TWI451871B - 用以抑制發炎反應及抗陰道炎之含乳酸菌食品組合物及醫藥組合物 - Google Patents
用以抑制發炎反應及抗陰道炎之含乳酸菌食品組合物及醫藥組合物 Download PDFInfo
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Description
本發明是有關一種食品組合物以及醫藥組合物，特別是一種包含乳酸菌菌株之食品組合物以及醫藥組合物，其用以抑制發炎反應。
由國際發表文獻中論述，益生菌定義為可促進宿主健康的活性微生物。益生菌擁有促進人體健康的能力，在上個世紀末已被發覺，且逐步進行許多科學驗證的研究。首先被發現益生菌對於腸胃不適的症狀有舒緩的能力，直至今日，調整腸胃道功能仍是益生菌在產品應用上重要的一環。
然而，除了腸胃道功能外，近年來益生菌在免疫調節方面的功能，也開始嶄露頭角，許多關於益生菌與免疫相關的文獻陸續發表，研究結果如雨後春筍般出現，益生菌在免疫調節上的能力，可以見得。目前在益生菌對於免疫功能上，有提升免疫力、調整過敏體質、輔助緩解自體免疫疾病及抗發炎等等，皆在研究範疇中。一般食用含乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)之產品僅具有調整腸道的健康效果，雖然有數以萬計的乳酸菌菌株存在自然界，但僅有少數乳酸菌菌株具有調節免疫，甚至抗發炎反應的特質。
時至今日，僅有少數幾株經證明其具有調節免疫的健康效果之乳酸菌菌株被確認出來，而乳酸菌對身體健康的功能在於菌株(strain)的特異性而非菌種(species)，此種對於人之身體健康有特殊功效之菌株稱為功能性益生菌(Guidelines for the evaluation of probiotics in food；Report of joint FAO/WHO working group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food；London Ontario,Canada April 30 and May 1,2002：1-7)。
抗發炎之益生菌株對於陰道發炎的症狀，有舒緩症狀的效果，尤其經由口服的途徑，更能加速緩解陰道發炎的症狀。國內外有許多益生菌與抗陰道炎方面有關之文獻報導。在體外試驗方面，Lactobacillus crispatus
及Lactobacillus jensenii
被發現具有產生H2
O2
及類抑菌物質化合物成分，可以有效抑制並殺死陰道內致病菌株(Jasadeeet al.
,2006)。Lactobacillus acidophilus
、Lactobacillus rhamnosus
、Lactobacillus plantarum
及Lactobacillus fermentum
菌株與陰道念珠菌共同培養後，發現可以有效抑制陰道念珠菌的生長(Magdalenaet al.
,2005)。將陰道炎致病菌株Gardnerella vaginalis
及Prevotella bivia
與HeLa細胞(模擬陰道黏膜內皮細胞)共同培養，使致病菌株吸附在細胞上，再加入Lactobacillus gasseri
共同培養，發現Lactobacillus gasseri
可以破壞Gardnerella vaginalis
及Prevotella bivia
對於HeLa細胞的吸附性外，pH值在4.5~5.5之間的破壞效果最好，顯示益生菌的確可以抑制並殺死陰道炎致病菌株，且維持陰道黏膜的弱酸性，對於抑制致病菌株的活性及增加益生菌的活性，皆有極大的幫助(Fabriceet al.
,2006)。這些文獻証實在陰道炎菌叢的體外模擬試驗上，益生菌確實能夠對抗陰道炎的致病菌叢，藉此改善陰道炎的症狀。
乳酸菌在臨床實驗上，將嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus
)醱酵優格，菌數大於108
以上，讓陰道炎病患服用2個月，病人改善情形為60%，遠大於安慰劑組的25%(Shalveet al.
,1996)。而將衛生棉條浸潤Lactobacillus acidophilus
醱酵優格及5%醋酸，用於陰道發炎病患4週~8週，發現陰道炎緩解的程度為88%，比醋酸組的38%高出許多(Neriet al.
