TWI356680B - Anti-allergy lactic acid bacteria - Google Patents

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1356680 第096100486號發明專利案 皇I線之全份·Μι!月換太^>9年7月7 B、 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關應用在食品或醫藥之抗過敏乳酸菌菌株組 合物及其應用於抗過敏能力上之用途。 ^ 【先前技術】 、近幾年來過敏疾病有逐年增加的趨勢，不論是在異位性皮 膚j、過敏性鼻炎和支氣管性氣喘的發生率都有增加的情形。 目前認為過敏疾病的發生可能與文明的進步有關，包括空氣的 污染和感染的減少都可能是導致過敏疾病增加的一些$能原 因而目刖應用在氣喘的治療主要是靠藥物治療：如類固醇和 抑制肥大細胞釋放發炎物質的藥物、氣管擴張劑和免疫療法 等。但是，包括抗發炎藥物和氣管擴張劑在内的藥物治療還是 無法真正的改變過敏免疫反應，所以只能說是治標的一種方 法。而唯一能夠說是改變過敏免疫體質的治療方式，便是所謂 的減敏療法，但是減敏治療通常需要較長的一段時間，而且有 時會出現一些副作用，因此也不是所有的病人都能夠使用。 ^有關過敏疾病的增加，目前認為跟大環境的變化有密切關 係，特別是在環境方面有更明顯的關係。人體腸道中的益生菌 會刺激免疫系統作用，但如果在曰常生活中的食品含有抗生素 或是類固醇含量太高，都會導致腸道内的益生菌降低，因而無 法有效地刺激免疫細胞中第一型T輔助細胞（Thl)的生成，、 這些第一型τ輔助細胞的生成與第二型τ輔助細胞（Th2)相 關的過敏疾病發生有著密切關連。因此，如果能利用保健食品 來刺激我們的免疫系統，誘發出可以調節過敏免疫反應的Thl 型免疫反應平衡過敏所引發Th2型免疫反應，將可達到改善過 敏體質的效果。 1356680 '. 第096100486號發明專利案 . 年 7 月 7 曰、 從早微生物的歷史上，乳酸菌的應用起源相當早。 改上發現，食用乳酸菌發酵之食品，有助於 ϊϋΐΛΐ：觸發生料及驗平均壽命的現象。由 於1&研雜魏酸s在促進人體健康中所能 扣决的角色。功能性乳酸菌在西元1954年提出之後，在幾年 ，研究熱潮不斷的發酵，於西元1%5年由LiUyDM等人正式 . 提出Pr〇bi〇tic—益生菌的概念，成為功能性乳酸菌的統稱。 ^ 叙㊅用3乳酸菌(LAB)之產品僅具有調整腸道的健康 效果丄雖然有數以萬計的乳酸菌菌株存在自然界，但僅有少數 乳酸菌株具有抗過敏的特質。少數這些細菌株所具有的耐酸與 耐膽鹽能力’吸附黏膜表皮細胞之能力及在通過腸胃道後仍可 存活的能力等特性，是篩選有促進健康效果的菌株時的重要依 ，。時至今日，僅有少數幾株經證明其具有抗過敏健康效果之 乳酸菌菌株被確認出來，而乳酸菌的對身體健康的功能在於菌 株(strain)的特異性而非菌種(Species)，此種對於人之身體健康 有特殊功效之鹵株稱為功能性益生菌（Guideiines for the evaluation of probiotics in food ； Report of joint FAO/WHO working group on drafting guidelines for the evaluation of — probiotics in food ； London Ontario, Canada April 30 and May 1, 2002 : 1-7)。 ’ 過敏疾病，例如過敏性濕療、蓴麻療、反覆發作的過敏性 鼻炎及過敏性氣喘，在台灣及其他已開發國家已成為嚴重的社 會問題。之所以形成過敏疾病的流行程度的提升，是有原因 的，這眾所皆知的衛生假說為：嬰幼兒接觸免疫刺激病原體的 機會愈少’愈容易引發過敏相關疾病的產生(Strachan，1989)。 過敏疾病發生時’人體内的免疫反應會使Thl細胞數量下降， 連續產生多種細胞激素促使免疫反應朝向Th2途徑，形成體液 1356680 第096100486號發明專利案 無畫線之全份說明書替換太(99年7月7日、 免疫反應，例如IgE的產生及嗜伊紅血球過多等 1994; Holt, 1995) 〇 在愛沙尼亞及瑞典這兩個國家的孩童人口中發現，有過敏 疾病的孩童腸道内的乳酸桿菌比無過敏疾病的孩童要少 (Bjo”rkstenetal.，1999)。乳酸桿菌被認為可促進丁hi的免疫反 應進而改善過敏症狀(Cross et al.，2001)。再者，以印白蛋白誘 發小鼠過敏的動物實驗模式中發現，讓小鼠以口服方式食用熱 處理後的Lactobacillus casei strain Shitota，可抑制小鼠血清中 IgE的含量(Matsuzaki et al.，1998)。此外’以酪蛋白誘發小鼠 過敏的動物實驗模式中證明，腹腔注射熱處理後的

Lactobacillus plantarum L-137，也可抑制 IgE 的產生(Murosaki et al.，1998)。由豕草花粉過敏引起的過敏症狀，口服 Enterococcus faecalisFK-23萃取物，可使腹膜内聚集的嗜伊紅 血球細胞量減少(Shimadaetal.,2003)。人體的臨床試驗中，於 待產期間服用Lactobacillus rhamnosus strain GG，發現在出生 後兩年(Kallioma"ki et al., 2001)及嬰兒期後(Kalliomald et al.， 2003)，可降低嬰幼兒產生過敏性濕療的風險及發生率。

