula inteira de Mycopiasma hyopneumoniae diluído em GBS a 10 mM. A placa é incubada por não mais do que uma hora a 3712+213 e é transferida para 2-7G por não menos do que 18 horas e não mais do que uma semana. Antes do uso a placa é lavada três vezes com PBST, com um tempo de encharcamento de um minuto entre cada lavagem, e é levemente batida para secar. Uma diluição de 1:40 em PBST do Soro de Controle Positivo é preparado, e o Soro Positivo Diluído (100 ul/cavidade) é adicionado a metade das cavidades na placa. PBST é adicionada à outra metade das cavidades. A placa é incubada por uma hora a temperatura ambiente, depois do que a placa é lavada três vezes. O soro conjugado é diluído em série com PBST duas vezes, partindo com uma diluição de 1:100 e finalizando com uma diluição de 1:10,240. 100 ul de cada diluição de conjugado são adicionados a qua- tro cavidades do Soro Positivo e quatro cavidades da PBST, e são deixados reagir por uma hora a temperatura ambiente. As placas são lavadas quatro vezes, e 100 ui da Solução de Substrato de Peroxidase (absts) são adicionados por cavidade. A placa é lida em um ajuste de comprimento de onda duplo T λ = 450. Uma diluição de Conjugado é escolhida que dá uma leitura de 0,850 a 1,050 para o Soro de Controle Positivo quando o valor do Controle de PBST é subtraído do valor do Soro de Controle Positivo.

Antíqeno de Teste: [0043] Antígeno de Mycoplasma hyopneumoniae é uma preparação de célula inteira, e é fornecido pela Fort Dodge Animal Health.

[0044] O ELISA é realizado como se segue: Placas de Microtítulo de Fundo Chato Immulon II da Dinatech são usadas. Um frasco de Antígeno de Célula Inteira de Mycoplasma hyopneumoniae liofilizado é reconstituído para dar dez ml com Solução Salina Tamponada por Gli-cina (GBS). A concentração da Proteína de Mycoplasma reconstituída é de 20 pg/ml. 100 μΙ (2 pg) de antígeno diluído são então adicionados a todas as cavidades de uma placa. A placa é incubada a 37ÍC±2ÍC por não menos do que uma hora e então é transferida para 2-7C: por um mínimo de 18 horas e um máximo de uma semana. As placas são lavadas três vezes com PBST, encharcando um minuto entre cada lavagem, e são então levemente batidas para secar. Soros diluídos 1:40 em PBST. O Soro de Controle Positivo será incluído em quadruplicata sobre cada placa. Volume de amostra por cavidade é de 100 μI. Amostras de Soro de Referência e Amostras de Soro Total em Série serão testadas em duplicada na mesma placa. As placas são incubadas por uma hora a temperatura ambiente, e são lavadas três vezes com PBST. 100 μΙ de Conjugado Marcado por Peroxidase de IgG de Anti-rato (Kirkegaard e Perry), diluídos em PBST são adicionados a todas as cavidades, e as cavidades são incubadas por 30 minutos a tempe- ratura ambiente. As placas são lavadas quatro vezes com PBST. 100 μΙ de Solução de Substrato de Peroxidase (ABTS) são adicionados a todas as cavidades, e as placas são incubadas até que o Controle de Soro Positivo alcance um OD405 (450) de 0,850 a 1,050, quando a máquina é reiniciada para as Cavidades de Controle PBST. As placas são lidas, e são testadas em branco contra as Cavidades de PBST. Para um teste ser válido, os soros de camundongos inoculados com Bacte-rina de Referência deve produzir um valor médio mínimo de 0,500, e os soros de camundongos de controle não vacinados não devem exceder o valor médio máximo de 0,100. Ou, a diferença entre o valor médio dos soros de camundongos inoculados com a Bacterina de Referência e os soros dos camundongos de controle não vacinados devem ser maior do que ou igual a 0,400.