,1993)。口服含Lactobacillus rhamnosus
及Lactobacillus fermentum
菌株109
以上菌數的膠囊，一天一次，服用60天，對於陰道炎的改善效果高達87.5%(Reidet al.
,2004)。
然而，僅少數乳酸菌菌株具有的耐酸與耐膽鹽能力、吸附黏膜表皮細胞之能力以及在通過腸胃道後仍可存活的能力等特性，因此需篩選可促進健康效果及可成為功能性益生菌的菌株。
綜合上述，尋找適合的乳酸桿菌，以作為抗發炎，特別是抗陰道炎之作用，以作為功能性益生菌菌株，是目前需要努力的目標。
本發明之目的為提供一種食品組合物及醫藥組合物，其可藉由抑制腫瘤壞死因子-α之產生及/或促進細胞介白素-10(IL-10)之產生，進而抑制發炎反應。
本發明之另一目的為提供一種食品組合物及醫藥組合物，其具有酸性及膽鹽之耐受性，以作為口服益生菌。
本發明之另一目的為提供一種食品組合物及醫藥組合物，其具有陰道炎栓劑之耐受性，以作為治療陰道炎之用途。
在一實施例之中，本發明之一種食品組合物，係用以抑制發炎反應，包含多株乳酸菌菌株以及生理上可接受的一賦形劑或一稀釋劑。乳酸菌菌株包含唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius
)AP-32菌株，寄存編號BCRC 910437、路乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri)TE-33菌株，寄存編號BCRC 910441、嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)F-1菌株，寄存編號BCRC 910469及鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)CT-53菌株，寄存編號BCRC 910468，其中該些乳酸菌菌株具有胃酸、膽鹽及抑霉劑克黴唑(Clotrimazole)耐受性。
在另一實施例之中，本發明之一種醫藥組合物，係用以抑制發炎反應，包含多株乳酸菌菌株以及生理上可接受的一賦形劑或一稀釋劑。乳酸菌菌株包含唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius
)AP-32菌株，寄存編號BCRC 910437、路乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri)TE-33菌株，寄存編號BCRC 910441、嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)F-1菌株，寄存編號BCRC 910469及鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)CT-53菌株，寄存編號BCRC 910468，其中該些乳酸菌菌株具有胃酸、膽鹽及抑霉劑克黴唑(Clotrimazole)耐受性。
本發明亦可廣義的包括本申請案說明書中分開或總合說明之部
分、構成要件與特徵，及任何包含該等部分、構成要件與特徵中任何一者或更多者之任何或全部組合，且若本文所述及之明確完整事物已於與本發明有關之相關技藝中出現已知之同等物時，此等已知之同等物將如同獨立事項併入本文中。
本發明一方面廣義的包括由下列任一種生物性培養物：唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius
)AP-32菌株，寄存編號BCRC 910437、路乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri
)TE-33菌株(寄存編號BCRC 910441)、F-1菌株(嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus
)，寄存編號BCRC 910469)、CT-53菌株(鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus
)，寄存編號BCRC 910468)或其組合，以及生理上可接受的賦形劑或稀釋劑所組成之食品組合物或醫藥組合物。其中乳酸菌菌株可為具有活性或去活性(inactivated)的菌株。
其中，食品組合物可包含但不限於醱酵乳、優格、乳酪、乳製飲品乳粉、茶、咖啡或以上之組合。
醫藥組合物可包含口服劑型或外用劑型；口服劑型例如為錠劑、膠囊、溶液劑及粉劑等。外用劑型例如為乳膏、噴霧劑、凝膠、散劑或霜劑等。
此外，本發明可用於抗陰道炎，因此可用於婦女用品，包含但不限於噴霧、軟膏或衛生棉等。
本發明所述之菌株之冷凍乾燥培養物已寄存在台灣食品工業發展研究所，地址為中華民國新竹市食品路331號。寄存之詳細資料如表1所示：表1：乳酸菌名稱及寄存資料
根據16S rDNA序列分析及API細菌鑑定系統分析結果來確認菌株在分類學上的特徵。發現，菌株編號AP-32為唾液乳酸桿菌；菌株編號TE-33為路乳酸桿菌；菌株編號F-1為嗜酸乳酸桿菌；菌株編號CT-53為鼠李糖乳酸桿菌。此菌株在形態學及一般性質上的特徵詳細列於表2：
目前已知在Th17發炎反應之中，Th17型輔助型T細胞在發炎激素腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)刺激下，其會分泌出許多細胞激素(例如IL-6、IL-17)及介質來吸引發炎細胞的聚集以共同造成感染的發炎反應。介白素-10(IL-10)被發現其具有抗發炎之作用，可抑制IL-6和TNF-α等發炎細胞激素產生。因此可藉由調控增加細胞IL-10及/或減少TNF-α，進而抑制Th17之發炎反應，改善Th17型免疫反應過剩的發炎現象。
一、抑制TNF-α的分泌(以樹狀細胞為體外功效驗證平台)
測定Th17型免疫能力的抑制效果，其作用方式為利用前述乳酸菌共同培養後測定TNF-α的分泌量。使用如下之實驗步驟：
1.抽取適當人類血液量每次約200mL。
2.取等比例之血球分離液(Ficoll-paque)與血液在18-20℃以400g離心30-40分鐘。
3.取人類周邊血液單核球(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)層，緩衝溶液清洗細胞2至3次後，以適當之培養基(例如RPMI-1640)懸浮細胞。
4.以帶有CD14+
之微珠體(microbeads)(MiniMACS system)將細胞之CD14+
單核球自利用PBMC細胞純化。
5.以細胞激素IL-4及生長激素GM-CSF刺激細胞分化成樹狀細胞，6-7天的培養時間，將已分化之樹狀細胞收集。
6.將乳酸菌菌株在共同培養之前3天活化，之後以100℃熱致死乳酸菌菌株30分鐘。
7.將樹狀細胞與已熱致死之乳酸菌菌株以1：10比例共同培養48小時。
8.收取細胞培養之上清液。利用酵素免疫分析法(enzyme-linked-immunosorbent serologic assay,ELISA)偵測TNF-α在上清液中的含量。
數據之統計分析如表3所示，以平均值±標準差(Mean±SD)表示。當分別以106
至108
個CFU菌株之混菌培養物與105
至107
個人類樹狀細胞分別共同培養48小時，收取細胞上清液，以酵素免疫分析法偵測TNF-α在上清液中的含量。其中以市售抗陰道炎功能產品之混菌培養物(Biocan Vagi-guard®
，其有效成份為乳酸菌)為對照組，脂多醣(Lipopolysaccharide,LPS)為正控制組，僅含細胞(Cell only)的實驗背景值為負控制組，偵測TNF-α受刺激濃度。結果顯示本發明之試驗組可以顯著的抑制人類樹狀細胞分泌TNF-α與正控制組(LPS)有顯著性差異並比正控制組(LPS)及對照組(Biocan Vagi-guard®
)之刺激量分別低於84倍與135倍。
二、促進IL-10分泌(以樹狀細胞為體外功效驗證平台)。