Lactobacillus rhamnosus 19070-2 及 Lactobacillus reuteri DSM122460也可以適度地改善患有異位性皮膚炎的孩童其嚴 重渔殄的過敏症狀(Rosenfeldt et al.，2003)。 【發明内容】 本發明一方面廣義的包括由下列任一種生物性純培養 物：嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus)PM-A0002(又名 PRO-2)菌株，民國九十五年二月二十三日食品工業發展研究所 寄存編號BCRC 910308、加氏乳酸桿菌（Lactobacillus gasseri)PM-A0005(又名PRO-5)菌株，民國九十五年一月十一 8 第096100486號發明專利案 無畫線之全份說明書替換太Γ99年7月7曰、 曰食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910304、唾液乳酸桿 菌（Lactobacillus salivarius subsp. salicinius)PM-A0006(又名 PRO-6)菌株’民國九十五年一月十一曰食品工業發展研究所寄 存編號BCRC 910305、約氏乳酸桿菌（Lactobacillus johnsonii)PM-A0009(又名PR0-9)菌株，民國九十五年十月十 七曰食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910336、嗜酸乳桿 菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013(又名 PR0-13)菌株，民 國九十五年二月二十三日食品工業發展研究所寄存編號 BCRC 910309。與生理上可接受的賦形劑或稀釋劑組成之組合 物。 在一項具體實施例中，該組合物含有一種或一種以上該等 菌株’如生理上可接受的賦形劑或稀釋劑是一種食品為較佳之 形式’該食σσ可以疋醱酵乳、優格、乳赂、乳製飲品、乳粉、 茶飲料或咖啡中任何一種較佳，又或者’該組合物是醫藥組合 物，且其賦形劑或稀釋劑應為醫藥上可接受之賦形劑或稀釋 劑0 在另一項具體實施例中，增強抗過敏能力之生理上可接受 之下列任一種菌株之同種或突變種之生物性純培養物：嗜酸乳 桿菌ΡΜ-Α0002菌株、加氏乳酸桿菌ΡΜ_Α〇〇〇5菌株、唾液 酸桿菌ΡΜ-Α0006菌株、約氏乳酸桿菌ρμ_α〇〇〇 乳桿菌ΡΜ-Α0013菌株。 困怀Ml ,項具體實施射，本發明可廣義的包括經由促進 碰間白素(IL-12)或干擾素γ調控Thl型免疫反應 球蛋白城’改善Th2型免疫反應過剩的過敏現象 ，動物投予可達到刺激Thl型免疫效果劑量之任—種前： 物性純培養物。 種月j it生 至 再者’另-項具體實施例中，含有前酬定義菌株中一 1356680 第096100486號發明專利案 s;稀是==: 物是醫荜组人2 B 3或咖啡中任-種較佳，或者，該組合 形且其咖触稀釋舰為㈣上可接受之賦 ，發明亦可廣義的包括本申請案說明書中分開或總 【實施方式】 -本發财廣義的包括由下列任—種生物性純培養物 乳桿菌ΡΜ·Α0002(又名PR〇_2)菌株，民國九十五年二月二 二曰食品工業發展研究所寄存編號BCRC 91〇3〇8、加 桿菌PM-A0005 (又名PRO-5)菌株，民國九十五年一月十一日文 食品工業發展研究所寄存編號运CRC 91〇3〇4、唾液乳酸浐 菌株PM-A0006(又名PRO-6)，民國九十五年一月十一日^品 工業發展研究所寄存編號BCRC 910305、約氏乳酸 PM-A0009 (又名PRO-9)菌株，民國九十五年十月十七日 工業發展研究所寄存編號BCRC 910336、嗜酸乳产菌 PM-A0013(又名PRO-13)菌株，民國九十五年二月曰二十三=入 品工業發展研究所寄存編號BCRC 910309。 — 艮

許多文獻指出增加第一型T細胞細胞激素包括細胞間白 素(IL-12)、干擾素γ (IFN-gamma)的分泌增加，可以有效改盖 過敏症狀；進一步的研究也指出特定的乳酸菌株和樹狀細胞I 1356680 —. 第096100486號發明專利案 無書線之全份說明書替換本(99年7 Θ 7 類鐸受體(Toll-like receptor)結合，活化細胞内的轉譯蛋白移至 核内而釋放大量細胞激素，屬於先天免疫的一環，因此某些特 定的乳酸菌菌種借由其細胞壁多酷類物質如peptidoglycan、 lipopolysaccharide、polysaccharide 等，經先天免疫系統，確實 能活化T細胞的發育。 該五株細菌菌株之冷凍乾燥培養物已寄存在台灣食品工 • 業發展研究所’地址為：中華民國新竹市食品路331號。寄存 • 之詳細資料如表1所示： 表1 菌株名 編號 曰期 嗜酸乳桿菌PM-A0002 (PR0-2) BCRC910308 2006年02月23日 加氏乳酸桿菌PM-A0005 BCRC910304 2006年01月11日 唾液乳酸桿菌PM-ΑΟΟΟό (PRO-6) BCRC910305 2006年01月11日 約氏乳酸桿菌PM-A0009 (PRO-9) BCRC910336 2006年10月17日 嗜酸乳桿菌 PM-A0013 (PRO· 13) BCRC910309 2006年02月23日 &如上所列專利寄存的這五株乳酸菌已發現具有抗過敏的 能力’包括對於異位性皮膚炎、蓴麻疹、過敏性鼻炎、食物過 敏及氣喘的症狀有減緩及治療的功能。 實例1 :五株抗過敏乳酸菌之形態學及一般性質。 Μ根據16S rDNA序列分析及API細菌鑑定系統分析結果來 確認菌株在分類學上的特徵。發現，東宇菌株編號PM-A0002 為嗜酸乳桿菌；東宇菌株編號PM-A0005 (又名 為加式乳酸桿菌；東宇菌株編號PM-A0006 (又名 為唾液乳酸桿菌；東宇菌株編號PM-A0009 (又名_ 為約式乳酸桿菌及東宇菌株編號PM-A0013 1356680 第096100486號發明專利案 life全份說明書4換太〔99年7月7 B、 。此五嶋細糾—般性質上的 嗜酸乳桿菌PM-A0002(PR〇-2) 於MRS培養液培養時，菌體呈短桿狀或稍長，_ 對或成短鍵狀。 長、呈圓形，通常單獨出現、成 革蘭氏染色陽性桿g，不生成抱子，不具_ 環境均能生長，最適宜的生長溫度為37±1gc，J；^及運動性’在好氧及厭氧 迦不產生氣體。 4於兼性異_酵_株，葡賴 加氏乳酸桿菌PM-A0005 (PR〇-5): 於MRS培碰培養時，菌體呈轉狀朗長， 對或成短鏈狀。 呈圓形’通常單獨出現、戌 革蘭氏染色陽性翻’不生成抱子，不具觸酶 環境均能生長，最適宜的生長_ 37±丨。c,^=運動性，在好氧及厭章 缝扭質醱酵性菌株， 唾液乳酸桿菌PM-A0006(PR〇-6): 於MRS培義液培養時，菌體呈短桿彳 狀。 —^㈣彡’通常單現、成對紹 革蘭氏染色陽性㈣，不生銳子，不具_ 環境均能生長，最適宜的生長溫麵。 ^性，在好氧及厭: 兼性異質酸酵性菌株，則 約氏乳酸桿菌PM-A0009 (PR_〇.9): 於MRS培義液培養時，菌體呈轉狀 革蘭氏㈣明负—知呈圓形，通常成短鏈狀。 平闌^㈣性㈣’不生成抱子 環境均能生長，«㈣«溫料37^c%性，在好氧及厥」 請酵性菌株，則 嗜酸乳桿菌ΡΜ-Α0013 (P：R〇u : 成鏈狀 12 革蘭氏染色·，不生錢子，不具_、氧㈣及運紐，在魏及厭氧 %境均能生長’最適宜的生長溫度為37±此，屬於兼性異雜雜_株葡糖 不產生氣體。葡萄糖㈣ 表2 f例2 .抗過敏乳酸菌對促進干擾素γ的分泌調控Thi型 免疫能力的仙（關邊血液單核球細胞為體外功效驗證平 台）。 檢視五株抗過敏乳酸菌株，嗜酸乳桿菌pM_a〇〇〇2菌株、 加氏乳酸桿菌PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌PM_A〇〇〇6菌 株、約氏乳酸桿菌PM-A0009菌株或嗜酸乳桿菌PM_A〇〇13菌 株對Thl型免疫能力的增進效果，其係測定人類週邊血液單核 球與抗過敏乳酸菌共同培養後測定干擾素γ的分泌量，來篩選 具有抗過敏能力的菌株。使用如下之實驗步驟： 1·抽取適當人類血液量每次約2〇〇m!。 2. 取等比例之血球分離液(Fic〇u_paque)與血液在18-2〇。〇以 400g離心30-40分鐘。 3. 取人類周邊金液白血球(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)層’緩衝溶液清洗細胞2-3次後，以適當之培養基(例 如RPMI-1640)懸浮細胞。 4. 將細胞與已活化3天之乳酸菌株以1 : 1〇比例共同培養48 小時。 5. 收取細胞培養之上清液。利用酵素免疫分析法(EUSA)偵測 干擾素γ (IFN-gamma)在上清液中的含量。 數據之統计分析如表3及第1圖所示，以Mean 土 SD表示 之。第1圖所示為當分別以106至1〇8個cfo嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus)PM-A0002 菌株、加氏乳酸桿菌 (Lactobacillus gasseri)PM-A0005 菌株、唾液乳酸桿菌 13 1356680 第096100486號發明專利案 無書線之全份說明書替換本(99车7月7曰、 (Lactobacillus salivarius subsp. salicinius)PM-A0006 菌株、約氏 乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株或嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus)PM-A0013 菌株與 1〇5 至 1〇7個人類周 邊A液白血球(PBMC)共同共同培養48小時，收取細胞上清 液’以酵素免疫分析法彳貞測干擾素γ (IFN-gamma)在上清液中 的含篁。其中以無抗過敏功能乳酸菌（Lactobacillus casei BCRC12249)為負控制組’ PHA為正控制組，偵測干擾素γ受 刺激濃度。結果顯示試驗組可以顯著的刺激人類周邊血液白血 球(PBMC)分泌干擾素γ與負控制組有顯著性差異。表3為分 別以五株抗過敏菌株與人類周邊血液單核球培養，刺激干擾素 菌株名稱 干擾素γ的分泌量(pg/ml) j酸乳桿菌 ΡΜ-ΑΌ002 19833±2767 加式乳酸桿菌PM-A0005 46625±3624 唾液乳酸桿菌PM-A0006 25850±2347 苎氏乳酸桿菌PM-A0009 25725±2〇〇8 嗜酸乳桿菌 PM-A0013 17416±2803 兔色制組（L. casei BCRC 12249) 11±2.3 赛制組（positive ecmtrol) 44666±2488 表3 實例3 ;抗過敏乳酸菌對促進細胞間白素(IL_；[2)的分泌調 控Thl型免疫能力的作用（以樹狀細胞dentritic cell為體外功效 驗證平台）。 檢視五株抗過敏乳酸菌株，嗜酸乳桿菌PM_A0002菌株、 加氏乳酸桿菌PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌PM-A0006菌 株、約氏乳酸桿菌PM-A0009菌株或嗜酸乳桿菌PM-A0013菌 株對Thl型免疫能力的增進效果，其係測定人類樹狀細胞與抗 14 1356680 第096100486號發明專利案 ' 無書線之全份說明書替換本年7 q 7 η) 過敏乳酸菌共同培養後測定細胞間白素(IL_i2)的分泌量’來篩 選具有抗過敏能力的菌株。使用如下之實驗步驟： 1. 抽取適當人類血液量每次約200ml。 2. 取等比例之血球分離液(Ficoll-paque)與血液在18-20。(：以 400g離心30-40分鐘。 3. 取人類周邊血液白血球(PBMC)層，緩衝溶液清洗細胞2-3 * 次後，以適當之培養基(例如RPMI-1640)懸浮細胞。 • 4·人類周邊血液白血球(PBMC)細胞以CD 14+ microbeads (MiniMACS system)將細胞之CD14+單核球純化。 鲁 5.以細胞激素(IL-4)及生長激素GM-CSF刺激細胞分化成樹狀 細胞，6-7天的培養時間’將已分化之樹狀細胞收集。 6. 將抗過敏乳酸菌株在共同培養之前3天活化，之後以l〇〇°C 熱致死乳酸菌株30分鐘。 7. 將樹狀細胞與已熱致死之乳酸菌株以1 : 1〇比例共同培養 48小時。 8. 收取細胞培養之上清液。利用酵素免疫分析法(ELISA)偵測 細胞間白素(IL-12)在上清液中的含量。 φ 數據之統，計分析如表4及第2圖所示，以Mean土 SD表示 之。