[0045] Os Valores Médios para as Vacinados em Série, os Vacinados de Referência, e os Controles, são calculados e são avaliados como se segue: Para serem considerados satisfatórios, a Bacterina de Teste deve demonstrar um Valor Médio de Densidade Ótica igual a, ou mais do que, a Referência. Ou, usando-se um Teste T de Student talhado para um, a Bacterina de Teste não deve ser significativamente (p<0,05 Nível de Confidência) mais baixa do que a Bacterina de Referência. Qualquer Valor T calculado igual a, ou maior do que, 1,686 indicará uma diferença significativa entre a Bacterina de Teste e de Referência, e levará a Bacterina de Teste a ser rejeitada. Qualquer Valor T calculado menor do que 1,686 indicará uma série satisfatória. Qualquer bacterina de teste determinada pelo Teste como sendo insatisfatória por qualquer razão não relacionada com eficácia de produto é re-testada, e o teste inicial é considerado como inválido.

Exemplo 2 Vacina de Teste: [0046] A vacina para testagem foi preparada de acordo com os procedimentos detalhados no Exemplo 1 usando-se 5% de uma mistura de um óleo metabolizável que compreende um ou mais hidrocarbo-netos de terpeno e um copolímero em blocos de polioxietileno-polipropileno (mistura de Esqualano/Pluronic L121) e 0,2% de polímero de ácido acrílico (Carbopol) como auxiliar, e 2x109 equivalentes de célula de DNA de Mycoplasma hyopneumoniae (MHDCE) por dose. Exemplo 3 [0047] Este estudo foi projetado para demonstrar uma duração de quatro meses de imunidade (DOI) em porcos induzidos por vacinação de uma dose da vacina do Exemplo 2 em uma idade de três semanas.

[0048] Duas experiências de animal separadas foram realizadas para este estudo. Todos os porcos em ambas as experiências eram soro-negativos (título de anticorpo <10) na hora da vacinação, indicando os animais eram suscetíveis a Mycoplasma hyopneumoniae. Todos os porcos no grupo de controle permaneceram soro-negativos antes do desafio. Isto indica que a resposta imune nos porcos vacinados era devido à vacina e não a qualquer exposição ambiental.

[0049] Na primeira experiência, uma vacina do Exemplo 2 foi avaliada juntamente com um produto comercialmente disponível, Ingelvac M. hyo® fabricado pela Boehringer Ingelheim (BI), por um alto nível de desafio de Mycoplasma hyopneumoniae virulento (.4 x 106 organismos). Vinte e dois (22) porcos na idade de 18-21 dias foram vacinados com a vacina do exemplo 2 intramuscularmente (IM) e oito (8) porcos com o Igelvac M. hyo® (série 271 032]. Vinte e dois (22) porcos serviram como controles de desafio e 10 porcos como controles de não desafio. Os porcos nos grupos de controle de desafio e vacinados foram desafiados com Mycoplasma hyopneumoniae virulento quatro meses depois da vacinação. Os porcos vacinados com a vacina do exemplo 2 tinham lesões médias de pulmão de 15,9% e os porcos de controle desafiados tinham lesões médias de pulmão de 19,6%. As lesões mé- dias de pulmão no grupo vacinado com a vacina do exemplo 2 eram menos do que os controles apesar dos porcos terem sido desafiados com uma dose mais alta do que aquela recomendada pela lowa State University (ISU), no entanto, a diferença não era significativa (p=0,19). Do mesmo modo, quando o produto comercial, Ingelvac M. hyo® foi avaliado no mesmo grupo de animais com a mesma dose de desafio, um nível similar de lesões de pulmão também foi observado (14,6%). Não houve também nenhuma diferença significativa entre o grupo vacinado com Igelvac M. hyo® e o grupo de controle (p=0,27) e entre o grupo vacinado com Igelvac M. hyo® e o grupo vacinado com a vacina do exemplo 2.