為測量IL-10分泌之增加，將人類樹狀細胞與前述乳酸菌共同培養後測定IL-10的分泌量，以測定對抗發炎細胞激素免疫能力的增進效果。使用如下之實驗步驟：
1.抽取適當人類血液量每次約200mL。
2.取等比例之血球分離液(Ficoll-paque)與血液在18-20℃以400g離心30-40分鐘。
3.取人類周邊血液單核球(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)層，緩衝溶液清洗細胞2至3次後，以適當之培養基(例如RPMI-1640)懸浮細胞。
4.以帶有CD14+之微珠體(microbeads)(MiniMACS system)將細胞之CD14+單核球自利用PBMC細胞純化。
5.以細胞激素IL-4及生長激素GM-CSF刺激細胞分化成樹狀細胞，6-7天的培養時間，將已分化之樹狀細胞收集。
6.將乳酸菌菌株在共同培養之前3天活化，之後以100℃熱致死乳酸菌菌株30分鐘。
7.將樹狀細胞與已熱致死之乳酸菌菌株以1：10比例共同培養48小時。
8.收取細胞培養之上清液。利用ELISA偵測IL-10在上清液中的含量。
數據之統計分析如表4所示，以Mean±SD表示之。當分別以熱致死106
至108
個CFU之混菌培養物與105
至107
個人類樹狀細胞共同培養48小時，收取細胞上清液，以酵素免疫分析法偵測IL-10在上清液中的含量。其中以僅含細胞(Cell only)的實驗背景值為負控制組，以抗陰道炎功能產品之混菌培養物(Biocan Vagi-guard®
)為對照組，植物凝集素(Phytohemagglutinin,PHA)為正控制組，偵測IL-10受刺激濃度。結果顯示本發明之試驗組可以顯著的刺激人類樹狀細胞分泌IL-10與負控制組(Cell only)有顯著性差異，並比對照組(Biocan Vagi-guard®
)之刺激量高出5倍。表4所示為以熱致死乳酸菌菌株混菌配方及控制組、對照組分別與樹狀細胞培養，刺激IL-10的分泌量。
本發明之一目的為提供大眾在陰道炎治療上除藥物以外的新選
擇，本發明找出對人體無副作用且有益健康的乳酸菌以作為陰道炎治療的新選擇。
由於口服益生菌要發揮抗陰道炎的效果除了要找出具有特定功能的菌株外，更要確認菌株能通過人體胃酸膽鹽的環境外，還要能對陰道炎常用藥物具有耐受能力之乳酸菌菌株，因此需要具備上述特性，本發明之乳酸菌才可以提供治療或舒緩陰道炎症狀的醫療用途，並降低陰道炎的復發率。
為檢視本發明之乳酸菌菌株是否具有通過胃酸膽鹽考驗的能力順利在腸道發揮其抗發炎的功能，試驗流程如下：
1.將本發明之乳酸菌活化3天。
2.取1mL菌液計算原始菌數，剩餘之乳酸菌以500g離心10分鐘，加入去離子水清洗乳酸菌2至3次。
3.加入以鹽酸調配成pH 2.5之培養基中，本發明之乳酸菌與pH 2.5之培養基充分混合後，置於37℃培養箱。
4.每小時取出1mL之菌液以去離子水清洗2至3次後，計算存活細胞數，至3小時培養時間為止。
5.剩餘菌液離心後沈澱物再以含1.5%(w/V)牛膽汁(ox gall，Sigma)之培養基中回溶，充分混合後，於37℃培養。
6.每小時取出1mL之菌液以去離子水清洗2至3次後，計算存活細胞數，至4小時培養時間為止。
7.記錄乳酸菌生長速率，計算乳酸菌對胃酸與膽鹽之耐受力，以比較樣品中本發明之乳酸菌在胃酸及膽鹽存在下，菌株生長是否受到抑制。
耐胃酸的能力結果與分析整理於表5及圖1所示。結果顯示，本發明之乳酸菌在培養基活化後，將菌株處理酸性緩衝溶液及膽鹽，
AP-32、TE-33、F-1及CT-53菌數並不受胃酸的影響。耐膽鹽的能力結果與分析整理於表6及圖1所示，在膽鹽的部份則除了CT-53較為敏感而使菌數下降之外，AP-32、TE-33及F-1菌株皆不受膽鹽影響。以上證明本發明之乳酸菌可以通過人體消化系統環境的考驗。