第2圖所示為當分別以熱殺死1〇6至1〇8個cfU嗜酸乳桿 菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002 菌株、加氏乳酸桿菌 (Lactobacillus gasseri)PM-A0005 菌株、唾液乳酸桿菌 (Lactobacillus salivarius subsp. salicinius)PM-A0006 菌株、約氏 乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株或嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus)PM-A0013 菌株與 1〇5 至 1〇7個人類樹 狀細胞(dentritic cell)共同培養48小時，收取細胞上清液，以 酵素免疫分析法偵測細胞間白素(IL-12)在上清液中的含量。其 中以無抗過敏功能乳酸菌(Lactobacillus casei BCRC12249)為 15 第096100486號發明專利案 無書線之全份說明書替換太(99车7 q 7曰Λ 負控制組，ΡΗΑ為正控制組，偵測細胞間白素(IL_12)受刺激 濃度。結果顯示試驗組可以顯著的刺激人類樹狀細胞分泌細胞 間白素(IL-12)與負控制組有顯著性差異。表4所示為分別以五 株熱致死抗過敏菌株與樹狀細胞培養，刺激細胞間白素(XL-12) 的分泌量(mean&iSD)： 菌株名稱 細胞間白素(IL-12)的分泌量(pg/ml) 嗜酸乳桿菌 PM-A0002 15019±569 加式乳酸桿菌PM-A0005 19222±212 唾液乳酸桿菌PM-A0006 18625±365 約氏乳酸桿菌PM-A0009 18291±39 嗜酸乳桿菌 PM-A0013 17836±168 負控制組（L. casei BCRC 12249) 80±15 正控制組（positive control) 13786土341 表4 實例4:抗過敏乳酸菌耐胃酸膽鹽試驗。 檢視五株抗過敏乳酸菌株，嗜酸乳桿菌PM-A0002菌株、 加氏乳酸桿菌PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌PM-A0006菌 株、約氏乳酸桿菌PM-A0009菌株或嗜酸乳桿菌PM-A0013菌 株’可否具有通過胃酸膽鹽考驗的能力順利在腸道發揮其抗過 敏的功能，試驗流程如下·· 1，將五株抗過敏乳酸菌活化3天。 2. 取1 mL菌液計算原始菌數，剩餘之乳酸菌以500g離心1〇 分鐘，加入去離子水清洗乳酸菌2-3次。 3. 加入以鹽酸調配成pH2 5之培養基中，乳酸菌與pH2 5之 培養基充分混合後，置於37〇C培養箱。 4. 每小時取出1 mL之菌液以去離子水清洗2-3次後，計算存 1356680 第096100486號發明專利案 無書線之全份說明書4換本(99年7 q 7 活細胞數，至3小時培養時間為止。 5. 剩餘菌液離心後沈殿物再以含u%(w/v)牛膽汁(〇 ， Sigma)之培養基中回溶，充分混合後，於37它培養。 6. 每小時取出1 mL之菌液以去離子水清洗2 3次後 活細胞數，至4小時培養時間為止。 7_記錄乳_生長速率’計算乳酸_胃酸與膽鹽之耐受力， 以比較樣品中減g在胃酸及_存在下，_生長是否受 对胃酸的能力結果與分析整理於表5及第3圖所示，第3 ，所不其結果顯示转抗過魏酸菌在培養基的活化後，總菌 衝溶液及膽鹽處理，下降許多；調節過 ，之專利寄存魏_在培養基活化後，將_處理酸性 ^液及膽鹽，pm_a_6、m_A_、ρΜ鳩 不 月酸膽驗改變影響而急劇下降，PM姻02及ΡΜ_Α0005 = ί 對胃酸具有耐受性，但將菌株經由膽 ίΓϊΓ菌株可輯過人體消化系統嚴格環境 其耐㈣^: ρ值2,5的鹽酸與抗過敏乳酸菌混合測驗 菌株名稱 嗜酸乳桿菌 PM-A0002 ~--丨__ 8.20x1 〇8 pH2.5-lhr 6.5〇xl〇8 pH2.5-2hr 2.87x10s pH2.5-3hr 9 ^ 1 x 1Π8 加式乳酸桿菌 PM-A0005 2.06x109 9.7〇xl〇8 4.05xl〇8 U9xl〇9 l_42xl〇9 4 15xl〇8 Δ*0 1 A1U 唾液乳酸 約氏乳酸桿菌 PM-A0006 ----- PM-A0009 _λ55χΐ〇^ 6.87x10s 7.10x10s 1.43xl09 Λ 0 ^ 1 嗜酸乳桿j PM-A0013 ------- J^78xi〇9 1.83xl〇9 1.86xl〇9 4.j jx 1U 1.73xl09 表5 3圖所示，表6 耐膽鹽雜力轉私祕麟表6及第 1356680 第096100486號發明專利案 無畫線之全份說明書替換太("年7㈢7日） 為以1.5%的膽汁與抗過敏乳酸菌混合測驗其耐膽鹽能力。 菌株名稱 原始菌數 1.5%bile-lhr 1.5%bile-2hr 1.5%bile-3hr 1.5%bile-4hr 嗜酸乳桿菌 PM-A0002 8·2〇χ1〇8 4.3〇χ106 1.5〇xl〇6 5.45xl〇5 4.4〇xl05 加式乳酸桿菌 PM-A0005 2.65 xlO9 5.8〇xl04 5.55xl〇4 2.4〇xl04 1.89xl04 唾液乳酸桿菌 PM-A0006 2.55χ1〇9 1.45x10s 9.2〇xl〇7 1.02xl08 8.3〇xl〇7 約氏乳酸桿菌 PM-A0009 6.87x10s 8.65xl07 1.13xl〇8 5.7〇xl07 8.3〇xl〇6 嗜酸乳桿菌 PM-A0013 1.78χ109 6.72x108 5.73xl08 8.00xl06 3.00x10s 表6 實例5 :抗過敏乳酸菌對人類腸道表皮細胞(cac〇-2)的吸 附能力試驗。 在活體外採用已分化的細胞株分析五株抗過敏乳酸菌菌 株吸附人類腸道表皮細胞(CaCo-2)的能力。先由人類腸道表皮 細胞(CaCo-2)單層細胞株於蓋玻片上生長至單層細胞後，置入 多孔細胞培養盤中。然後將細胞：乳酸菌之比例為1 : 2〇〇， 共同培養1-3小時，以lxPBS清洗及利用甲醇固定細胞及剩 餘之附著菌數後，以lxPBS清洗及利用甲醇固定後細胞及剩 餘之附著菌數後，進行格蘭氏染色並確定所附著之菌數。參考 Jacobsen等學者(1999)之分析方法，在1〇〇〇倍顯微鏡下計數 20個視野，當每個視野的平均菌數少於4〇時，判定為不附著 (nonadhesive);當每個視野的平均菌數介於41至1〇〇時，判 定為附著(adhesive);當每個視野的平均菌數大於10〇時，判 1356680 . 