[0050] Na segunda experiência, uma vacina do exemplo 2 foi avaliada por desafio de Mycoplasma hyopneumoniae virulento no nível sugerido por ISU (1,0 x 106 organismos) quatro meses depois da vacinação. Vinte e três (23) porcos foram vacinados com uma dose da vacina na idade de 21 dias, 25 porcos serviram como controles de desafio e 7 porcos como controles de não desafio. Os porcos nos grupos de controle de desafio e vacinados foram desafiados com Mycoplasma hyopneumoniae virulento quatro meses depois da vacinação. O grupo de controle tinha lesões médias de pulmão de 10,4% e o grupo vacinado tinha lesões médias de pulmão de 5,5%. Houve uma diferença significativa entre o grupo vacinado e o grupo de controle (p=0,031). Isto indica que a vacina do exemplo 2 é eficaz na estimulação de imunidade protetora, que pode durar pelo menos quatro meses depois de uma vacinação de dose única em porcos na idade de três semanas.

[0051] Quando os dados relacionados com a vacina do exemplo 2 nas duas experiências foram combinados e foram analisados, as lesões médias de pulmão do grupo vacinado foram significativamente menores do que aquela do grupo de controle.

[0052] Finalmente, a vacina do exemplo 2 induz imunidade prote- tora contra o desafio de Mycoplasma hyopneumoniae virulento quatro meses depois de vacinação de dose única em porcos na idade de três semanas.

Dados Experimentais [0053] Duas experiências separadas foram conduzidas neste estudo. N experiência um, sessenta e sete (67) porcos foram distribuídos em quatro grupos usando-se o programa de aleatorização Microsoft Excel. Vinte e quatro (24) porcos foram vacinados com uma dose de uma vacina preparada de acordo com o exemplo 2 intramuscularmen-te (IM) na idade de 18-21 dias. Vinte e quatro (24) porcos serviam como controles de desafio e 10 porcos como controles de não desafio. Nove porcos foram vacinados IM com o produto comercial, Ingelvac M. hyo® série 271 032, fabricado pela Boehringer Ingelheim (BI)], por instrução de rótulo. Cinco porcos (dois porcos vacinados com a vacina do exemplo 2, um com a vacina BI e dois controle) morreram durante o período de realização de vacinação devido a razões não relacionadas com a vacinação. Os porcos restantes nos grupos vacinados e no grupo de controle de desafio foram desafiados com 14 ml de Mycoplasma hyopneumoniae virulento (1,4 x 106 organismos) quatro meses depois da vacinação. Os porcos em todos os grupos foram submetidos a eutanásia 30 dias depois do desafio e lesões de pulmão foram classificadas para cada porco na experiência.

[0054] Em uma segunda experiência, vinte e cinco (25) porcos foram vacinados IM com uma dose de uma vacina preparada de acordo com o exemplo 2 na idade de 21 dias. Vinte e cinco (25) porcos serviram como controles de desafio e 10 porcos como controles de não desafio. Dois porcos morreram devido a razões não relacionadas com a vacinação e um porco foi por engano vendido durante o período de realização de vacinação. Os porcos restantes nos grupos de controle de desafio e vacinados foram desafiados com 10 ml de Mycoplasma hyopneumoniae virulento (1,0 x 106 organismos} quatro meses depois da vacinação. Dois porcos morreram durante o período de observação de pós-desafio devido a razões não relacionadas com a vacina-ção/desafio. Os porcos restantes em todos os três grupos foram submetidos a eutanásia 30 dias depois do desafio e lesões de pulmão foram classificadas para cada porco na experiência.

Vacinação;

[0055] Cada porco nos grupos de vacinação recebeu uma dose de 2 ml das vacinas de teste IM na lateral do pescoço.

Desafio e Necrópsia [0056] O estoque de desafio de Mycopfasma hyopneumoniae virulento, um homogenato de pulmão congelado (-70^) fo i preparado pelo Dr. Eileen Thacker da lowa State University (ISÜ). O estoque de desafio foi confirmado ser puro e continha cerca de 107 organismos de Mycopfasma hyopneumoniae por ml. A dose de desafio recomendada é de 10 ml de um estoque de diluição de 1:100 (isto é, 1,0x106 organismos).