在平板培養基上塗佈高密度菌數，使菌株長滿盤。將抑霉劑克黴唑(Clotrimazole)點置在平板正中央，以37℃培養48小時後，觀察抑菌環直徑的大小判定菌株之耐受能力。在耐受性判斷部分，抑菌環直徑小於等於4mm為耐受性良好，大於4mm且小於等於5mm為耐受性中等，大於5mm以上為無耐受性。耐受性結果整理於表7及圖2，其顯示AP-32、TE-33、F-1以及CT-53菌株皆判定為耐受性良好之菌株。
本發明之乳酸菌組合具有抑制發炎反應，並具有膽鹽、酸性及抑霉劑之耐受性，並因此用於口服益生菌，並具有抗陰道炎的能力，包括抑制陰道致病菌叢及發炎症狀，例如紅腫、搔癢、疼痛等的功能，並可用於噴霧或是衛生棉，以促進婦女健康。
以上所述之實施例僅是為說明本發明之技術思想及特點，其目的在使熟習此項技藝之人士能夠瞭解本發明之內容並據以實施，當不能以之限定本發明之專利範圍，即大凡依本發明所揭示之精神所作之均等變化或修飾，仍應涵蓋在本發明之專利範圍內。
圖1顯示，唾液乳酸桿菌AP-32菌株、路乳酸桿菌TE-33菌株、嗜酸乳酸桿菌F-1菌株以及鼠李糖乳酸桿菌CT-53菌株菌數並不受胃酸的影響，膽鹽的部份則除了鼠李糖乳酸桿菌CT-53菌株較為敏感外，唾液乳酸桿菌AP-32菌、路乳酸桿菌TE-33菌株、嗜酸乳酸桿菌F-1菌株皆不受膽鹽影響而使菌數急劇下降，証明本發明之抗陰道炎乳酸菌可以通過人體消化系統嚴格環境的考驗。
圖2顯示，唾液乳酸桿菌AP-32菌株、路乳酸桿菌TE-33菌株、嗜酸乳酸桿菌F-1菌株以及鼠李糖乳酸桿菌CT-53菌株其抑菌環直徑皆小於等於4mm，因此皆判定為耐受性良好之菌株。
Claims (7)
- 一種食品組合物，用以抑制發炎反應，包含：多株乳酸菌菌株，其包含唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius )AP-32菌株，寄存編號BCRC 910437、路乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri )TE-33菌株，寄存編號BCRC 910441、嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )F-1菌株，寄存編號BCRC 910469及鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus )CT-53菌株，寄存編號BCRC 910468，其中該些乳酸菌菌株具有胃酸、膽鹽及抑霉劑克黴唑(Clotrimazole)耐受性；以及生理上可接受的一賦形劑或一稀釋劑。
- 如請求項1所述之食品組合物，其中該賦形劑或該稀釋劑為醱酵乳、優格、乳酪、乳製飲品乳粉、茶、咖啡或以上之組合。
- 如請求項1所述之食品組合物，其中該乳酸菌菌株為具有活性或去活性的菌株。
- 如請求項1所述之食品組合物，係用以抗陰道炎。
- 一種醫藥組合物，用以抑制發炎反應，包含：多株乳酸菌菌株，其包含唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius )AP-32菌株，寄存編號BCRC 910437、路乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri )TE-33菌株，寄存編號BCRC 910441、嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )F-1菌株，寄存編號BCRC 910469及鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus )CT-53菌株，寄存編號BCRC 910468，其中該些乳酸菌菌株具有胃酸、膽鹽及抑霉劑克黴唑(Clotrimazole)耐受性；以及醫藥上可接受的一賦形劑或一稀釋劑。
- 如請求項5所述之醫藥組合物，其中該乳酸菌菌株為具有活性或去活性的菌株。
- 如請求項5所述之醫藥組合物，係用以抗陰道炎。
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