第096100486號發明專利案 無畫線之全份說明書替換本(99年7月7曰、 定為強烈附著(strongly adhesive)。 數據之統计分析以Mean土 SD表示之。平均來說，取四十 五個視野之計算值.其結果整理於表7及第4圖所示。第4圖 顯示依據Jacobsen等學者(1999)之分析方法，當每個視野的平 均菌數少於40時’判定為不附著(nonacjhesive);當每個視野 的平均函數介於41至100時’判定為附著(adhesive);當每個 視野的平均囷數大於100時’判定為強烈附著(s^〇ngly adhesive)。顯示嗜酸乳桿菌（Lact〇bacillus acidophilus)PM-A0002 菌株、加氏乳酸桿菌（Lact〇bacillus gaSSeri)PM-A0005 菌株、唾液乳酸桿菌(Lact〇badllussalivarius subsp. Salidnius)PM-A0006 菌株、約氏乳酸桿菌(Lact〇baciUus johnsonii)PM-A0009菌株等四株抗過敏菌株均判定「強烈附 著」而嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013 菌株則 判定為附著。表7為五株抗過敏乳酸菌對人類腸道表皮細胞 菌株名 Means±SD 嗜酸乳桿菌 PM-A0002 115.4±4.4 加式乳酸桿菌PM-A0005 100.1±2.6 唾液乳酸桿菌PM-A0006 108.3±1.4 ------- 208.3±22.1 約氏乳酸桿菌PM-A0009 表7 過敏改善評估 Α.實驗設計 實例6 :以抗過敏乳酸ϋ作為補充飼料所產生治療 過敏性氣喘的效果，藉由以餵食唾液乳酸桿菌ΡΜ·Α〇〇〇6 蛋白(ovalbumin; OVA)致氣喘小白鼠為例藉由如之 =Ρ 19 1356680 第096100486號發明專利案 皇畫巍之全份說明當替換本(99年7月7 Fn 1. 實驗動物 使用BALB/c小鼠’ 6-8週大，雌鼠，對照組與實驗組每 組14隻。選用常用的BALB/c雌鼠，8週大，傲食六週，每 組隻數14隻。自台大動物中心購進SpF六週大的BALB/c 雌鼠’母隻小鼠分別飼養於不鏽鋼籠中，室溫控制於22±2。〇， 光暗循環時間各為12小時(早上六點亮，下午六點暗），自由 攝食飲水及飼料，小鼠八週大時以體重隨機分組，開始以管餵 方式給予受測乳酸菌(2.6xl〇6至2.6xl〇7cfli/day)同時進行致敏。 2. 建立呼吸道發炎動物模式 小鼠致敏步驟簡述如下：實驗開始第2天以50吨卵白蛋 白（OVA)與佐劑Alum 4mg腹腔注射至小鼠體内，於實驗第 16、30、44天再以25吨之卵白蛋白(〇VA)與4mgAlum重 f注射老鼠。致敏後’在實驗第54、55天，將小鼠麻醉，以 鼻腔内(intra-nasal，ι.η.)滴入1〇〇咫印白蛋白(〇VA) 發呼吸道發炎反應。 )㈣ 3. 實驗；程如第5圖所示，抗過敏乳酸菌改善過敏實驗的 流程，管餵抗過敏乳酸菌之階段分為四期：第一期 天；第二期為23〜36天，·第三期為37〜5〇天；第四期為5ι〜53 天。其間以腹腔注射卵蛋白(0VA)致敏小鼠，分四次致 第:次為開始管餵之第2天；第二次為開始管顧之第π 第二次為開始管儀之第3〇天；第四次為開始管傲之 ’ 腹腔注射白(OVA)致敏小鼠之隔週皆會抽血 。 f在體内含量之變化。於犧牲小鼠前4天(第54天― 膜吸入之方式致敏小鼠連續2天後，侧小鼠呼力 之反應，隔天犧牲小鼠進行其他生化值的檢測。 力 B.實驗方法 1.動物犧牲和實驗材料收集與分析 第096100486號發明專利案 無晝線之全份說明書4換太⑴q年7月7日） a. 血清樣品的收集 於實驗進行第0、23、37、51天及犧牲時對小鼠進行以 眼窩採血（retro-orbital)收集血樣。將小鼠麻醉後，迅速以微 量毛細管自眼窩靜脈竇採血，約取200-250 pL血液，4t：靜 置2 - 4小時後，以12000 rpm轉速離心20分鐘，收集血 清，於-80°C保存。 b. 測定卵蛋白(OVA)專一性抗體的酵素免疫分析(ELISA) 將 0.5mg 抗原溶於 ΐ〇〇μΐ^ carbonate coating buffer (0.1 Μ NaHC03)加入微量培養盤於40C靜置過夜。第2天以含有 0.05% Tween 20之IX PBS緩衝液清洗微量培養盤。然後以 blocking solution (含有 1% BSA 之 IX PBS 緩衝液)進行 blocking兩小時以上，清洗3次後，接著加入lOOpL待測樣 本反應於4°C靜置過夜，清洗4次後，加入100μί抗小鼠IgE 抗體於室溫反應一至兩小時，再清洗5次加入100 pL經適 當稀釋之 avidin-HRP (avidin-horseradish peroxidase conjugated) 反應一小時，清洗6次，最後加入100 μι ABTS ( 2.2'-Azino-bis-3- Ethylbenzthiazoline -6-Sulfonic Acid)受質溶液於室溫呈 色約30分鐘後，以100 pL之5% SDS終止反應，並以吸光值 讀取機(microplate reader)讀取吸光值。測定結果以酵素免疫 分析(ELISA) unit方式表示如下： ELIS A Unit -（Asampie — Ablank) / (Apositive control — Ablank) c. 呼吸道過度反應（airway hyperresponsiveness，AHR)測定 為研究口服抗過敏乳酸菌是否能減缓致敏小鼠之過敏反 應，在兩次氣管内過敏原刺激後，隔天接受呼吸道阻力的測 試。測試系統為 Buxco system (Biosystem XA，Buxco Electronics Inc. Sharon，CT，USA)。利用系統中的 transducer

(differential pressure transducer, Buxco)及 preamplifier (MAX 1356680 第096100486號發明專利案 無晝線之全份說明書替換木(99车7月7 S、 II，Buxco)收集小鼠呼吸道變化的訊息而計算出pen^值。