[0057] Os porcos nos grupos de controle de desafio e vacinados na primeira experiência foram desafiados com 14 ml de estoque diluído de 1:100 (isto é, 1,4 x 106 organismos). Os porcos na segunda experiência foram desafiados com 10 ml de estoque diluído de 1:100 (isto é, 1,0 x 106 organismos) como recomendado.

[0058] No dia do desafio, o homogenato foi descongelado rapidamente sob água quente e foi diluído de acordo com as recomendações por ISU usando-se meio de crescimento de Mycopfasma hyopneumoniae estéril. Porcos foram sedados com uma mistura de Xilazina-Cetamína-Telazol® que consiste em 50 mg/ml de Xilazina, 50 mg/ml de Cetamina e 100 mg/ml de Telazol. Uma mistura anestésica foi dada IM a 0,01-0,02 ml/lb em peso de corpo. Cada porco recebeu uma dose única de 14 ml (primeira experiência) ou 10 ml (segunda experiência) do material de desafio, intratraquealmente. Para assegurar que a colocação de agulha estava correta, ar foi puxado para dentro da seringa antes da administração da dose de desafio. Os porcos de controle não desafiados não vacinados foram mantidos em salas separadas e não desafiados.

[0059] 30 Dias pós desafio (DPC), todos os porcos foram submetidos a eutanásia. Pulmões foram removidos e as lesões de pulmões grossas foram classificadas por um indivíduo com nenhum conhecimento dos grupos de teste.

Testaqem e Coleção de Amostra: [0060] Amostras de sangue foram coletadas a partir de todos os porcos no dia da vacinação (0 DPV), em um mês pós-vacinação (1 MPV), 4 MPV/0 DPC, e 30 DPC para anticorpos de soro contra Myco-pfasma hyopneumoniae como detectadas por um kit ELISA competitivo (produzidos por DAKO Co.). As amostras de soro foram armazenadas a -2013 antes de serem testadas.

Análise de Dados [0061] Classificações de lesão de pulmão foram comparadas entre grupos vacinados e não vacinados por análise de variãncia (ANOVA). Classificações de pulmão foram transformadas em arco-seno para aperfeiçoar a distribuição dos residuais.

Resultados e Discussão [0062] Sorologia: Todos os porcos em ambas as experiências foram testados quanto a anticorpos de soro contra Mycoplasma hyopneumoniae por um kit ELISA competitivo comercial, usando-se uma diluição de soro de 1:10 para toda a testagem. Todos os porcos foram soro-negativos (titulo de anticorpo <10) na hora de vacinação, indicando que os animais eram suscetíveis a Mycoplasma hyopneumoniae. Todos os porcos nos grupos de controle permaneceram soro-negativos antes do desafio. Isto indica que a resposta imune nos por- cos vacinados foi devido à vacina e não a qualquer exposição ambiental. Todos os porcos nos grupos vacinados e a maioria dos porcos nos grupos de controle de desafio (18 de cada 22 porcos na experiência um e 15 de cada 25 na experiência dois) soro-convertidos em Myco-pfasma hyopneumoniae depois do desafio enquanto todos os animais não desafiados permaneceram soro-negativos. Isto implica que o desafio foi específico de Mycoplasma hyopneumoniae. O estado soroló-gico dos animais de teste é sumarizado na tabela 1.

Testaqem de Imunoqenicidade na Primeira Experiência [0063] A primeira experiência foi conduzida para determinar se a vacina do exemplo 2 podia estimular forte imunidade que podería proteger contra um nível mais alto de desafio do que aquela recomendada por ISU quatro meses depois da vacinação. Esta experiência também comparou uma vacina do exemplo 2 com o Ingeivac M. hyo® comercialmente disponível, por sua capacidade de estimular imunidade quatro meses depois da vacinação.