Penh 值的計算方式為 pause X pIF/PEF ; Pause = (Te — Tr) /

Tr, (PIF . peak inspiratory flow ； PEF ： peak expiratory flow ； Te ： expiratory time ; Tr : relaxation time)。小鼠在意識清醒狀態下 置於 whole body plethysmograph chamber 中，以超音波震盪氣 化normal saline導入chamber三分鐘，之後紀錄小鼠三分鐘 内每分鐘平均肺呼吸阻力值Penh，再以漸增濃度之 Methacholine (6·25、12.5、25、50 mg/mL)喷霧化給予小鼠刺 激，各濃度皆在刺激三分鐘後，再記錄三分鐘之呼吸道生理變 化。記錄三分鐘内各分鐘平均Penh值。 · d. 肺沖洗液及肺部細胞分析 測試完肺呼吸阻力隔天’小鼠進行犧牲，剪開頸部皮肉使 氣管露出，以靜脈置留管插入氣管，第一次先以1扯無菌 HBSS buffer沖洗肺部，第二及第三次則以含有2% BSA之 HBSSbuffer沖洗肺部，首次取得之肺沖洗液經15〇〇rpm離 心5分鐘後，分離上清液保存於_8(rc待後續分析。細胞部 分則併入後兩次肺沖洗液中，以1500 rpm離心5分鐘，棄置 上清液後並將細胞以lmL含有2% BSA之HBSS buffer懸 浮，並以trypan blue染色計數，取約1 X 1〇5之細胞以離心 , 機(cytospin)500rpm離心3分鐘製作細胞抹片，待其自然風 乾後’依序以LiuA及LiuB染色，以少量阿拉伯膠封片， . 使用油鏡（1000 X)判讀至少五個視野之細胞或總數3〇〇個 以上之細胞，計算其中淋巴球及多核球比例。 e. 脾臟細胞培養 無菌條件下，打開小鼠腹腔取出脾臟置於已加入3 g HBSSbuffer之20 mm petri dish内，以無菌針筒尾端將脾臟 磨碎’使其中淋巴細胞釋出，細胞懸浮液吸入15 mL離心管， 22 第096100486號發明專利案 無畫線之全份說明書替換本(99年7 Θ 7曰、 靜置5分鐘後，取上清液以1500 rpm離心5分鐘，吸除上 清液後，加入1 mL RBC lysis buffer，靜置1分鐘使紅血球溶 解’加入5 mLAHBSS buffer，以1500 rpm離心5分鐘，，吸 除上清液；以HBSS buffer重複洗兩次後，再加入5 mL含 5% FBS 之 RPM-1640 complete medium 使細胞懸浮。以 trypan blue染色法計算細胞總數，調整細胞數鱼1 x 1〇7 cells/mL medium。取細胞液 〇.5 mL 加入 48-well plate 中，再 加入等體積培養液、含裂殖素或卵蛋白(OVA)之培養液，使細 胞最終濃度為5 X 106 cells/mL medium。置於恆溫培養箱 37°C、5%C〇2培養48小時，收取上清液保存於_80°c待曰 後分析其中各細胞激素分泌量。 f.細胞激素的測定 脾臟細胞分泌細胞激素的含量以三明治型酵素免疫分析 法(ELISA)來測定。簡述如下：先將抗細胞激素抗體以NaHC〇3 缓衝液（pH 9.6)稀釋後加入96孔微量培養盤於4°C靜置過 夜。第二天將培養盤清洗3次後，以含1% BSA之PBS在室 溫下反應至少1小時進行填塞(blocking)。加入待測樣本後可 於37 C反應2小時或置於4。(1!反應過夜。清洗4次後加入 以1。/。BSA-PBS緩衝液稀釋之biotin-conjugated抗細胞激素 抗體於室溫反應1小時’清洗5次，接著加入streptavidin _ conjugated peroxidase再反應1小時。最後在清洗後，每孔加 入100 μ!^的酵素受質溶液 TMB substmte (Tetramethylbenzidine substrate)，於室溫避光反應約 2〇 分鐘。 以microplate autoreader讀取波長450 nm的吸光值。 2.統計方法 實驗結果以平均值士標準誤差表示（Means 士 SEMs)。各 組間差異以Studentt-test分析’ p<〇.〇5視為有顯著差異（*， 1356680 第096100486號發明專利案 無畫線之全份說明書替換太(99车7 P<0.〇5;**，P<0.〇〇1)。另外將p<〇1視為有差異。 實驗結果分析： A.測定印蛋白(OVA)專-性抗體的酵素免疫分析(ELISA)結果 血清中卵蛋白（0VA)特異性抗體效價部分，餵食 PM-A0006乳酸菌的對照組，彡卩蛋自 ^蛋白(OVA)特異性IgE抗體有減少的趨勢結果於表8，圖 不於第6圖。表8顯示卵蛋白(〇VA)專一性抗體IgE測定結果 fMearK士SFMq ΧΓ=1Λ τ^、 組別 對照組 實驗組 IgE 0.66±0.05 0.44±0.03(P-0.06)# ELISAunit = (Asample-Ablank)/(Apositivec〇ntr〇1_Ablank) #:P<0.1 表8 B.呼及道過度反應（aifwayhypej^esponsivenes^AjjR)測定結果

組別(Mch : me/mU 肺呼吸阻力部分，相對於對照組，餵食pM_A〇〇〇6乳酸菌 在高濃度乙醯丑曱基膽素(Methacholine)刺激下顯著減低小 鼠Penh值。結果於表9，圖示於第7圖。表9顯示呼吸道過 星基座則定結果(MeansiSEMs, N=14, P value=P)_ 實驗組(Penh) 對照組(Penh> 1.41±〇.〇5 1.44±0.08(P=0.86) 6.25 1.50±0.ll 1.35 土 0·11(Ρ=0·62) 12.5 25 50 2.59±0.24 4.38±0.47 5.10±0.32 1.94±0.20(P=0.28) 1.95±0.12(P=0.08)# 2.63±0.13(P=0.002)i| 1356680 ·. 第096100486號發明專利案 ' 無，線之全扮說明書替換本(99年7月7日、_

Mch=Methacholne 配製濃度