[0064] Vinte e dois porcos vacinados com FDAH Suvaxyn MH-One e oitos porcos com um produto licenciado, Ingeivac M. hyo® série 271.032, foram desafiados com 1,4 x 106 organismos por porco do material de desafio (1,0 x 1Q6 organismos por porco foi recomendado por ISU, ver seção 5.5). Vinte e dois porcos serviram como controles de desafio e 10 porcos como controles de não desafio. As percentagens de lesões de pulmão são sumarizadas na tabela 2. Os porcos vacinados com a vacina do exemplo 2, tinham lesões médias de pulmão de 15,9% e os porcos de controle desafiados tinham lesões médias de pulmão de 19,6%. As lesões de pulmão no grupo vacinado com a vacina do exemplo 2 foram menos do que o controle mesmo quando os porcos foram desafiados com uma dose mais alta de Mycopiasma hyopneumoniae, No entanto, a diferença não era significativa (p=0,19). Do mesmo modo, quando um produto diponível comerialmente, In- gelvac M. hyo® foi avaliado no mesmo grupo de animais com a mesma dose de desafio, um nível similar de lesões de pulmão foi também obtido (14,6%). Não houve nenhuma diferença significativa entre o grupo vacinado com Ingelvac M. hyo® e o grupo de controle (p=0,27) e entre o grupo vacinado com Ingelvac M. hyo® e o grupo vacinado com a vacina do exemplo 2 (p=0»88).

[0065] Embora uma redução numérica não significativa em lesões fosse registrada no grupo que recebe a vacina do exemplo 2, os dados obtidos nesta experiência sugerem que a dose de desafio mais alta (1,4 x 106 organismos) usada nesta experiência era provavelmente esmagadora, mesmo para a imunidade dos porcos estimulados pelo produto de Ingelvac comercial. Este nível de desafio é provavelmente não apropriado para a avaliação de estudo de desafio/vacinação usando-se tamanhos de grupos de 20-25 animais, embora com tamanhos de grupo maiores seja possível que significância pudesse ser provada.

Testaoem de Imunoaenicidade na Segunda Experiência [0066] Os porcos nos grupos de controle vacinados e desafiados na experiência dois foram avaliados com a dose de desafio (1,0 x 106 organismos) como recomendado por ISU 4 meses depois da vacinação para demonstrar DOI de quatro meses. As porcentagens de lesão de pulmão são sumarizadas na tabela 3. O grupo de controle tinha uma lesão média de pulmão de 10,4%. O grupo vacinado tinha a lesão média de pulmão de 5,5%. Há uma diferença significativa entre os grupos vacinados e de controle (p=0,031). Isto indica que a vacina no exemplo 2 é eficaz na estimulação de imunidade protetora, que pode durar pelo menos quatro meses depois da vacinação de dose única em porcos na idade de três meses.

Avaliação dos Resultados Combinados de Ambas as Experiências: [0067] Embora as duas experiências fossem significativamente diferentes, o efeito da experiência sobre o grupo não era significativa. A magnitude do efeito de grupo foi similar entre as duas experiências. Assim, o efeito do grupo podería ser avaliado sem considerar a experiência. Uma vez que a análise do modelo completo mostrou que a interação entre o grupo e a experiência não era significativa, isto suporta a noção de que o efeito do grupo era o mesmo em ambas as experiências e justifica a combinação de dados das duas experiências em uma única análise. Como tal os dados relacionados com a vacina no exemplo 2 a partir das duas experiências foram combinados e a variável transformada em arco-seno para lesão de pulmão foi analisada com grupo e experiência como variáveis independentes (modelo reduzido), o grupo é estatisticamente significativo (p=0,013).

Tabelai: Sumário do estado sorológico a Mvcoofasma hvooneumo-niae em porcos de controle e vacinados Experiência um Positivo/Negativo (1:10) a Experiência dois Positivo/Negativo (1:10) a Tabela 2: Sumário das porcentagens de lesão de pulmão na experiência um fultradose)* *Porcos foram desafiados com 1,4x10& organismos por porco (dose recomendada de ISU 1,0x106 organismos por porco) ** comparação entre grupo de vacina de FDAH e grupo de controle *** comparação entre grupo de vacina de BI e grupo de controle ****comparação entre grupo de vacina de BI e grupo de vacina de FDAH

Tabela 3: Sumários das porcentagens de lesão de pulmão na experiência dois (dose recomendada) *Porcos foram desafiados com dose recomendada de ISU (TÕxTÕ6 organismos por porco) ** comparação entre grupo de vacina de FDAH e grupo de controle Exemplo 4 Avaliação da imunidade de longo prazo induzida por uma composição de vacina da invenção contra um desafio virulento seis meses depois de uma administração de dose única [0068] Usando-se essencialmente os mesmos procedimentos descritos nos exemplos 1 e 2 e empregando as quantidades mostradas abaixo, vacina A de teste foi preparada Vacina A de teste [0069] O pH da série é ajustado para 7,010,2. MHDCE = equivalentes de célula de DNA de Mycoptasma hyopneu- moniae Sumário [0070] Trinta e três porcos de 21 dias de idade foram arrolados nesta avaliação. Vinte porcos foram vacinados com uma dose de vacina A intramuscularmente (IM) na idade de três semanas. Dez porcos como controles não vacinados e três porcos como controles ambientais não desafiados.

[0071] Todos os porcos foram soro-negativos (título de anticorpo <10) no momento da vacinação, indicando que os animais eram suscetíveis a Mycoplasma hyopneumoniae. Todos os porcos nos grupos de controle permaneceram soro-negativos antes do desafio. Isto indica que a resposta imune nos porcos vacinados foi devido à vacina e não a qualquer exposição ambiental.

[0072] Seis meses após a vacinação, 20 porcos vacinados e 10 porcos de controle não vacinados foram desafiados com Mycoplasma hyopneumoniae virulento (1,0x106 organismos por porco). Três porcos serviram como controles não desafiados. Os porcos vacinados tinham uma classificação de lesão média de pulmão de 3,6% e os porcos de controle desafiados tinham uma classificação de lesão média de pulmão de 14,6%. As lesões de pulmão no grupo vacinado foram signifi-catívamente menos do que aquela nos controles (P=0,0215).

[0073] Os dados obtidos nesta avaliação demonstram que vacina A de teste induziram imunidade protetora de longo prazo contra o desafio de Mycoplasma hyopneumoniae virulento seis meses depois de uma vacinação de dose única.

Projeto experimental [0074] Trinta e dois porcos de 21 dias de idade foram aleatoriamente distribuídos em três grupos (grupo vacinado, grupo de controle de desafio e grupo de controle ambiente não desafiado) usando-se o programa de aleatorização Microsoft Excel por ninhada. Vinte porcos foram vacinados com uma dose de vacina A de teste intramuscular-mente na idade de três semanas. Dez porcos serviram como controles de desafio e três porcos como controles ambientais não desafiados. Os porcos no grupo vacinado e os controles de desafio foram desafiados com 10 ml de uma cultura de Mycoplasma hyopneumoniae viru-lenta (1,0x106 organismos) por porco seis meses depois da vacinação. Três porcos não vacinados foram usados como controles de não desafio. Os porcos desafiados e controles não desafiados foram submetidos a eutanásia 26 dias depois do desafio e lesões de pulmão foram classificadas para cada porco.

[0075] Cada porco nos grupos de vacinação recebeu uma dose de 2 ml da vacina de teste IM na lateral do pescoço.

Desafio e Necrópsia [0076] O estoque de desafio de Mycoplasma hyopneumoniae viru-lento, um homogenato de pulmão congelado (<-70Ό), foi preparado por Dr. Eileen Thacker da lowa State University (ISU). O estoque de desafio foi confirmado ser puro e continha cerca de 107 organismos de Mycoplasma hyopneumoniae por ml.