Penh-pause x PIF/PEF, Pause=(Te - Tr) / Tr, (PIF : peak inspiratory flow ； PEF : peak expiratory flow ； Te : expiratory time ； Tr : relaxation time) * :p<0.05 #: P<0.1_ 表9 c_肺沖洗液及肺部細胞分析結果

肺沖洗液中細胞組成部分，相對於對照組，餵食PM_ A0006 乳酸菌的實驗組有顯著較低的嗜伊紅白血球(eosin〇phii)浸潤 比例。結果總結於表1〇，圖示於第8圖。表1〇顯示肺沖洗液 組別 對照組0¼) 實驗組(％) eosinophil 27.5±1.37 17.1±1.66(P=0.02)* %=In percentage % * ： P<0.05 表10 D.肺沖洗液細胞激素分析結果 相對於對照組’餵食PM_A〇〇〇6乳酸菌的實驗組可顯著 降低肺沖洗中e〇taxin分泌量且PGE2也有減少之趨勢。結果 總結於表11 ’圖示於圖9及第10圖。表11顯示肺沖洗細胞 激素分析結果(Means±SEMs，N=14, P value=P) 25 1356680 第096100486號發明專利案 無書線之全份說明書替換本(99年7月7曰） 組別 對照組 實驗組 eotaxin 3 8.8 土 3.00 22.7±1.54(P=0.02)* pge2 8.1±1_04 3.82±0.41(P=0.08)# * : Ρ<0·05 #: P<0.1 表11 E.脾臟細胞培養之上清液細胞激素分析結果 脾臟細胞經ConA或卵蛋白(OVA)刺激培養48小時 後，在ConA刺激下，银食PM-A0006乳酸菌的實驗組之脾 臟細胞分泌的IFN-γ顯著高於對照組。結果總結於表12，圖 示於第11圖。表12顯示偵測脾臟細胞培養之上清液，分析不 同刺激物質對脾臟細胞之細胞激素分泌之影響(Means±SEMs， N=14, P value=P) 組別 對照組 實驗組 ConA 5185士558 9748±966(P=〇.〇5)* * : P<0.05 表12 綜合上述，本發明電化學免紐驗試#係_免疫反應有 效地克服電化學法_之干擾性問題，提高檢繼感度。另 外’本發明可提供-單步驟快速檢驗試片與定量之檢測，又， 更結合生物技術與電子製造技魅趋成本* Μ方便之生 物科技檢驗試片。 ρ品組合物，含有以上所述之任意—種或一種以 ΐϊif成之各種組合物，例如_乳、優格、乳赂、 礼錢。。捕、茶或咖啡轉，域株可以活菌或死菌的樣態 26 1356680 第096100486號發明專利案 皇晝^±_份說明書替換本^)9年7月7曰、 ' 存於組合物中。 ^由於乳酸菌要發揮抗過敏的效果除了要找出具有特定功 ^的菌株外，更要確認該菌株能通過人體胃酸膽鹽的環 還要能對小腸黏膜表皮細胞具有良好吸附能力之乳酸菌 株，也因為此種特性，本發明的抗過敏乳酸菌才可以提供治 或舒緩過敏症狀的醫療用途。本發明所描述的抗過敏乳酸菌可 同時增強Thl途徑調控Th2過盛的過敏反應。本發明的一個 . 目標就是繼續朝向達成這些希求或至少提供大眾在過敏治療 上除類固醇或是抗組織氨的的新選擇，本發明找出對人體無副 作用且有益健康的抗過敏乳酸菌來作為過敏治療的新選擇。 以上所述係藉由實施例說明本發明之特點，其目的在使熟 習該技術者能暸解本發明之内容並據以實施，而非限定本發= ，專利範圍，故，凡其他未脫離本發明所揭示之精神所完成之 等效修飾或修改，仍應包含在以下所述之申請專利範圍中。 【圖式簡單說明】 第1圖顯示，當分別以1〇6至108個cfb嗜酸乳桿菌 • (Lactobacillus acidophilus)PM-A0002 菌株、加氏乳酸桿菌 (Lactobacillus gasseri)PM-A0005 菌株、唾液乳酸桿菌 (Lactobacillus salivarius subsp. salicinius)PM-A0006 菌株、約氏 乳酸桿菌(Lactobacillus j ohnsonii)PM_A0009菌株或嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus)PM-A0013 菌株與 1〇5至 107個人類周 邊血液白血球(PBMC)共同培養48小時，收取細胞上清液，二 酵素免疫分析法偵測干擾素γ (IFN-gamma)在上清液中的含 量。其中以無抗過敏功能乳酸菌（Lact〇baciuus casei BCRC12249)為負控制組，PHA為正控制組，偵測干擾素^受 刺激濃度。結果顯示試驗組可以顯著的刺激人類周邊血液白血 27 1356680 第096100486號發明專利案 無畫線之全份說明書4換本(99年7 Θ 7 a、 球(PBMC)分泌干擾素γ與負控制組有顯著性差異。 第2圖顯示，當分別以熱殺死1〇6至1〇8個嗜酸乳桿 菌(Lactobacillus acid〇PhilUS)PM_A0002 菌株、加氏乳酸桿菌 (Lactobacillus gasseri)PM-A0005 菌株、唾液乳酸桿菌 (Lactobacillus salivarius subsp. salicinius)PM-A0006 菌株、約氏 乳酸桿菌(Lactobacillusjohnsonii)PM-A0009菌株岑诠酿到嫘茴 (Lactobacillus acidophi ΙΟ^ ΙΟ^Γ^ 狀細胞(dentritic cell)共同培養48小時，收取細胞上清液，以 酵素免疫分析法偵測細胞間白素IL-12在上清液中的含量。其 中以無抗過敏功月色乳酸菌(Lactobacillus casei BCRC12249)為 _ 負控制組，PHA為正控制組，偵測細胞間白素(il_ 12)受刺讀文 濃度。結果顯示試驗組可以顯著的刺激人類樹狀細胞分泌細胞 間白素(IL-12)與負控制組有顯著性差異。 ^第3圖顯示，結果顯示市售抗過敏乳酸菌在培養基的活化 後，總菌數經由酸性緩衝溶液及膽鹽處理，菌數明顯下降許 多；調節過敏之專利寄存乳酸菌株在培養基活化後，將菌株^ 理酸性緩衝溶液及膽鹽，PM_a〇〇〇6、pm_a〇㈨9、pM_A()()13 菌數並不受胃酸膽鹼改變影響而急劇下降，pM_A〇〇〇2及 PM-^0005雖然不受胃酸而影響菌數證明對胃酸具有耐受性，拳 但將菌株經由膽鹽處理時，雖然菌株有些許的下降，但對膽鹽 仍有耐受性，証明抗過敏之此五株乳酸菌株可以通過人體消二化 糸統嚴格環境的考驗。 — 第4圖顯示，依據jac〇bsen等學者(1999)之分析方法，當 每，視野的平均g數少於4〇時，判定為不畴(nGnadhesive); 當每個視野的平均菌數介於41至1〇〇時，判定為附著 (adhesive);當每個視野的平均菌數大於1〇〇時，判定為強烈 附著（strongly adhesive)。顯示嗜酸乳桿菌（Lact〇baciiius 28 ：s) 1356680 -· 第096100486號發明專利案 無書線之全份說明書替換本(99年7 Θ 7 口> add_ilUS)PM-A0002 菌株、加氏乳酸桿菌（Lact〇baciUus gasseri)PM-A0005 m ^ «(Lactobacillus salivarius subsp. SalidniUS)PM-A0006 菌株、約氏乳酸桿菌(Uet()badllus j〇hnS〇nii)PM-A0009菌株等四株抗過敏菌株均判定「強烈附 著」而嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acid〇phiius)PM_A〇〇13 菌株則 判定為附著。 第5圖顯示’抗過敏乳酸菌改善過敏實驗的設計流程，管 餵抗過敏乳酸菌之階段分為四期：第一期為〇〜22天；第二期 為23 36天，第二期為37〜50天；第四期為51〜53天。其間以 ，腔注射終白(〇VA)錄小鼠，分四次致敏，第—次為開始 ^之第2天；第二次為開始管傲之第16天；第三次為開始 I健之第3G天；第四次為開始管狀第44天。腹腔注射· ^=bUmin ; 0VA)致敏小鼠之隔週皆會抽血檢查小鼠之城 在體内3量之變化。於犧牲小鼠前4天(第54天)以鼻黏膜吸 =之方式，敏小鼠連續2天後，偵測小鼠之肺呼吸阻力之反 應，隔天犧牲小鼠進行其他生化值的檢測。 =6圖顯不，為小白鼠補充唾液乳酸桿菌pM_A〇〇〇6乳酸 體J二·蛋自致敏的袖鼠血*切蛋自(°VA)特異性抗 中ί Λ77 ’隨雜食劑量增加^蛋白(ova)致敏小鼠血清 、卵蛋白(OVA)特異性IgE抗體有減少的趨勢。 菌株ί ’為小白鼠補充唾液乳酸桿菌PM_侧6乳酸 組，比L f、蛋白致敏的小白鼠肺，及阻力部分，相對於對照 低小白鼠。PeiT農度乙酿丑甲基膽素(methaCh〇Une)刺激下顯著減 值。 菌抶Ϊ 8圖顯示’為小白鼠補充唾液乳酸桿® PM_A〇_乳酸 對於對昭Ϊ印蛋白致敏的小白鼠肺沖洗液中細胞組成部分，相 、―且，有顯著較低的eosinophil浸潤比例。 29 1356680 第096100486號發明專利案 無書線之全份說明書替換本(99年7月7曰） 第9圖顯示，相對於對照組，餵食PM-A0006乳酸菌可 顯著降低肺沖洗中eotaxin分泌量。 第10圖顯示，相對於對照組，餵食PM-A0006乳酸菌可 顯著降低肺沖洗中PGE2分泌量。 第π圖顯示’脾臟細胞經c〇nA或卵蛋白(0VA)刺激培 之脾臟=泌下，銀食腸〇_乳酸菌組 【主要元件舰】㈣料於對照組。 盤 30

Claims (1)

1356680 第096100486號發明專利申請案 修正後無劃線之申請專利範圍替換本（100年10月31曰）

十、申請專利範圍 種生物性純培養物，其中該4養物係選自由下尹ϋ且成之 群之一 ig 株·加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005(又名 PRO-5):食品工業發展研究所寄存編號bcrc 910304 ;唾液乳酸 桿菌（Lactobacillus salivarius subsp. salicinius )PM-A0006 (又名 PR〇-1 2):食品工業發展研究所寄存編號BCRC 910305 ;及約氏乳 酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009(又名 PRO-9):食品工業 發展研究所寄存編號BCRC 910336。 2. —種用於治療過敏之組合物，其包含促進__丫及IL_12 分泌和減少IgE抗體、嗜伊紅白血球數量之至少一種乳酸桿菌株， 其中該乳酸桿菌株係選自由加氏乳酸桿菌（Lact〇baciUus gaSSeri)PM-A0005(又名PR〇_5):食品工業發展研究所寄存編號 BCRC 910304 ;唾液乳酸桿菌（Lact〇bacillus salivarius subsp. salicinius )PM-A0006 (又名PRO-6):食品工業發展研究所寄存編號 BCRC 910305 ;及約氏乳酸桿菌（Lact〇bacillus johnsonii) PM-A0009(又名PR〇_9):食品工業發展研究所寄存編號BCRc 910336及其組合所組成之群。 3. 如申請專利範圍第2項之組合物，其中該等菌株係為活菌 或死菌。 4. 如申請專利範圍第2項之組合物’其中該組合物可添加 食品中。 、 5. 如申请專利範圍第4項之組合物，其中該食品係選自由赠 酵乳、優格、乳酪、乳製飲品乳粉、茶及咖啡所組成之群。 s 1 如申請專利範圍第1項之培養物’其中該培養物係指加氏 乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005(又名 PRO-5):食 〇 工董 發展研究所寄存編號BCRC 910304。 χ °α工乂 2 如申請專利範圍第丨項之培養物，其中該培養物係指唾液 1356680 第096100486號發明專利申請案 修正後無劃線之申請專利範圍替換本〇〇〇年10月3丨曰） 乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp. salicinius )PM-A0006 (又名 PRO-6):食品工業發展研究所寄存編號BCRC910305 〇 8.如申請專利範圍第1項之培養物’其中該培養物係指約氏 乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-Α0009(又名 PRO-9):食品工 業發展研究所寄存編號BCRC 910336。 32