[0077] Os porcos foram desafiados com 10 ml de uma diluição de 1:100 do estoque (isto é, cerca de 1,0x106 organismos).

[0078] No dia do desafio, o homogenato foi descongelado rapidamente sob água quente e foi diluído de acordo com as recomendações por ISU usando-se meio de crescimento de Mycoplasma hyopneumoniae. Porcos foram sedados com uma mistura de Xilazina-Cetamina-Telazol® que consiste em 50 mg/ml de Xilazina, 50 mg/ml de Cetamina e 100 mg/ml de Telazol. Uma mistura anestésica foi dada IM a 0,01-0,02 ml/lb em peso de corpo. Cada porco recebeu uma dose única de 10 ml do material de desafio (1,0x106 organismos), intratraqueal-mente. Para assegurar que a colocação de agulha estava correta, ar foi puxado para dentro da seringa antes da administração da dose de desafio. Os porcos de controle não desafiados não vacinados foram mantidos em salas separadas e não desafiados.

[0079] 26 Dias pós desafio (DPC), todos os porcos foram submetidos a eutanásia. Pulmões foram removidos e as lesões de pulmão grossas foram classficadas como descritas no exemplo 3.

Testaoem e Coleção de Amostra [0080] Amostras de sangue foram coletadas a partir de todos os porcos no dia da vacinação (0 DPV), a 35 DPV, -1 DPC e 26 DPC para a determinação de anticorpos de soro contra Mycoplasma hyopneumoniae como detectados por um kit de ELISA competitivo (produzido pela DAKO Co ). As amostras de soro foram armazenadas a <-20X^ antes de serem testadas.

Análise de Dados [0081] Classificações de lesão de pulmão foram comparadas entre vacinados e controles por um modo ANOVA. As classificações de lesão de pulmão foram transformadas em arco-seno para aperfeiçoar a distribuição dos residuais. Uma vez que a suposição de normalidade para as classificações de lesão de pulmão foi questionável, tanto as classificações de pulmão quanto as classificações de lesão de pulmão transformadas em arco-seno foram analisadas por teste de Wilcoxon Rank Sum. O nível de significância foi ajustado a p<0,05. Os resultados do teste Wilcoxon Rank Sum, não paramétrico foram usados para finalidades de relatório.

Resultados e Discussão Soroloqia [0082] Todos os porcos foram testados quanto a anticorpos de soro contra Mycoplasma hyopneumoniae por um kit de ELISA competitivo comercial, usando-se uma diluição de soro de 1:10 para toda a tes-tagem. As amostras com suspeita de resultado de teste por instruções de kit são tratadas como positiva em análise de dados. Todos os porcos soro-negativos (título de anticorpo <10) no momento da vacinação, indicando que os animais eram suscetíveis a Mycoplasma hyopneumoniae. Todos os porcos nos grupos de controle permaneceram soro-negativos antes do desafio. Depois da vacinação, quinze de vinte vacinados (15/20) se tornam soro-posítivos a Mycoplasma hyopneumoniae pelo menos uma vez (amostras coletadas a 35 DPV e -1 DPC). Isto indica que a resposta imune nos porcos vacinados era devido à vacina e não a qualquer exposição ambiental. Todos os porcos vacinados e quatro de dez porcos no grupo de controle de desafio se tornam soro-positivos a Mycoplasma hyopneumoniae depois do desafio enquanto todos os animais não desafiados permaneceram soro-negativos. O estado sorológico dos animais de teste é sumarizado na tabela 4.

Classfi cações de lesão de pulmão [0083] Vinte porcos vacinados com Vacina A de teste e dez porcos de controle não vacinados foram desafiados com Mycoplasma hyop-neumoniae virulento (1,0x10b organismos por porco) seis semanas depois da vacinação. Três porcos serviram como controles não desafiados. Oito dos vinte vacinados (40%) não desenvolveram lesões de pulmão depois do desafio enquanto que no grupo de controle apenas um de 10 porcos (10%) não teve lesão de pulmão. As porcentagens de lesões de pulmão são sumarizadas na tabela 5. Os porcos vacinados tiveram uma classificação de lesão média de pulmão de 3,6% e os porcos de controle desafiados tiveram uma classifcação de lesão de pulmão de 14,6%. As lesões de pulmão no grupo vacinado foram significativamente menores do que os controles (P=0,0215).

Tabela 4: Estado soro lógico em relação a Mycoplasma hvooneumonl·· ae dos porcos no estudo* Número de positivo (1:10)/total Número Gru- Tratamento de porcos 0 35 - 26 po DFV** DRV 1DPC** PPG * 1 vacina/desafio 20 0/20 9/20 12/20 20/20 2 controle/desafio 10 0/10 0/10 0/10 4/10 3 controle/não desa- 3 0/3 0/3 0/3 0/3 fio *As amostras de soro foram testadas quanto a anticorpos de soro para Mycoplasma hyopneumoniae por ELISA usando-se um kit comercial.

[0084] Todas as amostras foram testadas a diluição de soro de 1:10. Resultados foram interpretados por instruções do kit.

[0085] Amostra suspeita a 1:10 foram consideradas positivas. **DPV = dia pós-vacinação ***DPC = dia pós-desafio Tabela 5: Sumário de classificações de lesão de pulmão (%) em porcos desafiados com Mycoplasma hyopneumortiae e em controles não desafiados número classificações médias de le-grupo tratamento de são de pulmão em por cento porcos 1 vacina/desafío 20 3,6 2 controle/desafio 10 14,6 3 controle/não desa- 3 1,8 fio Tabela 5 (Continuação) Inferior 95% Superior 95% Gru- Desvio padrão de CL* para de CL* para Valor F** po média média 1 7,6 0,07 7,19 0,0215 2 20,0 0,33 28,94 3 1,8 -2,67 6,27 * CL = nível de confidência **0 valor de P era da comparação dos grupos 1 e 2.

[0086] Como pode ser visto a partir dos dados mostrados nas tabelas 4 e 5, Vacina A de teste induz imunidade protetora contra um desafio de Mycoplasma hyopneumoniae virulento por seis meses depois de uma administração de dose única em porcos vacinados na idade de três meses.

Claims (9)

1. Composição de vacina para imunização de um animal contra infecção por Mycoplasma hyopneumoniae, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade de imunizante de bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae; uma mistura auxiliar compreendendo um polímero de ácido acrílico e uma mistura de um óleo metabolizável e um copolímero em blocos de polioxietileno-polipropileno; e um veículo farmaceuticamente aceitável, composição de vacina essa que, depois da única administração elicia imunidade protetora contra Mycoplasma hyopneumoniae.

2. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mistura auxiliar consiste em um polímero de ácido acrílico e uma mistura de um óleo metabolizável que compreende um ou mais hidrocarbonetos de terpeno e um copolímero em blocos de polioxietileno-polipropileno em uma razão de cerca de 1:25 a 1:50 de polímero de ácido acrílico para mistura de óleo metabo-lizável/copolímero em blocos de polioxietileno-polipropileno.

3. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mistura auxiliar compreende cerca de 1-25% de v/v da composição de vacina.

4. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o polímero de ácido acrílico está presente em uma concentração final de cerca de 1% de v/v e a mistura de hidrocarbonetos de terpeno/copolímero em blocos de polioxietileno-polipropileno está presente em uma concentração final de cerca de 5% a 10% de v/v.

5. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a mistura auxiliar compreende cerca de 2% -15% de v/v da composição de vacina.

6. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a mistura auxiliar compreende cerca de 5% -12% de v/v da composição de vacina.

7. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o óleo metabolizável é esqualano ou esqualeno.

8. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o polímero de ácido acrílico é Carbopol.

9. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende Mycoplasma hyopneumoniae inativado, um óleo metabolizável, um copolímero em blocos de polioxietileno-polipropileno e um polímero de ácido acrílico na forma de uma emulsão de óleo em água.